TW200524545A

TW200524545A - Milk fractions and milk preparations for treating and/or preventing COX-2 mediated diseases

Info

Publication number: TW200524545A
Application number: TW093127522A
Authority: TW
Inventors: Lionel Bovetto; Joerg Hau; Catherine Mace
Original assignee: Nestec Sa
Priority date: 2003-09-12
Filing date: 2004-09-10
Publication date: 2005-08-01
Also published as: CR8265A; ATE407574T2; ES2314152T3; EP1514482B1; EP1514482B2; MXPA06002648A; EP1955602A1; US8012509B2; EP1514482A1; US20070110818A1; PT1514482E; AU2004271722B2; CN1849076B; BRPI0413714A; WO2005025335A1; JP2007505078A; CA2537544C; JP4824560B2; DE60323489D1; CN1849076A

Description

200524545 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種用於治療及/或預防環氧化酶-2調控疾病之、呂養及酉藥組合物、且係、關於_種用於增加產品之環氧化酶-2抑制活性之方法。具體而言，本發明亦係關於一種將或夕種礼蛋白質分餾物及/或一或多種乳蛋白質調劑用於抑制環氧化酶奴活性、特^而言用於製備供治療及/或預防環氧化酶_2調控疾病之食品或藥物上之用途。【先前技術】環氧化酶（cox)酵素係所需之用於將花生四烯酸轉化成前列腺素（PG)之關鍵酵素。迄今已識別c〇x之兩種異構體 COX-1及COX_2，彼等在諸多方面存在差異：cop係原構性表現於大多數組織中且推測其負責產生可控制正常生理機能（如胃黏膜之維護及腎血流量之調整）之前列腺素。第二種異構體COX-2看似並非原構性表現於大多數正常組織中’但其具有高度可誘發性且僅可發現於於具體位置 (如在發炎之部位或在癌細胞中）處。儘管發現COX-酵素係膜結合的，但其並不具有習知之透膜區域。實情為其含有經並置以形成疏水性區域之四個兩性螺旋片。此疏水區域將酵素之”下端”部分錨定於膜中。環氧化酶之活性部位係位於靠近兩性螺旋片之疏水性 £域中。據5忍為·酵素之基質及抑制劑可經由成形於雙層脂質（lipid bilayer)中之通道到達活性區域（w. Krause，R. Ν· Dubois，Prostaglandins & other Lipid Mediators 61 96088.doc 200524545 (2000)，145-161) 〇 COX抑制劑、且具體而言cox-2抑制劑用於治療各種不同疾病（如炎性疾病）且亦作為鎮痛劑使用。另外，已發現 COX-2通常在惡變前期組織及惡變組織中過度表現，且用 COX-2抑制劑所進行之治療已顯示可降低動物中腸瘤、食道瘤、舌瘤、乳房瘤、皮膚瘤、肺瘤及膀胱瘤之形成氓·

Subbaramaiah，A_J· Dannenberg，TRENDS in Pharmacological Sciences 24 (2003)，96-102)。各種熟知之諸如（例如）阿司匹林（aspirin)及布洛芬 (ibuprofen)之非類固醇消炎藥物（所謂之NS Am)可抑制 COX-1及COX-2。近來，一種僅可特定抑制c〇X-2酵素之新穎種類抑制劑（C0XIB)已有描述（Μ· Ε· Turini，R. n. Dubois, Physiology And Diseases. Annu. Rev. Med. 53 (2002)，35-57)。然而，已知NSAID可引起嚴重副效應，如腎問題和十二指腸及胃潰癌。因此，本發明之問題係提供用於抑制環氧化酶、具體而言COX-2之額外途徑，該途徑應與較低之有害副效應風險相關聯。【發明内容】此問題已藉由提供用於治療及/或預防c〇x_2調控疾病的呈現COX-2抑制活性的特異性之乳分餾物及/或乳調劑而解決。【實施方式】根據一態樣，本發明提供了一種用於治療及/或預 96088.doc 200524545 虱化=-2调控疾病的營養組合物及/或一種用於治療及/或 j防衣氧化酶調控疾病的醫藥組合物，該組合物：含可 ^環氧化酶d抑制活性的治療有效量之-或多種乳蛋白貝分餾物及/或一或多種乳蛋白質調劑。本申明案中所用之術語”治療及/或預防環氧化酶^調 ^疾病”既包含治療與環氧化酶之表現、具體而言與環乳化酶·2之增加之表現相關聯的疾病，亦包含預防可由降低個體體内特定部位處之環氧化酶-2之水平、或由預防個體體内特定部位處之環氧化酶_ 2之水平上升所影響之疾病％氧化酶-2之增加之水平表示超出在健康個體中於特定部位處統計學上平均出現之環氧化酶_2之水平的量。可根據本發明來治療及/或其發作可根據本發明來預防之第一組裱氧化酶_2調控疾病係癌症，其包含任何其癌症前期病狀。根據現有之科學資料，目前推測··在惡變前期及惡變組織中COX-2係過度表現，且C0X_2之該增加之表現至少部分地與腫瘤形成之誘發相關聯。事實上，c〇x_2 之该過度表現已在諸如（例如）結腸、胃、食道、肝、膽道 (biliary stem)、胰腺、頭及頸、肺、乳房、膀胱、女性生殖器官及皮膚之器官中之若干惡變前期病症及惡變病症中觀察到。基於先前技術之C0X-2抑制劑的成功之腫瘤治療亦已達成。因此’根據本發明之組合物之投用將有助於治療及/或預防癌症及/或癌症前期病狀。亦顯示COX-2抑制劑可阻止前列腺素之形成，前列腺素之存在與疼痛、發燒及發炎之顯現（development)和發展相 96088.doc 200524545 關聯。根據本發明，、、A & /σ療及/或預防所針對之COX-2調控疾病之額外目標組係關筋* 、九、風濕熱、與流感或其他病毒感染相關聯之症狀、痛奴 ^ 、彿、、、工頭痛，牙痛，退化性關節疾病等。因為已顯示C〇x 抑制劑對阿茲海默症（Alzheimer，s disease)之顯現且右彳 /、有保4效應，所以認為阿茲海默症亦係根據本發明之目標疾病。 #據本^明之營養及/或醫藥組合物設計以投予任何需要’、之個體、較佳哺乳動物、具體而言人類及動物(如寵物）〇如本文所提及之”環氧化酶_2抑制活性，，可根據基於如以下實例中所扣不2HUV_EC-C細胞之c〇x_2篩查方法來測疋’但其亦可基於此項技術中已知之其它檢定法來測定。特定所需的用於指定個體之治療有效量之一或多種乳蛋白質分餾物及/或一或多種乳蛋白質調劑可容易地由熟習此項技術者根據其於此項技術中考慮到各種因素（諸如體重、年齡、整體健康狀況、性別、飲食、投用時間、投用路仅排，世率、藥物組成專）之常識（general knowledge)來確定。基本上，用於具體個體之特定劑量方案將視該事實而定’而不論所針對者係疾病之整體預防抑或急性治療。例如’在70 kg之個人之情況下，該一或該等多種乳蛋白質分餾物及/或該一或該等多種乳蛋白質調劑之日均劑量可選自介於7 mg至70 g之間，該日均劑量對應於每公斤體重之自約0· 1 mg至約1 g、較佳自約〇·5 mg至約1 00 mg、更佳自約5 mg至約70 mg、甚至更佳自約1〇 mg至約50 mg之 96088.doc 200524545 曰均劑量。根據本發明之營養組合物 .z A w 、σ於人類或動物舍用> k 何組合物，其包含至少一 &用之任 n k目由水、蛋白皙碳水化合物、脂肪組成之群之物質。、或肽、本發明之醫藥組合物係包匕3至少一種如本文療活性化合物之任何組合物。攻之^ 此外，本發明提供一種包含』徒壞氧化每-2抑制法批的增加量之該-或該等多㈣居性年礼蛋白貝分餾物及/或一該等多種乳蛋白質調劑之營養或蚕及/或醫藥組合物，且該組 ΰ物提供一比其中該一矣么七_々、 / 戈§亥4多種乳蛋白質分館物及/或该一或该等多種乳蛋白質調乂醫藥組合物之環氧化醢^ 、之衣乳化Μ抑制活性更高之環氧化酶-2抑制活性。〜可提供環氧化酶-2抑制活性的該增加量之該一或該等多種乳蛋白質分餾物及/或該一或多種該等乳蛋白質調劑二或者藉由加人額外量之該_或該等多種乳蛋白質分顧物及 /或该一或該等多種乳蛋白質調劑及/或藉由用其中（一或多生^活性化合物已富集之乳分_取代乳分餾物來^ 得。富集可根據此項技術中熟知之物理、化學及生物技術來達成且可基於（例如）實例中所述之檢定法來執行。產生自如以上所概述之富集過程或加成過程之產品之環氧化酶-2抑制活性應比參考營養/醫藥組合物（亦即具有— 一除了額外及/或富集之一或多種乳蛋白質分餾物及/或一或多種乳蛋白質調劑以外一一與具有增加之環氧化酶_2抑 96088.doc 200524545 il :!·生之營養/醫藥組合物相同之組成的營養/醫藥組合物) 之環氧化酶-2抑制活性高至少1%、更佳至少5%、最佳至少1〇%、且具體而言至少25%。 /廣泛研究期間，本發明者證明特異性乳蛋白質分餾物提，基本上不可能發現於如此之乳中的或優於如此之乳之彼環氧化酶-2抑制活性的環氧化酶，制活性。不希望限制於任何理論，可假定人乳中所觀察到之較低初始活性似 U白為相關聯。酪蛋白自身可能具有壓製效應，或其含有由酸化或凝乳酶處理所活化之，，潛伏生物活性”（且其然後發現於乳清分餾物中）。作為經發現可呈現㈣加之⑽·2抑制活性之該等乳分館物，可提及人乳、牛乳、水牛乳、或另一哺乳動物乳之 ;清分館物，人乳、牛乳、水牛乳、牛乳、或另-嗜乳動物乳之脫脂乳分館物，牛乳之酸赂蛋白分顧物，牛乳之甜酪蛋白分餾物等，或其組合。作為乳清分餾物，可使用 (例如)酸乳清分館物、甜乳清分館物、可溶乳清分其組合。可溶乳清蛋白質之額外之子分師—tion)及筛查揭示來自牛乳之可溶乳清蛋白質之—些子分館物受到青味。原理上，可藉由（例如）疏水相互作用層析法（HIC)、或夢由疏水作U效液相層析法（HI舰〇、逆相高效 :法㈣狐〇,及類似方法（其均基於相同分離原理）^ 成可溶乳清蛋白質之子分餾物夕八她Ώ 餾物之分離及離析。熟習此項技 96088.d〇( -10- 200524545 術者已知HIC之原理。大體上，樣本裝填於包含可保留樣本之疏水物質之平衡管柱（固定相）上。疏水物質可為（例如）諸如可作為 Amberlite Xad 16 XAD 16 自 Rohm and Hass 購得之大孔交聯聚苯乙烯。亦可使用來自Amersham之15 RPC TN 17-0727-02(聚苯乙烯-二乙烯基苯）或等效物。在蛋白質裝填於管柱上之前，可用緩衝溶液平衡管柱。分餾物裝填於之後，缓衝溶液或缓衝溶液之混合物（流動相）可經管柱運行，緩衝溶液之混合物從而改變且因此可具有可根據蛋白質子分餾物之疏水性而將其自管柱溶離的改變特性。根據此方法之乳清蛋白質之分離描述於： ’’Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene” D. F. Elgar等人，Journal of Chromatography A 878 (2000) 183-196 中。自管柱溶離出之蛋白質子分餾物可藉由實現其自固定相之溶離的緩衝溶液混合物或乙腈内含物之組成來準確描述。例如，可將可溶乳清蛋白質裝填於其中填充有聚苯乙烯-二乙烯基苯珠粒之管柱上（來自Amer sham之15 RPC TN 17-0727-02)，緩衝溶液A定義為0.1體積％三氟乙酸（TFA) 於水中之溶液且緩衝溶液B定義為80體積％乙腈與0.85體積 % TFA(體積％)之混合物。然後，可藉由諸如FPLC(快速蛋白質液相層析法）UNICORN台（Pharmacia/Amersham)之特 96088.doc -11 - 200524545 疋系統來控制緩衝溶液A與B之混合及傳送。

溶離之蛋白質子分餾物可藉由上述之緩衝溶液A與B之混合比率之溶離範圍來界定。當使用特定之緩衝溶液电人物（因為溶離次序係依pH值而定）時，藉由在蛋白 I 溶離時刻出現之乙腈之相對量來簡單描述蛋白質子分餘邊之溶離瞬間或時間間隔。若需要’可藉由此項技術中熟知之技術濃縮如此獲得之 :分顧物’例如用蒸發法、超渡法或渗析法消除有機溶二而後藉由(例如)真空乾燥、冷，東乾燥、嘴霧乾燥、流化床乾燥、供箱乾燥或任何其他合適之乾燥方法來乾燥。

CotUr中所狀子分㈣已顯示特定有效於促進表5中所：1 :根據一甚至更佳之實施例，本發明係關於如、彳不之尚度有效之子分餾、9、⑽“。单大體上，任何哺乳動物來源(人類、奶牛、水牛、絲二白山馬等）之乳均可用來製備根據本發明之礼蛋白負为餾物或蛋白質調劑。脫脂乳、酸乳清及甜乳清備。如本發明之情形中利I 以中所述之方法製 ^ 用之術-”可溶乳清蛋白質丨丨或二:蛋二貝"意謂在超速離心(例如在1小時内，於_〇中所:：熟習此項技術者已知之另-方法於水溶液中所回收之蛋白質。術组，指示在該超速離心(例如:據實:广：質”機^ 熟習此項技術者已知之另—方=中所概述之步驟或根據洗滌物質。万法）之後自沈濺物回收之經 96088.doc 200524545 > :疋言之，較高環氧化酶，制活性係由來自人乳之甜 ::牛乳之若干種分館物(亦即，天然乳、脫脂乳清、可溶乳清、甜赂蛋白）來提供。就實例中所调研之所有三種乳種類（人乳、牛乳、水牛乳）而言，均以料清來獲得最高cox_2抑制率，甜乳清相應地代表發明之較佳實施例。乳清蛋白質調劑提供良好之結果，然而其並非如若干種礼蛋白質分顧物-樣有效。因而，可推測在根據本發明之礼蛋白質分餾物令提供了可增強c〇x_2抑制活性的正協同 ^應。若需要’乳蛋白質分餾物及乳清蛋白質調劑亦可組合0 針：出現在根據本發明之乳蛋白質分餾物中之(一或多種）衣氧化酶-2抑制化合物之識別研究顯示該等化合物必須係蛋白貝#。已顯示乳鐵蛋白、一種已知之化合物不且有任何環氧化酶-2抑制活性。八與該一或該等多種乳蛋白質分餾物及/或該一或該等多 —蛋白貝凋劑之生物降解相關之生物利用度及穩定度可精由保護該—矣么办 a 4 "亥荨夕種乳蛋白質分餾物及/或該一或該 ^ 乳蛋白貝凋劑中所出現之化合物之一或多種官能基 ^ (例如）-0H、_NH2、-SH、-COOH來進一步增加。該保護（例如）可藉由愈_ 或夕種糖或碳水化合物諸如（例如）乳糖進行反廡爽隹> ^ … 仃。例如，在乳糖存在下加熱乳蛋白質產生乳糖化之I占μ 貝（lactosylated protein)。保護之後，該等物將提供對降解、具體而言體内蛋白水解之降解的增 96088.doc -13- 200524545 加之抗性，其大體上接著導致增加之生物利用度。亦可使用衍生作絲獲得所要之溶解度且進而獲得所要之並受控之生物利用度。根據另-態樣，本發明係關於—或多種乳蛋白質分_ 及/或-或多種乳蛋白質調劑用於製備—種藉由抑制環氧化酶-2活性來治療瞻-2馳疾病之營養或醫藥組合物。

提供COX-2抑制活性之一或多種乳蛋白質分館物及/或一或多種乳蛋白質調劑可(例如)以含有習知無毒之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑、佐劑及媒劑之經口、經局部、非 :腸、或經直腸之劑型來投用。如本文所用之術語非經腸輸液技術。f肌肉内注射、胸骨内注射或很艨本發明之營養或醫藥組合物化酶-2調控疾病’例如（具體而言）結腸、胃膽道、騰腺、頭及頸、肺、乳房、膀耽皮膚之癌症或癌症前期病狀殖益6

風濕熱、與流感或疾病(例如瞻广^ /、病毋'感木相關之症狀、痛經、 ;:、退化性關節疾病等)及/或阿兹海默症。症Γ=:;虞本發明之營養或醫藥組合物可在習知之症…療及/或癌症前期病狀之治療、生物製劑治療％門及/5^ …療、放射阿兹海默症治療期間丑2疾病治療期間及/或 1作為共同治療藥物來施用。 ”衣乳S# -2抑制活性之

或-或多種乳蛋白所夕種礼蛋白質分餾物J 蛋白質調劑亦為適用於作為用於諸如(1 96088.doc 14 200524545 如）NS AID之習知藥物之部分或完全取代物。因此，本發明包含用於治療如上定義之環氧化酶調控疾病的包含治療有效量之該一或該等多種乳蛋白質分餾物及/或該一或該等多種乳蛋白質調劑及一或多種治療有效成份（例如疼痛舒解劑、增效劑、H2_拮抗劑、解充血藥、止咳藥、利尿劑、鎮靜或非鎮靜抗組胺藥、用於治療或預防癌症及/ 或癌症前期病狀之作用劑等）之醫藥組合物。含有（一或多種）活性成份之醫藥組合物可以任何適合於經口服用之形式諸如（例如）錠劑、糖錠、口含劑、水性或油性懸浮液、可分散之粉劑或粒劑、乳液、硬或軟膠囊、或糖漿或馳劑而存在。思欲用於經口服用之組合物可根據用於製造醫藥組合物之技術中已知之任何方法來製肖，且肖等組合物可含有一或多種選自由甜味劑、調味劑、著色劑及防腐劑組成之群之作用劑以提供醫藥上雅致且可口之調劑。 :劑含有與無毒醫藥上可接受之適合於製造錠劑別⑼如惰性稀釋劑、粒化劑、崩解劑及潤滑劑德合或夕種）活性成份。該等㈣可能未經塗覆或

之技術塗覆以在胃腸道中延緩崩解及吸收且二: 更長期間之持續作用。杈仏歷I _^ 口服用之調配物亦可作為其體稀釋劑混合之硬明膠膠囊而出現 0 與水或油介質混合之軟明膠膠囊而出現。〜、活性成份水性懸浮液含有與適合於製造水性懸浮液之賦形劑諸如 96088.doc 200524545 (例如）懸浮劑、分散劑或濕潤劑、防腐劑、著色劑、調味劑及甜味劑混合之活性物質。、適口於藉由水之加入來製備水性懸浮液之可分散粉劑及米刎提i、與刀放劑或濕潤劑、懸浮劑及一或多種防腐劑混白之（或夕種），舌性成份。諸如甜味劑、調味劑及著色劑之額外賦形劑亦可出現。上況月之乳蛋白質分德物及/或乳蛋白質調劑可用於任何營養、醫藥或機能性食品組合物中，㈣組合物可包 3 (例如）至少一種來自由水、蛋白質及/或肽、脂肪及碳水化合物組成之群之組份。該組合物可進一步包含（例如）根據U.s. RDA之曰均劑置之自3〇%至15〇%之量而存在之礦物貝及、准生素。另外’該等組合物可包含纖維物質、調味劑、乳化劑、游離基清除劑、防腐劑、酸、類脂、水果及果汁、茶等。具體而言，根據本發明之組合物可包含(例如)選自乳、酸乳赂、凝乳’乾赂、發㈣、乳基發酵產品、冰淇淋㈣.㈣、穀類基產品、乳基粉、嬰兒配方乳品 formulae)或寵物食品之食品組合物。預期可被食用者高度接受之調配物係（例如）飲品，例如基於包含根據本發明之乳蛋白質分㈣及/或調劑之乳製產品之習知飲料，例如水、果汁或茶。 )用於有利之調配物之額外實例係（例如）以甜品咖咖⑴ ㈣、減膠體或泡泳體（例如（諸如）”慕思加〇υ_)"("泡珠體”）、乳束（blanCmange)、果子涞、果醬餅（flan)之基於酸 96088.doc 200524545 乳路之調劑）之形式或以具有其中包含根據本發明之乳蛋白質分餾物及/或調劑之餡（fiUing)或核心之點心（snackX包含焙製產品）之形式而存在的組合物。根據本發明之乳蛋白質分餾物及/或調劑亦可（例如）以頂層或塗覆層之形式而施用於任何習知之食品上或被作為銘料物質而包括在任何習知之食品中。根據另一態樣，本發明提供一種增加產品之環抑制活性之方法，該方法包括在該產品中增加可提供環氧化酶-2抑制活性之一或多種乳蛋白質分餾物及/或一或多種乳蛋白質調劑之量之步驟。其中增加了環氧化酶_2抑制活性之產品可為（例如）營養組合物及/或醫藥組合物及/或機能性食品組合物，具體而言為乳製食品。本發明者亦發現離析乳蛋白質分餾物之方法，其既提供良好產量又大體上保存了該等乳蛋白質分顧物中活性組份之氧化酶-2抑制活性。離析可提供環氧化酶-2抑制活性之甜乳清蛋白質或酸乳清蛋白質之方法包含以下步驟：在3〇分鐘期間以l3 6〇〇 g 離心乳來獲得乳脂層及脫脂乳之層；分離該乳脂層；離析該脫脂乳；加入一定量之CaC12水溶液至脫脂乳以便獲得具有2 mmol/1 Ca2+之濃度之混合物；加熱該混合物至35。〇且將具有50 mg活性糜蛋白酶/升之活性之凝乳酶（例如以每笔升脫爿曰乳之0.4至〇·6之間、較佳〇·5 μ1凝乳酶之量）加入戎混合物或加熱該混合物至25〇Ca用HC1(32%)之水溶液酸 96088.doc 200524545 化。亥扣口物至pH值為4.6 ;在3〇分鐘期間以13 6〇〇 g離心該混合物以獲得相分離；且分別離析甜乳清蛋白質或酸乳清蛋白質。離析可提供環氧化__2抑制活性之可溶乳清蛋白質包含以下步驟^在30分鐘期間以13_ g離心乳來獲得乳脂層及脫脂乳之層；分離玆日匕麻·從，礼月曰層，離析該脫脂乳；以該可獲付具有2 nmiol/1 Ca之濃度之混合物之量將〔心2水溶液加

入該脫脂乳；在一小日车宜日pq ·、，t AA A 月間以100·00〇 g自非可溶膠束酪蛋白相分離可溶乳清蛋白質相；且離析可溶乳清蛋白質相。根據另外-態樣，本發㈣關於提供環氧化酶_2抑制活

性之乳分館物，該#1公趨私-Γ _li=i U 礼刀餾物可根據如上概述之方法中之一種來獲得。知因於其¥氧化酶_2抑制活性，根據本發明之乳蛋分顧物將提供習知之職出之替代品、具體而言在其中表明該等NSAID之療法不可取 j取之1f况下（例如在個體患有潰瘍、凝血失調（coagul t· 如η η )、腎疾病等之情況下）即如此。另外，可預期該產品將大應，且因此可在甚至較長時期 …：在有效丁 W ㊅用。當需要預防環氧酶-2調控疾病時、例如在個人於熟知之風險因素（高度風險总卷凌/^傳倾向或由於暴露且低纖維之典型”西式#呂養叙艮，諸如（例如）高脂肪之飲食# ^ ^食㈤㈣㈣”、暴露於化學品之奴艮寺）中而導致並撼扭钱，、據推測具有顯現癌情況T ’該產品不存在有害副效應且因此可在二Π 期内食用之上述情形且/ 纟甚至較長犄 ^月形具體而吕乃受到高度關注。 96088.doc -18- 200524545 因為乳產品長久以來一直被人類食用，所以可預期根據本發明之機能性食品或藥物將被食用者高度接受。以下實例係用於說明本發明而非將其限制於所提及之特定實施例。實例所有溶劑係屬於分析或HPLC等級且可自Merck (Dietikon，Switzerland)購得。水係使用 Millipore Milli-Q 水淨化系統（Millipore，Volketswil，Switzerland)於内部淨化或水係 HPLC-等級（Merck，Darmstadt，Germany) 〇 CaCl2x2 H20、HC1 (32%)、氫氧化納、強雙氧水30% H202 ρ. Α·均係來自Merck。凝乳酶簡單地預熟化”）係由TEXEL公司（38470 Vinay， France)生產且自 Rh0ne Poulenc Rohrer (Cooperation Pharmaceutique Francaise，77000 Melun，France ； Batch No.101089007)獲得，其具有50 mg活性糜蛋白酶/升之活性。實例1 乳樣本製備除非本文另有明確指示，否則製備乳分顧物之標準步驟如：C. Alais，Science du Lait，Principe des Techniques Laitieres. SEPAIC，Paris，4th ed.，1984, p. 29-35及 159-178 中所描述來進行。所指示之實驗室規模之分餾步驟係自習知之工業級乳處理過程開始而顯現。令人吃驚地，選擇度及分離效率可藉 96088.doc -19- 200524545 由執行以下所指示之過程步驟、具體而言藉由在高加速率下進行離心且進行經特定調適之洗滌步驟而顯著增加。 1.1牛乳牛乳係自當地市場r'Toni lait”，Switzerland)獲得。在第一步驟中，乳脂係藉由使用固定角式轉子Sorval GS3 (9000 rpm，30分鐘期間）具有高達13600 g之加速率的離心而自全乳萃取。自全乳之2.200 ml開始，90 g乳脂於頂層中回收。分離頂層之後，獲得2090 ml脫脂乳。自酪蛋白分離甜乳清係藉由可誘發酪蛋白凝結之脫脂乳酵素處理來達成。將520 /xl之200 mM (200 mmol/l)CaCl2水溶液加入520 ml脫脂乳得到具有Ca2+為2 mM (mmol/1)之最終濃度之混合物。在35CC下加熱此脫脂乳混合物且然後在適度磁攪拌下即刻加入250 μΐ凝乳酶。1 min後該摻合物在 35。0下於水浴中培育50 min (分鐘），傾入用於離心之瓶中並隨後以13600 g (固定角式轉子Sorval GS 3 ; 9000 rpm， 3 0 min)離心歷經30 min期間以自非可溶凝乳酶酪蛋白分離甜乳清。將476 ml上層清液（亦即”甜乳清’’）分餾成10x1.3 ml等分試樣（Eppendorf)且置於標記有（甜乳清）之40 ml之塑膠管中且藉由浸沒在液氮中來冷凍，且在零下20°C下將其儲存在塑膠袋中。將該凝乳酶路蛋白（45 g)分散在286 ml之2 mM (mmol/1) CaCl2水溶液中，該CaCl2溶液補充以0.9重量％2NaCl然後將其離心；將該上層清液（246 ml)分成相等之若干部分 96088.doc -20- 200524545 置入標記有（凝乳酶酪蛋白洗液）之容器中且在液氮中冷凍。將3 1 g經回收、洗滌之凝乳酶酪蛋白分散在2 mM (mmol/1) CaCl2水溶液中，該CaCl2溶液補充以0·9重量％之 NaC卜以便獲得250 ml之體積。然後將該混合物分成相等之若干部分置入標記有（凝乳酶酪蛋白）之容器中且冷凍。自酪蛋白分離酸乳清係藉由可誘發酪蛋白凝結之脫脂乳化學酸化來獲得。將520 μΐ之200 mM (mmol/1) CaCl2水溶液加入520 ml脫脂乳中以得到具有2 mM (mmol/1) Ca2+之最終濃度的混合物。在25°C下藉由在適度磁攪拌下加入HC1 (32%)水溶液而將該混合物自pH值6.6酸化至pH值4.6。攪拌1 min以後，該摻合物在25°C下培育歷經60 min期間，傾入用於離心之瓶中並隨後以13600 g (固定角式轉子Sorval GS3 ; 9000 rpm，在30 min期間）離心歷經30 min期間以自非可溶酸酪蛋白分離酸乳清。將503 ml上層清液（亦即酸乳清）分餾成l〇xl.3 ml等分試樣（Eppendorf)且置於標記有（酸乳清）之40 ml之塑膠管中且藉由浸沒在液氮中來冷凍且在零下20°C下將其儲存在塑膠袋中。將酸酪蛋白（41 g)分散在233 ml具有pH值4.6之20 mM (mmol/1)乙酸鈉水溶液中。離心由此獲得之混合物，且分離上層清液（250 ml)，且隨後分成相等之若干部分置入標記有（凝乳酶酪蛋白洗液）之容器中且在液氮中冷凍。將2 8.6 g經回收、洗條之酸絡蛋白分散在水中。藉由加 96088.doc 21 200524545 入NaOH將此混合物之pH值自4.67調整至6.6。隨後，調整其體積至250 ml，且將如此獲得之混合物分成相等之若干部分置入標記有（酸酪蛋白）之容器中且冷凍。為了分離可溶（乳清）蛋白質及經洗滌之非可溶蛋白質（膠束酪蛋白），可進行以下步驟：將 250 μΐ 之 200 mM (mmol/1) CaCl2 水溶液加入 250 ml 脫脂乳中以獲得具有Ca2+為2 mM (mmoVl)之最終濃度之混合物。超速離心此乳（在1小時期間在Beckman L8-60M超速離心機中以對應於管中間之100000 g處之32000 rpm之速度將固定角式轉子45 TI中之6支含有42.1 g脫脂乳之管離心）以自非可溶膠束酪蛋白分離可溶乳清蛋白質。將228 ml上層清液（亦即可溶乳清蛋白質）分餾成10x1.3 ml 等分試樣（Eppendorf)且置於標記有（可溶乳清蛋白質）之 40 ml之塑膠管中且藉由浸沒在液氮中來冷凍且在零下 2(TC下將其儲存在塑膠袋中。將膠束酪蛋白（24 g)分散在220 ml之2 mM (mmol/1) CaCl2 水溶液中，該CaCl2溶液補充以0.9重量％之NaCl。超速離心該混合物（在1小時期間在Beckman L8-60M超速離心機中以對應於管中間之100.000 g處之32.000 rpm之速度）。分離該上層清液（229 ml)，且然後分成相等之若干部分置入標記有（膠束酪蛋白洗液）之容器中且在液氮中冷凍。將22 g經回收、洗滌之膠束酪蛋白分散在2 mM (mmol/1) CaCl2水溶液中，該CaCl2溶液補充以0.9重量％2NaCl，以便250 ml之最終體積。將此混合物分成相等之若干部分置 96088.doc -22- 200524545 入標記有（膠束酪蛋白）之容器中且冷凍。 1·2人乳人礼係自同意捐獻人乳樣本之健康母親以並不危及嬰兒之營養供應之量（10-60 ml)而獲得。樣本係在產後直至7〇天内藉由吸乳器擠壓或偶爾藉由人工擠壓來獲得且在收集後之2 j日守内處理。除非另有明確指示，否則所有程序步驟如以上1 · 1中所述來進行。將 7.2 ml 之 200 mM (mmol/1) CaCl2 水溶液加入 715 ml 之全礼中以獲得具有2 mM (mmol/1) Ca2+之最終濃度之混合物。在進行用於乳脂分離之離心過程（如以上M中所述）之後，26.6 g乳脂作為頂層回收且713 g脫脂乳被分離。甜乳清/酪蛋白之分離係藉由可誘發酪蛋白凝結之脫脂礼酵素處理來獲得。在35cC下加熱脫脂乳（2〇〇幻，且然後在適度磁攪拌即刻加入100 μ1凝乳酶。丨min後該摻合物在 3 5 C下於水浴中培育歷經5〇 min期間，傾入用於離心之瓶中並Ik後在30 min期間以13.600 g離心（如以上1 · 1中所述）以自非可溶凝乳酶酪蛋白分離甜乳清。將199 ml上層乳清（亦即甜乳清）分餾成1〇xl 3ml等分試樣（Eppendorf)且置於標記有（甜乳清）之4〇 w之塑膠管中且藉由浸沒在液氮中來冷凍且在零下2〇〇c下將其儲存在塑膠袋中。 / 將凝乳酶赂蛋白（2 g)分散在98 ml之2 mM (mmol/1) CaCl2水洛液中’該CaCh溶液補充以〇·9重量％之Naci。離心所得混合物；將上層清液（99 111]()分離並然後分成相等之 96088.doc 200524545 若干部分置入標記有（凝乳酶酪蛋白洗液）之容器中且在液氮中冷凍。 / 將1.15以至时之凝乳酶路蛋白分散在2福（軸〇㈧ CaCh水溶液中，該CaCU溶液補充以〇·9重量體積％之

NaCl，以獲得100 ml之體積。然後將所得混合物分成相等之若干部分置入標記有（凝乳酶酪蛋白）之容器中且冷自酪蛋白中分離酸乳清係藉由可誘發酪乳化學酸化來獲得。在25。。下，藉由於適度磁擾;:= HC1 (32%)水溶液將200 ml脫脂乳自？11值66酸化至^^值 4.6。攪拌i min後，該摻合物在25乂下培育歷經6〇也沁期間，傾入用於離心之瓶中並隨後在3〇min期間以i36〇〇g離心（如實例1.1中所述）自非可溶酸酪蛋白中分離酸乳清。將195 ml上層清液（亦即酸乳清）分餾成1〇χ13如等分試樣（Eppendorf)且置於標記有（酸乳清）之4〇⑹之塑膠管中且藉由浸沒在液氮中來冷凍且在零下2〇。〇下將其儲存在塑膠袋中。將酸酿蛋白（4.9 g)分散在95 ml之具有pH值46之2〇 mM (mmol/1)乙酸納水溶液中，且離心該混合物。將該上層清液（96 ml)分成相等之若干部分置入標記有（酸酪蛋白洗液）之容器中且冷凍在液氮中。將2.9 g經回收、洗務之酸絡蛋白分散在95如水中。藉由加入NaOH調整此混合物之？11值至6 2。隨後，調整其體積至100 ml。然後將戎混合物分成相等之若干部分置入標 96088.doc -24- 200524545 記有（酸酪蛋白）之容器中且冷凍。為了分離可溶（乳清）蛋白質及經洗滌之非可溶蛋白質（膠束赂蛋白），可進行以下步驟：如1 · 1下所述超速離心脫脂乳。將198 ml上層清液分餾成ι〇χΐ·3 ml等分試樣（Eppendorf) 且置於標記有（可溶乳清蛋白質）之40 ml之塑膠管中且藉由浸沒在液氮中來冷凍且在零下2〇°C下將其儲存在塑膠袋中0 將膠束酪蛋白（〇·5 g)分散在32 ml之2 mM (mmol/1) CaCl2 水〉谷液中’該CaCl：2溶液補充以0.9重量％2NaCl，且超速離心該混合物（如實例1·1下所述）。將如此獲得之上層清液 (32.8 ml)分成相等之若干部分置入標記有（膠束酪蛋白洗液）之容器中且在液氮中將其冷凍。將0.4 g經回收、洗滌之膠束酪蛋白分散在2 mM (mmol/1) CaClyJc溶液中，該CaCl2溶液補充以〇.9重量％之 NaCl ’以獲得33 ml之最終體積。將所得混合物分成相等之右干部分置入標記有（膠束酿蛋白）容器中且冷束。 1 · 3水牛乳純鮮水牛乳係在巴基斯坦之Lahore地區獲得且其經冷藏並供應至附近一實驗室，在此將純鮮水牛乳冷凍乾燥。冷康溫度為約零下20°C至約零下25t且乾燥溫度為4〇t。真空壓力保持在2 Torr以下，且最終壓力為〇·2 T〇rr。乾燥之粉劑达、封在铭塗層塑料袋中、裝運且然後在室溫下儲存。除非另有明確指示，所有程序步驟如實例1 ·丨中所述來進 96088.doc -25- 200524545 行。藉由將70 g粉劑溶解在468 ml h2〇中且加入54 mi之2〇〇應（謂mmol/1) CaC^溶液以將冷來乾燥水牛乳於13% 總固體量(TS)下復原，543 ml之具有。2+為2碰之最終濃度之復原水牛乳。在進行如實壯1τ所概述之用於乳脂分離之離心過程之後’ 46 g|L脂作為頂層回收且奶 ml脫脂乳被分離。自酪蛋白分離甜乳清係藉由可誘發酪蛋白凝結之脫脂乳酵素處理來獲知。在35°C下加熱145 ml脫脂乳，然後在適度磁擾拌下即刻加入73…凝乳酶。丨min後該摻合物在 35 C下於水浴中培育歷經5〇 min期間，傾入用於離心之瓶中並隨後在30 min期間以136〇〇 g離心（如實例丨」中所述）以自非可溶凝乳酶酪蛋白中分離甜乳清。將130 ml上層乳清（亦即甜乳清）分餾成1〇χ1·3 mi等分試樣（Eppendorf)且置於標記有（甜乳清）之4〇㈤丨之塑膠管令且藉由浸沒在液氮中來冷凍且在零下2〇〇c下將其儲存在塑膠袋中。將凝乳酶酪蛋白（14 g)分散在140 ml之2 mM (mmol/1) CaCl2水溶液中，該CaC12溶液補充以〇 9重量％之1^〇1，並將其離心（如實例丨.1中所概述）。將如此獲得之上層清液 (130 ml)分成相等之若干部分置入標記有（凝乳酶酪蛋白洗液）之容器中且在液氮中將其冷柬。將13 g經回收、洗滌之凝乳酶酪蛋白分散在2 (mmol/1) CaClyic溶液中，該CaCl2溶液補充以〇9重量％之 96088.doc -26- 200524545

NaCl以獲得145 ml之體積。然後將所得混合物分成相等之若干部分置入標記有（凝乳酶酪蛋白）之容器中且將其冷凍。酸乳清/酪蛋白之分離係藉由可誘發酪蛋白凝結之脫脂乳化學酸化來獲得。在25t下，藉由在適度磁攪拌下加入 0.6 ml之HC1 (32%)水溶液將145㈤脫脂乳自1?11值6.74酸化至pH值4.6。攪拌1 min後，該摻合物在25它下培育歷經 60 min期間，傾入用於離心之瓶中並隨後在3〇爪化期^以 13600 g離心（如實例hl下所述）以自非可溶酸酪蛋白中分離酸乳清。將129 ml上層清液分成购3叫分試樣（Ερ_㈣且置於標記有（酸乳清）之4〇如之塑膠管中且藉由浸沒在液氮中來冷凍且在零下20°C下將其儲存在塑膠袋中。將酉夂酷蛋白（13 g)分散在130 ml之具有pH值4.6之20 mM (_ο1/1)乙酸鈉水溶液中，且離心該混合物（見實例 1.1)。將該上層清液⑽叫分成相等之若干部分置入標記有（酸酷蛋白洗液）之容器中且將其冷;東在液氣中。將12 g經回收、洗滌之酸赂蛋白分散在水中且藉由加入

NaOH調整pH值至6·7β隨後，調整其體積至⑷⑹。然後將該混合物分成相等之若干部分置入標記有(酸酷蛋白)之容器中且將其冷凍。為分離可溶蛋白質及經洗滌之非可溶蛋白質(膠束酪蛋白），進行以下步驟：；ml脫知水牛乳超速離心（如實例1 · 1中所述）以自非 96088.doc -27- 200524545 可溶膠束赂蛋白中分離乳清。將1 3 2 ml上層清液分餾成 1〇χ 1.3 ml等分試樣（Eppendorf)且置於標記有（可溶乳清蛋白質）之40 ml之塑膠管中且藉由浸沒在液氮中來冷凍且在零下20Y下將其儲存在塑膠袋中。將凝膠狀之膠束酪蛋白（11.4 g)分散在133 ml之2 mM (mmol/1) CaCl2水溶液中，該CaCl2溶液補充以0.9重量％之 NaCl。超速離心該混合物（見上述之1.1)。將如此獲得之上層清液（125 ml)分成相等之若干部分置入標記有（膠束酪蛋白洗液）之容器中且在液氮中將其冷凍。將11 g經回收、洗務之膠束赂蛋白分散在2 mM (mmol/1) CaCl2水溶液中，該CaCl2溶液補充以0.9重量％2NaCl，以獲得145 ml之體積。然後將所得混合物分成相等之若干部分置入標記有（膠束酪蛋白）之容器中且將其冷凍。實例2 來自牛乳之可溶乳清蛋白質之子分餾如實例1中所述而獲得之15 ml可溶乳清蛋白質在37°C下於水浴中解凍歷經20 min，藉由渦旋使其混合且以13.000 rpm在54 15 Eppendorf離心機中離心1 min。在0.45 μηι微孔過濾器（306/GSWP04700.GS)上過濾之後，將10 ml之此調劑注入其中填充以 100 ml Source 15 RPC TN 17-0727-02(聚苯乙烯-二乙烯基苯）之HR16x50管柱中，該管柱係與由 UNICORN站（Amersham Pharmacia Biotech)控制之 FPLC 系統連接。層析條件係： 96088.doc -28- 200524545 A緩衝溶液：0.1%TFA於水中之溶液（2’000 ml之在0.45 /m 微孔系統上過濾之miliQ水加上2 ml TFA (Sigma 91699， 100 ml)); B緩衝溶液：乙腈80%與TFA0.85%之混合物（400 ml之在 0.45 μπι微孔系統上過濾之miliQ水加上1.600 ml乙腈之混合物，其在1 5 min期間在超聲波浴中除氣，且最後補充以 1.7 ml TFA)。用20%之B緩衝溶液使管柱達到平衡。然後，在達到一管柱體積（CV)之後，樣本被注入管柱中，在15 CV時，B緩衝溶液增加到75%且在2.5 CV時其增至100%。最終，在0.4 CV 時，梯度減少到20%B缓衝溶液。流動率固定在3 ml/min。 96份之1 8 ml分餾物被收集在塑膠管中。該等分餾物被保存在零下20°C下。HIC-HPLC分析之後，將該等96份經收集之管藉由HPLC概況之相似性集中在14份分餾物中，且將其蒸發濃縮而後凍幹以用於隨後進行之篩查。表1顯示藉由其中子分餾物得以溶離的緩衝溶液B之體積-百分率變化範圍、或者乙腈之變化範圍所界定之14份乳清蛋白質子分鶴物。 96088.doc -29- 200524545 表1 藉由疏水相互作用層析法界定之可溶乳清蛋白質之子分德物分餾物 %6緩衝溶液開始 %3緩衝溶液結束 %乙猜開始 %乙腈結束 1 20 26 16 20.8 2 26 35 20.8 28 3 35 43 28 34.4 4 43 44.5 34.4 35.6 5 44.5 47 35.6 37.6 6 47 48.5 37.6 38.8 7 48.5 50 38.8 40 8 50 51.5 40 41.2 9 51.5 52.5 41.2 42 10 52.5 54 42 43.2 11 54 58 43.2 46.4 12 58 60 46.4 48 13 60 70 48 56 14 70 100 56 80

緩衝溶液A :水TFA 0· 1 % ;緩衝溶液B :乙腈/水/TFA (80%/19.15%/0.85% ； v/v) 管柱：Source 15 RPC Amersham (基質：聚苯乙稀/ 二乙烯基苯），管柱體積（CV=100ml) 梯度：自20%B緩衝溶液開始，達到1管柱體積（CV) 之後，將樣本注入管柱，然後梯度在15 CV 時增加到75%B且在2 CV時，得到100%B緩衝溶液實例3 COX-2篩查 2.1物質及方法將HUV-EC-C細胞（產生自正常人臍帶靜脈之永久内皮細 96088.doc -30· 200524545 胞株；ATCC CRL1730 ; M. Miralpeix，M.Camacho等人，

Brit. J. Pharmacol. 12 1 (1997)，1 71 -1 80)播種在 96 孔板

(RPMI 1640 + 10。/。FCS)上且在 37〇C 下用 100 n]V[ (nmol/iW 波醇12-肉豆蔻酸酯13_乙酸酯將其處理6個小時以誘發 COX-2同工酶。然後加入5〇 (/m〇1/1)花生四烯酸，且在 37 C下將該等細胞於測試化合物或混合物存在下培育％。藉由放射免疫檢定（RIA)量測前列腺素-E2之產生且放射性係由使用液體閃螺雞尾酒（packar(j)之閃爍計數器 (Topcount，Packard)測定。所得之結果表現為對照值之百分比，而作為在測試化合物存在下所獲得之對照值百分比抑制。該等對照值對應於在無測試化合物之存在下於P°C下在6小時期間以酸酯乙酸肉豆蔻佛波醇（PMA)刺激（亦可以α型腫瘤壞死因子： TNFa進行）之後JJUV-EC-C細胞之COX-2活性。藉由對其抑制曲線之非線性回歸分析對於參考化合物 (環己醯亞胺）測定引起對照值之半最大抑制之濃度（IC50 值）及希爾係數（nH)。該等參數係藉由希爾方程曲線擬合來獲仔。對於參考化合物所獲得之IC5〇值在獲得之歷史平均值士0.5個對數單位之允許界限之内。。下文中，低於10%之所有COX-2篩查實驗只進行一次抑制值不予考慮且已指示為” 〇，，。 2·2人乳分餾物之COX·2筛查脫脂人乳顯示顯荽夕p n v 化

，者之COX-2抑制（25% ;表2)。當藉由酸或凝乳酶移除酪蛋白贫曰I刀別產生酸乳清及甜乳清）時，達 96088.doc 31 200524545 成51%及58% COX-2抑制值。因此，移除酪蛋白極大改進了 COX-2抑制。另外，單獨之酪蛋白（酸酪蛋白、甜酪蛋白、膠束酪蛋白）對COX-2不顯示任何抑制效應。來自人乳之可溶乳清僅僅如起始產品（亦即，脫脂人乳）一樣進行抑制。表2 用人乳分餾物進行COX-2篩查之結果。TS，總固體量脫脂人乳編碼 TS (mg/ml) 稀釋以達成 50 jLtg/ml 估計之以（％)表示蛋白質之COX-2 (mg/ml)抑制脫脂人乳 H2 100 5.00E.-04 10 25 酸乳清人乳 H3 80 6.25E-04 6 51 甜乳清人乳 H4 80 6.25E-04 6 58 可溶乳清人乳 H5 80 6.25E-04 6 26 酸酪蛋白人乳 H6 10 5.00E-03 10 0 甜酪蛋白人乳 H7 10 5.00E-03 10 0 膠束酪蛋白人乳 H8 5 1.00E-02 5 0 2.3水牛乳之COX-2篩查脫脂水牛乳顯示中度抑制效應（36% ;表3)。與人乳相反，酪蛋白之酸移除導致其損失三分之二之活性（降至 12%)，此可能係歸因於酸化後酸誘發之活性損失。若pH 值保持不變（亦即在凝乳酶處理及超速離心之情況下），在兩種情況下活性均增加至44%。如同人乳之情況一樣，膠束水牛乳酪蛋白不顯示任何活性。由於酸及甜赂蛋白無溶解性，因此其未予測試。 96088.doc -32- 200524545 表3 以水牛乳進行COX-2篩查之結果。TS，總固體量。水牛乳(BM) 編碼 TS 稀釋以 (mg/ml)達成 50 "g/ml 樣本中估C0X-2 計之蛋白抑制質(mg/ml) (%) 脫脂水牛乳 B2 100 5.00E-04 30 36 酸乳清水牛乳 B3 70 7.14E-04 6 12 甜乳清水牛乳 B4 70 7.14E-04 6 44 可溶乳清水牛乳 B5 70 7.14E-04 6 44 酸酪蛋白水牛乳非可溶甜酪蛋白水牛乳非可溶膠束酪蛋白水牛乳 B8 25 2.00E-03 25 0 2.4牛乳之COX_2篩查原料牛乳及脫脂牛乳之高活性（52-53% ;表4)證明消除乳脂對於COX-2抑制不具有任何效應。在可溶乳清中活性保持不變（53%)，在酸乳清中活性輕微減少（45%)且在甜乳清中活性增加（68%)。不希望受任何理論限制，如在水牛乳中之情況一樣，酸乳清中活性之減少可能與酸之影響相關，而當進行凝乳酶處理時活性增加可由以下理論來解釋：正如在有時導致高於100%之產量的”分餾失敗’’期間所描述之情況一樣，酪蛋白之不穩定（destabilisation)釋放一些”潛伏”生物活性。 96088.doc 33- 200524545 表4 以牛乳進行COX-2篩查之結果。TS :總固體量。牛乳(αν〇編碼 TS(mg/ml) 稀釋以達樣本中估COX-2 成50 gg/ml計之蛋白抑制(％) 質(mg/ml) 牛乳CM C1 100 5.00E-04 31 53 脫脂牛乳 C2 100 5.00E-04 35 52 酸乳清牛乳 C3 70 7.14E-04 6 45 甜乳清牛乳 C4 70 7.14E-04 6 68 可溶乳清牛乳 C5 70 7·14Ε_04 6 53 酸酪蛋白牛乳 C6 50 1.00Ε-03 50 42 甜酪蛋白牛乳 C7 50 1.00E-03 50 65 膠束酪蛋白牛乳 C8 25 2.00E-03 25 0 2.5乳清蛋白質調劑之COX-2篩査兩種市售之乳清蛋白質調劑亦經受COX-2篩查： • Lacprodan 80 (MD Foods Ingredients，Viby，丹麥），其含有較高量之乳糖基心乳球蛋白形式； • WPI 95，其為一種事實上已耗盡乳糖基/5-乳球蛋白（藉由質譜分析驗證）之天然乳清蛋白質離析物。WPI可購自 Davisco Foods International. Inc. 620 North Main 5 Le Sueur，MN 56058 USA ; BIPRO batch JE 251-0-420。 96088.doc 34- 200524545 表5 以乳清蛋白質調劑進行COX-2篩查之結果。Ts · 乳清蛋白質調齊厂~^ 總固體

JS , 稀釋以樣# 〇〜 (mg/ml)達成估：C〇x^2 5〇Mg/ml蛋白質抑制(％) __(Πΐ07τν»1、 Lacprodan 80 LN 100 5.00E-04 80 天然乳清WPI95 NW 100 5.00E-04 95 半胱胺酸 CY 10 5.00E-03 10 乳清胰蛋白酶水解產物DM 10 DH 100 5.00E-04 80 如自表4可導出，該等化合物亦分別顯示相參大及3 3% COX-2抑制活性。與其相反，藉由騰蛋 /3 3 12 3 之 23〇/〇曰_之蛋白水解破壞乳清蛋白質之COX-2抑制活性。天钬，,κ 劑 …、抗氣化胺基酸’’半胱胺酸亦無關於COX-2抑制之效應。 2·5氧化牛乳之COX-2篩查新鮮牛乳樣本（50 ml)補充以強雙氧水（30% Ή2〇、 2 )以獲得

H2〇2於所得混合物中之〇·1 mM、1 mM、10 mM

100 mM (mmol/1)之最終濃度。所有樣本在3(TC下培育4小時。表6

以氧化牛乳進行COX-2篩查之結果。TS，總固徽昝 "Ϊ白質氧化編碼 TS 稀釋H (mg/ml)達成估計之抑0 5〇Mg/ml 蛋白質 f0 新鮮牛乳 L1 100 5.00E-04 ：新鮮牛乳H202 0.1 L2 100 5.00E-04 3.1 41 新鮮牛乳h2o2 1 L3 100 5.00E-04 3.1 41 新鮮牛乳H2〇2 10 L4 100 5.00E-04 3.1 35 新鮮牛乳氏02 ΤΥΐΛ/ί 100 L5 100 5.00E-04 3.1 27 0 96088.doc -35- 200524545 未處理之牛乳及用（M mM H2〇2處理之乳顯示關於C〇x_ 2抑制之相同”中度”效應（41%)。在^…濃度為l 時，抑

制輕彳政減少（至35%)，當H2〇2濃度進一步增加到1〇 mM 時，COX-2抑制降低至27%，且當h2〇2濃度為1〇() mM時— 然而生理條件遠遠達不到該濃度—不再能觀察至任何抑制活性。

結果指* :牛乳中之活性、亦即COX-2漫f之組份抵抗處於0.1-10 mM水平上之H2〇2。抑制效應之減少與蛋白質，增加相對應，此指示了 _抑制活性係基於蛋白質且與蛋白質之天然狀態密切相關。 2·6可溶乳清蛋白質子分餾物之c〇x_2篩查可溶乳清蛋白質子分餾物之c〇x_2抑制之結果指示於表。正值指示與對照組相比之更好效能。表7 COX Π抑制之結果

96088.doc -36- 200524545 【圖式簡單說明】圖1為顯千4 ^ 式；圖2為顯式； • ”、、/、如貫例1 · 1中所概述之牛乳分餾物之製備的圖不如實例I·2中所概述之人乳分餾物之製備的圖圖3為gg 一〜 W不如貫例1·3中所概述之水牛乳分餾物之製備的圖式，| 圖4_ 示源自人乳（ΗΜ；)、牛乳及水牛乳（ΒΜ)之各種乳蛋白~ 焉分餾物及乳蛋白質調劑之C〇x 比0 2抑制活性之對 96088.doc -37-

Claims

200524545 十、申請專利範圍： 1·二重用於治療及/或預防環氧化酶_2 或醫藥組合物，其包含治療有效量之呂養及/ 分德私7 $ / + A夕種？L蛋白質一或多種乳蛋白質調劑，其中該一 =蛋白質分顧物及/或該—或該等多種乳蛋白質 t、壤氧化酶-2抑制活性。 2·如請求们之營養及/或醫藥組合物，其中該一或該 =白貝刀顧物及/或该一或該等多種乳蛋白質調劑係 ^自由下列各物組成之群：人乳、牛乳、水牛乳之乳清分館物、脫脂乳分顧物、乳糖化乳清蛋白質調劑、天= 乳清蛋白質離析物調劑、牛乳之酸路蛋白分館物及/或：酪蛋白分館物、及/或其組合、或表7中子分館物 17。 3.如明求項2之營養及/或醫藥組合物，其中該等乳清分餾物係選自由下列各物組成之群：酸乳清、甜乳清及可溶乳清。月长項1、2及3中任一項之營養及/或醫藥組合物，其中該一或該等多種乳蛋白質分餾物及/或該一或該等多種礼蛋白質調劑之生物利用度及/或生物降解穩定度係藉由保護其中所含有之一或多種组份中之一或多種官能基來增加。 5.如請求項1、2、3及4中任一項之營養組合物，其包含一遥自乳、酸乳酪、凝乳、乾酪、發酵乳、乳基發酵產 υσ 冰》其淋、穀類基產品、乳基粉、婴兒配方乳品或寵 96088.doc 200524545 物食品之食品物質。 6. 7. 如請求項卜2、3、4及5中任— 物’其係以經口、經局部、腸呂^及/或醫藥組合在。 ‘腸、或經直腸劑型而存 -種將呈現環氧化酶_2抑制館物及/或-或多種乳蛋白質二—或夕種乳蛋白質分預防環氧化酶於製備供治療及/或 . 減㈤碰疾病之營養及/或醫藥組 8·如請求項7之用途，其卿抑制活性之該等礼蛋白貝为餾物及/或該等乳蛋貝调劑係選自由下列各物組成之群：人乳、牛乳、水孔之礼4分餾物、脫脂礼刀顧物、乳糖化乳清蛋白質玄曰貝凋劑、天然乳清蛋白質離析物調劑、牛乳之酸酪蛋白分为口刀獨物及/或甜酪蛋白分餾物、及/或其組合。 9.如睛求項7之用s，其中該營養及/或醫藥組合物係以經口、經局部、非經腸、或經直腸劑型提供。 10·如請求項7至9任一項之用途，其中該等環氧化酶销控疾病係選自由下列各種疾病組成之群··癌症及/或癌症前期病狀、具體而言結腸、胃、食道、肝、膽道、胰腺、頭及頸、肺、乳房、膀胱、女性生殖器官及皮膚之癌症及/或癌症前期病狀、及/或炎性疾病、具體而言關節炎、風濕熱、與流感或其它病毒性感染相關聯之症狀、痛經、頭痛、牙痛、退化性關節疾病、及/或阿茲海默症 (Alzheimer’s disease) 〇 96088.doc 200524545 11·如請求項7至9中任一項之用途，其中該醫藥及/或營養組合物在癌症治療及/或癌症前期病狀之治療期間、具體而言在化學治療、放射治療、生物製劑治療期間、及/或在疼痛治療期間、及/或在炎性疾病之治療期間及/或在阿兹海默症之治療期間提供一共同治療物。 12.如請求項7至1()中任—項之用途，其中該營養組合物包含一選自乳、酸乳酿、凝乳、乾赂、發酵乳、乳基發酵產印冰淇淋、殺類基產品、乳基粉、嬰兒配方乳品之食品物質。 -種增加產品之環氧化酶·2抑制………… 含在該產品中增加提供環氧化酶_2抑制活性之—或多種乳蛋白質分館物及/或—或多種乳蛋白質調劑之量。 14.如請求項13之方法’其中該-或該等多種乳蛋白質分館物及/或該一或該等多種乳蛋白質組成之群··人乳、丰、 > 礼、水牛乳之乳清分餾物、脫脂乳为館物、乳糖化乳清蛋蛋白^调劑、天然乳清蛋白質離析物π周劑、牛乳之酸絡| 八蛋白刀餾物及/或甜酪蛋白分餾物、及/或其組合。 15. 如明求項13或14中任一 ..方法，其中該產品係一營養組合物及/或醫藥組合物呂奮物及/或機能性食品組合物。 16. —種離析可提供環氧化 mm 2抑制活性之乳蛋白質分餾物之方法该方法包含下列步騍：在30分鐘期間以13 脂乳之層； g離心乳，而獲得乳脂層及脫 96088.doc 200524545 分離該乳脂層且離析該脫脂乳；以可獲得2 mmol/l Ca2+之最終濃度的量將CaCl2水溶液加入該脫脂乳中；加熱該混合物至35CC且將具有50 mg活性凝乳酶/公升之活性之凝乳酶加入該混合物；在30分鐘期間以13.600 g離心該混合物以獲得相分離；且離析甜乳清蛋白質相；或加熱該混合物至25〇C ,且用HCi(32%)水溶液酸化該混合物至pH值為4.6，以獲得酸乳清蛋白質相。 17· -種離析可提供冑氧化酶_2㈣活性之乳蛋白質分顧物之方法，該方法包含下列步驟：在30分鐘期間以13.600 乳之層； g離心乳以獲得乳脂層及脫脂分離該乳脂層；離析該脫脂乳；以可獲得具2 mmol/l Ca2+濃声夕、、日人此 ^ ^ 辰度之此合物的量將以012水溶液加入該脫脂乳；备在1小時期間以⑽㈣_心而自該非可相中分離可溶乳清蛋白質相；且 > 束赂蛋白離析可溶乳清蛋白質相。 18· -種提供環氧化酶_2抑制活性之係可根據如請求項16或17之方法來獲二物，該乳分館物 96088.doc