RU2823329C1 - Method of producing heterogeneous biocatalyst based on lipase immobilized on anion-exchange resins av-16-gs and an-12p in oh-form - Google Patents
Method of producing heterogeneous biocatalyst based on lipase immobilized on anion-exchange resins av-16-gs and an-12p in oh-form Download PDFInfo
- Publication number
- RU2823329C1 RU2823329C1 RU2023119828A RU2023119828A RU2823329C1 RU 2823329 C1 RU2823329 C1 RU 2823329C1 RU 2023119828 A RU2023119828 A RU 2023119828A RU 2023119828 A RU2023119828 A RU 2023119828A RU 2823329 C1 RU2823329 C1 RU 2823329C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- buffer
- lipase
- solution
- anion
- anion exchanger
- Prior art date
Links
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 title claims abstract description 80
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 title claims abstract description 80
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 title claims abstract description 80
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 38
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims abstract description 32
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000010908 decantation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 9
- 229940040461 lipase Drugs 0.000 abstract description 62
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 102000019280 Pancreatic lipases Human genes 0.000 abstract description 2
- 108050006759 Pancreatic lipases Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 229940116369 pancreatic lipase Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 20
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 8
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 8
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 8
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 8
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 102100021851 Calbindin Human genes 0.000 description 6
- 101000898082 Homo sapiens Calbindin Proteins 0.000 description 6
- 101001021643 Pseudozyma antarctica Lipase B Proteins 0.000 description 6
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N palmitic acid group Chemical group C(CCCCCCCCCCCCCCC)(=O)O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 4
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- -1 ferrous metals Chemical class 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000006068 polycondensation reaction Methods 0.000 description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical class O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008892 Helianthus tuberosus Species 0.000 description 2
- 235000003230 Helianthus tuberosus Nutrition 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 2
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 2
- 241001661345 Moesziomyces antarcticus Species 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 108010090785 inulinase Proteins 0.000 description 2
- 235000021243 milk fat Nutrition 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920000371 poly(diallyldimethylammonium chloride) polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 108010079522 solysime Proteins 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N toluene Substances CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940122930 Alkalising agent Drugs 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241001161843 Chandra Species 0.000 description 1
- 102100031375 Endothelial lipase Human genes 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 108010048733 Lipozyme Proteins 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 1
- XERQKTRGJIKTRB-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)N)CC1=CN=CN1 XERQKTRGJIKTRB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N batilol Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(O)CO OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N chembl402140 Chemical compound Cl.C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=C\C(=N/CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009713 electroplating Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000002638 heterogeneous catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000009854 hydrometallurgy Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000592 inorganic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N isocyanate group Chemical group [N-]=C=O IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- FCCDDURTIIUXBY-UHFFFAOYSA-N lipoamide Chemical compound NC(=O)CCCCC1CCSS1 FCCDDURTIIUXBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000005555 metalworking Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 108010072641 thermostable lipase Proteins 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical group 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, пищевой промышленности. Изобретение может применяться при создании препаратов для гидролиза молочного жира, для производства и улучшения качества сыров.The invention relates to biotechnology and can be used in the chemical and pharmaceutical industry, medical practice, and the food industry. The invention can be used in the creation of preparations for the hydrolysis of milk fat, for the production and improvement of the quality of cheeses.
Липаза (КФ 3.1.1.3) катализирует разложение триглицеридов до ди- и моноглицеридов, глицерина и жирных кислот. Фермент обладает чрезвычайно широкой субстратной специфичностью и способностью к восприятию широкого спектра структурно разнообразных сложных жиров, спиртов и карбоновых кислот в качестве субстратов. Липазы стабильны и активны в органических растворителях [А.М. Безбородов, Н.А. Загустина. Липазы в реакциях катализа в органическом синтезе // Прикладная биохимия и микробиология. -2014.-Т. 50, №4.-С. 347-373].Lipase (EC 3.1.1.3) catalyzes the decomposition of triglycerides to di- and monoglycerides, glycerol and fatty acids. The enzyme has extremely broad substrate specificity and the ability to accept a wide range of structurally diverse complex fats, alcohols and carboxylic acids as substrates. Lipases are stable and active in organic solvents [A.M. Bezborodov, N.A. Zagustina. Lipases in catalysis reactions in organic synthesis // Applied biochemistry and microbiology. -2014.-T. 50, No. 4.-S. 347-373].
Липазы относятся к суперсемейству α/β гидролаз, обладают интерфазной активацией. Активный центр образован остатками аминокислот Ser-His-Asp/Glu и покрыт lid-доменом. Для термостабильных липаз характерен крупный lid-домен с двумя или более α-спиралями, а для мезофильных липаз характерна структура меньшего размера, состоящая из одной петли или α-спирали. Именно этот домен позволяет липазам существовать в двух конформациях - открытой и закрытой. На границе раздела фаз масло-вода происходит активация фермента путем конформационного изменения, сопровождающегося смещением lid-домена, что открывает карман, связывающий субстрат [Самойлова Ю.В., Сорокина К.Н., Пилигаев А.В. и др. Применение бактериальных термостабильных липолитических ферментов в современных биотехнологических процессах // Катализ в промышленности. - 2018. Т. 6. - С. 61-73]. Липазы стабильны и проявляют активность в диапазоне рН 4,0-8,0 [P. Chandra, Enespa, R. Singh et al. Microbial lipases and their industrial applications: a comprehensive review // Microb Cell Fact. -2020. V. 19, №169.-P. 1-42].Lipases belong to the α/β hydrolase superfamily and have interphase activation. The active center is formed by Ser-His-Asp/Glu amino acid residues and is covered by a lid domain. Thermostable lipases are characterized by a large lid domain with two or more α-helices, while mesophilic lipases are characterized by a smaller structure consisting of a single loop or α-helix. It is this domain that allows lipases to exist in two conformations - open and closed. At the oil-water interface, activation of the enzyme occurs through a conformational change, accompanied by a displacement of the lid domain, which opens a pocket that binds the substrate [Samoilova Yu.V., Sorokina K.N., Piligaev A.V. and others. Application of bacterial thermostable lipolytic enzymes in modern biotechnological processes // Catalysis in industry. - 2018. T. 6. - P. 61-73]. Lipases are stable and active in the pH range 4.0-8.0 [P. Chandra, Enespa, R. Singh et al. Microbial lipases and their industrial applications: a comprehensive review // Microb Cell Fact. -2020. V. 19, No. 169.-P. 1-42].
В настоящее время липазы используются в молочной промышленности для гидролиза молочного жира, в сыроделии для улучшения вкуса сыров, ускорения созревания сыра, а также в переработке кислых масел [Стурова Ю.Г., Гришкова А.В. Исследование активности прегастральных липаз // Ползуновский вестник. - 2019. Т. 4. - С. 29-33].Currently, lipases are used in the dairy industry for the hydrolysis of milk fat, in cheese making to improve the taste of cheeses, accelerate the ripening of cheese, as well as in the processing of sour oils [Sturova Yu.G., Grishkova A.V. Study of the activity of pregastric lipases // Polzunovsky Bulletin. - 2019. T. 4. - P. 29-33].
Развитие энзимологии способствует созданию биокатализаторов нового типа -иммобилизованных ферментов. Иммобилизация - распространенный метод повышения стабильности ферментов к денатурирующим воздействиям внешней среды, способствующий многократному применению биокатализаторов в фармацевтической, пищевой промышленности, а также в аналитических целях. К соединениям, используемым в качестве нерастворимых носителей, предъявляются высокие требования: с одной стороны, молекула фермента после иммобилизации не должна претерпевать существенных структурно-функциональных изменений, с другой - она должна быть прикреплена к матрице необратимо. К перспективным носителям относят ионообменные смолы [Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Кожокина О.М. и др. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах / Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005. Т. 5, №5. - С. 704-711].The development of enzymology contributes to the creation of a new type of biocatalysts - immobilized enzymes. Immobilization is a common method of increasing the stability of enzymes to denaturing influences of the external environment, facilitating the repeated use of biocatalysts in the pharmaceutical and food industries, as well as for analytical purposes. High demands are placed on compounds used as insoluble carriers: on the one hand, the enzyme molecule after immobilization should not undergo significant structural and functional changes, on the other, it must be irreversibly attached to the matrix. Promising carriers include ion exchange resins [Kovalyova T.A., Artyukhov V.G., Kozhokina O.M. and others. Study of the conditions for the immobilization of some hydrolytic enzymes on ion-exchange resins / Sorption and chromatographic processes. - 2005. T. 5, No. 5. - P. 704-711].
Ионообменные смолы - это нерастворимые полимеры, представляющие собой высокомолекулярные синтетические соединения с трехмерной гелевой или макропористой структурой, которые содержат различные функциональные группы, способные осуществлять ионный обмен [K. Biswas, S. Ghosh, В. Basu. Ion-exchange Resins and Polypeptide Supported Catalysts: A Critical Review // Current Green Chemistry. - 2020. - V. 7. - P. 40-52]. Ионообменные смолы можно разделить на катионо-, анионообменные и амфотерные. Катиониты обмениваются положительно заряженными ионами, проявляя кислотные свойства. Аниониты обменивают отрицательно заряженные ионы, проявляя основные свойства. Амфотерные иониты одновременно содержат кислотные и основные ионогенные группы и в зависимости от условий проявляют себя как катиониты или аниониты [Ольшанникова С.С, Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г. и др. Разработка методики адсорбционной иммобилизации трипсина на ионообменных смолах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2021. - Т. 21, №3. - С. 408-416].Ion exchange resins are insoluble polymers, which are high molecular weight synthetic compounds with a three-dimensional gel or macroporous structure that contain various functional groups capable of performing ion exchange [K. Biswas, S. Ghosh, V. Basu. Ion-exchange Resins and Polypeptide Supported Catalysts: A Critical Review // Current Green Chemistry. - 2020. - V. 7. - P. 40-52]. Ion exchange resins can be divided into cation-, anion-exchange and amphoteric. Cation exchangers exchange positively charged ions, exhibiting acidic properties. Anion exchangers exchange negatively charged ions, exhibiting basic properties. Amphoteric ion exchangers simultaneously contain acidic and basic ionogenic groups and, depending on conditions, manifest themselves as cation exchangers or anion exchangers [Olshannikova S.S., Sakibaev F.A., Kholyavka M.G. and others. Development of a technique for adsorption immobilization of trypsin on ion-exchange resins // Sorption and chromatographic processes. - 2021. - T. 21, No. 3. - P. 408-416].
Свойства и области применения ионообменных материалов в основном зависят от особенностей диссоциации их функциональных групп.Сильноосновные смолы протонируются во всем диапазоне рН и способны обмениваться анионами как в кислых, так и в щелочных растворах. Сильноосновные смолы могут поглощать слабые кислоты и даже ионизировать очень слабо диссоциированные кислоты. Слабоосновные обменники протонируются при значениях рН ниже 8 и могут работать только в кислых средах. Они обычно не могут адсорбировать слабую кислоту. Также выделяют среднеосновные аниониты, которые протонируются в значениях рН от 0 до 5 [W.Н. Нöll. Anion Exchangers: Ion Exchange // Water Treatment/Anion Exchangers: Ion Exchange. - 2000. - V. 3. - P. 4477-484].The properties and applications of ion-exchange materials mainly depend on the characteristics of the dissociation of their functional groups. Strongly basic resins are protonated over the entire pH range and are capable of exchanging anions in both acidic and alkaline solutions. Strongly basic resins can absorb weak acids and even ionize very weakly dissociated acids. Weak base exchangers are protonated at pH values below 8 and can only operate in acidic environments. They usually cannot adsorb weak acid. Medium-basic anion exchangers are also isolated, which are protonated at pH values from 0 to 5 [W.H. Nöll. Anion Exchangers: Ion Exchange // Water Treatment/Anion Exchangers: Ion Exchange. - 2000. - V. 3. - P. 4477-484].
В зависимости от способа получения анионообменные смолы делят на полимеризационные и поликонденсационные. Благодаря более высокой химической и термической стойкости, а также повышенной механической прочности поликонденсационные смолы заняли ведущее место в производстве ионообменных материалов.Depending on the production method, anion exchange resins are divided into polymerization and polycondensation resins. Due to their higher chemical and thermal resistance, as well as increased mechanical strength, polycondensation resins have taken a leading place in the production of ion exchange materials.
Ионообменная смола обладает двумя основными характеристиками -ионообменной емкостью и селективностью. Ионообменная емкость определяется способностью функциональной группы подвергаться вытеснению ионов, которые свободно присоединяются к ее структуре противоположно заряженными ионами, доступными в окружающем растворе. Ионообменные смолы применяются в различных сферах производства: в теплоэнергетике для умягчения и обессоливания воды, в гидрометаллургии для разделения цветных металлов, для регенерации отходов гальванотехники и металлообработки, в органическом синтезе в качестве катализатора, при очистке сточных вод, в пищевой промышленности. Ионообменные смолы могут выступать в качестве носителя для иммобилизации ферментов, тем самым они расширяют горизонты своего применения в промышленности и фармации [Holyavka M.G., Kayumov A.R., Baydamshina D.R. et al. Efficient fructose production from plant extracts by immobilized inulinases from Kluyveromyces marxsianus and Helianthus tuberosus / International Journal of Biological Macromolecules. - 2018. - Vol. 115. - P. 829-834].Ion exchange resin has two main characteristics - ion exchange capacity and selectivity. Ion exchange capacity is determined by the ability of a functional group to undergo displacement of ions that are freely attached to its structure by oppositely charged ions available in the surrounding solution. Ion exchange resins are used in various fields of production: in thermal power engineering for softening and desalting water, in hydrometallurgy for the separation of non-ferrous metals, for the regeneration of electroplating and metalworking waste, in organic synthesis as a catalyst, in wastewater treatment, in the food industry. Ion exchange resins can act as a carrier for the immobilization of enzymes, thereby expanding the horizons of their use in industry and pharmacy [Holyavka M.G., Kayumov A.R., Baydamshina D.R. et al. Efficient fructose production from plant extracts by immobilized inulinases from Kluyveromyces marxsianus and Helianthus tuberosus / International Journal of Biological Macromolecules. - 2018. - Vol. 115. - P. 829-834].
Существует способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 2389792 С2, МПК C12N 9/20, C12N 11/12, опубл. 20.05.2020, Бюл. №14], включающий растворение пищевой карбоксиметилцеллюлозы в буферном растворе или подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10, добавление к фильтрату полученного раствора панкреатической липазы или микробной липазы из культуры Aspergillus niger, или их смеси с активностью не ниже 100 ед./г в виде порошка в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества, интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин, после чего образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, уменьшают рН реакционной смеси до 3,0-3,5, оставляют на сутки в холодильнике, отделяют выпавшие частицы из раствора, неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы, содержащие липазу, отделяют и высушивают.There is a method for producing immobilized lipase [Patent RU 2389792 C2, IPC C12N 9/20, C12N 11/12, publ. 05/20/2020, Bulletin. No. 14], including dissolving food-grade carboxymethylcellulose in a buffer solution or alkalized distilled water with a pH of 9.5-10, adding to the filtrate the resulting solution of pancreatic lipase or microbial lipase from the culture of Aspergillus niger, or a mixture thereof with an activity of at least 100 units/g in the form of a powder in the presence of a 1-1.5% solution of a surfactant, intensive stirring at a speed of 4500-5000 rpm, after which the resulting emulsion is cooled to 5-10°C, the pH of the reaction mixture is reduced to 3.0 -3.5, leave for a day in the refrigerator, separate the precipitated particles from the solution, repeatedly add an acetate buffer with pH 4-4.5 to the remaining particles with stirring, then the precipitated particles containing lipase are separated and dried.
В данном способе иммобилизация липазы проводится на растворимом носителе, который, безусловно, имеет свои преимущества, но может быть легко подвержен заражению микробной микрофлорой и неустойчив к воздействию сильных кислот, щелочей и окислителей.In this method, lipase immobilization is carried out on a soluble carrier, which certainly has its advantages, but can be easily infected by microbial microflora and is unstable to strong acids, alkalis and oxidizing agents.
Известен способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 2301831, МПК C12N 9/20, C12N 11/08, опубл. 27.06.2007], включающий иммобилизацию липазы в полидиаллилдиметиламмоний хлориде при массовом соотношении липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:1-100 при рН 7,6-8,2, температуре 18-24°С в течение 10-20 минут. В отличие от него наш способ позволяет получить иммобилизованную липазу в нерастворимой форме, т.е. гетерогенный биокатализатор, т.к. применяемые нами в качестве носителей ионообменные смолы не растворимы в воде.There is a known method for producing immobilized lipase [Patent RU 2301831, IPC C12N 9/20, C12N 11/08, publ. 06/27/2007], including the immobilization of lipase in polydiallyldimethylammonium chloride at a mass ratio of lipase: polydiallyldimethylammonium chloride 1:1-100 at pH 7.6-8.2, temperature 18-24°C for 10-20 minutes. In contrast, our method allows us to obtain immobilized lipase in an insoluble form, i.e. heterogeneous biocatalyst, because The ion exchange resins we use as carriers are insoluble in water.
Существует способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 1696475 А1, МПК C12N 11/08, C12N 9/18 опубл. 07.12.1991, Бюл. №45], включающий обработку полиамидного носителя бифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы, в нейтральной или слабощелочной среде и последующее связывание липазы с модифицированным носителем, в качестве бифункционального реагента используют 2,4-толуолдииэоцианат в количестве 1-2 мг на 1 г носителя, а после обработки бифункциональным реагентом проводят модификацию носителя пальмитиновой кислотой, устанавливая соотношение 20-30 мл пальмитиновой кислоты на 1 г носителя.There is a method for producing immobilized lipase [Patent RU 1696475 A1, IPC C12N 11/08, C12N 9/18 publ. 07.12.1991, Bulletin. No. 45], including the treatment of a polyamide carrier with a bifunctional reagent bearing isocyanate groups in a neutral or slightly alkaline medium and subsequent binding of lipase with a modified carrier; 2,4-toluene diieocyanate is used as a bifunctional reagent in an amount of 1-2 mg per 1 g of carrier, and after treatment with a bifunctional reagent, the carrier is modified with palmitic acid, setting a ratio of 20-30 ml of palmitic acid per 1 g of carrier.
Недостатком изобретения является использование 2,4-толуолдииэоцианата в качестве бифункционального реагента, что ограничивает применение препарата в фармацевтической промышленности и медицине.The disadvantage of the invention is the use of 2,4-toluene diieocyanate as a bifunctional reagent, which limits the use of the drug in the pharmaceutical industry and medicine.
Анионообменная смола АВ-17-2П уже рассматривалась в литературе в качестве носителя для иммобилизации липазы из Rhizopus japonicus 1403 [Ковалева Т.А., Кожокина О.М., Багно О.П., Трофимова О.Д., Беленова А.С.Иммобилизация гидролитических ферментов на анионитах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2008. - Т. 8. Вып. 6. - С. 1035-1041; Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Трофимова О.Д., Беленова А.С, Воропаева Е.Н. Исследование термодинамических аспектов реакции гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005 - Т. 5. Вып. 3. - С. 353-360]. Авторы показали, что оптимальным методом иммобилизации является модифицированный глутаральдегидный способ ковалентного связывания фермента с носителем, заключающийся в процессе наращивания связывающего звена между липазой и анионитом при обработке рядом органических реагентов. Иммобилизация липазы адсорбционным методом на товарных анионообменных смолах АВ-26 и АВ-17-2П не дала положительных результатов [Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Кожокина О.М., Селеменев В.Ф., Трофимова О.Д., Холявка М.Г., Китаева Т.А. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005. - Т. 5. Вып. 5. - С. 704-711].Anion exchange resin AV-17-2P has already been considered in the literature as a carrier for the immobilization of lipase from Rhizopus japonicus 1403 [Kovaleva T.A., Kozhokina O.M., Bagno O.P., Trofimova O.D., Belenova A.S. .Immobilization of hydrolytic enzymes on anion exchangers // Sorption and chromatographic processes. - 2008. - T. 8. Issue. 6. - pp. 1035-1041; Kovaleva T.A., Artyukhov V.G., Trofimova O.D., Belenova A.S., Voropaeva E.N. Study of the thermodynamic aspects of the reaction of triglyceride hydrolysis with free and immobilized lipase // Sorption and chromatographic processes. - 2005 - T. 5. Issue. 3. - P. 353-360]. The authors showed that the optimal immobilization method is a modified glutaraldehyde method of covalent binding of the enzyme to the carrier, which consists in the process of increasing the connecting link between the lipase and the anion exchanger during treatment with a number of organic reagents. Immobilization of lipase by the adsorption method on commercial anion exchange resins AV-26 and AV-17-2P did not give positive results [Kovaleva T.A., Artyukhov V.G., Kozhokina O.M., Selemenev V.F., Trofimova O.D. ., Kholyavka M.G., Kitaeva T.A. Study of the conditions for immobilization of some hydrolytic enzymes on ion exchange resins // Sorption and chromatographic processes. - 2005. - T. 5. Issue. 5. - P. 704-711].
Недостатком предложенного этими авторами метода является использование глутарового альдегида в качестве сшивающего агента, что ограничивает применение препарата в пищевой, фармацевтической промышленности и медицине.The disadvantage of the method proposed by these authors is the use of glutaraldehyde as a cross-linking agent, which limits the use of the drug in the food, pharmaceutical and medicine industries.
Описан способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы дрожжей Candida antarctica фракции В [Патент RU 2650668 С1, МПК C12N 9/16, C12N 11/08, опубл. 13.12.2016, Бюл. №11], включающий избирательную адсорбцию липазы из Candida antarctica фракции В на гидрофобном макропористом носителе в процессе инкубации частиц носителя в водном концентрате культуральной жидкости штамма дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4298 с удельной ферментативной активностью не менее 350 ЛЕ/мг белка и последующую ковалентную модификацию адсорбированного фермента глутаровым альдегидом, добавляемым непосредственно в инкубационную суспензию до конечной концентрации его 1,0-2,5%. Процесс инкубации продолжают в течение 30-120 мин.A method for producing a heterogeneous biocatalyst based on yeast lipase Candida antarctica fraction B is described [Patent RU 2650668 C1, IPC C12N 9/16, C12N 11/08, publ. 12/13/2016, Bulletin. No. 11], including selective adsorption of lipase from Candida antarctica fraction B on a hydrophobic macroporous carrier during incubation of carrier particles in an aqueous concentrate of the culture fluid of the yeast strain Pichia pastoris VKPM Y-4298 with a specific enzymatic activity of at least 350 LU/mg protein and subsequent covalent modification adsorbed enzyme with glutaraldehyde, added directly to the incubation suspension to a final concentration of 1.0-2.5%. The incubation process is continued for 30-120 minutes.
В отличие от этого изобретения предлагаемый нами способ позволяет получить иммобилизованную липазу адсорбционным методом без дальнейшей ковалентной модификации.In contrast to this invention, our proposed method makes it possible to obtain immobilized lipase by the adsorption method without further covalent modification.
Известен способ иммобилизации липазы CALB путем адсорбции на сополимере дивинилбензола и метакрилата, выпускаемом компанией Purolite®Life Sciences под маркой Lifetech™ ECR 1030М [Basso A., Froment L., Hesseler М., Serban S. New highly robust divinyl benzene/acrylate polymer for immobilization of lipase CALB // Eur. J. Lipid Sci. Technol. - 2013. - V. 115. - P. 468-472], в котором для иммобилизации используют липазу CALB в виде водного раствора (коммерческий препарат Lipozyme®CALB L, компания Novozymes) с удельной гйдролазной (липазной) активностью (по гидролизу трибутирина) 330 мкмоль/мг белка. Перед использованием в растворе CALB устанавливают рН 7,5 и инкубируют раствор с носителем при перемешивании в течение ночи. Затем внешний раствор отделяю вакуумной фильтрацией, носитель с адсорбированной CALB однократно промывают 0,02 М фосфатно-натриевым буфером, рН 7,5, и высушивают в токе азота.There is a known method for immobilizing CALB lipase by adsorption on a copolymer of divinylbenzene and methacrylate, produced by Purolite®Life Sciences under the brand Lifetech™ ECR 1030M [Basso A., Froment L., Hesseler M., Serban S. New highly robust divinyl benzene/acrylate polymer for immobilization of lipase CALB // Eur. J. Lipid Sci. Technol. - 2013. - V. 115. - P. 468-472], in which CALB lipase is used for immobilization in the form of an aqueous solution (commercial preparation Lipozyme®CALB L, Novozymes company) with specific hydrolase (lipase) activity (for the hydrolysis of tributyrin) 330 µmol/mg protein. Before use, adjust the pH of the CALB solution to 7.5 and incubate the solution with the carrier with stirring overnight. Then the external solution is separated by vacuum filtration, the carrier with adsorbed CALB is washed once with 0.02 M sodium phosphate buffer, pH 7.5, and dried in a stream of nitrogen.
Описаны способы сорбции липаз на ионообменных материалах [CN108148827A, CN 101712951 A, CN 106867989 A, JP H01273588 A, JPH 03160992 A, US 5273898 A, WO 2015081879 A1], в том числе Amberlite, Duolite, Purolite [WO 2008084470 A2, CN 102839166 A], Lewatit, Dowex [US 5292649 A], различных типах органических и неорганических полимерных смол [RU 2573929, CN 114657169 A], ковалентной иммобилизации этих же ферментов на названных типах носителей [WO 2008139455 A2], а также способы получения мультилипазных препаратов [WO 2009069116 A2] Перечисленные выше подходы не позволяют полностью удалить несвязанную с носителем форму липазы, которая в дальнейшем может попадать в целевой продукт.Methods for the sorption of lipases on ion exchange materials are described [CN108148827A, CN 101712951 A, CN 106867989 A, JP H01273588 A, JPH 03160992 A, US 5273898 A, WO 2015081879 A1], including Amberlite, Du olite, Purolite [WO 2008084470 A2, CN 102839166 A], Lewatit, Dowex [US 5292649 A], various types of organic and inorganic polymer resins [RU 2573929, CN 114657169 A], covalent immobilization of the same enzymes on these types of carriers [WO 2008139455 A2], as well as methods for producing multilipase drugs [ WO 2009069116 A2] The above approaches do not completely remove the form of lipase not bound to the carrier, which can subsequently end up in the target product.
Известны способы иммобилизации липазы на различных типах носителей путем абсорбции, ионного связывания, ковалентного связывания, включения в гели, мембраны, а также способы получения иммобилизованной липазы путем комбинирования этих методов [US 2010210745 A1]. Однако ни в одном из этих способов не доказано, что получаемый иммобилизованный препарат полностью очищен от несвязавшегося фермента.There are known methods for immobilizing lipase on various types of carriers by absorption, ionic binding, covalent binding, inclusion in gels, membranes, as well as methods for obtaining immobilized lipase by combining these methods [US 2010210745 A1]. However, in none of these methods has it been proven that the resulting immobilized drug is completely free of unbound enzyme.
В качестве прототипа был выбран способ получения препарата иммобилизованной липазы (ЕР0140542А1), согласно которому 2,20 г липазы Muсor miehei растворяли в 20 мл воды, смешивали с 10 г промытой (8,5 г сухой массы) ионообменной смолы Duolite ES 562, смесь доводили до рН 5,0 и оставляли на 4 часа при 5°С при перемешивании магнитной мешалкой. После фильтрации и промывки небольшим количеством воды препарат сушили в вакууме при комнатной температуре. Активность, оставшаяся в фильтрате, составила 8% от общего исходного количества.As a prototype, a method was chosen for producing an immobilized lipase preparation (EP0140542A1), according to which 2.20 g of Muсor miehei lipase was dissolved in 20 ml of water, mixed with 10 g of washed (8.5 g dry weight) Duolite ES 562 ion exchange resin, the mixture was adjusted to pH 5.0 and left for 4 hours at 5°C with stirring with a magnetic stirrer. After filtering and washing with a small amount of water, the preparation was dried in vacuum at room temperature. The activity remaining in the filtrate was 8% of the total original amount.
В отличие прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованную липазу с более высокой гидролазной активностью. Заявляемое изобретение предназначено для расширения числа носителей, используемых для стабилизации липазы. Кроме того, гетерогенный катализатор включает только иммобилизованную липазу и полностью отмыт от ее неиммобилизованной формы.Unlike the prototype, our method allows us to obtain immobilized lipase with higher hydrolase activity. The claimed invention is intended to expand the number of carriers used to stabilize lipase. In addition, the heterogeneous catalyst contains only immobilized lipase and is completely washed away from its non-immobilized form.
Технический результат заявленного изобретения заключается в получении гетерогенного, нерастворимого в воде биокатализатора на основе липазы из поджелудочной железы свиньи, иммобилизованной адсорбционным методом на анионообменных смолах АВ-16-ГС или АН-21А, включающего только иммобилизованную (стабилизированную) липазу и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, обладающего более высокой общей и удельной активностью, равной 29 мкмоль и 10700 мкмоль/мг, соответственно, для липазы, иммобилизованной на АН-12П, а также 22,5 мкмоль и 11900 мкмоль/мг, соответственно, для липазы, иммобилизованной на АВ-16-ГС, по сравнению с прототипом, благодаря чему возможно проводить ферментативные реакции с более высокими скоростями.The technical result of the claimed invention is to obtain a heterogeneous, water-insoluble biocatalyst based on lipase from the pig pancreas, immobilized by the adsorption method on anion exchange resins AV-16-GS or AN-21A, including only immobilized (stabilized) lipase and completely washed from its unstabilized (non-immobilized) form, which has a higher total and specific activity equal to 29 µmol and 10700 µmol/mg, respectively, for lipase immobilized on AN-12P, as well as 22.5 µmol and 11900 µmol/mg, respectively, for lipase, immobilized on AV-16-GS, compared to the prototype, making it possible to carry out enzymatic reactions at higher rates.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на анионообменных смолах АВ-16-ГС И АН-12П в ОН-форме, включающем адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу анионообменника в процессе инкубации липазы и анионообменника в буферном растворе при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на анионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора буфером; согласно изобретению, перед иммобилизацией анионообменник в ОН-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г анионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии, содержащей 1 г анионообменной смолы АВ-16-ГС или АН-12П в 20 мл буфера, 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 3 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации и, предшествующего ей, выдерживания анионообменника используют 0,05М глициновый буфер с рН 10,5, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на анионообменнике проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и последующей декантацией внешнего раствора, промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы.The technical result is achieved by the fact that in the method of producing a heterogeneous biocatalyst based on lipase immobilized on anion exchange resins AV-16-GS and AN-12P in the OH form, including adsorption immobilization of lipase in a buffer solution onto an anion exchanger matrix during incubation of the lipase and anion exchanger in buffer solution at room temperature with periodic stirring, separating the external solution from the immobilized lipase on an anion exchanger, washing the resulting biocatalyst with a buffer; according to the invention, before immobilization, the anion exchanger in the OH form is kept for 12 hours at room temperature in a buffer, 20 ml of buffer is used per 1 g of anion exchanger, immobilization is carried out by adding to a suspension containing 1 g of anion exchange resin AV-16-GS or AN-12P in 20 ml of buffer, 10 ml of a solution of lipase from the pig pancreas in a buffer at a lipase concentration of 3 mg/ml, 0.05 M glycine buffer with pH 10.5 is used as a buffer solution for immobilization and, prior to it, maintaining the anion exchanger , after which incubation is carried out with stirring at a speed of 250 rpm for 1.5 hours, then the separation of the external solution from the immobilized lipase on an anion exchanger is carried out by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes and subsequent decantation of the external solution, washing the resulting biocatalyst carried out using dialysis using a cellophane bag 34 mm wide, with a capacity of 3.7 ml per 1 cm of length, with a pore diameter of 25 kDa against 0.2 M phosphate-citrate buffer, pH 6.5, based on the calculation that for washing 1 g of the resulting biocatalyst, 400 ml of 0.2 M phosphate-citrate buffer with pH 6.5 are used, dialysis is carried out for 8 hours, after which the buffer is changed to a portion of buffer in a volume of 400 ml and dialysis is continued for another 16 hours until there is no free lipase in the washing solution .
Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных смолах.Fig. 1. Diagram of protein content values (in mg per 1 g of carrier) in lipase preparations immobilized by the adsorption method on ion-exchange resins.
Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в мкмоль жирных кислот) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных смолах.Fig. 2. Diagram of total activity values (in µmol of fatty acids) in lipase preparations immobilized by the adsorption method on ion-exchange resins.
Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных смолах.Fig. 3. Diagram of specific activity values (in µmol per 1 mg of protein in the sample) in lipase preparations immobilized by the adsorption method on ion-exchange resins.
Пример реализации способа.An example of the method implementation.
В качестве объекта исследования была выбрана липаза из поджелудочной железы свиньи, фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил трибутирин фирмы Acros. В качестве носителей для иммобилизации были рассмотрены ионообменные смолы ЭДЭ-10 (ГОСТ 20301-74), АМ-21, АВ-16-ГС (ГОСТ 20301-74), PUROLITE А100, АН-12П (Уральская химическая компания, Россия). Анионит ЭДЭ-10П - промежуточной основности, представляет собой полифункциональный анионит, содержит вторичные и третичные аминогруппы алифатического ряда и около 20% групп четвертичных аммонийных оснований. ЭДЭ-10П получают поликонденсаций полиэтиленполиаминов с эпихлоргидрином. AM 21А - сильноосновный анионит полистирольной природы. По классификации ионообменных смол АВ-16-ГС является анионитом, синтезированным путем поликонденсации полиэтиленполиамина, эпихлоргидрина и пиридина. АН-12П -полифункциональный анионит, содержит в качестве ионогенных групп вторичные и третичные аминогруппы алифатического ряда. Анионит PUROLITE А100 является аналогом ионитов группы АН и содержит в качестве ионогенных групп вторичные и третичные аминогруппы алифатического ряда [Лурье А.А. Сорбенты и хроматографические носители. - М.: Химия, 1972. - 320 с; Бруцкус Т.К., Замбровская Е.В., Самборский И.В. Иониты. Каталог.- Черкассы, 1975. - 36 с.].Lipase from the porcine pancreas from Sigma-Aldrich was chosen as the object of study; the substrate for hydrolysis was tributyrin from Acros. The ion exchange resins EDE-10 (GOST 20301-74), AM-21, AV-16-GS (GOST 20301-74), PUROLITE A100, AN-12P (Ural Chemical Company, Russia) were considered as carriers for immobilization. Anion exchanger EDE-10P - intermediate basicity, is a multifunctional anion exchanger, contains secondary and tertiary amino groups of the aliphatic series and about 20% of groups of quaternary ammonium bases. EDE-10P is obtained by polycondensation of polyethylene polyamines with epichlorohydrin. AM 21A is a strongly basic anion exchanger of polystyrene nature. According to the classification of ion exchange resins, AV-16-GS is an anion exchanger synthesized by polycondensation of polyethylene polyamine, epichlorohydrin and pyridine. AN-12P is a multifunctional anion exchanger that contains secondary and tertiary amino groups of the aliphatic series as ionogenic groups. Anion exchanger PUROLITE A100 is an analogue of ion exchangers of the AN group and contains secondary and tertiary amino groups of the aliphatic series as ionogenic groups [Lurie A.A. Sorbents and chromatographic media. - M.: Chemistry, 1972. - 320 p.; Brutskus T.K., Zambrovskaya E.V., Samborsky I.V. Ionites. Catalog. - Cherkassy, 1975. - 36 p.].
Перед проведением иммобилизации исследуемые образцы ионообменных смол помещали в насыщенный раствор NaCl на 3-4 ч для предотвращения растрескивания гранул, далее сорбент переносили в колонку и промывали дистиллированной водой. Для удаления минеральных примесей ионит сначала обрабатывали растворами НС1 в количестве 5 объемов на 1 объем смолы в нарастающей концентрации 0,5-3,0 М до отсутствия ионов железа в промывных водах, а затем обработку соляной кислотой повторяли при соответствующем уменьшении концентрации кислоты и отмывали смолу дистиллированной водой до нейтральной реакции. Следующей стадией подготовки ионитов-носителей была обработка растворами гидроксида натрия в нарастающей концентрации 0,1-0,25 М, после которой смолы отмывали дистиллированной водой. Для более полного удаления примесей кислотно-щелочную обработку проводили троекратно. После очистки ионит переводили в ОН-форму. Подготовленный таким образом носитель высушивали до постоянной массы при комнатной температуре и хранили в емкости с плотно притертой крышкой [Создание гетерогенного ферментного препарата на основе иммобилизованной инулиназы из Helianthus tuberosus.. Холявка М.Г. [и др.] // Биотехнология. -2012. - №6. - С. 31-42].Before immobilization, the studied samples of ion exchange resins were placed in a saturated NaCl solution for 3-4 hours to prevent cracking of the granules, then the sorbent was transferred to a column and washed with distilled water. To remove mineral impurities, the ion exchanger was first treated with HC1 solutions in an amount of 5 volumes per 1 volume of resin in an increasing concentration of 0.5-3.0 M until the absence of iron ions in the washing waters, and then the treatment with hydrochloric acid was repeated with a corresponding decrease in the acid concentration and the resin was washed distilled water until neutral. The next stage of preparation of ion exchange resins was treatment with sodium hydroxide solutions in increasing concentrations of 0.1-0.25 M, after which the resins were washed with distilled water. To more completely remove impurities, acid-base treatment was carried out three times. After purification, the ion exchanger was transferred to the OH form. The carrier prepared in this way was dried to a constant weight at room temperature and stored in a container with a tightly sealed lid [Creation of a heterogeneous enzyme preparation based on immobilized inulinase from Helianthus tuberosus.. Kholyavka M.G. [and others] // Biotechnology. -2012. - No. 6. - P. 31-42].
Иммобилизацию липазы на матрице ионообменной смолы осуществляли адсорбционным методом. 1 г воздушно сухой предварительно кондиционированной анионообменной смолы в ОН-форме оставляли на 12 ч при комнатной температуре в 20 мл 0,05М глицинового буфера с рН 10,5. После чего 10 мл раствора липазы в 0,05М глициновом буфере с рН 10,5 в концентрации липазы 3 мг/мл добавляли к суспензии носителя в буфере и перемешивали в колбе с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Полученную смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин, внешний раствор декантировали, осадок промывали до отсутствия белка в промывных водах с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 грамма полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы. Контроль наличия или отсутствия белка в промывных водах осуществляли с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ=280 нм.Immobilization of lipase on the ion exchange resin matrix was carried out by the adsorption method. 1 g of air-dried pre-conditioned anion exchange resin in OH form was left for 12 hours at room temperature in 20 ml of 0.05 M glycine buffer with pH 10.5. Then 10 ml of a solution of lipase in 0.05 M glycine buffer with pH 10.5 at a lipase concentration of 3 mg/ml was added to the suspension of the carrier in the buffer and stirred in the flask using an electric stirrer at a speed of 250 rpm for 1.5 h at room temperature. The resulting mixture was centrifuged at 3000 rpm for 5 min, the external solution was decanted, the precipitate was washed until protein was absent in the wash waters by dialysis using a Spectra/Por 6 Standard RC cellophane bag, 34 mm wide, with a capacity of 3.7 ml per 1 cm in length, made from regenerated cellulose, with a pore diameter of 25 kDa against 0.2 M phosphate-citrate buffer, pH 6.5, based on the calculation that 400 ml of 0.2 M phosphate-citrate buffer with pH 6 are used to wash 1 gram of the resulting biocatalyst 5, dialysis is carried out for 8 hours, after which the buffer is changed to a portion of buffer in a volume of 400 ml and dialysis is continued for another 16 hours until there is no free lipase in the washing solution. The presence or absence of protein in the washing waters was monitored using an SF-2000 spectrophotometer at λ=280 nm.
Содержание белка в иммобилизованных препаратах липазы определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].The protein content in immobilized lipase preparations was determined by the Lowry method [Lowry O.N., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].
Определение каталитической активности липазы проводили на субстрате трибутирине [Беленова А.А. Исследование закономерностей гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой: дис. к.б.н. 03.01.02 / Беленова А.С. - Воронеж, 2011. - 162 с.]. Реакционную смесь объемом 2 мл, содержащую 0,5 мл эмульсии субстрата в 0,2 М фосфатно-цитратном буфере, рН 6,5, инкубировали при 37°С с образцом иммобилизованного фермента в течение 15 мин. Отбирали 1 мл реакционной смеси и добавляли 1 мл 0,1 М HCl в этаноле для остановки реакции. Далее для количественного определения образующихся в ходе гидролиза жирных кислот к этой смеси добавляли 5 мл гексана, встряхивали, и после расслоения из гексанового слоя отбирали 1 мл пробы и вносили в пробирку с 3 мл цветного реагента родамина 6Ж. Интенсивность образующейся окраски измеряли через 20 мин при длине волны 515 нм. Для определения содержания жирных кислот использовали калибровочную кривую, построенную по пальмитиновой кислоте.Determination of the catalytic activity of lipase was carried out on the substrate tributyrin [Belenova A.A. Study of the patterns of triglyceride hydrolysis by free and immobilized lipase: dis. Ph.D. 03.01.02 / Belenova A.S. - Voronezh, 2011. - 162 p.]. A 2-mL reaction mixture containing 0.5 mL of substrate emulsion in 0.2 M phosphate-citrate buffer, pH 6.5, was incubated at 37°C with a sample of the immobilized enzyme for 15 min. 1 ml of the reaction mixture was taken and 1 ml of 0.1 M HCl in ethanol was added to stop the reaction. Next, to quantitatively determine the fatty acids formed during hydrolysis, 5 ml of hexane was added to this mixture, shaken, and after separation, 1 ml of sample was taken from the hexane layer and added to a test tube with 3 ml of the color reagent Rhodamine 6G. The intensity of the resulting color was measured after 20 min at a wavelength of 515 nm. To determine the fatty acid content, a calibration curve based on palmitic acid was used.
Удельную активность липазы выражали в мкмоль жирных кислот, выделившихся за 1 мин в расчете на 1 мг белка, и рассчитывали по формуле:The specific activity of lipase was expressed in µmol of fatty acids released in 1 min per 1 mg of protein and was calculated using the formula:
А=a/B⋅t,А=a/B⋅t,
где а - количество вещества жирных кислот, мкмоль;where a is the amount of fatty acid substance, µmol;
В - содержание белка в препарате, мг;B - protein content in the preparation, mg;
t - время гидролиза, мин.t - hydrolysis time, min.
Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.All experimental studies were carried out in at least 8-fold repetition. Statistical processing of the obtained results was carried out at a significance level of 5% using Student's t-test.
Результаты отражены на фиг. 1-3.The results are shown in Fig. 1-3.
Наибольшее количество белка в гетерогенных препаратах (в мг на г носителя) наблюдалось при иммобилизации липазы адсорбционным методом на анионообменной смоле АМ-21 (фиг. 1). Высокие значения общей активности липазы (в мкмоль жирных кислот) были зарегистрированы при ее сорбции на АН-12П (фиг. 2). Наибольшую удельную активность показали препараты липазы, иммобилизованной с помощью адсорбционного метода на матрицах АВ-16-ГС и АН-12П (фиг. 3). Таким образом, оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в мкмоль жирных кислот) и удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) было получено при адсорбции липазы на анионитах АВ-16-ГС и АН-12П.The largest amount of protein in heterogeneous preparations (in mg per g of carrier) was observed when lipase was immobilized by the adsorption method on an AM-21 anion exchange resin (Fig. 1). High values of total lipase activity (in μmol of fatty acids) were recorded during its sorption on AN-12P (Fig. 2). The highest specific activity was shown by lipase preparations immobilized using the adsorption method on matrices AB-16-GS and AN-12P (Fig. 3). Thus, the optimal ratio of protein content (mg per g of carrier), total activity (in µmol of fatty acids) and specific activity (in µmol per 1 mg of protein in the sample) was obtained by adsorption of lipase on anion exchangers AV-16-GS and AN- 12P.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2823329C1 true RU2823329C1 (en) | 2024-07-22 |
Family
ID=
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU883173A1 (en) * | 1979-12-03 | 1981-11-23 | Среднеазиатский Научно-Исследовательский И Проектно-Конструкторский Институт Пищевой Промышленности | Method of preparing immobilized lipase |
| RU2301830C1 (en) * | 2006-04-10 | 2007-06-27 | Федеральное Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Московская Государственная Академия Ветеринарной Медицины И Биотехнологии Имени К.И. Скрябина" | Immobilized lipase preparation method |
| RU2308486C1 (en) * | 2006-04-10 | 2007-10-20 | Федеральное Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Московская Государственная Академия Ветеринарной Медицины И Биотехнологии Имени К.И. Скрябина" | Method for production of immobilized lipase |
| RU2389792C2 (en) * | 2008-07-02 | 2010-05-20 | Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет леса" | Method for preparing immobilised lipase |
| WO2015081879A1 (en) * | 2013-12-06 | 2015-06-11 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | Sn-1,3 selective immobilized lipase for catalytic esterification and ester interchange and method for preparing same |
| RU2650668C1 (en) * | 2016-12-13 | 2018-04-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Method for obtaining a heterogeneous bioacatalizer based on candida antarctica yeast liquases of fraction b |
| CN108148827A (en) * | 2016-12-02 | 2018-06-12 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | Immobilised enzymes and its preparation method and application |
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU883173A1 (en) * | 1979-12-03 | 1981-11-23 | Среднеазиатский Научно-Исследовательский И Проектно-Конструкторский Институт Пищевой Промышленности | Method of preparing immobilized lipase |
| RU2301830C1 (en) * | 2006-04-10 | 2007-06-27 | Федеральное Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Московская Государственная Академия Ветеринарной Медицины И Биотехнологии Имени К.И. Скрябина" | Immobilized lipase preparation method |
| RU2308486C1 (en) * | 2006-04-10 | 2007-10-20 | Федеральное Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Московская Государственная Академия Ветеринарной Медицины И Биотехнологии Имени К.И. Скрябина" | Method for production of immobilized lipase |
| RU2389792C2 (en) * | 2008-07-02 | 2010-05-20 | Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет леса" | Method for preparing immobilised lipase |
| WO2015081879A1 (en) * | 2013-12-06 | 2015-06-11 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | Sn-1,3 selective immobilized lipase for catalytic esterification and ester interchange and method for preparing same |
| CN108148827A (en) * | 2016-12-02 | 2018-06-12 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | Immobilised enzymes and its preparation method and application |
| RU2650668C1 (en) * | 2016-12-13 | 2018-04-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Method for obtaining a heterogeneous bioacatalizer based on candida antarctica yeast liquases of fraction b |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zahirinejad et al. | Nano-organic supports for enzyme immobilization: scopes and perspectives | |
| Brena et al. | Immobilization of enzymes: a literature survey | |
| Brena et al. | Immobilization of enzymes: a literature survey | |
| Jesionowski et al. | Enzyme immobilization by adsorption: a review | |
| Ferreira et al. | Different strategies to immobilize lipase from Geotrichum candidum: kinetic and thermodynamic studies | |
| Gupta et al. | Protein crosslinking: uses in chemistry, biology and biotechnology | |
| T. sriwong et al. | Recent advances in enzyme immobilization utilizing nanotechnology for biocatalysis | |
| Coutinho et al. | Nanoimmobilization of β-glucosidase onto hydroxyapatite | |
| Reichardt et al. | Highly stable adsorptive and covalent immobilization of Thermomyces lanuginosus lipase on tailor-made porous carbon material | |
| Zhang et al. | Progress and perspective of enzyme immobilization on zeolite crystal materials | |
| Fernandez-Lorente et al. | Cross-linking of lipases adsorbed on hydrophobic supports: Highly selective hydrolysis of fish oil catalyzed by RML | |
| Guedidi et al. | Effect of enzyme location on activity and stability of trypsin and urease immobilized on porous membranes by using layer-by-layer self-assembly of polyelectrolyte | |
| Abdella et al. | Protease immobilization on a novel activated carrier alginate/dextrose beads: Improved stability and catalytic activity via covalent binding | |
| Sugahara et al. | Immobilization of Beauveria bassiana lipase on silica gel by physical adsorption | |
| Zhang et al. | Lipase immobilized to a short alkyl chain-containing zwitterionic polymer grafted on silica nanoparticles: Moderate activation and significant increase of thermal stability | |
| Kołodziejczak‐Radzimska et al. | Physicochemical and catalytic properties of acylase I from aspergillus melleus immobilized on amino‐and carbonyl‐grafted stöber silica | |
| Milani et al. | Enhancing organophosphorus hydrolase stability by immobilization on chitosan beads containing glutaraldehyde | |
| Suckling | Immobilized enzymes | |
| RU2823329C1 (en) | Method of producing heterogeneous biocatalyst based on lipase immobilized on anion-exchange resins av-16-gs and an-12p in oh-form | |
| Wang et al. | Influence of silica-derived nano-supporters on cellobiase after immobilization | |
| Ozmen et al. | Pretreatment of Candida rugosa lipase with soybean oil before immobilization on β-cyclodextrin-based polymer | |
| Abdulhamid et al. | Effect of the biological functionalization of nanoparticles on magnetic CLEA preparation | |
| Gennari et al. | Kluyveromyces lactis β-galactosidase immobilized on collagen: catalytic stability on batch and packed-bed reactor hydrolysis | |
| RU2813512C1 (en) | Method of producing a heterogeneous biocatalyst based on lipase immobilized on ku-2-8 cation exchange resins in the h-form | |
| Bhardwaj et al. | Enzyme Immobilization: An Effective Platform to Improve the Reusability and Catalytic Efficiency of Enzymes |