CN102131830A

CN102131830A - 嵌合呼吸道合胞病毒多肽抗原

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Publication number: CN102131830A
Application number: CN2009801332745A
Authority: CN
Inventors: 诺曼德.布莱斯; 帕特里克.雷奥尔特
Original assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Current assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Priority date: 2008-07-18
Filing date: 2009-07-17
Publication date: 2011-07-20
Also published as: CA2731194A1; EP2324062A4; KR20110045008A; ZA201100132B; MX2011000668A; BRPI0915960A2; IL210493A0; JP2011528222A; AU2009270399A1; EA201170217A1; US20110177117A1; WO2010006447A1; EP2324062A1

Abstract

提供了嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)多肽抗原。所公开的多肽包含第一氨基酸序列，其包含与呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白多肽的F1域不可切割地连接的F2域；和第二氨基酸序列，其包含RSV附着(G)蛋白多肽中包含免疫学优势表位的部分。公开内容还提供了编码嵌合RSV多肽的核酸和含有嵌合RSV多肽的药物组合物以及用于其生产和使用的方法。

Description

嵌合呼吸道合胞病毒多肽抗原

对相关申请的交叉引用

本申请要求2008年7月18日提交的美国临时申请号61/081,888的较早提交日的权益，通过提及而将其公开内容收入本文。

按照37C.F.R.§1.71(E)的版权通知

本专利文件的公开内容的一部分含有受到版权保护的材料。版权拥有人不反对任何人拓制专利文件或专利公开内容，就像其出现在专利商标局专利文件或记录中的那样，但是在其它情况中保留无论什么的所有版权权利。

发明领域

本公开内容关注免疫学领域。更具体而言，本公开内容涉及用于引发对呼吸道合胞病毒(RSV)特异性的免疫应答的组合物和方法。

发明背景

人呼吸道合胞病毒(RSV)是小于6个月龄的婴儿和怀孕期小于或等于35周的早产儿中下呼吸道感染(LRI)的最常见的全球性原因。RSV疾病谱包括从鼻炎(rhinitis)和耳炎(otitis)至肺炎(pneumonia)和细支气管炎(bronchiolitis)的一大批呼吸症状，后两种疾病与相当高的发病率和死亡率有关。人是RSV唯一已知的贮主。自受污染的鼻分泌物扩散病毒经由大的呼吸飞沫发生，因此传播需要与受感染个体或受污染表面紧密接触。RSV能在玩具或其它物体上持续数小时，这解释了医院RSV感染的高比率，特别是在儿科病房中。

估计全球每年的RSV感染和死亡数字分别是6400万和16万。仅在美国，估计RSV每年造成18,000至75,000例住院和90至1900例死亡。在温带气候，RSV被较好地证明为急性LRI(包括细支气管炎和肺炎)的每年冬季流行病的一个原因。在美国，几乎所有儿童到两岁时都感染过RSV。RSV相关LRI在其它方面健康的儿童中的发生率计算为生命前两年中37/1000名儿童-年(小于6个月龄的婴儿中45/1000名儿童-年)，而住院风险为6/1000名儿童-年(生命前6个月中11/1000名儿童-年)。发生率在患有心肺疾病的儿童和早产儿中较高，在美国这些儿童构成几乎半数的RSV相关医院收治。经受由RSV引起的更严重的LRI的儿童以后具有升高的儿童哮喘发生率。患有严重LRI及其后遗症的儿童的护理花费巨大，而且RSV还日益被公认为老年人中流感样病的发病率的一个重要原因，这突显了需要能够针对RSV诱导的疾病提供保护的安全且有效的疫苗。

发明概述

本公开内容关注嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)抗原。嵌合RSV抗原以N端至C端方向包含：第一氨基酸序列，其包含与呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白多肽的F1域不可切割地连接的F2域；和第二氨基酸序列，其包含RSV附着(G)蛋白多肽中包含免疫学优势表位的部分。所公开的抗原在对受试者施用时引发免疫应答，而且可以用于治疗和/或预防RSV感染的症状。还公开了编码嵌合抗原的核酸、含有嵌合抗原的免疫原性组合物、及用于生成和使用嵌合抗原的方法。

附图简述

图1是相对于原型FG(FG Rix)进行的修饰以生成FG V1-1和FG V2-1的图示。数字1和2分别指明引入的接头和G蛋白片段的位置。

图2是序列比对，其提供了FG-Rix与称作FG V1-1和FG V2-1的两种例示性的新型改良FG嵌合物的比较。

图3A和图3B是柱状图，其显示了FG V1-1和FG V2-1对人血清的中和抑制。

发明详述

导言

由于宿主免疫应答表现出在疾病的发病机制中起作用的实情而使开发针对由RSV感染引起的症状和后遗症提供保护的疫苗变得复杂。二十世纪60年代的早期研究显示了，与未接种疫苗的对照受试者相比，接种用福尔马林灭活的RSV疫苗的儿童在随后暴露于病毒后遭受更严重的疾病。这些早期试验导致80％的接种疫苗者住院和2例死亡。增强的疾病严重性已经在动物模型中得到再现，而且认为其源自血清中和性抗体的水平不足、缺乏局部免疫、和2型辅助T细胞样(Th2)免疫应答的诱导过量，其伴有肺嗜酸粒细胞增多及IL-4和IL-5细胞因子的生成增加。比较而言，针对RSV感染提供保护的成功疫苗诱导Th1型免疫应答，其特点在于IL-2和γ-干扰素(IFN-γ)的生成。

已经尝试了多种办法(包括杀死的或灭活的病毒、减毒的活病毒和纯化的亚基办法)来努力产生安全且有效的RSV疫苗，其在健康的和有风险的群体中产生持久的且保护性的免疫应答。然而，迄今所评估的候选物无一导致为了预防RSV感染和/或减轻或预防RSV疾病的疫苗的销售。一种办法已经牵涉生成重组嵌合抗原，其包含RSV融合(F)和附着(G)糖蛋白两者的构件。例示性的嵌合RSV抗原披露于美国专利号5,194,595中。这些嵌合构建体包含RSV F和G蛋白的整个胞外域(即RSV F的氨基酸残基1-526和RSV G的69-298)。虽然此嵌合抗原在动物模型(例如小鼠、棉鼠)中引发免疫应答，但是它由于生产和稳定性困难而不能进行销售。

本公开内容关注具有卓越的免疫原性和上佳的工艺特征的新型嵌合FG多肽。这些新型嵌合RSV抗原克服先前尝试中遇到的数项重大缺点以生成适合于作为预防性和治疗性疫苗施用的安全且有效的嵌合RSV抗原。

一方面，公开内容涉及包含嵌合多肽的呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，所述嵌合多肽以N端至C端方向包含(i)第一氨基酸序列，其包含与F蛋白多肽的F1域不可切割地连接的F2域；和(ii)第二氨基酸序列，其包含G蛋白多肽中含有免疫学优势表位的部分。典型地，RSV F蛋白多肽的F1域和F2域经由氨基酸接头不可切割地连接。可以通过消除弗林蛋白酶切割识别序列和/或位点来以不可切割的方式连接F2和F1域，所述弗林蛋白酶切割识别序列和/或位点使F2和F1域可分开，而且导致天然F蛋白的成熟和装配过程中释放pep27肽。例如，嵌合RSV多肽可以包括至少一处氨基酸删除或替代，其除去弗林蛋白酶切割位点，由此使嵌合多肽不可切割。例如，可以删除或替代一个或多个氨基酸(例如第106位和第133位)以生成不可切割的F蛋白。在某些例示性的实施方案中，可以删除或替代两个氨基酸(包括至少一个精氨酸，例如第106位和第107位的精氨酸和丙氨酸，和第133位和第134位的精氨酸和赖氨酸)。

任选地，为了便于表达和回收，嵌合RSV多肽包括N端的信号肽。信号肽可以选自本领域中已知的多种信号肽，而且通常进行选择以便于(增强或最大化)在选择用于重组表达嵌合多肽的系统中的生成和加工。一般地，信号肽在18-25个氨基酸的长度范围中。在某些实施方案中，信号肽来自RSV F蛋白，例如SEQ ID NO：2的氨基酸残基1-23。F2域可以包含天然F蛋白多肽的氨基酸残基24-105。会显而易见的是，信号肽与F2域之间的精确的氨基酸界限可以变化一个或多个氨基酸(实际上，在选自RSV F蛋白的信号肽的情况中，此类界限是任意的)。在例示性的实施方案中，F1域包含F1域的基本上整个胞外部分，例如天然F蛋白多肽的残基137至残基528。如上文所指明的，F2和F1域可以通过氨基酸接头序列不可切割地连接。本领域技术人员知道在本文中所公开的嵌合FG多肽的背景中合适的许多氨基酸接头。在例示性的实施方案中，接头选自下列序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

以符合读码框的方式将F多肽序列与RSV G蛋白多肽的一部分连接。选择G蛋白的一部分以改善生成特征(例如与全长G蛋白多肽相比)。选择G蛋白的一部分以保留免疫学优势表位，特别是氨基酸残基183和203之间的免疫学优势表位。例如，RSV G蛋白的一部分包含氨基酸152-229。在某些例示性的实施方案中，RSV G蛋白的一部分包含G蛋白的氨基酸残基149-229。

F和G构件的序列可以选自天然存在的F和G蛋白序列，而且可以选择为在序列上对应于单种毒株或超过一种毒株。例如，F和G部分可以来自同一毒株，或者F和G部分可以各自来自不同毒株，或者F部分和/或G部分可以是与来自超过一种毒株的氨基酸对应的杂合物。任选地，嵌合RSV多肽相对于天然存在的RSV多肽可以包含一处或超过一处氨基酸替代。例如，可以将氨基酸替代引入G蛋白部分中，诸如与减轻或预防模式系统中的疫苗增强性病毒疾病有关的氨基酸替代，例如嵌合多肽可以包含G蛋白的残基191处用丙氨酸对天冬酰胺的替代(N191A)。

任选地，如本文中所公开的嵌合RSV多肽可以包含多组氨酸标签或另一种此类序列，其设计用于便于或提高重组表达的蛋白质的回收和/或纯化。

在某些例示性的实施方案中，嵌合RSV多肽具有选自SEQ ID NO：11或13的氨基酸序列或其亚序列(例如缺乏氨基酸1-23的信号序列或具有不同信号序列替代和/或缺乏C端组氨酸标签的亚序列)。有利地，嵌合RSV多肽包含RSV F蛋白和RSV G蛋白两者的至少一个免疫优势表位。

表达(例如和纯化或分离)后，嵌合RSV多肽装配成多聚体，其拥有免疫学上类似天然F蛋白的构象。例如，嵌合RSV多肽可以有利地装配成三聚体。

本公开内容还涵盖免疫原性组合物，其包含与载体或赋形剂一起配制的上文所描述的任何嵌合RSV多肽。典型地，载体或赋形剂是药学可接受载体或赋形剂，诸如缓冲剂。任选地，载体或赋形剂可以包括提高嵌合RSV多肽的稳定性、溶解度或稳定性和溶解度两者的别的成分。任选地，免疫原性组合物进一步包含适合于施用入受试者群体中的佐剂，对于所述受试者群体，意图施用所述组合物例如以预防、减轻或改善RSV诱导性疾病或症状。因而，可以选择佐剂以对新生儿、婴儿或成人诸如年龄为至少65岁的成人施用。有利地，佐剂是Th1偏爱性佐剂。在某些实施方案中，佐剂是TLR-4配体诸如3D-MPL，或脂质A的任何其它合成衍生物。任选地，免疫原性组合物还可以包含颗粒载体诸如明矾。在某些实施方案中，佐剂可以包括脂质体或乳剂，例如水包油乳剂。

有利地，配制免疫原性组合物以在人中作为药物使用，例如以预防或减轻对人受试者施用后受RSV感染，或者以预防或减轻对人受试者施用后由受RSV感染引起的病理学应答。任选地，免疫原性组合物还包含与RSV不同的病原性生物体的至少一种别的抗原。例如，病原性生物体可以是与RSV不同的病毒，诸如副流感病毒(PIV)、流感病毒、乙肝病毒、和/或脊髓灰质炎病毒。或者，病原性生物体可以是细菌，诸如白喉、破伤风、百日咳、流感嗜血菌(Hemophilus influenza)、和/或肺炎球菌(Pneumococcus)。

本公开内容的另一方面关注编码本文中所提供的任何嵌合多肽的重组核酸。在一些实施方案中，核酸包括已经进行过密码子优化以在选定的宿主细胞中表达(例如进行密码子优化以在哺乳动物细胞、酵母细胞、植物细胞等中表达)的多核苷酸序列。在一些情况中，核酸包含在载体诸如原核或真核表达载体内。此类核酸或载体所导入的细胞(即宿主细胞)也是本公开内容的特征。宿主细胞可以是细菌细胞，但是更通常会是真核细胞，诸如酵母细胞(例如毕赤酵母(picchia))、植物细胞、昆虫细胞、或哺乳动物细胞(例如CHO细胞)。

嵌合多肽和核酸在制备用于处理(例如预防性)RSV感染的药物中是有用的。因而，本公开内容还提供了用于引发针对RSV的免疫应答的方法，其通过施用免疫学有效量的含有本文中所公开的任何嵌合RSV多肽的组合物来进行。有利地，在对人受试者(诸如为新生儿、婴儿或儿童或对老年受试者)施用时，组合物引发对RSV特异性的免疫应答而不在与RSV接触后增强病毒疾病。有利地，组合物引发保护性免疫应答，其减轻或预防受RSV感染和/或减轻或预防受RSV感染后的病理学应答。典型地，免疫应答引发以生成Th1型细胞因子为特征的免疫应答，例如Th1型免疫应答。

术语

除非另有解释，本文所使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域普通技术人员的通常理解具有相同含义。分子生物学中的常见术语的定义可以参见Benjamin Lewin，Genes V，由Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(编)，The Encyclopedia of MolecularBiology，由Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；及RobertA.Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive DeskReference，由VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。

除非上下文另有明确指明，单数术语“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指物。类似地，除非上下文另有明确指明，词语“或”意图包括“和”。术语“多个/种”指两个/种或更多个/种。应当进一步理解的是，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，和所有分子量或分子质量值是近似的，并且为了描述而提供。另外，关于物质诸如抗原的浓度或水平给出的数值限制意图为近似的。如此，若指明浓度是至少(例如)200pg，则意图该浓度被理解为至少约(或“大约”或“～”)200pg。

虽然与本文中所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以在本公开内容的实践或测试中使用，下文描述了合适的方法和材料。术语“包含”意味着“包括”。如此，除非上下文另有要求，词语“包含”及其变化形式应当理解为暗示包括规定的化合物或组合物(例如核酸、多肽、抗原)或步骤，或者化合物或步骤的组，但是不排除任何其它化合物、组合物、步骤，或其组。缩写“例如”(e.g.)衍生自拉丁语exemplify gratia，并且在本文中用于指明非限制性例子。如此，缩写“例如”(e.g.)与术语“例如”(for example)是同义的。

为了便于审阅本公开内容的各个实施方案，提供了术语的下列解释。可以在本公开内容的语境中提供别的术语和解释。

呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)、肺病毒亚科(Pneumovirinae)、肺病毒属(Pneumovirus)的一种病原性病毒。RSV的基因组是长15,222个核苷酸、单链、负义RNA分子，其编码11种蛋白质。RNA基因组与病毒N蛋白的紧密联合形成包在病毒包膜内部的核壳。基于G糖蛋白的抗原性差异，已经描述了两组人RSV株，即A和B组。迄今已经分离出多种RSV株。在图4和图5中通过GenBank和/或EMBL登录号指明例示性毒株。别的RSV株可能会得到分离，并且涵盖在RSV属内。类似地，RSV属涵盖通过遗传漂变、或人工合成和/或重组，源于天然存在的变体(例如以前或以后鉴定的毒株)。

术语“F蛋白”或“融合蛋白”或“F蛋白多肽”或“融合蛋白多肽”指具有RSV融合蛋白多肽的整个或部分氨基酸序列的多肽或蛋白质。术语“G蛋白”或“G蛋白多肽”指具有RSV附着蛋白多肽的整个或部分氨基酸序列的多肽或蛋白质。已经描述了许多RSV融合和附着蛋白，并且是本领域技术人员已知的。

为了便于理解本公开内容，在提及RSV F和/或G蛋白的氨基酸残基位置时，所有氨基酸残基位置相对于(即氨基酸残基位置对应于)例示性F蛋白SEQ ID NO：2的氨基酸位置和例示性G蛋白SEQ ID NO：4的氨基酸位置给出。然而，可以使用来自任何RSV A或B株的可比氨基酸。本领域普通技术人员可以通过使用容易地可获得且公知的比对算法(诸如BLAST，例如使用缺省参数)来比对选定RSV株的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列，从而容易地确定任何其它RSV A或B株的可比氨基酸位置。WO2008114149中提供了来自许多毒株的例示性F和G蛋白序列，其中任一种可以在本文中所公开的嵌合FG蛋白的背景中采用。为了公开适合于在嵌合G蛋白中使用的RSV F和G蛋白的序列，通过提及而将WO2008114149收入本文。

“嵌合FG多肽”或“FG抗原”或“FG多肽抗原”是掺入多肽构件(通常包括RSV F蛋白和RSV G蛋白两者的抗原决定簇或表位)的嵌合多肽。在本公开内容的背景中，嵌合FG多肽以N端至C端取向包含：包含与F1域不可切割地连接的F2域的第一氨基酸序列和包含RSV G蛋白中含有免疫学优势表位的部分的第二氨基酸序列。术语亚基和域在提及F蛋白和/或F0多肽的结构域时可互换使用。此背景中的术语嵌合的包括F和G蛋白构件都来自同一血清型或毒株的多肽及单独的F和G蛋白构件来自不同血清型或毒株的多肽。

“变体”在提及核酸或蛋白质(例如RSV F或G蛋白或蛋白质域，或FG嵌合多肽)时指与参照核酸或蛋白质不同的核酸或多肽。通常，变体与参照核酸或蛋白质之间的差异构成与参照物相比小比例数目的差异。此类差异可以是氨基酸添加、删除或替代。如此，变体通常相差不超过约1％、或2％、或5％、或10％、或15％、或20％的核苷酸或氨基酸残基。如此，RSV F或G蛋白，或嵌合FG多肽背景中的变体通常与参照蛋白(例如SEQ ID NO：2和4中显示的参照序列，或本文中所公开的任何例示性FG多肽)共享至少80％、或85％，更常见地，至少约90％或更多，诸如95％，或甚至98％或99％序列同一性。作为本公开内容特征包括的别的变体是如下的嵌合FG多肽，其掺入来自例如WO2008114149(同一或不同毒株)中提供的任何例示性序列的F2(例如包含所有或部分的氨基酸24-105，其通过与SEQ ID NO：2比对用数字指明)和/或F1构件(例如包含所有或部分的氨基酸137-528，其通过与SEQ ID NO：2比对用数字指明)和选自例如WO2008114149中提供的任何例示性序列的G蛋白构件(例如所有或部分的氨基酸149-229，其通过与SEQ ID NO：4比对用数字指明)。变体可以经由遗传漂变生成，或者可以使用定点或随机诱变，或者通过重组两种或更多种先前存在的变体来人工生成。例如，与SEQ IDNO：11和13的例示性FG嵌合物相比，变体FG多肽可以包含1、或2、或5或10、或15、或50处氨基酸差异，或者与例如SEQ ID NO：10和12的例示性FG嵌合核酸相比包含多至约100处核苷酸差异。

多肽或蛋白质的“域”或“结构域”指多肽或蛋白质内结构限定的元件。在本公开内容的背景中，“弗林蛋白酶切割域”是通过弗林蛋白酶蛋白酶切割前体多肽限定的域。例如，F蛋白合成为称作F0的单条多肽。随后，通过弗林蛋白酶蛋白酶在两个共有弗林蛋白酶识别基序处切割F0多肽以生成称作F2和F1的两个结构独立的多肽单元。F2从氨基酸24(信号肽后)延伸至第一(以N至C端方向)弗林蛋白酶切割识别位点。F1从第二弗林蛋白酶切割位点延伸至F0多肽的C端末端。在本公开内容的背景中，也使用术语F1来指F0多肽中包含F1域的胞外部分(例如氨基酸137-528)的部分。

术语“天然的”和“天然存在的”指以与其在自然界中相同状态存在的元件，诸如蛋白质、多肽或核酸。也就是说，该元件没有进行过人工修饰。应当理解的是，在本公开内容的语境中，RSV蛋白或多肽有许多天然的/天然存在的变体，例如自不同的天然存在的RSV株或隔离群获得的。

术语“多肽”指其中单体是经由酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。如本文中所使用的，术语“多肽”或“蛋白质”意图涵盖任何氨基酸序列，而且包括经修饰的序列诸如糖蛋白。术语“多肽”明确意图涵盖天然存在蛋白质，以及重组或合成生成的蛋白质。术语“片段”提到多肽时指多肽的一部分(即亚序列)。术语“免疫原性片段”指多肽的保留全长参照蛋白质或多肽的至少一个优势免疫原性表位的所有片段。多肽内的取向一般以N端至C端方向叙述，由各个氨基酸的氨基和羧基模块的取向限定。多肽从N或氨基端朝向C或羧基端翻译。

“信号肽”是一种短的氨基酸序列(例如长度为约18-25个氨基酸)，其将新合成的分泌性蛋白质或膜蛋白引导至膜及穿过膜，例如内质网的。信号肽常常但不普遍位于多肽的N端，并且常常在蛋白质穿过膜后被信号肽酶切去。信号序列通常含有三种常见的结构特征：N端极性碱性区(n区)、疏水性核心、和亲水性c区。

术语“多核苷酸”和“核酸序列”指长度为至少10个碱基的核苷酸聚合形式。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或任一核苷酸的经修饰形式。该术语包括单一和双重形式DNA。“分离的多核苷酸”指与衍生它的生物体的天然存在基因组中与它紧密相邻的两条编码序列(一个在5’端上，而一个在3’端上)均不紧密相邻的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸编码多肽。核酸的5’和3’方向通过参照各个核苷酸单元的连接性来限定，并依照脱氧核糖(或核糖)糖环的碳位置来指派。以5’至3’方向阅读多核苷酸序列的信息(编码)内容。

“重组”核酸指具有非天然存在序列或者具有通过人工组合两个在其它情况中分开的序列区段生成的序列的核酸。可以通过化学合成或者，更常见地，通过人工操作分离的核酸区段，例如通过遗传工程技术来实现此人工组合。“重组”蛋白指由已经导入宿主细胞诸如细菌或真核细胞中的异源(例如重组)核酸编码的蛋白质。可以在具有能够表达由所导入核酸编码的蛋白质的信号的表达载体上导入核酸，或者可以将核酸整合入宿主细胞染色体中。

术语“纯化”(例如就病原体或含有病原体的组合物而言)指自组合物除去其存在不是想要的成分的方法。纯化是一个相对术语，并且不要求从组合物除去不想要的成分的所有痕迹。在疫苗生产的语境中，纯化包括诸如离心、透析、离子交换层析、和大小排阻层析、亲和纯化或沉淀等工艺。如此，术语“纯化的”并不要求绝对纯度；相反，其意图为一个相对术语。如此，例如纯化的核酸制备物是指定蛋白质比该核酸在其生成环境中(例如在细胞内或在生化反应室中)得到更多富集的核酸制备物。可以纯化基本上纯的核酸或蛋白质的制备物，使得想要的核酸占制备物总核酸含量的至少50％。在某些实施方案中，基本上纯的核酸会占制备物总核酸或蛋白质含量的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％或更多。

“分离的”生物学成分(诸如核酸分子、蛋白质或细胞器)已经与该成分天然存在的生物体的细胞中的其它生物学成分，诸如其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器基本上分开或已经基本上纯化除去与该成分天然存在的生物体的细胞中的其它生物学成分，诸如其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已经“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸和蛋白质。

“抗原”指能在动物中刺激抗体生成和/或T细胞应答的化合物、组合物、或物质，包括注射、吸附、或别的方式导入动物中的组合物。术语“抗原”包括所有相关抗原性表位。术语“表位”或“抗原决定簇”指抗原上由B和/或T细胞应答的位点。“免疫学优势”表位指针对其产生功能上显著的宿主免疫应答(例如抗体应答或T细胞应答)的那些表位。如此，关于针对病原体的保护性免疫应答，免疫学优势表位指在被宿主免疫系统识别时产生保护免于由该病原体引起的疾病的那些抗原性模块。术语“T细胞表位”指在与合适的MHC分子结合时被T细胞特异性结合(经由T细胞受体)的表位。“B细胞表位”指被抗体(或B细胞受体分子)特异性结合的表位。

“佐剂”指以非特异性方式增强免疫应答产生的药剂。常见的佐剂包括将抗原吸附至其上的矿物(明矾、氢氧化铝、磷酸铝)的悬液液；乳剂，包括油包水、和水包油(及其变体，包括双重乳剂和可逆乳剂)、脂糖、脂多糖、免疫刺激性核酸(诸如CpG寡核苷酸)、脂质体、Toll受体激动剂(特别是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激动剂)，和此类成分的各种组合。

“免疫原性组合物”指适合于对人或动物受试者施用的物质组合物，其能够引发特异性免疫应答，例如针对病原体诸如RSV。因此，免疫原性组合物包含一种或多种抗原(例如多肽抗原)或抗原性表位。免疫原性组合物还可以包含一种或多种能够引发或增强免疫应答的别的成分，诸如赋形剂、载体、和/或佐剂。在某些例子中，施用免疫原性组合物来引发保护受试者免于由病原体诱导的症状或状况的免疫应答。在一些情况中，在受试者被暴露于病原体后通过抑制病原体(例如RSV)的复制来预防(或减轻或改善)由病原体引起的症状或疾病。在本公开内容的语境中，术语免疫原性组合物应当理解成涵盖意图用于对受试者或受试者群体施用以引发针对RSV的保护性或姑息性免疫应答的组合物(即疫苗组合物或疫苗)。

“免疫应答”指免疫系统细胞诸如B细胞、T细胞、或单核细胞对刺激的应答。免疫应答可以是B细胞应答，其导致特异性抗体诸如抗原特异性中和性抗体的生成。免疫应答也可以是T细胞应答，诸如CD4+应答或CD8+应答。在一些情况中，应答对特定抗原是特异性的(即“抗原特异性应答”)。若抗原衍生自病原体，则抗原特异性应答是“病原体特异性应答”。“保护性免疫应答”指抑制病原体的有害功能或活性、减轻病原体感染、或减轻源于病原体感染的症状(包括死亡)的免疫应答。可以例如通过在噬斑减少测定法或ELISA中和测定法中抑制病毒复制或噬斑形成，或者通过在体内测量对病原体攻击的抗性来测量保护性免疫应答。

“Th1”型免疫应答的特征在于生成IL-2和IFN-γ的CD4+T辅助细胞。比较而言，“Th2”型免疫应答的特征在于生成IL-4、IL-5、和IL-13的CD4+辅助细胞。

“免疫学有效量”是用于引发受试者中的免疫应答的组合物(典型地，免疫原性组合物)数量。通常，想要的结果是产生抗原(例如病原体)特异性免疫应答，其能够或促成针对病原体保护受试者。然而，为了获得针对病原体的保护性免疫应答，可需要免疫原性组合物的多次施用。如此，在本公开内容的语境中，术语免疫学有效量涵盖与先前或随后施用联合促成获得保护性免疫应答的分数剂量。

形容词“药学可接受的”指明主题物适合于对受试者(例如人或动物受试者)施用。Remington’s Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin，MackPublishing Co.，Easton，PA，第15版(1975)描述了适合于治疗性和/或预防性组合物(包括免疫原性组合物)的药学投递的组合物和配制剂(包括稀释剂)。

术语“调控”提到应答诸如免疫应答时指改变或变更应答的开始、幅度、持续时间或特征。调控免疫应答的药剂在其施用后改变免疫应答的开始、幅度、持续时间或特征中至少一项，或者与参照药剂相比改变开始、幅度、持续时间或特征中至少一项。

术语“减轻”是一个相对术语，从而若应答或状况在施用药剂后得到定量减弱，或者若与参照药剂相比，它在施用药剂后得到减弱，则所述药剂减轻应答或状况。类似地，术语“预防”不必然意味着药剂完全消除应答或状况，只要应答或状况的至少一项特征得到消除。如此，减轻或预防感染或应答诸如病理学应答(例如疫苗增强性病毒疾病)的免疫原性组合物可以但不必然完全消除此类感染或应答，只要所述感染或应答可测量地减弱例如至少约50％，诸如至少约70％，或约80％，或甚至约90％(即减弱至10％或更小)的感染或应答(在没有药剂的情况中，或者与参照药剂相比)。

“受试者”指活的多细胞脊椎动物生物体。在本公开内容的语境中，受试者可以是实验受试者，诸如非人动物，例如小鼠、棉鼠、或非人灵长类。或者，受试者可以是人受试者。

FG嵌合RSV抗原

RSV的病毒包膜包括病毒编码的F、G和SH糖蛋白。F和G糖蛋白是RSV病毒体的仅有的两种已知诱导RSV特异性中和性抗体的成分。设计本文中所公开的嵌合FG多肽以掺入天然F蛋白的结构特征，而同时展现出RSV G蛋白的重要免疫优势表位。

RSV的天然F蛋白被翻译为单条多肽前体，称作F0。F0折叠，并受到蛋白水解和其它翻译后修饰。首先，信号肽(Sp)将新生多肽的翻译靶向至内质网(ER)，随后被信号肽酶切割。然后初生多肽在RE中在3个位点处，即在例示性F多肽序列SEQ ID NO：2的氨基酸位置27、70和500处进行N-糖基化。通过弗林蛋白酶切割来生成F2和F1，并将它们一起折叠为异二聚体的三聚体(3x F2-F1)。弗林蛋白酶是一种钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，其能在配对的碱性氨基酸加工位点处有效地切割前体蛋白质。典型地，此类加工位点包括碱性氨基酸靶序列(规范地，Arg-X-(Arg/Lys)-Arg’)。RSV F蛋白在位置106-109和133-136处包含两个弗林蛋白酶识别位点。弗林蛋白酶蛋白酶在两个保守的弗林蛋白酶共有序列，即RAR/KR109(FCS-2)和KKRKRR136(FCS-1)处对天然存在的成熟F0多肽的蛋白水解切割导致生成三个蛋白水解片段。在其N端具有疏水性融合肽的大的膜锚定亚基F1(对应于氨基酸137-574)经由二硫化物桥连接至小亚基F2(对应于氨基酸24-105)，并释放最初位于两个切割位点之间的由27个氨基酸构成的小肽(pep27)。本领域技术人员会认可，缩写F0、F1和F2在科学文献中通常称作F0、F1和F2。对RSV F蛋白的弗林蛋白酶加工的描述以及本领域公认的术语的定义可参见Zimmer等“Proteolyticactivation of Respiratiory Syncytical Virus fusion protein.”J.Biol.Chem.276：31642-31650，2001，及Zimmer等，“Cleavage at the furin consensussequence RAR/KR109 and presence of the intervening peptide of theRespiratiory Syncytical Virus fusion protein are dispensable for virus replicationin cell culture.”J.Virol.76：9218-9224，2002。蛋白质使用在C端区中由白色菱形标示的其跨膜螺旋(TM)锚定至膜。另外，RSV F蛋白特征为15个半胱氨酸残基、4个已表征的中和性表位、2个卷曲螺旋区和1个脂质化基序。

天然G蛋白是通过其跨膜疏水区(氨基酸41-63)锚定至病毒体膜的298个氨基酸的蛋白质。氨基酸65-298包括G蛋白中在RSV的表面上暴露的部分。高度O-糖基化的粘蛋白样区存在于每个末端。5个N-糖基化基序也存在于这两个区域中。未糖基化的中部包括数种重要的结构基序，包括：1)半胱氨酸套索(aa173-190)，其是唯一可获得结构数据的G部分；2)在aa183-203处的免疫优势MHC II类表位；和3)趋化因子Fractalkine受体(C3XCR)和糖胺聚糖(GAG)结合基序，其牵涉宿主细胞表面上病毒附着的过程。

本公开内容关注嵌合RSV多肽，其以N端至C端取向包含：(i)第一氨基酸序列，其包含与RSV F蛋白的F1域连接的F2域和(ii)第二氨基酸序列，其包含RSV G蛋白的一部分。为了便于生成过程中的折叠和装配，修饰天然F蛋白序列以消除内部弗林蛋白酶识别位点，并阻止弗林蛋白酶切割。可以通过在氨基酸残基106-109和/或133-136的区域中添加、删除或替代一个或多个氨基酸来破坏弗林蛋白酶切割位点。例如，可以通过删除一个或两个氨基酸(例如第106位和第107位的精氨酸和丙氨酸，和第133位和第134位的精氨酸和赖氨酸)破坏弗林蛋白酶切割位点来消除弗林蛋白酶识别位点。如此，表达并装配后，嵌合多肽的F2和F1部分在单一不可切割的多肽单元中保留。

在选择F蛋白的F2和F1域时，本领域技术人员会认可，包含整个F2和/或F1域不是严格必要的。典型地，构象考虑在选择F2域的亚序列(或片段)时是重要的。如此，F2域通常包含F2域中促进嵌合多肽装配和稳定性的部分。在某些例示性的变体中，F2域包含氨基酸24-105。任选地，F2域可以包含天然F0多肽的信号肽(例如氨基酸1-23)。

典型地，至少选择F1域的亚序列(或片段)，并将其设计成维持包含F蛋白的免疫优势表位的稳定构象。例如，一般想要选择F1多肽域中包含氨基酸262-275(帕利珠单抗(palivizumab)中和)和423-436(Centocor的ch101F单抗)的区域中由中和性抗体识别的表位的亚序列。另外，想要包含T细胞表位，例如在氨基酸328-355的区域中。最常见地，作为F1亚基的单一连续部分(例如跨越氨基酸262-436)，但是表位可以在包含作为以稳定构象装配的不连续元件的这些免疫优势表位的合成序列中得到保留。如此，F1域多肽至少包含RSV F蛋白多肽的约氨基酸262-436。在本文提供的一个非限制性例子中，F1域包含天然F蛋白多肽的氨基酸137至528(虽然可以采用稍微小些的片段，例如开始于氨基酸残基151或氨基酸161，或终止于第524位的片段)。本领域技术人员会认可，别的更短的亚序列可以任凭从业人员使用。

为了便于折叠和装配，并使构象性表位的保留最大化，在两个F蛋白域之间引入氨基酸接头。本领域技术人员知道具有不同长度和结构属性的多种接头。在本文中所公开的嵌合RSV多肽的背景中，可以采用许多此类接头。例如，有利地采用简单富含甘氨酸的重复序列作为接头，如称作V1-1和V1-2的实施方案中所显示的。在FG V1-1中，采用简单甘氨酸和丝氨酸重复序列作为接头。变体FG V1-2包含甘氨酸/丝氨酸接头，其进行改编以包含糖基化位点。分别在SEQ ID NO：5和6中提供了具体的例示性甘氨酸/丝氨酸接头序列。或者，可以采用具有更复杂的结构属性的接头。在某些实施方案中，接头选自天然F蛋白。例如，在某些有利的实施方案中，接头在序列上对应于整个或部分的pep27序列，如由称作V2-1和V2-2的实施方案所显示的。在采用此类接头的情况中，它在长度上可以有所变化，例如以修饰结构或功能特征诸如糖基化。SEQ ID NO：7和8中提供了基于pep27的接头的两种例示性型式。

选择G蛋白多肽构件以包含G蛋白中保留免疫学优势或免疫优势T细胞表位(例如在氨基酸183-197的区域中)的部分(或亚序列或片段)。例示性变体包括例如G蛋白中包含氨基酸152、151、150、149、148等至氨基酸226、227、228、229、230等的亚序列或片段。任选地，可以用天然G蛋白的较大的片段(诸如包含氨基酸残基128-229或130-230的片段)替换。本领域技术人员会容易地领会，也可以使用更长或更短的G蛋白部分，只要选定的部分不在构象上使嵌合FG多肽不稳定或破坏嵌合FG多肽的表达、折叠或加工。任选地，G蛋白域包含第191位的氨基酸替代，先前已经将其与减轻和/或预防以与福尔马林灭活的RSV疫苗有关的嗜酸粒细胞增多为特征的增强性疾病联系起来。天然存在的和替代的(N191A)G蛋白的属性的全面描述可以参见例如美国专利公开文本No.2005/0042230，通过提及而将其收入本文用于所有目的。

若如此需要的话，可以使用本领域中已知的锚基序或其它方法诸如神经网络或多项式确定来鉴定别的T细胞表位，参见例如RANKPEP(在万维网上于：mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html可获得)；ProPredI(在万维网上于：imtech.res.in/raghava/propredI/index.html可获得)；Bimas(在万维网上于：www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.html可获得)；和SYFPEITH(在万维网上于：syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm可获得)。例如，使用算法来测定肽的“结合阈”，并选择那些具有给予它们MHC或抗体以某种亲和力结合的高概率的得分的。算法或是基于对MHC结合特定位置处的特定氨基酸的影响、对抗体结合特定位置处的特定氨基酸的影响、或是对结合含有基序的肽中的特定替代的影响。在免疫原性肽的背景内，“保守残基”指在肽中特定位置处以比通过随机分布会预期的频率显著更高的频率出现的残基。锚残基是保守残基，其提供与MHC分子的接触点。由此类预测方法鉴定出的T细胞表位可以通过测量它们对特定MHC蛋白的结合及通过其在MHC蛋白的背景中呈递时刺激T细胞的能力来确认。

虽然SEQ ID NO：11和13中列出了例示性的实施方案，但是本领域普通技术人员无需过度实验就可以产生许多其它实施方案。对本领域技术人员会显而易见的是，可以在重组嵌合RSV FG多肽的构建中采用任何RSV F和/或G蛋白序列。F蛋白(其负责融合病毒包膜与靶细胞膜)的序列在RSV隔离群间是高度保守的。比较而言，G蛋白(其负责病毒附着)的序列是相对可变的。WO2008114149中提供了RSV F和G蛋白序列的比对，其显示了不同蛋白质之间的同一性和变异。从这些比对看，保守的和可变的区域是容易显而易见的。

例如，在一个实施方案中，F2域(例如对应于参照F蛋白序列的氨基酸24-105)通过选自SEQ ID NO：5、6、7、或8之任一项的接头与F1域(例如对应于参照F蛋白序列的氨基酸137-528)不可切割地连接，并以符合读码框的方式与包含由G蛋白的氨基酸183-203提供的免疫优势表位的G蛋白域(例如大致与第149位对应的氨基酸至大致与参照F蛋白序列的第229位对应的氨基酸，例如第148位、第149位、第150位、第151位或第152位至第226位、第227位、第228位、第229位或第230位)连接。F2和F1域可以选自同一F蛋白多肽，诸如选自天然存在的F蛋白诸如SEQ ID NO：2的天然存在F蛋白的F蛋白多肽，或其它例示性F蛋白多肽(例如那些披露于WO2008114149中的)之任一种。或者，F2和F1域可以选自不同天然存在的F蛋白多肽。或者，可以修饰F2和F1域之一或两者，如本文中关于变体的讨论中更为详细地指明的。类似地，G蛋白域可以选自SEQ ID NO：4或WO2008114149中所披露的任何变体。

其它例示性的实施方案是具有一个或多个氨基酸的删除的变体。在想要较短片段的情况中，仍然选择如下的部分，其保留嵌合多肽的构件的结构和免疫学上重要的特征，如本文中所描述的。或者，变体可以包含额外的氨基酸。例如，变体可以包含便于纯化的额外的氨基酸(例如多组氨酸标签)。

另外/或者，可以对任何所公开的嵌合FG多肽进行修饰以在选定的表达系统中生成时提高嵌合多肽的表达和稳定性。例如，真核构建体通常设计为包含与表达系统对应的信号肽，例如在哺乳动物细胞中表达嵌合多肽时，有利地选择哺乳动物或病毒信号肽诸如RSV F0天然信号序列。或者，可以用信号肽(诸如杆状病毒信号肽，或蜂毒肽信号肽)替代以在昆虫细胞中表达。合适的植物信号肽是本领域中已知的，若植物表达系统是优选的话。适合于在本文中所公开的嵌合FG多肽的背景中使用的例示性信号肽包括下列各项的信号肽：组织纤溶酶原激活物(tPA)、单纯疱疹病毒(HSV)gD蛋白、人内皮抑制素、HIV gp120、CD33、巨细胞病毒gB蛋白、人Her2Neu、埃巴病毒(EBV)gp350、和Tan等，Protein Eng.15：337-45的SS。

在某些实施方案中，修饰嵌合FG多肽以改变糖基化样式或状态(例如通过提高或降低天然F蛋白多肽中存在的一个或多个糖基化位点处糖基化的分子的比例)。例如，预测SEQ ID NO：2的天然F蛋白多肽在氨基酸位置27、70和500处被糖基化。在一个实施方案中，在氨基酸位置500处的糖基化位点附近引入修饰。例如，可以通过用诸如谷氨酰胺(Q)的氨基酸替换与参照F蛋白序列(SEQ ID NO：2)的第500位对应的位置处的天冬酰胺来除去糖基化位点。有利地，引入提高此糖基化位点处的糖基化效率的修饰。合适的修饰的例子包括第500位-第502位的下列氨基酸序列：NGS；NKS；NGT；NKT。导致糖基化升高的对此糖基化位点的修饰还可以导致实质性升高的蛋白质生成。

编码嵌合FG多肽抗原的核酸

本公开内容的另一方面关注重组核酸，其编码上文所描述的嵌合FG多肽。重组核酸以5’至3’方向包含(1)至少编码RSV F蛋白多肽弗林蛋白酶切割域2(F2域)的一部分或片段的多核苷酸序列；(2)编码氨基酸接头的多核苷酸序列；(3)至少编码RSV F蛋白多肽弗林蛋白酶切割域1(F1域)的一部分或片段的多核苷酸序列；和(4)至少编码RSV G蛋白多肽的一部分或片段的多核苷酸序列。连接构件多核苷酸序列以使编码的多肽区段在如上文所公开的单条连续嵌合多肽中生成。

在某些实施方案中，重组核酸编码嵌合FG多肽，其中F2域(例如对应于参照F蛋白序列的氨基酸24-105)通过选自SEQ ID NO：5、6、7、或8之任一项的接头与F1域(例如对应于参照F蛋白序列的氨基酸137-528)不可切割地连接，并以符合读码框的方式与包含由G蛋白的氨基酸183-203提供的免疫优势表位的G蛋白域(例如大致与第149位对应的氨基酸至大致与参照F蛋白序列的第229位对应的氨基酸，例如第148位、第149位、第150位、第151位或第152位至第226位、第227位、第228位、第229位或第230位)连接。编码F2和F1域的多核苷酸可以选自同一F蛋白多肽，诸如选自天然存在的F蛋白诸如SEQ ID NO：2的天然存在的F蛋白(例如SEQ ID NO：1)的F蛋白多肽，或编码其它例示性F蛋白多肽(例如那些披露于WO2008114149中的)之任一种的。或者，可以选择F2和F1域以编码不同天然存在的F蛋白多肽。或者，编码F2和F1域之一或两者的多核苷酸可以包含一处或多处突变(例如核苷酸添加、删除或替代)以修饰多肽，如本文中关于变体的讨论中更为详细地指明的(例如以修饰第27位、第70位和/或第500位的糖基化位点)。类似地，编码G蛋白域的多核苷酸可以选自SEQ ID NO：4或WO2008114149中所披露的任何变体。

在某些实施方案中，对重组核酸进行密码子优化以在选定的原核或真核宿主细胞诸如哺乳动物、植物或昆虫细胞中表达。为了便于复制和表达，可以将核酸掺入载体诸如原核或真核表达载体中。虽然本文所公开的核酸可以包含在许多载体(包括例如细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；自质粒和噬菌体DNA、病毒DNA诸如牛痘、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病、腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒等的组合衍生的载体)之任一种中，但是最常见地，载体会是适合于生成多肽表达产物的表达载体。在表达载体中，编码FG嵌合物的核酸通常以对于合适的转录控制序列(启动子，和任选地，一种或多种增强子)的接近和取向排列以指导mRNA合成。也就是说，感兴趣的多核苷酸序列可操作连接至合适的转录控制序列。此类启动子的例子包括：CMV的立即早期启动子、LTR或SV40启动子、杆状病毒的多角体启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体T7和λP_L启动子、和已知在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的其它启动子。表达载体通常还含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。任选地，载体包含适合于扩增表达的序列。另外，任选地，表达载体包含一种或多种选择标志基因以提供供选择经转化的宿主细胞用的表型性状，诸如供真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者诸如大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。

表达载体还可以包含别的表达元件，例如以改善翻译的效率。这些信号可以包含例如ATG起始密码子和相邻序列。在一些情况中，例如与感兴趣的多核苷酸序列(例如天然的起始密码子)同时将翻译起始密码子和相关序列元件插入合适的表达载体中。在此类情况中，不需要别的翻译控制信号。然而，在仅插入多肽编码序列或其部分的情况中，提供外源翻译控制信号(包括ATG起始密码子)来表达嵌合FG序列。以正确读码框的方式放置起始密码子以确保翻译感兴趣的多核苷酸序列。外源转录元件和起始密码子可以是多种起源的(天然的和合成的两者)。

若想要的话，可以通过包含适合于使用中的细胞系统的增强子来进一步提高表达效率(Scharf等(1994)Results Probl Cell Differ 20：125-62；Bitter等(1987)Methods in Enzymol 153：516-544)。在一些例子中，编码FG多肽的核酸(诸如载体)包含为了在导入宿主细胞中时提高和/或优化FG编码核酸的表达而选择的一种或多种别的序列元件。一类表达增强序列包括外遗传元件诸如基质附着区(或MAR)，或类似的外遗传元件，例如STAR元件(例如诸如Otte等，Biotechnol.Prog.23：801-807，2007中披露的那些STAR元件)。不限于理论，认为MAR介导靶DNA序列锚定至细胞核基质，产生染色质环域，其自异染色质核心向外延伸。虽然MAR不含任何明显的共有或可识别序列，但是它们最一致的特征表现为总体上高的A/T含量，和另一条链上占优势的C碱基。这些区域表现为形成弯曲的二级结构，其可能倾向于链分开，而且可以包含能充当链分开的成核点的核心解旋元件(CUE)。已经将数个简单的富含AT的序列基序与MAR序列联系起来：例如A框(AATAAAYAAA)、T框(TTWTWTTWTT)、DNA解链基序(AATATATT，AATATT)、SATB1结合位点(H框，A/T/C25)和脊椎动物(RNYNNCNNGYNGKTNYNY)或果蝇属(Drosophila)(GTNWAYATTNATNNR)的共有拓扑异构酶II位点。例示性MAR序列记载于已公布的美国专利申请No.20070178469和国际专利申请No.WO02/074969(通过提及而将其收入本文)。可以用于增强编码FG多肽的核酸表达的别的MAR序列包括鸡溶菌酶MAR、MARp1-42、MARp1-6、MARp1-68、和MARpx-29，其记载于Girod等，Nature Methods，4：747-753，2007(分别以GenBank登录号EA423306、DI107030、DI106196、DI107561、和DI106512披露)。技术人员会领会，可以通过选择产生中间水平增强的MAR(如关于MAR 1-9报告的)来进一步调控表达。若想要的话，可以通过搜索序列数据库，例如使用诸如MAR-Finder(在网络上于futuresoft.org/MarFinder可获得)、SMARTest(在网络上于genomatix.de可获得)、或SMARScan I(Levitsky等，Bioinformatics 15：582-592，1999)等软件来鉴定用于提高FG多肽表达的备选MAR序列。在某些实施方案中，在与FG多肽编码序列相同的核酸(例如载体)上将MAR导入(例如转染)宿主细胞中。在一个备选的实施方案中，在不同的核酸上(例如反式)将MAR导入，并且任选地，它可以与FG核酸共整合。

足以指导本领域普通技术人员完成重组FG核酸生成的例示性规程可以参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989；Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，2001；Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，1992(和至2003年的增补)；及Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendiumof Methods from Current Protocols in Molecular Biology，第4版，Wiley & Sons，1999。

编码嵌合FG多肽的例示性核酸以SEQ ID NO：10和12表示。可以通过装配选自任何已知的(或随后)发现的RSV株的类似的F2、F1和G蛋白多肽序列来生成别的变体，例如如图4和图5中所显示的。本领域技术人员可以生成与例示性变体共享序列同一性的别的序列变体。典型地，核酸变体会编码相差不超过1％、或2％、或5％、或10％、或15％、或20％的核苷酸或氨基酸残基的多肽。也就是说，编码的多肽共享至少80％、或85％、更常见地，至少约90％或更多，诸如95％，或者甚至98％或99％序列同一性。本领域技术人员会立即理解的是，编码FG多肽的多核苷酸序列本身可以由于遗传密码冗余而共享较少的序列同一性。

本领域技术人员会理解，嵌合FG多肽和多核苷酸序列间的相似性一般就多肽和多核苷酸序列而言可以按照序列间的相似性(在其它情况中称为序列同一性)表示。序列同一性常常按照百分比同一性(或相似性)测量；百分比越高，两种序列的一级结构越相似。一般而言，两种氨基酸(或多核苷酸)序列的一级结构越相似，源于折叠和装配的更高级结构越相似。嵌合FG多肽和多核苷酸序列的变体可以具有一处或少量氨基酸删除、添加或替代，但是仍然会共享非常高百分比的其氨基酸，和一般地其多核苷酸序列。

测定序列同一性的方法是本领域中公知的。多种程序和比对算法记载于Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970；Higgins和Sharp，Gene 73：237，1988；Higgins和Sharp，CABIOS 5：151，1989；Corpet等，Nucleic Acids Research 16：10881，1988；及Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988。Altschul等，NatureGenet.6：119，1994呈现了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。NCBI基本的局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403，1990)可获自数个来源，包括(美国)国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI，Bethesda，MD)及在因特网上，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx组合使用。如何使用此程序来测定序列同一性的描述在因特网上NCBI网站上可获得。

两种核酸间的序列相似性的另一项指示是杂交能力。两种核酸的序列越相似，它们会杂交的条件越严格。杂交条件的严格性是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。如此，产生特定程度的严格性的杂交条件会随选择的杂交方法的性质和杂交的核酸序列的组成和长度而变化。一般而言，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na⁺和/或Mg⁺⁺浓度)会决定杂交的严格性，虽然清洗时间也影响严格性。一般而言，严格条件选择为比特定序列在规定离子强度和pH的热解链温度(T_m)低约5℃至20℃。T_m是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。用于核酸杂交的条件和严格性的计算可以参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；Tijssen，Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part I：Theory andNucleic Acid Preparation，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，Elsevier Science Ltd.，NY，NY，1993；及Ausubel等，Short Protocols inMolecular Biology，第4版，John Wiley & Sons，Inc.，1999。

出于本公开内容的目的，“严格条件”涵盖杂交仅会在杂交分子与靶序列之间有小于25％的错配时发生的条件。为了更精确的定义，“严格条件”可以分成特定的严格性水平。如此，如本文中所使用的，“中等严格性”条件指具有超过25％序列错配的分子不会杂交的条件；“中度严格性”条件指错配超过15％的分子不会杂交的条件，而“高严格性”条件指错配超过10％的序列不会杂交的条件。“非常高的严格性”条件指错配超过6％的序列不会杂交的条件。比较而言，在“低严格性条件”下杂交的核酸包括具有少得多的序列同一性，或仅在核酸的短的亚序列里具有序列同一性的核酸。因此，应当理解，由本公开内容所涵盖的核酸的各种变体能够在基本上其整个长度里与SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17、19、67或69的至少一项杂交。

生成嵌合RSV抗原性多肽的方法

使用用于表达和纯化重组蛋白的完善建立的规程来生成本文中所公开的嵌合FG多肽。足以指导本领域技术人员的规程可以参见例如上文所引用的Sambrook和Ausubel参考文献。下文提供了另外的和具体的详情。

通过许多公知的规程之任一种，诸如电穿孔、脂质体介导的转染、磷酸钙沉淀、感染、转染等(这取决于载体和宿主细胞的选择)来将编码上文所描述的任何嵌合FG RSV抗原的重组核酸诸如(但不限于)以SEQ ID NO：10和12表示的例示性核酸导入宿主细胞中。

如此，包含重组嵌合FG多肽编码核酸的宿主细胞也是本公开内容的特征。有利的宿主细胞包括原核(即细菌)宿主细胞诸如大肠杆菌，以及许多真核宿主细胞，包括真菌(例如酵母诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Picchia pastoris))细胞、昆虫细胞、植物细胞、和哺乳动物细胞(诸如CHO细胞)。将重组FG核酸导入(例如转导、转化或转染)宿主细胞中，例如经由载体诸如表达载体。如上文所描述的，载体最通常是质粒，但是此类载体也可以是例如病毒颗粒、噬菌体等。合适的表达宿主的例子包括：细菌细胞诸如大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)、和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；真菌细胞，诸如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；昆虫细胞诸如果蝇属和草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)；哺乳动物细胞诸如3T3、COS、CHO、BHK、HEK 293或Bowes黑素瘤；植物细胞，包括藻类细胞等。

可以在为了激活启动子、选择转化体、或者扩增所插入的多核苷酸序列而酌情修饰的常规营养培养基中培养宿主细胞。培养条件诸如温度、pH等通常是那些先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，而且对于本领域技术人员会是显而易见的，并且在本文所引用的参考文献中，包括例如Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第三版，Wiley-Liss，New York及其中所引用的参考文献。也可以在非动物细胞诸如植物、酵母、真菌、细菌等中生成与本发明的核酸对应的表达产物。在Sambrook，Berger和Ausubel外，关于细胞培养的详情可以参见Payne等(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc.New York，NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin HeidelbergNew York)及Atlas和Parks(编)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL。

在细菌系统中，可以根据所表达产物预期的用途来选择许多表达载体。例如，当需要大量多肽或其片段来生成抗体时，有利地采用指导容易纯化的融合蛋白高水平表达的载体。此类载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体诸如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中可以将感兴趣的编码序列(例如如上文所描述的本发明的多核苷酸)连接入载体中，符合氨基端翻译起始甲硫氨酸和随后β-半乳糖苷酶的7个残基的序列的读码框，生成有催化活性的β-半乳糖苷酶融合蛋白；pIN载体(Van Heeke和Schuster(1989)J Biol Chem264：5503-5509)；pET载体(Novagen，Madison WI)，其中将氨基端甲硫氨酸以符合读码框方式与组氨酸标签连接；等。

类似地，在酵母诸如酿酒酵母中，可以使用许多含有组成性或诱导型启动子诸如α因子、醇氧化酶和PGH的载体来生成想要的表达产物。关于综述，参见Berger、Ausubel、和例如Grant等(1987；Methods in Enzymology153：516-544)。在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多表达系统，包括质粒和基于病毒的系统两者。

任选地，对宿主细胞选择其调控插入序列的表达或以想要的方式加工所表达的蛋白质的能力。对蛋白质的此类修饰包括但不限于糖基化(以及例如乙酰化、羧基化、磷酸化、脂质化和酰化)。任选地，在宿主细胞的背景中实施翻译后加工，例如其将前体形式切割成蛋白质的成熟形式(例如通过弗林蛋白酶蛋白酶进行)。不同宿主细胞诸如3T3、COS、CHO、HeLa、BHK、MDCK、293、WI38等具有用于此类翻译后活性的特定细胞机器和特征性机制，而且可以选择为确保对所引入的外来蛋白质的正确修饰和加工。

为了长期、高产量生成由本文中所公开的核酸编码的重组嵌合FG多肽，通常使用稳定的表达系统。例如，使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标志基因的表达载体来将稳定表达嵌合FG多肽的细胞系引入宿主细胞中。导入载体后，容许细胞在滋养培养基中生长1-2天，之后将其转换至选择培养基。选择标志的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在容许成功表达所导入序列的细胞的生长和回收。例如，可以使用适合于细胞类型的组织培养技术来增殖稳定转化细胞的抗性组或集落。任选地，在适合于自细胞培养物表达和回收所编码蛋白质的条件下培养用编码嵌合FG多肽的核酸转化的宿主细胞。

转导合适的宿主细胞系并将宿主细胞培养至合适的细胞密度后，通过合适的手段(例如温度变动或化学诱导)来诱导选定的启动子，并将细胞再培养一段时间。然后自培养液回收所分泌的多肽产物。或者，可以通过离心来收获细胞，通过物理或化学手段来破坏细胞，并保留所得的粗制提取物用于进一步纯化。可以通过任何便利的方法来破坏蛋白质表达中所采用的真核或微生物细胞，包括冷冻-融化循环、超声处理、机械破坏、或者使用细胞裂解剂、或者其它方法，其对于本领域技术人员是公知的。

可以通过本领域公知的许多方法来从重组细胞培养物回收和纯化所表达的嵌合FG多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和层析(例如使用本文所记录的任何加标签系统)、羟磷灰石层析、和凝集素层析。根据需要，可以在完成成熟蛋白质的构造中使用蛋白质重折叠步骤。最后，可以在最终的纯化步骤中采用高效液相层析(HPLC)。在上文所记录的参考文献外，多种纯化方法是本领域公知的，包括例如下列文献列出的：Sandana(1997)Bioseparation of Proteins，Academic Press，Inc.；及Bollag等(1996)Protein Methods，第2版Wiley-Liss，NY；Walker(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press，NJ，Harris和Angal(1990)Protein Purification Applications：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，U.K.；Scopes(1993)Protein Purification： Principles and Practice第3版Springer Verlag，NY；Janson和Ryden(1998)Protein Purification：Principles，High Resolution Methods and Applications，二版Wiley-VCH，NY；及Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROMHumana Press，NJ。

在某些例子中，将核酸导入适合于在原核细胞(例如大肠杆菌细胞)中导入和表达的载体中。例如，可以将包含编码FG嵌合RSV抗原的多核苷酸序列的核酸导入多种商品化或专有载体诸如pET表达载体系列(例如pET19b和pET21d)之任一种中。IPTG可诱导编码序列的表达，产生高水平的蛋白质表达。在噬菌体T7启动子下转录编码嵌合RSV抗原的多核苷酸序列。备选的载体诸如包含热诱导型λpL启动子的pURV22也是合适的。

将表达载体导入(例如通过电穿孔)合适的细菌宿主中。许多合适的大肠杆菌菌株是可用的，并且可以由本领域技术人员进行选择(例如，已经证明了Rosetta和BL21(DE3)菌株对于表达含有编码FG嵌合RSV抗原的多核苷酸序列的重组载体是有利的)。

在另一个例子中，将编码嵌合FG多肽的多核苷酸克隆入适合于导入哺乳动物细胞(例如CHO细胞)中的载体中。在此例示性的实施方案中，将编码嵌合RSV抗原的多核苷酸序列导入由Lonza Biologicals公司开发的pEE14载体中。在组成性启动子，即立即早期CMV(巨细胞病毒)启动子下表达嵌合多肽。基于经转染的细胞在没有谷氨酰胺来源的情况中生长的能力来进行对表达嵌合物的经稳定转染的细胞的选择。已经成功整合pEE14的细胞能够在没有外源谷氨酰胺的情况中生长，因为pEE14载体表达GS(谷氨酰胺合成酶)酶。可以对选定的细胞进行克隆扩充，并表征嵌合多肽的表达。

在另一个例子中，使用杆状病毒表达载体系统(BEVS)来将编码FG嵌合RSV抗原的多核苷酸序列导入昆虫细胞中。可以使用商品化载体、试剂盒和/或系统，诸如来自BD BioScience的BD BaculoGold系统来生成能够感染昆虫细胞的重组杆状病毒。简言之，将编码FG嵌合RSV抗原的多核苷酸序列插入pAcSG2转移载体中。然后，通过pAcSG2嵌合物质粒和BD BaculoGold(含有杆状病毒苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的线性化基因组DNA)共转染宿主细胞SF9(草地夜蛾)。转染后，pACSG2质粒与杆状病毒基因组之间发生同源重组以生成重组病毒。在一个例子中，在多角体蛋白启动子(pH)的调节控制下表达嵌合RSV抗原。可以使用其它启动子诸如基本的(Ba)和p10启动子来生成类似的转移载体。类似地，可以采用备选的昆虫细胞，诸如与Sf9紧密相关的SF21，和自甘蓝尺蠖，即粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)衍生的HighFive(Hi5)细胞系。

转染和诱导表达(依照选定的启动子和/或增强子或其它调节元件)后，将所表达的嵌合多肽回收(例如纯化或富集)，并复性以确保折叠成抗原性活性构象。典型地，抗原性活性构象是嵌合FG多肽的多聚体。有利的是，多聚体是三聚体。

免疫原性组合物和方法

还提供了免疫原性组合物，其包含嵌合FG多肽和药学可接受稀释剂、载体或赋形剂。许多药学可接受稀释剂和载体和/或药学可接受赋形剂是本领域已知的，并且记载于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第15版(1975)。

一般而言，稀释剂、载体和/或赋形剂的性质会取决于所采用的具体施用模式。例如，胃肠外配制剂通常包含可注射流体，其包含药学和生理学可接受流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性右旋糖、甘油等作为媒介物。在某些配制剂(例如固体组合物，诸如粉末形式)中，不采用液体稀释剂。在此类配制剂中，可以使用无毒性固体载体，包括例如药用级的海藻糖、甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。

因而，本领域技术人员可以选择合适的赋形剂和载体以产生适合于通过选定的施用路径向受试者投递的配制剂。

上文在表1中给出了具体的例子。别的赋形剂包括但不限于：甘油、聚乙二醇(PEG)、玻璃形成多元醇(诸如山梨糖醇、海藻糖)、N-月桂酰肌氨酸(例如钠盐)、L-脯氨酸、非去污剂磺基甜菜碱、盐酸胍、脲、三甲胺氧化物、KCl、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺(和其它二价阳离子相关盐)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(Dithioerytrol)、β-巯基乙醇、去污剂(包括例如Tween80、Tween20、Triton X-100、NP-40、Empigen BB、辛基葡糖苷、月桂酰麦芽糖苷、Zwittergent 3-08、Zwittergent 3-10、Zwittergent 3-12、Zwittergent 3-14、Zwittergent 3-16、CHAPS、去氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、和溴化十六烷基三甲铵)。

在某些有利的例子中，免疫原性组合物还包含佐剂。适合于在含有嵌合FG多肽的免疫原性组合物中使用的佐剂是与本文中所公开的FG抗原组合在对受试者施用时是安全且最小反应原性的佐剂。

一种适合于与FG嵌合抗原组合使用的佐剂是非毒性细菌脂多糖衍生物。合适的脂质A无毒性衍生物的例子是单磷酰脂质A或者更具体的是，3-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。3D-MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.以名称MPL出售，并且贯穿整个文件称为MPL或3D-MPL。参见例如，美国专利No.4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094。3D-MPL主要促进具有IFN-γ(Th1)表型的CD4+T细胞应答。可以依照GB2220211A中所披露的方法来生成3D-MPL。在化学上，它是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，可以使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有如下颗粒大小，使得其可以无菌过滤流过0.22μm滤器。此类制备物记载于WO94/21292。

可以以每个人剂量的免疫原性组合物1和50μg之间的量使用所述脂多糖诸如3D-MPL。可以以约25μg，例如20-30μg之间，合适地21-29μg之间或22和28μg之间或23和27μg之间或24和26μg之间，或25μg的水平使用所述3D-MPL。在另一个实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约10μg，例如5和15μg之间，合适地6和14μg之间，例如7和13μg之间或8和12μg之间或9和11μg之间，或10μg的水平的3D-MPL。在又一个实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约5μg，例如1和9μg之间，或2和8μg之间或者合适地3和7μg之间或4和6μg之间，或5μg的水平的3D-MPL。

在其它实施方案中，脂多糖可以是β(1-6)葡糖胺二糖，如记载于美国专利No.6,005,099和欧洲专利No.0 729 473 B1。基于这些参考文献的教导，本领域技术人员会容易地能够生成各种脂多糖，诸如3D-MPL。尽管如此，通过提及而将每篇这些参考文献收入本文。在前述免疫刺激物(其在结构上与LPS或MPL或3D-MPL类似)外，作为上述MPL结构的亚部分的酰化单糖和二糖衍生物也是合适的佐剂。在其它实施方案中，佐剂是脂质A的合成衍生物，其中一些被描述为TLR-4激动剂，并且包括但不限于：

OM174(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰基氧基四-癸酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢酯)(WO 95/14026)

OM 294DP(3S，9R)-3--[(R)-十二烷酰基氧基四癸酰基氨基]-4-氧-5-氮-9(R)-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸-1，10-二醇，1，10-二(磷酸二氢酯)(WO99/64301和WO 00/0462)

OM 197MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰基氧基四癸酰基氨基]-4-氧-5-氮-9-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]癸-1，10-二醇，1-磷酸二氢酯10-(6-氨基己酸酯)(WO 01/46127)。

可以使用的其它TLR4配体是烃基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)诸如那些在WO 98/50399或美国专利No.6,303,347(还披露了用于制备AGP的方法)中披露的，合适地，RC527或RC529或AGP的药学可接受盐，如美国专利No.6,764,840中所披露的。一些AGP是TLR4激动剂，而一些是TLR4拮抗剂。认为两者作为佐剂都是有用的。

能够经由TLR-4引起信号传导应答的其它合适的TLR-4配体(Sabroe等，JI2003p1630-5)是例如来自革兰氏阴性细菌的脂多糖及其衍生物，或其片段，特别是LPS的无毒性衍生物(诸如3D-MPL)。其它合适的TLR激动剂是：热休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性剂蛋白A、乙酰透明质酸寡糖、硫酸乙酰肝素片段、纤连蛋白片段、血纤蛋白原肽和b-防卫素-2、和胞壁酰二肽(MDP)。在一个实施方案中，TLR激动剂是HSP 60、70或90。其它合适的TLR-4配体如记载于WO 2003/011223和WO 2003/099195，诸如WO2003/011223的第4页-第5页上或WO2003/099195的第3页-第4页上披露的化合物I、化合物II和化合物III和特别是WO2003/011223中披露为ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680、和ER804764的那些化合物。例如，一种合适的TLR-4配体是ER804057。

别的TLR激动剂作为佐剂也是有用的。术语“TLR激动剂”指能够经由TLR信号传导途径引起信号传导应答(或是作为直接的配体或是间接地经由生成内源或外源配体)的药剂。可以使用此类天然的或合成的TLR激动剂作为备选的或别的佐剂。Kaisho和Akira，Biochimica et Biophysica Acta1589：1-13，2002中提供了TLR作为佐剂受体的作用的简短综述。这些潜在佐剂包括但不限于TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的激动剂。因而，在一个实施方案中，佐剂和免疫原性组合物进一步包含选自下组的佐剂：TLR-1激动剂、TLR-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-5激动剂、TLR-6激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂、或其组合。

在本发明的一个实施方案中，使用能够经由TLR-1引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-1引起信号传导应答的TLR激动剂选自：三酰化脂肽(LP)；酚可溶性调控蛋白；结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)LP；三盐酸S-(2，3-二(棕榈酰基氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH(Pam3Cys)LP(其模拟细菌脂蛋白的乙酰化氨基端)和来自布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的OspA LP。

在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-2引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-2引起信号传导应答的TLR激动剂是下列一项或多项：来自结核分枝杆菌、布氏疏螺旋体或苍白密螺旋体(T pallidum)的脂蛋白、肽聚糖、细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的物种的肽聚糖；脂磷壁酸类、甘露糖醛酸类、奈瑟氏球菌(Neisseria)孔蛋白、细菌菌毛、耶尔森氏菌(Yersina)毒力因子、CMV病毒体、麻疹血细胞凝集素、和来自酵母的酵母聚糖。

在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-3引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-3引起信号传导应答的TLR激动剂是双链RNA(dsRNA)、或聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly IC)，一种与病毒感染有关的分子核酸样式。

在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-5引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-5引起信号传导应答的TLR激动剂是细菌鞭毛蛋白。

在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-6引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-6引起信号传导应答的TLR激动剂是分枝杆菌脂蛋白、二酰化LP、和酚可溶性调控蛋白。别的TLR6激动剂记载于WO 2003/043572。

在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-7引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-7引起信号传导应答的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、洛索立宾(loxoribine)、在位置N7和C8的鸟苷类似物、或咪唑喹啉化合物、或其衍生物。在一个实施方案中，TLR激动剂是咪喹莫特(imiquimod)。别的TLR7激动剂记载于WO 2002/085905。

在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-8引起信号传导应答的TLR激动剂。合适地，能够经由TLR-8引起信号传导应答的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)、具有抗病毒活性的咪唑喹啉分子，例如瑞喹莫德(resiquimod，R848)；瑞喹莫德也能够被TLR-7识别。可以使用的其它TLR-8激动剂包括记载于WO 2004/071459的。

在一个备选的实施方案中，使用能够经由TLR-9引起信号传导应答的TLR激动剂。在一个实施方案中，能够经由TLR-9引起信号传导应答的TLR激动剂是HSP90。或者，能够经由TLR-9引起信号传导应答的TLR激动剂是细菌或病毒DNA、含有未甲基化的CpG核苷酸的DNA，特别是称为CpG基序的序列背景。含有CpG的寡核苷酸主要诱导Th1应答。此类寡核苷酸是公知的，并且记载于例如WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利No.6,008,200和5,856,462。合适地，CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。在本发明的免疫原性组合物中使用的合适的寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸，任选地，其含有由至少三个，合适地，至少六个或更多个核苷酸分开的两个或更多个二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后面跟着鸟嘌呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在一个具体的实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸酯，或者合适的是硫代磷酸酯键，虽然磷酸二酯和其它核苷酸间键在本发明的范围内。还包括在本发明的范围内的是具有混合的核苷酸间连接的寡核苷酸。用于产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法记载于美国专利No.5,666,153、5,278,302和WO 95/26204。

可以在具有嵌合FG多肽的免疫原性组合物中使用(例如单独地或者与3D-MPL或本文所描述的其它佐剂组合地)的其它佐剂是皂苷类，诸如QS21。

皂苷类参见：Lacaille-Dubois，M和Wagner H.(1996.A review of thebiological and pharmacological activities of saponins.Phytomedicine第2卷第363页-第386页)。皂苷类是植物和海洋动物王国中广泛分布的类固醇或三萜糖苷。皂苷类记录用于在水中形成胶体溶液(其在摇动时起泡沫)及用于沉淀胆固醇。当皂苷类接近细胞膜时，它们在膜上产生引起膜爆裂的孔样结构。红细胞溶血是此现象的一个例子，其是某些但不是所有皂苷类的特性。

已知皂苷类为供系统施用的疫苗中的佐剂。本领域中已经广泛研究了各种皂苷的佐剂和溶血活性(Lacaille-Dubois和Wagner，见上文)。例如，QuilA(衍生自南美乔木皂皮树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮)及其级分记载于US 5,057,540和“Saponins as vaccine adjuvants”，Kensil，C.R.，Crit Rev TherDrug Carrier Syst，1996，12(1-2)：1-55；及EP 0 362 279 B1。包含Quil A级分的颗粒结构(称作免疫刺激性复合物(ISCOMS))是溶血的，并且已经在疫苗的制造中使用(Morein，B.，EP 0 109 942 B1；WO 96/11711；WO 96/33739)。溶血性皂苷类QS21和QS17(HPLC纯化的Quil A级分)已经被描述为有力的系统佐剂，并且其生产方法披露于美国专利No.5,057,540和EP 0 362 279 B1，通过提及而将其收入本文。已经在系统疫苗接种研究中使用的其它皂苷类包括衍生自其它植物物种诸如丝石竹(Gypsophila)和肥皂草(Saponaria)的(Bomford等，Vaccine，10(9)：572-577，1992)。

QS21是自皂皮树树皮衍生的Hplc纯化的非毒性级分。美国专利No.5,057,540中披露了用于生成QS21的方法。含有QS21的非反应原性佐剂配制剂记载于WO 96/33739。通过提及而将前述参考文献收入本文。可以以每个人剂量的免疫原性组合物1和50μg之间的量使用所述免疫学活性皂苷诸如QS21。有利地，以约25μg，例如20-30μg之间，合适地，21-29μg之间或22-28μg之间或23-27μg之间或24-26μg之间，或25μg的水平使用QS21。在另一个实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约10μg，例如5和15μg之间，合适地6-14μg之间，例如7-13μg之间或8-12μg之间或9-11μg之间，或10μg的水平的QS21。在又一个实施方案中，人剂量的免疫原性组合物包含在约5μg，例如1-9μg之间，或2-8μg之间或者合适地3-7μg之间或4-6μg之间，或5μg的水平的QS21。已经显示了包含QS21和胆固醇的此类配制剂在与抗原一起配制时是成功的Th1刺激性佐剂。如此，例如，可以在具有佐剂的免疫原性组合物中有利地采用嵌合FG多肽，所述佐剂包含QS21和胆固醇的组合。

任选地，佐剂还可以包括矿物盐诸如铝或钙盐，特别是氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙。例如，含有与铝盐(例如氢氧化铝或“明矾”)组合的3D-MPL的佐剂适合于在含有嵌合FG多肽的免疫原性组合物中配制用于对人受试者施用。

另一类适合于在具有嵌合FG多肽的配制剂中使用的Th1偏爱性佐剂包括基于OMP的免疫刺激性组合物。基于OMP的免疫刺激性组合物作为粘膜佐剂例如用于鼻内施用是特别合适的。基于OMP的免疫刺激性组合物是一类来自革兰氏阴性细菌诸如但不限于奈瑟氏球菌物种的外膜蛋白(OMP，包括一些孔蛋白)的制备物(参见例如Lowell等，J.Exp.Med.167：658，1988；Lowell等，Science 240：800，1988；Lynch等，Biophys.J.45：104，1984；Lowell，于“New Generation Vaccines”第2版，Marcel Dekker，Inc.，New York，Basil，Hong Kong，第193页，1997；美国专利No.5,726,292；美国专利No.4,707,543)，其作为载体或者在免疫原诸如细菌或病毒抗原的组合物中是有用的。一些基于OMP的免疫刺激性组合物可以称为“蛋白体”，其是疏水性的，并且供人使用是安全的。蛋白体具有自装配成约20nm至约800nm的小囊泡或小囊泡样OMP簇的能力，及非共价地与蛋白质抗原(Ag)，特别是具有疏水性模块的抗原合并、配合、结合(例如静电地或疏水地)、或以其它方式协作的能力。产生小囊泡或小囊泡样形式(包括一种或多种OMP的多分子膜性结构或熔球样OMP组合物)中的外膜蛋白成分的任何制备方法包括在蛋白体的定义内。可以制备蛋白体，例如如本领域中所描述的(参见例如美国专利No.5,726,292或美国专利No.5,985,284)。蛋白体还可以含有源于用于生成OMP孔蛋白的细菌(例如奈瑟氏球菌物种)的内源脂多糖或脂寡糖(分别为LPS或LOS)，其一般会小于2％的总OMP制备物。

蛋白体主要由来自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria menigitidis)的化学提取外膜蛋白(OMP)(主要为孔蛋白A和B以及4类OMP)构成，通过去污剂维持在溶液中(Lowell GH.Proteosomes for Improved Nasal，Oral，or InjectableVaccines.于：Levine MM，Woodrow GC，Kaper JB，Cobon GS编，NewGeneration Vaccines.New York：Marcel Dekker，Inc.1997；193-206)。蛋白体可以与多种抗原诸如自病毒来源衍生的纯化的或重组的蛋白质(包括本文所公开的嵌合FG多肽)一起配制，例如通过渗滤或传统的透析方法。逐渐除去去污剂容许直径约100-200nm的颗粒疏水性复合物的形成(Lowell GH.Proteosomes for Improved Nasal，Oral，or Injectable Vaccines.于：Levine MM，Woodrow GC，Kaper JB，Cobon GS编，New Generation Vaccines.New York：Marcel Dekker，Inc.1997；193-206)。

如本文中所使用的，“蛋白体：LPS或Protollin”指与至少一类脂多糖混合(例如通过外源添加)以提供OMP-LPS组合物(其能发挥免疫刺激性组合物的功能)的蛋白体制备物。如此，OMP-LPS组合物可以由Protollin基本成分之两种构成，其包括(1)自革兰氏阴性细菌诸如脑膜炎奈瑟氏球菌制备的蛋白体(例如Projuvant)的外膜蛋白制备物，和(2)一种或多种脂糖的制备物。脂寡糖可以是内源的(例如与OMP蛋白体制备物天然包含在一起)，可以与来自外源制备的脂寡糖(例如自与OMP制备物不同的培养物或微生物制备)的OMP制备物混合或组合，或者可以是其组合。此类外源添加的LPS可以来自制备OMP制备物的相同革兰氏阴性细菌或者来自不同革兰氏阴性细菌。还应当理解，任选地，Protollin包含脂质、糖脂、糖蛋白、小分子等，及其组合。可以制备Protollin，例如如记载于美国专利申请公开文本No.2003/0044425的。

也可以在具有嵌合FG多肽的组合物中使用不同佐剂诸如上文所提及的佐剂的组合。例如，如已经记录的，可以将QS21与3D-MPL配制在一起。QS21∶3D-MPL的比率通常会是大约1∶10至10∶1；诸如1∶5至5∶1，和经常基本上为1∶1的量级。典型地，比率在2.5∶1至1∶13D-MPL∶QS21的范围中。另一种组合佐剂配制剂包含3D-MPL和铝盐，诸如氢氧化铝。在组合配制时，此组合能增强抗原特异性Th1免疫应答。

在一些例子中，佐剂配制剂包含脂质体、水包油乳剂、或矿物盐诸如钙或铝盐，例如磷酸钙、磷酸铝或氢氧化铝。

水包油乳剂的一个例子在水性载体中包含可代谢油，诸如鲨烯、母育酚诸如例如α-生育酚、和表面活性剂诸如聚山梨酯80或Tween 80，并且不含任何别的免疫刺激物，特别是它不含非毒性脂质A衍生物(诸如3D-MPL)或皂苷(诸如QS21)。水性载体可以是例如磷酸盐缓冲盐水。另外，水包油乳剂可以含有Span 85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种疫苗组合物，其包含抗原或抗原组合物和佐剂组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳剂和任选地，一种或多种别的免疫刺激物，其中所述水包油乳剂包含0.5-10mg可代谢油(合适的是鲨烯)、0.5-11mg母育酚(合适的是α-生育酚)和0.4-4mg乳化剂。

在一个具体的实施方案中，佐剂配制剂包含以乳剂诸如水包油乳剂形式制备的3D-MPL。在一些情况中，乳剂具有直径小于0.2μm的小颗粒大小，如WO 94/21292中所披露的。例如，3D-MPL颗粒可以小得足以无菌过滤流过0.22微米膜(如记载于欧洲专利号0 689 454的)。或者，可以在脂质体配制剂中制备3D-MPL。任选地，含有3D-MPL(或其衍生物)的佐剂还包含别的免疫刺激性成分。

例如，在将具有嵌合FG多肽抗原的免疫原性组合物配制用于对婴儿施用时，佐剂的剂量确定为在婴儿受试者中是有效且相对非反应原性的。一般而言，婴儿配制剂中的佐剂剂量低于设计用于对成人(例如年龄为65岁或更年长的成人)施用的配制剂中使用的剂量。例如，3D-MPL的量通常在每剂1μg-200μg，诸如10-100μg，或10μg-50μg的范围中。婴儿剂量通常在此范围的下端，例如约1μg至约50μg，诸如约2μg、或约5μg、或约10μg至约25μg、或约50μg。典型地，在配制剂中使用QS21的情况中，范围是相当的(并且依照上文所指明的比率)。对于成人和老年人群体，配制剂通常包含比婴儿配制剂中通常找到的佐剂成分更多的佐剂成分。在使用水包油乳剂的特定配制剂中，此类乳剂可以包含别的成分，例如诸如胆固醇、鲨烯、α-生育酚、和/或去污剂，诸如Tween 80或Span 85。在例示性配制剂中，此类成分可以以下列量存在：约1-50mg胆固醇、2至10％鲨烯、2至10％α-生育酚和0.3至3％Tween 80。典型地，鲨烯：α-生育酚的比率等于或小于1，因为这提供更稳定的乳剂。在一些情况中，配制剂还可以含有稳定剂。在存在明矾(例如与3D-MPL组合)的情况中，量通常在每剂约100μg和1mg之间，诸如约100μg或约200μg至约750μg，诸如约500μg。

免疫原性组合物通常含有免疫保护数量(或其分数剂量)的抗原，并且可以通过常规技术来制备。免疫原性组合物(包括用于对人受试者施用的免疫原性组合物)的制备一般记载于Pharmaceutical Biotechnology，第61卷Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach，Powell和Newman编，PlenurnPress，1995.New Trends and Developments in Vaccines，Voller等编，UniversityPark Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。例如，Fullerton，美国专利4,235,877描述了脂质体内的包囊。例如，Likhite，美国专利4,372,945和Armor等，美国专利4,474,757披露了蛋白质与大分子的偶联。

典型地，每剂免疫原性组合物中的蛋白质量选择为在典型的受试者中诱导免疫保护性应答而没有显著的、不利的副作用的量。在此语境中的免疫保护性的并不必然意味着针对感染的完全保护的；它意味着提供保护免于症状或疾病，尤其是与病毒有关的严重疾病。抗原量可以随哪种特定的免疫原被采用而变化。一般而言，预期每个人剂量会包含1-1000μg的蛋白质，诸如约1μg至约100μg，例如约1μg至约50μg，诸如约1μg、约2μg、约5μg、约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约40μg、或约50μg。基于受试者群体(例如婴儿或老年人)来选择免疫原性组合物中利用的量。可以通过牵涉在受试者中观察抗体滴度和其它应答的标准研究来确定特定组合物的最佳量。初始疫苗接种后，受试者可以在约4周中接受加强免疫。

实施例

实施例1：例示性嵌合RSV多肽抗原

例示性真核FG多肽。

依照本公开内容生成例示性真核嵌合FG V1-1和FG V2-1。SEQ ID NO：10和11中提供了此类例示性FG嵌合物的序列。嵌合FG多肽包含F0天然信号序列。信号序列的掺入增强翻译后修饰，诸如糖基化。在这些例示性的实施方案中，两个弗林蛋白酶识别基序都除去，并将接头插入F2和F1域之间。SEQID NO：5和6中分别提供了FG V1-1和FG V2-1中存在的接头的序列。

使用GS表达系统将此例示性重组蛋白设计成在哺乳动物中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。在无谷氨酰胺的培养基中培养的CHO细胞需要外源谷氨酰胺来实现最佳生长。用包含编码嵌合FG多肽的多核苷酸序列的pEE14载体转染CHO细胞后，此系统经由代谢剥夺实现稳定克隆的选择，这是由于pEE14载体表达谷氨酰胺合酶。虽然生成本文所描述的构建体以在CHO细胞中表达，但是可以使用杆状病毒表达载体系统(BEVS)同等地生成这些构建体来表达。

实施例2：由嵌合RSV多肽进行的人血清中的中和抑制

通过ELISA对自志愿者获得的人血清筛选针对RSV A的反应性，并基于先前对RSV中和潜力的滴定以相关稀释度在中和抑制(NI)测定法中使用。将血清与25μg/ml浓度的抑制剂蛋白质混合，并于37℃温育1.5至2小时。在圆底96孔板中，将血清和蛋白质与固定浓度的RSV A混合，并于33℃温育20分钟。然后将血清-抑制剂-病毒混合物放入先前用Vero细胞接种的平底96孔板中，并在5％CO₂的情况中于33℃再温育5-6天，直至进行免疫荧光测定法来检测NI滴度。

使用Reed-Muench法来计算滴度，并如下计算NI百分比：[(25μg/ml抑制剂的NI滴度-0μg/ml抑制剂的NI滴度)/0μg/ml抑制剂的NI滴度]X 100。

序列表

SEQ ID NO：1

编码RSV参照融合蛋白的核苷酸序列

毒株A2 GenBank登录号U50362

atggagttgctaatcctcaaagcaaatgcaattaccacaatcctcactgcagtcacatttgttttgcttctggtcaa

aacatcactgaagaattttatcaatcaacatgcagtgcagtagcaaaggctatcttagtgctctgagaactggttgg

tataccagtgttataactatagattaagtaatatcaaggaaaataagtgtaatggaacagatgctaaggtaaaattg

ataaacaagaattagataaatataaaaatgctgtaacagaattgcagttgctcatgcaaagcacccagcaacaaaca

atcgagccagaagagaactaccaaggtttatgaattatacactcaaaatgccaaaaaaaccaatgtaacattaagca

agaaaaggaaaagaagatttcttggtttttgttaggtgttggatctgcaatcgccagtggcgttgctgtatctaagg

tcctgcacctgaaggggaagtgaacaagatcaaaagtgctctactatccacaaacaaggctgtagtcagttatcaaa

tggagttagtgtcttaaccagcaaagtgttagacctcaaaaactatatagaaaacaattgttacctattgtgaacaa

gcaaagctgcagcatatcaaatatagcaactgtatagagttccaacaaaagaacaacagactactagagattaccag

ggaatttagtgttaagcaggtgtaactacacctgtaagcacttacatgttaactaatagtgaattattgtcattatc

aatgatatgcctataacaaatgatcagaaaaagttaatgtccaacaatgttcaaatgttagacagcaaagttactct

atcatgtccataataaaagaggaagtcttagcatatgtgtacaattaccactatatggtgttatagatacaccctgt

tggaaactacacacatccccctatgtacaaccaacacaaaagaagggtccaacatctgtttaacaagaactgacaga

ggtggtactgtgacaatgcaggatcagtatctttcttcccacaagctgaaacatgtaaagtcaatcaaatcgagtat

tttgtgacacaatgaacagtttaacattaccaagtgaagtaaactctgcaatgttgacatattcaaccccaaatatg

attgtaaaattatgacttcaaaaacgatgtaagcagctccgttatcacatctctaggagccattgtgtcatgctatg

gcaaaacaaatgtacagcatccaataaaaatcgtggaatcataaagacattttctaacgggtgcgatatgtatcaaa

taaaggggtggacactgtgtctgtaggtaacacattatattatgtaaaaagcaagaaggtaaaagtctctatgtaaa

aggtgaaccaataataaatttctatgacccttagtattcccctctgatgaatttgatgcatcaatatctcaagtcaa

cgagaagattaacagagcctagcatttattcgtaaatccgatgaattattacataatgtaaatgctggtaatccacc

ataaatatcatgataactactataattatagtgattatagtaatattgttatcttaattgctgttggactgctctta

tactgtaaggccagaagcacaccagtcacactaagaaagatcaactgagtggtataaataatattgcatttagtaac

taa

SEQ ID NO：2

RSV参照F蛋白前体F0的氨基酸序列

毒株A2 GenBank登录号AAB86664

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVK

LIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAV

SKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIATVIEFQQKNNRLL

EITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGV

IDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVD

IFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQ

EGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTINIMITTIIIVIIVILL

SLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN

SEQ ID NO：3

编码RSV参照G蛋白的核苷酸序列

毒株Long

Atgtccaaaaacaaggaccaacgcaccgctaagacactagaaaagacctgggacactctcaatcatttattattcat

atcatcgggcttatataagttaaatcttaaatctatagcacaaatcacattatccattctggcaatgataatctcaa

cttcacttataattacagccatcatattcatagcctcggcaaaccacaaagtcacactaacaactgcaatcatacaa

gatgcaacaagccagatcaagaacacaaccccaacatacctcactcaggatcctcagcttggaatcagcttctccaa

tctgtctgaaattacatcacaaaccaccaccatactagcttcaacaacaccaggagtcaagtcaaacctgcaaccca

caacagtcaagactaaaaacacaacaacaacccaaacacaacccagcaagcccactacaaaacaacgccaaaacaaa

ccaccaaacaaacccaataatgattttcacttcgaagtgtttaactttgtaccctgcagcatatgcagcaacaatcc

aacctgctgggctatctgcaaaagaataccaaacaaaaaaccaggaaagaaaaccaccaccaagcctacaaaaaaac

caaccttcaagacaaccaaaaaagatctcaaacctcaaaccactaaaccaaaggaagtacccaccaccaagcccaca

gaagagccaaccatcaacaccaccaaaacaaacatcacaactacactgctcaccaacaacaccacaggaaatccaaa

actcacaagtcaaatggaaaccttccactcaacctcctccgaaggcaatctaagcccttctcaagtctccacaacat

ccgagcacccatcacaaccctcatctccacccaacacaacacgccagtag

SEQ ID NO：4

RSV参照G蛋白的氨基酸序列

MSKNKDQRTAKTLEKTWDTLNHLLFISSGLYKLNLKSIAQITLSILAMIISTSLIITAIIFIASANHKVTLTTAIIQ

DATSQIKNTTPTYLTQDPQLGISFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNK

PPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDLKPQTTKPKEVPTTKPT

EEPTINTTKTNITTTLLTNNTTGNPKLTSQMETFHSTSSEGNLSPSQVSTTSEHPSQPSSPPNTTRQ

SEQ ID NO：5

合成接头1

SGGSGGSGGSGGSG

SEQ ID NO：6

合成接头2

SGGSGGSGTNVTLS

SEQ ID NO：7

合成接头3

ELPRFMNYTLNNTKNTNVTLS

SEQ ID NO：8

合成接头4

QYTLNNTKNTNVTLS

SEQ ID NO：9

FG-Rixensart原始(WO

1 atggagttgc caatcctcaa agcaaatgca attaccacaa tcctcgctgc agtcacattt

61 tgctttgctt ctagtcaaaa catcactgaa gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtt

121 agcaaaggct atcttagtgc tctaagaact ggttggtata ctagtgttat aactatagaa

181 ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgatgaaa

241 caagaattag ataaatataa aaatgctgta acagaattgc agttgctcat gcaaagcaca

301 ccagcagcaa acaatcgagc cagaagagaa ctaccaaggt ttatgaatta tacactcaac

361 aataccaaaa aaaccaatgt aacattaagc aagaaaagga aaagaagatt tcttggtttt

421 ttgttaggtg ttggatctgc aatcgccagt ggcattgctg tatctaaggt cctgcactta

481 gaaggagaag tgaacaagat caaaagtgct ctactatcca caaacaaggc cgtagtcagc

541 ttatcaaatg gagttagtgt cttaaccagc aaagtgttag acctcaaaaa ctatatagat

601 aaacaattgt tacctattgt gaataagcaa agctgcagaa tatcaaatat agaaactgtg

661 atagagttcc aacaaaagaa caacagacta ctagagatta ccagggaatt tagtgttaat

721 gcaggtgtaa ctacacctgt aagcacttac atgttaacta atagtgaatt attgtcatta

781 atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaagttaa tgtccaacaa tgttcaaata

841 gttagacagc aaagttactc tatcatgtcc ataataaaag aggaagtctt agcatatgta

901 gtacaattac cactatatgg tgtgatagat acaccttgtt ggaaattaca cacatcccct

961 ctatgtacaa ccaacacaaa agaagggtca aacatctgtt taacaagaac tgacagagga

1021 tggtactgtg acaatgcagg atcagtatct ttcttcccac aagctgaaac atgtaaagtt

1081 caatcgaatc gagtattttg tgacacaatg aacagtttaa cattaccaag tgaagtaaat

1141 ctctgcaatg ttgacatatt caatcccaaa tatgattgta aaattatgac ttcaaaaaca

1201 gatgtaagca gctccgttat cacatctcta ggagccattg tgtcatgcta tggcaaaact

1261 aaatgtacag catccaataa aaatcgtgga atcataaaga cattttctaa cgggtgtgat

1321 tatgtatcaa ataaaggggt ggacactgtg tctgtaggta acacattata ttatgtaaat

1381 aagcaagaag gcaaaagtct ctatgtaaaa ggtgaaccaa taataaattt ctatgaccca

1441 ttagtattcc cctctgatga atttgatgca tcaatatctc aagtcaatga gaagattaac

1501 cagagtttag catttattcg taaatccgat gaattattac ataatgtaaa tgctggtaaa

1561 tcaaccacaa atatcctggt cacactaaca actgcaatca tacaagatgc aacaagccag

1621 atcaagaaca caaccccaac atacctcacc cagaatcccc agcttggaat cagcttctcc

1681 aatctgtctg aaactacatc acaaaccacc accatactag cttcaacaac accaagtgtc

1741 aagtcaaccc tgcaatccac aacagtcaag accaaaaaca caacaacaac caaaatacaa

1801 cccagcaagc ccaccacaaa acaacgccaa aacaaaccac caaacaaacc caataatgat

1861 tttcactttg aagtgttcaa ctttgtacct tgcagcatat gcagcaacaa tccaacctgc

1921 tgggctatct gtaaaagaat accaaacaaa aaacctggaa agaaaaccac caccaagccc

1981 acaaaaaaac caaccatcaa gacaaccaaa aaagatctca aacctcaaac cacaaaacca

2041 aaggaagtac ctaccaccaa gcccacagaa aagccaacca tcaacaccac caaaacaaac

2101 atcagaacta cactgctcac caacaatacc acaggaaatc cagaacacac aagtcaaaag

2161 ggaaccctcc actcaacctc ctccgatggc aatccaagcc cttcacaagt ctatacaaca

2221 tccgagtacc tatcacaacc tccatctcca tccaacacaa caaaccag

SEQ ID NO：10

FG V1-1(CHO)

1 aagcttgcca ccatggagct gctgatcctg aaaaccaacg ccatcaccgc catcctggcc

61 gccgtgaccc tgtgcttcgc ctcctcccag aacatcaccg aagagtttta ccagtccacc

121 tgctccgccg tgtccaaggg ctacctgtcc gccctgcgga ccggctggta cacctccgtg

181 atcaccatcg agctgtccaa catcaaagaa aacaagtgca acggcaccga cgccaaggtc

241 aagctgatca agcaggaact ggacaagtac aagagcgccg tgacagaact ccagctcctg

301 atgcagtcca cccctgccac caacaacaag aagtccggcg gcagcggcgg ctctggcggc

361 tccggcggat ctggcaagaa gttcctgggc ttcctgctgg gcgctggctc cgccatcgcc

421 tccggcaccg ccgtgagcaa ggtgctgcac ctggagggcg aggtgaacaa gatcaagagc

481 gccctgctgt ccaccaacaa ggccgtggtg tccctgtcca acggcgtgtc cgtgctgacc

541 tccaaggtgc tggatctgaa gaactacatc gacaagcagc tgctgcctat cgtgaacaag

601 cagtcctgct ccatctccaa catcgagacc gtgatcgagt tccagcagaa gaacaaccgg

661 ctgctggaga tcacccgcga gttctccgtg aacgccggcg tgaccacccc tgtgtccacc

721 tacatgctga ccaactccga gctgctgtcc ctgatcaacg acatgcctat caccaacgac

781 caaaaaaagc tgatgtccaa caacgtgcag atcgtgcggc agcagtccta cagcatcatg

841 agcatcatca aggaagaagt cctggcctac gtcgtgcagc tgcctctgta cggcgtgatc

901 gacacccctt gctggaagct gcacacctcc cccctgtgca ccaccaacac caaggaaggc

961 tccaacatct gcctgacccg gaccgaccgg ggctggtact gcgacaacgc cggctccgtg

1021 tccttcttcc ctctggccga gacctgcaag gtgcagtcca accgggtgtt ctgcgacacc

1081 atgaactccc tgaccctgcc ttccgaggtg aacctgtgca acatcgacat cttcaacccc

1141 aagtacgact gcaagatcat gaccagcaag accgacgtgt cctccagcgt gatcacctcc

1201 ctgggcgcca tcgtgtcctg ctacggcaag accaagtgca ccgcctccaa caagaaccgg

1261 ggaatcatca agaccttctc caacggctgc gactacgtgt ccaataaggg cgtggacacc

1321 gtgtccgtgg gcaacacact gtactacgtg aataagcagg aaggcaagag cctgtacgtg

1381 aagggcgagc ctatcatcaa cttctacgac cctctggtgt tcccttccga cgagttcgac

1441 gcctccatca gccaggtcaa cgagaagatc aaccagtccc tggccttcat ccggaagtcc

1501 gacgagctgc tgcacaacgt gaacgctggc aagtctacca ccaacatcat ggtgaccaag

1561 cagcggcaga acaagcctcc taacaagccc aacaacgact tccacttcga ggtgttcaac

1621 ttcgtgcctt gctccatctg ctccaacaac cctacctgct gggccatctg caagagaatc

1681 cccaacaaga agccaggcaa gaaaaccacc accaagccta ccaagaagcc taccttcaag

1741 accaccaaga aggaccacaa gcctcagacc acaaagccta aggaagtgcc aaccaccaag

1801 caccaccacc atcaccactg ataatcta

SEQ ID NO：11

FG V1-1

MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVK

LIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKKSGGSGGSGGSGGSGKKFLGFLLGAGSAIASGTAVSKVLHLEGEVNKI

KSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVT

TPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPL

CTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTS

KTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPII

NFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMVTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVP

CSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVPTTKHHHHHH

SEQ ID NO：12

FG V2-1

1 aagcttgcca ccatggagct gctgatcctc aagaccaacg ccatcaccgc catcctggcc

61 gccgtgaccc tgtgcttcgc ctcctcccag aacatcaccg aagagttcta ccagtccacc

121 tgctccgccg tgtccaaggg ctacctgtcc gccctgcgga ccggctggta cacctccgtg

181 atcaccatcg agctgtccaa catcaaagaa aacaagtgca acggcaccga cgccaaggtc

241 aagctgatca agcaggaact ggacaagtac aagagcgccg tgaccgaact ccagctgctg

301 atgcagtcca cccctgccac caacaacaag aaagaactgc ctcggttcat gaactacacc

361 ctgaacaaca ccaagaacac caacgtgacc ctgagcaaga agttcctggg cttcctgctg

421 ggcgctggct ccgccatcgc ctccggcacc gccgtgagca aggtgctgca cctggagggc

481 gaggtgaaca agatcaagag cgccctgctg tccaccaaca aggccgtggt gtccctgtcc

541 aacggcgtgt ccgtgctgac ctccaaggtg ctggatctga agaactacat cgacaagcag

601 ctgctgccta tcgtgaacaa gcagtcctgc tccatctcca acatcgagac cgtgatcgag

661 ttccagcaga agaacaaccg gctgctggag atcacccgcg agttctccgt gaacgccggc

721 gtgaccaccc ctgtgtccac ctacatgctg acaaactccg agctgctctc cctgatcaac

781 gacatgccta tcaccaacga ccaaaaaaag ctgatgtcca acaacgtgca gatcgtgcgg

841 cagcagtcct acagcatcat gagcatcatc aaggaagagg tcctggccta cgtggtgcag

901 ctgcctctgt acggcgtgat cgacacccct tgctggaagc tgcacacctc ccccctgtgc

961 accaccaaca ccaaggaagg ctccaacatc tgcctgaccc ggaccgaccg gggctggtac

1021 tgcgacaacg ccggctccgt gtccttcttc cctctggccg agacctgcaa ggtgcagtcc

1081 aaccgggtgt tctgcgacac catgaactcc ctgaccctgc cttccgaggt gaacctgtgc

1141 aacatcgaca tcttcaaccc caagtacgac tgcaagatca tgaccagcaa gaccgacgtg

1201 tcctccagcg tgatcacctc cctgggcgcc atcgtgtcct gctacggcaa gaccaagtgc

1261 accgcctcca acaagaaccg gggaatcatc aagaccttct ccaacggctg cgactacgtg

1321 tccaataagg gcgtggacac cgtgtccgtg ggcaacacac tgtactacgt gaataagcag

1381 gaaggcaaga gcctgtacgt gaagggcgag cctatcatca acttctacga ccctctggtg

1441 ttcccttccg acgagttcga cgcctccatc agccaggtca acgagaagat caaccagtcc

1501 ctggccttca tccggaagtc cgacgagctg ctgcacaacg tgaacgctgg caagtctacc

1561 accaacatca tggtgaccaa gcagcggcag aacaagcctc ctaacaagcc caacaacgac

1621 ttccacttcg aggtgttcaa cttcgtgcct tgctccatct gctccaacaa ccctacctgc

1681 tgggccatct gcaagagaat ccccaacaag aagcctggca agaaaaccac caccaagcct

1741 accaagaagc ctaccttcaa gaccaccaag aaggaccaca agcctcagac cacaaagcct

1801 aaggaagtgc caaccaccaa gcaccaccac catcaccact gataatcta

SEQ ID NO：13

FG V2-1

MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVK

LIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKKELPRFMNYTLNNTKNTNVTLSKKFLGFLLGAGSAIASGTAVSKVLHL

EGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREF

SVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCW

KLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKY

DCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLY

VKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMVTKQRQNKPPNKPNNDFHF

EVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVPTTKHHHHHH

Claims

1.一种嵌合RSV多肽，其以N端至C端方向包含：

(i)第一氨基酸序列，其包含与呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白多肽的F1域不可切割地连接的F2域；和

(ii)第二氨基酸序列，其包含RSV附着(G)蛋白多肽中包含免疫学优势表位的部分。

2.权利要求1的嵌合RSV多肽，其中所述RSV F蛋白多肽的F1域和F2域是经由氨基酸接头不可切割地连接的。

3.权利要求2的嵌合RSV多肽，其中所述氨基酸接头选自下组：SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

4.权利要求1-3中任一项的嵌合RSV多肽，其中所述第一氨基酸序列包含至少一处除去弗林蛋白酶切割位点的氨基酸删除或替代。

5.权利要求4的嵌合RSV多肽，其中所述第一氨基酸序列包含所述RSV F蛋白多肽的第106位和第133位的氨基酸删除。

6.权利要求1-5中任一项的嵌合RSV多肽，其进一步包含信号肽。

7.权利要求1-6中任一项的嵌合RSV多肽，其中所述F2域包含天然F蛋白多肽的残基24至残基105的氨基酸序列。

8.权利要求1-7中任一项的嵌合RSV多肽，其中所述F1域包含天然F蛋白多肽的残基137至残基528的氨基酸序列。

9.权利要求1-8中任一项的嵌合RSV多肽，其中所述RSV G蛋白多肽的部分包含天然G蛋白多肽的氨基酸残基183至残基203。

10.权利要求1-9中任一项的嵌合RSV多肽，其中所述RSV G蛋白多肽的部分包含天然G蛋白多肽的氨基酸残基152至残基229。

11.权利要求1-10中任一项的嵌合RSV多肽，其中所述RSV G蛋白多肽的部分包含天然G蛋白多肽的氨基酸残基149至残基229。

12.前述权利要求中任一项的嵌合RSV多肽，其中所述嵌合多肽相对于天然存在的RSV多肽包含至少一处氨基酸替代，其中所述氨基酸替代与疫苗增强性病毒疾病的减轻或预防有关。

13.权利要求12的嵌合RSV多肽，其中所述嵌合多肽包含G蛋白的残基191处用丙氨酸对天冬酰胺的替代(N191A)。

14.前述权利要求中任一项的嵌合RSV多肽，其中所述G蛋白多肽和所述F蛋白多肽的至少一部分在序列上对应于RSV ALong株或RSV A2株。

15.前述权利要求中任一项的嵌合RSV多肽，其中所述嵌合多肽进一步包含多组氨酸标签。

16.权利要求1的嵌合RSV多肽，其中所述嵌合多肽包含选自SEQ ID NO：11和13的氨基酸序列或其亚序列。

17.权利要求16的嵌合RSV多肽，其中所述亚序列省略选定序列的氨基酸残基1-23。

18.前述权利要求中任一项的嵌合RSV多肽，其中所述嵌合RSV多肽包含RSV F蛋白和RSV G蛋白两者的至少一个免疫优势表位。

19.一种重组RSV抗原，其包含前述权利要求中任一项的嵌合RSV多肽的多聚体。

20.权利要求19的重组RSV抗原，其中所述RSV抗原包含嵌合多肽的三聚体。

21.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1-18中任一项的嵌合RSV多肽和载体或赋形剂。

22.权利要求21的免疫原性组合物，其中所述载体或赋形剂是药学可接受载体或赋形剂。

23.权利要求21或22的免疫原性组合物，其中所述载体或赋形剂包含缓冲剂。

24.权利要求21-23中任一项的免疫原性组合物，其中所述载体或赋形剂包含至少一种使溶解度、稳定性或溶解度和稳定性两者稳定化的成分。

25.权利要求21-24中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。

26.权利要求25的免疫原性组合物，其中所述佐剂适合于对新生儿施用。

27.权利要求25的免疫原性组合物，其中所述佐剂能够增强年龄为至少65岁的人中的免疫应答。

28.权利要求25-27中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂是Th1偏爱性佐剂。

29.权利要求28的免疫原性组合物，其中所述佐剂是TLR-4配体。

30.权利要求29的免疫原性组合物，其中所述脂质A衍生物选自：3D-MPL和脂质A的任何合成衍生物。

31.权利要求28-30中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含颗粒载体。

32.权利要求31的免疫原性组合物，其中所述载体是明矾。

33.权利要求25-30中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含水包油乳剂.

34.权利要求21-33中任一项的免疫原性组合物，其用于在药物中使用。

35.权利要求21-33中任一项的免疫原性组合物，其用于在预防或减轻对人受试者施用后受RSV感染中使用。

36.权利要求21-33中任一项的免疫原性组合物，其用于在预防或减轻对人受试者施用后由受RSV感染引起的病理学应答中使用。

37.权利要求21-33中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物减轻或预防对人受试者施用后受RSV感染。

38.权利要求21-33中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物减轻或预防对人受试者施用后由受RSV感染引起的病理学应答。

39.权利要求21-33中任一项的免疫原性组合物，其进一步包含与RSV不同的病原性生物体的至少一种别的抗原。

40.权利要求39的免疫原性组合物，其中所述病原性生物体是与RSV不同的病毒。

41.权利要求40的免疫原性组合物，其中所述免疫原性病毒是副流感病毒(PIV)。

42.权利要求39的免疫原性组合物，其中所述病原性生物体选自：乙肝、流感、白喉、破伤风、百日咳、流感嗜血菌、脊髓灰质炎病毒、和肺炎球菌。

43.一种重组核酸，其包含编码权利要求1-18中任一项的嵌合多肽的多核苷酸序列。

44.权利要求43的重组核酸，其中所述编码嵌合多肽的多核苷酸序列包含至少一个为在选定的宿主细胞中表达而优化的密码子。

45.一种载体，其包含权利要求43或权利要求44的重组核酸。

46.权利要求45的载体，其中所述载体包含原核或真核表达载体。

47.一种宿主细胞，其包含权利要求43或权利要求44的核酸或权利要求46的表达载体。

48.权利要求47的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。

49.权利要求1-18中任一项的嵌合RSV多肽或权利要求43-46中任一项的核酸在制备用于治疗RSV感染的药物中的用途。

50.权利要求49的嵌合RSV多肽或核酸的用途，其中所述药物是为了预防性处理RSV感染而施用的。

51.一种用于引发针对呼吸道合胞病毒(RSV)的免疫应答的方法，该方法包括以下步骤：

对受试者施用免疫原性有效量的包含权利要求1-18中任一项的嵌合RSV多肽的组合物。

52.权利要求51的方法，其中施用所述包含嵌合RSV多肽的组合物引发对RSV特异性的免疫应答而在与RSV接触后不增强病毒疾病。

53.权利要求52的方法，其中所述免疫应答包含Th1型免疫应答。

54.权利要求52或53的方法，其中所述免疫应答包含保护性免疫应答，其减轻或预防受RSV感染和/或减轻或预防受RSV感染后的病理学应答。

55.权利要求51的方法，其中所述受试者是人受试者。

56.权利要求51的方法，包括施用所述包含嵌合RSV多肽的组合物，包括通过鼻内路径施用。

57.权利要求51的方法，包括施用所述包含嵌合RSV多肽的组合物，包括通过肌肉内路径施用。