RU2718990C1

RU2718990C1 - Антитела к альфа-синуклеину и способы применения

Info

Publication number: RU2718990C1
Application number: RU2019123989A
Authority: RU
Inventors: Маркус БРИЧГИ; Зильвия ХУБЕР; Клаус КАЛУЦА; Томас КРЕМЕР; Олаф МУНДИГЛЬ
Original assignee: Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2014-11-18
Publication date: 2020-04-15
Also published as: PT3071597T; CN111499742A; SI3071597T1; ES2821904T3; US20180237510A1; US20190292248A1; US20170327566A1; LT3071597T; US10647761B2; RS60882B1; CA2924268A1; EP3071597B1; TW201609804A; BR112016010065A2; CA2924268C; MX2016005631A; NZ717673A; EP3783020A1; RU2016124325A; US9890209B2

Abstract

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитела, связывающиеся с человеческим альфа-синуклеином. Также рассмотрен конъюгат антитела с челночным модулем, фармацевтическая композиция и применения антитела. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии синуклеинопатии и болезни Паркинсона. 6 н. и 2 з.п. ф-лы, 16 ил., 9 табл., 14 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам к человеческому альфа-синуклеину и способам их применения.

Предпосылки создания изобретения

Болезнь Паркинсона характеризуется прогрессирующей потерей дофаминовых (DA) нейронов нигростриатной системы и присутствием телец Леви (LB) и нейритов Леви (LN), белковыми внутринейронными включениями, в основном состоящими из филаментозных агрегатов альфа-синуклеина. Альфа-синуклеин представляет собой белок, который в головном мозге играет центральную роль в контроле функции дофаминергических нейронов и который, вероятно, имеет решающее значение для PD-патофизиологии. Фактически помимо того факта, что альфа-синуклеин является основным белковым компонентом LB, генетические исследования позволили установить, что некоторые точечные мутации в гене альфа-синуклеина и их мультипликация вызывает семейные формы PD. Имеется большой объем доказательств того, что связанная с альфа-синуклеином патология в дофаминергических синапсах может лежать в основе дисфункции и дегенерации нейронов в головном мозг при PD (Bellucci А. и др., Brain Res. 1432, 2012, сс. 95-113).

Тельца Леви, которые представляют собой отложения альфа-синуклеина, являются патологическим признаком болезни Паркинсона (PD) (Goeder М., Nat. Rev. Neurosci 2, 2001, сс. 492-501). Определение стадии патологии головного мозга, связанного со спорадической PD, описано у Braak и др. (Neurobiology of aging 24, 2003, сс. 197-211).

Фибриллярные агрегаты альфа-синуклеина являются основным компонентом телец Леви и нейритов Леви. В современных научных исследованиях высказано предположение о том, что дофибриллярные олигомеры альфа-синуклеина могут иметь основное значение в прогрессировании болезни Паркинсона (Luk K.С. и др., Science 338, 2012, сс. 949-953; Auluck Р.K. и др., Science 295, 2002, сс. 865-868; Bodner R.A. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 2006, сс. 4246-4251; Bucciantini M. и др., J. Biol. Chem. 279, 2004, сс. 31374-31382; El-Agnaf O.M. и др., FASEB J. 20, 2006, сс. 419-425; Kayed R. и др., Science 300, 2003, сс. 486-489; Lashuel Н.А. и др., J. Mol. Biol. 322, 2002, сс. 1089-1102; Masliah Е. и др., Science 287, 2000, сс. 1265-1269.).

Chai Y-J. с соавторами описали, что секретируемая олигомерная форма а-синуклеина влияет на несколько стадий мембранного транспорта (FEBS Lett. 587, 2013, сс. 452-459). Экзосомы BV-2-клеток, индуцированные альфа-синуклеином, являющимся важным медиатором нейродегенарации при PD, описаны у Chang С. и др., Neurosci. Lett. 548, 2013, сс. 190-195). У Feng R.L. соавторами описано, что альфа-синуклеин опосредует изменения проводимости мембран, т.е. описана потенциальная роль олигомеров альфа-синуклеина в уязвимости клеток (Eur. J. Neurosci. 32, 2010, сс. 10-17). У Lee H-J. с соавторами описано, что недостаток аутофагии усиливает экзоцитоз и внутриклеточный перенос альфа-синуклеина (Exp. Mol. Med. 45, 2013, е22). Патология синапсов, связанная с агрегацией альфа-синуклеина при деменции с тельцами Леви, болезни Паркинсона и деменции, связанной с болезнью Паркинсона, описаны у Schulz-Schaeffer W.J. (Acta Neuropathol. 120, 2010, сс. 131-143).

Основная часть альфа-синуклеина в головном мозге человека присутствует в виде ацетилированной на N-конце формы (Kellie J.F. и др., Sci. Rep. 4, 2014, с. 5797), и указанное N-концевое ацетилирование ингибирует агрегацию альфа-синуклеина (Bartels Т. и др., PLoS One 9, 2014, е103727).

Описаны различные олигомерные формы рекомбинантного альфа-синуклеина: олигомеры типа А (цитотоксические, влияют на приток Са²⁺), олигомеры типа С (виды, представляющие собой затравки для агрегатов), фибриллы, смешенные с липидами (затравка для агрегации внутриклеточных агрегатов), мутант с утроенным пролином (TP) А30Р/А56Р/А76Р (образует в основном токсичные олигомеры) (см., например, Danzer K.М. и др., J. Neurosci. 27, 2007, сс. 9220-9232; Danzer K.М. и др., J. Neurochem. 111, 2009, сс. 192-203; Luk С.K. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 2009, сс. 20051-20056; Desplates P. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 2009, cc. 13010-13015; Karpinar D.P. и др., EMBO J. 28, 2009, cc. 3256-3268; Lee H-J. и др., J. Biol. Chem. 285, 2010, cc. 9262-9272; Hansen С. и др., J. Clin. Invest. 121, 2011, cc. 715-725).

Патологический перенос альфа-синуклеина, который инициирует нейродегенерацию типа болезни Паркинсона у нетрансгенных мышей, описан у Luk K.С. и др., (Science 338, 2012, сс. 949-953). Индуцируемая олигомерами альфа-синуклеина затравка, являющаяся основой для распространения связанной с альфа-синуклеином патологии и экзосомального переноса по типу «от клетки к клетке» олигомеров альфа-синуклеина, описана у Danzer К.М. и др. (J. Neurochem. 111, 2009, сс. 192-203; Mol. Neurodegen. 7, 2012, с. 42). Braidy с соавторами описали перенос альфа-синуклеина и митохондриальную токсичность в первичных человеческих эмбриональных энтерических нейронах in vitro (Neurotox. Res., 2013, epub от 5 октября 2013 г.). Desplats Р. с соавторами описали образование включений и гибель нейронов в результате переноса альфа-синуклеина от нейрона к нейрону (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 2009, cc. 13010-13015). Непосредственный перенос альфа-синуклеина из нейрона в астроглию вызывает воспалительные ответы в виде синуклеинопатий, что описано у Lee и др. (J. Biol. Chem. 285, 2010, сс. 9262-9272). Lee S-J. с соавторами описали перенос от клетке к клетке агрегатов альфа-синуклеина (Meth. Mol. Biol. 849, 2012, сс. 347-359; Nat. Rev. Neurol. 6, 2010, cc. 702-706). По-видимому, наиболее убедительное доказательство развития связанной с альфа-синуклеином патологии путем возможного переноса затравки агрегации альфа-синуклеина получено с помощью посмертного анализа головного мозга некоторых страдающих PD пациентов, у которых обнаружена патология Леви в эмбриональных нейронах, которые трансплантировали в их головной мозг на 11-16 лет раньше (Li J-Y. и др., Nat. Med. 14, 2008, сс. 501-503).

Агрегированный альфа-синуклеин опосредует дофаминергическую нейротоксичность in vivo (Periquet М. и др., J. Neurosci. 27, 2007, сс. 3338-3346). Pieri L. с соатворами описали, что фибриллярный альфа-синуклеин и экзон 1 гена белка хантингтина в сочетании друг с другом являются токсичными для клеток (Biophys. J. 102, 2012, сс. 2894-2905). Van Rooijen с соавторами при изучение механизма действия описали повышение проницаемости мембран олигомерным альфа-синуклеином (PLoS One 5, 2010, е14292).

В самые последние годы Wagner с соавторами продемонстрировали с использованием клеточных анализов и на модели трансгенных по альфа-синуклеину мышей, что малая молекула Anlel38b действует в качестве модулятора, защищающего (замедляет скорость роста отложений) от олигомеров альфа-синуклеина, и ее можно применять для модифицирующей заболевание терапии болезни Паркинсона (Wagner J. и др., Acta Neuropathol. 125, 2013, сс. 795-813). Lynch S.M. с соатворами установили, что внутриклеточные антитела (интрабоди) в виде scFv против неамилоидного компонента альфа-синуклеина снижают внутриклеточную агрегацию и токсичность (J. Mol. Biol. 377, 2008, сс. 136-147). Стратегия создания ингибиторов агрегации и токсичности альфа-синуклеина в качестве нового пути лечения болезни Паркинсона и родственных заболеваний описана у El-Agnaf О.М. и др. (FASEB J., 2004). Emadi S. с соавторами описали ингибирование агрегации альфа-синуклеина с помощью одноцепочечных фрагментов человеческого антитела и выделение одноцепочечных фрагментов человеческого антитела против олигомерного альфа-синуклеина, которые ингибируют агрегацию и предупреждают проявление индуцируемой альфа-синуклеином токсичности (Biochem. 43, 2004, сс. 2871-2878; J. Mol. Biol. 368, 2007, сс. 1132-1144). Smith с соавторами описали воздействия внутривенного иммуноглобулина на агрегацию и нейротоксичность альфа-синуклеина (Int. Immunopharmacol. 14, 2012, сс. 550-557). Целенаправленное воздействие на внутриклеточный и внеклеточный альфа-синуклеин в качестве терапевтической стратегии при болезни Паркинсона и других синуклеинопатий описано у Vekrelis K. и Stefanis L. (Expert. Opin. Trier. Targets 16, 2012, cc. 421-432).

Клиренс, которому способствуют антитела, при церебральной синуклеинопатий в соответствующих трансгенных мышах продемонстрирован при осуществления активного (Masliah Е. и др., Neuron 46, 2005, сс. 857-868) и пассивного (Masliah Е. и др., PLoS One 6, 2011, е19338) путей иммунизации. Связывание внеклеточного альфа-синуклеина специфическими антителами, препятствующее переносу агрегатов от клетки к клетке, описано Bae E-J. и др. (J. Neurosci. 32, 2012, сс. 13454-13469).

Применение мимотопов эпитопов альфа-синуклеина для лечения болезней с тельцами Леви описано в WO 2011/020133. В WO 2007/011907 описаны антитела к альфа-синуклеину и относящиеся к ним методы. Слияние несущей высокий заряд протеосомальной перенацеливающей последовательности повышает экспрессию различных растворимых внутриклеточных антител к синуклеину, что продемонстрировано у Joshi и др. (MABS 4, 2012, сс. 686-693). Emadi и др. (J. Mol. Biol. 368, 2007, сс. 1132-1144) описали выделение одноцепочечного фрагмента человеческого антитела против олигомерного альфа-синуклеина, который ингибирует агрегацию и предупреждает индуцируемую альфа-синуклеином токсичность. Обнаружение морфологически различных олигомерных форм альфа-синуклеина описано у Emadi и др. (J. Biol. Chem. 284, 2009, сс. 11048-11058). У Zhou и др. (Mol. Ther. 10, 2004, сс. 1023-1031) описано, что одноцепочечный Fv человеческого внутриклеточного антитела блокирует аномальные клеточные воздействия сверхэкспрессируемого альфа-синуклеин. Данные о том, что антитела против альфа-синуклеина снижают олигомеризацию в живых клетках, описаны у Nasstrom и др. (PLoS One 6, 2011, е27230). Связывающие протофибриллы антитела и их применение в методах терапии и диагностики болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви и других альфа-синуклеинопатий описаны в WO 2011/104696. Выделение рекомбинантных антител против специфических морфологических форм белков с использованием атомно-силовой микроскопии и технологий фагового дисплея описано у Barkhordarian и др. (Prot. Eng. Des. Select. 19, 2006, сс. 497-502). Kvam и др. (PLoS One 4, 2009, e5727) установили, что конформационное нацеливание фибриллярных полиглутаминовых белков в живых клетках усиливает агрегацию и цитотоксичность.

Краткое изложение сущности изобретения

В изобретении предложены антитела к человеческому альфа-синуклеину и способы их применения.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое специфически связывается с человеческим альфа-синуклеином, где человеческий альфа-синуклеин имеет свободный N-концевой остаток метионина.

Понятие «свободный N-концевой остаток метионина» означает остаток метионина в полипептиде, который локализован на N-конце полипептида и который не модифицирован за исключением амидной связи, с помощью которой он конъюгирован с остальной частью полипептида. Указанный свободный N-концевой остаток метионина в одном из вариантов осуществления изобретения представляет собой немодифицированный остаток метионина. Указанный свободный N-концевой остаток метионина в одном из вариантов осуществления изобретения имеет свободную аминогруппу. Человеческий альфа-синуклеин имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело специфически связывается с человеческим и мышиным альфа-синуклеином, где человеческий и мышиный альфа-синуклеин имеет свободный N-концевой остаток метионина.

В одном из вариантов осуществления изобретения альфа-синуклеин представляет собой мономерный альфа-синуклеин.

В одном из вариантов осуществления изобретения альфа-синуклеин представляет собой мономерный и олигомерный альфа-синуклеин.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело связывается с таким же эпитопом или с перекрывающим эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело связывается с таким же эпитопом или с перекрывающим эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело связывается с таким же эпитопом или с перекрывающим эпитопом, что и антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело получали путем гуманизации антитела, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20, в котором в каждом HVR от 0 до 3 аминокислотных остатков заменены.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25, в котором в каждом HVR от 0 до 3 аминокислотных остатков заменены.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело, в котором вариабельный домен тяжелой цепи получен из вариабельного домена тяжелой цепи, имеющего SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи получен из вариабельного домена легкой цепи, имеющего SEQ ID NO: 27.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое связывается с таким же эпитопом или с перекрывающим эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое связывается с таким же эпитопом или с перекрывающим эпитопом, что и антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25.

Одним из объектов изобретения является вариант антитела, полученный из антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

В одном из вариантов осуществления изобретения вариант антитела представляет собой гуманизированное антитело, полученное гуманизацией антитела, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

Одним из объектов изобретения является гуманизированное антитело, которое содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20, в котором в каждом HVR от 0 до 3 аминокислотных остатков заменены.

Одним из объектов изобретения является гуманизированное антитело, которое содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 20, 21 и 17, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25, в котором в каждом HVR от 0 до 3 аминокислотных остатков заменены.

Одним из объектов изобретения является гуманизированное антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, полученный из вариабельного домена тяжелой цепи, имеющего SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, полученный из вариабельного домена легкой цепи, имеющего SEQ ID NO: 27.

В одном из вариантов осуществления всех указанных ранее объектов изобретения антитело конъюгируют с челночным модулем для гематоэнцефалического барьера.

В одном из вариантов осуществления изобретения челночный модуль для гематоэнцефалического барьера представляет собой антитело или фрагмент антитела, которое/который специфически связывается с LRP1 (белок 1, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности), LRP8 (белок 8, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности), рецептором человеческого трансферрина или рецептором человеческого инсулиноподобного фактора роста.

В одном из вариантов осуществления всех указанных ранее объектов изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело.

В одном из вариантов осуществления всех указанных ранее объектов изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело или химерное антитело.

В одном из вариантов осуществления всех указанных ранее объектов изобретения антитело представляет собой

а) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1 или

б) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4, или

в) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G,

г) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G,

д) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи, и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в соответствующей другой тяжелой цепи, или

е) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи, и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в соответствующей другой тяжелой цепи.

Одним из объектов изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

а) антитело содержит две тяжелые цепи антитела, каждая из которых содержит вариабельный домен тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи, в котором

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

II) константная область представляет собой константную область человеческого IgG1, в которой С-концевой остаток лизина может присутствовать или отсутствовать, и

III) константная область содержит аминокислотные замены L234A, L235A и P329G,

б) антитело содержит две легкие цепи антитела, каждая из которых содержит вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, в котором

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

II) константная область представляет собой константную область человеческой легкой каппа-цепи или константную область человеческой легкой лямбда-цепи.

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 17, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

I) вариабельный домен содержит представляет собой гуманизированную форму нечеловеческого (кроличьего) вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 26,

I) вариабельный домен представляет собой гуманизированную форму нечеловеческого (кроличьего) вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 27,

а) антитело содержит две тяжелых цепи антитела, каждая из которых содержит в направлении от N- к С-концу вариабельный домен тяжелой цепи, константную область тяжелой цепи, пептидный линкер и scFab- или scFv-фрагмент антитела, который специфически связывается с рецептором человеческого трансферрина, в котором

I) вариабельный домен представляет собой гуманизированную форму кроличьего вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 26,

I) вариабельный домен представляет собой гуманизированную форму кроличьего вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 27,

а) антитело содержит первую тяжелую цепь антитела, которая содержит в направлении от N- к С-концу вариабельный домен тяжелой цепи, константную область тяжелой цепи, пептидный линкер и scFab- или scFv-фрагмент антитела, который специфически связывается с рецептором человеческого трансферрина, в котором

константная область содержит аминокислотные замены L234A, L235A и P329G,

константная область содержит либо аминокислотные замены T366W и S354C, либо аминокислотные замены T366S, L368A, Y407V и Y349C,

б) антитело содержит вторую тяжелую цепь антитела, которая содержит в направлении от N- к С-концу вариабельный домен тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи, в котором

II) константная область представляет собой константную область человеческого IgG1, в которой С-концевой остаток лизина может присутствовать или отсутствовать,

III) константная область содержит аминокислотные замены L234A, L235A и P329GH

IV) константная область содержит аминокислотные замены T366W и S354C, если первая тяжелая цепь антитела содержит аминокислотные замены T366S, L368A, Y407V и Y349C, или константная область содержит аминокислотные замены T366S, L368A, Y407V и Y349C, если первая тяжелая цепь антитела содержит аминокислотные замены T366W и S354C,

в) антитело содержит две легкие цепи антитела, каждая из которых содержит вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, в котором

константная область содержит аминокислотные замены T366W и S354C, если первая тяжелая цепь антитела содержит аминокислотные замены T366S, L368A, Y407V и Y349C, или константная область содержит аминокислотные замены T366S, L368A, Y407V и Y349C, если первая тяжелая цепь антитела содержит аминокислотные замены T366W и S354C,

IV) константная область содержит либо аминокислотные замены T366W и S354C, либо аминокислотные замены T366S, L368A, Y407V и Y349C,

В одном из вариантов осуществления изобретения фрагмент антитела, который специфически связывается с рецептором человеческого трансферрина, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, который представляет собой гуманизированную форму вариабельного домена тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 56, и вариабельный домен легкой цепи, который представляет собой гуманизированную форму вариабельного домена легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 57.

В одном из варианте осуществления всех предыдущих объектов изобретения антитело

I) ингибирует индуцируемую альфа-синуклеином цитотоксичность в человеческих нейронах и глиальных клетках и/или

II) ингибирует перенос от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками, и/или

III) снижает индуцируемую альфа-синуклеином каспазную активность в человеческих нервных клетках, и/или

IV) специфически связывается с альфа-синуклеином, который имеет свободный N-концевой остаток метионина и не связывается специфически с альфа-синуклеином, который имеет модифицированный N-концевой остаток метионина.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое специфически связывается с человеческим альфа-синуклеином, где антитело

III) снижает индуцируемую альфа-синуклеином каспазную активность в человеческих нервных клетках.

В одном из вариантов осуществления всех объектов изобретения и вариантов осуществления изобретения человеческая нервная клетка представляет собой контролируемую тетрациклином, сверхэкспрессирующую v-myc полученную из человеческого мезэнцефалического отдела клеточную линию. В одном из вариантов осуществления изобретения всех объектов изобретения и вариантов осуществления изобретения человеческие нервные клетки представляют собой человеческие мезэнцефалические клетки Лунда (LUHMES).

В одном из вариантов осуществления изобретения каспазная активность представляет собой активность каспазы 3 и/или каспазы 7.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело предназначено для применения при лечении синуклеинопатий.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело предназначено для применения при лечении болезни Паркинсона.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело имеет молчащую эффекторную функцию.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело специфически связывается с пептидом, который состоит из аминокислотной последовательности GKNEEGAPQEG (SEQ ID NO: 01).

В одном из вариантов осуществления изобретения аффинность связывания антитела с мономерным альфа-синуклеином составляет менее чем 10^-09 Ми более чем 10^-07 М.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело специфически связывается с мономерным и олигомерным человеческим альфа-синуклеином.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 02-04 и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 05-07.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 08, 09 и 04, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 10-12.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 13, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 14.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело получали путем гуманизации антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 13, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 14.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 02-04, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 05-07, в котором в каждом HVR вплоть до 3 аминокислотных остатков могут быть заменены.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 08, 09 и 04, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 10-12, в котором в каждом HVR вплоть до 3 аминокислотных остатков могут быть заменены.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело, и вариабельный домен тяжелой цепи получают из вариабельного домена тяжелой цепи, который состоит из SEQ ID NO: 13, и вариабельный домен легкой цепи получают из вариабельного домена легкой цепи, который состоит из SEQ ID NO: 14.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело связывается с таким же эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело связывается с таким же эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 27.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело получали путем гуманизации антитела, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 27.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20, в котором в каждом HVR вплоть до 3 аминокислотных остатков могут быть заменены.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25, в котором в каждом HVR вплоть до 3 аминокислотных остатков могут быть заменены.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело, и вариабельный домен тяжелой цепи получают из вариабельного домена тяжелой цепи, который состоит из SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи получают из вариабельного домена легкой цепи, который состоит из SEQ ID NO: 27.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело связывается с таким же эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 28-30, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 31-33.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело связывается с таким же эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 28, 34 и 30, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 35-37.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 38, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 39.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело получали путем гуманизации антитела, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 38, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 39.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 28-30, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 31-33, в котором в каждом HVR вплоть до 3 аминокислотных остатков могут быть заменены.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 28, 34 и 30, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 35-37, в котором в каждом HVR вплоть до 3 аминокислотных остатков могут быть заменены.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело, и вариабельный домен тяжелой цепи получают из вариабельного домена тяжелой цепи, который состоит из SEQ ID NO: 38, и вариабельный домен легкой цепи получают из вариабельного домена легкой цепи, который состоит из SEQ ID NO: 39.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело специфически связывается с фибриллярным человеческим альфа-синуклеином и не связывается с нефибриллярным человеческим альфа-синуклеином.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело конъюгируют с челночным модулем для гематоэнцефалического барьера.

В одном из вариантов осуществления изобретения челночный модуль для гематоэнцефалического барьера представляет собой антитело или фрагмент антитела, которое/который специфически связывается с LRP1, LRP8, рецептором человеческого трансферрина или рецептором человеческого инсулиноподобного фактора роста.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело или химерное антитело.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой фрагмент антитела, который связывается с человеческим альфа-синуклеином, и

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 03 и SEQ ID NO: 04, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 06 и SEQ ID NO: 07, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

II) константная область представляет собой константную область человеческой легкой каппа-цепи или константную область человеческой легкой лямбда-цепи, и

в) антитело

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09 и SEQ ID NO: 04, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

в) антитело

I) вариабельный домен представляет собой гуманизированную форму нечеловеческого (кроличьего) вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 13,

I) вариабельный домен представляет собой гуманизированную форму нечеловеческого (кроличьего) вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 14,

в) антитело

I) вариабельный домен представляет собой гуманизированную форму нечеловеческого (кроличьего) вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 26,

в) антитело

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

в) антитело

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 30, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

в) антитело

I) вариабельный домен представляет собой гуманизированную форму нечеловеческого (кроличьего) вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 38,

I) вариабельный домен содержит представляет собой гуманизированную форму нечеловеческого (кроличьего) вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 39,

в) антитело

I) вариабельный домен представляет собой гуманизированную форму кроличьего вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 13,

I) вариабельный домен представляет собой гуманизированную форму кроличьего вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 14,

в) антитело

I) вариабельный домен представляет собой гуманизированную форму кроличьего вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 38,

I) вариабельный домен представляет собой гуманизированную форму кроличьего вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 39,

в) антитело

III) константная область содержит аминокислотные замены L234A, L235A и P329G и

г)антитело

II) ингибирует перенос от клетке к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками, и/или

г)антитело

II) константная область представляет собой константную область человеческой легкой каппа-цепи или константную область человеческой легкой лямбда-цепи и

г)антитело

В одном из вариантов осуществления изобретения фрагмент антитела содержит вариабельный домен тяжелой цепи, который представляет собой гуманизированную форму вариабельного домена тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 56, и вариабельный домен легкой цепи, который представляет собой гуманизированную форму вариабельного домена легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 57.

Одним из объектов изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, указанное в настоящем описании.

Одним из объектов изобретения является клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту, указанную в настоящем описании.

Одним из объектов изобретения является способ получения антитела, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых культивируют клетку-хозяина, указанную в настоящем описании, так, чтобы получать антитело.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию, на которой выделяют антитело из клетки или культуральной среды.

Одним из объектов изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит антитело, указанное в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит также дополнительное терапевтическое средство.

Одним из объектов изобретения является антитело, указанное в настоящем описании, предназначенное для применения в качестве лекарственного средства.

Одним из объектов изобретения является антитело, указанное в настоящем описании, предназначенное для применения для лечения синуклеинопатий.

Одним из объектов изобретения является антитело, указанное в настоящем описании, предназначенное для применения для лечения болезни Паркинсона.

Одним из объектов изобретения является антитело, указанное в настоящем описании, предназначенное для применения для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином токсичности в человеческих нейронах и глиальных клетках.

Одним из объектов изобретения является антитело, указанное в настоящем описании, предназначенное для применения для ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками.

Одним из объектов изобретения является антитело, указанное в настоящем описании, предназначенное для применения для снижения индуцируемой альфа-синуклеином капаной активности в нервных клетках или глиальных клетках.

Одним из объектов изобретения является применение антитела, указанного в настоящем описании, для приготовления лекарственного средства.

В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения болезни Паркинсона.

В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах и глиальных клетках.

В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками.

В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для снижения индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности в нервных клетках или глиальных клетках.

Одним из объектов изобретения является способ лечения индивидуума, который имеет болезнь Паркинсона, заключающийся в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело, указанное в настоящем описании.

Одним из объектов изобретения является способ ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах и глиальных клетках у индивидуума, заключающийся в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело, указанное в настоящем описании, для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах и глиальных клетках.

Одним из объектов изобретения является способ ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками, заключающийся в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело, указанное в настоящем описании, для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах и глиальных клетках.

Одним из объектов изобретения является применение антитела к человеческому альфа-синуклеину, указанному в настоящем описании, для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах и глиальных клетках.

Одним из объектов изобретения является применение антитела к человеческому альфа-синуклеину, указанному в настоящем описании, для ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками.

Одним из объектов изобретения является применение антитела к человеческому альфа-синуклеину, указанному в настоящем описании, для снижения индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности в нервных клетках или глиальных клетках.

Антитела, указанные в настоящем описании, можно применять для лечения болезни Паркинсона. Не вдаваясь в конкретную теорию, антитела ингибируют распространение токсичного олигомерного альфа-синуклеина или ингибируют поглощение токсичного олигомерного альфа-синуклеина нервными клетками или глиальными клетками, или снижают воспаление нейронов.

С помощью антител, указанных в настоящем описании, можно осуществлять ингибирование/снижение прогрессирования синуклеинопатии и нейропатологии.

Антитела, указанные в настоящем описании, можно применять для защиты от развития болезни Паркинсона или даже применять для прекращения прогрессирования болезни Паркинсона.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело, указанное в настоящем описании, I) связывается с альфа-синуклеином в срезах головного мозга трансгенных по альфа-синуклеину мышей и страдающих болезнью Паркинсона пациентов; и/или метит альфа-синуклеин в LUHMES-клетках.

Антитела, указанные в настоящем описании, можно применять для лечения синуклеинопатии. Некоторые синуклеинопатии представляют собой нейродегенерацию с накоплением железа в головном мозге типа 1 (NBIA1), чистую вегетативную (автономную) недостаточность, синдром Дауна, комплекс Гуам и несколько нарушений с тельцами Леви, таких как болезнь диффузных телец Леви (DLBD), вариант с тельцами Леви болезни Альцгеймера (LBVAD), некоторые формы болезни Гоше и связанную с болезнью Паркинсона деменцию (PDD).

Одним из объектов настоящего изобретения является антитело, которое специфически связывается с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 01 в человеческом альфа-синуклеине.

Одним из объектов настоящего изобретения является антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 13, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 14.

Одним из объектов настоящего изобретения является антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

Одним из объектов настоящего изобретения является антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 38, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 39.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - данные о зависящей от концентрации специфичности связывания антитела к альфа-синуклеину 0017; полоса: 1) препарат фибриллярного альфа-синуклеина, 2) мутантные олигомеры альфа-синуклеина с утроенным пролином, 3) олигомеры типа А альфа-синуклеина, 4) олигомеры типа С альфа-синуклеина;

на фиг. 2 данные о зависящей от концентрации специфичности связывания антитела к альфа-синуклеину 0018; полоса: 1) препарат фибриллярного альфа-синуклеина, 2) мутантные олигомеры альфа-синуклеина с утроенным пролином, 3) олигомеры типа А альфа-синуклеина, 4) олигомеры типа С альфа-синуклеина;

на фиг. 3 - данные о зависящей от концентрации специфичности связывания антитела к альфа-синуклеину 0081; полоса: 1) препарат фибриллярного альфа-синуклеина, 2) мутантные олигомеры альфа-синуклеина с утроенным пролином, 3) олигомеры типа А альфа-синуклеина, 4) олигомеры типа С альфа-синуклеина;

на фиг. 4 - результаты окрашивания альфа-синуклеином в стволе головного мозга трансгенных по альфа-синуклеину[А30Р] мышей; свежезамороженные сагиттальные срезы головного мозга толщиной 10 мкм; 40-кратное увеличение; все изображения получали в идентичных условиях освещения; наконечниками стрел обозначены включения, напоминающие нейрит Леви;

на фиг. 5 результаты окрашивания антителами 0017 и 0018 человеческой коры головного мозга пациента, страдающего болезнью Паркинсона (А), пациента, страдающего болезнь Альцгеймера с сопутствующей болезнью Паркинсона (Б) и прогрессирующим надъядерным параличом (PSP, таупатия) (В); стрелкой обозначены: включения, напоминающие тельца Леви; наконечниками стрел обозначены включения, напоминающие нейрит Леви;

на фиг. 6 результаты мечения церебральной альфа-синуклеиновой патологии у имеющих мутацию альфа-синуклеина А30Р трансгенных мышей после острой периферической инъекции специфических МАт (2×60 мг/кг антитела или ЗФР в течение 5 дней) 15-месячным имеющим мутацию альфа-синуклеина АЗОР трансгенным мышам; свежезамороженные сагиттальные срезы головного мозга толщиной 20 мкм окрашивали конъюгатом антимышиное антитело в виде IgG1-AF555 или соответствующим антителом к альфа-синуклеину и конъюгатом антимышиное антитело в виде IgG1-AF555; 40-кратное увеличение области ствола головного мозга; все изображения получали в идентичных условиях освещения; стрелками обозначены включения, напоминающие тельца Леви; наконечниками стрел обозначены включения, напоминающие нейрит Леви;

на фиг. 7 данные о клеточной цитотоксичности кондиционированных сред, содержащих рекомбинантный альфа-синуклеин из SHSYSY-клеток или LUHMES-клеток; (А) антитело 0017; (Б) антитело 0018; (В) антитело 12F4 (референс-антитело);

на фиг. 8 - данные об обработке LUHMES-клеток кондиционированными средами, содержащими рекомбинантно экспрессирующие альфа-синуклеин 8Н8У5У-клетки; 3-дневная обработка свежевысеянных LUHMES-клеток а) контрольной средой, т.е. средой для дифференцировки LUHMES-клеток и б) кондиционированной средой, т.е. средой для дифференцировки LUHMES, собранной после выращивания в течение 6 дней рекомбинантно экспрессирующих альфа-синуклеин 8Н8У5У-клеток;

на фиг. 9 - результаты, демонстрирующие, что антитела 0017 и 0018 обладали способностью осуществлять иммуноистощение олигомеров альфа-синуклеина из внеклеточных сред, и поэтому указанные антитела снижали токсичность олигомеров альфа-синуклеина;

на фиг. 10 необработанные данные о фазовом переходе к плавлению (незакрашенные окружности, 40°С наиболее высокие значения) и соответствующие аппроксимации (жирные линии), определенные согласно методу, описанному в примере 11;

на фиг. 11 - результаты мечения в головном мозге альфа-синуклеиновой патологии, сосудистой сети и паренхимы у имеющих мутацию альфа-синуклеина А30Р трансгенных мышей после острой периферической инъекции конъюгата антитело к альфа-синуклеину - челночный модуль для гематоэнцефалического барьера;

на фиг. 12 - результаты иммуногистохимического анализа криосрезов, проведенного на срезах головного мозга пациента с болезнью Паркинсона (идентичная настройка для всех изображений): (А) антитело 0017, (Б) антитело 0018, (В) референс-антитело 12F4;

на фиг. 13 результаты эпитопного картирования методом CelluSpots™ антитела 0018;

на фиг. 14 - данные о связывании мономерного (со свободным N-концом (1) и с His-меткой на N-конце (2)) и димерного (3) антитела к альфа-синуклеину 0018. Представлены результаты титрования с использованием 5 концентраций.

1: мономер, со свободным N-концом, 4,2 мг/мл, никогда не подвергали оттаиванию;

2: мономер, с His-меткой на N-конце, 4,8 мг/мл;

3: димер, со свободным N-концом, 1,6 мг/мл.

Подробное описание вариантов осуществления изобретения

I. Определения

В контексте настоящего описания «акцепторный человеческий каркасный участок» означает каркасный участок, содержащий аминокислотную последовательность каркасного участка вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасного участка вариабельного домена тяжелой цепи (VH), происходящий из каркасного участка человеческого иммуноглобулина или консенсусного человеческого каркасного участка, указанного ниже. Акцепторный человеческий каркасный участок «происходящий из» каркасного участка человеческого иммуноглобулина или консенсусного человеческого каркасного участка, может содержать такую же аминокислотную последовательность или может содержать замены в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество аминокислотных замен составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность акцепторного человеческого каркасного участка VL идентична последовательности каркасного участка VL человеческого иммуноглобулина или последовательности консенсусного человеческого каркасного участка.

Понятие «аффинность» относится к суммарной силе всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). В контексте настоящего описания, если не указано иное, «аффинность связывания» относится к присущей молекуле аффинности связывания, отражающей взаимодействие по типу 1:1 между компонентами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y, как правило, можно характеризовать с помощью константы диссоциации (Kd). Аффинность можно оценивать с помощью общепринятых методов, известных в данной области, включая те, которые представлены в настоящем описании. Ниже в качестве иллюстрации представлены конкретные варианты измерения аффинности связывания.

Антитело «с созревшей аффинностью» означает антитело с одним или несколькими изменениями в одном или нескольких гипервариабельных участках (HVR) по сравнению с родительским антителом, которое не содержит указанных изменений, указанные изменения приводят к повышению аффинности антитела к антигену.

Понятия «антитело к человеческому альфа-синуклеину» и «антитело, которое связывается с человеческим альфа-синуклеином» относятся к антителу, которое обладает способностью связываться с человеческим альфа-синуклеином с аффинностью, достаточной для того, чтобы антитело можно было применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента, мишенью которого является человеческий альфа-синуклеин. В одном из вариантов осуществления изобретения уровень связывания антитела к человеческому альфа-синуклеину с неродственным не человеческим белком альфа-синуклеина составляет менее чем примерно 10% от связывания антитела с человеческим альфа-синуклеином по данным измерений, полученным, например, с помощью радиоиммуноанализа (РИА).

В контексте настоящего описания понятие «антитело» используется в его наиболее широком смысле и относится к различным структурам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.

Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; димерные антитела (диабоди); линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Понятие «антитело, которое связывается с таким же эпитопом», что и референс-антитело, относится к антителу, которое обладает способностью связываться с такими же остатками на антигене, что и референс-антитело. Связывающее взаимодействие можно определять с помощью поверхностного плазмонного резонанса и мутантного антигена или рентгеновского структурного анализа комплекса антитело-антиген.

Понятие «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из конкретного источника или конкретных видов, а остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или других видов.

Понятие «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, который/которая входит в его тяжелую цепь. Известно пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них можно подразделять дополнительно на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулина, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно.

Понятие «эффекторные функции» относится к тем видам биологической активности, которые связаны с Fc-областью антитела, которые варьируются в зависимости от класса антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание Fc-рецептора; антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора) и активацию В-клеток.

Понятие «эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, означает количество, эффективное в дозах и в течение периода времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата.

Понятие «Fc-область» в контексте настоящего описания относится к С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Понятие включает нативную последовательность Fc-областей и вариант Fc-областей. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается с Cys226 или с Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) и иногда С-концевой дипептид лизин-глицин (Gly446Lys447) Fc-области может присутствовать или отсутствовать. Если специально не указано иное, то нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, которую обозначают также как EU-индекс, описанной у Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, NIH публикация 91-3242.

Понятие «каркасный участок» или «FR», означает аминокислотные остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка (HVR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности HVR и FR, как правило, имеют следующее расположение в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Понятия «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, практически сходную с нативной структурой антитела, или имеющее тяжелые цепи, которые содержат представленную в настоящем описании Fc-область.

Понятия «клетка-хозяин», «клеточная линия-хозяин» и «культура клеток-хозяев» используют взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые интродуцирована экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство указанных клеток. К клеткам-хозяевам относятся «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированную клетку и полученное из нее потомство безотносительно к количеству пересевов. Потомство может не быть полностью идентичным по составу нуклеиновых кислот родительской клетке, но может содержать мутации. Под объем изобретения подпадает мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, которая обнаружена в результате скрининга или отобрана у исходной трансформированной клетки.

«Человеческий консенсусный каркасный участок» представляет собой каркасный участок, в который входят наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в выбранных последовательностях каркасных участков VL или VH человеческого иммуноглобулина. Как правило, выбор последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина осуществляют из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, описанную у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., NIH Publication 91-3242, Bethesda MD, т.т. 1-3, 1991. В одном из вариантов осуществления изобретения касательно VL подгруппа представляет собой подгруппу каппа I согласно Kabat и др., выше. В одном из вариантов осуществления изобретения касательно VH подгруппа представляет собой подгруппу III согласно Kabat и др., выше.

Понятие «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, которое содержит аминокислотные остатки из нечеловеческих HVR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело может содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR (например, CDR) соответствуют участкам нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей из человеческого антитела. Понятие «гуманизированная форма» антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое подвергали гуманизации.

Понятие «гипервариабельный участок» или «HVR» в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательности которых являются гипервариабельными («определяющие комплементарность участки» или «CDR») и/или формируют петли определенной структуры («гипервариабельные петли»), и/или содержат контактирующие с антигеном остатки («контакты с антигеном»). Как правило, антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3).

В контексте настоящего описания HVR включают

(а) гипервариабельные петли, включающие аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia С.и Lesk A.M., J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917);

(б) CDR, включающие аминокислотные остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (Н3) (Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD,1991, публикация NIH 91-3242);

(в) области контакта с антигеном, включающие аминокислотные остатки 27 с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum и др., J. Mol. Biol. 262, 1996, cc. 732-745); и

(г) комбинации остатков, указанных в подпунктах (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).

Если не указано иное, то HVR-остатки и другие остатки в вариабельном домене (например, FR-остатки) нумеруют согласно Kabat и др., выше.

«Иммуноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичной(ыми) молекулой(ами), такими как челночный модуль для гематоэнцефалического барьера.

«Индивидуум» или «субъект» представляет собой млекопитающее. К млекопитающим относятся (но, не ограничиваясь только ими) одомашненные животные (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматы (например, люди и приматы кроме человека, например, обезьяны), кролики и грызуны (например, мыши и крысы). В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум или субъект представляет собой человека.

«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое отделено от компонента его естественного окружения. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело очищают до чистоты, превышающей 95% или 99% по данным, например, электрофоретических анализов (таких, например, как ДСН-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), капиллярный электрофорез) или хроматографических анализов (таких, например, как ионообменная хроматография или ЖХВР с обращенной фазой). Обзор методов оценки чистоты антител см., например, у Flatman S. и др., J. Chrom. В 848, 2007, сс. 79-87.

«Выделенная» нуклеиновая кислота представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая отделена от компонента ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетке, которая в норме включает молекулу нуклеиновой кислоты, но в которой молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или в которой ее локализация на хромосоме отличается от ее встречающейся в естественных условиях локализации на хромосоме.

Понятие «выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к человеческому альфа-синуклеину» относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая указанную(ые) молекулу(ы) в одной плазмиде или в различных плазмидах, и указанную(ые) молекулу(ы) нуклеиновой(ых) кислоты(т), присутствующую(ие) в одной или нескольких положениях в клетке-хозяине.

Понятие «моноклональное антитело» в контексте настоящего описания относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, входящие в популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих мутации, встречающиеся в естественных условиях или возникающие в процессе производства препарата моноклонального антитела, указанные варианты, как правило, присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело из препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты антигена. Таким образом, прилагательное «моноклональный» определяет особенность антитела, характеризуя его как полученное из практически гомогенной популяции антител, а не сконструированное в соответствии с требованиями к получению антитела с помощью какого-либо конкретного метода. Например, моноклональные антитела, которые можно применять согласно настоящему изобретению, можно создавать с помощью различных технологий, включая (но, не ограничиваясь только ими) метод гибридом, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы, основанные на использовании трансгенных животных, которые содержат все или часть локусов иммуноглобулина, указанные методы и другие, приведенные в качестве примера методы получения моноклональных антител, представлены в настоящем описании.

Понятие «нативные антитела» относится к встречающимся в естественных условиях молекулам иммуноглобулинов с различными структурами. Например, нативные антитела в виде IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными мостиками. В направлении от N-конца к С-концу, каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следует три константных домена (CH1, СН2 и СН3). Аналогично этому, в направлении от N-конца к С-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен легкой цепи (CL). Легкая цепь антитела в зависимости от аминокислотной последовательности ее константного домена может принадлежать к одному из двух типов, которые обозначают каппа (κ) и лямбда (λ).

Понятие «листовка-вкладыш в упаковку» относится к инструкциям, которые обычно входят в поступающие в продажу упаковки терапевтических продуктов, содержащим информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или мерах предосторожности, которые связаны с применением указанных терапевтических продуктов.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно полипептидной референс-последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в полипептидной референс-последовательности, после выравнивая последовательностей и при необходимости интродукции брешей для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривая какие-либо консервативные замены в качестве компонента при оценке идентичности последовательностей. Сравнительный анализ для целей определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными путями, известными в данной области, используя, например, публично доступные компьютерные программы, такие как программа BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения величины % идентичности аминокислотных последовательностей получают, используя компьютерную программу для сравнения последовательностей ALIGN-2. Авторство компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2 принадлежит фирме Genentech, Inc., и исходный код был представлен в комплекте с документацией для пользователей в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован как U.S. Copyright Registration № TXU510087. Программа ALIGN-2 публично доступна от фирмы Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, шт. Калифорния, или ее можно компилировать на основе исходного кода. Программу ALIGN-2 можно компилировать для применения в операционной системе UNIX, включая цифровую систему UNIX V4.0D. Все параметры, требуемые для сравнения последовательностей, устанавливаются программой ALIGN-2 и не должны изменяться.

В ситуациях, в которых ALIGN-2 применяют для сравнения аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотных последовательностей данной аминокислотной последовательности А по сравнению, с или относительно данной аминокислотной последовательности Б (что в альтернативном варианте можно обозначать как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет или содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности по сравнению, с или относительно данной аминокислотной последовательности Б), рассчитывают следующим образом:

100 × дробь X/Y,

где X обозначает количество аминокислотных остатков, определенных как идентичные совпадения при оценке с помощью программы для сравнительного анализа последовательностей ALIGN-2, где с помощью программы осуществляли сравнение А и Б, и где Y обозначает общее количество аминокислотных остатков в Б. Должно быть очевидно, что, если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности Б, то % идентичности аминокислотных последовательностей А относительно Б не может быть равен % идентичности аминокислотной последовательности Б относительно А. Если специально не указано иное, то все величины % идентичности аминокислотных последовательностей, указанные в настоящем описании, получали с использованием описанной в предыдущем параграфе компьютерной программы ALIGN-2.

Понятие «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, что он обеспечивает биологическую активность входящего в его состав действующего вещества, которое должно обладать эффективностью, и который не содержит дополнительных компонентов, обладающих неприемлемой токсичностью для индивидуума, которому следует вводить композицию.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от действующего вещества, который является нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемые носители включают (но, не ограничиваясь только ими) буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

В контексте настоящего описания понятие «человеческий альфа-синуклеин» относится к нативному человеческому альфа-синуклеину (UniProt Р37840). Под понятие подпадает «полноразмерный» непроцессированный человеческий альфа-синуклеин, а также любая форма человеческого альфа-синуклеина, которая образуется в результате процессинга в клетке. Под понятие подпадают также встречающиеся в естественных условиях варианты человеческого альфа-синуклеина, например, мутанты, сплайсинговые варианты или аллельные варианты. Аминокислотная последовательность человеческого альфа-синуклеина представлена в SEQ ID NO: 40.

В контексте настоящего описания понятие «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «процесс лечения») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики, либо в процессе развития клинической патологии. Требуемыми действиями лечения являются (но, не ограничиваясь только ими) предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезни и ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, применяют для задержки развития болезни или замедления прогрессирования болезни.

Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, можно выделять, используя VH- или VL-домен из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VL- или VH-доменов соответственно (см., например, Portolano и др., J. Immunol. 150, 1993, сс. 880-887; Clarkson и др., Nature 352, 1991, сс. 624-628).

Понятие «вектор» в контексте настоящего описания относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая обладает способностью к размножению другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Понятие включает вектор в виде самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он интродуцирован. Некоторые векторы обладают способность контролировать экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Указанные векторы в контексте настоящего описания обозначают как «экспрессионные векторы».

II. Композиции и способы

Один из объектов изобретение основан, по меньшей мере частично, на открытие того, что и антитела, указанные в настоящем описании, можно применять для снижения/элиминации индуцируемой альфа-синуклеином токсичности в нейронах и глиальных клетках в головном мозге. Некоторыми объектами изобретения являются антитела, которые связываются с человеческим альфа-синуклеином. Антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять, например, для диагностирования или лечения синуклеинопатии и нейропатии, прежде всего болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера с сопутствующей болезнью Паркинсона.

А. Примеры антител к человеческому альфа-синуклеину

Антитела, указанные в настоящем описании, можно получать с помощью взвешенной методологии иммунизации и целенаправленной селекции антител со специфическими особенностями связывания.

Сначала кроликов иммунизировали смесью различных конструкций и агрегатов рекомбинантного альфа-синуклеина. Выделенные В-клеточные клоны характеризовали с помощью ELISA и отбирали наиболее эффективные связывающие агенты. На следующей стадии антитела характеризовали с помощью эпитопного картирования, используя методологию на основе пептидных массивов, и с помощью определения их селективности в отношении мономерного и олигомерного рекомбинантного альфа-синуклеина, например, с помощью Вестерн-блоттинга. Кроме того, определяли связывание антител с рекомбинантным альфа-синуклеином и физиологическим альфа-синуклеином в человеческих нервных клетках и с патологическим альфа-синуклеином в срезах головного мозга трансгенных по человеческому альфа-синуклеину мышей и пациентов с болезнью Паркинсона. На основе указанных выше данных отбирали кандидатов и определяли фактическое связывание in vivo с патологическим альфа-синуклеином после периферической инъекции. Затем отбирали наиболее эффективные связывающие агенты. С использованием отобранных наиболее эффективных связывающих агентов можно определять снижение связанной с альфа-синуклеином патологии и/или прекращение прогрессирования связанной с альфа-синуклеином патологии на трансгенных мышах Thy1-(A30P)aSYN.

Одним из предпочтительных антител являлось антитело 0017. Указанное антитело обладает широким профилем специфического связывания с альфа-синуклеином, т.е. указанное антитело связывается с мономерным и агрегированным (олигомерным) человеческим альфа-синуклеином. На фиг. 1 представлена зависимость от концентрации антитела 0017 связывания с мономерными и несколькими агрегированными формами человеческого альфа-синуклеина. Антитело 0017 представляет собой химерное антитело с вариабельными доменами кроличьего антитела 233, отобранными с помощью изложенной выше процедуры, и мышиными константными областями.

Другим предпочтительным антителом является антитело 0018. Указанное антитело имеет зависящий от агрегации альфа-синуклеина профиль связывания, т.е. указанное антитело связывается с мономерным, димерным и олигомерным человеческим альфа-синуклеином, при этом связывание с мономерным человеческим и мышиным альфа-синуклеином снижается, если N-концевой остаток метионина модифицирован, например, путем ацетилирования или биотинилирования, или отсутствует. На фиг. 2 представлена зависимость от концентрации связывания антитела 0018 с различными агрегированными формами человеческого альфа-синуклеина. Характерное для олигомера связывание становится заметным при концентрации антитела ниже 0,5 мкг/мл. Антитело 0018 представляет собой химерное антитело с вариабельными доменами кроличьего антитела 064, отобранными с помощью изложенной выше процедуры, и мышиными константными областями.

При применении модифицированных на N-конце пептидов для определения сайта связывания антитела 0018 на человеческом альфа-синуклеине не удалось обнаружить какое-либо связывание. Поэтому осуществляли эпитопный анализ антитела 0018 с использованием библиотеки перекрывающихся иммобилизованных пептидных фрагментов (длина: 15 аминокислот, сдвиг: на 1 аминокислоту), соответствующих последовательностям α-синуклеина (1-140), β-синуклеина (60-134), γ-синуклеина (60-127) и N-ацетилированного пептида α-синуклеина (1-15), и, применяя основанный на ELISA метод детекции (см. пример 14 и фиг. 13).

Было установлено, что антитело 0018 связывается с коротким (состоящим из 15 аминокислот) пептидом мономерного альфа-синуклеина, который присутствует в пептидном массиве. Антитело 0018 распознает эпитоп на самом отдаленном N-конце альфа-синуклеина. N-концевая аминокислота метионин (М, МЕТ) имеет решающее значение для связывания, поскольку ее удаление (или блокирование) полностью элиминирует связывание антитела 0018. Кроме того, когда N-концевой остаток метионина кэппируют путем N-ацетилирования, то никакого связывания не удается обнаружить. Это подтверждается анализом методом поверхностного плазмонного резонанса (см. фиг. 14).

Еще одним предпочтительным антителом является антитело 0081. Для антитела к альфа-синуклеину 0081 обнаружена зависящая от дозы схема, напоминающая установленную для антитела 0018, с одинаковым снижением иммунореактивности в отношении всех форм альфа-синуклеина на блотте (фиг. 3).

На фиг. 4 представлены данные о различном характере окрашивания антителами 0017 и 0018 и референс-антителом 12F4 сагиттальных срезов головного мозга трансгенных по альфа-синуклеину мышей с мутацией А30Р.

На фиг. 5 представлены данные о различном характере окрашивания антителами 0017 и 0018 человеческой коры головного мозга у пациента с болезнью Паркинсона (А), пациента с болезнью Альцгеймера с сопутствующей болезнью Паркинсона (Б) и прогрессирующим надъядерным параличом (В). Применение антитела 0017 приводило к окрашиванию диффузной паренхимы, а также телец Леви и нейритов Леви. Для антитела 0018 характерно более слабое окрашивание паренхимы и более выраженное окрашивание телец Леви и нейритов Леви. Таким образом, антитела 0017 и 0018 характеризуются различной схемой окрашивания агрегатов альфа-синуклеина в срезах головного мозга пациентов с болезнью Паркинсона.

На фиг. 6 представлены результаты мечения церебральной альфа-синуклеиновой патологии у имеющих мутацию альфа-синуклеина А30Р трансгенных мышей после острой периферической инъекции специфических МАт.Антитело к альфа-синуклеину (2×60 мг/кг в течение 5 дней) или ЗФР вводили 15-месячным имеющим мутацию альфа-синуклеина А30Р трансгенным мышам. Свежезамороженные сагиттальные срезы головного мозга толщиной 20 мкм окрашивали конъюгатом антимышиное антитело в виде IgG1-AF555 или соответствующим антителом к альфа-синуклеину и конъюгатом антимышиное антитело в виде IgG1-AF555.

На фиг. 7 проиллюстрировано, что антитела 0017 и 0018 обладали способностью осуществлять иммуноистощение олигомеров альфа-синуклеина во внеклеточных средах и поэтому указанные антитела снижали токсичность олигомеров альфа-синуклеина.

Одним из объектов изобретения являются выделенные антитела, которые связываются с человеческим альфа-синуклеином. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к человеческому альфа-синуклеину:

связывается с пептидом, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01 и связывается с мономерным, но не с фибриллярным альфа-синуклеином, или

связывается с таким же эпитопом, что и антитело, которое содержит пару вариабельных доменов, имеющих SEQ ID NO: 26 и 27 или SEQ ID NO: 38 и 39, и связывается с фибриллярным альфа-синуклеином, но не мономерным альфа-синуклеином,

ингибирует индуцируемую альфа-синуклеином токсичность в нейронах и глиальных клетках,

ингибирует перенос от клетки к клетке агрегированного альфа-синуклеина,

снижает индуцируемую альфа-синуклеином каспазную активность (например, в LUHMES-клетках).

Одним из объектов изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, которое содержит по меньшей мере один или два, или три, или четыре, или пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 04; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07.

Одним из объектов изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, которое содержит по меньшей мере один или два, или три, или четыре, или пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 04; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (д) HVR-L2, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

Одним из объектов изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, которое содержит по меньшей мере один или два, или три, или четыре, или пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

Одним из объектов изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, которое содержит по меньшей мере один или два, или три, или четыре, или пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.

Одним из объектов изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, которое содержит по меньшей мере один или два, или три, или четыре, или пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33.

Одним из объектов изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, которое содержит по меньшей мере один или два, или три, или четыре, или пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.

Одним и объектов изобретения является антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из

I) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02; (6) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 04; или

II) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 04, или

III) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или

IV) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или

V) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, или

VI) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (б HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит

I) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 04; или

III) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; (6) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или

VI) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; и (в) HVR-H3 SEQ ID NO: 30.

В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит также по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из

I) (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07; или

II) (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, или

III) (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, или

IV) (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID О: 25, или

V) (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, или

VI) (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.

В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит

IV) (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, или

Одним из объектов изобретения является антитело, содержащее I) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 04; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, или

II) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 04; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (д) HVR-L2 SEQ ID NO: 11; и (e) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, или

III) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, или

IV) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, или

V) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; (д) HVR-L2 SEQ ID NO: 32; и (e) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, или

VI) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и (е) HVR-L3 SEQ ID NO: 37.

В любом из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения антитело к альфа-синуклеину является гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к человеческому альфа-синуклеину содержит HVR, указанные в любом из приведенных выше вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержит акцепторный человеческий каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.

В другом варианте осуществления изобретения VH или VL содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антитело к человеческому альфа-синуклеину, содержащее такие последовательности, сохраняет способность связываться с человеческим альфа-синуклеином.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 3 аминокислот заменены, встроены и/или удалены в результате делеции в каждой из последовательностей HVR, указанных выше в настоящем описании.

Следующим объектом изобретения является антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело к человеческому альфа-синуклеину, указанное в настоящем описании.

Например, некоторыми вариантами осуществления изобретения является антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело к человеческому альфа-синуклеину, содержащее

а) последовательность VH SEQ ID NO: 13 и последовательность VL SEQ ID NO: 14, или

б) последовательность VH SEQ ID NO: 26 и последовательность VL SEQ ID NO: 27, или

в) последовательность VH SEQ ID NO: 38 и последовательность VL SEQ ID NO: 39.

Некоторыми вариантами осуществления изобретения является антитело, которое связывается с эпитопом внутри фрагмента человеческого альфа-синуклеина, состоящего из аминокислот 101-111 SEQ ID NO: 40.

Некоторыми вариантами осуществления изобретения является антитело, которое связывается со свободным N-концевым эпитопом (свободный N-концевой остаток метионина) внутри фрагмента человеческого альфа-синуклеина, состоящего из аминокислот 1-15 SEQ ID NO: 40.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, которое связывается с человеческим альфа-синуклеином, который имеет свободный N-концевой остаток метионина, и которое связывается с конформационным эпитопом, простирающимся от остатка 1 до остатка 15 и от остатка 188 до остатка 195 человеческого альфа-синуклеина.

В следующем объекте изобретения антитело к человеческому альфа-синуклеину, указанное в любом их приведенных выше вариантов осуществления изобретения, представляет собой моноклональное антитело, включая химерное, гуманизированное или человеческое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к человеческому альфа-синуклеину представляет собой фрагмент антитела, например Fv-, Fab-, Fab'-, scFv-фрагмент, димерное антитело или Р(ab')₂-фрагмент. В другом варианте осуществления изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, интактное антитело IgG1- или IgG4-изотипа, или антитело другого класса или изотипа, указанного в настоящем описании

Согласно следующему объекту изобретения антитело к человеческому альфа-синуклеину, указанное в любом из приведенных выше вариантов осуществления изобретения, может обладать любыми особенностями, индивидуально или в комбинации, описанными ниже в разделах 1-7:

1. Аффинность антител

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, представленное в настоящем описании, имеет величину константы диссоциации (Kd), составляющую ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ или от 1нМ до 100 нМ (например, 10^-7 М или ниже, например, от 10^-7 М до 10^-9 М).

В одном из вариантов осуществления величину Kd измеряют с помощью анализа связывания несущего радиоактивную метку антигена (РИА). В одном из вариантов осуществления изобретения РИА осуществляют с использованием Fab-версии представляющего интерес антитела и его антигена. Например, измеряют в растворе аффинность связывания Fab с антигеном путем уравновешивания Fab минимальной концентрацией ¹²⁵I-меченного антигена в присутствии титрационных разведений немеченого антигена, осуществляя затем захват антигена на сенсибилизированном антителом к Fab планшете (Chen, и др., J. Mol Biol 293, 1999, сс. 865-881). Для обеспечения условий, необходимых для проведения анализа, многолуночные планшеты MICROTITER^® (фирма Thermo Scientific) сенсибилизируют в течение ночи захватывающим антителом к Fab (фирма Cappel Labs) в концентрации 5 мкг/мл в 50 мМ карбонате натрия (рН 9,6) и затем блокируют с помощью 2% (мас./об) бычьего сывороточного альбумина в ЗФР в течение 2-5 ч при комнатной температуре (примерно 23°С). В неадсорбирующем планшете (фирма Nunc, №269620) смешивают взятый в концентрации 100 или 26 пМ меченный с помощью ¹²⁵I антиген с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, пригодного для оценки антитела к VEGF, Fab-12, см. Presta и др., Cancer Res. 57, 1997, сс. 4593-4599). Затем представляющий интерес Fab инкубируют в течение ночи; однако инкубацию можно осуществлять в течение более продолжительного периода времени (например, в течение 65 ч) для того, чтобы гарантировать достижение равновесия. После этого смеси переносят в подготовленный для захвата планшет и инкубируют при комнатной температуре (например, в течение 1 ч). Затем раствор удаляют и планшет промывают восемь раз 0,1% полисорбатом 20 (TWEEN-20^®) в ЗФР. После просушки планшетов в них добавляют по 150 мкл/лунку сцинтилляционной жидкости ((MICROSCINT-20™; фирма Packard) и осуществляют считывание планшетов с помощью гамма-счетчика TOPCOUNT™ (фирма Packard) в течение 10 мин. Для осуществления анализа связывания в условиях конкуренции выбирают концентрации каждого Fab, обеспечивающие уровень связывания, составляющий менее или равный 20% от максимального.

В другом варианте осуществления изобретения Kd измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса с помощью устройства BIACORE®. Например, анализ осуществляют с помощью устройства BIACORE^®-2000 или BIACORE^®-3000 (фирма GE Healthcare Inc., Пискатавей, шт. Нью-Джерси) при 25°С с использованием антигена, иммобилизованного на СМ5-чипах с уровнем иммобилизации, соответствующим -10 единицам ответа (RU). В одном из вариантов осуществления изобретения биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма GE Healthcare Inc.) активируют с помощью гидрохлорида N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8 до концентрации 5 мкг/мл (~ 0,2 мкМ) перед инъекцией со скоростью потока 5 мкл/мин для достижения уровня иммобилизации, соответствующего примерно 10 единицам ответа (RU) сшитого белка. После инъекции антигена инъецируют 1М этаноламин для блокады непрореагировавших групп. Для кинетических измерений инъецируют двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 до 500 нМ) в ЗФР, дополненном 0,05% полисорбата 20 (TWEEN-20™) в качестве сурфактанта (ЗФРТ), при 25°С со скоростью потока примерно 25 мкл/мин. Скорость реакции ассоциации (k_on) и реакции диссоциации (k_off) рассчитывают с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (программа оценки BIACORE®, версия 3.2) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия реакции диссоциации (Kd) рассчитывают как соотношение k_off/k_on (см., например, Chen и др., J Mol Biol 293, 1999, сс. 865-881). Если скорость реакции ассоциации превышает 10⁶ М^-1 с^-1 при оценке с помощью описанного выше метода поверхностного плазмонного резонанса, то скорость реакции ассоциации можно определять с помощью метода гашения флуоресценции, который позволяет измерять повышение или снижение интенсивности излучения флуоресценции (длина волны возбуждения 295 нм; длина волны испускания 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С применяемого в концентрации 20нМ антитела к антигену (Fab-формат) в ЗФР, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, осуществляя измерения с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр, снабженный блоком для остановки потока (фирма Aviv Instruments), или спектрофотометр SLM-AMINCO™ серии 8000 (фирма ThermoSpectronic), при перемешивании содержимого кюветы.

2. Фрагменты антител

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антител включают (но, не ограничиваясь только ими) такие фрагменты как Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv и scFv, и другие описанные ниже фрагменты. Обзор некоторых фрагментов антител см., у Hudson P.J. и др., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134. Обзор scFv-фрагментов см., например, у Plueckthun А. в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, т. 113, 1994, сс. 269-315; см. также WO 93/16185; и US 5571894 и 5587458. Обсуждение, касающееся Fab- и F(ab')₂-фрагментов, которые содержат остатки эпитопа, связывающегося с рецептором спасения, и обладают удлиненным временем полужизни in vivo, см. в US 5869046.

Димерные антитела представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими центрами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими (см., например, ЕР 0404097; WO 1993/01161; Hudson P.J. и др., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134; и Holliger Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс. 6444-6448). Тримерные и тетрамерные антитела описаны также у Hudson P.J. и др., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134).

Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь вариабельный домен тяжелой цепи или его часть, или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В некоторых вариантах осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (фирма Domantis, Inc., Валтман, шт. Массачусетс; см., например, US 6248516).

Фрагменты антител можно создавать различными методиками, включая (но, не ограничиваясь только ими) протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получать с помощью рекомбинантных клеток-хозяев (например, Е. coli или фаг), указанных в настоящем описании.

3. Химерные и гуманизированные антитела

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, указанное в настоящем описании, представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в US 4816567; и у Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc. 6851-6855. В одном из примеров химерное антитело содержит нечеловеческую вариабельную область (например, вариабельную область из антитела мышей, крыс, хомяков, кроликов или приматов кроме человека, таких как обезьяны) и человеческую константную область. В другом примере химерное антитело представляет собой антитело «переключенного класса», класс или подкласс которого был изменен относительно родительского антитела. Химерные антитела включают их антигенсвязывающие фрагменты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, нечеловеческое антитело гуманизируют для снижения иммуногенности для людей, сохраняя при этом специфичность и аффинность родительского нечеловеческого антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или несколько вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их участки), получают из нечеловеческого антитела, a FR (или их участки) получают из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть человеческой константной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены на соответствующие остатки из нечеловеческого антитела (например, антитела, из которого происходят остатки HVR), например, для сохранения или улучшения специфичности или аффинности антитела.

Гуманизированные антитела и методы их создания обобщены, например, у Almagro J.C. и Fransson J., Front. Biosci. 13, 2008, cc. 1619-1633, и описаны также у Riechmann I. и др., Nature 332, 1988, cc. 323-329; Queen С.и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc. 10029-10033; US 5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri S.V. и др., Methods 36, 2005, cc. 25-34 (описание трансплантации SDR (a-CDR)); Padlan E.A., Mol. Immunol. 28, 1991, cc. 489-498 (описание «нанесения нового покрытия»);

W.F. и др., Methods 36, 2005, cc. 43-60 (описание «перестановки FR»); и Osbourn J. и др., Methods 36, 2005, cc. 61-68 и Klimka А. и др., Br. J. Cancer 83, 2000, cc. 252-260 (описание подхода «направленной селекции» для перестановки FR).

Человеческие каркасные участки, которые можно применять для гуманизации, включают (но, не ограничиваясь только ими): каркасные участки, выбранные с использованием методов «наилучшего подбора» (см., например, Sims M.J. и др., J. Immunol. 151, 1993, cc. 2296-2308; каркасные участки, происходящие из консенсусной последовательности конкретной подгруппы вариабельных областей легких и тяжелых цепей человеческих антител (см., например, Carter Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, cc. 4285-4289 и Presta L.G. и др., J. Immunol. 151, 1993, cc. 2623-2632); человеческие зрелые (с соматическими мутациями) каркасные области или каркасные области человеческой зародышевой линии (см., например, Almagro J.C. и Fransson J., Front. Biosci. 13, 2008, с. 1619-1633); и каркасные участки, полученные в результате скрининга FR-библиотек (см., например, Baca М. и др., J. Biol. Chem. 272, 1997, cc. 10678-10684 и Rosok M.J. и др., J. Biol. Chem. 271, 1996, cc. 22611-22618).

4. Человеческие антитела

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела можно получать, используя различные методики, известные в данной области. Человеческие антитела описаны в целом у van Dijk М.А. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5, 2001, cc. 368-374 и Lonberg N., Curr. Opin. Immunol. 20, 2008, cc. 450-459.

Человеческие антитела можно получать путем введения иммуногена трансгенному животному, модифицированному таким образом, чтобы оно продуцировало интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными областями в ответ на контрольное заражение антигеном. Указанные животные, как правило, содержат все или часть локусов человеческого иммуноглобулина вместо эндогенных иммуноглобулиновых локусов, которые либо присутствуют вне хромосом, либо интегрированы произвольно в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей эндогенные иммуноглобулиновые локусы, как правило, инактивированы. Обзор методов получения человеческих антител в трансгенных животных см. у Lonberg N., Nat. Biotech. 23, 2005, cc. 1117-1125 (см., например, также в US 6075181 и US 6150584 описание технологии XENOMOUSE™; в US 5770429 описание технологии HuMab®; в US 7041870 описание технологии К-М MOUSE® и в US 2007/0061900 описание технологии VelociMouse®). Человеческие вариабельные области из интактных антител, полученных с помощью указанных животных, можно дополнительно модифицировать, например, путем объединения с другой человеческой константной областью.

Человеческие антитела можно создавать с помощью методов на основе гибридом. Описаны клеточные линии человеческой миеломы и мышиной-человеческой гетеромиеломы, предназначенные для получения человеческих моноклональных антител (см., например, Kozbor D., J. Immunol. 133, 1984, cc. 3001-3005; Brodeur B.R. и др., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, изд-во Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, cc. 51-63 и Boerner P. и др., J. Immunol. 147, 1991, cc. 86-95). Человеческие антитела, созданные с использованием технологии на основе человеческих В-клеточных гибридом, описаны также у Li J. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 2006, cc. 3557-3562. Дополнительные методы включают методы, описанные, например, в US 7189826 (описание получения моноклональных человеческих антител типа IgM из клеточных линий гибридом), и у Ni J., Xiandai Mianyixue 26, 2006, cc. 265-268 (описание человеческих-человеческих гибридом). Технология человеческих гибридом (технология Trioma) описана также у Vollmers Н.Р. и Brandlein S., Histology and Histopathology 20, 2005, cc. 927-937 и Vollmers Н.Р. и Brandlein S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27, 2005, cc. 185-191.

Человеческие антитела можно создавать также путем выделения последовательностей вариабельных доменов Fv-клона, выбранных из фаговых дисплейных библиотек, для создания которых использовали человеческие антитела. Указанные последовательности вариабельных доменов затем можно объединять с требуемым человеческим константным доменом. Методики отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.

5. Антитела, полученные из библиотек

Антитела, предлагаемые в изобретении, можно выделять путем скрининга комбинаторных библиотек антител с требуемой активностью или видами активности. Например, в данной области известны разнообразные методы для создания фаговых дисплейных библиотек и скрининга указанных библиотек в отношении антител, обладающих требуемыми характеристиками связывания. Указанные методы обобщены, например, у Hoogenboom H.R. и др., Methods in Molecular Biology 178, 2001, cc. 1-37, и описаны также, например, у McCafferty J. и др., Nature 348, 1990, сс. 552-554; Clackson Т. и др., Nature 352, 1991, сс. 624-628; Marks J.D. и др., J. Mol. Biol. 222, 1992, сс. 581-597; Marks J.D. и Bradbury A., Methods in Molecular Biology 248, 2003, сс. 161-175; Sidhu S.S. и др., J. Mol. Biol. 338, 2004, cc. 299-310; Lee C.V. и др., J. Mol. Biol. 340, 2004, cc. 1073-1093; Fellouse F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2004, cc. 12467-12472 и Lee C.V. и др., J. Immunol. Methods 284, 2004, cc. 119-132.

При осуществлении некоторых методов фагового дисплея популяции VH- и VL-генов клонируют по отдельности с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рекомбинируют произвольно в фаговых библиотеках, которые затем подвергают скринингу в отношении антигенсвязывающего фага согласно методу, описанному у Winter G. и др., Ann. Rev. Immunol. 12, 1994, сс. 433-455. Фаг, как правило, экспонирует фрагменты антител либо в виде одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv), либо в виде Fab-фрагментов. Библиотеки, полученные из иммунизированных источников, включают антитела, обладающие высокой аффинностью к иммуногену, при этом отсутствует необходимость в создании гибридом. Альтернативно этому, можно клонировать необработанную («наивную») популяцию (например, из организма человека), получая один источник антител к широкому спектру чужих, а также своих антигенов без какой-либо иммунизации, что описано у Griffiths A.D. и др., EMBO J, 12, 1993, сс. 725-734. И, наконец, «наивные» библиотеки можно получать также методами синтеза путем клонирования неперегруппированных сегментов V-гена из стволовых клеток и с помощью ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность, для кодирования гипервариабельных CDRS-участков и для осуществления перегруппировки in vitro согласно методу, описанному у Hoogenboom H.R. и Winter G., J. Mol. Biol. 227, 1992, сс. 381-388. Фаговые библиотеки человеческих антител описаны, например, в следующих патентных публикациях: US 5750373 и публикации заявок на патент США 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.

Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, рассматриваются как человеческие антитела или фрагменты человеческих антител.

6. Мультиспецифические антитела

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, указанное в настоящем описании, представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности, связывающиеся по меньше мере с двумя различными сайтами. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из связывающих специфичностей обеспечивает связывание с человеческим альфа-синуклеином, а другая с любым другим антигеном. Биспецифические антитела можно применять также для локализации цитотоксических агентов в клетках, которые экспрессируют по меньшей мере один из антигенов. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.

Методики создания мультиспецифических антител включают (но, не ограничиваясь только ими) рекомбинантную совместную экспрессию двух пар тяжелых цепей-легких цепей иммуноглобулинов, обладающих различными специфичностями (см. Milstein С. и Cuello А.С, Nature 305, 1983, сс. 537-540, WO 93/08829 и Traunecker А. и др., EMBO J. 10,1991, сс. 3655-3659), и технологию «knob-in-hole» (обеспечение взаимодействия по типу «выступ-во впадину», см., например, US 5731168). Мультиспецифические антитела можно получать также путем создания регулируемых электростатических воздействий для получения молекул антитела с гетеродимерными Fc (WO 2009/089004); перекрестного связывания двух или большего количества антител или фрагментов (см., например, US 4676980 и Brennan М. и др., Science 229, 1985, сс. 81-83); применения лейциновых молний для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny S.A. и др., J. Immunol. 148, 1992, сс. 1547-1553); применения технологии «димерных антител (диабоди)» для создания фрагментов биспецифических антител (см., например, Holliger Р. и др., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс. 6444-6448); и применения димеров одноцепочечных Fv (sFv) (см., например, Gruber М и др., J. Immunol. 152, 1994, сс. 5368-5374); и получения триспецифических антител согласно методу, описанному, например, у Tutt А. и др., J. Immunol. 147, 1991, сс. 60-69).

Под объем настоящего изобретения подпадают также сконструированные антитела с тремя или большим количеством функциональных

антигенсвязывающих сайтов, включая «антитела-осьминоги» (см., например, US 2006/0025576А1).

Антитело или его фрагмент может включать также «Fab двойного действия» или «DAF»,содержащий антигенсвязывающий сайт, который связывается с человеческим альфа-синуклеином, а также с другим, отличным от первого антигеном (см., например, US 2008/0069820).

Представленные в настоящем описании антитела или фрагменты включают также мультиспецифические антитела, описанные в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2010/145793.

7. Варианты антител

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к вариантам аминокислотных последовательностей антител, представленных в настоящем описании. Например, может требоваться повышать аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела можно получать путем интродукции соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем синтеза пептидов. Указанные модификации включают, например, делеции и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечной конструкции можно использовать любую комбинацию делеций, инсерций и замен, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, способностью связываться с антигеном. а) Полученные путем замены, инсерций и делеций варианты Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются варианты антител, которые имеют одну или несколько аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для замещающего мутагенеза, включают HVR и FR. Консервативные замены представлены ниже в таблице 1 под заголовком «предпочтительные замены». Более общие замены представлены ниже в таблице 1 под заголовком «приведенные в качестве примера замены», и они дополнительно описаны ниже со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены можно интродуцировать в представляющее интерес антитело и продукты подвергать скринингу в отношении требуемой активности, например, сохранения/повышения способности к связыванию антигена, пониженной иммуногенности или повышенной ADCC или CDC.

Аминокислоты можно группировать на основе общих свойств боковых цепей следующим образом:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислотные: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Под неконсервативными заменами подразумевают замену представителя одного из указанных классов на представителя из другого класса.

Один тип полученного в результате замены варианта включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельного участка родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(ые) в результате вариант(ы), отобранный(ые) для дополнительного исследования, должен(ы) иметь модификации (например, улучшения) некоторых биологических свойств (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) относительно родительского антитела, и/или должен(ы) иметь практически сохраненные определенные биологические свойства родительского антитела. Примером полученного в результате замены варианта является антитело с созревшей аффинностью, которое можно создавать, например, с использованием технологий созревания аффинности на основе фагового дисплея, например, указанных в настоящем описании. В целом, метод состоит в следующем: один или несколько остатков HVR подвергают мутации и варианты антител экспонируют на фаге и подвергают скринингу в отношении конкретной биологической активности (например, аффинности связывания).

Изменения (например, замены) можно осуществлять в HVR, например, для повышения аффинности антитела. Указанные изменения можно делать в «горячих (активных) точках» в HVR, т.е. остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвергаются мутации в процессе соматического созревания (см., например, Chowdhury P.S., Methods Mol. Biol. 207, 2008, cc. 179-196), и/или остатках, которые контактируют с антигеном, с последующим тестированием варианта VH или VL в отношении аффинности связывания. Созревание аффинности путем создания и повторной селекции из вторичных библиотек описано, например, у Hoogenboom H.R. и др., Methods in Molecular Biology 178, 2002, cc. 1-37. В некоторых вариантах осуществления процесса созревания аффинности интродуцируют разнообразие в гены вариабельной области, выбранные для созревания, с помощью любого из широкого разнообразия методов (например, ПЦР пониженной точности, перестановка цепи или сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов). Затем создают вторичную библиотеку. Затем библиотеку подвергают скринингу для идентификации любых вариантов антител с требуемой аффинностью. Другой метод, применяемый для интродукции разнообразия, включает подходы, мишенью которых является HVR, при которых несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков одновременно) рандомизируют.Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, можно специфически идентифицировать, например, используя аланин-сканирующий мутагенез или моделирование. Часто мишенями являются прежде всего CDR-H3 и CDR-L3.

В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции могут затрагивать один или несколько HVR, если указанные изменения не снижают существенно способность антитела связываться с антигеном. Например, в HVR могут быть сделаны консервативные изменения (например, консервативные замены, указанные в настоящем описании), которые не снижают существенно аффинность связывания. Указанные изменения, например, могут находиться вне принимающих участие в контактировании с антигеном остатков HVR. В некоторых вариантах осуществления изобретения в последовательностях вариантов VH и VL, указанных выше, каждый HVR либо является неизмененным, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.

Ценным методом идентификации остатков или областей антитела, которые можно подвергать мутагенезу, является так называемый «аланин-сканирующий мутагенез», описанный у Cunningham B.C. и Wells J.A., Science 244, 1989, сс. 1081-1085. При осуществлении этого метода остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) идентифицируют и заменяют на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (например, аланин или полиаланин) для решения вопроса о том, будет ли это влиять на взаимодействие антитела с антигеном. Дополнительные замены можно интродуцировать в те положения аминокислот, для которых продемонстрирована функциональная чувствительность к начальным заменам. В альтернативном или дополнительном варианте изучают кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Указанные контактирующие остатки и соседние остатки можно рассматривать в качестве мишеней или исключать из рассмотрения в качестве кандидатов для замены. Варианты можно подвергать скринингу для решения вопроса о том, обладают ли они требуемыми свойствами.

Инсерции в аминокислотные последовательности включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или большее количество остатков, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутрь последовательности. Примером результата осуществления концевых инсерции является антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекул антител включают слияние N- или С-концов антитела с ферментом (например, для ADEPT (антитело-направляемый фермент пролекарственной терапии) или полипептидом, который удлиняет время полужизни антитела в сыворотке.

б) Варианты гликозилирования

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, изменяют с целью повышения или понижения степени гликозилирования антитела. Добавление или делецию сайтов гликозилирования в антителе можно легко осуществлять путем такого изменения аминокислотной последовательности, которое позволяет создавать или удалять один или несколько сайтов гликозилирования.

Если антитело содержит Fc-область, то можно изменять присоединенный к ней углевод. Нативные антитела, которые продуцируются клетками млекопитающих, как правило, содержат разветвленный биантенный олигосахарид, который, как правило, присоединен с помощью N-связи к Asn297 СН2-домена Fc-области (см., например, Wright А. и Morrison S.L., TIBTECH 15, 1997, cc. 26-32). Олигосахарид может включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стебле» биантенной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах осуществления изобретения модификации олигосахарида в антителе, предлагаемом в изобретении, можно осуществлять для создания вариантов антитела с определенными улучшенными свойствами.

Одним из вариантов осуществления изобретения являются варианты антитела, имеющие углеводную структуру, в которой снижено содержание фукозы, присоединенной (прямо или косвенно) к Fc-области. Например, содержание фукозы в указанной Fc-области может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Содержание фукозы определяют путем расчета среднего содержания фукозы в сахарной цепи на Asn297 относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), которое измеряют с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии согласно методу, описанному, например, в WO 2008/077546. Asn297 обозначает остаток аспарагина, присутствующий примерно в положении 297 в Fc-области (EU-нумерация остатков Fc-области); однако вследствие минорных вариаций последовательности антитела Asn297 может располагаться также в положении, находящемся на расстоянии примерно+3 аминокислоты в прямом или обратном направлении от положения 297, т.е. между положениями 294 и 300. Указанные фукозилированные варианты могут обладать улучшенной ADCC-функцией (см., например, US 2003/0157108; US 2004/0093621). Примерами публикаций, касающихся «дефукозилированных» вариантов антител или вариантов антител «с дефицитом фукозы» являются: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki и др., J. Mol. Biol. 336, 2004, cc. 1239-1249; Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, cc. 614-622). Примерами клеточных линий, которые обладают способностью продуцировать дефукозилированные антитела, являются Lecl3 СНО-клетки с дефицитом белкового фукозилирования (Ripka и др., Arch. Biochem. Biophys. 249, 1986, сс. 533-545; US 2003/0157108 и WO 2004/056312, см., прежде всего, пример 11), и клеточные линии с «выключенным» геном, например, СНО клетки с «выключенным» геном альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, cc. 614-622); Kanda Y. и др., Biotechnol. Bioeng., 94(4), 2006, cc. 680-688; и WO 2003/085107).

Кроме того, описаны варианты антител с бисекционными олигосахаридами, например, в которых биантенный олигосахарид, присоединенный к Fc-области антитела, бисекционнируется с помощью GlcNAc. Указанные варианты антител могут отличаться пониженным фукозилированием и/или повышенной ADCC-функцией. Примеры указанных вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878; US 6602684 и US 2005/0123546. Предложены также варианты антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc-области. Указанные варианты антител могут обладать повышенной CDC-функцией. Указанные варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964 и WO 1999/22764.

в) Варианты Fc-области

Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения можно интродуцировать в Fc-область антитела, представленного в настоящем описании, одну или несколько аминокислотных модификаций, создавая тем самым вариант Fc-области. Вариант Fc-области может содержать последовательность человеческой Fc-области (например, Fc-области человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), включающую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких аминокислотных положениях).

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к варианту антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его перспективным кандидатом для путей применения, для которых является важным время полужизни антитела in vivo, однако некоторые эффекторные функции (такие как CDC и ADCC) не являются необходимыми или являются вредными. Можно осуществлять анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo для подтверждения снижения/истощения CDC- и/или ADCC-активности. Например, можно осуществлять анализы связывания Fc-рецептора (FcR) для гарантии того, что у антитела отсутствует способность к связыванию с FcyR (и поэтому, вероятно, отсутствует ADCC-активность), но сохраняется способность связываться с FcRn. Первичные клетки, опосредующие ADCC, т.е. NK-клетки, экспрессируют только FcyRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Данные об экспрессии FcR на гематопоэтических клетках обобщены в таблице 3 на с. 464 у Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 1991, cc. 457-492. Примерами анализов in vitro ADCC-активности представляющей интерес молекулы являются (но, не ограничиваясь только ими) анализы, описанные в US 5500362 (см., например, Hellstrom I. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1986, cc. 7059-7063 и Hellstrom I. и др., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82, 1985, cc. 1499-1502); US 5821337 (см. Bruggemann M. и др., J. Exp.Med. 166, 1987, cc. 1351-1361). В альтернативном варианте можно применять нерадиоактивные методы анализа (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ на основе проточной цитометрии (фирма CellTechnology, Inc. Маунтин-Вью, шт. Калифорния); и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96^® (фирма Promega, Мэдисон, шт. Висконсин). Пригодными для таких анализов эффекторными клетками являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные клетки-киллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, на животной модели, например, как описано у Clynes и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, cc. 652-656. Можно осуществлять также анализы связывания C1q для подтверждения того, что антитело не может связывать C1q и поэтому у него отсутствует CDC-активность (см., например, описание ELISA для оценки связывания C1q и С3с в WO 2006/029879 и WO 2005/100402). Для оценки активации комплемента можно осуществлять анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro и др., J. Immunol. Methods 202, 1996, сс. 163-171; Cragg M.S. и др., Blood 101, 2003, сс. 1045-1052; и Cragg M.S. и M.J. Glennie, Blood 103, 2004, cc. 2738-2743). Определение FcRn-связывания и клиренса/времени полужизни in vivo можно осуществлять также с использованием методов, известных в данной области (см., например, Petkova S.B. и др., Int'l. Immunol. 18(12), 2006, сс. 1759-1769).

Антитела с пониженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или нескольких следующих остатков Fc-области, таких как 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (см., например, US 6737056). К указанным мутантам Fc относятся мутанты Fc с заменами в двух или большем количестве из следующих аминокислотных положений: 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант «DANA» Fc-области, несущий замену остатков 265 и 297 на аланин (US 7332581).

Описаны некоторые варианты антител с повышенной или пониженной способностью связываться с FcR (см., например, US 6737056; WO 2004/056312 и Shields R.L. и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, сс. 6591-6604).

Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения вариант антитела содержит Fc-область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые повышают ADCC, например, замены в положениях 298, 333, и/или 334 Fc-области (EU-нумерация остатков).

В некоторых вариантах осуществления изобретения в Fc-области осуществляют изменения, которые приводят к измененной (т.е. либо повышенной, либо пониженной) способности связывать C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), что описано, например, в US 6194551, WO 99/51642 и у Idusogie и др., J. Immunol. 164, 2000, сс. 4178-4184.

Антитела с удлиненным временем полужизни и повышенной способностью к связыванию с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), который ответствен за перенос материнских IgG эмбриону (Guyer и др., J. Immunol. 117, 1976, сс. 587-593 и Kim и др., J. Immunol. 24, 1994, сс. 2429-2434), описаны в US 2005/0014934А1. Эти антитела содержат Fc-область с одной или несколькими заменами, которые повышают связывание Fc-области с FcRn. Указанные варианты Fc-области включают варианты с заменами одного или нескольких следующих остатков Fc-области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замену остатка 434 в Fc-области (US 7371826).

Дополнительные примеры, касающиеся других вариантов Fc-области, описаны также у Duncan и Winter, Nature 322, 1988, сс. 738-740; в US 5648260; US 5624821 и WO 94/29351.

г) Варианты антител, сконструированные с помощью цистеина

В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться желательным создавать антитела, сконструированные с помощью цистеина, например, «тиоМАт», в которых один или несколько остатков в антителе заменены на остатки цистеина. В конкретных вариантах осуществления изобретения замененные остатки находятся в доступных сайтах антитела. Путем замены этих остатков на цистеин реакционноспособные тиольные группы помещаются в доступные сайты антитела и могут использоваться для конъюгации антитела с другими фрагментами, такими как фрагменты, представляющие собой лекарственное средство, или фрагменты, представляющие собой линкер, связанный с лекарственным средством, с созданием иммуноконъюгата, указанного ниже в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения любой(ые) один или несколько следующих остатков может(гут) быть заменен(ы) на цистеин: V205 (нумерация по Кэботу) легкой цепи; А118 (EU-нумерация) тяжелой цепи и S400 (EU-нумерация) Fc-области тяжелой цепи. Антитела, сконструированные с помощью цистеина, можно создавать согласно методу, например, описанному в US 7521541.

д) Производные антител

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, представленное в настоящем описании, можно дополнительно модифицировать таким образом, чтобы оно содержало дополнительные небелковые фрагменты, известные в данной области и легкодоступные. Фрагменты, пригодные для дериватизации антитела, включают (но, не ограничиваясь только ими) водорастворимые полимеры. Примерами водорастворимых полимеров являются (но, не ограничиваясь только ими) полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо статистические сополимеры) и декстран- или поли(н-винилпиролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликольпропиональдегид может иметь преимущество при производстве благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может варьироваться и, если присоединено более одного полимера, то они могут представлять собой одинаковые или различные молекулы. В целом, количество и/или тип полимеров, применяемых для дериватизации, можно определять с учетом таких особенностей (но, не ограничиваясь только ими), как конкретные свойства или функции антитела, подлежащие усовершенствованию, предполагается ли применение производного антитела в терапии в определенных условиях, и т.д.

Другим вариантом осуществления изобретения являются конъюгаты антитела и небелкового фрагмента, которые можно избирательно нагревать, воздействуя на него излучением. В одном из вариантов осуществления изобретения небелковый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (Кат и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2005, cc. 11600-11605). Излучение может иметь любую длину волны и включает (но, не ограничиваясь только ими) длины волн, которые не повреждают обычные клетки, но которые нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой уничтожаются клетки, ближайшие к конъюгату: антитело-небелковый фрагмент.

е) Слияния с челночным модулем для гематоэнцефалического барьера

Моноклональные антитела имеют огромный терапевтический потенциал с позиций лечения неврологических заболеваний или заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), но их проникновение в головной мозг ограничено гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ). В проведенных ранее исследованиях было продемонстрировано, что через ГЭБ в ЦНС проникает очень небольшой процент (примерно 0,1%) IgG, циркулирующего в кровотоке (Felgenhauer, Klin. Wschr. 52, 1974, сс. 1158-1164), поэтому концентрация антитела в ЦНС может является недостаточной для обеспечения выраженного действия.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения антитело, представленное в настоящем описании, можно дополнительно модифицировать так, чтобы оно содержало один или несколько челночных модулей для гематоэнцефалического барьера, которые известны в данной области и легкодоступны.

Один или несколько челночных модулей для гематоэнцефалического барьера можно сливать с любым концом легкой или тяжелой цепи. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения челночный модуль для гематоэнцефалического барьера сливают с С-концом тяжелой цепи.

С-конец тяжелой цепи может представлять собой полный С-конец, оканчивающийся аминокислотными остатками PGK. С-конец тяжелой цепи может представлять собой укороченный С-конец, из которого удален(ы) один или два С-концевых аминокислотных остатка. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения С-конец тяжелой цепи представляет собой укороченный С-конец, оканчивающийся PG.

Один или несколько челночных модулей для гематоэнцефалического барьера можно сливать с соответствующей цепью антитела либо непосредственно, либо через линкерный пептид. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения линкерный пептид имеет аминокислотную последовательность GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41).

Челночный модуль для гематоэнцефалического барьера может представлять собой scFv-фрагмент антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения челночный модуль для гематоэнцефалического барьера представляет собой scFv, содержащий в направлении от N- к С-концу вариабельный домен легкой цепи-константный домен легкой цепи-линкерный пептид-вариабельный домен тяжелой цепи-константный домен 1 тяжелой цепи.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения челночный модуль для гематоэнцефалического барьера представляет собой scFv-фрагмент антитела 8D3 к рецептору трансферрина с линкерным пептидом (G4S)g или его гуманизированный вариант.

Понятие «его гуманизированный вариант» означает молекулу, полученную путем трансплантации CDR мышиного антитела 8D3 в человеческий каркасный участок с необязательной интродукцией 1-3 мутаций, каждой независимо друг от друга, в каждый из каркасных участков (FR) и/или гипервариабельных участков (HVR).

Одним из объектов настоящего изобретения является слитый полипептид антитела к человеческому альфа-синуклеину, содержащий антитело к человеческому альфа-синуклеину, два пептидных линкера и два одновалентных связывающих элемента, которые связываются с рецептором гематоэнцефалического барьера, в котором линкер сшивает антитело к человеческому альфа-синуклеину с одновалентными связывающими элементами, которые связываются с рецептором гематоэнцефалического барьера.

Одним из объектов настоящего изобретения является слитый полипептид антитела к человеческому альфа-синуклеину, содержащий антитело к человеческому альфа-синуклеину, пептидный линкер и один одновалентный связывающий элемент, который связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера, в котором линкер сшивает антитело к человеческому альфа-синуклеину с одновалентным связывающим элементом, который связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера.

В одном из вариантов осуществления изобретения одновалентный связывающий элемент, который связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера, выбирают из группы, состоящей из белков, полипептидов и пептидов.

В одном из вариантов осуществления изобретения одновалентный связывающий элемент, который связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера, содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из лиганда рецептора гематоэнцефалического барьера, scFv, Fv, scFab, VHH, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения scFv или scFab.

В одном из вариантов осуществления изобретения рецептор гематоэнцефалического барьера выбирают из группы, состоящей из рецептора трансферрина, рецептора инсулина, рецептора инсулиноподобного фактора роста, белка 8, родственного рецептору липопротеинов низкой плотности, белка 1, родственного рецептору липопротеинов низкой плотности, и фактора роста, подобного гепаринсвязывающему эпидермальному фактору роста. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения рецептор гематоэнцефалического барьера представляет собой рецептор трансферрина.

В одном из вариантов осуществления изобретения одновалентный связывающий элемент, который связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера, содержит один scFab или один scFv, мишенью которого является рецептор трансферрина, более конкретно, scFab или scFv, который распознает эпитоп в рецепторе трансферрина, содержащийся в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52, 53 и 54.

В одном из вариантов осуществления изобретения одновалентный связывающий элемент, который связывается с рецептором гематоэнцефалического барьера, сшит с С-концом тяжелой цепи антитела к человеческому альфа-синуклеину через линкер.

В одном из вариантов осуществления изобретения пептидный линкер представляет собой аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере из 15 аминокислот, более предпочтительно из 18-25 аминокислот.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к человеческому альфа-синуклеину представляет собой полноразмерное антитело, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения полноразмерный IgG. Понятие «полноразмерное антитело» относится к антителу, состоящему из двух полипептидов легких цепей антитела и двух полипептидов тяжелых цепей антитела, при этом в двух полипептидах тяжелых цепей антитела С-концевой остаток лизина (К) может присутствовать или отсутствовать.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения слитый полипептид антитела к человеческому альфа-синуклеину содержит полноразмерное антитело к человеческому альфа-синуклеину IgG-типа в качестве эффекторного элемента для головного мозга, линкер, имеющий последовательность GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41), и один scFab в качестве одновалентного связывающего элемента, который связывается с рецептором человеческого трансферрина, в качестве рецептора гематоэнцефалического барьера, в котором scFab сшит с помощью линкера с С-концом (Fc-области) одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела к человеческому альфа-синуклеину и в котором scFab распознает эпитоп в рецепторе человеческого трансферрина, содержащийся в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52, 53 и 54.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения слитый полипептид антитела к человеческому альфа-синуклеину содержит полноразмерное антитело к человеческому альфа-синуклеину IgG-типа в качестве эффекторного элемента для головного мозга, линкер, имеющий последовательность GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41), и один scFv в качестве одновалентного связывающего элемента, который связывается с рецептором человеческого трансферрина в качестве рецептора гематоэнцефалического барьера, в котором scFab сшит с помощью линкера с С концом (Fc-области) одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела к человеческому альфа-синуклеину и в котором scFab распознает эпитоп в рецепторе человеческого трансферрина, содержащийся в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52, 53 и 54.

В одном из вариантов осуществления изобретения первая тяжелая цепь антитела к человеческому альфа-синуклеину содержит первый модуль димеризации, а вторая тяжелая цепь антитела содержит второй модуль димеризации, что обеспечивает гетеродимеризацию двух тяжелых цепей.

В одном из вариантов осуществления изобретения первый модуль димеризации первой тяжелой цепи антитела к человеческому альфа-синуклеину представляет собой тяжелую цепь с «выступом», а модуль димеризации второй тяжелой цепи антитела к человеческому альфа-синуклеину представляет собой тяжелую цепь с «впадиной (согласно стратегии «knobs-into-holes».

Слитый полипептид антитела к человеческому альфа-синуклеину, указанный в настоящем описании, можно применять в качестве лекарственного средства, прежде всего для лечения неврологического нарушения, такого, например, как болезнь Паркинсона.

Слитый полипептид антитела к человеческому альфа-синуклеину, указанный в настоящем описании, можно применять для того, чтобы транспортировать антитело к человеческому альфа-синуклеину (эффекторный элемент для головного мозга) через гематоэнцефалический барьер.

В одном из вариантов осуществления изобретения тяжелая цепь антитела к человеческому альфа-синуклеину, которая сшита на ее С-конце Fc-области с scFab в качестве одновалентного связывающего элемента, который связывается с человеческим рецептором трансферрина, имеет следующую структуру в направлении от N- к С-концу:

тяжелая цепь IgG,

пептидный линкер, сшивающий С-конец Fc-области тяжелой цепи IgG с N-концом VL-домена scFab, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения пептидный линкер имеет аминокислотную последовательность GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41),

• вариабельный домен легкой цепи (VL) и С-каппа-домен легкой цепи scFab,

• пептидный линкер, сшивающий С-конец С-каппа-домена легкой цепи scFab с N-концом VH-домена scFab, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения пептидный линкер имеет аминокислотную последовательность (G₄S)₆GG (SEQ ID NO: 55),

• вариабельный домен тяжелой цепи (VH) антитела scFab и СН1-домен тяжелой цепи IgG.

В одном из вариантов осуществления изобретения тяжелая цепь антитела к человеческому альфа-синуклеину, которая сшита на ее С-конце Fc-области с scFv в качестве одновалентного связывающего элемента, который связывается с человеческим рецептором трансферрина, имеет следующую структуру в направлении от N- к С-концу:

• тяжелая цепь IgG,

• пептидный линкер, сшивающий С-конец Fc-области тяжелой цепи IgG с N-концом VL-домена scFv, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения пептидный линкер имеет аминокислотную последовательность

• вариабельный домен легкой цепи (VL),

• пептидный линкер, сшивающий С-конец вариабельного домена легкой цепи с N-концом VH-домена scFv, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения пептидный линкер представляет собой пептид, имеющий аминокислотную последовательность (G₄S)₆GG (SEQ ID NO: 55),

• вариабельный домен тяжелой цепи (VH) scFv-фрагмента антитела.

Другим объектом настоящего изобретения является слитый полипептид, предназначенный для транспортирования эффекторного элемента для головного мозга через гематоэнцефалический барьер, который содержит элемент СН2-СН3 Ig, пептидный линкер и один scFab или scFv, мишенью которого является рецептор гематоэнцефалического барьера, в котором scFab или scFv сшит с С-концом элемента СН2-СН3 Ig с помощью пептидного линкера.

В одном из вариантов осуществления изобретения челночный модуль для гематоэнцефалического барьера/scFab или scFv, мишенью которого является рецептор гематоэнцефалического барьера, получают из гуманизированного антитела 8D3 к рецептору трансферрина (см., например, Boado R.J. и др., Biotechnol. Bioeng. 102, 2009, cc. 1251-1258). Вариабельный домен мышиной тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность

Вариабельный домен мышиной легкой цепи (вариант 1) имеет аминокислотную последовательность

вариабельный домен мышиной легкой цепи (вариант 2) имеет аминокислотную последовательность

Один челночный модуль для гематоэнцефалического барьера

В одном из объектов изобретения слитый полипептид антитела к человеческому альфа-синуклеину содержит строго один челночный модуль для гематоэнцефалического барьера, где челночный модуль для гематоэнцефалического барьера содержит гуманизированные вариабельные домены мышиного антитела 8D3 к человеческому рецептору трансферрина, при этом челночный модуль для гематоэнцефалического барьера, содержащий гуманизированные вариабельные домены мышиного антитела 8D3 к человеческому рецептору трансферрина, транспортирует антитело к человеческому альфа-синуклеину через гематоэнцефалический барьер. Вариабельные домены антитела 8D3 к человеческому рецептору трансферрина имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 56 и 57.

Один или два челночных модуля для гематоэнцефалического барьера

В одном из объектов изобретения слитый полипептид антитела к человеческому альфа-синуклеину содержит один или два челночный(х) модул(ь)я для гематоэнцефалического барьера, где челночный модуль для гематоэнцефалического барьера получен из антитела, которое связывается с низкой аффинностью с рецептором гематоэнцефалического барьера (ГЭБ-R), при этом челночный модуль для гематоэнцефалического барьера, полученный из антитела, которое связывается с низкой аффинностью с рецептором гематоэнцефалического барьера, транспортирует антитело к человеческому альфа-синуклеину через гематоэнцефалический барьер.

В другом объекте изобретения ГЭБ-R выбирают из группы, состоящей из рецептора трансферрина (TfR), рецептора инсулина, рецептора инсулиноподобного фактора роста (IGF-R), белка 8, родственного рецептору липопротеинов низкой плотности (LRP1), белка 1, родственного рецептору липопротеинов низкой плотности (LRP8), и фактора роста, подобного гепаринсвязывающему эпидермальному фактору роста (HB-EGF). В другом указанном объекте изобретения ГЭБ-R представляет собой человеческий ГЭБ-R. В одном из указанных объектов изобретения ГЭБ-R представляет собой TfR. В другом указанном объекте изобретения ГЭБ-R представляет собой TfR и антитело не ингибирует активность TfR. В другом указанном объекте изобретения ГЭБ-R представляет собой TfR и антитело не ингибирует связывание TfR с трансферрином.

В другом объекте изобретения антитело не нарушает связывание ГЭБ-R с одним или несколькими его нативными лигандами. В другом указанном объекте изобретения антитело специфически связывается с рецептором человеческого трансферрина (hTfR) таким образом, что оно не ингибирует связывание hTfR с человеческим трансферрином.

В другом объекте изобретения антитело к ГЭБ-R характеризуется величиной IC₅₀ в отношении ГЭБ-R, составляющей от примерно 1 нМ до примерно 100 мкМ. В другом указанном объекте изобретения IC₅₀ составляет от примерно 5 нМ до примерно 100 мкМ. В другом указанном объекте изобретения IC₅₀ составляет от примерно 50 нМ до примерно 100 мкМ. В другом указанном объекте изобретения IC₅₀ составляет от примерно 100 нМ до примерно 100 мкМ. В другом указанном объекте изобретения антитело имеет аффинность к ГЭБ-R, составляющую от примерно 5 нМ до примерно 10 мкМ. В другом указанном объекте изобретения антитело, когда его сшивают с антителом к человеческому альфа-синуклеину, имеет аффинность к ГЭБ-R, составляющую от примерно 30 нМ до примерно 1 мкМ. В другом указанном объекте изобретения антитело, когда его сшивают с антителом к человеческому альфа-синуклеину, имеет аффинность к ГЭБ-R, составляющую от примерно 50 нМ до примерно 1 мкМ. В одном из объектов изобретения аффинность антитела к ГЭБ-R или слитого полипептида антитела к человеческому альфа-синуклеину к ГЭБ-R измеряют с помощью Скэтчарда. В другом объекте изобретения аффинность антитела к ГЭБ-R или слитого полипептида антитела к человеческому альфа-синуклеину к ГЭБ-R измеряют с помощью BIACORE-анализа. В другом объекте изобретения аффинность антитела к ГЭБ-R или слитого полипептида антитела к человеческому альфа-синуклеину к ГЭБ-R измеряют с помощью ELISA в условиях конкуренции.

Применение слитых полипептидов антител, содержащих челночный вектор для гематоэнцефалического барьера

Другим вариантом осуществления изобретения является способ повышения воздействия на ЦНС антитела к человеческому альфа-синуклеину, в котором антитело к человеческому альфа-синуклеину сшивают с антителом или фрагментом антитела, которое/который связывается с низкой аффинностью с ГЭБ-R, повышая тем самым воздействие на ЦНС антитела к человеческому альфа-синуклеину. В другом объекте изобретения повышение воздействия на ЦНС антитела к человеческому альфа-синуклеину измеряют относительно воздействия на ЦНС антитела к человеческому альфа-синуклеину, сшитого с типичным антителом, которое не обладает пониженной аффинностью к ГЭБ-R. В другом объекте изобретения повышение воздействия на ЦНС антитела к человеческому альфа-синуклеину измеряют по соотношению количества антитела к человеческому альфа-синуклеину, обнаруженного в ЦНС, относительно количества в сыворотке, обнаруженного после введения. В другом объекте изобретения повышение воздействия на ЦНС приводит к соотношению, превышающему 0,1%. В другом объекте изобретения повышение воздействия на ЦНС антитела к человеческому альфа-синуклеину измеряют относительно воздействия на ЦНС антитела к человеческому альфа-синуклеину в отсутствии сшитого антитела к ГЭБ-R. В другом объекте изобретения повышение воздействия на ЦНС антитела к человеческому альфа-синуклеину измеряют путем визуализации. В другом объекте изобретения повышение воздействия на ЦНС антитела к человеческому альфа-синуклеину измеряют на основе косвенных данных, таких как изменение одного или нескольких физиологических симптомов.

Предложен способ повышения удерживания в ЦНС антитела к человеческому альфа-синуклеину, введенного индивидууму, при котором антитело к человеческому альфа-синуклеину сшивают с антителом или фрагментом антитела, которое/который связывается с низкой аффинностью с ГЭБ-R, в результате чего удерживание в ЦНС антитела к человеческому альфа-синуклеину повышается.

Другим вариантом осуществления изобретения является способ оптимизации фармакокинетики и/или фармакодинамики антитела к человеческому альфа-синуклеину для обеспечения его эффективности в ЦНС индивидуума, при котором антитело к человеческому альфа-синуклеину сшивают с антителом или фрагментом антитела, которое/который связывается с низкой аффинностью с ГЭБ-R, в котором антитело или фрагмент антитела выбирают так, чтобы его аффинность к ГЭБ-R после сшивания с антителом к человеческому альфа-синуклеину приводила к уровню транспортирования антитела или фрагмента антитела, конъюгированного с антителом к человеческому альфа-синуклеину через ГЭБ, который оптимизирует фармакокинетику и/или фармакодинамику антитела к человеческому альфа-синуклеину в ЦНС.

Другим вариантом осуществления изобретения является способ лечения неврологического нарушения у млекопитающего, заключающийся в том, что обрабатывают млекопитающего антителом или фрагментом антитела, которое/который связывается с ГЭБ-R и которое/который сшито/сшит с антителом к человеческому альфа-синуклеина, в котором антитело выбирают так, чтобы оно обладало низкой аффинностью к ГЭБ-R, и повышают тем самым поглощение ЦНС антитела и сшитого с ним антитела к человеческому альфа-синуклеину. В одном из вариантов осуществления изобретения лечение приводит к снижению или элиминации симптомов нарушения. В другом объекте изобретения лечение приводит к облегчению неврологического нарушения.

В одном из вариантов осуществления всех указанных выше объектов изобретения антитело к ГЭБ-R характеризуется величиной IC₅₀ в отношении ГЭБ-R, составляющей от примерно 1 нМ до примерно 100 мкМ. В другом указанном объекте изобретения IC₅₀ составляет от примерно 5 нМ до примерно 100 мкМ. В другом указанном объекте изобретения IC₅₀ составляет от примерно 50 нМ до примерно 100 мкМ. В другом указанном объекте изобретения IC₅₀ составляет от примерно 100 нМ до примерно 100 мкМ. В другом указанном объекте изобретения антитело имеет аффинность к ГЭБ-R, составляющую от примерно 5 нМ до примерно 10 мкМ. В другом указанном объекте изобретения антитело, когда его сшивают с антителом к человеческому альфа-синуклеину, имеет аффинность к ГЭБ-R, составляющую от примерно 30 нМ до примерно 1 мкМ. В другом указанном объекте изобретения антитело, когда его сшивают с антителом к человеческому альфа-синуклеину, имеет аффинность к ГЭБ-R, составляющую от примерно 50 нМ до примерно 1 мкМ. В одном из объектов изобретения аффинность антитела к ГЭБ-R или слитого полипептида антитела к человеческому альфа-синуклеину к ГЭБ-R измеряют с помощью анализа Скэтчарда. В другом варианте осуществления изобретения аффинность антитела к ГЭБ-R или слитого полипептида антитела к человеческому альфа-синуклеину к ГЭБ-R измеряют с помощью BIACORE-анализа. В другом варианте осуществления изобретения аффинность антитела к ГЭБ-R или слитого полипептида антитела к человеческому альфа-синуклеину к ГЭБ-R измеряют с помощью ELISA в условиях конкуренции.

В другом варианте осуществления изобретения слитый полипептид антитела к человеческому альфа-синуклеину является меченым. В другом варианте осуществления изобретения антитело к ГЭБ-R или его фрагмент не влияет на связывание ГЭБ-R с одним или несколькими его нативными лигандами. В другом варианте осуществления изобретения, антитело к ГЭБ-R специфически связывается с hTfR таким образом, что не ингибирует связывание hTfR с человеческим трансферрином. В другом варианте осуществления изобретения слитый полипептид антитела к человеческому альфа-синуклеину вводят млекопитающему. В другом варианте осуществления изобретения млекопитающее представляет собой человека. В другом варианте осуществления изобретения млекопитающее имеет неврологическое нарушение. В другом варианте осуществления изобретения неврологическое нарушение выбирают из группы, состоящей из болезни Альцгеймера (AD), «удара», деменции, мышечной дистрофии (MD), рассеянного склероза (MS), амиотрофического бокового склероза (ALS), муковисцидоза, синдрома Ангельмана, синдрома Лиддла, болезни Паркинсона, болезни Пика, болезни Педжета, рака и травматического повреждения головного мозга.

Б. Методы рекомбинации и композиции

Антитела можно получать, используя методы рекомбинации и композиции, например, описанные в US 4816567. Одним из вариантов осуществления изобретения является выделенная(ые) нуклеиновая(ые) кислота(ы), кодирующая(ие) антитело(а), представленное(ые) в настоящем описании. Указанная нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, легкие и/или тяжелые цепи антитела). Следующим вариантом осуществления изобретения является(ются) один или несколько векторов (например, экспрессионных векторов), который(е) содержит(ат) указанную нуклеиновую кислоту. Еще одним вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, которая содержит указанную нуклеиновую кислоту. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин содержит (например, в результате трансформации указанными векторами): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО) или лимфоидную клетку (например, Y0-, NS0-, Sp20-клетку). Одним из вариантов осуществления изобретения является способ получения антитела к человеческому альфа-синуклеину, заключающийся в том, что культивируют клетку-хозяина, содержащую нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело, описанное выше, в условиях, пригодных для экспрессии антитела, и необязательно выделяют антитело из клетки-хозяина (или среды для культивирования клетки-хозяина).

Для рекомбинантного получения антитела к человеческому альфа-синуклеину нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, описанное выше, выделяют и встраивают в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Указанную нуклеиновую кислоту легко можно выделять и секвенировать с использованием общепринятых процедур (например, путем использования олигонуклеотидных зондов, которые обладают способностью специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела).

Приемлемые клетки-хозяева для клонирования или экспрессии кодирующих антитело векторов включают прокариотические или эукариотические клетки, представленные в настоящем описании. Например, антитела можно получать в бактериях, в частности, когда не требуется гликозилирование и связанная с Fc эффекторная функция. Сведения об экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактериях см. например, в US 5648237, US 5789199 и US 5840523 (см. также у Charlton K.А. в: Methods in Molecular Biology, под ред. Lo В.K.С., изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, cc. 245-254 описание экспрессии фрагментов антител в Е. coli.) После экспрессии антитело можно выделять из пасты бактериальных клеток в виде растворимой фракции и можно дополнительно очищать.

Помимо прокариотических организмов в качестве хозяев, пригодных для клонирования или экспрессии плазмид, которые кодируют антитела, можно использовать эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что позволяет получать антитело с частично или полностью человеческой схемой гликозилирования (см. Gerngross, Nat. Biotech. 22, 2004, cc. 1409-1414 и Li и др., Nat. Biotech. 24, 2006, cc. 210-215).

Клетки-хозяева, которые можно использовать для экспрессии гликозилированного антитела, получают также из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных животных). Примерами клеток беспозвоночных являются клетки насекомых, а также можно применять клетки растений. Были выявлены многочисленные штаммы бакуловирусов и соответствующие пригодные для них в качестве хозяев клетки насекомых, прежде всего для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

В качестве хозяев можно применять также культуры растительных клеток (см., например, US 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описание технологии PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях).

В качестве хозяев можно применять также клетки позвоночных. Например, можно использовать клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы к росту в суспензии. Другими примерами приемлемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная с помощью ОВ40 (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (HEK 293-клетки или клетки линии 293, описанные, например, у Graham и др., J. Gen. Virol., 36, 1977, сс. 59-74); клетки почки детеныша хомяка (ВНК); клетки Сертоли мыши (ТМ4-клетки, описанные, например, у Mather, Biol. Reprod., 23, 1980, сс. 243-251); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76,); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени бычьей крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, описанные, например, у Mather и др., Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 1982, сс. 44-68); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другими ценными линиями клеток-хозяев млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая DHFR^--СНО-клетки (Urlaub и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, сс. 4216-4220); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор конкретных линий клеток-хозяев млекопитающих, которые можно применять для производства антител, см., например, у Yazaki и Wu, в: Methods in Molecular Biology под ред. В.K.С. Lo, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, сс. 255-268.

В. Анализы

Представленные в настоящем описании антитела к человеческому альфа-синуклеину можно идентифицировать, осуществлять их скрининг или характеризовать их физические/химические свойства и/или виды биологической активности с помощью различных анализов, известных в данной области.

Анализы связывания и другие анализы

Согласно одному из объектов изобретения антитело, предложенное в изобретении, тестируют в отношении его антигенсвязывающей активности, например, с помощью известных методов, таких как ELISA, AlphaLISA®, Вестерн-блоттинг, с использованием массива антитела или обращенных фаз и т.д.

В приведенном в качестве примера анализе ELISA или AlphaLISA альфа-синуклеин в растворе (клеточный супернатант, лизаты клеток или тканей, жидкости организма и т.д.) связывают с помощью захватывающего антитела, которое специфически связывается с первым эпитопом альфа-синуклеина, или альфа-синуклеин в определенной конформации и идентифицирующее антитело сшивают с идентифицирующим элементом, который специфически связывается со вторым эпитопом или конформацией альфа-синуклеина. Данные получают с помощью идентифицирующего элемента (хемилюминесценция, флуоресценция, индуцируемая переносом энергии люминесценцией и т.д.). В некоторых случаях одно и то же антитело можно использовать в одном и том же анализе в качестве и захватывающего (иммобилизованного) антитела, и идентифицирующего антитела для выявления агрегированных форм альфа-синуклеина (см., например, Tokuda Т. и др., Neurology 75, 2010, cc. 1766-1772).

В случае применения массива антител антитела наносят пятнами на стеклянные или нитроцеллюлозные чипы. Слайды блокируют и инкубируют с содержащим альфа-синуклеин раствором, промывают для удаления несвязанных антител и связанные антитела выявляют с помощью флуоресцентно меченного соответствующего вторичного антитела. Флуоресцентный сигнал измеряют с помощью флуоресцентного слайд-сканера. Аналогично этому, в случае применения массивов обратных фаз рекомбинантный альфа-синуклеин, клеточный супернатант, лизаты клеток или тканей, жидкости организма и т.д. наносят пятнами на стеклянные или нитроцеллюлозные чипы. Слайды блокируют и индивидуальные массивы инкубируют с антителом к специфическому эпитопу альфа-синуклеина. Несвязанные антитела отмывают и связанные антитела выявляют с помощью флуоресцентно меченного соответствующего вторичного антитела. Флуоресцентный сигнал измеряют с помощью флуоресцентного слайд-сканера (Dernick G. и др., J. Lipid Res. 52, 2011, cc. 2323-2331).

В приведенном в качестве примера анализа методом Вестерн-блоттинга агрегированный рекомбинантный альфа-синуклеин или альфа-синуклеин, полученный из клеточного супернатанта, лизатов клеток или тканей, жидкостей организма и т.д., разделяют на основе молекулярной массы с помощью ДСН-ПААГ или в нативных условиях применения геля и блоттируют на нитроцеллюлозную мембрану или ПВДФ-мембрану. После блокирования мембрану инкубируют с антителами, специфическими в отношении аминокислотной последовательности или конформаций альфа-синуклеина. Затем мембрану промывают для удаления несвязанного антитела. Связанные антитела выявляют с помощью соответствующих вторичных антител, сшитых с идентифицирующими субстанциями, предназначенными для хемилюминесцентной или флуоресцентной, или других путей детекции. Антитела, специфические в отношении аминокислотных последовательностей альфа-синуклеина, могут связываться с альфа-синуклеином в различных агрегированных формах, и поэтому молекулярные массы, а также эпитопы не маскируются при агрегации. С другой стороны, специфические в отношении конформаций антитела могут выявлять только определенные агрегированные формы альфа-синуклеина, осуществляя обнаружение только полос, соответствующих конкретным молекулярным массам (см., например, Towbin Н. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1979, cc. 4350-4353; Burnette W.N., Anal. Biochem. 112, 1981, cc. 195-203).

В другом объекте изобретения анализы в условиях конкуренции можно применять для идентификации антитела, которое конкурирует с антителом 0017, антителом 0018 или антителом 0081 за связывание с человеческим альфа-синуклеином. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное конкурирующее антитело связывается с таким же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), с которым связывается антитело, обозначенное в настоящем описании как антитело 0017, антитело 0018 и антитело 0081. Подробное описание приведенных в качестве примера методов картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлены в Epitope Mapping Protocols, в: Methods in Molecular Biology, под ред. Morris G.E., т. 66, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, 1996.

В приведенном в качестве примера анализа в условиях конкуренции иммобилизованный человеческий альфа-синуклеин инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с человеческим альфа-синуклеином (например, антитело 0017, антитело 0018 или антитело 0081), и второе немеченое антитело, у которого определяют способность конкурировать с первым антителом за связывание с человеческим альфа-синуклеином. В качестве контроля иммобилизованный человеческий альфа-синуклеин инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не второе немеченое антитело. После инкубации в условиях, приемлемых для связывания первого антитела с человеческим альфа-синуклеином, избыток несвязанного антитела удаляют и измеряют количество метки, ассоциированной с иммобилизованным человеческим альфа-синуклеином. Если количество метки, ассоциированной с иммобилизованным человеческим альфа-синуклеином, существенно снижается в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это свидетельствует о том, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с человеческим альфа-синуклеином (см., например, Harlow Е. и Lane D., Antibodies: A Laboratory Manual, глава 14, Cold Spring Harbor Laboratory, изд-во Cold Spring Harbor, NY, 1988).

2. Анализы активности

Одним из объектов изобретения являются анализы, предназначенные для идентификации антител к человеческому альфа-синуклеину, которые обладают биологической активностью. Биологическая активность может включать, например, защиту от/снижение/ингибирование индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности и/или защиту от/снижение/ингибирование переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина, и/или снижение индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности в человеческих нервных клетках. Предложены также антитела, обладающие указанной биологической активностью in vivo и/или in vitro.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, тестируют в отношении указанной биологической активности.

Защитную биологическую активность можно оценивать, добавляя кондиционированную среду, содержащую секретированный альфа-синуклеин, что вызывает клеточную гибель нервных клеток-реципиентов. Указанную токсичность можно устранять путем добавления защитных антител, указанных в настоящем описании. Токсическая природа секретируемого альфа-синуклеина была установлена ранее (Emmanouilidou Е. и др., J. Neurosci., 30, 2010, сс. 6838-6851).

Г. Способы и композиции для диагностирования и детекции

В некоторых вариантах осуществления изобретения любое из антител к человеческому альфа-синуклеину, представленное в настоящем описании, можно применять для выявления присутствия человеческого альфа-синуклеина в биологическом образце. Понятие «выявление (обнаружение, детекция)» в контексте настоящего описания включает количественное или качественное определение. В конкретных вариантах осуществления изобретения биологический образец представляет собой клетку или ткань, такую как ткань головного мозга.

Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, предназначенное для применения в способе диагностирования или выявления. Следующим объектом изобретения является способ выявления присутствия в биологическом образце человеческого альфа-синуклеина. В конкретных вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что приводят в контакт биологический образец с антителом к человеческому альфа-синуклеину, представленным в настоящем описании, в условиях, пригодных для связывания антитела к человеческому альфа-синуклеину с человеческим альфа-синуклеином, и выявляют образование комплекса между антителом к человеческому альфа-синуклеину и человеческим альфа-синуклеином. Указанный способ может представлять собой способ in vitro или in vivo. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к человеческому альфа-синуклеину применяют для отбора индивидуумов, которых можно лечить с помощью антител к человеческому альфа-синуклеину, например, если человеческий альфа-синуклеин является биомаркером для отбора пациентов.

Примеры нарушений, которые можно диагностировать с использованием антитела, предлагаемого в изобретении, включают нейродегенерацию с накоплением железа в головном мозге типа 1 (NBIA1), чистую вегетативную (автономную) недостаточность, синдром Дауна, комплекс Гуам и несколько нарушений с тельцами Леви, таких как болезнь диффузных телец Леви (DLBD), вариант с тельцами Леви болезни Альцгеймера (LBVAD), некоторые формы болезни Гоше и связанную с болезнью Паркинсона деменцию (PDD). В некоторых вариантах осуществления изобретения применяют меченые антитела к человеческому альфа-синуклеину. Метки представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) метки или фрагменты, которые выявляют непосредственно (такие как флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также фрагменты, такие как ферменты или лиганды, которые выявляют косвенным путем, например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Примерами меток являются (но, не ограничиваясь только ими) радиоизотопы ³²Р, ¹⁴С, ¹²⁵I, ³Н и ¹³¹I, флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люцифераза светляка и бактериальная люцифераза (US 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидаза из хрена (HRP), щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, оксидазы сахарина, например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, оксидазы гетероциклических соединений, такие как уреказа и ксантиноксидаза, комплексы с ферментом, в которых применяют перекись водорода для окисления предшественника красителя, такого, например, как HRP, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спин-метки, бактериофаги в качестве меток, стабильные свободные радикалы и т.п.

Д. Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции антитела к человеческому альфа-синуклеину, представленного в настоящем описании, получают путем смешения указанного антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. A. Osol, 1980) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, они включают (но, не ограничиваясь только ими) буферы, такие как фосфатный, цитратный, ацетатный буферы, а также буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и мета-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (содержащие менее приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; содержащие металл комплексы (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). В контексте настоящего описания фармацевтически приемлемые носители включают также диспергирующие агенты интерстициальных лекарственных средств, такие как растворимые активные в нейтральной среде гликопротеины гиалуронидаз (sHASEGP), например, человеческие растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX^®, фирма Baxter International, Inc.). Некоторые примеры sHASEGP и методы их применения, в том числе rHuPH20, описаны в публикациях патентов США 2005/0260186 и 2006/0104968. Согласно одному из объектов изобретения sHASEGP объединяют с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.

Примеры лиофилизированных композиций антител описаны в US 6267958. Водные композиции антител включают композиции, описанные в US 6171586 и WO 2006/044908, последние композиции включают гистидин-ацетатный буфер.

Композиция, представленная в настоящем описании, может содержать также более одного действующего вещества, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению показания, предпочтительно вещества, обладающие дополнительными видами активности, которые не оказывают вредного воздействия друг на друга. Например, может оказаться желательным, применять указанные дополнительные ингредиенты [см. список лекарственных средств, которые можно объединять с антителом к человеческому альфа-синуклеину]. Указанные действующие вещества могут присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для указанных целей. Действующие вещества можно включать также в микрокапсулы, например, полученные с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации, например в гидроксипропилметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы введения лекарственного средства (например в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. A. Osol, 1980.

Можно приготавливать препараты с замедленным высвобождением. Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, включающие антитело, такие матрицы представляют собой изделия определенной формы, например, пленки или микрокапсулы.

Композиции, предназначенные для применения in vivo, как правило, должны быть стерильными. Это легко можно осуществлять путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

Е. Терапевтические способы и композиции

Любое из указанных в настоящем описании антител к человеческому альфа-синуклеину можно применять в терапевтических способах. Одним из объектов изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, предназначенное для применения в качестве лекарственного средства. Следующими объектами изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, предназначенное для применения для лечения болезни Паркинсона. Конкретными вариантами осуществления изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, предназначенное для применения в способе лечения. Конкретными вариантами осуществления изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, предназначенное для применения в способе лечения индивидуума, который имеет болезнь Паркинсона, заключающемся в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело к человеческому альфа-синуклеину. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения способ заключается также в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, указанное ниже. Дополнительными вариантами осуществления изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, предназначенное для применения для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах или глиальных клетках или ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками, или снижения индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности. Конкретными вариантами осуществления изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, предназначенное для применения в способе ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах или глиальных клетках или ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками, или снижения индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности у индивидуума, заключающемся в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело к человеческому альфа-синуклеину для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах или глиальных клетках или ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками, или снижения индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности. «Индивидуум» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения предпочтительно представляет собой человека.

Следующим объектом изобретения является применение антитела к человеческому альфа-синуклеину для производства или приготовления лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения болезни Паркинсона. В следующем варианте осуществления изобретения лекарственное средство применяют в способе лечения болезни Паркинсона, заключающемся в том, индивидууму, который имеет болезнь Паркинсона, вводят в эффективном количестве лекарственное средство. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения способ заключается также в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, указанное ниже. В дополнительном варианте осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах или глиальных клетках или ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками, или снижения индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности. В другом варианте осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для применения в способе ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах или глиальных клетках или ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками, или снижения индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности у индивидуума, заключающемся в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело к человеческому альфа-синуклеину для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах или глиальных клетках или ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками, или снижения индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности. «Индивидуум» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения может представлять собой человека.

Следующим объектом изобретения является способ лечения болезни Паркинсона. В одном из вариантов осуществления изобретения способ заключается в том, что вводят индивидууму, который имеет болезнь Паркинсона, в эффективном количестве антитело к человеческому альфа-синуклеину. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения способ заключается также в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, указанное ниже. «Индивидуум» в контексте любого из указанных выше вариантов осуществления изобретения может представлять собой человека.

Следующим объектом изобретения является способ ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах или глиальных клетках или ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками, или снижения индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности у индивидуума. В одном из вариантов осуществления изобретения способ заключается в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело к человеческому альфа-синуклеину для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах или глиальных клетках или ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками, или снижения индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности. В одном из вариантов осуществления изобретения «индивидуум» представляет собой человека.

Следующим объектом изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие любое из антител к человеческому альфа-синуклеину, представленных в настоящем описании, например, для применения в любом из терапевтических способов. В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любое из антител к человеческому альфа-синуклеину, представленных в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любое из антител к человеческому альфа-синуклеину, представленных в настоящем описании, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, указанное ниже.

Антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять для лечения либо индивидуально, либо в комбинации с другими агентами. Например, антитело, предлагаемое в изобретении, можно применять совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим средством.

Указанные упомянутые выше комбинированные терапии включают совместное введение (при котором два или большее количество терапевтических средств включают в одну и ту же или различные препаративные формы), и раздельное введение, в этом случае введение антитела, предлагаемого в изобретении, можно осуществлять до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического средства или средств. В одном из вариантов осуществления изобретения введение антитела к человеческому альфа-синуклеину и введение дополнительного терапевтического средства осуществляют в пределах примерно одного месяца или примерно одной, двух или трех недель, или примерно одного, двух, трех, четырех, пяти или шести дней друг за другом.

Антитело, предлагаемое в изобретении (и любое дополнительное терапевтическое средство), можно вводить любыми приемлемыми путями, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное введение и при необходимости в случае местной обработки введение в повреждение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование можно осуществлять любым приемлемым путем, например, с помощью инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, в зависимости, в том числе от того, является ли введение кратковременным или длительным. Согласно настоящему изобретению различные схемы введения включают (но, не ограничиваясь только ими) однократные или многократные введения в различные моменты времени, болюсное введение и импульсную инфузию.

Антитела, предлагаемые в изобретении, можно включать в состав композиций, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей клинической практикой. Рассматриваемые в этом контексте факторы включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину заболевания, область введения агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медикам. Антитело можно, но это не является обязательным, включать в композицию в сочетании с одним или несколькими другими агентами, которые в настоящее время применяют для предупреждения или лечения рассматриваемого заболевания. Эффективное количество указанных других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в композиции, типа нарушения или лечения и других указанных выше факторов. Их, как правило, применяют в таких же дозах и с использованием таких же путей введения, которые указаны в настоящем описании, или в количестве, составляющем примерно от 1 до 99% от дозы, указанной в настоящем описании, или в любой дозе и с помощью любого пути, который по данным эмпирической/клинической оценки является пригодным.

Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая доза антитела представленного в настоящем описании (при его применении индивидуально или в сочетании с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими средствами), должна зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, серьезности и течения болезни, применяют ли антитело для профилактических или терапевтических целей, предшествующей терапии, истории болезни пациента и ответа на антитело, а также предписания лечащего врача. Антитело можно вводить пациенту однократно или в виде серий обработок. В зависимости от типа и серьезности заболевания примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,5-10 мг/кг) антитела может представлять собой начальную возможную дозу для введения пациенту, например, с помощью одной или нескольких отдельных обработок или с помощью непрерывной инфузии. Одним из примеров типичных суточных доз может являться доза, составляющая от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. При использовании повторных введений в течение нескольких дней или более длительного периода времени, в зависимости от состояния, лечение, как правило, следует продолжать до достижения подавления симптомов заболевания. Одним из примеров доз антитела является доза, составляющая от примерно 0,05 до примерно 10 мг/кг. Так, пациенту можно вводить одну или несколько следующих доз: примерно 0,5, 2,0, 4,0 или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Указанные дозы можно вводить дробно, например, каждую неделю или каждые три недели (например, так, чтобы пациент получал от примерно двух до примерно двадцати, например, примерно шесть доз антитела). Можно применять начальную повышенную ударную дозу с последующим введением одной или нескольких более низких доз. С помощью общепринятых методов и анализов можно легко осуществлять мониторинг действия указанной терапии.

Очевидно, что любые из вышеуказанных композиций или терапевтических способов можно применять с использованием иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, вместо или в дополнение к антителу к человеческому альфа-синуклеину.

III. Изделия

Другим объектом изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения, предупреждения и/или диагностирования указанных выше нарушений. Изделие представляет собой контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковку, которые размещены на контейнере или вложены в него. Приемлемыми контейнерами являются, например банки, пузырьки, шприцы, пакеты для внутривенного раствора и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая сама или в сочетании с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностирования состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для IV-раствора или пузырек, снабженный пробкой, которую можно прокалывать с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет антитело, указанное в настоящем описании. На этикетке или листовке-вкладыше в упаковку указано, что композицию применяют для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может включать (а) первый контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит антитело, представленное в настоящем описании; и (б) второй контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит дополнительное цитотоксическое или иное терапевтическое средство. Согласно этому варианту осуществления изобретения изделие может содержать листовку-вкладыш в упаковку, которая содержит информацию о том, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. В альтернативном или дополнительном варианте изделие может дополнительно включать второй (или третий) контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в частности, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Как должно быть очевидно, любое из указанных выше изделий может включать иммуноконъюгат, предлагаемый в изобретении, вместо или в дополнение к антителу человеческому альфа-синуклеину.

IV. Конкретные варианты осуществления изобретения

1. Антитело, которое специфически связывается с человеческим альфа-синуклеином, где антитело

III) снижает индуцируемую альфа-синуклеином каспазную активность в LUHMES-клетках.

2. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что каспазная активность представляет собой активность каспазы 3 и/или каспазы 7.

3. Антитело по одному из п.п. 1-2, отличающееся тем, что антитело предназначено для применения для лечения синуклеинопатий.

4. Антитело по п. 3, отличающееся тем, что антитело предназначено для применения для лечения болезни Паркинсона.

5. Антитело по одному из п.п. 1-4, отличающееся тем, что антитело специфически связывается с пептидом, который состоит из аминокислотной последовательности GKNEEGAPQEG (SEQ ID NO: 01).

6. Антитело по одному из п.п. 1-5, отличающееся тем, что антитело имеет аффинность связывания с мономерным человеческим альфа-синуклеином, составляющую менее чем 10Е-09М и более чем 10Е-07М.

7. Антитело по одному из п.п. 1-6, отличающееся тем, что антитело специфически связывается с мономерным и олигомерным человеческим альфа-синуклеином и не связывается с фибриллярным человеческим альфа-синуклеином.

8. Антитело по одному из п.п. 1-7, отличающееся тем, что антитело содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 02-04, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 05-07.

9. Антитело по одному из п.п. 1-7, отличающееся тем, что антитело содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 08, 09 и 04, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 10-12.

10. Антитело по одному из п.п. 8-9, отличающееся тем, что антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 13, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 14.

11. Антитело по одному из п.п. 1-10, отличающееся тем, что антитело получено путем гуманизации антитела, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 13, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 14.

12. Антитело по одному из п.п. 1-7, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 02-04, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 05-07, в котором в каждом из HVR вплоть до 3 аминокислотных остатков могут быть заменены.

13. Антитело по одному из п.п. 1-7, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 08, 09 и 04, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 10-12, в котором в каждом из HVR вплоть до 3 аминокислотных остатков могут быть заменены.

14. Антитело по одному из п.п. 1-7 и 12-13, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное антитело и вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой гуманизированную форму (происходит из) вариабельного домена тяжелой цепи, состоящего из SEQ ID NO: 13, и вариабельный домен легкой цепи представляет собой гуманизированную форму (происходит из) вариабельного домена легкой цепи, состоящего из SEQ ID NO: 14.

15. Антитело по одному из п.п. 1-4, отличающееся тем, что антитело связывается с таким же эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

16. Антитело по одному из п.п. 1-4, отличающееся тем, что антитело связывается с таким же эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25.

17. Антитело по одному из п.п. 15 и 16, отличающееся тем, что антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 27.

18. Антитело по одному из п.п. 1-4, отличающееся тем, что антитело получено путем гуманизации антитела, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 27.

19. Антитело по одному из п.п. 1-4, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20, в котором в каждом из HVR вплоть до 3 аминокислотных остатков могут быть заменены.

20. Антитело по одному из п.п. 1-4, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25, в котором в каждом из HVR вплоть до 3 аминокислотных остатков могут быть заменены.

21. Антитело по одному из п.п. 1-4 и 19-20, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное антитело и вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой гуманизированную форму (происходит из) вариабельного домена тяжелой цепи, состоящего из SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи представляет собой гуманизированную форму (происходит из) вариабельного домена легкой цепи, состоящего из SEQ ID NO: 27.

22. Антитело по одному из п.п. 1-4, отличающееся тем, что антитело связывается с таким же эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 28-30, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 31-33.

23. Антитело по одному из п.п. 1-4, отличающееся тем, что антитело связывается с таким же эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 28, 34 и 30, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 35-37.

24. Антитело по одному из п.п. 22-23, отличающееся тем, что антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 38, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 39.

25. Антитело по одному из п.п. 1-4, отличающееся тем, что антитело получено путем гуманизации антитела, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 38, и вариабельный домен легкой цепи, состоящий из SEQ ID NO: 39.

26. Антитело по одному из п.п. 1-4, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 28-30, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 31-33, в котором в каждом из HVR вплоть до 3 аминокислотных остатков могут быть заменены.

27. Антитело по одному из п.п. 1-4, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 28, 34 и 30, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 35-37, в котором в каждом из HVR вплоть до 3 аминокислотных остатков могут быть заменены.

28. Антитело по одному из п.п. 1-4 и 26-27, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное антитело и вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой гуманизированную форму (происходит из) вариабельного домена тяжелой цепи, состоящего из SEQ ID NO: 38, и вариабельный домен легкой цепи представляет собой гуманизированную форму (происходит из) вариабельного домена легкой цепи, состоящего из SEQ ID NO: 39.

29. Антитело по одному из п.п. 1-4 и 15-28, отличающееся тем, что антитело специфически связывается с фибриллярным человеческим альфа-синуклеином и не связывается с нефибриллярным человеческим альфа-синуклеином.

30. Антитело по одному из п.п. 1-29, отличающееся тем, что антитело конъюгировано с челночным модулем для гематоэнцефалического барьера.

31. Антитело по п. 30, отличающееся тем, что челночный модуль для гематоэнцефалического барьера представляет собой антитело или фрагмент антитела, которое/который специфически связывается с LRP1, LRP8, рецептором человеческого трансферрина или рецептором человеческого инсулиноподобного фактора роста.

32. Антитело по одному из п.п. 1-31, отличающееся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.

33. Антитело по одному из 1-32, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное антитело или химерное антитело.

34. Антитело по одному из п.п. 1-33, отличающееся тем, что антитело представляет собой фрагмент антитела, который связывается с человеческим альфа-синуклеином и

35. Антитело по одному из п.п. 1-34, отличающееся тем, что антитело представляет собой

д) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в соответствующей другой тяжелой цепи, или

е) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4 с мутациями S228P и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в соответствующей другой тяжелой цепи.

36. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по одному из п.п. 1-35.

37. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 36.

38. Способ получения антитела, заключающийся в том, что осуществляют стадию, на которой культивируют клетку-хозяина по п. 37 с получением антитела.

39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что способ включают также стадию, на которой выделяют антитело из клетки или культуральной среды.

40. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по одному из п.п. 1-35 и фармацевтически приемлемый носитель.

41. Фармацевтическая композиция по п. 40, отличающаяся тем, что содержит также дополнительное терапевтическое средство.

42. Антитело по одному из п.п. 1-35, предназначенное для применения в качестве лекарственного средства.

43. Антитело по одному из п.п. 1-35, предназначенное для применения для лечения синуклеинопатии.

44. Антитело по одному из п.п. 1-35, предназначенное для применения для лечения болезни Паркинсона.

45. Антитело по одному из п.п. 1-35, предназначенное для применения для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах и глиальных клетках.

46. Антитело по одному из п.п. 1-35, предназначенное для применения для ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками.

47. Антитело по одному из п.п. 1-35, предназначенное для применения для снижения индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности в нервных клетках или глиальных клетках.

48. Применение антитела по одному из п.п. 1-35 для приготовления лекарственного средства.

49. Применение по п. 48, в котором лекарственное средство предназначено для лечения болезни Паркинсона.

50. Применение по п. 48, в котором лекарственное средство предназначено для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах и глиальных клетках.

51. Применение по п. 48, в котором лекарственное средство предназначено для ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками.

52. Применение по п. 48, в котором лекарственное средство предназначено для снижения индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности в нервных клетках или глиальных клетках.

53. Способ лечения индивидуума, который имеет болезнь Паркинсона, заключающийся в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело по одному из п.п. 1-35.

54. Способ ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах и глиальных клетках у индивидуума, заключающийся в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело по одному из п.п. 1-35 для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах и глиальных клетках.

55. Способ ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками у индивидуума, заключающийся в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве антитело по одному из п.п. 1-35 для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах и глиальных клетках.

56. Применение антитела к человеческому альфа-синуклеину по одному из п.п. 1-35 для ингибирования индуцируемой альфа-синуклеином цитотоксичности в человеческих нейронах и глиальных клетках.

57. Применение антитела к человеческому альфа-синуклеину по одному из п.п. 1-35 для ингибирования переноса от клетки к клетке олигомерного человеческого альфа-синуклеина между нейронами и глиальными клетками.

58. Применение антитела к человеческому альфа-синуклеину по одному из п.п. 1-35 для снижения индуцируемой альфа-синуклеином каспазной активности в нервных клетках или глиальных клетках.

59. Антитело, которое специфически связывается с человеческим альфа-синуклеином и содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, выбранные из

IV) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; (б) HVR-H2 который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или

VI) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; и (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.

60. Антитело, которое специфически связывается с человеческим альфа-синуклеином и содержит в качестве последовательности HVR VH

61. Антитело по одному из п.п. 59-60, отличающееся тем, что содержит также по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, выбранные из

62. Антитело по п. 60, отличающееся тем, что содержит также в качестве последовательностей HVR VL

63. Антитело, которое специфически связывается с человеческим альфа-синуклеином и содержит в качестве последовательностей HVR

I) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 04; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 07, или

II) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 08; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 09; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 04; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, или

V) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, или

VI) (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.

64. Антитело, специфически связывающееся с человеческим альфа-синуклеином, где человеческий альфа-синуклеин имеет свободный N-концевой остаток метионина.

65. Антитело по п. 64, где антитело специфически связывается с человеческим или мышиным альфа-синуклеином, где человеческий и мышиный альфа-синуклеин имеет свободный N-концевой остаток метионина.

66. Антитело по одному из п.п. 64-65, где альфа-синуклеин представляет собой мономерный альфа-синуклеин.

67. Антитело по одному из п.п. 64-65, где альфа-синуклеин представляет собой олигомерный альфа-синуклеин.

68. Антитело по одному из п.п. 64-67, где альфа-синуклеин представляет собой мономерный и олигомерный альфа-синуклеин.

69. Антитело по одному из п.п. 64-68, где антитело связывается с таким же эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

70. Антитело по одному из п.п. 64-69, где антитело связывается с таким же эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25.

71. Антитело по одному из п.п. 64-70, где антитело связывается с таким же эпитопом, что и антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

72. Антитело по одному из п.п. 64-68, где антитело содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

73. Антитело по одному из п.п. 64-68, где антитело содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25.

74. Антитело по одному из п.п. 64-68, где антитело получено путем гуманизации антитела, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

75. Антитело по одному из п.п. 64-68, где антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20, в котором в каждом из HVR от 0 до 3 аминокислотных остатков заменены.

76. Антитело по одному из п.п. 64-68, где антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17 и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25, в котором в каждом из HVR от 0 до 3 аминокислотных остатков заменены.

77. Антитело по одному из п.п. 64-68, где антитело представляет собой гуманизированное антитело и вариабельный домен тяжелой цепи которого получен из вариабельного домена тяжелой цепи, имеющего SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи получен из вариабельного домена легкой цепи, имеющего SEQ ID NO: 27.

78. Антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

79. Антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

80. Антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25.

81. Антитело (вариант), полученное из антитела, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

82. Антитело по одному из п.п. 64-68, где антитело представляет собой гуманизированное антитело, полученное путем гуманизации антитела, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

83. (Гуманизированное) антитело, которое содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20, в котором в каждом HVR от 0 до 3 аминокислотных остатков заменены.

84. (Гуманизированное) антитело, которое содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25, в котором в каждом HVR от 0 до 3 аминокислотных остатков заменены.

85. (Гуманизированное) антитело, вариабельный домен тяжелой цепи которого получен из вариабельного домена тяжелой цепи, имеющего SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи получен из вариабельного домена легкой цепи, имеющего SEQ ID NO: 27.

86. Антитело по одному из п.п. 64-85, где антитело конъюгировано с челночным модулем для гематоэнцефалического барьера.

87. Антитело по п. 86, где челночный модуль для гематоэнцефалического барьера представляет собой антитело или фрагмент антитела, которое/который специфически связывается с LRP1, LRP8, рецептором человеческого трансферрина или рецептором человеческого инсулиноподобного фактора роста.

88. Антитело по одному из п.п. 64-87, где антитело представляет собой моноклональное антитело.

89. Антитело по одному из п.п. 64-88, где антитело представляет собой гуманизированное антитело или химерное антитело.

90. Антитело по одному из п.п. 64-89, где антитело представляет собой

91. Антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

92. Антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

93. Антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

94. Антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

95. Антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

96. Антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

97. Антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

98. Антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

99. Антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

100. Антитело по одному из п.п. 94-99, где фрагмент антитела, который специфически связывается с рецептором человеческого трансферрина, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, который представляет собой гуманизированную форму вариабельного домена тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 56, и вариабельный домен легкой цепи, который представляет собой гуманизированную форму вариабельного домена легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 57.

101. Антитело по одному из п.п. 64-100, где антитело

V. Примеры

Ниже приведены примеры методов и композиций, предлагаемых в изобретении. Как должно быть очевидно, на практике можно применять различные другие варианты осуществления изобретения с учетом представленного выше общего описания изобретения.

Материалы и методы

Методы рекомбинантной ДНК

Для манипуляций с ДНК применяли стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии применяли согласно инструкциям производителя.

Синтез генов и олигонуклеотидов

Требуемые генные сегменты получали путем химического синтеза на фирме Geneart GmbH (Регенсбург, Германия). Синтезированные фрагменты генов клонировали для размножения/амплификации в плазмиде для Е. coli. ДНК-последовательности субклонированных фрагментов генов подтверждали с помощью секвенирования ДНК. Альтернативно этому, короткие синтетические ДНК-фрагменты собирали с помощью отжига с использованием химически синтезированных олигонуклеотидов или в помощью ПЦР. Соответствующие олигонуклеотиды получали на фирме Metabion GmbH (Планег-Мартинсрид, Германия).

Реагенты

Все поступающие в продажу химические вещества, антитела и наборы применяли согласно протоколу производителя, если не указано иное.

Клеточные клоны

Антитело 0017, т.е. ASYN-233HC_110-IV, т.е. aSyn.S019.006A08;

антитело 0018, т.е. ASYN-064HC_110-II, т.е. aSyn.S003.006A11;

антитело 0081, т.е. ASYN-235HC_110-IV, т.е. aSyn.S019.005A08;

антитело 0070, т.е. антитело 0017 + челночный модуль для гематоэнцефалического барьера;

антитело 0076, т.е. антитело 0018 + челночный модуль для гематоэнцефалического барьера.

Пример 1

Получение антигена

Материалы

Белки:

- лиофилизированный человеческий альфа-синуклеин дикого типа (аликвоты 100 мкг, 200 мкг или 500 мкг);

- человеческий ТР-мутантный альфа-синуклеин (8,2 мг/мл, полученный путем диализа в противотоке 50 мМ HEPES/100 мМ NaCl).

Буферы и растворы (хранили при комнатной температуре в защищенном от действия прямых солнечных лучей месте):

- РВ-маточный раствор (5×): 250 мМ фосфатный буфер, рН 7,0 (профильтрованный через фильтр с размером пор 0,22 мкм);

- EtOH-маточный раствор: этанол абсолютный с чистотой, пригодной для анализов (EMSURE) (фирма Merck; каталожный №1.00989.1000);

- вода чистоты, пригодной для ЖХВР (LiChrosolv, фирма Merck);

- 50 мМ HEPES/100 мМ NaCl, рН 7,4 (профильтрованный через фильтр с размером пор 0,22 мкм);

- TBS (50 мМ Трис/100 мМ NaCl) рН 7,0 (профильтрованный через фильтр с размером пор 0,22 мкм);

- реагент для доставки белков BioPORTER (фирма Genlantis, каталожный № ВР502424).

Получение А1-олигомеров

В качестве ссылки см. Danzer K.М. и др., J. Neurosci. 27, 2007, сс. 9220-9232 и Danzer K.М. и др., J. Neurochem. 111, 2009, сс. 192-203.

Лиофилизированный альфа-синуклеин солюбилизировали в воде для ЖХВР с получением раствора, содержащего примерно 70 мкМ альфа-синуклеин (100 мкл на 100 мкг белка). Раствор обрабатывали ультразвуком в течение 30 с в водяной бане ультразвукового аппарата, используя устройство с плавающим зондом. Затем добавляли 500 мкл воды с чистотой, пригодной для ЖХВР, 200 мкл 250 мМ РВ, рН 7,0, 200 мкл абсолютного EtOH с чистотой, пригодной для анализов. Смесь интенсивно перемешивали при максимальной скорости в течение 10 с. После этого получали раствор альфа-синуклеина с концентрацией 100 мкг/мл в 50 мМ РВ, рН 7,0/20% этанола. Для получения референс-образца смешивали такие же буферы в отсутствии альфа-синуклеина. Раствор встряхивали в течение 4 ч при комнатной температуре на качалке типа Nutator®. После встряхивания растворы замораживали на сухом льду для немедленной лиофилизации. Лиофлизацию осуществляли в течение ночи при комнатной температуре при постоянном быстром вращении (например, в устройстве Speedvac). Лиофилизат ресуспендировали в 0,5 мл 50 мМ РВ, рН 7,0 с 10% этанола. Этанол выпаривали при 20-21°С в течение 24 ч в вытяжном шкафу с открытой крышкой (устройство Eppendorf Thermomixer 5436, скорость 5). Затем крышку закрывали и встряхивание продолжали при комнатной температуре в течение 6 дней. А1-олигомеры концентрировали до 1 мг/мл с помощью устройства Vivaspin 500 (верхняя граница отсекаемой молекулярной массы 30 кДа) и объединяли для иммунизации. Для длительного хранения олигомеры выдерживали при -80°С. Контроль качества правильного образования олигомера осуществляли с помощью ДСН-ПААГ и ЭМ.

Получение С1-олигомеров

Лиофилизированный альфа-синуклеин солюбилизировали в воде для ЖХВР с получением раствора с концентрацией альфа-синуклеина примерно 70 мкМ (100 мкл на 100 мкг белка). Раствор обрабатывали ультразвуком в течение 30 с в водяной бане ультразвукового аппарата, используя устройство с плавающим зондом. Затем добавляли 500 мкл воды с чистотой, пригодной для ЖХВР, 200 мкл 250 мМ РВ, рН 7,0, 200 мкл абсолютного EtOH с чистотой, пригодной для анализов. Смесь интенсивно перемешивали при максимальной скорости в течение 10 с. После этого получали растворы альфа-синуклеина с концентрацией 100 мкг/мл в 50 мМ РВ, рН 7,0/20% этанола. Для получения контрольного образца смешивали такие же буферы без альфа-синуклеина. Растворы встряхивали в течение 16 ч при комнатной температуре качалке типа nutator® (например, в течение ночи). С1-олигомеры концентрировали до 1 мг/мл с помощью устройства Vivaspin 500 (верхняя граница отсекаемой молекулярной массы 30 кДа) и объединяли для иммунизации. Для длительного хранения олигомеры выдерживали при -80°С. Контроль качества правильного образования олигомера осуществляли с помощью ДСН-ПААГ и ЭМ.

Получение TP-мутантов олигомеров альфа-синуклеина

Метод представлял собой адаптированный метод, предложенный Karpinar D.P. и др., EMBO J. 28, 2009, сс. 3256-3268.

Аликвоты по 100 мкл (8,2 мг/мл (примерно 590 мМ) ТР-альфа-синуклеина в 50 мМ HEPES/100 мМ NaCl, рН 7,4 перемешивали с помощью 2×5 мм магнитной микромешалки при 37°С (200 об/мин) в течение 6 дней. Контроль качества правильного образования олигомера осуществляли с помощью ДСН-ПААГ и ЭМ.

Получение фибрилл альфа-синуклеина и смешение с реагентом BioPORTER

Метод представлял собой адаптированный метод, предложенный Luk K.С. и др., Biochem. 46, 2007, сс.12522-12526 и Luk K.С. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 2009, сс. 20051-20056.

Температуру аликвоты лиофилизированного и подвергнутого вакуумизации альфа-синуклеина (хранившуюся при -80°С) доводили до комнатной температуры (КТ) в течение 10-15 мин, не открывая емкость для ваккуумизации. Параллельно орбитальный шейкер для пробирок предварительно нагревали до 37°С. Затем содержащую пробирки емкость открывали и при необходимости при наличии на внешней стороне пробирки капель воды пробирку очищали. 100 мкг лиофилизированного альфа-синуклеина растворяли в 100 мкл TBS, рН 7. Пробирки помещали в орбитальный шейкер для пробирок и инкубировали при 37°С/1000 об/мин в течение 96 ч. Затем пробирку центрифугировали при максимальной скорости (20000 g) в течение 10 мин при комнатной температуре. Удаляли 90 мкл супернатанта. Дебрис ресуспендировали в 90 мкл свежего TBS (считалось, что примерная концентрация составляла 1 мг/мл). Контроль качества правильного образования фибрилл осуществляли с помощью ДСН-ПААГ и ЭМ. Для длительного хранения образец выдерживали при -80°С.

Незадолго до иммунизации добавляли по 100 мкл хорошо суспендированных фибрилл в концентрации 1 мг/мл к 20 мкл реагента BioPORTER в виде сухой пленки и интенсивно перемешивали и облучали ультразвуком в водяной бане. Раствор инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре перед применением для иммунизации.

Пример 2

Иммунизация кроликов

Трех новозеландских белых кролика иммунизировали С1-олигомерами альфа-синуклеина, фибрилл альфа-синуклеина и олигомеров TP-мутанта альфа-синуклеина (по 400 мкг каждого компонента для первой иммунизации; по 200 мкг каждого компонента для последующих иммунизации; метод получения см. в примере 1). Животных обрабатывали иммуногеном, эмульгированным в полном адъюванте Фрейнда, путем внутрикожного введения в день 0 и путем чередующихся внутримышечных и подкожных введений в дни 7, 14, 35, 63 и 91. Образцы крови (10% от установленного общего объема крови) получали в дни 21, 41, 69 и 97. Получали сыворотку, которую применяли для определения титров с помощью ELISA (см. ниже). Выделяли мононуклеарные клетки периферической крови, которые использовали в качестве источника антигенспецифических В-клеток и процессе В-клеточного клонирования (примеры 3 и 4).

Определение титров в сыворотке

Титры определяли индивидуально для каждого компонента, входящего в иммуногенную смесь. С1-олигомеры альфа-синуклеина, фибриллы альфа-синуклеина или олигомеры TP-мутанта альфа-синуклеина иммобилизовали на 96-луночном Maxisorb-планшете фирмы NUNC из расчета 0,6 мкг/мл, 100 мкл/лунку в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор), после чего: планшет блокировали 2% CroteinC в ЗФР, 200 мкл/лунку; вносили серийные разведения антисыворотки с дублированием в 0,5% CroteinC в ЗФР, 100 мкл/лунку; осуществляли обнаружение с помощью конъюгированного с HRP (конъюгированного с пероксидазой из хрена) ослиного антикроличьего антитела в виде IgG (фирма Jackson Immunoresearch), разведенного в соотношении 1:16000 в 0,5% CroteinC в ЗФР, 100 мкл/лунку. При осуществлении каждой стадии планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Между всеми стадиями планшеты промывали трижды 0,05% Твин 20 в ЗФР. Сигнал получали путем добавления растворимого субстрата ВМ Blue POD (фирма Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия), 100 мкл/лунку и реакцию прекращали путем добавления 1 М HCl, 100 мкл/лунку. Абсорбцию считывали при 450 нм, используя в качестве референс-стандарта длину волны 690 нм. Титр определяли как разведение антисыворотки, при котором образуется сигнал, составляющий половину от максимального.

Пример 3

Выделение продуцирующих антитела к человеческому альфа-синуклеину В-клеток

Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) кроликов

В качестве доноров крови использовали трех кроликов (описанных в примере 2). Содержащую ЭДТК цельную кровь разводили двукратно 1×ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор; фирма РАА, Пашинг, Австрия) перед центрифугированием в градиенте плотности с использованием лимфоцита млекопитающих (фирма Cedarlane Laboratories, Бурлингтон, провинция Онтарио, Канада) согласно спецификациям производителя. РВМС промывали дважды 1×ЗФР.

Среда EL-4 В5

Применяли среду RPMI 1640 (фирма Pan Biotech, Айденбах, Германия), дополненную 10% FCS (фирма Hyclone, Логан, шт. Юта, США), 2 мМ глутамином, 1% раствором пенициллина/стрептомицина (фирма РАА, Пашинг, Австрия), 2 мМ пируватом натрия, 10 мМ HEPES (фирма PAN Biotech, Айденбах, Германия) и 0,05 мМ β-меркаптоэтанолом (фирма Gibco, Пейсли, Шотландия).

Истощение макрофагов/моноцитов

Стерильные 6-луночные планшеты (имеющие чистоту, пригодную для культивирования клеток) применяли для истощения макрофагов и моноцитов посредством неспецифической адгезии. В каждую лунку вносили максимум 4 мл среды и вплоть до 6×10⁶ РВМС, полученных из иммунизированного кролика, и давали связываться в течение 1 ч при 37°С в инкубаторе. Клетки в супернатанте (лимфоциты периферической крови (PBL)) применяли для стадии пэннинга антигена.

Сенсибилизация планшетов

Стерильные 6-луночные планшеты для культуры клеток сенсибилизировали смесью двух различных олигомеров человеческого альфа-синуклеина (1 мкг/мл С1-олигомера и 1 мкг/мл олигомера TP-мутанта) в карбонатном буфере (0,1 М бикарбонат натрия, 34 мМ динатрийкарбонат, рН 9,55) в течение ночи при 4°С. Перед применением планшеты трижды промывали в стерильном ЗФР.

Обогащение В-клеток на олигомерах человеческого альфа-синуклеина

В 6-луночные планшеты для культуры клеток, сенсибилизированные олигомерами человеческого альфа-синуклеина, высевали вплоть до 6×10⁶ PBL на 4 мл среды и давали связываться в течение 1 ч при 37°С в инкубаторе. После стадии обогащения на олигомерах альфа-синуклеина не прикрепившиеся клетки удали путем острожной промывки лунок 1-2 раза 1×ЗФР. Оставшиеся прикрепившиеся клетки удаляли обработкой трипсином в течение 10 мин при 37°С в инкубаторе. Трипсинизацию прекращали, добавляя среду EL-4 В5. Клетки выдерживали на льду вплоть до осуществления иммунного флуоресцентного окрашивания.

Иммунное флуоресцентное окрашивание и проточная цитометрия

Для сортинга индивидуальных клеток применяли конъюгат антитела к IgG с ФИТЦ (фирма AbD Serotec, Дюссельдорф, Германия). Для окрашивания поверхности клетки, полученные после стадии истощения и обогащения, инкубировали с конъюгатом антитела к IgG с ФИТЦ в ЗФР и инкубировали в течение 45 мин в темноте при 4°С. После окрашивания РВМС промывали дважды охлажденным на льду ЗФР. И, наконец, РВМС ресуспендировали в охлажденном на льду ЗФР и немедленно подвергали FACS-анализу. Перед осуществлением FACS-анализов добавляли йодид пропидия в концентрации 5 мкг/мл (BD Pharmingen, Сан-Диего, шт. Калифорния, США) для того, что отличать мертвые клетки от живых.

Для сортинга индивидуальных клеток применяли устройство Becton Dickinson FACSAria, снабженное компьютером и программой FACSDiva (фирма BD Biosciences, США).

Культивирование В-клеток

Для культивирования кроличьих В-клеток использовали метод, аналогичный описанному у Zubler и др., J. Exp. Med. 160, 1984, сс. 1170-1183. В целом, метод состоял в следующем: полученные в результате сортинга индивидуальные кроличьи В-клетки инкубировали в 96-луночных планшетах с 200 мкл/лунку среды EL-4 В5, содержащей обработанные реагентом пансорбином клетки (1:100000) (фирма Calbiochem (Merck), Дармштадт, Германия), 5%-ный супернатант кроличьих тимоцитов (нагрузка 20100908, получен в лаборатории заявителей) и облученные гамма-лучами клетки мышиной тимомы EL-4-B5 (2,5×10⁴/лунок), в течение 7 дней при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂. Супернатанты, полученные после культивирования В-клеток, удаляли для скрининга. Параллельно мРНК оставшихся клеток немедленно помещали для консервации в 100 мкл RLT-буфера (фирма Qiagen, Хильден, Германия) и лизаты хранили при - 80°С.

Пример 4

Определение нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные домены антител

ПЦР-амплификация V-доменов и секвенирование

Общую РНК получали, используя набор для РНК NucleoSpin 8/96 (фирма Macherey&Nagel; каталожный №740709.4, 740698) согласно протоколу производителя. Все стадии осуществляли в системе для работы с жидкостями epMotion 5075 (фирма Eppendorf). РНК элюировали, используя 60 мкл свободной от РНКазы воды. 6 мкл РНК использовали для создания кДНК с помощью реакции с обратной транскриптазой, используя систему Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (фирма Invitrogen; каталожный №18080-400) и олиго-dT-праймер согласно инструкциям производителя. 4 мкл кДНК применяли для амплификации вариабельных областей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина (VH и VL) с использованием системы AccuPrime SuperMix (фирма Invitrogen; каталожный №12344-040) в конечном объеме 50 мкл, применяя праймеры rbHCfinal.up (AAGCTTGCCACCATGGAGACTGGGC TGCGCTGGCTTC; SEQ ID NO: 42) и rbHCfinal.do (CCATTGGTG AGGGTGCCCGAG; SEQ ID NO: 43) для тяжелой цепи, и rbLCfinal.up (AAGCTTGCCACCATGGACAYGAGGGCCCCCACTC; SEQ ID NO: 44) и rbLCfinal.do (CAGAGTRCTGCTGAGGTTGTAGGTAC; SEQ ID NO: 45) для легкой цепи. Условия ПЦР были следующими: «горячий старт» при 94°С в течение 5 мин; 35 циклов по 20 с при 94°С, 20 с при 70°С, 45 с при 68°С и конечное удлинение при 68°С в течение 7 мин.

По 8 мкл раствора ПЦР объемом 50 мкл вносили в 48 Е-гель 2% (фирма Invitrogen; каталожный №G8008-02). Позитивные по данным ПЦР-реакций продукты очищали, используя набор NucleoSpin Extract II (фирма Macherey&Nagel; каталожный №740609250) согласно протоколу производителя, и осуществляя элюцию в 50 мкл буфера для элюции. По 12 мкл очищенных ПЦР-продуктов секвенировали непосредственно в обоих направлениях, используя праймеры rbHCfinal.up и rbHCfinal.do для тяжелых цепей и rbLCfinal.up и rbLCfinal.do для легких цепей.

Пример 5

Гуманизация кроличьих антител к человеческому альфа-синуклеину

Кроличьи антитела к человеческому альфа-синуклеину можно гуманизировать согласно стандартным методикам, таким как трансплантация CDR.

Пример 6

Создание рекомбинантных экспрессионных векторов

а) Создание векторов для экспрессии тяжелых цепей иммуноглобулина с использованием константной области мышиного IgG1

Слитый ген, кодирующий мышиный IgG1, который содержал константную область мышиного IgG1 (CH1, шарнир, СН2, СН3) и VH-домен антитела к альфа-синуклеину, полученный из кроличьего антитела, собирали путем слияния ДНК-фрагмента, кодирующего VH-домен соответствующего специфического для альфа-синуклеина антитела, с элементом последовательности, кодирующим константную область мышиного IgG1.

Константная область мышиного IgG1 имеет следующую аминокислотную последовательность:

(SEQ ID NO: 46).

Экспрессионный вектор содержал также сайт инициации репликации из вектора pUC18, обеспечивающий репликацию этой плазмиды в Е. coli, и ген бета-лактамазы, который обусловливает устойчивость к ампициллину в Е. coli.

Транскрипционная единица тяжелой цепи антитела содержала следующие функциональные элементы в 5' → 3' направлении:

- немедленно-ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса (P-CMV), включая интрон А,

- 5'-нетранслируемая область (5'UTR) тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина,

- сигнальная последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный (VH) домен тяжелой цепи,

- нуклеиновая кислота, кодирующая константную область мышиного IgG1, и

- последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH рА).

б) Создание векторов для экспрессии легких цепей иммуноглобулина с использованием константной области каппа-цепи мышиного Ig

Слитый ген, кодирующий мышиную легкую каппа-цепь, которая содержала константную область каппа-цепи мышиного Ig (CL-каппа) и VL- (каппа) домен антитела к альфа-синуклеину, полученный из кроличьего антитела, собирали путем слияния ДНК-фрагмента, кодирующего VL (каппа) домен соответствующего специфического для альфа-синуклеина антитела, с элементом последовательности, кодирующим константную область каппа-цепи мышиного Ig-

Константная область каппа-цепи мышиного Ig имеет следующую аминокислотную последовательность:

(SEQ ID NO: 47).

Транскрипционная единица легкой каппа-цепи антитела содержала следующие функциональные элементы в 5' → 3' направлении:

- сигнальная последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный (VL) домен легкой цепи, нуклеиновая кислота, кодирующая константную область каппа-цепи мышиного Ig, и

в) Создание векторов для экспрессии легких цепей иммуноглобулина с использованием константной области лямбда-цепи мышиного Ig

Слитый ген, кодирующий мышиную легкую лямбда-цепь, которая содержит константную область лямбда-цепи мышиного Ig (CL-лямбда) и VL-(лямбда) домен антитела к альфа-синуклеину, полученный из кроличьего антитела, собирали путем слияния ДНК-фрагмента, кодирующего VL-(лямбда) домен соответствующего специфического для альфа-синуклеина антитела, с элементом последовательности, кодирующим константную область лямбда-цепи мышиного Ig.

Константная область лямбда-цепи мышиного Ig имеет следующую аминокислотную последовательность:

(SEQ ID NO: 48).

Транскрипционная единица легкой лямбда-цепи антитела содержала следующие функциональные элементы в 5' → 3' направлении:

- сигнальная последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина, нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный (VL) домен легкой цепи, нуклеиновая кислота, кодирующая константную область лямбда-цепи мышиного Ig, и

г) Создание векторов для экспрессии цепей иммуноглобулина, конъюгированных с челночным модулем для гематоэнцефалического барьера

В случае экспрессионных векторов, кодирующих конструкции тяжелых цепей IgG, часть молекулы, представляющая собой IgG, имела геномную организацию, т.е. в ней присутствовали интроны в сигнальном пептиде между VH- и CH1-доменами, между CH1-доменом и шарнирной областью, между шарнирной областью и СН2-доменом и между СН2- и СН3-доменами. С ней (С-конец/на 3'-конце) сливали кДНК-элемент, кодирующий челночный модуль для головного мозга. Для получения молекул антител, несущих только один челночный модуль для головного мозга на полную молекулу антитела, применяли технологию «knob-into-hole».

Несущая «впадину» цепь содержала следующие мутации: T366W.

Несущая «выступ» цепь содержала следующие мутации: T366S/L368A/Y407V.

Необязательно искусственную дисульфидную связь можно интродуцировать между остатком 354 в несущей «впадину» цепи и остатком 349 в несущей «выступ» цепи. Дополнительные требуемые мутации представляли собой S354C в тяжелой цепи с «впадиной» и Y349C в тяжелой цепи с «выступом».

В случае экспрессионных векторов, кодирующих конструкции легких цепей Ig, часть молекулы, представляющая собой Ig-каппа или Ig-лямбда, имела геномную организацию, т.е. интроны присутствовали в сигнальном пептиде и между VL- и CL-доменами.

Помимо экспрессионной единицы/кассеты, включающей требуемый подлежащий экспрессии ген, для создания основной/стандартной экспрессионной плазмиды применяли:

I) Создание векторов для экспрессии тяжелых цепей иммуноглобулина, содержащих челночный модуль, с использованием константной области человеческого IgG1 с мутацией, приводящей к образованию «впадины»

Слитый ген, кодирующий человеческий IgG1, содержащий константную область человеческого IgG1 (CH1, шарнир, СН2, СН3) и VH-домен антитела к альфа-синуклеину, полученный из кроличьего антитела, собирали путем слияния ДНК-фрагмента, который кодирует VH-домен соответствующего антитела к альфа-синуклеину, с элементом последовательности, который кодирует константную область человеческого IgG1, содержащую мутацию, приводящую к образованию «впадины». Конструкция имела геномную организацию, т.е. в ней присутствовали интроны в сигнальном пептиде, между VH- и СН1-доменами, между СН1-доменом и шарнирной областью, между шарнирной областью и СН2-доменом, и между СН2- и СН3-доменами.

Константная область человеческого Ig1 имеет следующую аминокислотную последовательность:

(SEQ ID NO: 49).

Содержащая «впадину» константная область человеческого Ig1 имеет следующую аминокислотную последовательность:

(SEQ ID NO: 50).

Транскрипционная единица тяжелой цепи антитела с модификацией, приводящей к образованию «впадины», содержала следующие функциональные элементы в 5' → 3' направлении:

- нуклеиновая кислота, кодирующая константную область человеческого IgG1 с мутацией, приводящей к образованию «впадины»,

- необязательно нуклеиновая кислота, которая кодирует GS-линкер, слитая с нуклеиновой кислотой, которая кодирует челночный модуль для гематоэнцефалического барьера, и

II) Создание векторов для экспрессии тяжелых цепей иммуноглобулина, содержащих челночный модуль, с использованием константной области человеческого IgG1 с мутацией, приводящей к образованию «выступа»

Слитый ген, кодирующий человеческий IgG1, содержащий константную область человеческого IgG1 (CH1, шарнир, СН2, СН3) и VH-домен антитела к альфа-синуклеину, полученный из кроличьего антитела, собирали путем слияния ДНК-фрагмента, который кодирует VH-домен соответствующего антитела к альфа-синуклеину, с элементом последовательности, который кодирует константную область человеческого IgG1, содержащую мутацию, приводящую к образованию «выступа». Конструкция имела геномную организацию, т.е. в ней присутствовали интроны в сигнальном пептиде, между VH- и СН1-доменами, между СН1-доменом и шарнирной областью, между шарнирной областью и СН2-доменом, и между СН2- и СН3-доменами.

Содержащая «выступ» константная область человеческого Ig1 имеет следующую аминокислотную последовательность:

(SEQ ID NO: 51).

Транскрипционная единица тяжелой цепи антитела с модификацией, приводящей к образованию «выступа», содержала следующие функциональные элементы в 5' → 3' направлении:

- нуклеиновая кислота, кодирующая константную область человеческого IgG1 с мутацией, приводящей к образованию «выступа»,

III) Создание векторов для экспрессии легких каппа-цепей иммуноглобулина с использованием константной области легкой каппа-цепи человеческого Ig

Слитый ген, кодирующий легкую каппа-цепь человеческого Ig, которая содержит константную область каппа-цепи человеческого Ig (CL-каппа) и VL-(каппа) домен антитела к альфа-синуклеину, полученный из кроличьего антитела, собирали путем слияния ДНК-фрагмента, кодирующего VL- (каппа) домен соответствующего специфического для альфа-синуклеина антитела, с элементом последовательности, кодирующим константную область каппа-цепи человеческого Ig. Конструкция имела геномную организацию, т.е. в ней присутствовали интроны в сигнальном пептиде и между VL- (каппа) и CL-каппа доменами.

- сигнальная последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина,

- нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный (VL) домен легкой цепи,

- нуклеиновая кислота, кодирующая константную область каппа-цепи человеческого IgG, и

IV) Создание векторов для экспрессии легких лямбда-цепей иммуноглобулина с использованием константной области легкой лямбда-цепи человеческого Ig

Слитый ген, кодирующий легкую лямбда-цепь человеческого Ig, которая содержит константную область лямбда-цепи человеческого Ig (CL-лямбда) и VL-(лямбда) домен антитела к альфа-синуклеину, полученный из кроличьего антитела, собирали путем слияния ДНК-фрагмента, кодирующего VL- (лямбда) домен соответствующего специфического для альфа-синуклеина антитела, с элементом последовательности, кодирующим константную область лямбда-цепи человеческого Ig. Конструкция имела геномную организацию, т.е. в ней присутствовали интроны в сигнальном пептиде и между VL- (лямбда) и CL-лямбда-доменами.

- нуклеиновая кислота, кодирующая константную область лямбда-цепи человеческого IgG, и

Пример 7

Рекомбинантное получение антител к человеческому альфа-синуклеину

Антитела получали в кратковременно трансфектированных клетках HEK293 (линия 293, полученная из почки человеческого эмбриона), которые культивировали в среде F17 (фирма Invitrogen Corp.). Для трансфекции соответствующими векторами, которые описаны в примере 6, применяли трансфектирующий реагент «293-Free» (фирма Novagen). Антитела и слияния антитело-челночный вектор для гематоэнцефалического барьера экспрессировали из индивидуальных экспрессионных плазмид. Трансфекции осуществляли согласно спецификации, указанной в инструкциях производителя. Содержащие рекомбинантные антитела супернатанты клеточных культур собирали через 3-7 дней после трансфекции. Супернатанты хранили при пониженной температуре (например, -80°С) до очистки.

Общая информация, касающаяся рекомбинантной экспрессии человеческих иммуноглобулинов, например, в HEK293-клетках, приведена у Meissner Р. и др., Biotechnol. Bioeng. 75, 2001, сс.197-203.

Пример 8

Очистка рекомбинантных антител к человеческому альфа-синуклеину

Содержащие антитела супернатанты культур фильтровали и очищали с использованием двух хроматографических стадий.

Антитела «захватывали» с помощью аффинной хроматографии, используя колонку HiTrap MabSelectSuRe (фирма GE Healthcare), уравновешенную ЗФР (1 мМ KH₂PO₄, 10мМ Na₂HPO₄, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl), рН 7,4. Несвязанные белки удаляли путем промывки уравновешивающим буфером и антитело выделяли с помощью 25 мМ цитратного буфера, рН 3,1, значение рН которого сразу после элюции доводили до рН 6,0 с помощью 1М Трис-основания, рН 9,0.

Гель-фильтрацию на колонке Superdex 200™ (фирма GE Healthcare) применяли в качестве второй стадии очистки. Гель-фильтрацию осуществляли в 20 мМ гистидиновом буфере, 0,14М NaCl, рН 6,0. Содержащие антитела растворы концентрировали с помощью центрифужного фильтра Ultrafree-CL, снабженного мембраной Biomax-SK (фирма Millipore, Биллерика, шт. Массачусетс, США), и хранили при -80°С.

Пример 9

Характеризация связывающей специфичности с помощью поверхностного плазмонного резонанса

Для осуществления всех указанных методов использовали устройства BIAcore 2000, 3000 или Т200 (фирма GE Healthcare, BIAcore, Уппсала, Швеция). Все стадии иммобилизации и анализы связывания осуществляли при 25°С. Иммобилизации и анализы связывания осуществляли (если специально не указано иное) со скоростью 5 или 30 мкл мин 1 соответственно.

а) Характеризация связывания мономерного альфа-синуклеина с иммобилизованными моноклональными антителами

Буферы:

буфер для иммобилизации:

10мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 0,05% полисорбата 20 (Р20), рН 7,5;

буфер для «захвата» и связывания:

10мМ Hepes, рН 7,5, 150 мМ NaCl, ЗмМ ЭДТК, 0,05% Р20.

Анализ связывания очищенного мономерного α-синуклеина-гексаHis с иммобилизованными моноклональными антителами на «захватывающем» антителе

I) Иммобилизация козьего антимышиного иммуноглобулина IgG («захватывающее» антитело)

Иммобилизацию козьего антимышиного IgG (набор для «захвата» мышиного антитела; каталожный №BR-1008-38; фирма GE Healthcare, Уппсала, Швеция) осуществляли в буфере, содержащем 10мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 0,05% Р20, рН 7,5. На первой стадии карбоксильные группы поверхности сенсорного СМ5-чипа трансформировали с образованием реакционноспособных сложных сукцинимидных эфиров путем приведения в контакт сенсорной поверхности в течение 7 мин с раствором 0,2М N-этил-N-диметиламинополикарбодиимида (EDC) и 0,05М N-гидроксисукцинимида (NHS). После активации сенсорную поверхность приводили в контакт в течение 3 мин с козьим антимышиным IgG в концентрации 30 мкг/мл в 10мМ натрий-ацетатом буфере (рН 5,0). Уровень иммобилизации IgG соответствовал примерно 3000 RU (резонансных единиц). И, наконец, избыток активированных карбоксильных групп на поверхности «гасили» с помощью этаноламина (1М, рН 8,5, 7 мин).

II) «Захват» антител к альфа-синуклеину

Моноклональные антитела к альфа-синуклеину (100нМ раствор в подвижном буфере) «захватывали» на иммобилизованном антителе IgG-типа вплоть до достижения уровня «захваченного» антитела, соответствующего 200-250 RU. Один канал сенсорного чипа применяли в качестве референс-канала с иммобилизованным козьим антимышиным антителом.

III) Эксперимент по связыванию мономерного альфа-синуклеина с N-концевой гекса-гистидиновой меткой

Эксперимент по связыванию осуществляли в буфере, содержащем 10мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 3мМ ЭДТК, 0,05% Р20, при рН 7,5. Очищенный мономерный альфа-синуклеин-гексаHis титровали вплоть до достижения концентрации 334нМ (5 точек, фактор разведения 2) на поверхности «захваченных» моноклональных антител к альфа-синуклеину. После каждого титрования удаляли с чипа очищенный мономерный альфа-синуклеин-гексаHis, комплекс альфа-синуклеина и моноклонального антитела к альфа-синуклеину с помощью кратковременной обработки раствором 10мМ глицин-HCl раствор (рН 1,7). После этого новые моноклональные антитела к альфа-синуклеину «захватывали» на поверхности сенсора.

б) Характеризация связывания моноклональных антител к альфа-синуклеину с мономерным альфа-синуклеином, иммобилизованным посредством His-метки на NTA-Снитрилотриуксусная кислота) чипе

Буферы:

буфер для иммобилизации:

10мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 0,05% Р20, рН 7,5,

буфер для связывания:

10мМ Hepes, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 3мМ ЭДТК, 0,05% Р20.

I) Иммобилизация очищенного мономерного альфа-синуклеина на поверхности NTA-сенсора

Иммобилизацию мономерного α-синуклеин-гексаHis (N-концевой) на поверхности NTA-(нитролотриуксусная кислота) сенсора осуществляли в подвижном буфере, содержащем 10мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 0,05% Р20, при рН 7,5. Поверхность NTA-сенсора сначала промывали трижды каждый раз в течение 1 мин 0,35М ЭДТК при скорости потока 5 мкл/мин. Затем сенсорную поверхность загружали ионами Ni²⁺ посредством контакта в течение 1 мин сенсорной поверхности с 500 мкМ NiCl₂ в подвижном буфере и дополнительно активировали в течение 7 мин раствором 0,2М EDC и 0,05М NHS. Кроме того, меченный с помощью гексаHis-метки альфа-синуклеин в подвижном буфер (<0,1 мкг/мл) приводили в контакт с сенсорной поверхностью до достижения низкой плотности (вплоть до 5 RU) на поверхности, что позволяло обнаруживать также одновалентное связывание моноклональных антител к альфа-синуклеину с альфа-синуклеином. И, наконец, оставшиеся группы активного сложного эфира деактивировали в течение 5 мин с помощью 1М Трис, рН 7,5. Проточный канал без иммобилизованного альфа-синуклеина применяли в качестве референс-канала.

II) Анализ связывания моноклональных антител с иммобилизованным α-синуклеином

Анализ связывания осуществляли в буфере, содержащем 10мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 3мМ ЭДТК, 0,05% Р20, при рН 7,5. Моноклональные антитела к альфа-синуклеину анализировали в одной концентрации 100нМ, выражая ответ связывания как «да/нет», или осуществляли титрование в подвижном буфере, используя концентрации вплоть до 100нМ (индивидуальные инъекции 5 концентраций с фактором разведения 2) для оценки кинетики и аффинности связывания с мономерным альфа-синуклеином. После мониторинга кривой связывания для каждой концентрации каждого из антител к альфа-синуклеину покрытую альфа-синуклеином поверхность регенерировали с использованием двух кратковременных обработок 100мМ фосфорной кислотой (2× 1 мин) для отмывки связанного антитела и получения возможности осуществлять мониторинг связывания другого антитела.

в) Характеризация связывания моноклональных антител к альфа-синуклеину с мономерным альфа-синуклеином. иммобилизованным на липосомах DOPC:DOPS на L1-сенсоре

Буферы:

буфер для иммобилизации и связывания:

50 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, рН 7,5.

I) Получение липосом DOPC:DOPS

25 мг/мл смеси (7:3 (мас/мас.)) липидов DOPC:DOPS (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-рфосфохолин: 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин) в хлороформе выпаривали в стеклянной колбе в струе аргона в вакуумном шкафу с получением липидной пленки на стенке колбы. Липидную пленку гидратировали в Hepes-буфере (50 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, рН 7,5) с получением 5 мМ буферного липидного раствора. Липидный раствор экструдировали с помощью мини-экструдера (фирма Avanti Polar Lipids, Алабастер, США), пропуская липидный раствор 15 раз через фильтры экструдеров размером 100 нм, с получением раствора липосом. Качество и размер липосом подтверждали с помощью динамического рассеяния света.

II) Иммобилизация очищенного мономерного α-синуклеина на DOPC:DOPS-липосомах

Иммобилизацию альфа-синуклеина-rekcaHis (N-концевая метка) на DOPC:DOPS-липосомах осуществляли в буфере, содержащем 50 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, при рН 7,5. Все проточные каналы на поверхности L1-сенсора сначала промывали в течение 1 мин раствором 20 мМ Chaps до получения стабильного исходного уровня. Раствор DOPC:DOPS-липосом, полученной путем экструзии, разводили в 5 раз подвижным буфером и вносили на сенсорную поверхность во все проточные каналы с получением уровней иммобилизации, составляющих примерно 3000 RU. На следующей стадии все проточные каналы блокировали раствором БСА (бычий сывороточный альбумин) в концентрации 0,1 мг/мл для снижения неспецифического связывания альфа-синуклеина на сенсорной поверхности /с сенсорной поверхностью. Альфа-синуклеин разводили в подвижном буфере до концентрации 5,0 мкг/мл и иммобилизовали на липосомах с низкой плотностью (<30 RU) на выбранных проточных каналах, что позволяло определять связывание одновалентных антител с альфа-синуклеином. Проточный канал с иммобилизованными липосомами, но без альфа-синуклеина применяли в качестве референс-канала.

III) Анализ связывания моноклональных антител с иммобилизованным альфа-синуклеином на липосомах DOPC:DOPS

При осуществлении анализа связывания каждое антитело анализировали в одной концентрации 100нМ, выражая ответ связывания как «да/нет», или осуществляли титрование в подвижном буфере, используя концентрации вплоть до 100нМ (индивидуальные инъекции 5 концентраций с фактором разведения 2) для оценки кинетики и аффинности связывания с альфа-синуклеином. После мониторинга связывания антитела сенсорную поверхность регенерировали в течение 1 мин с помощью 20 мМ Chaps и уравновешивали с помощью подвижного буфера для следующей иммобилизации липосом.

г) Характеризация связывания моноклональных антител к альфа-синуклеину с предварительно сформированными фибриллами альфа-синуклеина (PFF)

Буферы:

буфер для иммобилизации:

10мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 0,05% Р20, рН 7,5,

буфер для связывания:

10мМ Hepes, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 3мМ ЭДТК, 0,05% Р20.

I) Иммобилизация предварительно сформированных фибрилл α-синуклеина на поверхности NTA-сенсора

Иммобилизацию с помощью His-метки альфа-синуклеина PFF (содержащего меченный на N-конце с помощью гексаHis-метки альфа-синуклеин и немеченый альфа-синуклеин в соотношении 1:10) осуществляли на NTA-сенсоре в подвижном буфер, содержащем 10мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 0,05% Р20, при рН 7,5. Поверхность NTA-сенсора сначала промывали в течение 1 мин 0,35М ЭДТК при скорости потока 5 мкл/мин. Затем сенсорную поверхность загружали ионами Ni²⁺ посредством контакта в течение 1 мин сенсорной поверхности с 500 мкМ NiCl₂ в подвижном буфере и дополнительно активировали в течение 7 мин раствором 0,2М EDC и 0,05М NHS. Разведенный раствор альфа-синуклеина PFF в подвижном буфере приводили в контакт с сенсорной поверхностью для достижения различной плотности фибрилл на сенсорной поверхности (соответствующей примерно 20 RU, примерно 200 RU и примерно 2000 RU). Деактивацию оставшихся свободных групп активного сложного эфира осуществляли в течение 5 мин с помощью 1М Трис при рН 7,5. Один из проточных каналов, в котором отсутствовали иммобилизованные фибриллы альфа-синуклеина, применяли в качестве референс-канала.

II) Анализ связывания моноклональных антител с иммобилизованными PFF

Мониторинг связывания каждого антитела к альфа-синуклеину осуществляли с помощью эксперимента по титрованию, применяя концентрации вплоть до 100нМ (5 точек, фактор разведения 2), параллельно на всех четырех каналах. После мониторинга кривой связывания для каждого антитела поверхность с альфа-синуклеином PFF регенерировали с помощью кратковременных обработок (2× 1 мин) 100мМ фосфорной кислотой для отмывки связанного антитела.

Результаты:

Данные о связывании различных антител к альфа-синуклеину, указанных в настоящем описании, а также в виде слияний с челночным модулем для гематоэнцефалического барьера и некоторых референс-антител, полученные с помощью описанного выше SPR-анализа, представлены ниже в таблице.

- антитело 0070 представляет собой слияние с челночным модулем для гематоэнцефалического барьера антитела 0017, несущего scFv антитела 8D3 к рецептору трансферрина;

- антитело 0076 представляет собой слияние с челночным модулем для гематоэнцефалического барьера антитела 0018, несущего scFv антитела 8D3 к рецептору трансферрина.

Пример 10

Иммуногистохимической анализ и анализы цитотоксичности

Иммуногистохимический анализ срезов головного мозга пораженного PD пациента

Криосрезы (10 мкм) головного мозга человека, пораженного болезнью Паркинсона, окрашивали с помощью 5,0 мкг/мл первичного IgG, представляющего собой антитело 0017, антитело 0018 или антитело 0057 (мышиная Fc), и осуществляли контрастное окрашивание с помощью 5,0 мкг/мл кроличьего антитела к альфа-синуклеину (фирма Cell Signaling; каталожный №2628S).

В качестве вторичных антител использовали конъюгированное с Alexa Fluor 488 козье антимышиное антитело IgG-типа (H+L) (фирма Invitrogen, каталожный №А11001) и конъюгированное с Alexa Fluor 594 козье антикроличье антитело IgG-типа (H+L) (обладающее высокой перекрестной адсорбционной способностью, фирма Invitrogen, каталожный №А11037).

Образцы визуализировали с помощью конфокального микроскопа LEICA (SP5×), используя 63× линзы 1.2NA, 1,6× объектив, точечная диафрагма 1,0AU.

Длина волны возбуждения Alexa 488 составляла 497 нм (10% WLL («белый» лазер); испускания - 505-571 нм (98% HyD (система детекции)).

Длина волны возбуждения Alexa 594 составляла 590 нм (8% WLL); испускания - 596-680 нм (92% HyD). Изображения усредняли путем 5-кратных линейных усреднений.

Результаты представлены на фиг. 12.

Человеческие нервные клетки (LUHMES) в качестве функциональной клеточной модели для оценки защиты от опосредуемой альфа-синуклеином токсичности с помощью терапевтических антител

Осуществляли дифференцировку клеток LUHMES в течение 5 дней в 384-луночных планшетах согласно подробно описанному ниже методу. Через 24 ч после посева супернатанты кондиционированных клеточных культур SHSY5Y-клеток, выращиваемых в средах для дифференцированных средах для дифференцировки LUHMES, добавляли в планшеты в разведении 1:1 для индукции экзосомальной опосредуемой альфа-синуклеином токсичности. В контрольные культуры добавляли среды для дифференцировки LUHMES. Подлежащие тестированию антитела добавляли вместе с кондиционированными средами SHSY5Y в конечной концентрации 10 мкг/мл. Жизнеспособность клеток определяли еще через 4 дня с помощью анализа CellTiterGlo (фирма Promega, каталожный №REF G7571). Уровни жизнеспособности выражали в виде количества CPS.

Клеточные культуры, применяемые в методах

Покрытие, среда и добавки:

- поли-L-орнитин (PLO): фирма Sigma-Aldrich, каталожный №Р-3655, 100 мг,

- фибронектин (раствор): фирма Sigma-Aldrich, каталожный №F-1141, 5 мг,

- усовершенствованная DMEM/F-12: фирма Gibco/Invitrogen, каталожный №. 12634-010,

- N-2: фирма Gibco/Invitrogen, каталожный №17502048 или фирма РАА F005-004,

- L-глутамин: фирма Sigma-Aldrich, каталожный №G7513,

FGF (фактор роста фибробластов): фирма R&D Systems, каталожный №4114-ТС (1 мг),

- GDNF (глиальный нетрофический фактор): фирма R&D Systems, каталожный №212-GD (50 мкг),

- тетрациклин: фирма Sigma-Aldrich, каталожный №Т-7660,

- цАМФ: фирма Sigma-Aldrich, каталожный №D0627.

Культивирование и диффенцировка LUHMES:

Покрытие (все планшеты и колбы должны иметь модифицированную поверхность Nunclon):

Раствор для нанесения покрытия вносили в планшеты и колбы (Т75-колба: 7 мл; Т175-колба: 14 мл; 96-луночный планшет: 50 мкл на лунку, 24-луночный планшет: 250 мкл на лунку, 12-луночный планшет: 500 мкл на лунку, 6 луночный планшет: 1 мл на лунку). Планшеты и лунки инкубировали в течение по меньшей мере 3 ч (или в течение ночи) при 37°С. После инкубации раствор для нанесения покрытия отсасывали. Колбы промывали дважды водой, очищенной с помощью системы Milli Q. Перед использованием планшеты и колбы сушили на рабочем столе с ламинарным потоком воздуха.

Среда для пролиферации:

Среда для дифференцировки

Субклонированная культура:

Клетки, которые культивировали в колбе площадью 75 см² в среде для пролиферации, расщепляли, когда они достигали 80% конфлюэнтности. Сначала клетки дважды промывали 10 мл ЗФР. Затем добавляли 4 мл ATV-трипсина (2 мл 2-кратного маточного раствора ATV-трипсина предварительно смешивали с 2 мл ЗФР). Клетки инкубировали в течение 3 мин при 37°С. После открепления клеток к ним добавляли 21 мл усовершенствованной среды DMEM/F12 без добавок. Клеточную суспензию центрифугировали в 50-миллилитровой фальконовской пробирке при 300 × g в течение 5 мин. Супернатант удаляли и клетки ресуспендировали в 5 мл усовершенствованной среды DMEM/F12 без добавок. Подсчет клеток осуществляли в камере Нейбауэра.

Для пересевов клетки расщепляли через 2, 3 или 4 дня. Если требовалось осуществлять пересев через 2 дня, то 2×10⁶ клеток (расщепление 1:5) высевали в колбу площадью 75 см². В случае пересева через 3 дня достаточно 1×10⁶ клеток (расщепление 1:10), а случае пересева через 4 дня достаточно 500000 клеток (расщепление 1:20). Клетки высевали в колбу площадью 75 см², содержащую 10 мл среды для пролиферации.

Предварительная дифференцировка:

Предварительную дифференцировку клеток LUHMES осуществляли в колбе площадью 175 см². Для этого 6×10⁶ клеток высевали в 20 мл среды для пролиферации. Через 24 ч после прикрепления и пролиферации среду заменяли. Среду для пролиферации заменяли на среду для дифференцировки. Еще через 48 ч прекращали стадию предварительной дифференцировки.

Клетки высевали в многолуночные планшеты. Для этого среду отсасывали. Клетки промывали дважды 10 мл ЗФР. После этого добавляли 8 мл ATV-трипсина (4 мл 2-кратного маточного раствора ATV-трипсина предварительно смешивали с 4 мл ЗФР). Клетки инкубировали в течение 3-5 мин при 37°С. После открепления клеток к ним добавляли 42 мл усовершенствованной среды DMEM/F12 без добавок. Клеточную суспензию центрифугировали в 50-миллилитровой фальконовской пробирке при 300 × g в течение 5 мин. Супернатант удаляли и клетки ресуспендировали в 10 мл среды для дифференцировки. Подсчет клеток осуществляли в камере Нейбауэра.

Дифференцировка:

Дополнительную дифференцировку осуществляли в сенсибилизированных планшетах для культуры клеток.

Клетки разводили средой для дифференцировки и засевали соответствующий объем среды дифференцировки, которую вносили в планшеты для культуры клеток. Еще через 72 ч дифференцировка завершалась. Результаты представлены на фиг. 7 и 9.

Пример 11

Термостабильность

Температуры денатурации (точки плавления, T_m) моноклональных антител к альфа-синуклеину (2 мкМ) определяли путем анализа температурного сдвига, используя в качестве репортерного флуорофора Sypro Orange.

Фазовые переходы к плавлению аппроксимировали с помощью сигмоидального уравнения Больцмана и точку излома на уровне амплитуды сигнала, составляющей половину от максимального, определяли как температуру плавления T_m, при которой половина антитела денатурирована (фиг. 10). Установлено, что значения T_m составляли от 60°С до 75°С.

Пример 12

Эпитопное картирование

Эпитопное картирование осуществляли с помощью общепринятых пептидных микромассивов PepStar™, которые получали от фирмы JPT Peptide Technologies. Пептидные последовательности состояли из 15 аминокислотных остатков и их создавали так, чтобы они перекрывали полную последовательность человеческого альфа-синуклеина (UniProt, регистрационный номер: Р37840). Смежные пептиды имели перекрывающуюся последовательность, состоящую из 11 аминокислот. Дополнительные пептиды содержали последовательности с известными сайтами с мутациями альфа-синуклеина (А30Р, А53Т, Е57К), которые обусловливают заболевания, и последовательности, предназначенные для оценки перекрестной реактивности с альфа-синуклеином грызунов. Кроме того, осуществляли точечное нанесение 12 пептидов/белков, которые служили в качестве контролей реактивности и специфичности первичных и вторичных антител. Применяли следующие белки: бычий сывороточный альбумин, человеческий IgG, кроличий IgG, мышиный IgG, человеческий tau-белок, человеческий альфа-синуклеин, человеческий бета-синуклеин, человеческий гамма-синуклеин, человеческий IgM, мышиный IgM, фосфотирозиновый пептид, мутант человеческого альфа-синуклеина с утроенным пролином (А30Р, А56Р, А76Р).

Эпитопное картирование осуществляли согласно инструкциям производителя.

Пример 13

Точное мечение in vivo альфа-синуклеиновой патологии с помощью конъюгатов антитело к альфа-синуклеину - челночный модуль для гематоэнцефалического барьера

План опыта

Трем группам 15-месячных трансгенных по Thyl-(A30P) альфа-синуклеину мышей (мыши Kahle; n=3 на группу) и применяемым в качестве контролей мышам дикого типа (n=1 на группу) инъецировали три различных конъюгата антитело к альфа-синуклеину-челночный модуль для гематоэнцефалического барьера:

- антитело 0070 -> конъюгат антитело 0017-scFab8D3

- антитело 0076 -> конъюгат антитело 0018-scFab8D3

- контроль -> конъюгат 12F4-scFab8D3

Одну трансгенную мышь и одну мышь дикого типа включали в качестве контроля, не подвергнутого инъекции. Всего в опыт включали 14 мышей.

Окрашивание/обнаружение связанного МАт-«шаттла» для головного мозга в ткани головного мозга

Оккупацию мишеней в головном мозге определяли с помощью меченного AF555 антитела к huIgG на криостатных срезах головного мозга толщиной 20 мкм (4 на мышь; фиксированные в ацетоне, блокированные с помощью NGS (нормальная козья сыворотка)). Осуществляли совместное окрашивание: кровеносные сосуды (антитело к подокаликсину, AF647); DAPI.

Результат

Паренхима ствола головного мозга: вариации от крупных невритических/альфа-синуклеиновых агрегированных структур до диффузного точечного окрашивания, напоминающего окрашивание синапсов.

Невритическая патология (основная патологическая особенность на указанной мышиной модели) ограничена стволом головного мозга и отличается значительной вариабельностью от мыши к мыши.

Весь головной мозг, а также у нетрансгенных мышей: в основном точечное окрашивание; напоминает окрашивание синапсов (см. фиг. 11).

Пример 14

Синтез с использованием технологии CelluSpots™ и эпитопное картирование

Пептидный массив для анализа эпитопов антитела 0018 получали, применяя технологию фирмы Intavis CelluSpots™. При таком подходе пептиды синтезировали с использованием автоматического синтезатора (фирма Intavis, MultiPep RS) на модифицированных целлюлозных дисках, которые растворяли после синтеза. Растворы индивидуальных пептидов, которые оставались ковалентно связанными с макромолекулярной целлюлозой, затем наносили пятнами на покрытые предметные стекла для микроскопа. Синтез CelluSpots™ осуществляли постадийно, используя 9-флуоренилметоксикарбонильную (Fmoc) химию, на аминомодифицированных целлюлозных дисках в 384-луночном планшете для синтеза. На каждой стадии сочетания соответствующие аминокислоты активировали с помощью раствора DIC/HOBt в ДМФ. Между стадиями сочетания нереакционноспособные (т.е. свободные) аминогруппы кэппировали смесью уксусного ангидрида, диизопропилэтиламина и 1-гидроксибензотриазола. После завершения синтеза целлюлозные диски переносили в 96-луночный планшет и обрабатывали смесью трифторуксусной кислоты (ТФК), дихлорметана, триизопропилсилана (ТИС) и воды для удаления защитных групп боковых цепей. После удаления раствора для расщепления связанные с целлюлозой пептиды растворяли смесью ТФК, ТФЭСК (трифторэтансульфоновая кислота), ТИС и воды, осаждали простым диизопропиловым эфиром и ресуспендировали в ДМСО. Указанные растворы пептидов затем наносили пятнами на предметные стекла фирмы Intavis CelluSpots™ с использованием автоматического устройства для нанесения пятен на предметные стекла фирмы Intavis.

Для анализа эпитопов подготовленные предметные стекла промывали этанолом и затем TBS (забуференный ТРИС физиологический раствор; 50 мМ Трис, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, рН 8) перед стадией блокады, которую осуществляли в течение 16 ч при 4°С с использованием 5 мл 10-кратного реагента Western Blocking (фирма Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия), 2,5 г сахарозы в TBS, 0,1% Твин-20. После промывки TBS-T (TBS + 0,1% Твин-20) предметные стекла инкубировали с раствором (1 мкг/мл) антитела 0018 в TBS, содержащем 0,1% Твин-2,0 при температуре окружающей среды в течение 2 ч. После промывки предметные стекла инкубировали для обнаружения с использованием антимышиного или антикроличьего вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой из хрена (HRP) (1:20000 в TBS-T) с последующей инкубацией с субстратом DAB (3,3'-диаминобензидин)/пероксидный буфер (фирма Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия). Позитивные по данным ELISA пятна оценивали количественно и путем оценки соответствующих пептидных последовательностей идентифицировали антителосвязывающие эпитопы.

Хотя выше изобретение описано с некоторыми деталями с целью иллюстрации и примера для лучшего его понимания, описание и примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Описание всей патентной и научной литературы, процитированной в настоящем описании, специально полностью включено в него в качестве ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ф. ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ

<120> АНТИТЕЛА К АЛЬФА-СИНУКЛЕИНУ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> Case P31869

<150> EP13193892.0

<151> 2013-11-21

<160> 58

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент человеческого альфа-синуклеина

<400> 1

Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1

<400> 2

Tyr Ala Met Ile

1

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2

<400> 3

Pro Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3

<400> 4

Arg Asp Gly Thr Asp Lys Thr Phe Asn Ile

1 5 10

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL1

<400> 5

Asn Val Tyr Gly Asp Asn

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL2

<400> 6

Glu Ala Ser Lys Leu Ala

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL3

<400> 7

Gly Glu Phe Leu Cys Thr Thr Ser Asp Cys

1 5 10

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1

<400> 8

Ser Tyr Ala Met Ile

1 5

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2

<400> 9

Val Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL1

<400> 10

Gln Ala Ser Gln Asn Val Tyr Gly Asp Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL2

<400> 11

Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL3

<400> 12

Gln Gly Glu Phe Leu Cys Thr Thr Ser Asp Cys Phe Thr

1 5 10

<210> 13

<211> 115

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> heavy chain variable domain

<400> 13

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ile Asn Ser Tyr Ala

20 25 30

Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Val Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Val Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Asp

85 90 95

Gly Thr Asp Lys Thr Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Leu

115

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> light chain variable domain

<400> 14

Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Tyr Gly Asp Asn

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Leu Cys Thr

85 90 95

Thr Ser Asp Cys Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Gly Val Val Val Arg

100 105 110

<210> 15

<211> 3

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1

<400> 15

Arg Tyr Ala

1

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2

<400> 16

Asn Ser Ser Gly Ala

1 5

<210> 17

<211> 14

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3

<400> 17

Trp Thr Tyr Asp Asp Tyr Gly Asp Phe Gln Gly Phe Asn Ile

1 5 10

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL1

<400> 18

Ser Val Tyr Asn Asn Asn Asp Leu Ala

1 5

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL2

<400> 19

Arg Ala Ser Lys Leu Ala

1 5

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL3

<400> 20

Gly Gly Tyr Asp Asp Asp Ala Asp Met Gly Ala

1 5 10

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1

<400> 21

Arg Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 22

<211> 16

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2

<400> 22

Val Ile Asn Ser Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 23

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL1

<400> 23

Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Asp Leu Ala

1 5 10

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL2

<400> 24

Arg Ala Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 25

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL3

<400> 25

Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Asp Ala Asp Met Gly Ala

1 5 10

<210> 26

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи

<400> 26

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Val Ile Asn Ser Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Glu Thr Ser Thr Thr Val Glu Leu Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Thr

85 90 95

Tyr Asp Asp Tyr Gly Asp Phe Gln Gly Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Leu

115

<210> 27

<211> 111

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен легкой цепи

<400> 27

Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn

20 25 30

Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Asp

85 90 95

Ala Asp Met Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH1

<400> 28

Arg Asp Thr Met Ile

1 5

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2

<400> 29

Ser Ile Tyr Thr Asp Ser Gly Asn Thr Trp

1 5 10

<210> 30

<211> 4

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH3

<400> 30

Asn Phe Ser Val

1

<210> 31

<211> 6

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL1

<400> 31

Val Tyr Asn Ser Asp Arg

1 5

<210> 32

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL2

<400> 32

Val Ser Lys Leu Ala

1 5

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL3

<400> 33

Leu Gly Gly Tyr Asp Cys Ser Ser Ala Glu Cys

1 5 10

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRH2

<400> 34

Ser Ile Tyr Thr Asp Ser Gly Asn Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 35

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL1

<400> 35

Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Ser Asp Arg Leu Ala

1 5 10

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL2

<400> 36

Asp Val Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 37

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDRL3

<400> 37

Leu Gly Gly Tyr Asp Cys Ser Ser Ala Glu Cys Asn Val

1 5 10

<210> 38

<211> 111

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи

<400> 38

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Arg Asp Thr

20 25 30

Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ser Ile Tyr Thr Asp Ser Gly Asn Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Arg

65 70 75 80

Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg

85 90 95

Asn Phe Ser Val Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Leu

100 105 110

<210> 39

<211> 112

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен легкой цепи

<400> 39

Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Ser Asp

20 25 30

Arg Leu Ala Trp Phe Gln Gln Met Arg Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Val Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Cys Ser

85 90 95

Ser Ala Glu Cys Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 40

<211> 140

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 41

<211> 18

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкерный пептид

<400> 41

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 42

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> rbHCfinal.up

<400> 42

aagcttgcca ccatggagac tgggctgcgc tggcttc 37

<210> 43

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> rbHCfinal.do

<400> 43

ccattggtga gggtgcccga g 21

<210> 44

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> rbLCfinal.up

<400> 44

aagcttgcca ccatggacay gagggccccc actc 34

<210> 45

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> rbLCfinal.do

<400> 45

cagagtrctg ctgaggttgt aggtac 26

<210> 46

<211> 324

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 46

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 47

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 47

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 48

<211> 106

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 48

Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Glu Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Val Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro

35 40 45

Val Thr Gln Gly Met Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Met Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp Glu

65 70 75 80

Arg His Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val

85 90 95

Glu Lys Ser Leu Ser Arg Ala Asp Cys Ser

100 105

<210> 49

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 50

<211> 330

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> содержащая «впадину» константная область человеческого Ig1 constant region

<400> 50

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 51

<211> 330

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> содержащая «выступ» константная область человеческого Ig1

<400> 51

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 52

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент рецептора человеческого трансферрина

<400> 52

Ile Gly Gln Asn Met Val Thr Ile Val Gln Ser Asn Gly Asn Leu

1 5 10 15

<210> 53

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 53

Asn Met Val Thr Ile Val Gln Ser Asn Gly Asn Leu Asp Pro Val

1 5 10 15

<210> 54

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<400> 54

Gln Ser Asn Gly Asn Leu Asp Pro Val Glu Ser Pro Glu Gly Tyr

1 5 10 15

<210> 55

<211> 32

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептидный линкер

<400> 55

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

<210> 56

<211> 118

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 56

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Met Asn Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Pro Thr Ser His Tyr Val Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Val

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 57

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 57

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu

1 5 10 15

Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Arg Val Gln Val

65 70 75 80

Glu Asp Ile Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Tyr Asn Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 58

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант L104V и L106I SEQ ID NO: 57

<400> 58

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu

1 5 10 15

Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Arg Val Gln Val

65 70 75 80

Glu Asp Ile Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Tyr Asn Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<---

Claims

1. Антитело, связывающееся с человеческим альфа-синуклеином, содержащее

i) в тяжелой цепи HVRs, имеющие SEQ ID NO: 02 до 04, и в легкой цепи HVRs, имеющие SEQ ID NO: 05 до 07; или

ii) в тяжелой цепи HVRs, имеющие SEQ ID NO: 08, 09 и 04, и в легкой цепи HVRs, имеющие SEQ ID NO: 10 до 12.

2. Антитело, связывающееся с человеческим альфа-синуклеином, содержащее

i) в тяжелой цепи HVRs, имеющие SEQ ID NO: 28 до 30, и в легкой цепи HVRs, имеющие SEQ ID NO: 31 до 33; или

ii) в тяжелой цепи HVRs, имеющие SEQ ID NO: 28, 34 и 30, и в легкой цепи HVRs, имеющие SEQ ID NO: 35 до 37.

3. Конъюгат антитела по любому из пп. 1, 2 с челночным модулем для гематоэнцефалического барьера, предназначенный для переноса антитела в головной мозг, где челночный модуль для гематоэнцефалического барьера представляет собой антитело или фрагмент антитела, которое/который специфически связывается с LRP1, LRP8, рецептором человеческого трансферрина или рецептором человеческого инсулиноподобного фактора роста.

4. Антитело по любому из пп. 1, 2, где антитело представляет собой

а) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1, или

е) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в соответствующей другой тяжелой цепи.

5. Антитело по любому из пп. 1, 2, где антитело

I) ингибирует индуцируемую альфа-синуклеином цитотоксичность в человеческих нейронах и глиальных клетках, и/или

IV) специфически связывается с альфа-синуклеином, который имеет свободный N-концевой остаток метионина, и не связывается специфически с альфа-синуклеином, который имеет модифицированный N-концевой остаток метионина.

6. Фармацевтическая композиция для лечения синуклеинопатии или болезни Паркинсона, содержащая эффективное количество антитела по одному из пп. 1, 2, 4, 5 и фармацевтически приемлемый наполнитель.

7. Применение антитела по одному из пп. 1, 2, 4, 5 в качестве лекарственного средства для лечения синуклеинопатии и болезни Паркинсона.

8. Применение антитела по одному из пп. 1, 2, 4, 5 для приготовления лекарственного средства для лечения болезни Паркинсона.