RU2389792C2

RU2389792C2 - Method for preparing immobilised lipase

Info

Publication number: RU2389792C2
Application number: RU2008126752/13A
Authority: RU
Inventors: Андрей Дмитриевич Неклюдов (RU); Андрей Дмитриевич Неклюдов; Андрей Николаевич Иванкин (RU); Андрей Николаевич Иванкин; Ольга Петровна Прошина (RU); Ольга Петровна Прошина; Галина Львовна Олиференко (RU); Галина Львовна Олиференко
Priority date: 2008-07-02
Filing date: 2008-07-02
Publication date: 2010-05-20
Also published as: RU2008126752A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: food grade carboxymethyl cellulose is dissolved in a buffer solution or alkalified distilled water of pH 9.5-10 and added to a filtrate of the prepared solution of pancreatic lipase or microbial lipase of culture Aspergillus niger, or their mixture with activity 100 unit/g and more as a powder with 1-1.5% surfactant solution while vortexing at 4500-5000 rpm. The prepared emulsion is cooled to 5-10°C, pH of the reaction mixture is reduced to 3.0-3.5 and the mixture is kept for one day in a refrigerator. The precipitated particles are separated from the solution, and an acetate buffer of pH 4-4.5 is multiply added to the stirred remained particles; then the precipitated particles containing lipase are separated and dried up.

EFFECT: downsizing the particles of immobilised lipase, faster enzymatic process.

3 ex

Description

Изобретение относится к нанотехнологиям и может быть использовано в медицинской, пищевой и сельскохозяйственной отраслях промышленности.The invention relates to nanotechnology and can be used in the medical, food and agricultural industries.

В настоящее время известны многочисленные методы иммобилизации различных ферментов, включая и липазы, самыми разнообразными способами, например их включением в различные биополимеры (см. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Экологические основы биотехнологии. - М.: МГУЛ, 2006. - С.105-106). Ближайшим аналогом к предлагаемому способу является способ получения иммобилизованной липазы, предусматривающий смешивание 1 мг липазы из поджелудочной железы (фирма Сигма) или микробной липазы из Mucor javanicus (фирма Сигма) и полистиролсульфоната натрия в соотношении 1:1-100 при комнатной температуре, рН 7,6-8,2 в течение 10-20 мин (патент РФ №2308486 С1, 20.10.2006 г.).Currently, numerous methods are known for immobilizing various enzymes, including lipases, in a variety of ways, for example, by incorporating them into various biopolymers (see Neklyudov A.D., Ivankin A.N. Ecological fundamentals of biotechnology. - M.: MGUL, 2006. - S.105-106). The closest analogue to the proposed method is a method for producing immobilized lipase, which involves mixing 1 mg of lipase from the pancreas (Sigma company) or microbial lipase from Mucor javanicus (Sigma company) and sodium polystyrene sulfonate in a ratio of 1: 1-100 at room temperature, pH 7, 6-8.2 for 10-20 minutes (RF patent No. 2308486 C1, 10.20.2006).

Основным недостатком всех этих способов является использование в качестве носителя преимущественно синтетических полимеров, которые невозможно использовать в пищевой и медицинской промышленностях. Кроме того, в результате получения подобных биокатализаторов размер частиц обычно составляет 100-200 мкм, что не позволяет использовать их в медицинской практике, так как с их помощью нельзя получать истинные растворы, необходимые для инфузионной и других видов терапии.The main disadvantage of all these methods is the use as a carrier of predominantly synthetic polymers, which cannot be used in the food and medical industries. In addition, as a result of obtaining such biocatalysts, the particle size is usually 100-200 microns, which does not allow their use in medical practice, since they cannot be used to obtain the true solutions necessary for infusion and other types of therapy.

Задача, решаемая данным изобретением, заключается в разработке способа включения липаз в частицы размером 250-300 нм, которые дают возможность использовать полученные биокатализаторы в самых разнообразных целях, включая медицину и пищевую промышленность.The problem solved by this invention is to develop a method for incorporating lipases into particles of 250-300 nm in size, which make it possible to use the obtained biocatalysts for a wide variety of purposes, including medicine and the food industry.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе получения иммобилизованной липазы, заключающемся в растворении носителя в растворе с добавлением порошка фермента с активностью не ниже 100 ед./г, в качестве носителя используют пищевую карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ), в качестве фермента - липазу, продуцируемые культурами животных панкреатических клеток и Aspergillus niger в виде порошка, иммобилизацию проводят в буферных растворах или в подщелоченной дистиллированной воде с pH 9,5-10 в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества при интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин, после чего рН реакционной смеси уменьшают до значения рН 3,0-3, 5, выпавшие частицы липазы вместе с ферментом отделяют и высушивают.The solution of this problem is ensured by the fact that in the method of obtaining immobilized lipase, which consists in dissolving the carrier in a solution with the addition of an enzyme powder with an activity of at least 100 units / g, food carboxymethyl cellulose (CMC) is used as a carrier, and lipase produced as an enzyme cultures of animal pancreatic cells and Aspergillus niger in powder form, immobilization is carried out in buffer solutions or in alkaline distilled water with a pH of 9.5-10 in the presence of a 1-1.5% solution of surface-active substances with vigorous stirring at a speed of 4500-5000 rpm, after which the pH of the reaction mixture is reduced to pH 3.0-3-3, precipitated lipase particles together with the enzyme are separated and dried.

Изобретение поясняется следующими примерами:The invention is illustrated by the following examples:

Пример 1. 10 г пищевой карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) добавляют к 50 мл боратного буфера, имеющего рН 9,5, и реакционную смесь перемешивают до максимального растворения КМЦ. Полученный раствор фильтруют и добавляют к фильтрату 1 г панкреатической липазы с активностью 150 ед./г и 3 мл 1,5%-ного раствора ПАВ, например твин 40. Раствор интенсивно перемешивают при помощи вибротуракса со скоростью 4500-5000 об/мин в течение 60 мин и образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, после чего подкисляют ее соляной кислотой до значения рН 3,0-3,5. Эмульсию помещают на сутки в холодильник, через каждые 3-3,5 ч снова подвергают всю смесь перемешиванию при помощи вибротуракса. Спустя сутки раствор вновь перемешивают при помощи вибротуракса. Полученные частицы отделяют от реакционной массы центрифугированием со скоростью 5000 об/мин, после чего отделившийся раствор сливают, а к оставшимся частицам добавляют по 10 мл ацетатного буфера с рН 4-4,5. Операцию повторяют 2-3 раза, каждый раз подвергая реакционную массу перемешиванию вибротураксом. После этого раствор снова центрифугируют. Оставшуюся массу переносят в колбы или пенициллиновые флаконы по 1 мл во флакон и высушивают на сублимационной сушилке.Example 1. 10 g of edible carboxymethyl cellulose (CMC) is added to 50 ml of borate buffer having a pH of 9.5, and the reaction mixture is stirred until the CMC is completely dissolved. The resulting solution was filtered and 1 g of pancreatic lipase with an activity of 150 units / g and 3 ml of a 1.5% surfactant solution, for example tween 40, was added to the filtrate. The solution was vigorously mixed with a vibroturax at a speed of 4500-5000 rpm for 60 minutes and the resulting emulsion is cooled to 5-10 ° C, after which it is acidified with hydrochloric acid to a pH of 3.0-3.5. The emulsion is placed in a refrigerator for a day, every 3-3.5 hours the whole mixture is again mixed using vibroturax. After a day, the solution was again stirred using vibroturax. The resulting particles are separated from the reaction mass by centrifugation at a speed of 5000 rpm, after which the separated solution is drained, and 10 ml of acetate buffer with a pH of 4-4.5 are added to the remaining particles. The operation is repeated 2-3 times, each time subjecting the reaction mass to stirring with vibroturax. After that, the solution is centrifuged again. The remaining mass is transferred into flasks or penicillin vials of 1 ml per vial and dried on a freeze dryer.

Выход полученных частиц составляет 80%, активность нейтральной липазы составляет 130-142 ед./г. Размер полученных частиц биокатализатора равен 250-260 нм.The yield of the obtained particles is 80%, the activity of neutral lipase is 130-142 units / g The size of the obtained biocatalyst particles is 250-260 nm.

Пример 2. Опыт проводят аналогично примеру 1, но вместо буфера используют подщелоченную дистиллированную воду, в качестве фермента берут микробную липазу из культуры Aspergillus niger с активностью 200 ед./г, в качестве ПАВ 1 мл 1%-ного раствора твин 20. Выход частиц вместе с включенным в них ферментом составляет 75%. Активность протеаз составляет 179-190 ед./г, размер частиц 260-270 нм.Example 2. The experiment is carried out analogously to example 1, but instead of a buffer, alkalized distilled water is used, a microbial lipase from an Aspergillus niger culture with an activity of 200 units / g is used as an enzyme, and 1 ml of a 1% tween 20 solution is a surfactant. Particle yield together with the enzyme included in them is 75%. The activity of proteases is 179-190 units / g, particle size 260-270 nm.

Пример 3. Опыт проводят аналогично примеру 1, но в качестве фермента используют смесь липаз обоих видов, взятых в соотношении 1:1, а в качестве ПАВ-Спан-85. Выход биокатализатора составляет 80%. Активность 90 ед./г. Размер частиц 280-300 нм.Example 3. The experiment is carried out analogously to example 1, but as an enzyme using a mixture of lipases of both types, taken in a ratio of 1: 1, and as a surfactant-Span-85. The biocatalyst yield is 80%. Activity 90 units / g. Particle size 280-300 nm.

Таким образом, изобретение позволяет получать иммобилизированные липазы с размером частиц 250-300 нм, которые могут быть с успехом использованы в пищевой и медицинской промышленности.Thus, the invention allows to obtain immobilized lipases with a particle size of 250-300 nm, which can be successfully used in the food and medical industries.

Claims

A method of obtaining an immobilized lipase with a particle size of 250-300 nm, which consists in dissolving edible carboxymethyl cellulose in a buffer solution or alkalized distilled water with a pH of 9.5-10, adding to the filtrate the resulting solution of pancreatic lipase or microbial lipase from Aspergillus niger culture, or a mixture thereof with an activity of not less than 100 units / g in the form of a powder in the presence of a 1-1.5% solution of a surfactant, vigorous stirring at a speed of 4500-5000 rpm, after which the emulsion formed is cooled to 5-10 ° C mind the pH of the reaction mixture is adjusted to 3.0-3.5, left in the refrigerator for a day, the precipitated particles are separated from the solution, the acetate buffer with a pH of 4-4.5 is repeatedly added to the remaining particles with stirring, then the precipitated particles containing lipase are separated and dried.