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TW201446962A - 具有修飾的糖化作用之蛋白質及其製造方法 - Google Patents

具有修飾的糖化作用之蛋白質及其製造方法 Download PDF

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TW201446962A
TW201446962A TW103104779A TW103104779A TW201446962A TW 201446962 A TW201446962 A TW 201446962A TW 103104779 A TW103104779 A TW 103104779A TW 103104779 A TW103104779 A TW 103104779A TW 201446962 A TW201446962 A TW 201446962A
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TW103104779A
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Li-How Chen
Harry M Meade
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Lab Francais Du Fractionnement
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Abstract

於一方面，本發明提供具有修飾的糖化作用之蛋白質及其製造方法。於一方面，本發明提供用於具有修飾的糖化作用之蛋白質的製造的基因轉殖動物與細胞。在某些具體實施例中，該修飾的糖化作用為增加的唾液酸化作用。

Description

具有修飾的糖化作用之蛋白質及其製造方法 【相關申請案】
本申請案主張美國專利法第119條(e)項之美國臨時申請案案號61/764,502之優先權，其名稱為「具有修飾的糖化作用之蛋白質及其製造方法」，係於2013年2月13日提出申請，其整個揭露內容係以引用的方式全部併入本文中。
本發明係關於蛋白質領域與蛋白質製造的方法。
在乳腺內的蛋白質基因轉殖產物可以生產大量的蛋白質，包括治療性蛋白質。然而，在乳腺內生產的蛋白質的糖化作用模式有時會與血清生產的蛋白質的糖化作用模式不同。因此需要有可以修改在乳腺內生產的蛋白質的糖化作用的方法。
在一方面，本發明提供具有修飾的糖化作用之蛋白質及其製造方法。在一方面，本發明提供用以製造具有修飾的糖化作用之蛋白質的基因轉殖動物與細胞。在某一具體實施例中，該修飾的糖化作用係增加的唾液酸化作用。
在一方面，本發明提供一種製造具有修飾的糖化作用之蛋白質的方法，該方法包含提供已被修飾以增加該乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物，其中該基因轉殖哺乳動物在該乳腺中表現蛋白質，以及自該基因轉殖哺乳動物的該乳腺中收穫該蛋白質。
在一方面，本發明提供一種製造具有修飾的糖化作用之蛋白質的方法，該方法包含提供已被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現的乳腺上皮細胞，其中該乳腺上皮細胞表現蛋白質，以及自該乳腺上皮細胞中收穫該蛋白質。
在本文提供之方法的某些具體實施例中，相較於在未被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞中產生的蛋白質，該糖化作用係經過修飾的。在本文提供之方法的某些具體實施例中，該修飾的糖化作用係增加的唾液酸化作用。
在一方面，本發明提供一種製造具有增加的唾液酸化作用之蛋白質的方法，該方法包含提供已被修飾以增加該乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物，其中該基因轉殖哺乳動物在該乳腺中表現蛋白質，以及自該基因轉殖哺乳動物的該乳腺中收穫該具有增加的唾液酸化作用之蛋白質。
在本文提供之方法的某些具體實施例中，相較於在未被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞中產生的蛋白質，該唾液酸化作用是增加的。
在本文提供之方法的某些具體實施例中，該具有修飾的糖化作用之蛋白質或具有增加的唾液酸化作用之蛋白質係人類蛋白質。在本文 提供之方法的某些具體實施例中，該具有修飾的糖化作用之蛋白質或具有增加的唾液酸化作用之蛋白質係抗體。在本文提供之方法的某些具體實施例中，該具有修飾的糖化作用之蛋白質或具有增加的唾液酸化作用之蛋白質係為抗凝血酶。在本文提供之方法的某些具體實施例中，該具有修飾的糖化作用之蛋白質或具有增加的唾液酸化作用之蛋白質係為α-1抗胰蛋白酶。
在一方面，本發明提供根據本文所提供之任何方法所製造的具有修飾的糖化作用之蛋白質或具有增加的唾液酸化作用之蛋白質。
在一方面，本發明提供一種包含根據本文所提供之任何方法所製造的具有修飾的糖化作用之蛋白質或具有增加的唾液酸化作用之蛋白質的組合物，該組合物進一步包含乳汁。
在一方面，本發明提供一種在該乳腺中增加該唾液酸轉移酶活性之方法，該方法包含提供已被修飾以增加該乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物。
在一方面，本發明提供一種製造唾液酸轉移酶之方法，該方法包含提供已被修飾以增加該乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物，以及自該基因轉殖哺乳類動物的乳腺中收穫該唾液酸轉移酶。在本文提供之方法的某些具體實施例中，該方法進一步包含使用該唾液酸轉移酶以唾液酸化蛋白質。
在一方面，本發明提供一種在該乳腺中增加該唾液酸轉移酶活性的方法，該方法包含製造已被修飾以增加該乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物。在一方面，本發明提供一種製造唾液酸轉移酶之 方法，該方法包含製造已被修飾以增加該乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物，以及自該基因轉殖哺乳類動物的乳腺中收穫該唾液酸轉移酶。在本文提供之方法的某些具體實施例中，該方法進一步包含使用該唾液酸轉移酶以唾液酸化蛋白質。在某些具體實施例中，該唾液酸轉移酶係與該蛋白質接觸。
在一方面，本發明提供一種根據本文所提供之任何方法所製造的唾液酸轉移酶。
在一方面，本發明提供一種包含根據本文所提供之任何方法所製造的唾液酸轉移酶的組合物，且其進一步包含乳汁。
在本文所提供之方法、蛋白質、組合物、基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的某些具體實施例中，該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞係由將編碼唾液酸轉移酶的核酸序列引入到該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的基因組中而被修飾的。
在本文所提供之方法、蛋白質、組合物、基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的某些具體實施例中，在該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞中表現的該蛋白質係由被引入到該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的基因組中的核酸序列所編碼。
在一方面，本發明提供一種已被修飾以增加該乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物。在本文所提供之基因轉殖哺乳動物的某些具體實施例中，該基因轉殖哺乳動物進一步在該乳腺中表現外源蛋白質。在本文所提供之基因轉殖哺乳動物的某些具體實施例中，該外源蛋白質係人類蛋白質。在本文所提供之基因轉殖哺乳動物的某些具體實施例 中，該外源蛋白質係抗體。在本文所提供之基因轉殖哺乳動物的某些具體實施例中，該外源蛋白質係為抗凝血酶。在本文所提供之基因轉殖哺乳動物的某些具體實施例中，該外源蛋白質係為α-1抗胰蛋白酶。
在一方面，本發明提供一種已被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現的乳腺上皮細胞。在本文所提供之乳腺上皮細胞的某些具體實施例中，該乳腺上皮細胞進一步表現外源蛋白質。在本文所提供之乳腺上皮細胞的某些具體實施例中，該外源蛋白質係人類蛋白質。在本文所提供之乳腺上皮細胞的某些具體實施例中，該外源蛋白質係抗體。在本文所提供之乳腺上皮細胞的某些具體實施例中，該外源蛋白質係為抗凝血酶。在本文所提供之乳腺上皮細胞的某些具體實施例中，該外源蛋白質係為α-1抗胰蛋白酶。
在本文所提供之方法、蛋白質、組合物、基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的某些具體實施例中，該轉殖基因哺乳動物係有蹄類動物。在某些具體實施例中，該有蹄類動物係為山羊。
在本文所提供之方法、蛋白質、組合物、基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的某些具體實施例中，唾液酸轉移酶的表現係在乳汁啟動子的控制下進行。在某些具體實施例中，該乳汁啟動子係山羊β酪蛋白啟動子。
在本文所提供之方法、蛋白質、組合物、基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的某些具體實施例中，該唾液酸轉移酶係β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶。
在本文所提供之方法、蛋白質、組合物、基因轉殖哺乳動物 或乳腺上皮細胞的某些具體實施例中，該唾液酸轉移酶係β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶。
本發明的每個限制可包括本發明的各種具體實施例。因此，可預期涉及任一元素或元素之組合的本發明的每個限制可以被包括到本發明的各個方面中。本發明並不限於將其應用到闡述於以下描述或描述於圖式中的構造之細節與組件之排列。本發明係可為其他具體實施例，且能被以各種方式實踐或進行。再者，本文所用之措辭與術語係為描述之目的，且不應被視為是限制之用。
圖式僅為說明之用，而非實施本發明所必需。
圖1所示為標記為「查詢」之上排序列的ST6 β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶GENE ID：100861310 ST6GAL1[山羊(Capra hircus)]的序列(SEQ ID NO：1)，與標記為「主體」之下排序列的該人類蛋白質(SEQ ID NO：2)的比較。
圖2提供了ST6 β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶基因之示意圖。
圖3提供了顯示帶有增加含量的唾液酸之蛋白質的等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)凝膠。圖3A描述兩種凝膠：左邊的凝膠顯示了一等電點標準梯度(第1道)、α-抗胰蛋白酶(alpha-antitrypsin，AAT；第2道)，以及以一市售唾液酸轉移酶之混合物處理的AAT(第3道)。右邊的凝膠描述了一等電點標準梯度(第1道)、以一唾液酸轉移酶處理前的AAT(第2道)、以一市售唾液酸轉移酶之混合物處理後的AAT(第3道)、或以自一基因轉殖山羊的乳汁中純化的單一唾液酸轉移酶處理後的AAT(第4道與第5道)。圖3B 描述一凝膠，該凝膠顯示Alfalastin®，一種AAT的唾液酸化版本(第1道)、以來自產生唾液酸轉移酶的基因轉殖山羊之乳汁處理的AAT(第2道與第7道)、以來自一對照組動物的乳汁處理的AAT(第3道與第8道)、以來自一對照組動物的乳汁與基因轉殖生產的唾液酸轉移酶處理的AAT(第4道)、以緩衝液與基因轉殖生產的唾液酸轉移酶處理的AAT(第5道)，以及以緩衝液處理的AAT(第6道)。
圖4提供了顯示帶有基因轉殖生產的唾液酸轉移酶之α-1抗胰蛋白酶的體外唾液酸化作用的圖。
圖5顯示了在一對照組動物(第1欄)以及在一乳腺中過度表現唾液酸轉移酶的基因轉殖山羊(第2欄)中乳鐵蛋白的唾液酸化作用。
圖6顯示了可產生唾液酸轉移酶與AAT兩者(上圖)與只產生AAT(下圖)的山羊的乳腺中的AAT的「活體內」唾液酸化作用。
圖7顯示了相較於來自血漿的AAT(plasma-derived，pdAAT)之ST3與ST6基因轉殖之唾液酸化產生的AAT之藥物動力學曲線。
在一方面，本發明提供具有修飾的糖化作用之蛋白質及其製造方法。在一方面，本發明提供用以製造具有修飾的糖化作用之蛋白質的基因轉殖動物與細胞。
在一方面，本發明提供具有增加的唾液酸化作用之蛋白質與其製造方法。在一方面，本發明提供用以製造具有增加的唾液酸化作用之蛋白質的基因轉殖哺乳動物與細胞。在一方面，本發明提供用以製造具有增加的唾液酸化作用之蛋白質的基因轉殖哺乳動物與細胞，其中該基因轉 殖哺乳動物或細胞已被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現。
在基因轉殖的非人類哺乳動物的乳腺中生產蛋白質具有可大量生產蛋白質的優點。各種蛋白質可以在乳腺中生產，且非人類哺乳動物中的基因轉殖生產方法已被用來製造人類治療性蛋白質，例如血清蛋白質。基因轉殖產生的血清蛋白質的一個實例為Atryn®，係為一種基因轉殖產生的抗凝血酶，其已被批准在美國及歐洲使用(參見，例如，美國專利號US 5,843,705、US 6,441,145、US 7,019,193以及US 7,928,064)。
只要引入基因轉殖哺乳動物的編碼蛋白質的核酸與其「天然的」蛋白質的核酸相同，在乳腺中以基因轉殖方式生產的蛋白質就具有與該「天然的」蛋白質相同的胺基酸序列。然而，若該基因轉殖的蛋白質為一糖蛋白，則與「天然的」蛋白質相比，由基因轉殖非人類哺乳動物的乳腺所產生的蛋白質的糖化作用模式可能會有所不同。例如，與分離自血清的相同蛋白質相比，乳腺生產的蛋白質可能具有較低程度的唾液酸化作用(見，例如，Edmunds,T.等人，Blood期刊，第91卷第12期，1998年，第4561-4571頁；Geun-Cheol Gil等人，Glycobiology期刊，第18卷第7期，2008年，第526-539頁)。重組生產的蛋白質與天然的蛋白質之間糖化作用的差異對於在乳腺中產生的重組(基因轉殖的)蛋白質而言並非獨一無二的。相較於天然的蛋白質，幾乎任何重組蛋白質的製造方法，例如在CHO細胞中生產，可以導致不同的糖化作用，這僅僅是因為細胞類型之間可用性與糖化作用酵素的活性的不同而造成。重組生產的蛋白質的糖化作用的差異可能是也可能不是相關的。重組的糖蛋白，既使是治療性的蛋白質，仍可具有所要的生物性質，就算該糖化作用不同於該天然的蛋白質。然而，在某些例子中，不同 的糖化作用可能是較佳的，因為相較於該天然的蛋白質，不同的糖化作用可能提供該重組生產的蛋白質不同的功能特性(例如，較慢的清除率)。
然而，在某些例子中，需要重組生產的蛋白質的糖化作用模式類似，或完全相同於，天然的蛋白質的糖化作用模式(例如，發現於血流中的一蛋白質)。
有多種方法可以用來修飾重組生產的蛋白質的糖化作用。例如，特定糖化作用酵素的抑制劑可以被添加到產生蛋白質的細胞中，造成該生產的蛋白質的修飾的糖化作用。此外，糖化的蛋白質可於生產後被修飾，例如經由將該蛋白質與一或多個糖化作用酵素培養，及/或透過化學反應修飾該糖化作用。
在一方面，本發明提供製造具有修飾的糖化作用之蛋白質的方法。在一方面，本發明提供用於製造具有修飾的糖化作用之蛋白質的基因轉殖哺乳動物。在某些具體實施例中，該基因轉殖哺乳動物可在乳腺中生產具有修飾的糖化作用之蛋白質。
在一方面，本發明提供製造具有修飾的糖化作用之蛋白質的方法。在一方面，本發明提供用於製造具有修飾的糖化作用之蛋白質的細胞。在某些具體實施例中，該細胞為乳腺上皮細胞。
在一方面，本發明提供具有修飾的糖化作用之蛋白質。在某些具體實施例中，該蛋白質為人類蛋白質。
在一方面，本發明提供一種製造具有修飾的糖化作用之蛋白質的方法，包含提供或製造已被/被修飾以增加乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物，其中該基因轉殖哺乳動物在該乳腺中表現蛋白質， 以及自該基因轉殖哺乳動物的該乳腺中收穫該蛋白質。在某些具體實施例中，相較於在未被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞中產生的蛋白質，該糖化作用是被修飾的。在某些具體實施例中，該修飾的糖化作用為增加的唾液酸化作用。
在一方面，本發明提供一種製造具有修飾的糖化作用之蛋白質的方法，包含提供或製造已被/被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現的乳腺上皮細胞，其中該乳腺上皮細胞表現蛋白質，以及自該乳腺上皮細胞中收穫該蛋白質。在某些具體實施例中，相較於在未被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞中產生的蛋白質，該糖化作用是被修飾的。在某些具體實施例中，該修飾的糖化作用為增加的唾液酸化作用。
在一方面，本發明提供一種製造具有增加的唾液酸化作用之蛋白質的方法，該方法包含提供已被修飾以增加乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物，其中該基因轉殖哺乳動物在該乳腺中表現一蛋白質，以及自該基因轉殖哺乳動物的該乳腺中收穫該具有增加的唾液酸化作用之蛋白質。在某些具體實施例中，相較於在未被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞中產生的一蛋白質，該唾液酸化作用是增加的。
本文所用之具有修飾的糖化作用之蛋白質意指具有由於基因轉殖哺乳動物的乳腺或乳腺上皮細胞之產生而來的糖化作用模式的蛋白質，其中該乳腺或乳腺上皮細胞具有增加表現的唾液酸轉移酶。相較於在未具有增加表現的唾液酸轉移酶之基因轉殖哺乳動物的乳腺或乳腺上皮細 胞中產生的相同蛋白質，該糖化作用是被修飾的。在某些具體實施例中，該修飾的糖化作用是增加的唾液酸化作用(即，在寡糖鏈上的唾液酸基團的數量增加)。在某些具體實施例中，相較於在未具有增加表現的唾液酸轉移酶之基因轉殖哺乳動物的乳腺或乳腺上皮細胞中產生的相同蛋白質，該蛋白質的唾液酸化作用增加了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多。唾液酸化的程度可以由例如以HPLC/MS分析該蛋白質的糖化作用而確定。
應當理解的是，相較於在未具有增加表現的唾液酸轉移酶之基因轉殖哺乳動物的乳腺或乳腺上皮細胞中產生的相同蛋白質，唾液酸化的程度是增加的。相較於「天然的蛋白質」(即，在肝臟中產生的蛋白質)，本文所定義之具有增加的唾液酸化作用之蛋白質可能仍具有較低程度的唾液酸化作用。在某些具體實施例中，相較於在一「天然的蛋白質」中的唾液酸化程度，該具有增加的唾液酸化作用之蛋白質具有一唾液酸化之程度為至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少200%或至少300%或更多。如本文所示，在乳腺與乳腺上皮細胞中的唾液酸轉移酶的表現程度低於在其他器官與細胞(即，肝臟)內的表現程度。據此，在乳腺或乳腺上皮細胞中產生的糖蛋白通常會具有低於在其他器官與細胞(即，肝臟)內產生的相同蛋白質的唾液酸化程度。既使該乳腺或乳腺上皮細胞已根據本文所提供之方法而被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現，該程度仍可能是較低的。
還應當理解的是，在具有增加表現的唾液酸轉移酶的基因轉殖哺乳動物的乳腺或乳腺上皮細胞中產生的蛋白質可能造成之修飾的糖化 作用並不限於增加的唾液酸化作用。例如，唾液酸轉移酶可用性的增加可能造成較短的寡糖鏈，因為其被唾液酸所覆蓋而阻止進一步添加單糖。此外，例如，唾液酸轉移酶可用性的增加可能造成糖化作用受質不同的可用性，而導致具有不同單糖模式的寡糖側鏈的合成。
可以設想的是，具有修飾的糖化作用(如，增加的唾液酸化作用)的各種蛋白質可以根據本文所提供的方法產生。在某些具體實施例中，該蛋白質為外源的蛋白質(即，非天然地發現於該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的基因組中的蛋白質，例如在基因轉殖山羊中的人類蛋白質)。在某些具體實施例中，具有修飾的糖化作用之蛋白質為人類蛋白質。可以根據本文所提供之方法產生的具有修飾的糖化作用之蛋白質包括抗體與糖蛋白，其在血液平衡狀態下是活化的，例如抗凝血酶與α-抗胰蛋白酶。在某些具體實施例中，「待修飾的」蛋白質為在該基因轉殖哺乳動物的乳腺或乳腺上皮細胞內表現的基因轉殖蛋白質，因為其被引入該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的基因組的核酸序列所編碼。然而，在某些具體實施例中，根據本文所提供之方法產生的該具有修飾的糖化作用之蛋白質為天然地表現於該乳腺或乳腺上皮細胞中的蛋白質，例如乳鐵蛋白。
在一方面，本發明提供一種在乳腺中增加該唾液酸轉移酶活性之方法，包含提供已被修飾以增加該乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物。在一方面，本發明提供一種在乳腺上皮細胞中增加該唾液酸轉移酶活性之方法，包含提供或製造已被/被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現的乳腺上皮細胞。本文所用之增加的表現意指，相較於未修飾的(「天然的」)乳腺或未修飾的乳腺上皮細胞而言，表現增加。應當理解的是，且 本文也顯示，未修飾的乳腺或未修飾的乳腺上皮細胞具有一些唾液酸轉移酶的殘基表現。因此，在某些具體實施例中，在乳腺或乳腺上皮細胞中唾液酸轉移酶之增加的表現較在該乳腺或乳腺上皮細胞中唾液酸轉移酶的天然表現高2倍或更多、高3倍或更多、高4倍或更多、高5倍或更多、高10倍或更多、高20倍或更多、高50倍或更多、高100倍或更多、高1000倍或更多。
該乳腺或乳腺上皮細胞可以由各種方法所修飾以增加唾液酸轉移酶的表現。在某些具體實施例中，經由上調一或多個在基因組中自然存在之唾液酸轉移酶的表現而增加表現。在某些具體實施例中，經由將新的乳腺特定啟動子引入該一或多個在基因組中自然存在之唾液酸轉移酶的基因組上游而增加表現。在某些具體實施例中，經由將編碼唾液酸轉移酶的核酸序列引入該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的基因組中，而修飾該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞。應當理解的是，該已被修飾以表現唾液酸轉移酶的基因轉殖哺乳動物與乳腺上皮細胞可能也表現一待修飾的蛋白質(如，外源蛋白質)。
唾液酸轉移酶為酵素的糖基轉移酶群組中的成員。唾液酸轉移酶是一種可以將唾液酸轉移到寡糖上的酵素，包括在糖化蛋白上的寡糖。一般而言，唾液酸轉移酶將唾液酸引入複合糖鏈的末端位置上。唾液酸轉移酶係根據其特定活性而分類，且一般分為三類：α-2,6-唾液酸轉移酶、α-2,3-唾液酸轉移酶以及α-2,8-唾液酸轉移酶，其可分別經由一α-2,6-、α-2,3-以及α-2,8-鍵聯而引入唾液酸基團(見，例如，Harduin-Lepers等人，人類之唾液酸轉移酶家族，Biochimie期刊，第83卷：第727-737頁，2001年)。
該α-2,6-唾液酸轉移酶係進一步分為將一唾液酸貼附於半乳 糖的唾液酸轉移酶(「ST6Gal I」、「β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶」或「ST6 β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶1」)，以及將一唾液酸貼附於N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)的唾液酸轉移酶(「ST6GalNAc I-VI」)。該β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶調節一唾液酸殘基轉移至一個二醣上的末端半乳糖殘基，該二醣被發現作為一游離二醣或被發現作為在一N-聯結或O-聯結的寡糖上的一末端單元。因此，在某些具體實施例中，本發明提供允許N-聯結的唾液酸化作用之方法與組合物。在某些具體實施例中，本發明提供允許O-聯結的唾液酸化作用之方法與組合物。
該N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)α-2,6-唾液酸轉移酶可以將唾液酸貼附於非末端的GalNAc殘基上。
該α-2,3-唾液酸轉移酶透過一2,3鏈結到在糖脂質與糖蛋白上一末端半乳糖殘基而調節唾液酸的轉移。
該α-2,8-唾液酸轉移酶一般係涉及多唾液酸鏈的產生。
在某些具體實施例中，該唾液酸轉移酶為β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶(「ST6 Gal」)、α-N-乙醯胺基半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶、β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶、N-乙醯胺基乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶、α-N-乙醯-神經胺酸苷-α-2,8-唾液酸轉移酶，或乳糖神經醯胺α-2,3-唾液酸轉移酶。在某些具體實施例中，該唾液酸轉移酶為β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶(「ST6 Gal」)。在某些具體實施例中，該唾液酸轉移酶為β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶。例如，在Harduin-Lepers等人發表的文獻中提供了人類唾液酸轉移酶的序列(人類之唾液酸轉移酶家族，Biochimie期刊，第83卷：第727-737頁，2001年)。
一般而言，根據本發明之方法使用之唾液酸轉移酶的物種將與基因轉殖哺乳動物或該乳腺上皮細胞的物種相同。例如，山羊唾液酸轉移酶被引入一基因轉殖山羊或山羊乳腺上皮細胞內。然而，應當被理解的是，使用之唾液酸轉移酶也可是來自與該基因轉殖哺乳動物或該乳腺上皮細胞不同之物種。在某些具體實施例中，被引入該基因轉殖哺乳動物或該乳腺上皮細胞的唾液酸轉移酶細來自與要被修飾之蛋白質相同之物種(例如，使用人類唾液酸轉移酶以產生帶有增加的唾液酸化作用的人類抗體)。在某些具體實施例中，該基因轉殖哺乳動物或該乳腺上皮細胞經由基因轉殖方式表現來自相同物種的唾液酸轉移酶與外源蛋白質(例如，將人類唾液酸轉移酶與人類治療性抗體都基因轉殖到山羊內)。
在一方面，本發明提供治療發炎反應的方法與組合物。試驗顯示，以靜脈注射的Ig具有的抗發炎活性係因為IgG分子的Fc段連結的聚糖上具有末端α-2,6-唾液酸連結所造成。該以靜脈注射的Ig的族群之抗發炎活性的增加係經由將一末端α-2,6-唾液酸連結引入到所有Fc段連結的聚糖上而來(見，例如，Anthony等人，IVIG的抗發炎活性所需之受體的鑑定，PNAS第105卷：第19571-19578頁，2008年)。本文所提供之方法可使在基因轉殖動物的乳腺與乳腺上皮細胞中產生的外源蛋白質，例如治療性抗體，具有α-2,6-唾液酸化程度的增加。因此，本文所提供之方法可使在基因轉殖動物的乳腺與乳腺上皮細胞中產生的外源蛋白質，例如治療性抗體，具有增加抗發炎的特性。
應當理解的是，本文所提供之增加治療性抗體的抗發炎特性之方法可以被應用於任何治療性抗體。因此，在某些具體實施例中，本發 明提供具有增加的抗發炎活性之治療性抗體。應當進一步被理解的是，本文所提供之具有增加的抗發炎活性之抗體的產生方法可以被應用於抗發炎抗體，從而提供了具有作用的協同模式之抗發炎抗體(透過與一抗發炎標的物結合以及透過在其Fc段連結的聚糖上的α-2,6-唾液酸連結)。用於抗發炎治療的治療性抗體包括抗-TNFα抗體，例如infliximab單株抗體/Remicade(Centocor公司)，是一種小鼠-人類嵌合的單株抗TNF抗體、adalimumab單株抗體/Humira(Abbott公司)，一種全人類抗TNF抗體，以及golimumab單株抗體/Simponi(Centocor公司)，一種全人類抗TNF抗體，以抗體為基底的治療性TNF-α結合子包括Etanercept/Enbrel(Amgen公司)，一種將TNF受體的胞外區域與Ig1的Fc區域融合的融合蛋白質，以及certolizumab pegol/Cimzia(UCB公司)，一種人類化單株抗TNF抗體之聚乙二醇化的Fab’片段。用於抗發炎治療的治療性抗體亦包括非TNF-α抗細胞介素抗體，例如抗IL5(如，mepolizumab單株抗體)、抗IL2(如，daclizumab單株抗體)、抗IL4以及抗IL13抗體。用於抗發炎治療的治療性抗體亦包括抗IgE抗體(如，omalizumab單株抗體)、抗CD62抗體，及其他。
因此，在一方面，本發明提供經由基因轉殖而在乳腺中製造外源治療性抗體以及經由基因轉殖而製造唾液酸轉移酶的基因轉殖動物(以及乳腺上皮細胞)。由這樣的動物及細胞所製造的治療性抗體在其Fc段連結的聚糖上具有末端α-2,6-唾液酸連結程度的增加，進而具有增加的抗發炎活性(相較於在未以基因轉殖表現唾液酸轉移酶的基因轉殖動物與乳腺細胞中製造的治療性抗體)。在某些具體實施例中，該基因轉殖動物(與乳腺上皮細胞)係透過基因轉殖而在乳腺中製造外源抗發炎抗體，且透過基因轉殖而製 造唾液酸轉移酶。在某些具體實施例中，該抗發炎抗體係為抗TNF-α抗體。在某些具體實施例中，該抗發炎抗體為adalimumab單株抗體。
在一方面，本發明提供一種治療個體發炎反應的方法，包含投予個體該具有本文所提供之增加的抗發炎反應性質的抗體。
在一方面，本發明提供一種製造唾液酸轉移酶之方法，包含提供或製造已被/被修飾以增加該乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物，以及自該基因轉殖哺乳類動物的乳腺中收穫該唾液酸轉移酶。在某些具體實施例中，該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞係由將編碼唾液酸轉移酶的核酸序列引入到該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的基因組中而被修飾的。
在某些具體實施例中，根據本文所提供之方法製造之唾液酸轉移酶係用以唾液酸化蛋白質。
在一方面，本發明提供經由提供已被修飾以增加在乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物所製造的唾液酸轉移酶，以及自該基因轉殖哺乳動物的乳腺中收穫該唾液酸轉移酶。在某些具體實施例中，該基因轉殖哺乳動物係由將編碼唾液酸轉移酶的核酸序列引入到該基因轉殖哺乳動物的基因組中而被修飾的。
在某些具體實施例中，該唾液酸轉移酶係存在於一進一步包含乳汁的組合物中。
在一方面，本發明提供一種經由提供或製造已被/被修飾以增加乳腺中唾液酸轉移酶表現的基因轉殖哺乳動物所產生的具有修飾的糖化作用的蛋白質，其中該基因轉殖哺乳動物在該乳腺中表現蛋白質，以及 自該基因轉殖哺乳動物的該乳腺中收穫具有修飾的糖化作用的該蛋白質。在某些具體實施例中，該基因轉殖哺乳動物係由將編碼唾液酸轉移酶的核酸序列引入到該基因轉殖哺乳動物細胞的基因組中而被修飾的。
在某些具體實施例中，該具有修飾的糖化作用的蛋白質係存在於進一步含有乳汁的組合物中。在某些具體實施例中，該具有修飾的糖化作用的蛋白質係人類蛋白質。在某些具體實施例中，該具有修飾的糖化作用的蛋白質係抗體、抗凝血酶或α抗胰蛋白酶。
基因轉殖哺乳動物
在一方面，本發明提供一種已被修飾以增加乳腺中唾液酸轉移酶表現的基因轉殖哺乳動物。在某些具體實施例中，該基因轉殖哺乳動物為一有蹄類動物。在某些具體實施例中，該有蹄類動物為山羊。
在一方面，本發明提供一種已被修飾以增加唾液酸轉移酶表現的乳腺上皮細胞。
在某些具體實施例中，該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞係由將編碼唾液酸轉移酶的核酸序列引入到該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的基因組中而被修飾的。在某些具體實施例中，唾液酸轉移酶的表現係在乳汁啟動子的控制下進行。在某些具體實施例中，該乳汁啟動子係山羊β酪蛋白啟動子。
在一方面，本發明提供製造具有修飾的糖化作用之蛋白質的方法，其中該被修飾的蛋白質係在乳腺或乳腺上皮細胞中表現。在某些具體實施例中，該在基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞中表現的蛋白質係由被引入該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的基因組中的核酸序列所編 碼。在某些具體實施例中，唾液酸轉移酶的表現係在一乳汁啟動子的控制下進行。在某些具體實施例中，該乳汁啟動子係山羊β酪蛋白啟動子。
在一方面，本發明提供一種在乳腺中增加唾液酸轉移酶表現的基因轉殖非人類哺乳動物。在某些具體實施例中，該在乳腺中增加唾液酸轉移酶表現的基因轉殖非人類哺乳動物也在該乳腺中表現一基因轉殖蛋白質(如，外源蛋白質)。
在一方面，本發明提供具有增加唾液酸轉移酶表現的乳腺上皮細胞。在某些具體實施例中，該具有增加唾液酸轉移酶表現的乳腺上皮細胞亦表現一重組蛋白質(如，外源蛋白質)。
在一方面，本發明提供一種包含在具有由一核酸構築體所編碼的唾液酸轉移酶的基因轉殖非人類哺乳動物的乳汁中表現的唾液酸轉移酶的製造方法。在一方面，本發明提供一種具有修飾的糖化作用之蛋白質的製造方法，包含在乳腺中具有增加的唾液酸轉移酶的表現之基因轉殖非人類哺乳動物的乳汁中表現，以及由一核酸構築體所編碼的基因轉殖蛋白質(如，外源蛋白質)。
在某些具體實施例中，該唾液酸轉移酶或具有修飾的糖化作用之蛋白質的製造方法包含：
(a)將編碼唾液酸轉移酶及/或該待被修飾的蛋白質的基因轉殖DNA構築體轉染到非人類哺乳動物細胞中；
(b)選擇細胞，其中該基因轉殖DNA構築體已被插入該細胞的基因組中；以及
(c)執行第一核轉移過程以產生非人類基因轉殖哺乳動物的雜合唾液 酸轉移酶及/或待被修飾的蛋白質，且其可在其乳汁中表現唾液酸轉移酶及/或具有修飾的糖化作用之蛋白質，以及可視情況地
(d)重複一或多個該步驟以創造可以在乳腺中表現該唾液酸轉移酶與待被修飾的蛋白質的基因轉殖哺乳動物。
在一方面，本發明提供一種以下之方法：(a)提供一種以遺傳工程表現唾液酸轉移酶與待被修飾的蛋白質(如，一外源蛋白質)的非人類基因轉殖哺乳動物；(b)在該非人類基因轉殖哺乳動物的乳汁中表現唾液酸轉移酶與待被修飾的蛋白質；以及(c)分離在乳汁中產生的具有修飾的糖化作用之蛋白質。
基因轉殖哺乳動物亦可根據本領預習知的方式來產生(見，例如，美國專利號5,945,577)。適合用於基因轉殖表現的哺乳動物包括，但不限於，山羊、綿羊、野牛、駱駝、乳牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或駱馬。合適的哺乳動物也包括牛、山羊、綿羊及豬，其分別涉及不同種類的乳牛、山羊、綿羊及豬(或豬(swine))。合適的哺乳動物也包括有蹄類動物。本文所用之「有蹄類動物」為或涉及一有蹄一般為草食性的四足哺乳動物，包括，但不限於，綿羊、豬、山羊、牛及馬。在一具體實施例中，該哺乳動物係由將初代細胞與單獨的構築體共轉染而產生。這些細胞接著被用於核轉移。或者，若使用微注射來產生基因轉殖哺乳動物，該構築體也可被注入。
基因轉殖蛋白質(如，唾液酸轉移酶)的哺乳動物可以與基因轉殖待被修飾之蛋白質的哺乳動物雜交，從而產生基因轉殖唾液酸轉移酶 與待被修飾之蛋白質兩者的哺乳動物。
選殖會造成基因轉殖哺乳動物的多樣性-每種都能製造一唾液酸轉移酶或其他有興趣的基因構築體。該製造方法包括使用該選殖哺乳動物與繁衍這些哺乳動物。在某些具體實施例中，該選殖的哺乳動物為山羊、牛或小鼠。選殖亦包含胎兒的核轉移、核轉移、組織與器官移植，以及嵌合後代的創造。
該選殖過程的步驟包含將含有編碼該唾液酸轉移酶及/或待被修飾之蛋白質的轉殖基因的細胞基因組轉移到去核的卵母細胞中。如本文所用，「轉殖基因」意指由人工方法插入細胞或其祖先細胞之核酸分子的任何片段，且變成自該細胞發展成哺乳動物之基因組的部分。這樣的轉殖基因可包括對該基因轉殖哺乳動物而言為部分或全然外源的(即，外來的)基因，或可代表具有與該哺乳動物的內源基因相同的基因。
合適的卵母細胞的哺乳動物來源包括山羊、綿羊、乳牛、豬、兔、天竺鼠、小鼠、倉鼠、大鼠、非人類之靈長類等。較佳地，卵母細胞係來自於有蹄類動物，且最佳地為山羊或牛。卵母細胞的分離方法為本領域所習知的。基本上，該方法包含自哺乳動物，如山羊，的卵巢或生殖道分離卵母細胞。一個有蹄類動物卵母細胞的現成來源係來自由激素引發的雌性哺乳動物。為了成功使用如基因工程、核轉移與選殖技術，較佳地，在卵母細胞被用作核轉移的受體細胞之前，以及在卵母細胞由精子細胞受精以發展為胚胎之前，卵母細胞係在體內成熟。已在體內成熟的處於中期II階段的卵母細胞，已經成功地被用於核轉移技術。基本上，在發情開始過後或注射人類絨毛膜促性腺素(human chorionic gonadotropin，hCG)或類似的 激素過後數小時，以外科手術自非超排卵或超排卵哺乳動物中收集成熟的中期II卵母細胞。
一項用於預測在乳腺中表現的重組蛋白質之數量與質量的工具係透過誘導泌乳達成(Ebert KM，1994年)。誘導泌乳可用於來自基因轉殖產物早期之蛋白質，而非來自因懷孕所造成的第一次自然泌乳之蛋白質的表現及分析，因懷孕所造成的第一次自然泌乳至少需一年以後。誘導泌乳可以激素或手動完成。
在某些具體實施例中，根據本文所提供之方法製造的該唾液酸轉移酶及/或具有修飾的糖化作用之蛋白質的組合物進一步包含乳汁。
在某些具體實施例中，本文所提供的方法包括自一基因轉殖哺乳動物的乳汁中收獲(如，分離)該唾液酸轉移酶及/或具有修飾的糖化作用之蛋白質的步驟(見，例如，Pollock等人，免疫學方法期刊，第231卷，第1-2期，1999年12月10日，第147-157頁)。
用於產生基因轉殖哺乳動物的構築體
在某些具體實施例中，為製造含有構築體(如，編碼唾液酸轉移酶及/或待被修飾的蛋白質)的初代細胞株，且該構築體係用於經由核轉移而產生基因轉殖哺乳動物(如，山羊)，該構築體可以被轉染至初代(山羊)皮膚上皮細胞內，該細胞係經由選殖而擴增且充分具有評估轉殖基因拷貝數、轉殖基因結構完整性與染色體嵌入位點的特性。如本文所用，「核轉移」意指一種選殖的方法，其中來自供體細胞的細胞核被移植到去核卵母細胞內。
目標蛋白質(如，唾液酸轉移酶)的編碼序列可以經由篩選衍 生自選擇的哺乳動物(例如有蹄類動物，嚙齒動物等)的基因庫或反轉錄訊息RNA而得，亦可自序列資料庫如NCBI、Genbank而得，或經由獲得唾液酸轉移酶及/或待被修飾的蛋白質的序列而來等等。該序列可被選殖到適當的質體載體中且在合適的宿主生物體，如大腸桿菌E.coli，中擴增。在擴增該載體後，該DNA構築體可以被切出，自載體的剩餘部分中純化出來，並且被引入可以被用來製造基因轉殖哺乳動物的表現載體中。該基因轉殖哺乳動物將具有嵌合到其基因組中的目標基因轉殖蛋白質。
在擴增該載體之後，該DNA構築體可以與適當的5’及3’控制序列一起被切出，自載體的剩餘部分中純化出來，並且被用來製造已將目標非糖化作用的相關基因轉殖蛋白質嵌合至其基因組中的基因轉殖哺乳動物。相反地，當使用某些載體時，例如酵母菌人工染色體(yeast artificial chromosomes，YACs)，就不需自該載體中移除組裝的構築體；在這樣的情況下，該擴增的載體可以被直接用來製造基因轉殖哺乳動物。該編碼序列可被操作地連結控制序列，其可使該編碼序列在基因轉殖非人類哺乳動物的乳汁中被表現。
一種適合將唾液酸轉移酶及/或待被修飾之蛋白質的製造引導至基因轉殖哺乳動物的乳汁的DNA序列可以攜帶來自天然衍生的乳汁蛋白質的5’啟動子區域。因此，該啟動子是在激素與組織特異性因子的控制之下，且在泌乳乳腺組織中最為活躍。在某些具體實施例中，該啟動子是一種山羊β-酪蛋白啟動子。該啟動子可被操作地連結到一種引導蛋白質領導序列之產生的DNA序列，其係引導該基因轉殖蛋白質在整個乳腺上皮細胞中分泌進入乳汁。在某些具體實施例中，一種3’序列，其可衍生自天然分泌的 乳汁蛋白質，可被添加以增進mRNA的穩定性。
如本文所用，「領導序列」或「訊號序列」係編碼蛋白質分泌訊號的核酸序列，且當其可被操作地連結到一編碼基因轉殖蛋白質的核酸分子之下游，該序列引導分泌。該領導序列可為天然的人類領導序列、人工衍生的領導序列，或可得自與用於引導該轉殖基因編碼序列之轉錄的啟動子相同的基因，或得自通常自細胞，例如哺乳動物乳腺上皮細胞，分泌的另一蛋白質。
在某些具體實施例中，該啟動子為乳汁特定的啟動子。如本文所用，「乳汁特定的啟動子」係為天然地引導在分泌蛋白質到乳汁中的細胞(如，乳腺上皮細胞)內表現基因的啟動子，且包括，例如，酪蛋白啟動子，如，α-酪蛋白啟動子(如，α S-1酪蛋白啟動子與α S2-酪蛋白啟動子)、β-酪蛋白啟動子(如，山羊β-酪蛋白基因啟動子(DiTullio，生物技術期刊，第10卷：第74-77頁，1992年))、γ-酪蛋白啟動子、κ-酪蛋白啟動子、乳清酸性蛋白質(whey acidic protein，WAP)啟動子(Gordon等人，生物技術期刊，第5卷：第1183-1187頁，1987年)、β-乳球蛋白啟動子(Clark等人，生物技術期刊，第7卷：第487-492頁，1989年)以及α-乳白蛋白啟動子(Soulier等人，FEBS LETTS.期刊，第297卷：第13頁，1992年)。也包括在此定義的是在乳腺組織中特異地活化的啟動子，例如，小鼠乳腺腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)的長終端重複序列(long terminal repeat，LTR)啟動子。
如本文所用，編碼序列與調控序列被說成是「可操作地連接」，意指該編碼序列與調控序列以這樣的方式共價連結，以將該編碼序列的表現或轉錄放置於該調控序列的影響或控制之下。為了使該編碼序列被 轉譯為功能性蛋白質，該編碼序列被可操作地連接到調控序列。若將啟動子引入該5’調控序列而造成該編碼序列的轉錄，且若該二DNA序列之間連結的性質不會(1)導致引入編碼框架位移突變，(2)干擾該啟動子區域引導該編碼序列轉錄的能力，或(3)干擾對應的RNA轉錄產物被轉譯為蛋白質的能力，則該二DNA序列被說成是可操作地連接。因此，若啟動子區域可以影響DNA序列的轉錄，且這樣所產生的轉錄產物可能被轉譯為目標蛋白質或多胜肽，則該啟動子區域係可操作地連接至該編碼序列。
如本文所用，「載體」可能為任何數目的核酸，且目標序列可透過限制酶切與連接作用而被插入該核酸中，用以在不同的遺傳環境之間運輸或用以在宿主細胞中表現。載體通常由DNA組成，雖然也可使用RNA載體。載體包括，但不限於，質體與噬菌粒。選殖載體是可以在宿主細胞中複製的載體，且其進一步的特徵為，在該載體上具有一或多個內切酶限制切位可使該載體以可決定的方式被切開，且一目標DNA序列可連接到該載體上，而該新的重組載體仍保留其在該宿主細胞中的複製能力。在質體的情況下，該目標序列的複製可能會發生很多次，因為該質體的拷貝數在該宿主細菌中增加的緣故，或是當該宿主以有絲分裂進行複製時，在每個宿主中只發生一次該目標序列的複製。在噬菌體的情況下，複製可能在裂解期間主動發生，或在溶原期間被動發生。表現載體是目標DNA序列可以經由限制酶切與連接作用而被插入其中的載體，使得該目標DNA序列被可操作地連接到調控序列，且可能表現出RNA轉錄產物。載體可進一步包含一或多個適合用於辨識細胞的標記序列，該細胞已被或尚未被轉型或轉染該載體。標記包括，例如，編碼蛋白質的基因，其中該蛋白質會增加或減 少對抗生素或其他化合物的抗性或敏感性；編碼酵素的基因，其中該酵素的活性可經由本領域習知的標準分析所偵測(例如，β-半乳糖苷酶或鹼性磷酸酶)；以及明顯地影響轉型或轉染的細胞、宿主、菌落或噬菌斑的表現型的基因。較佳的載體為可以自主複製與表現存在於該載體可操作地連接之DNA片段上的結構基因產物。
本發明進一步由以下實施例所說明，其以任何方式皆不應被解釋為進一步之限制。本申請案中引用之所有參考文獻(包括著作參考文獻、已授權的專利、公開的專利申請，以及同在審查中的專利申請)的全部內容在此係明確地以引用方式併入，特別是針對上文中引用到的教示。然而，任何參考文獻的引用並非意圖承認該參考文獻為現有技術。
實施例 實施例1 在乳腺中唾液酸轉移酶含量之確定
在乳腺中產生的蛋白質的不完全唾液酸化的一個原因可能是，相較於在肝臟中發現的唾液酸轉移酶的含量，在該乳腺中唾液酸轉移酶的含量有限，而在肝臟中血清蛋白質可被正常地分泌。為了評估此一假設，從來自山羊肝臟的cDNA庫中分離出2,6唾液酸轉移酶的基因。將這個cDNA用來作為北方氏墨點分析的探針，以確定在乳腺中與在肝臟中該基因表現的程度。經由北方氏分析，在乳腺中所發現的唾液酸轉移酶表現的程度大約為在肝臟中所發現的表現程度的百分之一，暗示在乳腺中該唾液酸化能力的限制。
來自山羊肝臟的ST6 Gal1之選殖
使用分離自山羊肝臟的RNA來構築一cDNA庫。使用人類ST6的已知序列來設計可以擴增該山羊序列的PCR引子。在RT-PCR反應之後，分離出一個編碼2,6唾液酸轉移酶(ST6 Gal1)的全長cDNA。該山羊ST6 Gal1的蛋白質序列可與人類的該蛋白質相比(見圖1：GENE ID：100861310 ST6GAL1，ST6 β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶-1[山羊(Capra hircus)]；圖1描述了山羊(上排：「查詢」；SEQ ID NO：1)與人類(下排：「主體」；SEQ ID NO：2)的ST6 Gal1序列。
將編碼該2,6唾液酸轉移酶的基因連結到山羊β酪蛋白表現載體中，以得到該質體BC2541 ST6Gal1(見圖2)。該載體包括該山羊β酪蛋白啟動子以引導連接的基因表現到乳腺中。
基因轉殖山羊的產生
該BC2541 ST6Gal1轉殖基因係用來產生在其乳腺中表現該ST6Gal1的基因轉殖山羊。所得到的山羊的基因組中帶有該β酪蛋白唾液酸轉移酶基因。如下所示，該基因轉殖山羊在其乳汁中生產唾液酸轉移酶。
唾液酸轉移酶係在乳腺中被製造(「活體外」活性)
經由分析測試唾液酸轉移酶的酵素活性以確認該基因轉殖山羊的乳腺中存在唾液酸轉移酶。意即，唾液酸轉移酶可以對在N-連結的複糖上暴露的1,4半乳糖進行唾液酸化作用。
重組的α-1抗胰蛋白酶(Alpha-1 antitrypsin，AAT)，當在基因轉殖山羊的乳汁中製造，有50%被唾液酸化，相較之下，自血清中分離的AAT幾乎完全地被唾液酸化(如，市售可得的Alfalastin®)。在基因轉殖山羊的乳汁中製造的該重組的α-1抗胰蛋白酶被用來作為與在基因轉殖山羊的乳汁中製造的唾液酸轉移酶進行唾液酸化反應的標的。來自在乳腺中表現唾液酸轉移酶的山羊的乳汁，隨著核苷糖CMP-唾液酸，與低唾液酸化的AAT共同培養。此外，以市售可得的唾液酸轉移酶作為對照組。經由將該 培養的AAT在一等電聚焦凝膠(isoelectric focusing gel，IEF gel)上進行電泳，以確認在培養時唾液酸添加至該低唾液酸化的AAT。在該蛋白質(AAT)上增加的唾液酸含量導致一較低的等電點(isoelectronic point，pI)造成該蛋白質跑到該凝膠上較低的位置。相較於正對照組，其為自血清分離的完全唾液酸化的AAT Alfalastin®，該重組的AAT(其係為50%唾液酸化)被預期跑在該膠體上較高的位置。
圖3A的左排顯示一唾液酸化試驗，比較AAT(第2道)與處理市售可得之唾液酸轉移酶混合物之低唾液酸化的AAT(第3道)。如同預期，相較於未處理唾液酸轉移酶的AAT(第2道)，該處理唾液酸轉移酶的AAT(第3道)在該IEF凝膠上跑到較低的位置。
圖3A右排顯示出相似的結果。相較於未處理的低唾液酸化的AAT(第2道)，將低唾液酸化的AAT以一唾液酸轉移酶的混合物處理(第3道)或將低唾液酸化的AAT以來自乳汁的唾液酸轉移酶的不同純化批次處理(第4道與第5道)，造成唾液酸含量的增加且向下位移。
圖3B顯示凝膠出示Alfalastin®，一種AAT的唾液酸化版本(第1道)、以來自製造唾液酸轉移酶的基因轉殖山羊的乳汁處理的AAT(第2道與第7道)、以來自一對照動物的乳汁處理的AAT(第3道與第8道)、以來自對照動物的乳汁與由基因轉殖製造的唾液酸轉移酶處理的AAT(第4道)、以緩衝液與由基因轉殖製造的唾液酸轉移酶處理的AAT(第5道)，以及以緩衝液處理的AAT(第6道)。
因此，如圖3所示，在基因轉殖山羊的乳汁中製造的唾液酸轉移酶ST6Gal1在「活體外」是活化的，且可以將低唾液酸化的AAT進行唾液酸化到血漿衍生的完全唾液酸化AAT的程度。
以基因轉殖製造的唾液酸轉移酶處理的AAT的糖化作用模式
由基因轉殖製造的唾液酸轉移酶是從基因轉殖動物的乳汁中純化出來的，且被用來對目標蛋白質(即低唾液酸化的AAT)進行唾液酸化。在對低唾液酸化的AAT處理唾液酸轉移酶之後，評估AAT的糖化作用以確認唾液酸是否被加到AAT的糖化側鏈上暴露的半乳糖殘基。
如圖4所示，以自製造唾液酸轉移酶的基因轉殖山羊的乳汁中收獲的唾液酸轉移酶進行之「活體外」唾液酸化作用，將AAT上大部份的單唾液酸化的雙觸角複糖轉換為雙唾液酸化的形式。下方圖式顯示，在唾液酸化作用之前的AAT，而上圖顯示在受到唾液酸化作用之後的AAT。
在乳腺中的唾液酸轉移酶活性(「活體內」)
評估在乳腺中以基因轉殖製造的唾液酸轉移酶對於增加同樣也是由該乳腺分泌的重組蛋白質的唾液酸化程度之能力。
為了測試該ST6Gal1在乳腺中是否活化，評估內源蛋白質唾液酸化的程度。乳鐵蛋白為內源的乳汁產生的蛋白質，其帶有三個N連結糖化作用位置。乳鐵蛋白是由帶有該ST6Gal1基因且在其乳汁中製造唾液酸轉移酶的山羊的乳汁中分離而來(圖5，第2欄)。乳鐵蛋白亦自未帶有該ST6Gal1基因的對照動物中分離而來(圖5，第1欄)。該二個乳鐵蛋白樣本，與其二重複製備物，以N-聚糖酶，衍生的2-胺基苯甲酸(2-aminobenzoic acid，2-AA)處理，且糖化作用模式以帶有螢光偵測的HILIC LC-MS/(MS)分析。該結果(圖5)顯示，在基因轉殖哺乳動物中唾液酸轉移酶的活性增加，因為在該乳鐵蛋白上的雙唾液酸化的N-連結糖的數量自總糖的25%增加至34%。雙唾液酸化的增加與單唾液酸化的糖的轉換有關，其顯示出自在對照組中的18%減少到在表現唾液酸轉移酶山羊中的5%。因此，在乳腺中產生的該ST6Gal1將大部份的低唾液酸化的單唾液酸化之N-連結糖轉換為雙唾液酸化的形式。因此，該ST6 Gal1唾液酸轉移酶在乳腺中是活化的，且可以將唾液酸加到在乳腺中的糖蛋白上。
由基因轉殖而製造的蛋白質之唾液酸化
在乳腺中唾液酸轉移酶表現量的增加應該導致也在該乳腺中製造的重組蛋白質的唾液酸化的增加。如上所示，ST6Gal1，當分泌到乳汁中，在「體外」AAT上是活化的。AAT也被用來評估基因轉殖表現的唾液酸轉移酶對以基因轉殖表現的蛋白質進行唾液酸化的能力。ST6 Gal1與AAT兩者在相同的乳腺中共同表現。這是透過帶有AAT的山羊與帶有該ST6 Gal1的山羊雜交的品系所達成，產生帶有該兩種構築體的哺乳動物。帶有該基因構築體以將AAT表現到乳汁中的雄性山羊(BC30)係與超排卵ST6Gal1雌性雜交。分離來自該雜交的胚胎，且將之植入代理孕母體內。由此過程中，產出26隻動物。經基因檢測，有2隻雌性動物被確認帶有AAT與ST6 Gal1基因構築體兩者。此外，確認有4隻雌性動物只帶有AAT構築體，其作為負對照組。
在該帶有ST6Gal1與AAT基因兩者的動物(以及對照組動物)3個月大時，誘發其泌乳。自帶有該ST6Gal1的動物以及對照組動物分離AAT。分析該蛋白質的糖化作用，包括唾液酸的含量。如圖6所示，在該對照組AAT動物上的雙觸角N-連結糖為50%雙唾液酸化(下圖)。然而，分離自帶有該ST6Gal1構築體的品系的AAT則完全地被唾液酸化。在AAT上唾液酸含量的增加表示，過度表現唾液酸轉移酶能增加由乳腺表現之重組蛋白質的唾液酸化。
實施例2 在乳腺中2,3唾液酸轉移酶含量之確定
由來自山羊肝臟的cDNA庫分離2,3唾液酸轉移酶的基因。此cDNA庫被用來作為在北方氏墨點分析法中的探針，以確定在乳腺與肝臟中該基因的表現程度。相較於肝臟，在乳腺中該2,3唾液酸轉移酶表現的減少意味著在乳腺中該2,3唾液酸化能力的限制。
來自山羊肝臟的ST3 Gal1之選殖
使用分離自山羊肝臟的RNA來構築cDNA庫。使用人類ST3的序列來設計可以擴增該山羊序列的PCR引子。在RT-PCR反應之後，分離出一個編碼2,3唾液酸轉移酶(ST3 Gal1)的全長cDNA。將編碼該2,3唾液酸轉移酶的基因連結到山羊β酪蛋白表現載體中，以得到該質體，例如BC2541 ST3Gal1，包括該山羊β酪蛋白啟動子以引導連接的基因表現到乳腺中。
基因轉殖山羊的產生
含有ST3Gal1的轉殖基因係用來產生在其乳腺中表現該ST3Gal1的基因轉殖山羊。所得到的山羊的基因組中帶有該β酪蛋白唾液酸轉移酶基因，且該基因轉殖山羊在其乳汁中製造唾液酸轉移酶。
在乳腺中唾液酸轉移酶的製造(「活體外」活性)
使用分析以測試唾液酸轉移酶的酵素活性來確認該基因轉殖山羊的乳腺中存在唾液酸轉移酶。例如，唾液酸轉移酶可以對在N-連結的複糖上暴露的1,4半乳糖進行唾液酸化作用。
在基因轉殖山羊的乳汁中製造的該重組的α-1抗胰蛋白酶被用來作為與在基因轉殖山羊的乳汁中製造的2,3唾液酸轉移酶進行唾液酸化反應的標的。來自在乳腺中表現唾液酸轉移酶的山羊的乳汁，隨著核苷糖CMP-唾液酸，與該低唾液酸化的AAT共同培養。此外，以市售可得的唾液酸轉移酶作為對照組。經由將該培養的AAT在一等電聚焦凝膠(IEF gel)上進行電泳，以確認在培養時唾液酸添加至該低唾液酸化的AAT。在該蛋白質(AAT)上增加的唾液酸含量可導致一較低的等電點(pI)造成該蛋白質跑到該凝膠上較低的位置。相較於正對照組，其為自血清分離的完全唾液酸化的AAT Alfalastin®，該重組的AAT(其係為50%唾液酸化)被預期跑在該膠體上較高的位置。
以基因轉殖方式製造的ST3處理的AAT之糖化作用模式
由基因轉殖製造的2,3唾液酸轉移酶是從基因轉殖動物的乳汁中純化出來的，且被用來對低唾液酸化的AAT進行唾液酸化作用。在對低唾液酸化的AAT處理唾液酸轉移酶之後，評估AAT的糖化作用以確認唾液酸是否被加到AAT的糖化側鏈上暴露的半乳糖殘基。
在乳腺中唾液酸轉移酶的活性(「活體內」)
評估在乳腺中以基因轉殖製造的2,3唾液酸轉移酶對於增加同樣也是由該乳腺分泌的重組蛋白質，或由該乳腺分泌的內源蛋白質(如，乳鐵蛋白)，的唾液酸化程度之能力。
以基因轉殖製造的蛋白質之唾液酸化
在乳腺中唾液酸轉移酶表現量的增加可以導致也在該乳腺中製造的重組蛋白質的唾液酸化作用的增加。AAT也被用來評估基因轉殖表現的唾液酸轉移酶對一以基因轉殖表現的蛋白質進行唾液酸化的能力。ST3 Gal1與AAT兩者在相同的乳腺中共同表現。這是透過帶有AAT的山羊與帶有該ST3 Gal1的山羊雜交的品系所達成，產生帶有該兩種構築體的哺乳動物。帶有該基因構築體以將AAT表現到乳汁中的雄性山羊(BC30)係與超排卵ST3Gal1雌性雜交。分離來自該雜交的胚胎，且將之植入代理孕母體內。檢測後代且確認帶有AAT與ST3 Gal1基因構築體兩者的後代動物。其他只帶有AAT構築體的後代動物可作為負對照組。
在該帶有ST3Gal1與AAT基因兩者的動物(以及對照組動物)3個月大時，誘發其泌乳。自帶有該ST3Gal1的動物以及對照組動物分離AAT，並且分析該蛋白質的糖化作用，包括唾液酸的含量。
實施例3：藥物動力學曲線
如圖7所示，經由分析經過25小時的時間週期之AAT濃度的演化，來比較已經被ST3或ST6唾液酸化之以基因轉殖製造的AAT的藥物動力學曲線與血漿衍生的AAT(plasma-derived AAT，pdAAT)。
圖7顯示，相較於沒有被唾液酸化的AAT(pdAAT)，被ST3或ST6唾液酸化之AAT具有較佳的半衰期。
等同範圍
前述書面說明書被認為足以使本領域技術人員能夠實施本發明。本發明並不以提供實施例之方式來限制範圍，因為這些實施例係被意圖作為本發明某些方面以及具體實施例的說明。其他功能上等同的具體實施例皆於本發明的範圍之內。除了那些在本文所顯示與描述的修改之外，對於本領域技術人員而言，從前面的描述，本發明的各種修改將變得明顯，且落在所附之申請專利範圍的範圍之內。本發明的優點與目的不必然是由本發明的各具體實施例所涵蓋。
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Claims (38)

  1. 一種製造具有修飾的糖化作用之蛋白質的方法，該方法包含：提供已被修飾以增加乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物，其中該基因轉殖哺乳動物在該乳腺中表現蛋白質；以及自該基因轉殖哺乳動物的該乳腺中收穫該蛋白質。
  2. 一種製造具有修飾的糖化作用之蛋白質的方法，該方法包含：提供已被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現的乳腺上皮細胞，其中該乳腺上皮細胞表現蛋白質；以及自該乳腺上皮細胞中收穫該蛋白質。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中相較於在未被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞中製造的蛋白質，該糖化作用係經過修飾的。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中該修飾的糖化作用係增加的唾液酸化作用。
  5. 一種製造具有增加的唾液酸化作用之蛋白質的方法，該方法包含：提供已被修飾以增加該乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物，其中該基因轉殖哺乳動物在該乳腺中表現蛋白質；以及自該基因轉殖哺乳動物的該乳腺中收穫該具有增加的唾液酸化作用之蛋白質。
  6. 如申請專利範圍第4或5項之方法，其中相較於在未被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞中製造的蛋白質，該唾液酸化作用是增加的。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之方法，其中該具有修飾的糖化 作用之蛋白質或具有增加的唾液酸化作用之蛋白質係人類蛋白質。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該具有修飾的糖化作用之蛋白質或具有增加的唾液酸化作用之蛋白質係抗體。
  9. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該具有修飾的糖化作用之蛋白質或具有增加的唾液酸化作用之蛋白質係為抗凝血酶。
  10. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中該具有修飾的糖化作用之蛋白質或具有增加的唾液酸化作用之蛋白質係為α-1抗胰蛋白酶。
  11. 根據申請專利範圍第1至10項中任一項之方法所製造之具有修飾的糖化作用之蛋白質或具有增加的唾液酸化作用之蛋白質。
  12. 一種包含如申請專利範圍第11項之具有修飾的糖化作用之蛋白質或具有增加的唾液酸化作用之蛋白質的組合物，進一步包含乳汁。
  13. 一種在該乳腺中增加該唾液酸轉移酶活性之方法，該方法包含：提供已被修飾以增加該乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物。
  14. 一種製造唾液酸轉移酶之方法，該方法包含：提供已被修飾以增加該乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物；以及自該基因轉殖哺乳類動物的乳腺中收穫該唾液酸轉移酶。
  15. 如申請專利範圍第14項之方法，進一步包含使用該唾液酸轉移酶以唾液酸化一蛋白質。
  16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該唾液酸轉移酶係與該蛋白質接觸。
  17. 根據如申請專利範圍第15或16項之方法所製造之唾液酸轉移酶。
  18. 一種包含如申請專利範圍第17項之唾液酸轉移酶的組合物，進一步包 含乳汁。
  19. 如前述任何一項申請專利範圍之方法，其中該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞係由將編碼唾液酸轉移酶的核酸序列引入到該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的基因組中而被修飾。
  20. 如前述任何一項申請專利範圍之方法，其中在該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞中表現的該蛋白質係由被引入到該基因轉殖哺乳動物或乳腺上皮細胞的基因組中的核酸序列所編碼。
  21. 一種已被修飾以增加該乳腺中唾液酸轉移酶之表現的基因轉殖哺乳動物。
  22. 如申請專利範圍第21項之基因轉殖哺乳動物，其中該基因轉殖哺乳動物進一步在該乳腺中表現外源蛋白質。
  23. 如申請專利範圍第22項之基因轉殖哺乳動物，其中該外源蛋白質係人類蛋白質。
  24. 如申請專利範圍第22或23項之基因轉殖哺乳動物，其中該外源蛋白質係抗體。
  25. 如申請專利範圍第22或23項之基因轉殖哺乳動物，其中該外源蛋白質係為抗凝血酶。
  26. 如申請專利範圍第22或23項之基因轉殖哺乳動物，其中該外源蛋白質係為α-1抗胰蛋白酶。
  27. 一種已被修飾以增加唾液酸轉移酶之表現的乳腺上皮細胞。
  28. 如申請專利範圍第27項之乳腺上皮細胞，其中該乳腺上皮細胞進一步表現外源蛋白質。
  29. 如申請專利範圍第28項之乳腺上皮細胞，其中該外源蛋白質係人類蛋白質。
  30. 如申請專利範圍第28或29項之乳腺上皮細胞，其中該外源蛋白質係 抗體。
  31. 如申請專利範圍第28或29項之乳腺上皮細胞，其中該外源蛋白質係為抗凝血酶。
  32. 如申請專利範圍第28或29項之乳腺上皮細胞，其中該外源蛋白質係為α-1抗胰蛋白酶。
  33. 如前述任何一項申請專利範圍之方法或哺乳動物，其中該基因轉殖哺乳動物係有蹄類動物。
  34. 如申請專利範圍第33項之方法或哺乳動物，其中該有蹄類動物係山羊。
  35. 如前述任何一項申請專利範圍之方法、細胞或哺乳動物，其中唾液酸轉移酶及/或該蛋白質的表現係在乳汁啟動子的控制下進行。
  36. 如申請專利範圍第35項之方法、細胞或哺乳動物，其中該乳汁啟動子係山羊β酪蛋白啟動子。
  37. 如前述任何一項申請專利範圍之方法、細胞或哺乳動物，其中該唾液酸轉移酶係β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶。
  38. 如前述任何一項申請專利範圍之方法、細胞或哺乳動物，其中該唾液酸轉移酶係β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶。
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