SK4232002A3 - Fibrinolytically active polypeptide - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa vzťahuje k fibrinolyticky aktívnej metaloproteináze, ktorá má v prírode sa nevyskytujúcu sekvenciu, k metódam jej výroby a k jej použitiu v liečbe trombóz in vivo.

Doterajší stav techniky

Fibroláza je enzymaticky aktívny polypeptid (konkrétne metaloproteináza), tvorený 203 aminokyselinami, ktorý bol prvý raz izolovaný purifikáciou z jedu hada Southern Copperhead (Patent USA č. 4, 610,879, vydaný 9. septembra 1986 (Markland et al.); a Guán et. Al., Archives of Biochemistry and Biophysics, zväzok 289, číslo 2, strany 197-207 (1991). Enzým vykazuje priamu fibrinolytickú aktivitu so slabou alebo žiadnou hemoragickou aktivitou. Rozpúšťa krvné zrazeniny tvorené z fibrinogénu alebo z plnej krvi.

Aminokyselinová sekvencia fibrolázy bola určená a tiež boli popísané metódy pre rekombinantnú produkciu v kvasinkách a použitie pre úpravu tromboembolických podmienok in vivo. Randolph et al., Protein Science, Cambridge University Press (1992), strany 590-600 a Európska patentová žiadosť č. 0 323 722 (Valenzuela et al.), publikovaná 12. júla 1989.

01-852-02-Ce

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje fibrinolytickú metaloproteinázu o amínokyselinovej sekvencii, ktorá sa bežne v prírode nevyskytuje (popísaná viď. SEQ ID NO:1 a tiež popisovaná tu ako novel acting thrombolytic (NAT). Tiež sú· poskytnuté sekvencie nukleovej kyseliny ako napr. SEQ ID NO: 2 a jej varianty, ktoré kódujú NAT.

Termín zrelý je používaný v jeho konvenčnom zmysle označuje biologicky aktívny polypeptid, ktorý bol enzymaticky spracovaný in situ v hostiteľskej bunke, vyštiepením z prepro” oblasti.

Vzhľadom k fibrinolytickej aktivite je NAT použiteľný in vivo ako lyzačné činidlo krvných zrazenín pri liečení trombóz u cicavcov (vrátane krýs, prasiat a človeka).

NAT polypeptid v tomto vynáleze ako liečebné činidlo poskytuje výhody oproti v prírode sa vyskytujúcej fibroláze (napr. fibrinolytický polypeptid nájdený v hadom jede). U natívnej fibrolázy je popísané niekoľko alternatívnych Nkoncov: QQRFP, EQRFP a ERFP (kde E značí cyklický glutamín alebo kyselinu pyroglutámovú). Presnejšie, molekula fibrolázy, ktorá začína na N-konci sekvenciou QQRFP, je degradovaná na 2 izoformy, ktoré majú N-konce EQRFP a ERFP. Rekombinantná fibroláza vyrábaná v kvasinkách je zmes všetkých týchto 3 foriem a teda nie je homogénna. Viď. Loayza et al, Journal of Chromatography, B 662, strany 227-243 (1994).

A naviac cyklický glutamín blokuje N-koniec a znemožňuje tak sekvenovanie.

01-852-02-Če

V zrovnaní s tým rekombinantný NAT (popisovaný v tomto vynáleze) poskytuje jednu formu: iba jeden N-koniec je typicky vyrábaný. Výsledkom je väčšia homogenita koncového produktu v zrovnaní s rekombinantnou fibrolázou, čo je výhodné, keď ako konečné upotrebenie sú zamýšľané lekárske aplikácie.

Stručný prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 zobrazuje v lineárnom tvare celú aminokyselinovú sekvenciu NATu (Seq ID N0:3), skladajúcu sa z prepo oblasti (podčiarknutá), ktorá obsahuje signálny peptid, a zrelý polypeptid (nepodčiarknutý).

Podrobný prehľad obrázkov na výkresoch

NAT môže byť vyrábaný rekombinantnou expresiou molekuly nukleovej kyseliny o SEQ ID NO:4, ktorá kóduje kompletnú aminokyselinovú sekvenciu NATu (SEQ ID NO:3), vrátane prepo oblasti ( nukleotidy 1173) a zrelého polypeptidu (nukleotidy 784-1386), vo vhodnom hostiteľovi. Následne po expresii, je prepo oblasť v hostiteľskej bunke enzymaticky odštiepená a poskytuje zrelý aktívny polypeptid (SEQ ID NO:1).

NAT je vyrábaný v kvasinkách, ako bude vysvetlené detailnejšie nižšie.

Zrelý polypeptid (SEQ ID NO: 1) , ktorý je takto vyrábaný môže mať a tiež nemusí ako koncovú aminokyselinu - metionín a to v závislosti od spôsobu prípravy. Typicky je metionín, ako koncová aminokyselina prítomný, keď je polypeptid vyrábaný rekombinantne v nesekretujúcom bakteriálnom druhu (napr. E.coli) ako hostiteľovi.

01-852-02-Če

Okrem toho, molekula nukleovej kyseliny o SEQ ID NO: 2, je tiež použiteľná, pretože je to degenerovaná sekvencia a kóduje rovnaký polypeptid. Tento vynález zahrnuje tiež molekuly nukleovej kyseliny, ktoré môžu kódovať ďalšie aminokyseliny hraničiace na 5'alebo 3' konci s oblasťou, ktorá kóduje zrelý polypeptid, rovnako ako sekvencie kódujúce alternatívne pre/pro oblasti (napr. sekvencie zodpovedné za sekréciu polypeptidu cez bunkové membrány) v mieste natívnej pre/pro oblasti, (napr. nájdené v prírode vyskytujúcej sa fibroláze). Ďalšie sekvencie môžu tiež byť nekódujúce sekvencie, vrátane regulačných oblastí ako promótor transkripcie alebo translácie, v závislosti od hostitelskej bunky.

NAT môže byť pripravený pomocou dobre známych rekombinantných techník, ktoré sú popísané bližšie v Sambrook et al., Molecular cloniňg: Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) a/alebo v Aqusubel et al., editors, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, New York (1994).

DNA molekula kódujúca polypeptid alebo jeho skrátená verzia, môže byť získaná napríklad pomocou metódy: screening genómovej alebo cDNA knižnice, alebo pomocou PCR amplifikácie. Nasleduje nahradenie kodónu, ktorý kóduje N-koncové aminokyseliny QQR, kodónom pre serín (S).

Alternatívne, môže byť molekula kódujúca NAT pripravená chemickou syntézou, pomocou metód, ktoré sú dobre známe skúseným chemikom. Popísané boli Engelsom et al. v Angew. Chem. Intl. Ed., Volume 28, strany 716-734 (1989). DNA je niekolko stoviek nukleotidov dlhá. Nukleové kyseliny dlhšie ako jedno sto nukleotidov môžu byť syntetizované rovnakými metódami ako niekolko fragmentov a následne tieto fragmenty

01-852-02-Ce môžu byť ligované k sebe, tak aby vytvorili nukleotidovú sekvenciu o žiadanej dĺžke.

DNA molekula je vložená do príslušného expresného vektora pre expresiu vo vhodnej hostiteľskej bunke.

Vektor je vybraný, tak aby fungoval v danej hostiteľskej bunke (napr. vektor je kompatibilný s hostiteľským bunkovým aparátom, tak že dochádza k expresii DNA).

Aj keď polypeptid môže byť exprimovaný v prokaryotickej, kvasinkovej, hmyzej (bakulovírusový systém) alebo eukaryotickej hostiteľskej bunke, kvasinka je uprednostnená, ako bude ďalej podrobnejšie vysvetlené.

Vektory používané k expresii NAT v akejkoľvek hostitelskej bunke môžu tiež obsahovať 5' hraničiacu oblasť (spomínaná ako promótor) a ďalšie regulačné prvky prakticky pripojené k DNA tak, aby boli exprimované. Sú to enhancery, začiatok replikačného elementu, celá sekvencia intrónu, obsahujúca donorové a akceptorové vystrihovacie miesto, signálna peptidová sekvencia, sekvencia pre väzbu ribozómu a polyadenylačná sekvencia, polylinkérová oblasť pre inzerciu nukleovej kyseliny kódujúcej NAT a selekčný markér.

Každý z týchto elementov je diskutovaný ďalej.

Nie nutne, môže vektor tiež obsahovať tag sekvenciu, napr. oligonukleotidovú sekvenciu lokalizovanú na 5'alebo 3'koncu polypetid- kódujúci sekvenciu, ktorá kóduje poly His (ako hexaHis) alebo krátke imunogénne sekvencie ( ako c-myc alebo hemaglutinínový epiptop, pre ktoré sú protilátky, vrátane monoklonálnych protilátok, komerčne dostupné. Tento tag je exprimovaný spoločne s NAT a môže slúžiť ako afinitný

01-852-02-Če tag pre purifikáciu tohto polypeptidú z hostiteľskej bunky. Následne môže byť tag odstránený z purifikovaného polypeptidú rôznymi spôsobmi, napríklad použitím selektívnej peptidázy.

5' hraničná sekvencia môže byť v prírode sa vyskytujúca sekvencia, alebo môže byť homológna (napr. z rovnakého druhu alebo rodu ako hostitelská bunka), heterogénna (napr. z iného druhu alebo rodu, ako je hostitelská bunka), hybridná (napr. kombinácia 5' hraničná sekvencia z viacej ako jedného druhu) alebo syntetická.

Zdrojom môže byť akýkoľvek prokaryotický alebo eukaryotický organizmus, alebo akákoľvek rastlina, za predpokladu, že 5' hraničná sekvencia je funkčná, a môže byť aktivovaný systémom hostiteľskej bunky.

Začiatok replikácie je väčšinou súčasťou prokaryotických expresných vektorov, ktoré sú komerčne dostupné, a napomáha replikácii vektora v hostiteľskej bunke. Amplifikácia vektora v určitom počtu kópií, môže byť v niektorých prípadoch dôležitá pre optimálnu expresiu NATu. Akonáhle vybraný vektor neobsahuje začiatok replikácie, môže byť na základe známej sekvencie chemicky syntetizovaný a následne vložený do vektora.

Prvok konca transkripcie je typicky lokalizovaný na 3'konci polypeptidovej kódujúcej sekvencie a slúži k ukončeniu transkripcie mRNA. Terrainačný prvok v prokaryotických bunkách je väčšinou G-C bohatý fragment nasledovaný polyT sekvenciou. Tento prvok je lahko klonovateľný z knižnice alebo komerčne dostupný ako súčasť vektora, a tiež môže byť pripravený metódami syntézy nukleových kyselín.

01-852-02-Če

Gén pre selekčný markér kóduje proteín nezbytný pre prežitie a rast hostiteľskej bunky na selektívnom kultivačnom médiu. Typický selekčný markérový gén kóduje proteíny, ktoré (a) prepožičiavajú rezistenciu na antibiotiká alebo na iné toxíny, napríklad, ampicilín, tetracyklín alebo kanamycín v prokaryotických hostiteľských bunkách, zeocín v kvasinkách a neomycín v cicavčích hostiteľských bunkách; (b) doplnok auxotrofickej deficiencie buniek; alebo (c) doplnok kritických živín nedostupných z komplexného média. Preferované selekčné markéry používané pri prokaryotickej expresii sú gény pre rezistenciu na kanamycín, ampicilín a tetracyklín.

Ribozomálny väzobný prvok, bežne nazývaný Shine-Dalgarno sekvencia (u prokaryotov) alebo Kozák sekvencia (pre eukaryoty), je nezbytný pre iniciáciu translácie mRNA. Tento prvok je typicky lokalizovaný na 3' konci od promótora a na 5'konci od kódujúcej sekvencie polypeptidu, ktorý je syntetizovaný.

Shine-Dalgarno sekvencia je variabilná, ale typicky obsahuje polypurín (napr. vysoký obsah A-G). Mnoho ShineDalgarno sekvencií bolo identifikované, každá môže byť lahko syntetizovaná pomocou metód, ktoré boli popísané a použité v prokaryotickom vektore.

Kozák sekvencia zahrnuje sekvencie bezprostredne pred a za iniciačným kodónom.

Preferovaná Kozák sekvencia je tá, ktorá je asociovaná s vysokou účinnosťou s iniciáciou translácie v AUG štart kodóne.

V tých prípadoch, kedy je žiadúce, aby NAT polypeptid bol

01-852-02-Če sekretovaný z hostiteľskej bunky, môže byť signálna sekvencia použitá k nasmerovaniu polypeptidú von z bunky, v ktorej bol syntetizovaný. Signálna sekvencia je umiestnená v kódujúcej oblasti sekvencie nukleovej kyseliny, alebo priamo na 5' konci kódujúcej oblasti. Veľa signálnych sekvencii bolo identifikované a akákoľvek z nich funguje vo vybranej hostiteľskej bunke a môžu tu byť použité. Teda, signálna sekvencia môže byť homológna alebo heterológna s polypeptidom.

Naviac signálna sekvencia môže byť chemicky syntetizovaná za použitia metód popísaných vyššie.

Keď je vektor skonštruovaný a nukleová kyselina bola vložená do správneho miesta vo vektore, celý vektor môže byť vložený do vhodnej hostiteľskej bunky a ďalej amplifikovaný a/alebo polypeptid exprimovaný.

Ako už bolo spomínané, hostiteľské bunky môžu byť prokaryotické (ako E.coli) alebo eukaryotické (ako kvasinkové bunky, alebo hmyzie alebo bunky stavovcov). Hostiteľská bunka, nech už je to kvasinka alebo iný hostiteľ, za vhodných podmienok môže syntetizovať NAT, ktorý môže byť neskoršie pozbieraný z kultivačného média (ako náhle je hostitelskou bunkou sekretovaný do média), alebo priamo z hostiteľských buniek, ktoré ho produkujú (pokiaľ nie je sekretovaný). Po zberu NAT polypeptidú môže byť purifikovaný použitím metód, ako je molekulárna sieťová chromatografia, afinitná chromatografia a podobné.

Výber hostiteľskej bunky bude z velkej miery závisieť od spôsobu, akým je bunka schopná zbaliť NAT do jeho natívnej sekundárnej a terciálnej štruktúry (napr. správna orientácia di-sulfidických mostíkov, apod.), aktívny. Napriek tomu, dokonca tak aby bol biologicky keď hostiteľská bunka

01-852-02-Če nesyntetizuje biologicky aktívny materiál, môže byť zbalený po syntéze za použitia vhodných chemických podmienok, takých, ktoré sú známe skúseným chemikom. V tomto prípade, môže byť správne zbalenie” odvodené z faktu, že materiál je biologicky aktívny.

Vhodné hostitelské bunky, alebo tkanivové kultúry môžu byť cicavčie bunky, ako napríklad bunky z vaječníka čínskeho škrečka (CHO-Chinese hamster ovary cells) alebo 3T3 bunky. Vhodné cicavčie hostitelské bunky a metódy transformácie, kultivácie, množenia, screeningu, a výroby produktu a jeho purifikácie sú obecne známe.

Ďalšie vhodné cicavčie bunkové kultúry sú opičie COS-1 a COS-7 bunkové línie a CV-1 bunková línia. Ďalšie prípadné cicavčie hostitelské bunky sú bunková línia primátov a hlodavcov, vrátane transformovaných bunkových línií. Vhodné sú tiež normálne diploidné bunky, bunkové druhy odvodené od in vitro kultivovaných primárnych tkanivových línií, rovnako ako primárne explantáty. Kandidátne bunky by mali byť génotypovo deficitné v selekčnom géne, alebo by mali obsahovať dominantne pôsobiaci selekčný gén.

Avšak aj ďalšie cicavčie bunkové . línie je možné použiť, HeLa, myšacie L-929 bunky, 3T3 bunky odvodené od Swiss, Balb-c alebo NIH myšacích, BHK alebo HaK bunkové línie zo škrečka.

Užitočné sú tiež baktérie ako hostitelské bunky. Napríklad rôzne druhy E.Coli. (napr. HB101, DH5a, DH10 a MC1061) sú dobre známe ako hostitelské bunky používané v biotechnológii.

Rôzne druhy B.subtilis, Pseudomonas druhy, iné druhy

Bacillus, Streptomyces a im podobné môžu byť tiež použité.

Naviac veľa druhov kvasinkových buniek je tiež použiteľných

01-852-02-Če ako hostiteľské bunky pre expresiu polypeptidu prezentovaného v tomto vynáleze. Tiež hmyzie bunky môžu byť použité ako hostiteľské bunky. Popísané napríklad v Miller et al., Genetic Engineering,, Volume 8, strany 277-298 (1986).

. Inzercia (tiež nazývaná ako transformácia alebo transfekcia) vektora do vybranej hostiteľskej bunky môže byť uskutočnená pomocou kalcium fosfátu, elektroporáciou, mikroinjekciou, lipofekciou alebo DEAEdextránom.

Vybraná metóda musí funkčne korelovať s použitou hostiteľskou bunkou. Tieto a iné vhodné metódy sú známe skúseným chemikom a popísané hocikde (napr. v Sambrook et al.)

Hostiteľské bunky obsahujúci vektor môžu byť kultivované vo štandardnom médiu. Médium väčšinou obsahuje všetky nezbytné živiny pre rast a prežitie buniek.

Vhodné médiá pre kultiváciu E.coli sú napríklad Luria Broth (LB) a/alebo Terrific Broth (TB). Vhodné médiá pre kultiváciu eukaryotických buniek sú RPMI 1640, MEM, ĎMEM a všetky, ktoré môžu byť doplnené sérom a/alebo rastovými faktormi, ktoré sú nezbytné pre kultiváciu danej bunkovej línie. Vhodné médium pre kultiváciu hmyzích buniek je Graceovo médium doplnené, ak je to nezbytné, yestolátom, hydrolyzátom laktoalbumínu a/alebo fetálnym teľacím sérom.

Antibiotiká alebo iné zlúčeniny používané pre selektívny rast transformovaných buniek môžu byť pridané ako doplnok do média. Zlúčenina, ktorá je použitá pre selekciu, je vybraná podľa selekčného markéra, ktorý je prítomný v plazmidu, ktorým bola hostiteľská bunka transformovaná. Napríklad, keď je selekčný markér rezistencie na kanamycín, tak sa kanamycín pridáva do kultivačného média.

01-852-02-Če

Množstvo NATu vyprodukovaného hostiteľskou bunkou sa vyhodnocuje metódami bežne známymi.

Sú to metódy ako Western blot , SDS-polyakrylamidová gélová elektroforéza, nedenaturujúca gélová elektroforéza, HPLC, imunoprecipitácia, a/alebo stanovenie aktivity ako stanovenie gélového väzobného DNA posunu.

Akonáhle je NAT sekretovaný z hostiteľských buniek (okrem gram negatívnych baktérií), väčšina proteínu sa nachádza v médiu. Akonáhle je NAT sekretovaný z gram-negatívnych baktérií, určitá časť sa nájde v periplazme.

Akonáhle nie je NAT sekretovaný nachádza sa v cytoplazme.

V prípade intracelulárneho NATu sa bunky mechanicky rozbijú. Akonáhle je NAT lokalizovaný v periplazme, mechanické rozbitie alebo osmotická úprava môžu byť použité k uvoľneniu periplazmatického obsahu do pufrovaného roztoku. NAT je potom izolovaný priamo z roztoku. Vlastná izolácia z roztoku môže byť uskutočnená rôznymi technikami. Akonáhle je NAT syntetizovaný, tak obsahuje tzn. TAG , napr. hexa-histidín, alebo iný malý peptid buď karboxyl alebo amino koniec, v podstate môže byť purifikovaný v jednom kroku cez afinitnú kolónovú chromatografiu, kde náplň kolóny je vysoko afinitný k TAGu alebo priamo k polypeptidu (napr. monoklonálna protilátka).

Napríklad poly-histidín sa viaže s vysokou afinitou a špecificky k niklovej afinitnej kolóne (napr. Qiagen niklová kolóna), ktorá môže byť použitá k purifikácii (napríklad v

Ausubel et al., editors, current Protocols in Molecular

Biology).

01-852-02-Če

Na druhej strane, aj keď polypeptid nemá TAG, alebo nie je vhodná protilátka, iné dobre známe metódy purifikácie môžu byť použité. Sú to iónovymieňačová chromatografia, fázovo reverzná chromatografia, HPLC, natívna gélová elektroforéza v kombinácii s elúciou z gélu a preparatívna izoelektrická fokusácia (Isoprime prístroj/technika, Hoefer Scientific). V niektorých prípadoch dve alebo i viacej týchto technik môže byť skombinované, aby sa docielilo vyššej čistoty.

Pre produkciu NATu sa s výhodou používajú kvasinky, najvýhodnejší je druh Pichia (napr. Pichia pastoris), voči ich vyššej účinnosti pri zabaiovaní polypeptidu do pôvodnej štruktúry, v zrovnaní s bakteriálnymi bunkami, napr. E.coli. Vhodné rekombinantné metódy pre expresiu v kvasinkách sú popísané v Patente Spojených Štátov 4, 855, 231, (Stroman et al.), 4, 812, 405 (Lair et al.), 4, 818, 700 (Cregg et al.),

4, 885, 242 (Cregg), 4, 837, 148 (Cregg), ktoré sú začlenené vnútri referencií.

Pichia bunky môžu byť tiež použité na expresiu fibrolázy z DNA molekúl, ktoré kódujú túto metaloproteinázu s rovnakou efektivitou a takáto metóda predstavuje ďalšie hľadisko predkladaného vynálezu.

Fibroláza je známa metaloproteináza, ktorá bola popísaná vo vedeckej a patentovej literatúre, viď. Randolph et al., a Európska patentová žiadosť č. 0 323 722, citovaná vyššie.

Väčšinou je exprimovaná fibroláza o SEQ ID NO: 5, ktorá je kódovaná cDNA molekulou SEQ ID NO: 6 (alebo variantmi, ktoré kódujú rovnakú aminokyselinovú sekvenciu). Expresia fibrolázy v takom to systéme väčšinou naviac, okrem maturovaného polypeptidu (nukleotidy 784-1392), zahrnuje DNA molekulu o SEQ ID NO: 7, ktorá kóduje prepo sekvenciu (nukleotidy 1-783).

01-852-02-Ce

Chemicky modifikované varianty NATu, v ktorých je polypeptid naviazaný na polymér alebo inú molekulu, aby vytvoril derivát, preto aby modifikoval vlastnosti, sú tiež zahrnuté v rámci tohto predkladaného vynálezu.

Výhodné, hlavne pre ľudské liečebné účely, je derivatizovať NAT tak, že je pripojená jedna alebo viacej chemických molekúl na molekulu polypeptidu. Tieto molekuly môžu byť rôzne vo vode rozpustné polyméry. Polymér musí byť vo vode rozpustný, pretože NAT, ku ktorému je pripojený vo vode , ako vo fyziologickom prostredí rozpustný. Vo vode rozpustné polyméry môžu byť vybrané zo skupín, ktoré zostávajú, napríklad, z polyetylén-glykolu, kopolymérov etylénglykol/propylén-glykolu, karboxy-metyl-celulózy, dextránu, polyvinyl-alkoholu, polyvinyl pyrolidónu, poly-1,3-dioxalánu, poly-1,3,6-trioxánu, etylén/anhydridu kyseliny maleínovej kopolyméru polyamino kyseliny (buď homopolyméry, alebo náhodné či nenáhodné kopolyméry (viď. Ďalej u fúznych molekúl) a dextránu alebo poly (n-vinylpyrolidón)polyetylén-glykolu, homopolymérov polypropylénglykolu, kopolymérov polypropylénu oxid/etylén oxidu, polyoxyetylovaných polyolov, polystyrénmaleátu a polyvinyl-alkoholu.

Polyetylén-glykol-propión-aldehyd je vhodný pre priemyslovú výrobu vďaky svojej stabilite vo vode.

Polymér môže mať akúkoľvek molekulárnu hmotnosť a môže byť rozvetvený alebo nerozvetvený. Pre polyetylén glykol je preferovaná molekulárna hmotnosť medzi 2 kilodaltonmi (kDa) a okolo 100 kDa (termín okolo znamená, že pri príprave polyetylénglykolu niektoré molekuly viažu viacej, iné o niečo menej ako je stanovená molekulárna hmotnosť), čo ulahčí zachádzanie a priemyslovú výrobu. Iné veľkosti môžu byť

01-852-02-Če použité v závislosti od žiadaného terapeutického profilu (napr. požadovaná dĺžka doby uvoľňovania, účinky na biologickú aktivitu, akonáhle sú nejaké, uľahčenie manipulácie, stupeň, alebo nedostatok antigenicity alebo iných známych efektov polyetylénglykolu na terapeutický proteín.

Počet pripojených molekúl polyméru môže byť rôzny a skúsený chemik je schopný zistiť účinok na funkciu. Môže byť použitá derivatizácia, ako mono-, tak aj di-, tri-, tetraalebo aj kombinovaná, s rovnakou alebo inou chemickou molekulou (napr. polymérom o inej molekulovej hmotnosti, ako je polyetylénglykol).

Pomer molekúl polyméru a molekúl NAT polypeptidu kolísa, rovnako ako kolísa ich koncentrácia v reakčnej zmesi. Obecne, je optimálny pomer (vo zmysle efektivity reakcie tu nie je prebytok nezreagovaného polypeptidu alebo polyméru) určený faktormi ako je požadovaný stupeň derivatizácie (napr. mono-, di-, tri-, atď.), molekulárna hmotnosť vybraného polyméru, akonáhle je polymér rozvetvený či nie a reakčné podmienky.

Chemické skupiny by mali byt pripojené k NAT s ohľadom na ich účinok na funkciu alebo antigénne domény polypeptidu. Jestvuje veľký počet metód pre vytvorenie väzby, napríklad viď, E- 0401 384 (spojenie PEG k G-CSF) a Malik et al., Experimental Hematoloqy, Volume 20, strany 1028-1035 (1992) (popisujúce pegyláciu GM-CSF pomocou chloridu tresylového). Pre ilustráciu, polyetylénglykol môže byť kovalentne naviazaný cez reaktívne skupiny aminokyselinových zvyškov, ako voľná amino alebo karboxylová skupina. Reaktívne skupiny sú tie, ku ktorým sa aktivovaná molekula polyetylénglykolu (alebo iné chemické skupiny) môže viazať.

01-852-02-Če

Aminokyselinové zvyšky, ktoré majú volné aminoskupiny môžu obsahovať lyzínové zvyšky a N-koncový aminokyselinový zvyšok.

Tie ktoré majú voľné karboxylové skupiny, môžu obsahovať zvyšky kyseliny asparágovej a glutámovej a C-koncový aminokyselinový zvyšok. Sulfohydrylové skupiny môžu byť tiež použité ako reaktívne skupiny pre väzbu molekuly polyetylénglykolu alebo iných chemických skupín. V priemyslovej výrobe je preferovaná väzba aminokyseliny ako je N-koniec alebo lyžínová skupina.

Je potreba sa vyvarovať väzby na reaktívne skupiny, ktoré sú dôležité pre väzbu receptora, akonáhle je naviazanie na receptor požadované.

N-koncová chemicky modifikovaná derivatizácia môže byť tiež požadovaná.. Pre ilustráciu, rôzne molekuly polyetylénglykolu môžu byť vybrané (podlá molekulovej hmotnosti, rozvetvenia, atď.), rôzny pomer molekúl polyetylénglykolu s molekulou polypeptidu v reakčnej zmesi, typy pegylácia a metódy pre získanie vybraného N-koncového pegylatovaného NATu.

Metódou k získaniu pegylatovaného N-konca (napr. akonáhle je nezbytné oddelenie týchto zlúčenín od iných monopegylatovaných molekúl) môže byť purifikácia N-koncovo pegylatovaného materiálu z populácie pegylatovaných NAT molekúl. Selektívna N-koncová chemická modifikácia môže byť dosiahnutá pomocou redukujúcej alkylácie, ktorá využíva rozdielne reaktivity rôznych typov primárnych amino skupín (lyzín verzus N-koniec), ktoré sú k dispozícii pre derivatizácii. Viď PCT žiadosť WO 96/11953, publikovanej 25. augusta 1996.

01-852-02-Če

Za vhodných reakčných podmienok je dosiahnutá podstatne selektívna derivatizácia NATu na N-konci s karboxylovou skupinou, ktorá obsahuje polymér. Napríklad sa môže použiť selektívna N-koncová pegylácia NATu pri pH, ktoré potom zvýhodňuje rozdiely medzi ε-amino skupiny lyzínových zvyškov a α-amino skupiny N-konca polypeptidú. Vďaka tejto selektívnej derivatizácii je pripojenie polyméru k polypeptidú kontrolované: konjugácia s polymérom sa uskutočňuje prevážne na N-konci polypeptidú a nevyskytuje sa žiadna významná modifikácia iných reaktívnych skupín, ako je postranný reťazec amino skupín lyzínu. Pri použití redukujúcej alkylácie môže byť použitie akýkoľvek z polymérov popísaných vyššie, a mal by mať jedinú reaktívnu aldehydovú skupinu pre spojenie s polypeptidom.

Polyetylénglykol propionaldehyd, obsahujúci jediný reaktívny aldehyd, môže byť použitý.

NAT alebo chemicky modifikované deriváty v súhlase s vynálezom môžu byť navrhnuté k in vivo aplikácii, najlepšie cez intratrombus. (napr. cez lokalizované podanie priamo na miesto zrazeniny v cieve, napr. cez katéter). Systémové podávanie nie je bežne preferované, voči pravdepodobnosti, že prirodzený a2 makroglobulín v celkovom krvnom obehu môže vytvoriť komplex s NAT, a tak zabráni interakcii s fibrínom alebo fibrinogénom a zníži rozpustenie zrazeniny. Hoci môžu byť prípady, kedy väčšie množstvo NATu môže byť aplikované, čo prevýši krvné hladiny a2 makroglobulínu, a teda umožní systémové podávanie.

Obecne, v rámci vynálezu farmaceutická zlúčenina zahrnuje efektívne množstvo NATu spoločne s farmaceutický prijateľnými riedidlami, konzervačnými činidlami, rozpúšťadlami, emulgátormi, adjuvans, a/alebo nosičmi. Efektívnym množstvom

01-852-02-Ce je spomínané množstvo dostatočné k produkcii meratelného biologického vplyvu (napr. trombolyticky efektívne množstvo, ktoré spôsobí rozpustenie krvnej zrazeniny alebo vznikajúcej zrazeniny , lieči).

Typicky, NAT je vo vysoko purifikovanej forme a akákoľvek farmaceutická zlúčenina, ktorá bude použitá ako spojivo, bude pred použitím normálne sterilizovaná, napr. filtráciou cez sterilné filtračné membrány.

Skúsený farmaceut bude schopný zistiť efektívne dávky podávaním a pozorovaním požadovaného terapeutického vplyvu. Určité vplyvy dávok budú závisiet od danej choroby alebo stavu, ktorý bude liečený, rovnako ako od veku a od celkového zdravotného stavu príjemca.· a ktorý môže byť určený štandardnými klinickými postupmi.

Kde je to možné, bude vhodné stanoviť krivku farmaceutického zloženia odozvy na dávku, najskôr in vitro ako bio-test a potom vo vhodnom zvieracom modelu (in vivo), pred tým, ako sa začne s testovaním na ľuďoch. Skúsený praktický lekár, po zvážení liečebných súvislostí, typu liečenej choroby a iných vhodných faktorov bude schopný zistiť správne dávkovanie bez prílišného úsilia. Typicky, praktický lekár bude podávať zlúčeninu NAT dokiaľ nebude dosiahnuté dávky, ktorá spôsobí požadovaný efekt (napr. rozpustenie krvnej zrazeniny). Zlúčenina môže byť podávaná ako jednorázová dávka, alebo vo dvoch a viacej dávkach (ktoré môžu ale nemusia obsahovať rovnaké množstvo polypeptidov) v určitých časoch, alebo kontinuálne.

NAT môže byť tiež použitý pre prípravu protilátok podľa štandardných metód. Protilátky môžu byť polyklonálne, monoklonálne, rekombinantná, chimérické, jednoreťazcové

01-852-02-Če a/alebo bi-špecifické, apod. Aby sa vylepšila pravdepodobnosť produkcie imunitnej odpovedi, aminokyselinová sekvencia NATu môže byť analyzovaná, aby sa určila časť molekuly, ktorá by mohla byť spojená so zvýšenou imunogenitou. Napríklad, aminokyselinová sekvencia môže byť podrobená počítačovej analýze, aby sa určili povrchové epitopy, podľa metód Hopa a Wooda, v Proceedings of the National Academy of Science USA, Volume 78, strany 3824-3828 (1981) .

Rôzne známe postupy môžu byť použité pre produkciu polyklonálnych protilátok, ktoré rozoznajú epitopy NATu. Ako hostiteľ na produkcii protilátky môžu byt imunizované rôzne zvieratá (bez obmedzenia králiky, myši, krysy, atď.)

Rôzne adjuvans môžu byť použité k zvýšeniu imunologickej odpovedi, v závislosti od hostiteľského druhu, vrátane a bez obmedzenia Freundovo adjuvans, minerálne gély ako je hydroxid hlinitý, (alum), povrchovo aktívne látky, ako je lyzolecitín, plurónové polyoly, polyanióny, peptidy, olejové emulzie, hemocyanín z prílipky, dinitrofenol a potencionálne užitočné ľudské adjuvans, ako je Bacilus Calmette-Guerin a Corynebacterium parvum.

Pre prípravu monoklonálnych protilátok účinných na NAT môže byť použitá akákoľvek technika, ktorá umožňuje prípravu molekúl protilátky v bunkovej línii. Napríklad, hybridómová metóda, pôvodne vyvinutá Kohlerom a Milsteinom, ktorá je popísaná v Náture, Volume 256, strany 495-497 (1975), rovnako ako trióma technika, metodika hybridómov ľudských B-buniek popísaná Rozborom et al., v Immunology Today, Volume 4, strana 72 (1983) a EBV-hybridomová metodika produkcie monoklonálnych protilátok popísaná Coleom et al. v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,. Inc., strany 77-96

Liss,. Inc.,

01-852-02-Ce (1985).Všetky tieto metódy sú použitelné pre prípravu monoklonálnych protilátok v súlade s týmto vynálezom.

Protilátky tohto vynálezu môžu byť použité k liečebným účelom, ako je väzba a tým neutralizácia alebo inhibícia prebytočného množstva NATu in vivo po podaní. Protilátky môžu byť ďalej použité k diagnostickým účelom, ako treba v označenej forme k detekcii prítomnosti NATu v telových tekutinách, vzorkách tkaniva alebo iných extraktoch, v súhlasu so známymi diagnostickými metódami.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Ďalej je vynález ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi.

Príklad 1

Odvodenie sekvencie NATu

Efektívny spôsob výroby fibrolázy je exprimovať ju ako prefibrolázu, ktorá je štiepatelná proteázou kex-2 na prepo a maturovanú časť. (Získa sa biologicky aktívny materiál (maturovaná fibroláza)).

V tomto usporiadaní, vedie syntéza a procesovanie prefibrolázy k sekrecii maturovanej fibrolázy do kultivačného média. Skutočná sekvencia v štiepatelným mieste je (...TKRIQQRF...) .

Kex-2 je endoproteáza, ktorá štiepi za dvomi susednými bázickými aminokyselinami, v tomto prípade lyzínom (K)arginínom (R). Zrelá fibroláza exprimovaná z DNA má, už vyššie

01-852-02-Če spomínaný, N-koncový glutamínu (Q) , ktorý bol pozmenený deamináciou a cyklizáciou na pyroglutámovú kyselinu (E) . Táto chemická modifikácia bola považovaná za nežiadúcu, pretože peptídy s N-koncovým cyklickým glutamínom (pyroglutámová kyselina) zlyhávali pri reakcii v Edmanovom odbúravaní aminokyselinovom sekvenovaní. Teda boli oba glutamínmi (Q) na N-konci v sekvencií zrelej fibrolázy odstránené, a N-koncom sa stal arginín (R) . Pretože kex-2 štiepi po dvoch susedných bázických aminokyselinách, ako bolo spomínané, očakávalo sa, že sekvencia (...KRRF...), ukáže nejednoznačné miesto pre štiepenie kex-2.

Preto bol N-koncový arginín (R ) (podčiarknutý) nahradený serínom (S) s výslednou sekvenciou (...KRSF...). Serín bol vybraný na základe potreby vloženia aminokyseliny, ktorá uľahčí štiepenie kex-2, keď sa vyskytne na C-konci miesta hydrolýzi. Rholám et al., European Journal of biochemistry, Volume 227, strany 707-714 (1995) .

DNA sekvencia preprofibrolázy bola modifikovaná metódou cielenej mutagenézy na N-konci kódujúcej sekvencie matúrovanéj fibrolázy, tak aby sa nahradil kodón pre QQR kodónom pre S”, použitím štandardného PCR protokolu. Výsledkom je prepoNAT o aminokyselinovej sekvencií SEQ ID NO:3. Oligonukleotidy použité ako priméry pre PCR reakcie sú spísané ďalej a ich homológia s cieľovou sekvenciou je tiež naznačená. Na začiatku boli uskutočnené 2 PCR reakcie za použitia oligonukleotidov 1 a 4 v jednom páre a oligonukleotidy 2 a 3 v druhom páre primérov. Templátom bola DNA. PCR produkty týchto reakcií (601 a 815 nukleotidov dlhé) boli následne prečistené pomocou agarózovej gélovej elektroforézy a ďalej slúžili ako templát pre druhé kolo PCR za použitia oligonukleotidov 1 a 2 ako primérov. Tento konečný PCR produkt (1372 nukleotidov dlhý) bol štiepený reštrikčnými endonukleázami Xhol a Nôti.

01-852-02-Ce

Rozštiepená zmes bola zbavená proteínu pomocou fenol/chloroformu a DNA vyzrážaná. Časť tejto znovu získanej DNA bola vložená do plazmidu pPICZa (Invitrogen, Carlsbad, CA, Katalógové č. VI95-20), ktorý bol zhodne naštiepený reštrikčnými endonukleázami Xhol a Nôti, enzymaticky defosforylovaný a zbavený proteínu fenol/chloroformom.

Všetky ďalšie kroky boli uskutočnené podľa príručky Expresného Kitu- Invitrogen Pichia (Invitrogen Corp., katalógové ligačnej reakcie elektroporácie a zeocínom. Plazmid boli tie bol

DNA

č. K1710-01) . Produkty transformované do E.coli pomocou selektované na pevnom médiu s vyizolovaný a sekvencia prefibrolázy bola overená sekvenovaním. Plazmid bol linearizovaný štiepením reštrikčnou endonukleázou Pmel a ďalej transformovaný do Pichia pastoris G5115his+. Rod GS115 je bežne his-, his+ genotyp bol obnovený transformáciou DNA, ktorá kóduje divokú (wild-type) verziu génu his4. Alternatívne môže byť his+ druh získaný komerčne od Invitrogenu (X-33 tkanivová kultúra, katalógové č. C180-00). Úspešne integrované komplexy boli selektované ako kolónia rezistentná na zeocín. Kandidátne klony boli indukované kultivačným médiom, ktoré obsahovali metanol a kultúra bola testovaná na produkciu NATu na 4- 20 % PAGE, farbením

Coomassie.

Pre cielenú PCR mutagenézu boli použité nasledujúce oligonukleotidy:

Oligo 1 5'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3' (SEQ ID NO: 8)

Oligo 2 5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3' (SEQ ID NO: 9)

Oligo 3 (SEQ ID NO: 10)

5' -TCCAATTAAACTTGACTAAGAGTCTTCCCACAAAGATACGTAC-3'

01-852-02-Če

Oligo 4 (SEQ IĎ NO: 11)

5'-GTACGTATCTTTGTGGGAAAGATCTCTTAGTCAAGTTTAATTGG-3'

Umiestnenie týchto oligonukleotidov je naznačené nižšie na dvojvláknovej sekvencií DNA (SEQ ID NO: 12 kódujúcej čiže sens vlákno, SEQ ID NO: 13, komplementárne čiže antisens vlákno) a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia (SEQ ID NO:14) fibrolázy (vrátane prepo úseku). N-koncové a C-koncovej oblasti maturovanej fibrolázy sú označené podčiarknutím koncovej aminokyselinovej sekvencie (QQRF a LNKP). N-koncová oblasť (QQRF) je modifikovaná (nahradenie S za QQF). V oligonukleotidoch 3 a 4, značí vložené pomlčky miesto, kde boli vynechané kodóny kódujúce aminokyseliny QQ na N-konci fibrolázy.

01-852-02-Ce

ATGAGATTTCČTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT

---------,+-----.----+---------+---------+----------₊---------₊

TACTCTAAAGGAAGTTAAAAATGACGACAAAAŤAAGCGTCGTAGGAdGCGTAATCGACGA

M R F P S IFTAV .LFAASSALAA

CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT

---------+---------+--------_+---------:+----------+---------+

GGTCAGTTGTGATGTTGTCTTCTACTTTGCCGTGTTTAAGGCCGACTTCGACAGTAGCCA

PVNTTTEDETAQIP AEAVIG

TACTCAGATTTÁGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT

---------₊---------+---------+---------+---------+----:-----+

ATGAGTCTAAATCTTCCCCTAAAGCTACAACGACAAAACGGTAAAAGGTTGTCGTGTTTA

YSDLEGDFDVAVL-PFSNSTN

Oligo 1 5' -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'

AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA

---------+---------+---------+---------+--------+---------+

TTGCCCAATAACAAATATTTATGATGATAACGGTCGTAACGACGATTTCTTCTTCCCCAT

NGLLFINTTIASIAAK EEGV.

01-852-02-Ce

Xhol

I .

tctctcgagaaaagagaggctgaagcttcttctattatcttggaatctggtaacgttaac

---------+---------+---------+---------+---------+---------+

AGAGÁGCTCTTTTCTCTCCGACTTCGAAGAAGATAATAGAACCTTAGACCATTGCAATTG slekreaeassiile'sgnvn

GATTACGAAGTTGTTTATCCAAGAAAGGTCACTCCAGTTCCTAGGGGTGCTGTTCAACCA

---------+---------+---------+----------h---------+---------₊

CTAATGCTTCAACAAATÁGGTTCTTTCCAGTGAGGTCAAGGATCCCCACGACAAGTTGGT

DYEVVYPRK VTPVPRGAVQP

AAGTACGAAGATGCCATGCAATACGAATTCAAGGTTAACAGTGAACCAGTTGTCTTGCAC

-------·,—H---------------- + ----------·-------^; ►---------+

TTCATGCTTCTACGGTACGTTATGCTTAAGTTCCAATTGTCACTTGGTCAACAGAACGTG

K YEDAMQYEFKVNS E.P V V L H

TTGGAAAAAAACAAAGGTTTGTTCTCTGAAGATTACTCŤGAAACTCATTACTCCCCAGAT

---------+---------+----;-----+—--------+---------+

AACCTTTTTTTGTTTCCAAACAAGAGACTTCTAATGAGACTTTGAGTAATGAGGGGTCTA

LEKNKGLFSE DYSET.HYSPD

GGTAGAGAAATTACTACTTAGCCATTGGGTGAAGATCACTGTTACTACCATGGTAGAATC

---------+---------+----------+----------+---------+---------+

CCATCTCTTTAATGATGAATGGGTAACCCACTTCTAGTGACAATGATGGTACCATCTTAG

GREX T TYPLGEDH C YYHGRI

GAAAACGATGCTGACTCCACTGCTTCTATCTCTGCTTX3TAACGGTTTGAAGGGTCATTTC

---------+---------+---------+---------+--------+---------+

CTTTTGCTACGACTGAGGTGACGAAGATAGAGACGAACATTGCCAAACTTCCCAGTAAAG

ENDAD STASI SACNGLKGHF

AAGTTGCAAGGTGAAATCTACTTCäTTGAACCATTGGAATTGTCCGACTCTGAAGCCCAT _________+---------+---------+---------+---------+---------+

TTCAACGTTCCACTTTACATGAACTAÁCTTGGTAACCTTAACAGGCTGAGACTTCGGGTA klqgemylieplelsdseah

01-852-02-Ce

GCTGTCTACAAGTACGAAAACGTCGAAAAGGAAGATGAAGCCCCAAAGATGTGTGGTGTT

---------_----------+---------+---------+---------₊---------₊

CGACAGATGTTCATGCTTTTGCAGCTTTTCCTTCTACTTCGGGGTTTCTACACACCACAA

AVYXYENVEXEDEAPXMCGV

Oligo 3 5 '-TCCAATTAAACTTGACTAAG

ACCCAAAACTGGGAATCATATGAACCAATCAAGAAGGCCTTCCAATTAAACTTGACTAAG

---------+---------+---------+---------₊---------+---------+

TGGGTTTTGACCCTTAGTATACTTGGTTAGTTCTTCCGGAAGGTTAATTTGAACTGATTC

Oligo 4 3 ' -GGTTAATTTGAACTGATTC

TQNWESYEPIKKAFQLNLTK

AGA-----TCTTTCCCACAAAGATACGTAC-3 '

AGACAACAAAGATTCCCACAAAGATACGTACAGCTGGTTATCGTTGCTGACCACCGTATG ------------------+---------+---------+-------—+---------+

TCTGTTGTTTCTAAGGGTGTTTCTATGCATGTCGACCAATAGCAACGACTGGTGGCATAC TCT------AGAAÄGGGTGTTTCTATGCATG- 5'

R O Q R F PQR YVQLVIVADHRM

AACACTAAATACAACGGTGACTCTGACAAAATCCGTCAATGGGTGCACCAAATCGTCAAC

---------₊---------+---------+---------+—,--------+---------+

TTGTGATTTATGTTGCCACTGAGACTGTTTTAGGCAGTTACCCACGTGGTTTAGCAGTTG

NTKYN GDSDKIRQWVHQI VN accattaacgaaatctacagaccactgaacatccaattcacŤttggttggtttggaaatc ________t--------------------+---------+---------»---------+

TGGTAATTGCTTTAGATGTCTGGTGACTTGTAGGTTAAGTGAAACCAACCAAACCTTTAG tineiyrplniqftlvglei

TGGTCCAACCAAGATTTGATCACCGTTACTTCTGTATCCCACGACACTCTGGCATCCTTC

--------------------+----------+---------+----------+---------+ accaggttggttctaaactagtggcaatgaagacatagggtgctgtgagaccgtaggaag

WSNQDLITVTSVSHDTLASF

01-852-02-Če

GGTAACTGGCGTGAAACCGACCTGCTGCGTCGCCAACGTCATGATAACGCTCAACTGCTG

---------+---------+-------------------+---------+---------+

CCATTGACCGCACTTTGGCTGGACGACGCAGCGGTTGCAGTACTATTGCGÄGTTGACGAC

GNW'RETDLLRRQRHDNAQLL

ACCGCTATCGACTTCGACGGTGATACTGTTGGTCTGGCTTACGTTGGTGGCATGTGTCAA

---------+---------+---------+----------h---------+---------₊

TGGCGATAGCTGAAGCTGCCACTATGACAACCAGACCGAATGCAACCACCGTACACAGTT

TAIDFDGDTVGLAYVGGMC Q

CTGAAACATTCTACTGGTGTTATCCAGGACCACTCCGCTATTAACCTGCTGGTTGCTCTG

---------+-------—+---------+---------₊---------₊---------₊

GACTTTGTAAGATGACCACAATAGGTCCTGGTGAGGCGATAATTGGACGACCAACGAGAC

L KHSTGVI QDHSAINLLVAL accatggcacacgaactgggtcataacctgggtatgaaccacgatggcaaccagtgtcac

---------+:---------4--------—4---------4---------4---------4 tggtaccgtgtgcttgacccagtattggacccatacttggtgctaccgttggtcacagtg

TMAHELGHN LGMNH.. D G N Q C H tgcggtgcaaactcctgtgttatggctgctatgctgtccgatcaaccatccaaactgttc

---------4----------+ ---------4---------4---------4---------4 acgccacgtttgaggacacaataccgacgatacgacaggctagttggtaggtttgacaag

C G A N S C V M A ’ A M L S D Q P S K L F

TCCGACTGCTCTAAGAAAGACTACCAGACCTTCCTGACCGTTAACAACCCGCAGTGTATC

---------4---------4--------4---------4---------4---------4

AGGCTGACGAGATTCTTTCTGATGGTCTGGAAGGACTČiGCAATTGTTGGGCGTCACATAG

SD CSKKDYQT FLTVNNPQC I

Nôti

I

CTGAACAAACCGTAAGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGAT

---------4---------4---------4-------------------+---------f

GACTTGTTTGGCATTCGCCGGCGGTCGAAAGATCTTGTTTTTGAGTAGAGTCTTCTCCTA

L N K P * AA AS.FLEQKLISEED

01-852-02-Ce

CTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGCCTTAGACATGAC

---------+---------+---------+-------------------+---------₊

GACTTATCGCGGCAGCTGGTAGTAGTAGTAGTAGTAACTCAAACATCGGAATCTGTACTG

LNSAVDHHHHHH*VCSLRHD tgttcctcagttcaagttgggcaCttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaag

---------+---------+---------+---------H--------------------ACAAGGAGTCAAGTTCAACCCGTGAATGCTCTTCTGGCCAGAACGATCTAAGATTAGTTC

CSSVQ. VGHLR EDRSC* ILIK

AGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTrTTTATT

----------------+---------+---------+---------+---------+

TCCTACAGTCTTACGGTAAACGGACTCTCTACGTCCGAAGTAAAAACTATGAAAAAATAA

CCTACAGTCTTACGGTAAACG-5' Oligo 2

R M. S E C HLPERCRLHF*YFFI

01-852-02-Če

Príklad 2

Expresia NATu v Pichla pas t ori s

Pri pokusoch exprimovať DNA NATu v E.coli, veľmi slabé zbalenie do sekundárnej štruktúry a požiadavka na zriedené podmienky znížili efektivitu purifikácie. Tieto a iné úvahy viedli k použitiu druhu kvasiniek Pichia pastoris ako hostiteľskej bunky. Kultúra selektovaných bunkových klonov Pichia pastoris, ktoré boli transfekované cDNA prepo NATu (SEQ ID NO: 4) bola inokulovaná do 500 ml inokulačného rastového média, popísaného tu:

Na 1 liter média

Kvasničný extrakt

Fosforečnan draselný dihydrát

Glukóza

Biotín

Voda

Fosforečná kyselina, 85%

30, 0 g

17,2 g

20,0 g 0, 004 g do 1 litra upraviť pH na 6,00

Transfekované P.pastoris boli inkubované v 30°C v trepačke po dobu 30-32 hodín. Približne 1% (hmotnostné) výslednej kultúry bolo použité ako inokulum do 10-ti litrového fermentora. Fermentor obsahoval sterilné základné soli a glukózu (nižšie). Dvanásť mililitrov na liter PTM4 solí (PTM4 je roztok stopových kovov obsahujúci síran meďný pentahydrát, jodid sodný, síran horečnatý monohydrát, molybdénan sodný dihydrát, kyselinu boritú, chlorid kobaltnatý hexahydrát, chlorid zinočnatý, síran železnatý heptahydrát, d-biotín, kyselinu sírovú a purifikovanú vodu) bolo pridané do litrovej

01-852-02-Ce dávky média po sterilizácii fermentora. Rastová teplota vo fermentore bola 30°C. pH vo fermentore bolo regulované hydroxidom amónnym a kyselinou fosforečnou na hodnotu 6.00.

Zinok zo zinočnatých solí, ktoré boli pridané do média boli inkorporované do NATu ako súčasť štruktúry metaloproteinázy.

Základne soli na litrovú dávku média

Fosforečná kyselina, 85% 26,7 ml

Síran vápenatý 0,93 g

Síran draselný 18,2 g

Síran horečnatý-7 H₂O 14,9 g

Hydroxid draselný 4,13 g

Glukóza 30,0 g

Voda do 1 litra

Kultúra sa nechá rásť, dokial nie je všetka glukóza spotrebovaná (17 až 20 hodín). Potom sa začne so sýtiacou fázou. Sýtiace médium je tvorené glukózou a 12 ml PTM4 solí na 1 liter. Indukcia sýtenia sa zostáva z glukózy, 25% metanolu, a 12 ml PTM4 solí na 1 liter. Pri indukcii je teplota reaktora 20°C. Indukčná fáza trvá 60 až 75 hodín. Upravené médiá boli odpratané a bunkové zvyšky boli vyhodené.

Príklad 3

Purifikácia NATu z Pichia pastoris

Kvasinková živná pôda z Príkladu 2 bola vyčistená a upravené pH na 6,5 a vodivosť 10-20mS/ cm. Živná pôda bola naliata na imobilizovanú kovovú afinitnú živicu, ktorá bola naplnená meďou a ekvilibrovaná fosfátovým pufrom (PBS) < Živica bola opláchnutá v PBS a vymývaná gradientom imidazolu (0-100

01-852-02-Če mM) v PBS. Frakcie, ktoré obsahovali maturovaný NAT (SEQ ID N0:l) boli dané napospol a riedené dokial vodivosť nebola nižšia ako 1,5 mS/cm, pH 6,9. Riedená vzorka bola naliata na SP Sefarózovú živicu (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) , ktorá bola ekvilibrovaná 10 mM 2-(Nmorfolino)etán-sírovou kyselinou (MES). Kolóna bola omytá pomocou MES a eluovaná a vymytá pomocou gradientu NaCl (0500mM) v MES. Frakcie, ktoré obsahovali NAT boli dané dohromady a uschované.

Príklad 4

Trombolýza v akútnej trombóze v krysej krčnici, porovnanie NATu s Urokinázou

Aby sa preukázala biologická aktivita a funkčná jednoznačnosť maturovaného NATu (SEQ ID NO:1) boli uskutočnené farmakologické štúdie na krysách. Anódovým prúdom bolo vytvorené ohniskové poškodenie na jednej krčnici. Toto poškodenie vyvolalo do 15 minút vytvorenie okluzívnej krvnej zrazeniny. Po vytvorení trombu, bola tepna ešte po 30 minút pozorovaná, či je oklúzia krčnice stabilná. Potom bol aplikovaný intravenózne heparin a aspirín, aby sa predišlo šíreniu trombu. Zvieratá boli liečené pomocou intraarteriálnych infúzií testovanej látky. Bol sledovaný prietok krvi krčnicou počas podávania testovaného materiálu, takže úspešné rozpustenie krvnej zrazeniny mohlo byť detekované a tiež mohol byť zaznamenaný čas lýzy. Percentá pokusov, kedy bola zrazenina rozpustená boli zaznamenané a vyrátaný priemer iba u tých, kde bola zrazenina úspešne rozpustená. Pretože je meraný hemoragický potenciál testovanej látky, všetka krv, ktorá bola vylúčená z operačného miesta bola zbieraná gázovými tampónmi. Tampóny boli umiestnené do

01-852-02-Če roztoku detergentu, aby sa rozpustili červené krvinky a množstvo uvoľneného hemoglobínu bolo potom merané spektrofotometricky. Podlá množstva vysušeného hemoglobínu boli vyrátané straty krvi. Dáta získané v testoch sú uvedené v tabulke ďalej.

Tabuľka 1

Výskyt lýzy krvnej zrazeniny, čas za ktorý došlo k rozpusteniu zrazeniny a operačné straty krvi (priemer ± štandardná odchýlka)

VÝSKYT LÝZY	ČAS (min)	KRVNÉ	STRATY (ml)
	(%)
FYZIOLOGICKÝ	0%	NEMERANÉ	0,10	± 0,23
ROZTOK (n=6)	( 0 zo 6)
Urokináza	33%	55,3 ± 15,9	1,06	+ 1,59
25 U/ min	(5 z 15)
(n=15)
Urokináza	86 %	33,5 ± 15,3	1,43	± 1,45
250 U/ml	(13 z 15)
(n=15)
NAT 2mg	78%	6,3 ± 5,8	0,96	± 0,77
(n=14)	(11 zo 14)

Tieto štúdie preukazujú, že NAT je biologicky aktívny na zvieracom modelu v in vivo lýze krvnej zrazeniny.

01-852-02-Če

Ďalej, rozpustenie krvnej zrazeniny bolo dosiahnuté v značne kratšom čase a s menšími stratami krvi z operačného miesta, v porovnaní s urokinázou. Tak profil aktivity NATu môže byť odlíšený od triedy plazminogén - aktivátorov trombolytických činiteľov (reprezentovaných urokinázou), tak že rozpustenie krvnej zrazeniny NATom sa uskutoční rýchlejšie a so zníženými hemoragickými komplikáciami.

Fibrinolytická aktivita NATu je zrovnateľná s firolázou. A naviac, ako bolo spomínané vyššie, stabilita N-konca NATu vedie k väčšej homogenite. koncového produktu pri rekombinantnej expresii, čo je nesporná výhoda (napr. N-koniec sa v čase nemení na zmes rôznych foriem, čo vytvára stabilnejší polypeptid).

01-852-02-Ce

Obrázok 1

MRFPSIFTAV ĽFAASSALAA

YSDLEGDFDV AVLPFSNSTN

SLEKREAEAS SIILESGNVN

KYEDAMQYEF KVNSEPWLH

GREITTYPLG EDHCYYHGRI

KLOGEMYLIE PLELSDSEAH

TQNWESYEPI KKAFQLNLTK

KYNGDSĎKIR QWVHQIVNTI NQDLITVTSV SHDTLASFGN

IDFDGDTVGL AYVGGMCQLK

AHELGHNLGM NHDGNQCHCG

PVNTTTEDET AQIPAEAVIG

NGLLFINTTI ASIAAKEEGV

DYEWYPRKV TPVPRGAVQP

LEKNKGLFSE DYSETHYSPD

ENDADSTASI SACNGLKGHF

AVYKYENVEK EDEAPKMCGV

RSFPQRYVQL VIVADHRMNT NEIYRPLNIQ FTLVGLEIWS WRETDLLRRQ RHDNAQLLTA

HSTGVIQDHS AINLLVALTM

ANSCVMAAML SDQPSKLFSD

CSKKDYQTFL TVNNPQCILN KP

01-852-02-Ce

Zoznam sekvencii <110> Boone, Thomas C.

Li, Huimin Mann, Michael B.

<12O> Fybrinolyticky aktívny polypeptid <130> A-596 <140> 09/411,329 <141> 1999-10-01 <160> 20 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 201 <?12> PRT <213> . , ,

Umelá sekvencia <220>

<223> Popis umelej sekvencie: NAT (analóg fibrolázy z Agkistrodon contortrix)

<400> 1

Tyr Val

Gin Leu Val íle Val Ala Asp His Arg

Ser 1

Phe

Pro

Gin Arg 5

10

15

Met

Asn

Thr

Lys

Tyr

Asn

Gly

Asp

Ser

Asp

Lys

íle

Arg

Gin

Trp

Val

20

25

30

His

Gin

íle

Val

Asn

Thr

íle

Asn

Glu

lle

Tyr

Arg

Pro

Leu

Asn

íle

35

40

45

Gin

Phe

Thr

Leu

Val

Gly

Leu

Glu

íle

Trp

Ser

Asn

Gin

Asp

Leu

íle

50

55

.60

Thr

Val

Thr

Ser

Val

Ser

His

Asp

Thr

Leu

Ala

Ser

Phe.

Gly

Asn

Trp

65

70

75

80

Arg

Glu

Thr

Asp

Leu

Leu

Arg

Arg

Gin

Arg

His

Asp

Asn

Ala

Gin

L>eu

85

90

95

Leu

Thr

Ala

íle

Asp

Phe

Asp

Gly

Asp

Thr

Val

Gly

Leu

Ala

Tyr

Val

100

105

110

Gly Gly

Met

Cys

Gin

Leu

Lys

His

Ser

Thr

Gly

Val

íle

Gin.

Asp

His

115

120

125

Sér

Ala

íle

Asn

Leu

Leu

val

Ala

Leu

Thr

Met

Ala

His

Glu

Leu

Gly

130

135

140

KÍ 3

Asn

Leu

Gly

Met

Asn

His

Asp

Gly

Asn

Gin

Cys

His

Cys

Gly

Ala

145

150

155

160

01-852-02-Ce

Asn

Ser

Cys

Val

Met 165

Ala

Ala

Met

Leu

Ser 170

Asp

Gin

Pro

Ser

Lys 175

Leu

Phe

Ser

Asp

Cys 180

Ser

Lys

Lys

Asp

Tyr 185

Gin

Thr

Phe

Leu

Thr 190

Val

Asn

Asn

Pro

Gin 195

Cys

íle

Leu

Asn

Lys 200

Pro

-

<210» 2 <211» 603 <212» DNA <213* _Umeiá sekvencia <220>

^<223> Popis umelej sekvencie: kódujúci NAT (analóg fibrolázy) <400» 2 tctttcccac aaagatacgt acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaacactaaa 60 tacaacggtg actctgacaa aatccgtcaá tgggtgcacc aáatqgtcaa caccattaac 120 gaaatctaca gaceactgaa catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac 180 caagatttga tcaccgttac ttctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg 240 cgtgaaaccg acctgctgcg tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc 300 gacttcgacg gtgatactgt tggtctggct tacgttggtg gcatgtgtca actgaaacat 360 tctactggtg ttatccagga ccactccgct attaaectgc tggttgctct gaccatggca 420 cacgáactgg gtcataacct gggtatgaac cacgatggca accagtgtca ctgcggtgca 480 aactcctgtg ttatggctgc tatgctgtcc gatcaaccat ccaaactgtt ctccgactgc 540 tctaagaaag actaccagac cttcctgacc gttaacaacc cgcagtgtat cctgaacaaa 600 ccg 603 <210» 3 <211» 462 <212» PRT <213» _Umelá sekvencia <220» <223» Popis umelej sekvencie: Natívny pro-ΝΑΤ (analóg fibrolázy) <400» 3

Met 1

Arg

Phe

Pro

Ser 5

íle

Phe

Thr

Ala

Val 10

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser 15

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala. 20

Pro

Val

Asn

Thr

Thr 25

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr 30

Ala

Gin

íle

Pro

Ala 35

Glu

Ala

Val

íle

Gly 40

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu 45

Gly

Asp.

Phe

Asp

Val 50

Ala

Val

Leu

Pro

Phe 55

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn 60

Asn

Gly

Leu

Leu

01-852-02-Ce

Phe 65

íle

Asn

Thr

Thr

íle 70

Ala

Ser

íle

Ala

Ala 75

Lys

Glu

Glu

Gly

Val 80

Ser

Leu

Glu

Lys

Arg 85

Glu

Ala

Glu

Ala

Ser 90

Ser

íle

íle

Leu

Glu 95

Ser

Gly

Asn

Val

Asn 100

Asp

Tyr

Glu

Val

Val 105

Tyr

Pro

Arg

Lys

Val 110

Thr

Pro

Val

Pro

Arg 115

Gly

Ala

Val

Gin

Pro 120

Lys

Tyr

Glu

Asp

Ala 125

Met

Gin

Tyr

Glu

Phe 130

Lys

Val

Asn

Ser

Glu 135

Pro

Val

Val

Leu

His 140

Leu

Glu

Lys

Asn

Lys 145

Gly

Leu

Phe

Ser

Glu 150

Asp

Tyr

Ser

Glu

Thr 155

His

Tyr

Ser

Pro

Asp 160

Gly

Arg

Glu

íle

Thr 165

Thr

Tyr

Pro

Leu

Gly 170

Glu

Asp

His

Cys

Tyr 175

Tyr

His

Gly

Arg

íle 180

Glu

Asn

Asp

Ala

Asp 185

Ser

Thr

Ala

Ser •

íle 190

Sex

Ala

Cys

Asn

Gly 195

Leu

Lys

Gly

His

Phe 200

Lys

Leu

Gin

Gly

Glu 205

Met

Tyr

Leu

íle

Glu 210

Pro

Leu

Glu

Leu

Ser 215

Asp

Ser

Glu

Ala

His 220

Ala

Val

Tyr

Lys

Tyr 225

Glu

Asn

Val

Glu

Lys 230

Glu

Asp

Glu

Ala

Pro 235

Lys

Met

Cys

Gly

Val 240

Thr

Gin

Asn

Trp

Glu 245

Sier

Tyr

Glu

Pro

íle 250

Lys

Lys

Ala

Phe

Gin 255

Leu

Asn

Leu

Thr

Lys 260

Arg

Ser

Phe

Pro

Gin 265

Arg

Tyr

Val

Gin

Leu 270

Val

íle

Val

Ala

Asp 275

His

Arg

Met

Asn

Thr 280

Lys

Tyr

Asn

Gly

Asp 285

Ser

Asp

Lys

íle

Arg 290

Gin

Trp

Val

His

Gin 295

íle

Val

Asn

Thr

íle 300

Asn

Glu

íle

Tyr

Arg 305

Pro

Leu

Asn

íle

Gin 310

Phe

Thr

Leu

Val

Gly 315

Leu

Glu

íle

Trp

Ser 320

Asn

Gin

Asp

Leu

íle 325

Thr

Val

Thr

Ser

Val 330

Ser

His

Asp

Thr

Leu 335

Ala

Ser

Phe

Gly

Asn 340

Trp

Arg

Glu

Thr

Asp 345

Leu

Leu

Arg

Arg

Gin 350

Arg

His

Asp

Asn

Ala 355

Gin

Leu

Leu

Thr

Ala 360

íle

Asp

Phe

Asp

Gly 365

Asp

Thr

Val

01-852-02-Ce

Gly

Leu 370

Ala

Tyr

Val

Gly

Gly 375

Met

Cys

Gin

Leu

Lys 380

His

Ser

Thr

Gly

Val 385

íle

Gin

Asp

His

Ser 390

Ala

íle

Asn

Leu

Leu’ Val 395

Ala

Leu

Thr

Met 400

Ala

His

Glu

Leu

Gly 405

His

Asn

Leu

Gly

Met 410

Asn

His

Asp

Gly

Asn 415

Gin

cys

His

Cys

Gly 420

Ala

Asn

Ser

Cys

Val 425

Met

Ala

Ala

Met

Leu 430

Ser

Asp

Gin

Pro

Ser 435

Lys

Leu

Phe

Ser

Asp 440

Cys

Ser

Lys

Lys

Asp 445

Tyr

Gin

Thr

Phe

Leu 450

Thr

Val

Asn

Asn

Pro 455

Gin

Cys

íle

Leu

Asn 460

Lys

Pro

<210> 4 <211> 1386 <212> DNA .

<213> ' .

Umelá sekvencia <220>

<223>

Popis umelej sekvencie: kóduje pro-ΝΑΤ (analóg fibrolá-zy) <400> 4 atgagatttc ccagtcaaca tactcagatt aacgggttat tctctcgaga gattacgaag aagtacgaag tcggaaaaaa ggtagagaaa gaaaacgatg aagttgcaag gctgtctaca acccaaaact agatctttcc aaatacaacg aacgaaatct aaccaagatC tggcgtgaaa atcgacttcg cattctactg gcacacgaac gcaaactcct tgccctaaga aaaccg cttcaatttt ctacaacaga tagaagggga tgtttataaa aaagagaggc ttgtttatcc atgccatgca acaaaggttt ttactactta ctgactccac gtgaaAtgta agtacgaaaa gggaatcata cacaaagata gtgactctga acagaccact tgatcaccgt ccgacctgct acggtgatac gtgttatcca tgggtcataa gtgttatggc aagactacca tactgctgtt agatgaaacg tttcgatgtt tactactatt tgaagcttct aagaaaggtc atacgaattc gttctctgaa cccattgggt tgcttctatc cttgattgaa cgtcgaaaag tgaaccaatc cgtacagctg caaaatccgt gaacatccaa tacttctgta gcgtcgccaa tgttggtctg ggaccactcc cctgggtatg tgctatgctg gaccttcctg ttattcgcag gcacaaattc gctgttttgc gccagcattg tctattatct actccagttc aaggttaaca gattactctg gaagatcact tctgcttgta ccattggaat gaagatgaag aagaaggcct gttatcgttg caatgggtgc ttcactttgg tcccacgaca cgtcatgata gcttacgttg gctattaacc aaccacgatg tccgatcaac accgttaaca catcctccgc cggctgaagc cattttccaa ctgctaaaga tggaatctgg ctággggtge gtgaaccagt .aaactcatca gttactacca acggtttgaa tgtccgactc ccccaaagat tccaattaaa ctgaccaccg accaaatcgt tcggtttgga ctctggcatc acgctcaact gtggcatgcg tgctggttgc gcaaccagtg cat.ccaaact acccgcagtg

attagctgct	60
tgtcatcggt	120
cagcacaaat	ISO
agaaggggta	240
taacgttaac	300
tgttcaacca	360
tgtcttgcac	420
ctccccagat	480
tggtagaatc	540
gggtcatttc	600
tgaagcccat	660
gtgtggtgtt	720
cttgactaag	780
tatgaacact	840
caacaccatt	900
aatctggtcc	960
cttcggtaac	1020
gctgaccgct	1080
tcaactgaaa	1140
tctgaccatg	1200
tcactgcggt	1260
gttctccgac	1320
tatcctgaac	1380
	1386

01-852-02-Ce <210> 5 <211> 203 <212> PRT <213> Agkistrodon contortrix <220>

<223> Natívna	fibroláza	z Agkistrodon	contortrix
<400> 5
Gin Gin Arg Phe	Pro Gin Arg	Tyr Val Gin Leu	Val íle Val Ala Asp
1	5	10	15
His Arg Met Asn	Thr Lys Tyr	Asn Gly Asp Ser	Asp Lys íle Arg Gin
20		25	30
Trp Val His Gin	íle Val Asn	Thr íle Asn Glu	íle Tyr Arg Pro Leu
35		40	45
Asn íle Gin Phe	Thr Leu Val	Gly Leu Glu íle	Trp Ser Asn Gin Asp
50	55		60
Leu íle Thr Val	Thr Ser Val	Ser His Asp Thr	Leu Ala Ser Phe Gly
65	70	75	80
Asn Trp Arg Glu	Thr Asp Leu	Leu Arg Arg Gin	Arg His Asp Asn Ala
	85	90	95
Gin Leu Leu Thr	Ala íle Asp	Phe Asp Gly Asp	Thr Val Gly Leu Ala
100		105	110
Tyr Val Gly Gly	Met Cys Gin	Leu Lys His Ser	Thr Gly Val íle Gin
115		120	125
Asp His Ser Ala	íle Asn Leu	Leu Val Ala Leu	Thr Met Ala His Glu
130	135		140
Leu Gly His Asn	Leu Gly Met	Asn His Asp Gly	Asn Gin Cys His Cys
145	150	155	160
Gly Ala Asn Ser	Cys Val Met	Ala Ala Met Leu	Ser Asp Gin Pro Ser
	165	170	175
Lys Leu Phe Ser	Asp Cys Ser	Lys Lys Asp Tyr	Gin Thr Phe Leu Thr
180		185	190

Val Asn Asn Ero Gin Cys íle Leu Asn Lys Pro 195 200 <210> 6 <211> 609 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220>

^<223> Kóduje natívnu fibrolázu z Agkistrodon contortrix

01-852-02-Ce <400> 6 caacaaagac ccccacaaag atacgcacag ctggttatcg tcgctgacca ccgcatgaac 60 actaaataca acggtgactc tgacaaaatc cgtcaatggg tgcaccaaat cgtcaacacc 120 attaacgaaa Cctacagacc actgaacatc caattcactt tggttggttt ggaaatccgg 180 tccaaccaag atttgatcac cgttacttct gtatcccacg acactctggc atccttcggt 240 aactggcgtg aaaccgácct gctgcgtcgc caacgtcatg ataacgctca actgctgacc 300 gctatcgact tcgacggtga tactgttggt ctggcttacg_ttggtggcat gtgtcaactg 360 aaacattcta ctggtgttat ccaggaccac tccgctatta acctgctggt tgctctgacc 420 atggcacacg aactgggtca taacctgggt atgaaccacg atggcaacca gtgtcactgc 480 ggtgcaaact cctgtgttat ggctgctatg ctgtccgatc aaccatccaa actgttctcc 540 gactgctcta agaaagacta ccagaccttc ctgaccgtta acaacccgca gtgtatcctg 600 aacaaaccg 509 <210» 7 <211» 1392 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220» <223>

Kódujúca sekvencia natívnej pro-fibrolázy z Agkistrodon contortrix <400» 7 atgagatttc cttcaatttt ccagtcaaca ctacaacaga tactcagatt.tagaagggga aacgggttat tgtttataaa tctctcgaga aaagagaggc gattacgaag ttgtttatcc aágtacgaag atgccatgca ttggaaaaaa acaaaggttt ggtagagaaa ctactactta gaaaacgatg ctgactccac aagttgcaag gtgaaatgta gctgtctaca agtacgaaaa acccaaaact gggaaccata agacaacaaa gattcccaca aacactaaat acaacggtga accattaacg aaatctacag tggtccaacc aagatttgat ggtaactggc gtgaaaccga accgctatcg, acttcgacgg ctgaaacatt ctactggtgt accacggcac acgaactggg tgcggtgcaa actcctgtgt tccgactgct ctaagaaaga ctgaacaaac cg tactgctgtt agatgaaacg tttcgatgtt tactactatt tgaagcttct aagaaaggtc atacgaattc gttctctgaa cccattgggt tgcttctatc cttgattgaa cgtcgaaaag tgaaccaatc aagatacgta ctctgacaaa accactgaac caccgttact cctgctgcgt tgatactgtt tatccaggac tcataacctg tatggctgct ctaccagacc ttattcgcag gcacaaattc gctgttttgc gccagcattg tctattatct actccagttc aaggttaaca gattactctg gaagatcact tctgcttgta ccattggaat gaagatgaag aagaaggcct cagctggtta atccgtcaat atccaattca tctgtatccc cgcca’ácgtc ggtctggctt cactccgcta ggtatgaacc atgctgtccg ttcctgaccg catcctccgc attagctgct 60 cggctgaagc tgtcatcggt 120 cattttccaa cagcacaaat 180 ctgctaaaga agaaggggta 240 tggaatctgg taacgttaac 300 ctaggggtgc tgttcaacca 360 gtgaaccagt tgtcttgcac 420 aaactcatta ctccccagat 480 gttactacca tggtagaatc 540 acggtttgaa gggtcatttc 600 tgtccgactc tgaagcccat 660 ccccaaagat gtgtggtgtt 720 tccaattaaa cttgactaag 780 tcgttgctga ccaccgtatg 840 gggtgcacca aatcgtcaac 900 ctttggttgg tttggaaatc 960 acgacactct ggcatccttc 1020 atgataacgc tcaactgčtg 1080 acgttggtgg catgtgtcaa 1140 ttaacctgct ggttgctctg 1200 acgatggcaa ccagtgtcac 1260 atcaaccatc caaactgctc 1320 ttaacaaccc gcagtgtatc 1380

1392 <210> 8 <211> 21 <212> DNA ^<213* Umelá sekvencia

01-852-02-Če <220» . , <223> Popis umelej sekvencie: : Oligonukleotid <400> 8 tactattgcc agcattgctg c <210» 9 <211> 21 <212> DNA ^<213> Umelá sekvencia <220>

<223» j

Popis umelej sekvencie: Oligonukleotid <400» 9 cctacagtct tacggtaaac g <210» 10 <211» 45 <212» DNA ^<213> Umelá sekvencia <223» ^PoPÍ^{s ume}l^ej sekvencie: Oligonukleotid <400» 10 tccaattaaa cttgactaag agatctttcc cacaaagata cgtac <210» 11 <211» 44 <212» DNA <213» umelá sekvencia <220» <223» popis umelej sekvencie: Oligonukleotid <400» 11 ľ ggttaatttg aactgattct ctagaaaggg tgtttctatg catg <210» 12 <211» 1620 <212» DNA <213» Agkistrodon contortrix <220» <221» misc_feature <222» Komplement ((1) . . (1620))

01-852-02-Ce _<223> Komplementárny (sens) reťazec k antisensovému reťazci (viď SEQ ID NO:13) <220>

<223> Kódujúca sekvencia natívnej pro-fibrolázy z Agkistrodon contortrix <400> 12 atgagatttc cttcaacttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 tactcagatt tagaagggga tttcgaťgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaac 180 aacgggttat tgtccacaaa tactactatt gccagcattg ccgccaaaga agaaggggta 240 cctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300 gactacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagctc ctaggggtgc tgttcaacca 360 aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gcgaaccagt tgccttgcac 420 ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gatcactctg aaacccatta ctccccagat 480 ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540 gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600 aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660 gctgtctaca agtacgaaaa jggtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720 acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780 agacaacaaa gattcccaca aagatacgta cagctggtta tcgttgctga ccaccgtacg 840 aacactaaat acaacggtga ccctgacaaa atccgtcaat gggtqcacca aatcgtcaac 900 accattaacg aaatctacag accactgaac atccaattca ctttggttgg tttggaaatc 960 tggtccaaec aagatttgat caccgttact tctgtatccc acgacactct ggcatccttc 1020 ggtaactggc gtgaaaccga cctgctgcgt cgccaacgtc at'gataacgc tcaactgctg 1080 accgctatcg acttcgacgg tgatactgtt ggtctggctt acgttggtgg catgtgtcaa 1140 ctgaaacatt ctactggtgt tatccaggac cactccgcta ttaacctgct ggttgctctg 1200 accatggcac acgaactggg tcataacctg ggtatgaacc acgatggcaa ccagtgtcac 1260 tgcggtgcaa actcctgtgt tatggctgct atgctgtccg atcaaccatc caaactgttc 1320 tccgactgct ctaagaaaga ctaccagacc ttcctgaccg ttaacaaccc gcagtgtatc 1380 ctgaacaaae cgtaagcggc cgccagcttt ctagaacaaa aactcacctc agaagaggat 1440 ccgaatagcg ccgtcgacca tcatcatcat catcattgag tttgtagcct tagacatgac 1500 tgttcctcag ttcaagttgg gcacttacga gaagaccggt cttgctagat tctaatcaag 1560 aggatgtcag aatgccattt gcctgagaga tgcaggcttc atttttgaca cttttttatt 1620 <210> 13 <211> 1620 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220>

<221> misc_feature <222> Complement{(1)..(1620)) ^<223:> Komplementárny (antisens) reťazec k sens reťazcu (viď SEQ ID NO. 12) <220>

<223> Anti-kódujúca sekvencia natívnej pro-fibrolázy z Agkistrodon contortrix <400> 13 aataaaaaag tatcaaaaat gaagcccgca tctctcaggc aaatggcatc ctgačatcct 60 cttgattaga atctagcaag accggtcttc tcgtaagtgc ccaacttgaa ctgaggaaca 120 gtcatgtcta aggctacaaa ctcaatgatg atgatgatga tggtcgacgg cgctattcag 180

01-852-02-Ce atcctcttct gagatgagcc ctcgttctag aaagctggcg gccgcttacg gtttgttcag 240 gatacactgc gggttgttaa cggtcaggaa ggtctggtag tctttcttag agcagccgga 300 gaacagtttg gatggttgac cggacagcat agcagccata acacaggagt ctgcaccgca 360gcgacactgg ttgccatcgt ggttcatacc caggttatga cccagttcgC gcgccacggc 420 cagagcaacc agcaggtCaa tagcggagtg gtcctggata acaccagtag aaCgCCtcag 480 ttgacacatg ccaccaacgt aagccagacc aacagtacca ccgtcgaagt cgatagcggt 540 cagcagttga gcgttatcat gacgctggcg acgcagcagg tcggtttcac gccagttacc 600 gaaggatgcc agagtgtcgt gggatacaga agtaacggtg atcaaatctt ggttggacca 660 gatttccaaa ccaaccaaag tgaattggat gctcagtggt ctgtagacct cgttaatggt 720 gttgacgatt tggtgcaccc attgacggat tttgtcagag tcaccgttgt atttagtgct 780 catacggtgg tcagcaacga taaccagctg tacgtatctt tgtgggaatc cttgttgtct 840 cttagtcaag tttaattgga aggccttctt gattggttca tatgattccc agtettgggt ?00 aacaccacac atctttgggg cttcatcttc cttttcgacg ttttcgtact tgtagacagc 960 atgggcttca gagtcggaca attccaatgg ttcaatcaag tacatttcac cttgcaactt 1020 gaaatgaccc ttcaaaccgt tacaagcaga gatagaagca gtggagtcag caccgttttc 1080 gattccacca tggtagtaac agtgatcttc acccaatggg taagtagtaa tttctctacc. 1140 aťctggggag taatgagttt cagagtaatc ttcagagaac aaacctttgt ttttttccaa 1200 gtgcaagaca actggttcac tgttaacctt gaattcgtat tgcatggcat cttcgtactt 1260 tggctgaaca gcacccctag gaactggagt gacctttct,t ggataaacaa ctccgtaatc 1320 gtcaacgtta ccagattcca agataataga agaagcttca gcctctcttt tctcgagaga 1380 taccccttct tctCtagcag caatgetggc aatagtagta tttataaaca ataacccgtt 1440 atttgtgctg ttggaaaatg gcaaaacagc aacatcgaaa tccccttcta aatctgagta 1500 accgatgaca gcctcagccg gaatttgtgc cgtttcatct tctgttgtag tgttgactgg 1560 agcagctaat gcggaggatg ctgcgaataa aacagcagta aaaattgaag gaaatctcat 1620 <210> 14 <211> 540 <2Í2> PRT <213> Agkistrodon contortrix <220>

*223> x_aa na pozíciách 465,493,516 a 536 označuje stop kodónf <220> „ .

<223> Natívna pro-fibroláza z Agkistrodon contortrix <400> 14

Met 1

Arg

Phe

Pro

Ser 5

íle

Phe

Thr

Ala

Val 10

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser 15

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala 20

Pro

Val

Asn

Thr

Thr 25

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr 30

Ala

Gin

íle

Pro

Ala 35

Glu

Ala

Val

íle

Gly 40

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu 45

Gly

Asp

Phe

Asp

Val 50

Ala

Val

Leu

Pro

Phe 55

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn 60

Asn

Gly

Leu

Leu

Phe 65

íle

Asn

Thr

Thr

íle 70

Ala

Ser

íle

Ala

Ala 75

Lys

Glu

Glu

Gly

Val 80

Ser

Leu

Glu

Lys

Arg 85

Glu

Ala

Glu

Ala

Ser 90

Ser

íle

íle

Leu

Glu 95

Ser

01-852-02-Ce

Gly Asn Val Asn	Asp	Tyr	Glu Val Val Tyr Pro Arg Lys Val Thr Pro
	100	105	110
Val Pro Arg	Gly	Ala	Val	Gin Pro Lys	Tyr Glu Asp Ala Met Gin Tyr
115				120	125
Glu Phe Lys	Val	Asn	Ser	Glu Pro Val	Val Leu .His Leu Glu Lys Asn
130				135	140
Lys Gly Leu	Phe	Ser	Glu	Asp Tyr Ser	Glu Thr His Tyr Ser Pro Asp
145			150		155 160
Gly Arg Glu	íle	Thr	Thr	Tyr Pro Leu	Gly Glu Asp His Cys Tyr Tyr
		165			170 175
His Gly Arg	íle	Glu	Asn	Asp Ala Asp	Ser Thr Ala Ser íle Ser Ala
	180			185	190
Cys Asn Gly	Leu	Lys	Gly	His Phe Lys	Leu Gin Gly Glu Met Ťyr Leu
195				200	205
íle Glu Pro	.Leu	Glu	Leu	Ser Asp Ser	Glu Ala His J^la Val Tyr Lys
210				215	220
Tyr Glu Asn.	Val	Glu	Lys	Glu Asp Glu	Ala Pro Lys Met Cys Gly Val
225			230		235 240
Thr Gin Asn	Trp	Glu	Ser	Tyr Glu Pro	íle Lys Lys Ala Phe Gin Leu
		245			250 255
Asn Leu Thr	Lys	Arg	Gin	Gin Arg Phe	Pro Gin Arg Tyr Val Gin Leu
	260			265	270
Val íle Val	Ala	Asp	His	Arg Met Asn	Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser
275				280	‘ 285
Asp Lys íle	Arg	Gin	Trp	Val His Gin	íle Val Asn Thr íle Asn Glu
290				295	'300
íle Tyr Arg	Pro	Leu	Asn	íle Gin Phe	Thr Leu Val Gly Leu Glu íle
305			310		315 320
Trp Ser Asn	Gin	Ašp	Leu	íle Thr Val	Thr'Ser Val Ser His Asp Thr
		325			330 335
Leu Ala Ser	Phe	Gly	Asn	Trp Arg Glu	Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gin
	340			345	350
Arg His Asp	Asn	Ala	Gin	Leu Leu Thr	Ala íle Asp Phe Asp Gly Asp
355				360	365
Thr Val Gly	Leu	Ala	Tyr	Val Gly Gly	Met Cys Gin Leu Lys His Šer
370				375	380

01-852-02-Ce

Thr Gly Val íle Gin Asp His.

Ser Ala

íle

Asn Leu Leu Val 395

Ala Leu 400

385

390

Thr

Met

Ala

His

Glu

Leu

Gly

His

Asn

Leu

Gly

Met

Asn

His

Asp

Gly

405

410

415

Asn

Gin

Cys

His

Cys

Gly

Ala

Asn

Ser

Cys

Val

Met

Ala

Ala

Met

Leu

420

425

430

Ser

Asp

Gin

Pro

Ser

Lys

Leu

Phe

Ser

Asp

Cys

Ser

Lys

Lys

Asp

Tyr

435

440

445

Gin

Thr

Phe

Leu

Thr

Val

Asn

Asn

Pro

Gin

Cys

íle

Leu

Asn

Lys

Pro

450

455

460

Xaa

Ala

Ala

Ala

Ser

Phe

Leu

Glu

Gin

Lys

Leu

íle

Ser

Glu

Glu

Asp

465

470

475

480

Leu

Asn

Ser

Ala

Val

Asp

His

His

His

His

His

His

Xaa

Val

Cys

Ser

4Θ5

490

495

Leu

Arg

His

Asp

Cys

Ser

Ser

Val

Gin

Val

Gly

His

Leu

Arg

Glu

Asp

500

505

*

510

Arg

Ser

Cys

Xaa

íle

Leu

íle

Lys

Arg

Met

Ser

Glu

Cys

His

Leu

Pro

515

520

525

Glu

Arg

Cys

Arg

Leu

His

Phe

Xaa

Tyr

Phe

Phe

íle

530

535

540

<210> 15 <211> 203 <212> PRT <213> Agkistrodon contortrix <220>

<223>Natívna, fibroláza z Agkistrodon contortrix <220>

<223> ) x_{aa na} p_OZ^_c£^ i zastupuje chemickú zlúčeninu

-kyselinu pyroglutámovú. Táto chemická zlúčenina je označovaná v zozname písmenkom E.

<400> 15

Xaa 1

Gin

Arg

Phe

Pro 5

Gin

Arg

Tyr

Val

Gin 10

Leu

Val

íle

Val

Ala 15

Asp

His

Arg

Met

Asn 20

Thr

Lys

Tyr

Asn

Gly 25

Asp

Ser

Asp

Lys

íle 30

Arg

Gin

Trp

Val

His 35

Gin

íle

Val

Asn

Thr 40

íle

Asn

Glu

íle

Tyr 45

Arg

Pro

Leu

01-852-02-Ce

Asn íle Gin Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu íle Trp Ser Asn Gin Asp

50

55

60

Leu

íle

Thr

Val

Thr

Ser

Val

Ser

His

Asp

Thr

Leu

Ala

Ser

Phe

Gly

65

70

75

80

Asn

Trp

Arg

Glu

Thr

Asp

Leu

Leu

Arg

Arg

Gin

Arg

His

Asp

Asn

Ala

85

90

95

Gin

Leu

Leu

Thr

Ala

íle

Asp

Phe

Asp

Gly

Asp

Thr

Val

Gly

Leu

Ala

100

*

105

110

Tyr

Val

Gly Gly

Met

Cys

Gin

Leu

Lys

His

Ser

Thr.

Gly

Val

íle

Gin

115

120

125

Asp

His

Ser

Ala

íle

Asn

Leu

Leu

Val

Ala

Leu

Thr

Met

Ala

His

Glu

130

135

140

Leu

Gly

His

Asn

Leu

Gly

Met

Asn

His

Asp

Gly

Asn

Gin

Cys

His

Cys

145

150 -*

155

160

Gly

Ala

Asn

Ser

Cys

Val

Met

Ala

Ala

Met

Leu

Ser

Asp

Gin

Pro

Ser

165

170

•

175

Lys

Leu

Phe

Ser

Asp

Cys

Ser

Lys

Lys

Asp

Tyr

Gin

Thr

Phe

Leu

Thr

ISO

185

190

Val

Asn

Asn

Pro

Gin

Cys

íle

Leu

Asn

Lys

Pro

195 200 <210> 16 <211> 202 <212> PRT <213> Agkistrodon contortrix ^<220> <223> Natívna fihroláza z Agkistrodon contortrix <220> . , , , ,.

<223> Xaa na pozícii 1 zastupuje chemickú zlúčeninu.

-kyselinu pyroglutámovú. Táto chemická zlúčenina

	je označovaná v zozname písmenkom	E.
<400> 16
Xaa Arg 1	Phe Pro Gin Arg Tyr Val Gin Leu Val íle 5 10	Val Ala Asp His 15
Arg Met	Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys 20 25	íle Arg Gin Trp 30
Val His	Gin íle Val Asn Thr íle Asn Glu íle Tyr 35 40	Arg Pro Leu Asn 45

01-852-02-Ce

Xle Gin Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu íle Trp Ser Asn Gin

Asp

Leu

50

55

60

íle

Thr

Val

Thr

Ser

val

Ser

His

Asp

Thr

Leu

Ala

Ser

Phe

Gly

Asn

65

70

75

80

Trp

Arg

Glu

Thr

Asp

Leu

Leu

Arg

Arg

Gin

Arg

His

Asp

Asn

Ala

Gin

85

90

95

Leu

Leu

Thr

Ala

íle

Asp

Phe

Asp

Gly

Asp

Thr

Val

Gly

Leu

Ala

Tyr

100

105

110

Val

Gly

Gly

Met

Cys

Gin

Leu

Lys

His

Ser

Thr

Gly

Val

íle

Gin

Asp

115

120

125

His

Ser

Ala

íle

Asn

Leu

Leu

Val

Ala

Leu

Thr

Met

Ala

His

Glu

Leu

130

135

140

Gly

His

Asn

Leu

Gly

Met

Asn

His

Asp

Gly

Asn

Gin

Cys

His

Cys

Gly

145

150

155

160

Ala

Asn

Šer

Cys

Val

Met

Ala

Ala

Met

Leu

Ser

Asp

Gin

Pro

Ser

Lys

165

170

•

175

Leu

Phe

Ser

Asp

Cys

Ser

Lys

Lys

Asp

Tyr

Gin

Thr

Phe

Leu

Thr

Val

180

185

•

190

Asn

Asn

Pro

Gin

Cys

íle

Leu

Asn

Lys

Pro

195 200 <210> 17 <211> 538 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220* . . , <223> Popis umelej sekvencie: analóg natívnej pro-fibrolazy z

Agkistrodon contortrix <400> 17

Met 1

Arg

Phe

Pro

Ser 5

íle

Phe

Thr

Ala

Val 10

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser 15

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala 20

Pro

Val

Asn

Thr

Thr 25

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr 30

Ala

Glú

íle

Pro

Ala 35

Glu

Ala

Val

íle

Gly 40

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu 45

Gly

Asp

Phe

Asp

Val 50

Ala

Val

Leu

Pro

Phe 55

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn 60

Asn

Gly

Leu

Leu

Phe

íle

Asn

Thr

Thr

íle

Ala

Ser

íle

Ala

Ala

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

70 75 80

01-852-02-Ce

Ser

Leu

Glu

Lys

Arg 85

Glu

Ala

Glu

.Ala

Ser 90

Ser

íle

íle

Leu

Glu 95

Ser

Gly

Asn

Val

Asn 100

Asp

Tyr

Glu

Val

Val 105

Tyr

Pro

Arg

Lys

Val 110

Thr

Pro

Val

Pro

Arg 115

Gly

Ala

Val

Gin

Pro 120

Lys

Tyr

Glu

Asp

Ala 125

Met

Gin

Tyr

Glu

Phe 130

Lys

Val

Asn

Ser

Glu 135

Pro

Val

Val

Leu

His 140

Leu

Glu

Lys

Asn

Lys 145

Gly

Leu

Phe

Ser

Glu 150

Asp

Tyr

Ser

Glu

Thr 155

His

Tyr

Ser

Pro

Asp 160

Gly

Arg

Glu

íle

Thr 165

Thr

Tyr

Pro

Leu

Gly 170

Glu

Asp

His

Cys

Tyr 175

Tyr

His

Gly

Arg

íle 180

Glu

Asn

Asp

Ala

Asp 185

Ser

Thr

Ala

Ser

íle 190

Ser

Ala

Cys

Asn

Gly 195,

Leu

Lys

Gly

His

Phe 200

Lys

Leu

Gin

Gly

Glu 305

Met

Tyr

Leu

íle

Glu 210

Pro

Leu

Glu

Leu

Ser 215

Asp

Ser

Glu

Ala

His 22*0

Ala

Val

Tyr

Lys

Tyr 225

Glu

Asn

Val

Glu

Lys 230

Glu

Asp

Glu

Ala

Pro 235

Lys

Met

Cys

Gly

Val 240

Thr

Gin

Asn

Trp

Glu 245

Ser

Tyr

Glu

Pro

íle 250

Lys

Lys

Ala

Phe

Gin 255

Leu

Asn

Leu

Thr

Lys 260

Arg

Ser

Phe

Pro

Gin 265

Arg

Tyr

Val

Gin

Leu 270

Val

íle

Val

Ala

Asp 275

His

Arg

Met

Asn

Thr 280

Lys

Tyr

Asn

Gly

Asp 285

Ser

Asp

Lys

íle

Arg 290

Gin

Trp

Val

His

Gin 295

íle

Val

Asn

Thr

íle 300

Asn

Glu

íle

Tyr

Arg 305

Pro

Leu

Ásn

íle

Gin 310

Phe

Thr

Leu

Val

Gly 315

Leu

Glu

íle

Trp

Ser 320

Asn

Gin

Asp

Leu

íle 325

Thr

Val

Thr

Ser

Val 330

Ser

His

Asp

Thr

Leu 335

Ala

Ser

Phe

Gly

Asn 340

Trp

Arg

Glu

Thr

Asp 345

Leu

Leu

Arg

Arg

Gin 350

Arg

His

Asp

Asn

Ala 355

Gin

Leu

Leu

Thr

Ala 360

íle

Asp

Phe

Asp

Gly 365

Asp

Thr

Val

Gly

Leu 370

Ala

Tyr

Val

Gly

Gly 375

Met

Cys

Gin

Leu

Lys 380

His

Ser

Thr

Gly

01-852-02-Ce

Val 385

íle

Gin

Asp

His

Ser 390

Ala

íle

Asn

Leu

Leu 395

Val

Ala

Leu

Thr

Met 400

Ala

His

Glu

Leu

Gly 405

His

Asn

Leu

Gly

Met 410

Asn

His

Asp

Gly

Asn 415

Gin

Cys

His

Cys

Gly 420

Ala

Asn

Ser

Cys

Val 425

Met

Ala

Ala

Met

Leu 430

Ser

Asp

Gin

Pro

Ser 435

Lys

Leu

Phe

Ser

Asp 440

Cys

Ser

Lys

Lys

Asp 445

Tyr

Gin

Thr

Phe

Leu 450

Thr

Val

Asn

Asn

Pro 455

Gin

Cys

íle

Leu

Asn 460

Lys

Pro

Xaa

Ala

Ala 465

Ala

Ser

Phe

Leu

Glu 470

Gin

Lys

Leu

íle

Ser 475

Glu

Glu

Asp

Leu

Asn 480

Ser

Ala

Val

Asp

His 485

His

His

His

His

His 490

Xaa

Val

Cys

Ser

Leu 495

Arg

His

Asp

Cys

Ser 500

Ser

Val

Gin

Val

Gly 505

His

Leu

Arg

Glu •

Asp 510

Arg

Ser

Cys

Xaa

íle 515

Leu

íle

Lys

Arg

Met 520

Ser

Glu

Cys

His

Leu 525

Pro

Glu

Arg

Cys

Arg 530

Leu

His

Phe

Xaa

Tyr 535

Phe

Phe

íle

<210> 18 <211> 602 <212> DNA <213> Agkistrodon čontortrix <223> fragment fibrolázy z Agkistrodon čontortrix <400> 18 tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct ctcgagaaaa gagaggctga 60 agcttcttct attatcttgg aatctggtaa cgttaacgat tacgaagttg tttatccaag 120 aaaggtcact ccagttccta ggggtgctgt tcaaccaaag tacgaagatg ccatgcáata 180 cgaattcaag gttaacagtg aaccagttgt cttgcacttg gaaaaaaaca aaggtttgtt 240 ctctgaagat tactctgaaa ctcattactc cccagatggt agagaaatta ctacttaccc 300 attgggtgaa gatcactgtt actaccatgg tagaatcgaa aacgatgctg actccactgc'360 ttctatctct gcttgtaacg gtttgaaggg tcatttcaag ttgcaaggtg aaatgtactt 420 gattgaacca ttggaattgt ccgactctga agcccatgct gtctacaagt acgaaaacgt 480 cgaaaaggaa gatgaagccc caaagatgtg tggtgttacc caaaactggg aatcatatga 540 accaatcaag aaggccttcc aattaaactt gactaagaga tctttcccac aaagatac.gt 600 <210> 19 <211> 816

01-852-02-Ce <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220>

<223> Fragment fibrolázy z Agkistrodon contortrix <400> 19 tccaattaaa cttgactaag agatctttcc cacaaagata cgtacagctg gttatcgttg 60 ctgaccaccg tatgaacact aaatacaacg gtgactctga caaaatccgt caatgggtgc 120 accaaatcgt caacaccatt aacgaaatct acagaccact gaacatccaa ttcactttgg 180 ttggcttgga aatctggtcc aaccaagatt tgatcaccgt tacttctgta tcccacgaca 240 ccctggcatc cttcggtaac tggcgtgaaa ccgacctgct gcgtcgccaa cgtcatgata 300 acgctcaact gctgaccgct atcgacttcg acggtgatac tgttggtctg gcttacgtcg 360 gtggcatgtg tcaactgaaa cattctactg gtgttatcca ggaccactcc gctattaacc 420 tgctggttgc tctgaccatg gcacacgaac tgggtcataa cctgggtatg aaccacgatg 480 gcaaccagtg tcactgcggt gcaaactcct gtgttatggc tgctatgctg tccgatcaac 540 catccaaact gttctccgac tgctctaaga aagactacca gaccttcctg accgttaaca 600 acccgcagtg tatcctgaac aaaccgtaag cggccgccag ctttctagaa caaaaactca 660 tctcagaaga ggatctgaat agcgccgtcg accatcatca tcatcatcat tgagtttgta 720 gccttagaca tgactgttcc tcagttcaag ttgggcactt acgagaagac cggtcttgct 780 agattctaat caagaggatg tcagaatgcc atttgc 815 <210> 20 <211> 1373 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220>

<223> Fragment fibrolázy z Agkistrodon contortrix <400> 20 tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct ctcgagaaaa gagaggctga 60 agcttcttct attatcttgg aatctggtaa cgttaacgat tacgaagttg tttatccaag 120 aaaggtcact ccagttccta ggggtgctgt tcaaccaaag tacgaagatg ccatgcaata 180 cgaattcaag gttaacagtg aaccagttgt cttgcacttg gaáaaaaaca aaggtttgtt 240 ctctgaagat tactctgaaa. ctcattactč cccagatggt agagaaatta ctacttaccc 300 attgggtgaa gatcactgtt actaccatgg tagaatcgaa aacgatgctg actccactgc 360 ttctatctct gcttgtaacg gtttgaaggg tcatttcaag ttgcaaggtg aaatgtactt 420 gattgaacca ttggaattgt ccgactctga agcccatgct gtctacaagt acgaaaacgt 480 cgaaaaggaa gatgaagccc caaagatgtg tggtgttacc caaaactggg aatcatatga 540 accaatcaag aaggccttcc aattaaactt gactaagaga tctttcccac aaagatacgt 600 acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaácactaaa tacaacggtg actctgacaa 660 aatccgtcaa tgggtgcacc aaatcgtcaa caccattaac gaaatctaca gaccactgaa 720 catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac caagatttga tcaccgttac 780 ttctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg cgtgaaaccg acctgctgcg 840 tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc gacttcgacg gtgatactgt 900 tggtctggct tacgttggtg gcatgtgtca actgaaacat tctactggtg ttatccagga 960 ccactccgct attaacctgc tggttgctct gaccatggca cacgaactgg gtcataacct 1020 gggtatgaac cacgatggca accagtgtca ctgcggtgca aactcctgtg ttatggctgc 1080 tatgctgtcc gatcaaccat ccaaactgtt ctccgactgc tctaagaaag actaccagac 1140 cttcctgacc gttaacaacc cgcagtgtat cctgaacaaa ccgtaagcgg ccgccagctt 1200 tctagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatagc gcčgtcgacc atcatcatca 1260 tcatcattga gtttgtagcc ttagacatga ctgttcctca gttčaagttg ggcacttacg 1320 agaagaccgg tcttgctaga ttctaatcaa gaggatgtca gaatgccatt tgc 1373

01-852-02-Če

Claims (19)

1. Fibrinolyticky aktívny polypeptid má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:1.

2. Polypeptid z nároku 1, ktorý bol vyrobený rekombinantnou expresiou v kvasinkách.

3. Molekula nukleovej kyseliny kóduje polypeptid o sekvencií SEQ ID NO:1.

4. Molekula nukleovej kyseliny z nároku 3, ktorá má sekvenciu SEQ ID NO :4.

5. Expresný vektor obsahuje expresné regulačné prvky, ktoré sú účinne pripojené k molekule nukleovej kyseliny podía nároku 3.

6. Expresný vektor podía nároku 5, v ktorom je molekula nukleovej kyseliny a má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO:4.

7. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná molekulou nukleovej kyseliny podía nároku 3.

8. Transformovaná alebo transfekovaná hostiteľská bunka podľa nároku 7, ktorá je prokaryotická alebo eukaryotická.

9. Transformovaná alebo transfekovaná prokaryotická bunka podía nároku 8, ktorá je kvasinková bunka.

10. Transformovaná alebo transfekovaná kvasinková bunka podľa nároku 9, ktorá je Pichia pastoris.

01-852-02-Če

11. Metóda produkcie NATu, zahrnujúca kultiváciu hostiteľských buniek obsahujúcich DNA molekulu kódujúcu uvedenú metaloproteinázu, účinne pripojenú k regulačným prvkom ktoré stimulujú expresiu za podmienok, že je DNA molekula exprimovaná a izolácia exprimovanej metaloproteinázy z kultúry hostitelských buniek.

12. Metóda z nároku 11, kde DNA molekula je SEQ ID NO:4.

13. Metóda z nároku 11, v ktorej sú hostiteľské bunky kvasinky.

14. Metóda z nároku 13, v ktorom sú kvasinkové bunky Pichia pastoris.

15. Metóda produkcie metaloproteinázy-fybrinolytického agens vybraného zo skupiny zostávajúcej sa z fibrolázy NATu, obsahujúcej kultiváciu Pichia hostitelských buniek, ktoré obsahujú DNA molekulu kódujúcu spomínanú metaloproteinázu, účinne pripojenú k regulačným prvkom pre stimuláciu expresie za podmienok, kedy je DNA molekula exprimovaná a izolácia exprimovanej metaloproteinázy z kultúry hostitelských buniek.

16. Metóda z nároku 15, kde Pichia hostiteľská bunka je Pichia pastoris.

17. Metoda liečby trombózy u cicavcov zahrnujúca podávanie trombolyticky efektívneho množstva NATu cicavcom.

18. Protilátku proti polypeptidu z nároku 1.

19. Protilátka z nároku 17, ktorá je monoklonálna protilátka.