JP2020534269A - Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、およびｃ型レクチン様分子−１（ｃｌｌ−１）に結合するタンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、腫瘍関連抗原ＣＬＥＣ１２Ａに、ならびにナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。本発明の一態様は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメイン、その一部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを組み込んだタンパク質を提供する。抗原結合部位は各々、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインを組み込んでいてもよいか、または抗原結合部位の１つもしくは複数は、ＶＨＨ抗体もしくはＶＮＡＲ抗体などの単一ドメイン抗体であってもよい。本発明の別の態様は、患者のがんを処置する方法を提供する。本方法は、それを必要とする患者に、多重特異性結合タンパク質を治療有効量で投与することを含む。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年９月１４日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５５８，５１０号に基づく利益および優先権を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含み、その全体は、参照により本明細書に組み込まれている。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０１８年９月１１日に作成され、ＤＦＹ−０４１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、８９，９９３バイトのサイズである。

発明の分野
本発明は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、および腫瘍関連抗原、Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１）に結合する多重特異性結合タンパク質に関する。

背景
がんは、この疾患を処置するための文献に報告されている十分な研究努力および科学進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。最も頻繁に診断されるがんの中には、前立腺がん、乳がん、肺がんおよび結腸直腸がんが含まれる。前立腺がんは、男性におけるがんの最も一般的な形態である。乳がんは依然として女性における主要な死因である。血液および骨髄のがんはまた、頻繁に診断されるがんのタイプであり、多発性骨髄腫、白血病、およびリンパ腫が挙げられる。これらのがんに対する現在の処置選択肢は、すべての患者に効果的というわけではなく、および／または実質的な有害副作用を有する可能性がある。他のタイプのがんもまた、既存の治療選択肢を使用して処置することは依然として難題である。

がん免疫療法は、それらが非常に特異的であり、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進することができるので望ましい。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの融合タンパク質は、腫瘍細胞の破壊を促進するために腫瘍細胞およびＴ細胞に結合する、文献に記載されているがん免疫療法である。ある特定の腫瘍関連抗原およびある特定の免疫細胞に結合する抗体は文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１およびＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系の構成要素であり、循環リンパ球の約１５％を構成する。ＮＫ細胞は実質的にすべての組織に浸潤し、最初は、事前感作を必要とせずに腫瘍細胞を効果的に殺傷するそれらの能力によって特徴付けられた。活性化されたＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と同様の手段によって、すなわち、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒を介して、ならびに死受容体経路を介して、標的細胞を殺傷する。活性化されたＮＫ細胞はまた、標的組織への他の白血球の動員を促進するＩＦＮ−ガンマおよびケモカインなどの炎症性サイトカインを分泌する。

ＮＫ細胞は、それらの表面における様々な活性化受容体および阻害受容体を介してシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇すると、それらの活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化によって阻害される。あるいはＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇すると、それらは、それらの活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、それらの表面におけるＣＤ１６受容体を介していくつかの免疫グロブリンの定常領域によって活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的な感受性は、刺激シグナルおよび阻害シグナルの合計に依存する。
Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ遺伝子は、Ｃ型レクチン／Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬ／ＣＴＬＤ）スーパーファミリーのメンバーをコードする。このファミリーのメンバーは、共通するタンパク質折りたたみを共に有し、多様な機能（例えば、細胞接着、細胞間シグナル伝達、糖タンパク質ターンオーバー、ならびに炎症および免疫応答における役割）を有する。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、顆粒球および単球機能の負の調節因子である。ＭＩＣＬまたはＣＬＥＣ１２Ａとしても公知のヒトＣ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１）は、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、免疫調節に関与するＣ型レクチン様レセプターの大きなファミリーのメンバーである。ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａは、急性骨髄性白血病患者のうちの９０％超において、白血病幹細胞上で過剰発現されるが、正常な造血細胞上では過剰発現されない。本発明は、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａに結合する多重特異性結合タンパク質、およびがんの処置における上記タンパク質の使用を提供する。

国際公開第２０１６／１３４３７１号 国際公開第２０１５／０９５４１２号

要旨
本発明は、腫瘍関連抗原ＣＬＥＣ１２Ａに、ならびにナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２ＤレセプターおよびＣＤ１６レセプターに結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。かかるタンパク質は、２種類以上のＮＫ活性化受容体と会合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断し得る。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ヒトにおいてＮＫ細胞を刺激し得、げっ歯動物およびカニクイザルなどの他の種においてＮＫ細胞を刺激し得る。本発明の様々な態様および実施形態を以下にさらに詳細に記載する。

したがって、本発明の一態様は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメイン、その一部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを組み込んだタンパク質を提供する。抗原結合部位は各々、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメイン（例えば、抗体のように配列されるか、またはｓｃＦｖを形成するために一緒に融合される）を組み込んでいてもよいか、または抗原結合部位の１つもしくは複数は、ラクダ科抗体などのＶ_ＨＨ抗体もしくは軟骨魚類に見出されるものなどのＶ_ＮＡＲ抗体などの単一ドメイン抗体であってもよい。

ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、一部の実施形態では、例えば配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有すること、ならびに／または、配列番号１のＣＤＲ１配列（配列番号１０５）、ＣＤＲ２配列（配列番号１０６）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１０７）と同一のアミノ酸配列を組み込むことにより、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。配列番号１に関する重鎖可変ドメインは、種々の軽鎖可変ドメインと結びついてＮＫＧ２Ｄ結合部位を形成することができる。例えば、配列番号１に関する重鎖可変ドメインを組み込む第１の抗原結合部位はさらに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、および４０に関する配列のうちのいずれか１つから選択される軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１の抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一なアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、および４０から選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一なアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込む。

代替的に、第１の抗原結合部位は、配列番号４１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号４２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または列番号４１のＣＤＲ１配列（配列番号４３）、ＣＤＲ２配列（配列番号４４）、およびＣＤＲ３配列（配列番号４５）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号４２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号４２のＣＤＲ１配列（配列番号４６）、ＣＤＲ２配列（配列番号４７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号４８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

他の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号４９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号５０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号４９のＣＤＲ１配列（配列番号５１）、ＣＤＲ２配列（配列番号５２）、およびＣＤＲ３配列（配列番号５３）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号５０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号５０のＣＤＲ１配列（配列番号５４）、ＣＤＲ２配列（配列番号５５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号５６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

代替的に、第１の抗原結合部位は、例えば、それぞれ、配列番号５７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である、および配列番号５８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有することによって、配列番号５７に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号５８に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。

別の実施形態において、第１の抗原結合部位は、配列番号５９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号６０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号５９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号５９のＣＤＲ１配列（配列番号１０９）、ＣＤＲ２配列（配列番号１１０）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１１１）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号６０のＣＤＲ１配列（配列番号１１２）、ＣＤＲ２配列（配列番号１１３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１１４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、一部の実施形態では、配列番号６１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号６２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号６１のＣＤＲ１配列（配列番号６３）、ＣＤＲ２配列（配列番号６４）、およびＣＤＲ３配列（配列番号６５）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号６２のＣＤＲ１配列（配列番号６６）、ＣＤＲ２配列（配列番号６７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号６８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号６９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号７０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号６９のＣＤＲ１配列（配列番号７１）、ＣＤＲ２配列（配列番号７２）、およびＣＤＲ３配列（配列番号７３）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号７０のＣＤＲ１配列（配列番号７４）、ＣＤＲ２配列（配列番号７５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号７６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号７７に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号７８に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号７７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号７７のＣＤＲ１配列（配列番号７９）、ＣＤＲ２配列（配列番号８０）、およびＣＤＲ３配列（配列番号８１）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号７８のＣＤＲ１配列（配列番号８２）、ＣＤＲ２配列（配列番号８３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号８４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号８５に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号８５のＣＤＲ１配列（配列番号８７）、ＣＤＲ２配列（配列番号８８）、およびＣＤＲ３配列（配列番号８９）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号８６のＣＤＲ１配列（配列番号９０）、ＣＤＲ２配列（配列番号９１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号９２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号９３に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号９４に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号９３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号９３のＣＤＲ１配列（配列番号９５）、ＣＤＲ２配列（配列番号９６）、およびＣＤＲ３配列（配列番号９７）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号９４のＣＤＲ１配列（配列番号９８）、ＣＤＲ２配列（配列番号９９）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１００）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、例えば、それぞれ、配列番号１０１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である、および配列番号１０２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有することによって、配列番号１０１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１０２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。

一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、例えば、それぞれ、配列番号１０３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である、および配列番号１０４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を有することによって、配列番号１０３に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１０４に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａに結合し、配列番号１１５に関する重鎖可変ドメインと、配列番号１１９に関する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１１５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１１５のＣＤＲ１配列（配列番号１１６）、ＣＤＲ２配列（配列番号１１７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１１８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１１９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１１９のＣＤＲ１配列（配列番号１２０）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１２２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。

一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、第１の抗原結合部位に存在する軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。

一部の実施形態では、本タンパク質は、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメインの一部分を組み込んでおり、ここで抗体Ｆｃドメインは、ヒンジおよびＣＨ２ドメイン、および／またはヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸配列２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。

これらのタンパク質のうちの１つを含有する製剤、これらのタンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含有する細胞、およびこれらのタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法も提供される。

本発明の別の態様は、患者のがんを処置する方法を提供する。本方法は、それを必要とする患者に、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を治療有効量で投与することを含む。多重特異性結合タンパク質を使用して処置するための例示的ながんとしては、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および古典的ホジキンリンパ腫が挙げられる。

ある特定の実施形態では、処置するがんは、急性未分化型骨髄芽球性白血病、急性最小分化型骨髄芽球性白血病（acute myeloblastic leukemia with minimal maturation）、急性分化型骨髄芽球性白血病（acute myeloblastic leukemia with maturation）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性骨髄単球性白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病（ＡＭＫＬ）、急性好塩基球性白血病、線維症を伴う急性汎骨髄症、および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）から選択されるＡＭＬである。

本発明のある特定の実施形態では、がんは、多血球系異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ−ＭＬＤ）、単一血球系異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ−ＳＬＤ）、環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ−ＲＳ）、芽球増加を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ−ＥＢ）、単独ｄｅｌ（５ｑ）を伴うＭＤＳ、および分類不能型ＭＤＳ（ＭＤＳ−Ｕ）から選択されるＭＤＳである。

本発明のある特定の実施形態では、処置するＡＬＬは、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）から選択される。本発明の実施形態では、処置するＭＰＮは、真性赤血球増加症（polycythaemia vera）、本態性血小板血症（ＥＴ）、および骨髄線維症から選択される。本発明のある特定の実施形態では、処置する非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫から選択される。本発明のある特定の実施形態では、処置するリンパ腫は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＰＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、形質細胞骨髄腫（ＰＣＭ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）、成熟Ｔ／ＮＫ細胞腫瘍、および組織球腫瘍から選択される。

図１は、ヘテロ二量体の多重特異性抗体（三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ））の図である。各アームは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたは腫瘍関連抗原結合ドメインのいずれかを表し得る。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび腫瘍関連抗原結合ドメインは、共通の軽鎖を共に有し得る。

図２は、ヘテロ二量体の多重特異性抗体の図である。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたは腫瘍関連抗原結合ドメインのいずれかは、ｓｃＦｖフォーマット（右アーム）をとることができる。

図３は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒト組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。

図４は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるカニクイザル組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。

図５は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるマウス組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。

図６は、フローサイトメトリーによる、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示す棒グラフであり、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍率（ＦＯＢ）を示している。

図７は、フローサイトメトリーによる、マウスＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示す棒グラフであり、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍率（ＦＯＢ）を示している。

図８は、天然リガンドＵＬＢＰ−６と競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。

図９は、天然リガンドＭＩＣＡと競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。

図１０は、天然リガンドＲａｅ−１デルタと競合することによる、組換えマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。

図１１は、ヒトＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージを定量することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。

図１２は、マウスＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージを定量することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。

図１３は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。

図１４は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。

図１５は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。

図１６は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。

図１７は、腫瘍細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の細胞傷害作用を示す棒グラフである。

図１８は、示差走査型蛍光定量法によって測定された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の融解温度を示す棒グラフである。

図１９Ａ〜１９Ｃは、ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄ結合を使用したＮＫ細胞の相乗的活性化の棒グラフである。図１９ＡはＣＤ１０７ａのレベルを示し、図１９ＢはＩＦＮγのレベルを示し、図１９ＣはＣＤ１０７ａおよびＩＦＮγのレベルを示す。グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。データは、５名の異なる健康なドナーを使用した、５つの独立した実験を代表するものである。

図２０は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体であるＴｒｉｏｍａｂ形態における三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の図である。このキメラは、２つの親抗体に由来する２つの半抗体からなり、各半抗体が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。Ｔｒｉｏｍａｂ形態は、ラット抗体の１／２およびマウス抗体の１／２を含有するヘテロ二量体構築物であり得る。

図２１は、ノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ：ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）技術を含むＫｉＨ共通軽鎖形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＫｉＨは、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。ＫｉＨフォーマットにおけるＴｒｉＮＫＥＴは、２つの異なる重鎖と、両方の重鎖と対合する共通の軽鎖とを含有する、標的１および標的２に結合する２つのＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物であり得る。

図２２は、自然起源の可動性リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）とは、抗原２を標的とする可変ドメインが、抗原１を標的とするＦａｂ断片の可変ドメインのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）形態は通常のＦｃを含有する。

図２３は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つのＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、直交性Ｆａｂ界面（オルト−Ｆａｂ）形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。軽鎖（ＬＣ）−重鎖（ＨＣ）の対合は、直交界面によって確実になっている。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける変異によって確実になっている。

図２４は、２ｉｎ１ ＩｇフォーマットにおけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。

図２５は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電的ステアリング変異によって確実になっている。

図２６は、Ｆａｂ断片アーム交換形態におけるＴｒｉＮＫＥＴ、すなわち、重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子の重鎖−軽鎖対とスワップすることによりＦａｂアームを交換した結果、二重特異性抗体となった抗体の図である。Ｆａｂアーム交換形態（ｃＦＡＥ）は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。

図２７は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である、ＳＥＥＤ Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。

図２８は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーを使用する、ＬｕＺ−Ｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＬｕＺ−Ｙ形態は、Ｆｃに融合した標的１および２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端に融合したロイシンジッパーモチーフによって確実になっている。

図２９は、Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。

図３０Ａおよび３０Ｂは、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、κλ−Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。抗原１を標的とする一方のＦａｂ断片はカッパＬＣを含有し、抗原２を標的とする第２のＦａｂ断片はラムダＬＣを含有する。図３０Ａは、κλ−Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のκλ−Ｂｏｄｙの例示的な図である。

図３１は、標的１に結合するＦａｂ断片と、標的２に結合するｓｃＦａｂとを含み、その両方がＦｃドメインに融合したＯａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメインにおける変異によって確実になっている。

図３２は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂである。Ｆａｂ断片１および２は、軽鎖および重鎖の正確な対合を確実にする特異な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）Ｓ−Ｓ架橋を含有する。

図３３は、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂである。ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインと、ＶＨドメインおよびＶＬドメインとが切り換わっており、例えば、ＣＨ１は、ＶＬと一列をなして融合しており、一方、ＣＬは、ＶＨと一列をなして融合している。

図３４は、抗原２に結合するＦａｂ断片が、抗原１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ−Ｉｇである。この構築物は、野生型Ｆｃを含有する。

図３５は、ＣＬＥＣ１２Ａを発現するヒトＡＭＬ細胞株ＳＫＭ−１への、ＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＬＥＣ１２Ａ）および抗ＣＬＥＣ１２Ａモノクローナル抗体の結合を示す線グラフである。

図３６は、ＣＬＥＣ１２Ａを発現するヒトＡＭＬ細胞株Ｕ９３７への、ＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＬＥＣ１２Ａ）および抗ＣＬＥＣ１２Ａモノクローナル抗体の結合を示す線グラフである。

図３７は、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞への、ＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＬＥＣ１２Ａ）および抗ＣＬＥＣ１２Ａモノクローナル抗体の結合を示す線グラフである。

図３８は、ＨＬ６０細胞でのＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＬＥＣ１２Ａ）、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体、および抗ＣＤ３３抗体リンツズマブの内部移行を示す線グラフである。

図３９は、ＳＫＭ−１細胞でのＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＬＥＣ１２Ａ）、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体、および抗ＣＤ３３抗体リンツズマブの内部移行を示す線グラフである。

図４０は、Ｕ９３７細胞でのＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＬＥＣ１２Ａ）、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体、および抗ＣＤ３３抗体リンツズマブの内部移行を示す線グラフである。

図４１は、ＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴが、初代ヒトＮＫ細胞によるＨＬ６０標的細胞殺滅を媒介することを示す線グラフである。対照抗体は、抗ＣＬＥＣ１２Ａモノクローナル抗体および非特異性ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、ＣＬＥＣ１２Ａを標的としないＴｒｉＮＫＥＴ）である。

図４２は、ＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴが初代ヒトＮＫ細胞によるＭｖ４−１１標的細胞殺滅を媒介することを示す線グラフである。対照抗体は、抗ＣＬＥＣ１２Ａモノクローナル抗体および非特異性ＴｒｉＮＫＥＴ （例えば、ＣＬＥＣ１２Ａを標的としないＴｒｉＮＫＥＴ）である。

詳細な説明
本発明は、がん細胞上のＣＬＥＣ１２Ａ、ならびにナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合して、ナチュラルキラー細胞を活性化する多重特異性結合タンパク質、かかる多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにがんの処置などの目的のためのかかる多重特異性タンパク質および医薬組成物を使用する治療方法を提供する。本発明の様々な態様を複数のセクションに分けて以下に記述する。しかしながら、１つの特定のセクションに記載される本発明の態様は、いずれかの特定のセクションに限定されるものではない。

本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および句を以下に定義する。

本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、「１つまたは複数」を意味し、文脈が不適切でない限り、複数を含む。

本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知である、より保存された隣接するストレッチの間に介在している「超可変領域」と称される。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンにおける超可変領域の間におよびそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するように三次元空間において互いに対して配置される。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。ラクダおよび軟骨魚類などのある特定の動物において、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する単一抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、インタクトな抗体中、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片中、またはｓｃＦｖなどの組換えポリペプチド中に存在し、ペプチドリンカーを使用して単一ポリペプチドにおいて重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに連結することができる。

本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」という用語は、がんに関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含むがこれらに限定されない、任意の抗原を意味する。このような抗原は、悪性細胞において、または腫瘍関連血管、細胞外マトリックス、間葉系間質、もしくは免疫浸潤物におけるような腫瘍微小環境中で発現され得る。

本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載の方法および組成物によって処置される生物を指す。かかる生物には、好ましくは、限定されないが、哺乳動物（例えば、ネズミ、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれ、より好ましくはヒトが含まれる。

本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬量で投与されてもよく、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図しない。本明細書中で使用される場合、「処置する」という用語は、何らかの効果、例えば、状態、疾患、障害などの好転をもたらす、減少、低減、モジュレート、改善もしくは除去、またはそれらの症状の改善を含む。

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、組成物を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断的使用または治療的使用に特に適切にする、活性剤と、不活性または活性な担体との組合せを指す。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水または水／油エマルションなど）、および種々の種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定剤および保存剤を含んでもよい。担体、安定剤およびアジュバントの例に関しては、例えば、Ｍａｒｔｉｎ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ［１９７５年］を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象に投与すると、本発明の化合物またはその活性代謝産物もしくは残留物を提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者に公知であるように、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基から誘導され得る。例示的な酸には、限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが含まれる。シュウ酸などの他の酸は、それら自体では薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に利用され得る。

例示的な塩基には、限定されないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニアおよび式ＮＷ_４ ^＋（式中、ＷはＣ_１〜４アルキルである）の化合物などが含まれる。

例示的な塩には、限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが含まれる。塩の他の例には、Ｎａ^＋、ＮＨ_４ ^＋およびＮＷ_４ ^＋（式中、ＷはＣ_１〜４アルキル基である）などの適切なカチオンと配合された本発明の化合物のアニオンが含まれる。

治療的使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されると意図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において使用することができる。

組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されているか、またはプロセスおよび方法が特定のステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている説明全体にわたって、さらに、列挙された成分から本質的になる、またはそれからなる本発明の組成物が存在すること、ならびに列挙されたプロセスステップから本質的になる、またはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが意図される。

一般的事項として、パーセンテージを特定する組成物は、特に明記しない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴わない場合、変数の以前の定義が優先する。

Ｉ．タンパク質
本発明は、ナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに腫瘍関連抗原ＣＬＥＣ１２Ａに結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載の医薬組成物および治療方法において有用である。ナチュラルキラー細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に多重特異性結合タンパク質が結合すると、腫瘍関連抗原ＣＬＥＣ１２Ａを発現する腫瘍細胞の破壊に向けてのナチュラルキラー細胞の活性が増強される。腫瘍関連抗原発現細胞に多重特異性結合タンパク質が結合すると、がん細胞をナチュラルキラー細胞に近接させるため、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的および間接的な破壊が容易になる。一部の例示的な多重特異性結合タンパク質のさらなる記載を、以下に提供する。

多重特異性結合タンパク質の第１の構成要素は、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８^＋αβＴ細胞を含み得るがこれらに限定されない、ＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合する。多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合すると、ＵＬＢＰ６（ＵＬ１６結合タンパク質６）およびＭＩＣＡ（主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ鎖関連Ａ）などの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合することおよびＮＫＧ２Ｄ受容体を活性化することを遮断し得る。

多重特異性結合タンパク質の第２の構成要素は、腫瘍関連抗原ＣＬＥＣ１２Ａに結合する。腫瘍関連抗原発現細胞は、例えば、急性骨髄性白血病およびＴ細胞白血病などの白血病において見出され得る。

多重特異性結合タンパク質の第３の構成要素は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、および濾胞性樹状細胞を含む白血球の表面にあるＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する。

本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、様々なフォーマットをとることができる。例えば、１つのフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、および第２の免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体の多重特異性抗体（図１）である。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第１の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第１のＣＨ１重鎖ドメインとを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の軽鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖定常ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒に、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第２の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第２のＣＨ１重鎖ドメインとを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の軽鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と一緒に、腫瘍関連抗原ＣＬＥＣ１２Ａに結合する抗原結合部位を形成する。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒にＣＤ１６に結合することができる（図１）。一部の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン軽鎖と同一である。

別の例示的フォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体の多重特異性抗体（図２）に関する。第１の免疫グロブリン重鎖は、対合し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、または腫瘍関連抗原ＣＬＥＣ１２Ａに結合する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して融合している、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第２の重鎖可変ドメインと、必要に応じてＣＨ１重鎖ドメインとを含む。この免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対合し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、またはＣＬＥＣ１２Ａに結合する。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒にＣＤ１６に結合することができる（図２）。

１つまたは複数のさらなる結合モチーフが、必要に応じてリンカー配列を介して、定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合され得る。ある特定の実施形態では、抗原結合モチーフは、四価もしくは三価の分子を形成する、一本鎖もしくはジスルフィド安定化可変領域（ｓｃＦｖ）である。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体である、Ｔｒｉｏｍａｂ形態である。このキメラは、２つの親抗体に由来する２つの半抗体からなり、各半抗体が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ）技術を用いるＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態である。ＫＩＨは、ヘテロ二量体化を促進するために、Ｃ_Ｈ３ドメインを工学操作して各重鎖に「ノブ」または「ホール」のいずれかを作出することを伴う。「ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）」Ｆｃ技術の背後にある概念は、小さな残基を嵩高の残基で置換することにより、１つのＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）に「ノブ」（例えば、ＥＵ付番でＴ３６６Ｗ_ＣＨ３Ａ）を導入することであった。この「ノブ」に適応するように、他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）において、ノブに最も近い隣接残基をより小さな残基に置き換えること（例えば、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ_ＣＨ３Ｂ）により、相補的な「ホール」表面が作出された。「ホール」変異は、構造情報に基づくファージライブラリスクリーニング（Ａｔｗｅｌｌ Ｓ、Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ、Ｗｅｌｌｓ ＪＡ、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．、Ｓｔａｂｌｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｏｆ ａ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９７年）２７０巻（１号）：２６〜３５頁）によって最適化された。ＫｉＨ Ｆｃ変異体のＸ線結晶構造（Ｅｌｌｉｏｔｔ ＪＭ、Ｕｌｔｓｃｈ Ｍ、Ｌｅｅ Ｊ、Ｔｏｎｇ Ｒ、Ｔａｋｅｄａ Ｋ、Ｓｐｉｅｓｓ Ｃら、Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ＣＨ２−ＣＨ３ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１４年）４２６巻（９号）：１９４７〜５７頁、Ｍｉｍｏｔｏ Ｆ、Ｋａｄｏｎｏ Ｓ、Ｋａｔａｄａ Ｈ、Ｉｇａｗａ Ｔ、Ｋａｍｉｋａｗａ Ｔ、Ｈａｔｔｏｒｉ Ｋ． Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ＦｃγＲｓ． Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１４年）５８巻（１号）：１３２〜８頁）は、ＣＨ３ドメイン間のコア界面では、立体的相補性によって推進される疎水性相互作用がヘテロ二量体化に熱力学的に有利に働くが、ノブ−ノブおよびホール−ホールの界面は、それぞれ立体障害および好ましい相互作用の妨害が原因でホモ二量体化に有利に働かないことを示した。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、自然起源の可動性リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態におけるものである。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、直交性Ｆａｂ界面（オルト−Ｆａｂ）形態におけるものである。オルト−Ｆａｂ ＩｇＧアプローチ（Ｌｅｗｉｓ ＳＭ、Ｗｕ Ｘ、Ｐｕｓｔｉｌｎｉｋ Ａ、Ｓｅｒｅｎｏ Ａ、Ｈｕａｎｇ Ｆ、Ｒｉｃｋ ＨＬら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｆａｂ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４年）３２巻（２号）：１９１〜８頁）では、構造に基づく領域デザインにより、一方のＦａｂ断片のみにおいてＬＣおよびＨＣ_{ＶＨ−ＣＨ１}の界面に相補的変異が導入され、他方のＦａｂ断片にはいかなる変更もなされない。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２ｉｎ１ Ｉｇフォーマットにおけるものである。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態におけるものである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電的ステアリング変異によって確実になっている。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、κλ−Ｂｏｄｙ形態におけるものである。抗原１を標的とするＦａｂ断片１はカッパＬＣを含有し、一方、抗原２を標的とする第２のＦａｂ断片はラムダＬＣを含有する。図３０Ａは、κλ−Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のκλ−Ｂｏｄｙの例示的な図である。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆａｂアーム交換形態（重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子の重鎖−軽鎖対とスワップすることによりＦａｂアームを交換した結果、二重特異性抗体となった抗体）である。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＳＥＥＤ Ｂｏｄｙ形態におけるものである。ＳＥＥＤ（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ）プラットフォームは、天然抗体の治療用途を広げる可能性がある非対称かつ二重特異性抗体様の分子を生成するためにデザインされた。このタンパク質工学操作プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメインにおける免疫グロブリンの構造的に関連した配列の交換に基づく。ＳＥＥＤデザインは、ＡＧおよびＧＡ ＳＥＥＤ ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避しつつ、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効果的な生成を可能にする（Ｍｕｄａ Ｍ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ．（２０１１年、２４巻（５号）：４４７〜５４頁））。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーを使用する、ＬｕＺ−Ｙ形態におけるものである（Ｗｒａｎｉｋ， ＢＪ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（２０１２年）、２８７巻：４３３３１〜９頁）。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ形態におけるものである。二重特異性ＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙでは、分枝状のアゼチジノンリンカーを使用して２つの異なるペプチドをひとつに結合させ、温和な条件下にてスキャフォールド抗体に部位特異的様式で融合させる。機能的活性に関与するのはファルマコフォアだが、抗体スキャフォールドは長い半減期およびＩｇ様の分布をもたらす。最適化された、または独特の二重特異性抗体を生成するために、ファルマコフォアは化学的に最適化するか、または他のファルマコフォアに置き換えることができる（Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ ＶＲら、ＰＮＡＳ（２０１０年）、１０７巻（５２号）；２２６１１〜２２６１６頁）。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合した、標的１に結合するＦａｂ断片と、標的２に結合するｓｃＦａｂとを含む、Ｏａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体形態におけるものである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける変異によって確実になっている。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂ形態におけるものである。Ｆａｂ断片１および２は、ＬＣおよびＨＣの正確な対合を確実にする特異なＳ−Ｓ架橋を含有する。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態におけるものである。ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインと、ＶＨドメインおよびＶＬドメインとが切り換わっており、例えば、ＣＨ１は、ＶＬと一列をなして融合しており、ＣＬは、ＶＨと一列をなして融合している。

一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原２に結合するＦａｂ断片が、抗原１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ−Ｉｇ形態におけるものである。この構築物は、野生型Ｆｃを含有する。

表１は、組み合わせてＮＫＧ２Ｄと結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を記載している。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに対するそれらの結合親和性において変動し得、にも拘わらず、それらは全て、ヒトＮＫＧ２ＤおよびＮＫ細胞を活性化する。

代替的に、ＵＳ９，２７３，１３６において説明されているように、配列番号１０１によって表される重鎖可変ドメインを、配列番号１０２によって表される軽鎖可変ドメインと対合させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成してもよい。
配列番号101
配列番号102

代替的に、ＵＳ７，８７９，９８５において説明されているように、配列番号１０３によって表される重鎖可変ドメインを、配列番号１０４によって表される軽鎖可変ドメインと対合させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成してもよい。
配列番号103
配列番号104

表２は、組み合わせて、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａに結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を記載する。

腫瘍関連抗原ＣＬＬ１に結合できる抗原結合部位は、配列番号１２３によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。

Ｆｃドメイン内で、ＣＤ１６結合はヒンジ領域およびＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内で、ＣＤ１６との相互作用は主に、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７〜Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７〜Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９、およびＣＨ２ドメインにおける炭水化物残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに焦点が当てられている（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻（６７９３号）：２６７〜２７３頁を参照されたい）。既知のドメインに基づいて、変異は、ファージディスプレイライブラリもしくは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリを使用することなどによって、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強もしくは低減させるように選択され得るか、または相互作用の既知の三次元構造に基づいてデザインされ得る。

ヘテロ二量体抗体重鎖の構築は、同じ細胞内で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることによって達成することができ、これにより、各抗体重鎖のホモ二量体の構築およびヘテロ二量体の構築をもたらすことができる。ヘテロ二量体の選択的構築の促進は、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０および、ＵＳ１４／８３０３３６に示されているように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン内に異なる変異を組み込むことによって達成することができる。例えば、変異は、ヒトＩｇＧ１に基づき、これらの２つの鎖が互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にする第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド内にアミノ酸置換の異なる対を組み込んでいるＣＨ３ドメイン内で作製され得る。以下に例示したアミノ酸置換の位置は、Ｋａｂａｔにおけるように、すべてＥＵインデックスに従って番号付けしている。

１つの状況では、第１のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択される、より大きなアミノ酸で置換し、第２のポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、より大きなアミノ酸置換（突出）が、より小さなアミノ酸置換（空洞）の表面に適合するように、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）から選択される、より小さなアミノ酸で置換する。例えば、一方のポリペプチドはＴ３６６Ｗ置換を組み込むことができ、他方のポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込むことができる。

本発明の抗体重鎖可変ドメインは、必要に応じて、ＣＨ１ドメインを有するまたは有さないヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域などの、抗体定常領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と連結され得る。一部の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域などの、ヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。一部の他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマなどの別の哺乳動物由来の抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。１つまたは複数の変異が、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１および／またはＫ４３９において定常領域に組み込まれ得る。例示的な置換には、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅが含まれる。

ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込まれ得る変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、および／またはＶ１７３であり得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込まれ得る変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、および／またはＴ１６４であり得る。

代替的に、アミノ酸置換は以下の表３にされる置換のセットから選択され得る。

代替的に、アミノ酸置換は、以下の表４に示される置換のセットから選択され得る。

代替的に、アミノ酸置換は以下の表５に示される置換のセットから選択され得る。

代替的に、各ポリペプチド鎖における少なくとも１つのアミノ酸置換は、表６から選択され得る。

代替的に、以下の表７における置換のセットから少なくとも１つのアミノ酸置換を選択してもよく、ここで第１のポリペプチド欄に示される位置（複数可）は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチド欄に示される位置（複数可）は、任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられる。

代替的に、以下の表８におけるセットから少なくとも１つのアミノ酸置換を選択してもよく、ここで第１のポリペプチド欄に示される位置（複数可）は、任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチド欄に示される位置（複数可）は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられる。

代替的に、アミノ酸置換は、以下の表９におけるセットから選択してもよい。

代替的にまたは付加的に、ヘテロ多量体タンパク質の構造安定性は、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃを導入し、反対のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入することによって増加させることができ、これにより、２つのポリペプチドの界面内で人工ジスルフィド架橋が形成する。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６位においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６位においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、およびＴ４１１からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、およびＴ４１１からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０、およびＫ４０９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７およびＫ４０９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群より選択される１またはこれより多くの位置においてＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｏ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｏ３４７Ｒ、Ｄ３９９ＶおよびＦ４０５Ｔ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、ここで抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖ置換だけＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。

上記の多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列を第１の発現ベクターにクローニングすることができ、第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列を第２の発現ベクターにクローニングすることができ、免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列を第３の発現ベクターにクローニングすることができ、第１、第２および第３の発現ベクターを一緒に宿主細胞に安定にトランスフェクトして多量体タンパク質を産生することができる。

多重特異性タンパク質の最も高い収率を達成するために、第１、第２および第３の発現ベクターの異なる比率を調べて宿主細胞へのトランスフェクションのための最適比率を決定することができる。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法、またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当技術分野において公知の方法を使用して、細胞バンク生成のために単一クローンを単離することができる。

クローンは、バイオリアクタスケールアップに適した条件下で培養することができ、多重特異性タンパク質の発現を維持することができる。多重特異性タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、均質化、凍結融解、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、およびミックスモードクロマトグラフィーを含む、当技術分野において公知の方法を使用して単離され、精製され得る。

ＩＩ．多重特異性タンパク質の特徴
本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位と、ＣＤ１６結合部位と、腫瘍関連抗原ＣＬＥＣ１２Ａとを含む。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＮＫ細胞などのＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＤ１６を発現する細胞に、ならびに腫瘍関連抗原ＣＬＥＣ１２Ａを発現する腫瘍細胞に同時に結合する。多重特異性タンパク質がＮＫ細胞に結合すると、腫瘍細胞の破壊に向けてのＮＫ細胞の活性が増強され得る。

一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、腫瘍関連抗原ＣＬＥＣ１２Ａに、対応するモノクローナル抗体（例えば、米国特許出願公開番号２１０４／０１２００９６ Ａ１に記載されるモノクローナル抗体４３３１）））に類似の親和性で結合する。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するモノクローナル抗体と比較して、腫瘍関連抗原ＣＬＥＣ１２Ａを発現する腫瘍細胞を死滅させることにおいてより有効である。

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位および腫瘍関連抗原ＣＬＥＣ１２Ａの結合部位を含む本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する細胞と共培養すると、初代ヒトＮＫ細胞を活性化する。ＮＫ細胞活性化は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ−γサイトカイン産生の増加によって示される。さらに、対応するＣＬＥＣ１２Ａに対するモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する細胞の存在下において、ヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示し得る。

ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位およびＣＬＥＣ１２Ａの結合部位を含む本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する細胞と共培養して、休止ヒトＮＫ細胞およびＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞の活性を増強する。

ある特定の実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに結合する対応するモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する腫瘍細胞を標的とすることにおいて利点を提供する。本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、腫瘍成長を低減し、がん細胞を死滅させることにおいてより有効であり得る。例えば、ＴｒｉＮＫＥＴｓ Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＬＥＣ１２Ａ（クローンＡＤＩ−２７７４９のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよびＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメイン）は、抗ＣＬＥＣ１２Ａモノクローナル抗体と比較して、有効性の増強およびＣＬＥＣ１２Ａ発現標的細胞の最大の溶解を有する。

ＩＩＩ．治療用途
本発明は、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質および／または本明細書に記載の医薬組成物を使用してがんを処置するための方法を提供する。その方法は、治療有効量の本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することによって、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する種々のがんを処置するために使用され得る。

治療方法は、処置するがんに応じて特徴づけられ得る。例えば、ある特定の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胸腺腫、腺様嚢胞癌、消化器がん、腎がん、乳がん、膠芽腫、肺がん、卵巣がん、脳がん、前立腺がん、膵臓がん、または黒色腫である。

ある特定の他の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。ある特定の他の実施形態では、がんは、結腸がん、膀胱がん、子宮頚がん、子宮体がん、食道がん、白血病、肝臓がん、直腸がん、胃がん、精巣がん、または子宮がんである。なお他の実施形態では、がんは、血管化腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、神経芽腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭がん、耳下腺がん、胆道がん、甲状腺がん、末端黒子型黒色腫、日光角化症、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管がん、肛門がん、肛門直腸がん、星細胞系腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆管がん（biliary cancer）、骨がん、骨髄がん、気管支がん、気管支腺癌、カルチノイド、胆管癌（cholangiocarcinoma）、軟骨肉腫（chondosarcoma）、脈絡叢乳頭腫（choriod plexus papilloma）／癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織がん、嚢胞腺腫、消化器系がん、十二指腸がん、内分泌系がん、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞がん、上衣がん、上皮細胞がん、ユーイング肉腫、眼および眼窩のがん、女性性器がん、限局性結節性過形成、胆嚢がん、胃前庭部がん、胃底部がん、ガストリノーマ、神経膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓がん、血管芽腫（hemangiblastoma）、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道がん、肝細胞癌、ホジキン病、回腸がん、インスリノーマ、上皮内新生物（intaepithelial neoplasia）、上皮間扁平上皮新生物（interepithelial squamous cell neoplasia）、肝内胆管がん、浸潤性扁平上皮癌、空腸がん、関節がん、カポジ肉腫、骨盤がん、大細胞癌、大腸がん、平滑筋肉腫、悪性黒子由来黒色腫、リンパ腫、男性生殖器がん、悪性黒色腫瘍、悪性中皮腫、髄芽腫、髄上皮腫、髄膜がん、中皮がん、転移性癌、口腔がん（mouth cancer）、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉がん、鼻道がん（nasal tract cancer）、神経系がん、神経上皮腺癌 結節性黒色腫、非上皮性皮膚がん、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起神経膠がん（oligodendroglial cancer）、口腔がん（oral cavity cancer）、骨肉腫、漿液性乳頭腺癌、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸がん、腎細胞癌、呼吸器系がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔がん、皮膚がん、小細胞癌、小腸がん、平滑筋がん、軟部組織がん、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎がん、扁平上皮癌、横紋筋がん、中皮下がん、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌がん、未分化癌、尿管がん、尿道がん、膀胱がん、泌尿器系がん、子宮頸部がん、子宮体がん、ぶどう膜黒色腫、膣がん、疣状癌、ビポーマ、外陰部がん、高分化癌、またはウィルムス腫瘍である。

ある特定の他の実施形態では、がんは、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。ある特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫である。ある特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、または末梢Ｔ細胞リンパ腫などのＴ細胞リンパ腫である。

処置するがんは、がん細胞の表面で発現される特定の抗原の存在に従って特徴づけられ得る。ある特定の実施形態では、がん細胞は、ＣＬＥＣ１２Ａに加えて、以下のうちの１または複数を発現し得る： ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ＴＲＯＰ２、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、およびＰＤ１。

本発明の実施形態では、処置するがんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および古典的ホジキンリンパ腫から選択される。

本発明の一部の実施形態では、処置するがんは、急性未分化型骨髄芽球性白血病、急性最小分化型骨髄芽球性白血病、急性分化型骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性骨髄単球性白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病（ＡＭＫＬ）、急性好塩基球性白血病、線維症を伴う急性汎骨髄症、および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）から選択されるＡＭＬである。本発明の一部の実施形態では、ＡＭＬは、ＡＭＬの白血病幹細胞（ＬＳＣ）でのＣＬＬ−１の発現によって特徴づけられる。本発明の一部の実施形態では、ＡＭＬ対象におけるＬＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＴＩＭ３、ＣＤ２５、ＣＤ３２、およびＣＤ９６から選択される膜マーカーをさらに発現する。本発明の一部の実施形態では、ＡＭＬは、微小残存病変（ＭＲＤ）として特徴づけられる。本発明の一部の実施形態では、ＡＭＬのＭＲＤは、ＦＬＴ３−ＩＴＤ（（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３）−遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ））、ＮＰＭ１（ヌクレオホスミン１）、ＤＮＭＴ３Ａ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＭＴ３Ａ）、およびＩＤＨ（イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１および２（ＩＤＨ１およびＩＤＨ２））から選択される変異の存在または非存在によって特徴づけられる。

本発明のある特定の実施形態では、がんは、多血球系異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ−ＭＬＤ）、単一血球系異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ−ＳＬＤ）、環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ−ＲＳ）、芽球増加を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ−ＥＢ）、単独ｄｅｌ（５ｑ）を伴うＭＤＳ、および分類不能型ＭＤＳ（ＭＤＳ−Ｕ）から選択されるＭＤＳである。

本発明のある特定の実施形態では、処置するＡＬＬは、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）から選択される。本発明のある特定の実施形態では、処置するＭＰＮは、真性赤血球増加症、本態性血小板血症（ＥＴ）、および骨髄線維症から選択される。本発明のある特定の実施形態では、処置する非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫から選択される。本発明のある特定の実施形態では、処置するリンパ腫は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＰＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、形質細胞骨髄腫（ＰＣＭ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）、成熟Ｔ／ＮＫ細胞腫瘍、および組織球腫瘍から選択される。

ＩＶ．併用療法
本発明の別の態様は併用療法を提供する。本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、がんを処置するためのさらなる治療剤と組み合わせて使用され得る。

がんを処置する際の併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤には、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、チマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−２アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、コロニー刺激因子−１、コロニー刺激因子−２、デニロイキンジフチトクス、インターロイキン−２、黄体形成ホルモン放出因子、ならびにその同種受容体に対して特異な結合（differential binding）、および増加したまたは減少した血清半減期を示し得る上述の薬剤の変形型が含まれる。

がんを処置する際の併用療法の一部として使用され得る薬剤のさらなるクラスは免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７−Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７−Ｈ４、および（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つまたは複数を阻害する薬剤が含まれる。ＣＴＬＡ４阻害剤であるイピリムマブは、黒色腫を処置するために米国食品医薬品局によって承認されている。

がんを処置する際に併用療法の一部として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的を標的とするモノクローナル抗体薬剤（例えば、ハーセプチン）および非細胞傷害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。

抗がん剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫおよびｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤＋２−クロロ−デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１およびＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ−ＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ならびにＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、またはＩＣＯＳのアゴニスト；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦから選択されるサイトカインが含まれる。

本発明のタンパク質はまた、原発病巣の外科的除去の補助として使用され得る。

多重特異性結合タンパク質およびさらなる治療剤の量ならびに投与の相対的タイミングは、所望の併用療法効果を達成するために選択され得る。例えば、このような投与を必要とする患者に併用療法を投与する場合、組み合わせる治療剤、または治療剤を含む１つもしくは複数の医薬組成物は、例えば、連続的に、併せて、一緒に、同時になどの任意の順序で投与され得る。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、さらなる治療剤がその予防効果または治療効果を発揮する時間の間投与されてもよく、またはその逆であってもよい。

Ｖ．医薬組成物
本開示はまた、治療有効量の本明細書に記載のタンパク質を含有する医薬組成物を特徴とする。組成物は、種々の薬物送達系で使用されるように製剤化することができる。適切な製剤を作るために、１種または複数の生理学的に許容される賦形剤または担体を組成物に含めることもできる。本開示で使用される好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．、第１７版、１９８５年に見出される。薬物送達のための方法に関する簡潔な概説については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：１５２７〜１５３３頁、１９９０年）を参照されたい。

医薬組成物は、ＣＬＥＣ１２Ａ結合部位を含有する治療有効量の多重特異性結合タンパク質を含み得る。

本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、または注射器に含有されてもよい。ある特定の実施形態では、バッグはチューブおよび／または針を含むチャネルに接続されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は凍結乾燥製剤または液体製剤であってもよい。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライ（凍結乾燥）されてもよく、約１２〜６０個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライされてもよく、４５ｍｇのフリーズドライされた製剤が１個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、約４０ｍｇ〜約１００ｍｇのフリーズドライされた製剤が１個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、１２、２７、または４５個のバイアルからのフリーズドライされた製剤は、静脈内薬物製剤中に治療用量のタンパク質を得るために組み合わされてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約２５０ｍｇ／バイアル〜約１０００ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約６００ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約２５０ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。

タンパク質は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療有効量のタンパク質を含む液体水性医薬製剤中に存在することができる。

これらの組成物は従来の滅菌技術によって滅菌されてもよく、または濾過滅菌されてもよい。得られた水溶液はそのままで使用するためにパッケージ化されてもよく、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的に、３から１１の間、より好ましくは５から９の間または６から８の間、最も好ましくは７から８の間、例えば７〜７．５である。得られた固形の組成物は複数の単回用量単位でパッケージ化されてもよく、各々は一定量の上述の１つまたは複数の薬剤を含有する。固形の組成物はまた、柔軟な量のための容器にパッケージ化されてもよい。

ある特定の実施形態では、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、および酸化ナトリウムと組み合わせて本開示のタンパク質を含む、延長された貯蔵寿命を有する製剤を提供する。

ある特定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製される。本発明の緩衝液は、約４〜約８、例えば、約４．５〜約６．０、もしくは約４．８〜約５．５の範囲のｐＨを有してもよく、または約５．０〜約５．２のｐＨを有してもよい。上記に列挙したｐＨの中間の範囲も、本開示の一部であることが意図される。例えば、上限および／または下限として上記に列挙した値のいずれかの組合せを使用する値の範囲が含まれることが意図される。ｐＨをこの範囲内に制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が含まれる。

ある特定の実施形態では、製剤は、ｐＨを約４〜約８の範囲に維持するためにクエン酸塩およびリン酸塩を含有する緩衝系を含む。ある特定の実施形態では、ｐＨの範囲は、約４．５〜約６．０、または約ｐＨ４．８〜約５．５、または約５．０〜約５．２のｐＨ範囲であってもよい。ある特定の実施形態では、緩衝系には、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、および／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物が含まれる。ある特定の実施形態では、緩衝系は、約１．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍｌ）、約０．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍｌ）、約１．５ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍｌ）、約０．９ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６）、および約６．２ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍｌ）を含む。ある特定の実施形態では、緩衝系は、１〜１．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸、０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム、１．２５〜１．７５ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム二水和物、０．７〜１．１ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素ナトリウム二水和物、および６．０〜６．４ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは水酸化ナトリウムを用いて調整される。

トニシファイヤー（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）として作用し、抗体を安定化させることができるポリオールも、製剤に含めることができる。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変化し得る量で製剤に添加される。ある特定の実施形態では、水性製剤は等張性であってもよい。添加されるポリオールの量も、ポリオールの分子量に関して変化し得る。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、少量の単糖（例えば、マンニトール）が添加されてもよい。ある特定の実施形態では、等張化剤として製剤に使用され得るポリオールはマンニトールである。ある特定の実施形態では、マンニトール濃度は約５〜約２０ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約７．５〜１５ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１０〜１４ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１２ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、ポリオールソルビトールを製剤に含めることができる。

洗剤または界面活性剤もまた、製剤に添加してもよい。例示的な洗剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロクサマー（例えば、ポロクサマー１８８）などの非イオン性洗剤が挙げられる。添加される洗剤の量は、製剤化された抗体の凝集を低減させ、かつ／または製剤中の微粒子の形成を最低限に抑え、かつ／または吸着を低減させるようなものである。ある特定の実施形態では、製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含み得る。ある特定の実施形態では、製剤は、洗剤のポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ ８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを表すために使用される用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ、Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ、Ｅｄｉｔｉｏ Ｃａｎｔｏｒ Ｖｅｒｌａｇ Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ、第４版、１９９６年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの間のポリソルベート８０、または約０．５ｍｇ／ｍＬから約５ｍｇ／ｍＬの間を含有し得る。ある特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０が製剤に添加され得る。

実施形態では、本開示のタンパク質産物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉じ、アルミニウムクリンプシールクロージャで密封した、ＵＳＰ／Ｐｈ ＥｕｒいずれかのタイプＩ ５０Ｒバイアルにおいて、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され得る。栓は、ＵＳＰおよびＰｈ Ｅｕｒに準拠したエラストマーで作られていてもよい。ある特定の実施形態では、６０ｍＬの採取容量を可能にするために、バイアルに６１．２ｍＬのタンパク質産物溶液が充填され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、０．９％の生理食塩水で希釈され得る。

ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、安定化レベルで糖と組み合わせた１０ｍｇ／ｍＬ濃度溶液として調製され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は水性担体中に調製され得る。ある特定の実施形態では、安定化剤は、静脈内投与に望ましくないまたは不適切な粘度をもたらし得る量以下の量で添加され得る。ある特定の実施形態では、糖は、二糖、例えば、スクロースであり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、および保存剤のうちの１つまたは複数を含み得る。

ある特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムであり得る。

凝集に加えて、脱アミドは、発酵、採取／細胞清澄化、精製、薬物物質／薬物製品貯蔵の間および試料分析の間に発生し得るペプチドおよびタンパク質の一般的な産物のバリアントである。脱アミドは、加水分解を受け得るスクシンイミド中間体を形成するタンパク質からのＮＨ_３の喪失である。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量減少をもたらす。その後の加水分解は、１８ダルトンの質量増加をもたらす。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下での不安定性に起因して困難である。したがって、脱アミドは、典型的に１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミドは、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかを生じる。脱アミドの速度に影響を及ぼすパラメータには、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所ポリペプチド立体配座および三次構造が含まれる。ペプチド鎖におけるＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド化速度に影響を及ぼす。タンパク質配列におけるＡｓｎに続くＧｌｙおよびＳｅｒは、脱アミドに対してより高い感受性を生じる。

ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミノを阻止するためのｐＨおよび湿度の条件下で保存され得る。

本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。

保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加することができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にすることができる。

静脈内（ＩＶ）製剤は、患者が、移植後に入院しており、ＩＶ経路を介してすべての薬物を受けている場合などの特定の場合に好ましい投与経路であり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％の塩化ナトリウム溶液により希釈される。ある特定の実施形態では、注射のための希釈された薬物製品は等張であり、静脈内注入による投与に適している。

ある特定の実施形態では、塩または緩衝成分は１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加することができる。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いて種々の公知の酸（無機および有機）から誘導される。ある特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート、炭酸、クエン酸緩衝液であってもよく、これらの場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。

保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加することができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にすることができる。

本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。

本開示のタンパク質は、タンパク質およびリオプロテクタントを含む凍結乾燥製剤として存在することもできる。リオプロテクタントは糖、例えば二糖であり得る。ある特定の実施形態では、リオプロテクタント（lycoprotectant）は、スクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤は、緩衝剤、界面活性剤、増量剤、および／または保存剤のうちの１つまたは複数を含んでもよい。

凍結乾燥された薬物製品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２のタンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比であり得る。ある特定の実施形態では、タンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比は１：２〜１：５であり得る。

ある特定の実施形態では、凍結乾燥前の製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される塩基は水酸化ナトリウムであり得る。

凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは６から８の間に調整され得る。ある特定の実施形態では、凍結乾燥した薬物製品についてのｐＨ範囲は７〜８であり得る。

ある特定の実施形態では、塩または緩衝成分は１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加することができる。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いて種々の公知の酸（無機および有機）から誘導される。ある特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート、炭酸、クエン酸緩衝液であってもよく、これらの場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。

ある特定の実施形態では、「増量剤」を添加することができる。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開放気孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが含まれる。本発明の凍結乾燥製剤はこのような増量剤を含有し得る。

保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加することができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にすることができる。

ある特定の実施形態では、凍結乾燥薬物製品は水性担体で構成され得る。本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、凍結乾燥後、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な希釈剤には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。

ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥薬物製品は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％の塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰのいずれかで再構成される。再構成の間、凍結乾燥粉末は溶液に溶解する。

ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質製品は、約４．５ｍＬの注射用水に構成され、０．９％の生理食塩水溶液（塩化ナトリウム溶液）により希釈される。

本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性を生じず、特定の患者、組成物、および投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように変化し得る。

特定の用量は、各患者に対して均一な用量、例えば、５０〜５０００ｍｇのタンパク質であってもよい。代替的に、患者の用量は、患者のおおよその体重または表面積に合わせられ得る。適切な投薬量を決定する際の他の要因には、処置または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別および医学的状態が含まれ得る。処置のための適切な投薬量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、特に、本明細書に開示される投薬量情報およびアッセイを考慮して当業者によって慣用的になされる。投薬量はまた、適切な用量応答データと併せて使用される投薬量を決定するための公知のアッセイの使用によって決定することができる。個々の患者の投薬量は、疾患の進行がモニターされるにつれて調節されてもよい。患者における標的化可能な構築物または複合物の血中レベルは、有効濃度に達するか、または有効濃度を維持するように投薬量が調節される必要があるかどうかを調べるために測定され得る。どの標的化可能な構築物および／または複合物、ならびにそれらの投薬量が、所与の個体に対して効果的である可能性が高いかを決定するために薬理ゲノム学が使用され得る（Ｓｃｈｍｉｔｚら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３０８巻：４３〜５３頁、２００１年；Ｓｔｅｉｍｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３０８巻：３３〜４１頁、２００１年）。

一般に、体重に基づく投薬量は、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。

用量は、１日に１回もしくは複数回、１週間に１回もしくは複数回、１ヶ月に１回もしくは複数回または１年に１回もしくは複数回、またはさらに２〜２０年に１回与えられ得る。当業者は、体液または組織中の標的化可能な構築物または複合体の測定された滞留時間および濃度に基づいて投薬のための反復率を容易に推定することができる。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内であってもよく、カテーテルを介する潅流によってでもよく、または直接的な病巣内注射によってでもよい。これは、１日に１回または複数回、１週間に１回または複数回、１ヶ月に１回または複数回、および１年に１回または複数回、投与され得る。

上記の説明は本発明の複数の態様および実施形態を記載している。本出願は特に、態様および実施形態のすべての組合せおよび置換を意図する。

ここで概して記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、これらの実施例は本発明のある特定の態様および実施形態の例示の目的のためにのみ含まれ、本発明を限定することを意図していない。

（実施例１）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄに結合する
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは精製した組換えＮＫＧ２Ｄに結合する
ヒト、マウスまたはカニクイザルＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインの核酸配列を、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインをコードする核酸配列と融合させ、発現させる哺乳動物細胞に導入した。精製後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させた。非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミンでウェルを阻止した後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを滴定し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質を予め吸着させたウェルに添加した。一次抗体結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートし、Ｆｃ交差反応を回避するためにヒトカッパ軽鎖を特異的に認識する二次抗体を使用して検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼに対する基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェルに添加して結合シグナルを可視化し、その吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローン、アイソタイプ対照または陽性対照（配列番号１０１〜１０４、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択した重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）を各ウェルに添加した。

アイソタイプ対照は組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対してわずかな結合を示したが、陽性対照が組換え抗原に対して最も強く結合した。クローン毎に親和性は異なったが、すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒト、マウス、およびカニクイザルの組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質のすべてで結合を示した。概して、各抗ＮＫＧ２Ｄクローンは、ヒト（図３）およびカニクイザル（図４）の組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに同様の親和性で結合したが、マウス（図５）の組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対する親和性は比較的低かった。

ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株を、ヒトまたはマウスのＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインキメラ抗原受容体を発現するように工学操作した。ＮＫＧ２Ｄ結合クローン、アイソタイプ対照または陽性対照を１００ｎＭ濃度にて使用して、ＥＬ４細胞において発現した細胞外ＮＫＧ２Ｄを染色した。フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して抗体結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、親ＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を計算した。

すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒトおよびマウスのＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に結合した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択される重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）が最も良好なＦＯＢ結合シグナルをもたらした。各クローンのＮＫＧ２Ｄ結合親和性は、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（図６）とマウスＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（図７）との間で同様であった。

（実施例２）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄへの天然リガンドの結合を阻止する
ＵＬＢＰ−６との競合
組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウシ血清アルブミンでウェルをブロッキングした。飽和濃度のＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンを添加した。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンを、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジンおよびＴＭＢ基質によって検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ウェル中のＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への結合を遮断されたＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）および種々のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２ＤへのＵＬＢＰ−６の結合を遮断したが、アイソタイプ対照はＵＬＢＰ−６との競合をほとんど示さなかった（図８）。
ＵＬＢＰ−６配列は、配列番号１０８により表される。

ＭＩＣＡとの競合
組換えヒトＭＩＣＡ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウシ血清アルブミンでウェルを阻止した。ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーションおよび洗浄後、ＭＩＣＡ−Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ＭＩＣＡ−Ｆｃでコーティングされたウェルへの結合を阻止されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）および種々のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２ＤへのＭＩＣＡ結合を阻止したが、アイソタイプ対照はＭＩＣＡとの競合をほとんど示さなかった（図９）。

Ｒａｅ−１デルタとの競合
組換えマウスＲａｅ−１デルタ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した）をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウェルをウシ血清アルブミンで阻止した。マウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーションおよび洗浄後、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃでコーティングされたウェルへの結合を阻止されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択される重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）および種々のＮＫＧ２Ｄ−結合ドメインクローンはマウスＮＫＧ２ＤへのＲａｅ−１デルタ結合を阻止したが、アイソタイプ対照抗体はＲａｅ−１デルタとの競合をほとんど示さなかった（図１０）。

（実施例３）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンはＮＫＧ２Ｄを活性化させる
ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に、ヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄの核酸配列を融合させて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を得た。次に、ギブソンアセンブリを使用してＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ構築物をレトロウイルスベクターにクローニングし、レトロウイルス産生のためにｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。８μｇ／ｍＬのポリブレンと共にＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを含有するウイルスにＥＬ４細胞を感染させた。感染の２４時間後、ＥＬ４細胞中のＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーによって分析し、細胞表面で高レベルのＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを発現するクローンを選択した。

ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＮＫＧ２Ｄを活性化させるかどうかを判定するために、それらをマイクロプレートのウェルに吸着させ、抗体断片でコーティングされたウェルにおいてＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ ＥＬ４細胞をブレフェルジン−Ａおよびモネンシンの存在下で４時間にわたって培養した。ＮＫＧ２Ｄ活性化の指標である細胞内ＴＮＦ−α産生をフローサイトメトリーによってアッセイした。陽性対照で処置した細胞に対してＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージを正規化した。すべてのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがヒトＮＫＧ２Ｄ（図１１）およびマウスＮＫＧ２Ｄ（図１２）の両方を活性化させた。

（実施例４）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫ細胞を活性化させる
初代ヒトＮＫ細胞
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血バフィコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞（ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋）を単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には＞９５％であった。次に、単離されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地中で２４〜４８時間にわたって培養した後、それらを、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａ、およびモネンシンを含有する培地中で培養した。培養後、ＣＤ３、ＣＤ５６、およびＩＦＮ−γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋細胞におけるＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γの染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の会合による、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび陽性対照（例えば、配列番号１０１または配列番号１０３によって表される重鎖可変ドメイン、および配列番号１０２または配列番号１０４によって表される軽鎖可変ドメイン）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ^＋およびＩＦＮ−γ^＋になることを示した（図１３および図１４は、ＮＫ細胞の調製のために異なるドナーのＰＢＭＣをそれぞれ使用した、２つの独立した実験のデータを表す）。

初代マウスＮＫ細胞
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから脾臓を得、７０μｍのセルストレイナーを通して押しつぶして、単一細胞懸濁液を得た。細胞をペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した、＃Ａ１０４９２０１；１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ炭酸水素カリウム、０．０１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁して赤血球を除去した。残存する細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２と共に７２時間にわたって培養し、その後採取し、ＮＫ細胞単離のために用意した。次に、磁気ビーズを用いたネガティブディプリーション技術を使用し、典型的には＞９０％の純度で脾臓細胞からＮＫ細胞（ＣＤ３⁻ＮＫ１．１^＋）を単離した。精製されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−１５を含有する培地中で４８時間にわたって培養した後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａ、およびモネンシンを含有する培地中で培養した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインでコーティングされたウェルにおいて培養した後、ＣＤ３、ＮＫ１．１、およびＩＦＮ−γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３⁻ＮＫ１．１^＋細胞におけるＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γの染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の会合による、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび陽性対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択される）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ^＋およびＩＦＮ−γ^＋になることを示した（図１５および図１６は、ＮＫ細胞の調製のために異なるマウスをそれぞれ使用した、２つの独立した実験のデータを表す）。

（実施例５）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは標的腫瘍細胞の細胞傷害性を可能にする
ヒトおよびマウス初代ＮＫ細胞活性化アッセイは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインとのインキュベーション後、ＮＫ細胞において細胞傷害性マーカーの増加を実証した。これが腫瘍細胞溶解の増加につながるかどうかに対処するために、各ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが単一特異的抗体に発達する細胞ベースのアッセイを利用した。Ｆｃ領域を１つの標的化アームとして使用し、一方、Ｆａｂ断片領域（ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン）はＮＫ細胞を活性化するための別の標的化アームとして働いた。ヒト起源であり、高レベルのＦｃ受容体を発現するＴＨＰ−１細胞を腫瘍標的として使用し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性キットを使用した。ＴＨＰ−１細胞をＢＡＴＤＡ試薬で標識し、１０^５／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。次に、標識したＴＨＰ−１細胞をＮＫＧ２Ｄ抗体と組み合わせ、マイクロタイタープレートのウェル中で３７℃にて３時間、マウスＮＫ細胞を単離した。インキュベーション後、２０μｌの培養上清を取り出し、２００μｌのユーロピウム溶液と混合し、暗所で１５分間振盪しながらインキュベートした。時間分解蛍光モジュール（励起３３７ｎｍ、発光６２０ｎｍ）を備えたＰｈｅｒａＳｔａｒプレートリーダーによって蛍光を経時的に測定し、キットの指示に従って特異的溶解を計算した。

Ｆｃにコンジュゲートした、陽性対照のＵＬＢＰ−６（ＮＫＧ２Ｄに対する天然リガンド）は、マウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解の増加を示した。ＮＫＧ２Ｄ抗体も、ＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解を増加させたが、アイソタイプ対照抗体は特異的溶解の低減を示した。点線は、抗体を添加していないマウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１細胞の特異的溶解を示す（図１７）。

（実施例６）
ＮＫＧ２Ｄ抗体は高い熱安定性を示す
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの融解温度を、示差走査型蛍光定量法を使用してアッセイした。外挿した見かけの融解温度は典型的なＩｇＧ１抗体と比較して高い（図１８）。

（実施例７）
ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６の架橋によるヒトＮＫ細胞の相乗的活性化
初代ヒトＮＫ細胞活性化アッセイ
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血バフィコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ネガティブ磁気ビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＃１７９５５）を使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞を精製した。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによって決定して＞９０％のＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋であった。次に、細胞を、活性化アッセイに使用する前に１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃２００−０２）を含有する培地中で４８時間増やした。抗体を、１００μｌの滅菌ＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌ（抗ＣＤ１６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３０２０１３）および５μｇ／ｍＬ（抗ＮＫＧ２Ｄ、Ｒ＆Ｄ ＃ＭＡＢ１３９）の濃度にて４℃で一晩、９６ウェル平底プレート上にコーティングし、続いてウェルを十分に洗浄して過剰の抗体を除去した。脱顆粒の評価のために、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２（ｈＩＬ２）および１μｇ／ｍＬのＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３２８６１９）を補充した培養培地に５×１０^５個の細胞／ｍＬにて再懸濁した。次に、１×１０^５個の細胞／ウェルを、抗体をコーティングしたプレート上に添加した。タンパク質輸送阻害剤であるブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４２０６０１）およびモネンシン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４２０７０１）を、それぞれ１：１０００および１：２７０の最終希釈度にて添加した。蒔いた細胞を、３７℃にて４時間にわたって５％ＣＯ_２においてインキュベートした。ＩＦＮ−γの細胞内染色のために、ＮＫ細胞を、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３００４５２）および抗ＣＤ５６ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１８３２８）で標識し、続いて固定し、透過処理し、抗ＩＦＮ−γ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃５０６５０７）で標識した。ＮＫ細胞を、生ＣＤ５６^＋ＣＤ３⁻細胞においてゲーティングした後、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γの発現について分析した。

受容体の組合せの相対的効力を調査するため、プレート結合刺激により、ＮＫＧ２ＤまたはＣＤ１６の架橋および両受容体の共架橋を行った。図１９（図１９Ａ〜１９Ｃ）に示したように、ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄの組み合わせた刺激は、ＣＤ１０７ａ（脱顆粒）レベル（図１９Ａ）および／またはＩＦＮ−γ産生レベル（図１９Ｂ）の大きな上昇をもたらした。点線は、各受容体の個々の刺激の相加効果を表す。

抗ＣＤ１６、抗ＮＫＧ２Ｄまたは両方のモノクローナル抗体の組合せを用いた４時間のプレート結合刺激の後、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａレベルおよび細胞内ＩＦＮ−γ産生を分析した。グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。図１９ＡはＣＤ１０７ａのレベルを示し、図１９ＢはＩＦＮγのレベルを示し、図１９ＣはＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γ産生のレベルを示す。図１９Ａ〜１９Ｃに示したデータは、５名の異なる健康なドナーを使用した、５つの独立した実験を代表するものである。

（実施例８）
標的細胞の三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）媒介性の細胞傷害性の増強
ヒトＮＫＧ２Ｄを発現した細胞へのＴｒｉＮＫＥＴ結合の評価：

ヒトＮＫＧ２Ｄで形質導入したＥＬ４細胞を、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞へのＡ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＬＥＣ１２Ａ（クローンＡＤＩ−２７７４９のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよびＵＳ２０１４／０１２００９６に記載されるモノクローナル抗体４３３１（第２１頁を参照のこと）のＣＬＥＣ１２Ａ結合ドメイン）の結合を試験するために使用した。ＴｒｉＮＫＥＴを、最高濃度に希釈し、次いで、段階希釈した。ｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴの希釈物を使用して細胞を染色し、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して、ＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂの結合を検出した。フローサイトメトリーによって細胞を分析し、結合ＭＦＩを、二次抗体対照に対して正規化して、バックグラウンド値に対する倍率を得た。

図３５および図３６は、ＣＬＥＣ１２Ａを発現するヒトＡＭＬ細胞株へのＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す。抗ＣＬＥＣ１２Ａモノクローナル抗体およびＴｒｉＮＫＥＴは、ＳＫＭ−１細胞（図３５）およびＵ９３７細胞（図３６）の両方への類似の結合を示した。

ヒトがん抗原を発現した細胞へのＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂ結合の評価：
ＣＬＥＣ１２Ａを発現するヒトがん細胞株を使用して、ＣＬＥＣ１２Ａを標的とするＴｒｉＮＫＥＴの腫瘍抗原結合を評価した。ヒトＡＭＬ細胞株Ｕ９３７およびＳＫＭ−１を使用して、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する細胞へのＴｒｉＮＫＥＴの結合を評価した。ＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂを希釈し、それぞれの細胞と共にインキュベートした。フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して、ＴｒｉＮＫＥＴの結合を検出した。フローサイトメトリーによって細胞を分析し、ＣＬＥＣ１２Ａを発現する細胞への結合ＭＦＩを、二次抗体対照に対して正規化して、バックグラウンド値に対する倍率を得た。

図３７は、ＥＬ４細胞の表面において発現されるヒトＮＫＧ２ＤへのＣＬＥＣ１２Ａ−ＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す。細胞表面において発現されるＮＫＧ２Ｄへの結合は弱かったが、抗ＣＬＥＣ１２Ａモノクローナル抗体と比較して検出可能であった。

ＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂ内部移行の評価：
ＨＬ６０、ＳＫＭ−１、およびＵ９３７ヒトＡＭＬ細胞株を、細胞表面において発現されるＣＬＥＣ１２Ａに結合したＴｒＩＮＫＥＴの内部移行を評価するために使用した。ＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂを２０μｇ／ｍＬに希釈し、希釈物を使用して、細胞を染色した。ＣＬＥＣ１２Ａサンプルの表面染色を分けた後に、そのサンプルの２／３を３７℃で一晩静置して、内部移行を促進し、他方のそのサンプルの１／３に結合した抗体を、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。二次抗体で染色した後に細胞を固定し、翌日に分析するために、４℃で一晩貯蔵した。３７℃で２時間および２０時間後、サンプルをインキュベーターから取り出し、細胞の表面に結合した抗体を、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。サンプルを固定し、全サンプルを同日に分析した。抗体またはＴｒｉＮＫＥＴの内部移行を、以下のように計算した： ％内部移行＝（１−（サンプルＭＦＩ ２４時間／ベースラインＭＦＩ）） × １００％。

図３８、３９、および４０は、それぞれ、ＨＬ６０細胞（図３８）、ＳＫＭ−１細胞（図３９）、およびＵ９３７細胞（図４０）とのインキュベーション後の、ＣＬＥＣ１２Ａを標的とするＴｒｉＮＫＥＴの内部移行を示す。抗ＣＤ３３抗体リンツズマブを、内部移行のための陽性対照として使用した。なぜならＣＤ３３は、ＨＬ６０細胞株（図３８）、ＳＫＭ−１細胞株（図３９）、およびＵ９３７細胞株（図４０）によって発現されるからである。リンツズマブは、全ての細胞株において高レベルの内部移行を示し、これは時間と共に増大した。試験した全３種の細胞株において、抗ＣＬＥＣ１２Ａ ｍＡｂおよびＴｒＩＮＫＥＴは、２時間および２０時間のインキュベーション後に、類似のレベルの内部移行を示した。

初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイ：
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血バフィコートからＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞単離のために用意した。磁気ビーズを用いたネガティブ選択技術を使用してＮＫ細胞を単離したところ、単離したＮＫ細胞の純度は、典型的には＞９０％ ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋であった。単離したＮＫ細胞を、一晩休止させた。休止ＮＫ細胞を、翌日の細胞傷害性アッセイにおいて使用した。

図４１および４２は、初代ヒトＮＫ細胞によるＣＬＥＣ１２Ａ陽性ヒトＡＭＬ細胞株の殺滅を示す。休止したヒトＮＫ細胞は、５：１ エフェクター対標的比において、ＨＬ６０細胞（図４１）およびＭｖ４−１１細胞（図４２）に対してほとんど活性を示さなかった。用量応答性様式で、ＣＬＥＣ１２Ａ標的化ＴｒｉＮＫＥＴは、ＨＬ６０細胞（図４１）およびＭｖ４−１１細胞（図４２）の両方の効率的殺滅を示した。ＣＬＥＣ１２Ａに対するモノクローナル抗体は、ＨＬ６０（図４１）およびＭｖ４−１１（図４２）に対してごく弱い活性を示した。その一方で、非標的化ＴｒＩＮＫＥＴは活性を示さなかった。ＣＬＥＣ１２Ａ−ＴｒｉＮＮＫＥＴは、Ｍｖ４−１１細胞（図４２）と比較して、より高レベルのＣＬＥＣ１２Ａを発現するＨＬ６０細胞（図４１）に対してより良好な有効性を示した。

ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ
目的の標的を発現するヒトがん細胞株を培養物から採取し、ＨＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＡＤ０１１６）で標識するために、１０^６細胞／ｍＬにて成長培地に再懸濁した。標的細胞を標識するために製造業者の指示に従った。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、培養培地に０．５×１０^５ 細胞／ｍＬにて再懸濁した。バックグラウンドウェルを調製するために、標識した細胞のアリコートをとっておき、その細胞を培地からスピンアウトした。その培地１００μｌを、三連でウェルへと注意深く添加して、ペレット化した細胞が乱れるのを回避した。ＢＡＴＤＡ標識細胞１００μｌを、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ウェルを、標的細胞からの自発的放出のために保全し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加による標的細胞の溶解のために調製した。目的の腫瘍標的に対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを、培養培地で希釈し、希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴ５０μｌを、各ウェルに添加した。休止ＮＫ細胞を培養物から採取し、洗浄し、望ましいエフェクター対標的細胞比に応じて、培養培地中１．０×１０^５〜２．０×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した。ＮＫ細胞５０μｌを、そのプレートの各ウェルに添加して、合計２００μｌ培養容積にした。そのプレートを、アッセイを展開する前に、３７℃、５％ ＣＯ_２で２〜３時間にわたってインキュベートした。

２〜３時間の培養の後、そのプレートをインキュベーターから取り出し、細胞を、２００×ｇで５分間遠心分離することによってペレット化した。培養上清２０μｌを、製造業者から提供されたきれいなマイクロプレートへと移し、室温のユーロピウム溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ１３５−１００）２００μｌを、各ウェルに添加した。そのプレートを遮光し、プレート振盪機上で２５０ｒｐｍにおいて１５分間インキュベートした。プレートを、Ｖｉｃｔｏｒ ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標） ｉ３Ｘ機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して読み取った。％ 特異的溶解を、以下のように計算した： ％ 特異的溶解＝（（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出））×１００。

参照による組み込み
本明細書で参照される特許文献および科学論文の各々の開示全体は、すべての目的のために参照により組み込まれる。

等価物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱せずに他の特定の形態で実現されてもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書で記載している本発明を限定するのではなく、すべての点で例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に入るすべての変更はその中に包含されることが意図される。

Claims (48)

1. （ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と
   （ｂ）ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａに結合する第２の抗原結合部位と
   （ｃ）ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
   を含むタンパク質。
2. 前記第１の抗原結合部位は、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯動物のＮＫＧ２Ｄに結合する、請求項１に記載のタンパク質。
3. 前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項１または２に記載のタンパク質。
4. 前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインは、同じポリペプチド上に存在する、請求項３に記載のタンパク質。
5. 前記第２の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項３または４に記載のタンパク質。
6. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインは、同じポリペプチド上に存在する、請求項５に記載のタンパク質。
7. 前記第１の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、請求項５または６に記載のタンパク質。
8. 前記第１の抗原結合部位は、配列番号１、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、および配列番号９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
9. 前記第１の抗原結合部位は、配列番号４１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号４２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
10. 前記第１の抗原結合部位は、配列番号４９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号５０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
11. 前記第１の抗原結合部位は、配列番号５７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号５８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
12. 前記第１の抗原結合部位は、配列番号５９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号６０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
13. 前記第１の抗原結合部位は、配列番号６１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号６２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
14. 前記第１の抗原結合部位は、配列番号６９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。前
15. 前記第１の抗原結合部位は、配列番号７７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
16. 前記第１の抗原結合部位は、配列番号８５と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号８６と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
17. 前記第１の抗原結合部位は、配列番号９３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号９４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
18. 前記第１の抗原結合部位は、配列番号１０１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号１０２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
19. 前記第１の抗原結合部位は、配列番号１０３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号１０４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
20. 前記第１の抗原結合部位は、単一ドメイン抗体である、請求項１または２に記載のタンパク質。
21. 前記単一ドメイン抗体は、Ｖ_ＨＨ断片またはＶ_ＮＡＲ断片である、請求項２０に記載のタンパク質。
22. 前記第２の抗原結合部位は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜２または２０〜２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
23. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインは、同じポリペプチド上に存在する、請求項２２に記載のタンパク質。
24. 前記第２の抗原結合部位は、単一ドメイン抗体である、請求項１〜４または８〜１９のいずれか１項に記載のタンパク質。
25. 前記第２の抗原結合部位は、Ｖ_ＨＨ断片またはＶ_ＮＡＲ断片である、請求項２４に記載のタンパク質。
26. 前記第２の抗原結合部位は、ＣＬＥＣ１２Ａに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１１５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１１９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２５のいずれかに記載のタンパク質。
27. 前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインは、
    配列番号１１６のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列と、
    配列番号１１７のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列と、
    配列番号１１８のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列と
    を含むアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のタンパク質。
28. 前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインは、
    配列番号１２０のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列と、
    配列番号１２１のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列と、
    配列番号１２２のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列と、
    を含むアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のタンパク質。
29. 前記タンパク質は、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメインの一部分を含み、前記抗体Ｆｃドメインは、ヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のタンパク質。
30. 前記抗体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、請求項２９に記載のタンパク質。
31. 前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９または３０に記載のタンパク質。
32. 前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、Ｋ４３９からなる群より選択される１つまたは複数の位置において異なる、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のタンパク質。
33. 先行する請求項のいずれか１項に記載のタンパク質および薬学的に許容される担体を含む製剤。
34. 請求項１〜３２のいずれか１項に記載のタンパク質を発現する１または複数の核酸を含む細胞。
35. 請求項１〜３２のいずれか１項に記載のタンパク質に、腫瘍細胞およびナチュラルキラー細胞を曝露する工程を包含する、腫瘍細胞死を直接的におよび／または間接的に増強する方法。
36. 請求項１〜３２のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項３３に記載の製剤を、患者に投与することを包含する、がんを処置する方法。
37. 前記がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および古典的ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
38. 前記ＡＭＬは、急性未分化型骨髄芽球性白血病、急性最小分化型骨髄芽球性白血病、急性分化型骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性骨髄単球性白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病（ＡＭＫＬ）、急性好塩基球性白血病、線維症を伴う急性汎骨髄症、および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍（ＢＰＤＣＮ）から選択される、請求項３７に記載の方法。
39. 前記ＡＭＬは、前記ＡＭＬ白血病幹細胞（ＬＳＣ）上のＣＬＬ−１の発現によって特徴づけられる、請求項３７または３８に記載の方法。
40. 前記ＬＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＴＩＭ３、ＣＤ２５、ＣＤ３２、およびＣＤ９６から選択される膜マーカーをさらに発現する、請求項３９に記載の方法。
41. 前記ＡＭＬは、微小残存病変（ＭＲＤ）である、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記ＭＲＤは、ＦＬＴ３−ＩＴＤ（（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３）−遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ））、ＮＰＭ１（ヌクレオホスミン１）、ＤＮＭＴ３Ａ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子ＤＮＭＴ３Ａ）、およびＩＤＨ（イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１および２（ＩＤＨ１およびＩＤＨ２））から選択される変異の存在または非存在によって特徴づけられる、請求項４１に記載の方法。
43. 前記ＭＤＳは、多血球系異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ−ＭＬＤ）、単一血球系異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ−ＳＬＤ）、環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ−ＲＳ）、芽球増加を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ−ＥＢ）、単独ｄｅｌ（５ｑ）を伴うＭＤＳ、および分類不能型ＭＤＳ（ＭＤＳ−Ｕ）から選択される、請求項３７に記載の方法。
44. 前記ＭＤＳは、原発性ＭＤＳまたは二次性ＭＤＳである、請求項３７に記載の方法。
45. 前記ＡＬＬは、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）から選択される、請求項３７に記載の方法。
46. 前記ＭＰＮは、真性赤血球増加症、本態性血小板血症（ＥＴ）、および骨髄線維症から選択される、請求項３７に記載の方法。
47. 前記非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫から選択される、請求項３７に記載の方法。
48. 前記リンパ腫は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＰＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、形質細胞骨髄腫（ＰＣＭ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）、成熟Ｔ／ＮＫ細胞腫瘍、および組織球腫瘍から選択される、請求項３７に記載の方法。