TW201034684A

TW201034684A - Method for inhibiting neurodegeneration

Info

Publication number: TW201034684A
Application number: TW099104907A
Authority: TW
Inventors: Marc Tessier-Lavigne; Anatoly Nikolaev; Julie Pinkston-Gosse
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2009-02-18
Filing date: 2010-02-12
Publication date: 2010-10-01
Also published as: AU2010216107A1; KR20120011841A; JP2012518042A; WO2010096470A4; WO2010096470A3; CA2752171A1; CN102326083A; WO2010096470A2; MX2011007567A; EP2399135A2; AR078216A1; IL214647A0; EP2399135A4; US20120076785A1; BRPI1005403A2

Description

201034684 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明大體而言係關於一種筛選抑制神經元退化之化合物的方法。更特定言之，該等方法包括篩選抑制APP在神經元退化之觸發事件後自神經元脫落之化合物。本申請案為2009年6月12曰申請之PCT申請案第 PCT/US2009/47255號之部份接續申請案，該PCT申請案第 PCT/US2009/47255號為2007年12月21曰申請之PCT申請案 _ 第PCT/US2007/88521號之部份接續申請案，該PCT申請案第PCT/US2007/88521號主張2006年12月22曰申請之美國臨時申請案第60/871528號及2007年2月12曰申請之美國臨時申請案第60/900848號的權益。本申請案進一步主張2008 年6月12日申請之美國臨時申請案第61/061062號及2009年 2月18曰申請之美國臨時申請案第61/153 540號的權益。此等申請案之内容係以全文引用的方式併入本文中。【先前技術】 Q 在此項技術中已鑑別出屬於腫瘤壞死因子（TNF)超家族之各種配位體及受體。在該等配位體中包括腫瘤壞死因子-α(「TNF-α」）、腫瘤壞死因子-β(「TNF-β」或「淋巴毒素-a」）、淋巴毒素-β(「LT-β」）、CD30配位體、CD27配位體、CD40配位體、ΟΧ-40配位體、4-1ΒΒ配位體、 LIGHT、Αρο-1配位體（亦稱為Fas配位體或CD95配位體）、 Apo-2酉己位體（亦寿爯為Apo2L或TRAIL) 、 Apo-3酉己位體（亦稱為TWEAK)、APRIL、OPG配位體（亦稱為RANK配位體、 146428.doc 201034684 ODF 或 TRANCE)及 TALL-1(亦稱為 BlyS、BAFF 或 THANK) (參見例如 Ashkenazi, TVaiwre 2:420-430 (2002);

Ashkenazi 及 Dixit, «SWace, 281:1305-1308 (1998);

Ashkenazi 及 Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000) ； Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) ； Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000 > 第 377-411 頁； Locksley等人，Ce//, 104:487-501 (2001) ; Gruss及Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995) ; Schmid 等人，iVoc. Λ^"·

Acad. 5^，··，83:1881 (1986) ; Dealtry 等人，Ewr. ·/·

O 7wwm«o/·， 17:689 (1987) ; Pitti 等人，丄 C/zem·， 271:12687-12690 (1996) : Wiley等人，/mwwm.O；，3:673-682 (1995) ; Browning 等人，Ce//，72:847-856 (1993);

Armitage# Λ » Nature, 357:80-82 (1992) ； 1997年 1 月 16 曰

公開之WO 97/01633 ; 1997年7月17日公開之WO 97/25428 ; Marsters 等人，Cwrr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche 等人，J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997) ; Hahne等人，·/_ 五xp. MeA, 188:1185-1190 (1998); 1998年7月2日公開之WO 98/28426 ; 1998年10月22日公開之 WO 98/46751 ; 1998 年 5 月 7 日公開之 WO/98/18921 ;

Moore 等人，Science，285:260-263 (1999) ； Shu 等人，J. lew灸价〇/·, 65:680 (1999) ; Schneider等人，《/·

Mel, 189:1747-1756 (1999) ; Mukhopadhyay等人，·/·^。/· C/zew·, 274:15978- 15981 (1999))。由該等TNF家族配位體介導之各種細胞反應之誘導通常 146428.doc -4- 201034684 由其與特異性細胞受體之結合起始。在至今鑑別出之TNF 受體超家族之成員中包括TNFR1、TNFR2、p75-NGFR、 TACI、GITR、CD27、OX-40、CD30、CD40、HVEM、 Fas(亦稱為 Apo-1 或 CD95)、DR4(亦稱為 TRAIL-R1)、 DR5(亦稱為Apo-2或TRAIL-R2)、DR6(亦稱為TR9，在文獻中亦稱為TNF受體超家族成員21或TNFRSF21)、DcRl、 DcR2、骨保護素（osteoprotegerin，OPG)、RANK 及 Apo-3(亦稱為 DR3 或 TRAMP)(參見例如 Ashkenazi, Nature ❹ 及⑼化柃·?，2:420-430 (2002) ; Ashkenazi 及 Dixit， 281:1305-1308 (1998) ; Ashkenazi及 Dixit, Cwrr Ce//

Biol., 11:255-260 (2000)； Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) 1 Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000，第 377-411 頁；Locksley 等人，O//，104:487-501 (2001) ; Gruss 及 Dower, Blood，85:3378-3404 (1995); Hohman等人，J. 5,o/· C72em_，264:14927-14934 (1989); Brockhaus等人，Proc. •/V'a". Jcac/· t/iSd, 87:3127-3131 0 (1990) ; 1991 年 3 月 20 曰公開之 EP 417,563 ; Loetscher 等人，Ce//，61:351 (1990) ; Schall等人，Ce//，61:361 (1990); Smith等人，248:1019-1023 (1990) ; Lewis等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2830-2834 (1991) ； Goodwin ^ A » Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991) ； Stamenkovic 等人，五«/.，8:1403-1410 (1989) ; Mallett等人，五ΜδΟ J., 9:1063-1068 (1990) ； Anderson# K » Nature, 390:175-179 (1997) ; Chicheportiche等人，J. 5/o/· C72em·，272: 146428.doc 201034684 32401-32410 (1997) ; Pan 等人，iSc/e«ce，276:111-113 (1997) ; Pan等人，277:815-818 (1997) ; Sheridan 等人’ 277:818-821 (1997) ; Degli-Esposti等人， J· Mecf·，186:1165-1170 (1997); Marsters等人’匸心厂· 5ζ·ο/.，7:1003-1006 (1997) ; Tsuda等人，234:137-142 (1997) ; Nocentini等人，Proc. iVai/. Jcfli Sci. 94:6216-6221 (1997) ; vonBulow等人，Science, 278:138-141 (1997) ; Johnson 等人，Ce", 47:545-554 (1986); Radeke 等人，iVaiwre，325:593-597 (1987) ; Pan等人， FEBS Lett., 431:351-356 (1998)) 〇此等TNF受體家族成員之多數共有細胞表面受體包括細胞外、跨膜及細胞内區域之典型結構，而發現其他成員為缺乏跨膜及細胞内域之天然可溶性蛋白質。典型TNFR之細胞外部分含有由NH2末端起始的多個半胱胺酸富集域 (CRD)之重複胺基酸序列模式。對於配位體及受體之TNF家族之回顧，通常參見例如

Wallach，Academic Press, 2000，第 377-411 頁；Locksley 等人，〇//, 104:487-501 (2001);

Ware, Cytokine & Growth Factor Reviews, 14:181-184 (2003) ’ Liu 等人，15(1):23-34 (2001)及 Bossen 等人，·/.出〇/ CTzem. 281(20):13964-71 (2006)。稱為DR6受體之TNFR家族成員（在文獻中亦稱為「TR9」；在文獻中亦稱為tnF受體超家族成員21或 TNFRSF21)已經描述為具有4個細胞外半胱胺酸富集基元 146428.doc -6 - 201034684 及細胞質死亡域結構之I型跨膜受體（Pan等人，F五Zdi.， 431:351-356 (1998);亦參見美國專利 6,358,508 ; 6,667,390 ； 6,919,078 ； 6,949,358) ° 已報導DR6在某些經轉染細胞株中之過度表現導致細胞凋亡及NF-kB與JNK兩者之活化（Pan等人，43 1:351-356 (1998))。在DR6缺陷型小鼠模型中，在JNK活化中T細胞實質上受損，且當DR6(-/-)小鼠經蛋白質抗原攻毒時，發現其T細胞過度增殖且顯示朝向Th2反應之深度極化（而Th 1分化並不 U 受同等影響）(Zhao 等人，·/·五;φ. Med.，194:1441-1448 (2001))。進一步報導在活體外靶向破壞DR6導致2型輔助T 細胞（Th2)分化增強（前述Zhao等人）。2005年3月31曰公開之US 2005/0069540中描述DR6促效劑或拮抗劑在調節B細胞介導之病狀中的各種用途。 DR6受體可在調節OVA誘發之小鼠哮喘模型中之氣管炎症中起作用（Venkataraman等人，Ze".，106:42-47 (2006))。 Ο 使用髓鞘募樹突神經膠質細胞醣蛋白（MOG(35-55))誘發之實驗性自體免疫性腦脊髓炎模型，發現與野生型（WT)仔畜相比，DR6-/-小鼠對CNS疾病之發作及進展具有高度抗性。因此，DR6可與調節白細胞浸潤有關且在實驗性自體免疫性腦脊髓炎之誘導及進展中起作用（Schmidt等人，/. 175:2286-2292. (2005)) ° 儘管已鑑別出各種TNF配位體及受體家族成員具有多樣生物活性及特性，但極少數該等配位體及受體已報導與神 146428.doc 201034684 經相關功能有關。舉例而言，2004年8月26曰公開之WO 2004/071528描述在鼠類模型中抑制CD95(Fas)配位體/受體複合物來治療脊髓損傷。 TNF受體超家族之一個成員p75為神經營養蛋白 (neurotrophin)(例如神經生長因子（NGF)、腦來源神經營養因子（BDNF)、神經營養蛋白-3(NT3)及神經營養蛋白-4(NT4))之受體（關於p75之回顧，請參見Dechant及Barde (2002) TVaiwre 5(11):1131-113 6)。已知前NGF結合p75且誘導細胞死亡，且在阿茲海默氏症患者 (Alzheimer's patient)之腦中發現前NGF含量升高，且已進一步顯示Αβ肽（與阿茲海默氏症相關）與p75結合且誘導神經元細胞死亡（Dechant 及 Barde (2002) iVa/wre iVewroscz·· 5(11):113卜1136)。因此，p75似乎在阿茲海默氏症中起作用。 p75亦已與軸突伸長及在一些髓鞘相關抑制劑存在下之伸長抑制相關。Nogo受體結合軸突伸長之三種不同髓鞘相關抑制劑：髓鞘相關醣蛋白（MAG)、Nogo-66及募樹突神經膠質細胞-髓勒醣蛋白（OmgP)。Nogo受體與p75締合，且已表明p75可能經由其與Nogo受體締合而在軸突伸長中起作用（Dechant及 Barde (2002) TVa/wre TVewroscz·· 5(11):1131-1136)。【發明内容】在本發明之實施例中，提供經分離之死亡受體 6(「DR6」）拮抗劑。本文中揭示之拮抗劑的某些實施例抑 146428.doc 201034684 制或阻斷DR6與一或多種其同源配位體之間的相互作用。在較佳實施例中，本文中揭示之DR6拮抗劑抑制或阻斷 DR6與其同源配位體類澱粉前驅蛋白（「APP」）之間的相互作用。DR6拮抗劑之實施例可包含諸如DR6或APP抗體之抗體。該等DR6拮抗抗體可為例如單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在本發明之某些實施例中， DR6拮抗劑可包含抗DR6抗體，其結合DR6胞外域多肽或其片段，且視情況可結合包含圖1A之胺基酸1-349或42- U 349之DR6多肽。或者，DR6拮抗劑可包含抗APP抗體，其結合APP多肽且視情況可結合包含圖1B之胺基酸66-81(SEQ ID NO: 6)的 APP 多肽。所涵蓋之DR6拮抗劑亦包括DR6免疫黏附素、DR6變體、DR6片段、其共價修飾形式、或其融合蛋白以及小分子拮抗劑。舉例而言，DR6拮抗劑可包括聚乙二醇化DR6 或與諸如抗原決定基標籤之異源序列、諸如人類Fc之抗體片段或白胺酸拉鏈融合的DR6之可溶性胞外域形式。 Q 本發明之說明性實施例亦包括抑制或阻斷DR6與APP結合之方法，其包含在DR6與APP之結合受抑制之條件下使 DR6多肽及/或APP多肽暴露於一或多種DR6拮抗劑。用於該等方法中之典型DR6拮抗劑包括結合DR6或APP之抗體以及可溶性DR6多肽。視情況，藉由觀測DR6拮抗劑抑制 DR6與APP之間結合的能力來選擇用於此等方法中之DR6 拮抗劑。在本發明之某些實施例中，使用該等方法來例如抑制細胞凋亡及/或增強神經元細胞在活體外組織培養物 146428.doc 201034684 中之生長及/或存活。該等方法涵蓋使用單一類型之抓6括抗劑分子或兩種或兩種以上類型之D R 6枯抗劑之組合。本發明之實細(例亦提供用於增強神經元細胞或組織在哺礼動物中生長或再生或存活之方法，其包含投與哺乳動物有效量之DR6拮抗劑。在視情況選用之實施例中，投與 DR6拮抗劑在該哺乳動物中增強神經元細胞或組織之生長且阻斷神經元細胞或組織之細胞死亡及退化。神經元細胞或組織可包含例如運動神經元、感覺神經元、連合神經儿、軸突、微神經膠質細胞及/或寡樹突神經膠質細胞。在本發明之一些實施例中，用於該等方法中之DR6拮抗劑可包含結合APP且抑制其結合DR6之能力的抗體。在本發明之其他實施例中，用於該等方法中之DR6拮抗劑可包含結合DR6且抑制其結合App之能力的抗體。或者，DR6拮抗劑可包含DR6免疫黏附素，與選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物連接之DR6多肽，或DR6多肽變體。用於該等方法中之DR6免疫黏附素可包含與免疫球蛋白之Fc區融合的可溶性DR6受體。此外，本發明之DR6拮抗劑可包括小分子。本發明之實施例亦提供治療神經病症之方法，其包含投與哺乳動物有效量之DR6拮抗劑。在視情況選用之實施例中’該等方法包含治療哺乳動物之阿茲海默氏症。用於該等方法中之DR6拮抗劑可包含結合app且抑制其結合DR6 之能力的抗體。DR6拮抗劑亦可包含DR6抗體。或者， DR6拮抗劑可包含DR6免疫黏附素，與選自由聚乙二醇、 146428.doc -10· 201034684 聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物連接之 DR6多肽’ DR6抗體或DR6變體。用於該等方法中之dr6 免疫黏附素可包含與免疫球蛋白之以區融合的可溶性Dr6 受體。用於該等方法中之抗DR6抗體可結合包含圖j A之胺基酸1-349或42-349的DR6受體。本發明之實施例亦包括診斷患有神經病症或易患神經病症之患者的方法，其包含自患者獲得樣本及測試樣本中具有與SEQ ID NO: 1之DR6多肽序列不同之多肽序列iDR6 〇多肽變體的存在。通常在該等方法中，多肽變體經鑑別對 APP多肽具有與對SEQ ID NO: 1之DR6多肽序列觀測到之親和力不同的親和力。本發明之實施例亦提供鑑別所關注抑制DR6與App結合之分子的方法。該等方法可包含在所關注分子存在或不存在之情況下組合DR6與APP，及隨後偵測在該所關注分子存在下對DR6與APP結合之抑制。視情況，使用在細胞表面上表現DR6之哺乳動物細胞進行該等方法；且該等方法 © 進一步包括偵測對DR6活化或信號傳導之抑制。本發明之實施例進一步包括由該等方法鑑別之分子。視情況，所關注之分子為結合APP之抗體，結合DR6之抗體或可溶性 DR6多狀。本發明之實施例亦提供能夠特異性結合App配位體、 DR6受體，及/或能夠調節與DR6及/或其配位體及/或辅助受體相關的生物活性，且適用於治療各種神經病症之抗體。在特定實施例中，提供與DR6多肽之胞外域序列特異 146428.doc 201034684 性結合之抗體（下文實例中進一步描述）。典型抗體為彼等結合APP或DR6且進一步針對抑制DR6與APP之間結合之能力加以選擇者。視情況，抗體為單株抗體。視情況，單株抗體包含由分別以寄存編號PTA-8095、PTA-8094或PTA-8096寄存之融合瘤分泌的3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7抗體。亦提供結合與由分別以ATCC寄存編號PTA-8095、PTA-8094或PTA-8096寄存之融合瘤細胞株產生之3F4.4.8、 4B6.9.7或1Ε5.5·7單株抗體結合之抗體抗原決定基相同的〇抗原決定基之抗體。在一態樣中，本發明係關於包含 3F4.4.8、4Β6.9.7或1Ε5.5.7抗體之抗DR6抗體，其對DR6展示至少與抗體3F4.4.8、4Β6.9.7或1Ε5.5.7相同的親和力，及/或展現至少與其相同的生物活性及/或效力。在其他特定實施例中，提供產生單株抗體3F4.4.8、 4Β6.9.7 或 1Ε5.5.7，且分別以寄存編號 PTA-8095、ΡΤΑ-8094或ΡΤΑ-8096寄存於ATCC之融合瘤細胞株，且單株抗體3F4.4.8、4Β6.9.7或1Ε5.5.7分別由以寄存編號ΡΤΑ- | % 8095、ΡΤΑ-8094或ΡΤΑ-8096寄存於ATCC的融合瘤分泌。亦提供經分離之抗DR6單株抗體，其包含結合DR6多肽且競爭性抑制由以ATCC寄存編號PTA-8095、ΡΤΑ-8094或 ΡΤΑ-8096寄存之融合瘤產生的單株抗體與該DR6多肽之結合之抗體。亦提供嵌合或人類化抗DR6抗體，其特異性結合DR6多肽且包含（a)來源於由分別以寄存編號PTA-8095、 ΡΤΑ-8094或ΡΤΑ-8096寄存於ATCC之融合瘤分泌的 146428.doc -12- 201034684 3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7抗體之序列。視情況，該等抗體可包含來源於3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7抗體的重鏈、輕鏈或可變區。在另一態樣中’本發明係關於編碼本文之抗DR6抗體或抗體片段的經分離之核酸分子，包含該等核酸分子之載體，包含該等核酸分子之宿主細胞，及用於產生本文之抗體及抗體片段之方法。本發明進一步係關於包含如本文中所定義之DR6拮抗劑 0 及載劑的組合物。載劑可為醫藥學上可接受之載劑且組合物可進一步包含其他藥劑。在另一態樣中’本發明係關於包含容器及含於該容器中之組合物的製品’其中該組合物包括本發明之DR6拮抗劑。製品可進一步包含活體外或活體内使用DR6拮抗劑之用法說明書。在一較佳實施例中’用法說明書係關於神經病症之治療。在一相關態樣中，本發明之實施例包括套組，其包含第 © 一谷器、該容器上之標籤、及含於該容器内之組合物。在該套組中，組合物包括有效抑制至少一種類型之哺乳動物神經元細胞的細胞凋亡之DR6拮抗劑，該容器上之標籤，或包括於該容器中之包裝插頁’指示該組合物可用於抑制至上一種類型之哺乳動物神經元細胞的細胞凋亡。視情況，該套組包括其他元件，諸如包含醫藥學上可接受之緩衝液之第二容器；及/或使用DR6拮抗劑抑制至少一種類型之哺乳動物神經元細胞的細胞凋亡之說明書。 146428.doc -13· 201034684 本發明進一步提供本文中所述之DR6拮抗劑及組合物用於製備或製造用於治療哺乳動物神經病症，包括用於治療阿茲海默氏症之藥物的用途。本發明亦提供一種篩選抑制神經元退化之化合物的方法，其中將候選化合物添加至基於細胞之檢定中，在該檢定中存在神經元退化之觸發事件，通常導致App自神經元表面脫落。若在候選化合物存在下未觀測到脫落，則該候選化合物為神經元退化之抑制劑，可用作神經疾病及病症 (諸如（但不限於）阿茲海默氏症）及與損傷相關之退化的療法。在本發明之一些實施例中，提供一種抑制神經退化之方法，其中使神經細胞與JNK抑制劑接觸。在其他實施例中，提供一種抑制有需要之患者之神經退化的方法，其中投與患者有效量之JNK抑制劑以減少神經退化。患者可為經鑑別患有神經疾病者或有發展神經疾病風險者。此等疾病包括例如家族性及偶發性肌萎縮性側索硬化（分別為 FALS及ALS)、家族性及偶發性帕金森氏病（parkins〇n s disease)、予廷頓氏病（Huntingt〇n，s ⑴“心 —(spinal Ml：：r -吻，SMA)。在—些實施例中，患者為阿兹海默氏症患者。JNK抑制劑可為此項技術中已知之任何抑制劑，包括此項技術中已知可投與患者之化合物。本發明亦提供如上方法，其中亦使用p75之拮抗劑以防止App經由P75受體信號傳導來抑制神經退化。p75之拮抗 146428.doc -14· 201034684 劑可包括例如可溶性P75、結合p75之抗體、防止ai>|>結合於膜結合p75的p75之免疫黏附素。上述本發明之方法可進一步包括抑制P75信號傳導。【實施方式】使用習知方法熟習此項技術者通常充分理解且通常採用本文中描述或引用之技術及程序’該方法諸如8&11^1100让等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual第 2版（1989) 〇 ❹

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y.中描述之廣泛使用之分子選殖方法。除非另作說明，否則適當時通常根據製造商定義之方案及/或參數進行涉及使用市售套組及試劑之程序。在描述本發明方法及檢定之前，應瞭解本發明不侷限於特定方法、方案、細胞株、動物物種或屬、構築體，且因而所描述之試劑當然:可變化。亦應瞭解本文中使用之術語僅為描述特定實施狀目的，以欲限制本發明之範鳴，該範疇僅由隨附申請專利範圍限定。須注意，除非上下文中另外明確限定，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一 x ^ 一」（'a」、'an」）及該（「加」）包括複數個指示物。因此，舉例而言提及「一遺傳變異」包括複數個該等變異且提及「一探針」包括提及:或多個探針及其熟f此項技術者已知之等效物專。本說明書及相關申諸直*丨丨鈐㈤丄關甲月專利圍中陳述之所有數字（例如胺基酸22-81，1_354等）均應〜'解為經術語「約」修飾。本文中提及之所有公開案係以 Ή用的方式併入本文中以 146428. doc 201034684 揭示及描述連同該等公開案一起引用之方法及/或材料。引用本文中引用之公開案在本申請案申請曰期之前的揭示内容。此處不應理解為由於本發明之較早優先權日期或先前曰期而承認發明者無權提早公開案之曰斯。另外，實際公開日期可不同於所示者且要求獨立核實。 I.定義術語「類澱粉前驅蛋白」或「APP」包括由APP前 mRNA編碼之各種多肽同功異型物，例如圖1B-1D中分別展示之APP695、APP75 1及App770同功異型物（自APP前 mRNA之替代剪接轉錄物轉譯之同功異型物），以及APP同功異型物之轉譯後加工部分°如在此項技術中所已知，自 APP基因轉錄之APP前mRNA經歷替代外顯子剪接以產生許多同功異型物（參見例如Sandbrink等人’ Ann NY Acad. Sci. 777: 281-287 (1996);及與 PubMed NCBI蛋白質基因座寄存P05067相關之資訊）。此替代外顯子剪接產生具有 695、751及770個胺基酸之三種主要同功異型物（參見例如 Kang等人，325: 733-736 (1987) ; Kitaguchi等人， iVaiwre 331: 530-532 (1988) ; Ponte等人 ’ 331: 525- 527 (1988);及 Tanzi 等人，ATaiwre 331: 528-532 (1988))。此等同功異型物中之兩種（Αρρ75ι及APP77〇)含有與絲胺酸蛋白酶抑制劑（KPI)之Kunitz家族高度同源的具有56個殘基之插入物且普遍表現。與此相反，缺乏KPI基元之較短同功異型物APP695主要表現於神經系統中，例如表現於神經元及神經膠質細胞中，且因此其通常稱為「神經元APP」 146428.doc -Ϊ6- 201034684 (參見例如Tanzi等人，iSciewce 235: 880-884 (1988) ; Neve 等人，1: 669-677 (1988);及 Haas 等人，乂 A^wrojcz· 11: 3783-3793 (1991))。包括 695、751 及 770 之 APP同功異型物經歷顯著轉譯後加工事件（參見例如Esch等人 1990 248:1122-1124; Sisodia 等人 1990 248:492-495)。舉例而言，此等同功異型物中之每一者皆由各種分泌酶及/或分泌酶複合物裂解，此為產生包括含有APP胞外域（sAPPa及sAPPp)之N端分泌多肽之APP片段 Λ 的事件。由a分泌酶或者由β分泌酶裂解分別導致產生可溶 Ό 性Ν端ΑΡΡ多肽、sAPPa及sAPPp且釋放至細胞外部，且保留相應膜錨定C端片段C83及C99。γ分泌酶對C83之後續加工產生Ρ3多肽。此為主要分泌路徑且不產生類澱粉蛋白。或者，C99之早老素（presenilin)/尼卡斯群（nicastrin)介導之 γ分泌酶加工釋放類澱粉β多肽類澱粉β40(Αβ40)及類澱粉 β42(Αβ42)(類澱粉斑塊之主要組份），及細胞毒性C端片段 y_CTF(50)、Y-CTF(57)及y-CTF(59)。證據表明各裂解事件〇之相對重要性視細胞類型而定。舉例而言，非神經元細胞優先由在Αβ序列中裂解APP之α分泌酶路徑加工APP ’由此排除Αβ之形成（參見例如Esch等人1990 248:1122- 1124 ; Sisodia 等人 1990 248:492-495)。與此相反，神經元細胞由β分泌酶路徑加工更大部分之APP695，其由至少兩種酶類別之組合活性產生完整Αβ。在神經元細胞中，β-分泌酶在Αβ域之胺基端裂解ΑΡΡ695，釋放不同Ν 端片段（sAPPP)。此外，γ-分泌酶在羧基端之替代位點裂解 146428.doc -17· 201034684 APP ’產生為40(Αβ4ο)或42個胺基酸長（Αβ42)之Αβ物質（參見例如 Seubert 等人 1993 TVaiwre 361:260-263 ; Suzuki 等人 1994 264:1336-1340;及 Turner 等人 1996 J. Βί〇/. C/zem. 271:8966-8970)。當用於本文中時’術語「APP」、「APP蛋白」及「APP 多肽」涵蓋原生APP序列及APP變體及其加工片段。此等術δ吾涵蓋表現於包括人類之多種哺乳動物中之App。App 可内源性表現為天然存在於多種人類組織譜系十，或可藉由重組或合成方法表現。「原生序列Αρρ」包含具有與來源於自然界之ΑΡΡ(例如695、75 1及770同功異型物或其經加工部分）相同之胺基酸序列的多肽。因此，原生序列ΑΡΡ 可具有.來自包括人類之任何哺乳動物的天然存在之Αρρ的胺基酸序列。該等原生序列ΑΡΡ可自自然界分離或可由重組及/或合成方法產生。術語「原生序列Αρρ」特定涵蓋 ΑΡΡ之天然存在之加工及/或分泌形式（例如，含有例如胞外域序列之可溶形式）、天然存在變體形式（例如，替代性 .之對偶基因變段或缺失突變男接及/或蛋白質水解加工形式）及天然存在異體。ΑΡΡ變體可包括原生序列Αρρ之片體。適用於本發明實施例之Αρρ多肽包括上述術多狀及下

ΑΡΡ75!及/或ΑΡΡ77〇同功異型物。在本發明之其他實施例 146428.doc • 18- 201034684 中，APP多肽包含App之轉譯後加工同功異型物，例如經歷由諸如α-分泌酶、卜分泌酶或γ•分泌酶之分泌酶裂解之 ΑΡΡ多肽（例如可溶性Ν端片段，諸如sApp〇^sAppp)。在本發明之相關實施例中，App多肽可經選擇以包含一或多個特定域，諸如N端胞外域（參見例如Quast等人，又 2003; 17(12):ΐ739·41)、肝素結合域（參見例如R〇ssj〇hn等人，伽加⑽細/. 1999 Apr; 6 (4):327 31)、銅第難（參見例如 Hesse 等人，349 (1): 1〇9_116 (1994)) 〇或Kunitz蛋白酶抑制劑域（參見例如Ponte等人，勤 331 (6156):525-7 (1988))。在本發明之一些實施例中， APP多狀包括經觀測包含由本文中揭示之廳枯抗劑（諸如抗體或DR6免疫黏附素）識別的抗原決定基之序列，例如 APP695之胺基酸22-81，包含由單株抗體22C11結合的抗原決定基之序列（參見例如Hilbich等人，乂价〇/以州 268(35): 26571-26577 (1993)) ° 在本發明之某些實施例中，App多肽不包含一或多個特 © 定域或序列’例如不包括某些N端或c端胺基酸之App多狀 (例如實例12中揭示之人類重組N_App多肽）、不包括 Kunitz蛋白酶抑制劑域之App多肽（例如APPmD、或不包括阿茲海默氏β類澱粉蛋白（Ap)序列之App多肽（例如sAppp，一種不包括Αβ^及/或Αβά序列之多肽κ參見例如8〇以等人，J.汾沿〇/_ 2003年 2月；141(2):156-70)。在本發明之其他實施例中，用於本發明實施例中之App多肽包含一或夕個域或序列而非其他域或序列，例如包含]^端胞外域 146428.doc -19- 201034684 (或至少其之經觀測由諸如單株抗體22C11之DR6拮抗劑結合的部分）而非位於一或多個分泌酶裂解位點之C端的諸如 β類澱粉（Αβ)序列（例如sAPPa或sAPPp)之域或序列之APP 多肽。術語「p75」係指軸突表面上之TNF受體超家族成員蛋白質，咸信其充當神經營養蛋白之受體。「p75」包括聚核苷酸及多肽序列分別展示於SEQ ID NO: 17及SEQ ID NO: 16中之此項技術中提及之受體。人類p75為按序具有推定信號序列（胺基酸1-28)、細胞外域（胺基酸29-250)、柄狀域 (stalk domain)(胺基酸 189-250)、跨膜域（胺基酸 251-272)及細胞質域（胺基酸273-327)(各自相對於SEQ ID NO: 16)之 427個胺基酸之蛋白質（參見SEQ ID NO: 16)(Underwood, (3.Κ·&Ε·】·（^οιιΐ5〇η(2008)/«ί·«/.5ζ·〇ί7/^/«·άΟ"5/ο/· 40(9):1664-1668)。人類p75之非限制性實例的核酸及胺基酸序列展示於 SEQ ID NO: 16-17(NM—002507)中。術語「細胞外域」、「胞外域」或「ECD」係指基本上不含跨膜及細胞質域之APP形式。通常可溶性ECD將具有少於1 %之該等跨膜及細胞質域，且較佳將具有少於0.5%之該等域。應瞭解，按照通常用於此項技術中鑑別疏水性域之類型的標準來鑑別針對本發明多肽所鑑別之任何跨膜域。跨膜域之確切邊界可改變，但最可能在如最初所鑑別之域的任一末端改變不超過約5個胺基酸。在較佳實施例中，ECD將由不含跨膜及細胞質或胞内域的多肽之可溶性胞外域序列組成（且不為膜結合型）。 146428.doc •20· 201034684 術浯「APP變體」意謂如下定義之與具有圖1B_1D中所示之胺基酸序列的人類APP具有至少約8〇%、較佳至少约 85%、86%、87%、88%、89%、更佳至少約 9〇%、91%、 92%、93%、94%、最佳至少約 95%、96%、97%、98% 或 99%胺基酸序列一致性之APP多肽，或其可溶性片段，或其可溶性胞外域。該等變體包括例如圖1B_1D之全長或成熟序列的N端或C端中添加有一或多個胺基酸殘基或自圖 1B-1D之全長或成熟序列的N端或c端中缺失一或多個胺基〇酸殘基之App多肽，或多肽之内部序列或域中插入有一或多個胺基酸殘基或自多肽之内部序列或域中缺失一或多個胺基酸殘基之APP多肽，包括來自其他物種之變體，但排除原生序列APP多肽。「DR6」或「DR6受體」包括在此項技術中提及之受體’其聚核苷酸及多肽序列展示於圖j Add A_2中。Pan等人已描述稱為「DR6」或「TR9」之TNF受體家族成員的 t核苦酸及多狀序列（pan等人’ F五万S乙扣.，43 1:35 1-356 〇 (1998);亦參見美國專利 6,358,508 ; 6,667,390 ; 6,919,078 ; 6,949,358)。人類DR6受體為655個胺基酸之蛋白質（參見圖1A-2)，其具有推測信號序列（胺基酸丨_41)、胞外域（胺基酸42-349)、跨膜域（胺基酸350-369),接著為細胞貝域（胺基酸370-655)。當在本文中使用時，術語「DR6受體」涵蓋原生序列受體及受體變體。此等術語涵蓋表現於包括人類之多種哺乳動物中之Dr6受體。DR6受體可内源性表現為天然存在於多種人類組織譜系中，或可 146428.doc •21- 201034684 藉由重組或合成方法表現。「原生序列DR6受體」包含具有與來源於自然界的DR6受體相同之胺基酸序列的多肽。因此，原生序列DR6受體可具有來自包括人類之任何哺乳動物的天然存在之DR6受體的胺基酸序列。該等原生序列 DR6受體可自自然界分離或可藉由重組或合成方法產生。術語「原生序列DR6受體」特定涵蓋天然存在之截短或分泌形式之受體（例如，含有例如胞外域序列之可溶形式）、天然存在之變體形式（例如替代性剪接形式）及天然存在之對偶基因變異體。受體變體可包括原生序列DR6受體之片段或缺失突變體。術語「細胞外域」或「ECD」係指基本上不含跨膜及細胞質域之DR6受體形式。通常可溶性ECD將具有少於1%之該等跨膜及細胞質域，且較佳將具有少於〇·5%之該等域。應瞭解，按照通常用於此項技術中用以鑑別疏水性域之類型的標準來鐘別針對本發明多肽所鑑別之任何跨膜域。跨膜域之確切邊界可改變’但最可能在如最初鏗別之域的任一末端改變不超過約5個胺基酸。在較佳實施例中，ecd 將由不含跨膜及細胞質或胞内域的多肽之可溶性胞外域序列組成（且不為膜結合型）。術語「DR6變體」意謂如下定義與具有圖ία中所展示之推斷胺基酸序列的人類DR6具有至少約80%、較佳至少約 85%、86%、87%、88%、89%、更佳至少約 90%、910/。、 92%、93%、94%、最佳至少約 95%、96%、97%、98。/〇戋 99%胺基酸序列一致性之DR6多肽，或其可溶性片段，咬 146428.doc -22- 201034684 其可溶性胞外域。该4變體包括例如在囷i A之全長或成熟序列的N端或C端添加有一或多個胺基酸殘基或自圖1Ai 全長或成熟序列的N端或C端缺失一或多個胺基酸殘基之 DR6多肽，或在多肽之内部序列或域插入有一或多個胺基酸殘基或自多肽之内部序列或域缺失一或多個胺基酸殘基之DR6多肽，包括來自其他物種之變體，但排除原生序列 DR6多肽。視情況，DR6變體包含DR6受體之可溶形式，其包含圏1A的胺基酸1-349或42-349，具有至多10個保守〇胺基酸取代。較佳地，該變體充當如下文定義之DR6拮抗劑。術語「DR6拮抗劑」以最廣泛意義使用，且包括在神經 X*細胞或組織中（活體外、原位、活體内或離體）部分或完全阻斷、抑制或中和DR6受體結合其同源配位體、較佳其同源配位體APP或活化一或多個細胞内信號或細胞内信號傳導路徑之能力的任何分子。舉例而言，DR6拮抗劑可在神、、’至元細胞或組織中部分或完全阻斷、抑制或中和受 © 體活化導致神經元細胞或組織中細胞洞亡或細胞死亡之一或多個細胞内信號或細胞内信號傳導路徑之能力。DR6拮抗劑可起作用以藉由多種機制部分或完全阻斷、抑制或中和DR6，該等機制包括（但不限於）阻斷、抑制或中和同源配位體與DR6之結合、DR6與其同源配位體（例如App)之間複合物之形成、DR6受體之募聚化、1)尺6受體與異源輔助爻體之間複合物之形成、同源配位體與DR6受體/異源輔助文體複合物之結合，或DR6受體、異源輔助受體與其同源 146428.doc -23· 201034684 配位體之間複合物之形成。DR6拮抗劑可以直接或間接方式起作用。本發明涵蓋之DR6拮抗劑包括（但不限於）APP 抗體、DR6抗體、免疫黏附素、DR6免疫黏附素、DR6融合蛋白、DR6之共價修飾形式、DR6變體及其融合蛋白，或DR6之較高寡聚物形式（二聚體、聚集體）或DR6之均聚物或雜聚物形式、小分子，諸如JNK信號轉導級聯之藥理學抑制劑，包括Jun N端激酶JNK活性之小分子及肽抑制劑，在信號轉導路徑中JNK之上游起作用的蛋白質激酶 MLK及MKK活性之藥理學抑制劑，JNK與支架蛋白JIP-1結合之藥理學抑制劑，JNK與其諸如c-Jun或AP-1轉錄因子複合物之受質結合之藥理學抑制劑，JNK介導之其受質磷酸化之藥理學抑制劑（諸如JNK結合域（JBD)肽及/或JNK之受質結合域及/或包含JNK受質磷酸化位點之肽抑制劑），阻斷ATP與JNK結合之小分子，及阻斷受質與JNK結合之小分子。為測定DR6拮抗劑是否部分或完全阻斷、抑制或中和 DR6受體在神經元細胞或組織中活化一或多個細胞内信號或細胞内信號傳導路徑之能力，可進行檢定以評估DR6拮抗劑對例如各種神經元細胞或組織（如實例中所述）以及在中風/大腦局部缺血活體内模型、神經退化性疾病活體内模型（諸如帕金森氏病小鼠模型；阿茲海默氏症小鼠模型；肌萎縮性側索硬化ALS小鼠模型；脊髓性肌萎縮SMA 小鼠模型；病灶性及整體大腦局部缺血小鼠/大鼠模型，例如頸總動脈阻塞模型或大腦中動脈阻塞模型；或離體全 146428.doc -24- 201034684 胚胎培養物）中之作用。可以諸如如下所述或如在此項技術中已知及在文獻中所述之已知活體外或活體内檢定格式進行各種檢定（參見例如McGowan等人，7>6«心Μ Genetics, 22:281-289 (2006) ; Fleming 等人， 2:495-503 [2005) ·，Wong 專尺，Nature Neuroscience, 5:633-639 (2002))。測定DR6拮抗劑是否在神經元細胞或組織中部分或完全阻斷、抑制或中和DR6受體活化一或多個細胞内信號或細胞内信號傳導路徑之能力的檢定之一實 0 施例包含在DR6拮抗劑或潛在DR6拮抗劑（亦即所關注之分子）存在或不存在之情況下組合DR6與APP ;且隨後在此 DR6拮抗劑或潛在DR6拮抗劑存在下偵測對DR6與APP結合之抑制。「核酸」意欲包括任何DNA或RNA。舉例而言，組織樣本中存在染色體、粒線體、病毒及/或細菌核酸。術語「核酸」涵蓋雙股核酸分子之任一股或兩股且包括完整核酸分子之任何片段或部分。〇「基因」意謂在編碼或轉錄蛋白質或調控其他基因表現中具有功能性作用之任何核酸序列或其部分。基因可由負責編碼功能性蛋白質之所有核酸或僅由核酸中負責編碼或表現蛋白質之部分組成。核酸序列可在外顯子、内含子、啟始或終止區、啟動子序列、其他調控序列或基因之獨特相鄰區内含有遺傳異常。術語「胺基酸」係指所有天然存在之L-α-胺基酸。此定義意謂包括正白胺酸、鳥胺酸及高半胱胺酸。該等胺基酸 U6428.doc -25- 201034684 由單字母或三字母名稱鑑別：

Asp D 天冬胺酸 lie I 異白胺酸 Thr T 蘇胺酸 Leu L 白胺酸 Ser S 絲胺酸 Tyr Y 酪胺酸 Glu E 麩胺酸 Phe F 苯丙胺酸 Pro P 脯胺酸 His H 組胺酸 Gly G 甘胺酸 Lys K 離胺酸 Ala A 丙胺酸 Arg R 精胺酸 Cys C 半胱胺酸 Trp W 色胺酸 Val V 纈胺酸 Gin Q 麩胺醯胺 Met M 甲硫胺酸 Asn N 天冬醯胺在圖中，可採用某些其他單字母或三字母名稱來指代及鑑別在序列之指定位置處的兩個或兩個以上胺基酸或核苷酸。當用以描述本文中揭示之各種肽或蛋白質時，「經分離」意謂已自其天然環境之組份鑑別且分離及/或回收之肽或蛋白質。其天然環境之污染組份為通常將干擾肽或蛋白質的診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在較佳實施例中，肽或蛋白質將經純化（1)至足以藉由使用旋杯式序列分析儀獲得N端或内部胺基酸序列之至少1 5個殘基之程度；或（2)至使用考馬斯藍（Coomassie blue)或較佳銀染色法在非還原或還原條件下進行SDS-PAGE測定為均質；或（3)至使用光譜技術或肽定位技術測定為均質。經分離之物質包括重組細胞内的原位肽或蛋白質，此係由於其天然環境之至少一種組份將不存在。然而，通常藉由至少一個純化步驟製備經分離之 146428.doc -26- 201034684 肽或蛋白質。關於本文中鑑別之序列的「胺基酸序列一致性百分數 (%)」經定義為比對序列且引入缺口（必要時）以取得最大序列一致性百分數，且不將任何保守性取代視為序列一致性之部分後，候選序列中與參考序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分率。可以此項技術之技藝範圍内，可測定量測比對之適當參數的多種方式（包括為對所比較全長序列取得最大比對所需之賦值算法）取得為達成測定胺基 ❹ 酸序列一致性百分數目的之比對。出於本文之目的，可使用由Genentech, Inc.設計且原始碼已與使用者文件一起保存在 US Copyright Office, Washington, DC，20559 中，以 US 版權登記（Copyright Registration)第 TXU5 10087號登記之序列比較電腦程式ALIGN-2獲得胺基酸一致性百分數值。 ALIGN-2程式可經由 Genentech，Inc.，South San Francisco, CA公開獲得。所有序列比較參數係由ALIGN-2程式設定且不加改變。〇一般技術者可易於確定雜交反應之「嚴格性」且其通常為根據探針長度、洗滌溫度及鹽濃度確定之經驗計算值。通常，較長探針要求較高溫度以便適當黏接，而較短探針需要較低溫度。雜交通常依賴於當互補股存在於低於其熔融溫度之環境時變性DNA再黏接之能力。探針與可雜交序列之間的所需一致性程度愈高，其可使用之相對溫度愈高。因此，由此得出結論，較高相對溫度將趨向於使反應條件更嚴格，而因此較低溫度趨向於使反應條件不太嚴 146428.doc -27- 201034684 格。對於雜交反應之嚴格性之其他細節及說明，參見 Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Wiley Interscience Publishers (1995)。藉由以下條件鑑別如本文中所定義之「高嚴格性條件」：（1)採用低離子強度及高溫以供洗滌；0.015 Μ氣化鈉 /0.0015 Μ檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉，50QC ; (2)在雜交期間採用變性劑；在42°C下具有0.1%牛血清白蛋白/ 0.1% Ficoll/0_l%聚乙烯吡咯啶酮之50%(v/v)曱醯胺/具有 750 mM氣化鈉、75 mM檸檬酸鈉之50 mM磷酸鈉緩衝液 (pH 6.5);或（3)採用在42°C 下 50%甲醯胺、5xSSC(0.75 Μ NaCl、0·075 Μ檸檬酸鈉）、50 mM磷酸鈉（pH 6.8)、0.1% 焦填酸納、5 χ唐納氏溶液（Denhardt's solution)、音波處理之鮭魚精DNA(50 pg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸聚葡萄糖，洗滌液為在42°C下於〇.2xSSC(氣化鈉/檸檬酸鈉）中及 55°C下50%甲醯胺，接著為由在55°C下含有EDTA之 O.lxSSC組成的高嚴格性洗滌液。可如 Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press，1989所述鑑別「中等嚴格條件」，且其包括在37°C下於包含以下各物之溶液中培育隔夜：20%曱醯胺、5xSSC(150 mM NaC卜 1 5 mM檸:檬酸納）、5 0 mM碗酸納（pH 7.6)、5 χ唐納氏溶液、10°/。硫酸聚葡萄糖及20 mg/ml變性剪切鮭魚精DNA，接著在lxSSC中在約37-50°C下洗滌過濾器。熟習此項技術者應認識到如何視需要調節溫度、離子強度等以適應諸如 146428.doc -28- 201034684 探針長度及其類似因素之因素。術語「引子」係指如例如在聚合酶鍵反應中所存在’與互補RNA或DNA目標聚核皆酸雜交且充當藉由核普酸轉移酶作用自單核苦酸逐步合成聚核普酸之起始點之寡核芽酸序列。術”控制序列」係、指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所必需的⑽八序列。適於原核生物之控制序列包括例如啟動子、視情況選用之操縱基因及核糖體〇、结合位點。已知真核細胞使用啟動子、多聚腺嗓呤信號及強化子。當將核酸置於與另—核酸序列之功能關係中時，其係經可操作地連接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其與該多肽之 DNA可操作地連接，啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則其與該編碼序列可操作地連接；或若核糖體結合位論定位以便促進轉譯，㈣與編碼序列可操作地連接。〇通常，「可操作地連接」意謂所連接之舰序列為鄰接的且在分泌前導序列之情況下，鄰接且處於閱讀相中。然而強化子不必鄰接。藉由連接反應在便利限制性位點實現連接。若該等位點並不存在，則根據習知實踐使用合成寡核普酸銜接子或連接子。當在本文中使用時，措詞「標記」係指直接或間接共軛或融合至諸如核酸探針或抗體之試劑且促進谓測其所共辆或融合之該試劑的化合物或組合物。標記本身可能可偵測 146428.doc •29- 201034684 (例如放射性同位素標記或螢光標記），或在酶促標記之情況下’可催化可偵測之受質化合物或組合物之化學改變。如本文中所用，術S吾「免疫黏附素」表示抗體樣分子，其組合異源蛋白質（「黏附素」）之結合特異性與免疫球蛋白恆定域之效應功能。在結構上，免疫黏附素包含具有所需結合特異性且不為抗體之抗原識別及結合位點的（亦即為「異源」的）胺基酸序列與免疫球蛋白恆定域序列之融合體。免疫黏附素分子之黏附素部分通常為至少包含受體或配位體之結合位點的連續胺基酸序列。免疫黏附素中之免疫球蛋白恆定域序列可獲自任何免疫球蛋白，諸如IgG_ 1、IgG-2、IgG-3 或 IgG-4亞型、IgA(包括 IgA-1 及 IgA-2)、

IgE、IgD或 IgM。「DR6受體抗體」、「DR6抗體」或「抗DR6抗體」以廣泛意義使用以指結合至少一種形式之DR6受體、較佳人類 DR6受體、諸如圖1A中所示之DR6序列或其胞外域序列的抗體。視情況，將DR6抗體與異源序列或分子融合或連接。較佳地，異源序列允許或幫助抗體形成高階或募聚複合物。術§吾「抗DR6抗體」及其語法等效物尤其涵蓋下文貫例部分中所述之DR6單株抗體。視情況，DR6抗體與 DR6受體結合但不與腫瘤壞死因子家族之任何其他受體（例如 DR4、DR5、TNFR1、TNFR2、Fas)結合或交又反應。視情況，如在BIAcore結合檢定中所量測，本發明之dr6 抗體以約0.067 nM至約0.033 μΜ之濃度範圍與DR6受體結合0 146428.doc 30- 201034684 術語「抗APP抗體」、「APP抗體」及語法等效物係以廣泛意義使用，且係指與至少一種形式之App、較佳諸如本文中特定描述之APP多肽同功異型物的人類APP結合之抗體。較佳地，APP抗體為DR6拮抗劑抗體。舉例而言，在製造及/或鑑別如本文中揭示之〇尺6拮抗劑的方法中，App 之—或多種同功異型物及/或其部分可用作免疫原以免疫動物（例如作為產生單株抗體之方法之部分的小鼠）及/或用作探針以篩選化合物文庫（例如重組抗體文庫）。適用於本〇發明實施例之典型APP多肽包括以下非限制性實例。可選擇此等說明性形式用於本發明之各種實施例中。在本發明之一些實施例中’ APP多肽包含全長APP同功異型物，諸如圖1中所示之APP695及/或APP75,*/或APP770同功異型物。在本發明之其他實施例中，APP多肽包含APP之轉譯後加工同功異型物，例如已經歷諸如α-分泌酶、β-分泌酶或γ-分泌酶之分泌酶裂解之ΑΡΡ多肽（例如可溶性Ν端片段，諸如sAPPa或3ΑΡΡβ)。在本發明之相關實施例中， Ο APP夕肽可經選擇以包含一或多個特定域，諸如ν端胞外域（參見例如Quast等人，«/. 2003; 17(12):1739-41)、肝素結合域（參見例如Rossj〇hn等人，^^ 1999

Apr; 6(4):327· 31)、銅第Π型（參見例如Hesse等人，柯似尤e"㈣349(1): 109-116 (1994))或Kunitz蛋白酶抑制劑域 (參見例如 Ponte等人，331(6156):525_7 (1988))。在本發明之一些實施例中，APP多肽包括經觀測包含由本文中揭示之DR6拮抗劑（諸如抗體或DR6免疫黏附素（例如 146428.doc -31 - 201034684 APP695之胺基酸22-81))所識別的抗原決定基之序列，包含由單株抗體22C11結合的抗原決定基之序列（參見例如

Hilbich 等人，J. 5/〇/· CT2ew·, 268(35): 26571-26577 (1993))。在本發明之某些實施例中，App多肽不包含一或多個特定域或序列，例如不包括某些N端或C端胺基酸之 APP多肽（例如實例12中揭示之人類重組N_App多肽）、不包括Kunitz蛋白酶抑制劑域之App多肽（例如App695)或不包括阿茲海默氏β類澱粉蛋白（Αβ)序列之App多肽（例如 βΑΡΡβ，一種不包括Αβά及/或Αβ42序列之多肽）（參見例如

Bond等人，乂加㈣扪0/· 2003 年 2 月；141(2):156-70)。在本發明之其他實施例中，用於本發明實施例中之App多肽包含一或多個域或序列而非其他域或序列，例如包含N端胞外域（或至少其經觀測由諸如單株抗體22C11之dR6拮抗劑結合的部分）而非位於一或多個分泌酶裂解位點之c端的諸如β類殿粉（Αβ)序列（例如sAPPa或SAPPp)之域或序列之

ApP多肽。視情況，抗APP抗體將抑制APP多肽與DR6之結合且將如本文中所述及/或如在基於細胞之定量結合檢定中所量測以10 Pg/ml至50 pg/ml之濃度與APP多肽結合。本文之術語「抗體」以最廣泛意義使用且尤其涵蓋完整單株抗體、多株抗體、由至少兩個完整抗體形成之多特異性抗體（例如雙特異性抗體）及抗體片段，只要其展現所需生物活性。「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳包含其抗原結合或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab，、F(ab，）2及 146428.doc •32- 201034684

Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鍵抗體片段形成之多特異性抗體。及由抗鍵二生抗體」通常為約15°，_道爾頓之由兩個相同輕及兩個相同重鏈⑻構成的雜四聚體黯蛋白。各輕鏈 =二個共價雙硫鍵與重鏈連接，而雙硫鍵之數目在不同 a之重鏈之間不同。各重鏈及輕則隔開之鏈内雙硫橋。各重鏈有規鳊具有可變域（vH)，接

一 y多㈣域。各輕鏈在—端具有可變域（Vl)且在其另 -端具有恆定域；輕鏈之恆定域與重鏈之第一恆定域對準，且輕鏈可變域與重鏈之可變域對準。咸信特定胺基酸殘基形成輕鏈與重鏈可變域之間的界面。術語「可變」係指以下事實：可變域之某些部分在序列上在抗體之間廣泛不同且用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。然而，可變性並不均勾分布在整個抗體之可變域中。其集中在三個輕鏈與重鏈可變域中稱為高變區或互補決定區之區段令。可變域之較高度保守部分稱作構架區（FR)。原生重鏈及輕鏈之可變域各包含々個fr，大部分採用β摺疊構型，經形成環連接且在一些情況下形成^摺疊結構之一部分的三個高變區連接。各鏈中之高變區經FR 與其他鏈之高變區緊密接近保持在一起，促進抗體之抗原、、-口〇位點之七成（參見Kabat等人，化/似0y /mwtmo/o抑d /价㈣"，第五版。puMic Health Service，

National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。恆定域並不直接參與使抗體結合至抗原，但顯示各種效應功 146428.doc •33· 201034684 能，諸如抗體參與抗體依賴型細胞介導之細胞毒性 (ADCC)。以木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個稱為「Fab」片段之各具有單一抗原結合位點的相同抗原結合片段及殘餘「F c」片段，其名稱反映其易於結晶之能力。胃蛋白酶處理產生 F(ab')2片段，其具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原。厂Fv」為含有完整抗原識別及抗原結合位點之最小抗體片段。此區域由呈緊密、非共價締合之一個重鏈及一個輕鏈可變域之二聚體組成。在此構型中，各可變域之三個高隻區相互作用以界定vH_vL二聚體表面上之抗原結合位點。六個高變區共同賦予抗體抗原結合特異性。然而，甚至單一可變域（或僅包含三個對抗原具有特異性之高變區的一半Fv)具有識別及結合抗原之能力，儘管親和力比整個結合位點低。

Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域 (CHI) ° Fab'片段與Fab片段不同之處在於在重鏈CH1域之幾基端添加有數個殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab’-SH為本文中對恆定域之半胱胺酸殘基帶有至少一個游離硫醇基之Fab，之命名。F(ab，）2抗體片段最初產生為其間具有鉸鏈半胱胺酸的Fab，片段對。亦已知抗體片段之其他化學偶合。來自任何脊椎動物物種之抗體（免疫球蛋白）的r輕鏈」可基於其恆定域之胺基酸序列指派為稱為 <及χ兩個明顯不 146428.doc -34· 201034684 同類型中之一種。根據重鏈之恆定域之胺基酸序列，抗體可指派為不同類別。存在5種完整抗體之主要類別：IgA、IgD、ι§ε、ζ扣及IgM，且此等類別中之數種可進一步分成子類（同型），例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及 IgA2。對應於抗體之不同類別的重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、γ&μ。熟知免疫球蛋白之不同類別之次單位結構及三維構型。「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之Vh&Vl域，〇其中此等域存在於單一多肽鏈中。較佳地，Fv多肽進一步在vH與vL域之間包含多肽連接子，其使得3(^乂能夠形成供抗原結合之所需結構。關於SCFV之回顧請參見Pliickthun之

The Pharmacology 〇f Monoclonal Antibodies，第]A3 卷， Rosenburg及 Moore編，Springer-Verlag, New York，第 269_ 315 頁（1994)。術§吾「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段在同一多肽鏈（VH_vL)中包含重鏈可變〇域（VH)連接至輕鏈可變域（VL)。藉由使用過短以使同一鏈上之兩個域之間無法配對的連接子，域被迫與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更充分描述於例如 EP 404,097 ; W0 93/11161 ;及 Hollinger 等人， Proc. 以，90:6444-6448 (1993)中。如本文中所用之術語「單株抗體」係指獲自實質上同源抗體之群體之抗體，亦即除可少量存在之可能的天然存在之突變外構成群體之個別抗體相同。單株抗體針對單一抗 146428.doc •35- 201034684 原位點具有高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子（抗原決定基）之不同抗體的習知（多株）抗體製劑不同，各單株抗體針對抗原上之單_決定子。除其特異性外，單株抗體之有利之處在於其係藉由融合瘤培養而合成，未污染有其他免疫球蛋白。修都語「單株」指示獲自抗體之實質上同源群體的抗體之特徵且其不應理解為要求藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言’可藉由K〇hler等人，編卿，256:495 (1975)首先描述之融合瘤方法或可藉由重組DNA方法（參見例如美國專利第4,816,567號）製備欲根據本發明使用之單株抗體。亦可使用例wClacks〇n等人， Nature, 352:624-628 (1991)^ Marks t Λ，y. MoL Bi〇l^ 222:581-597 (1991)中描述之技術自噬菌體抗體文庫分離「單株抗體」。本文之單株抗體特定言之包括「後合」㈣（免疫球蛋白）’其中重鏈及/或輕鏈之-部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類的抗體之相應序列相同或同源，而鍵之剩餘部分與來源於另一物種或屬於另—抗體類別或子類的抗體之相應序列相同或同源，以及該等抗於之片段，只要其顯示所需生物活性（美國專利第4,816,567號； Morrison等人，P⑽· 如··咖，8i 685i 6855 (刪)）。本文中所關注之欲合抗體包#「靈長類化」抗體’其包含來源於非人類靈長類動物（例如舊大陸猴（〇ld World Monkey)，諸如狒狒、恆河猴或獼猴）之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列（美國專利第5,693,78〇號）。 146428.doc •36- 201034684 非人類（例如鼠類）抗體之「人類化」形式為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。人類化抗體之大部分為人類免疫球蛋白（受體抗體），其中受體之高變區的殘基經來自諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類之非人類物種（供體抗體）之高變區的具有所需特異性、親和力及能力之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架區（FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。進行此等修飾 0 以進一步改善抗體效能。通常，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中所有或實質上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環，且所有或實質上所有FR為人免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區（Fc)之至少一部分，通常人類免疫球蛋白之恆定區之至少一部分。關於其他細節，請參見 Jones 等人，321:522-525 (1986) ; Riechmann等人 'Nature 332:323-329 (1988);及 Presta, Cwrr· (7/?· 〇 Sirwci. 2:593-596 (1992)。當在本文中使用時，術語「高變區」係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區包含「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基（例如輕鏈可變域中之殘基24-34(L1)、50-56(L2)及 89-97(L3)，及重鏈可變域中之 31-35(H1)、50-65(H2)及 95-102(H3) ; Kabat 等人，51 叫似似打 of Proteins of ImmunoiogicaZ Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health, Bethesda, 146428.doc -37- 201034684 MD. (1991))及/或「馬變環」之殘基（例如輕鍵可變域之殘基 26-32(Ll)、50-52(L2)及 91-96(L3)，及重鏈可變域之26-32(H1)、53-55(H2)及 96-101(H3) ; Chothia及 Lesk J. Mo/, 价〇/· 196:901-917 (1987))。「構架」或「FR」殘基為除如本文中所定義之高變區殘基以外的可變域殘基。「結合」所關注之抗原的抗體為能夠以足夠親和力及/ 或親和性結合彼抗原以使得抗體適用作靶向表現該抗原之細胞的治療或診斷劑之抗體。 ❹ 出於本文之目的’「免疫療法」將係指以抗體治療哺乳動物（較佳人類患者）之方法，其中該抗體可為未共輛或「裸」抗體，或該抗體可與諸如一或多個細胞毒性劑之異源分子或藥劑共輕或融合’藉此產生「免疫共軛物」。〇「經分離」抗體為已自其天然環境之組份鏗別且分離及/或回收的抗體。其天然環境之污染組份為干擾抗體的診斷或治療用途之物質，且可包括酶 '激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在較佳實施财，抗體將經純化⑴ 至如方法所測定大於95重量％之抗體，且最佳大於 99重量％ ’⑺至；^以藉由使用旋杯式序列分析儀獲得至少 __或内部胺基酸序列之殘基之程度；或⑺至使用考馬斯藍或較佳銀染色法在還原或非還原性條件下進行SDS· 定為均質。經分離抗體包括重组細胞内之原位抗 & H為&體之天然環境的至少—種組份將不存在。 …：在：常藉由至少一個純化步驟製備經分離抗體。 …使用時，術語「經標藏標記」係指包含與 I46428.doc -38- 201034684 「標籤多肽」融合之抗體或多肽的嵌合分子。標籤多狀具有足夠殘基以提供可針對其製備抗體之抗原決定基或提供某些其他功能，諸如寡聚能力（例如，如具有白胺酸拉鏈域之肽中所發生），然而應足夠短以使得其通常並不干擾抗體或多肽之活性。標籤多肽較佳亦相當獨特，以便標籤特異性抗體實質上不與其他抗原決定基交叉反應。適當標籤多肽通常具有至少六個胺基酸殘基且通常在約8至約5〇個胺基酸殘基之間（較佳在約10至約20個殘基之間）。〇術語「Fc受體」或「FcR」用以描述與抗體之Fc區結合

的受體。較佳FcR為原生序列人類FcR^此外，較佳FcR為結合IgG抗體（γ受體）之FcR且包括FcyRI、FcYRII&FcyRIII 子類之受體’包括此等受體之對偶基因變異體及替代剪接形式。FcyRII受體包括FqRiiA(「活化受體」）及 FcYRIIB(「抑制受體」），其具有主要在其細胞質域中不同之相似胺基酸序列。活化受體FcyRIIA在其細胞質域中含有免疫受體酪胺酸基活化基元（ITAM)。抑制受體FeYRIIB ϋ 在其細胞質域中含有免疫受體酿胺酸基抑制基元（ΙΤΙΜ)(參 ^.Daeron, Annu. Rev. Immunol. 1 5:203-234 (1 997)) 〇 FcR回顧於 Ravetch 及 Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) ; Capel 等人，4:25-34 (1994)及 de

Haas等人，·/· Med. 126:330-41 (1995)中。本文之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括將來待識別者。該術語亦包括新生受體FcRn，其負責將母系IgG轉移至胎兒 (Guyer 等人，《/· /mmMno/· 117:587 (1976)及 Kim 等人，J. 146428.doc -39- 201034684 /m廳《〇/· 24:249 (1994))。本文之FcR包括多形現象，諸如編碼FqRIIIa之基因之遺傳二形現象，其在位於結合“⑴ 之受體之區域中的胺基酸位置158產生苯丙胺酸（F)或纈胺酸（v)。相對於同種接合子苯丙胺酸FcYRnia(FcYRIIIa_ 158F)或異種接合子（FcYRIIIa_158F/v)受體，已展示同種接合子缔胺酸FCYRIIIa(FCYRIIIa-l58V)對人類igGl具有較高親和力且在活體外介導ADCC增強。當在本文中使用時，術語「多元醇」廣泛指多羥基醇化合物。多元酵可為例如任何水溶性聚（環氧烷）聚合物且可具有線性或分支鏈。較佳多元醇包括在—或多個羥基位置經諸如具有1與4個之間的碳之烷基的化學基團取代之多元醇。通常，多元醇為聚（烷二醇），較佳為聚（乙二醇）(PEG) H熟習此項技術者認識料藉由使用本文中關於PEG所描述之共軛技術，採用諸如聚（丙二醇）及聚乙二醇_聚丙二醇共聚物之其他多元醇。h醇包括在此項技術中熟知之多元醇及諸如可自諸如齡&@ Corporation之市售來源公開獲得之多元醇。定義使用以意謂用或操作時，分術語「共軛物」在本文中根據其最廣泛聯接或連接在一起。當分子如聯接般起作子係「經共輛」。表述「有效量」係指有效預防、改盖 H療所討論之病症或病狀之樂劑（例如DR6拮抗劑等）的量。篁。預期本發明之 DR6拮抗劑將適用於減緩或終止退化性、* m 听、，k病症之進展咦適用於增強受損神經元細胞或組織之展^ 设且有助於恢復適 146428.doc 40- 201034684 當神經功能。如本文中所用之術語「治療」（「treating」，「treatment」）及「療法」（「therapy」）係指治療性療法及預防性療法。連續治療或投藥係指至少乂甘y基礎上之治療，在-或多天之治療中無間斷。間歇治療或投藥或以間歇方式治療或投藥係指不連續，但性質上為循環之治療。如本文中所用術語「病症」通常係指將受益於以1文中所描述之DR6拮抗劑治療的任何病狀。其包括慢性及急性〇病症，以及使哺乳動物易患所討論之病症的病理學病狀。「神經元細胞或組織」通常指運動神經元、中間神經元 (包括（但不限於）連合神經元）、感覺神經元（包括（但不限於）背根神經節神經元）、黑質之多巴胺（DA)神經元、紋狀體DA神經元、皮層神經元、腦幹神經元、脊髓中間神經元及運動神經元、海馬區神經元（包括（但不限於）海馬區之 CA1錐體神經元）及前腦神經元。本文中術語神經元細胞或組織意欲指由細胞體、軸突及樹突組成之神經元細胞以 ❹ 及指可形成該等神經元細胞之部分的軸突或樹突。本文中使用「神經病症」來指包括神經退化性病狀、特徵在於中枢或外周神經系統功能異常或神經元細胞或組織壞死及/或細胞凋亡之神經元細胞或組織損傷，及與營養因子剝奪相關之神經元細胞或組織損傷的病狀。神經退化性疾病之實例包括家族性及偶發性肌萎縮性側索硬化（分別為FALS及ALS)、家族性及偶發性帕金森氏病、亨廷頓氏症（亨廷頓氏舞蹈病（Huntington's chorea))、家族性及偶 146428.doc •41 · 201034684 發性阿茲海默氏症、脊髓性肌萎縮（SMA)、諸如青光眼或

相關疾病之視神經病（包括視網膜變性、糖尿病性神經病或黃斑退化）、歸因於内耳感覺細胞或神經元退化之聽力受扣、癲癇症、貝爾麻療（Bell's palsy)、具有與染色體 1 7(FTDP-17)有關的帕金森氏病之額顳葉型癡呆、多發性硬化症、擴散型大腦皮層萎縮、路易體癡呆（Lewy_b〇dy dementia)、匹克氏病（pick disease)、三核苦酸重複疾病、朊病毋病症及香德症候群（Shy-Drager syndrome)。可因損害神經元細胞或組織之存活或適當功能之多種不同病因發生神經元細胞或組織之損傷，其包括（但不限於）因例如以下原因導致之急性及非急性損傷：整體及病灶性大腦局部缺血（中風）時缺血性條件限制（暫時或永久）血流；例如大腦組織或脊髓之切口或傷口；神經元組織中之病變或斑塊；細胞生長及存活所需要之營養因子的剥奪；暴露於諸如化學治療劑之神經毒素；以及易發生諸如慢性代謝疾病 (諸如糖尿病或腎功能異常）之其他疾病病況。

「個體」或「患者」意謂任何需要療法之單個對象，包括人類。亦意欲包括任何參與臨床研究試驗但未展示任何疾病臨床徵象㈣象作為個體，或參與流行病學研究之= 象或用作對照之對象作為個體。 ' 係指任何歸類為哺乳、犬及貓。在本發明如本文中所用之術語「哺乳動物」動物之哺乳動物，包括人類、牛、馬之一較佳實施例中，哺乳動物為人類 II·本發明之例示性方法及材料 146428.doc .42· 201034684 先前研究已分析神經系統發育期間細胞死亡之現象 (Hamburger 等人，*/· Neurosci., 1:60-71 (1981);

Oppenheim, Ann. Rev. Neurosci., 14:453-501 (1991)； O'Leary 等人，Neurosci., 6:3692-3705 (1986)；

Henderson等人，TVaiMre，363:266-270 (1993) ; Yuen等人， 5raz_« Dev., 18:3 62-3 68 (1996))。咸信神經元細胞之死亡在各種神經病症之發展及/或進展中起作用，該等神經病症諸如家族性及偶發性肌萎縮性側索硬化（分別為FALS及 0 ALS)、家族性及偶發性帕金森氏病、亨廷頓氏症、家族性及家族性及偶發性阿茲海默氏症及脊髓性肌萎縮 (SMA)(Price等人，282:1079-1083 (1998))。申請者意外發現TNFR家族之成員DR6高度表現於包括大腦皮質、海馬區、脊髓:之運動神經元及中間神經元的胚胎及成人中樞神經系統中。如下文實例中所述，申請者進行各種實驗性檢定以研究DR6作為神經元細胞存活或死亡之調節劑可能起到之作用。連合神經元之存活依賴於其中〇間目標之一者脊髓基板的營養支持。在活體外外植體培養物中，申請者發現RNA干擾對DR6表現之抑制阻斷連合神經元之軸突退化。亦在背脊髓存活檢定中測試抗DR6單株抗體，且確定DR6特異性抗體3F4.4.8、4B6.9.7及1E5.5.7 對DR6受體信號傳導之抑制防止活體外外植體培養物中連合神經元之軸突退化。在文獻中已報導DR6經由活化JNK 傳導信號（上文之Pan等人，1998 ;上文之Zhao等人， 2001)。因此，為研究DR6-JNK信號傳導在軸突退化中之 146428.doc -43- 201034684 作用，進行背脊髓存活檢定，其中連合神經元中之JNK信號傳導路徑被肽抑制劑L-JNK-I阻斷。JNK信號傳導之此抑制在背脊髓存活檢定中部分阻斷軸突退化。因此，咸信 DR6至少部分經由JNK路徑傳導軸突過程退化之信號。為更好地理解DR6在發育中調節神經元細胞死亡之生理學作用，在全胚胎培養系統中藉由抗DR6抗體阻斷DR6信號傳導。驚人地，某些DR6特異性抗體對DR6信號傳導之抑制在此系統中保護脊髓神經元免於天然存在之發育細胞死亡。因此，可使用諸如DR6拮抗劑抗體之DR6拮抗劑來減少神經病症中出現之神經元細胞死亡，該等神經病症諸如神經退化性疾病（例如ALS、SMA、阿茲海默氏症及帕金森氏病、FTDP-17、亨廷頓氏症）及中風。為研究DR6是否在活體内充當真正促凋亡受體，申請者分析發育階段E1 5.5 之DR6基因剔除胚胎之表型。根據所提出的DR6作為神經元細胞存活之負調節劑之作用，與DR6異種接合子仔畜對照相比，在DR6缺乏脊髓及背根神經節中偵側到神經元細胞死亡減少約40%至50%。申請者亦已意外發現類澱粉前驅蛋白（APP)為DR6受體之同源配位體，且進一步發現APP起作用以經由DR6受體觸發軸突退化。先前已假設類澱粉前驅蛋白在阿茲海默氏症中起某些（儘管未充分瞭解）作用（Selkoe, J. C/zem. 271:18295 (1996) ; Scheuner ;等人，TVaiwre 2:864 (1996) ; Goate，等人，Naiwre 349:704 (1991))。申請者已進一步確定p75在一些環境中亦充當APP之受 146428.doc -44 - 201034684 體，但具有較小親和力（例如，藉由ELISA所測定，EC50= 約3 00 nM)(資料未圖示）。然而，在其他環境中，可量測得到稍南親和力。因此’咸信親和力係在約EC5〇=20-300 η Μ 之範圍内。

咸信DR6拮抗劑單獨或與ρ75拮抗劑組合將尤其適用於治療各種神經病症。因此本發明提供DR6拮抗劑組合物及抑制、阻斷或中和哺乳動物之DR6活性的方法，其包含投與有效量之DR6拮抗劑。較佳地，所用DR6拮抗劑之量將為有效阻斷軸突退化及神經元細胞死亡之量。此可根據例如下文及實例中所述之方法達成。本發明亦提供DR6拮抗劑及ρ 7 5 #抗劑組合物，及抑制、阻斷或中和哺乳動物之 DR6及ρ75活性之方法，其包含投與有效量之DR6拮抗劑及 ρ75拮抗劑。所用DR6拮抗劑及ρ75拮抗劑之量較佳將為有效阻斷軸突退化及神經元細胞死亡之量。可用於該等方法之DR6拮抗劑包括（但不限於）DR6及/或 ΑΡΡ免疫黏附素、包含DR6及/或ΑΡΡ之融合蛋白、DR6及/ 或ΑΡΡ之共價修飾形式、DR6及/或ΑΡΡ變體、其融合蛋白及DR6及/或ΑΡΡ抗體。可用於該等方法之ρ75拮抗劑包括 (但不限於）ρ75免疫黏附素、包含ρ75之融合蛋白、ρ75之共價修飾形式、ρ75變體、其融合蛋白，及ρ75抗體。抗ρ75 抗體可為任何在此項技術中已知者。本文中描述可用於製造拮抗劑之各種技術。舉例而言，描述用以製備DR6、 ρ75及ΑΡΡ多肽之方法及技術。亦描述DR6、ρ75及ΑΡΡ多肽之其他修飾，及DR6、ρ75及ΑΡΡ之抗體。 146428.doc -45 - 201034684 本文中揭示之本發明具有許多實施例。本發明提供抑制 DR6與APP結合之方法，其包含在DR6與APP之結合受抑制之條件下使DR6多肽及/或APP多肽暴露於一或多種DR6拮

抗劑。本發明之相關實施例提供抑制包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1-655的DR6多肽與包含SEQ ID NO: 6之胺基酸66-81的APP多肽（例如sAPPP)結合之方法，該方法包含組合 DR6多肽及APP多肽與結合DR6或APP之經分離拮抗劑，其中該經分離拮抗劑係選自結合APP之抗體、結合DR6之抗體及包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1-354的可溶性DR6多肽中之至少一者；且就該經分離拮抗劑抑制DR6與APP結合之能力對其加以選擇；以便抑制DR6與APP之結合。本發明亦提供抑制DR6與APP結合及抑制p75與APP結合之方法，其包含在DR6及p75與APP之結合受抑制之條件下使DR6多肽、p75多肽及視情況選用之APP多肽暴露於一或多種DR6拮抗劑及一或多種P75拮抗劑。本發明之相關實施例提供抑制包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1-655的DR6多肽與包含SEQ ID NO: 6之胺基酸66-81的APP多肽（例如sAPPp) () 結合之方法，該方法包含組合DR6多肽及APP多肽與結合 DR6或APP之經分離拮抗劑，及結合p75之拮抗劑，其中經分離DR6拮抗劑係選自結合APP之抗體、結合DR6之抗體及包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1-3 5 4之可溶性DR6多肽中之至少一者；且就抑制DR6與APP之結合的能力來選擇經分離DR6拮抗劑，以便抑制DR6與APP之結合。經分離p75拮抗劑係選自結合p75之抗體及包含p75之細胞外域之胺基酸 146428.doc -46- 201034684 (例如SEQ ID NO: 16之胺基酸29-250)的可溶性p75多肽中之至少一者；且就抑制p75與APP之結合的能力來選擇經分離p75拮抗劑；以便抑制p75與APP之結合。視情況在該等方法中，一或多種DR6拮抗劑係選自結合 DR6之抗體（例如結合DR6、競爭性抑制由分別以ATCC寄存編號PTA-8095、PTA-8094或PTA-8096寄存之融合瘤細胞株產生的3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7單株抗體的結合之抗體），包含8£(^10>10:1之胺基酸1-3 54的可溶性0116多 0 肽（例如DR6免疫黏附素）或結合APP之抗體（例如單株抗體 22C11)。在本發明之某些實施例中，DR6拮抗劑為結合 DR6之抗體、結合APP之抗體或與一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物連接的可溶性DR6多肽。p75拮抗劑亦可與一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物連接。在此等方法之視情況選用之實施例中，DR6多肽單獨或 Ο 與P75多肽組合表現於一或多種哺乳動物細胞（例如連合神經元細胞、感覺神經元細胞或運動神經元細胞）之細胞表面上，且該一或多種DR6拮抗劑及/或p75拮抗劑之結合抑制DR6活化或信號傳導及/或p75活化或信號傳導。在本發明之一此實施例中，活體外進行該方法以抑制一或多種單獨或與p75組合表現DR6的哺乳動物細胞之細胞凋亡以便在組織培養物中增強神經元細胞之生長及/或再生及/或存活。舉例而言，該等DR6拮抗劑及p75拮抗劑適用作組織 146428.doc •47- 201034684 培養基之活體外添加劑’例如彼等經設計以使神經元細胞培養物增殖者。特定言之，如在此項技術中所已知，歸因於該等細胞經歷細胞凋亡之趨勢’某些神經元細胞培養物之增殖可能成問題。一些神經元培養物在例如缺乏諸如神經生長因子之外源因子之情況下死亡。本文中提供之揭示内容展示DR6拮抗劑單獨或與p75拮抗劑組合可用於該等神經元細胞培養物以例如近乎於在該等培養物中使用神經生長因子之方式增強細胞生長及/或再生及/或存活。在本發明之其他實施例中，可在患有神經病狀或病症之哺乳動物中活體内進行抑制DR6及視情況選用之p75與App 結合之方法。視情況，該神經病狀或病症為肌萎縮性側索硬化、帕金森氏病、亨廷頓氏症或阿茲海默氏症。或者，該神經病狀或病症包含由於中風、大腦或脊髓組織外傷、或神經元組織病變導致之神經元細胞或組織損傷。本發明之其他實施例提供治療患有神經病狀或病症之哺乳動物之方法，其包含投與該哺乳動物有效量之一或多種單獨或與-或多種p75拮抗劑組合之DR6枯抗劑。通常，在該等方法中，該-或多種DR6拮抗劑係選自結合娜之抗體、包含SEQlDNO:】之胺基酸[354的可溶性⑽多肽、dr6免疫黏附素及結合App之抗體。該一或多種p⑽ 抗劑係選自結合p75之抗體、p75免疫黏附素及包含卿江紙之胺基酸29韻之可溶性ρ75多肽。在本發明之視情況選用之實施例中，神經病狀或病症為肌萎縮性側素硬化、帕金森氏病、亨廷頓氏症或阿兹海默氏症。或者，該 146428.doc -48- 201034684 神經病狀或病症包含由於中風、大腦或脊髓組織外傷、或神經元組織病變導致之神經元細胞或組織損傷。在本發明之各種實施例中，將一或多種其他治療劑投與該哺乳動物。在本發明之某些說明性實施例中，該一或多種其他治療劑係選自NGF、細胞凋亡抑制劑、EGFR抑制劑、β_分泌酶抑制劑、γ-分泌酶抑制劑、膽鹼酯酶抑制劑、抗Αβ抗體及NMDA受體拮抗劑。視情況，經由注射、輸液或灌注將該一或多種DR6拮抗劑、Ρ75拮抗劑及/或其他治療劑投與 0 哺乳動物。本發明之其他實施例提供鐘別所關注之抑制DR6與Αρρ 結合的分子之方法，該方法包含：在所關注之分子存在或不存在之情況下組合DR6與APP ;及隨後在該所關注之分子存在下偵測對DR6與APP結合之抑制。本發明之相關實施例提供測定組合物是否調節包含SEQ m N〇: 胺基酸 1-655(且視情況SEqidn〇:丨之胺基u54)的刪多狀與包3 SEQ ID Ν〇: 6之胺基酸66-81的ΑΡΡ多肽（例如〇 APP695、SAPP(^SAPPP)之間的結合之方法，該方法包含組合該組合物與DR6及ΑΡΡ ;及隨後比較在組合物存在下 DR6與ΑΡΡ之間的、结合與組合物不存在之情況下與Μ? 之間的結合；以便測定組合物是否調節DR6與Αρρ之間的結合。視情況，經由表面電聚共振（spRm術（如自心咖 Life Sciences獲得）量測該等方法中之結合差異。本發明之實施例進-步包括根據此等方法鑑別之所關注之分子。本毛月之其他實施例包括診斷患有神經病症或易患神經 146428.doc -49- 201034684 病症之患者的方法，其包含自患料得樣本及㈣樣本中具有與SEQ ID N0:丨之0如多肽序列不同的多肽序列之 DR6多肽變體的存在。視情況，料方法進—步包含鑑別該多肽變體為對APP多肽具有與所觀測到之對SEQmN〇 1之DR6多肽序列的親和力不同之親和力。本發明之相關實施例包括測定包含SEQ IDNO: 胺基酸1 655的〇116之多肽變體是否存在於哺乳動物中之方法，該方法包含比較哺乳動物中所表現之DR6多肽之序列與SEQ ID Ν〇: ι以便測定DR6之多肽變體是否存在於哺乳動物中。此等方法之某些實施例可包括鑑別經觀測作為App結合變體存在於哺乳動物中之多肽變體之其他步驟，其中APP結合變體之特徵在於對包含SEQ ID NO: 6之胺基酸66_81的類澱粉前驅蛋白（APP)多肽（例如APP695、sAPPa或ΑΡΡβ)具有不同於包含SEQ ID NO: 1之DR6多肽對包含SEQ ID N〇: 6之胺基酸66-81的APP多肽之結合親和力的結合親和力。視情況，經由表面電漿共振（SPR)技術（如自Biacore Life Sciences獲得）量測該等方法中之結合親和力差異。此等方法之一些實知例可包括選擇個別患者之步驟，如具有在肌萎縮性側索硬化、帕金森氏病、亨廷頓氏症或阿茲海默氏症中觀測到之症狀或病狀的患者。除本文中所描述之全長原生序列DR6、p75及APP多肽外’預期可製備DR6、p75及APP多肽變體。可藉由將適當核普酸變化引入編碼DNA及/或藉由合成所需多肽來製備 DR6、P75及/或APP變體。熟習此項技術者應瞭解，胺基 146428.doc •50· 201034684 酸變化可改變DR6、p75及/或APP多肽之轉譯後加工，諸如改變糖基化位點之數目或位置或改變膜錫定特徵。可例如使用闡述於例如美國專利第5,364,934號中之保守及非保守突變之任何技術及指導原則進行本文中所描述之 DR6、p75及/或APP多肽之變異。變異可為編碼與原生序列多肽相比產生胺基酸序列變化的多肽之一或多個密碼子之取代、缺失或插入。視情況，藉由在DR6、p75及/或 APP多肽之一或多個域中以任何其他胺基酸取代至少一個 ❹胺基酸進行變異。可藉由比較DR6、p75及/或APP多肽之序列與同源已知蛋白質分子之序列且使高同源性區域中所發生之胺基酸序列變化的數目最少，來發現確定可插入、取代或缺失何種胺基酸殘基而不對所需活性產生不利影響的指導原則。胺基酸取代可為以另一具有相似結構及/或化學特性之胺基酸置換一個胺基酸之結果，諸如以絲胺酸置換白胺酸，亦即保守胺基酸置換。插入或缺失可視情況在約I至5個胺基酸之範圍内。可藉由在序列中系統地進行〇胺基酸之插入、缺失或取代且測試所得變體之DR6、p75 及/或APP拮抗活性來確定所允許之變異。本文中提供DR6、p75及/或APP多肽片段。例如當與全長天然蛋白質相比時’該等片段可在N端或C端經截短，或可缺乏内部殘基。某些片段缺乏對DR6多肽之所需生物活性並非必需的胺基酸殘基。可藉由§午多習知技術中之任一種製備DR6、p75及/或 APP多肽片段。可化學合成所需肽片⑫。替代方法包括藉 146428.doc 51 201034684 由酶促消化產生多肽片段，例如藉由以已知在由特定胺基酸殘基界定之位點裂解蛋白質之酶處理蛋白質，或藉由以適當限制酶消化DNA且分離所需片段。另一適當技術包括藉由聚合酶鏈反應（PCR)分離及擴增編碼所需多肽片段之 DNA片段。在PCR中對於5'及3'引子採用界定DNA片段之所需末端之寡核苷酸。在特定實施例中，所關注之保守性取代展示於下表中較佳取代之標題下。若該等取代導致生物活性變化，則引入更實質變化（在表中命名為「例示性取代」，或如下所述關於胺基酸類型進一步描述）且筛選該等產物。原始殘基例示性取代較佳取代 Ala (A) val ； leu ； ile val Arg(R) lys ; gin ; asn lys Asn (N) gin ; his ; lys ; arg gin Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gin (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro ; ala ala His (H) asn ; gin ; lys ; arg arg He (I) leu ; val ; met ; ala ; phe ;正白胺酸 leu Leu (L) 正白胺酸；ile ; val ; met ; ala ; phe ile Lys (K) arg ； gin ； asn arg Met (M) leu ; phe ; ile leu Phe (F) leu ； val ； ile ； ala ； tyr leu Pro (P) ala ala Ser(S) thr thr 146428.doc •52- 201034684

Thrm ser .. cpt· ΤφΟλΠ tyr ·’ phe tvr _ Tyr(Y) trp ； phe ； thr ； ser -~-- νΑ nhp Val (V) ile ; leu ; met ; phe ; ala ;正 leu -- --- 白胺酸. a f π I土 < ι，貝 ι 贫飾係藉由選擇對於保持以下特性具有顯著不同效應之取代來實現：（a)取代區域内多肽主鏈之結構，例如呈摺疊片或 Ο 螺旋構型；（b)該分子在目標位點之電荷或疏水性；或側鏈之體積。基於常見側鏈特性可將天然存在之殘基分

(1) 疏水性.正白胺酸、met、ala、val、leu、ile ; (2) 中性親水性：cys、ser、thr ; (3) 酸性：asp、glu ; (4) 鹼性：asn、gln、his、iys、arg ; (5) 影響鏈取向之殘基：gly、pr〇 ;及 (6) 方族：trp、tyr、phe。非保守性取代將需要使該等類別中之一者之成員更換為另一類別。亦可將該等取代殘基引入保守性取代位點中，或更佳引入其餘（非保守）位點中。可使用在此項技術中已知之方法，諸如寡核苷酸介導 (定點）之突變誘發、丙胺酸掃描及PCR突變誘發進行變 ” 了對選殖之DNA執行定點突變誘發（Carter等人，7VW/. 心必及仏，13:4331 (1986) ; Zoller等人，Wc?/· Jc 油 h·， 10:6487 (1987))、卡匣突變誘發（Wells等人，仏如，34:315 146428.doc -53· 201034684 (1985))、限制性選擇突變誘發（Wells等人，尸/π·/〇·5. TVam 兄Socr. Sed, 317:415 (1986))或其他已知技術以產生DR6多肽變體DNA。亦可採用掃描胺基酸分析來鑑別毗連序列中之一或多個胺基酸。較佳掃描胺基酸為相對較小之中性胺基酸。該等胺基酸包括丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸及半胱胺酸。在此組中丙胺酸通常為較佳掃描胺基酸，因其消除超出β碳之側鏈且較不可能改變變體之主鏈構形（Cunningham及Wells, 244:1081-1085 (1989))。丙胺酸亦通常較佳，因其為最常見之胺基酸。此外，其常見於内埋及暴露位置兩者（Creighton, 77ze Proiez.w·?, (W.H. Freeman & Co·, N.Y·); Chothia，J. Mo/.价〇/., 150:1 (1976))。若丙胺酸取代未得到足夠量之變體，則可使用電子等排胺基酸。任何不參與維持DR6、p75及/或APP多肽之適當構形之半胱胺酸殘基亦可通常經絲胺酸取代以提高分子之氧化穩定性且防止異常交聯。相反，可將半胱胺酸鍵添加至 DR6、p75及/或APP多肽中以提高其穩定性。本文中揭示之本發明實施例適用於多種APP多肽。在本發明之某些實施例中，例如APP為圖1B-1D中所示之全長 695、750或770 APP同功異型物。在本發明之其他實施例中，APP包含APP之具有APP胞外域且為由轉譯後加工事件產生者（例如sAPPa或sAPPp)的N端部分。視情況’例如 APP可包含由分泌酶裂解產生之695、750或770 APP同功異型物中之一者的可溶形式，例如由β-分泌酶裂解產生之 146428.doc -54- 201034684 神經元APP695之可溶形式。在一特定說明性實施例中， APP包含APP695之胺基酸20-591(參見例如jin等人，·/. 14(9): 5461-5470 (1994))。在本發明之另一實施例中，APP包含具有由單株抗體22C11識別之抗原決定基之多肽（例如如可自 Chemicon International Inc.，Temecula， CA, U.S.A.獲得）。視情況，APP包含APP695之殘基66-81，其為含有22C11抗原決定基之區域（參見例如Hilbrich，J. 出〇/. C/jem. 268(35):26571-26577 (1993))。 0 下文之描述主要係關於藉由培養經含有編碼DR6、p75 及/或APP多肽之核酸的載體轉型或轉染之細胞產生DR6、 p75及/或APP多肽。當然預期可採用在此項技術中熟知之替代性方法來製備DR6、p75及/或APP多肽。舉例而言，可藉由使用固相技術之直接肽合成法來產生適當胺基酸序列或其部分（參見例如Stewart等人，Pepifi/e Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)； Merrifield，/. dw. C/zew. iSoc·，85:2149-2154 (1963))。可使〇用人工技術或藉由自動裝置進行活體外蛋白質合成。可例如使用 Applied Biosystems 肽合成儀（Foster City, CA)使用製造商之說明實現自動合成。可獨立地化學合成DR6及/或 APP多肽之各種部分且使用化學或酶促方法將其組合來產生所需DR6、p75及/或APP多肽。所述方法及技術可類似地應用於產生DR6、p75及/或 APP變體、DR6、p75及/或APP之經修飾形式；及DR6、 p75及/或APP抗體。 146428.doc -55· 201034684

分離編碼DR6及/或APP多肽之DNA 編碼DR6、p75及/或APP多肽之DNA可獲自由認為具有 DR6、p75及/或APP多肽mRNA且以可偵測量表現其的組織製備之cDNA文庫。因此，人類DR6、p75及/或APP多肽 DNA可便利地獲自由人類組織製備之cdNA文庫。DR6、 p75及/或APP多肽編碼基因亦可獲自基因組文庫或藉由已知合成程序獲得（例如自動核酸合成）。可以經設計以鑑別所關注之基因或其所編碼之蛋白質的探針（諸如具有至少約20-80個鹼基之寡核苷酸）篩選文庫。可使用諸如 Sambrook等人，Mo/ecw/ar 4 少

Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中描述之標準程序以所選探針來篩選cDNA或基因組文庫。分離編碼DR6多肽之基因的替代方法係使用PCR方法（上文之 Sambrook等人；Dieffenbach 等人，尸Ci? A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1 995))。篩選cDNA文庫之技術為此項技術中所熟知。選用作探針之寡核苷酸序列應具有足夠長度及足夠明確性以使假陽性最小。寡核苷酸較佳經標記以使得雜交至所篩選之文庫中的DNA後可偵測。標記之方法為此項技術中所熟知且包括使用如經32P標記之ATP的放射性標記、生物素化或酶標記。包括中度嚴格性及高度嚴格性之雜交條件提供於上文之Sambrook等人中。在該等文庫篩選法中鑑別出之序列可與在諸如GenBank 146428.doc -56- 201034684 之公共資料庫或其他私人序列資料庫中寄存且可獲得之其他已知序列比較及比對。可使用在此項技術中已知且如本文中所描述之方法確定分子之確定區域内或整個全長序列内之序列一致性（在胺基酸或核苷酸層面）。可藉由篩選所選cDNA或基因組文庫，首次使用本文中揭示之推斷胺基酸序列且必要時使用如上文之Sambrook等人中所述的習知引子延伸程序來獲得具有蛋白質編碼序列之核酸，以偵測可能未逆轉錄為cDNA的mRNA之前驅體及加工中間物。宿主細胞之選擇及轉型以本文中關於DR6、p75及/或APP多肽製備所描述之表現或選殖載體轉染或轉型宿主細胞且將該等細胞在適當時經改良以供誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因的習知培養基中培養。熟習此項技術者可在不進行過度實驗之情況下選擇諸如培養基、溫度、pH值及其類似因素之培養條件。通常，用以使細胞培養物之生產率最大〇化的原理、方案及實施技術可見於MAMMALIAN CELL BIOTECHNOLOGY: A PRACTICAL APPROACH, M. Butler 編（IRL Press，1991)及上文之Sambrook等人中。真核細胞轉染及原核細胞轉型之方法為一般技術者所已知，例如CaCl2、CaP04、脂質體介導及電穿孔。視所用宿主細胞而定，使用適合於該等細胞之標準技術進行轉型。對於原核生物通常使用如上文之Sambrook等人中所述採用氯化妈之4弓處理或電穿孔。如Shaw等人，Gewe, 23:3 15 146428.doc -57- 201034684 (1983)及1989年6月29日公開之WO 89/05859中所述，以根癌土壤桿菌感染用於某些植物細胞之轉型。對於無該等細胞壁之哺乳動物細胞，可採用 Graham及 van der Eb，52:456-457 (1978)之破酸鹽沈澱法。哺乳動物細胞宿主系統轉染之一般態樣已描述於美國專利第4,399,216號中。轉型至酵母中通常根據Van Solingen 等人，/· 5aci·，130:946 (1977)及 Hsiao 等人， Proc. TVai/. Jcad. <SW. 76:3829 (1979)之方法進行。然而，亦可使用諸如藉由核顯微注射、電穿孔、與完整細胞之細菌原生質體融合或聚陽離子（例如聚凝胺、聚鳥胺酸）將DN Α引入細胞中之其他方法。對於轉型哺乳動物細胞之各種技術，參見 Keown 等人，A/W/ίθΰ^ in Enzymology, 185:527-537 (1990)及 Mansour 等人，TVaiwre, 336:348-352 (1988)。用以選殖或表現本文載體中DNA之適當宿主細胞包括原核生物、酵母或較高等真核生物細胞。適當原核生物包括 (但不限於）真細菌，諸如革蘭氏陰性（Gram-negative)或格蘭氏陽性（Gram-positive)生物體，例如腸内菌科 (Enterobacteriaceae)，諸如大腸桿菌（£. co/z·)。各種大腸桿菌菌株可公開獲得，諸如大腸桿菌K12菌株MM294 (ATCC 31,446);大腸桿菌XI776 (ATCC 31,53 7);大腸桿菌菌株 W3110 (ATCC 27,3 25)及 K5 772 (ATCC 53,63 5)。其他適當原核宿主細胞包括腸内菌科，諸如埃希氏菌屬，例如大腸桿菌；腸桿菌屬（五; 146428.doc -58 - 201034684 歐文菌屬（五rwzWa);克雷伯氏菌屬;變形桿菌屬（Proiews);沙門氏菌屬（5*α/»ί〇«β//β)，例如鼠傷寒沙門菌 (Sa/mo^ie/Za ί少p/n'wwriww);沙雷氏菌屬（《Serraifa) ’ 例如黏質沙雷菌（Serraiz'a wareacawi); 及志賀氏菌屬 (灿/ge//i〇 ;以及芽胞桿菌屬（心^7/〇，諸如枯草芽孢桿菌 (5. ·?Μ0"·/ζ·ί)及地衣芽抱桿菌（5. 例如，1989 年4月12日公開之DD 266,710中揭示之地衣芽抱桿菌 41P);假單胞桿菌屬，諸如綠膿桿菌（尸. ^ ;及鏈黴菌（Sirepiowiyces)。此等實例為說明性而非限制性實例。菌株W3 110為一個尤其較佳之宿主或親本宿主，此係因為其為用於重組DNA產物醱酵之常見宿主菌株。較佳地，宿主細胞分泌最小量之蛋白質水解酶。舉例而言，菌株W3110可經改良以在編碼宿主内源性蛋白質之基因中實現遺傳突變，該等宿主之實例包括大腸桿菌 W3110菌株1A2,其具有完整基因型;大腸桿菌W3110 菌株9E4，其具有完整基因型pirJ ;大腸桿菌W3 11 〇〇菌株27C7 (ATCC 55,244)，其具有完整基因型以以 phoA El5 (argF-lac)169 degP ompT kanr ’，大腸得菌菌株37D6，其具有完整基因型iowdpirip/zod五/5 (arg尸-/izc) deg尸 om/?rrZ)s7 z7vG A：a«r;大腸桿菌 W3110 菌株 40B4，其為具有非卡那黴素（non-kanamycin)抗性rfegp缺失突變之菌株37D6 ;及揭示於1990年8月7曰頒予之美國專利第4,946,783號中具有突變型周質蛋白酶之大腸桿菌菌株。或者，例如PCR或其他核酸聚合酶反應之活體外選殖方法 146428.doc -59- 201034684 為適當的。除原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物亦為DR6多肽編碼載體的適當選殖或表現宿主。釀酒酵母 (Sacc/mromyee·? 為通常使用之較低等真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母 pom6e)(Beach及Nurse, (1981) TVaiMre，290: 140; 1985年 5 月2曰公開之EP 139,383);刻魯維酵母（K/Mjveromyce·?)宿主（美國專利第 4,943,529 號；Fleer等人 ’ 5zo/：Tec/2«i?/ogy， 9:968-975 (1991))，諸如乳酸刻魯維酵母（尺· /aciis)

D (MW98-8C、CBS683、CBS4574 ; Louvencourt 等人，7· 5ac^Ho/.，154 (2):737-742 (1983))、脆壁刻魯維酵母（尤· /rag"h)(ATCC 12,424)、保加利亞刻魯維酵母（尤. bulgaricus)(ATCC 16,045)、魏氏刻魯維酵母（尺· wicA:eram/z')(ATCC 24,178)、（【W(3"“）（ATCC 56,500)、果繩刻魯維酵母（A". i/rosop/n./arwmKATCC 36,906 ; Van den Berg等人，5z’o/Tec/mo/og_y, 8:135 (1990))、耐熱刻魯維酵母（Κ· i/zerwoio/era”·?)及馬克斯刻魯維酵母（尤.^ marxia«M«s);耶氏酵母（_yarrovWa)(EP 402,226);巴斯德畢赤酵母pasiorbMEP 183,070; Sreekrishna等人，/·

Basic Microbiol.，28:265-278 (1988)) ; ϋ /¾ {Candida) ί 里氏木黴（TWe/zoi/erwa λ*ββ·5ζ·β)(ΕΡ 244,234);粗縫脈孢菌 (Neurospora crassa)、Case 專 k，Proc. Natl. Acad. Sci, tASyi，76:5259-5263 (1979));許旺酵母（iSc/zwawm'omjces)，諸如西方許旺酵母（<Sc/zw<3«m-ow 少 cei ¢^£^¢^^^/4)(1990 年 146428.doc -60- 201034684 1。月31日公開之EP 394,53 8);及絲狀真菌，諸如鏈孢黴屬 (Neurospora) ' 青徽屬(Penicillium)、彎頸徽菌 (Ζ·〇/>77〇£?/αί/ζ_Μ»2)(1991年 1月 10 曰公開之WO 91/00357)及麵黴屬宿主，諸如構巢麯黴（丄《，如/⑽·?） (Ballance等人，（1983) 112:284-289 ; Tilburn等人，（1983) Ge«e，26:205-221 ; Yelton等人，（1984) Proc. ΛΓαίΖ. Jca乂 SW. C/U，81: 1470-1474)及黑麯黴（儿 mger)(Kelly 及 Hynes, (1985)五M50 乂， 0 4:475-479)。曱醇酵母在本文中為適當的且包括（但不限於）能夠在甲醇上生長之酵母，其係選自由漢森酵母 (Hansenula)、念或議、免勒免酵母（Kloeckera)、畢赤酵母 (P/c/π’α)、酵母（Sacc/mrowyce·?)、球擬酵母（Tbrw/opsi·?)及紅酵母組成之屬。例示此類酵母之特定物種之清單可見於 C. Anthony, The Biochemistry of Mei/zy/oirop/zj1，269 (1982)中。適用於表現糖基化DR6、p75及/或APP多肽之宿主細胞〇係來源於多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括昆蟲細胞，諸如果蠅S2及夜蛾Sf9，以及植物細胞，諸如棉花、玉米、馬鈐薯、大豆、矮牵牛、西紅柿及煙草之細胞培養物。已鑑別出許多桿狀病毒株及變體及諸如草地黏蟲 (Spodoptera frugiperda)(毛義）、埃反伊蚊（Aedes aegypti) (蚊子）、白紋伊蚊a/hop/ciMs)(蚊子）、黑腹果繩 (Drosop/n'/a (果蝶）及家蠶worz·)之宿主之相應許可昆蟲宿主細胞。多種用於轉染之病毒株可公 146428.doc -61 - 201034684 開獲得’例如苜稽銀紋夜蛾ca///or«z’ca)NPV 之L-1變體及家蠶NPV之Bm-5病毒株，且根據本發明該等病毒在本文中可用作尤其用以轉染草地黏蟲細胞之病毒。然而’最關注脊椎動物細胞，且培養物（組織培養物）中脊椎動物細胞之增殖已成為常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉型之猴腎CV1細胞株（COS-7、 ATCC CRL 165 1);人類胚腎細胞株(293或經次選殖以在懸浮培養物中生長之293細胞，Graham等人，乂 F/ro/. 3 6:59 (1977));幼倉鼠腎臟細胞（ΒΗΚ，ATCC CCL 10); 中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，iVoc. ΛΓαί/. Acad. Scz·· 77:4216 (1980));小鼠足細胞（TM4，

Mather, 5b/· Λ 印 23:243-251 (1980));猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-15 87);人類子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2);犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34);布法羅（buffalo)大鼠肝細胞 (BRL 3A，ATCC CRL 1442);人類肺細胞（W138，ATCC CCL 75);人類肝細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳房腫瘤 (MMT 060562，ATCC CCL51) ； TRI 細胞（Mather 等人， (1982) Annals N.Y. Acad. Sci. 3 83:44-68) ; MRC 5 細胞； FS4細胞；及人類肝癌細胞株（Hep G2)。以上述用於DR6及/或APP多肽製備之表現或選殖載體轉型宿主細胞且將該等細胞在適當時經改良以供誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因的習知培養基中培養。 146428.doc -62- 201034684 可複製載體之選擇及使用可將編碼DR6、p75及/或APP多肽之核酸（例如cdNA或基因組DNA)插入用以選殖（擴增DNA)或表現之可複製載體中。各種載體可公開獲得。載體可例如呈質體、黏質體、病毒顆粒或噬菌體之形式。可藉由多種程序將適當核酸序列插入載體中。通常，使用在此項技術中已知之技術將 DNA插入適當限制酶位點中。載體組份通常包括（但不限於）信號序列、複製起點、一或多種標記基因、強化子組 0 件、啟動子及轉錄終止序列中之一或多種。含有一或多種此等組份之適當載體的構築採用熟習此項技術者已知之標準連接技術。 DR6、P75及/或APP不僅可直接、而且亦以與異源多肽之融合多肽形式重組產生，該異源多肽可為信號序列或其他在成熟蛋白質或多肽之N端具有特定裂解位點之多肽。通常，信號序列可為載體之組份或其可為插入載體中的 DR6、P75及/或APP多肽編碼DNA之一部分。信號序列可〇為選自例如鹼性磷酸酶、青黴素酶、1PP或熱穩定型腸毒素II刮導序列之群組的原核信號序列。對於酵母分泌，作號序列可為例如酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列（包括酵母及刻魯維酵母α-因子前導序列，後者描述於美國專利第5,010，182號中）或酸性磷酸酯酶前導序列，白色念珠菌（C. ⑽?)葡糖澱粉酶前導序列（1990年4月4曰公開之 ΕΡ 362，179)或描述於1990年11月15日公開之|〇 9〇/13646 中的信號。在哺乳動物細胞表現中，可使用哺乳動物信號 146428. doc •63- 201034684 序列來指導蛋白質之分泌，諸如來自相同或相關物種之分泌多肽以及病毒分泌前導序列之信號序列。表現與選殖載體均含有使得栽體能夠在一或多種所選宿主細胞中複製之核酸序列。熟知多種細菌、酵母及病毒之該等序列。質體PBR322之複製起點適合於多數革蘭氏陰性細菌’ 2μ質體起點適合於酵母，且各種病毒起點 (SV40、多形瘤、腺病毒、VSV或BPV)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。表現及選殖載體通常含有亦稱為可選擇標記之選擇基因。典型選擇基因編碼（a)賦予對例如胺节青徽素 (ampicillin)、新徽素（neomycin)、甲胺嗓吟（methotrexate) 或四環素（tetracycline)之抗生素或其他毒素之抗性；（b)補足營養缺陷型缺陷；或（c)供應自複合培養基不可獲得之關鍵營養素（例如編碼芽胞桿菌之D-丙胺酸消旋酶之基因）的蛋白質。哺乳動物細胞之適當可選擇標記之實例為使得能夠鑑別勝任吸收DR6、p75及/或APP多肽編碼核酸之細胞者，諸如DHFR或胸苷激酶。當採用野生型DHFR時，適當宿主細胞為缺乏DHFR活性之CHO細胞株，其如Urlaub等人， Proc. y以，77:4216 (1980)所述製備及增殖。適用於酵母之適當選擇基因為存在於酵母質體YRp7 中之 ir〆基因（Stinchcomb 等人，282:39 (1979); Kingsman 等人 ’ 7:141 (1979) ; Tschemper 等人， 10:157 (1980))。irp 7基因為缺乏在色胺酸中生長之 146428.doc •64- 201034684 能力的酵母之突變株（例如ATCC第44076號或第PEP4-1號）提供選擇標記（Jones，85:12 (1977))。表現及選瘦載體通常含有與DR6、P75及/或APP多肽編碼核酸序列可操作地連接之啟動子以指導mRNA合成。熟知由多種潛在宿主細胞識別之啟動子。適用於原核宿主之啟動子包括P-内醯胺酶及乳糖啟動子系統（Chang等人， (1978) 275..615 ; Goeddel 等人，（1979) 281:544 )、鹼性磷酸酶、色胺酸（trp)啟動子系統（G〇eddel，〇 1 必及以.，8:4057 (1980) ; EP 36,776)及雜交啟動子’諸如tac啟動子（deBoer等人，iVoc.編".心ζ·. 80:21-25 (1983))。適用於細菌系統之啟動子亦含有與編碼DR6、p75及/或APP多肽之DNA可操作地連接的 Shine-Dalgarno(S.D.)序列。適用於酵母宿主之啟動序列之實例包括3_磷酸甘油酸激酶（Hitzeman等人，J.价〇/· 〇^册·，255:2073 (1980))或其他糖解扭（Hess專人’ Jc/v.五似少及叹·，7:149 (1968); O Holland，价oc/zemkir少，17:4900 (1978))之啟動子，該等其他糖解酶為諸如烯醇化酶、甘油醛_3_磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖_6_磷酸異構酶、 3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、麟酸葡糖異構酶及葡糖激酶。其他為具有由生長條件控制之另一轉錄優勢之誘導型啟動子的酵母啟動子為醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性碟酸酯酶、與氮代謝相關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛_3 _磷 146428.doc -65- 201034684 酸脫氫酶及負貝麥芽糖及半乳糖利用之酶之啟動子區。適用於酵母表現之載體及啟動子進—步描述於Ep73,657中。利用例如獲自以下之啟動子來控制DR6、卩乃及/或多肽在哺乳動物宿主細胞中自載體之轉錄：諸如多形瘤病毒、禽癌病毒（1_年7月5日公開之收腺病毒（諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、細胞巨大病毒逆轉錄病毋、8型肝炎病毒及猿猴病毒4〇(SV4〇)之病毒的基因組，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子 ^異源哺乳動物啟動子，及熱休克啟動子，限制條件為該等啟動子與宿主細胞系統相容。可藉由將強化子序列插入載體中來增加編碼DR6、p75 及/或APP多肽之DNA在較高等真核生物中之轉錄。強化子為通常約10至300 bp之DNA之順式作用組件，其作用於啟動子以增加其轉錄。現自哺乳動物基因（珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白（alpha_fet〇pr〇tein)及胰島素）已知許多強化子序列。然而，通常使用來自真核細胞病毒之強化子。實例包括複製起點之晚期側上的強化子（bp 100-270)、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、複製起點之晚期側上的多形瘤強化子及腺病毒強化子。強化子可剪接入載體中DR6、P75及/或APP多肽編碼序列之5，或3，位置，但較佳位於啟動子5,端之位點。用於真核宿主細胞（酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或來自其他多細胞生物體之有核細胞）之表現載體亦含有終止轉錄及使mRNA穩定所必需的序列。該等序列通 146428.doc •66- 201034684 常可自真核或病毒DNA或cDNA之5'且有時3’非轉譯區獲得。此等區域含有轉錄為編碼DR6多肽之mRNA的非轉譯部分中之多聚腺嘌呤化片段之核苷酸片段。其他適於配合在重組脊椎動物細胞培養物中合成DR6、 p75及/或APP多肽的方法、載體及宿主細胞描述於Gething 等人，TVaiMre, 293:620-625 (1981) ; Mantei等人，iWziwre， 281:40-46 (1979) ; EP 117,060 ;及 EP 117,058 中。培養宿主細胞 0 可在多種培養基中培養用以產生本發明之DR6、p75及/ 或APP多肽的宿主細胞。諸如漢姆FlOCHam's F10)(Sigma)、最低必需培養基（MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜貝卡改良伊格爾培養基（Dulbecco's Modified Eagle’s Medium)(DMEM)(Sigma)之市售培養基適合於培養宿主細胞。此外，Ham等人，Μ以Λ. 58:44 (1979) ; Barnes等人，•价oc/ze所.102:255 (1980);美國專利第 4,767,704號；第 4,657,866號；第 4,927,762號； €) 第 4,560,655 號；或第 5,122,469 號；WO 90/03430 ; WO 87/00195 ;或美國專利參考案30,985中所述之任何培養基可用作宿主細胞之培養基。必要時，任何該等培養基可補充有激素及/或其他生長因子（諸如胰島素、運鐵蛋白或上皮生長因子）、鹽（諸如氯化納、妈、鎂及填酸鹽）、緩衝劑 (諸如HEPES)、核苷酸（諸如腺苷及胸苷）、抗生素（諸如 GENTAMYCINtm藥物）、微量元素（定義為通常以微莫耳濃度範圍内之最終濃度存在之無機化合物）及葡萄糖或等效 146428.doc -67- 201034684 能量來源。亦可以熟習此項技術者已知之適當濃度包括任何其他必要補充物。諸如溫度、pH值及其類似因素之培養條件為彼等先前用於經選擇以供表現之宿主細胞的培養條件，且對一般技術者而言將顯而易見。偵測基因擴增/表現可在樣本中藉由例如習知南方墨點法（Southern blotting)、定量mRNA之轉錄之北方墨點法（Northern blotting)(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980))、點印跡法（dot blotting)(DNA分析）或原位雜交，使用經適當標記之探針基於本文中提供之序列來直接量測基因擴增及/或表現。或者，可採用可識別包括DNA 雙鏈體、RNA雙鏈體及DNA-RNA雜交雙鏈體或DNA-蛋白質雙鏈體之特定雙鏈體之抗體。抗體接著可經標記且可進行檢定，其中使雙鏈體結合至表面，以便雙鏈體在表面上形成後，可偵測結合至雙鏈體之抗體的存在。或者，可藉由諸如細胞或組織切片之免疫組織化學染色及細胞培養物或體液之檢定的免疫學方法量測基因表現，以直接定量基因產物之表現。適用於免疫組織化學染色及/或樣本流體檢定之抗體可為單株或多株抗體，且可在任何哺乳動物中製備。便利地，可製備針對原生序列DR6 多肽或針對基於本文中提供之DR6序列的合成肽或針對融合至DR6 DNA且編碼特定抗體抗原決定基之外源序列的抗體。 DR6多肽之純化 146428.doc -68 - 201034684 可自培養基或自宿主細胞溶解產物回收DR6、p75及/或 APP多肽之形式。若與膜結合，則可使用適當清潔劑溶液 (例如曲通_X l〇〇(Triton-X 100))或藉由酶促裂解使其自模釋放。可藉由各種物理或化學方法破壞DR6多肽表現中所使用之細胞，該等方法為諸如凍融循環、音波處理、機械破壞或細胞溶解劑。可能需要自重組細胞蛋白質或多肽純化DR6、p75及/或 APP多肽。以下程序例示適當純化程序：經離子交換柱分級分離；乙醇沈澱；逆相HPLC ;經二氧化矽或諸如DEAE 之陽離子交換樹脂層析；層析聚焦；SDS-PAGE ;硫酸銨沈澱；使用例如Sephadex G-75之凝膠過濾；使用蛋白質A 瓊脂糖管柱以移除諸如IgG之污染物；及結合DR6及/或 APP多肽之經抗原決定基標籤標記形式之金屬螯合管柱。可採用各種蛋白質純化方法且該等方法為在此項技術中所已知且描述於例如Deutscher, ζ·«五似少182 (1990) ; Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE，Springer-Verlag，New York (1982)中。所選純化步驟將視例如所用製備方法及所產生之特定DR6多肽之性質而定。可採用DR6、p75及/或APP之可溶形式作為本發明方法中之DR6拮抗劑或p75拮抗劑。DR6、p75及/或APP之該等可溶形式可包含如下所述之修飾（諸如融合至免疫球蛋白、抗原決定基標籤或白胺酸拉鏈）。進一步預期免疫黏附素分子可用於本文之方法中。DR6、p75及/或APP免疫 14642S.doc -69- 201034684 黏附素可包含DR6、P75及/或APP之各種形式，諸如dR6、 P75及/或APP之全長多肽以及可溶性細胞外域形式或其片段。在特定實施例中’分子可包含DR6多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白之特定區域的融合體。對於免疫黏附素之二價形式，該融合體可融合至IgG分子之Fc區。1§融合體較佳包括多肽之可溶（跨膜域經缺失或失活）形式之取代，來替代Ig分子中之至少一個可變區。在一尤其較佳實施例中’免疫球蛋白融合體包括IgGi分子之鉸鏈、CH2及 CH3，或鉸鏈、CH1、CH2&CH3區。對於產生免疫球蛋白融合體，亦參見1995年6月27日頒予之美國專利第 M28,130 號及 Chamow等人，14:52_6〇(1996)。視情況選用之免疫黏附素設計組合黏附素之結合域（例如DR6、p75及/或APP胞外域）與免疫球蛋白重鏈之Fc區。通㊉，當製備本發明之免疫黏附素時，編碼黏附素之結合域的核酸將融合至編碼免疫球蛋白恆定域序列之N端之核酸的C端’然而亦可能融合於n端。通常，在該等融合體中，所編碼嵌合多肽將保留免疫球蛋白重鏈之恆定區的至少功能上有效之鉸鏈、Ch2及Ch3 域。亦對恆定域之Fc部分的c端或緊接重鏈之以丨的^^端或輕鏈之相應區域進行融合。進行融合之精確位點並不關鍵；熟知特定位點且其可經選擇以優化免疫黏附素之生物活性、分泌或結合特徵。在一較佳實施例中，將黏附素序列融合至免疫球蛋白 G1(IgGl)Uc區的N端。可將整個重鏈恆定區融合至黏附 14642S.doc -70- 201034684 素序列。然而’更佳地’在融合中使用在鉸鏈區中僅在化學上界定IgG Fc之木瓜蛋白酶裂解位點（亦即殘基2丨6，令重鏈恆定區之第一個殘基為丨14)之上游或其他免疫球蛋白之類似位點開始的序列。在一尤其較佳實施例中，將黏附素胺基酸序列融合至IgG重鏈之（a)鉸鏈區及Ch2&Ch3 ;或 (b)CHl、鉸鏈、CH2 及 CH3 域。對於雙特異性免疫黏附素，免疫黏附素經組裝成多聚體且尤其組裝成雜二聚體或雜四聚體。通常，此等所組裝之〇免疫球蛋白將具有已知單元結構。基本4鏈結構單元係呈 IgG、IgD及IgE所存在之形式。在較高分子量免疫球蛋白中4鏈單元重複；IgM通常以藉由雙硫鍵保持在一起之4個基本單元的五聚體开）式存在。IgA球蛋白及有時igG球蛋白亦可在血清中以多聚形式存在。在多聚體之情況下，4個單元中之各者可相同或不同。在本文之範疇内將各種例示性經組裝免疫黏附素示意性圖示如下： ❹ （a) ACl-ACl ; (b) ACH-(ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH 或 VLCL-ACH); (c) acl-ach-(acl-ach、acl-vhch、vlCl_ACj^VlCl_

VhCh); ⑷ ACL-VHCH-(ACH 或 ACl-VhCh 或 VLCL-ACH); (e) VlCl-ACh-(ACl-VhCh或 VLCL-ACH);及 (f) (A-Y)n-(VLCL-VHCH)2 ；其中各A表示相同或不同黏附素胺基酸序列； 146428.doc •71- 201034684 vL為免疫球蛋白輕鏈可變域；

Vh為免疫球蛋白重鏈可變域； cL為免疫球蛋白輕鏈怪定域；

Ch為免疫球蛋白重鏈怪定域； η為大於1之整數； Υ表示共價交聯劑之殘基。為簡短起見’上述結構僅展示關鍵特徵；其並不指示免疫球蛋白之聯接⑺域或其他域’亦未展示雙硫鍵。然而，若該等域為結合活性所需，則其應經構築以存在於其在免疫球蛋白分子中佔據之常見位置。或者’可將黏附素序列插於免疫球蛋白重鏈與輕鍵序列之間，以使得獲得包含嵌合重鏈之免疫球蛋白。在此實施例中，將黏附素序列融合至免疫球蛋白之各臂中的免疫球蛋白重鏈之3’末端，或融合在鉸鏈與Ch2域之間，或融合在 CH2 與 CH3 域之間。Hoogenb〇om 等人，Mo/ 28:1027-1037 (1991)已報導類似構築體。儘官在本發明之免疫黏附素中並不要求存在免疫球蛋白輕鏈，但免疫球蛋白輕鏈可存在與黏附素_免疫球蛋白重鏈融合多肽共價結合或直接融合至黏附素。在前者情況下，編碼免疫球蛋白輕鏈之DNA通常與編碼黏附素-免疫球蛋白重鏈融合蛋白之DNA—起共表現。分泌後，雜交重鏈及輕鏈將共價結合以提供包含由雙硫鍵鍵聯之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的免疫球蛋白樣結構。適於製備該等結構之方法揭示於例如1989年3月28日頒予之美國專利第 146428.doc -72- 201034684 4,816,567號中。藉由將編碼黏附素部分之cDNA序列同框融合至免疫球蛋白cDNA序列來最便利地構築免疫黏附素。然而，亦可使用與基因組免疫球蛋白片段之融合體（參見例如Aruff〇等人，Ce", 61:1303-1313 (1990);及 Stamenkovic 等人，

Ce//，66:1 133-1144 (1991))。後者類型之融合體要求存在用於表現之Ig調節序列。可基於來自來源於脾臟或外周血淋巴細胞之cDNA文庫之公開序列藉由雜交或藉由聚合酶〇鏈反應（PCR)技術分離編碼igG重鏈怪定區之cdna。將編碼免疫黏附素之「黏附素」及免疫球蛋白部分的cDNA串聯插入指導在所選宿主細胞中有效表現之質體載體中。在另一實施例中，可藉由以美國專利第4,64〇,835號；第 4,496,689 號；第 4,301，144 號；第 4,670,417 號；第 4,791，192號或第4，179,337號中闡述之方式將受體多肽連接至例如聚乙二醇（PEG)、聚丙二醇或聚環氧烷之多種非蛋白質性聚合物中之一種或諸如聚麩胺酸酯之其他類似分子 ◎ 來共價修飾DR6拮抗劑。可使用在此項技術中已知之技術製備該等聚乙二醇化形式。本發明亦涵蓋此等分子之白胺酸拉鏈形式。「白胺酸拉鏈」為在此項技術中用以指增強、促進或驅動融合搭配物 (例如白胺酸拉鏈所融合或連接之序列或分子）二聚化或三聚化之白胺酸富集序列之術語。各種白胺酸拉鏈多肽已描述於此項技術中。參見例如Landschulz等人， 240:1759 (1988);美國專利 5,716,805 ; WO 94/10308 ; 146428.doc •73· 201034684

Hoppe 等人 ’ F五344:1991 (1994) ; Maniatis 等人’ iVaiwre，341:24 (1989)。熟習此項技術者應瞭解白胺酸拉鏈序列可融合於DR6或p75分子之5'或3'末端。亦可以形成嵌合分子之方式，藉由將多肽融合至另一異源多肽或胺基酸序列來修飾本發明之DR6、p75及/或APP 多肽。較佳地’該等異源多肽或胺基酸序列為起作用以使欲合分子募聚者。在一實施例中，該敌合分子包含DR6、 p75及/或APP多肽與提供抗標籤抗體可選擇性結合之抗原決定基的標籤多肽之融合體。通常將抗原決定基標籤置於多肽之胺基端或竣基端。可使用針對標籤多肽之抗體偵測多肽之該等抗原決定基標記形式之存在。又，提供抗原決定基標籤使得多肽能夠易於藉由親和純化法使用抗標籤抗體或另一類型之與抗原決定基標籤結合的親和力基質純化。各種標籤多肽及其各別抗體為此項技術中所熟知。實例包括聚組胺酸（聚his)或聚組胺酸-甘胺酸（聚_his-gly)標籤；flu HA標籤多肽及其抗體12CA5(Field等人，Mo/. Ce//·价〇/.，8:2159-2165 (1988)); c-myc標籤及其8F9、 3C7、6E10、G4、B7 及 9E10抗體（Evan 等人，Mo/. Cell. 5ζ·ο/.，5:3610-3616 (1985));及疮療單純型病毒聽蛋白 D(gD)標戴及其抗體（Paborsky 等人 ’ /Voie/w •Ewg'/weer/wg·， 3(6):547-553 (1990))。其他標籤多肽包括Flag-肽（Hopp等人’价〇rec/mo/og>;，6:1204-1210 (1988)); KT3抗原決定基肽（Martin等人，255:192-194 (1992)) ; α-微管蛋白抗原決定基肽（Skinner等人，《/·价〇/. CTze/w.，266:15163- 146428.doc .74- 201034684 15166 (1991));及T7基因ι〇蛋白質肽標籤（Lutz-Freyermuth等人，尸π W". f/M，87:6393-6397 (1990))。抗DR6、抗p75及抗APP抗體在本發明之其他實施例中，提供DR6、p75及/或APP抗體。例示性抗體包括多株、單株、人類化、雙特異性及雜共輛抗體。在一些實施例中’此等抗DR6、p75及/或APP 抗體較佳為DR6拮抗劑抗體。 Q 多株抗體本發明之抗體可包含多株抗體。製備多株抗體之方法為熟習此項技術者所已知。可在哺乳動物中藉由例如一或多次注射免疫劑及（必要時）佐劑來激發多株抗體。通常，將藉由多次皮下或腹膜内注射將免疫劑及/或佐劑注射至哺乳動物中。免疫劑可包括DR6、p75及/或APP多肽（例如 DR6、P75及/或APP ECD)或其融合蛋白。使免疫劑共軛至已知在所免疫之哺乳動物中具有免疫原性的蛋白質可為適〇用的。該等免疫原性蛋白質之實例包括（但不限於）匙孔螺也氰蛋白、血清白蛋白、牛類甲狀腺球蛋白及大豆胰蛋白酶抑制劑。可採用之佐劑之實例包括傅氏完全佐劑 (Freund’s complete adjuvant)及 MPL-TDM佐劑（單磷醯基脂質A、合成海藻糖二棒狀桿菌酸鹽（trehal〇se diCOryn〇myC〇late))。熟習此項技術者可在不進行過度實驗之情況下選擇免疫方案。可隨後將哺乳動物放血，且檢定血清之DR6及/或APP抗體力價。若需要，則可對哺乳動物 146428.doc -75- 201034684 增強免疫直至抗體力價增加或趨於平穩。單株抗體或者，本發明之抗體可為單株抗體。可使用諸如K〇hler 及Milstein，A/Wwre，256:495 (1975)描述之融合瘤方法製備單株抗體。在融合瘤方法中，通常以免疫劑免疫小鼠、倉鼠或其他適當宿主動物以得到產生或能夠產生與免疫劑特異性結合之抗體的淋巴細胞。或者，淋巴細胞可經活體外免疫。免疫劑通常包括DR6、p75及/或APP多肽（例如DR6、p75 及/或APP ECD)或其融合蛋白，諸如DR6 ECD-IgG、p75 ECD-IgG及 / 或 APPsAPP-IgG 融合蛋白。通常，若需要人類來源之細胞，則使用外周血淋巴細胞 (「PBL」）；或若需要非人類哺乳動物來源，則使用脾臟細胞或淋巴結細胞。接著使用諸如聚乙二醇之適當融合劑使淋巴細胞與永生化細胞株融合以形成融合瘤細胞 (Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE，Academic Press, (1986)第 59-103 頁）。永生化細胞株通常為經轉型之哺乳動物細胞，尤其齧齒動物、牛及人類來源之骨髓瘤細胞。通常採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株。可在較佳含有一或多種抑制未融合永生化細胞之生長或存活的物質之適當培養基中培養融合瘤細胞。舉例而言，若親本細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 (HGPRT或ΗΡΙΓΓ)，貝ij融合瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷（「HAT培養基」），該等物質阻止 146428.doc •76- 201034684 HGPRT缺陷型細胞生長。較佳永生化細胞株為彼等有效融合、支持所選抗體產生細胞中抗體之穩定高含量表現且對諸如HAT培養基之培養基敏感的永生化細胞株。更佳永生化細胞株為鼠類骨髓瘤細胞株，其可獲自例如索爾克學院細胞分配中心（Salk Institute Cell Distribution Center 5 San Diego, California) 及美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，Manassas, Virginia)。該鼠類骨聽瘤細胞株之 0 一實例為P3X63Ag8U.l(ATCC CRL 1580)。亦描述人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株用於製備人類單株抗體（Kozbor, J. /www«o/·，133:3001 (1984) ; Brodeur等人， MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)第 51-63頁）。可隨後檢定培養融合瘤細胞之培養基中針對DR6、p75 及/或APP的單株抗體之存在。較佳地，藉由免疫沉定反應〇或藉由活體外結合檢定（諸如放射免疫檢定（RIA)或酶聯免疫吸附檢定（ELISA))來測定由融合瘤細胞所產生之單株抗體之結合特異性。該等技術及檢定為此項技術中所已知。可例如藉由 Munson 及 Pollard， Anal. Biochem., 107:220(1980)之Scatchard分析或藉助於BiaCore分析測定單株抗體之結合親和力。鑑別出所需融合瘤細胞後，可藉由限制稀釋程序次選殖該等純系且藉由標準方法（前述Goding)培養。用於此目的 146428.doc -77- 201034684 之適當培養基包括例如杜貝卡改良伊格爾培養基或rpmi_ 1 640培養基。或者，可使融合瘤細胞在哺乳動物中以腹水形式活體内生長。可藉由習知免疫球蛋白純化程序自培養基或腹水流體分離或純化次純系所分泌之單株抗體’該等程序為諸如蛋白質A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。亦可由諸如彼等描述於美國專利第4,816,567號中之重址 DN A方法製備單株抗體。編碼單株抗體之DN A易於使用習知程序分離及定序（例如藉由使用能夠特異性結合編碼該等單株抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針）。融合瘤細胞充當該DNA之較佳來源。分離後，可將DNA置於表現載體中，隨後將其轉染至並不另外產生免疫球蛋白蛋白 λ之伤主細胞（諸如大腸桿菌細胞、猿c〇s細胞、中國倉鼠印巢（CHO)細胞或骨髓瘤細胞）中以在^組宿主細胞中獲得單株抗體之合成^ DNA亦可藉由例如以人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列取代同源鼠類序列（Morrison等人，/v〇c. 偏.細A 5W. 81，6851 (1984))或藉由使非免疫球蛋白多肽之王。p或部分編碼序列共價聯接至免疫球蛋白編碼序列加以L飾。以該種方式，製備具有本文之抗^尺6單株抗體之結:特異性的「丧合」或「雜交」抗體。、用X等非免疫球蛋白多肽取代本發明之抗體之怪定域或用其取代本發明抗體之_個抗原結合位點的可變域以產·生" X»· HJt 口 —價抗體，該二價抗體包含一個對DR6具有特 146428.doc 201034684 異性之抗原結合位點及另一對不同抗原具有特異性之抗原結合位點。亦可使用合成蛋白質化學中之包括彼等涉及交聯劑之已知方法活體外製備嵌合或雜交抗體。舉例而言，可使用雙硫鍵交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築免疫毒素。用於此目的之適當試劑之實例包括亞胺基硫醇酯及甲基-4-酼基丁酿^亞胺醋。諸如 Iliades等人，409:437-441(1997)中所〇述’亦可製備單鏈Fv片段。使用各種連接子偶合該等單鏈片段描述於 Kortt 等人，ZVoie/w 10:423-433 (1997)中。重組產生及操作抗體之多種技術為此項技術中所熟知。下文更詳細地描述熟習此項技術者通常使用之該等技術之說明性實例。人類化抗體通常，人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入其中之胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」 ^ 殘基’其通常取自「輸入」可變域。可基本上按照Winter 及其合作者之方法（Jones等人，iVaiwre，321:522-525 (1986) ; Riechmann等人，TVaiwre，332:323-327 (1988); Verhoeyen等人，Sczewd 239:1534-1536 (1988))藉由以齧齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來進行人類化。因此’該等「人類化」抗體為嵌合抗體，其中實質上小於完整人類可變域已經非人類物種之相應序列取代。實際 146428.doc •79· 201034684 上，人類化抗體通常為人類抗體，其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基經來自齧齒動物抗體中類似位點之殘基取代。重要的是抗體經人類化，同時保留對抗原之高親和力及其他有利生物特性。為實現該目標，根據一較佳方法，人類化抗體藉由使用親本及人類化序列之三維模型分析親本序列及各種設想之人類化產物的方法來製備。三維免疫球蛋白模型通常可獲得且為熟習此項技術者所熟知。可獲得說明且顯示所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構型結構之電腦程式。對該等顯示之檢視允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中之可能作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可自共同及輸入序列選擇及組合FR殘基以便獲得所需抗體特徵，諸如對目標抗原之親和力增加。通常，CDR殘基直接且最實質上參與影響抗原結合。人類抗體可藉由融合瘤方法製備人類單株抗體。舉例而言， Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984);及 Brodeur 等人， MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS，第 51-63 頁（Marcel Dekker，Inc.， New York, 1987)已描述用以產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株。現可能產生免疫後能夠在不存在内源免疫球蛋白產生之情況下產生人類抗體譜系的轉殖基因動物（例如小鼠）。舉 146428.doc -80- 201034684 例而言，已描述在嵌合及生殖系突變型小鼠中同型接合子缺失抗體重鏈聯接區（jH)基因導致内源抗體產生之完全抑制。人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移入該生殖系突變型小鼠中將使得在抗原攻毒後產生人類抗體。參見例如

Jakobovits等人 ’ Proc. 心/. ί/α 90, 2551-255 (1993) ; Jakobovits等人，勤⑽e 362, 255-258 (1993)。

Mendez 專人（iVaiwre Geweiz'cs 15: 146-156 (1997))已進一步改良該技術且已產生命名為「異種小鼠II(Xen〇rnouse Ο π)」之轉殖基因小鼠品系’當以抗原攻毒時其產生高親和力完全人類抗體。藉由將巨鹼基人類重鏈及輕鏈基因座生殖系整合入如上所述缺失内源性JH片段之小鼠中達成此目的。異種小鼠II具有1，020 kb之含有約66 VH基因、完整dh 及JH區及三個不同恆定區（μ、之人類重鏈基因座且亦具有800 kb之含有32 Vk基因、JK片段及CK基因之人類忙基因座。在此等小鼠中產生之抗體在包括基因重排、組裝及譜系之各方面非常類似於人類中所見之抗體。歸因於阻止〇 w 鼠類基因座中基因重排之内源性JH片段之缺失，人類抗體優先於内源性抗體表現。或者’可使用嗟菌體呈現技術（McCafferty等人，JVaiWre 348，552-553 (1990))來由來自未經免疫之供體之免疫球蛋白可變（V)域基因譜系活體外產生人類抗體及抗體片段。根據該技術，將抗體V域基因同框選殖入絲狀噬菌體之主要或次要外殼蛋白質基因（諸如M13或fd)中，且作為功能性抗體片段呈現於嗟菌體顆粒之表面上。由於絲狀顆粒含 146428.doc •81 - 201034684 有噬菌體基因組之單股DNA複本，故基於抗體功能特性之選擇亦使得可選擇編碼顯示彼等特性之抗體的基因。因此，噬菌體模擬B細胞之一些特性。可以多種形式執行噬菌體呈現，·對於該等形式之回顧請參見例如J〇hns〇n Kevin S.及 Chiswell，David J.，CW⑽咖⑴·⑽ ζ·„ 加价3, 564-571 (1993)。對於噬菌體呈現可使用數種ν_ 基因區段來源。Clackson等人，λγ加Mre，352，624_628 (1991) 由來源於經免疫小鼠脾臟之v基因的小型隨機組合文庫分離出各種系列之抗噁唑酮抗體。可構築來自未經免疫之人類供體之v基因譜系，且可基本上按照Marks等人， J. M〇//. 222, 581·597 等人，五細〇汄 12, 725-734 (1993)描述之技術分離針對多種系列抗原（包括自體杬原）之抗體。在自然免疫反應中，抗體基因以高速率累積犬變（體細胞超突變）。一些所引入之變化將賦予較南親和力，且顯示南親和力表面免疫球蛋白之B細胞較佳在後續抗原攻毒期間複製及分化。可藉由採用稱為「鏈改、卫」之技術（Marks 卓人 ’ 1〇，779-783 [1992] )模擬此自然過程。在此方法中，可藉由以獲自未經免疫之供體的V域基因之天然存在之變體（譜系）的譜系依 -人置換重鏈及輕鏈V區基因來改良藉由嗟菌體呈現獲得之「初級」人類抗體的親和力。此技術允許產生親和力在 nM範圍内之抗體及抗體片段。Waterhouse等人， A/心Λα. 21，2265-2266 (1993)已描述製備極大噬菌體抗體譜系（亦稱為「所有文庫之根源」）之策略。基因改組亦 146428.doc -82- 201034684 可用以自齧齒動物抗體得到人類抗體，其中人類抗體與起始齧齒動物抗體具有相似親和力及特異性。根據此亦稱為「抗原決定基印記」之方法，藉由噬菌體呈現技術獲得之齧齒動物抗體之重鏈或輕鏈v域基因經人類v域基因譜系置換，產生齧齒動物-人類嵌合體。對抗原之選擇使得可分離能夠恢復功能性抗原結合位點的人類可變域，亦即抗原決定基支配（印記）搭配物之選擇。當重複該過程以置換其餘齧齒動物V域時，獲得人類抗體（參見1993年4月丨曰公〇開之PCT專利申請案W〇 93/06213)。不同於利用CDR移植的齧齒動物抗體之傳統人類化，此技術提供完全人類抗體，其不具有齧齒動物來源之構架或CDR殘基。如下文所詳細討論，本發明之抗體可視情況包含單體抗體、二聚體抗體以及抗體之多價形式。熟習此項技術者可藉由此項技術中已知之技術及使用本文之DR6及/或App抗體構築該等二聚體或多價形式。製備單價抗體之方法亦為此項技術中所熟知。舉例而言，一種方法包括重組表現免 U 疫球蛋白輕鏈及經修飾重鏈。通常在Fc區中之任一點將重鏈載短以便防止重鏈交聯。或者，以另一胺基酸殘基取代相關半胱胺酸殘基或將其缺失以便防止交聯。雙特異性抗體雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性之單株抗體’較佳為人類或人類化抗體。在本發明之情況下，-種結合特異性係針對DR6受體，另一種係針對任何其他抗原，且較佳針對另-受體或受體次單位。在_個實 146428.doc -83- 201034684 施例中’其他抗原為p75。製備雙特異性抗體之方法在此項技術中已知。傳統上，雙特異性抗體之重組製備係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中該兩個重鏈，、有不同特異性（Miustein 及 cueu〇，y305, 537-539 (1983))。由於免疫球蛋白重鏈與輕鏈之隨機搭配，故此等融合瘤（四體融合瘤）產生1〇種不同抗體分子之可能混合物’其中僅一種具有恰當雙特異性結構。通常藉由親和層析步驟進行之恰當分子之純化十分繁靖且產物產率低。類似程序揭不於PCT申請公開案第號（1993年$ 月 13 日公開）及 Traunecker等人，五細 Ο J. /0, 3655-3659 (1991)中。根據；f同且更佳之方法，將具有所需結合特異性之抗體可1域（&體_抗原組合位點）與免疫球蛋白㈣域序列融口較L與包含鉸鏈、CH2及CH3區之至少—部分的免疫球蛋白重鏈恆定域融合。較佳具有含有輕鏈結合所必需之位點的第-重鏈恆定區(CH1)，其存在於至少一種融合體中將編碼免疫球蛋白重鏈融合體及（必要時）免疫球蛋白 I鏈之DNA插人單獨表現載體中且共轉染人適當宿主生物，中。在實施例中當三種用於該構築之多肽鏈之不等比率 ^供最佳產率時，此舉在調整三種多肽片段之相互比例中 =極大靈活性。然而當至少兩種等比率之多肽鏈之表現馬產率時或當比率不具有特別重要性時，可在一個表現載體中插入兩種或所有三種多肽鏈之編碼序列。在1方法之—較佳實施例中’雙特異性抗體由-臂中具有第Γ結 I46428.doc -84- 201034684 合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈及另一臂中之雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對（提供第二結合特異性）構成。發現當僅一半雙特異性分子中之免疫球蛋白輕鏈的存在提供較易分離方式時，該不對稱結構促進所需雙特異性化合物自不當免疫球蛋白鏈組合之分離。此方法揭示於丨994年3月3日公開之PCT公開案第WO 94/04690號中。關於產生雙特異性抗體之其他細節，請參見例如Suresh 等人，从以/2·五少210 (1986)。雜共輛抗想雜共軛抗體亦在本發明之範疇内。雜共軛抗體由兩個共價聯接之抗體構成。已提出該等抗體例如使免疫系統細胞靶向不當細胞（美國專利第4,676,980號）且用於治療HIV感染（PCT申請公開案第WO 91/00360號及第WO 92/200373 號；EP 03089)。可使用任何適宜交聯方法製造雜共輛抗體。適當交聯劑以及許多交聯技術為此項技術中所熟知且揭示於美國專利第4,676,980號中。 0 抗體片段在某些實施例中，抗DR6、抗p75及/或抗APP抗體（包括鼠類、人類及人類化抗體及抗體變體）為抗體片段。已發展出多種用於產生抗體片段之技術。傳統上，經由完整抗體之蛋白質水解消化獲付此等片段（參見例如M〇rim〇t〇等 k ’ J· Biochem. Biophys. Methods 24·Λ0Ί-\\Ί [\992、瓦 Brennan等人，Scz’ewce 229:81 (1985))。然而，該等片段現可直接藉由重組宿主細胞產生。舉例而言，Fab，_SH片段 14642S.doc -85- 201034684 可直接自大腸桿菌回收且以化學方式偶合以形成F(ab，）2片段（Carter等人，价幻；10:163-167 (1992))。在另一實施例中，使用白胺酸拉鏈GCN4以促進F(ab，）2分子之組裝來形成F(ab，）2。根據另一方法，可直接自重組宿主細胞培養物分離Fv、Fab或F(ab，）2片段。對熟練從業者而言多種產生抗體片段之技術將顯而易見。舉例而言，可使用木瓜蛋白酶進行消化。木瓜蛋白酶消化之實例描述於 94/12/22公開之WO 94/29348及美國專利第4,342,566號中。用木瓜蛋白酶消化抗體通常產生兩個稱為Fab片段之各自具有單一抗原結合位點的相同抗原結合片段，及殘餘 Fc片段。胃蛋白酶處理產生F(ab，）2片段，其具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原。抗體消化產生之F ab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域（CH〗）。Fab'片段與Fab片段不同之處在於在重鏈（:心域之羧基端添加有包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸的數個殘基。Fab'-SH為本文中對怪定域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab，之命名。F(ab')2抗體片段最初產生為其間具有鉸鏈半胱胺酸的Fab'片段對。亦已知抗體片段之其他化學偶合。抗體之糖基化變體抗體在其恆定區中之保守位置經糖基化（Jefferis及Lund， C/zew. TmwiMwo/. 65:111-128 (1997) ; Wright 及 Morrison, ΠόΤΈΟϋΜ 5:26-32 [1997])。免疫球蛋白之寡醣側鏈影響蛋白質之功能（Boyd等人，Mo/. /所则《〇/· 32:1311-1318 146428.doc •86- 201034684 (1996) ; Wittwe及 Howard, 29:4175-4180 (1990))，及可影響醣蛋白之構形及所呈示之三維表面的醣蛋白部分之間的分子内相互作用（前述Hefferis及Lund ; Wyss及 Wagner, CwrreW 7:409-416 (1996))。寡醋亦可用來基於特定識別結構使指定醣蛋白靶向某些分子。舉例而言，已報導在異半乳糖化之IgG中，寡醣部分自CH2 間空間『彈出』，且末端N-乙醢葡萄胺糖殘基變得可用以結合甘露糖結合蛋白（Malhotra等人，TVaiwre Meci. 243 (1995))。藉由糖肽酶移除中國倉鼠卵巢（CHO)細胞中產生之CAMPATH-1H(重組人類化鼠類單株IgGl抗體，其識別人類淋巴細胞之CDw52抗原）的寡醣使得補體介導之溶解（CMCL)完全降低（Boyd等人，Mo/, /mmwwo/. 32:1311-1318 [1996])，而使用神經胺酸酶選擇性移除唾液酸殘基未引起DMCL損失。亦已報導抗體之糖基化影響抗體依賴性細胞毒性（ADCC)。特定言之，已報導具有四環素調控之β(1，4)-Ν-乙醯基葡糖胺轉移酶m(GnTIII)(—種催化形成 Ο 二等分GlcNAc之糖基轉移酶）之表現的CHO細胞具有提高之 ADCC 活性（Umana 等人，Mfliwre 17:176-180 (1999))。抗體之糖基化變體為抗體之糖基化模式已改變之變體。改變意謂缺失抗體中存在之一或多個碳水化合物部分，向抗體添加一或多個碳水化合物部分，改變糖基化之組成 (糖基化模式）、糖基化程度等。可例如藉由在編碼抗體之核酸序列中移除、改變及/或添加一或多個糖基化位點來 146428.doc -87- 201034684 製備糖基化變體。抗體之糖基化通常為N-連接型或〇-連接型。N_連接型係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之侧鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸（其中X為除脯胺酸之外之任何胺基酸）為碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈酶促連接的識別序列。因此，在多肽中該等三肽序列中任一者之存在產生可能的糖基化位點。〇_連接型糖基化係指糖N -乙酿基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與經胺基酸 (最通常為絲胺酸或蘇胺酸，不過亦可使用5_羥脯胺酸或5_ 羥賴胺酸）連接。藉由改變胺基酸序列以使得其含有上述三肽序列中之一或多者來便利地將糖基化位點添加至抗體中（用於N_連接型糖基化位點）。亦可藉由添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基至原始抗體之序列中或用一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代原始抗體之序列來進行該變異（用於〇_連接型糖基化位點）。亦可在不改變基本核苷酸序列之情況下改變抗體之糖基化（包括糖基化模式）。糖基化在很大程度上依賴於用於表現抗體之宿主細胞。由於用於表現作為潛在治療劑之重組醣蛋白（例如抗體）之細胞類型極少為原生細胞，因此可期望顯著改變抗體之糖基化模式（參見例如Hse等人，J Chm. 272:9062-9070 (1997))。除宿主細胞之選擇外，在抗體之重組產生期間影響糖基化之因素亦包括生長模式、培養基調配物、培養物密度、氧合作用、？11值、純化苄程 146428.doc 88- 201034684 及/、類似因素。已提出各種方法來改變特定宿主生物體中達成之糖基化模式，其包括引入或過度表現某些與寡醣產生有關之酶（美國專利第5,047,335號；第5，训，261號及第 M99號）可使用例如内切糖苦酶H(End。h)自醣蛋白酶促移除糖基化或某些類型之糖基化。此外，重組宿主細紀可、座遺傳工程改造，例如使得在加工某些類型之多酿中八有缺此等及類似技術為此項技術中所熟知。藉由石厌水化合物分析之f知技術可易於分析抗體之糖基〇化結構，該等技術包括凝集素層析、nmr、質議分析、 LC GPC、單醣組成分析、按序酶促消化及HPAEC-PAD #使用局邱值陰離子交換層析來基於電荷分離募醣。亦已知出於分析目的用以釋放寡糖之方法，且其包括 (仁不限於）酶促處理（通常使用肽_N_糖苷酶内半乳糖普酶進行）、使用苛刻鹼環境消除以主要釋放〇_連接型結構，及使用無水肼以釋放Ν·連接型及〇_連接型寡·的化學方法。〇例示性抗體如下文實例中所述，已鑑別出抗DR6單株抗體。在視情況選用之實施例中，本發明之DR6抗體具有與本文中特定揭不之抗DR6、抗P75及/或抗APP抗體中之任一者相同的生物學特徵。術語「生物學特徵」用以指單株抗體之活體外及/或活體内活性或特性，諸如特異性結合DR6或阻斷、抑制或中和DR6活化之能力。在下文實例中進—步描述抓6、π $ 146428.doc -89- 201034684 及/或APP抗體之特性及活性。視情況，本發明之單株抗體具有與下文實例中特定表徵之抗體中之任一者相同的生物學特徵及/或此等抗體結合相同抗原決定基。此可藉由進行諸如本文中及實例中描述之各種檢定來測定。舉例而言，為測定單株抗體是否具有與本文中特定提及的DR6、p75及/或APP抗體相同之特異性，可在競爭性結合檢定中比較其活性。此外，可藉由 DR6、p75及/或APP與所討論之抗體之間的複合物之晶體學研究來測定特定抗DR6、p75及/或APP抗體結合之抗原決定基。如本文中所描述之DR6、p75及/或APP抗體較佳具有所需DR6、p75或APP拮抗活性。該等抗體可包括（但不限於）嵌合、人類化、人類及親和力成熟抗體。如上所述，可使用各種技術構築或工程改造DR6、p75及/或APP抗體以達成此等所需活性或特性。本發明之其他實施例包括與一或多個選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群之非蛋白質性聚合物連接的本文中揭示之抗DR6受體、抗p75及/或抗APP配位體抗體。視情況，本文中揭示之抗DR6、抗p75受體及/或抗 ΛΡΡ酉己立體才宄體係經It U匕或者才唐4匕。本發明之抗體包括「交聯」DR6、p75及/或APP抗體。如本文中所用之術語「交聯」係指至少兩個IgG分子結合在一起以形成一個（或單一）分子。可使用各種連接子分子交聯DR6、p75及/或APP抗體，較佳使用抗IgG分子、補 146428.doc -90- 201034684 體、化學修飾或分子工程改造來交聯DR6、p75及/或App 抗體。熟習此項技術者應瞭解，抗體與細胞表面膜結合後，補體對抗體分子具有相對高的親和力。因此，舉例而吕，咸信補體可用作交聯分子以連接與細胞表面膜結合之兩個或兩個以上抗DR6抗體。本發明亦提供如本文中揭示之編碼DR6、p75及/或App 抗體的經分離核酸’包含該核酸之載體及宿主細胞，及用以產生該抗體之重組技術。〇對於重組產生抗體，將編碼其之核酸分離且插入可複製載體中以供進一步選殖（擴增DNA)或表現。編碼抗體之 DNA易於使用習知程序分離及定序（例如藉由使用能夠特異性結合編碼該抗體之基因的寡核苷酸探針）。許多載體可獲得。載體組份通常包括（但不限於）一或多種以下：信號序列、複製起點、一或多種標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。本文之方法包括用以產生嵌合或重組抗DR6& /或App抗〇體之方法，其包含以下步驟：提供包含編碼抗DR6、抗 p75及/或抗APP抗體輕鏈或重鏈（或輕鏈與重鏈兩者）之 DNA序列之載體；以該载體轉染或轉型宿主細胞；及在足以產生重組抗DR6抗體、抗p75抗體及/或抗App抗體產物之條件下培養宿主細胞。 DR6拮抗劑之調配物在本文之典型調配物之製備中，應注意所採用組份之推薦品質或「等級」將視調配物之最終用途而定。對於治療 146428.doc -91 - 201034684 級用途，組份較佳具有作為醫藥產品之添加劑之容 (諸如「GRAS」）。；寺在某些實施例中，提供包含DR6及視情況選用之拮抗劑及-或多種提供足夠離子強度以增強卿拮抗齊^之^ 解性及/或穩枝的賦形劑之組合物，其中組合物具：約6)至9(或約9)之pH值。可藉由任何適當方法（例如根據上述方法）製備DR6及p75拮抗劑以達成所需蛋白質純度。在某些實施例中’拮抗劑係重組表現於宿主細胞中或藉由化學合成製備。DR6或p75拮抗劑在調配物中之濃度‘視例如調配物之預定用途而改變。熟習此項技術者可:不進行〇過度實驗之情況下測定DR6或p75拮抗劑之所需仃調配物中提供足夠離子強度以增強或p75^抗劑之溶解性及/或穩定性之該一或多種賦形劑視情況為聚離子型有機或無機酸、天冬胺酸鹽、硫酸鈉、琥雖酸納、乙酸納、氯化鈉、C一so〜ris、精胺酸鹽或其他胺基酸，諸如海藤糖及蔗糖之糖及多元醇。較佳地，調配物中提供足夠離子強度之該-或多種賦形劑為鹽。可採用之鹽包括 (但不限於)鈉鹽及精胺酸[所用之鹽的類型及鹽之濃度較佳使得調配物具有使調配物中之⑽括抗劑穩定的相對較高離子強度。視情況，調配物中所存在之鹽的濃度為約 20 mM至約〇,5 Μ。組合物較佳具有6(或約6)至9(或約9)、更佳約65至約 8.5且甚至更佳約7至約7·5之阳值。在此實施例之一較佳先、樣中’組合物將進—步包含緩衝劑以使組合物之pH值 146428.doc -92- 201034684 保持在至少約6至約8。可採用之緩衝劑之實例包括（但不限於）Tris、HEPES及組胺酸。當採用Tris時，#值可視情況調整至約7至8.5。當採用Hepes或組胺酸時，pH值可視情況調整至約6.5至7。視情況，所用緩衝劑在調配物中之濃度為約5 mM至約50 mM。特定言之，對於液體調配物（或復原凍乾調配物），可能需要在組合物中包括一或多種界面活性劑。該等界面活性劑可例如包含非離子型界面活性劑，如tweentm或〇 plur〇nicstm(例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆（p〇1〇xamer))。較佳地，界面活性劑包含聚山梨醇酯2〇(「吐溫 (Tween)20」）。視情況採用之界面活性劑的濃度為約 0.005%至約 0.2%。除DR6括抗劑及彼等如上所述之組份外，本發明之調配物還可進一步包括各種其他賦形劑或組份。視情況，對於非經腸投藥，調配物可含有醫藥學上或非經腸可接受之載劑，亦即在所用劑量及濃度下對接受者無毒且與調配物之 © 其他成份相容的載劑。視情況，載劑為非經腸載劑’諸如與接受者之血液等張的溶液。該等載劑媒劑之實例包括水、鹽水或緩衝溶液，諸如麟酸鹽緩衝鹽水（PBS)、林葛爾氏溶液（Ringer’s solution)及右旋糖溶液。各種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑進一步描述於Remington’s Pharmaceutical Sciences，第 16版，Osol，A. 編（1980)中。本文之調配物亦可含有一或多種防腐劑。實例包括十八 146428.doc -93- 201034684 烧基一甲基卞基乳化錄、氯化六經季敍（hexamethonium chloride)、氯苄烷銨（benzalk〇nium cM〇ride)(烷基為長鏈化合物之氣化烧基节基二甲基銨之混合物）及苄索氯銨 (benzethonium chlodde)。其他類型之防腐劑包括芳族醇、諸如對羥基苯甲酸曱酯或對羥基苯曱酸丙酯之對羥基苯曱酸烧醋、及間曱紛。抗氧化劑包括抗壞血酸及曱硫胺酸；防腐劑（諸如十八烷基二甲基苄基氣化銨；氯化六羥季銨；氯苄烷銨、苄索氯銨；丁醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯曱酸甲酯或對羥基苯曱酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚）；低分子量（少於約1〇個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白，親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麵胺醯胺'天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單餹、二膽及其他碳水化合物，包㈣萄冑、甘露糖或糊精，糖’諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；或聚乙二醇（PEG)。

本發明之組合物可包含液體調配物（液體溶液或液體浮液）及凍乾調配物以及懸浮液調配物。若為液體，則最終調配物較佳在S2〇t：下冷凍儲存。者’調配物可經凍乾且以可視情況在2_3〇。。下儲存之供注射用水復原之粉末形式提供。欲用於治療性投藥之調配物必須為無菌的。藉由經無過濾膜(例如0.2微米膜)過濾易於實現無菌。通常將治療、自合物置於具有無菌接取孔之容器中，例如具有可由皮下3 146428.doc • 94- 201034684 射針刺穿之塞子的靜脈内溶液袋或小瓶。組合物通常將以水溶液或用於復原之凍乾調配物形式儲存於單一單元或多劑量容器中，例如密封安瓿或小瓶。容器可為此項技術中之任何可用容器且使用習知方法填充。視情況，調配物可包括於注射筆裝置中（或裝入筆裝置中之濾筒），諸如彼等在此項技術中可用者（參見例如美國專利5,3 70,629)，其適合於調配物之治療性傳遞。可藉由使用例如注射用水將凍乾DR6拮抗劑調配物復原來製備注射溶液。使用DR6拮抗劑之療法本發明之DR6拮抗劑具有各種效用dDR6拮抗劑適用於神經病症之診斷及治療。熟習從業者可進行哺乳動物中本文中所描述之各種病理學病狀的診斷。此項技術中可獲得允許例如診斷或偵測哺乳動物之各種神經病症之診斷技術。

預期本發明治療之神經病症包括家族性及偶發性肌萎縮性側索硬化（分別為FALS及ALS)、家族性及偶發性帕金森氏病、亨廷頓氏舞蹈症、家族性及偶發性阿茲海默氏症及脊髓性肌萎縮（SMA)(前述Price等人）。許多此等疾病之特徵在於在成人中年年齡期間發作且導致神經系統内神經元之特定子集的快速退化，最終導致禍覃取、、等级過早死亡。肌萎縮性側索硬化（ALS)為最常診斷出之進行性運叙抽^ _ 疋灯旺運動神經兀疾病。該疾病之特徵在於皮質、腦幹及脊髄中订夂’腿干之運動神經元退化 (Siddique 等人，X Γ iransm. Suppl., 49:219-233 146428.doc *95- 201034684 (1997) . Siddique^ A 5 Neurology, 47: (4增干ij 2):S27_34 ; discussion S34-5 (1996) ; Rosen等人 ’ TVaiwre，362:59-62 (1993) ; Gurney等人，Sc/ewe，264:1772-1775 1994))。帕金森氏病（震顫麻痹）為常見神經退化性病症，其通常出現在生命中期或晚期。存在家族性及偶發性病例，不過家族性病例僅佔所觀測到病例之1 _2%。患者時常具有神經細胞損失伴隨反應性神經膠樣變性及腦幹之黑質與藍斑核 (locus coeruleus)中出現路易體（LeWy body)。作為一類，黑質紋狀體多巴胺激導性神經元似乎最受影響（Uhl等人，凡 35:1215_1218 (1985) ; Levine 等人，巧⑼心 ^_則··，27:691-697 (2004) ; Fleming 等人， 2:495-503 (2005)) 〇近端脊髓性肌萎縮（SMA)為人類中常見之體染色體隱性神經退化性疾病，其特徵通常在於脊椎運動神經元損失及四肢及軀幹肌肉萎縮（Monani等人，办所M〇/ ， 9:2451-2457 (2000); Monani等人，Ce//^o/.，160:41-52 (2003))。其發生之頻率為1〇〇〇〇個個體人發病且為嬰兒死亡之最常見遺傳病因。基於發作時的年齡及疾病表型之嚴重程度，近端SMA已分類為第〖型（嚴重）、第〗〗型（中度）及第m型（輕度）SMA。所有三種形式之疾病均歸因於運動神經元基因（SMN1)端粒存活之損失或突變作用（上述 Monani等人，2000;上述M〇nani等人，（2〇〇3))。已在》午多神經退化性疾病中報導神經元細胞損失，該等疾病包括阿兹海默氏症、帕金森氏病、肌萎縮性側素硬化 146428.doc •96· 201034684 (ALS)及脊髓性肌萎縮（SMA)。視情況，患者中阿茲海默氏症之診斷可基於Diagnostic and Statistical Manual of Mental disorders，第 4版（DSM-IV-TR)(參見例如 American Psychiatric Association. Diagnostic and statistical manual of mental disorders，第 4 修訂版 Washington, DC: 2000)之標準。簡言之，DSM-IV-TR準則包括：（A)表現為記憶受損及一或多種以下症狀之多種認知缺陷的發展：（1)失語症；（2)精神性運動不能； (3)認識不能；或（4)執行功能干擾；（B)認知缺陷表示先前功能下降且導致社會或職業功能顯著受損；（C)該病程之特徵在於漸進發作及持續下降；（D)認知缺陷並不歸因於其他中樞神經系統、全身性或物質誘發之造成記憶及認知進行性缺陷的病狀；及（E)干擾無法由另一精神病症更佳說明。可進行阿茲海默氏症之診斷的替代準則包括彼等基於國家神經學及交流病症及中風-阿茲海默氏症及相關病症協會研究院（National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer's Disease and Related Disorder Association，NINDS-ADRDA)之阿茲海默氏症之工作組準則（參見例如McKhann等人， iVewro/ogy 1984; 34: 939-944)者。簡言之，可能的阿兹海默氏症之NINCDS-ADRDA準則包括具有非典型發作、表現或進展且無已知病原學之癡呆症候群，其中並不認為任何能夠產生癡呆之伴隨疾病為病因。可能的阿兹.海默氏症之NINCDS-ADRDA準貝ij包括由臨床及神經心理學檢查確 146428.doc -97- 201034684 定之癡呆’且其包括⑷包括記憶之兩個或兩個以上認知方生缺陷；°"在4〇與9〇歲之間發作；及⑷不存在月匕。L括譫妄之癡呆症候群之全身性或其他腦疾病。明確㈣海默氏症之臟DS顧DA準則包括滿足可能的阿纽海默氏症準則且經由屍檢或生檢具有阿兹海默氏症之組織病理學證據。 uboisf Λ , The Lancef Neurology , , , 厕年M，第734_746頁已提出修訂之細ds_adrda診斷準則。如下文所簡要概述，為滿足可能的阿兹海默以之此準則又衫響個體必須滿足準則A(核心臨床準則）及 B、C、D或E中所註明之支持性生物標記準則中之至少一或多種。在此上下文中，準則A之特徵在於包括以下特徵之早期及顯著情節記憶受損之存在：（1)超過6個月患者或病史申述者報V §己憶功能之漸進及進行性變化；（2)測試時顯著受損情節記憶之客觀證據：此通常由提示或識別測試時及已預先控制資訊之有效編碼後未顯著改良或未正常化之回憶缺陷組成；（3)情節記憶受損可與AD發作時或AD進行中之其他認知變化分離或相關。準則B之特徵在於存在内側顯葉萎縮，如例如以下所示：以使用公開示分法 (visual scoring)(參考具有正常年齡標準之充分表徵之群體）或所關注區域之定量容積測定法（參考具有正常年齡標準之充分表徵的群體）進行定性評級在MRI上所證明之海馬區、内嗅皮質 '扁桃體之體積損失。準則C之特徵在於腦脊髓液生物標記異常，例如低類澱粉βΐ-42濃度，增加之總 146428.doc -98· 201034684 τ濃度或增加之磷酸_τ濃度或三者之組合。準則c之特徵在於利用PET之功能性神經成像之特定圖案，例如雙邊顳頂聯合區中之葡萄糖代謝降低。準則E之特徵在於直系親屬中已驗證之AD體染色體顯性突變。若存在以下情形則認為AD為明確的：（1)如死後AD診斷之NIA-Reagan準則所要求疾病之臨床與組織病理學（腦生檢或屍檢）證據；準則必須存在（參見例如 Neurobiol Aging 1997; 18: S1-S2);及 (2)AD之雖床與遺傳證據（染色體1、14或21之突變）；準則 0 必須存在。在本發明之方法中，較佳在載劑、較佳醫藥學上可接受之載劑中將DR6拮抗劑投與哺乳動物。適當載劑及其調配物&述於由〇s〇l等人所編之 PHARMACEUTICAL SCIENCES,第 16 版，1980，Mack

Publishing Co.中。通常，在調配物中使用適量醫藥學上可接丈之鹽以使調配物等張。載劑之實例包括鹽水、林葛爾氏溶液及右旋糖溶液。溶液之pH值較佳為約5至約8，且更仫為約7至約7.5。其他载劑包括持續釋放製劑，諸如含有抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈例如溥膜、月曰質體或微粒之成形物品之形式。對於熟習此項技術者顯而易見，視例如投藥途徑及所投與DR6拮抗劑之濃度而定，某些載劑可能更佳。可藉由注射（例如靜脈内、腹膜内、皮下、肌肉内、門靜脈内）、經口或藉由諸如輸液之確保以有效形式傳遞至血流中的其他方法將DR6拮抗劑投與哺乳動物。亦可藉由 146428.doc •99- 201034684 諸如分離組織灌注的分離灌注技術或藉由鞘内、眼内或腰椎穿刺投與DR6拮抗劑以發揮局部治療作用。可直接（例如顱内）給予不易於穿過血腦障壁之DR6拮抗劑，或提供至脊髓間隙中，或者使其傳輸穿過障壁。可按經驗確定投與 DR6拮抗劑之有效劑量及時程，且進行該等判定係在此項技術之技藝内。熟習此項技術者應瞭解，必須投與之DR6 拮抗劑之劑量將視例如將接受拮抗劑之哺乳動物、投藥途徑、所用拮抗劑之特定類型及投與哺乳動物之其他藥物而改變。選擇適當劑量之指導原則可見於文獻中，例如關於抗體之治療用途，例如HANDBOOK OF MONOCLONAL ANTIBODIES,. Ferrone等人編，Noges Publications, Park Ridge，N.J.，（1985)第 22 章及第 303-357 頁；Smith 等人， ANTIBODIES IN HUMAN DIAGNOSIS AND THERAPY, Haber等人編，Raven Press, New York (1977)第 365-389 頁。單獨使用之DR6抗體之典型曰劑量可根據上述因素在每曰約1 pg/kg至至多100 mg/kg體重範圍内或更多。亦可組合一或多種其他治療劑將DR6拮抗劑投與哺乳動物。似乎APP亦以較小程度結合p75(藉由ELISA測定， EC50=約3 00 nM)。因此，以DR6拮抗劑與p75拮抗劑之組合治療神經病症可能有利。可將其他治療劑進一步與DR6 拮抗劑組合，視情況與p75拮抗劑組合。該等其他治療劑之實例包括上皮生長因子受體（EGFR)抑制劑，例如結合 EGFR或以其他方式直接與EGFR相互作用且阻止或降低信號傳導活性之化合物，諸如它赛瓦（Tarceva)，如C225之抗 146428.doc •100· 201034684

體，其亦稱為西妥昔單抗（cetuximab)及Erbitux®(ImClone Systems Inc.)，完全人類ABX-EGF(盤尼圖單抗 (panitumumab)，Abgenix Inc.)，以及稱為 E1.1、E2.4、 E2.5、E6.2、E6.4、E2.ll、E6.3 及 E7.6.3 且描述於 US 6,235,883中之完全人類抗體；MDX-447(Medarex Inc)以及 EGFR小分子抑制劑，諸如描述於US 5616582、US 5457105 ' US 5475001 > US 5654307 、 US 5679683 、 US

6084095 ' US 6265410 、 US 6455534 、 US 6521620 、 US

6596726 、 US 6713484 、 US 5770599 、 US 6140332 、 US

5866572 ' US 6399602 ' US 6344459 、 US 6602863 、 US

6391874、WO 9814451、WO 9850038、WO 9909016、WO 9924037 ' US 6344455 、 US 5760041 、 US 6002008 、 US 5747498中之化合物；特定小分子EGFR抑制劑包括OSI-774 (CP-358774，埃羅替尼（erlotinib)，OSI Pharmaceuticals); PD 183805(CI 1033，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基）胺基]-7-[3-(4-嗎啉基）丙氧基]-6-喹唑啉基]-2-丙烯醯胺二鹽酸鹽，Pfizer Inc.);易瑞沙（Iressa)(ZD1839，吉非替尼（gefitinib)，4-(3'-氣-4’-氟笨胺基）-7-甲氧基-6-(3-嗎啉基丙氧基）喹唑啉，AstraZeneca) ; ZM 105180((6-胺基-4-(3-曱基苯基-胺基）-喹唑啉，Zeneca) ; BIBX_1382(N8-(3-氣-4-氟-苯基）->^-(1-甲基-哌啶-4-基）-嘧啶并[5,4-(1]嘧啶-2,8-二胺， Boehringer Ingelheim); PKI-166((R)-4-[4-[(l-苯基乙基）胺基]-1Η-°比咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚）；（R)-6-(4-羥苯基）-4-[(1-苯基乙基）胺基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶）；CL- 146428.doc -101- 201034684 387785(N-[4-[(3-漠笨基）胺基]_6_啥唾琳基]、2_丁块酿胺及EKB-569(N-[4-[(3k氟苯基）胺基]3_氛基_7_乙氧美 6-料基]-4-(二甲胺基）_2_ 丁浠酿胺）。彳採用之其他治土療劑包括細胞调亡抑制劑，尤其細胞内細胞〉周亡抑制劑，例如卡斯蛋白酶抑制劑，諸如卡斯蛋白酶_3、卡斯蛋白酶^ 或卡斯蛋白酶-8抑制劑、Bid抑制劑、細抑制劑或其任何組合。適當抑制劑之實例通常為卡斯蛋白酶抑制劑、二肽抑制劑、胺基甲酸酯抑制劑、經取代天冬胺酸縮醛、雜環基醯胺口圭啉-(二-、三_四肽）衍生物、經取代2_胺基苄醯胺卡斯蛋白酶抑制劑、經取代a_羥基酸卡斯蛋白酶抑制劑、藉由亞硝基化加以抑制；CASIM ; CASp_3 :蛋白質抑制劑，反義分子，菸鹼基_天冬胺醯基_酮，y_酮酸二肽衍生物’ CASP-8 :反義分子，相互作用蛋白質caSP_ 9，CASP2 .反義分子；CASP-6 :反義分子；CASP-7 :反義分子，及CASP-12抑制劑。其他實例為粒線體抑制劑，諸如Bel-2-調節因子；衍生自Bad、Bad、BH3相互作用域死亡促效劑、Bax抑制劑蛋白質及BLK基因及基因產物之 Bel-2-突變型肽。細胞凋亡之其他適當細胞内調節劑為 CASP9/Apaf-1結合之調節劑，Apaf-1表現之反義調節劑，抑制細胞凋亡之肽，包含疱疹單純型病毒之R1次單位、 MEKK1及其片段之抗細胞〉周亡組合物，存活素（Survivin) 之調節劑、細胞洞亡抑制劑之調節劑及HIAP2。該等藥劑之其他實例包括二曱胺四環素（Minocycline) (Neuroapoptosis Laboratory)，其抑制細胞色素C自粒線體 146428.doc -102- 201034684 之釋放且阻斷卡斯蛋白酶-3 mRNA上調；Pifithrin a(UIC)，其為P53抑制劑；CEP-1346(Cephalon Inc.)，其為 JNK路徑抑制劑；TCH346(Novartis)，其抑制促凋亡 GAPDH信號轉導；IDN6556(Idun Pharmaceuticals)，其為泛卡斯蛋白酶抑制劑；AZQs(AstraZeneca)，其為卡斯蛋白酶-3抑制劑；HMR-3480(Aventis Pharma)，其為卡斯蛋白酶-1/-4抑制劑；及Activase/TPA(Genentech)，其溶解血塊 (溶企栓藥物）。 0 除DR6拮抗劑外亦可投與之其他適當藥劑包括BACE抑制劑、膽驗醋酶抑制劑（諸如冬尼培°坐（Donepezil)、加蘭他敏（Galantamine)、雷斯替明（Rivastigmine)、塔克林 (Tacrine))、NMDA受體拮抗劑（諸如美金剛（Memantine))、 Αβ聚集抑制劑、抗氧化劑、γ-分泌酶調節劑、NGF模擬物或NGF基因治療劑、ΡΡΑΙΙγ促效劑、HMG-CoA還原酶抑制劑（斯達丁（statins))、安目帕克（ampakines)、約通道阻斷劑、GABA受體拮抗劑、肝糖合成酶激酶抑制劑、靜脈内〇免疫球蛋白、蕈毒鹼受體促效劑、菸鹼受體調節劑、主動或被動Αβ免疫法、磷酸二酯酶抑制劑、血清素受體拮抗劑及抗Αβ抗體（參見例如WO 2007/062852 ; WO 2007/ 064972 ； WO 2003/040183 ； WO 1999/06066 ； WO 2006/ 081171 ； WO 1993/21526 ； ΕΡ 0276723Β1 ； WO 2005/ 028511 ; WO 2005/082939)。亦已發現ΑΡΡ相關蛋白質N-APLP2亦結合DR6。因此’ 舉例而言，在本發明之方法及組合物中，抗DR6抗體亦可 146428.doc -103· 201034684 抑制刪與n.APLP2結合。其在本發明之方法中在抑制 APP/DR6結合之同時或除抑制App/DR6結合之外還可抑制 DR6/N-APLP2相互作用。已進-步發現N-APLP2以較小程度與奶相互作用。铁而’在本發明之方法中’亦可希望抑修APLP2與p75以及DR6(單獨或組合）之結合。可依次或與該-或多種其他治療劑同時投與刪结抗劑。DR6拮抗劑及治療社量視例如利藥物之類型、所治療之病理學病狀及投藥時程及途徑而定，但其量通常將小於各自單獨使用時的量。投與哺乳動物DR6拮抗劑及視情況選用之p75拮抗劑後’可以熟習從業者所熟知之多種方式監測哺乳動物之生理學病狀。可在活體外檢定中且使用活體内動物模型檢驗本發明之 DR6拮抗劑及視情況選用之p75拮抗劑的治療作用。多種熟知檢定及動物模型可用於測試候選治療劑之功效。該等模型之活體内性質使得其尤其預示人類患者體内之反應。各種神經退化性病狀之動物模型及用以研究與神經退化之此等模型相關的病變之相關技術（例如在DR6拮抗劑存在及不存在之情況下）論述於下文實例14中。各種神經病症之動物模型包括非重組及重組（轉殖基因）動物。非重組動物模型包括例如齧齒動物，例如鼠類模型。可藉由使用例如皮下注射、尾靜脈注射、脾臟植入、腹膜内植入及腎包膜下植入之標準技術將細胞引入同基因 146428.doc •104· 201034684 型小鼠中來產生該等模型。活體内模型包括中風/大腦局部缺血模型、神經退化性疾病之活體内模型，諸如帕金森氏病之小鼠模型；阿茲海默氏症之小鼠模型；肌萎縮性側索硬化ALS之小鼠模型；脊髓性肌萎縮SMA之小鼠模型；病灶性及整體大腦局部缺血之小鼠/大鼠模型，例如頸總動脈阻塞模型或大腦中動脈阻塞模型；或離體全胚胎培養物。可以諸如如下所述或如在此項技術中已知且描述於文獻（參見例如McGowan等人，TVewi/·? h Ge 邮"c·?, 22:28 ΙΟ 289 (2006) ； Fleming^ A 5 NeuroRx, 2:495-503 (2005) » Wong等人，TVeMrosc/ewce，5:633-639 (2002))中之已知活體外或活體内檢定格式進行各種檢定。亦由諸如傑克遜實驗室（Jackson Laboratory)之商業供貨商獲得各種該等動物模型（參見URL位址jaxmice.jax.org)。可使用在此項技術中已知之多種動物模型研究本文中所揭示的DR6拮抗劑對諸如AD之神經病症之活性（參見例如 Rakover 等人，iVewroi/egewer Dz's. 2007; 4(5): 392-402 ; 〇 Mouri 等人，/^從5 J. 2007 年 7 月；21(9):2135-48 ; Minkeviciene等人，·/ P/zarmaco/ 2004年 11 月； 311(2):677-82 ;及 Yuede 等人，Behav Pharmacol. 2007年 9 月；18(5-6)··347-63)。舉例而言，可使用目標識別測試研究本文中揭示的DR6拮抗劑對小鼠之認知功能之作用（參見例如 Ennaceur等人，1988; 31:47-59)。可藉由例如經設計以量測諸如IL-Ιβ及TNF-α之炎症標記及抗發炎細胞激素IL-10在小鼠血漿部分中的含量之組織化學 146428.doc -105- 201034684 分析以及ELISA方案，在小鼠中研究本文中揭示之DR6拮抗劑對例如大腦炎症的活性（參見例如Rak〇ver等人’ Neurodegener Dis. 2007; 4(5):392-402) ° 可經由使用例如認知結果量測結合整體評估研究本文中揭示的DR6拮抗劑對諸如阿茲海默氏症（AD)之人類神經病症之作用（參見例如Leber P: GUIDELINES FOR THE CLINICAL EVALUATION OF ANTIDEMENTIA DRUGS, 第一草案，Rockville, MD，美國食品及藥物管理局（US Food and Drug Administration), 1990)。可使用例如單一或多組準則研究對諸如AD之神經病症之作用。舉例而言’ 歐洲醫藥品管理局（European Medicine Evaluation Agency，EMEA)提出對應於認知之預先指定程度之提高及功能性與整體活性穩定的反應者之定義（參見例如歐洲醫藥品管理局（European Medicine Evaluation Agency， EMEA): Note for Guidelines on Medicinal Products in the Treatment of Alzheimer's Disease. London, EMEA, 1997) ° 在此項技術中已知可單獨或組合使用以評估患者對藥劑的反應性之許多具體既定測試（參見例如Van Dyke等人，Xw J Gehair. 14:5 (2006))。舉例而言，可使用嚴重損害量表（Severe Impairment Battery，SIB，一種用以量測患有較嚴重AD之患者的認知變化之測試）評估對藥劑之反應性（參見例如 Schmitt等人 ’ J/z/zez’mer Db ylwoc 1997; 11(增刊2):51-56)。亦可使用經設計且確認用於晚期癡呆之1 9項阿茲海默氏症合作研究-日常生活活動清單（19- 146428.doc -106- 201034684 item Alzheimer's Disease Cooperative Study-Activities of Daily Living inventory，ADCSADL19)，亦即量測執行曰常生活活動之獨立性程度的19項清單，量測對藥劑之反應性（參見例如 Galasko等人，《/. «Soc. 2005;

11:446-453)。亦可使用基於臨床醫師之訪談的變化印象加上護理者輸入（Clinician’s Interview-Based Impression of Change Plus Caregiver Input，CIBIC-Plus，一種基於患者與護理者之結構化訪談的7分整體變化評級）量測對藥劑之反應性（參見例如Schneider等人，J/z/zeimer J 1997; 11(增刊2):22-32)。亦可基於護理者訪談使用評估12種行為症狀之頻率及嚴重程度的神經精神病學清單 (Neuropsychiatric Inventory，NPI)量測對藥劑之反應性（參見例如 Cummings等人，TVewro/og少 1994;44:2308-2314)。各種膽鹼酯酶抑制劑（冬尼培唑、加蘭他敏、雷斯替明及塔克林以及美金剛，N-曱基-D-天冬胺酸鹽（NMDA)受體拮抗劑）已獲得管理批准用於治療阿茲海默氏症（參見例如 Roberson等人，iSciewce 314: 781-784 (2006))。在患有輕度至中度嚴重性AD之患者中的膽鹼酯酶抑制劑之臨床試驗中，治療反應之常見定義包括經6個月阿茲海默氏症評估表-認知子表（Alzheimer’s Disease Assessment Scale-Cognitive Subscale，ADAS-cog)提高至少 4 分（參見例如 Winblad等人，_/^1/〇6以'〇^/}15>^/^如厂>|2001;16:653· 666 ； Cummings J., Am J Geriatr Psychiatry 2003; 11: 131-145 ;及 Lanctot等人，CMAJ 2003; 169: 557-564)。此等結 146428.doc -107- 201034684 果亦已與分別經約6個月或1年逆轉疾病過程相比較（參見例如 Doraiswamy 等人，Ζ)ζ·ί· Jwoc (2001) 1 5 : 1 74-1 83)。在美金剛之臨床試驗中，治療反應者已經預先指定為未展示整體能力惡化且無功能性或認知能力惡化之患者（參見例如Reisberg等人，见五《g/. J. Med. 2003; 348: 1333-1341)。美金剛在服用穩定劑量之膽鹼酯酶抑制劑冬尼培唑之患者中的另一試驗，表徵美金剛為根據嚴重損害量表（SIB)及改進之19項阿茲海默氏症合作研究-日常生活活動清單（ADCS-ADL19)、基於臨床醫師之訪談的變化印象加上護理者輸入（CIBIC-Plus)、神經精神病學清單 (NPI)及老年患者行為評級表（BGP監護依賴性子表）包括自基線變化之結果量測顯示優於安慰劑之效益（參見例如 Tariot 等人，2004; 291:317-324)。美金剛之特徵進一步在於在多個 SIB、ADCS-ADL19、CIBIC-Plus及 NPI 結果量測中產生症狀改善及穩定之有效性（參見例如van Dyck等人，Am. J. Geriair. 14:5 (2006))。 DR6拮抗劑診斷應用家族性阿茲海默氏症（FAD)或體染色體顯性早期發作阿茲海默氏症（ADEOAD)係指通常在定義為65歲之前（通常介於20與65歲之間）的生命早期發作之阿茲海默氏症之不常見形式，其可以體染色體顯性方式遺傳。類澱粉前驅蛋白 (APP)、早老素l(PSENl)及早老素2(PSEN2)基因之研究提供此等基因中之突變造成大多數所觀測到之ADEOAD病例之證據（參見例如Raux等人，J. Met/· Gewei. 2005; 42:793- 146428.doc -108- 201034684 795)。然而，許多所觀測到之該等症候群之病例仍未獲得解釋。本文中提供之資料表明死亡受體6之多肽及/或聚核苷酸變體可能造成FAD及/或其他神經病症之某些病例。本發明之實施例包括測定包含SEQ ID NO: 1之死亡受體 6(DR6)多肽之變體是否存在於個體中之方法，該等方法包含比較個體中所存在之DR6多肽的序列與SEQ ID NO: 1，以便判定DR6之多肽變體是否出現在個體中。視情況，在該等方法中，患者患有或懷疑患有FAD及/或另一神經病 0 症。在其他實施例中，該方法亦包括測定是否存在p75蛋白之變體。在此上下文中，可藉由在此項技術中熟知之多種方法分析患者樣本中之DR6多肽及/或聚核苷酸（例如以鑑別天然存在之DR6變體），該等方法包括（但不限於）臨床樣本及細胞株之免疫組織化學分析、原位雜交、RT-PCR分析、西方墨點分析（western blot analysis)，及組織陣列分析。用以評估DR6基因之序列（例如DR6 5'及3'調控序列、内含〇子、外顯子及其類似物）及DR6基因產物（例如DR6 mRNA、DR6多肽及其類似物）之典型方案可見於例如 Ausubel 等人編，2007, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,第2單元（北方墨點法）、第4單元 (南方墨點法）_、第15單元（免疫墨點法（lmmunoblotting))& 第18單元（PCR分析）中。在該等分析之說明性實施例中，自患有神經病症或懷疑易患神經病症之患者獲得神經元細胞，以便可藉由諸如免 146428.doc -109- 201034684 疫檢定、北方墨點檢定或聚核苷酸序列分析之程序分析其中表現之DR6多肽及/或mRNA序列（參見例如Lane等人， 2002; 112(7 Pt 1):1183-9 ;及 Silani 等人， Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord. 200; 2增刊l:S69-76)。在本發明之某些實施例中，可藉由諸如西方墨點分析之免疫檢定分析獲自患者神經元細胞（其可視情況在活體外培養中繼代）之DR6多肽（參見例如 Pettermann等人，J. (10): 3624-3632 (1988))。或者，可藉由例如自患者神經元細胞中萃取之mRNA之逆轉錄酶聚合酶鏈反應（RT-PCR)分析來分析DR6基因及視情況選用之p75基因之一部分或整個編碼區。在本發明之其他實施例中，自除神經元細胞以外之細胞，例如纖維母細胞或外周血液白血球獲得DR6基因組序列，且隨後分析以測定此等基因組序列是否編碼DR6多肽及/或具有DR6之聚核苷酸變體及視情況選用的p75基因之變體（包括5’及3’調控序列變體，例如影響DR6在細胞中之表現量者）。在本發明之某些實施例中，該等分析可根據類澱粉前驅蛋白 (APP)、早老素l(PSENl)及早老素2(PSEN2)基因之分析而圖案化（參見例如 Nagasaka等人，iVoc_ 7Vai/_ 5c/. 2005; 102(41):14854-9 ;及 Finckh 等人，T'/ewrogeweiz'cs 2005; 6(2):85-9) ° 鑑別DR6拮抗劑之篩選方法本發明之實施例包括鑑別抑制DR6與APP結合的所關注分子之方法，該方法包含：在所關注之分子存在或不存在 146428.doc -110- 201034684 之情況下組合DR6與APP ;及隨後在該所關注之分子存在下偵測對DR6與APP結合之抑制。在其他實施例中，一種方法偵測抑制APP對p75與DR6兩者之結合的所關注分子。特定言之，使用本文中提供之揭示内容可鑑別例如與 DR6、p75及/或APP相互作用且抑制DR6與APP及/或p75與 APP之間的相互作用之蛋白質、小分子及其他分子。在此方法之一說明性實施例中，DR6可固定於基質上。可隨後在所關注之分子存在及不存在之情況下，觀測游離APP(例 ❹ 如，經諸如發色標記、螢光標籤、放射性標記、磁性標籤或酶促反應產物等之可偵測標記加以標記之APP)結合所固定DR6之能力。APP與DR6結合之下降（例如如經由可偵測標記之含量及/或位置的變化所觀測到）可隨後用以鑑別分子抑制APP結合DR6之能力。在本發明之替代實施例中， APP可固定於基質上以在所關注之分子存在及不存在之情況下偵測APP結合游離DR6(例如經可偵測標記加以標記之 DR6)之能力。視情況在該等實施例中，所關注之分子可為〇抗體。

本文中提供之揭示内容允許多種用於此項技術之方案表徵諸如DR6、p75及APP之欲用於鑑別抑制DR6與APP及/或 APP與p75之間的結合相互作用之分子的多肽之間的結合。本發明之該等實施例包括彼等採用ELIS A檢定（例如如美國專利第6,855,508號；第6,113,897號及第7,241，803號中揭示之競爭或爽層ELIS A檢定）、放射免疫檢定（例如如 Ausubel等人編，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR 146428.doc -Ill - 201034684 BIOLOGY’ 2007之第10.24單元中所揭示）、西方墨點檢定 (例如如 Pettermann 等人，义心以〇^· (1〇): 3624_3632 (1988)及下文貫例1〇中所揭示）、免疫組織化學檢定（例如下文實例ίο中所揭示）、IAsys分析及CM_5(BIAc〇re)感應器晶片分析（參見例如美國專利第6,72()，156號及第7，ι〇ι，85ΐ 號）者。在本發明之某些實施例中，鑑別抑制^^^與App結合的所關注分子之方法使用蛋白質微陣列。蛋白質微陣列通常使用固定於表面上確定位置處的所關注蛋白質分子 (例如DR6及/或APP)且其已用例如Wilson等人，CURR_

以鑑別小分子結合蛋白（參見 opinion in chemical

Science 2001, BIOLOGY 2001，6, 81-85 ;及 Zhu，H·,等人 293， 1201-2105)。鑑別抑制神經退化之化合物的筛選方法

本發明提供鑑別抑制神經退化之化合物的基於細胞之, 選方法。實例之檢定說明在神經退化觸發事件後，· 自神、70表面脫洛。此脫落之抑制劑亦預防神經退化。丨此，可使用此讀出(read〇ut)作為抑制神經退化之指示。該方法包括進行在存在或不存在候選化合物之情況下J 養細胞之檢定。在提供㈣退化之觸發後，比較存在候」〇物夺之APP脫洛與無候選化合物存在時觀測到之μ 脫落。若觀測到候選化合物抑制脫落，則其為抑制神經化之化合物。神經退化之觸發可為神經退化之任何已知; 發’諸如（但不限於）機械破壞' 剝奪營養素或營養因如服P下文實例中展示培養條件及可添加候選心 146428.doc 112- 201034684 之檢定的實例。在此等情況下，可在培養物及/或肯佩諾腔室（Campenot chamber)中培養外植體且可在存在或不存在候選化合物之情況下啟始退化之觸發（諸如ngf剝奪）。候選化合物應將脫落抑制至少1〇_3〇%、3〇 5〇%、5〇_ 7〇%、7〇-9〇%或90-100%(包括此等範圍中之所有整數）。可使用針對APP之抗血清（諸如多株血清或單株抗體，諸如在下文實财所述）觀職落。可將Bax抑㈣添加至培養基中以防止由於軸突退化導致之蛋白質之非特異性損耗。〇纟此等衫中鑑別之化合物適用於預防或治療神經病症0 套組及製品〇在本發明之其他實施财，提供含有適用於治療神經病症之物質的製品及套組。製品包含具有標藏之容器。適當 ^包括例如瓶、小瓶及試管。容器可由諸如玻璃或塑料 2多種材料形成且較佳經滅菌。容器容納具有有效治療包阿炫海默氏症之神經病症的活性劑之組合物 '组合物中之= ㈣则_且㈣包含抗啊株抗體或抗早株抗體。在一些實施例中，組合物中之另一活性劑體^拮t劑且較佳包含抗p75單株抗體或抗App單株抗 =上之標籤指示組合物可用於治療神經病症，且亦 ‘不：體内或活體外使用之用法說明，諸如彼等以上所。氣品或套組視情況進一步包括藥品說明通常包括於治療產口之脔I ^ 係扣法 μ °〇之商業包裝中含有有關適應症、用罝 '投藥、禁忌症、待與封裝產物組合之其他治療 146428.doc -113- 201034684 產品及/或關於使用該等治療產品之警告等之資訊的用法說明書。本發明之套組包含如上所述之容器及包含緩衝液之第二容器。其可進一步包括其他自商業及使用者觀點來看合乎需要之物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭及注射器。實例藉助於下文之實例進一步描述及說明本發明之各種態樣’意欲任何該等實例均不限制本發明之範嘴。實例1 : DR6在胚胎及成人中樞神經系統中之表現進行鼠類胚胎組織中TNF受體超家族表現模式之RNA原位篩選。更特定言之，使用mRNA定位器套組（Ambion，目錄號1803)按照製造商之方案進行原位雜交實驗。使用 DR6 cDNA之以下一級序列來產生此等實驗之RNA探針 (riboprobe):

GAGCAGAAACGGCTCCTTTATTACCAAAGAAAAGAAGGA

CACAGTGTTGCGGCAGGTCCGCCTGGACCCCTGTGACTT

GCAGCCCATCTTTGATGACATGCTGCATATCCTGAACCCC

GAGGAGCTGCGGGTGATTGAAGAGATTCCCCAGGCTGAG

GACAAACTGGACCGCCTCTTCGAGATCATTGGGGTCAAG

AGCCAAGAAGCCAGCCAGACCCTCTTGGACTCTGTGTAC

AGTCATCTTCCTGACCTATTGTAGAACACAGGGGCACTGC ATTCTGGGAATCAACCTACTGGCGG(SEQ ID NO: 3) 對於RNA探針之活體外合成根據製造商之方案使用 146428.doc -114- 201034684

Maxiscript 套組（Ambion，目錄號 1308)。如圖2A中所示，發現在階段E10至E12(當已知神經元細胞死亡發生時之階段）在正發育之脊髓及背根神經節細胞中DR6幾乎僅由分化之神經元而非正增瘦之祖細胞表現。如圖2B中所示，DR6蛋白表現於神經元之細胞體及軸突上。在圖2B中，上部兩張照片展示來自觀測DR6(左）或對照蛋白質（右）之正常小鼠之神經元。下部兩張照片相應地展 0 示來自觀測DR6(左）或對照蛋白質（右）之DR6基因剔除小鼠之神經元。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。為觀測如例如圖2B中所示DR6蛋白在感覺軸突上之表現，在 Genentech使用人類重組DR6作為免疫原產生DR6特異性小鼠單株抗體（參見下文實例3)。藉由免疫螢光進一步就此等抗體識別表現於細胞表面上之全長小鼠及人類DR6的能力對其加以篩選。一種稱為「3F4·8.8」mAb，且進一步描述〇於下文實例3及實例7中之此抗體與人類及小鼠DR6多肽兩者均交叉反應，且用以觀測DR6在軸突上的表現，如圖2B 中所示。使用在此項技術中已知之標準方案進行免疫螢光染色程序（Nikolaev等人，2003, Ce// 112(1), 29-40)。為觀測DR6在軸突上之表現，使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體在Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上拍攝照片。如圖2C中所示，DR6 mRNA由正分化之神經元表現。在 146428.doc -115- 201034684 圈2C中自左至右，三張照片展示對來自分別處於發育階段 E10.5、E 11.5及E12.5之正常小鼠的神經元之腦部掃描。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。為觀測正發育小鼠胚胎中之DR6 mRNA表現，對取自E10.5-E12.5 小鼠胚胎之胸軸向層面的20微米組織橫切片進行與DR6 3'UTR-特異性放射性標記RNA探針的原位mRNA雜交 (ISH)。使用mRNA定位器原位雜交套組根據如mRNA定位器使用手冊（Amb ion Inc.，目錄號1803)中所概述之製造商之方案進行ISH實驗。在活體外轉譯反應中使用 ^ f) MAXIscript套組根據製造商之使用手冊（Ambion Inc.，目錄號1308-1326)產生對應於小鼠DR6 3'UTR之反義序列的放射性標記mRNA探針。使用應用於具有胚胎組織橫切片之載片的 Kodak Autoradiography .Emulsion(Kodak)觀測 DR6 mRNA表現資料。使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體在 Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上在暗視野中拍攝照片。用以產生此等實驗中之RNA探針之DR6 cDNA的一級序列如下：

GAGCAGAAACGGCTCCTTTATTACCAAAGAAAAGAAGGA

CACAGTGTTGCGGCAGGTCCGCCTGGACCCCTGTGACTT

GCAGCCCATCTTTGATGACATGCTGCATATCCTGAACCCC

GAGGAGCTGCGGGTGATTGAAGAGATTCCCCAGGCTGAG

GACAAACTGGACCGCCTCTTCGAGATCATTGGGGTCAAG

AGCCAAGAAGCCAGCCAGACCCTCTTGGACTCTGTGTAC 146428.doc -116- 201034684 AGTCATCTTCCTGACCTATTGTAGAACACAGGGGCACTGC ATTCTGGGAATCAACCTACTGGCGG(SEQ ID NO: 3) 使用Allen Brain Atlas(其可見於全球資訊網，URL位址為 brainatlas.org/aba/ ;該 Allen Brain Atlas為可公開獲得之科學資源，其提供小鼠腦中約20,000個基因之表現圖）進一步分析揭示DR6高度表現於成人腦之大腦皮層中。DR6 mRNA表現例如於皮層神經元、海馬區CA1-CA4錐體神經元及齒狀回中。DR6蛋白表現於成人皮層及海馬區之神經 0 元細胞體中。此表現模式提供DR6除在發育中之作用外亦可在與神經元細胞損失相關的神經退化性疾病之進展中起作用之證據。實例2 :在外植體培養物中RNA干擾對DR6表現之抑制預防連合神經元之轴突退化連合神經元為一群在發育階段E9.5至E11.5之間於背脊髓中長出的投射脊椎中間神經元。認為連合神經元之存活〇依賴於一種其中間目標脊髓基板的營養支持。此依賴性在其軸突沿基板延伸時的數天長之時段期間發生，此後其發展出其他營養需求。神經元對順道自其中間軸突目標獲得之營養支持之依賴性提供迅速消除錯誤投射神經元之機制，此可有助於防止在神經系統發育期間形成異常神經元迴路（Wang等人，401:765-769 (1999))。為研究DR6在連合神經元之轴突退化及漸進式細胞死亡中之功能作用，進行基於RNAi之背脊髓存活檢定 146428.doc -117- 201034684 (Kennedy 等人，Ce//，78:425_435 (1994);前述％时§等人，1999)(參見圖3)。將E13大鼠或E11.5小鼠胚胎置於U5 培養基（Gibco)中，且將siRNA(IDT)連同綠色螢光蛋白 (「GFP」）編碼質體一起注射至神經管中。接著藉由電穿孔將siRNA及質體傳遞至背祖細胞。剝離出背脊趟外植體、包埋入3D膠原蛋白凝膠基質中，且在具有重組轴突導向因子-l(netrin-l)(R&D Pharmaceuticals)及 5% 馬灰、生 (Sigma)之 Opti-MEM/F12培養基（Invitrogen)中在 37°C 下在 5% C〇2環境中培養。在16小時内，回應於化學引誘劑轴突導向因子-1，連合軸突自外植體長出進入膠原蛋白基質凝膝内（如述Kennedy等人，1994)。以GFP螢光藉由使用倒置顯微鏡觀測來目測連合轴突。如圖4A中所示’在不存在獲自基板的營養因子支持之情況下培養48小時後，連合神經元經歷漸進式細胞死亡且其軸突退化（亦參見前述Wang等人，1999)。當連合神經元中之DR6表現受到DR6特異性siRNA分子下調時該軸突退化顯著阻斷（參見圖4，下圖）。在具有非靶向siRNA分子之對照實驗中並未觀測到對軸突退化之此抑制。該資料表明 DR6為撤消來自中間目標脊髓基板之營養支持後，連合神經元軸突退化所需之重要促凋亡受體。如圖4B中所示，RNAi抗性DR6 cDNA恢復由DR6 siRNA 阻斷之退化表型。在圈4B中自左至右，上部4張照片展示以下各物存在下之神經元：（1)對照RNAi ; (2)暴露於DR6 siRNA #3之野生 146428.doc -118- 201034684 型-DR6 ; (3)暴露於DR6 siRNA #2之錯配DR6 ;及（4)暴露於DR6 siRNA #3之錯配DR6。下部2張圖展示以下各物之放射自顯影圖··（1)在對照siRNA、siRNA#2及siRNA#3存在下之野生型DR6 mRNA ;及（2)在對照siRNA、siRNA#2 及siRNA#3存在下之錯配DR6 mRNA。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。為研究 DR6受體在連合神經元之軸突退化及漸進式細胞死亡中之生理學作用，根據此項技術中已知之方案（Kennedy等人， ❹ Ce// 78:425-435 (1994) ; Wang 等人，iVaiwre 401:765-769 (1999))執行背脊髓存活檢定（資料展示於圖4B中）。將E13 大鼠胚胎置於L15培養基（Gibco)中，且將以下siRNA構築體（圖4B)注射至其神經管中： 5'-AAUCUGUUGAGUUCAUGCCUU-3' (SEQBDNOill) 5'-CAAUAGGUCAGGAAGAUGGCU-3' (SEQIDNO: 12) 5'-GGACTCTGTGTACAGTCACCTCCCAGArCTGTTATAG-3' (SEQIDNO: 13) 對照非靶向或靶向DR6 siRNA #2或靶向DR6 siRNA O #3(IDT)連同野生型或錯配DR6 cDNA及GFP編碼質體。將 DR6 cDNA及GFP cDNA次選殖入pCAGGS載體骨架（可購自 BCCM/LMBP)中。接著藉由電穿孔將siRNA及質體傳遞至背祖細胞。接著將背脊髓外植體剝離出，包埋入3D膠原蛋白凝膠基質中，且在具有重組軸突導向因子-1及5%馬血清 (Sigma)之 Opti-MEM/F12培養基（Invitrogen)中在 37°C 下在 5% C02環境中培養。在16小時内，回應於化學引誘劑軸突導向因子-1，連合轴突自外植體長出進入膠原蛋白基質凝 146428.doc -119· 201034684 膠内（Kennedy等人，ce//，78:425-435 (1994))。以 GFP螢光藉由使用倒置顯微鏡觀測來目測連合軸突。在不存在獲自基板的營養因子支持之情況下培養48小時後，連合神經元經歷漸進式細胞死亡且其軸突退化（Wang等人，iWiiwre, 401:765-769 (1999))(圏4B)。然而，可藉由引入靶向DR6 特異性siRNA #3阻斷軸突退化程序（圖4B)。在恢復實驗中進一步證實DR6特異性siRNA #3對目標之特異性作用，在該恢復實驗中藉由共表現siRNA #3抗性錯配DR6 cDNA構築體與DR6 siRNA #3恢復軸突退化表型（圖4B)。所提供之實驗證據確定自中間目標脊髓基板取出後，DR6受體功能為連合神經元之軸突退化及死亡所需。 DR6 siRNA #2及#3(有義股）之序列及與上述檢定中所用之DR6 siRNA #3序列互補的DR6 cDNA之錯配片段如下：大鼠 DR6 siRNA #2 : 5'-AAUCUGUUGAGUUCAUGCCUU-3' (SEQ ID NO: 11) 大鼠 DR6 siRNA #3 : 5，-CAAUAGGUCAGGAAGAUGGCU-3,（SEQ ID NO: 12) 與DR6 siRNA #3序列互補的大鼠DR6 cDNA之錯配片段： 5'-GGACTCTGTGTACAGTCACCTCCCAGATCTGTTATAG-3' (SEQ ID NO: 13)。實例3:外植體培養物中抗DR6抗體對DR6受體信號傳導之抑制預防連合神經元之軸突退化使用抗DR6抗體進行背脊髓存活檢定（如上文實例2中所述）。採用微觀觀測（使用GFP之綠色螢光通道）目測連合軸 146428.doc -120· 201034684 突。根據在此項技術中已知之方案（Kennedy等人，Ο// 78:425-435 (1994) ; Wang等人，401:765-769 (1999)) 以上文實例2中概述之修改形式進行背脊髓存活檢定。將 GFP表現質體構築體（將GFP cDNA次選殖入可購自 BCCM/LMBP之pCAGGS載體骨架）注射至E13大鼠胚胎之神經管中。接著藉由電穿孔將GFP表現質體傳遞至背祖細胞。塗鋪24小時後，以40 pg/ml將抗DR6阻斷抗體或對照正常小鼠IgG添加至連合外植體中。塗鋪48小時後如下文 0 所概述拍攝連合外植體之照片。為觀測GFP表現連合軸突，在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡（在GFP之綠色榮光通道中）上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。用於此實驗之抗DR6抗體如下產生。將與Fc融合之人類DR6細胞外域序列（hDR6-ECD-Fc)用作免疫原以產生抗DR6小鼠單株抗體。所用hDR6-ECD-Fc 〇免疫原之序列如下：

MGTSPSSSTALASCSRIARRATATMIAGSLLLLGFLSTTTAQ

PEQKASNLIGTYRHVDRATGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTN

TSLRVCSSCPVGTFTRHENGIEKCHDCSQPCPWPMIEKLPC

AALTDRECTCPPGMFQSNATCAPHTVCPVGWGVRKKGTE

TEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAYTDCLSQNLVVIKP

GTKETDNVCGTLPSFSSSTSPSPGTAIFPRPEHMETHEVPSS

TYVPKGMNSTESNSSASVRPKVLSSIQEGTVPDNTSSARG 146428.doc -121 - 201034684

KEDVNKTLPNLQVVNHQQGPHHRHILKLLPSMEATGGEK

SSTPIKGPKRGHPRQNLHKHFDINEHLPWMIPDKTHTCPPC

PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED

PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY

TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN

NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 4) 使用先前描述之免疫黏附素方案產生融合多肽 0 (Ashkenazi等人，Cwrr /mmwTio/· 9(2):195-200 (1997);

Haak-Frendscho等人，J. Immunol· 152(3):1347-53 (1994))。藉由經約8週之時程注射100 μΐ hDR6_ECD-Fc免疫原（1 毫克/動物）免疫9週齡Balb/c小鼠。接著使所有經免疫小鼠之淋巴結（llxlO6個細胞/毫升，5 ml)與5 ml濃度為5χ106個細胞/毫升之PU. 1骨髓瘤細胞（來自ATCC之鼠類骨髓瘤細胞）融合。將細胞以2χ106個細胞/毫升塗舖於4個板中。使用捕捉ELISA就融合瘤與如上所述之hDR6-ECD-Fc多 g 肽結合的特異性篩選融合瘤。在4°C下，以50 μΐ之2 pg/ml Fc特異性山羊抗人類IgG(Cappel目錄號55071)塗布平板隔夜。以PBS加上Brij將平板洗滌3次，且在室溫下以200 μΐ 2% BSA阻斷平板1小時。接著以PBS加上Brij將平板洗滌3 次。隨後’在震盪器上以100微升/孔0.4 pg/ml之免疫黏附素培育平板1小時。接著以PBS加上Brij將平板洗滌3次。將100 μΐ第一抗體添加至各孔，在震盪器上培育1小時。再 146428.doc -122· 201034684 次以PBS加上Brij將平板洗滌3次。100 μΐ之1:1000綿羊抗小鼠IgG HRP(與人類無交叉，Cappel目錄號55569)抗體1 小時。以PBS加上Brij將平板洗滌3次。添加50 μΐ受質 (ΤΜΒ微孔過氧化酶KPL #50-76-05)且培育平板5分鐘。以 50微升/孔終止溶液（KPL #50-85-05)終止反應。在450 nm 下讀取吸光率。所用檢定緩衝液含有PBS、5% BSA及 0.05%吐溫 20。接著藉由限制稀釋法（含有10% HCF、10% FCS之 0 SCDME培養基）選殖在捕捉ELISA檢定中測試與hDR6-ECD-Fc多肽之結合顯陽性之融合瘤。1 0天後，取出平板且藉由如上所述之捕捉ELISA檢定具有一個群落之孔。接著同型測試各種所選單株抗體，且其經展示為IgGl同型。接著在背脊髓存活檢定中測試鑑別為「3B11.7.7」；「3F4.4.8」；「4B6.9.7」；及「1E5.5.7」之 4個抗 DR6 mAb 的阻斷轴突退化之能力。驚人的是，此等抗DR6 mAb中之某些（3F4.4.8 ; 〇 4B6.9.7 ;及1E5.5.7)能夠部分抑制由在培養物中營養剝奪 48小時誘發之連合神經元之軸突退化（參見圖5) 〇咸信該等抗體可例如藉由阻斷推測DR6配位體與DR6受體之間的相互作用或藉由抑制配位體獨立型DR6信號傳導促進神經元存活。3B11.7.7 DR6抗體在誘發軸突退化中具有輕微刺激作用。實例4 : JUN N端激酶（JNKi)之特異性肽抑制劑對DR6受體信號傳導之抑制 H6428.doc -123 - 201034684 已報導DR6受體經由活化JNK傳導信號，且在DR6缺乏小鼠模型中觀測到JNK活性受損（Pan等人，F凡Ldi.， 43 1:351-356 (1998) ; Zhao等人，Journal of Experimental Medicine，第 194 卷，1441-1441，2001))。為研究 DR6-JNK 信號傳導在軸突退化中之作用，進行背脊髓存活檢定（如上文實例2中所述），其例外為藉由使用1 μΜ濃度之肽抑制劑 L-JNK-I((Z)-HIV-TAT48-57-PP-JBD20 ; Calbiochem)阻斷連合神經元中之JNK信號傳導路徑。測試 DMSO(SIGMA)及正常小鼠IgG作為對照。如圖6中所示，在背脊髓存活檢定中JNK信號傳導之此抑制部分阻斷轴突退化。該等資料表明DR6至少部分經由 JNK路徑傳導軸突過程退化之信號。實例5 :在小鼠胚胎脊趙中抗DR6抗體對DR6受體信號傳導之抑制預防神經元細胞死亡在全胚胎培養系統中進行DR6信號傳導經抗DR6 mAb阻斷之檢定。下文所述之此系統允許在小瓶中自發育階段 E9.5至E11.5活體外培養全小鼠胚胎2天。自卵黃囊與胚胎連接之子宮中剝離出E9.5胚胎，且第一天在65%氧環境中在100%大鼠血清（Harlan)中培養且第二天在37°C下在95% 氧中培養。在檢定中以10 pg/ml之最終濃度添加抗DR6 mAb(上文實例中所述），且將濃度為10 pg/ml之正常小鼠 IgG抗體用作對照。使用利用識別已裂解卡斯蛋白酶-3之抗體（針對小鼠裂解卡斯蛋白酶-3之抗體，購自R&D Systems)的免疫螢光染 146428.doc •124- 201034684 色偵測且顯微鏡觀測凋亡細胞。結果說明於圓7中。驚人的是’在此系統中抗DR6 mAb 3F4.4.8 ; 4B6.9.7 ;及 1E5.5.7對DR6之抑制保護脊髓神經元免於天然存在之發育細胞死亡。實例6 : DR6缺乏小鼠中神經元細胞死亡減少分析發育階段E15.5時DR6基因剔除胚胎（Zhao等人，j. Mei 194:1441-1441，2001)之表型。裂解卡斯蛋白酶3 為凋亡細胞之標記，且為研究胚胎脊髓中神經元細胞死亡〇之程度’使用對裂解卡斯蛋白酶3的免疫染色（針對小鼠裂解卡斯蛋白酶-3的抗體’睛自R&D Systems)。亦研究DR6 異源同窩同伴作為對照。將經多聚甲醛（PFA)固定之胚胎組織切片在阻斷溶液（2%加熱失活之山羊血清（sigma)/ PBS(Gibco)/0.1%曲通（Sigma))中阻斷1小時，且在4〇c下在阻斷溶液中以初級抗體（小鼠裂解卡斯蛋白酶_3之抗體的 1:500稀釋液，購自r&d Systems)培育隔夜。在室溫下以阻斷溶液將切片洗滌3次，歷時1小時，且在室溫了以二級〇抗體（山羊抗兔Alexa 488之1:500稀釋液，分子探針， Invitrogen)培育1小時。接著在室溫下以阻斷溶液將切片洗滌1小時’且以免疫螢光在綠色通道中觀測。疋量每個胚胎母個脊髓切片中卡斯蛋白酶3陽性核之數目（參見圖8及9A)。與DR6異型接合子仔畜對照相比，在 DR6缺乏小鼠脊髓及背根神經節（「DRG」）中偵測到神經元細胞死亡減少約40至50。/。（圖8及9A)。因此，咸信dR6信號傳導可在活體内發育神經系統中促進神經元細胞死亡。 146428.doc -125- 201034684 如圖9B中所示’如以DR6缺乏小鼠所證實，DR6為運動軸突退化所需。在大腦衍生之神經營養因子（BDNF)及神經營養蛋白3(NT-3)(BDNF及NT-3，獲自Chemicon)存在及不存在之情況下，分析發育階段E13.5之正常以及DR6基因剔除胚胎（Zhao等人 ’ Journal of Experimental Medicine，第194卷’ 1441-1441，2001)之腹側脊髓外植體（運動神經元）。在圖9B中，左上圖展示在bdNF及NT-3存在下正常小氣之腹側脊髓外植體’而左下圖展示在BDNF及NT-3存在下 DR6基因剔除（κ〇)小鼠之腹側脊髓外植體。類似地，右上圖展示不存在此等生長因子之情況下正常小鼠之腹側脊髓外植體’且右下圖展示不存在此等生長因子之情況下DRg 基因剔除（KO)小鼠之腹側脊髓外植體。用以產生此圖9B中所示之資料的材料及方法如下。如

Henderson等人，363:266-270 (1993)中所述以數處改進進行運動神經元腹側脊髓存活檢定。使用酒精處理之剪刀剝離出DR6異型接合子或DR6缺乏小鼠£13 5胚胎且將其置於皿熱L15培養基（Gibco)中。使用相同剪刀及錯子，打開胚胎之腹側區域，移除器官，切掉肋骨且剝離出全脊髓，隨後以鑷子移除周圍腦脊膜組織。移除頂板且獲得脊髓之書頁狀製備物。分離包括厘]^(：及LMC運動管之脊髓之腹側一半且謹慎切除剩餘基板組織。以已在l15中塗布之黃色尖嘴轉移腹側脊髓至新的小碟w/L15 + 5% FBS(Sigma)血清中以便使用鎢針進一步切為外植體。 146428.doc -126- 201034684 以每孔5〇0 μΐ神經基質培養基（Invitrogen)加上50 ng/ml 各重組BDNF及NT-3 Chemicon)、加上B-27補充劑X50 (Invitrogen);加上青黴素鏈黴素麩胺醯胺χι〇〇(目錄號 1〇378-016;〇11^〇)加上葡萄糖又1〇0填充經？〇1^/層黏連蛋白塗布之8孔载片（Becton, Dickinson and Company)。將經切片之腹側脊髓外植體置於各孔（每孔2_3個外植體）中且置於37°C培養室中48小時以便生長《兩天後，如下進行營養因子剝奪•取走舊培養基且以神經基質培養基（無營養因 0 子）將孔溫和洗滌兩次。以20 gg/ml添加預先加熱之神經基質培養基/b_27 (Invitrogen)(如上所述製備，無營養因子）加上抗bdnf及抗NT3阻斷杬體（Genentech，inc )。接著在37艺下將具有外植體之載片再培育24-48小時。 2天後’將外植體在於PBS中之4% PFA中固定，在0。(：以於（Nik〇laeV等人，2003, CW/ 112(1)，29-40)網狀凝膠中之 0.2%曲通滲透1〇分鐘且以網狀凝膠洗滌兩次。為阻斷非特〇異性結合位點’在4°C下將載片在於PBS中之1 % BSA中培月隔夜。為觀測正退化之運動軸突，第二天進行利用抗 P 特異丨生抗體（1:稀釋液，Chemicon)之免疫染色 (在4。〇下於1% BSA/PBS中初級Ab 1:500隔夜，在室溫下二 1小時）。將各孔取出，且使用Fluoromount-G 女裝載片與蓋破片。為觀測表現P75NTR之運動轴突，使 1 Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40

Release 4.5.〇·〇 spi (〇3/2〇〇6)電腦軟體在 Axi〇pithe2 146428.doc -127· 201034684

Imaging Zeiss顯微鏡上拍攝照片。如圖9C中揭示之資料所展示，DR6基因剔除小鼠中誘發之退化延遲。鼠"貝傷在圖9C中自左至右，上部4張圖展示在神經生長因子 (腳)存在下；及分別損傷4、小時後正常小鼠之神經元。在圖9C中自左至右，下部4張圖自左至右展示在外源神經生長因子（NGF)存在下；及分別損傷4、8或16小後DR6 KO小鼠之神經元。、如圖9C中所示之活體外感覺軸突病變檢定如下進行。剝離出DR6異型接合子或DR6缺乏小鼠E12 5胚胎且將其置於溫熱L15培養基（Gibco)中。使用相同剪刀及鑷子，打開胚胎之腹侧區域，移除器官，切掉肋骨且以鑷子剝離出與脊髓連接之背根神經節（DRG)。接著以黃色尖嘴將已在[15 中塗布之DRG轉移至新的小碟w/Ll5 + 5% FBS(Sigma)血清中以便使用鎢針進一步切為1 /4 DRG外植體。以每孔500 μΐ神經基質培養基（invitrogen)加上50 ng/ml NGF(Roche Molecular Biochemicals)、加上 B-27 補充劑 X50(Invitrogen);加上筆狀長條麩胺醯胺X100 ;加上葡萄糖X100填充經PDL/層黏連蛋白預先塗布之塑料8孔載片 (Becton ’ Dickinson及 Company)。將經切片之 DRG 外植體置於各孔（每孔2-3個DRG外植體）中且置於37°C培養室中48 小時以便生長。2天後，如下進行軸突病變檢定：藉由恰在DRG外植體上方或恰在下方以微刀（Fine Science Tools) 對感覺軸突作兩個平行切口誘發損傷。DRG外植體左邊及 146428.doc -128 - 201034684 右邊之未切口軸突充當内源性無病變對照。損傷〇、4、 8、1 6及24小時後在於PBS中之4% pFA中固定具有切口 DRG外植體之載片、在〇它下經網狀凝膠（Nik〇laev等人， 2003, Ce//，112(1)，29-40)中之〇.2〇/0 曲通滲透10 分鐘，且以網狀凝膠洗務兩次。為阻斷非特異性結合位點，在4。〇下將載片在於PBS中之1 % BS A中培育隔夜。為觀測正退化之感覺轴突’第一天進行利用神經元類別;β —微管蛋白 (TUJ1)特異性抗體（1:500稀釋液，Covance)之免疫毕色（在 ❹ 4°C下1% BSA/PBS中一級Ab 1:500隔夜，在室溫下二級Ab 1:500 1小時）。將各孔取出，且使用Fiu〇r〇inount_G安裝载片與蓋玻片。為觀測經免疫螢光標記之感覺軸突，使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4·5.0·0 SP1 (03/2006)電腦軟體在 Axioplthe-2 Imaging

Zeiss顯微鏡上拍攝照片。實例7 :抗DR6抗體拮抗劑抑制神經元退化如圖10A中所示’抗DR6抗體抑制各種營養因子剝奪之〇神經元之退化（在軸突退化之檢定中）。在圖10A中自左至右’上部及下部之前2張照片展示連合神經元之資料。在此等前4張照片中，上部兩張照片分別展示在對照IgG及3B11.7.7 DR6抗體存在下之連合神經元，而下部兩張照片分別展示在4B6.9.7 DR6抗體及 3F4.4.8 DR6抗體存在下之連合神經元。圖i〇A中上部及下部之中間兩張照片展示感覺神經元之資料。在此等中間4 張照片中，上部兩張照片分別展示在NGF存在及不存在之 146428.doc -129- 201034684 情況下之感覺神經元，而下部兩張照片分別展示不存在 NGF但存在4B6.9.7 DR6抗體及3F4.4.8 DR6抗體情況下之感覺神經元。圖10A右側上之兩張上部及下部照片展示運動神經元之資料。在此等右側4張照片中，上部兩張照片分別展示在生長因子存在及不存在之情況下之運動神經元，而下部兩張照片分別展示不存在生長因子但存在 4Β6·9.7 DR6抗體及3F4.4.8 DR6抗體情況下之運動神經元。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。藉由以如上文實例3中所述之DR6細胞外域免疫小鼠產生小鼠單株 4Β6.9.7、ΙΕ5.5.7、3F4.4.8，2C7.3.7 及 3Β11.7.7 DR6 抗體。如上文實例2及實例6中所述以如下修改形式進行感覺、運動及連合外植體培養。對於連合外植體存活檢定，塗鋪 24小時後將DR6抗體4Β6.9.7或3F4.4.8或對照IgG以20微克/ 毫升最終濃度添加至連合外植體培養物中（圖10A)。對於感覺外植體培養物，塗鋪48小時後進行NGF剝奪檢定。塗鋪48小時後，將無NGF但具有NGF阻斷抗體（Genentech, Inc.)之新鮮神經基質培養基與指定DR6抗體（4B6.9.7或 3F4.4.8)或對照IgG—起以20微克/毫升最終濃度添加至感覺外植體培養物中（圖10A)。對於運動外植體培養物，塗鋪48小時後進行營養因子剝奪檢定。塗鋪48小時後，將無 NT3/BDNF但具有BDNF阻斷及NT3阻斷抗體（功能阻斷營養因子mAb，Genentech, Inc.)之新鮮神經基質培養基與指 146428.doc -130- 201034684 定DR6抗體（4B6.9.7或3F4.4.8)或對照IgG—起以20微克/毫升最終濃度添加至感覺外植體培養物中（圖10A)。為觀測經由以抗 TUJ1 (Covance)及抗 p75NTR(Chemicon/Millipore) 抗體免疫螢光染色標記之感覺及運動軸突，因此在 Axioplan-2 Imaging Zeiss 顯微鏡上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。為觀測GFP表現連合軸突，在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡（在GFP之綠色螢光通道〇中）上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。如圖10B中所示，抗DR6抗體抑制各種營養因子剝奪神經元之退化（在正凋亡細胞體之檢定中經由TUNEL染色）。在圖10B中由左側起始，兩張上部及下部照片展示連合神經元之資料。在此等前4張照片中，上部兩張照片分別展示在對照IgG及3B11.7.7 DR6抗體存在下之連合神經元，而下部兩張照片分別展示在4B6.9.7 DR6抗體及3F4.4.8 〇 DR6抗體存在下之連合神經元。圖10B中中間組之兩張上部及下部照片展示感覺神經元之資料。在此等中間4張照片中，上部兩張照片分別展示在NGF存在及不存在之情況下之感覺神經元，而下部兩張照片分別展示不存在NGF但存在4B6.9.7 DR6抗體及3F4.4.8 DR6抗體情況下之感覺神經元。圖10B右側上之兩張上部及下部照片組展示運動神經元之資料。在此等右側4張照片中，上部兩張照片分別展示在生長因子存在及不存在之情況下之運動神經元，而 146428.doc -131 - 201034684 下部兩張照片分別展示不存在生長因子但存在4B6.9.7 DR6抗體及3F4.4.8 DR6抗體情況下之運動神經元。圖10之揭示内容表明對於DR6在軸突退化中之功能，配位體可能起重要作用。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。如上所述，藉由以如上文實例3中所述之DR6胞外域免疫小鼠產生小鼠單株 4B6.9.7、IE5.5.7、3F4.4.8、2C7.3.7 及 3B 11.7.7 DR6抗體。如上文實例2及實例6中所述以如下概述之修改形式進行感覺、運動及連合外植體培養。對於連合外植體存活檢定，如上文實例3中所述，塗鋪24小時後將DR6抗體4B6.9.7及3F4.4.8、抗體3Β11·7.7(或者稱為對照IgG(Genentech, Inc·))以20微克/毫升最終濃度單獨添加至連合外植體培養物中（圖10B，左）。對於感覺外植體培養物，塗鋪48小時後進行NGF剝奪檢定。塗鋪48小時後，將無NGF但具有NGF阻斷抗體 (Genentech，Inc.)之新鮮神經基質培養基與DR6抗體 4B6.9.7或 3F4.4.8或對照 IgG(Genentech, Inc.)—起以 20微克/毫升最終濃度添加至感覺外植體培養物中（圖10B，中間）。對於運動外植體培養物，塗鋪48小時後進行營養因子剝奪檢定。塗鋪48小時後，將無NT3/BDNF但具有BDNF 阻斷及NT3阻斷抗體（功能阻斷營養因子mAb，Genentech, Inc.)之新鮮神經基質培養基與4B6.9.7或3F4.4.8或對照 IgG(Genentech, Inc.)—起以20微克/毫升最終濃度添加至感覺外植體培養物中（圖10B，右）。 146428.doc -132· 201034684 將外植體於4% PFA/PBS中固定且經處理以便基於DNA 股斷裂之標記（穿隧技術）使用原位細胞死亡偵測套組（目錄號11 684 795 910，Roche)根據製造商之使用手冊（R〇che) 在單細胞層面偵測細胞凋亡。藉由螢光顯微鏡術分析連合、感覺及運動外植體培養物之細胞體中的細胞洞亡（圖 10B)。為觀測螢光標記之穿隧陽性細胞凋亡細胞體，在 Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡（在紅色螢光通道中）上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 0 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。實例8 ·· DR6免疫黏附素拮抗劑抑制神經元退化如圖11A中所示’ hDR6-ECD-Fc使連合軸突退化延遲。用於此檢定之hDR6-ECD-Fc免疫黏附素蛋白質如以上實例 3中所述。在圖11A中自左至右，第一張照片提供展示在48小時時連合軸突退化的對照。第二張照片展示在30 pg/ml hDR6_ ECD-Fc存在下48小時時之連合轴突退化。第三張照片展〇示在1〇 pg/ml hDR6-ECD-Fc存在下在48小時時之連合軸突退化。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。如上實例2-6中所述製備且進行連合外植體培養物及存活檢定。用於此檢定之hDR6-ECD-Fc免疫黏附素蛋白質序列如以上實例3中所述。為觀測經GFP標記之連合軸突，在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡（在GFP之綠色螢光通道中）上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 Axi〇Visi〇n40 Release 146428.doc -133- 201034684 4.5.0.0 SPl (03/2006)電腦軟體拍攝照片。如圖11B中所示，hDR6-ECD-Fc延遲經神經生長因子 (NGF)撤消誘發之感覺軸突退化。在圖11B中自左至右，上部三張照片分別展示在對照Fc存在下在0、6及24小時之剝奪NGF之感覺神經元，而下部三張照片分別展示在DR6-FC 構築體存在下在〇、6及24小時之剝奪NGF之感覺神經元。圖11中提供之揭示内容提供配位體對於DR6在轴突退化中之功能可能起重要作用之進一步提示。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。為研究配位體是否為DR6在感覺軸突退化中之功能所需，如下進行感覺轴突生長及退化之間隔培養物分析。使用肯佩諾 (Campenot)神經細胞腔室系統以自不同隔室（獨立流體環境）中之細胞體分離神經突出（軸突），該等細胞體與將軸突投射至另一位置中之遠程目標的神經系統之一個位置中的神經元細胞體類似。如最初Campenot(Campenot等人，J. 11(4): 1 126-39 (1991))所述以以下修改形式進行檢定。簡言之，如例如前述Campenot等人之圖1及4中所說明以PDL/層黏連蛋白塗布3 5 mm組織培養皿且以大頭耙 (Tyler Research)刮擦以產生軌道。將一滴培養基（具有B27補充劑、25 ng/ml NGF及4 g/L甲基纖維素之神經基質培養基）置於經刮擦之底層。將鐵氟龍（Teflon)分隔器（Tyler Research)固定在聚石夕氧潤滑脂上，且將少量聚矽氧潤滑脂置於中心缝之口處。將獲自 E 12.5小鼠DRG之解離感覺神經元懸浮於經甲基纖維素稠 146428.doc •134- 201034684 化之培養基中且裝填入裝備有22號針之拋棄式無菌注射器中。在解剖顯微鏡下將此細胞懸浮液注入各間隔培養皿之中心缝中。將神經元靜置隔夜。以含有曱基纖維素之培養基填充培養孤之外部周邊（細胞體隔室）及内部軸突隔室。活體外3-5天内，如例如前述Campenot等人之圖1及4中所說明軸突開始出現在左及右隔室中。為觸發局部軸突退化，以具有NGF阻斷抗體（抗NGF， Genentech, Inc·, 20 pg/ml)之神經基質培養基取代來自軸突 0 隔室之含NGF培養基。NGF剝奪0小時、6小時或24至48小時後，在室溫下將感覺神經元於4% PFA中固定30分鐘且處理以便以軸突標記TUJ-l(Covance，1:500稀釋液）免疫螢光染色以藉由螢光顯微鏡術觀測正退化之軸突（圖11B)(如以上實例7中所述）。為觀測肯佩諾腔室之軸突隔室中經免疫螢光標記之感覺軸突，在Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。 O 為研究配位體是否為DR6在由NGF撤消觸發之軸突退化程序中之功能所需，在肯佩諾腔室之軸突隔室中包括30 pg/ml hDR6-ECD-Fc免疫黏附素蛋白質（上文實例3中所述）或 30 pg/ml對照 Fc(Genentech, Inc·)連同抗NGF處理。NGF 剝奪0至24小時後，以4% PFA/PBS將肯佩諾腔室中之軸突固定且藉由以TUJ-1(1:500，Covance)/與發光基團Alexa 48 8接合之二級抗體（Molecular Probes，BD)免疫螢光染色加以觀測（圖11B)。 146428.doc -135 - 201034684 如圖11B中所示，NGF剝奪觸發軸突退化之明顯圖案。顯著地，在此系統中hDR6-ECD-Fc免疫黏附素蛋白質之添加延遲轴突退化之發作（圖11B，下圖）。因此，此等資料提示可溶性配位體可為DR6受體在藉由生長因子移除誘發之局部軸突退化中之功能所需。實例9 : NGF剝奪後DR6配位體結合位點自轴突之脫落如圖12A及圖12B中所示，使用DR6-AP構築體來觀測感覺轴突上之DR6結合位點。在圖12A中自左至右，上部兩張照片展示在NGF存在下在48小時使用DR6-AP構築體使處於發育階段E12.5的感覺軸突上之DR6結合位點觀測以分別在低及高放大倍數下觀測此等軸突，而下部兩張照片展示使用AP對照構築體分別在低及高放大倍數下觀測感覺軸突。如圖12B中所示，NGF剝奪後DR6配位體結合位點自感覺軸突損失。在圖12B中自左至右，上部兩張照片展示感覺軸突上 DR6結合位點之觀測，其中第一張照片展示在NGF及ΒΑΧ 抑制劑存在下之感覺神經元，而第二張照片展示在NGF存在下之Bax缺乏感覺神經元。下部兩張照片分別展示：不存在NGF但存在ΒΑΧ抑制劑情況下之感覺神經元；及不存在NGF情況下之Bax缺乏感覺神經元。在神經營養蛋白存在及不存在之情況下，在運動軸突中觀測到等效結果。用以產生圖12A及圖12B中所示之資料的材料及方法如下。藉由將小鼠DR6胞外域融合至人類胎盤鹼性磷酸酶 146428.doc -136- 201034684 (DR6-AP)，使用pRK5-AP選殖載體產生DR6-AP構築體（參見例如 Yan等人，iVaiwre Immunology 1，37-41 (2000))。 PRK5親本選殖載體可獲自 Becton, Dickinson and Company, Pharmingen部門。用以產生DR6-AP融合蛋白之鼠類DR6胞外域序列如下：

MGTRASSITALASCSRTAGQVGATMVAGSLLLLGFLSTITA

QPEQKTLSLPGTYRHVDRTTGQVLTCDKCPAGTYVSEHCT

NMSLRVCSSCPAGTFTRHENGIERCHDCSQPCPWPMIERLP

CAALTDRECICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVRKKGT

ENEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAHTDCLGQNLEVV

KPGTKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESHD

VPSSTYEPQGMNSTDSNSTASVRTKVPSGIEEGTVPDNTSS

TSGKEGTNRTLPNPPQVTHQQAPHHRHILKLLPSSMEATG EKSSTAIKAPKRGHPRQNAHKHFDINEH(SEQ ID NO: 14) 先前已描述（Deckwerth 等人，iVewron，17:401-411， 1996)Bax缺乏小鼠品系（Bax-Rl)且其獲自傑克遜實驗室 (Jackson Laboratories)。使用10 μΜ之ΒΑΧ抑制性肽以阻斷神經元細胞死亡（Bax-V5，Tocris Inc)。為產生小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白（DR bv6-AP)，根據製造商之方案以15微克DR6_AP融合表現構築體使用 FuGene轉染試劑（Roche)轉染於 DMEM/10% FBS(Gibco)培養基中培養之COS-1細胞。轉染12小時後，將COS-1細胞培養基改變為OPTI-MEM(Invitrogen)。轉染48小時後，收集且過濾含有DR6-AP蛋白之COS-1細胞條件培養基。如下 146428.doc -137- 201034684 定量培養基中DR6-AP蛋白之量：將100微升2XAP緩衝液（藉由添加10〇 mg對硝基苯基磷酸鹽（Sigma)及15微升1 M MgCl2至15 ml 2 Μ二乙醇胺（pH 9.8)中製備）與等體積之經轉染c〇s細胞條件培養基或來自未轉染C0S-1細胞之對照條件培養基混合。使反應之顏色顯影12-15分鐘，其中0.D·在線性範圍（on)内。隨後藉由添加800微升蒸德水調卽反應之體積，且在405 nm吸光率波長下量測O.D.。根據下式（100微升）計算nM濃度： C(nM)=O.D.xlO〇x(60/顯影時間）/3〇。對於原位DR6-AP感覺軸突結合檢定，如上文實例7_8中所概述在具有50 ng/ml KfGF (Roche)之神經基質培養基/ B27(Invitrogen)中培養野生型或Bax缺乏感覺外植體。塗鋪後2天’ DRG外植體不加以處理或如上實例7-8中所述剝奪NGF。在圖12B上所指示處添加Bax抑制性肽（10 μΜ, Bax-V5, Tocris)。NGF剝奪後12小時，以結合緩衝液 (HBSS，Gibco 目錄號：14175-095，具有 0.2% BSA、0.1% NaN3、5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、20 mM HEPES， pH=7.0)將DRG外植體洗滌兩次。接著藉由製備DR6-AP條件培養基與結合緩衝液（或對照AP條件培養基與結合緩衝液）之1:1混合物進行AP結合檢定，將該混合物直接應用至 8孔培養載片（Becton, Dickinson and Company)中之DRG外植體且在室溫下培育90分鐘。培育後’藉由以結合缓衝液將DRG外植體沖洗5次洗去未結合DR6-AP蛋白質。接著在室溫下以在PBS中稀釋之 146428.doc -138- 201034684 3.7%曱醛將DRG外植體固定12分鐘。藉由以HBS緩衝液 (20 mM HEPES pH=7.0，150 mM NaCl)沖洗 DRG 外植體 3 次移除剩餘甲醛。藉由在65°C下在HBS緩衝液中加熱失活 30分鐘阻斷内源性AP活性。接著在AP反應緩衝液（100 mM TRIS ρΗ=9·5，100 mM NaCM，50 mM MgCl2)中將 DRG外植體沖洗3次。接著藉由在室溫下在AP反應緩衝液中以 1/50(體積）NBT/BCIP儲備溶液（Roche，目錄號1681451)使對DRG外植體之染色顯影隔夜使與感覺軸突結合之DR6-0 AP融合蛋白可見（圖12A及圖12B)。在平行對照實驗中，將來自經AP-轉染之COS細胞之條件培養基用於AP軸突結合檢定（圖12A，下圖）。如圖12B中所見，NGF剝奪後DR6-AP結合位點自感覺軸突表面損失，此提示營養剝奪後DR6配位體釋放入軸突條件培養基中。如圖12C中所示，處於發育階段E12.5之ΒΑΧ缺乏感覺轴突之研究展示β分泌酶（BACE)抑制劑可阻斷NGF撤消後〇 DR6-AP結合位點自感覺轴突之消失。在圖12C中自左至右，上部三張照片展示分別在DMSO對照；ΟΜ99-2(BACE-I抑制劑）及ΤΑΡ1(α分泌酶-I抑制劑）存在下之此等神經元。下部照片展示在NGF存在下之此等神經元。用以產生此資料之小鼠DR6胞外域-ΑΡ融合蛋白係如上所述。先前已描述（Deckwerth等人，iVewrow ’第17卷’ 401-411，1996)Bax缺乏小鼠品系（Bax-Rl)且其獲自傑克遜實驗室（Jackson Laboratories)。如上圖12A及圖12B所述進 146428.doc •139· 201034684 行DRG外植體培養及DR6-AP轴突結合檢定。該檢定中 BACE抑制劑以1 μΜ最終濃度使用（InSolution OM99-2, Calbiochem/Merck)。該檢定中α分泌酶抑制劑TAPI以10 μΜ最終濃度使用（TAPI-1，Calbiochem)。為觀測DR6-AP-陽性感覺轴突（經上文實例9中概述之AP比色染色反應染色），在Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝明視場照片。實例10:類澱粉前驅蛋白（APP)為DR6之同源配位體如圖13中所示，發現N-APP為DR6胞外域聯結之配位體。在圖13A中由左至右，前2個墨點提供在生長因子存在及不存在下（及在Bax抑制劑存在下）使用DR6-AP構築體探測獲自感覺及運動神經元之蛋白質的研究資料。在此等墨點中，在剝奪生長因子（及在Bax抑制劑存在下）之感覺與運動神經元中均觀測到包括強條帶在約35 kDA之APP多肽。圖13 A之中心墨點顯示以剝奪生長因子之感覺神經元所獲得多肽之抗N-APP抗體探針相應地觀測到包括強條帶在約 35 kDA之APP多肽。以1··100稀釋用於西方墨點法實驗之多株抗 Ν-ΑΡΡ 抗體獲自 Thermo Scientific(目錄號 RB-9023-P1)。以 10 μΜ使用 Bax抑制劑肽P5(Tocris Biosciences，目錄號1 7 8 6，B ax易位至粒線體之細胞可渗透性合成肽抑制劑）。

圖13 A之右側顯示之墨點所提供的資料進一步證實APP 146428.doc -140· 201034684 為DR6胞外域聯結配位體之觀測結果。使用通用下拉（pulldown) 方案（例如 Nikolaev等人， 2004， BBRC， 323， 1216-1222)以在剝奪NGF的條件下由肯佩諾腔室之轴突隔室所收集之感覺軸突條件培養基純化DR6-ECD胞外域聯結因子。DR6-ECD-His胞外域（下文所述之構築體）偶合之 NiNTA珠粒（Sigma)以50 ml感覺軸突條件培養基在以下條件下在 4°C 培育隔夜：150 mM NaCl、0.2% NP-40 (Calbiochem)、lxPBS緩衝液。接著DR6-ECD-His胞外域偶 0 合之NiNTA珠粒（Sigma)以10倍過量之結合緩衝液（150 mM NaCl、0.2% NP-40(Calbiochem)於 lxPBS緩衝液中）洗 5 次，且以 1 xSDS 上樣緩衝液（sample loading buffer) (Invitrogen)溶離出DR6-ECD聯結之蛋白質複合物，接著經由凝膠電泳分離且以抗N-APP抗體探測。此DR6-ECD下拉實驗之資料相應地鑑別包括強條帶在約35 kDA之APP多肽。根據先前描述之方案以軸突條件培養基進行DR6-AP墨〇點檢定（Pettmann 等人，1988，J. iVeMrose/. 8(10):3624-3632)。用於西方墨點法實驗之多株抗N-APP抗體獲自 Thermo Scientific^ 目錄號 RB-9023-P1)。所用小鼠 DR6胞外域-AP融合蛋白係描述於上文實例9中。表現小鼠重組 DR6-ECD-His，隨後自CHO細胞培養物純化。鼠類DR6-ECD-His之胺基酸序列如下：

MGTRASSITALASCSRTAGQVGATMVAGSLLLLGFLSTITAQ

PEQKTLSLPGTYRHVDRTTGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTN 146428.doc -141 - 201034684

MSLRVCSSCPAGTFTRHENGIERCHDCSQPCPWPMIERLPC

AALTDRECICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVRKKGTEN

EDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAHTDCLGQNLEVVKPG

TKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESHDVPSS

TYEPQGMNSTDSNSTASVRTKVPSGIEEGTVPDNTSSTSGKE

GTNRTLPNPPQVTHQQAPHHRHILKLLPSSMEATGEKSSTAI KAPKRGHPRQNAHKHFDINEHHHHHH(SEQ ID NO: 15) 圖13B展示以DR6-AP墨點對轴突條件培養基中DR6配位體之另一次觀測。此墨點資料鑑別許多包括35 kDa N末端〇 APP之APP多肽，以及C99-APP及C83/C89 APP多肽。根據先前描述之方案進行軸突條件培養基之DR6-AP墨點檢定 (Pettmann等人，1988，《/· 8(10): 3624-3632)。如上在實例8中所述產生小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白。表現小鼠重組DR6-ECD-His且隨後自CHO細胞培養物純化。 DR6-ECD-His之胺基酸序列展示於上文中。用於西方墨點法實驗之多株抗N-APP抗體獲自Thermo Scientific^目錄號 RB-9023-P1)。為觀測膜繫鏈 APP C 端片段（CTF)C99-APP Q 及C83/C89-APP，使用識別Αβ之中心部分内的抗原決定基之4G8抗體（單株4G8，1:500，Covance)進行軸突溶解產物之西方墨點分析。

圖14A提供展示剝奪NGF後不久發生之APP胞外域脫落。在圖14A中，在經添加以阻斷轴突退化之Bax抑制劑存在下以N-APP多株抗體將生長因子移除後各時間之神經元染色。自左至右，此等照片展示NGF移除（且添加抗NGF 146428.doc 142- 201034684 抗體）〇小時以及3、6、12及24小時後之軸突退化。用以觀測APP軸突脫落實驗中表面APP表現之多株抗N-APP抗體獲自 Thermo Scientific^ 目錄號RB-9023-P1)。如上文實例6及7中所述進行感覺外植體培養。如上實例7中所述以如下修改形式進行NGF剝奪檢定。NGF剝奪後之指定時間間隔後：〇小時、3小時、6小時、12小時及24小時，將DRG外植體培養物於4% PFA/PBS中固定。為觀測表面 APP表現，DRG軸突經處理以便如實例6及7中（無曲通滲透 0 步驟）使用上述抗N-APP初級抗體進行免疫螢光染色。為觀測感覺軸突（經抗N-APP抗體（Thermo Scientific，目錄號RB-9023-P1)免疫螢光標記）上之表面APP表現，在 Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上（在紅色榮光通道中）使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。圖14B提供展示DR6胞外域結合由培養細胞表現之APP的照片。在圖14B中自左至右，上部兩張照片分別展示用〇 DR6-APP(具有DR6胞外域）探測之對照COS細胞及APP表現細胞。下部兩張照片展示用DR6-AP探測之p75NTR受體及 DR6受體表現細胞。DR6胞外域不與p75NTR或DR6受體表現細胞結合。用以產生此圖中展示之資料的材料及方法如下。為測試 APP是否與DR6胞外域直接相互作用，進行細胞基AP結合檢定（圖14B)。為產生DR6胞外域-AP融合蛋白（DR6-AP)，根據製造商之方案以15微克DR6-AP融合表現構築體使用 146428.doc -143 - 201034684

FuGene轉染試劑（Roche)轉染於 DMEN?/10% FBS(Gibco)培養基中培養之COS-1細胞。轉染12小時後，將COS-1細胞培養基改變為OPTI-MEM(Invitrogen)。轉染48小時後，收集且過濾含有DR6-AP蛋白質之COS-1細胞條件培養基。根據以下程序定量培養基中DR6-AP蛋白質之量。將100 微升2XAP缓衝液（藉由添加100 mg對-硝基苯基磷酸鹽 (Sigma)及 15 微升 1 M MgCl2 至 15 ml 2 Μ二乙醇胺（pH 9.8) 中製備）與等體積之經轉染COS細胞條件培養基或來自未轉染COS-1細胞之對照條件培養基混合。使反應之顏色顯影 12-15分鐘，其中O.D.在線性範圍（0.1-1)内。隨後藉由添加 800微升蒸餾水調節反應之體積，且在405 nm吸光率波長下量測O.D.。根據下式（100微升）計算nM濃度：C(nM)= 0.0.><100><(60/顯影時間）/3 0。對於APP AP結合檢定，根據製造商之方案使用FuGene 轉染試劑（Roche)以每孔2微克APP表現載體轉染在6孔培養皿中於DMEM/10% FBS(Gibco)培養基中培養之COS-1細胞。轉染2天後，以結合緩衝液（HBSS，Gibco目錄號 14175-095，具有 0.2% BSA、0.1% NaN3、5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、20 mM HEPES，pH=7.0)將細胞洗滌兩次。接著藉由製備DR6-AP條件培養基與結合緩衝液之1:1混合物進行AP結合檢定，將混合物直接應用至APP過度表現之 COS-1細胞且在室溫下培育90分鐘。培育後，藉由以結合缓衝液將COS-1細胞沖洗5次洗去未結合之DR6-AP蛋白質。接著在室溫下以在PBS中稀釋之3·7%曱醛將細胞固定 146428.doc •144- 201034684 12分鐘。藉由以HBS緩衝液（20 mM HEPES pH=7.0，150 mM NaCl)沖洗細胞3次移除剩餘甲醛。藉由在65°C下在 HBS緩衝液中加熱失活30分鐘阻斷内源性AP活性。接著在 AP 反應緩衝液（1〇〇 mM TRIS ρΗ=9·5，100 mM NaC 卜 50 mM MgCl2)中將COS-1細胞沖洗3次。接著藉由在室溫下在 AP結合緩衝液中以1/50(體積）NBT/BCIP儲備溶液（Roche，目錄號1681451)使COS-1細胞之顏色反應顯色隔夜來觀測與跨膜APP結合之DR6-AP融合蛋白（圖14B)。在平行對照 0 實驗中，將來自未轉染COS細胞之條件培養基用於AP結合檢定。在相同實驗條件下COS-1細胞中表現之跨膜P75NTR 及DR6受體未展示與DR6-AP融合蛋白之特異性結合（圖 14B)，此指示DR6胞外域與APP之間的相互作用具有特異性。圖14C提供展示DR6為感覺軸突上N-APP之主要受體，且APP結合位點在DR6缺乏小鼠的神經元細胞中顯著消耗之照片。在圖14C中自左至右，上部三張照片分別展示獲〇自用 AP對照、N-APP-AP及 Sema3A-AP探測之 DR6 +/- (het) 小鼠之神經元。下部三張照片相應地分別展示獲自用AP對照、N-APP-AP及 Sema3A-AP探測之 DR6-/-(KO)小鼠之神經元。用以產生圖14C中展示之資料的材料及方法如下。如以上實例9中所述產生小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白。如先前所述產生小鼠Sema3A胞外域-AP(Sema3A-AP)融合蛋白 (Feiner等人，1997，TVewrow 19:539-545)。先前已描述DR6 146428.doc -145- 201034684 缺乏小鼠品系（DR6.KO)(Zhao 等人，《/ 194: 1441-1441，2001)。如以上實例9中關於圖12A及圖12B所述進行DRG外植體培養及DR6-AP軸突結合檢定。圖14D提供展示拮抗劑DR6抗體破壞DR6胞外域與神經元APP之間的相互作用之照片。在此等研究中，將N-APP 添加至表現DR6之神經元細胞且隨後以抗N-APP抗體觀測。自左至右，前4張照片分別展示在對照IgG ; 2C7.3.7 抗DR6抗體；3F4.4.8抗DR6抗體；及4B6.9.7抗DR6抗體存在下N-APP結合神經元表面上之DR6之能力。最右端之照片展示使用對照IgG對細胞上DR6的染色。用以產生此圖中展示之資料的材料及方法如下。如先前所述（Okada等人，2006, 444:369-373)以以下修改形式進行用以獲得圖14D中所示之資料之細胞基配位體結合檢定。為產生N端生長因子樣域APP-His融合蛋白（N-APP-His)，根據製造商之方案使用FuGene轉染試劑（Roche)以15 微克N-APP-His融合表現構築體轉染於DMEM/10% FBS(Gibco)培養基中培養之COS-1細胞。轉染12小時後，將COS-1細胞培養基改變為OPTI-MEM(Invitrogen)。轉染 48小時後，收集且過濾含有N-APP-His蛋白質之COS-1細胞條件培養基。藉由西方墨點分析以上述抗N-APP抗體測定N-APP-His之濃度。

用於此結合檢定之人類N-APP-His之胺基酸序列如下： MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCG RLNMHMNVQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYP 146428.doc _ 146· 201034684 ELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRCL VGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKET CSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVD SADAEEDHHHHHH(SEQ ID NO: 10) 接著藉由製備N-APP-His條件培養基與結合緩衝液之1:1 混合物進行N-APP-His結合檢定，將混合物直接應用至 DR6受體過度表現COS-1細胞且在室溫下培育90分鐘。若指示，則連同N-APP-His條件培養基及結合緩衝液一起以 20 pg/ml個別添加 DR6 mAb 4B6.9.7、3F4.4.8 或 2C7.3.7(上文所述，實例3及7)。在對照實驗中，連同N-APP-His條件培養基及結合緩衝液一起以20 pg/ml添加正常小鼠 IgG(Genentech Inc) ° 藉由根據如實例6及7之方案中所述之已知方案（Okada等人，2006，第 444 卷，369-373)以抗 N-APP 抗體 (Thermo Scientific目錄號RB-9023-P1)免疫螢光染色觀測與DR6受體表現細胞結合之N-APP。為觀測與細胞表面（經抗 N-APP 抗體（Thermo Scientific，目錄號 RB-9023-P1)免疫螢光標記）上之DR6受體結合的N-APP蛋白質，在Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上（在紅色發光通道中）使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。實例11 ··類澱粉前驅蛋白（APP)活化DR6從而誘發轴突退化圖15A提供展示N端APP之多株抗體在連合軸突檢定中阻斷軸突退化之照片。自左至右，圖15A中之照片分別展示 146428.doc -147- 201034684 在對照IgG; 30 pg/ml抗NAPP抗體；及 1.1 pg/ml抗NAPP抗體存在下之連合轴突退化。用以產生圖15A中展示之資料的材料及方法如下。如實例2之方案及圖4B中產生之資料中所述，以指定量之多株抗 N-APP抗體（Thermo Scientific 目錄號 RB-9023-P1，經廣泛透析）或對照IgG(兔IgG，R&D systems)進行連合外植體存活檢定。為觀測經GFP標記之連合軸突，在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡（在GFP之綠色螢光通道中）上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5-0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。圖15B提供展示N端APP抗體抑制由NGF移除誘發之感覺軸突退化之照片。自左至右’圖15B之上部三張照片分別展示在NGF及：對照抗體；抗APP單株抗體22C11 ;及抗 APP多株抗體存在下之感覺軸突。下部三張照片相應地分別展示不存在NGF(以及抗NGF抗體）及：對照抗體；抗 APP單株抗體22C11 ;及抗APP多株抗體情況下之感覺轴突。用以產生此圖15B中展示之資料的材料及方法如下。如以上實例8中所述在肯佩諾腔室中進行NGF剝奪檢定。檢定中所用之N端APP之抗體為多株抗N-APP抗體（Thermo Scientific目錄號RB-9023-P1，經廣泛透析）或22C11單株抗體（22C11 ’ Chemicon ’經廣泛透析）。添加正常IgG(兔 IgG ’ R&D systems)作為對照實驗。如實例1、7及8中所述進行用TUJ1抗體（1:500，Covance)對感覺軸突之免疫螢光 146428.doc •148- 201034684 標記。為觀測肯佩諾腔室之軸突隔室中經免疫螢光標記之感覺軸突，在Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4‘ϋ〇 SPi (03/2006)電腦軟體拍攝照片。圖1SC提供展示藉由抑制β-分泌酶（BACE)活性阻斷之轴突退化可藉由添加N-APP恢復的照片。自左至右，圖15C 中之上部三張照片分別展示在以下各物存在下觀測到之神經元（在NGF不存在之情況下培養）及軸突退化：DMSO對〇照、BACE抑制劑及N-APP(及BACE-I)。圖15C中之下部三張照片相應地分別展示神經元（在NGF存在下培養）以及： DMSO坶照、BACE抑制劑及 N-APP(及 BACE-I)。用以產生此圖15C中展示之資料的材料及方法如下。如以上實例8中所述在肯佩諾腔室中進行NGF剝奪檢定。用於此檢定之人類重組N-APP胺基酸19-306購自Novus(Novus Biologicals，目錄號 H00000351-P01)。在 NGF剝奪時，連同 BACE抑制劑（1 μίν[最終濃度，InSolution OM99-2，〇 Calbiochem/Merck)—起以 3 pg/ml 添加 N-APP。此檢定中 BACE抑制劑以1 μΜ最終濃度使用（InSolution OM99-2， Calbiochem/Merck)。如實例1、7及8中所述進行用TUJ1抗體（1·.500，Covance)對感覺軸突之免疫螢光標記。為觀測肯佩諾腔室之軸突隔室中經免疫螢光標記之感覺軸突，在 Axioplan-2 Imaging Zeiss 顯微鏡上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。 146428.doc •149· 201034684 圖15D提供展示利用RNAi移除APP使在BACE抑制劑存在下生長之神經元細胞對由N-APP誘發之細胞死亡敏感之照片。在圖15D中自左至右，上部三張照片展示在對照 RNAi存在下培養之神經元。此等上部照片分別展示對照以及用3 pg/ml N-APP或0.1 pg/ml N-APP培養之神經元。下部三張照片展示在APP RNAi存在下培養之神經元。此等下部照片分別展示對照以及用3 pg/ml N-APP或0.1 pg/mlN-APP培養之神經元。用以產生此圖15D中展示之資料的材料及方法如下。如實例2中所述進行連合外植體培養物中之APP RNAi。用於此檢定之人類重組N-APP胺基酸19-306購自Novus(Novus Biologicals，目錄號H0000035卜P01)。根據製造商之方案，在此檢定中使用預先設計之大鼠特異性APP ON-TARGETplus siRNA池以下調E13大鼠連合外植體中之APP 表現（APP ON-TARGETplus siRNA池 ’ GenelD : 54226 ’ 目錄號088191，Dharmacon Inc.)。為觀測經GFP標記及經RFP 標記之連合軸突（如實例2及7中所述），在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡上（在GFP綠色螢光通道中）使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions 之 Axi〇Visi〇n40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。實例12 : DR6為APP誘發之軸突退化所需，但不為Αβ觸發之退化所需如圖16Α中所示，DR6活化為Ν-ΑΡΡ誘發之轴突退化所需0 146428.doc 150· 201034684 在圖16A中自左至右，上部三張照片展示獲自DR6+/-(het)小鼠之神經元。第一張照片展示未暴露於Αβ或N-APP 之對照神經元，第二張照片展示暴露於Αβ之神經元且第三張照片展示暴露於Ν-ΑΡΡ之神經元。下部三張照片展示獲自DR6-/-(KO)小鼠之神經元。自左至右，下部第一張照片展示未暴露於Αβ或N-APP之對照神經元，第二張照片展示暴露於Αβ之神經元且第三張照片展示暴露於Ν-ΑΡΡ之神經元。用以產生此圓16Α中展示之資料的材料及方法如下。如實例2中所述進行連合外植體培養及存活檢定。先前已描述DR6缺乏小鼠品系（DR6.KO)(Zhao等人，义Med. 194:1441-1441，2001)。用於此檢定之人類重組Ν-ΑΡΡ胺基酸 19-306 係購自 Novus(Novus Biologicals，目錄號 H00000351-P01)。用於此檢定之重組人類β類澱粉胺基酸 1-42係購自Chemicon(超純人類Αβ1-42，目錄號AG912， Chemicon)。塗鋪後24小時，連同BACE抑制劑一起將Ν-APP以3 pg/ml添加至連合外植體中。塗鋪後24小時，連同 BACE抑制劑一起將重組人類β類澱粉胺基酸1-42以3 μΜ添加至連合外植體中。該檢定中BACE抑制劑以1 μΜ最終濃度使用（InSolution ΟΜ99-2，Calbiochem/Merck)。以指定量之N-APP或Αβ將連合外植體再培育24小時。連合外植體塗鋪後48小時收集資料。為觀測連合軸突，在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡（在明視場中）上使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 -151 - 146428.doc 201034684 SP 1(03/2006)電腦軟體拍攝照片。如圖16B中所示，拮抗劑DR6抗體未能阻斷由Αβ觸發之軸突退化。在圖16Β中自左至右，上部三張照片展示對照神經元、在BACE-I存在下之神經元及在BACE-I及Αβ存在下之神經元。在圖16Β中，下部兩張照片展示在B ACE-I、 Αβ及抗DR6抗體4Β6.9.7存在下之神經元，且隨後為在 BACE-I、Αβ及抗DR6抗體3F4.4.8存在下之神經元。用以產生此圖16Β中展示之資料的材料及方法如下。如實例2中所述進行連合外植體培養及存活檢定。用於此檢定之重組人類β類澱粉胺基酸1-42購自Chemicon(超純人類 Αβ1-42，目錄號AG912，Chemicon)。該檢定中BACE抑制劑以1 μΜ最終濃度使用（InSolution OM99-2，Calbiochem/ Merck)。塗鋪後24小時，連同BACE抑制劑及指定40 gg/ml 之抗DR6 mAb —起將重組人類β類澱粉胺基酸1-42以3 μΜ 添加至連合外植體中。該檢定中BACE抑制劑以1 μΜ最終濃度使用（InSolution ΟΜ99-2，Calbiochem/Merck)。以指定量之Αβ將連合外植體再培育24小時。連合外植體塗鋪後 48小時收集資料。藉由以如上文實例3中所述之DR6胞外域免疫小鼠產生小鼠單株4Β6.9.7、ΙΕ5.5.7、3F4.4.8, 2C7.3.7 及 3Β11.7.7 DR6抗體。如上所述，此處命名為Β6·9·7及3F4.4.8抗體之 DR6抗體為實例3中描述之DR6抗體。為觀測經GFP標記之連合軸突，在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡（在GFP之綠色勞光通道中）上使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions之 146428.doc -152- 201034684

AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。實例13 :細胞内DR6信號傳導卡斯蛋白酶為漸進式細胞死亡路徑中之重要因子（參見例如 Grutter 等人，Curr. Opin. Struct. Biol. 10(6):649-55 (2000) ; Kuida等人，Waiwre 384(6607):368-72 (1996);及 Finn等人，J. iVewrc^cz·. 20(4):1333-41 (2000))且某些卡斯蛋白酶與包括亨廷頓氏病及AD之神經退化性疾病中之細胞内信號傳導相關聯（參見例如Wellington等人，乂 Ο iVewroscz·· 22(18):7862-72 (2002) ; Graham 等人，Ce" 125(6):1179-91 (2006) ; Guo等人，dm. J. (2):523- 31 (2004);及 Horowitz等人，iVewroscz·· 24(36):7895-902 (2004)) 〇圖17A展示經培養5天且隨後暴露於各種不同培養條件24 小時之感覺神經元之照片。如圖17Α中所示，軸突退化藉由抑制JNK及上游卡斯蛋白酶-8而非下游卡斯蛋白酶-3而 Q 延遲。在圖17Α中，左側以下行順序之兩張照片分別展示暴露於NGF及抗NGF抗體之感覺神經元。在圖17Α中，右側以下行順序之4張照片分別展示暴露於以下各物之感覺神經元：抗NGF抗體及JNK抑制劑；抗NGF抗體及卡斯蛋白酶-8抑制劑；抗NGF抗體及ΒΑΧ抑制劑；及抗NGF抗體及卡斯蛋白酶-3抑制劑。用以產生此圖17Α中展不之貢料的材料及方法如下。如上實例8中所述在肯佩諾腔室中進行NGF剝奪檢定。此檢 146428.doc -153 - 201034684 定中小分子爪〖抑制劑8卩6〇〇125以10]^最終濃度使用（8? 600125，目錄號 1496，Tocris Bioscience)。此檢定中卡斯蛋白酶-3抑制劑Z-DEVD-FMK以10 μΜ使用（Z-DEVD-FMK，目錄號264155，Calbiochem)。此檢定中卡斯蛋白酶-8抑制劑 Z-IETD-FMK以 10 μΜ使用（Z-IETD-FMK，目錄號FMK007，R&D Systems)。ΒΑΧ抑制性肽以10 μΜ使用以阻斷神經元細胞死亡（Bax-V5，Tocris Inc)。先前已描述 (Deckwerth 等人，jVewrow 1 7:401-4 11，1 996)Bax缺乏小鼠品系（Bax-Rl)且其獲自傑克遜實驗室（Jackson Lab)。如實例1、7及8中所述進行用TUJ1抗體（1:500，Covance)對感覺轴突之免疫螢光標記。為觀測肯佩諾腔室之轴突隔室中經免疫榮光標記之感覺軸突，在Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4_5.0·0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。圖17B提供E12.5運動神經元外植體培養物之運動神經元之照片，且其展示卡斯蛋白酶-3在細胞體中起作用，而卡斯蛋白酶-6在軸突中起作用。在圖17B中自左至右，4張照片分別展示在以下條件下培養之神經元：（1)生長因子；（2)無生長因子且不存在卡斯蛋白酶抑制劑（對照）；（3)無生長因子，存在卡斯蛋白酶-3 抑制劑；及（4)無生長因子，存在卡斯蛋白酶-6抑制劑。用以產生此圖17B中展示之資料的材料及方法如下。此檢定中卡斯蛋白酶-3抑制劑Z-DEVD-FMK以10 μΜ使用（Z- 146428.doc •154· 201034684 DEVD-FMK，目錄號 264155，Calbiochem)。此檢定中卡斯蛋白酶-6抑制劑Z-VEID-FMK以10 μΜ使用（Z-VEID-FMK，目錄號 550379，Becton，Dickinson and Company PHARMINGEN部門）。如上文實例6中所述進行運動神經元腹側脊髓存活檢定。如實例1、7及8中所述進行用TUJ1抗體（1:500，Covance)對運動軸突之免疫螢光標記。為觀測經免疫勞光標記之運動軸突，使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電 Q 腦軟體在Axioplthe-2 Imaging Zeiss顯微鏡上拍攝照片。圖17C提供經培養5天且隨後暴露於各種不同培養條件24 小時之感覺神經元之照片。圖17C之資料展示儘管卡斯蛋白酶-3似乎不為軸突退化所需，但ΒΑΧ為其所需。在圖17C中自左至右，上部4張照片分別展示用NGF ;且隨後在抗NGF抗體（亦即NGF剎奪）存在下培養16、24及48 小時之ΒΑΧ +/+神經元。下部4張照片相應地分別展示用 NGF且隨後用抗NGF抗體培養16、24及48小時之ΒΑΧ -/-神 ❹經元。用以產生此圖17C中展示之資料的材料及方法如下。如上在上文實例8中所述在肯佩諾腔室中進行NGF剝奪檢定。先前已描述（Deckwerth 等人，17: 401-411, 1996)Bax缺乏小鼠品系（Bax-Rl)且其獲自傑克遜實驗室 (Jackson Lab)。將NGF抗體用於肯佩諾腔室之軸突隔室中之NGF剝奪檢定（單株功能阻斷抗NGF #911，Genentech， 20 pg/ml)。如實例1、7及8中所述進行用TUJ1抗體 146428.doc -155- 201034684 (1:500 ’ Covance)對感覺轴突之免疫螢光標記。為觀測肯佩諾腔室之軸突隔室中經免疫螢光標記之感覺軸突，在 Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上（在綠色螢光通道中）使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVisi〇n40 Release 4.5.0.0 SP 1(03/2006)電腦軟體拍攝照片。圖17D提供經在不同培養條件下培養24小時之El3大鼠外植體連合神經元之培養物的照片。圖17D之資料展示卡斯蛋白酶-3在細胞體中起作用，而卡斯蛋白酶_6在軸突中起作用。

在® 17D中自左至右’上部三張照片分別展示與經卡斯蛋白酶-3或卡斯蛋白酶_6抑制劑培養之神經元相比對照神經元之GFP分析。下部三張照片相應地分別展示與經卡斯蛋白酶3或卡斯蛋白酶_6抑制劑培養之神經元相比對照神經元之TUNEL(細胞死亡）分析。

用以產生此圖17D中展示之資料的材料及方法如下。女實例2中所料行連合外植體培養及存活衫。如上文^ 4令所述在連合外植體培養物中藉由TUNNEL檢定萄測連合細胞體中之漸進式細胞死亡。將連合外植體於4? A/PBS中固疋且經處理以便基於膽a股斷裂之標资 (⑽舰技術）使用原位細胞死亡偵測套組（目錄號η 68 ‘

795 910，如）根據製造商之使用手冊（Roche)在單細诞層面㈣漸進式細胞死亡（細胞〉周亡）。藉由螢光顯微鏡掏刀析連合、感覺及運動外植體培養物之細胞體中的細胞周亡（圖間。此檢定中卡斯蛋白酶·3抑制劑Z_DEVD_FMK 146428.doc -156- 201034684 以 10 μΜ 使用（Z-DEVD-FMK ，目錄號 264155 ，

Calbiochem)。此檢定中卡斯蛋白酶-6抑制劑Z-VEID-FMK 以 10 μΜ 使用（Z-VEID-FMK，目錄號 550379，Becton， Dickinson and Company，PHARMINGEN部門）。為觀測經 GFP標記之連合軸突，在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡（在 GFP之綠色螢光通道中）上使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SPl(03/2006)電腦軟體拍攝照片。為觀測螢光標記之TUNNEL陽性凋亡細胞〇體，在 Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上（在 TUNNEL之紅色螢光通道中）使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SPl(03/2006)電腦軟體拍攝照片。實例14 :動物模型中之DR6拮抗劑活性熟習此項技術者可採用許多與不同神經退化性疾病相關之動物模型來研究活體内DR6拮抗劑作用。舉例而言， APP/RK轉殖基因小鼠表現突變型類澱粉前驅蛋白多肽且〇顯示嚴重神經退化及細胞凋亡。因此，APP/PK轉殖基因小鼠提供阿茲海默氏症之模型，其可用於研究DR6拮抗劑對與在此動物模型中觀測到之此症候群相關的病理學過程之作用（參見例如 Moechars等人，Neuro*sck«ce 91(3): 819-830 (1999))。諸如APP23及JNPL3轉殖基因品系之多種其他轉殖基因鼠類品系表現突變型阿茲海默氏症相關多肽，且進一步顯示神經元細胞損失。因此，APP23及JNPL3轉殖基因小鼠提供可投與DR6拮抗劑之阿茲海默氏症之替代 146428.doc -157- 201034684 模型（參見例如 McGowan等人，ζ·« Geweiz’cs 22(5) (2006)) 〇 G93A SOD1轉殖基因小鼠表現人類超氧化歧化酶突變型多肽，且顯示升高程度之卡斯蛋白酶-3表現以及運動神經元細胞凋亡。G93A SOD1轉殖基因小鼠提供肌萎縮性側索硬化之模型，其可用於研究DR6拮抗劑之作用（參見例如 Tokuda^ A j Brain Res. 1148: 234-242 (2007);及 Wang等人，五wr. J. 26(3): 633-641 (2007))。R6/2轉殖基因小鼠在其原生啟動子控制下表現具有延長N末端聚麩胺酸重複之亨廷頓（huntington)之外顯子-1，且顯示暗示人類亨廷頓氏病之進行性神經病理學變化（參見例如Mangarini 等人，Cd/，87, 493-506 (1996) ; Chen等人，iVai. Med. 6, 797-801 (2000))。R6/2轉殖基因小鼠提供亨廷頓氏病之模型，其可用於研究DR6拮抗劑對與在此動物模型中觀測到之此症候群相關的病理學過程之作用（參見例如Wang等 A 5 Eur. J. Neurosci. 26: 633-641 (2007)) ° PK-KO轉殖基因小鼠並不表現Park-2基因之蛋白質產物，顯示類似帕金森氏病之異常且具有與野生型小鼠相比對細胞凋亡更敏感之神經元（參見例如 Casarejos等人，J. TVewroc/zem. 97(4): 93 4-46 (2006))。PK-KO轉殖基因小鼠提供帕金森氏病之模型，其可用於表徵DR6拮抗劑對與在此動物模型中觀測到之此症候群相關的病理學過程之作用。此外，諸如Smn-/-SMN2小鼠、攜帶在人類AR啟動子控制下之純239三核苷酸CAG重複以及具有至少一個在鼠類背景中起作用的人類 146428.doc -158· 201034684 SMN基因複本之轉殖基因雙重原生小鼠Smn基因剔除的轉殖基因小鼠之許多轉殖基因小鼠品系皆不表現存活運動神經元基因之蛋白質產物或表現存活運動神經元基因之蛋白質產物之變異形式，且因此顯示類似脊髓性肌萎縮疾病之異常（參見例如 Hsiu 等人，iVaiwre 24，66-70 (2000) ; Ferri等人 ’ iVeMrorepori 15(2): 275-280 (2004); Ferri 等人，Cwrr·价〇/· 2003 年 4 月，15;13(8):669-73 ;及 Rossol等人，J. Ce// 別〇/.，第 163卷（4):801-812 (2003))。〇因此，該等轉殖基因鼠類品系提供脊髓性肌萎縮之模型，其可用於表徵DR6抬抗劑對與在此動物模型中觀測到之此症候群相關的病理學過程之作用。包括上文所述者之神經病狀或病症之動物模型可用於研究本文中揭示之DR6拮抗劑之作用，該等拮抗劑為例如一或多種結合DR6之抗體（例如3F4.4.8、4B6.9.7或1E5 5 7單株抗體），及/或結合APP之DR6之一或多種可溶形式（例如包含SEQIDN0: 1之胺基酸1-354者），及/或一或多種結合〇 APP之抗體（例如22C11單株抗體）以及此等藥劑彼此及/或與其他在此項技術中已知之治療劑之組合。在本文中揭示之一或多種DR6拮抗劑之實驗性測試的說明性方案中，可將動物模型之許多年齡及性別匹配動物 (例如6月齡雌性APP/PK轉殖基因小鼠）分配至多個測試及/ 或對照組之一者。可隨後根據特定投藥方案將所選dr6拮抗劑投與此等動物之第一測試組（例如對於每兩週之每次注射以20 mg/kg體重腹膜内注射DR6拮抗劑抗體，歷時六 146428.doc -159- 201034684 個月之時間）°其他測試组之條件可根據標準操作規程改變’例如：投與不同劑量之DR6拮抗劑（例如卜5、1〇、15 mg/kg體重）；投與不同時程之DR6拮抗劑（例如每週注射，歷時u個月之時間广投與不同DR6拮抗劑（例如DR6免疫黏附素）；使用藥劑組合（例如與膽鹼酯酶抑制劑組合之 DR6拮抗劑），使用不同投藥途棱（例如靜脈内投藥）等。一或多個動物組可充當對照，例如根據與接受DR6拮抗劑之測試組相同的投藥過程接受無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水之組。在接文DR6拮抗劑後之某些時間，可隨後比較此等動物之測試及匹配對照組以例如研究及/或表徵DR6拮抗劑之活體内作用。舉例而t，可藉由諸如磁共振顯微鏡術及/或免疫組織化學分析之技術評估此等動物之測試及對照組之包含來自特定組織或器官（例如大腦）之神經元細胞的樣本以比較此等組中神經元細胞之狀態（參見例如petrik等人， Μ从 9(3):216-29 (2007))。或者，可藉由諸如多光子顯微鏡術之技術評估獲自此等組之樣本以證明諸如神經突軌道改變、樹突棘損失或樹突薄化之現象（參見例如Tsai等人，iVewoKi· 7:1181_1183 (2〇〇4);及

Spires等人，乂 W卿似·，25:7278-7287 (2005))。或者，可使獲自此等組之血液或其他組織樣本經受經設計以量測諸如IL-Ιβ、TNF-α、IL-10、P53蛋白質、干擾素彳或^^⑼的炎症及/或細胞凋亡之標記的含量之ELISA方案（參見例如 Rakover等人，如 4(5):392 4〇2 (2〇〇7);及 146428.doc •160· 201034684

Mogi等人，Ze". 414(1):94-7 (2007))。或者，可以在此項技術中已知之行為測試範例比較來自測試及匹配對照組之動物，該等範例例如莫里斯（Morris)水迷宮或目標識別測試（參見例如Hsiao等人，Science 274，99-102 (1996) ; Janus等人，TVaiwre 408:979-982 (2000) ; Morgan 等人，Nature 408:982-985 (2000);及 Ennaceur 等人，忍e/ζαν. Λα. 1988，31:47-59)。動物之測試與匹配對照組之間比較的結果將允許熟習此項技術者研究動物模型 0 中DR6拮抗劑之活體内作用。實例1-13，其中包括之資料及此等資料之相關特徵證明 DR6拮抗劑將例如抑制神經元細胞之活體内細胞凋亡。特定言之，上文之實例1-13教示例如：（1)DR6誘發多種神經元細胞之細胞凋亡；（2)APP為DR6之同源配位體，其結合 DR6且觸發DR6介導之細胞凋亡；及（3)抑制活體外 DR6/APP結合相互作用之DR6拮抗劑因此抑制DR6介導之活體外細胞凋亡。鑒於申請者之觀測結果及揭示内容，熟 ❹ 習此項技術者將合理地預期DR6拮抗劑抑制DR6介導之活體内細胞凋亡。因此，如本文中所述，熟習此項技術者將合理地預期諸如彼等上文所述者之動物模型及相關技術用於研究在此等動物模型中所觀測到之各種病理學過程以證實DR6拮抗劑之生物活性。實例I5:脊髓性肌萎縮動物模塑中之Ra.l(「1E5.S.7」）、 Ra.2、Ra.3(「3F4.4.8」）及 Ra.4 抗體治療脊髓性肌萎縮（SMA)為影響脊髓之前柱中的運動神經元 146428.doc •161· 201034684 之隱性運動神經元疾病，且認為其因SMN(存活運動神經元）蛋白質減少產生。SMA之動物模型為具有以下品系名稱之轉殖基因小鼠品系：品系名稱：FVB.Cg-Tg (SMN2*A7)4299Ahmb Tg(SMN2)89Ahmb SmnltmlMsd/J (JAX 5025)(參見例如 Le等人，Human Molecular Genetics 14(6):845-857 (2005))。此三倍體突變型小鼠具有兩個轉殖基因等位基因及單一靶向突變體。Tg (SMN2*A7)4299Ahmb等位基因由缺乏外顯子7之SMA cDNA組成，而Tg(SMN2)89Ahmb等位基因由整個人類 SMN2基因組成。在下文之描述中，此品系亦稱為Δ7 SMA KO模型。靶向突變型Smn等位基因同型接合且兩個轉殖基因等位基因同型接合之小鼠顯示類似於罹患近端脊髓性肌萎縮 (SMA)之患者的症狀及神經病理學。出生時，三倍突變體顯著小於正常仔畜。截至第5天，肌無力之病徵明顯且在接下來的一週内因小鼠顯示步態異常、後肢顫抖及易於倒下而逐漸變得更加顯著。平均存活時間為約13天。三倍體突變型小鼠進一步顯示對平面翻正反射、負趨地性及懸崖排斥而非對觸覺刺激之反應受損。此等小鼠中自發運動活動及握力亦顯著受損（參見例如Butchbach等人，WewroWo/ 27(2):207-19 (2007))。以下方案經設計以測定諸如 DR6拮抗劑抗體之某些抗體及劑量對Δ7 SMA模型小鼠 (ΚΟ)之存活、體重及肌緊張之作用。

如上所述，用於此研究中之小鼠可為A-7 SMA (JAX 146428.doc -162- 201034684 5025)ΚΟ模型（smn-/- ; SMN2+/+ ; d7+/+)。出生時，可伴以例如移除相等數目之雄性及雌性將同窩仔畜隨機剔除至 10隻動物（或某些其他數目）。此方案後，截至第一次給藥時（P3)同窩仔畜可經剔除至8隻小鼠。可自研究排除少於6 隻幼畜之任何同窩仔畜。可自週一與週三之間出生的同窩仔畜出生時（P0)將小鼠尾剪斷。可藉由在此項技術中已知之多種方法進行基因型分析，例如使用可購自諸如 Transnetyx Inc之分子診斷公司的自動基因型分析服務篩選 0 生檢中之轉殖基因、基因剔除及插入突變。通常出生後48 小時内可獲得該基因型資料。在說明性實驗中可使用例如週一至週三出生之小鼠。可在P3起始對小鼠IP給藥。研究中之典型數目可為：（1)例如平均10隻KO(5隻雄性及5隻雌性）使用諸如無菌PBS之媒劑對照；（2)例如平均1 0隻ΚΟ(5隻雄性及5隻雌性）使用包含 20 mg/kg之各別抗體之第一劑量；及（3)例如平均10隻 KO(5隻雄性及5隻雌性）使用包含5 mg/kg之各別DR6抗體之〇第二劑量。各動物可每週兩次接受各別4B6.9.7、 IE5.5.7、3F4.4.8 及 2C7.3.7 抗體之 IP 給藥。2C7.3.7 抗體 (Genentech, Inc·)為結合DR6但不阻斷功能之抗體。 3B 11.7.7抗體（Genentech, Inc.)為結合DR6但可增強或刺激 DR6活性之抗體。 4B6.9.7、IE5.5.7、3F4.4.8 及 2C7.3.7 抗體可在 4°C 下儲存。必要時，可在給藥之前將此等抗體溫至室溫。可使用諸如PBS之典型媒劑。儘管此實例中之4B6.9.7、IE5.5.7、 146428.doc -163 - 201034684 3F4.4.8及2C7.3.7單株抗體係使用人類DR6多肽序列作為免疫原產生，但如諸如實例7中所述之軸突退化及細胞凋亡檢定方案所示，所有此等抗體與人類以及大鼠及小鼠DR6 反應。在一說明性實施例中，所評估之DR6拮抗劑可為拮抗劑抗體：4B6.9.7、IE5.5.7、3F4.4.8 及 2C7.3.7 ;每種抗體治療組之數目可為2組（每組10隻動物）；投藥途徑可為ιρ ;且劑量範圍可為5及20 mg/kg。視情況該等組可如下： 4B6.9.7 ： 5 mg/kg IP ； (2) 4B6.9.7 ： 20 mg/kg IP ； (3) IE5.5.7 3F4.4.8 2C7.3.7

5 mg/kg IP ； (4) IE5.5.7 ： 20 mg/kg IP ； (5； 5 mg/kg IP，（6) 3F4.4.8 : 20 mg/kg IP ; (7、 5 mg/kg IP，（8) 2C7.3.7 : 20 mg/kg IP ;及（9)媒劑（PBS)IP。在此方案中，可將小鼠每日稱重。在出生後第10、12及14天（PND)，可稱量同窩仔畜中各仔畜之體重。在PND 6、8、10、12、14及16，可對研究中之每隻動物進打肌緊張評估（參見例如下文提供之說明性基因型分析方案）。

$在出生之日（Ρ0)，可使用在皮下應用之無毒墨水將幼畜身且取尾剪段樣本用於基因型分析（通常可在a小時之、獲得、果）。在實驗當天（ρ3)可每天在同一時間將母畜與初生仔畜帶至實驗室且在測試開始前使其鎮定至少1〇分鐘:可首先在趨地性職巾且隨後在管測試（2次連續管測試試驗）中測試幼畜。可將幼畜置於經加熱之襯塾上，直至Κ同窩仔畜中之所有幼畜，且隨後可使所有幼畜返回 146428.doc -164* 201034684 至其母畜（幼畜可與其籠之草墊混合以使處理後母畜之排斥反應最小）。自出生直至斷乳可每天檢查存活及體重。通常在先前進行之慢性MTD研究期間評估藥物對初生仔畜軸向體溫之影響。體溫：可在規定年齡取軸向體溫之一個讀數。可藉由包括趨地性之研究方案研究測試及對照組中小鼠之差異。趨地性測試當面向下放置在傾斜平台上時動物自身定向之能力。此測試量測運動協調及前庭系統。〇可使用Kaplan-Meier分析以Mantel_c〇J^為事後測試進行存活評估。為分析隨時間重複量測之資料，可採用混合效應模型 (亦稱為混合ANOVA模型）。如典型重複量測AN〇vA* 析，此方法係基於似然性估算而非矩估計法，但其對於歸因於】鼠隨時間死亡而遺漏值更可靠。可使用SAs 9丄3(SAS lnstitute，Cary，NC)中之 pR〇c mixed_式擬合所有模型。治療為模型中之最重要因素。亦可考慮性別及天數以及其與治療之相互作用。研究終點可為死亡。可藉由諸如彼專於實例丨4中所述（例如組織學分析）之方法進一步評估動物。此外，可評估血清/ Α液以測定 4B6.9.7, IE5.5.7, 3F4.4.8 及 2C7.3.7 血清濃度。實例16 方法間隔（肯佩諾）腔室培養 146428.doc -165- 201034684 使用肯佩諾神經細胞腔室系統以自個別隔室（流體環境）中之細胞體分離神經突出（軸突）。如所述（Campenot等人， (1991) J. 11:1126-1139)加以一些修改來進行檢定。簡言之，以PDL/層黏連蛋白塗布3 5 mm組織培養孤且以大頭把（Tyler Research)刮擦以產生軌道。將一滴培養基 (具有B27補充劑、25 ng/ml NGF及4 g/L曱基纖維素之神經基質培養基）置於經刮擦之底層。將鐵氟龍分隔器（Tyler Research)固定在聚石夕氧潤滑脂上，且將少量聚石夕氧潤滑脂置於中心缝之口處。將獲自E12.5小鼠DRG之解離感覺神經元懸浮於經曱基纖維素稠化之培養基中且裝填入裝備有 22號針之拋棄式無菌注射器中。在解剖顯微鏡下將此細胞懸浮液注入各間隔培養皿之中心縫中。將神經元靜置隔夜。以含曱基纖維素之培養基填充培養盟之外部周邊（細胞體隔室）及内部軸突隔室。活體外3-5天内，軸突開始出現在左及右隔室中。為觸發局部軸突退化，以含有NGF阻斷抗體（抗NGF 911，Genentech，50 pg/ml)之神經基質培養基替代來自轴突隔室之含NGF培養基。當指示時，在 NGF 剝奪時將抗 DR6.1 或對照 IgG(R&D systems)以 50 pg/ml 最終濃度添加至感覺軸突隔室中。在NGF剝奪後之不同時刻，在室溫下將培養物固定於4% PFA中30分鐘且處理以便以TUJ-l(Covance，1:500稀釋液）免疫螢光染色以藉由螢光顯微鏡術觀測正退化之軸突。背脊髓外植體檢定如所述（Wang 等人，（1999) iVaiwre 401:765-769)同時經 146428.doc •166- 201034684 以下修改來進行背脊髓（DSC)存活檢定。將E13大鼠胚胎置於L15培養基（Gibco)中。為觀測連合軸突，將GFp編碼質體注射至第四腦室且擴散至神經管中，接著藉由電穿孔傳遞至背祖細胞。接著解剖背脊髓外植體，包埋入3維膠原蛋白凝膠基質中，且在含重組軸突導向因子 1)(R&D systems)及 5%馬血清（Sigma)之〇pti-MEM/F12 培養基（Invitrogen)中在37°C下在5% C02環境中培養。在16小時内，回應於軸突導向因子-1，連合轴突自外植體長出進入 0 膠原蛋白凝膠内（Kennedy 等人，（1994) Ce// 78:425-435)。在24與48小時之間，神經元經歷漸進式細胞死亡及其軸突退化（Wang等人，（1999) 401:765-769)。當指示時，在塗鋪之後16小時以50 pg/ml添加純化之抗DR6.1或對照正常小鼠IgG(R&D systems)。在 Axiovert 200 Zeiss 倒置顯微鏡（在GFP之綠色螢光通道中）上使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions之AxioVision軟體拍攝照片。結果展示於圖18中。〇自軸突隔室剝奪NGF之後肯佩諾腔室中出現感覺軸突之局部退化（圖18圖A)。然而，感覺軸突之局部退化被JNK抑制劑SP600125(JNK-1、JNK-2及JNK-3之有效抑制劑）阻斷 (Bennett等人，（2001) Proc. iVa"_ Jcad. (Scz·. t/M 24:13681-13686)(圖18圖B)。儘管當在無順道營養因子存在下培養時 DSC外植體培養物中之連合神經元在48小時内以典型方式退化（圈18 (D)，圖之上部），但添加JNK抑制劑（1〇 μΜ L-JNKI-1)在很大程度上阻斷DSC外植體培養物中連合神經元 146428.doc -167- 201034684 在48小時之典型退化（圖18(D)，圖之下部）。實例17 方法免疫組織化學為進行 DR6(抗 DR6.1，1:100)、BACE(抗 N-BACE1 (46-62)，1:100，Sigma)及N-APP(多株，1:100，Thermo Fisher Scientific ;單株22C11，Calbiochem)之表面標記，不添加清潔劑。以抗DR6.1 mAb、抗N-BACE及N-APP多株抗體染色來自野生型小鼠及DR6基因剔除小鼠的P10背根神經節（DRG)神經元。結果展示於圖19中。圖19A展示DR6由DRG神經元表現。圖19B展示BACE表現於DRG神經元中且圖19C展示 APP存在於DRG神經元中。實例18 方法神經突外生長檢定如先前所述（Zheng等人，（2005) _Proc. Λ^αί/. 5W. 102·· 1205)解離P7小鼠之小腦顆粒神經元（CGN)或P1 0 小鼠之背根神經節（DRG)神經元。在塗有AP-Nogo66(150 毫微克/點）、OMgp(R&D，300毫微克/點）或N-APP(150毫微克/點）的經聚D-離胺酸塗布之96孔培養盤上培養神經元兩小時，且在塗有層黏連蛋白（10 pg/ml)的該等培養盤上培養神經元2小時（CGN)或4小時（DRG)。以神經元特異性抗β-微管蛋白抗體（TuJl，Covance)標記神經元。使用 146428.doc -168- 201034684

ImageJ軟體（NIH, Bethesda, MD，USA)量測最大轴突長度且在6個重複孔之間測定平均值。使用學生t檢驗（Student's t test)計算值。鹼性磷酸酶APP(APP-AP)結合檢定使與APP(1 -286)融合之鹼性磷酸酶短暫表現於COS細胞中且在36小時後收集條件培養基且過濾。在室溫下與50% 結合緩衝液（0.2% BSA、0.1% NaN3、5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、20 mM HEPES，HBSS pH 7.0)及 50%條件培養基 fy 一起培育初級培養物90分鐘。以結合緩衝液洗滌培養物若干次，接著以4%甲醛固定15分鐘，且以HBS(20 mM HEPES，pH 7·0，150 mM NaCl)沖洗三次。使内源性鹼性磷酸酶活性在65°C下加熱失活30分鐘。在以鹼性磷酸酶反應緩衝液（100 mM Tris，pH 9.5，100 mM NaCl，50 mM MgCl2)沖洗三次之後，在室溫下使用1:50 NBT/BCIP色溶液（Roche)觀測結合之AP隔夜。在顯示APP對神經突外生長之影響的研究中，在N-O APP(150毫微克/點）存在下培養P10 DRG神經元（圖20)且顯示APP抑制DRG神經元中之神經突外生長。此影響見於 DR6+/·而非DR6々·基因剔除之動物（圖21)。在測定Nogo在此路徑中之影響的研究中，在Nogo66存在下培養P10 DRG神經元（PirB"· ; NgR"·)(圖22)。結果顯示儘管Nogo處理如所預期抑制神經突外生長，但PirB及 NgR不能解釋所有利用Nogo處理所見之抑制。在神經突外生長檢定中使用抗APP抗體、抗DR6抗體、抗AP(4G8)、卡 146428.doc -169- 201034684 斯蛋白酶6(Caspase 6)之抑制劑及BACE之抑制劑進行進一步研究得到Nogo抑制降低（圖23-25)。以Nogo處理亦使得APP脫落（圖26)。

軸突再生之另一髓鞘來源抑制劑OMgp亦與DR6/APP路徑有關。Pl〇 DRG神經元中之研究顯示以OMgp處理使得神經突外生長受抑制，其可藉由抗DR6、抗A0(4G8)或 BACE抑制劑來消除抑制（圖27P 當使用P7小鼠之小腦顆粒神經元（CGN)進行研究時，許多結果為類似的。舉例而言，當APP以點狀出現於CGN上時APP抑制神經突外生長（圖28);針對APP及Ap(4G8)之抗體阻斷神經突外生長之Nogo抑制（圖29);卡斯蛋白酶6抑制劑及BACE抑制劑降低Nogo抑制（圖30) ; Nogo提高CGN 中之APP脫落（圖31);且OMgp抑制可藉由BACE抑制劑及卡斯蛋白酶6抑制劑阻斷之神經突外生長（圖32)。然而，以抗DR6抗體處理不阻斷神經突外生長之APP抑制（圖33)。在表明DR6不表現於CGN中之另一研究中，解釋抗DR6抗體不能阻斷神經突外生長之APP抑制（圖34)。然而，神經突外生長之APP抑制由阻斷性p75(使用p75+"及p75+突變體）抑制（圖35)。實例19 方法背半切損傷（Dorsal Hemisection Lesion) 使小鼠麻醉且接受T8脊髓背半切損傷。在康復兩週之後，藉由在三個注射部位（相對於前囟側向1.2 mm及前方 146428.doc -170- 201034684 0.5 mm、側向1.2 mm及後方0.5 mm，及側向1.2 mm及後方 1.0 mm)向軀體感覺皮質中0.5 mm注射1 0%四甲基羅丹明 (tetramethylrhodamine)及經生物素標記之聚葡萄糖胺 (BDA)溶液來單側標記皮層脊髓束。兩週以後，灌注動物。沿矢狀面切開（25 μιη)含損傷部位及損傷任一側4 mm 之組織。將緊接損傷前方及後方之3 mm區段製備為橫切片 (25 μιη)。如先前所述（Zheng等人，（2003) jVewrow 38:213-224)來觀測BDA。 0 背半切損傷後CST轴突之回縮/枯萎的定量包括距中線20 μηι、40 μιη及60 μιη之三個矢狀切面以便分析。在相對於損傷部位-2、-1、-0.5、-0.25、-0.1、0、 0.1、0.25、0.5、1、2 mm之位置計數BDA-陽性軸突之數目。接著將各值校正為相對於在-2 mm處存在之軸突數目的比率。計算各距離之平均值及標準誤差，且使用學生t 檢驗測定顯著性。以實驗者不知情之各基因型進行定量。背半切損傷後萌芽之定量〇對於在損傷部位3 mm内之萌芽，分析距中線20 μιη、4 0 μηι 及60 μιη之矢狀切面且求平均值。對於距損傷部位超過4 mm之萌芽，使用損傷部位前方4 mm之橫切片供分析。使用 ImageJ軟體（NIH，Bethesda，MD, USA)追蹤異位 CST纖維以測定萌芽像素密度（sprouting pixel density)。為調節 BDA標記效率，相對於矢狀切面中損傷部位前3 mm之經 BDA標記軸突之數目校正各個別動物之萌芽密度。在不知基因型之情況下進行定量。 146428.doc • 171 - 201034684 進行研究以測定Dr6/APP路徑是否影響活體内軸突再生長。一般而言，遭受半切損傷之軸突顯示在皮層脊髓束 (CST)範圍内損傷部位極少（若存在）再生（圖36)。然而，當對DR6基因剔除動物進行此等研究時，此等動物顯示軸突回縮減少且CST軸突萌芽增加（圖37)。材料之寄存以下材料已寄存於美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection ， 10801 University Blvd.,

Manassas, VA 201 10-2209, USA(ATCC))：材料 ATCC寄存編號寄存曰期 3F4.4.8 PTA-8095 2006年12月21曰 4B6.9.7 PTA-8094 2006年12月21日 1E5.5.7 PTA-8096 2006年12月21日依據布達佩斯條約（Budapest Treaty)之關於微生物寄存之國際識別的條款，出於專利程序及據此之管理（布達佩斯條約）的目的進行此寄存。此確保自寄存之日起保存寄存之活體培養物30年。寄存將由ATCC按照布達佩斯條約之條款同意進行，且其服從Genentech，Inc.與ATCC之間的協定，該協定確保相關美國專利頒予後或任何美國或國外專利申請案公諸於眾後（無論兩種情況何者首先出現），公眾可永久及無限制獲得寄存之培養物之子代，且確保子代可由待根據35 U.S.C· §122授權之美國專利與商標委員及與其有關的委員規定（包括37 CFR § 1.14，尤其參考886 OG 638)確定之人員獲得。 146428.doc -172- 201034684 本申凊案之受讓人已同意’若當在適當條件下培養時寄存之材料之培養物死亡或損失或破壞，則根據通知立即以另一相同材料替換該等材料。可獲得所寄存材料不應理解為准許違反任何政府當局根據其專利法授予的權利實施本發明。認為上述書面說明足以使得熟習此項技術者能夠實施本發明。本發明之範疇不應受本文中所提供之實例限制。實際上，除彼等本文十所示及所描述者外的本發明之各種修〇改形式將因上述說明而對熟習此項技術者變得顯而易見，且屬於隨附申請專利範圍之範疇内。【圖式簡單說明】圖1A展示人類DR6 CDNA之核苷酸序列（圓，SEQ ID NO: 2) ’其推導出之胺基酸序列（圖1A_2，SEQ m N〇: 1)以及其域結構之示意圖（圖1A_3)。在dR6示意圖中，指示包括推測信號肽、半胱胺酸富集域基元、跨膜域及死亡域之域邊界。在此示意圖中，指示推測信號肽、半胱胺酸畐集域基元、跨膜域及死亡域之推測域邊界。圖1B展示人類類澱粉前驅蛋白（APP)cDNA之695同功異型物的核^:酸序列（圖1B-1 ’ SEQ ID NO: 5)及其推導出之胺基酸序列（圖 1B-2，SEQ ID NO: 6)。囷1C展示人類類澱粉前驅蛋白之 751同功異型物的胺基酸序列（Seq Π) NO: 7)。圖1D展示人類類澱粉前驅蛋白（APP)cDNA之770同功異型物的核普酸序列（圖1D-1 ’ SEQ ID NO: 8)及其推導出之胺基酸序列 (圖 1D-2，SEQ ID NO: 9)。參見例如 UniProtKB/Swiss-prot 146428.doc -173- 201034684 entry P05067及相關揭示内容，包括分別與同功異型物ID P05067-1、同功異型物ID P05067-4及同功異型物ID P05067-8 有關的揭示内容（http://expasy.org/uniprot/ P05067)；圖2A展示DR6在發育階段E10.5-E12.5強烈表現於包括脊鏟之運動及連合神經元及背根神經節神經元之正發育之中樞神經系統中。圖2B展示表現在轴突及細胞體上之DR6蛋白質。圖2C展示表現於正分化神經元中之DR6 mRNA ; 圖3展示背脊髓外植體存活檢定中軸突退化及神經元細胞死亡之示意圖；指示藉由電穿孔將干擾RNA之siRNA劑連同GFP表現質體一起引入胚胎連合神經元中；圖4A說明小干擾RNA對DR6表現之抑制在背脊髓存活檢定中阻斷連合軸突退化且預防神經元細胞死亡。圖4B展示援救經DR6 siRNA阻斷之退化表型的RNAi抗性DR6 cDNA ；圖5展示拮抗性DR6抗體在背脊髓存活檢定中幫助阻斷轴突退化及神經元細胞死亡；圖6提供神經元的機制示意圖及照片，其展示藉由藥理學抑制c-Jun N端激酶（JNK)來下調DR6下游的細胞内信號傳導在外植體存活檢定中預防軸突退化及神經元細胞死亡；圖7展示拮抗性DR6抗體在離體全胚胎培養物中對脊椎運動及中間神經元之存活的神經保護作用；圖8提供用經裂解卡斯蛋白酶3抗體免疫染色之E15.5頸 146428.doc • 174- 201034684 部脊髓切片之照片，以展示DR6之損失在DR6缺乏胚胎的脊髓及背根神經節中使得神經元細胞死亡減少；圖9A展示對表現經裂解卡斯蛋白酶-3之E15.5 DR6 KO胚胎中神經元細胞之定量，其證明與DR6+/-仔畜對照（DR6 hets)相比DR6缺乏胚胎中神經元細胞死亡減少約50%。圖 9B提供細胞之照片，其展示如在神經營養生長因子存在及不存在之情況下正常小鼠與DR6基因剔除小鼠之比較所證實，DR6為運動軸突退化所需。圖9C提供細胞之照片，其 0 展示損傷誘發之軸突退化在DR6基因剔除小鼠中延遲；圖10A提供神經元之照片，其展示抗DR6抗體抑制因撤消各種營養因子剝奪神經元之神經生長因子（NGF)而產生的軸突退化。圖10B提供連合、感覺及運動神經元中細胞凋亡細胞體之TUNEL染色觀測之其他照片資料，其展示抗 DR6抗體抑制各種營養因子剝奪神經元的退化；圖11A提供連合神經元之照片，其展示可藉由DR6-FC延遲連合軸突退化。圖11B提供感覺神經元之照片，其展示〇因NGF撤消誘發之感覺軸突退化可經DR6-Fc延遲；圖12A提供神經元之照片，其展示使用DR6-AP觀測轴突上之DR6結合位點。圖12B提供在NGF存在及不存在之情況下神經元之照片，其展示NGF剝奪後DR6配位體結合位點自軸突消失。圖12C提供對在發育階段E12.5之ΒΑΧ缺乏感覺軸突之研究的照片，其展示β分泌酶（BACE)抑制劑可阻斷NGF撤消後DR6-AP結合位點自感覺軸突之消失；圖13Α提供獲自各種西方墨點法（Western blotting)程序 146428.doc • 175 - 201034684 之資料之照片，該程序中以DR6-AP(左上部）或抗N-APP抗體（右上部）探測神經元細胞之多肽，以及：（1)就多肽結合 DR6之能力選擇多肽；及隨後（2)以抗N-APP抗體探測多肽 (下圖，「DR6-ECD下拉」）。此資料鑑別類澱粉前驅蛋白 (APP)為DR6胞外域相關配位體。圖13B提供獲自允許觀測軸突條件培養基中用DR6-AP探測之DR6配位體（包括APP 多肽）的各種墨點法實驗之資料之照片。此墨點法資料鑑別許多包括35 kDa N端APP以及C99-APP及C83/C89 APP多肽之APP多肽；囷14A提供神經元之照片，其展示剝奪NGF後不久出現 APP胞外域脫落。圖14B提供細胞之照片，其展示DR6胞外域結合由培養細胞產生之APP。圖14C提供細胞之照片，其展示DR6為感覺軸突上N-APP之主要受體，且APP結合位點在DR6缺乏小鼠的神經元細胞中顯著消耗。圖14D提供細胞之照片，其展示DR6功能阻斷抗體破壞DR6胞外域與N-APP之間的相互作用；圖15A提供神經元之照片，其展示針對N端APP之多株抗體在連合軸突檢定中阻斷軸突退化。圖15B提供神經元之照片，其展示針對N端APP之多株抗體以及22C11抗APP單株抗體抑制因NGF移除誘發之局部軸突退化。圖15C提供神經元之照片，其展示藉由抑制β-分泌酶（BACE)活性阻斷之軸突退化可藉由添加Ν-ΑΡΡ援救。圏15D提供神經元之照片，其展示由RNAi移除ΑΡΡ使神經元細胞對由Ν-ΑΡΡ誘發之死亡敏感； 146428.doc -176· 201034684 圖16A提供神經元之照片，其展示DR6功能為N-APP誘發之軸突退化所需，而非由Αβ觸發之退化所需。圖16B提供神經元之照片，其展示功能阻斷DR6抗體未能阻斷由Αβ 觸發之軸突退化；圖17Α提供神經元之照片，其展示軸突退化藉由抑制 JNK及上游卡斯蛋白酶-8，而非下游卡斯蛋白酶-3而得以延遲。圖17Β提供來自Ε12·5外植體培養物之運動神經元之照片，其展示卡斯蛋白酶-3在細胞體中起作用，卡斯蛋白 0 酶-6在轴突中起作用。圖17C提供感覺神經元之照片，其展示儘管卡斯蛋白酶-3並不為軸突退化所需，但ΒΑΧ為其所需。圖17D提供連合神經元之照片，其展示卡斯蛋白酶-3在細胞體中起作用，而卡斯蛋白酶-6在軸突中起作用；圖18顯示轴突退化需要JNK功能。圖（Α)展示間隔（「肯佩諾」）腔室之示意圖；上部：自Campenot等人，（1991) ⑽c/· 11:1126-1139改編而來；及下部··在NGF存在下或在NGF剝奪之後，軸突及細胞體隔室（以ΤιιΠ染色）之典〇型影像。（軸突隔室之放大率為中心隔室之兩倍）。圖（B)展示肯佩諾腔室中感覺軸突之局部退化由JNK抑制劑 SP600125(JNK1、JNK2 及 JNK3 之有效抑制劑）阻斷（Bennett 等人，（2001)尸，〇二7\^".^^〇^.5^.£/1^4 24:1368卜 13686)。自軸突隔室剝奪NGF之後在肯佩諾腔室中出現感覺轴突之局部退化。該圖之上部展示在24小時保持具有 NGF(50 ng/ml)之培養物。該圖之中部展示在剝奪後24小時之培養物（以TuJl染色）。當在剝奪時添加SP600125(10 14642B.doc -177- 201034684 μιη)時（該圖之下部），退化在24小時在很大程度上被阻斷。圖（C)展示實驗範例之示意圖。連合（C)神經元來源於背脊髓中之背祖細胞（dP)，且將軸突送至底板（fp)。將GFP 質體（有或無其他質體及/或siRNA)電穿孔（指示電極（紅色：陽極；藍色：陰極）於dP中，使得C神經元及其轴突經 GFP標記。當將背脊髓外植體（DSC)與轴突導向因子-1 一起培養24小時時，軸突出現於膠原蛋白基質中。在無添加之營養因子（-TF)存在下，在接下來24小時内神經元死亡且其軸突退化。此等消退事件可藉由添加底板組織或含有未鑑別營養因子（+TF)之底板條件培養基來阻斷。圖（D)展示 D S C外植體培養物中之連合神經元當在無順道營養因子存在下培養時在48小時内以典型方式退化（圖之上部）（Wang 等人，（1999) iVWww 401:765-769);圖（D)之下部展示添加 JNK抑制劑（10 μΜ L-JNKI-1)在很大程度上阻斷DSC外植體培養物中連合神經元在48小時之典型退化；圖19展示在野生型（圖A)及DR6基因剔除（圖B)DRG神經元中，使用抗DR6.1 mAb對P10背根神經節神經元（DRG)進行免疫組織化學（IHC)染色。圖C展示使用抗BACE mAb對 P10 DRG神經元進行IHC染色。圖D展示以抗APP mAb對P1 DRG神經元進行IHC染色；圖20展示在不存在（圖A)或存在（圖B)APP之情況下P10 DRG神經元中之神經突外生長檢定。圖C展示在抑制存在 APP時觀測到之神經突外生長中的定量結果；圖21展示在不存在（圖A)或存在（圖B)APP之情況下P10 146428.doc •178· 201034684 DRG神經元之神經突外生長檢定。圖C展示在DR6基因剔除（DR_")DRG神經元中存在APP時之神經突外生長。圖D 展示在APP存在或不存在時觀測到之神經突外生長抑制之定量結果；圖22展示不存在及存在Nogo時之神經突外生長抑制。該等圖展示在野生型DRG神經元中或在PirB^/NgR"· DRG神經元中，未以Nogo處理或單獨以Nogo處理的結果；圖23展示抗APP抗體（圖A)及抗DR6抗體（圖B)對以Nogo 0 處理之P10 DRG神經元的抑制消除作用；圖24展示存在及不存在Nogo時抗Αβ抗體（圖A)對P10 DRG神經元之抑制消除作用；圖25展示存在及不存在Nogo時卡斯蛋白酶6抑制劑（圖Α) 及BACE抑制劑（圖B)對P10 DRG神經元之抑制消除作用；圖26展示以Nogo處理增加APP脫落。圖A展示存在及不存在Nogo時P10 DRG神經元表面上APP之定量之量；圖B 展示不存在Nogo時之DRG ;圖C展示不存在Nogo時之DRG 〇神經元；圖27展示以〇11^?處理0110神經元之作用。圖八展示存在或不存在OmgP時之DRG神經元及存在抗DR6抗體時之抑制消除。圖B展示存在或不存在OmgP時之DRG神經元及存在B ACE抑制劑時之抑制消除；圖28展示在APP不存在（圖A)或存在（圖B)之情況下P7小腦顆粒神經元（CGN)中之神經突外生長檢定。圖C展示在存在APP時所觀測到之神經突外生長之抑制的定量結果； 146428.doc -179- 201034684 圖29展示存在或不存在Nogo時抗APP抗體（圖A)及抗Αβ 抗體（圖Β)對P7CGN之抑制消除作用；圖30展示存在及不存在Nogo時卡斯蛋白酶6抑制劑（圖Α) 及BACE抑制劑（圖B)對P7 CGN之抑制消除作用；圖31展示以Nogo處理增加APP脫落。圖A展示存在及不存在Nogo時P7 CGN表面上APP之定量之量；圖B展示不存在Nogo時之CGN ;圖C展示存在Nogo時之CGN ; 圖32展示以OmgP處理CGN之作用。展示存在或不存在 OmgP時CGN之條形圖，及存在卡斯蛋白酶6抑制劑及 B ACE抑制劑時之抑制消除；圖33展示在APP不存在（圖A)或存在（圖B)之情況下P7 CGN之神經突外生長檢定。圖C展示存在APP及抗DR6 mAb時之神經突外生長。圖D展示在APP存在或不存在時觀測到之神經突外生長抑制之定量結果及存在抗DR6 mAb 時缺乏抑制消除；圖34展示DR6不表現於CGN中。圖A:以抗DR6.1染色之野生型CGN;圖B:以抗DR6.1染色之DR6基因剔除CGN; 圖C :未添加經鹼性磷酸酶標記APP(APP-AP)之Dr6+/_ CGN;圖D:添加 APP-AP 之 Dr6+/- CGN;圖E:添加 APP-AP之 DR6基因易J 除（DR6+)CGN ; 圖35展示在APP不存在（圖A)或存在（圖B)之情況下P7 CGN之神經突外生長檢定。圖C展示在p75基因剔除（p75+) CGN中存在APP時之神經突外生長。圖D展示在APP存在或不存在時觀測到之神經突外生長抑制之定量結果； 146428.doc -180- 201034684 圖36展示半切損傷範例之示意圖。圖A展示半切損傷及注射生物素標記聚葡萄糖胺（BDA)之位置；圖B展示來自展示極少或無皮層脊髓束（CST)軸突延伸至損傷部位的示意圖之分解圖之IHC ;及圖37展示DR6突變體顯示在背半切損傷之後軸突回縮減少且CST軸突萌芽增加。圖A展示軸突回縮之圖。圖B展示對照及DR6基因剔除軸突中CST軸突異位萌芽之條形圖。

146428.doc 181 · 201034684 序列表 <11〇>美商建南德克公司 <：120>抑制神經退化之方法 <130> P4218R2 <140> 099104907 <141> 2010-02-12 <150> 60/871528 <151> 2006-12-22 <150> 60/900848 <151> 2007-02-12 <150〉 61/061062 <151> 2008-06-12 <150> 61/153540 <15]> 2009-02-18

<150> PCT/US07/088521 <151> 2007-12-21 <150> PCT/US09/47255 <151> 2009-06-12 <160> 17 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 and Microsoft Word Pad <210> 1 <211> 655 <212> PRT <213>智人 <220> <223>人類死亡受體6 <400> 1

Met Gly Thr Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg 1 5 10 15 lie Ala Arg Arg Ala Thr Ala Thr Met lie Ala Gly Ser Leu Leu Leu 20 25 30

Leu Gly Phe Leu Ser Thr Thr Thr Ala Gin Pro Glu Gin Lys Ala Ser 35 40 45

Asn Leu He Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Ala Thr Gly Gin Val 50 55 60

Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Scr Glu His Cys 65 70 75 80

Thr Asn Thr Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Val Gly Thr Phe 85 90 95

Thr Arg His Glu Asn Gly lie Glu Lys Cys His Asp Cys Ser Gin Pro 100 105 110

Cys Pro Trp Pro Met lie Glu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp 115 120 125

Arg Glu Cys Thr Cys Pro Pro Gly Met Phe Gin Ser Asn Ala Thr Cys 130 135 140

Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val Arg Lys Lys Gly 145 150 155 160

Thr Glu Thr Glu Asp Val Arg Cys Lys Gin Cys Ala Arg Gly Thr Phe 165 170 175

Ser Asp Val Pro Ser Ser Val Met Lys Cys Lys Ala Tyr Thr Asp Cys 180 185 190

Leu Ser Gin Asn Leu Val Val lie Lys Pro Gly Thr Lys Glu Thr Asp 195 200 205

Asn Val Cys Gly Thr Leu Pro Ser Phe Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser 2l〇 215 220

Pro Gly Thr Ala lie Phe Pro Arg Pro Glu His Met Glu Thr His Glu 225 230 235 240 146428.doc 201034684

Val Pro Ser Ser Thr Tyr Val Pro Lys Gly Met Asn Ser Thr Glu Ser 245 250 255

Asn Ser Ser Ala Ser Val Arg Pro Lys Val Leu Ser Ser lie Gin Glu 260 265 270

Gly Thr Val Pro Asp Asn Thr Ser Ser Ala Arg Gly Lys Glu Asp Val 275 280 285

Asn Lys Thr Leu Pro Asn Leu Gin Val Val Asn His Gin Gin Gly Pro 290 295 300

His His Arg His lie Leu Lys Leu Leu Pro Ser Met Glu Ala Thr Gly 305 310 315 320

Gly Glu Lys Ser Ser Thr Pro lie Lys Gly Pro Lys Arg Gly His Pro 325 330 335

Arg Gin Asn Leu His Lys His Phe Asp lie Asn Glu His Leu Pro Trp 340 345 350

Met lie Val Leu Phe Leu Leu Leu Val Leu Val Val lie Val Val Cys 355 360 365

Ser lie Arg Lys Ser Ser Arg Thr Leu Lys Lys Gly Pro Arg Gin Asp 370 375 380

Pro Ser Ala He Val Glu Lys Ala Gly Leu Lys Lys Ser Met Thr Pro 385 390 395 400

Thr Gin Asn Arg Glu Lys Trp lie Tyr Tyr Cys Asn Gly His Gly He 405 410 415

Asp lie Leu Lys Leu Val Ala Ala Gin Val Gly Ser Gin Trp Lys Asp 420 425 430 lie Tyr Gin Phe Leu Cys Asn Ala Ser Glu Arg Glu Val Ala Ala Phe 435 440 445

Ser Asn Gly Tyr Thr Ala Asp His Glu Arg Ala Tyr Ala Ala Leu Gin 450 455 460

His Trp Thr lie Arg Gly Pro Glu Ala Ser Leu Ala Gin Leu lie Ser 465 470 475 480

Ala Leu Arg Gin His Arg Arg Asn Asp Val Val Glu Lys lie Arg Gly 485 490 495

Leu Met Glu Asp Thr Thr Gin Leu Glu Thr Asp Lys Leu Ala Leu Pro 500 505 510

Met Ser Pro Ser Pro Leu Ser Pro Ser Pro lie Pro Ser Pro Asn Ala 515 520 525

Lys Leu Glu Asn Ser Ala Leu Leu Thr Val Glu Pro Ser Pro Gin Asp 530 535 540

Lys Asn Lys Gly Phe Phe Val Asp Glu Ser Glu Pro Leu Leu Arg Cys 545 550 555 560

Asp Ser Thr Ser Ser Gly Ser Ser Ala Leu Ser Arg Asa Gly Ser Phe 565 570 575 lie Thr Lys Glu Lys Lys Asp Thr Val Leu Arg Gin Val Arg Leu Asp 580 585 590

Pro Cys Asp Leu Gin Pro lie Phe Asp Asp Met Leu His Phe Leu Asn 595 600 605

Pro Glu Glu Leu Arg Val lie Glu Glu lie Pro Gin Ala Glu Asp Lys 610 615 620

Leu Asp Arg Leu Phe Glu lie lie Gly Val Lys Ser Gin Glu Ala Ser 625 630 635 640

Gin Thr Leu Leu Asp Ser Val Tyr Ser His Leu Pro Asp Leu Leu 645 650 655 ϋ <210> 2 <211> 3662 <212> DNA <213>智人 <220> <223>人類死亡受體6 <400> 2 gccaccacgt gtgtccctgc gcccggtggc caccgactca gtccctcgcc gaccagtctg 60 ggeageggae gagggtggtt ggcagtggct ggaagetteg ctatgggaag ttgttccttt 120 gctctctcgc gcccagtcct cctccctggt tctcctcagc cgctgtcgga ggagagcacc 180 eggagaegeg ggctgcagtc geggeggett ctccccgcct gggcggccgc gccgctgggc 240 aggtgctgag cgcccctaga gcctcccttg ccgcctccct cctctgcccg gccgcagcag 300 tgcacatggg gtgttggagg tagatgggct cccggcccgg gaggeggegg tggatgegge 360 gctgggcaga agcagccgcc gattccagct gccccgcgcg ccccgggcgc ccctgcgagt 420 ccccggttca gcc atg ggg acc tet ccg age age age acc gcc etc gcc 469

Met Gly Tbr Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ala Leu Ala 5 10 tcc tgc age ege ate gcc ege ega gcc aca gcc aeg atg ate geg ggc 517

Ser Cys Ser Arg lie Ala Arg Arg Ala Thr Ala Thr Met lie Ala GJy 15 20 25 146428.doc 565 565 Ο

201034684 tcc ctt etc ctg ett gga ttc ett age acc acc aca get cag cca gaa

Ser Leu Leu Leu Leu Gly Phe Leu Ser Thr Thr Thr Ala Gin Pro Glu 30 35 40 cag aag gee teg aat etc att ggc aca tac ege cat gtt gac cgt gee

Gin Lys Ala Scr Asn Leu lie Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Ala 45 50 55 60 acc ggc cag gtg eta acc tgt gac aag tgt cca gca gga acc tat gtc

Thr Gly Gin Val Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val 65 70 75 tet gag cat tgt acc aac aca age ctg ege gtc tgc age agt tgc cct

Scr Glu His Cys Thr Asn Thr Scr Leu Arg Val Cys Scr Ser Cys Pro 80 85 90 gtg ggg acc ttt acc agg cat gag aat ggc ata gag aaa tgc cat gac

Val Gly Thr Phe Thr Arg His Glu Asn Gly lie Glu Lys Cys His Asp 95 100 105 tgt agt cag cca tgc cca tgg cca atg att gag aaa tta cct tgt get

Cys Ser Gin Pro Cys Pro Trp Pro Met He Glu Lys Leu Pro Cys Ala no 115 120 gee ttg act gac ega gaa tgc act tgc cca cct ggc atg ttc cag tet

Ala Leu Thr Asp Arg Glu Cys Thr Cys Pro Pro Gly Met Phe Gin Ser 125 130 135 140 aac get acc tgt gee ccc cat aeg gtg tgt cct gtg ggt tgg ggt gtg

Asn Ala Thr Cys Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val 145 150 155 egg aag aaa ggg aca gag act gag gat gtg egg tgt aag cag tgt get

Arg Lys Lys Gly Thr Glu Thr Glu Asp Val Arg Cys Lys Gin Cys Ala 160 165 170 egg ggt acc ttc tea gat gtg cct tet agt gtg atg aaa tgc aaa gca

Arg 6Iy Thr Phe Ser Asp Va了 Pro Ser Ser Vai Met [ys Cys [ys Xia 175 180 185 tac aca gac tgt ctg agt cag aac ctg gtg gtg ate aag ccg ggg acc

Tyr Thr Asp Cys Leu Ser Gin Asn Leu Val Val lie Lys Pro Gly Thr 190 195 200 aag gag aca gac aac gtc tgt ggc aca etc ccg tec ttc tec age tec

Lys Glu Thr Asp Asn Val Cys Gly Thr Leu Pro Ser Phe Ser Ser Ser 205 210 215 220 acc tea cct tec cct ggc aca gee ate ttt cca ege cct gag cac atg

Thr Ser Pro Ser Pro Gly Thr Ala lie Phe Pro Arg Pro Glu His Met 225 230 235 gaa acc cat gaa gtc cct tec tec act tat gtt ccc aaa ggc atg aac

Glu Thr His Glu Val Pro Ser Scr Thr Tyr Val Pro Lys Gly Met Asn 240 245 250 tea aca gaa tec aac tet tet gee tet gtt aga cca aag gta ctg agt

Ser Thr Glu Ser Asn Ser Ser Ala Ser Val Arg Pro Lys Val Leu Ser 255 260 265 age ate cag gaa ggg aca gtc cct gac aac aca age tea gca agg ggg

Ser lie Gin Glu Gly Thr Val Pro Asp Asn Thr Ser Ser Ala Arg Gly 270 275 280 aag gaa gac gtg aac aag acc etc cca aac ett cag gta gtc aac cac

Lys Glu Asp Val Asn Lys Thr Leu Pro Asn Leu Gin Val Val Asn His 285 290 295 300 cag caa ggc ccc cac cac aga cac ate ctg aag ctg ctg ccg tec atg

Gin Gin Gly Pro His His Arg His lie Leu Lys Leu Leu Pro Ser Met 305 310 315 gag gee act ggg ggc gag aag tec age aeg ccc ate aag ggc ccc aag

Glu Ala Thr Gly Gly Glu Lys Ser Ser Thr Pro He Lys Gly Pro Lys 320 325 330 agg gga cat cct aga cag aac eta cac aag cat ttt gac ate aat gag

Arg Gly His Pro Arg Gin Asn Leu His Lys His Phe Asp lie Asn Glu 335 340 345 cat ttg ccc tgg atg att gtg ett ttc ctg ctg ctg gtg ett gtg gtg

His Leu Pro Trp Met lie Val Leu Phe Leu Leu Leu Val Leu Val Val 350 355 360 att gtg gtg tgc agt ate egg aaa age teg agg act ctg aaa aag ggg lie Val Val Cys Ser He Arg Lys Ser Ser Arg Thr Leu Lys Lys Gly 365 370 375 380 ccc egg cag gat ccc agt gee att gtg gaa aag gca ggg ctg aag aaa

Pro Arg Gin Asp Pro Ser Ala lie Val Glu Lys Ala Gly Leu Lys Lys 385 390 395 tec atg act cca acc cag aac egg gag aaa tgg ate tac tac tgc aat

Ser Met Thr Pro Thr Gin Asn Arg Glu Lys Trp lie Tyr Tyr Cys Asn 400 405 410 ggc cat ggt ate gat ate ctg aag ett gta gca gee caa gtg gga age

Gly His Gly lie Asp lie Leu Lys Leu Val Ala Ala Gin Val Gly Ser 415 420 425 146428.doc 613 661 709 757 805 853 901 949 997 1045 1093 1141 1189 1237 1285 1333 1381 1429 1477 1525 1573 1621 1669 1717 201034684 cag tgg aaa gat ate tat cag ttt ett tgc aat gee agt gag agg gag 1765

Gin Trp Lys Asp lie Tyr Gin Phe Leu Cys Asn Ala Ser Glu Arg Glu 430 435 440 gtt get get ttc tee aat ggg tac aca gee gac cac gag egg gee tac 1813

Val Ala Ala Phe Ser Asn Gly Tyr Thr Ala Asp His Glu Arg Ala Tyr 445 450 455 460 gca get ctg cag cac tgg acc ate egg £gc ccc gag gee age etc gee 1861

Ala Ala Leu Gin His Trp Thr lie Arg Gly Pro Glu Ala Ser Leu Ala 465 470 475 cag eta att age gee ctg ege cag cac egg aga aac gat gtt gtg gag 1909

Gin Leu lie Ser Ala Leu Arg Gin His Arg Arg Asn Asp Val Val Glu 480 485 490 aag att cgt ggg ctg atg gaa gac acc acc cag ctg gaa act gac aaa 1957

Lys lie Arg Gly Leu Met Glu Asp Thr Thr Gin Leu Glu Thr Asp Lys 495 500 505 eta get etc ccg atg age ccc age ccg ett age ccg age ccc ate ccc 2005

Leu Ala Leu Pro Met Ser Pro Ser Pro Leu Ser Pro Ser Pro lie Pro 510 515 520 age ccc aac geg aaa ett gag aat tee get etc ctg aeg gtg gag cct 2053

Ser Pro Asn Ala Lys Leu Glu Asn Ser Ala Leu Leu Thr Val Glu Pro 525 530 535 540 tee cca cag gac aag aac aag ggc ttc ttc gtg gat gag teg gag ccc 2101

Ser Pro Gin Asp Lys Asn Lys Gly Phe Phe Val Asp Glu Ser Glu Pro 545 550 555 ett etc ege tgt gac tet aca tee age ggc tee tee geg ctg age agg 2149

Leu Leu Arg Cys Asp Ser Thr Ser Ser Gly Ser Ser Ala Leu Ser Arg 560 565 570 aac ggt tee ttt att acc aaa gaa aag aag gac aca gtg ttg egg cag 2197

Asn Gly Ser Phe lie Thr Lys Glu Lys Lys Asp Thr Val Leu Arg Gin 575 580 585 gta ege ctg gac ccc tgt gac ttg cag cct ate ttt gat gac atg etc 2245

Val Arg Leu Asp Pro Cys Asp Leu Gin Pro lie Phe Asp Asp Met Leu 590 595 600 cac ttt eta aat cct gag gag ctg egg gtg att gaa gag att ccc cag 2293

His Phe Leu Asn Pro Glu Glu Leu Arg Val lie Glu Glu lie Pro Gin 605 610 615 620 get gag gac aaa eta gac egg eta ttc gaa att att gga gtc aag age 2341

Ala Glu Asp Lys Leu Asp Arg Leu Phe Glu lie lie Gly Val Lys Ser 625 630 635 cag gaa gee age cag acc etc ctg gac tet gtt tat age cat ett cct 2389

Gin Glu Ala Ser Gin Thr Leu Leu Asp Ser Val Tyr Ser His Leu Pro 640 645 650 * gac ctg ctg tag aacataggga tactgcattc tggaaattac tcaatttagt 2441

Asp Leu Leu * 655 ggcagggtgg ttttttaatt ttcttctgtt tctgattttt gttgtttggg gtgtgtgtgt 2501 gtgtttgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt ttaacagaga atatggccag 2561 tgcttgagtt ctttctcctt ctctctctct cttttttttt taaataactc ttctgggaag 2621 ttggtttata agcctttgcc aggtgtaact gttgtgaaat acccaccact aaagtttttt 2681 aagttccata ttttctccat tttgeettet tatgtatttt caagattatt ctgtgcactt 2741 taaatttact taacttacca taaatgcagt gtgacttttc ccacacactg gattgtgagg 2801 ctcttaactt cttaaaagta taatggcatc ttgtgaatcc tataageagt ctttatgtct 2861 cttaacattc acacctactt tttaaaaaca aatattatta ctatttttat tattgtttgt 2921 cctttataaa ttttcttaaa gattaagaaa atttaagacc ccattgagtt actgtaatgc 2981 aattcaactt tgagttatct tttaaatatg tettgtatag ttcatattca tggctgaaac 3041 ttgaccacac tattgetgat tgtatggttt tcacctggac accgtgtaga atgettgatt 3101 acttgtactc ttettatget aatatgetet gggctggaga aatgaaatcc tcaagccatc 3161 aggatttget atttaagtgg cttgacaact gggccaccaa agaaettgaa cttcaccttt 3221 taggatttga gctgttctgg aacacattgc tgcactttgg aaagtcaaaa tcaagtgcca 3281 gtggcgccct ttccatagag aatttgccca gctttgcttt aaaagatgtc ttgtttttta 3341 tatacacata atcaataggt ccaatctgct ctcaaggcct tggtcctggt gggattcctt 3401 caccaattac tttaattaaa aatggctgca actgtaagaa cccttgtctg atatatttgc 3461 aactatgctc ccatttacaa atgtaccttc taatgctcag ttgccaggtt ccaatgcaaa 3521 gEtggcgtgg actccctttg tgtgggtggg gtttgtgggt agtggtgaag gaccgatatc 3581 agaaaaatgc cttcaagtgt actaatttat taataaacat taggtgtttg ttaaaaaaaa 3641 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3662 <210> 3 <211> 300 <212> DNA <213>小家鼠 <400> 3 gagcagaaac ggctccttta ttaccaaaga aaagaaggac acagtgttgc ggcaggtccg 60 •4- 146428.doc 201034684 cctggacccc tgtgacttgc agcccatctt tgatgacatg ctgcatatcc tgaaccccga ggagctgcgg gtgattgaag agattcccca ggctgaggac aaactggacc gcctcttcga gatcattggg gtcaagagcc aagaagccag ccagaccctc ttggactctg tgtacagtca tcttcctgac ctattgtaga acacaggggc actgcattct gggaatcaac ctactggcgg <210> 4 <211> 582 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>嵌合蛋白··人類DR6細胞外域與免疫球蛋白Fc融合 <400> 4

Met Gly Thr Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg 15 10 15 lie Ala Arg Arg Ala Thr Ala Thr Met lie Ala Gly Ser Leu Leu Leu 20 25 30

Leu Gly Phe Leu Scr Thr Thr Thr Ala Gin Pro Glu Gin Lys Ala Ser 35 40 45

Asn Leu lie Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Ala Thr Gly Gin Val 50 55 60

Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys 65 70 75 80

Thr Asn Thr Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Val Gly Thr Phe 85 90 95 ❹

Thr Arg His Glu Asn Gly lie Glu Lys Cys His Asp Cys Ser Gin Pro 100 105 110

Cys Pro Trp Pro Met lie Glu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp 115 120 125

Arg Glu Cys Thr Cys Pro Pro Gly Met Phe Gin Ser Asn Ala Thr Cys 130 135 140

Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Va】Arg Lys Lys Gly 145 150 155 160

Thr Glu Thr Glu Asp Val Arg Cys Lys Gin Cys Ala Arg Gly Thr Phe 165 170 175

Ser Asp Val Pro Ser Ser Val Met Lys Cys Lys Ala Tyr Thr Asp Cys 180 185 190

Leu Ser Gin Asn Leu Val Val lie Lys Pro Gly Thr Lys Glu Thr Asp 195 200 205

Asn Val Cys Gly Thr Leu Pro Ser Phe Scr Ser Ser Thr Scr Pro Ser 210 215 220

Pro Gly Thr Ala lie Phe Pro Arg Pro Glu His Met Glu Thr His Glu 225 230 235 240

Val Pro Ser Ser Thr Tyr Val Pro Lys Gly Met Asn Ser Thr Glu Ser 245 250 255

Asn Scr Ser Ala Ser Val Arg Pro Lys Val Leu Ser Ser lie Gin Glu 260 265 270

Gly Thr Val Pro Asp Asn Thr Ser Ser Ala Arg Gly Lys Glu Asp Val 275 280 285

Asn Lys Thr Leu Pro Asn Leu Gin Val Val Asn His Gin Gin Gly Pro 290 295 300

His His Arg His lie Leu Lys Leu Leu Pro Ser Met Glu Ala Thr Gly 305 310 315 320

Gly Glu Lys Ser Ser Thr Pro lie Lys Gly Pro Lys Arg Gly His Pro 325 330 335

Arg Gin Asn Leu His Lys His Phe Asp lie Asn Glu His Leu Pro Trp 340 345 350

Met lie Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 355 360 365

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 370 375 380

Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 385 390 395 400

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 405 410 415

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 420 425 430

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 435 440 445

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 450 455' 460

Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 465 470 475 480

Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Scr Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 146428.doc 201034684 485 490 495

Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 500 505 510

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro GIu Asn Asn Tyr Lys Thr 515 520 525

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 530 535 540

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 545 550 555 560

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 565 570 575

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 580 <210> 5 <211> 2088 <212> DNA <213>智人 <220〉 <223>人類類澱粉前驅蛋白695 cDNA <400> 5 atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc gctggaggta cccactgatg gtaatgctgg cctgctggct gaaccccaga ttgccatgtt ctgtggcaga ctgaacatgc acatgaatgt ccagaatggg aagtgggatt cagatccatc agggaccaaa acctgcattg ataccaagga aggcatcctg cagtattgcc aagaagtcta ccctgaactg cagatcacca atgtggtaga agccaaccaa ccagtgacca tccagaactg gtgcaagcgg ggccgcaagc agtgcaagac ccatccccac tttgtgattc cctaccgctg cttagttggt gagtttgtaa gtgatgccct tctcgttcct gacaagtgca aattcttaca ccaggagagg atggatgttt gcgaaactca tcttcactgg cacaccgtcg ccaaagagac atgcagtgag aagagtacca acttgcatga ctacggcatg ttgctgccct gcggaattga caagttccga ggggtagagt ttgtgtgttg cccactggct gaagaaagtg acaatgtgga ttctgctgat gcggaggagg atgactcgga tgtctggtgg ggcggagcag acacagacta tgcagatggg agtgaagaca aagtagtaga agtagcagag gaggaagaag tggctgaggt ggaagaagaa gaagccgatg atgacgagga cgatgaggat ggtgatgagg tagaggaaga ggctgaggaa ccctacgaag aagccacaga gagaaccacc agcattgcca ccaccaccac caccaccaca gagtctgtgg aagaggtggt tcgagttcct acaacagcag ccagtacccc tgatgccgtt gacaagtatc tcgagacacc tggggatgag aatgaacatg cccatttcca gaaagccaaa gagaggcttg aggccaagca ccgagagaga atgtcccagg tcatgagaga atgggaagag gcagaacgtc aagcaaagaa cttgcctaaa gctgataaga aggcagttat ccagcatttc caggagaaag tggaatcttt ggaacaggaa gcagccaacg agagacagca gctggtggag acacacatgg ccagagtgga agccatgctc aatgaccgcc gccgcctggc cctggagaac tacatcaccg ctctgcaggc tgttcctcct cggcctcgtc acgtgttcaa tatgctaaag aagtatgtcc gcgcagaaca gaaggacaga cagcacaccc taaagcattt cgagcatgtg cgcatggtgg atcccaagaa agccgctcag atccggtccc aggttatgac acacctccgt gtgatttatg agcgcatgaa tcagtctctc tccctgctct acaacgtgcc tgcagtggcc gaggagattc aggatgaagt tgatgagctg cttcagaaag agcaaaacta ttcagatgac gtcttggcca acatgattag tgaaccaagg atcagttacg gaaacgatgc tctcatgcca tctttgaccg aaacgaaaac caccgtggag electtcccg tgaatggaga gttcagcctg gacgatctcc agccgtggca ttcttttggg gctgactctg tgccagccaa cacagaaaac gaagttgagc ctgttgatgc ccgccctgct gccgaccgag gactgaccac tcgaccaggt tctgggttga caaatatcaa gaeggaggag atetetgaag tgaagatgga tgeagaatte cgacatgact caggatatga agttcatcat caaaaattgg tgttctttgc aaaagatgtg ggttcaaaca aaggtgcaat cattggactc atggtgggcg gtgttgtcat agcgacagtg ategteatea ccttggtgat getgaagaag aaacagtaca catccattca tcatggt£tg gtggaggttg acgccgctgt caccccagag gagcgccacc tgtccaagat gcagcagaac ggctacgaaa atccaaccta caagttcttt gageagatge agaactag <210> 6 <211> 695 <212> PRT <213>智人 <220> <223>人類類澱粉前驅蛋白APP695 <400> 6

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 15 10 15

Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30

Gin lie Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gin 35 40 45

Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys lie Asp 146428.doc OOOOOOOOOOOOOOOOOOWWQOOOOOOOOQ00008 6 2 00 40620040628 406200 4wa28406284W62 0048 1123344566778990012233455667889900 *2 2 ll· 1i 11 ti 11 11 11 11 n 11 11 11 11 1i n ( /% 201034684 50 55 60

Thr Lys Glu Gly lie Leu Gin Tyr Cys Gin Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80

Gin lie Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gin Pro Val Thr lie Gin Asn 85 90 95

Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gin Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 lie Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Scr Asp Ala Leu Leu 115 120 125

Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gin Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160

Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly lie 165 170 175

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205

Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220

Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255

Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser lie 260 265 270

❾

Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285

Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu 290 295 300

Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys 305 310 315 320

Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gin Val Met Arg 325 330 335

Glu 丁rp Glu Glu Ala Glu Arg Gin Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp 340 345 350

Lys Lys Ala Val He Gin His Phe Gin Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu 355 360 365

Gin Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gin Gin Leu Val Glu Thr His Met Ala 370 375 380

Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn 385 390 395 400

Tyr lie Thr Ala Leu Gin Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe 405 410 415

Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His 420 425 430

Thr Leu Lys His Phe Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala 435 440 445

Ala Gin lie Arg Ser Gin Val Met Thr His Leu Arg Val lie Tyr Glu 450 455 460

Arg Met Asn Gin Ser Leu Scr Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala 465 470 475 480

Glu Glu lie Gin Asp Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn 485 490 495

Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn Met lie Ser Glu Pro Arg lie Ser 500 505 510

Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu TTir Lys Thr Thr 515 520 525

Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin 530 535 540

Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn 545 550 555 560

Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr 565 570 575

Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn lie Lys Thr Glu Glu lie Sct 580 585 590

Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 595 600 605

His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Scr Asn Lys 610 615 620

Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala Thr Val 625 630 635 640 lie Val lie Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Ser lie 645 650 655 146428.doc 201034684

His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg 660 665 670

His Leu Ser Lys Met Gin Gin Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys 675 680 685

Phe Phe Glu Gin Met Gin Asn 690 695 <210> 7 <211> 751 <212> PRT <213>智人 <220> <223>人類類澱粉前驅蛋白（APP751) <400> 7

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 15 10 15

Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30

Gin lie Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gin 35 40 45

Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys lie Asp 50 55 60

Thr Lys Glu Gly lie Leu Gin Tyr Cys Gin Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80

Gin lie Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gin Pro Val Thr lie Gin Asn 85 90 95

Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gin Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 lie Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 _ 125

Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gin Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160

Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly lie 165 170 175

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205

Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220

Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255

Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser lie 260 265 270

Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285

Glu Val Cys Ser Glu Gin Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met lie 290 295 300

Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320

Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335

Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala lie Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr 340 345 350

Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu 355 360 365

His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg 370 375 380

Glu Arg Met Ser Gin Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gin 385 390 395 400

Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val lie Gin His Phe 405 410 415

Gin Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gin Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gin 420 425 430

Gin Leu Val Giu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp 435 440 445

Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr lie Thr Ala Leu Gin Ala Val 450 455 460

Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg 146428.doc

201034684 465 470 475 480

Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His Thr Leu Lys His Phe Glu His Val 485 490 495

Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gin He Arg Ser Gin Val Met 500 505 510

Thr His Leu Arg Val lie Tyr Glu Arg Met Asn Gin Ser Leu Ser Leu 515 520 525

Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu lie Gin Asp Glu Val Asp 530 535 540

Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn 545 550 555 560

Met lie Scr Glu Pro Arg lie Scr Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro 565 570 575

Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly 580 585 590

Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp 595 600 605

Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg 610 615 620

Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr 625 630 635 640

Asn lie Lys Thr Glu Glu lie Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe 645 650 655

Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe 660 665 670

Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val 675 680 685

Gly Gly Val Val lie Ala Thr Val lie Val lie Thr Leu Val Met Leu 690 695 700

Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Ser lie His His Gly Val Val Glu Val Asp 705 710 715 720

Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met Gin Gin Asn 725 730 735

Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gin Met Gin Asn 740 745 750 <210> 8 <211> 2310 <212> DNA <2]3>智人 <220> <223>人類類澱粉前驅蛋白（APP770) <400> 8 atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc gctggaggta cccactgatg gtaatgctgg cctgctggct gaaccccaga ttgccatgtt ctgtggcaga ctgaacatgc acatgaatgt ccagaatggg aagtgggatt cagatccatc agggaccaaa acctgcattg ataccaagga aggcatcctg cagtattgcc aagaagteta ccctgaactg cagatcacca atgtggtaga agccaaccaa ccagtgacca tccagaactg gtgcaagcgg ggccgcaagc agtgcaagac ccatccccac tttgtgattc cctaccgctg cttagttggt gagtttgtaa gtgatgccct tctcgttcct gacaagtgca aattcttaca ccaggagagg atggatgttt gcgaaactca tcttcactgg cacaccgtcg ccaaagagac atgeagtgag aagagtacca aettgeatga etaeggeatg ttgctgccct geggaattga caagttccga ggggtagagt ttgtgtgttg cccactggct gaagaaagtg acaatgtgga ttctgctgat geggaggagg atgactcgga tgtctggtgg ggcggagcag acacagacta tgcagatggg agtgaagaca aagtagtaga agtageagag gaggaagaag tggctgaggt ggaagaagaa gaagccgatg atgaegagga egatgaggat ggtgatgagg tagaggaaga ggctgaggaa ccctacgaag aagccacaga gagaaccacc agcattgcca ccaccaccac caccaccaca gagtctgtgg aagaggtggt tcgagaggtg tgctctgaac aageegagae ggggccgtgc cgagcaatga tctcccgctg gtactttgat gtgactgaag ggaagtgtgc cccattcttt taeggeggat gtggcggcaa ccggaacaac tttgacacag aagagtactg catggccgtg tgtggcagcg ccatgtccca aagtttactc aagactaccc aggaacctct tgcccgagat cctgttaaac ttcctacaac agcagccagt acccctgatg ccgttgacaa gtatetegag acacctgggg atgagaatga acatgcccat ttccagaaag ccaaagagag gettgaggee aagcaccgag agagaatgtc ccaggtcatg agagaatggg aagaggeaga acgtcaagca aagaacttgc ctaaagctga taagaaggea gttatccagc atttccagga gaaagtggaa tctttggaac aggaageage caacgagaga cagcagctgg tggagacaca catggccaga gtggaagcca tgctcaatga ccgccgccgc ctggccctgg agaactacat caccgctctg caggctgttc ctcctcggcc tegteaegtg ttcaatatgc taaagaagta tgtccgcgca gaacagaagg acagacagca caccctaaag catttcgagc atgtgcgcat ggtggatccc aagaaagccg ctcagatccg gtcccaggtt atgacacacc tccgtgtgat ttatgagege atgaatcagt ctctctccct gctctacaac gtgcctgcag tggccgagga gattcaggat gaagttgatg agetgettea gaaagagcaa aactattcag atgaegtett ggccaacatg attagtgaac caaggatcag ttacggaaac gatgetetea tgccatcttt gaccgaaacg 146428.doc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 -9- 201034684 aaaaccaccg tggagctcct tcccgtgaat ggagagttca gcctggacga tctccagccg tggcattctt ttggggctga ctctgtgcca gccaacacag aaaacgaagt tgagcctgtt gatgcccgcc ctgctgccga ccgaggactg accactcgac caggttctgg gttgacaaat atcaagacgg aggagatctc tgaagtgaag atggatgcag aattccgaca tgactcagga tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc tttgcagaag atgtgggttc aaacaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcga cagtgatcgt catcaccttg gtgatgctga agaagaaaca gtacacatcc attcatcatg gtgtggtgga ggttgacgcc gctgtcaccc cagaggagcg ccacctgtcc aagatgcagc agaacggcta cgaaaatcca acctacaagt tctttgagca gatgcagaac <210〉 9 <211> 770 <212> PRT <213>智人 <220> <223>人類類澱粉前驅蛋白（APP770) <400> 9

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 15 10 15

Ala Leu G!u Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30

Gin He Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gin 35 40 45

Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys lie Asp 50 55 60

Thr Lys Glu Gly lie Leu Gin Tyr Cys Gin Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 G]n lie Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gin Pro Val Thr lie Gin Asn 85 90 95

Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gin Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110

He Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125

Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gin Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160

Lys Ser Thr Asm Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly lie 165 170 175

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205

Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220

Val Vai Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255

Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser lie 260 265 270

Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285

Glu Val Cys Ser Glu Gin Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met lie 290 295 300

Scr Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320

Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335

Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gin Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350

Thr Gin Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365

Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 · 375 380

Glu Asn Glu His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400

Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gin Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415

Glu Arg Gin Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val lie 420 425 430

Gin His Phe Gin Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gin Glu Ala Ala Asn 435 440 445 10· 146428.doc 201034684

Glu Arg Gin Gin Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460

Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr lie Thr Ala Leu 465 470 475 480

Gin Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phc Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495

Tyr Val Arg Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510

Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gin He Arg Ser 515 520 525

Gin Val Met Thr His Leu Arg Val He Tyr Glu Arg Met Asn Gin Ser 530 535 540

Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu lie Gin Asp 545 550 555 560

Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575

Leu Ala Asn Met lie Ser Glu Pro Arg lie Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590

Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605

Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin Pro Trp His Ser Phe 610 615 620

Gly Ala Asp Scr Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640

Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655

Ο

Gly Leu Thr Asn lie Lys Thr Glu Glu lie Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670

Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys Leu 675 680 685

Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Scr Asn Lys Gly Ala lie lie Gly 690 695 700

Leu Met Val Gly Gly Val Va! lie Ala Thr Val lie Val lie Thr Leu 705 710 715 720

Val Met Leu Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Scr lie His His Gly Val Val 725 730 735

Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745· 750

Gin Gin Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gin Met 755 760 765

Gin Asn 770 <210> 10 <211> 210 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>經組胺酸標籤標記之人類NAPP <400> 10

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 15 10 15

Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30

Gin lie Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gin 35 40 45

Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys lie Asp 50 55 60

Thr Lys Glu Gly lie Leu Gin Tyr Cys Gin Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80

Gin lie Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gin Pro Val Thr lie Gin Asn 85 90 95

Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gin Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 lie Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Scr Asp Ala Leu Leu , 115 120 125

Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gin Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Sct Glu 145 150 155 160

Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly lie 165 170 175

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu -11· 146428.doc 201034684 180 185 190

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp His His His His 195 200 205

His His 210 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223> SiRNA <400> 11 aaucuguuga guucaugccu u 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>褐家鼠 <400> 12 caauagguca ggaagauggc u 21 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>褐家鼠 <400> 13 ggactctgtg tacagtcacc tcccagatct gttatag 37 <210> 14 <211> 349 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 14

Met Gly Thr Arg Ala Ser Ser lie Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg 15 10 15

Thr Ala Gly Gin Val Gly Ala Thr Met Val Ala Gly Ser Leu Leu Leu 20 25 30

Leu Gly Phe Leu Ser Thr He Thr Ala Gin Pro Glu Gin Lys Thr Leu 35 40 45

Ser Leu Pro Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Thr Thr Gly Gin Val 50 55 60

Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys 65 70 75 80

Thr Asn Met Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Ala Gly Thr Phe 85 90 95

Thr Arg His Glu Asn Gly lie Glu Arg Cys His Asp Cys Ser Gin Pro 100 105 110

Cys Pro Trp Pro Met lie Glu Arg Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp 115 120 125

Arg Glu Cys lie Cys Pro Pro Gly Met Tyr Gin Ser Asn Gly Thr Cys 130 135 140

Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val Arg Lys Lys Gly 145 150 155 160

Thr Glu Asn Glu Asp Val Arg Cys Lys Gin Cys Ala Arg Gly Thr Phe 165 170 175

Ser Asp Val Pro Ser Ser Val Met Lys Cys Lys Ala His Thr Asp Cys 180 185 190

Leu Gly Gin Asn Leu Glu Val Val Lys Pro Gly Thr Lys Glu Thr Asp 195 200 205

Asn Val Cys Gly Met Arg Leu Phe Phe Ser Ser Thr Asn Pro Pro Ser 210 215 220

Ser Gly Thr Val Thr Phe Ser His Pro Glu His Met Glu Ser His Asp 225 230 235 240 -12- 146428.doc 201034684

Val Pro Ser Ser Thr Tyr Glu Pro Gin Gly Met Asn Ser Thr Asp Ser 245 250 255

Asn Ser Thr Ala Ser Val Arg Thr Lys Val Pro Ser Gly lie Glu Glu 260 265 270

Gly Thr Val Pro Asp Asn Thr Ser Scr Thr Ser Gly Lys Glu Gly Thr 275 280 285

Asn Arg Thr Leu Pro Asn Pro Pro Gin Val Thr His Gin Gin Ala Pro 290 295 300

His His Arg His He Leu Lys Leu Leu Pro Ser Ser Met Glu Ala Thr 305 310 315 320

Gly Glu Lys Ser Ser Thr Ala lie Lys Ala Pro Lys Arg Gly His Pro 325 330 335

Arg Gin Asn Ala His Lys His Phe Asp lie Asn Glu His 340 345 <210〉 15 <211> 354 <212> PRT <2]3>人工序列 <220〉 <223>小家鼠 <400> 15

Met Gly Thr Arg Ala Ser Ser lie Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg 15 10 15

Thr Ala Gly Gin Val Gly Ala Thr Met Val Ala Gly Ser Leu Leu Leu 20 25 30

Leu Gly Phe Leu Ser Thr lie Thr Ala Gin Pro Glu Gin Lys Thr Leu 35 40 45

Ser Leu Pro Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Thr Thr Gly Gin Val 50 55 60

Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys 65 70 75 80

Thr Asn Met Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Ala Gly Thr Phe 85 90 95

Thr Arg His Glu Asn Gly He Glu Arg Cys His Asp Cys Ser Gin Pro 100 105 110

Cys Pro Trp Pro Met lie Glu Arg Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp 115 120 125

Arg Glu Cys He Cys Pro Pro Gly Met Tyr Gin Ser Asn Gly Thr Cys 130 135 140

Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val Arg Lys Lys Gly 145 150 155 160

Thr Glu Asn Glu Asp Val Arg Cys Lys Gin Cys Ala Arg Gly Thr Phe 165 170 175

Ser Asp Va! Pro Ser Ser Val Met Lys Cys Lys Ala His Thr Asp Cys 180 185 190

Leu Gly Gin Asn Leu Glu Val Val Lys Pro Gly Thr Lys Glu Thr Asp 195 200 205

Asn Val Cys Gly Met Arg Leu Phe Phe Ser Ser Thr Asn Pro Pro Ser 210 215 220

Ser Gly Thr Val Thr Phe Ser His Pro Glu His Met Glu Ser His Asp 225 230 235 240

Val Pro Ser Ser Thr Tyr Glu Pro Gin Gly Met Asn Ser Thr Asp Ser 245 250 255

Asn Ser Thr Ala Ser Val Arg Thr Lys Val Pro Ser Gly lie Glu Glu 260 265 270

Gly Thr Val Pro Asp Asn Thr Ser Ser Thr Ser Gly Lys Glu Gly Thr 275 280 285

Asn Arg Thr Leu Pro Asn Pro Pro Gin Val Thr His Gin Gin Ala Pro 290 295 300

His His Arg His lie Leu Lys Leu Leu Pro Ser Ser Met Glu Ala Thr 305 310 315 320

Gly Glu Lys Ser Ser Thr Ala lie Lys Ala Pro Lys Arg Gly His Pro 325 330 335

Arg Gin Asn Ala His Lys His Phe Asp lie Asn Glu His His His His 340 345 350

His His <210> 16 <211> 427 <212> PRT <213>智人 •13- 146428.doc 201034684 <220> <223> 人類p75 <400> 16

Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys GIu Ala Cys 20 25 30

Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly GIu Cys Cys Lys Ala Cys Asn 35 40 45

Leu Gly GIu Gly Val Ala Gin Pro Cys Gly Ala Asn Gin Thr Val Cys 50 55 60 GIu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr 65 70 75 80 GIu Pro Cys Lys Pro Cys Thr GIu Cys Val Gly Leu Gin Ser Met Ser 85 90 95

Ala Pro Cys Val GIu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly 100 105 110

Tyr Tyr Gin Asp GIu Thr Thr Gly Arg Cys GIu Ala Cys Arg Val Cys 115 120 125 GIu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gin Asp Lys Gin Asn Thr 130 135 140

Val Cys GIu GIu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp GIu Ala Asn His 145 150 155 160

Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys GIu Asp Thr GIu Arg Gin 165 170 175

Leu Arg GIu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala GIu Cys GIu GIu lie Pro 180 185 190

Gly Arg Trp lie Thr Arg Ser Thr Pro Pro GIu Gly Ser Asp Ser Thr 195 200 205

Ala Pro Ser Thr Gin GIu Pro GIu Ala Pro Pro GIu Gin Asp Leu lie 210 215 220

Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gin 225 230 235 240

Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu lie Pro Val Tyr Cys 245 250 255

Ser lie Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr lie Ala Phe 260 265 270

Lys Arg Trp Asn Ser Cys Lys Gin Asn Lys Gin Gly Ala Asn Ser Arg 275 280 285

Pro Val Asn Gin Thr Pro Pro Pro GIu Gly GIu Lys Leu His Ser Asp 290 295 300

Ser Gly lie Ser Val Asp Ser Gin Ser Leu His Asp Gin Gin Pro His 305 310 315 320

Thr Gin Thr Ala Ser Gly Gin Ala Leu Lys Gly Asp Gly Gly Leu Tyr 325 330 335

Ser Ser Leu Pro Pro Ala Lys Arg GIu GIu Val GIu Lys Leu Leu Asn 340 345 350

Gly Ser Ala Gly Asp Thr Trp Arg His Leu Ala Gly GIu Leu Gly Tyr 355 360 365

Gin Pro GIu His lie Asp Ser Phe Thr His GIu Ala Cys Pro Val Arg 370 375 380

Ala Leu Leu Ala Ser Trp Ala Thr Gin Asp Ser Ala Thr Leu Asp Ala 385 390 395 400

Leu Leu Ala Ala Leu Arg Arg lie Gin Arg Ala Asp Leu Val GIu Ser 405 410 415

Leu Cys Ser GIu Ser Thr Ala Thr Ser Pro Val 420 425 <210> 17 <211> 1284 <212> DNA <213>人類 <220> <223> 人類p75 cDNA <400> 17 atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct gttgctgctt ctgggggtgt cccttggagg tgccaaggag gcatgcccca caggcctgta cacacacagc ggtgagtgct gcaaagcctg caacctgggc gagggtgtgg cccagccttg tggagccaac cagaccgtgt gtgagccctg cctggacagc gtgacgttct ccgacgtggt gagcgcgacc gagccgtgca agccgtgcac cgagtgcgtg gggctccaga gcatgtcggc gccgtgcgtg gaggccgacg acgccgtgtg ccgctgcgcc tacggctact accaggatga gacgactggg cgctgcgagg cgtgccgcgt gtgcgaggcg ggctcgggcc tcgtgttctc ctgccaggac -14- 146428.doc 201034684 aagcagaaca ccgtgtgcga ggagtgcccc gacggcacgt attccgacga ggccaaccac gtggacccgt gcctgccctg caccgtgtgc gaggacaccg agcgccagct ccgcgagtgc acacgctggg ccgacgccga gtgcgaggag atccctggcc gttggattac acggtccaca cccccagagg gctcggacag cacagccccc agcacccagg agcctgaggc acctccagaa caagacctca tagccagcac ggtggcaggt gtggtgacca cagtgatggg cagctcccag cccgtggtga cccgaggcac caccgacaac ctcatccctg tctattgctc catcctggct gctgtggttg tgggccttgt ggcctacata gccttcaaga ggtggaacag ctgcaagcag aacaagcaag gagccaacag ccggccagtg aaccagacgc ccccaccaga gggagaaaaa ctccacagcg acagtggcat ctccgtggac agccagagcc tgcatgacca gcagccccac acgcagacag cctcgggcca ggccctcaag ggtgacggag gcctctacag cagcctgccc ccagccaagc gggaggaggt ggagaagctt ctcaacggct ctgcggggga cacctggcgg cacctggcgg gcgagctggg ctaccagccc gagcacatag actcctttac ccatgaggcc tgccccgttc gcgccctgct tgcaagctgg gccacccagg acagcgccac actggacgcc ctcctggccg ccctgcgccg catccagcga gccgacctcg tggagagtct gtgcagtgag tccactgcca catccccggt gtga

O 15· 146428.doc

Claims

201034684 七、申請專利範圍·· 1. 一種抑制神經退化之方法，其包含： (a) 在抑制DR6與APP結合之條件下將DR6多肽及/或 APP多肽暴露於一或多種DR6拮抗劑； (b) 在抑制APP與p75結合之條件下將p75多肽及/或APP 多肽暴露於一或多種p75拮抗劑；或 (c) 在抑制DR6及p75與APP結合之條件下將DR6多肽、 p75多肽及/或APP多肽暴露於一或多種DR6及p75拮抗〇劑。 2. 如請求項1之方法，其中該一或多種DR6拮抗劑係選自結合DR6之抗體、包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1-354的可溶性DR6多肽、及結合APP之抗體。 3. 如請求項1之方法，其中該一或多種p75拮抗劑係選自結合p75之抗體、可溶性p75多肽' 及結合APP之抗體。 4. 如請求項2之方法，其中該可溶性DR6多肽包含DR6免疫黏附素。〇 5.如請求項3之方法，其中該可溶性p75多肽包含p75免疫黏附素。 6. 如請求項4之方法，其中該可溶性DR6多肽包含與免疫球蛋白之Fc區融合的DR6細胞外域序列。 7. 如請求項5之方法，其中該可溶性p75多肽包含與免疫球蛋白之Fc區融合的p75細胞外域序列。 8. 如請求項2之方法，其中該結合DR6之抗體結合包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1-349或42-349的DR6多肽。 1 46428.doc 201034684 9. 如請求項2之方法，其中該結合DR6之抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 10. 如請求項2之方法，其中該結合DR6之抗體競爭性抑制分別以 ATCC 寄存編號 ΡΤΑ-8095、ΡΤΑ-8094 或 ΡΤΑ-8096 寄存的融合瘤細胞株所產生之3F4.4.8、4Β6.9.7或1Ε5.5.7 卓株抗體之結合。 11. 如請求項2之方法，其中該結合DR6之抗體或可溶性DR6 多肽係連接於一或多種選自由聚乙二酵、聚丙二醇及聚環氧燒（polyoxyalkylene)組成之群的非蛋白質性聚合物。 12·如請求項i之方法，其中該結合App之抗體為單株抗體。 13.如請求項12之方法，其中該結合App之單株抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 14.如請求項12之方法，其中該結合App之單株抗體競爭性抑制該3F4.4.8、該4B6.9.7或該1E5.5.7抗體之結合。 15·如凊求項12之方法，其中該結合App之抗體係連接於一或多種ϋ自由聚6二醇、^二醇及聚環氧燒組成的非蛋白質性聚合物。 %如請求们之方法，其中該DR6多肽表現於一或多種哺乳動物細胞之細胞表面上，且該_或多種嶋结抗劑之蛛合抑制DR6活化或信號傳導。、° 17·如請求項16之㈣，其中該方㈣於活料進行 -或多種表現DR6之哺乳動物細胞之細胞凋亡。 18.如請求項16之方法，其中該方法 Μ β進仃以抑制 146428.doc 201034684 一或多種表現DR6之哺乳動物細胞之細胞凋亡。 19. 如請求項16之方法，其中該一或多種具有dR6#肽表現於細胞表面上之哺乳動物細胞中至少一者為連合神經元細胞、感覺神經元細胞或運動神經元細胞。 20. 如請求項16之方法’其中該方法係在患有神經病狀或病症之哺乳動物活體内進行。 21 ·如請求項20之方法，其中該神經病狀或病症為肌萎縮性側索硬化、帕金森氏病（parkinson's disease)、亨廷頓氏〇病（Huntington,s disease)或阿茲海默氏症（Alzheimer,s disease) ° 22.如請求項2〇之方法，其中該神經病狀或病症包含由於中風、大腦或脊髓組織外傷、或神經元組織病變之神經元細胞或組織損傷。 23. 如吻求項1之方法，其中該一或多種DR6拮抗劑中之至少一者抑制DR6與包含SEQ ID N0: 6之胺基酸“⑷的八叩多肽之結合。 ❹24 如求項1之方法，其中該一或多種DR6拮抗劑中之至少一者抑制APP與包含SEQ ID N〇:丨之胺基酸1 655的娜多肽之結合。 25. 如晴求項3之方法，其中該結合p75之抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 26. ^請求項3之方法’其中該結合P75之抗體或可溶性p75 =係連接於-或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧燒組成之群的非蛋白質性聚合物。 146428.doc 201034684 27. 如請求項！之方法’其中該p75多肽表現於_或多種動物細胞之細胞表面上，且該_或多種p75拮抗劑之結合抑制DR6活化或信號傳導。 28. 如請求項27之方法，其φ訪古、土及μ 具中該方法係於活體外進行以抑制一或多種表現Ρ75之哺乳動物細胞之細胞凋亡。 29. 如請求項27之方法，装巾呤古.土及从具中8亥方法係於活體内進行以抑制一或多種表現Ρ75之哺乳動物細胞之細胞凋亡。 3 0.如s青求項2 7之方法，其中今玄^ ^赤夕级曰丹甲忒或多種具有Ρ75多肽表現於細胞表面上之哺乳動物細胞中至少一者為連合神經元細胞、感覺神經元細胞、背根神經節神經元、小腦顆粒神經元、或運動神經元細胞。 31·如請求項27之方法’其中該方法係在患有神經病狀或病症之哺乳動物活體内進行。 32·如請求項31之方法，其中該神經病狀或病症為肌萎縮性側索硬化、帕金森氏病、亨廷頓氏病或阿茲海默氏症。 33.如請求項31之方法，其中該神經病狀或病症包含由於中風、大腦或脊髓組織外傷、或神經元組織病變之神經元細胞或組織損傷。 34· —種治療患有神經病狀或病症之哺乳動物的方法，其包含投與該哺乳動物有效量之一或多種DR6拮抗劑及一或多種p75拮抗劑。 35.如請求項34之方法，其中該一或多種DR6拮抗劑係選自結合DR6之抗體、包含SEQ ID NO: 1之胺基酸卜354的可溶性DR6多肽、及結合APP之抗體；其中該p75拮抗劑係 146428.doc -4- 201034684 選自可溶性p75、及結合p75之抗體。 3 6.如請求項35之方法，其中該可溶性DR6多肽包含DR6免疫黏附素。 3 7.如請求項35之方法，其中該可溶性DR6多肽包含DR6細胞外域序列與免疫球蛋白之Fc區融合。 38.如請求項35之方法，其中該結合DR6之抗體結合包含 SEQ ID NO: 1之胺基酸1-349或42-349的DR6多肽。 3 9.如請求項35之方法，其中該結合DR6之抗體為嵌合、人 0 類化或人類抗體。 40. 如請求項35之方法，其中該結合DR6之抗體競爭性抑制分別以 ATCC 寄存編號 PTA-8095、PTA-8094 或 PTA-8096 寄存的融合瘤細胞株所產生之3F4.4.8、4B6.9.7或 1E5.5.7單株抗體之結合。 41. 如請求項35之方法，其中結合DR6之抗體或可溶性DR6 多肽係連接於一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物。〇 42.如請求項34之方法，其中該結合APP之抗體為單株抗體。 43. 如請求項30之方法，其中該結合APP之單株抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 44. 如請求項30之方法，其中該結合APP之單株抗體競爭性抑制單株抗體22C 11之結合。 45. 如請求項30之方法，其中該結合APP之單株抗體係連接於一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成 146428.doc 201034684 之群的非蛋白質性聚合物。 46. 如請求項34之方法，其中該一或多種DR6拮抗劑中之至少一者抑制DR6與包含SEQ ID N0: 6之胺基酸66_81的 APP多肽之結合。 47. 如請求項34之方法，其中該一或多種〇][16拮抗劑中之至少一者抑制APP與包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1_655的 DR6多肽之結合。 48. 如請求項34之方法，其中該神經病狀或病症為肌萎縮性側索硬化、帕金森氏病 '亨廷頓氏病或阿茲海默氏症。 49. 如請求項34之方法，其中該神經病狀或病症包含由於中風、大腦或脊髓組織外傷、或神經元組織病變之神經元細胞或組織損傷。 50_如請求項34之方法，其中投與該哺乳動物一或多種其他治療劑。 51. 如請求項34之方法，其中該—或多種DR6拮抗劑經由注射、輸注或灌注投與該哺乳動物。 52. 如請求項50之方法，其中該一或多種其他治療劑係選自 NGF、細胞洞亡抑制劑、EGFR抑制劑、卜分泌酶抑制劑、分泌酶抑制劑、膽鹼酯酶抑制劑、抗Ap抗體、及 NMDA受體拮抗劑。 53. 如請求項35之方法，其中該可溶性ρ75多肽包含ρ75免疫黏附素。 54·如請求項35之方法，其中該可溶性Ρ75多肽包含ρ75細胞外域序列與免疫球蛋白之FC區融合。 146428.doc 201034684 55. 如請求項35之方法，其中該結合p75之抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 56. 如請求項35之方法，其中結合p75之抗體或可溶性p75多肽係連接於一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物。 5 7. —種組合物，其包含： (a) 經分離之DR6拮抗劑，其包含⑴結合包含SEQ ID NO: 1之DR6多肽之單株抗體、或（ii)可溶性DR6多肽、或（iii)結合包含SEQ ID NO: 6之APP的單株抗體，其中該 DR6拮抗劑抑制APP與DR6之結合；及 (b) 經分離之p75拮抗劑，其包含⑴結合p75多肽之單株抗體、或（ii)可溶性p75多肽，其中該p75拮抗劑抑制APP 與p75之結合。 58.如請求項57之經分離之DR6拮抗劑，其中該可溶性DR6 多肽包含DR6免疫黏附素。 59_如請求項58之經分離之DR6拮抗劑，其中該可溶性DR6 多肽包含DR6細胞外域序列與免疫球蛋白之Fc區融合。 60. 如請求項57之經分離之DR6拮抗劑，其中該結合DR6之抗體結合包含圖1(SEQ ID NO: 1)之胺基酸1-349或42-349 的DR6多肽。 61. 如請求項57之經分離之DR6拮抗劑，其中該結合DR6之抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 62. 如請求項57之經分離之DR6拮抗劑，其中該結合DR6之抗體競爭性抑制分別以ATCC寄存編號PTA-8095、PTA- 146428.doc 201034684 8094或PTA-8096寄存的融合瘤細胞株所產生之3F4.4.8、 4Β6.9.7或1Ε5.5.7單株抗體之結合。 63.如請求項57之經分離之DR6拮抗劑，其中該結合DR6之抗體或可溶性DR6多肽係連接於一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物。 64·如請求項57之經分離之DR6拮抗劑，其中該DR6拮抗劑抑制DR6與包含SEQ ID NO: 6之胺基酸66-81的ΑΡΡ多肽之結合。 65. 如請求項57之經分離之DR6拮抗劑，其中該拮抗劑結合一種藉由空間抑制來抑制DR6與APP結合之抗原決定基。 66. 如請求項57之經分離之DR6拮抗劑，其中該結合APP之單株抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 67. 如請求項57之經分離之DR6拮抗劑，其中該結合APP之抗體競爭性抑制22C 11單株抗體之結合。 68. 如請求項57之經分離之DR6拮抗劑，其中該結合APP之抗體係連接於一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物。 69. 如請求項57之經分離之DR6拮抗劑，其中該拮抗劑抑制 DR6與包含SEQ ID NO: 6之胺基酸66-81的APP多肽之結合。 70. 如請求項35之方法，其中該可溶性p75多肽包含p75免疫黏附素。 146428.doc 201034684 71. 72. 73. 74. Ο 75. G 76. 如請求項35之方法，其中該可溶性ρ75多肽包含ρ75細胞外域序列與免疫球蛋白之Fc區融合。如請求項35之方法，其中該結合p75之抗體為嵌合、人類化或人類抗體。如明求項35之方法，其中結合p75之抗體或可溶性p75多肽係連接於一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烧組成之群的非蛋白質性聚合物。 —種醫藥la合H包含如請求項57至69之腸结抗劑及P75拮抗劑及醫藥學上可接受之載劑。一種製品，其包含： ⑷種包3有效置之如請求項57至69之结抗劑的組合物； (b) —種包含有效量之如培龙明衣項57至69之P75拮抗劑的組合物； (C)容納該組合物之容器；及 (d)貼於該容器之標鏟， '織或包括於該容器中之包裝插頁，其提供使用該DR6梓；^為丨、人由 _ 彳°抗劑治療神經病狀或病症之指示。一種套組，其包含：及容納於該容器中之組第一容器、該容器上之標籤，合物；其中該組合物包括有效 ,,^ , 抑制至乂一種類型之哺乳動物神經兀細胞之細胞凋亡、 , 乐—活性劑、有效抑制至少一種類型之哺乳動物神經_ *队、疋、、、田胞之細胞凋亡之第二活性 146428.doc 201034684 劑，该容器上之該標籤或包括於該容器中之包裝插頁指示該組合物可用於抑制至少一種類型之哺乳動物神經元細胞之細胞凋亡，該組合物中之該第/活性劑包含至少一種如請求項57至69之DR6拮抗劑，該組合物中之該第二活性劑包含至少一種如請求項57至69之p75拮抗取j . 第二容器’其包含醫藥學上可接受之緩衝劑；及使用該DR6拮抗劑及P75拮抗劑抑制至少一種類型之喷乳動物神經元之細胞凋亡之指示。 146428.doc 10-