JPH06206893A

JPH06206893A - 新規なジサッカライド誘導体

Info

Publication number: JPH06206893A
Application number: JP5222449A
Authority: JP
Inventors: Toru Kodama; 亨児玉; Masayuki Saito; 雅之齊藤; Tomohiko Ogawa; 知彦小川
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1992-09-07
Filing date: 1993-09-07
Publication date: 1994-07-26

Abstract

(57)【要約】（修正有）【構成】下記式に示すジサッカライド誘導体、および
その立体異性体、並びにその塩、またはそれらを有効成
分として含む医薬組成物。【効果】上記化合物は、強いマイトジェン活性、アジ
ュバント活性、多クローン性Ｂ細胞活性化（非特異的感
染防御）活性、ナチュラルキラー活性、抗腫瘍活性、抗
ウイルス活性等の多様な生物活性を持ち、従来のリピド
ＡおよびリピドＡ誘導体において見られたマクロファー
ジからの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）やＩＬ−１等のいわゆ
る炎症性サイトカインの産生を誘導する活性が殆ど見ら
れないことから、免疫賦活剤、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤
のほか、敗血症、慢性関節リューマチ等の治療・予防用
剤等としても有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業の利用分野】本発明は、多様な生物活性を有し、
かつ致死毒性および発熱原性が非常に弱く低毒性である
という特性を有する新規なジサッカライド誘導体および
その塩に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】各種グラム陰性菌の細胞壁外膜に含まれ
るリポポリサッカライド（ＬＰＳ）は、リピドＡと呼ば
れる糖脂質に各種の糖類が結合したものであり、以前か
ら内毒素の主成分であることが知られている。ＬＰＳは
生体の各種免疫機能促進活性を有することが知られてお
り、その主たる活性発現部位はリピドＡにあることが明
らかにされており免疫調整作用および抗腫瘍作用の他、
多様な生物活性を有することが認められている。

【０００３】リピドＡの化学構造は大腸菌を初め各種グ
ラム陰性菌において明らかにされてきた（"Structure o
f the lipopolysaccharide from an E. Coli Heptose-l
essMutant", Marcha R. R., Jiunn-yann T., Israel
B., and H. Gobind Khorana,The Journal of Biologic
al Chemistry, vol. 254, No.13 p5906-5917(1979))。
その中で大腸菌由来リピドＡについては完全に化学合成
がなされ、各種誘導体も化学合成されている。その結果
一部合成されたリピドＡ誘導体については腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ）誘導作用およびマイトジェン活性において大
腸菌由来リピドＡと同等または同等以上であることが認
められている（特開昭５９−４８４９７号）。

【０００４】しかしながら大腸菌由来リピドＡおよびリ
ピドＡ誘導体については発熱原性、壊死毒性活性等の好
ましくない作用が認められることから、さらに広範囲に
誘導体の合成研究が行われた（特開昭６１−２２７５８
６号）。またリピドＡ様活性を有する単糖構造を基本骨
格とするものを初め種々の置換基による修飾、置換基導
入部位の検討が詳細に行われ各種類縁体も合成され、生
物活性、免疫活性および毒性について調べられたが
（「リピドＡ類似体の生物活性」，小川裕示，木曽真，
長谷川明，代謝，第２６巻，No．５，ｐ１５〜２７，１
９８９、「合成リピドＡとその誘導体」，本間遜，免疫
薬理，第８巻，No．４，１９９０，ｐ２５〜３２）、３
位，３′位および４′位の水酸基が遊離であるような化
合物に言及した例はなく、未だ医薬品として実用化しう
るものは開発されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】したがって、上記の理
由からリピドＡ類似体のうちでより低毒性でより強い有
用活性を有する化合物が強く望まれている。

【０００６】本発明は、強いマイトジェン活性、アジュ
バント活性、非特異的感染防御活性、抗ウイルス活性、
免疫賦活作用等の種々の有用な生物活性を有し、かつ発
熱原性および致死毒性等の有害作用がほとんどなく、特
に医薬品等として有用である新規なジサッカライド誘導
体を提供するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトの口
腔内に常在しており、現在歯周病の原因と考えられてい
る細菌の一つであるPorphyromanas(Bacteroides) ging
ivalisの細胞壁外膜中に含まれるＬＰＳがマイトジェン
活性等を有し、同時に致死毒性および発熱原性が非常に
弱いことを見いだした。さらに、ＬＰＳ中の活性発現部
位を調製後精製し、構造解析を行い、鋭意研究の結果、
本発明の活性化合物はグルコサミンβ（１−６）ジサッ
カライドの構造の１位にリン酸基がエステル結合をした
ものを基本骨格とし、２位のアミノ基に3-hydroxy-15-m
ethylhexadecanoic acidがアミド結合し、２′位のアミ
ノ基に3-hexadecanoyloxy-15-methylhexadecanoic acid
がアミド結合していることを見いだした。本発明の化合
物の構造は、従来のリピドＡ誘導体と大きく異なり４′
位にリン酸基を持たず、３位および３′位の水酸基が遊
離のままである点に特徴がある。したがって本発明の化
合物は式；

【化１】で表されるような構造を有することが推定される。また
本願化合物は強いマイトジェン活性、アジュバント活
性、多クローン性Ｂ細胞活性化（非特異的感染防御）活
性、ナチュラルキラー活性等多様な生物活性を有する一
方、従来のリピドＡおよびリピドＡ誘導体においてみら
れたマイクロファージからの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）や
ＩＬ−１等のいわゆる炎症性サイトカインの産生を誘導
する活性が殆ど見られないことを見いだした。したがっ
て従来、リピドＡおよびリピドＡ誘導体において問題と
なっていた致死毒性および発熱原性等の有害作用を示す
ことなく、免疫賦活剤として有用である。さらには大腸
菌のリピドＡが誘導するＩＬ−１の産生を抑え、さらに
ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の
産生を誘導することを見いだしたが、これらの活性は、
強い非特異的感染防御活性を有することと併せて、大腸
菌等グラム陰性菌の感染によって引き起こされる病態、
特に敗血症、あるいは敗血症性ショックの予防・治療用
剤として有用である。また、ＩＬ−１の産生を抑え、さ
らにＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒ
ａ）の産生を誘導することは、ＩＬ−１自身の異常産生
状態になっていると考えられるような病態、例えば慢性
関節リューマチ等の治療用剤としても有用である。さら
に、ナチュラルキラー細胞を活性化し、抗腫瘍活性を有
することを見いだした上、抗ウイルス活性を有すること
も明らかになった。抗腫瘍活性からは、抗腫瘍剤として
の有用性が考えられ、抗ウイルス活性と併せて強い非特
異的感染防御活性を有することからは、抗ウイルス剤と
しての有用性がある。このような特性から、本願発明化
合物である新規なジサッカライド誘導体またはその塩
は、医薬用担体および／または希釈剤と配合してなる医
薬組成物として特に有用であると期待される。

【０００８】なお、本化合物には種々の立体異性体が存
在し得るが、単離されたこれらの異性体および異性体混
合物は、いずれも本発明の技術的思想に包含される。

【０００９】本願発明の化合物は微生物源より調製し、
精製して使用することができる。

【００１０】さらに種々の化学合成法により製造するこ
とも可能である。

【００１１】以下に各製造法による具体的な製造例を示
す。

【００１２】（１）微生物を用いた製造例本願化合物を微生物により製造する場合には、前記〔化
１〕により示される本願発明の化合物を生産することが
できる微生物であればいずれも使用できるが、例えばPo
rphyromanas(Bacteroides) gingivalis（ＡＴＣＣカタ
ログ番号３３２７７）等を使用することができる。

【００１３】培養に使用される培地は液状または固状で
よいが、通常は液状培地による嫌気静置培養が便利であ
る。培地は本願発明化合物生産菌が生育して本願発明化
合物を生産するものであればどのようなものでもよい。
培養温度、培養期間、培養の液性等の条件は、本願発明
化合物の生産量が最大となるように適宜選択、調節され
得るが、好ましくは嫌気的条件下に２５℃〜４０℃、好
ましくは３７℃にて、１２〜３６時間、好ましくは２６
時間培養され、その培地のｐＨは６．０〜８．０、好ま
しくは７．３に維持される。

【００１４】上記条件で培養することにより本発明化合
物が生産、蓄積される。培養物を濾過または遠心分離し
て菌体を回収し、目的物の分離、精製を行う。菌体から
のＬＰＳの分離、精製には化合物の化学的特性に基づく
種々の手段を用いることができる。例えば熱フェノール
−水抽出法にて抽出し、各種酵素処理後に遠心して精
製、溶媒分画、各種樹脂を用いたカラム法を使用し、こ
れらを適当に組み合わせることによりＬＰＳを分離、精
製することができる。

【００１５】次に精製を繰り返したＬＰＳまたは粗ＬＰ
Ｓを弱酸加水分解する。弱酸加水分解は、本願発明化合
物が遊離する方法であればどのような方法でもよく、好
ましくは０．０５〜０．２規定の酢酸を用い、９０℃〜
１１０℃、２〜３時間の反応でよい。反応物から目的物
の分離、精製には本願発明化合物の化学的特性に基づく
種々の手段が採用できる。すなわち、溶媒分画法、各種
樹脂を使用したカラム法等が用いられ、これらを適当に
組み合わせることにより本願発明に係わる物質を分離、
精製することができる。

【００１６】（２）化学合成法を用いた製造例適当な保護基で適当な位置を保護したＮ−グルコサミン
誘導体を配糖体結合形成反応によってジサッカライド誘
導体とし、これを脂肪酸によるＮ−アシル化、還元末端
１位のリン酸化後、脱保護する。または所望の脂肪酸に
よってＮ−アシル化された保護Ｎ−グルコサミン誘導体
を配糖体結合形成反応によってジサッカライド誘導体と
し、これをリン酸化後、脱保護基を行うことによっても
合成することができる。

【００１７】上記の説明にしたがって得られた本発明化
合物は、リン酸基部分で塩を形成しうる化合物であり、
公知の方法により容易に塩に変換することができる。そ
のような塩の例としては、例えばナトリウムまたはカリ
ウムのようなアルカリ金属の塩、カルシウム、マグネシ
ウム等のアルカリ土類金属の塩、アンモニウム塩および
薬学的に許容されるアミン塩、等が含まれる。非毒性ア
ミン類の塩としては、テトラメチルアンモニウムのよう
なテトラアルキルアンモニウムの塩、およびメチルアミ
ン塩、トリエチルアミン塩、シクロペンチルアミン塩、
ベンジルアミン塩、ピリジン塩、ピペリジン塩、ジエタ
ノールアミン塩、リジン塩、アルギニン塩のような有機
アミン塩等が例として挙げられる。このようにして得ら
れた本発明化合物であるジサッカライド誘導体またはそ
の塩は、治療または予防の目的で用いる医薬組成物とし
て通常全身的あるいは局所的に経口または非経口で投与
される。投与量としては、年齢、体重、症状、投与方法
等により異なるが、通常成人ひとり当たり１回につき
０．０１mg〜１００mgの範囲で１日１回から数回、経口
あるいは非経口で投与される。勿論投与量は種々の条件
で異なるので、上記投与量より少ない範囲で充分効果の
ある場合もあるし、逆にこれらの範囲を超えて投与する
必要のある場合もある。本発明による経口投与のための
固形医薬組成物には、錠剤、散剤、顆粒剤等が含まれ
る。このような固形組成物においては、少なくともひと
つの不活性な希釈剤、例えば乳糖、ブトウ糖、微結晶セ
ルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ
酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、
さらに不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、ステアリ
ン酸マグネシウムのような潤滑剤や、繊維素グルコン酸
カルシウムのような崩壊剤を含有していてもよい。錠剤
または丸剤は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシ
プロピルセルロース等の胃溶解性あるいは腸溶解性物質
のフィルムで被覆してもよいし、また２以上の層で被覆
してもよい。さらにゼラチンのように吸収されうる物質
のカプセルであってもよい。経口投与のための液体医薬
組成物は、薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁
剤、シロップ剤等を含み、一般的に用いられる不活性な
希釈剤としては、例えば精製水、エタノール等を含む。
不活性な希釈剤以外に、補助剤として湿潤剤、懸濁剤
等、さらに甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤等を含有し
ていてもよい。また、経口投与のための組成物には、常
法により処方されるスプレー剤も含まれる。本発明によ
る非経口投与のための注射剤組成物としては、無菌の水
性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤等が含まれ
る。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば注射用蒸留
水および生理食塩水が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁
剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレ
ングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等の
アルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）等があ
る。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化
剤、分散剤のような補助剤を含んでもよい。これらは、
特定の濾過や、殺菌剤の配合または照射によって無菌化
される。これらはまた、無菌の固体組成物を製造し、使
用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用す
ることもできる。非経口投与のための組成物としては、
このほか公知の方法により処方される外用液剤、軟膏の
ような塗布剤、および座剤、ペッサリー等も含まれる。

【００１８】また本願化合物は強いマイトジェン活性、
アジュバント活性、多クローン性Ｂ細胞活性化（非特異
的感染防御）活性、ナチュラルキラー活性等多様な生物
活性を有する一方、従来のリピドＡおよびリピドＡ誘導
体においてみられたマイクロファージからの腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ）やＩＬ−１等のいわゆる炎症性サイトカイ
ンの産生を誘導する活性が殆ど見られないことを見いだ
した。したがって従来、リピドＡおよびリピドＡ誘導体
において問題となっていた致死毒性および発熱原性等の
有害作用を示すことなく、免疫賦活剤として有用であ
る。さらには大腸菌のリピドＡが誘導するＩＬ−１の産
生を抑え、さらにＩＬ−１レセプターアンタゴニスト
（ＩＬ−１ｒａ）の産生を誘導することを見いだした
が、これらの活性は、強い非特異的感染防御活性を有す
ることと併せて、大腸菌等グラム陰性菌の感染によって
引き起こされる病態、特に敗血症、あるいは敗血症性シ
ョックの予防・治療用剤として有用である。また、ＩＬ
−１の産生を抑え、さらにＩＬ−１レセプターアンタゴ
ニスト（ＩＬ−１ｒａ）の産生を誘導することは、ＩＬ
−１自身の異常産生状態になっていると考えられるよう
な病態、例えば慢性関節リューマチ等の治療用剤として
も有用である。さらに、ナチュラルキラー細胞を活性化
し、抗腫瘍活性を有することを見いだした上、抗ウイル
ス活性を有することも明らかになった。抗腫瘍活性から
は、抗腫瘍剤としての有用性が考えられ、抗ウイルス活
性と併せて強い非特異的感染防御活性を有することから
は、抗ウイルス剤としての有用性がある。

【００１９】このような特性から、本願発明化合物であ
る新規なジサッカライド誘導体またはその塩は、医薬用
担体および／または希釈剤と配合してなる医薬組成物と
して特に有用であると期待される。

【００２０】以下、本願発明に関する化合物について実
施例に基づき詳細に説明するが、本発明を以下に記載す
る特別な態様に限定することを意図するものではない。

【００２１】

【実施例】

実施例１微生物源からの製造 Porphyromanas(Bacteroides) gingivalisを１６０リッ
トルのＧＡＭブイヨン（日水製薬株式会社製）培地（ｐ
Ｈ７．３）で嫌気的に３７℃で２６時間培養した。培養
完了後培養液の遠心を行い菌体を回収し、凍結乾燥によ
り乾燥菌体１００ｇを得た。この乾燥菌体を熱フェノー
ル−水抽出法にて抽出処理して粗ＬＰＳを得た。すなわ
ち１００ｇの乾燥菌体に３．５リットルの蒸留水を加え
６８℃に加熱し、別に６８℃に加熱した９０％フェノー
ルを加え６８℃にて２０分間撹拌し、氷冷後遠心して水
層を分取後、再度３．５リットルの蒸留水を加え抽出操
作を繰り返した。得られた水層を合わせ、蒸留水に対し
て十分透析後、濃縮し凍結乾燥を行い粗抽出物１２．４
７ｇを得た。

【００２２】粗抽出物１０ｇを１リットルの蒸留水に懸
濁し超遠心沈渣をヌクレアーゼＰ１（ヤマサ醤油株式会
社製）およびプロナーゼ（カルビオケミカル製；米国）
酵素処理を二度づつ繰り返し、蒸留水で超遠心沈渣の洗
浄を二度繰り返し、凍結乾燥を行い粗ＬＰＳ画分２５０
mgを得た。粗ＬＰＳ画分２５０mgを５０mMトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．４）に懸濁後、セファロース４Ｂカラム
クロクトグラフィー（内径１．５cm、長さ９０cm）に供
し、排除体積画分を分取後、エタノール沈殿を行い、蒸
留水で二度洗浄後凍結乾燥を行った。ＬＰＳ画分１１０
mgを得た。ＬＰＳ画分を０．１規定の酢酸で１０５℃、
２．５時間弱酸加水分解を行い、反応物を遠心後、遠心
沈渣を得た。この画分をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィー（クロロホルム／メタノール／水／トリエチルア
ミン＝３０／１２／１．５／０．１）で精製を行い、
４．５mgの本発明化合物を得た。

【００２３】実施例２構造解析上記、実施例１で得られた化合物の物理化学的性質を検
討したところ、以下の結果が得られた。

【００２４】（１）糖分析および脂肪酸分析；ア．グルコサミンβ（１−６）ジサッカライド構造の１
位にリン酸基がエステル結合したものを基本骨格とし、イ．２位のアミノ基に3-hydroxy-15-methylhexadecanoi
c acidがアミド結合し、ウ．２′位のアミノ基に3-hexadecanoyloxy-15-methylh
exadecanoic acidがアミド結合し、エ．４′位にリン酸基を持たず、オ．３位，３′位および４′位の水酸基が遊離のままで
ある。

【００２５】（２）分子式；Ｃ₆₂Ｈ₁₁₉ Ｏ₁₇Ｎ₂ Ｐ（３）呈色反応；硫酸反応に陽性、ディットマー・レス
ター反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性、ＴＴＣ反応
に陰性である。

【００２６】（４）物質の色、形状；白色粉末（５）質量スペクトル；ネガティブＦＡＢ−ＭＳ−Ｍ
Ｓ、Ｍ／Ｚ 1193（Ｍ−Ｈ），937(Ｍ−２Ｈ−Ｃ₁₅Ｈ₃₁
ＣＯＯ）（６）ＮＭＲスペクトル； ¹Ｈ−ＮＭＲ（300MHz，ＣＤ
Ｃｌ₃ ＋ＭｅＯＤ＋Ｄ₂Ｏ）δ：0.81（12Ｈ，ｄ）、0.8
2(3Ｈ，ｔ）、1.1-1.6(72Ｈ，ｍ，ＣＨ₂ ，ＣＨ）、2.2
-2.5 (6Ｈ，ｍ，ＣＯ−ＣＨ₂ ）、3.1-4.3(13Ｈ，
ｍ）、4.46(1Ｈ，ｄ）、5.15(1Ｈ，ｍ）、5.45(1Ｈ，
ｍ）以上の結果より、本発明化合物の構造は〔化１〕で表さ
れるものと推定された。

【００２７】実施例３活性測定次に本願発明の化合物について試験した生理活性の結果
を示す。

【００２８】（１）マイトジェン活性マイトジェン活性は、例えば単離されたマウスリンパ系
培養細胞中に取り込まれた ³Ｈ−チミジンの量を測定す
ることにより行った。すなわちＢＡＬＢ／ｃマウスの脾
臓を擂り潰し、５×１０⁵ 個／well（２００μｌ）に調
製した脾細胞に所定濃度の本願発明化合物、あるいは比
較化合物を添加、または培地のみを添加して培養した。
培養終了６時間前に３７kBq/well（１０μｌ）の ³Ｈ−
チミジンを加え、培養終了後細胞に取り込まれた ³Ｈ−
チミジンの量（放射線量）を定量した。結果は下式で示
すStimulation Index で表した。

【００２９】Stimulation Index＝化合物の添加群(cp
m）／培地のみ添加群(cpm）本発明化合物は、表１に示されるようにマイトジェン活
性を有することを示した。比較化合物としては、合成リ
ピドＡである５０６を用いた。５０６は、６−Ｏ−〔２
−デオキシ−２−（３−ドテカノイルオキシテトラデカ
ノイルアミノ）−３−Ｏ−（３−テトラデカノイルオキ
シテトラデカノイル）−４−Ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グ
ルコピラノシル〕−２−デオキシ−２−（３−ヒドロキ
シテトラデカノイルアミノ）−３−Ｏ−テトラデカノイ
ル−１−Ｏ−ホスホノ−α−Ｄ−グルコピラノースであ
る。

【００３０】

【表１】

【００３１】（２）ＮＫ（ナチュラルキラー）活性本試験は以下の方法により検討した。すなわち、ＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスを用い１００μｇの本発明化合物、あるい
は比較化合物を０日目および７日目に静脈内に注射し、
１４日目に脾細胞を採取した。調製した脾細胞（１×１
０⁶ 個／０．１ml）に⁵¹Ｃｒで標識した標的細胞(Molon
eyウイルス誘発リンパ種ＹＡＣ−１：２×１０⁴ 個／
０．１ml）を加え、４時間培養した。なお、最小遊離対
照群には脾細胞を含まない培養液のみを加え、最大遊離
対照群には０．１ＮＮａＯＨを加えた。培養終了後、
培養上清０．１mlを採取し、標的細胞が障害を受けるこ
とにより遊離した⁵¹Ｃｒの量（放射線量）を測定した。
活性は各価を以下の式に代入し、NK Activity(％）を求
めた。

【００３２】NK Activity(%)＝｛（実験群−最小遊離対
照群)(cpm)／（最大遊離対照群−最小遊離対照群)(cp
m)｝×100 本発明化合物は、上式で算出した結果５０．１のNK Act
ivity(％）という値を示し、合成リピドＡである５０６
と同等の活性を有することが明らかとなった。（３）抗腫瘍活性本試験はメチルコラントレン誘発線維肉腫（Ｍｅｔｈ
Ａ）に対する増殖抑制活性により検討した。すなわち、
ＢＡＬＢ／ｃマウスより取り出した脾細胞より付着細胞
（マクロファージ）を採取した。調製したマクロファー
ジ（２×１０⁵個／０．１ml）と標的細胞（Ｍｅｔｈ
Ａ：２×１０⁴ 個／０．１ml）に所定濃度の本発明化合
物あるいは比較化合物を加え、１８時間培養した後、１
４．８kBq/well（１０μｌ）の ³Ｈ−チミジンを加えて
さらに６時間培養した。培養終了後細胞に取り込まれた
³Ｈ−チミジンの量（放射線量）を定量した。結果は得
られた値を次式に代入して ³Ｈ−チミジンの取り込み抑
制率を計算し、マクロファージの腫瘍細胞増殖抑制活性
として表した。 Cytostatic Activity(%)＝｛１−（マクロファージおよ
び標的細胞−マクロファージのみ)(cpm)／標的細胞のみ
(cpm)}×100 本発明化合物は表２で示されるような値を示し、合成リ
ピドＡである５０６とほぼ同等の腫瘍増殖抑制活性を示
した。

【００３４】

【表２】

【００３５】（４）アジュバント活性本試験は１群６匹の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、０
日目と２８日目に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１００μ
ｇに本発明化合物あるいは比較化合物１００μｇを添加
あるいは無添加にて、フロイントの不完全アジュバント
（ＦＩＡ）を用いて油中水型乳剤として皮下注射し、追
加免疫後５日目に血清中に産生した抗ＢＳＡＩｇＧ抗体
量をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果は、次式で示す
Stimulation Index で表した。

【００３６】Stimulation Index ＝ＦＩＡに化合物とＢ
ＳＡの添加群（μg/ml）／ＦＩＡにＢＳＡのみの添加群
（μg/ml）本発明化合物は、表３に示されるように合成リピドＡで
ある５０６より強いアジュバント活性を有することが明
らかとなった。

【００３７】

【表３】

【００３８】（５）抗ウイルス活性本試験は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ；Ｖｅｓｉｃ
ｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）のマウ
ス線維芽細胞株Ｌ９２９に対する作用の抑制を指標にし
た。すなわち、各ウェルにＬ９２９細胞を４×１０⁴ 個
／０．１mlに入れ２４時間培養後、本発明化合物あるい
は比較化合物（１mg／ml）の希釈系列より各希釈試料液
を０．１mlずつ加えさらに２４時間培養した。培養上清
除去後、１００ＴＣＩＤ₅₀／０．１mlに調製したＶＳＶ
を加え２４時間培養後、培養液を除去し、５％ホルムア
ルデヒド溶液により２０分間固定し、続いて０．５％ク
リスタルバイオレット染色液にて２０分間染色した。水
洗後乾燥し、吸光度６００nmで測定を行った。活性はＬ
９２９細胞が５０％生存する試料液の元の試料濃度（１
mg／ml）に対する希釈倍数の逆数で表した。本発明化合
物は表４に示すように合成リピドＡである５０６より強
い抗ウイルス活性を有することが明らかとなった。

【００３９】

【表４】

【００４０】（６）多クローン性Ｂ細胞活性化活性本試験はエリスポット（Enzyme-Linked Immunospot; EL
ISPOT)法を用いて検討した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細
胞（２．５×１０⁶ 個）に所定量の本発明化合物あるい
は比較化合物の添加あるいは無添加の条件下で５％の牛
胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、
３７℃、７２時間培養した。洗浄後、抗体産生細胞はＥ
ＬＩＳＰＯＴ法にて測定した。

【００４１】すなわち、ヤギ抗マウスイムノグロブリン
をコートし、５％ＦＢＳ処理したプレートの各ウェルに
上述した脾細胞を加え４時間培養した。細胞を洗浄除去
後、プレートをビオチン標識したヤギ抗マウスμ鎖特異
抗血清と２５℃で一晩反応し、生理緩衝食塩水（ＰＢ
Ｓ）で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジ
ンにて処理した。活性は抗体産生細胞により生じるスポ
ット数（細胞数）を実体顕微鏡下で計測し、供試化合物
添加の細胞数に対する供試化合物無添加の細胞数をコン
トロールしたときのStimulation Index にて表した。な
お、供試化合物の用量は、細胞２．５×１０⁶ 個当たり
のμｇで表した。本発明化合物は、表５に示されるよう
に合成リピドＡである５０６と同等もしくはそれ以上の
多クローン性Ｂ細胞活性化活性を有することが明らかと
なり、従って強い非特異的感染防御活性を有するものと
考えられる。

【００４２】

【表５】

【００４３】（７）サイトカイン産生誘導活性サイトカイン産生誘導活性試験は、ＴＮＦ−α測定用Ｅ
ＬＩＳＡシステム（アマーシャム・ジャパン株式会社
製）およびＩＬ−１β測定用ＥＬＩＳＡシステム（大塚
製薬株式会社製）を用いて検討した。すなわち、ヒト末
梢血単球（５×１０⁵ 個）に所定濃度の本発明化合物あ
るいは比較化合物を加え、２４時間培養後、培養上清中
のサイトカイン量をＥＬＩＳＡ法により定量した。

【００４４】その結果、ヒト末梢血単球からのＴＮＦ−
αやＩＬ−１βの産生を誘導する活性は、本発明化合物
には殆ど認められなかった。さらに、合成リピドＡであ
る化合物５０６あるいは大腸菌由来のＬＰＳと本発明化
合物（５０倍量）を同時に加えて培養することによっ
て、化合物５０６あるいは大腸菌由来のＬＰＳによって
誘導されるＩＬ−１βの産生を抑制することが明らかと
なった。さらに、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト
（ＩＬ−１ｒａ）測定用ＥＬＩＳＡシステム（Ｒ＆Ｄ社
製）により、本発明化合物はヒト末梢血単球の培養上清
中にＩＬ−ｌｒａを合成リピドＡである化合物５０６よ
り多量に産生することも明らかとなった。

【００４５】（８）ガラクトサミン負荷致死毒性ガラクトサミン負荷致死毒性は以下の実験系を用いて求
めた。

【００４６】Ｃ５７ＢＬマウス（雄性、８週齢）に、１
６mgのＤ−ガラクトサミン／ＨＣｌを腹腔内投与し、そ
の直後に本願発明化合物を静脈注射し、２４時間後に状
態観察を行った。

【００４７】本願発明化合物は、以下の表６に示される
ような活性を示し、低毒性であることが明らかになっ
た。

【００４８】

【表６】

【００４９】（９）その他の毒性局所シュワルツマン反応本試験は以下の方法により検討した。即ち雄のウサギの
皮内に０．２mlの生理食塩水で所定濃度に調製した供試
化合物を注射し、２４時間後、１００μｇ／ml／kgのサ
ルモネラミネソタ９７００ＬＰＳ−Ｗ（ディフコ社製）
を静脈より惹起注射して４時間後の皮内の出血反応を観
察した。その結果、本発明化合物は１００μｇ／siteで
出血反応は見られなかった。

【００５０】発熱原性試験本試験はウサギを用い、供試化合物を５ml／kgの生理食
塩水に所定濃度に調製したものを静脈注射し、直腸温度
の測定を実施した。注射後４時間の間に、０．６℃以上
の体温上昇が認められたものについて発熱作用ありと判
定した。その結果、合成リピドＡである５０６は０．０
１μｇで発熱作用が認められるのに対して、本発明化合
物は１０μｇ／kgの用量においても発熱作用が認められ
なかった。

【００５１】リムルス試験本試験はエンドトキシン測定試薬であるプレゲル（生化
学工業株式会社製）を使用して検定した。即ち日本産カ
ブトガニのライセートより調製した凍結乾燥品を用い
て、ゲル形成能の有無を判定した。その結果、本発明化
合物の最小有効量は、合成リピドＡである５０６の１０
００倍であり、非常に低毒性であった。

【００５２】本願発明化合物は、リムルス活性、局所シ
ュワルツマン反応および発熱性等の諸試験において低毒
性であった。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年１２月７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００２

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００２】

【従来の技術】各種グラム陰性菌の細胞壁外膜に含まれ
るリポポリサッカライド（ＬＰＳ）は、リピドＡと呼ば
れる糖脂質に各種の糖類が結合したものであり、以前か
ら内毒素の主成分であることが知られている。ＬＰＳは
生体の各種免疫機能促進活性を有することが知られてお
り、その主たる活性発現部位はリピドＡにあることが明
らかにされており免疫調節作用および抗腫瘍作用の他、
多様な生物活性を有することが認められている。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトの口
腔内に常在しており、現在歯周病の原因と考えられてい
る細菌の一つであるPorphyromonas(Bacteroides) gingi
valisの細胞壁外膜中に含まれるＬＰＳがマイトジェン
活性等を有し、同時に致死毒性および発熱原性が非常に
弱いことを見いだした。さらに、ＬＰＳ中の活性発現部
位を調製後精製し、構造解析を行い、鋭意研究の結果、
本発明の活性化合物はグルコサミンβ（１−６）ジサッ
カライドの構造の１位にリン酸基がエステル結合をした
ものを基本骨格とし、２位のアミノ基に3-hydroxy-15-m
ethylhexadecanoic acidがアミド結合し、２′位のアミ
ノ基に3-hexadecanoyloxy-15-methylhexadecanoic acid
がアミド結合していることを見いだした。本発明の化合
物の構造は、従来のリピドＡ誘導体と大きく異なり４′
位にリン酸基を持たず、３位および３′位の水酸基が遊
離のままである点に特徴がある。したがって本発明の化
合物は式；

【化１】で表されるような構造を有することが推定される。また
本願化合物は強いマイトジェン活性、アジュバント活
性、多クローン性Ｂ細胞活性化（非特異的感染防御）活
性、ナチュラルキラー活性等多様な生物活性を有する一
方、従来のリピドＡおよびリピドＡ誘導体においてみら
れたマクロファージからの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）やＩ
Ｌ−１等のいわゆる炎症性サイトカインの産生を誘導す
る活性が殆ど見られないことを見いだした。したがって
従来、リピドＡおよびリピドＡ誘導体において問題とな
っていた致死毒性および発熱原性等の有害作用を示すこ
となく、免疫賦活剤として有用である。さらには大腸菌
のリピドＡが誘導するＩＬ−１の産生を抑え、さらにＩ
Ｌ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の産
生を誘導することを見いだしたが、これらの活性は、強
い非特異的感染防御活性を有することと併せて、大腸菌
等グラム陰性菌の感染によって引き起こされる病態、特
に敗血症、あるいは敗血症性ショックの予防・治療用剤
として有用である。また、ＩＬ−１の産生を抑え、さら
にＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）
の産生を誘導することは、ＩＬ−１自身の異常産生状態
になっていると考えられるような病態、例えば慢性関節
リューマチ等の治療用剤としても有用である。さらに、
ナチュラルキラー細胞を活性化し、抗腫瘍活性を有する
ことを見いだした上、抗ウイルス活性を有することも明
らかになった。抗腫瘍活性からは、抗腫瘍剤としての有
用性が考えられ、抗ウイルス活性と併せて強い非特異的
感染防御活性を有することからは、抗ウイルス剤として
の有用性がある。このような特性から、本願発明化合物
である新規なジサッカライド誘導体またはその塩は、医
薬用担体および／または希釈剤と配合してなる医薬組成
物として特に有用であると期待される。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１２】（１）微生物を用いた製造例本願化合物を微生物により製造する場合には、前記〔化
１〕により示される本願発明の化合物を生産することが
できる微生物であればいずれも使用できるが、例えばPo
rphyromonas(Bacteroides) gingivalis（ＡＴＣＣカタ
ログ番号３３２７７）等を使用することができる。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１８】また本願化合物は強いマイトジェン活性、
アジュバント活性、多クローン性Ｂ細胞活性化（非特異
的感染防御）活性、ナチュラルキラー活性等多様な生物
活性を有する一方、従来のリピドＡおよびリピドＡ誘導
体においてみられたマクロファージからの腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ）やＩＬ−１等のいわゆる炎症性サイトカイン
の産生を誘導する活性が殆ど見られないことを見いだし
た。したがって従来、リピドＡおよびリピドＡ誘導体に
おいて問題となっていた致死毒性および発熱原性等の有
害作用を示すことなく、免疫賦活剤として有用である。
さらには大腸菌のリピドＡが誘導するＩＬ−１の産生を
抑え、さらにＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ
−１ｒａ）の産生を誘導することを見いだしたが、これ
らの活性は、強い非特異的感染防御活性を有することと
併せて、大腸菌等グラム陰性菌の感染によって引き起こ
される病態、特に敗血症、あるいは敗血症性ショックの
予防・治療用剤として有用である。また、ＩＬ−１の産
生を抑え、さらにＩＬ−１レセプターアンタゴニスト
（ＩＬ−１ｒａ）の産生を誘導することは、ＩＬ−１自
身の異常産生状態になっていると考えられるような病
態、例えば慢性関節リューマチ等の治療用剤としても有
用である。さらに、ナチュラルキラー細胞を活性化し、
抗腫瘍活性を有することを見いだした上、抗ウイルス活
性を有することも明らかになった。抗腫瘍活性からは、
抗腫瘍剤としての有用性が考えられ、抗ウイルス活性と
併せて強い非特異的感染防御活性を有することからは、
抗ウイルス剤としての有用性がある。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２１】

【実施例】実施例１微生物源からの製造 Porphyromonas(Bacteroides) gingivalisを１６０リッ
トルのＧＡＭブイヨン（日水製薬株式会社製）培地（ｐ
Ｈ７．３）で嫌気的に３７℃で２６時間培養した。培養
完了後培養液の遠心を行い菌体を回収し、凍結乾燥によ
り乾燥菌体１００ｇを得た。この乾燥菌体を熱フェノー
ル−水抽出法にて抽出処理して粗ＬＰＳを得た。すなわ
ち１００ｇの乾燥菌体に３．５リットルの蒸留水を加え
６８℃に加熱し、別に６８℃に加熱した９０％フェノー
ルを加え６８℃にて２０分間撹拌し、氷冷後遠心して水
層を分取後、再度３．５リットルの蒸留水を加え抽出操
作を繰り返した。得られた水層を合わせ、蒸留水に対し
て十分透析後、濃縮し凍結乾燥を行い粗抽出物１２．４
７ｇを得た。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３０】

【表１】

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３１】（２）ＮＫ（ナチュラルキラー）活性本試験は以下の方法により検討した。すなわち、ＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスを用い１００μｇの本発明化合物、あるい
は比較化合物を０日目および７日目に静脈内に注射し、
１４日目に脾細胞を採取した。調製した脾細胞（１×１
０⁶ 個／０．１ml）に⁵¹Ｃｒで標識した標的細胞(Molon
eyウイルス誘発リンパ腫ＹＡＣ−１：２×１０⁴ 個／
０．１ml）を加え、４時間培養した。なお、最小遊離対
照群には脾細胞を含まない培養液のみを加え、最大遊離
対照群には０．１ＮＮａＯＨを加えた。培養終了後、
培養上清０．１mlを採取し、標的細胞が障害を受けるこ
とにより遊離した⁵¹Ｃｒの量（放射線量）を測定した。
活性は各価を以下の式に代入し、NK Activity(％）を求
めた。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３４】

【表２】

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４９】（９）その他の毒性局所シュワルツマン反応本試験は以下の方法により検討した。即ち雄のウサギの
皮内に０．２mlの生理食塩水で所定濃度に調製した供試
化合物を注射し、２４時間後、１００μｇ／ml／kgの S
almonella minnesota９７００ＬＰＳ−Ｗ（ディフコ社
製）を静脈より惹起注射して４時間後の皮内の出血反応
を観察した。その結果、本発明化合物は１００μｇ／si
teで出血反応は見られなかった。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 19/26 7432−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（１）呈色反応として、硫酸反応に陽
性、ディットマー・レスター反応に陽性、ニンヒドリン
反応に陰性、ＴＴＣ反応に陰性であって、（２）ＮＭＲスペクトルとして、 ¹Ｈ−ＮＭＲ(300MHz,
ＣＤＣｌ₃ ＋ＭｅＯＤ＋Ｄ₂ Ｏ）δ：0.81（12Ｈ，
ｄ）、0.82(3Ｈ，ｔ）、1.1-1.6(72Ｈ，ｍ，ＣＨ₂，Ｃ
Ｈ）、2.2-2.5 (6Ｈ，ｍ，ＣＯ−ＣＨ₂ ）、3.1-4.3(13
Ｈ，ｍ）、4.46(1Ｈ，ｄ）、5.15(1Ｈ，ｍ）、5.45(1
Ｈ，ｍ）の物性値をもち、（３）質量スペクトルとして、ネガティブＦＡＢ−ＭＳ
−ＭＳ、Ｍ／Ｚ 1193（Ｍ−Ｈ）、937(Ｍ−２Ｈ−Ｃ₁₅
Ｈ₃₁ＣＯＯ）の物性値を持つ、新規ジサッカライド誘導
体、またはその塩。
【請求項２】（１）グルコサミンβ（１−６）ジサッ
カライド構造の１位にリン酸基がエステル結合したもの
を基本骨格とし、（２）２位のアミノ基に3-hydroxy-15-methylhexadecan
oic acidがアミド結合し、（３）２′位のアミノ基に3-hexadecanoyl-15-methylhe
xadecanoic acid がアミド結合し、（４）４′位にリン酸基を持たず、（５）３位，３′位が遊離のままである、新規ジサッカ
ライド誘導体またはその塩。
【請求項３】請求項１または２に記載の化合物または
その薬学的に許容される塩を、医薬用担体および／また
は希釈剤と配合してなる医薬組成物。