TW201307254A

TW201307254A - 二苯基－胺衍生物的用途、合成方法和醫藥組合物

Info

Publication number: TW201307254A
Application number: TW100142739A
Authority: TW
Inventors: Solanes Rosa Rodes; Dominguez Neftali Garcia; Ortega Beatriz Lopez; De Mon Soto Melchor Alvarez; La Hera Martinez Antonio De; Munoz Ana Munoz; Gomez Francisco Ledo
Original assignee: Faes Farma Sa
Priority date: 2010-11-23
Filing date: 2011-11-22
Publication date: 2013-02-16

Abstract

本發明涉及式(I)的化合物：□或其藥學上可接受的鹽、前體藥物或其溶劑化物、所述化合物的合成方法、包含其的醫藥組合物及其作為治療炎症疾病藥劑的用途。

Description

二苯基-胺衍生物的用途、合成方法和醫藥組合物

本發明涉及二苯基衍生物、其合成方法、包含其的組合物和在製備治療免疫調節(例如，免疫疾病或特定類型的癌症)藥劑中的用途。

炎症是血管組織先天的複雜免疫系統，包含感染部位的白血球和血漿蛋白的聚集和活化，所述感染部位暴露於毒素或細胞損傷。

炎症開始於促進白血球募集反應的血管改變。

局部適應性免疫反應可以刺激炎症。雖然炎症對控制感染和增強組織修復具有保護作用，但也會引起組織損傷和疾病。

所謂的免疫炎症是對抗原的適應性免疫反應的結果。在炎症部位浸潤的細胞含有先天的免疫系統的細胞，如中性粒細胞和巨噬細胞，其因T細胞產生的細胞介素作用而募集。

細胞介素是介導多種先天的免疫和適應性免疫反應的蛋白質家族。相同的細胞介素能夠由多種類型的細胞產生，而且相同的細胞介素通常作用於不同類型的細胞。

細胞介素作為對炎症或抗原刺激的反應而合成，而且它們通常以自分泌或旁分泌方式在局部發揮作用，與存在於靶細胞的高親和性受體結合。某些細胞介素能夠足量產生以循環並發揮內分泌作用。細胞介素還作為多種類型細胞的生長因子。

細胞介素通過與屬於少數結構性家族的高親和性受體結合發揮作用。不同的細胞介素使用專門的信號途徑，如JAK/STAT途徑。

介導先天的免疫的細胞介素主要由活化的小噬細胞產生，並包括：TNF和IL-1，作為對微生物的急性炎症反應的介質；趨化介素(chemokines)，作為炎症病灶部位的白血球募集器(recruiters)；IL-12，作為巨噬細胞活化細胞介素(IFN-γ)產生興奮劑2；I型干擾素，作為抗病毒細胞介素和IL-10，作為巨噬細胞抑制劑。

介導和調節適應性免疫的活化和效應階段的細胞介素主要由抗原刺激的T細胞產生，包括：IL-2，作為主要T細胞生長因子；IL-4，作為IgE合成和來自協助的處女型T細胞的Th2細胞發育的刺激劑；IL-5，作為嗜酸性粒細胞活化劑；IFN-γ，作為巨噬細胞活化劑和TGF-β，作為T細胞增殖和白血球活化抑制劑。

協助T細胞的CD4+能夠分化成專門的Th1效應細胞，其分泌IFN-γ，促進吞噬細胞介導的免疫，或分化成Th2細胞，其分泌IL-4和IL-5，促進IgE、嗜酸性粒細胞和肥大細胞介導的免疫。

總之，細胞介素發揮多種關鍵性作用來幫助宿主抵禦病原體，而且它們提供了先天的免疫和適應性免疫之間的連接。細胞介素還調節免疫反應的強度和性質，影響淋巴細胞的生長和分化。最後，細胞介素提供了重要的擴增機制，使少量特異於任意抗原的淋巴細胞能夠活化多種效應機制，清除抗原。細胞介素的過量產生或作用可能導致病理學結果。

目前，使用細胞介素、細胞介素的可溶性受體或抑制劑已經成為修飾與急性和慢性免疫及炎症疾病相關的生物反應和治療多種類型癌症的新型有效方法。通過免疫方案治療癌症患者的可能性給癌症免疫學家和生物學家帶來了曙光。該目的的主要原因基於目前的癌症治療依賴於破壞分裂細胞或阻止細胞分裂的藥物，而這些治療對癌症患者體內正常的增殖細胞具有嚴重影響。因此癌症治療引起顯著的發病率和死亡率。與這些治療不同，免疫調節療法具有成為可以期待的最高特異性和最低毒性治療的潛力。

然而，實際上所有這些新治療工具都具有生物來源，而且高度特異於單一細胞介素。這牽涉到一系列耐受性風險，和產生免疫反應及在複雜的免疫系統中誘導大量反應失調的風險。

本發明中說明的系列化合物除了是小分子而不是生物化合物之外，還具有清楚地作用於一個以上相關細胞介素但不作用於其他細胞介素的特性，其更多地是作為介質而不只是嚴格的抑制劑來發揮作用，並不改變細胞存活力和正常細胞生理機能，但具有促進罹患急性或慢性炎症疾病或甚至特定類型癌症的宿主恢復正常的急性免疫機制的能力。

Eur. J. Med. Chem. 2008，43，2404公開了作為鼠GABA轉運體抑制劑的苄基-(4，4-二苯基-丁-3-烯基)-胺、2-[(4，4-二苯基-丁-3-烯基胺基)-甲基]-苯酚、3-[(4，4-二苯基-丁-3-烯基胺基)-甲基]-苯酚、5-[(4，4-二苯基-丁-3-烯基胺基)-甲基]-2-甲氧基-苯酚和4-[(4，4-二苯基-丁-3-烯基胺基)-甲基]-2，6-二氟-苯酚。Eur. J. Med. Chem. 1993，28，555，727和783公開了苄基-(4，4-二苯基-丁-3-烯基)-胺和作為所述化合物的推定療法應用的血管舒張素。Org. Lett. 1999，1，849公開了苄基-(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-乙基-胺，但未報導任何該化合物的生物活性。US 5，795，756描述了作為腺苷酸環化酶抑制劑的6-氯-9-(4，4-二苯基-丁-3-烯基)-9H-嘌呤和9-(4，4-二苯基-丁-3-烯基)-9H-嘌呤-6-基胺，即

並且還有，Falch，E.等在Drug Dev. Res.，1990，21，169-188中描述了作為GABA攝取抑制劑的5-(4，4-二苯基-丁-3-烯基)-4，5，6，7-四氫-異噁噁唑並[4，5-c]吡啶-3-酚。

發明簡述

本發明的作者已經驚奇地發現式(I)化合物顯示了免疫調節療法的目的活性。

因此，根據第一方面，本發明針對式(I)的化合物或其鹽、前體藥物或溶劑化物：

其中：Ph是苯基；n是2、3或4；R₁選自由氫和C₁-C₆烷基組成的組中；R₂是式-[[CH(R₃)]_m-R₄]的基團，其中m是1；R₃，如果恰當的話，選自由氫、苯基和C₁-C₆烷基組成的組中；R₄選自由未取代的雜芳基、取代的雜芳基和取代的芳基組成的組中，所述取代基選自C₁-C₆烷基、C₇-C₁₁芳烷基、苯基、5或6員雜芳基、F、Cl、Br、I、三氟甲基、氰基、-N(R_a)(R_b)、-OR_c、-SR_d或-C(O)R_e；其中R_a、R_b、R_c、R_d和R_e獨立地選自氫、C₁-C₆烷基、苯基和三氟甲基；或如果R₁和/或R₃與氫不同，那麼R₄還可能是未取代的苯基；或R₁和R₂，與它們連接的氮原子一起形成取代的或未取代的雜芳基，其中所述取代基如上所限定；具有以下附帶條件：2-[(4，4-二苯基-丁-3-烯基胺基)-甲基]-苯酚，3-[(4，4-二苯基-丁-3-烯基胺基)-甲基]-苯酚，5-[(4，4-二苯基-丁-3-烯基胺基)-甲基]-2-甲氧基-苯酚，4-[(4，4-二苯基-丁-3-烯基胺基)-甲基]-2，6-二氟-苯酚，苄基-(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-乙基-胺，6-氯-9-(4，4-二苯基-丁-3-烯基)-9H-嘌呤，9-(4，4-二苯基-丁-3-烯基)-9H-嘌呤-6-基胺和5-(4，4-二苯基-丁-3-烯基)-4，5，6，7-四氫異噁唑並[4，5-c]吡啶-3-酚不包括於式(I)中。

根據另一方面，本發明涉及醫藥組合物，包含如上所限定的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽、前體藥物或溶劑化物，以及至少一種藥學上可接受的載體。

本發明還涉及如上所限定的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽、前體藥物或溶劑化物，以用作藥劑。

本發明還涉及式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽、前體藥物或溶劑化物，

其中：Ph是苯基；n是2、3或4；R₁選自由氫和C₁-C₆烷基組成的組中；R₂是式-[[CH(R₃)]_m-R₄]的基團，其中m是整數，選自由1、0或2組成的組中；每個R₃，如果恰當的話，選自由氫和C₁-C₆烷基組成的組中；R₄選自由未取代的雜芳基、取代的雜芳基、未取代的芳基和取代的芳基組成的組中，所述取代基選自C₁-C₆烷基、C₇-C₁₁芳烷基、苯基、5或6員雜芳基、F、Cl、Br、I、三氟甲基、氰基、-N(R_a)(R_b)、-OR_c、-SR_d或-C(O)R_e；其中R_a、R_b、R_c、R_d和R_e獨立地選自氫、C₁-C₆烷基、苯基和三氟甲基；或R₁和R₂，與它們連接的氮原子一起形成取代的或未取代的雜芳基，其中所述取代基如上所限定，以用作治療炎症疾病的藥劑。

根據另一方面，本發明涉及式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽、前體藥物或溶劑化物在製備治療炎症疾病藥劑中的用途。

另一方面，本發明涉及治療炎症疾病的方法，所述方法包含向需要這種治療的患者施用至少一種治療有效劑量的如上所限定的式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽、前體藥物或溶劑化物。

根據另一方面，本發明涉及式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽、前體藥物或溶劑化物的合成過程。

發明詳述

在本發明的上下文中，下列術語的含義詳述如下：術語“C₁-C₆烷基”是指線性或分支的烴鏈基團，由碳和氫原子組成，不含有不飽和狀態，並具有1至6個，優選地具有1至3個(“C₁-C₃烷基”)碳原子，而且其通過單鍵與分子的其餘部分連接，包括例如，但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、正戊基等。

術語“芳基”是指具有(除非另有說明)6至18個，優選地6至10個，更優選的6或10個碳原子的芳基，包含1、2或3個芳香核，通過碳-碳鍵的方式連接或融合，包括例如，但不限於苯基、萘基、二苯基、茚基、菲基等。優選地“芳基”是指苯基。

“雜芳基”是指穩定的3至10元芳環基，優選地5或6元芳環，其由碳原子和一至五個雜原子組成，該雜原子選自由氮、氧和硫組成的組中。為了達到本發明的目的，雜芳基可以是單環、二環或三環系統，其可以包括稠環系統，每個環是穩定的3至10元芳環基，優選地5或6元芳環，其由碳原子和一至五個雜原子組成，該雜原子選自由氮、氧和硫組成的組中。在雜芳基中氮、氧和硫原子可任選地被氧化；而且氮原子可任選地地被季銨化。這種雜芳基的例子包括但不限於苯並咪唑、苯並噻唑、呋喃、吡咯、噻吩、吡啶、嘧啶、異噻唑、咪唑、吲哚、嘌呤、喹啉、噻二唑。優選地，“雜芳基”是指呋喃、噻吩、吡啶和苯並咪唑。

“芳烷基”是指通過烷基與分子的其餘部分連接的芳香基，如苄基和苯乙基。

術語“鹵素”是指溴、氯、碘或氟。

式(I)的化合物

根據優選的實施方案，“取代的”是指選自由C₁-C₆烷基、C₇-C₁₁芳烷基、苯基、5或6員雜芳基、F、Br、I、三氟甲基、氰基、-N(R_a)(R_b)、-OR_c、-SR_d或-C(O)R_e組成的組中；其中R_a、R_b.R_d、和R_e獨立地選自氫、C₁-C₆烷基、苯基和三氟甲基，R_c選自C₁-C₆烷基、苯基和三氟甲基；且-N(R_a)(R_b)不是-NH₂。取代的基團，例如芳基或雜芳基，可能是在它們自由位置上的任意一個。在本發明的實施方案中，取代的基團是在其1、2、3或4位，優選地在1或2的位置上取代的。

根據本發明的實施方案，取代基選自由甲基、異丙基、苯基甲基、苯基、噻吩、吡啶、F、Br、I、三氟甲基、氰基、胺基、甲氧基、三氟甲氧基和硫甲氧基組成的組中。

本發明的實施方案針對式(IA)的化合物或其鹽、前體藥物或溶劑化物，

其中Ph、n、R₁和R₄如上述限定。

根據本發明的實施方案，R₄選自由噻吩基、呋喃基、吡啶、1H-苯並咪唑、9H-嘌呤、1H-咪唑和1H-吡唑並[3，4-d]嘧啶組成的雜芳基，其中每個基團可如上述限定地取代。

本發明的另一實施方案是式(I)或(IA)的化合物，或其鹽、前體藥物或溶劑化物，其中R₄是式(V)或(VI)的基團。

其中，A和B獨立地選自-CH-和-N-；D獨立地選自由-O-、-S-和-NH-組成的組中；p是整數，選自由0、1、2或3組成的組中；每個R₅選自C₁-C₃烷基、苯基、苯基甲基、5或6員雜芳基、F、Cl、Br、I、三氟甲基、-N(R_a)(R_b)、-SR_d或-C(O)R_e；其中R_a、R_b、R_d、和R_e獨立地選自氫、C₁-C₃烷基、苯基和三氟甲基，惟式(V)的化合物中-N(R_a)(R_b)不是-NH₂；所述式(V)或(VI)基團通過任意一個自由位置與分子的其餘部分連接。

根據本發明的實施方案，每個R₅(如果有的話)獨立地選自甲基、異丙基、苯基甲基、苯基、噻吩、吡啶、F、Cl、Br、I、三氟甲基、氰基、胺基、甲氧基、三氟甲氧基和硫甲氧基組成的組中。根據另一實施方案，p是1或2。

根據本發明的實施方案R₄是式(VII)的基團。

其中R₆選自由-OCF₃、OC₁-C₃烷基、F、Cl、Br、I和-CN組成的組中；而且q是整數，選自由0、1、2或3的組成的組中，而且所述式(VII)的基團通過任意一個自由位置與分子的其餘部分連接。

根據本發明的實施方案，R₁和R₂，與它們連接的氮原子一起形成選自由1H-苯並咪唑、9H-嘌呤、1H-咪唑和1H-吡唑並[3，4-d]嘧啶組成的組的基團。

根據本發明的實施方案R₁是氫或甲基。

在本發明的實施方案中，式(I)的化合物選自以下化合物或其鹽、前體藥物和/或溶劑化物：

式(I)的化合物可能是以鹽，優選藥學上可接受的鹽的形式、溶劑化物的形式或前體藥物的形式存在。術語“其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前體藥物”涉及鹽、溶劑化物或前體藥物，當將其施用于接受者時，能夠提供(直接或間接地)如本文中所描述的化合物。然而，會觀察到的是，藥學上不可接受的鹽也在本發明範圍內，因為它們能夠用於製備藥學上可接受的鹽。能夠通過本領域已知的方法製備鹽、前體藥物和衍生物。“藥學上可接受的”優選地涉及分子實體和組合物，當將其施用於人類或動物時，其是生理上耐受的而且通常不會引發變態反應或相似的不良反應，如胃功能紊亂、眩暈，諸如此類。術語“藥學上可接受”是指由聯邦或州政府管理局批准或包含於美國藥典或另一個用於動物，更特別地用於人類的公認藥典。

根據本發明，術語“溶劑化物”理解為根據本發明的任意形式的活性化合物，其具有通過非共價鍵與其連接的另一個分子(最可能的是極性溶劑)。溶劑化物的例子包括水合物和醇化物，例如甲醇鹽。優選地，溶劑化物是藥學上可接受的溶劑化物。

能夠通過本領域已知的方法製備鹽和溶劑化物。比如，本文提供的化合物的藥學上可接受的鹽通過常規化學方法從母體化合物中合成，其含有一個或多個基本部分。一般地，這種鹽，比如通過將游離鹼形式的這些化合物與適當鹼或酸在水或有機溶劑或兩者的混合物中反應來製備。一般地，非水介質優選如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。酸加成鹽的例子包括無機酸加成鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽和有機酸加成鹽，如乙酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽和對甲苯磺酸鹽。在優選實施方案中，鹽是鹽酸鹽或延胡索酸鹽。

一個優選藥學上可接受的形式是結晶形式，包括醫藥組合物中的這種形式。在鹽和溶劑化物的實施方案中，附加的離子和溶劑基團還必須是無毒的。本發明的化合物可以不同的多晶形式存在，本發明包含所有這種形式。

式(I)化合物前體藥物的任何化合物都在本發明的範圍內。術語“前體藥物”以其最廣義的意義使用，並包含那些在體內轉化成本發明的化合物的衍生物。眾所周知的產生特定作用化合物的前體藥物的方法的例子是本領域專業人士已知的，而且能夠在例如Krogsgaard-Larsen等，Textbook of Drug design and Discovery，Taylor & Francis(April 2002)中發現。本領域專業人士會輕易地想到這種衍生物，其包括(取決於分子中存在的官能團)但不限於本發明的化合物的下列衍生物：酯、胺基酸酯、磷酸酯、金屬鹽磺酸酯、胺基甲酸酯和醯胺。

本發明的化合物還旨在包括僅在一個或多個同位素富集原子的存在方面有所不同的化合物。例如，除了氫被氘或氚取代，或碳被¹³C或¹⁴C富集的碳取代，或氮被¹⁵N富集的氮取代之外，具有本文結構的化合物均在本發明的範圍內。

由上述式(I)表示的本發明的化合物可能包括取決於手性中心存在的對映體或取決於多鍵存在的異構體(例如Z，E)。單個異構體、對映體或非對映異構體及其混合物落入本發明的範圍內。

式(I)的化合物的用途

根據優選實施方案，炎症疾病選自炎症性腸病(IBD)、類風濕性關節炎(RA)、良性前列腺增生、巴雷特病症、哮喘、骨骼肌和腱修復、潰瘍性結腸炎、利什曼病和自體免疫性疾病，優選克羅恩氏病。根據另一實施方案，疾病是癌症，例如選自轉移瘤、乳癌、食道癌、結腸癌、結腸癌、胃癌、白血病、黑色素瘤、子宮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巢癌、卵巢惡性腫瘤、前列腺癌、腎癌、肝癌、胰臟癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、骨癌、皮膚癌、肉瘤、卡波西肉瘤、腦瘤、肌肉瘤、神經母細胞瘤、淋巴瘤和多發性骨髓瘤。

在本說明書的上下文中，術語“治療(treatment)”或“治療(to treat)”或“治療(treating)”指施用根據本發明化合物或製劑以預防、改善或消除疾病或一個或多個所述疾病相關的症狀。“治療(treatment)”還包含預防、改善或消除疾病的生理後遺症。

在本發明的上下文中，術語“改善”理解為對治療的患者狀況主觀上(患者或患者身體上的感覺)或客觀上(測定參數)的任一改進。

醫藥組合物

根據另一方面，本發明針對醫藥組合物，包含如上所限定的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽、前體藥物或溶劑化物，以及至少一種藥學上可接受載體。

術語“載體”是指稀釋劑、佐劑、賦形劑或載劑，活性成分與它們一併施用。這種藥用載體可以是無菌液體，如水和油，包括那些石油、動物、蔬菜或合成源的，如花生油、豆油、礦物油、芝麻油諸如此類。水或水溶液鹽溶液和葡萄糖和甘油水溶液優選用作載體，尤其用於可注射的溶液。合適的藥用載體如E.W. Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”，21^st Edition，2005；或Rowe C. R.的“Handbook of Pharmaceutical Excipients”；Paul J. S.；Marian E. Q.，第六版中描述。優選本發明的載體由聯邦或州政府管理局批准或在美國藥典或其他用於動物，更尤其地用於人類的公認藥典中列明。

在製造本發明醫藥組合物理想的施用的藥物劑型所必需的載體和輔助物質將取決於(在其他因素中)選擇的施用的藥物劑型。所述醫藥組合物施用的藥物劑型將根據本領域技術人員已知的常規方法來生產。對不同的活性成分施用方法、使用的賦形劑及產生它們的過程的綜述能夠在E.W. Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”，21^st Edition，2005；或Rowe C. R.的“Handbook of Pharmaceutical Excipients”；Paul J. S.；Marian E. Q.，第六版中找到。

醫藥組合物的例子包括任意固體(片劑、小丸、膠囊、顆粒等)或液體(溶液、懸浮液或乳液)組合物以用於口服、局部或胃腸外給藥。

在優選的實施方案中，醫藥組合物是口服形式的。適合口服施用的劑型可以是片劑和膠囊，可能含有本領域已知的常規賦形劑，如粘合劑，例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃蓍膠或聚乙烯吡咯烷酮；填充物，例如乳糖、糖、玉米澱粉、磷酸鈣，山梨醇或甘胺酸；壓片潤滑劑，例如硬脂酸鎂；崩解劑，例如澱粉、聚乙烯吡咯烷酮、澱粉羥基乙酸鈉或微晶纖維素；或藥學上可接受的潤濕劑，如硫酸月桂酯鈉。

固體口服組合物可以通過混合、填充或壓片的常規方法來製備。可以使用重複的混合操作來分散採用大量填充物的組合物中的活性成分。這種操作是本領域常規的方法。例如片劑可能通過濕或乾的顆粒製備，並根據通常藥學實踐中眾所周知的方法，尤其地使用腸溶衣任選地包被。

醫藥組合物還可能調整用於胃腸外給藥，如無菌溶液、懸浮液或適當單位劑型的凍乾產物。可以使用適當的賦形劑，如填充劑、緩衝劑或表面活性劑。

將使用標準方法，如在西班牙和美國藥典和相似文獻中描述或提到的那些方法製備所述製劑。

一般地，本發明化合物的有效施用量將取決於所選化合物的相對療效、所治療的疾病的嚴重程度和患者的體重。然而，典型地，活性化合物一天施用一次或多次，例如每天施用1、2、3或4次，通常的日劑量為0.01至1000 mg/kg/每天。

本發明的這些醫藥組合物能夠與其他活性成分，如用於炎症疾病治療的另外的化合物合併使用。所述組合物根據每個組分的製備(根據式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽、前體藥物或溶劑化物以及另外的活性成分)用於同時、獨立或連續的施用。

式(I)的化合物的合成

本發明的化合物能夠通過可利用的合成過程按照多步驟順序合成。例如，它們能夠通過以下示出的基本方案1中總結的過程製備：

在特殊實施方案中，式(I)的化合物能夠通過存在鹼和有機溶劑下，用攜帶R₁和R₂基的胺與衍生物(II)的取代反應來製備。根據優選實施方案，將二異丙基乙胺或碳酸鉀用作鹼。根據另一優選的實施方案，有機溶劑是乙腈或乙醇。存在於化合物(II)中的離去基團(LG)優選選自鹵素和磺酸鹽。更優選其是溴化物。

另外，當胺是伯胺(R₁=H)時，得到的化合物(I)能夠在鹼存在下，通過使用烷基鹵化物(R₁-X；其中R₁是C₁-C₆烷基或C₇-C₁₅芳烷基)處理進一步烷基化。

在特殊的實施方案中，式(II)的化合物能夠通過將苯基-鹵化鋰加入到式(IV)的酯中進行隨後的脫水反應來製備。根據優選的實施方案，有機鋰化合物通過將正丁基鋰加入到苯基鹵化物中製備。根據另一優選的實施方案，在酸存在下施行脫水步驟。在優選的實施方案中，酸是H₂SO₄。優選地，在類醚溶劑存在下施行化合物(II)的製備。更優選地，類醚溶劑選自二乙醚和四氫呋喃。

在特殊的實施方案中，式(VI)的化合物，即式(I)化合物中R₁是氫，R₂是-[[CH(R₃)]_m-R₄]-，m是0而且R₄是如本文限定取代的或未取代的雜芳基，該化合物能夠通過式(VIII)的胺與對應取代的或未取代的鹵化雜芳基衍生物(Het-X；X是F、Br、Cl或I)在鹼和有機溶液存在下反應來製備。根據優選的實施方案，二異丙基乙胺或碳酸鉀用作鹼。根據另一優選的實施方案，有機溶劑是乙醇。本領域技術人員已知胺烷基化的進一步條件。

在特殊的實施方案中，式(VIII)的化合物能夠通過化合物(III)與疊氯化鈉在DMF中反應，並且此疊氮與三苯膦在THF中的隨後還原來製備。

本發明還另外通過如下實施例進行說明。這種說明必須在任意情況下都不能理解為如其在申請專利範圍第所限定的本發明的範圍的限制。

實施例

根據本發明式(I)的化合物按照以下詳述的一般製備方案進行製備。一些化合物的詳細製備方案如下所述。使用的所有反應物都可商購。

實施例1：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(4-氟-苄基)-胺鹽酸鹽的合成(化合物3) 步驟1.5-溴-1，1-二苯基戊烯的合成

在氬氣氛下向無水Et₂O(100 mL)中的2.5M正丁基鋰混合物(100 mL，0.250 mol)中加入無水Et₂O(60 mL)中的溴苯溶液(20.86 mL，0.225 mol)，並使溫度保持在5至10℃。混合物冷卻至-70℃前在10℃下再繼續攪拌15分鐘。加入無水Et₂O(60 mL)的中5-溴戊酸乙酯溶液(14.54 mL，0.090 mol)並使溫度保持在-65℃以下。加完後，在-70℃下攪拌混合物2.5小時。依序加入冷水(75 mL)和冷1 N HCl水溶液(35 mL)並保持溫度在0℃以下。攪拌反應混合物15分鐘使溫度上升到0℃以上，並分離相。使用Et₂O(75 mL)提取水相，並用水(60 mL)和鹽水(60 mL)洗滌合併的有機相。溶液通過無水硫酸鈉乾燥，溶劑在真空下蒸發，得到46.5 g固體，將其溶解於2-丙醇(225 mL)。加入20% H₂SO₄水溶液(25 mL)並在回流下攪拌混合物1小時。將溶劑在真空下蒸發得到殘餘物，該殘餘物在CH₂Cl₂₍400 mL)和飽和的NaHCO₃溶液(75 mL)之間分佈。分離不同相，並用CH₂Cl₂₍75 mL)進一步提取水相。用水(75 mL)、鹽水(75 mL)洗滌合併的有機相並通過無水硫酸鈉乾燥。將溶劑在真空下蒸發得到黃色油狀物5-溴-1,1-二苯基戊烯(20.0 g，73.7%)。¹H NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.2-7.4(m，10 H)；6.2(t，1H)；3.3(t，2H)；2.3(q，2H)；1.9(q，2H)。

進一步的化合物：步驟2(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(4-氟-苄基)-胺的合成

將4-氟-苄基胺(0.62 g，5 mmol)和K₂CO₃(0.7 g，5 mmol)加入到溶解於25 mL乙腈的5-溴-1-1-二苯基戊烯(0.75 g，2.5 mmol)溶液中。攪拌16小時將反應加熱至回流。在減壓下除去溶劑，加入水並用CH₂Cl₂(3 x 50 mL)提取混合物。將有機層通過無水硫酸鈉乾燥，並將溶劑在真空下蒸發得到油狀物，將其通過急驟層析(AcOEt/庚烷/TEA 45：55：1)純化得到0.58 g(產率67.1%)黃色油狀物(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(4-氟-苄基)-胺。¹H NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.2_-7.5(m，12H)；7.0-7.1(m，2H)；6.2(t，1H)；3.8(s，2H)；2.7(t，2H)；2.3(c，2H)；1.7(q，2H)。¹³C NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：163.2；143.4；141.9；139.5；132.5；132.3；129.6；128.3；128.1；127.1；126.6；125.7；116.3；115.9；49.6；45.3；26.7；25.8。

步驟3(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(4-氟-苄基)-胺鹽酸鹽的合成(化合物3)

在10分鐘內向100 mL無水Et₂O中的(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(4-氟-苄基)-胺(1 g，3 mmol)溶液中加入無水Et₂O(3 mL，3 mmol)的1M HCl溶液。攪拌反應30分鐘。過濾固體、將其移至結晶皿中並在50℃下在真空烘箱中乾燥(0.9 g，產率84.7%)。MP=128.0-130.1℃。¹H NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：9.9(bs，2H)；7.6-7.5(m，2H)；7.3-7.0(m，12H)；5.9(t，1H)；4.0(bs，2H)；2.7(t，2H)；2.2-1.9(m，4H). ¹³C NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：163.2；143.4；141.9；139.5；132.5；132.3；129.6；128.3；128.1；127.1；126.6；125.7；116.3；115.9；49.6；45.3；26.7；25.8。

按照上述式(I)化合物的一般合成過程獲得下列化合物，具體來說，通過5-溴-1-1-二苯基戊烯與對應的芳基苄基胺反應獲得：

實施例2：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(4-三氟甲氧基苄基)胺鹽酸鹽(化合物2)¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.2(m，14H)；6.1(t，1H)；3.8(s，2H)；2.7(t，2H)；2.2(q，2H)；1.7(m，2H)。

實施例3：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(4-三氟甲基苄基)胺鹽酸鹽(化合物1).m.p.：121.4-122.7℃。

¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：10.1(s，2H，)；7.7-7.6(m，4H)；7.0-6.8(m，10H)；5.9(t，2H)；4.0(s，2H)；2.6(bs 2H)；2.1-1.9(m，4H)。

實施例4：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(4-甲氧基苄基)胺鹽酸鹽(化合物4) m.p.：69.2-73.8℃。

¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：9.7(bs，2H)；7.4(d，2H)；7.3-7.0(m，10H)；6.8(d，2H)；5.9(t，1H)；3.9(bs 2H)；3.7(s，3H)；2.6(bs，2H，)；2.1-1.9(m，4H)。

實施例5：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-噻吩-3-基甲基胺鹽酸鹽(化合物5)。m.p.：108.0-109.7℃.¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：9.8(bs，2H)；7.5-7.4(m，1H)；7.3-7.0(m，12H)；5.9(t，1H)；4.0(bs，2H)；2.7(bs，2H)；2.1-1.9(m，4H)。

實施例6：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-噻吩-2-基甲基-胺鹽酸鹽(化合物6)。m.p.：161.0-161.6℃。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.4-7.1(m，11H)；6.9(m，2H)；6.1(t，1H)；4.0(s，2H)；2.7(t，2H)；2.2(q，2H)；1.6(m，2H)。

實施例7：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)吡啶-2-基甲基胺鹽酸鹽(化合物7)。m.p.：125.0-126.9℃。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：8.5(m，1H)；7.8(m，2H)；7.4-7.0(m，11H)；5.9(t，1H)；4.4(s，2H)；2.9(t，2H)；2.2-2.0(m，4H)。

實施例8：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)呋喃-2-基甲基胺鹽酸鹽(化合物8)。m.p.：139.0-141.3℃。¹H-NMR(DMSO-d₆)，δ(ppm)：9.5(bs，2H)；7.7(m，1H)；7.5-7.0(m，10H)；6.6(m，1H)；6.5(m，1H)；6.0(t，1H)；4.1(bs，2H)；2.8(bs，2H)；2.1-2.0(m，2H)；1.8-1.7(m，2H)。

實施例9：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(3-三氟甲氧基-苄基)胺鹽酸鹽(化合物9)。m.p.：102.4-104.0℃。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：10.0(bs 2H)；7.6-7.0(m，14H)；5.9(t，1H)；4.0(s，2H)；2.7(bs，2H)；2.1-1.9(m，4H)。

實施例10：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(2-三氟甲氧基苄基)胺鹽酸鹽(化合物10)。m.p.：109.0-110.7℃。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：10.0(bs，2H)，8.0(m，1H)；7.4-7.0(m，13H)；5.9(t，1H)；4.2(s，2H)；2.7(bs，2H)；2.1-2.0(m，4H)。

實施例11：(1H-苯並咪唑-2-基甲基)-(5，5-二苯基-戊-4-烯基)胺鹽酸鹽(化合物11)。m.p.：251.0-253.8℃。¹H-NMR(DMSO-d₆)，δ(ppm)：10.1(bs，2H)；7.8-7.1(m，14H)；6.2(bs 2H，)；6.1(t，1H)；4.6(s，2H)；3.0(bs，2H)；2.1-2.0(m，2H)；1.8-1.0(m，2H)。

實施例12：(4，4-二苯基-丁-3-烯基)-(4-三氟甲氧基苄基)胺鹽酸鹽(化合物12)。m.p.：126-128.℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：10.1(s，1H)；6.1(t，1H)；7.5(d，2H)；7.3-7.0(m，12H)；3.9(s，2H)；2.8(m，2H)；2.6(m，2H)。

實施例13：(4.4-二苯基-丁-3-烯基)-噻吩-2-基甲基-胺鹽酸鹽(化合物13)。m.p.：163-165.5℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：2.3(q，2H)；2.8(t，2H)；4.0(s，2H)；6.1(t，1H)；6.9(m，2H)；7.0(m，8H)；7.4(m，3H)。

實施例14：(6，6-二苯基-己-5-烯基)-(4-三氟甲氧基苄基)胺鹽酸鹽(化合物14)。m.p.：109-110.5℃.¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：10.0(m，2H)；7.6(d，2H)；7.4-7.0(m，14H)；6.0(t，1H)；3.9(s，2H)；2.7(s，2H)；2.1(q，2H)；1.8(m，2H)；1.5(m，2H)。

實施例15：(6，6-二苯基-己-5-烯基)-(3-三氟甲氧基苄基)胺鹽酸鹽(化合物15)。m.p.：96.6-98.5℃.¹H-NMR(CDCl₃)，5(ppm)：7.4-7.0(m，13H)；6.1(t，1H)；3.8(s，2H)；2.6(t，2H)，2.2(q，2H)；1.6(m，4H)。

實施例16：苄基-(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-甲基-胺鹽酸鹽(化合物16)。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：12.5(s，1H)；7.0-7.6(m，15H)；5.9(t，1H)；4.1(s，2H)；2.9-2.6(m，2H)；2.6(s，3H)；2.2-1.8(m，4H).

實施例17：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(1-苯基-乙基)-胺鹽酸鹽(化合物17)。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：10.1(bs 1H)；9.8(bs，1H)；7.6-7.0(m，15H)；5.9(t，1H)；4.16(t，1H)；2.6(bs，2H)；2.0(m，4H)；1.9(d，3H)。

實施例18：二苯甲基-(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-胺鹽酸鹽(化合物18)。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：10.3(bs，2H)；7.6-7.0(m，20H)；5.8(t，1H)；5.1(bs，1H)；2.5(bs 2H)；1.9-1.7(m，4H)。

實施例19：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(2-氟苄基)胺鹽酸鹽(化合物19)。¹H-NMR(CDCl₃) δ(ppm)：10.0(s，2H)；7.4-6.9(m，15H)；6.0(t，1H)；4.0(s，2H)；2.7(m，2H)；2.2-2.0(m，4H)。

實施例20：(4-氯苄基)-(5，5-二苯基-戊-4-烯基)胺鹽酸鹽(化合物20)。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：1.7(m，2H)；2.2(m，2H)；2.7(m，2H)；4.0(s，2H)；6.1(t，1H)；7.5-7.0(m，14H)；10.0(bs，2H)。

實施例21：4-[(5，5-二苯基-戊-4-烯基胺基)-甲基]苯基腈鹽酸鹽¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：10.2(s，2H)；7.8-7.6(m，4H)；7.4-7.0(m，10H)；5.9(t，1H)；4.1(s，2H)；2.7(m，2H)；2.2(m，2H)；2.0(m，2H)。

實施例22：(4，4-二苯基-丁-3-烯基)-(4-三氟甲基苄基)胺鹽酸鹽。¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：11.0(bs，2H)；7.6(m，4H)；7.4-7.2(m，8H)；7.1(m，2H)；6.1(t，1H)；4.0(s，2H)；2.9(t，2H)；2.6(m，2H)。

實施例23：(4，4-二苯基-丁-3-烯基)-(4-氟-苄基-胺鹽酸鹽。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：10.0(s，2H)；7.6-7.4(m，10H)；7.0-6.8(m，4H)；6.1(t，1H)；3.9(m，2H)；2.8(m，2H)；2.5(m，2H)。

實施例24：苄基-(4，4-二苯基-丁-3-烯基)胺鹽酸鹽。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：10.0(bs，2H)；7.5-7.2(m，13H)；7.0(m，2H)；6.1(t，1H)；3.9(s2H)；2.9(m，2H)；2.6(m，2H)。

實施例25：(4，4-二苯基-丁-3-烯基)-(3-三氟甲氧基苄基)胺鹽酸鹽。¹H-NMR(CDCl₃，δ(ppm)：10.2(bs，2H)；7.8(d，1H)；7.6(m，2H)；7.5(m，1H)；7.7-7.4(m，10H)；6.1(t，1H)；4.0(s，2H)；2.9(m，2H)；2.6(m，2H)。

實施例26：(4，4-二苯基-丁-3-烯基)-(3-氟苄基)胺鹽酸鹽。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：10.0(bs，2H)；7.4-7.7(m，14H)；6，1(t，1H)；4.0(s，2H)；2.9(m，2H)；2.6(m，2H)。

實施例27：(1-(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-2-甲基-1H-苯並咪唑的合成(化合物27)

將氫化鈉(0.24 g，60%油分散液，6.0 mmol)緩慢地分批加入20 mL無水DMF中的2-甲基-苯並咪唑的預冷溶液(冰/水冷卻浴)(0.66 g，5.0 mmol)中。2小時後，分批加入5-溴-1，1-二苯基戊烯(1.5 g，5.0 mmol)，並攪拌得到的混合物20小時。通過加入甲醇(3 mL)中斷反應直到氣體逸出终止。將其用水(120 mL)稀釋並用乙酸乙酯(3 x 25 mL)提取。在低壓下用鹽水(1 x 20 mL)洗滌有機提取物，通過無水硫酸鈉乾燥並除去溶劑以得到殘餘物(1.9 g)，通過急驟層析(DCM/MeOH 98：2)純化以得到1.5 g(4.2 mmol，產率60%)的黃色固體。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.7(m，1H)；7.4-7.0(m，13H)；6.0(t，1H)；4.0(t，2H)；2.5(s，3H)；2.3(q，2H)；1.9(m，2H)。

下列化合物以類似的方式製備：

實施例28：1-(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-1H-咪唑(化合物28)。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.5-7.2(m，11H)；7.0(s，1H)；6.8(s，1H)；6.1(t，1H)；3.9(t，2H)；2.2(q，2H)；1.9(m，2H)。

實施例29：(2-氯-9H-嘌呤-6-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)-胺(化合物29)的合成

步驟1.6-疊氮-1，1-二苯基-1-己烯的合成。中間體[D]

將6-溴-1，1-二苯基-1-己烯(50.0 g，158 mmol)和疊氮化鈉(31.0 g，476 mmol)DMF(250 mL)的混合物在室溫下攪拌16小時。用乙酸乙酯(400 mL)稀釋反應混合物，並用NH₄Cl的飽和水溶液(3 x 100 mL)洗滌。在低壓下用鹽水(1 x 60 mL)洗滌有機提取物，通過無水硫酸鈉乾燥並除去溶劑以得到41g(148 mmol，96.68%)無色油狀物，鑒定為6-疊氮-1，1-二苯基-1-己烯。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.4-7.1(m，10H)；6.1(t，1H)；3.2(t，2H)；2.1(m，2H)；1.5(m，4H)。

下列中間體化合物以類似的方式通過中間體[A](參見實施例27)與疊氮化鈉反應製備：

中間體[E]5-疊氮-1，1-二苯基-1-戊烯 ¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.4-7.0(m，10H)；6.1(t，1H)；3.3(t，2H)；2.1(m，2H)；1.6(m，2H)。

步驟2.　6，6-二苯基-己-5-烯基胺的合成。中間體[F]

將在THF(50 mL)和水(2.5 mL)中的6-疊氮-1，1-二苯基-1-己烯(2.7 g，9.7 mmol)和三苯基膦(3.1 g，12 mmol)的混合物在室溫下攪拌20小時。在減壓下除去溶劑以得到油狀物，將其通過急驟層析(DCM/MeOH/Et₃N 95：5：5)純化以產生黃色油狀物6，6-二苯基-己-5-烯基胺(2.4 g，產率98%)¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：1.4(m，4H)；7.3(m，10H)；6.1(t，1H)；2.6(m，2H)；2.2(q，2H)；1.6(s，2H)。

下列中間體化合物以類似的方式製備：

中間體[G] 5，5-二苯基-戊-4-烯基胺¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.4-7.2(m，10H)；6.1(t，1H)；2.7(t，2H)；2.2(q，2H)；1.9(s，2H)；1.6(m，2H)。

步驟3.　(2-氯-9H-嘌呤-6-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)-胺

向乙醇(500 mL)的6，6-二苯基-己-5-烯基胺(25.6 g，103 mmol)溶液加入嘌呤(17.0 g，90 mmol)和DIPEA(15.7 mL，90 mmol)。將得到的混合物加熱，回流3小時。反應完全後，在低壓下除去溶劑，加入水(150 mL)，過濾沉澱物並用甲醇洗滌以得到白色固體(2-氯-9H-嘌呤-6-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)-胺(31.76g，78.6 mmol，產率87.3%) (m.p.：205.7°-207.0℃ ¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：8.1(s，2H)；7.5-7.0(m，10H)；6.1(t，1H)；2.5(m，2H)；2.1(m，2H)；1.7-1.4(m，4H)。

下列化合物以類似的方式通過6，6-二苯基-己-5-烯基胺與對應商用6-氯嘌呤衍生物或4-氯-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶衍生物反應來製備。通過如在US6936713；Eur. J. Med. Chem，2003，38，199-214；WO2005/009348；Synthesis，1994，1401；J. Am. Chem. Soc. 1956，78，784-790；J. Med. Chem. 2005，6887；J. Med. Chem. 2006，1549；和/或Eur. J. Med. Chem，2004，939中所描述的已知文獻方法製備非商用化合物。

實施例30：(9-苄基-2-碘-9H-嘌呤-6-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)胺鹽酸鹽(化合物30)。與6-氯-2-碘-9H-嘌呤的反應得到標題化合物。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.5(s，1H)；7.4-7.0(m，15H)；6.1(t，1H)；5.7(s，1H)；5.3(s，2H)；3.6(s，2H)；2.1(q，2H)；1.6(m，5H)。

實施例31：9-苄基-N-(6，6-二苯基-己-5-烯基)-9H-嘌呤-2，6-二胺(化合物31)與9-苄基-6-氯-9H-嘌呤-2-基胺的反應得到標題化合物。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.4-7.1(m，15H)，6.1(t，1H)，5.5(m，1H，NH)；5.2(s，2H)；4.7(s，2H，NH₂)；3.5(m，2H)；2.2(m，2H)；1.6(m，4H)。

實施例32：(6，6-二苯基-己-5-烯基)-(2-苯基-9H-嘌呤-6-基)胺(化合物32)與6-氯-2-苯基-9H-嘌呤的反應得到標題化合物。¹H-NMR(CDCl₃+DMSO-d ₆)，δ(ppm)：8.2(m，2H)；7.7(s，1H)；7.4-7.0(m，14H)；6.9(bs，1H)；6.0(t，1H)；3.6(m，2H)；2.1(q，2H)；1.8-1.4(m，4H)。

實施例33：(6，6-二苯基-己-5-烯基)-(9-甲基-2-三氟甲基-9H-嘌呤-6-基)胺(化合物33)與6-氯-9-甲基-2-三氟甲基-9H-嘌呤的反應得到標題化合物。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.8(s，1H)；7.4-7.0(m，10H)；6.1(t，1H)；5.8(bs，1H)；3.9(s，3H)；3.6(bs，2H)；2.2(q，2H)；1.8-1.5(m，4H)。

實施例34：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(9-甲基-9H-嘌呤-6-基)胺(化合物34)與6-氯-9-甲基-9H-嘌呤的反應得到標題化合物。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：8.4(s，1H)；7.7(s，1H)；7.4-7.0(m，10H)；6.1(t，1H)；5.7(s，1H，NH)；3.9(s，3H)；3.6(m，2H)；2.3(q，2H)；1.9(m，2H)。

實施例35：(2-氯-9-甲基-9H-嘌呤-6-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)胺的製備(化合物35)

向DMF(50 mL)的(2-氯-9H-嘌呤-6-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)-胺溶液(2.0 g，5.0 mmol)加入碳酸鉀(1.4 g，10 mmol)，並用甲基碘(0.5 mL，7.92 mmol)處理得到的懸浮液。在室溫下攪拌反應混合物72小時。加入水(250 mL)並用乙酸乙酯(3 x 50 mL)提取得到的化合物。在低壓下用鹽水(1 x 25 mL)洗滌有機提取物，通過無水磷酸鈉乾燥並除去溶劑以獲得固體殘餘物(2.30 g)，將其通過急驟層析(EtOAc/庚烷60：30)提純以得到白色固體2-氯-9-甲基-9H-嘌呤-6-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)胺(1.45 g，產率70%)¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.7(s，1H)；7.4-7.0(m，10H)；6.1(t，1H)；5.9(bs，1H)；3.8(s，3H)；3.6(bs，2H)；2.2(q，2H)；1.7-1.5(2q，4H)。

實施例36：(9-苄基-2-甲硫基-9H-嘌呤-6-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)胺的合成(化合物36)

在250 mL高壓反應器中，用甲硫醇鈉(1.4 g，20.5 mmol)處理乙醇(30 mL)和水(30 mL)的混合物的(9-苄基-2-碘-9H-嘌呤-6-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)-胺(化合物30)溶液(2.4 g，4.1 mmol)。關閉反應容器並在130℃下加熱混合物6小時(最大內壓：2巴)。反應完全後，在低壓下除去溶劑，加入水(120 mL)並用乙酸乙酯(3 x 50 mL)提取得到的混合物。通過無水硫酸鈉乾燥有機層並將溶劑在真空下蒸發以得到殘餘物，將其通過急驟層析(EtOAc/庚烷1：1)提純以得到黃色固體(9-苄基-2-甲硫基-9H-嘌呤-6-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)胺(1.68 g，3.3 mmol，81%)。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.55(s，1H)；7.45-7.12(m，15H)；6.07(1H，t)；5.65(bs，1H)；5.29(s，2H)；3.58(bs，2H)；2.55(s，3H)；2.16(q，2H)；1.79-1.51(m，4H)。

實施例37：(6，6-二苯基-己-5-烯基)-(9-甲基-2-苯基-9H-嘌呤-6-基)胺(化合物37)

在氬氣氛下在100℃下攪拌DME(50 mL)的(2-氯-9-甲基-9H-嘌呤-6-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)胺(3.0 g，7.0 mmol)、碳酸鈉(1.3 g，12.28 mmol)、苯硼酸(1.05 g，8.6 mmol)和四(三苯基膦)鈀(0)(1.21 g，1.05 mmol，15 mol%)的懸浮液40小時。

反應完全後，在低壓下除去溶劑並加入水(34 mL)。攪拌得到的混合物10分鐘，過濾沉澱物並用水(2 x 20 mL)和乙醚(2 x 20 mL)洗滌。在真空下乾燥該沉澱得到黃色固體2-氯-9-甲基-9H-嘌呤-6-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)胺(2.6 g，5.7 mmol，產率81%)。¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：8.5(d，2H)；7.7(s，1H)；7.5-7.1(m，13H)；6.1(t，1H)；5.7(m，1H，NH)；3.9(s，3H)；3.7(m，2H)；2.3(q，2H)；1.8(m，2H)；1，6(q，2H)。

下列化合物以類似的方式通過(2-氯-9-甲基-9H-嘌呤-6-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)胺與對應的雜芳基硼酸衍生物反應來製備：

實施例38：(6，6-二苯基-己-5-烯基)-(9-甲基-2-噻吩-2-基-9H-嘌呤-6-基)胺(化合物38)¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：7.7-7.5(m，2H)；7.5-7.0(m，11H)；6.1(t，1H)；5.4(bs，1H)；3.7(s，3H)；3.6(bs，2H)；2.1(q，2H)；1.8-1.5(2q，4H)。

實施例39：(6，6-二苯基-己-5-烯基)-(9-甲基-2-吡啶-4-基-9H-嘌呤-6-基)胺(化合物39)¹H-NMR(CDCl₃，δ(ppm)：8.7(d，2H)；8.3(d，2H)；7.7(s，1H)；7.3-7.0(m，10H)；6.1(t，1H)；5，5(bs，1H)；3.9(s，3H)；3.7(bs，2H)；2.2(q，2H)；1.8-1.5(2q，4H)。

實施例40：(6，6-二苯基-己-5-烯基)-(1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-基)胺。(化合物40)¹H-NMR(CDCl₃，DMSO-d ₆)，δ(ppm)：12.81(bs，1H)；8.22(s，1H)；7.92(s，1H)；7.02-7.26(m，10H)；6.80(bs，1H)；5.95(t，1H)；3.41-3.45(m，2H)；2.45-2.58(m，2H)；2.03-2.10(m，2H)；1.42-1.62(m，4H)。

實施例41：(5，5-二苯基-戊-4-烯基)-(1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-基)胺(化合物41)¹H-NMR(DMSO-d ₆)，δ(ppm)：13.35(bs，1H)；8.11(bs，1H)；8.04(s，1H)；7.05-7.33(m，10H)；6.16(t，1H)；3.42-3.49(m，2H)；2.08-2.15(m，2H)；1.72-1.77(m，2H)；下列化合物以與化合物35類似的方式通過化合物41與對應的烷基苄基鹵化物衍生物反應來製備。

實施例42：(6，6-二苯基-己-5-烯基)-(1-甲基-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-基)胺鹽酸鹽。(化合物42)¹H-NMR(CDCl₃)，(ppm)：8.35(bs，1H)；7.83(s，1H)；7.14-7.39(m，10H)；6.07(t，1H)；4.04(s，3H)；3.5.3.6(m，2H)；2.19(q，2H)；1.67-1.75(m，2H)；1.56-1.63(m，2H)。

實施例43：(1-苄基-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-基)-(6，6-二苯基-己-5-烯基)胺鹽酸鹽(化合物43)¹H-NMR(CDCl₃)，δ(ppm)：8.4(bs，1H)；7.9(s，1H)；7.4-7.2(m，16H)；6.1(t，1H)；5.6(s，2H)；3.6-3.5(m，2H)；2.2(q，2H)；1.9-1.8(m，2H)；1.6-1.5(m，2H)。

實施例44：(6，6-二苯基-己-5-烯基)-(1-異丙基-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-基)胺鹽酸鹽(化合物44)¹H-NMR(DMSO-d ₆)，δ(ppm)：11.0(bs，1H)；8.8(s，1H)；8.4(s，1H)；7.3-7.1(m，10H)；6.1(t，1H)；5.0(hept，1H)；3.7-3.4(m，2H)；2.1-1.9(m，2H)；1.7-1.6(m，2H)；1.6-1.40(m，2H)；1.39(d，6H)。

生物分析

轉染子的產生。

所有轉染子具有共同的細胞鹼基，缺乏那些研究中的關鍵受體路徑。由於分泌的磷酸酶sPase能夠處理來自基於化學上類似硝基酚磷酸鹽基質的水解培養物的發光或比色基質，將其用作報告基因。建立了5代轉染子系，描述如下：

1.　IL-4R。轉染在非造血細胞中常見的II型IL-4r鏈，並引入通過IL-4r的細胞核信號路徑中的關鍵分子STAT6，和最後用於測定對STAT6反應的報告基因。細胞內源具有Janus相關激酶1(JAK1)，其之前已知通過p62/aPKC與STAT6相關。

2.　IL-6R。轉染IL-6R鏈並引入能夠測定對STAT3反應的報告基因。眾所周知，STAT3是在標準反應IL-6/IL-6R中生理上產生的轉導分子和核因子。

3.　TNF-R。在該實施方案中，引入能夠測定對NF-kB反應的報告基因，因為這是在對TNF-α反應中生理上產生的轉導分子和核因子。TNF-α轉染子不對NFkB的有效的啟動劑如LPS反應。

4.　通過TLR4/MD2/CD14表示的LPS-受體複合物。如在之前的實施方案中使用具有對NFkB反應的元素(element)的報告基因，但是通過協同轉染LPS-R複合物組分獲得選擇性。通過與已知為LBP的一個血漿蛋白連接從血清中捕捉到LPS，該LBP將LPS轉運到膜蛋白CD14。與不含LBP的介質或培養基相比，含有LBP靈敏性增加了1000倍。分子CD14不是LPS-受體，而是捕捉LBP的受體複合物的模組(module)，使LPS在細胞表面向MD2轉移。CD14不具有胞質尾區，而且其不能作為信號感測器，但其實質地增加了體系的敏感度。同理，MD2不是信號感測器，但CD14和MD2的組合使敏感度增加了1000倍。

5.　IL-1R。如在之前實施方案中使用具有對NFkB反應的元素(element)的報告基因，但是通過屬於受體複合物IL-1R的組分的表達來獲得選擇性。IL-1R屬於使用TIR轉導域(Toll樣IL-1R)的受體超家族。已知IL-1R通路啟動了JNK型有絲分裂原啟動蛋白激酶(MAPK)，其反過來生成如AP-1的具有轉錄活性的核因子。報告基因包括NFkB和AP-1位置鏈，以模擬生理環境。

小鼠內毒素血症：化合物11和化合物8在TNF-α血清水平上的活性。

材料和方法：使用體重30-35 g，在控制的標準條件下飼養的雄性CD1小鼠。這些動物禁食(14-16小時；每組12只；每籠6只500 cm²)，隨意地用蔗糖(8%)和NaCl(0.2%)製成的營養液維持。懸浮液(載劑；吐溫(Tween)80 0.1%-NaCl 0.9%)以10 ml/kg體積比給藥，進行口服測定治療。一小時後，通過以10 ml/kg體積比腹膜內注射1 mg/kg劑量的脂多糖誘導小鼠內毒素血症，該脂多糖來自大腸桿菌血清型055：B5(Sigma L-2880)並在無菌鹽水中溶解。注射LPS(腹膜內)90分鐘後，在異氟烷麻醉下通過心臟穿刺提取0.5-0.8 ml血液；離心血樣(6000 rpm；10分鐘；4℃)並取2個血清樣品在-70℃下冷凍保存直到測定血清TNF-α濃度(EIA：來自研發體系的鼠TNF/TNFSF1A Quantikine)。

以100 mg/kg/10ml劑量口服的化合物11和8在來自大腸桿菌的LPS(腹膜內)誘導的小鼠內毒素血症的該實驗模型中顯示出了活性；相對於載劑組，以統計上顯著地方式，分別降低了35.42%和37.7%的TNF-α的血清濃度水平。

在用甲狀旁腺激素治療的小鼠中IL6的血清水平。化合物15的活性。

材料和方法：使用5-7周大，在控制的標準條件下飼養的雄性CD1小鼠。這些動物禁食(14-16小時；每組12只；每籠6只1100 cm²)，隨意地用固體和液體食物維持。

5天中，以15 μg/0.1ml/每次注射的劑量使用pTH-rp(1-34，人類)，腹膜內施用8次治療動物。

注射pTH一小時後，懸浮液(溶劑：吐溫80 0.1%-NaCl 0.9%)以10 ml/kg體積比給藥，進行口服測定治療。

在最後施用pTH兩小時後，在異氟烷麻醉下通過心臟穿刺提取0.5-0.8 ml血液；離心血樣(6000 rpm；10分鐘；4℃)並取2個血清樣品在-70℃下冷凍保存直到測定血清IL6濃度(EIA：參考號555240. BD Bioscience)。

以25 mg/kg/10ml劑量口服給藥的化合物15在此實驗模型中顯示出了活性；相對於其載劑組，以統計上顯著地方式，降低了64.58%的IL6血清濃度水平。

抗腫瘤活性。

細胞系NCI組(初步篩選)

此研究中使用的特殊的人類細胞系從美國標準菌種中心(ATCC)獲得，並在37℃下在濕潤的95%的空氣和5% CO₂下，在含有10%(v/v)熱滅活的胎牛血清、2 mM L-麩醯胺、100 U/ml青黴素和100 μg/ml鏈黴素的RPMI-1640培養基中培養。

明顯量的指數生長人類細胞系接種到96孔平底微量滴定板中，達到100 μl終體積，並在37℃下在濕潤的5% CO₂/95%空氣下，培養24小時，以使得細胞附在板上。然後，在37℃下5% CO₂/95%空氣下用不同濃度的分析化合物培養細胞72小時。採用XTT(3'-[1-(苯基胺基)羰基]-3，4-四唑鎓-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉鹽水合物)細胞增殖試劑盒(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，德國)按照廠商說明書定量細胞增殖情況。簡言之，將剛製備的XTT標記試劑和PMS(N-甲基二苯並吡嗪硫酸甲酯)電子耦合試劑的混合溶液(50 μl)加入到每個孔中。將得到的混合物在濕潤氣氛(37℃，5% CO₂)中進一步培養4小時，並在波長490 nm和參考波長655 nm測定中用微量滴定板讀數器測定生成的甲產物吸光度。然後計算IC₅₀(50%抑制濃度)作為致使50%細胞增殖抑制的藥物濃度。資料示出了四個獨立實驗(每個實驗重複施行三次)的平均值(±標準差)。表1示出了在篩查後3和60細胞系板中的測定化合物的一些IC50濃度。

表1.在細胞系篩查中的IC50(微莫耳濃度)

在黑色素瘤(B16-F1，MALM-3M)、結腸癌(HCT-116，SW260)、肝細胞癌(HepG2)，成膠質細胞瘤(SF268)和肺(NCI-H460)癌細胞系的化合物6、8、40、41和44的體外細胞毒活性。

SRB方法如下(Wieland，V.等Sulforhodamine B Assay and Chemosensitivity. Chemosensitivity，volume 1，In Vitro Assays. Methods in Molecular Medicine. Edited by Rosalyn D. Blumenthal. Humana Press，Totowa，New Jersey，2005)。

將細胞接種到96孔微板中。根據細胞類型在每個孔中接種200微升的具體數量細胞。在這些條件下，將細胞培養3天以達到其生長指數期分析產物細胞毒活性的目的。在解凍儲存溶液(10 mM)後，在處理當天製備產物濃度。在接種細胞3天收穫微板後，廢棄每個孔的培養基並用150 μl新鮮培養基取代。隨後加入50 μl相應產物稀釋液以使得每個孔裏200微升最終容量的最終濃度是預定濃度。在分析濃度下使產物與細胞生長單分子層接觸72小時，並在37℃，5% CO₂下培養。最終，加入50 μl 50%的冷TCA(三氯醋酸)終止細胞生長(孔內最終濃度10%)。然後在4℃下維持微板超過60分鐘，以固定細胞蛋白直到開始用SRB洗滌和染色為止。

細胞存活力(%)=(處理孔的細胞群/標準曲線的最大細胞群)x 100.

從分析濃度的每個孔獲得的值計算每種濃度的平均存活力值。

表2示出了在七個不同細胞類型中測定化合物的IC50濃度。

表2.　在細胞系篩查中的IC50(微莫耳濃度)

人類非腫瘤細胞(次級篩查)

在纖維母細胞、HUVEC細胞和其餘PBL(外周血液淋巴細胞)中研究了化合物對人類非腫瘤細胞的細胞毒性。

測定化合物顯示出了在10^-5 M範圍內對抗HUVEC和纖維母細胞的某些細胞毒活性。關於其他PBL，甚至在10^-4 M下化合物幾乎不影響PBL。因為化合物誘導10^-5-10^-6 M濃度範圍的血液學癌症細胞系中的凋亡，這些資料示出了與正常血細胞比較的血液學癌症的治療區間(window)。

通過使用I型膠原酶處理人臍帶獲得HUVEC細胞，37℃下在Hank培養基中培養20分鐘。之後收集細胞並使用20% FBS、1% P/S和25 mg/500 ml培養基ECGF的補充物在培養基M199中培養，細胞在0.2%明膠基質上生長。

將接種到96孔平底微量滴定板中達到終體積100 μl的明顯量的指數生長細胞，接種到96孔平底微量滴定板中，並在37℃下在5% CO₂/95%空氣的濕潤氣氛下，培養24小時，以使細胞附在板上。然後，在37℃下5% CO₂/95%空氣的氣氛下用不同濃度的分析化合物培養細胞72小時。使用XTT細胞增殖試劑盒(Roche Molecular Biochemicals，曼海姆，德國)按照廠商說明書定量細胞增殖情況。簡言之，將剛製備的XTT標記試劑和PMS(N-甲基二苯並吡嗪硫酸甲酯)電子耦合試劑的混合溶液(50 μl)加入到每個孔中。將得到的混合物進一步在濕潤氣氛(37℃，5% CO₂)中培養4小時，並在波長490 nm和參考波長655 nm測定中用微量滴定板讀數器測定生成的甲產物吸光度。然後計算IC₅₀(50%抑制濃度)作為致使細胞增殖50%抑制的藥物濃度。資料示出了四個獨立實驗(每個實驗重複施行三次)的平均值。結果在表3中示出。

表3.　人類非腫瘤細胞的IC50

為了分離正常的外周血液淋巴細胞(PBLs)，通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心法離心從來自健康志願者的新鮮人類外周血液中得到單核細胞，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌，並在含有10%(v/v)熱滅活的FBS、2 mM L-麩醯胺、100 U/ml青黴素和100 μg/ml鏈黴素的RPMI-1640培養基中培養，如上所述(Cabaner等Br. J. Pharmacol 127：813-825.1999)。過夜培養後，通過培養皿粘附來棄去單核細胞。用PBS洗滌非貼壁細胞(淋巴細胞)並收集。PBL製備典型的為70-75%的CD3⁺，24-29%的CD19⁺，和少於0.4%的CD14⁺。

表4.化合物3和6在其餘人類PBL上的作用

化合物3和6甚至在10^-4M下幾乎不影響PBL，再一次示出了其細胞毒性小於阿黴素。因為這些化合物在10^-6M濃度範圍內誘導血液學癌症細胞系的凋亡，這些資料示出了與正常細胞比較的血液學癌症的治療區間(window)。

在慢性淋巴細胞白血病異種移植動物模型中化合物3的體內抗癌活性。

37℃下在濕潤的95%空氣和5% CO₂中，在含有10%(v/v)熱滅活的胎牛血清、2 mM L-麩醯胺、100 U/ml青黴素和100 μg/ml鏈黴素的RPMI-1640培養基中，培養慢性淋巴細胞白血病(CLL)EHEB細胞系。定期測定細胞的黴漿菌感染，結果為陰性。遵守西班牙法規在22℃溫度下12/12小時晝夜循環下根據制度準則，維持和處理的CB17-嚴重合併免疫缺陷(SCID)小鼠(Charles River laboratories，里昂，法國)隨意餵給標準食物和酸化水。對CB17-SCID小鼠用100 μl PBS和100 μl Matrigel基底膜基質(Becton Dickinson)中的1.5 x 10⁷ EHEB細胞通過皮下接種到其下腹部中。當腫瘤可觸及時，隨機將小鼠分配到10只小鼠一隊的佇列中，在尾靜脈注射化合物(每週3次)。每次靜脈注射量為200 μl，使得最終藥物濃度為2.5 mg/kg(體重)。平行對小鼠靜脈注射等量溶劑。使用測徑器測定腫瘤的最短和最長直徑，並使用以下標準式計算腫瘤體積(10^-3cm³)：(最短直徑)²×(最長直徑)×0.5。當其腫瘤達到3 cm或當觀察到明顯毒性時，根據制度準則處死動物。監測動物體重和所有發病跡象。藥物治療持續41天。然後，分離、測定和稱重腫瘤，並進行關於腫瘤和特殊器官的屍檢分析。用平均值±標準差表達所有值。使用Mann-Whitney檢驗或t檢驗估算組間的統計差異。認為p值小於0.05是統計上顯著的。結果在圖1中描述。與對照組(用載劑治療)相比，化合物3顯著地(**，p<0.01)抑制CLL腫瘤的生長。

完成體內分析後，處死對照和化合物3治療的小鼠，分離異種移植腫瘤並測定腫瘤的重量和體積，與對照未治療小鼠相比，化合物3治療的小鼠顯示出了腫瘤大小和重量的明顯而顯著的(p<0.01)減小。

一旦處死小鼠，便進行關於腫瘤和特殊器官的屍檢分析。完成屍檢分析後，未在特殊器官中檢測到顯著的事件或變化。未治療對照組和治療組的小鼠的重量相似。這些資料表明使用化合物3對小鼠進行治療，沒有顯著的副作用。與腫瘤未用藥的對照小鼠相比，從化合物3治療的小鼠中分離的腫瘤顯示出了極少的血管化，表明化合物3可能具有抗血管原活性，其能夠增強抗癌細胞毒性。這些結果表明化合物3在CLL異種移植腫瘤小鼠模型中顯示了顯著而有效的體內抗癌活性。另外，兩種藥物治療耐受良好，而且在屍檢研究中未檢測出明顯毒性。

在所有測定日中，化合物3與對照的差異在統計學上顯著的(p<0.05)。

化合物3在多發性骨髓瘤異種移植動物模型中的體內抗癌活性。

在37℃下在濕潤的95%空氣和5% CO₂下，在含有10%(v/v)熱滅活的胎牛血清、2 mM L-麩醯胺、100 U/ml青黴素和100 μg/ml鏈黴素的RPMI-1640培養基中培養多發性骨髓瘤(MM)MM1S細胞系。定期測定細胞的黴漿菌感染，結果為陰性。

遵守西班牙法規在22℃下12/12小時晝夜循環下根據制度準則維持和處理的CB17-嚴重合併免疫缺陷(SCID)小鼠(Charles River laboratories，Lyon，法國)隨意餵給標準食物和酸化水。對CB17-SCID小鼠用100 μl PBS和100 μl Matrigel基底膜基質(Becton Dickinson)中的3 x 10⁷ MM1S細胞通過皮下接種到其下腹部中。當腫瘤可觸及時，隨機將小鼠分配到10只小鼠一隊的佇列中，在尾靜脈注射化合物(每週3次)。每次靜脈注射量為200 μl，使得最終藥物濃度為2.5 mg/kg(體重)。平行對小鼠靜脈注射等量溶劑。使用測徑器測定腫瘤的最短和最長直徑，並使用以下標準式計算腫瘤體積(10^-3cm³)：(最短直徑)²×(最長直徑)×0.5。當其腫瘤達到3 cm或當觀察到明顯毒性時，根據制度準則處死動物。監測動物體重和所有發病跡象。藥物治療持續1個月。然後，分離、測定和稱重腫瘤，並進行腫瘤和特殊器官的屍檢分析。用平均值±標準方差表達所有值。

在所有測定日中，化合物3與對照的差異在統計學上是顯著的(p<0.05)。結果顯示在圖2中。下表顯示出了治療結束時的體外腫瘤資料。

化合物3對患者慢性淋巴細胞白血病細胞的抗癌活性。

選擇一組6位人類患者的慢性淋巴細胞白血病細胞，這些細胞顯示出了不同模式的ZAP70表達(參見表5中標記的細胞發生的變化)。在化合物3存在下培養細胞。在圖3中描述顯示細胞存活力的該研究結果。

細胞存活力的下降在ZAP70低表達的細胞中更顯著，呈劑量依賴的方式。

化合物3在突變的KRAS結腸癌原位動物模型中的體內抗癌活性。

採用來自罹患Kras突變患者的結腸直腸癌細胞的動物模型，將該細胞植入大鼠的結腸部位(Yao，M. Cyclooxygenase-2 selective inhibition with NS-398 suppresses proliferation and invasiveness and delays liver metastasis in colorectal cancer. Br. J. Cancer,2004 Feb 9；90(3)：71)測定化合物3的療效。

圖4A顯示了對人類結腸直腸癌腫瘤體積的清晰的減小的效果。顯示了化合物3和兩個不同的廣泛使用的結腸癌抗癌藥物：5-FU和奧沙利柏(OXA)的直接比較效果。

圖4B中示出了來自用化合物3(NF)、奧沙利柏(OXA)、5-F尿嘧啶(5-FU)及其聯合治療的小鼠的人類結腸癌腫瘤重量。

化合物3在黑色素瘤原位動物模型中的體內抗癌活性。

採用基於B16黑色素瘤小鼠細胞的動物模型(Szende，B.，等，Effect of a novel somatostatin analogue combined with cytotoxic drugs on human tumour xenografts and metastasis of B16 melanoma. British Journal of Cancer(2003)88，132-136)，化合物3在黑色素瘤原位小鼠模型中顯示了有效的體內抗癌活性。在所有這些實驗中化合物3的劑量為腹膜內注射30 mg/kg。結果在圖5中示出。

圖5A表示體內黑色素瘤腫瘤螢光素酶活性的PET圖像。腫瘤增殖細胞越多，信號越強。圖5B顯示了在治療結束時來自動物的體外黑色素瘤腫瘤。圖5C的圖表顯示了對照或化合物3治療後黑色素瘤腫瘤重量。實施4個不同並獨立的實驗(每組n=4個動物)。圖5D顯示了黑色素瘤B16體內模型的單個實驗(每組n=9個動物)。

化合物3在卵巢腫瘤原位動物模型中的體內抗癌活性。

化合物3展示了減小腫瘤區域的有效的體內抗癌活性。採用MOSEC ID8細胞(小鼠卵巢表面上皮細胞)和複製的螢光素酶報告基因及植入小鼠卵巢區域的細胞進行實驗(Yu-Hung Huang等，Claudin-3 gene silencing with siRNA suppresses ovarian tumor growth and metastasis. 3426-3430 PNAS 2009. vol. 106,no. 9)。結果在圖6中示出。

圖6A表示體內腫瘤螢光素酶活性的Pet圖像(化合物3治療的小鼠：30 mg/Kg腹膜內注射每週5天，持續2周)。圖6B示出了對照和化合物3治療的動物的螢光素酶的定量。

作用機制

血液學癌細胞系。

採用不同的人類血液學癌細胞系，包括CLL、MM、急性T細胞和急性髓細胞性白血病細胞系，與化合物3共培養，誘導細胞凋亡，估算少於G1的DNA含量的細胞，早凋亡特徵(亞G1峰值；6-9小時治療後)。在10 μM化合物3與EHEB(CLL)、RPMI-8226(MM)、Jurkat(急性T細胞白血病)和HL-60(急性髓細胞性白血病)细胞治療24小時後誘導出的細胞凋亡超過20%。

通過快速剪切半胱天冬酶-3的底物PARP及活化半胱天冬酶-3，可進一步促進誘導凋亡细胞凋亡。當用化合物3處理EHEB细胞時，還活化了半胱天冬酶-9，表明有藥物作用中固有的線粒體介導的信號途徑參與。半胱天冬酶-4得到活化表明藥物作用中內質網應激的推定參與。有趣的是，如通過隨著培養時間脂化微管相關蛋白1輕鏈3(LC3-II)的強力形成進行評價，在化合物3治療後觀察到非常快速並有效的自噬誘導。

化合物3對EHEB細胞凋亡的誘導(圖7A)：用10 μM化合物3在指定的時間內培養EHEB細胞，然後通過流式細胞術以細胞週期分析中亞G₁區域的細胞百分比定量細胞凋亡。通過凋亡細胞結合的亞G₁峰值(低二倍性)的位置以及G0/G1和G2/M峰值用箭頭顯示。平行進行未治療的對照細胞。每個直條圖示出了具有小於G1(亞G₁)DNA含量的細胞百分比。顯示的實驗代表進行三次。簡言之，細胞(5 x 10⁵)在4℃下離心並在70%乙醇中固定過夜。細胞用PBS洗滌3次，並用1 mg/ml RNaseA和20 μg/ml碘化丙啶在室溫下培養1小時，然後用Becton Dickinson FACS Calibur流動血細胞計數器(San Jose，加州)分析細胞週期。以在細胞週期分析中的亞G₁(低二倍性)的細胞百分比定量計算凋亡細胞。

化合物3處理的EHEB細胞中不同蛋白的表達(圖7B)。用10 μM化合物3在指定的時間內處理細胞，並通過免疫印跡用指定蛋白的特異性抗體分析。顯示了不同蛋白的移行位置。使用β-肌動蛋白作為加樣對照。顯示的資料是施行的三個實驗的代表。

結腸癌細胞。

得到的結果表明，如通過細胞週期分析中亞G1峰值(低二倍性)的現象並通過半胱天冬酶活化估算，化合物3誘導人類結腸癌細胞系(SW620，HCT-116)的凋亡。通過半胱天冬酶-9的誘導表明了化合物3誘導凋亡中有線粒體-介導固有的凋亡信號途徑的推定參與。另外，化合物3誘導可選擇的髓樣細胞白血病-1(Mcl-1)的拼接的短基因產物的表達，該髓樣細胞白血病-1命名為Mcl-1S(短)，是凋亡啟動子。用化合物3處理還提高了p53的蛋白水平。總之，此資料表明化合物3促進Mcl-1S和p53的上調，其能夠參與殺滅結腸癌細胞。

化合物3對人類結腸癌HCT-116細胞系凋亡的誘導(圖8A)。以亞G₁區域(低二倍性)的細胞百分比定量凋亡誘導。簡言之，細胞(5 x 10⁵)在4℃下離心並在70%乙醇中固定過夜。細胞用PBS洗滌3次，並用1 mg/ml RNaseA和20 μg/ml碘化丙啶在室溫下培養1小時，然後用Becton Dickinson FACS Calibur流動血細胞計數器(San Jose，加州)分析細胞週期。用10 μM化合物3在指定時間內培養HCT-116細胞，然後通過流式細胞術以細胞週期分析中亞G₁區域的細胞百分比定量細胞凋亡。通過凋亡細胞結合的亞G₁峰值(低二倍性)的位置以及G0/G1和G2/M峰值用箭頭顯示。平行進行未處理的對照細胞。每個直條圖表明具有小於G1(亞G₁)DNA含量的細胞百分比。顯示的實驗代表進行三次。

化合物3處理過程中不同凋亡相關蛋白的表達(圖8B)。用10 μM化合物3在指定時間內處理HCT-116和SW620，並通過免疫印跡用指定蛋白的特異性抗體分析。顯示了不同蛋白的移行位置。使用β-肌動蛋白作為加樣對照。顯示的資料是三個實驗的代表。將大約10⁷細胞離心，沉澱用PBS洗滌，然後溶解。蛋白(20 μg)在十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠上電泳，轉移到硝化纖維素膜，室溫下在TBST中用(50 mM Tris-HCl(pH 8.0)，150 mM NaCl和0.1%吐溫20)5%(w/v)脫脂牛奶封閉90分鐘，並在室溫下放置1小時或用特異性抗體在4℃下培養過夜，該特異性抗體為：抗聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)(稀釋度1：1000)小鼠單株抗體(BD Biosciences Pharmingen)；抗Bcl-X_L(稀釋度1：500)兔多株抗體(BD Biosciences Pharmingen)；抗Bcl-2(稀釋度1：250)小鼠單株抗體(BD Biosciences Pharmingen)；抗半胱天冬酶-3(稀釋度1：500)兔多株抗體(BD Biosciences Pharmingen)；抗半胱天冬酶-9(稀釋度1：1000)兔多株抗體(癌基因)；抗Mcl-1(稀釋度1：1000)兔多株抗體(BD Biosciences Pharmingen)；抗p53(稀釋度1：500)小鼠單株抗體(Santa Cruz Biotechnology)；抗-β-肌動蛋白(稀釋度1：5000)小鼠單株抗體(Sigma)。室溫下在TBST中在5%(w/v)脫脂牛奶中以1：5000稀釋度培養小鼠、兔(GE Healthcare)和山羊(Santa Cruz Biotechnology)第二HRP抗體。使用增強的化學發光檢測劑盒(Amersham)產生信號。

圖1：與用載劑治療的對照組比較，化合物3在異種移植動物模型中對慢性淋巴細胞白血病(CLL)的抑制。

圖2：與使用載劑治療的對照組比較，化合物3在異種移植動物模型中對多發性骨髓瘤(MM)的抑制。

圖3：來自慢性淋巴細胞白血病患者的細胞存活力。

圖4：化合物3在原位動物模型中對結腸癌的抑制。A：顯示出了與使用載劑治療的對照組比較，化合物3，5-F尿嘧啶(5-FU；在測定的實驗條件下沒有活性)和奧沙利鉑(OXA)的縮小腫瘤體積效果的圖像。B：顯示出了來自使用化合物3(NF)、奧沙利鉑(OXA)、5-F尿嘧啶(5-FU)及其聯合治療的小鼠的人類結腸直腸癌症腫瘤重量的圖表。

圖5：與用載劑治療的對照組比較，化合物3在原位動物模型中對黑色素瘤的抑制。A：體內黑色素瘤螢光素酶活性的PET圖像。B：在治療結束時來自動物的體外黑色素瘤。C：對照或化合物3治療(n=4)後的黑色素瘤重量。D：對照或化合物3治療(n=9)後的黑色素瘤重量。

圖6：與用載劑治療的對照組比較，化合物3在原位動物模型中對卵巢癌的抑制。A：體內腫瘤螢光素酶活性的PET圖像。B：來自對照和化合物3治療的動物組中螢光素酶信號的定量。

圖7：使用化合物3(10 μM)治療的EHEB細胞(B細胞慢性淋巴細胞白血病)。A：顯示出了EHEB細胞中受化合物3誘導的凋亡的直條圖。B：在化合物3治療的EHEB細胞中不同蛋白的表達。

圖8：用化合物3(10 μM)治療的HCT-116細胞(結腸癌)。A：顯示出了人類結腸癌HCT-116細胞系中受化合物3誘導的凋亡的直條圖。B：化合物3治療期間不同的凋亡相關蛋白的表達。

Claims

一種式(I)的化合物，或其鹽、前體藥物或溶劑化物：其中：Ph是苯基；n是2、3或4；R₁選自由氫和C₁-C₆烷基組成的組中；R₂是式-[[CH(R₃)]_m-R₄]的基團，其中m是1；R₃，如果恰當的話，選自由氫、苯基和C₁-C₆烷基組成的組中；R₄選自由未取代的雜芳基、取代的雜芳基和取代的芳基組成的組中，所述取代基選自C₁-C₆烷基、C₇-C₁₁芳烷基、苯基、5或6員雜芳基、F、Cl、Br、I、三氟甲基、氰基、-N(R_a)(R_b)、-OR_c、-SR_d或-C(O)R_e；其中R_a、R_b、R_c、R_d和R_e獨立地選自氫、C₁-C₆烷基、苯基和三氟甲基；或如果R₁和/或R₃與氫不同，那麼R₄還可能是未取代的苯基；或R₁和R₂，與它們連接的氮原子一起形成取代的或未取代的雜芳基，其中所述取代基如上所限定；具有以下附加條件：2-[(4,4-二苯基-丁-3-烯基胺基)-甲基]-苯酚，3-[(4,4-二苯基-丁-3-烯基胺基)-甲基]-苯酚，5-[(4,4-二苯基-丁-3-烯基胺基)-甲基]-2-甲氧基-苯酚，4-[(4,4-二苯基-丁-3-烯基胺基)-甲基]-2,6-二氟-苯酚，苄基-(5,5-二苯基-戊-4-烯基)-乙基-胺，6-氯-9-(4,4-二苯基-丁-3-烯基)-9H-嘌呤，9-(4,4-二苯基-丁-3-烯基)-9H-嘌呤-6-基胺和5-(4,4-二苯基-丁-3-烯基)-4,5,6,7-四氫異噁唑並[4,5-c]吡啶-3-酚，不包括於式(I)中。
根據申請專利範圍第1項的化合物，其中每個所述取代基選自C₁-C₆烷基、C₇-C₁₁芳烷基、苯基、5或6員雜芳基、F、Br、I、三氟甲基、氰基、-N(R_a)(R_b)、-OR_c、-SR_d或-C(O)R_e；其中R_a、R_b、R_d和R_e獨立地選自氫、C₁-C₆烷基、苯基和三氟甲基，R_c選自C₁-C₆烷基、苯基和三氟甲基；而且-N(R_a)(R_b)不是-NH₂。
根據申請專利範圍第1項的化合物，或其鹽、前體藥物和/或溶劑化物，該化合物具有式(IA)：其中Ph、n、R₁和R₄如前述申請專利範圍任一項所界定。
根據申請專利範圍第1-3項中任一項的化合物，其中R₄是選自由噻吩基、呋喃基、吡啶、1H-苯並咪唑、9H-嘌呤、1H-咪唑和1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶組成的組中的未取代的雜芳基或取代的雜芳基。
根據申請專利範圍第1-3項中任一項的化合物，其中R₄是式(V)或(VI)的基團其中，A和B獨立地選自-CH-和-N-；D獨立地選自由-O-、-S-和-NH-組成的組中；p是整數，選自由0、1、2或3組成的組中；每個R₅選自C₁-C₃烷基、苯基、苯甲基、5或6員雜芳基、F、Br、I、三氟甲基、-N(R_a)(R_b)、-SR_d或-C(O)R_e；其中R_a、R_b、R_d和R_e獨立地選自氫、C₁-C₃烷基、苯基和三氟甲基；而且式(V)中-N(R_a)(R_b)不是-NH₂，；所述式(V)或(VI)基團通過任意一個自由位置與分子的其餘部分連接。
根據申請專利範圍第1項的化合物，其中R₁和R₂，與它們連接的氮原子一起形成選自由1H-苯並咪唑、9H-嘌呤、1H-咪唑和1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶組成的組的基團。
根據申請專利範圍第1項的化合物，其中R₄是式(VII)的基團其中R₆選自由-OCF₃、OC₁-C₃烷基、F、Cl、Br、I和-CN組成的組；而且q是整數，選自由1、2或3組成的組中，而且所述式(VII)的基團通過任意一個自由位置與分子的其餘部分連接。
根據申請專利範圍第1-3項中任一項的化合物，其中R₁是氫或甲基。
根據申請專利範圍第1項的化合物，其選自以下化合物或其鹽、前體藥物和/或其溶劑化物：
一種醫藥組合物，包含根據申請專利範圍第1-9項中任一項的式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽、前體藥物或溶劑化物和至少一種藥學上可接受載體。
根據申請專利範圍第1-3項中任一項的式(I)的化合物，或其藥學上可接受的鹽、前體藥物或溶劑化物，係用作藥劑。
一種式(I)的化合物，或其藥學上可接受的鹽、前體藥物或溶劑化物，係用作治療炎症疾病的藥劑：其中：Ph是苯基；n是2、3或4；R₁選自由氫和C₁-C₆烷基組成的組中；R₂是式-[[CH(R₃)]_m-R₄]的基團，其中m是整數，選自由1、0或2的組成的組中；每個R₃，如果恰當的話，選自由氫和C₁-C₆烷基組成的組中；R₄選自由未取代的雜芳基、取代的雜芳基、未取代的芳基和取代的芳基組成的組中，所述取代基選自C₁-C₆烷基、C₇-C₁₁芳烷基、苯基、5或6員雜芳基、F、Cl、Br、I、三氟甲基、氰基、-N(R_a)(R_b)、-OR_c、-SR_d或-C(O)R_e；其中R_a、R_b、R_c、R_d和R_e獨立地選自氫、C₁-C₆烷基、苯基和三氟甲基；或R₁和R₂，與它們連接的氮原子一起形成取代的或未取代的雜芳基，其中所述取代基如上所限定。
根據申請專利範圍第12項的式(I)化合物，其中炎症疾病選自炎症性腸病(IBD)、類風濕性關節炎(RA)、良性前列腺增生、巴雷特病症(Barrett’s disease)、哮喘、骨骼肌和腱修復、潰瘍性結腸炎、利什曼病和自體免疫性疾病，較佳為克羅恩氏病(Crohn’s disease)。
根據申請專利範圍第12項的式(I)化合物，係用於癌症的治療。
根據申請專利範圍第14項的化合物，其中所述癌症選自轉移瘤、乳癌、食道癌、結腸癌、結腸癌、胃癌、白血病、黑色素瘤、子宮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巢癌、卵巢惡性腫瘤、前列腺癌、腎癌、肝癌、胰臟癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、骨癌、皮膚癌、肉瘤、卡波西肉瘤、腦瘤、肌肉瘤、神經母細胞瘤、淋巴瘤和多發性骨髓瘤。