SK281944B6 - Beta(1->6)glukozamínové disacharidy, spôsob ich prípravy, farmaceutický prostriedok, ktorý ich obsahuje, a ich použitie - Google Patents

Abstract

Beta(1->6)Glukozamínové disacharidy všeobecného vzorca (I) sa pripravujú spôsobom, ktorý zahrnuje nasledujúce stupne: i) poskytnutie východiskového materiálu obsahujúceho lipid A skupinu lipopolysacharid-obsahujúceho mikroorganizmu a ii) podrobenie východiskového materiálu alkalickému spracovaniu tak, že lipid A skupina je O-deacylovaná v polohe 3 a v polohe 3'. Farmaceutický prípravok obsahujúci ako aktívnu zložku tieto disacharidy sa používa ako imunostimulačné činidlo, protinádorové činidlo a vakcínová zložka.ŕ

Description

Predložený vynález sa týka glukozamínových disacharidov, najmä 2-N- a/alebo 2'-N-acylovaných glukozamínových disacharidov, kde je aspoň jedna z acylových skupín rozvetvená, a zlúčenín, obsahujúcich tieto disacharidy. Predložený vynález sa ďalej týka spôsobu prípravy týchto disacharidov z východiskových materiálov, obsahujúcich lipid A skupinu liposacharidov, kedy sa východiskový materiál podrobí špecifickému alkalickému ošetreniu. Vynález sa týka aj farmaceutických prostriedkov, obsahujúcich tieto disacharidy ako účinné činidlo, a konečne použitia týchto disacharidov v terapii a profylaxii.

Doterajší stav techniky

Liposacharidy tvoria endotoxíny mikroorganizmov ako sú gramnegativne baktérie a zahrnujú polysacharidovú zložku a lipidovú zložku. Táto lipidová zložka, nazývaná tiež lipid A, určuje endotoxické vlastnosti lipopolysacharidov (Rietschel E. Th. a spol. v Immunobiology, Vol. 186, str. 169 až 190 (1993)).

V US-A-4912094 boli modifikované lipospolysacharidy opísané ako majúce redukované endotoxické vlastnosti pri zachovaní svojich antigénnych a imunostimulačných vlastností. Tieto modifikované lipopolysacharidy sú 3-0-deacylované a môžu byť premenené na 3-O-deacylované disacharidy kyslou hydrolýzou. Z týchto zlúčenín je monofosforyl-3-O-deacylovaný disacharid menej toxický než difosforyl-3-O-deacylovanýdisacharid.

Predložený vynález sa týka disacharidov, ktoré sú 3-Odeacylované a 3-O-deacylované alebo obsahujú v 3-0-polohe a/alebo 3'-O-polohe krátku O-pripojenú alkylovú alebo acylovú skupinu a obsahujú aspoň N-pripojenú, rozvetvenú acylovú skupinu v polohe 2, polohe 2' alebo v oboch týchto polohách 2 a 2'. Tieto zlúčeniny ešte majú nižšiu endotoxicitu pri zachovaní biologickej aktivity (ako je imunomodulácia) a majú protirakovinovú aktivitu.

Je prekvapujúce, že tieto špecifické glukozamínové disacharidy majú kombináciu nižšej endotoxicity a zachovania biologickej aktivity, pretože syntetické 3-0- a 3'-O-deacylované glukozamín-disacharidy, obsahujúce N-pripojenú acylovú skupinu v polohe 2 a 2' (zlúčenina 307, Takada H. a spol. v CRC Critical Rewiews in Microbiology, vol. 16, str. 477 až 523 (1989) a zlúčenina LA-19-PP, Rietschel a spol. (1993)) majú určité imunobiologické aktivity v in vitro eseji, tieto aktivity boli oveľa slabšie než aktivity referenčných bakteriálnych lipid A vzoriek. Týmto tiež chýbajú typické endotoxické aktivity.

Podstata vynálezu

V súlade s tým, že predložený vynález sa týka P(l->6)glukozamínových disacharidov všeobecného vzorca®

kde

R¹ je hydroxylová skupina, dihydroxyfosfonoyloxyskupina alebo jej nabitá forma, (Ci-C₅)acyloxyskupina, (Ci-C₅)alkyloxyskupina alebo skupina X,

R² a R²' sú každý acylová skupina alebo skupina Y s tou podmienkou, že aspoň jeden z R² a R²' je skupina Y, R³ a R³' sú každý vodík, (C_rC₃)alkylová skupina alebo (C_rC₃)acylová skupina, R⁴ je vodík, (C]-C₃)alkylová skupina alebo (Ci-C₃)acylová skupina, R⁴'je vodík, (Ci-C₅)acylová skupina, (Ci-C₃)alkylová skupina, dimetoxyfosfonoylskupina alebo fosfonoskupina, alebo jej nabitá forma a R⁶' je vodík, hydroxyskupina, dihydroxyfosfonoyloxyskupina, hydroxysulfonyloxyskupina, jej nabité formy alebo skupina Z, pričom skupina X je vybratá zo skupiny, zahrnujúcej karboxy(C i -C₅)alkyloxyskupinu, -O-CH-[(CH₂)_mCOOH][(CH₂)„COOH]skupinu, pričom m = O až 5 a n = 0až5 fosfono(Ci -C₅)alkylskupinu, dimetoxyfosfonoyloxyskupinu, hydroxysulfonyXCrCsjalkylskupinu a nabité formy skupiny X, pričom skupina Y je vybratá zo skupiny, zahrnujúcej acyloxyacylskupinu, acylaminoacylskupinu, acyltioacylskupinu, (C ] -C₂₄)alkyloxyacylskupinu, (C i -C₂₄)alkylaminoacylskupinu, (C|-C₂₄)alkyltioacylskupinu a pričom je skupina Z vybratá zo skupiny, zahrnujúcej (C i -C₂₄)alkyloxyskupinu, (C,-C ₂₄)acyloxyskupinu, 3-deoxy-D-mano-2-oktulozónovú kyselinu (KDO), (KDO)_n, kde n = 1 až 10, polysacharidový bočný reťazec, ako je bočný reťazec pochádzajúci z prírodného lipopolysacharidu, jadrovú zložku ako je zložka pochádzajúca z prírodného lipopolysacharidu a amino-(C]-C₈)alkyl-karboxylovú skupinu a ich soli.

Tieto glukozamínové disacharidy majú oveľa nižšiu endotoxicitu, stanovanú v limulus amoebocyte lyzátovom (LAL) testu, než lipopolysacharidy (LPS) napríklad z E. coli, lipidu A a modifikovaného lipidu A podľa US-A-4912094. Ďalej tieto glukozamínové disacharidy podľa vynálezu indukujú oxid dusnatý medziproduktmi a cytokínmi ako je interleukín la (IL la), IL-6, faktor nádorovej nekrózy (TNF) a prostaglandín (PGE).

Ďalej tieto disacharidy majú protinádorovú aktivitu ako v peritoneálnej karcinomatóze.

Konečne akútna toxicita týchto disacharidov je extrémne nízka. Neboli zaznamenané žiadne úmrtia Swiss myší po intravenóznej dávke 100 mg disacharidu na kg telesnej hmotnosti.

Predložený vynález sa tiež týka spôsobu prípravy týchto glukozamínových disacharidov s použitím výcho diskového materiálu biologického pôvodu, t. j. akéhokoľvek východiskového materiálu, obsahujúceho lipid A skupinu polysacharidov z mikroorganizmov ako sú gramnegatívne baktérie. Podľa vynálezu sa tento východiskový materiál podrobí aspoň alkalickému spracovaniu tak, že sa odstránia cukrové O-pripojené acylové a/alebo O-pripojené oxyacylové skupiny. Ak je to žiaduce, môže byť alkalický spracovaný východiskový materiál podrobený ďalšiemu spracovaniu a jadrová zložka (kyslým ošetrením) a pre zmenu alebo výmenu substituentov v 1-polohe, 2-polohe, 3-polohe, 4-polohe, 2'-polohe, 3'-polohe, 4'-polohe a 6'-polohe.

Predsa len glukozamínové disacharidy podľa vynálezu môžu byť tiež získané syntézou východiskových zodpovedajúcich glukozamínových disacharidov a zavedením príslušných substituentov do polohy 2 a/alebo 2'.

Vďaka extrémne nízkej endotoxicite v kombinácii s opísanou biologickou aktivitou, tvoria tieto disacharidy podľa vynálezu elitnú aktívnu zložku farmaceutického prípravku. Takáto farmaceutická kompozícia a disacharidy per se môžu byť použité ako imunomodulačné činidlá, protinádorové činidlá a ako zložka vakcíny.

Glukozamínové disacharidy podľa vynálezu (β(1—>6)D-glukozamínový dimér) sa vyznačujú tým, že každý glukozamín obsahuje v polohe 3 a 3' hydroxylovú skupinu alebo krátku O-pripojenú alkylovú alebo acylovú skupinu v podstate nemeniacu endotoxicitu a/alebo biologickú aktivitu a ďalej aspoň jednu N-pripojenú, rozvetvenú acylovú skupinu v polohe 2 alebo 2' alebo v oboch polohách 2 a 2'. Zvyšná 2- a 2'-poloha je acylovaná. Predpokladaná prítomnosť dvoch hydrofóbnych reťazcov v polohe 2 a polohe 2—, z ktorých aspoň jedna tvorí rozvetvenú acylovú skupinu, dáva disacharidom kombináciou extrémne nízku endotoxicitu a zachovanie biologickej aktivity.

Rozvetvená acylová skupina, označovaná všeobecne ako skupina Y, je vybratá zo skupiny, zahrnujúcej acyloxyacylovú skupinu, acylaminoacylovú skupinu, acyltioacylovú skupinu, (C_rC24)alkoxyacylovú skupinu, (C_rC24)alkylaminoacylovú skupinu a (C_t-C₂4)alkyltioacylovú skupinu.

V prípade acyloxyacylovej skupiny sú dve acylové skupiny pripojené cez atóm kyslíka, v prípade acylaminoacylovej skupiny cez NH skupinu a v prípade acyltioacylovej skupiny cez atóm síry. Ďalší členovia skupiny Y, (C_r -C₂₄)alkyloxyacylova skupina, (C_rC₂₄)-alkylaminoacylova skupina a (C_rC₂₄)alkyltioacylová skupina môžu byť získané zo zodpovedajúcej hydroxymastnej kyseliny.

Výhodne skupina Y predstavuje N-pripojenú acylovú skupinu pripojený k jeho polohe 3, ako je 3-acyloxyacylová skupina a 3-acyltioacylová skupina. Rovnako sa aplikuje na skôr uvedené (C₁-C₂₄)alkylekvivalenty.

Výhodne zahrnuje skupina Y jednu alebo dve acylové skupiny, výhodne vybraté zo zvyškov mastných kyselín, zvyškov hydroxymastných kyselín a zvyškov oxymastných kyselín. Ak je acyloxyacylová skupina výhodne 3-acyloxyacylová skupina, obsahujú tieto acylové skupiny zvyšok 3-hydroxy-mastnej kyseliny alebo esterovú pripojenú skupinu zvyšku 3-oxo-mastnej kyseliny. Typické príklady acyloxyacylovej skupiny sú 3-hydroxy(C₁-C₂₄)mastná kyselina-acyly, ktoré sú esterovo pripojené k 3-hydroxypolohe s (C_rC₂₄)karboxylovou kyselinou. Výhodne acyloxyacylová skupina je 3-hydroxy(C_g-C]_g)mastná kyselina-acyl, ktorý je esterovo pripojený v polohe 3-hydroxy k (Cio-C₁₈)mastnej kyseline. Takéto acyloxyacylové skupiny sú prítomné v lipid A zložke gramnegatívnej baktérie, ako je Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Campylobacter jejuni, Rhodocyclus gelatinosus, Chromabacterium violaceum, Neisseria meningitidis, Salmonella minnesota.

V prvej skupine výhodných glukozamínových disacharidov podľa vynálezu je acyloxyacylová skupina N-pripojeného 3-hydroxy-C|₄-mastná kyselina-acylesteru spojená s 3-hydroxypolohou C₁₂-mastnej kyseliny v polohe 2'. V ďalšom výhodnom glukozamínovom disacharide podľa vynálezu je acyloxyacylová skupina N-pripojeného 3-hydroxy-C₁₄-mastná kyselina-acylesteru spojená v 3-hydroxypolohe s C_]4-mastnou kyselinou a acyloxyacylová skupina je výhodne v 2'-polohe.

V ďalšom výhodnom glukozamínovom disacharide podľa vynálezu je acyloxyacylová skupina N-pripojeného 3-hydroxy-Ci₄-mastná kyselina-acylesteru spojená s 3-hydroxypolohou Ci₂-mastnej kyseliny s touto acyloxyacylskupinou v polohe 2. V ďalšom výhodnom uskutočnení glukozamínovom disacharide podľa vynálezu je acyloxyacylová skupina N-pripojeného 3-hydroxy-C]₄-mastná kyselina-acylesteru spojená v 3-hydroxypolohe s Ci2-mastnou kyselinou, s acyloxyacylovou skupinu tak v polohe 2, ako aj v polohe 2'.

Ak skupina Y obsahuje chirálne centrum, zahrnuje vynález všetky R- a S-enantioméry a akékoľvek racemické zmesi.

Iný pripojený substituent môže byť acylová skupina alebo tiež acyloxyacylová skupina. Podľa druhej skupiny disacharidov podľa vynálezu je acylovou skupinou 3-hydroxy(C₄-C₂₄)mastná kyselina, výhodne 3-hydroxy(C₁₀-Ci₈)mastná kyselina. Vo výhodných disacharidoch podľa vynálezu je acylová skupina 3-hydroxy-C|₄-mastná kyselina v polohe 2 alebo v polohe 2'.

Predsa len pripojený substituent môže byť tiež acyloxyacylová skupina tu definovaná skôr a obsahujúca N-pripojený 3-hydroxy(C₄-C₂₄)-mastná kyselina-acyl, ktorý je esterovo spojený s 3-hydroxypolohou (C]-C2o)karboxylovej kyseliny, výhodne N-pripojený 3-hydroxy(C_g-C|_g)-mastná kyselina-acylester spojený v 3-hydroxypolohe s (C₁₀-C_lg)-mastnou kyselinou. Navyše je výhodný disacharid, kde R² je N-pripojený 3-hydroxyC14mastná kyselina-acylester spojený v 3-hydroxypolohe s C12-mastnou kyselinou alebo Ci6-mastnou kyselinou, a kde R² je N-pripojený 3-hydroxyC14-mastná kyselina-acylester spojený v 3-hydroxypolohe s C|₂-mastnou kyselinou alebo C₁₄-mastnou kyselinou.

Je nutné uviesť, že v skupine Y môžu byť acylové skupiny a/alebo acylová a alkylová skupina navzájom spojené.

V tomto opise „zvyšok mastnej kyseliny“ znamená v podstate hydrofóbny reťazec s C₂-C₃₀ atómami, kde tento reťazec môže byť priamy, rozvetvený, nasýtený, monoalebo polynasýtený, majúci vložené jeden alebo viac heteroatómov ako je dusík, kyslík, síra, a kde tento reťazec môže byť substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi ako je hydroxyl, oxo, acyloxy, alkoxy, amino, nitro, kyano, halogén, sulfhydryl, s tou podmienkou, že nie je negatívne ovplyvnená biologická aktivita. Príklad zvyšku substituovanej mastnej kyseliny (obsahujúci amino-pripojený substituent) je opísaný v práci, ktorej autorom je Onozuka K. a spol. v Int. J. Immunopharmac., Vol. 15, str. 657 až 664 (1993)).

Substituenty R¹ môžu byť (CrC5)acyloxyskupma alebo (Ci-Cs)alkyloxyskupina, zatiaľ čo R⁴’ môže byť (Cr -C₅)acylová skupina alebo (C_rC₅)alkylová skupina s tou podmienkou, že glukozamínové disacharidy nie sú negatívne ovplyvnené. Navyše môže byť R¹ hydroxylová skupina a R⁴ môže byť vodík. Výhodne môže byť každý R¹ a R⁴' skupina, obsahujúca fosfor. Najmä takáto skupina v polohe 1 alebo 4' môže ovplyvňovať biologickú aktivitu, ako je odlišná stimulácia cytokínov (pozri Takada H. a Kotani S. v Bacterial Endotoxic Lipopolysaccharides, Morrison D. C.

SK 281944 Β6 aRyan J., CRC Press, vol. 1, str. 107 až 134 (1992), najmä str. 123). Výhodné disacharidy podľa vynálezu obsahujú dihydroxyfosfonoyloxyskupinu v polohe 1 a fosfonoskupinu v polohe 4', pričom skupina je v polohe 1 výhodne v a-konfigurácii.

Substituent R¹ môže byť tiež predstavovaný skupinou X. Skupina X je všeobecne pri fyziologickom pH negatívne nabitá. Skupina X môže byť karboxy(Ci-C₅)alkoxyskupina. Skupina X môže byť tiež dikarboxylová skupina vzorca -0-CH-KCH^COOHJKCHzKCOOH], kde m = O až 10 a n = 0 až 10, ako je man = 0 a n = 1, m = 1 an = 3. Substituenty dikarboxylovej kyseliny v polohe 1, kde m a n = 1 sú opísané v práci autora Onozuka a spol. (1993). Namiesto dikarboxylovej kyseliny skupina X môže predstavovať fosfono(Ci-C₅)alkylovú skupinu ako je fosfonometylskupina alebo fosfonoetylskupina.

Substituent X môže mať tiež formu sulfátovej skupiny alebo hydroxysulfonyl(Ci-Cs)alkoxyskupiny, ako je hydroxysulfonylmetylskupina.

Substituenty R³ a R^3, môžu byť krátka alkylová alebo acylová skupina, ktoré škodlivo neovplyvňujú endotoxicitu a/alebo biologickú aktivitu glukozaminových disacharidov podľa vynálezu. Príklady sú (CrCjjalkylskupina a (C_t-C₃)acylová skupina. Výhodne sú substituenty R³ a R^3- oba vodík, čo znamená, že 3-poloha a 3'-poloha nie sú acylované.

Substituent R⁴ v polohe 4 môže byť (C_rC₃)alkylová skupina alebo (C_rC₃)Acylová skupina, ktorých významy boli definované skôr. 4-O-acylovaný disacharid môže byť syntetizovaný s použitím metódy opísanej Kusumoto S. a spol., ACS Symposium Šerieš, Vol. 231, str. 237 až 254 (1983). Je výhodná v polohe 4 hydroxylová skupina (R⁴=H).

Substituent R^6, môže byť vodík, hydroxylová skupina, dihydroxyfosfonoyloxyskupina, dihydroxysul fonyloxyskupina a ich nabité formy.

Na účely zlepšenia rozpustnosti vo vode glukozamínových disacharidov podľa vynálezu, môže mať substituent v polohe 6' zreteľne hydrofilný charakter daný skupinou Z. Skupina Z môže byť 3-deoxy-D-mano-2-oktulozónová kyselina (KDO) alebo niektoré KDO molekuly, ako sú tie, ktoré sú prítomné vo vnútornom jadre prírodných polysacharidov priamo pripojené k lipidovej A zložke.

Skupina Z môže mať tiež kompletný alebo parciálny polysacharidový reťazec, ako je bočný reťazec pochádzajúci z prírodného lipopolysacharidu alebo jadrová zložka pochádzajúca z prírodných lipopolysacharidov.

Skupina Z môže tiež byť am ino(C₁-C₈)alkylkarboxylová skupina.

Rozpustnosť vo vode disacharidov podľa vynálezu je na jednej strane určená prítomnosťou nabitej skupiny, hydrofilným charakterom substituenta v polohe 6. Na druhej strane môže byť rozpustnosť vo vode zlepšená, ak je glukozamín disacharid vo forme soli, ako je soľ, zahrnujúca jeden alebo viac katiónov alkalických kovov a/alebo amóniový ión tvoriaci pár s napríklad dihydroxyfosfonyloxyskupinami, karboxylátovými skupinami, fosfonoskupinami, hydroxysulfonyloxyskupinami a hydroxysulfonylalkylskupinami, ak sú prítomné.

Akýkoľvek z alkylových a acylových reťazcov alebo skupín môže byť priamy, rozvetvený, nasýtený, mono- alebo polynasýtený, majúci vložený jeden alebo viac heteroatómov ako je dusík, kyslík, síra a kde tento reťazec môže byť substituovaný jedným alebo viacerými substituentmi ako je hydroxyl, oxo, acyloxy, alkoxy, amino, nitro, kyano, halogeno, sulfhydryl s tou podmienkou, že nie je podstatne nežiaducim spôsobom ovplyvnená biologická aktivita.

Glukozamínové disacharidy podľa vynálezu môžu byť získané z východiskového materiálu, obsahujúceho lipid A skupinu lipopolysacharidov, ktoré sú prítomné v mikroorganizmoch ako sú gramnegatívne baktérie. Tieto lipopolysacharidy sú napríklad prítomné na povrchu štruktúry, obsahujúcej frakciu týchto mikroorganizmov a v lipopolysacharidoch z nich pochádzajúcich. Výhodné gramnegatívne baktérie použité ako zdroj východiskového materiálu sú Escherichia coli a Haemophilus influenzae. Môžu však byť použité komerčne dostupné LPS alebo lipid A ako východiskový materiál.

Selektívna deacylácia v polohe 3 a 3' sa vykonáva použitím alkalického spracovania. Podmienky alkalického spracovania sú volené tak, že sú oba glukozamíny 3-hydroxy deacylované. Alkalické spracovanie môže byť vykonané s použitím hydroxidov, uhličitanov a fosforečnanov ako je hydroxid sodný alebo uhličitan draselný. Príklady organických alkalických činidiel sú alkylamíny ako je dietylamín a trietylamín. Alkalické spracovanie sa normálne vykonáva vo vodnom alebo organickom médiu. pH je typicky v rozmedzí 10 až 14, napríklad 11 až 13, za podmienok praktického vykonania je pH napríklad 12,2. Alkalické spracovanie sa normálne vykonáva pri teplote medzi teplotou okolia a 70 °C, napríklad pri 37 °C. Čas závisí od typu východiskového materiálu. Ak sa vychádza z mikroorganizmu, mení sa časová perióda medzi 1 hodinou a 10 dňami, napríklad 8 hodín a 5 dňami, ale normálne je v rozmedzí 8 až 40 hodín. Ak sa vychádza z lipopolysacharidov alebo lipidu A, môže byť časová perióda 0,2 až 10 hodín, napríklad 1 až 5 hodín. V praxi je časová perióda asi 1,5 až 3 hodiny.

Ak východiskový materiál obsahuje v 6'-polohe jadrovú zložku, ktorá má byť odstránená, podrobí sa východiskový materiál kyslému spracovaniu na odstránenie jadrovej zložky. Toto kyslé spracovanie môže byť uskutočnené pred alebo po zmienenom alkalickom spracovaní. Kyslé spracovanie sa vykonáva pri pH 1 až 5, vhodne pri pH v rozmedzí 2,5 až 4,5, normálne pri pH vyššom než 3 a nižšom než 4,5, napríklad 3,5. Pri pH 1 alebo nižšom je glukozamín disacharid defosforylovaný, čo vedie k monofosforylovanej forme. Kyseliny, ktoré môžu byť použité, sú minerálne a organické kyseliny, ako je kyselina chlorovodíková a ľadová kyselina octová. Časová perióda na kyslé spracovanie je asi 30 minút až 5 hodín, ako 1 až 2 hodiny. Počas kyslého spracovania sa teplota zvýši na asi 70 až 100 °C, napríklad 80 až 100 °C, prakticky 95 “C. Následne sa teplota zníži na teplotu okolia.

Glukozamínové disacharidy podľa vynálezu môžu byť tiež získané tak, že sa vychádza zo zodpovedajúceho de-, mono- alebo di-fosforylovaného glukozamínového diméru pripojením acyloxyacylovej skupiny, acylaminoacylovej skupiny a/alebo acyltioacylovej skupiny tak v 2-polohe, aj v 2'-polohe.

Po parciálnej deacylácii týchto glukozaminových disacharidov podľa vynálezu a oddelení sa získajú produkty glukozaminových disacharidov, majúce rozvetvenú acylovú skupinu v polohe 2 alebo polohe 2'.

Glukozamínové disacharidy podľa vynálezu môžu byť použité podľa vynálezu vo farmaceutickej kompozícii alebo v liečive ako imunomodulačné činidlo na inhibíciu, stimuláciu alebo vyvolávanie tolerovania produkcie reaktívnych medziproduktov obsahujúcich oxid dusnatý a cytokínov, v závislosti od frekvencie podania a od dávky, ako protinádorové činidlo, ako napríklad na T-bunkovú reaktiváciu, ako vakcínová zložka, ako kompetitor pre endotoxín väzbové miesta a ako modulátor interleukínov. Vďaka extrémne

SK 281944 Β6 nízkej endotoxicite sú tieto disacharidy celkom alebo v podstate zbavené vedľajších účinkov.

Disacharidy podľa predloženého vynálezu môžu byť aplikované systemicky alebo miestne s použitím intravenóznej injekcie, subkutánnej injekcie, intraperitoneálnej injekcie, intramuskulámej injekcie a podobne. Dávka sa bude meniť v závislosti od zvieracieho alebo ľudského pacienta, veku, telesnej hmotnosti, symptómov alebo choroby, ktoré majú byť ošetrované, požadovaného terapeutického účinku, spôsobu podania a podobne. Bezpečné účinky budú dosiahnuté s použitím dávky 0,001 až 500 mg/kg telesnej hmotnosti podávanej v jednom alebo viacerých dávkach ako forma s predĺženým uvoľňovaním.

Farmaceutická kompozícia môže obsahovať farmaceutický prijateľný nosič alebo riedidlo, napríklad na perorálne podanie vodných alebo nevodných roztokov, suspenzií a emulzií. Vodné roztoky alebo suspenzie môžu obsahovať destilovanú vodu alebo fyziologicky soľný roztok. Nevodné roztoky môžu zahrnovať propylénglykol, polyetylénglykol, rastlinné oleje ako je olivový olej, alkoholy. Kompozícia môže obsahovať iné aditíva ako sú ochranné látky, zmáčacie činidlá, emulgačné činidlá, dispergačné činidlá a podobne.

Na úplne pochopenie predloženého vynálezu je treba poukázať na nasledujúce príklady, ktoré sú uvádzané len z ilustračných dôvodov a v žiadnom prípade nijako neobmedzujú rozsah predloženého vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je znázornené FAB-MS spektrum disacharidu A a bližšie bude vysvetlené v príkladoch.

Na obr. 2 je znázornené FAB-MS spektrum disacharidu B a bližšie bude vysvetlené v príkladoch.

Na obr. 3 je znázornené ’H-NMR-spektrum disacharidu A.

Na obr. 4 a 5 sú znázornené ¹³C-NMR-spektrá disacharidu A.

Na obr. 6. a 7 je znázornená HPLC analýza.

Na obr. 8 je znázornená aktivita disacharidu v závislosti od jeho koncentrácie.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Escherichia coli 1-1147 (uložená v CNCM 3. októbra 1991 pod číslom 1-1147) bola kultivovaná v kultivačnom médiu zloženia, ktoré je opísané v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Zloženie kultivačného média (rozpusteného vo vode) pre E. coli 1-1147

Zložka	množstvo/1
inozín	0,200 g
monohydrát kyseliny citrónovej	0,300 g
kyselina glutámová	1.300 g
chlorid amónny	1,050 g
síran horečnatý.7HjO	1.110 g
dihydrogénfosfozečnan draselný
(KH3PO4)	1,360 g
arginin	0,300 g
uracil	0.100 g
chlorid vápenatý	0,017 g
chlorid sodný	2,000 g
oligokovy (zás.lOGOx kone.)	1 nl
L-leucin	10,0 g
L-lyzin.HCl	10.0 g
L-serín	10,0. g
L-metionín	10,0 B
L-valia	lo.o g
L-alanin	ío.o g
L-asparagín	10,0 g
glukóza (zás. 500 g/1)	5 ml

Oligokovový zásobný roztok: 2,5 g FeCl₂.4 H₂O, 0,25 g CoCl₂ . 6 H₂O, 0,25 g NaMoO₄ . 7 H₂O, 0,25 g MnSO₄ . 4 H₂O, 0,25 g ZnSO₄ . 7 H₂O, 0,25 g NiSO₄ . . 7 H₂O, 0,05 g H₃BO₄,0,05 g CuSO₄, potom sa pridá 1,0 1 H₂O, premieša sa a pridá 1,1 ml H₂SO₄ (85%).

pH kultivačného média sa upraví s použitím 5 M NaOH, 5% amoniaku alebo 25% HC1. Za prevzdušňovania a miešania (500 otáčok/minútu) sa kultivuje Escherichia coli

1-1147 pri 37 °C a pH 6,9.

Následne sa obsah fermentora inaktivuje tepelným spracovaním (105 °C, 2 minúty).

Inaktivovaný obsah fermentora sa ultrafiltruje (delenie 1000 kD) a zadržané baktérie sa premyjú s použitím vodného 0,6 % NaCl roztoku. Premytá bakteriálna suspenzia sa zakoncentruje ultrafiltráciou. Získa sa biomasa so suchou hmotnosťou 764 g.

Biomasa sa zriedi na 7,0 g/1 a podrobí sa alkalickému spracovaniu prídavkom 345 ml 10,7 M NaOH a inkubuje sa pri37°C 40 hodín (pH 12,2).

Alkalický extrakt sa podrobí prvej ultrafiltrácii (delenie 1000 kD) a druhej ultrafiltrácii permeátu (10 kD). Retentát druhej ultrafiltrácie sa podrobí kyslému spracovaniu.

Retentát sa zriedi 7,0 1 vody a okyslí sa použitím 370 ml ľadovej kyseliny octovej (konečné pH 3,52). Zmes sa zohrieva na 95 °C počas 120 minút za miešania Potom sa kyslá suspenzia ochladí na 25 °C. Zrazenina sa oddelí odstredením (4000 x g počas 50 minút). Peleta sa resuspenduje vo vode (3,7 1) a podrobí sa extrakcii s použitím propan-2-olu (4,3 1) a po 60 minútach pri 25 °C sa pridá 252 ml trietylamínu (pH 9,0) a v miešaní sa pokračuje 24 hodín.

Supematant sa získa odstredením (4000 x g, 25 °C počas 50 minút) a peleta sa reextrahuje dvakrát s použitím propan-2-olu 90 %. Supematanty sa spoja a podrobia chromatografii s reverznou fázou (Waters č. 10001, preparatívnaC₁₈,125).

Alternatívne sa kyslo spracovaný extrakt podrobí ultrafiltrácii a retentát (> 1000 kD) sa zahustí a dialyzuje proti 5 objemom vody. Dialyzovaný retentát sa zriedi 9 objemami propan-2-olu a pH sa upraví na hodnotu 9 trietylamínom (TEA). Extrakcia sa vykonáva za miešania počas 2 hodín.

Supematant sa odstráni ako je opísané a zrazenina sa reextrahuje propan-2-olom. Supematanty sa spoja a podro5

SK 281944 Β6 bia vákuovému zahusteniu (40 °C, 1596 Pa (12 torr)) a nakoniec sa podrobia chromatografii s reverznou fázou C₁₈ Prep Sep Pak (Waters č. 10001).

Každý z dvoch supematantov sa zriedi dvoma objemami vody a zmieša sa s 5 mM tetrabutylamóniumfosfátu (TBAP a nanesie sa na stĺpec, obsahujúci 50 g reverznej fázy C|_S Prep Sep Pak (Waters č. 10001, Preparative C|_S, 125 A) vopred spracovaného s 250 ml CH₃Cn : H₂O 1 : 1 (obj./obj.) + 5 mM TBAP.

Stĺpec sa premyje 60 % CH₃CN : H₂O 1 : 1, (obj./obj.) + + 5 mM TBAP a 40 % propan-2-olu:H₂0 9:1, (obj./obj.) + + 5 mM TBAP. Disacharidy podľa vynálezu sa eluujú vo frakcii, obsahujúcej 30 % CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj./obj.) + + 5 mM TBAP a 70 % propan-2-olu : H₂O 9:1, (obj./obj.) + 5 mM TBAP.

Disacharidová frakcia získaná v chromatografii s reverznou fázou sa zriedi vodou 1 : 1 (obj./obj.) + 25 mM TBAP a nanesie sa na preparatívny HPLC stĺpec (Millipore-Waters Bondapack C18 300 15 M, 300 mm x 47 mm). Disacharidová frakcia podľa vynálezu sa eluuje 67 % propan-2-olom:H₂O 9:1, (obj./obj.) + 25 mM TBAP a 33 % CH₃CN : H₂O 1 : 1, (obj./obj.) + 25 mM TBAP. Táto frakcia obsahuje 55 mg disacharidu A podľa vynálezu.

Odsolenie disacharidu

Soľ bola odstránená z podielu disacharidovej frakcie nasledovne. Sep Pak Vac C₁₈ Plus kolóna (silica C₁₈, 0,6 ml, Waters č. 20515) sa kondicionuje postupne vstrekovaním 5 ml CHC1₃-CH₃OH 2 : 1, (obj./obj.), 5 ml CH₃CN a 5 ml CH₃CN : H₂O 1 : 1, (obj./obj.). Vzorka sa pridá na kolónu po zriedení HPLC frakcie 3 objemami H₂O a získa sa celkom 6 ml zriedenej vzorky. TBAP sa potom odstráni 10 ml CH₃CN : H₂O 1 : 1, (obj./obj.) + 10 ml mM HC1 a následne 10 ml CH₃CN. Čistý disacharid A sa potom odstráni 5 ml CHC1₃-CH₃OH 2:1, (obj./obj.).

Frakcie sa sušia odparením za vákua (1596 Pa (12 torr)) pri 35 °C. Odsolený disacharid A sa znova rozpustí v H₂O : TEA 1000 : 1, (obj./obj.) pre biologické a biochemické testy v chloroforme:metanole 2:1, (obj./obj.) pre FABMS.

Príprava formy sodnej soli

Kolóna, obsahujúca 10 g reverznej fázy C₁₈ Prep Sep Pak (Waters č. 10001, Preparative C₁₈,125 A) bola vopred kondicionovaná postupne 50 ml CH₃CN a 50 ml CH₃CN : : H₂O 1 : 1 (obj./obj.).

Vzorka (HPLC frakcia) sa vloží na kolónu po zriedení 1 objemom H₂O. Po adsorpcii sa kolóna premyje 100 ml CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj./obj.) + 5 mM TBAP. Disacharid sa potom odstráni 50 ml propan-2-olu : H₂O 9 : 1 (obj./obj.) + 5 mM TBAP.

Výsledná frakcia sa čistí nasledovne. Kolóna, obsahujúca 20 ml Q-Sepharose fast ílow (Pharmacia 0510-01) sa kondicionuje postupne s 30 ml NaOH IM, premyje H₂O na neutralizáciu, 30 ml HC1 IM a premyje H₂O na neutralizáciu.

Vzorka sa aplikuje priamo na kolónu. Po adsorpcii sa neadsorbovaný materiál odstráni 200 ml H₂O a 100 ml propan-2-olu : H₂O 9 : 1, (obj./obj.). Disacharid sa eluuje 100 ml NaCl 0,9 %:izopropanolu 1: 1 (obj./obj.).

Konečné čistenie sa vykonáva nasledovne. Kolóna, obsahujúca 10 g reverznej fázy C₁₈ Prep Sep Pak bola vopred kondicionovaná postupne 50 ml CH₃CN, 50 ml CHC1₃-CH₃OH 2:1, (obj./obj.), 50 ml CH₃CN a 50 ml 50 % CH₃CN : H₂O 1:1, (obj./obj.). Vzorka sa vloží na kolónu po zriedení 1 objemom vody. Po adsorpcii sa kolóna postupne premyje 200 ml H₂O, 200 ml propan-2-olu:H₂0 9:1, (obj./obj.) a 50 ml CH₃CN. Disacharid sa eluuje 50 ml CHC1₃-CH₃OH 2 : 1, (obj./obj.). Frakcia sa suší odparením za vákua (1596 Pa (12 ton)) pri 35 °C.

Sodná soľ bola ľahko rozpustná vo vode (až 100 mg/ml).

Príklad 2

Haemophilus influenzae (zakúpený od National Collection of Type Cultures (ATCC 9795)) bol kultivovaný v kultivačnom médiu, ktorého zloženie je uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Zložka	množstvo/1
chlorid sodný	2 g
monohydrogénfosforečnan sodný	2 g
octan sodný	0.5 g
aneurín	0,003 g
kyselina nikotínová	0,003 g
70% roztok mliečnanu sodného	2 ml
60% roztok mliečnanu amónneho	2 ml
mftsový extrakt	7.5 g
peptón	15 g
sójový peptón	i g
tryptón	3 g
kvasnicový extrakt	7.5 g
glukóza	3 g

Kultivačné médium bolo doplnené hemínom (10 mg/1) a NADH (4 mg/1). pH sa upraví na 7,0 +0,3 s použitím 5 M NaOH alebo 25 % HC1. Po začatí tvorby stacionárnej fázy kultivácie bola prerušená a obsah fermentora bol inaktivovaný tepelným spracovaním (100 °C počas 100 sekúnd). Inaktivovaná kultúra bola podrobená odstreďovaniu a oddelená biomasa bola zriedená 0,6 % vodným NaCl roztokom (približne 60 g/1). Alkalické spracovanie bolo vykonané prídavkom 10 M NaOH na konečnú koncentráciu 0,2 M NaOH. Spracovanie sa vykonáva pri 37 °C počas 5 dní za kontinuálneho miešania.

Alkalický spracovaný lyzát sa priamo podrobí spracovaniu kyselinou po okysleni na pH 3,5 s použitím ľadovej kyseliny octovej. Zmes sa zohrieva na 95 °C 120 minút, a potom sa ochladí na teplotu miestnosti.

Zrazenina sa odstreďuje (10 000 x g, 30 minút pri 4 °C) a supematant sa odloží.

Zrazenina sa resuspenduje vCH₃CN : H₂O 1:1, (obj./obj.) a pH sa upraví na 9 s použitím TEA. Po odstredení (15 000 x g, 10 minút) sa supematant upraví na 5 mM TBAP. Supematant sa nanesie na Sep Pak Vac C|₈ kolónu (10 g silica C|₈, 35 ml ml, Waters č. 43345) kondicionovanou s použitím 50 ml CH₃CN : H₂O) 1 : 1 (obj./obj.). Frakcia, obsahujúca disacharid B podľa vynálezu, sa eluuje 50 ml propan-2-olu : H₂O 9 : 1, (obj./obj.) + 5 mM TBAP.

Táto frakcia sa zahustí odparením (35 °C, 1596 Pa (12 torr)) na asi 2 ml. Frakcia sa odstreďuje (15 000 x g, 5 minút) a supematant sa aplikuje na semipreparatívnu HPLC C₁₈ kolónu (Macherey-Nagel č. 715806, 250 mm x x 10 mm, Nucleosil 300-7C18). Frakcia, obsahujúca disacharid B podľa vynálezu sa eluuje vo frakcii, obsahujúcej 28 % CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj./obj.) + 25 mM TBAP a 72 % propan-2-olu:H₂O 9 :1 (obj./obj.) + 25 mM TBAP.

Disacharid B sa odsolí s použitím spôsobu podobného spôsobu podľa príkladu L

SK 281944 Β6

Príklad 3

Lipopolysacharidy z Escherichia coli 0111 :B4 (sigma Product No. L3024) boli podrobené alkalickému spracovaniu v 0,2 M NaOH pri 37 °C počas 1,5-hodiny. Roztok bol neutralizovaný použitím 1 M kyseliny fosforečnej.

400 μΐ alkalický spracovaného LPS roztoku bol zahustený ultrafiltráciou (Millipore Ultrafree-MC, UFC3 LGC 00, delenie 10 kD).

Retentát (> 10 kD) bol zriedený v 400 μΐ H₂O a podrobený kyslému spracovaniu úpravou na 0,2 M kyselinu octovú s použitím ľadovej kyseliny octovej. Okyslený roztok bol zahrievaný na 95 °C počas 120 minút. Po ochladení na 25 °C bola zrazenina odsedimentovaná odstreďovaním (15 000 x g, 10 minút) a supematant bol odložený. Zrazenina bola rozpustená v 20 μΐ H₂O: TEA 1000 :1 (obj./obj.) a tento roztok bol aplikovaný na analytickú HPLC C₎₈ kolónu (Supelco No. 58985, Supelcosil LC-18, 3 pm, 150 mm x 4,6 mm). Disacharidové frakcie podľa vynálezu eluujú vo frakcii, obsahujúcej 42 % CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj./obj.) + 5 mM TBAP.

Príklad 4

Roztok 2 mg/ml lipidu A z Escherichia coli F-583 (Sigma, Product No. L5399) bol pripravený v H₂O : TEA pri 1000 : 1 (obj./obj.) a tento roztok bol podrobený alkalickému spracovaniu s použitím 0,2 M NaOH pri 37 °C počas 2,5-hodiny. Roztok bol neutralizovaný s použitím 1 M kyseliny fosforečnej.

Neutralizovaný roztok bol nanesený na analytickú HPLC kolónu (Supelco No. 58958, Supelcosil LC-18, 3 pm, 150 mm x 4,6 mm). Disacharidy podľa vynálezu eluujú pri 42 % CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj./obj.) + 5 mM TBAP a 59 % propan-2-olu : H₂O 9 : 1 (obj./obj.) + 5 mM TBAP.

Príklad 5

2-Amino-2-deoxy-6-0-(2-amino-2-deoxy-4-0-fosfono-p-D-glukopyranosyl)-a-D-glukopyranosyl-dihydrogenfosfát (Holst a spol. Eur. J. Biochem. 214 (1993) 695 až 701) sa spracuje v metanole s metoxidom sodným (presne 4,0 mol ekv.), a potom anhydridom (R)-3-dodekanoyloxytetradekánovej kyseliny (2,2 mol. ekv.) (pripravený reakciou kyseliny (R)-3-dodekanoyloxytetradekánovej s DDC (0,5 mol. ekv.) v bezvodom dichlórmetáne, pozri. Charon a spol., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. (1984) 2291 až 2295. Po 12 hodinách pri teplote miestnosti sa pridá voda (2x objem metanolu) a zmes sa extrahuje dietyléterom (na odstránenie kyseliny 3-dodekanoyloxytetradekánovej). Vodná fáza sa zahusti a surový disacharid C podľa vynálezu sa podrobí HPLC s reverznou fázou. Produkt sa rozpustí v H₂O : TEA 1000 : 1 (obj./obj.) a tetrabutylamóniumfosfát (TBAP) na koncentráciu 5 mM. Tento roztok sa potom nanesie na preparatívnu HPLC kolónu (Millipore-Waters Bondapak C18 300 15 M, 300 mm x 47 mm). Disacharid C sa eluuje s gradientom CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj./obj.) + + 25 mM TBAP (rozpúšťadlo A) a propan-2-olom:H₂O 9 : : 1 (obj./obj.) + 25 mM TBAP (rozpúšťadlo B) (50 % A/50 % B až 0 % A:100 % pri 10 % minútu, prietok 80 ml/minútu). HPLC frakcia, obsahujúca disacharid C sa zriedi vodou, a potom nanesie na C_I8-Sep Pak Vac Plus kolónu (Waters) (C 18 reverzná fáza silikagél vopred kondicionovaný postupne s CHC1₃ : CH₃OH 2 : 1 (obj./obj.), CH₃CN, CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj./obj.)). TBAP sa odstráni premývaním postupne sCH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj./obj.), mM HC1 a CH₃CN. Čistý disacharid sa eluuje CHC1₃ s CHC1₃. CH₃OH 2 : 1 (obj./obj.).

Príklad 6

Vodná fáza, obsahujúca disacharid C získaný v príklade 5 (pred čistením) sa spracuje s vodným hydroxidom sodným (presne 1,0 mol. ekv.; koncentrácia poskytujúca počiatočné pH 12,5), po 24 hodinách pri teplote miestnosti sa zmes upraví na pH 6,5 až 7 a nanesie na preparatívnu HPLC kolónu (Millipore Waters Bondapack C18 300 15 M, 300 mm x 47 mm). Disacharidy A a D sa eluujú gradientom CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj./obj.) + 25 mM TBAP (rozpúšťadlo A) a propan-2-ol:H₂O 9 : 1 (obj./obj.) + + 25 mM TBAP (rozpúšťadlo B) (75 % A:25 % B až 0 % A; 100 % B pri 1 %/min., prietok 80 ml/minútu). HPLC frakcia, obsahujúca disacharidy A a D sa odsolí ako je opísané pre disacharid C v príklade 5.

Porovnávací príklad (nie podľa vynálezu)

Roztok 10 mg/ml lipidu A z Escherichia coli F-583 (Sigma Product No. L5399) sa pripraví v H₂O : trietylamín pri 1000 : 1 (obj./obj.) a následne sa podrobí alkalickému spracovaniu s 0,2 M NaOH pri 37 °C počas 20 minút. Táto časová perióda bola dostačujúca len na 3-O-deacylovaný lipid A (Myers a spol. v Cellular and Molecular Aspects of Endotoxin Reactions, str. 145 až 156 (1990), Elsevier Science Publishers).

Roztok sa neutralizuje kyselinou ortofosforečnou. Pre biologické eseje sa zriedi v 0,1 % TEA/0, 9% NaCl a použije bez ďalšieho čistenia.

Pre FAB-MS sa vzorka alkalický spracovaného lipidu A čistí HPLC s reverznou fázou (Supelco No. 58985, Supelcosil LC18, 3 pm, 15 mm x 4,6 mm). Hlavný pík, eluujúci pri 18 % CH₃CN : H₂O 1 : 1 (obj./obj.) + 5 mM TBAP a 82 % propan-2-ol: H₂O 9 :1 (obj./obj.) + 5 TBAP sa odsolí za podmienok opísaných v príklade L FAB-MS analýza poskytuje molekulárny ión s 1570,1 hmotnostnými jednotkami (vypočítané 1569,1 hmotnostných jednotiek).

Fyzikálno-chemické charakteristiky disacharidov podľa vynálezu

Disacharidy A a B získané v príkladoch 1 a 2 boli podrobené fyzikálno-chemickej charakterizácii.

Glukozamín bol stanovený po kyslej hydrolýze (4 M HC1, 16 hodín, 100 °C, argónová atmosféra) a derivatizáciou s použitím fenylizotiokyanátu a následnej kvantitatívnej analýzy pomocou HPLC (pozri Anumula K. R. a spol., Analytical Biochcmistry, Vol. 179, str. 113 až 122 (1991)).

Celkové mastné kyseliny boli stanovené po kyslej hydrolýze (4 M HC1, 4 hodiny, 100 °C) metyláciou s použitím BFj za prítomnosti metanolu a kvantitatívnym stanovením plynovou chromatografiou (kolóna OV-1, Hewlett Packard) (pozri Miller L. Gas-Liquid Chromatography of Cellular Fatty Acids as a Bacterial Identification Aid, Gas Chromatography Application Note, str. 228 až 237 (1984)).

Esterovo naviazané mastné kyseliny boli stanovené plynovou chromatografiou po spracovaní s použitím NaOCH₃ (pozri Rictschcl E. T. a spol., European Joumal of Biochemistry, Vol. 28, str, 166 až 173 (1972)).

Fosfáty boli stanovené metódou podľa Amesa (pozri Ames B. N., Methods in Enzymology, Vol. 8, str. 115 až 118(1966)).

Kyselina 3-deoxy-D-mano-2-oktulozónová (KDO) bola stanovená s použitím metódy Karkhanisa Y. D. a spol. (Analytical Biochemistry, Vol. 58, str. 595 až 601 (1978)).

Roztok disacharidu A obsahuje 2,1 pmol/ml fosfátu, 1,9 pmol/ml glukozamínu, 1,0 pmol/ml C₎₂. _omastnej kyseliny a 2,2 pmol/ml 3OH-C|₄ . _omastnej kyseliny. Len C_{12 o}mastná kyselina bola detegovaná po uvoľnení zvyškov esterovo napojenej mastnej kyseliny, ukazujúc, že zvyšky 3OH-C₎₄.omastnej kyseliny boli amidovo napojené. KDO nebola detegovaná (>1 mol na 10 ml disacharidu A).

V súlade s tým obsahuje disacharid na mol 2 mol fosfátu, 2 mol glukozamínu, 2 mol 3OH-C_{14 : o}mastnej kyseliny a 1 mol C₁₂. omastnej kyseliny.

Hmotnostná spektroskopia s bombardovaním rýchlymi atómami (FAB-MS), negatívny móde vzorky vCHCl₃ : : CH₃OH 1 : 1 (obj./obj.), koncentrácia 1 mg/ml. Bol použitý VG ZAB-2SE hmotnostný spektrometer pri V_acc8 kV na získanie spektra pri 30 kV a emisnom prúde 1 μΑ. Spektrometer je kalibrovaný s použitím jodidu cézneho. FAB-MS spektrum je uvedené na obr. 1. Disacharid A ukazuje molekulový pík pri 1133,55 hmotnostných jednotkách (vypočítaná hmotnosť 1133,3). Iné piky potvrdzujú fragmentáciu produktu počas analýzy. Pík 1053,5 predstavuje stratu fosfátovej skupiny a 951,3 stratu C₁₂mastnej kyseliny

FAB-MS spektrum disacharidu B je uvedené na obr. 2 a má molekulárny pík pri 1161,8 hmotnostných jednotkách (vypočítané 1161,3). Pík pri 1183,8 hmotnostných jednotkách predstavuje adíciu sodíka. Pík pri 951,6 predstavuje stratu C_]4mastnej kyseliny. Pík pri 973,6 hmotnostných jednotkách predstavuje fragment piku 951,6 so sodným iónom.

'H-NMR-spektrum (Bruker 360 MHz) disacharidu A (sodná soľ v D20) je uvedené na obr. 3 a jeho ⁿC-NMR-spektrum (Bruker 90 MHz) je uvedené na obr. 4 a 5 (expandovaná stupnica).

Štruktúrne vzorce nasledujúcich p-D-glukozamín-(l-6)-a-glukozamínových disacharidov: *disacharid A: (2-deoxy-6-0-[2-deoxy-2-[(R)-3-dodekanoyl-oxytetradekanoylamino]-4-O-fosfono-P-D-glukopyranosyl]-2-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-a-D-glukopyranosyldihydrogénfosfát), *disacharid B: (2-deoxy-6-O-[2-deoxy-2-[(R)-3-tetradekanoyloxytetradekanoylamino]-4-O-fosfono-P-D-glukopyranosyl]-2-[(R)-3— hydroxytetradekanoylamino]-a-D-glukopyranosyldihydrogénfosfát), ♦disacharid C: (2-deoxy-6-O-[2-deoxy-2-[(R)-3-dodekanoyl-oxytetradekanoylamino]-4-0-fosfono-P-D-glukopyranosyl]-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-a-D-glukopyranosyldihydrogénfosfát), ♦disacharid D: (2-deoxy-6-O-[2-deoxy-2-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-4-0-fosfono-[J-D-glukopyranosyl]-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-a-D-glukopyranosyldihydrogénfosfát) sú uvedené ďalej.

B λ

Endotoxicita a biologická aktivita disacharidov podľa vynálezu

Endotoxicita a biologická aktivita disacharidu A (príklad 1) a disacharidu B (príklad 2) bola stanovená a porovnaná s týmito vlastnosťami lipopolysacharidu pochádzajúceho z Esterichia coli 0111:B₄ (Sigma, Product No. L3024), lipidu A (sigma, Product No. L3599, použitý ako východiskový materiál v príklade 4) a 3-O-deacylovaného lipidu A pochádzajúceho z lipidu A Escherichia coli F583 (pripravený v porovnávacom príklade), ale bez čistenia pomocou HPLC.

1. Endotoxicita

Endotoxicita bola stanovená v teste Limulus amoebocyte lyzátu (LAL). Tento test je založený na pozorovaní, že endoxíny indukujú koaguláciu hemolymfu Limulus polyphemus.

V gelifikačnom teste sériových riedení bola testovaná zlúčenina zmiešaná s LAL 1 : 1 (obj./obj.) (Haemachem Inc., citlivosť LAL 0,06 endotoxínových jednotiek/ml) a zmes bola inkubovaná počas 1 hodiny pri 37 °C. Potom bola sledovaná tvorba gélu meraním optickej hustoty pri 405 nm. Posledné riedenie, ktoré vytváralo gél, bolo stanovené preklopením reakčných mikroplatní. Endotoxínová aktivita vo vzorcoch bola stanovená porovnaním s riedeniami lipopolysacharidového štandardu (1 endotoxínová jednotka = 0,1 ng LPS).

Endotoxicita bola tiež meraná v chromogénnom teste, v ktorom bola aktivácia proteázy v LAL pri LPS meraná s použitím chromogénu (Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA; Bio Whittaker Kit No. 50-650U). Tvorba farby (uvoľnenie pNA (p-nitroanilín) bola meraná pri 405 nm.

Vzorky boli predinkubované pri 37 °C počas 10 minút a následne bol pridávaný chromogén, obsahujúci LAL. Bol meraný čas vyžadovaný na dosiahnutie optickej hustoty 0,2

SK 281944 Β6 pri 405 nm. Endotoxínová aktivita bola vypočítaná v porovnaní s referenčnou krivkou získanou z LPS štandardu.

Výsledky sú vyjadrené v tabuľke 3 ako ng LPS na ng produktu.

Tabuľka 3

Endotoxická aktivita v LAL (ng/ng)

Typ testu E.coli lipid 3-0-dea- disacha- disacha- iaonoLPS*) A cylova- rid A rid B fosfoný ryl lipid A disacharid

A

gelifikácia 0,9*0,4 0,6*0,3 1,0*0,1	0,003a 0.002 (n«12)	0,004* 0.0031*
(o-6) (n=3)	(n-2)	0,002 (n=<7)	0,0013 (n-10)
chronogén 0,70 0,7*0,3	1,7*0,95	0,0014*	0,0008* 0,0016*
(n-1) (n-3)	(n-3)	0,0013	0,0006	0,0009
		(n-9)	(n-7)	(n-10)

*) Endotoxínová aktivita LPS v LAL = 1 ng/ng, experimentálne dáta sú v rozsahu 0,3 až 3 ng/ng.

Táto tabuľka 3 ukazuje, že disacharidy A a B podľa vynálezu majú nízku endotoxicitu, najmä s ohľadom na

3-O-deacylovaný lipid A podľa US-A-4912094.

2. In vitro biologická aktivita vyvolaná v makrofágoch C57BL/6myší

Kostná dreň bola odobraná z bedrového kĺbu, femoru a tíbie šesť týždňových samčekov C57BL/myší. Po homogenizácii suspenzie drene v Dulbecco modifikovanom médiu a odstredení, bola peleta resuspendovaná v Dulbecco modifikovanom médiu a bunky boli kultivované v koncentrácii 4 x 10⁵ buniek na ml v rovnakom médiu doplnenom 30 % supematantu L-929 fibroblastov (bežný zdroj kolónie stimulujúceho faktora 1 (CSF-1)) a 20 % konského séra.

Po 7 dňoch boli zrelé makrofágy oddelené a resuspendované v Dulbecco modifikovanom médiu, obsahujúcom 5 % fetálneho teľacieho séra na koncentráciu 7 x 10⁶ buniek na ml. Táto bunková suspenzia bola zmiešaná 1 : 1 (obj./obj.) so vzorkami zriedenými v rovnakom médiu a použité v biologických testoch vykonaných v mikroplatniach so 000 bunkami/jamka (inkubácia pri 37 °C počas 32 hodín, 100 % vlhkosť a 8 % CO₂).

Produkcia oxidu dusnatého (NO)

Oxid dusnatý (NO) je produkovaný makrofágmi v odozve na bakteriálnu infekciu a najmä PLS. NO sa javí ako majúci cytostatické a cytotoxické vlastnosti. NO je extrémne reaktívny a rýchlo sa oxidáciou premieňa na dusitan a dusičnan.

Tvorba dusitanu bola stanovená s použitím Griessovho testu (prídavok 1 : 1, obj./obj.) N-(l-naftyl)etyléndiamínhydrochloridu (1 g/1 vo vode) a p-aminobenzénsulfónamidu (10 g/1 v 50 H₃PO₄). Koncentrácia dusitanu v supematantoch aktivovaných makrofágov bola vypočítaná v porovnaní k NaNO₂ štandardom.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.

Tabuľka 4

NO-produkcia v supematantoch makrofágov stimulovaných LPS a príbuznými produktmi

Produkt	Daxinua aktivity ’)	niniaun aktivity ·)	aktivita 50« ')	NO aktivita pri 50« v naol N0j-/nl··)	počet analýz
LPS B.coll	100	0,0004	0,01	7	n— 6
lipid A	50	0,005	0.07	5	n-7
3-O-deacylovaný lipid A	SO	0,005	0,16	S	n-3
disacharid A	50	0,016	0,16	5	n—6
disacharid B	16	0,00$	0,005	5	n—1
nonofosfo ryl disacharid A	50	5	8	4	n—1

*) Koncentrácia produktu vyjadrená ako pg/ml, zodpovedajúca indukovanej NO aktivite.

*♦) Koncentrácia v N0₂/ml extrapolovaná z krivky postupného riedenia.

LPS vyvoláva najvyššiu NO produkciu. Lipid A, 3-O-deacylovaný lipid A disacharid A a disacharid B indukujú rádovo rovnakú produkciu NO.

Disacharidy A a B indukujú NO-produkciu v makrofágu tak silno ako lipid A a 3-O-deacylovaný lipid A.

Produkcia interleukínu-ΐα (IL-la)

IL-la je produkovaný mnohými bunkami, zahrnujúcimi makrofágy, ak sú stimulované LPS. Niektoré správy o IL-la aktivitách uvádzajú aktiváciu T-buniek, indukciu IL-2 receptorovej expresie a cytokín génovej expresie v T-bunkách, na stimuláciu B-bunkovej proliferácie a Ig sekrécie a obohatenie IL-2 a IFN-indukovanej aktivácie NK-sprostredkovanej cytotoxicity, indukciu akútnej fázy syntézy proteínu a indukciu horúčky.

Koncentrácia IL-la v supematantoch makrofágov bola meraná ELISA testom (kit GENZYME, Intertest-1 a).

Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 5.

Tabuľka 5

Produkcia IL-la v supematantoch makrofágov stimulovaných LPS a príbuznými produktmi

Produkt najvyššia skúšaná koncentrácia ainlnálna delegovaná koncentrácia 500 pg/nl koncentrácia

	kone.	IL-la (Pg/nl)	IL-la (pg/nl)	kone. (pg/nl)	IL-la (pg/»l)
slepýTEA 0,1« LPS	500	<15’)	<15*)		<15 *)
B.coli	1600	295*129	170*·)	1,56	18*4
lipid A 3-0-deacylovaný	500	53*35	53*35	50	17*8
lipid A disacha-	500	56*19	56*19	160	21*6
rid A	$00	75±4S	75*45	16	19*11

♦) Hranica detekcie testuje rádovo 15 pg/ml.

**) IL-la koncentrácia extrapolovaná z krivky sériového riedenia.

Nebolo možné stanoviť maximálmu produkciu IL-la, pretože produkcia sa ešte zvyšovala pri najvyššej použitej koncentrácii.

SK 281944 Β6

Vyvolanie IL-Ια produkcie pri koncentrácii 500 pg/ml nie je významne rozdielna pre lipid A, 3-O-deacylovaný lipid A a disacharid A. LPS vyvoláva produkciu IL-Ια oveľa silnejšie.

IL-Ια produkcia disacharidu A je aspoň taká silná ako pri lipide A a 3-O-deacylovanom lipide A.

Produkcia interleukínu-6 (IL-6)

IL-6 sa produkuje aktivovanými monocytmi alebo makrofágmi, T- a B-lymfocytmi, IL-6 indukuje veľa iných proliferácii určitých typov buniek, rastovú inhibíciu určitých melanómových bunkových línií, diferenciáciu B-lymfocytov a stimuláciu IgG sekrécie, diferenciáciu cytotoxických T-buniek a slabú antivirálnu aktivitu.

IL-6 koncentrácia v supematantoch makrofágov bola stanovená ELISA testom (kit ENDOGEN, EM-IL-6).

Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 6.

Tabuľka 6

Produkcia IL-Ια v supematantoch makrofágov stimulovaných LPS a príbuznými produktmi

Produkt najvyššia skúšaní koncentrácia koncentrácia 500 pg/nl kone. IL-6 kon. IL-6 nininálna delegovaná koncentrácia kone. IL-6 (pg/nl) (pg/nl) (pg/nl) (pg/nl) (pg/nl) (pg/»l)

slepý TEA 0,1* LPS	500	1150180
E.coli	1600	1386012750
lipid A	160 až	2800 až
	0,016	2200’)
3-0-deacylovený lipid A	150 až	3000 až
	0.016	2200’
disacha-
rid A	50	570012650

710*240

0,006	24001960	0.3	6950
0,016	2460150	ND**)	nd”:
0,016	24101160	ND**)	nd”:
0,016	8301350	1	2850

*) Indukovaná aktivita je relatívne konštantná v testovanom rozmedzí a neposkytuje maximum.

**) ND = nestanovené

Aktivita indukovaná najslabšou koncentráciou testovaného produktu (0,016) je ešte väčšia než 50 % aktivita.

Stimulácia IL-6 sekrécie disacharidom A je významne nižšia než pri LPS. Aj napriek tomu disacharid A indukuje IL-produkciu v makrofágoch silnejšie než lipid A a 3-O-deacylovaný lipid A.

Produkcia tumor-nekrosis-faktora-alfa (TNF-a)

TNF-a je hlavne produkovaný makrogágmi a monocytmi stimulovanými LPS. Aktivity indukované TNF-a majú inter alia antivirálnu aktivitu, cytolytickú a cytostatickú aktivitu pre určité bunkové typy, rast určitých bunkových línií, antigénovú expresiu ako je hlavný histokompatibilný komplex triedy I a II, nekrózu metylcholantrénom indukovaného sarkómu, aktiváciu polymorfonukleámych leukocytov (PMN), osteoklastovú aktiváciu a kostnú resorpciu. TNF-α je tiež základný mediátor v toxickom šoku a sepsii.

Koncentrácie TNF-α v supematantoch makrofágov bola stanovená ELISA testom (kit GENZYME, Factor-test mTNF-a).

Výsledky sú uvedené v tabuľke 7.

Tabuľka 7

Produkcia TNF-α v supematantoch makrofágov pomocou LPS a príbuznými produktmi koncentrácia nininálna detegovaná 500 pg/ml

TOF-s (P8/-1)

Produkt najvyššia skúšaná koncentrácia kone. TNF-a (pg/nl) (pg/nl) koncentrácia kone. TNF-a (pg/nl) (pg/nl)

slepý»	500	13819	13819	0	<100’)
TEA 0,1¾ LPS E.coli	100 až	257 až	130**’)	0,006	175155
lipid A	6,25 500	284 223164	223164	0,016	11819
3-0-deacylovaný lipid A	500	311172	311172	0,016	15516
disacharid A	500	5301139	S30H39	0,16	159143

*) Hranica detekcie testu je rádovo 100 pg/ml.

**) TNF-α koncentrácia je relatívne konštantná medzi 100 a 6,25 pg/ml.

***) TNF-α koncentrácia je extrapolovaná z krivky postupného riedenia

Nebolo možné stanoviť maximálmu produkciu TNF-a, pretože produkcia sa ešte zvyšovala pri najvyššej použitej koncentrácii.

Na rozdiel od iných testov bola produkcia TNF-α indukovaná LPS nižšia než pri disacharidoch A. Disacharid A indukuje TNF-α rovnako alebo silnejšie než lipid A alebo 3-O-deacylovaný lipid A.

Prostaglandín E2 (PGE2) produkcia

PGE1 a PGE2 sú hlavné metabolity arachidonovej kyseliny makrofágmi stimulovanými LPS, TNF-α alebo IL-6. PGE má imunomodulačné aktivity T- a B-lymfocytov. Javí sa ako indukujúca stimuláciu Th2 a inhibíciu Thl T-lymfocytovú subpopuláciu a obrat v izotype imunoglobulinov.

PGE2 koncentrácia v supematantoch makrogágov bola meraná RIA-testom (kit PAESEL + LOREI, 36-104-6001 Prostaglandín E2 3H-RIA Kit).

Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 8.

Tabuľka 8

Produkcia PGE2 v supematantoch makrofágov stimulovaných LPS a príbuznými produktmi

Produkt	najvyššia koncentrácia indukovanej aktivity	nininálna koncentrácia indukovanej aktivity
kone. (pg/nl)	PGE2 (pg/nl)	kone.	PGE2 (pg/nl)
slepý
TBA 0,1%	500	<80‘)	-	<80*)
LPS E.coli	1600	1120*135	6,25	135129
lipid A	500	<80“)	-	<80 *)
3-0-deacylo-
vaný lipid A	500	240125	500	240125
disacha-
rid A	500	540165	16	80141

*) Hranica detekcie testuje rádovo 80 pg/ml.

SK 281944 Β6

Nebolo možné stanoviť maximálnu produkciu PGE2, pretože produkcia sa ešte zvyšovala pri najvyššej použitej koncentrácii. Stimulácia PGE2 produkcie disacharidom A je výrazne nižšia než a LPS. Aj napriek tomu disacharid A bol aktívnejší než lipid A a 3-O-deacylovaný lipid A. Lipid A neindukoval PGE2 produkciu a 3-O-deacylovaný lipid A len v najvyššej použitej koncentrácii.

Záver

Disacharidy podľa vynálezu sú aktívne in vitro a indukujú produkciu NO, IL-Ία, IL-6, TNF-a a PGE2. Disacharidy podľa vynálezu sú tak aktívne alebo aj aktívnejšie než lipid A a 3-O-deacylovaný lipid A, ale majú podstatne redukovanú endotoxicitu ako bolo stanovené LAL testom. Nižšia aktivita lipidu A a 3-O-deacylovaného lipidu A by mohla byť spôsobená rozdielmi v čistote. Disacharidy A a B sú čistené HPLC, lipid A je komerčný biologický preparát (Sigma L-5399) a 3-O-deacylovaný lipid A sa pripraví podľa US-A-4912054, vychádza sa z komerčného prípravku lipidu A. Len produkt s vyššou aktivitou je LPS, ktorý indukuje všeobecne vyššiu odozvu a vyžaduje nižšiu koncentráciu na vyvolanie významného signálu.

3. In vivo biologická aktivita

In vivo biologická aktivita disacharidu A bola hodnotená na protinádorovú aktivitu proti peritoneálnej karcinomatosis indukovanej v BDIX krysách. Pre b bunky získané podľa metódy Martina (Martin F. a spol., Intemational Joumal of Cancer, Vol. 32, str. 623 až 627 (1983)) boli injektované intraperitoneálne krysám (10⁶ buniek na krysu). Po 10 dňoch sa objavujú tuhé uzlíky v mesentériu ako mliečne škvrny a progresívne postupujú do peritoneálnej dutiny (pozri Lagadac P. a spol., Invasion and Metastasis, Vol. 7, str. 83 až 95 (1987)). Hcmorrhagický ascitus sa objavuje po 4 až 5 týždňoch a všetky krysy hynú počas 8 až 12 týždňov.

Imunoterapia začína 14 dní po injekciách tumorálnych pre b bunky. Ošetrenie zahrnuje intraperitoneálne injekcie disacharidu A, dávky 0,1, 0,3 a 0,8 mg/kg telesnej hmotnosti. Disacharid A bol rozpustený vo vodnom roztoku 0,9 % NaCl, 0,1 % trietylamínu. Krysy dostali päť injekcií po jednej každého 3,5-dňa. Kontrolná skupina bola injektovaná vodným roztokom. Obe skupiny zahrnujú 10 krýs.

týždňov po injekcii bola vykonaná autopsia tumorálnych buniek. Rozsah peritoneálnej karcinomatózy bol hodnotený vizuálne a krysy boli klasifikované podľa zvyšujúcej sa karcinomatosis.

Klasifikácia veľkosti uzlíkov je nasledujúca, trieda 0: neviditeľné žiadne nádorové uzlíky, trieda 1: málo uzlíkov veľkosti menšej než 0,2 cm, trieda 2: príliš veľa uzlíkov, aby boli spočítané so veľkosti až 0,5 cm.

trieda 3: nádory s veľkosťou až 1 cm, trieda 4: tumorálna dutina plne napadnutá nádormi, veľkosť niekoľko cm.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 9.

Tabuľka 9

In vitro protinádorová aktivita disacharidu A v peritoneálnej karcinomatosis

Disacharid A počet krýs s karcinonatO-	vplyv produktu d)	ascitický objem vplyv
(nl/krysa)	produktu (2)
	zou triedy: 0 12 3 4	nedza	priemer
O ag/kg	0 112 6		0-64	40224
0,1 mg/kg	0 2 0 4 4	NS	0-18	7*7	p<0,001
0,3 mg/kg	2 3 2 2 1	p<0,01	0-20	2*6	p<0.001
0,8 mg/kg	16 111	p<0,01	0-2	0*1	p<0,001

Štatistická významnosť protinádorovej aktivity bola vypočítaná testom Kruskal-Wallise (1) alebo (2) s použitím variančnej analýzy.

Je zrejmé, že disacharid A má dávkovo závislý protinádorový účinok.

4. Akútna toxicita

Disacharid A bol injektovaný do chvostovej žily samca a samice NMRI myši (vek 6 až 7 týždňov). Dávka až 100 mg/kg telesnej hmotnosti nevyvoláva akúkoľvek smrť.

Príklad 7

Východiskový materiál je lipopolysacharid z Pseudomonas aeruginosa (Sigma, Product No. L7018). Štruktúra lipidu A je už známe (pozri Kulshin a spol. V Eur. J. Biochem. 198 (1991) 697 až 704). Na rozdiel od lipidu A z E. coli prevládajúce druhy obsahujú acyloxyacylované zvyšky na oboch aminoskupinách diglukozamínového difosfátového reťazca. Navyše tu je 3-hydroxydekanová kyselina v polohe 3', ale rovnaký mastný acylový zvyšok je prítomný len v polohe 3 v malej frakcii.

Odstránenie tohto mastného acylového zvyšku v polohe 3' by mohlo viesť k analógu disacharidu C. Ďalšia hydrolýza by mohla viesť k strate esterifikovaného mastného acylového zvyšku na acyloxyacylskupine buď v polohe 2, alebo 2'. Tieto štruktúry sú analogické disacharidom C a D.

Lipopolysacharidy z Ps. Aeruginosa (Sigma L7018) boli rozpustené v 0,1 M octane sodnom pH 4,0 pri 5 mg/ml a zohrievané 120 minút na 100 °C. Po ochladení bolo pridaných 0,5 objemov propan-2-olu, a potom tetrabutylamóniumfosfát (TBAP) na konečnú koncentráciu 25 mM. Trietylamín (TEA) bol pridaný na pH 9,0 (približne, pH papieriky). Zmes bola nanesená na C18 Sep-Pak (Waters) s recyklovanim (10 prechodov). Sep-Pak bol premytý 10 ml 5 mM TBAP v acetinitrile:H₂O 1 : 1 (obj./obj.), a potom 10 ml acetonitrilu. Adsorbované substancie boli eluované 4 ml chloroformu : metanolu 2 :1 (obj./obj.).

Dva hlavné piky, PsAl a PsA2 (obr. 6) boli čistené pomocou HPLC a boli analyzované mastné kyseliny. Zloženie mastných kyselín zodpovedá molekulám opísaným Kulshinom a spol. (tabuľka ďalej). PsAl je menej hydrofóbna než PsA2 pretože sa eluuje z kolóny s nižšim retenčným časom (R_t). Toto zodpovedá molekule s dvoma 2OH-C12:0 kyslými zvyškami. PsA2 má 2OH-C12:0 a C12:0.

Pík	identifikovaná mastná kyselina
PsAl	30H-C10:0

20H-C12:0

30H-C12:0

PsA2 3OH-C10:0

C12:O

2OH-C12:0

3OH-C12:0

SK 281944 Β6

Rozpúšťadlo bolo odstránené na rotačnej odparke a zvyšok bol znova rozpustený v 0,2 % TEA vo vode.

K roztoku Ps. aeruginosa lipid A bol pridaný hydroxid sodný na koncentráciu 0,2 M a roztok bol inkubovaný pri teplote miestnosti 60 minút. Roztok bol potom neutralizovaný (8,5 %) kyselinou ortoťosťorečnou. Potom bol aplikovaný na HPLC systém s reverznou fázou (HP1050 so Supelco LC18, 3 pm kolóna s reverznou fázou, s predkolónou) ekvilibrovaný v 75 % rozpúšťadle A (5 mM TBAP v acetonitrile : vode 1 : 1 (obj./obj.) 25 % rozpúšťadlo B (5 mM TBAP v propan-2-ole : vode 9 : 1 (obj./obj.) a eluovaný s gradientom 2 % rozpúšťadlo B/min. na 100 % B. Piky boli detegované pri absorpcii 210 nm. Hlavné piky boli spojené (pozri obr. 7). Tieto boli zriedené 2 objemami vody a aplikované na C18 Sep-Pak patróny ekvilibrované v rozpúšťadle A. Sep-Pak boli premyté 10 ml 0,45 % chloridu sodného v propan-2-ole : H₂O 1 : 3 (obj./obj.), 10 ml vody a 10 ml acetonitrilu. Adsorbované substancie boli eluované so 4 ml chloroformu : metanolu 2 : 1 (obj./obj.) a rozpúšťadlá boli odstránené za zníženého tlaku. Frakcie boli znova rozpustené v 100 μΐ vody.

Obsah mastného acylu vo frakciách bol analyzovaný plynovou chromatografiou po hydrolýze v 4 M HC1, 100 °C, 4 hodiny. Uvoľnené mastné kyseliny boli premenené na metylestery podľa Millera (Miller L. Gas Chromatography application note 228 až 37 (Hewlett Packard) a analyzované na plynovom chromatograťe Hewlett-Packard 5890 s pripojenou kremičitou kolónou (Supelco 2-4026) s porovnaním k štandardným metylesterom mastných kyselín (Supelco).

Po hydrolýze extraktu lipidu A je pozorovaných veľa píkov pri HPLC s reverznou fázou. Hlavný pík (PaAOHl, 2, 4 a 6) boli zhromaždené z HPLC. Mastné kyseliny boli identifikované v každej frakcii ako je uvedené.

Pík identifikovaná mastná kyselina

PsAOHl 30H-C12:0

20H-C12:0

PsAOH2 3ÔH-C12:0

20H-C12:0

PsA0H4 30H-C12:0

C12z0

PsA0H6 30H-C12:0

20H-C12:0

C12:0

Štruktúrne vzorce týchto disacharidov sú nasledujúce: *PsAOHl: 2-deoxy-6-0-[2-deoxy-2-[(R)-3-[(S)-2-hydroxydodekanoyloxy]dodekanoylamino]-4-0-fosfono-fi-D-glukopyranosyl]-2-[(R)-3-hydroxydodekanoylamino]-a-D-glukopyranosyldihydrogénfosfát, *PsAOH2: 2-deoxy-6-0-[2-deoxy-2-[(R)-3-hydroxydodekanoyloxyamino]-4-O-fosfono-fl-D-glukopyranosyl]-2-[(R)-3-[(S)-2— hydroxydodekanoyloxy]dodekanoylamino]-a-D-glukopyranosyldihydrogénfosfát, *PsAOH3: 2-deoxy-6-0-[2-deoxy-2-[(R)-3-dodekanoyloxydodekanoylamino]-4-0-fosfono-P-D-glukopyranosyl]-2-[(R)-3-hydroxydodekanoylamino]-a-D-glukopyTanosyldihydrogénfosfát, *PsAOH4:

2-deoxy-6-O- [2-deoxy-2- [(R)-3 -dodekanoyloxydodekanoylamino]-4-0-fosfono-p-D-glukopyranosyl]-2-[(R)-3-hydroxydodekanoylamino]-a-D-glukopyranosyldihydro· génfosfát, *PsAOH6:

2-deoxy-6-0-[2-deoxy-2-[(R)-3-dodekanoyloxydodekanoylamino]-4-0-fosfono-p-D-glukopyranosyl]-2-[(R)-3-[(S)-hydroxydodekanoyloxy]dodekanoylamino]-a-D-glukopyranosyldihydrogénfosfát sú uvedené ďalej.

disacharid E (PsAOHl)

disacharid G (PsA0H4)

O CH.-OH

disacharid H (PsAOHó)

Frakcie boli tiež analyzované elektro-sprejovou hmotnostnou spektrometriou (ES-MS) v negatívnom móde. Vg Biotech BIO-Q zariadenie bolo použité s trojnásobným kvadrupólovým analyzátorom. 2 až 4 μΐ každej vzorky bolo zriedených do 10 μΐ roztoku acetonitril: voda : 25 % amoniak 50 : 50 : 1 (obj./obj.). 10 μΐ potom bolo vstreknutých priamo do zdroja hmotnostného spektrometra. Ako eluant bol použitý roztok acetonitril : voda : 25 % amoniak 50 : : 50 : 1 (obj./obj.) pri 7 μΐ/minútu. Na analýzu fragmentácie základných iónov boli rodičovské ióny z prvého kvadrupólu podrobené kolízne aktivovanému rozkladu v druhom kvadrupóle s použitím argónu ako kolízneho plynu. Dcérske ióny boli detegované v treťom kvadrupóle.

Hmotnosť vypočítaná pre každý z píkov a hmotnosť pozorovaná pri ES-MS sú uvedené.

Pík	vypočítaná hmotnosť	pozorovaná hmotnosť
PsAOHl	1053,5	1093,4
PsAOH2	1093,5	1093,1
PaA0H4	1077,5	1077,0
PsAOHó	1275,8	1275,7

V každom prípade je dobrý súlad.

V prípade PsAOHl a PsAOH2 sú hmotnosti rovnaké. Toto indikuje, že tieto predstavujú dve izoformy molekuly, lipidy A sú známe ako ftagmentujúce za určitých analytických podmienok v hmotnostnej spektroskopii (Kulshib, 1991 a Cotter a spol., Biomed. Encl. Mass Spectrum. 14 (1987), 591 až 598). Sú produkované ióny, ktoré predstavujú neredukovanú polovicu molekuly s adíciou 102 hmotnostných jednotiek. Takto môže byť s dvoma MS v tandeme fragmentovaný základný ión v prvom MS a „dcérske“ ióny môžu byť detegované v druhom MS. Toto odstraňuje možnosť, že sekundárne pozorované ióny sú kontaminanty; musia pochádzať z pôvodných iónov fragmentáciou. Hmotnosť dcérskych iónov očakávaných pre každú frakciu a hmotnosti pozorované na MS-MS sú uvedené.

Píle vypočítaná hmotnosť pozorovaná hmotnosť fragmentu fragmentu

PsAOHl	558,5 alebo 756,8	756,1
PSA0H2	558,5 alebo 756,8	557,7
PsA0H4	558,5 alebo 740,8	739,9
PsAOHÓ	558,5 alebo 740,8	740,1

Tieto pozorovania jasne identifikujú štruktúry disacharidov E, F, G a H.

Na interné porovnanie bol sacharid A tiež analyzovaný pomocou ES-MS. Vypočítaná hmotnosť bola 768,9 a pozorovaná hmotnosť fragmentu 768.

Biologická aktivita frakcii bola skúšaná stimuláciou nitrilovej produkcie v myšacích peritoneálnych maktofágoch ako sú opísané.

Množstvo každého analógu v zásobnom roztoku bolo stanovené absorpciou na HPLC s odkazom na absorpciu disacharidu A. Frakcie majú aktivity rádovo rovnaké ako disacharid A (obr. 8). Disacharid H, ktorý mal dve acyloxyacylové skupiny a žiadne mastné kyseliny acylové zvyšky je najaktívnejší. Poloha acyloxyacylu, 2 versus 2', má len malý vplyv na aktivitu.

Na účely odstránenia možnosti, že aktivita bola spôsobená kontamináciou vzoriek inými substanciami ako je LPS, disacharidy E, F, G a H boli znova čistené HPLC s reverznou fázou a oblasti HPLC základnej línie práve pred a práve po piku boli zhromaždené a spracované rovnakým spôsobom ako frakcie, obsahujúce piky materiálu. Aktivita pikových frakcií a frakcií so základnej línie bola skúšaná. Piky, obsahujúce disacharid E, F, G a H majú podobnú aktivitu ako je možné vidieť v prvej eseji. Slepé vzorky, predstavujúce oblasti HPLC profilu práve pred a po piku lipid A analógu, boli inaktivované. Stimulácia nitrilovej produkcie je tak špecificky spojená s lipid A analógmi.

Endotoxicita disacharidov E, F a G bola stanovená s použitím chromogénneho LAL testu (pozri vyššie). Namiesto použitia 1 mg/ml hovädzieho sérového albumínu bolo použitých 0,1 mg/ml. Výsledky (n = 4 alebo 6) sú získané v dvoch sériách pokusov a sú uvedené.

Vzorka

E. coli LPS

E. coli lipid A disacharid E disacharid F disacharid G disacharid E endotoxická aktivita v LAL (ag/nl)

0,58±0,14

0,32*0,06

0.00000510.000002

0.00002510,000026

0,0000610,00003

0,00000310,000002

SK 281944 Β6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (33)

1. P(l->6)Glukozamínových disacharidov všeobecného vzorca (I) kde

R* je hydroxylová skupina, dihydroxyfosfonoyloxyskupina alebo jej nabitá forma, (C ]-C₅)acyloxyskupina, (Ci-C₅)alkyloxyskupina alebo skupina X,

R² a R²' sú každý acylová skupina alebo skupina Y s tou podmienkou, že aspoň jeden z R² a R²' je skupina Y, R³ a R³' sú každý vodík, (Ci-C5)alkylová skupina alebo (C,-C3)acylová skupina, R⁴ je vodík, (C1-C₃)alkylová skupina alebo (C_rC₃)acylová skupina, R⁴' je vodík, (CrC5)acylová skupina, (CrC5)alkylová skupina, dimetoxyfosfonoylskupina alebo fosfonoskupina, alebo jej nabitá forma a R⁶'je vodík, hydroxyskupina, dihydroxyfosfonoyloxyskupina, hydroxysulfonyloxyskupina, jej nabité formy alebo skupina Z, pričom skupina X je vybratá zo skupiny, zahrnujúcej karboxyCCrC₅)alkyloxyskupinu, -O-CH-[(CH₂)_mCOOH][(CH₂)_nCOOH] skupinu, pričom m = 0 až 5 a n = 0 až 5, fosfono(Ci-C₅)alkylskupinu, dimetoxyfosfonoyloxyskupinu, hydroxysulfonyl(C|-C₅)alkylskupinu a nabité formy skupiny X, pričom skupina Y je vybratá zo skupiny, zahrnujúcej acyloxyacylskupinu, acylaminoacylskupinu, acyltioacylskupinu, (C|-C₂₄)alkyloxyacylskupinu, (C₁-C₂₄)alkylarrunoacylskupmu, (Ci-C^úalkyltioacylskupinu a pričom je skupina Z vybratá zo skupiny, zahrnujúcej (C [ -C₂4)alkyloxyskupinu, (C i -C₂₄)acyloxyskupinu, 3-deoxy-D-mano-2-oktulozónovú kyselinu (KDO), (KDO)„, kden= 1 až 10, polysacharidový bočný reťazec, ako je bočný reťazec pochádzajúci z prírodného lipopolysacharidu, jadrovú zložku ako je zložka pochádzajúca z prírodného lipopolysacharidu a amino-fCrC^alkyl-karboxylovú skupinu a ich soli.

2. Disacharid podľa nároku 1, kde skupina Y zahrnuje 3-acyloxyacylovú skupinu, 3-acylaminoacylovú skupinu a 3-acyltioacylovú skupinu.

3. Disacharid podľa nároku 1 alebo 2, kde skupina Y je acyloxyacylová skupina.

4. Disacharid podľa nárokov 1 až 3, kde acylskupina je zvyšok mastnej kyseliny, 3-hydroxymastná kyselina, 3-oxomastná kyselina.

5. Disacharid podľa nárokov 1 až 4, kde acyloxyacylová skupina, acylaminoacylová skupina a acyltioacylová skupina tvoriaca skupinu Y, zahrnuje acylové skupiny vybraté zo skupiny, zahrnujúcej zvyšok mastnej kyseliny, zvyšok 3-hydroxymastnej kyseliny, zvyšok 3-oxomastnej kyseliny.

6. Disacharid podľa nárokov 3 až 5, kde skupina Y je acyloxyacylová skupina, ktorou je N-napojený 3-hydroxy(C₄-C₂₄)acyl, výhodne (C₈-Ci₈)-mastná kyselina-acylester, pripojený v polohe 3-hydroxy s (C_rC₂₀)acylom, výhodne (C,o-C₁₈)mastná kyselina-acyl.

7. Disacharid podľa nároku 6, kde acyloxyskupina je N-naviazaná 3-hydroxy-C₁₄-mastná kyselina-acylester, spojený v 3-hydroxypolohe s C₁₂-mastnou kyselinou.

8. Disacharid podľa nároku 6, kde acyloxyacylová skupina je N-naviazaná 3-hydroxy-C_M-mastná kyselina-acylester, pripojená k 3-hydroxy-polohe C₁₄-aminokyselinou.

9. Disacharid podľa nárokov 1 až 8, kde R²' je skupina Y.

10. Disacharid podľa nárokov 1 až 8, kde R² je skupina Y.

11. Disacharid podľa nárokov 1 až 10, kde zvyšok 3-hydroxymastnej kyseliny je 3-hydroxy(C₄-C₂₄)-, výhodne 3-hydroxy(C|o-C|_g)mastná kyselina.

12. Disacharid podľa nároku 11, kde zvyšok 3-hydroxymastnej kyseliny je 3-hydroxy-Ci₄-mastná kyselina.

13. Disacharid podľa nárokov 11 alebo 12, kde R² je zvyšok 3-hydroxymastnej kyseliny.

14. Disacharid podľa nárokov 11 alebo 12, kde R²' je zvyšok 3-hydroxymastnej kyseliny.

15. Disacharid podľa nárokov 1 až 10, kde R² a R²' sú oba skupina Y.

16. Disacharid podľa nároku 15, kde R² a R²' sú oba acyloxyacylová skupina, obsahujúca N-napojený 3-hydroxy-(C₄-C₂₄)-acyl, výhodne (C₈-C_l8)-mastná kyselina-acylester, spojenú v 3-hydroxylovej polohe s (C_rC2o)acylom, výhodne (Ci₀-Ci₈)mastná kyselina-acylom.

17. Disacharid podľa nároku 16, kde R² je N-napojený 3-hydroxyC|4-mastná kyselina-acylester, spojený v 3-hydroxypolohe S C16 -mastnou kyselinou, a kde R²' je N-napojený 3-hydroxyC]4-mastná kyselina-acylester, spojený v 3-hydroxy-polohe s C₁₂-mastnou kyselinou.

18. Disacharid podľa nárokov 1 až 17, kde R¹ je dihydroxyfosfonoyloxyskupina.

19. Disacharid podľa nárokov 1 až 18, kde R⁴ je vodík.

20. Disacharid podľa nárokov 1 až 19, kde R¹ je v a-konfigurácii.

21. Disacharid podľa nárokov 1 až 20, kde R³ je vodík.

22. Disacharid podľa nárokov 1 až 21, kde R³' je vodík.

23. Disacharid podľa nárokov 1 až 22, kde R⁶' je hydroxylová skupina.

24. Disacharid podľa nárokov 1 až 23, kde R⁴' je fosfonoskupina.

25. Disacharid podľa nárokov 1 až 24, kde disacharid je vo forme soli, obsahujúcej jeden alebo viac katiónov.

26. Disacharid podľa nároku 25, kde katióny sú ióny alkalických kovov.

27. Spôsob prípravy disacharidu podľa nárokov 1 až 26, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje stupne i) poskytnutie východiskového materiálu obsahujúceho lipid A skupinu lipopolysacharid-obsahujúceho mikroorganizmu a ii) podrobenie sa východiskového materiálu alkalickému spracovaniu tak, že lipid A skupina je O-deacylovaná v polohe 3 a v polohe 3'.

28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa t ý m , že východiskový materiál je vybraný zo skupiny, zahrnujúcej lipopolysacharid-obsahujúce mikroorganizmy, gramnegatívne baktérie, povrchovú štruktúru obsahujúce frakcie týchto mikroorganizmov a gramnegatívne baktérie alebo lipopolysacharidy týchto mikroorganizmov a gramnegatívnych baktérií.

29. Spôsob podľa nároku 27 alebo 28, vyznačujúci sa tým, že východiskovým materiálom je lipid A gramnegatívnej baktérie.

30. Spôsob podľa nárokov 27 až 29, v y z n a č u júci sa tým, že alkalickému spracovaniu predchádza alebo ho nasleduje kyslé spracovanie na odstránenie jadrovej skupiny a polysacharidového bočného reťazca.

31. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje ako účinnú zložku disacharid podľa nárokov 1 až 26 a farmaceutický prijateľný nosič alebo riedidlo.

32. Disacharid podľa nárokov 1 až 26 na použitie ako imunomodulačné činidlo a/alebo protinádorové činidlo.

33. Disacharid podľa nárokov 1 až 26 na použitie ako zložka vakcíny.

8 výkresov

Obr. i

SK 281944 Β6

Obr .2

Obr .3

SK 281944 Bé α r*. ο/** (H cv P1CU irt tu

O Γ-ΑΦΟ'·’ σι oa <o en .(Vľ«.fVfX r^intvftľ* us <nrjw^* c. x

T o in NON OQ • » · •a. «70 CO*> owo O<3<^ o® -víoen ťVCSX a h*xvg n Aí -*

CO G»«7*O ocooootoon cncvoooovoci meno roc n-r» o cu <w eu r*, o

X-v IO t u\

U.^’Mr-.QX/w <π«σαβ?Γ-4ίχ xeootniu twc, a.Ä5r^>- iucq a o x > aj kj c. c JOUOUKXLW o -o

Obr .4

SK 281944 Β6

ΤΖΓΤΠ· ffi'ia -sze'il wn-EžS t8

X«M

C (u «hm (O in tn r* CJ 10 or* (nra *<cn ’4)

Nor*

O fv (O CO CT

OJ O ** <0 ¹⁰ *ia: ta . χαχω X OlX±3O.< O< Q

-cyr*r-rr*incuív*« 10 {ί)ΠΝΗ o« irto oom □ on *rion α cn asoaucniy O.X<<£X>“ o v □ C •CL oiflu QQ ruo~ r*^Gi cu xcuo. Ľ.QO

HcJd

Obr .5

27.6ήβ

Obr .6 nmof NO₂7ml

Koncentrácia produktu v pg/ml

Obr. Ä