CN101932231A - 禽类的糖基化 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了在输卵管组织中产生具有修饰寡糖结构的蛋白质的转基因禽类，以及产生这种禽类的方法。本发明还包含转基因个体中产生的修饰的蛋白质。
Description
相关申请信息
本申请要求2008年1月7日提交的美国临时申请号61/010,207的权利，并将其整体纳入作为参考。
背景
某些具有潜在商业用途的蛋白质需要翻译后修饰，这些修饰可由哺乳动物细胞有效产生。然而，哺乳动物细胞，如工业标准中国仓鼠细胞(CHO)，在GMP条件下难以生长，如果繁殖至商业目的所需规模需要大量资源。基于动物的反应器系统因为其低成本、低维护且易于规模化，是具有吸引力的基于CHO和其它哺乳动物细胞的系统的替代品。然而，治疗性蛋白质的翻译后修饰，尤其是糖基化，与哺乳动物细胞如CHO细胞相比，在某些动物和植物中执行方式不同。转基因禽类，部分因其高效产卵和产生蛋白质的能力，已成功用作治疗性蛋白质的生物反应器。在一些例子中，发现与禽类如鸡的输卵管产生的并存储于卵的蛋白质相连接的糖分子(即寡糖或糖基化结构)具有CHO和人类蛋白质相似的基本结构。然而，输卵管中产生的某些蛋白质中并不出现某些结构性糖元件，这些结构性糖元件对于蛋白质在病人中的生物反应性和生物利用度至关紧要。
当卵黄在输卵管(哺乳动物输卵管的禽类等价物)中行进时在其周围形成卵清。输卵管中卵清形成的部分叫做输卵管膨大部(magnum)，由专门负责合成并分泌卵清蛋白质的称作管状腺细胞(TGC)的细胞聚集而成。
蛋白质中的两类主要的糖基化结构，N-和O-连接的寡糖，由不同的酶的集合合成。对于产蛋母鸡的输卵管膨大部产生并存储于卵清中的O-连接的寡糖(也称作O-聚糖)，寡糖产生所用的酶机器似乎与人O-聚糖产生所用的类似，因为在人和禽类输卵管中产生的寡糖结构中出现完全相同的糖和连接。
母鸡卵清N-连接寡糖(也称作N-聚糖)具有与人中那些某种程度相似的结构，但通常缺少末端的半乳糖和唾液酸糖。对于某些治疗性蛋白，末端的半乳糖和唾液酸也许对于病人中的生物利用度以及因此产生的效果至关紧要。
末端的唾液酸残基在母鸡输卵管产生的N-聚糖结构中很少出现或根本不出现，它掩盖N-聚糖不被各种凝集素(识别糖分子的受体)识别。末端具有Gal的蛋白质可被肝脏中表达的凝集素结合并从病人的血液循环中清除(Ashwell和Morell.Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 41：99-128，1974)。具有含末端GlcNAc的N-聚糖的蛋白质，通常如母鸡输卵管产生的蛋白质，或者含末端甘露糖的N-聚糖的蛋白质被巨嗜细胞上表达的凝集素结合，并导致清除(Schlesinger等，Biochem J 192：597-606，1980)。这些结果可导致蛋白半衰期缩短，并降低效果。
有趣的时，鸡的其它器官中产生的N-聚糖，如血液中的那些，通常以Gal和/或唾液酸结尾(Ito等，Rapid Commun Mass Spectrom 20：3557-65，2006；Raju等，Glycobiology 10：477-86.，2000)。因此显然鸡的基因组中包含合成完全唾液酸化N-聚糖所需的酶的编码基因。
对于来自鸡卵清的N-聚糖，一小部分的侧链被Gal占据，这些Gal中的一小部分带有唾液酸帽子。对于卵清O-聚糖，绝大部分的侧链带有唾液酸帽子。在卵清蛋白质中有相当数量的半乳糖和唾液酸，主要是因为O-聚糖修饰的卵清蛋白质的丰度(Feeney等，J Biol Chem 235：2633-7，1960；Feeney等，J Biol Chem 235：2307-11，1960；Robinson和Monsey.Biochem J 147：55-62，1975)。N-和O-聚糖合成通路共享相同的Gal和唾液酸库(Varki，等，《糖生物学纲要》(Essentials ofGlycobiology)，纽约普莱恩维尤，冷泉港实验室出版社(Plainview，NY，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)。因此在TGC中用于聚糖合成的Gal和唾液酸水平很高，并不是限制因素。
卵清N-聚糖的结构以及已知有关哺乳动物中相关酶的信息提供了关于产生卵清N-聚糖结构的细胞机制的线索。在哺乳动物中，N-聚糖合成开始于内质网中多萜醇寡糖前体的合成，包括GlcNAc残基和多个甘露糖和葡萄糖残基。该复合物与靶蛋白的天冬酰胺相连接。多种糖苷酶将前体修剪为3个甘露糖和2个GlcNac残基(称为核心五糖)。然后糖苷转移酶将GlcNac、Gal和唾液酸残基依次加入。在此阶段N-聚糖结构的多样性变得明显，可能是由于各种糖基转移酶的胞内水平以及糖基转移酶间对于生长的N-聚糖侧链上自由接受位点的竞争(Varki，等《糖生物学纲要》(Essentials of Glycobiology)，纽约普莱恩维尤，冷泉港实验室出版社(Plainview，NY，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)。
从GlcNac开始，至少有6种N-乙酰葡糖胺基转移酶(GnTs)负责将GlcNAc加入到N-聚糖的三甘露糖基。卵清N-聚糖的高水平分支表明所有6种GnTs可在母鸡输卵管细胞中某种程度表达。
半乳糖基转移酶(如，β1，4半乳糖基转移酶)，本文称为GalT，是一个具有至少7个成员的家族，它们在N-和O-聚糖形成中扮有独特以及重叠的角色。GalT1(1型)被认为负责将Gal加入到N-聚糖上所有连接的GlcNac残基中(Lee等，J Biol Chem 276：13924-34，2001)。该家族的其它成员，尤其是2型和3型，被认为能够催化这种转移，尽管它们在N-聚糖合成中的实际作用看起来很小。GalT1在所有细胞类型中广泛表达，尽管水平不同。
唾液酸转移酶(SialT)家族催化唾液酸加入到Gal或N-乙酰基半乳糖胺(GalNac)(在O-连接聚糖的情况下)以及其它受体中。关于N-和O-聚糖，通过α2，3或α2，6连接加入唾液酸，取决于所参与的具体SialT。人N-聚糖可具有α2，3和α2，6连接之一或二者兼有。CHO-产生的N-聚糖仅具有α2，3连接，因为缺少α2，6SialT的表达(Lee等，J Biol Chem264：13848-55，1989)。卵清N-聚糖和O-聚糖也似乎仅通过α2，3连接进行连接。
α2，3SialT家族有6个成员。1和2型参与O-聚糖合成，因为它们使用Gal-GalNAc链作为受体。3、4和6型显然将唾液酸加入到Gal-GlcNac链末端，可能参与N-聚糖和O-聚糖合成。5型似乎不参与O-聚糖或N-聚糖合成，但是可能参与将唾液酸加入到含神经酰胺的化合物中(Harduin-Lepers等，Biochimie 83：727-37，2001)。除了在鸡胚中对于1型(SialT1)进行表达分析外，对于禽类α2，3SialT家族所知甚少(Kurosawa等，Biochim Biophys Acta 1244：216-22，1995)。
目前估计在卵清聚糖最后(即末端)或次末(即，倒数第二)位置的Gal水平少于约10％和末端唾液酸的水平少于约2％。所需的是在输卵管组织如输卵管膨大部组织中产生糖基化蛋白质的鸟类，在该部位大量半乳糖和/或唾液酸加入到N-连接寡糖中。
发明内容
已发现TGC中不表达参与Gal转移到N-聚糖的关键酶。这一点尤为显著，因为唾液酸仅通过Gal残基与N-聚糖连接。已发现表达将唾液酸转移至N-聚糖上Gal的酶，但是其水平似乎避免了有效的唾液酸化。这些发现部分导致了产生治疗性蛋白质(如，人治疗性蛋白质)的转基因禽类的发明，所述治疗性蛋白具有含更完整的末端唾液酸残基和Gal(如次末Gal)残基的补充物的寡糖结构(如N-连接的寡糖结构)。本文中通常将这些鸟类称为“转基因-增强糖基化”鸟类。
本发明包括基因组中含有转基因的转基因禽类(如转基因鸡)，所述基因组包含所表达的糖基转移酶编码序列。本发明还包括产生转基因禽类的方法。所述输卵管组织，例如转基因禽类的输卵管膨大部组织(如管状腺细胞)可产生蛋白质(如，外源性蛋白质，例如治疗性蛋白质)，所述蛋白质含有与至少一种转基因不存在时不会出现的糖相连接的N-连接寡糖。本发明还包含具有本文所公开的修饰的寡糖形式的蛋白质。
在一个实施方式中，所述糖基转移酶是N-乙酰葡糖胺基转移酶，例如，N-乙酰葡糖胺基转移酶3，并且糖是N-乙酰葡糖胺。
在另一实施方式中，所述糖基转移酶是半乳糖基转移酶(如，1型半乳糖基转移酶)，并且糖是半乳糖。在一个实施方式中，在转基因-增强半乳糖基转移酶(如1型半乳糖基转移酶)鸟类的输卵管中产生的外源性蛋白质(如治疗性蛋白质)可作为加入唾液酸的底物。例如，使用熟知的体外方法将唾液酸连接于通过输卵管中重组或外源性半乳糖基转移酶加入的Gal上。
在另一实施方式中，所述糖基转移酶是唾液酸转移酶(如3型唾液酸转移酶)，并且糖是唾液酸。
在一个实施方式中，本发明转基因禽类的输卵管组织的细胞在卵清存在时分泌蛋白质。
在一个实施方式中，本发明的转基因包括至少一个输卵管特异性启动子和至少一部分逆转录病毒，如LTR。
本发明的一个方面涉及分离或纯化具有改变的寡糖形式的蛋白质。
在一个具体的实施方式中，本发明涉及产生蛋白质的方法，其中所述蛋白质对于禽类是外源性的。该方法包含产生编码糖基转移酶的转基因的转基因禽类，其中所述禽类的输卵管组织产生第二转基因编码的外源性蛋白质，并且具有N-连接寡糖。N-连接寡糖具有与其连接的半乳糖和唾液酸中的至少一个，其中所述寡糖在编码糖基转移酶的转基因不存在时不与半乳糖和/或唾液酸连接。
本发明包括含有转基因的转基因禽类，所述转基因具有合成寡糖结构所涉及的酶的编码序列，所述寡糖结构在鸡输卵管组织如膨大部分(管状腺细胞)中出现的量相对较低。例如，在输卵管组织中所述酶出现的量少于鸟类其它组织中出现的量。例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如肝和肾组织中平均含量的约90％，或者例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如肝和肾组织中平均含量的约80％，或者例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如肝和肾组织中平均含量的约70％，或者例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如肝和肾组织中平均含量的约60％，或者例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如肝和肾组织中平均含量的约50％，或者例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如肝和肾组织中平均含量的约30％，或者例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如肝和肾组织中平均含量的约20％，或者例如，该酶在输卵管组织中的含量可能小于禽类其它组织如肝和肾组织中平均含量的约10％。
本发明还包括含有本发明转基因的载体。根据本发明所使用的载体设计为将本发明的转基因整合入鸡的基因组中，并在产生卵清蛋白质的输卵管细胞中表达酶。可使用任何有用载体产生本发明的禽类，如转基因-增强糖基化禽类。一些有用的载体包括病毒载体，如能变成禽类基因组部分(即整合入基因组)的逆转录病毒载体和腺病毒载体，质粒和其它核苷酸序列。
其它有用载体如非感染性核酸载体也在本文使用范围内。例如，根据本发明定点DNA整合、整合酶介导的整合和人工染色体也在本文使用范围内。
考虑用于本发明的禽类逆转录病毒的例子包括但不限于，禽白血病病毒(ALV)，例如但不限于RAV-0、RAV-1、RAV-2；禽肉瘤病毒(ASV)；禽肉瘤/急性白血病病毒(ASLV)，包括但不限于劳氏肉瘤病毒(RSV)；弗吉纳米肉瘤病毒(FSV)；禽类成髓细胞血症病毒(AMV)；禽骨髓成红血细胞增多症病毒(AEV)；禽类髓细胞瘤病病毒(MCV)，例如但不限于MC29；网状内皮组织增殖病毒(REV)，例如但不限于，脾坏死病毒(SNV)。本发明也考虑使用鼠白血病病毒(MLV)；莫罗尼(Moloney)鼠肉瘤病毒(MMSV)；莫罗尼(Moloney)鼠白血病病毒(MMLV)；和慢病毒(如人体免疫缺陷病毒(HIV)、马感染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿免疫缺陷病毒(SIV)和这些逆转录病毒的复制缺陷形式。通常，本发明所用逆转录病毒载体是复制缺陷型。
还可使用其它方法产生转基因-增强糖基化禽类，其中无需使用感染性DNA产生种系传递，如de Lavoir等，2006年6月8日的Nature第441卷，766-769中所报道的，将其公开内容整体纳入本文作参考。
在一个实施方式中，本发明涉及转基因-增强糖基化鸟类，所述鸟类在其基因组中包含GalT1、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6和/或GalT7的编码转基因，并在输卵管组织，如输卵管膨大部组织(例如管状腺细胞)中产生重组蛋白质，如治疗性蛋白质，所述蛋白质含有末端位置被半乳糖完全或基本覆盖的N-聚糖。例如，本发明产生的外源性蛋白质(如治疗性蛋白质)具有末端位置约30％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约40％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约50％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约60％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约70％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约80％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约90％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约95％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约100％被半乳糖占据的N-聚糖结构。
在一个实施方式中，本发明涉及转基因-增强糖基化鸟类，所述鸟类在其基因组中包含一种或多种GalT1、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6和/或GalT7的编码转基因，并在输卵管组织，如输卵管膨大部组织(例如管状腺细胞)中产生重组蛋白质，如治疗性蛋白质，所述蛋白质含有次末位置被半乳糖完全或基本覆盖的N-聚糖。例如，本发明产生的外源性蛋白质(如治疗性蛋白质)具有次末位置约30％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有次末位置约40％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有次末位置约50％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有次末位置约60％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有次末位置约70％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有次末位置约80％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有次末位置约90％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有次末位置约95％被半乳糖占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有次末位置约100％被半乳糖占据的N-聚糖结构。
在一个实施方式中，本发明涉及转基因-增强糖基化鸟类，所述鸟类在其基因组中包含一种或多种GalT1、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6和/或GalT7的编码转基因，并在输卵管组织，如输卵管膨大部组织(例如管状腺细胞)中产生重组蛋白质，如治疗性蛋白质，所述蛋白质含有末端位置被唾液酸完全或基本覆盖的N-聚糖。例如，外源性蛋白质具有末端位置约30％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约40％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约50％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约60％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约70％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约80％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约90％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约95％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置约100％被唾液酸占据的N-聚糖结构。
在一个实施方式中，本发明涉及转基因-增强糖基化鸟类，所述鸟类在其基因组中包含一种或多种GalT1、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6和GalT7的编码转基因并在输卵管组织，如输卵管膨大部组织(例如在管状腺细胞中)中产生重组蛋白质，如治疗性蛋白质，其中寡糖中三分之一的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中三分之二的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中三分之三的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中四分之一的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中四分之二的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中四分之三的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中四分之四的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中五分之一的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中五分之二的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中五分之三的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中五分之四的GlcNac残基附连有半乳糖残基，或者例如，其中寡糖中五分之五的GlcNac残基附连有半乳糖残基。
在一个实施方式中，本发明涉及转基因-增强糖基化鸟类，所述鸟类在其基因组中包含一种或多种SialT1、SialT2、SialT3、SialT4、SialT5和SialT6编码转基因并在输卵管组织，如输卵管膨大部组织(例如在管状腺细胞中)中产生重组蛋白质，如治疗性蛋白质，其中寡糖中一分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中二分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中二分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中三分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中三分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中三分之三的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中四分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中四分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中四分之三的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中四分之四的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之三的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之四的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之五的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之三的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之四的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之五的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之六的半乳糖残基附连有唾液酸残基。
在一个实施方式中，本发明涉及转基因母鸡，所述转基因母鸡在其基因组中包含一种或多种SialT1、SialT2、SialT3、SialT4、SialT5和SialT6编码转基因，所述转基因在其输卵管组织，如输卵管膨大部组织(例如在管状腺细胞中)中产生N-聚糖，与非转基因鸟类相比，所述N-聚糖中具有唾液酸结尾的分支的比例增加。例如，外源性蛋白质具有末端位置30％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置40％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置50％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置60％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置70％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置80％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置90％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置95％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置100％被唾液酸占据的N-聚糖结构。
在一个实施方式中，本发明涉及转基因-增强糖基化鸟类，所述鸟类在其基因组中包含一种或多种GalT1、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6、GalT7、SialT1、SialT2、SialT3、SialT4、SialT5和SialT6编码转基因，例如GalT1和SialT3编码转基因，并在输卵管组织，如输卵管膨大部组织(例如在管状腺细胞中)中产生重组蛋白质，如治疗性蛋白质，其中寡糖中一分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中二分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中二分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中三分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中三分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中三分之三的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中四分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中四分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中四分之三的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中四分之四的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之三的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之四的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中五分之五的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之一的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之二的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之三的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之四的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之五的半乳糖残基附连有唾液酸残基，或者例如，其中寡糖中六分之六的半乳糖残基附连有唾液酸残基。
在一个实施方式中，本发明提供了转基因母鸡，所述转基因母鸡在其基因组中包含一种或多种GalT1、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6、GalT7、SialT1、SialT2、SialT3、SialT4、SialT5和SialT6编码转基因，例如GalT1和SialT3编码转基因，并在输卵管组织，如输卵管膨大部组织(例如在管状腺细胞中)中产生外源性蛋白质，与非转基因鸟类相比，所述外源性蛋白质具有唾液酸结尾的分支比例增加。例如，外源性蛋白质具有末端位置20％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置30％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置40％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置50％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置60％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置70％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置80％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置90％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置95％被唾液酸占据的N-聚糖结构，或者例如，外源性蛋白质具有末端位置100％被唾液酸占据的N-聚糖结构。
在一个实施方式中，本发明的蛋白质包含具有1-5个唾液酸(如1-4个唾液酸)的寡糖。
在一个实施方式中，本发明的蛋白质包含具有1-5个半乳糖(如1-4个半乳糖)的寡糖。
为了产生可生产外源性蛋白质的转基因-增强糖基化鸟类，可将转基因-增强糖基化鸟类与已有鸟类交配，其中所述已有鸟类是转基因的，在其输卵管中产生治疗性蛋白，其中通过在所述治疗性蛋白中加入具有半乳糖和/或唾液酸的寡糖，使其效果增强。可使用转基因-增强糖基化鸟类产生卵或胚胎供体。可将转基因编码蛋白质，如治疗性蛋白质引入胚胎，例如通过本领域已知方法，以产生在输卵管中产生转基因编码蛋白质的禽类品系，其中所述糖基化的转基因编码蛋白质在其寡糖结构中可具有另外的糖，如半乳糖和唾液酸。在另一实施方式中，用于产生治疗性蛋白质的已有鸟类可用于产生卵或胚胎供体，并且将编码糖基转移酶(如GalT、SialT)转基因的载体引入供体卵或胚胎。
在一个实施方式中，本发明涉及产生雌鸟如母鸡，从而在卵清来源的治疗性蛋白质中产生寡糖结构，所述治疗性蛋白质更接近于哺乳动物蛋白质尤其是人蛋白质中出现的天然寡糖结构。
根据本发明产生的第一代转基因鸟类统称称为G0代，并且通常对于每一插入转基因是半合子。可将G0代与非转基因鸟类配种得到完全转基因G1后代，所述G1后代也是转基因半合子。G1半合子后代可与非转基因动物配种，产生G2半合子后代，或互相配种产生转基因纯合的G2后代。G0代鸟类的转基因半合子或纯合子后代与G0代鸟类的另一转基因半合子或纯合子后代配种，从而产生两种转基因的半合子后代。可将双半合子鸟类种间杂交，从而产生一种或两种转基因的纯合子。这些仅仅是一些有用的育种计划的例子。本发明关注本领域一般技术人员所知的任何有用的育种方案的使用。
只要本文所述特点的任何组合所包含的特点不互相抵触，所述任何组合所包含的特点均在本发明的范围之内。基于本说明书和本领域一般技术人员的知识，此类组合是清楚明了的。
附图简要说明
图1A和B显示了天然的(1A)和符合本发明的(1B)与卵清蛋白质附连的N-聚糖的示例性结构。偶然发现Gal占据了末端GlcNac残基，并似乎是如图1A所示的β1，4-连接。在天然产生的卵清蛋白质中未在平分型GlcNac上检测到Gal的存在。此外，似乎当Gal在N-连接寡糖上出现时，有时，虽然很少，被唾液酸化。根据本发明在末端GlcNac残基上加入Gal，与不存在转基因增强糖基化时的唾液酸化相比，更多的末端GlcNac残基被唾液酸化。图1B显示根据本发明在禽类输卵管中产生的蛋白质上存在的示例性N-连接寡糖结构。在这个示例性图解和非限制性结构中，所有的末端GlcNac残基(除了平分型GlcNac)都与唾液酸化Gal附连。
图2显示了鸡半乳糖基转移酶的表达分析。mRNA分离自培养成纤维细胞(F)、产卵母鸡的输卵管膨大部组织(M)、肝脏(L)和肾脏(K)组织，并用Northern印迹法进行分析。用鸡1、2和3型β1，4半乳糖基转移酶的互补序列探测印迹。左边显示RNA分子量标记物的大约位置。1型mRNA的期望大小为2.2kb。1型印迹中约4.3kb的条代可能代表部分加工的RNA。数据表明在输卵管膨大部组织不产生1型。
图3显示了鸡唾液酸转移酶1、3、4和6的表达分析。mRNA分离自培养成纤维细胞(F)、产卵母鸡的输卵管膨大部组织(M)、肝脏(L)和肾脏(K)组织，并用Northern印迹法进行分析。用鸡1、3、4和6型唾液酸转移酶的互补序列探测印迹。左边显示RNA分子量标记物的大约位置。数据表明在输卵管膨大部组织低表达3型，以及可能低表达4型。
图4显示了示例性两种载体方案的流程图。GalT1群可由如图6A所示pALV-SIN-1.8-OM-GalT1转基因产生。SialT3群可由如图6B所示pALV-SIN-1.8-OM-SialT3转基因产生。EW指卵清。Sial指唾液酸。Gal指半乳糖。GS鸟类指同时含GalT1和SialT3转基因的鸟类。Gal/Sial指Gal和唾液酸。GGSS鸟类指GalT1和SialT3转基因均为纯合子的鸟类。“蛋白质产生群”指产生附连寡糖结构的蛋白质的群，如治疗性蛋白质，可通过在寡糖结构中加入Gal和/或唾液酸提高其效率。
图5显示了示例性载体方案的流程图。用图6C所示载体pALV-SIN-1.8-OM-GalT1-IRES-SialT3产生群。EW指卵清。
图6A、B和C分别显示了pALV-SIN-1.8-OM-GalT1、pALV-SIN-1.8-OM-SialT3和pALV-SIN-1.8-OM-GalT1-IRES-SialT3载体的图谱。显示了每一载体的逆转录病毒转基因部分。简便起见未显示载体主链。一旦载体整合入鸡胚细胞，3’SIN LTR拷贝至5’LTR上，使转基因被失活的LTR侧接。图6A显示了1.8kb卵类粘蛋白启动子可操作的与鸡1型β-1，4-半乳糖基转移酶编码序列连接。图6B显示了1.8kb卵类粘蛋白启动子可操作的与鸡3型α-2，3-唾液酸转移酶连接。图6C显示了1.8kb卵类粘蛋白启动子通过两个编码序列间的IRES可操作的与1型鸡β-1，4-半乳糖基转移酶编码序列和鸡α-2，3-唾液酸转移酶3编码序列连接，如1990年6月26日提交的美国专利号4,937,190所公开的，将其公开内容整体纳入本文作参考。
图7产生转基因增强糖基化鸟类的一般方法和时间表。
图8A显示了转基因增强糖基化鸡所产生的卵清蛋白质的寡糖结构的MALDI-MS分析，其中使用如图6A所示载体将GatT1转基因插入所述转基因增强糖基化鸡的基因组(图9)。进行13次独立分析，并显示具有代表性的一次实验结果。图8B-8C显示其它加入Gal和/或唾液酸寡糖结构，在另外12次分析中的一次或多次也有同样发现(每一次实验的质量/mz)。图8D是对照样品。数据显示Gal和一些唾液酸加入到卵清蛋白质中出现的寡糖结构中，这是转基因增强糖基化的结果。图例：●＝甘露糖；▲＝岩藻糖；○＝半乳糖；■＝N-乙酰葡糖胺；◆＝唾液酸。
本发明包含具有N-连接寡糖的蛋白质，例如人蛋白质，包括本申请所公开的那些(如人蛋白质)，可在具有新颖寡糖结构的转基因增强糖基化鸟类的输卵管中表达。
图9A-C(SEQ ID NO：1)显示长为7434bp的pSIN-OM-1.8-GalT1。序列的特点如下：LTR-核苷酸370..542；LTR-3645..3990；CDS-268..7356；启动子4441..6214。
图10A-C(SEQ ID NO：2)显示长为7545bp的pSIN-OM-1.8-SialT3。序列的特点如下：LTR-核苷酸370..542；LTR-3645..3990；CDS6362..7540；启动子4431..6309。
图11A-C(SEQ ID NO：3)显示长为9119bp的pSIN-OM-1.8-GalT1-IRES-SialT3。序列的特点如下：LTR-核苷酸3653..3998；LTR-核苷酸378..550；CDS-核苷酸7930..9108；CDS-核苷酸6276..7361；启动子核苷酸4449..6222；IRES 7362...7929。包括一种或多种下列IRES产生的翻译产物量的核苷酸取代：nt 7920T-G；nt7918 C-A；nt 7917 G-T；nt 7836 G-A；用AATTCCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAAC(SEQ ID NO：39)替换nt7366-7368(CCC)。
图12A(SEQ ID NO：4)显示了鸡1型β-1，4-半乳糖转移酶(CKI)mRNA-登录号U19890。特征是：5′UTR-核苷酸1..57；CDS-核苷酸58..1146；3′UTR-核苷酸1147..2279；聚A_信号-核苷酸2260..2265。
图12B(SEQ ID NO：5)显示了鸡β-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
图13A(SEQ ID NO：6)显示了鸡2型β-1，4-半乳糖转移酶(CKII)mRNA-登录号U19889。核苷酸202..1323显示了CDS。
图13B(SEQ ID NO：7)显示了鸡β-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
图14A(SEQ ID NO：8)显示了鸡3型β-1，4-半乳糖转移酶mRNA-登录号XM_416564。核苷酸1..1029显示了CDS。
图14B(SEQ ID NO：9)显示了鸡3型β-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
图15A(SEQ ID NO：10)显示了鸡4型β-1，4-半乳糖转移酶mRNA-登录号XM_416563。核苷酸221..1288显示了CDS。
图15B(SEQ ID NO：11)显示了鸡4型β-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
图16A(SEQ ID NO：12)显示了鸡5型β-1，4-半乳糖转移酶mRNA。核苷酸1..1773显示了CDS。
图16B(SEQ ID NO：13)显示了鸡5型β-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
图17A-B(SEQ ID NO：14)显示了鸡6型β-1，4-半乳糖转移酶mRNA。核苷酸294..1400显示了CDS。
图17C(SEQ ID NO：15)显示了鸡6型β-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
图18A(SEQ ID NO：16)显示了鸡7型β-1，4-半乳糖转移酶mRNA。核苷酸57..1016显示了CDS。
图18B(SEQ ID NO：17)显示了鸡7型β-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列。
图19A(SEQ ID NO：18)显示了鸡1型α-2.3唾液酸转移酶mRNA。核苷酸132..1160显示了CDS。
图19B(SEQ ID NO：19)显示了鸡α-2.3-唾液酸转移酶的氨基酸序列。
图20A(SEQ ID NO：20)显示了鸡2型α-2.3唾液酸转移酶mRNA。核苷酸290..1339显示了CDS。
图20B(SEQ ID NO：21)显示了鸡α-2.3-唾液酸转移酶的氨基酸序列。
图21A(SEQ ID NO：22)显示了鸡3型α-2.3唾液酸转移酶mRNA。核苷酸1..1179显示了CDS。
图21B(SEQ ID NO：23)显示了鸡α-2.3-唾液酸转移酶的氨基酸序列。
图21C(SEQ ID NO：24)显示了具有一个氨基酸片段缺失的候选亚型，即在图21a所示核苷酸序列中缺失了对应的核苷酸序列片段。
图22A(SEQ ID NO：25)显示了鸡4型α-2.3唾液酸转移酶mRNA。核苷酸325..1332显示了CDS。
图22B(SEQ ID NO：26)显示了鸡4型α-2.3-唾液酸转移酶的氨基酸序列。
图23A(SEQ ID NO：27)显示了鸡5型α-2.3唾液酸转移酶mRNA。核苷酸128..1234显示了CDS。
图23B(SEQ ID NO：28)显示了鸡α-2.3-唾液酸转移酶的氨基酸序列。
图24A(SEQ ID NO：29)显示了鸡6型α-2.3唾液酸转移酶mRNA。核苷酸740..1798显示了CDS。
图24B(SEQ ID NO：30)显示了鸡6型α-2.3-唾液酸转移酶的氨基酸序列。
图25A(SEQ ID NO：31)显示了鸡1型α-2.6唾液酸转移酶mRNA。核苷酸359..1600显示了CDS。
图25B(SEQ ID NO：32)显示了鸡1型α-2.6-唾液酸转移酶的氨基酸序列。
图26A(SEQ ID NO：33)显示了鸡2型α-2.6唾液酸转移酶mRNA。核苷酸1..1590显示了CDS。
图26B(SEQ ID NO：34)显示了鸡α-2.6-唾液酸转移酶的氨基酸序列。
图27A(SEQ ID NO：35)显示了鸡4型α-2.6唾液酸转移酶mRNA。核苷酸202..1323显示了CDS。核苷酸62..931显示了CDS。
图27B(SEQ ID NO：36)显示了鸡4型α-2.6-唾液酸转移酶的氨基酸序列。
图28A(SEQ ID NO：37)显示了鸡5型α-2.6唾液酸转移酶mRNA。核苷酸51..1100显示了CDS。
图28B(SEQ ID NO：38)显示了鸡5型α-2.6-唾液酸转移酶的氨基酸序列。
具体实施方式
本文所用定义和缩写如下：aa，氨基酸；bp，碱基对；CDS，编码序列；cDNA，与RNA互补的DNA；GalNac，N-乙酰基半乳糖胺；Gal，半乳糖；GlcNac，IRES，内部核糖体进入位点；N-乙酰葡糖胺nt，核苷酸；kb，1000碱基对；μg，微克；ml，毫升；ng，纳克；nt，核苷酸。
本文提出下面的定义用于阐述和明确描述本发明所用的各种术语的含义和范围。
本文所用术语“禽类”指鸟纲分类的任何种、亚种或品系，例如但不限于诸如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦和平胸鸟，包括鸵鸟、鸸鹋和食火鸡等生物。该术语包括原鸡(Gallus gallus)或鸡的各种已知品系(例如，白来杭鸡、褐来杭鸡、斑纹石鸡(Barred-Rock)、苏赛克斯鸡(Sussex)、新罕布什尔鸡、罗德岛鸡、澳洲黑鸡、米诺卡鸡、阿木鸡(Amrox)、加利福尼亚州灰鸡、意大利山鹑色鸡)，以及通常以商业规模饲养的火鸡、雉、鹌鹑、鸭、鸵鸟和其它家禽的品系。
词组“基于”或“来自”通常指整体或部分获自。例如，基于或来自于特定逆转录病毒或基于特地工嫩逆转录病毒的核苷酸序列指逆转录病毒载体的基因组包含特定逆转录病毒基因组核苷酸序列的大部分。所述大部分可以是特定的基因或核苷酸序列，如编码gag、pol和或包膜蛋白质的核苷酸序列，或病毒基因组的其它结构或功能性核苷酸序列，如编码LTR的序列，或大部分完整的逆转录病毒基因组，例如大多数(如多于60％或多于70％或多于80％或多于90％)或全部逆转录病毒基因组，根据本说明书和本领域熟练技术人员的知识来说是显而易见的。基于或来自你逆转录病毒的逆转录病毒载体的例子是NL逆转录病毒载体(如NLB)，该载体基于Cosset等，Journal of Virology(1991)65卷，3388-3394中公开ALV逆转录病毒。
本文所用“编码序列”和“编码区”指核苷酸序列和核酸序列，包括编码合成RNA、蛋白质或RNA或蛋白质的任何部分的遗传信息的RNA和DNA。
将不是特定有机体基因组的天然部分或在有机体基因组非天然位点引入的核苷酸序列称作“外来”核苷酸序列、“异源”核苷酸序列、“重组”核苷酸序列或“外源”核苷酸序列。此外，不认为分离后重新引入相同类型(如同种)有机体的核苷酸序列是特定有机体基因组的天然产生部分，因此认为是外源的或异源的。“异源蛋白质”或“外源蛋白质”可以是外来、异源或外源性核苷酸序列编码的蛋白质，因此通常不在有机体的细胞中天然表达。
如本文所用形容核酸如DNA和RNA的术语“外源”、“异源”和“外来”可以互换使用，指在其出现的染色体、基因组或细胞中不天然产生的核酸，或出现的位置和/或数量不同于天然发生的位置和/或数量。可以是基因组、染色体或细胞的非内源性核酸，或者外源性引入基因组、染色体或细胞的核酸。异源性DNA的例子包括但不限于：编码基因产物或例如感兴趣的用于产生编码蛋白的基因产物的DNA。异源性DNA的例子包括但不限于：编码可追踪的标记物蛋白的DNA，编码治疗性蛋白质的DNA。术语“异源”或“外源”指在某种细胞、组织或有机体产生的物质中通常没有的生物分子，如核酸或蛋白质，或在某种细胞、组织或有机体产生的物质中没有与天然产生的量或位置相同的生物分子。例如，卵异源性或外源性的蛋白质指在卵中通常没有的蛋白质。
本文中术语“构建物”指线性或环状核苷酸序列如DNA，其中所述核苷酸序列组装自不止一种分离自天然来源或化学合成或其组合的核苷酸序列的片段。
本文所用术语“互补的”指两种能形成特异性相互作用的核算分子。在特异性相互作用中，当两条核酸链极性相反时，一条核酸链中的腺嘌呤碱基与第二条核酸链中的胸腺嘧啶形成两个氢键。同样，在特异性相互作用中，当两条核酸链极性相反时，一条核酸链中的鸟嘌呤碱基与第二条核酸链中的胞嘧啶形成两个氢键。本文中互补核酸还可包括修饰的碱基，其中修饰的腺嘌呤可与胸腺嘧啶或修饰的胸腺嘧啶形成氢键，修饰的胞嘧啶可与鸟嘌呤或修饰的鸟嘌呤形成氢键。
本文所用术语“细胞因子”指影响细胞功能的任意的分泌氨基酸序列，是调节免疫、炎症和造血反应中细胞相互作用的分子。细胞因子包括但不限于单核因子和淋巴因子，不管由哪种细胞产生。例如，单核因子通常指由单个核细胞如巨嗜细胞和/或单核细胞产生或分泌的因子。然而一些其它细胞也产生单核因子，如自然杀伤细胞、成纤维细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、脑星状细胞、骨髓基质细胞、表皮角质形成细胞和B-淋巴细胞。淋巴因子通常指淋巴细胞产生的因子。细胞因子的例子包括但不限于：干扰素、红细胞生成素、G-CSF、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子β(TNF-β)。
本文所用术语“表达的”或“表达”指编码序列转录产生RNA核酸分子，所述RNA核酸分子至少与编码序列的两条核酸链中的一条的区域部分互补。本文所用术语“表达的”或“表达”也指翻译RNA产生蛋白质或肽。
本文所用术语“表达载体”指含有基因表达控制区的核酸载体，所述控制区如可操作的连接于至少一条多肽的编码核苷酸序列的启动子或启动子组件。
本文所用术语“片段”可指，例如，核酸中至少约10、20、50、75、100、150、200、250、300、500、1000、2000、5000、6,000、8,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000或60,000核苷酸长的部分，所述核酸通过人工构建(如通过化学合成)，或使用限制性核酸内切酶或机械剪切将天然产物切割为多个片段，或酶法构建如PCR或其它任何本领域所知聚合技术，或使用本领域技术人员所知重组核酸在宿主细胞中表达。本文所用术语“片段”也指，例如氨基酸序列中至少约5、10、20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、1000、2000、5000、6,000、8,000或10,000个氨基酸的部分，其中所述部分来自至少一种蛋白酶对天然产生的氨基酸序列切割，或使用化学合成或本领域技术人员所知重组DNA技术(如表达自天然产生的氨基酸序列的编码核苷酸序列的一部分)所产生的氨基酸序列。“片段”也可指特定核苷酸序列或氨基酸序列的一部分，例如，约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％。
“功能性部分”和“功能性片段”可互换使用，在本文中指能够完全或部分执行完整功能的全部的部分或片段。例如，分子的生物学功能性部分指执行整个或完整分子的生物学功能的分子的一部分。功能性部分可以是任何有用大小。例如，功能性片段的大小范围可以从长为20个碱基到等于特定序列全长减一个核苷酸。在另一实施例中，功能性片段的大小范围可以从长为50个碱基到等于特定序列全长减一个核苷酸。在另一实施例中，功能性片段的大小范围从长约50个碱基到约20kb。在另一实施例中，功能性片段的大小范围从长约500个碱基到约20kb。在另一实施例中，功能性片段的大小范围从长约1kb到约20kb。在另一实施例中，功能性片段的大小范围从长约0.1kb到约10kb。在另一实施例中，功能性片段的大小范围从长约20碱基kb到约10kb。
术语“完全转基因”指在其全部体细胞中包含至少一个转基因拷贝的动物，如鸟。
本文所用术语“基因表达控制区”与编码序列连接的、全部或部分调节编码序列表达的核苷酸序列，例如，全部或部分调节编码序列的转录。可从天然产生的资源分离基因表达控制区域，或化学合成，并掺入核酸载体从而在合适的细胞中调节转录。“基因表达控制区”可位于被转录为mRNA的编码序列的5’末端区域之前，但不仅限于在其之前。
本文所用术语“分离的核酸”包括例如，(a)具有天然产生的基因组分子部分序列的DNA，但不与至少一条天然产生物种基因组中分子部分侧接的序列侧接；(b)以某种方式掺入载体或原核或真核基因组DNA的核酸，使所得载体或基因组DNA与核酸来源的天然产生的DNA不同；(c)分离的分子，如cDNA，基因组片段，聚合酶链反应(PCR)、连接酶反应(LCR)或化学合成所产生的片段，或限制性片段；(d)作为杂合基因即编码融合蛋白的基因的部分的重组核苷酸序列；以及(e)作为非天然产生的杂合序列的部分的重组核苷酸序列。本发明的分离的核酸分子包括，例如，天然等位基因变体，以及通过核苷酸缺失、插入、倒位或替换修饰的核酸分子。
如本文所用术语“核酸”指任何核苷酸和核苷的线性或顺序阵列，例如cDNA、基因组DNA、mRNA、tRNA、寡核苷酸、寡核苷及其衍生物。为了便于讨论，本文将非天然产生的核酸称为构建物。核酸可包括细菌质粒载体，包括表达、克隆、粘粒和转化载体，如动物病毒载体，例如但不限于修饰的腺病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、逆转录病毒，如禽白血病病毒(ALV)逆转录病毒载体，鼠白血病病毒(MLV)逆转录病毒载体和慢病毒载体等及其片段。此外，核酸可以是禽白血病病毒(ALV)逆转录病毒载体、鼠白血病病毒(MLV)逆转录病毒载体或慢病毒载体及其片段的LTR。核酸还可包括NL载体，如NLB、NLD、NLA及其片段，以及合成寡核苷酸如化学合成的DNA或RNA。核酸可包括修饰的或衍生化的核苷酸和核苷，例如但不限于卤化核苷酸例如但不仅是5-溴尿嘧啶，以及衍生化的核苷酸，如生物素标记的核苷酸。
本文所用术语“载体”和“核酸载体”指天然的或合成的单链或双链质粒或病毒核酸分子，所述分子可以通过转染或转化进入细胞，并不依赖于宿主细胞基因组复制或在宿主细胞基因组内复制。基于载体的核苷酸序列，用合适的限制性酶可将环状双链载体线性化。如本领域所知，通过用限制性酶切割载体，将期望片段连接在一起，可将核酸插入载体。
术语″操作性连接″指配置所述组件以便行使其普通功能的元件安排。操作性连接于编码序列的基因表达控制区或启动子(如启动子组件)能够对编码序列进行表达。控制序列可不必与编码序列毗连，只要它们可发挥功能指导编码序列的表达。因此，例如，间插非翻译的转录序列存在于启动子序列和编码序列之间时，仍可认为该启动子序列与该编码序列“操作性连接”。
术语“输卵管”或“输卵管组织”指产生N-连接寡糖的禽输卵管的组织，如膨大部组织，如管状腺细胞，其中所述N-连接寡糖与禽类其它组织如肝脏或肾脏组织相比，Gal和/或唾液酸含量显著降低。
本文所用术语“输卵管特异性启动子”指功能性启动子和启动子组件，即使编码序列的转录在很大程度上，例如，主要(即多于50％的转录产物在动物中通过输卵管细胞中产生的特定启动子类型产生)或仅在鸟类的输卵管细胞中产生。输卵管特异性启动子的例子包括，卵清蛋白启动子、卵类粘蛋白启动子、卵抑制剂启动子、溶菌酶启动子和卵传铁蛋白启动子，以及这些启动子的功能性部分，如启动子组件。糖基化酶如GalT(如GalT1)和SialT(如SialT3)通常定位于ER/高尔基细胞器，并参与N-聚糖合成通路。通过使用输卵管特异性启动子将这些酶的表达限制于膨大部组织中，从而尽量减小这些酶在其它组织中表达对鸟类造成的有害生理效应。
“序列相同性百分数”、“相同性百分数”、“％相同性”、“序列同源性百分数”、“同源性百分数”、“％同源性”和“序列相似性百分数”均指两条核苷酸序列或两条氨基酸序列间序列匹配程度。使用Karlin & Attschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87：2264-2268，Karlin & Attschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：5873-5877修饰的算法可确定序列匹配。将这类算法结合到Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215：403-410的NBLAST和XBLAST程序中。可利用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，评分＝100，字长＝12，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。利用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索(评分＝50，字长＝3)，以获得与参比氨基酸序列同源的氨基酸序列。为了进行缺口比对(出于比较目的)，如Altschul等(1997)，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402所述利用缺口BLAST。利用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。其它算法、程序和默认设置也可能适用，例如但不限于，英国人类基因组作图计划资源中心(U.K.Human Genome Mapping Project Resource Centre)的GCG-序列分析软件包，其包括核苷酸或氨基酸序列比较程序。
术语“家禽衍生的”指由家禽产生或获得的组合物或物质。“家禽”指可作为家畜饲养的禽类，包括但不限于：鸡、鸭、火鸡、鹌鹑和平胸鸟。例如，“家禽衍生的”可指鸡衍生的、火鸡衍生的和/或鹌鹑衍生的。术语“禽类衍生的”指由禽类产生或获得的组合物或物质。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸序列”在本文中可互换使用，包括但不限于：编码序列，即在体外或体内置于合适的调节或控制序列之下转录并翻译为多肽的多核苷酸或核酸序列；控制序列，如翻译起始和终止密码子，启动子序列，核糖体结合位点，聚腺苷酸化信号，转录因子结合位点，转录终止序列，上游和下游调节结构域，增强子，沉默子，转录因子结合并改变基因启动子活性的DNA序列，这种改变可以是正向(诱导)或负向(抑制)，等等。本文所述术语对于长度或合成起始不作限制。
如本文所用术语“多肽”和“蛋白质指氨基酸聚合物，例如三个或多个氨基酸通过肽键以顺序阵列方式连接。术语“多肽”包括蛋白质、蛋白质片段、蛋白质类似物、寡肽等。术语“多肽”包括上文所述由核酸编码，通过重组技术产生(如从转基因鸟中分离)或合成的多肽。术语“多肽”还涵盖上文所述包含化学修饰的氨基酸或与标记配体共价或非共价连接的氨基酸的多肽。
本文所用术语“启动子”指在禽类细胞中用于起始RNA聚合酶转录的DNA序列。“启动子组件”是本身或与其它DNA序列组合影响或促进转录的DNA序列。启动子组件可以是启动子的功能性片段。例如，卵类粘蛋白启动子组件包括但不限于2007年5月17日公开的美国申请号11/649,543中公开的约1.8kb，约3.9kb和约10kb卵类粘蛋白启动子，将其整体纳入本文作参考。“启动子组件”还包括重排基因表达控制区，其功能是起始RNA转录，以及使由起始RNA转录的天然产生的DNA序列和/或合成DNA序列组成的DNA分子杂交。
如本文所用术语“重组核酸”和“重组DNA”指将至少两条在真核或原核细胞中非天然产生的核酸序列的组合。核酸序列包括但不限于：核酸载体，基因表达，调控元件，复制起始为断，产生抗生素抗性的合适基因序列，蛋白质编码序列等。术语“重组多肽”指通过重组DNA技术产生的多肽，因此在位置、纯度或结构方面区别于天然产生的多肽。通常，此类重组多肽以区别与通常天然产生的量在细胞中表达。
如本文所用术语“调节”序列或元件包括启动子、增强子、终止子、终止密码子和其它控制基因表达的元件。
“逆转录病毒”、“逆转录颗粒”或“转导颗粒”指能够将非病毒DNA或RNA转导如细胞中的复制缺陷型或能够复制的病毒。
“SIN载体”是自失活载体。具体说，SIN载体是含有改变的基因组的逆转录病毒载体，因此一旦整合入靶细胞(如禽类胚胎细胞)的基因组DNA，整合的逆转录病毒载体的5’LTR不执行启动子功能。例如，可将逆转录病毒载体中整合后得到逆转录病毒载体5’LTR的U3区域的部分或所有核苷酸序列删除或更改，以降低或消除5’LTR的启动子活性。在某些实施例中，如本领域所知，删除来自5’LTR U3的CAAT盒和/或TAATA盒可得到SIN载体。
如本文所用术语“正义链”指可被转录为RNA并翻译成基因的天然多肽产物的来自基因组DNA的单链DNA分子。如本文所用术语“反义链”指与基因的正义联互补的基因组DNA的单链DNA分子。
“治疗性蛋白质”或“药物性蛋白质”指全部或部分组成药物的物质。具体说“治疗性蛋白质”或“药物性蛋白质”包括全部或部分组成药物的氨基酸序列。
本文所用术语“转录调节序列”和“启动子组件”指调节编码序列转录表达的核苷酸。示例性的转录调节序列包括增强子元件，激素效应元件，类固醇效应元件和负调控元件等。“转录调节序列”可分离并插入载体，从而能够在合适细胞中调节载体DNA部分的转录。“转录调节序列”可位于被转录为mRNA的蛋白质编码序列末端的5’区域之前，但不仅限于在其之前。转录调节序列还可位于蛋白质编码区域之内，例如位于鉴定为“内含子”区域的基因区域。
本文所用术语“转化”和“转染”指将核酸插入宿主的过程。本领域熟练技术人员熟知多种利于将核酸转化或转染进入原核或真核有机体的方法。这些方法涉及多种技术，如使用某些浓度的盐处理细胞，例如但不限于钙或镁盐，或将细胞暴露于电场、去污剂或脂质体材料，使宿主细胞能够摄取核酸分子。
本文所用“转基因动物”指任何非人动物，如禽类，包括鸡，其中所述动物的一个或多个细胞包含人工干预下引入的异源核酸，如通过本领域所知转基因技术(参见例如，2007年10月18日公开的美国专利公开号2007/0243165，将其公开内容整体纳入本文作参考)，包括本文公开的那些技术。通过特定的遗传学操纵将核酸引入细胞(如卵或胚胎细胞)直接或间接将核酸引入动物，如通过显微注射注射或重组病毒感染。术语遗传学操纵不包括经典的杂交育种或体外受精，而指直接引入重组DNA分子。该分子可整合入染色体，或者可作为染色体外复制DNA。在典型的转基因动物中，转基因可使细胞表达靶蛋白或多肽的重组形式。本文所用术语“嵌合动物”或“镶嵌动物”(mosaic animal)指在其一些但非所有细胞中含有转基因或表达重组核苷酸序列的动物。种系嵌合动物在其生殖细胞中含有转基因，并可产生在多数或所有细胞中包含转基因的后代转基因动物。
如本文中术语“转基因”指对于引入的动物或细胞来说部分或全部异源性的核酸序列(例如编码人蛋白质)，或者对于引入的转基因动物或细胞的内源性基因而言，部分或全部异源性即外源性的核酸序列，从而改变插入有机体基因组(如在不同于天然基因的位置插入，或插入引起敲除)。
本领域技术人员熟知用于分离并鉴定本发明核酸和蛋白质的技术，可参考标准分子生物学或生物化学手册而无需过多实验过程来选择合适的实验方案。参见如Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》(″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″)，第2版，将其内容整体纳入本文作参考。
输卵管中表达并分泌的外源治疗性蛋白质以及内源卵清蛋白质均包含缺少Gal和唾液酸的N-聚糖结构。已发现这是糖基化酶通路的结果，该通路负责卵清蛋白质中糖修饰。
迄今已经产生存储于转基因母鸡的卵清中的多种蛋白质，包括红细胞生成素、干扰素α和G-CSF。禽来源的G-CSF和禽来源的干扰素都是仅有O-聚糖但不含N-聚糖的蛋白质。这两种蛋白中的一些O-聚糖结构与人O-聚糖相似，具有大部分合成完成的结构(Rapp等，TransgenicRes 12：569-75.，2003)。此外，这些蛋白质显示高稳定性、高效能以及在病人体内的低免疫反应性，所有这些都是具有合适O-连接的糖基化的蛋白质的期望特性(Patel等，Int J Clin Pharmacol Ther 45：161-8，2007)。
已分析在鸡输卵管中表达的具有N-聚糖修饰的糖基化的蛋白质如人红细胞生成素。参见例如，2007年10月10日提交的美国专利申请号11/973,853，将其整体纳入本文作参考。基本的N-连接结构与人的具有一些共同点，但是也有一些差别。例如，在人N-聚糖的一些例子中，岩藻糖连接于和天冬酰胺连接的N-乙酰葡糖胺(GlcNac)残基。在输卵管产生的卵清蛋白质和重组蛋白质中，通常岩藻糖不大量出现。人N-聚糖的所有或大多数末端位置通常以唾液酸结尾，连接于和GlaNac连接的半乳糖(Gal)。在输卵管中即膨大部组织(如管状腺细胞)产生的鸡卵清蛋白质和外源性蛋白质的情况下，N-聚糖中通常不出现或很少出现唾液酸。此外，在已表征的来源于转基因禽类外源性蛋白的N-聚糖结构中的末端糖中通常很少出现Gal残基(图8A)。因此，鸡输卵管中产生并分泌的卵清蛋白质和外源性蛋白质中N-聚糖的大多数末端位置被GlcNac占据。
发明人还在β1，4-连接的甘露糖中发现平分型GlcNac，在人的某些组织或细胞类型中发现一种结构。平分型GlcNac被认为可以增加抗体的ADCC活性。在一个实施方式中，本发明的转基因禽类包含具有乙酰葡糖胺基转移酶，如N-乙酰葡糖胺基转移酶3的编码序列的转基因，所述转基因与输卵管特异性启动子连接从而在输卵管产生蛋白质(如外源性蛋白质，如抗体)的N-连接寡糖结构中加入另外的平分型GlcNac。
输卵管产生并分泌的外源性和内源性(如卵清蛋白、卵类粘蛋白)蛋白质中的N-聚糖具有如图1A所示的基本结构，参见(Yamashita等，J Biol Chem 257：12809-14，1982；Harvey等，J Am Soc Mass Spectrom11：564-71，2000；Lattova等，J Am Soc Mass Spectrom 15：725-35，2004)和2007年10月10日日教的美国专利申请号11/973,853。
在一个实施方式中，本发明涉及通过在禽类基因组中引入表达在输卵管膨大部组织如TGC(管状腺细胞)中缺陷的糖基转移酶的转基因，纠正糖基化缺陷。可从转基因母鸡的卵中收集具有N-聚糖的卵清蛋白质，如卵清蛋白和卵类粘蛋白，并评价引起转基因增强糖基化群的末端唾液酸和/或末端Gal和/或次末位Gal。
所述转基因增强糖基化群具有多种用途。例如，可将所述群与已有的产生治疗性蛋白的群交配，所述治疗性蛋白的有效性可通过增加唾液酸化N-聚糖结构而增强。在另一用途中，转基因群可用于产生全新的具有转基因的群，所述转基因包含产生于输卵管如输卵管膨大部组织的外源性蛋白质的编码序列。即将外源性(如治疗性)蛋白质转基因引入转基因增强糖基化群。
之前通过筛选鸡肝癌cDNA文库鉴定出鸡1型和2型β1，4Gal(Shaper，N.L.，J.A.Meurer，等(1997)J Biol Chem272(50)：31389-99).通过对公开的鸡基因组序列进行分析，发明人在鸡基因组中鉴定出另外5个GalT(如，3-7型β1，4 GalT)，这5个成员与在另外物种包括人、小鼠和仓鼠中鉴定出的5个成员相对应。
通过Northern分析法对7种鸡GalT在多种组织包括输卵管膨大部组织中的表达进行分析。在膨大部组织种基本未发现GalT1的表达，但培养的鸡成纤维细胞以及肝脏和肾脏组织种表达可检测水平的GalT1，如图2所示。在输卵管膨大部组织中未检测到6型的表达。在输卵管膨大部组织中表达2-5型以及7型。
缺少GalT1的表达是一个令人吃惊的结构，因为认为GalT1广泛表达于多种组织中(Hennet.Cell Mol Life Sci 59：1081-95，2002)。另外的研究发现GalT1表达于鸡的多种组织中，但是这些研究未评价输卵管膨大部组织的表达(Shaper，Meurer，Joziasse，Chou，Smith，Schnaar和Shaper.J Biol Chem 272：31389-99，1997)。
本发明发现在膨大部组织中缺少GalT1表达造成了缺少N-连接的Gal。同样母鸡输卵管膨大部组织中缺少GalT6表达。然而，认为GalT6主要负责将Gal加到葡萄糖-神经酰胺，糖脂乳糖-脑酰合成步骤中的一步(Guo等，Glycobiology 11：813-20，2001)，但通常不参与将Gal加入到母鸡中产生的其它蛋白质中。
因此，从发现的角度，本发明的目的是产生包含具有GalT1编码序列的转基因的鸟类，所述编码序列可操作的连接于在输卵管中发挥功能的启动子，从而如实施例所公开的，将Gal加入到输卵管组织中产生蛋白质的N-连接寡糖中。此外，期望这些GalT1鸟类还使一些唾液酸加入到蛋白质的-连接寡糖中。
GalT1的表达使Gal加入到输卵管膨大部组织产生的作为唾液酸附连点的N-连接寡糖中。如图8所示，于正常鸟类相比，将另外的唾液酸加入GalT1鸟类膨大部组织产生蛋白质的N-连接寡糖结构中。
本发明还涵盖通过提供比GalT1鸟具有更多唾液酸化N-连接寡糖的转基因增强糖基化鸟，从而补偿SiaT家族成员的表达缺陷。
发明人分析了最近测序的鸡基因组，发现其中存在α2，3 SialT家族的所有6种成员。还通过Northern印迹分析了SialT的表达。输卵管膨大部组织种SialT1表达很强(图3)，但SialT2表达低，表明SialT1在卵清O-聚糖合成中具有主要作用，因为在卵清蛋白质中发现的O-聚糖中Galβ1，3GalNAc链大多数被唾液酸化(尽管N-聚糖中出现的少数Galβ1，4GlcNAc链具有少量或未附连唾液酸)。在膨大部组织中可检测到SialT3的表达，但与鸡成纤维细胞、肾脏和肝脏相比，表达非常低(图3)。事实上，在肾脏和肝脏中SialT3的合成相当丰富，来自这些器官的N-聚糖唾液酸化水平程度高(Ito，Takegawa，Deguchi，Nagai，Nakagawa，Shinohara和Nishimura.Rapid Commun Mass Spectrom 20：3557-65，2006；Deguchi等，Rapid Commun Mass Spectrom 20：741-6，2006；Sasaki等，J Biol Chem 262：12059-76，1987)，表明在鸡中SialT3对N-聚糖唾液酸化具有重要作用。在鸡成纤维细胞中检测到SiaT4的弱信号，在膨大部组织和肾脏中信号更弱。受检组织中SialT4的低表达表明SialT4对于鸡N-聚糖唾液酸化作用较小。SialT6在膨大部组织和肾脏中表达较高，但在鸡成纤维细胞和肝脏中检测不到。
因此，根据本发明，涵盖在输卵管组织如输卵管膨大部组织中表达一种或多种重组或外源性SialT编码序列的转基因禽类。在一个实施方式中，涵盖转基因禽类，如转基因鸡，在输卵管膨大部组织(如管状腺细胞)表达外源性SialT编码序列，即重组禽类，如鸡，编码SialT的核苷酸序列。在一个实施方式中，涵盖表达外源性SialT1编码序列的转基因禽类。在一个实施方式中，涵盖表达外源性SialT2编码序列的转基因禽类。在一个实施方式中，涵盖表达外源性SialT3编码序列的转基因禽类。在一个实施方式中，涵盖表达外源性SialT4编码序列的转基因禽类。在一个实施方式中，涵盖表达外源性SialT5编码序列的转基因禽类。在一个实施方式中，涵盖表达外源性SialT6编码序列的转基因禽类。
在一个尤其有用的实施方式中，产生在输卵管膨大部组织(如管状腺细胞)中表达SialT3的转基因禽类，如鸡。
在一个实施方式中，产生根据本发明产生转基因增强糖基化的禽类，所述禽类包含一种或多种用于在输卵管中表达一种或多种GalT的转基因，或者一种或多种用于在输卵管中表达一种或多种SialT的转基因。在一个尤其有用但非限制性的实施例中，根据本发明产生转基因禽类，所述禽类包含用于在输卵管中表达GalT1的转基因以及用于在输卵管中表达SialT3的转基因。在另一个尤其有用的实施例中，根据本发明产生转基因禽类，所述禽类包含用于在输卵管中表达GalT1的转基因，用于在输卵管中表达SialT3的转基因以及用于在输卵管中表达SiaT4的转基因。在另一个尤其有用的实施例中，根据本发明产生转基因禽类，所述禽类包含用于在输卵管中表达GalT1的转基因，用于在输卵管中表达GalT6的转基因，用于在输卵管中表达SialT3的转基因以及用于在输卵管中表达SiaT4的转基因。
本领域一般技术人员了用于在禽类基因组中表达多于一种(例如1、3、4或更多种)外源性核苷酸序列的方法。例如，实施例6种描述了一种使用含有内部核糖体进入位点(IRES)单一转录物的方法。在另一实施例中，含有第一个所需转基因的完全转基因鸟(即G1转基因或G1转基因的后代)可包含使用标准方法引入其基因组的第二个转基因。即可通过与第一个转基因完全相同的方法将所述转基因引入完全转基因鸟。在另一实施例中，如本领域所知，可使完全转基因鸟与第二种含有所需转基因的完全转基因鸟交配。可重复这些步骤以在基因组种引入需要数目的转基因。
根据本发明用途涵盖任何有用的IRES，包括本文公开的那些IRES以及其它任何有用的IRES(如，足口病毒IRES，参见例如，Belsham和Brangwyn(1990)J of Virology，64卷，5389-5395)。
可使用任何有用方法将本发明的转基因引入禽类基因组，包括例如，2007年8月2日公开的美国专利公开号2007/0180546；2007年4月5日公开的美国专利公开号2007/0077650和2008年3月13日公开的美国专利公开号2008/0064862，将这些专利申请中每一个的公开内容整体纳入本文作参考。一个考虑是，尽管根据本发明产生的糖基转移酶不从细胞分泌因此通常不含信号序列，但是根据引用文献公开方法产生的蛋白质与信号序列一起生产，因此蛋白质被分泌入卵清。
根据本发明的用途涵盖任何可用于本发明的基因表达控制区(如启动子)。例如，可使用已证明在可在禽类发挥功能的组成型启动子如CMV和β-肌动蛋白。参见例如，2006年1月19日公开的美国专利公开号2006/0015960，和2006年6月29日公开的2006/0143725。将这两个专利申请的公开内容整体纳入本文作参考。在一个尤其有用的实施方式中，启动子主要或仅仅在输卵管中表达，如卵类粘蛋白启动子，卵清蛋白启动子和溶菌酶启动子，伴清蛋白启动子，卵粘蛋白启动子，卵转铁蛋白启动子。参见例如，2005年8月11日公开的美国专利公开号2005/0176047；2007年2月13日授权的美国专利号7,176,300；2007年5月31日公开的美国专利公开号2007/0124829；以及2006年6月15日公开的美国专利公开号2006/0130170。这三个专利申请和一个授权专利每一个的公开内容均整体纳入本文作参考。此类启动子可用于避免在禽类输卵管组织的相邻组织中过表达糖基转移酶，在相邻组织中过表达糖基转移酶可对转基因鸟的健康或存活产生问题。其它根据本发明有用的启动子包括，例如但不限于，MDOT启动子和罗斯肉瘤病毒(RSV)启动子，鼠白血病病毒(MLV)启动子，小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子和SV40启动子，以及这些启动子每一个的功能部分。其它可用于本发明的启动子包括但不限于Pol III启动子(例如1、2、3型Pol III启动子)，如H1启动子，U6启动子，tRNA启动子，RNA酶MPR启动子以及这些启动子每一个的功能部分。通常，如本领域技术人员所知，根据所用启动子选自用于本发明的功能性终止子序列。
在一个有用的实施方式中，使用2007年5月17日公开的美国专利公开号2007/0113299中完全公开的1.8kb卵类粘蛋白启动子，将其公开内容整体纳入本文作参考。如实施例3所示，该1.8kb OM启动子可用于在膨大部组织细胞中表达GalT编码序列。涵盖在1.8kb卵类粘蛋白启动子控制下在输卵管中产生的其它糖基化酶。
所涵盖的在本发明转基因增强糖基化鸟类中产生的蛋白质具体包括含有一个或多个N-连接寡糖结构的治疗性蛋白质，包括但不限于人蛋白质。此类蛋白质包括但不限于：下列蛋白质，包括其可应用的人蛋白质的等价物：融合蛋白，生长激素，细胞因子，结构蛋白和酶，包括人生长激素，干扰素，溶菌酶和β-酪蛋白，清蛋白，α-1抗胰蛋白酶，抗凝血酶III，胶原，因子VIII，因子IX，因子X(等)，纤维蛋白原，胰岛素，乳铁蛋白，蛋白质C，红细胞生成素(EPO)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，组织型纤溶酶原激活物(tPA)，生长激素和糜蛋白酶，葡糖脑苷脂酶，溶酶体酸脂肪酶，β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；半乳糖基神经酰胺酶(GALC)；阿加糖酶α(Replagal)，阿加糖酶β(Fabrazyme)或α半乳糖苷酶A；α-葡糖苷酶；酸性鞘磷脂酶(rhASM)；半乳糖基神经酰胺酶(GALC)；修饰的免疫球蛋白和抗体，包括可结合人肿瘤细胞的表面抗原的免疫毒素、b-结构域缺失的因子VIII、因子VIIa、抗凝素；水蛭素，阿替普酶，tpa，瑞替普酶，tpa，tpa-5个结构域中3个缺失，胰岛素，赖脯胰岛素、速效胰岛素、甘精胰岛素、长效胰岛素类似物，hgh，胰高血糖素，tsh，促卵泡素-β，fsh，gm-csf，pdgh，ifnα2，ifnα2a，ifnα2b，inf-α，inf-β1b，ifn-β1a，ifn-γ1b，il-2，il-11，hbsag，ospa，抗t-淋巴细胞抗原的单抗，抗tag-72的单抗，肿瘤相关性糖蛋白，衍生自抗血小板表面受体gpII(b)/III(a)的嵌合单抗的fab片段，抗肿瘤相关抗原ca125的单抗或单抗片段，抗人癌胚抗原cea的单抗或单抗片段，抗人心肌球蛋白的单抗或单抗片段，抗肿瘤表面抗原psma的单抗或单抗片段，抗hmw-maa的单抗片段(fab/fab2混合物)，抗癌症相关抗原的单抗或单抗片段(fab)，抗nca90(一种表面粒细胞非特异性交叉反应性抗原)的单抗片段(fab)，抗b淋巴细胞表面上的cd20抗原的嵌合单抗，抗il2受体α链的人源化单抗，抗il2受体α链的的嵌合单抗，抗tnf-α的嵌合单抗，抗呼吸道合胞病毒表面上的表位的人源化单抗，抗her2(人表皮生长因子受体2)的人源化单抗，抗细胞角蛋白肿瘤相关抗原抗-ctla4的人单抗，抗b淋巴细胞的cd 20表面抗原的嵌合单抗、阿法链道酶-DNA酶，β葡糖脑苷脂酶，tnf-α，il-2-白喉毒素融合蛋白，tnfr-lgg片段融合蛋白、拉罗尼酶，DNA酶，单抗，阿来法塞，托西莫单抗，阿来组单抗，拉布立酶，阿加糖酶β，特立帕肽，甲状旁腺激素衍生物，阿达木单抗(lgg1)，阿那白滞素、生物改性剂，奈西立肽(nesiritide)，人b-型利钠肽(hbnp)，集落刺激因子，培维索孟，人生长激素受体拮抗剂，重组活化的蛋白质c，奥马珠单抗，免疫球蛋白e(lge)阻断物，替伊莫单抗，ACTH，胰高血糖素，促生长素抑制素，促生长素，胸腺素，甲状旁腺激素，色素激素，生长调节素，红细胞生成素，黄体生成素，绒毛膜促性腺素，下丘脑释放因子，依那西普，抗利尿激素，促乳素，促甲状腺激素，多聚蛋白质，包括免疫球蛋白，如抗体和其抗原结合片段，包含可变区或其变体的免疫球蛋白重链多肽，其可包含D区、J区、C区或其组合；包含可变区或其变体的免疫球蛋白轻链多肽，其可包含J区和C区；由至少一种包含免疫球蛋白重链可变区、免疫球蛋白轻链可变区和接头肽编码的表达载体编码的免疫球蛋白多肽，从而形成能够选择性结合抗原的单链抗体；贺赛汀TM(曲妥珠单抗)(基因泰克公司(Genentech)，CA)，它是用于治疗转移性乳腺癌患者的人源化抗-HER2单克隆抗体；REOPROTM(阿昔单抗)(森托克公司(Centocor))，它是用于防止血凝块形成的血小板上糖蛋白IIb/IIIa受体的抗体；ZENAPAXTM(达珠单抗)(瑞士罗氏制药公司(Roche Pharmaceuticals，Switzerland))，它是免疫抑制剂型人源化抗-CD25单克隆抗体，用于预防急性肾移植排斥；PANOREXTM，它是抗-17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(葛兰素史克公司(Glaxo Wellcome)/森托克公司)；BEC2，它是鼠抗-独特型(GD3表位)IgG抗体(因克隆系统公司(ImClone System))；IMC-C225，它是嵌合抗-EGFR IgG抗体(因克隆系统公司)；维他辛(VITAXIN)TM，它是人源化抗-αVβ3整联蛋白抗体(应用分子演化公司(Applied Molecular Evolution)/米迪缪尼公司(MedImmune))；坎帕斯(Campath)；坎帕斯1H/LDP-03，它是人源化抗CD52IgG1抗体(LS公司(Leukosite))；斯马特(Smart)M195，它是人源化抗-CD33IgG抗体(蛋白质设计实验室(Protein Design Lab)/康宝公司(Kanebo))；利妥昔TM，它是嵌合抗-CD2O IgG1抗体(IDEC制药/基因泰克公司，罗氏公司/泽塔公司(Zettyaku))；LYMPHOCIDETM，它是人源化抗-CD22IgG抗体(IM公司(Immunomedics))；ICM3，它是人源化抗-ICAM3抗体(ICOS制药)；IDEC-114，它是灵长动物抗-CD80抗体(IDEC制药/三菱公司(Mitsubishi))；ZEVALINTM，它是放射性标记的鼠抗-CD20抗体(IDEC/先灵公司(ScheringAG))；IDEC-131，它是人源化抗CD40L抗体(IDEC/卫才公司(Eisai))；IDEC-151，它是灵长化的抗-CD4抗体(IDEC)；IDEC-152，它是灵长化的抗-CD23抗体(IDEC/生化公司(Seikagaku))；SMART抗-CD3，它是人源化抗-CD3IgG(蛋白质设计实验室)；5G1.1，它是人源化抗-补体因子5(CS)抗体(阿来申制药公司(Alexion Pharm))；D2E7，它是人源化抗-TNF-α抗体(CATIBASF)；CDP870，它是人源化抗-TNF-αFab片段(塞尔泰克公司(Celltech))；IDEC-151，它是灵长化的抗-CD4 IgG1抗体(IDEC制药/史可必成公司(SmithKline Beecham))；MDX-CD4，它是人抗-CD4 IgG抗体(麦得莱克斯公司/卫才公司/基麦公司(Medarex/Eisai/Genmab))；CDP571，它是人源化抗-TNF-αIgG4抗体(塞尔泰克公司)；LDP-02，它是人源化抗-α4β7抗体(LS公司/基因泰克公司)；奥索克隆(OrthoClone)OKT4A，它是人源化抗-CD4 IgG抗体(奥索生物技术公司(Ortho Biotech))；ANTOVATM，它是人源化抗CD40L IgG抗体(拜基公司(Biogen))；ANTEGRENTM，它是人源化抗-VLA-4 IgG抗体(伊兰公司(Elan))；CAT-152，它是人抗-TGF-β2抗体(剑桥抗体技术公司(Cambridge Ab Tech))；西妥昔单抗(BMS)，它是单克隆抗-EGF受体(EGFr)抗体；贝伐单抗(基因泰克公司)，它是抗-VEGF人单克隆抗体；英夫利昔单抗(森托克公司(Centocore)，JJ)，它是用于自身免疫病的嵌合(小鼠和人)单克隆抗体；吉姆单抗奥佐米星(惠氏公司(Wyeth))，它是用于化疗的单克隆抗体；雷珠单抗(基因泰克公司)，它是用于治疗黄斑变性的嵌合(小鼠和人)单克隆抗体，GM-CSF，干扰素β，融合蛋白，CTLA4-Fc融合蛋白，生长激素，细胞因子，结构蛋白，干扰素，溶菌酶，β-酪蛋白，清蛋白，α-1抗胰蛋白酶，抗凝血酶III，胶原，因子VIII，因子IX，因子X(等)，纤维蛋白原，乳铁蛋白，蛋白质C，组织型纤溶酶原激活物(tPA)，促生长素和胰凝乳蛋白酶，免疫球蛋白，抗体，免疫毒素，因子VIII，b-结构域缺失的因子VIII，因子VIIa，因子IX，抗凝素；水蛭素，阿替普酶，tpa，瑞替普酶，tpa，tpa-5个结构域中缺失3个，胰岛素、赖脯胰岛素、速效胰岛素、甘精胰岛素、长效胰岛素类似物，胰高血糖素，tsh，促卵泡素-β，fsh，pdgh，inf-β，ifn-β1，ifn-β2，ifn-α，ifn-α1，ifn-α2，ifn-γ，il-2，il-11，hbsag，ospa，阿法链道酶-DNA酶，β葡糖脑苷脂酶，tnf-α，il-2-白喉毒素融合蛋白，tnfr-lgg片段融合蛋白，拉罗尼酶，DNA酶，阿来法塞，托西莫单抗，鼠单抗，阿来组单抗，拉布立酶，阿加糖酶β，特立帕肽，甲状旁腺激素衍生物，阿达木单抗(lgg1)，阿那白滞素、生物改性剂，奈西立肽，人b-型利钠肽(hbnp)，集落刺激因子，培维索孟，人生长激素受体拮抗剂，重组活化的蛋白质c，奥马珠单抗，免疫球蛋白e(lge)阻断物，替伊莫单抗，ACTH，胰高血糖素，促生长素抑制素，促生长素，胸腺素，甲状旁腺激素，色素激素，生长调节素，黄体生成素，绒毛膜促性腺素，下丘脑释放因子，依那西普，抗利尿激素，促乳素和促甲状腺激素，免疫球蛋白多肽，免疫球蛋白多肽D区，免疫球蛋白多肽J区，免疫球蛋白多肽C区，免疫球蛋白轻链，免疫球蛋白重链，免疫球蛋白重链可变区，免疫球蛋白轻链可变区和接头肽。
如本领域技术人员所知，可对如本文公开的那些通常没有N-糖基化的蛋白质进行工程改造，使其包含在禽类系统中可糖基化的糖基化位点(即N-连接的糖基化位点)。此外，可对如本文公开的蛋白质进行工程改造，使其包含一个或多个另外的N-连接的糖基化位点。在一个实施方式中，将附加糖基化的蛋白质与一个或多个具有如本文公开的方法产生的修饰末端的N-连接寡糖结构连接。
尤其涵盖如本文所述产生的可使用本领域一般技术人员所知方法分离或纯化的蛋白质。
在一个实施方式中，根据本发明产生的禽类在输卵管中生产的卵包含具有糖基化模式改变的外源或异源蛋白质(如治疗性蛋白质)，每个硬壳卵中包含的量大于约0.01μg。例如，所述卵包含异源性蛋白质的量范围为每个硬壳卵中含约0.01μg-2g。在一个实施方式中，所述卵包含的量为每个硬壳卵中含约0.1μg-1g。例如，所述卵包含的量为每个硬壳卵中含约1μg-1g。在一个实施方式中，所述卵包含的量为每个硬壳卵中含约10μg-1g。例如，所述卵包含的量为每个硬壳卵中含约100μg-1g(如，所述卵包含的量为每个硬壳卵中含约100μg-100mg)。
通常，本文所公开的糖基化模式改变的异源性蛋白质(如治疗性蛋白质)出现于卵清中。在一个实施方式中，卵清中异源性蛋白质的量大于每毫升卵约0.01μg。在另一实施方式中，卵清中异源蛋白质的量的范围是约每毫升卵清0.01μg-0.2g。例如，卵清中异源蛋白质的量的范围是每毫升卵清约0.1μg-0.5g。在一个实施方式中，卵清中异源蛋白质的量的范围是每毫升卵清约1μg-0.2g。例如，卵清中异源性蛋白质量的范围是每毫升卵清约10μg-0.1g(如卵清中异源性蛋白质量的范围是每毫升卵清约10μg-5mg)。
本发明也考虑，将按照本文所述产生的蛋白质PEG化可能是有利的，如2006年10月23日提交的美国专利申请11/584,832(通过参考将其全部内容纳入本文)所述。
虽然本发明产生的治疗性蛋白质可以原型给药，但优选作为药物制剂的一部分给予该治疗性蛋白质。
因此，本发明还提供了含有按照本发明产生的治疗性蛋白质或其药学上可接受的衍生物及一种或多种药学上可接受的载体和任选的其它治疗性和/或预防性成分的药物制剂，以及给予这种药物制剂的方法。所述载体必须是“可接受的”，这意味着它与该制剂的其它成分相容，并且对接受者无害。可利用具有本领域技术的医生知道的标准方法确定用本发明药物组合物治疗患者的方法(如药物蛋白质的给药量、给药频率和治疗持续时间)，
药物制剂包括适合口服、直肠、经鼻、局部(包括粘膜和舌下)、阴道给予的制剂。药物制剂包括适合注射给药，包括肌肉内、皮下和静脉内给药的制剂。药物制剂也包括通过吸入或吹入给药的制剂。适当时，该制剂可方便地制备成独立的剂量单位，可通过药学领域熟知的任何方法来制备。生产药物制剂的方法一般包括以下步骤：将治疗性蛋白质与液体载体或细碎的固体载体或二者放在一起，然后(如果必要)使该产品成型制成所需制剂。
适用于口服给药的药物制剂可方便地制成各自含有预定量的活性成分的粉末剂或颗粒剂、溶液剂、混悬剂或乳剂形式的独立单位，如胶囊剂、扁囊剂或片剂。该活性成分也可制成大丸剂、药糖剂或贴剂。口服给药的片剂和胶囊可含有常规赋形剂，如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或湿润剂。可按照本领域熟知方法对片剂进行包衣。口服液体制剂可以是(例如)水性或油性混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或酏剂的形式，或者可制成临用前用水或其它合适的载体进行重建的干燥产品。这类液体制剂可含有常规的添加剂，如助悬剂、乳化剂、非水性载体(可含食用油)或防腐剂。
配制成胃肠道外给药(例如注射，如推注或连续输注)形式的本发明治疗性蛋白质可制成单位剂型装在安瓿、预填充注射器、小体积输液瓶或加入防腐剂的多剂量容器中。可通过(例如)皮下注射、肌肉内注射和静脉内输液或注射来注射该治疗性蛋白质。
该治疗性蛋白质可以是诸如油性或水性载体中的悬浮剂、溶液剂或乳剂的形式，可含有配方试剂，如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。也考虑该治疗性蛋白质可以是无菌固体经无菌分离或溶液经冻干获得的临用前用合适的载体如无菌无热原水进行重建的粉末形式。
外用于表皮时，本发明产生的治疗性蛋白质可配制成软膏剂、乳膏剂或洗剂，或透皮贴剂。可用水性或油性基料，加入合适的增稠剂和/或凝胶剂来配制软膏剂和乳膏剂。可用水性或油性基料配制洗剂，通常还含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。
适合局部给予口腔的制剂包括含有活性成分和调味基料，例如蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶的锭剂；含有活性成分和惰性基料如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶的软锭剂；以及含有活性成分和合适液体载体的漱口水。
载体是固体的适合直肠给药的药物制剂最优选为单位剂量栓剂。合适载体包括可可油和本领域常用的其它材料，通过将活性化合物与软化或融化的载体混合，然后在模具中冷却成型，可方便地形成栓剂。
适合阴道给药的制剂可制成阴道栓剂、棉塞剂，乳膏剂、凝胶剂、贴剂、泡沫剂或喷雾剂。
就鼻内给药而言，本发明治疗性蛋白质可用作液体喷雾剂或可分散粉末剂，或者是滴剂形式。
可使用还含有一种或多种分散剂、增溶剂或助悬剂的水性或非水性基料来配制滴剂。通过加压罐可方便地递送液体喷雾剂。
吸入给药时，可由吹药器、喷雾器或加压罐或其它方便的递送气溶胶喷雾的方式来方便地递送本发明治疗性蛋白质。加压罐可包含合适的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适气体。在加压气溶胶的情况下，可通过阀门递送计量用量，以确定剂量单位。
吸入或吹入给药时，本发明治疗性蛋白质可以是干燥粉末组合物的形式，例如该化合物与合适的粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。可将粉末组合物制成单位剂型，装在(例如)胶囊或药筒中，或者(如)明胶或泡罩包装中，可通过吸入器或吹药器的辅助来给予该粉末。
需要时，上述制剂被配置成能实现活性成分的缓释。
本发明药物组合物也可含有其它活性成分，如抗微生物剂或防腐剂。此外，还考虑到本发明治疗性蛋白质可与其它治疗剂联合使用。
本发明组合物或化合物可用于治疗各种疾病。例如，本领域技术人员已知用于治疗许多疾病的治疗方案，这些方案利用获自细胞培养物(如CHO细胞)的治疗性蛋白质。本发明涵盖根据本发明产生的可用于治疗这类病症的治疗性蛋白质。就是说，本发明考虑利用本发明产生的治疗性蛋白质来治疗已知可方便地用常规治疗性蛋白质进行治疗的疾病。例如，根据本发明产生的红细胞生成素可用于治疗人的病症，如贫血和肾脏疾病，如慢性肾衰竭(或其它可通过给予本发明EPO进行治疗的病症)。
通常，给药剂量取决于已知因素，如接受者的年龄、健康状况和体重、并行治疗的类型、治疗频率等。通常，活性成分的剂量可约为0.0001-10毫克/千克体重。可由熟知各治疗性蛋白质的给药知识的医生确定准确的剂量、给药频率和治疗时间间隔。
例如本文中图9-11公开了图6中至少部分所示载体的核苷酸序列。还显示了编码糖基转移酶的糖基转移酶氨基酸序列和核苷酸序列，这些序列是根据本发明的用途所涵盖的序列例子。本发明用途还涵盖与本文所公开的氨基酸序列包括图12-28公开的序列中每一条具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％相同性或同源性的氨基酸序列。本发明用途还涵盖与本文所公开的核苷酸序列包括图9-28公开的序列中每一条具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％相同性或同源性的核苷酸序列。
本文标明了所公开的糖基转移酶的编码序列，本领域技术人员可从这些具体编码序列确定氨基酸序列。因此，本发明包括编码具有糖基转移酶功能的氨基酸序列的核苷酸序列，所述糖基转移酶与本文公开的糖基转移酶编码序列中每一个的编码氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％相同性。
本发明的范围还包括，根据本发明本文所公开的核苷酸和氨基酸序列中每一个的功能性片段的用途。
还涵盖本文所公开的在蛋白质的N-连接寡糖结构中加入糖(如唾液酸，半乳糖)的概念和用途在其它动物和其它有机体如植物中的用途。
用下列实施例对本发明作进一步说明，但仅以说明方式提供，而不应当解释为对本发明的限制。将本发明所有引用的参考文献、公开的专利申请以及专利内容整体纳入本文作参考。
实施例1
在禽类输卵管中表达GalT1的载体设计和构建
利用整合DNA技术(爱荷华州科尔维尔)(Coralville，IA)，使用针对母鸡输卵管膨大部组织表达优化的密码子合成GalT1编码序列，如下所示(SEQ ID NO：40)：
ATGAAAGAACCTGCACTTCCTGGTACTTCACTGCAAAGAGCATGTAGACTGCTGGTAGCATTTTGCGCCCTGCACCTGAGCGCAACCCTGCTCTACTACCTGGCTGGATCCAGCCTGACTCCACCCCGCTCTCCAGAACCTCCCCCTCGGAGGCCGCCTCCAGCCAACCTCTCCCTGCCACCCTCCCGGCCTCCTCCTCCCCCTGCGGCTCGCCCCCGCCCAGGACCTGTTTCTGCACAACCCCGGAACCTGCCAGATTCTGCACCATCTGGACTGTGCCCCGATCCAAGTCCACTGCTCGTTGGTCCTCTGCGGGTGGAGTTTAGTCAGCCAGTGAACCTGGAGGAAGTGGCTTCTACCAATCCGGAGGTCAGGGAAGGAGGGAGATTCGCCCCAAAGGACTGCAAAGCGCTCCAGAAGGTGGCTATTATTATCCCCTTCAGGAACAGAGAGGAGCACCTGAAGTATTGGCTGTACTACATGCACCCGATTCTTCAGAGACAGCAATTGGACTATGGGGTCTATGTGATTAATCAAGACGGCGATGAAGAATTTAACAGAGCTAAACTGCTTAATGTCGGTTTCACTGAGGCACTCAAGGAATACGATTATGATTGCTTTGTGTTTTCCGATGTGGATCTGATTCCTATGGACGACCGTAACACATATAAGTGCTATAGTCAACCACGTCACCTGAGTGTGTCAATGGACAAGTTTGGCTTTAGGCTGCCGTATAACCAGTATTTCGGAGGAGTTTCAGCATTGAGTAAAGAACAGTTTACAAAAATCAACGGGTTCCCAAATAACTACTGGGGGTGGGGCGGAGAGGACGACGACATCTACAACAGACTGGTTTTTAAGGGGATGGGGATTTCCCGCCCGGATGCAGTAATAGGCAAGTGTCGTATGATACGCCATAGCAGGGATAGAAAGAACGAACCCAACCCTGAGCGCTTTGACCGGATTGCACATACAAGAGAAACTATGTCATCTGATGGACTTAACTCTCTTTCATATGAGGTGCTGAGAACAGATCGGTTCCCCCTGTACACTAGAATCACAGTAGATATCGGGGCACCTGGGTCATAA
如图6A所示，将合成编码序列插入到ALV载体(gag、pol和env基因缺失)的卵类粘蛋白(OM)启动子下游(图9所示序列)。
ALV载体的LTR是自失活(SIN)，因此该载体称为pALV-SIN，如2008年3月13日公开的美国专利公开号2008/0064862，将其公开内容整体纳入本文作参考。所用载体也是SC-阴性载体，如美国专利公开号2008/0064862所述。即从pALV-SIN移除了滴定基因(即新霉素抗性基因)相关元件。
图6A所示pALV-SIN载体(图9)使用了1.8kb卵类粘蛋白(OM)启动子，该启动子用于驱动半乳糖基转移酶编码序列的输卵管膨大部组织的特异性表达。OM蛋白质是一种主要的卵清蛋白质，OM基因的表达完全限制于膨大部组织。所述载体称作pALV-SIN-GalT1。
实施例2
产生GalT1转基因增强鸟类
通过2007年4月5日公开的美国专利公开号2007/0077650中所公开的瞬时转染方法将如实施例1所述pALV-SIN-GalT1载体包装入病毒颗粒。
转染后48小时收集包含病毒的培养基并离心浓缩，然后立即注射入开窗卵的X期胚胎(X期是约有50,000个细胞的胚胎，通常可见于新鲜产下的卵中)。
注射约150个胚胎。用热胶栓封闭卵后进行孵育(Andacht等，MolReprod Dev 69：31-4.，2004)。21天后孵化出42只小鸡，于1周后评价血液DNA中转基因的存在。所述孵化小鸡记作G0，表示第0代。
为了评价转基因步骤是否成功，使用Taqman
定量PCR系统确定孵化的G0鸡血液DNA中的转基因含量(Harvey等，Poultry Science 81：202-12，2002)。基于糖基转移酶CDS的序列设计引物和荧光标记的探针。纯化血液DNA，使用Picogreen
试剂盒定量，并用Taqman实验进行分析。约80％的鸡在其血液DNA中具有可检测水平的转基因。
进行进一步的分子确认转基因的整合完整性。使用PCR从阳性鸡的血液中扩增转基因的不同部分(OM启动子、CDS和3’非翻译区)，使用琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物的大小。所有测试的GalT1阳性G0鸟均包含完整的转基因拷贝。
实施例3
产生完全转基因GalT1鸟并评价转基因增强糖基化
收集实施例2中的G0公鸡的精液，用Taqman实验分析精子DNA中转基因的含量(Harvey，Speksnijder，Baugh，Morris和Ivarie.PoultryScience 81：202-12，2002)。将转基因含量最高的公鸡与野生型母鸡交配，产生的子代经Taqman分析，鉴定出完全完全转基因G1。
收集13只G1母鸡的卵。用PNG酶处理卵清蛋白质，PNG酶可从蛋白质中特异性释放N-连接寡糖(N-聚糖)。纯化N-聚糖，通过MALDI-MS分析确定结构，结果如图8所示。如图所示，结果表明在许多寡糖结构中加入了相当数量的半乳糖，证实了本发明的有效性。此外，图8A-8C显示，与来自野生型母鸡的蛋白质寡糖结构相比(图8D)，GalT1鸟蛋白质的寡糖结构中加入了更多的唾液酸。
实施例4
表达SialT3转基因增强鸟的载体设计和构建
使用根据在母鸡输卵管膨大部组织中合成鸡3型α-2，3-唾液酸转移酶所优化的密码子合成SialT3编码序列，如下所示(SEQ ID NO：41)：
ATGGGTCTTTTGGTTTTCATGAGAAATCTGCTGCTGGCTCTGTGTCTGTTCCTGGTCCTGGGATTTCTGTACTACTCTGCATGGAAGCTCCACCTGCTGCGCTGGGAGGATAGCTCTAAATATGGACGCCTGAGCCATAGCTCTTTTCCTAAGCAAAGACCAAGTGCTGATTCTGTGGTCTTGTCATTTGACTCTGTTGGACATACTATTGGCTCTGAATATGACAAACTGGGTTTTCTGCTTAACCTTGATTCTAAACTTCCCCCTGAATTGGCCTCAAAATATGCCAACTTCTCTGAGGGAGTGTGCAAGCCTGGTTATGCATCTGCCCTGATGACTGTGATTTTCCCTAAATTCTCCAAACCTGCCCCCATGTTCCTTGATGACTCCTTCCGGCGCTGGGCCCGCATTAGAGACTTTGTGCCTCCATTTGGCATTAAAGGGCAGGACAATCTGATAAAGGCAATACTGTCTGCTACAAAAGATTACAGACTCACACCAGCACTGGACAGCTTGTCATGCCGCCGCTGTATCATTGTTGGGAATGGTGGTGTTCTGGCCAACAAGAGTTTGGGTCTTAAGATTGATGACTATGATGTGGTCGTTCGCCTGAACTCTGCACCTGTCAAAGGCTTTGAGAAAGATGTTGGTGGAAAGACAACACTGCGGATCACTTACCCAGAGGGGGCTATTCAGAAGATGGAACAGTATGAGAAAGACTCCCTGTTTGTGCTGGCGGGATTTAAATGGCAAGACTTTAAGTGGCTGAAATATATTGTGTATAAAGAAAAGGTCTCAGCTTCTGATGGCTTCTGGAAATCAGTGGCTACCCGGGTGCCTCGGGAGCCACATGAAATTCGCATACTGAATCCCTATTTCATCCAAGAAGCTGCTTTTTCATTCATTGGCCTGCCATTCAATAATGGTCTGATGGGTCGGGGGAATATCCCCACCCTGGGTTCTGTGGCCATCACAATGGCTCTGCATAATTGTGATGAGGTGGCTGTTGCTGGCTTTGGATATGACATGAGTTCCCCTAATGCTCCCCTGCATTACTATGAGAACATAAAAATGAGTGCCATTAAGGAGTCATGGACTCATAATATACAACGGGAGAAGGAATTTCTTCGCAAGCTGGTTAAAGCCAGAGTGATTACAGATCTTACATCTGGGATATGA
如图10所示，将合成编码序列插入到如图6B所示pALV-SIN载体中卵类粘蛋白(OM)启动子下游，得到pALV-SIN-SialT3，序列如图10所示。组装构建物，产生G0鸟类，并完全如实施例1和2中GalT1G0鸟所述进行分析，并完全如实施例3中GalT1鸟所述产生G1鸟。
实施例5
用SiaT3阳性鸟和GalT1阳性鸟交配产生SialT3/GalT1转基因增强鸟
如本领域所知，将实施例3中一只或多只GalT1 G1鸟(或两只GalT1 G1鸟交配所得纯合子G2 GalT1鸟)与实施例4中SialT3 G1鸟交配(或与两只SialT3 G1鸟交配所得纯合子G2 SialT3鸟交配)，从而得到带有GalT1和SialT3转基因的子代鸟。如本领域所知，将这些鸟彼此进行再次交配产生两种转基因的纯合子。
实施例6
用于单一载体产生SialT3和GalT1转基因增强鸟类的载体设计和构建
使用如实施例1和4中为鸡输卵管膨大部组织表达而优化的密码子合成GalT1和SialT3编码序列。将编码序列插入到单个逆转录病毒载体中单个1.8kb卵类粘蛋白启动子的下游。将用于第二或下游CDS翻译的序列(如IRES)插入到GalT1和SialT3 CDS之间，从而产生具有双顺反子信息的载体，如图6C和图11所示。
上游翻译起始位点起始GalT1的翻译，内部核糖体进入位点(IRES)起始SialT3的翻译，GalT1和SialT3 CDS从同一mRNA中表达。如图6C所示IRES来自于脑心肌炎病(EMCV)(Jang等，J Virol 62：2636-43.，1988；Ghattas等，Mol Cell Biol 11：5848-59，1991)。
将该载体插入禽类(如鸡、鹌鹑、火鸡)胚胎，如上述实施例关于pALV-SIN-GalT1的描述，获得胚胎和G0、G1。如本领域所知，可获取纯合子。
将本文所引用的所有参开文献整体纳入本文作参考，出于如每一单独公开物、专利或专利申请所表明的相同程度的所有目的，将其整体纳入本文作参考。
对任何公开物引用是因为其在本申请申请日之前公开，不应被解释为承认本发明是在此公开物之后作出的。
虽然已经通过各种具体实施例对这项发明进行描述，应当理解的是并不因此而限制本发明，并且可根据权利要求范围对本发明进行多种实践。
Claims (36)
1.一种转基因禽类，其包含含有糖基转移酶编码序列的转基因，其中所述转基因禽类的输卵管组织产生具有包含至少一个糖的N-连接寡糖的蛋白质，其中在不存在所述转基因的情况下所述寡糖不包含所述糖。
2.如权利要求1所述的转基因禽类，其特征在于，所述糖基转移酶是N-乙酰葡糖胺基转移酶。
3.如权利要求1所述的转基因禽类，其特征在于，所述糖基转移酶是N-乙酰葡糖胺基转移酶3。
4.如权利要求1所述的转基因禽类，其特征在于，所述输卵管组织是输卵管膨大部组织。
5.如权利要求1所述的转基因禽类，其特征在于，所述输卵管组织含有管状腺细胞。
6.如权利要求1所述的转基因禽类，其特征在于，所述输卵管组织的细胞在卵清存在时分泌蛋白质。
7.如权利要求1所述的转基因禽类，其特征在于，所述转基因包含LTR。
8.如权利要求1所述的转基因禽类，其特征在于，所述转基因包含输卵管特异性启动子。
9.一种包含分离权利要求1所述转基因禽类所产生的蛋白质的方法。
10.如权利要求1所述的转基因禽类，其特征在于，所述蛋白质对于禽类是外源性的。
11.一种包含分离权利要求10所述的转基因禽类所产生的外源性蛋白质的方法。
12.如权利要求1所述的转基因禽类，其特征在于，所述蛋白质是治疗性蛋白质。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述禽类是鸡。
14.一种转基因禽类，其包含含有半乳糖转移酶编码序列的转基因，其中所述转基因禽类的输卵管组织产生具有包含至少一个半乳糖的N-连接寡糖的蛋白质，其中在不存在所述转基因的情况下所述寡糖不包含所述半乳糖。
15.如权利要求14所述的转基因禽类，其特征在于，所述糖基转移酶是1型半乳糖基转移酶。
16.如权利要求14所述的转基因禽类，其特征在于，所述蛋白质产生于管状腺细胞。
17.如权利要求14所述的转基因禽类，其特征在于，所述输卵管组织的细胞在卵清存在时分泌蛋白质。
18.如权利要求14所述的转基因禽类，其特征在于，所述寡糖包含1-5个半乳糖。
19.如权利要求14所述的转基因禽类，其特征在于，所述转基因包含禽类特异性启动子。
20.一种包含分离权利要求14所述转基因禽类所产生的蛋白质的方法。
21.如权利要求14所述的转基因禽类，其特征在于，所述蛋白质是外源性蛋白质。
22.一种包含分离权利要求21所述转基因禽类所产生的外源性蛋白质的方法。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是治疗性蛋白质。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述禽类是鸡。
25.一种转基因禽类，其包含含有唾液酸转移酶编码序列的转基因，其中所述转基因禽类的输卵管组织产生具有包含至少一个唾液酸的N-连接寡糖的蛋白质，其中在不存在所述转基因的情况下所述寡糖不包含所述唾液酸。
26.如权利要求25所述的转基因禽类，其特征在于，所述糖基转移酶是1型半乳糖基转移酶。
27.如权利要求25所述的转基因禽类，其特征在于，所述蛋白质产生于管状腺细胞。
28.如权利要求25所述的转基因禽类，其特征在于，所述输卵管组织的细胞在卵清存在时分泌蛋白质。
29.如权利要求25所述的转基因禽类，其特征在于，所述寡糖包含1-5个唾液酸。
30.如权利要求25所述的转基因禽类，其特征在于，所述转基因包含禽类特异性启动子。
31.一种包含分离权利要求25所述转基因禽类所产生的蛋白质的方法。
32.如权利要求25所述的转基因禽类，其特征在于，所述蛋白质是外源性蛋白质。
33.一种包含分离权利要求32所述转基因禽类所产生的外源性蛋白质的方法。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是治疗性蛋白质。
35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述禽类是鸡。
36.一种在禽类中产生蛋白质的方法，其中所述蛋白质对于禽类是外源性的，所述方法包括产生含有编码糖基转移酶的转基因的转基因禽类，其中所述禽类的输卵管组织产生由第二个转基因编码的外源性蛋白质，所述蛋白质具有包含半乳糖和唾液酸中至少一个的N-连接寡糖，其中在不存在编码糖基转移酶的转基因时所述寡糖不包含所述半乳糖和/或唾液酸。
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