RU2663721C1 - Моноклональные антитела к человеческому il-17 и их применение - Google Patents
Моноклональные антитела к человеческому il-17 и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2663721C1 RU2663721C1 RU2017123752A RU2017123752A RU2663721C1 RU 2663721 C1 RU2663721 C1 RU 2663721C1 RU 2017123752 A RU2017123752 A RU 2017123752A RU 2017123752 A RU2017123752 A RU 2017123752A RU 2663721 C1 RU2663721 C1 RU 2663721C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- sequence
- human
- seq
- variable region
- Prior art date
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims description 43
- 101000998146 Homo sapiens Interleukin-17A Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 32
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 102000053162 human IL17A Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 22
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 10
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 claims description 8
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 7
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims description 5
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 4
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 4
- 230000017306 interleukin-6 production Effects 0.000 claims description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 abstract 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 abstract 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 91
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 91
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 description 39
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 34
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 14
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 102000004554 Interleukin-17 Receptors Human genes 0.000 description 10
- 241000718541 Tetragastris balsamifera Species 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 108010017525 Interleukin-17 Receptors Proteins 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 8
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 8
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 229960004540 secukinumab Drugs 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 5
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 3
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 3
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 229960005435 ixekizumab Drugs 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010051728 Bone erosion Diseases 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 102000039989 IL-17 family Human genes 0.000 description 2
- 108091069193 IL-17 family Proteins 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 2
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 101150038172 1.2 gene Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101001033249 Homo sapiens Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100039065 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 102100033096 Interleukin-17D Human genes 0.000 description 1
- 108010066979 Interleukin-27 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000024949 interleukin-17 production Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000022632 negative regulation of interleukin-6 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012409 standard PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/54—F(ab')2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело и фрагмент антитела, способные к связыванию с человеческим IL-17A. Также рассмотрены фармацевтическая композиция и применение антитела или фрагмента антитела. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии различных заболеваний, опосредованных человеческим IL-17A. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 10 ил., 10 табл., 12 пр.
Description
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится, в целом, к области фармацевтических препаратов на основе антител, созданных методами генетической инженерии, и, в частности, к моноклональному антителу к человеческому IL-17 и его применению. Настоящее изобретение относится к новому моноклональному антителу к человеческому IL-17 и к применению предлагаемого антитела для лечения заболеваний, опосредованных IL-17.
Уровень техники
В настоящее время в состав семейства интерлейкина 17 (IL-17) входят шесть цитокинов, а именно IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E и IL-17F. Члены семейства IL-17 отличаются от других известных цитокинов последовательностью, а также характеризуются относительно низким сходством последовательности среди членов семейства (Gaffen SL, Nat. Rev. Immunol. 2009 Aug; 9(8):556-67). Функция членов семейства IL-17 преимущественно связана с модуляцией иммунного ответа.
IL-17a, гомодимерный гликопротеин с молекулярной массой 20-30 кДа, главным образом вырабатывается активированными CD4+ Т-клетками и действует как провоспалительный цитокин. Секреция IL-17 активированными Т-клетками происходит в очаге воспаления, но не во время их нахождения в системном кровотоке. IL-17 обладает множеством биологических свойств, включая усиление синтеза молекул адгезии и индукцию продукции многих воспалительных цитокинов и хемокинов в различных типах клеток, включая синовиальные клетки, хрящевые клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки эпителия, кератиноциты и макрофаги. Наряду с этим, IL-17 индуцирует агрегацию нейтрофильных гранулоцитов в очаге воспаления, индуцируя секрецию хемокинов, стимулирует продукцию простагландинов и металлопротеаз, а также ингибирует синтез протеогликанов. Кроме того, IL-17 играет решающую роль в созревании гемопоэтических клеток-предшественников. IL-17 участвует в передаче сигнала в различных органах и тканях, включая легкое, суставной хрящ, кость, головной мозг, кроветворные клетки, почки, кожные покровы и кишечник. Таким образом, иммунная реакция, опосредованная IL-17A/Th17, имеет системный характер и приводит к воспалительной реакции, проявляющейся преимущественно в виде инфильтрации нейтрофильными гранулоцитами.
Как видно из многочисленных исследований, повышение уровня IL-17 наблюдается при различных заболеваниях, включая воспаление дыхательных путей, ревматоидный артрит (RA), остеоартрит, эрозию костей, воспалительное заболевание кишечника (IBD), отторжение аллотрансплантата, псориаз, некоторые виды злокачественной опухоли, ангиогенез, атеросклероз и рассеянный склероз (MS) (Witkowski et al, Cell. Mol. Life Sci.61:567-579, 2004). Кроме того, IL-17 играет роль в деградации коллагенового матрикса, а также в регуляции воспаления и постравматических процессов в суставах, независимо от IL-1B. Также, IL-17 и TNF-α действуют синергично, усиливая воспаление. Как было подтверждено в дальнейших исследованиях, блокирование in vivo биологической активности IL-17 с помощью антитела, специфически связывающегося с IL-17 или с растворимым рецептором IL-17, эффективно уменьшает воспаление и костную эрозию в различных животных моделях артрита. Таким образом, IL-17 представляет собой новую терапевтическую мишень в лечении RA и других аутоиммунных заболеваний. Более того, поскольку большая часть IL-17 локализуется в очаге воспаления, лекарственный препарат, нацеленный на IL-17, потенциально может оказаться безопаснее лекарственных препаратов, нацеленных на другие провоспалительные цитокины в системном кровотоке (например, на TNF).
В настоящее время Европейский союз и Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в США одобрили препарат косентикс фармацевтической компании Novartis Pharma AG для лечения взрослых пациентов, страдающих от умеренной - тяжелой формы бляшечного псориаза. Активный ингредиент косентикса - секукинумаб, который представляет собой моноклональное антитело к IL-17. Тем не менее, в настоящей области техники все еще сохраняется потребность в создании более совершенных антител к IL-17, пригодных для лечения пациента.
Сущность изобретения
Согласно одному аспекту настоящей заявки предлагается моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим IL-17A и содержит в своем составе вариабельный участок тяжелой цепи, включающий участки HCDR1, HCDR2 и HCDR3, причем HCDR1 имеет последовательность GX1X2X3X4X5Y, HCDR2 имеет последовательность NQDGX6E и HCDR3 имеет последовательность DYYDX7ISDYYIHYWYFDL; где последовательность Х1Х2Х3Х4Х5 представляет собой FTIDN, MSMSD или ITMDD, Х6 представляет собой N или D, а Х7 представляет собой V или L; и где участки HCDR определены согласно Chothia.
Согласно некоторым вариантам осуществления вариабельный участок тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность, указанную под SEQ ID NO: 24, 25 или 26.
Согласно одному аспекту настоящей заявки предлагается моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим IL-17A и содержит в своем составе вариабельный участок легкой цепи, включающий участки LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем LCDR1 имеет последовательность RASQNVHNRLT, LCDR2 имеет последовательность GASNLES и LCDR3 имеет последовательность QQYNGSPTT; где участки LCDR определены согласно Chothia.
Согласно некоторым вариантам осуществления вариабельный участок легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность, указанную под SEQ ID NO: 21.
Согласно одному аспекту настоящей заявки предлагается моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим IL-17A и содержит в своем составе вариабельный участок тяжелой цепи, включающий участки HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и вариабельный участок легкой цепи, включающий участки LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем HCDR1 имеет последовательность GX1X2X3X4X5Y, HCDR2 имеет последовательность NQDGX6E, HCDR3 имеет последовательность DYYDX7ISDYYIHYWYFDL, LCDR1 имеет последовательность RASQNVHNRLT, LCDR2 имеет последовательность GASNLES и LCDR3 имеет последовательность QQYNGSPTT; где последовательность X1X2X3X4X5 представляет собой FTIDN, MSMSD или ITMDD, Х6 представляет собой N или D, а Х7 представляет собой V или L; и где участки HCDR и LCDR определены согласно Chothia.
Согласно некоторым вариантам осуществления вариабельный участок тяжелой цепи антитела имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 24, а вариабельный участок легкой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 21; или вариабельный участок тяжелой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 25, а вариабельный участок легкой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 21; или вариабельный участок тяжелой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 26, а вариабельный участок легкой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 21.
Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутых трех аспектов антитело представляет собой интактное антитело, по существу, интактное антитело, Fab фрагмент, F(ab')2 фрагмент или одноцепочечный Fv фрагмент.
Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутых трех аспектов антитело представляют собой полностью человеческое антитело.
Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутых трех аспектов антитело дополнительно включает константный участок тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из подтипов IgG1 и IgG4, и/или константный участок легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из подтипов каппа и лямбда.
Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутых трех аспектов предлагаемое моноклональное антитело в концентрации менее 1 нМ способно ингибировать на 50% активность человеческого IL-17a в концентрации 2 нМ, где ингибирование активности измерено путем определения индуцированной человеческим IL-17А продукции IL-6 в дермальных фибробластах человека (HDFa).
Согласно одному аспекту настоящей заявки раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая в своем составе моноклональное антитело, описанное в любом из вышеупомянутых аспектов.
Согласно одному аспекту настоящей заявки раскрыто применение моноклонального антитела, описанного в любом из вышеупомянутых аспектов, для лечения заболевания, опосредованного человеческим IL-17A.
Согласно некоторым вариантам осуществления заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.
Согласно некоторым вариантам осуществления заболевание представляет собой псориаз, ревматоидный артрит или анкилозирующий спондилит.
Согласно одному аспекту настоящей заявки раскрыто применение моноклонального антитела, описанного в любом из вышеупомянутых аспектов, для производства лекарственного препарата, предназначенного для лечения заболевания, опосредованного человеческим IL-17A.
Согласно некоторым вариантам осуществления заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.
Согласно некоторым вариантам осуществления заболевание представляет собой псориаз, ревматоидный артрит или анкилозирующий спондилит.
Согласно одному аспекту настоящей заявки раскрыт способ лечения заболевания, опосредованного человеческим IL-17A, предусматривающий введение моноклонального антитела, описанного в любом из вышеупомянутых аспектов, нуждающемуся в том субъекту.
Согласно некоторым вариантам осуществления заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.
Согласно некоторым вариантам осуществления заболевание представляет собой псориаз, ревматоидный артрит или анкилозирующий спондилит.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана схема строения нового вектора для фагового дисплея pADSCFV-S (Para: арабинозный промотор, PelB leader: ген сигнального пептида PelB, NcoI: сайт рестрикции NcoI, Stuff: спейсерный фрагмент длиной 750 п. н., NotI: сайт рестрикции NotI, gIII: ген gIII фага М13, flori: сайт инициации репликации фага М13, Ampr: ген устойчивости к ампициллину, pBRori: сайт инициации репликации плазмиды pBR322, AraC: ген AraC).
На фиг. 2 показаны результаты конкурентного связывания с IL-17 моноклонального фага и IL17R.
На фиг. 3 представлены схемы строения плазмид pADK-S и pAK-S (Para: арабинозный промотор, leader: ген сигнального пептида PelB, NcoI: сайт рестрикции NcoI, Stuff: спейсерный фрагмент длиной 750 п. н., PmlI: сайт рестрикции PmlI, CK: константный участок легкой каппа-цепи человеческого антитела, f1ori: сайт инициации репликации фага М13, Ampr: ген устойчивости к ампициллину, pBRori: сайт инициации репликации плазмиды pBR322, AraC: ген AraC, CmR: ген устойчивости к хлорамфениколу, CDFori: сайт инициации репликации плазмиды CDF).
На фиг. 4 показаны результаты измерения относительной аффинности фаговых антител с помощью анализов фагового ELISA.
На фиг. 5 показаны результаты оценки с помощью анализов ELISA способности антител к IL-17 связываться с человеческим IL-17.
На фиг. 6 показаны результаты оценки с помощью анализов ELISA способности моноклональных антител к IL-17 связываться с IL-17 из разных видов животных.
На фиг. 7 показаны результаты конкурентного связывания с IL-17 моноклональных антител к человеческому IL-17 и IL17R.
На фиг. 8 показаны результаты сравнительного анализа ингибирования моноклональными антителами к IL-17 индуцированной IL-17 продукции IL-6 в клетках HDFa.
На фиг. 9 показаны результаты анализа стабильности различных моноклональных антител к IL-17 в сыворотке крови человека.
На фиг. 10 показана тенденция изменения концентрации четырех моноклональных антител к IL-17 в организме мышей.
Подробное описание изобретения
Различные изобретения, упоминаемые в настоящей заявке, частично основаны на создании фаговой библиотеки человеческих антител. Авторами настоящего изобретения был проведен скрининг моноклональных антител к человеческому IL-17 с необходимыми свойствами в созданной библиотеке антител.
Согласно различным аспектам настоящей заявки предлагается новое моноклональное антитело к человеческому IL-17 или его антиген-связывающий фрагмент; полинуклеотид, кодирующий указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент; вектор, содержащий в своем составе указанный полинуклеотид; клетка-хозяин, содержащая указанный полинуклеотид или вектор; способ получения и очистки указанного антитела; и медицинское применение указанного антитела или антиген-связывающего фрагмента. На основании последовательностей перспективных участков антитела, предлагаемого в настоящей заявке, молекулу интактного антитела можно составить в форме лекарственного препарата для клинического лечения аутоиммунного заболевания, опосредованного IL-17, в том числе без ограничения псориаза, ревматоидного артрита и анкилозирующего спондилита.
Если не оговорено иначе, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют то же значение, что и в общепринятом их понимании специалистом в настоящей области техники.
В контексте настоящего документа термин «полипептид» относится к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков, связанных посредством пептидной связи. Термин «белок» обычно относится к полипептиду относительно большого размера. Термин «пептид» обычно относится к полипептиду относительно небольшого размера (например, содержащему не более 100, 80, 60, 50, 30 или 20 аминокислотных остатков).
В контексте настоящего документа термин «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина, которая специфически связывается с целевой молекулой посредством по меньшей мере одного антиген-распознающего паратопа в вариабельном участке молекулы иммуноглобулина. Примеры целевой молекулы включают без ограничения углевод, полинуклеотид, липид, полипептид. В контексте настоящего документа термин «антитело» включает в себя не только интактное (полноразмерное) антитело, но также и антиген-связывающий фрагмент (например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv); вариантный, слитый белок, содержащий в своем составе часть антитела; гуманизированное антитело; химерное антитело; диатело; антитело, распознающее линейный эпитоп; одноцепочечное антитело; мультиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело) и любые другие модифицированные версии молекулы иммуноглобулина, содержащие антиген-распознающий участок, обладающий необходимой специфичностью, включая гликозилированный вариант антитела, вариант антитела с модифицированной аминокислотной последовательностью и ковалентно модифицированное антитело.
Интактное или полноразмерное антитело обычно содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), а также первый, второй и третий константный участок (CH1, СН2 и СН3). Каждая легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи (VL) и константный участок (CL). Полноразмерное антитело может принадлежать к любому из классов, например, IgD, IgE, IgG, IgA или IgM (или подклассу любого из вышеупомянутых). Вместе с тем, антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, не обязательно принадлежат к какому-либо определенному классу. Иммуноглобулин может быть отнесен к разным классам на основании аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи антитела. В целом, существует пять классов иммуноглобулинов, а именно IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из этих классов могут быть дополнительно разделены на несколько подклассов (изоформ), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей различных классов иммуноглобулинов называются α, δ, ε, γ и μ. Структуры субъединиц и трехмерные структуры различных классов иммуноглобулинов хорошо известны из уровня техники.
В контексте настоящего документа термин «антиген-связывающий фрагмент» относится к части или участку молекулы интактного антитела, отвечающему за связывание антигена. Антиген-связывающий домен может содержать вариабельный участок тяжелой цепи (VH), вариабельный участок легкой цепи (VL), или оба эти участка. Каждый из участков VH и VL обычно содержит в своем составе три определяющих комплементарность участка, а именно CDR1, CDR2 и CDR3.
Примеры антиген-связывающего фрагмента включают без ограничения (1) Fab фрагмент, который может быть моновалентным фрагментом, содержащим VL-CL цепь и VH-CH1 цепь; (2) F(ab')2 фрагмент, который может быть двухвалентным фрагментом, содержащим два Fab фрагмента, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области (например, димер Fab); (3) Fv фрагмент, содержащий в своем составе VL домен и VH домен одного плеча антитела; (4) одноцепочечный Fv (scFv), который может представлять собой одну полипептидную цепь, содержащую в своем составе VH домен и VL домен, соединенные пептидным линкером; и 5) (scFv)2, который может содержать в своем составе два VH домена, связанные пептидным линкером, и два VL домена, соединенные с двумя VH доменами посредством дисульфидных мостиков.
В контексте настоящего документа термин «специфически связывается с» относится к реакции неслучайного связывания между двумя молекулами, например, к связыванию антитела с эпитопом антигена.
При записи последовательностей нуклеиновых кислот, приведенных в настоящей заявке, наряду с обычными символами А, Т, С и G использованы символы вырожденных оснований. Символы, обозначающие вырожденные основания, использованы в том значении, как их обычно понимает специалист в настоящей области техники. Например, R обозначает А или G, Y обозначает С или Т, М обозначает А или С, K обозначает G или Т, S обозначает С или G, W обозначает А или Т, Н обозначает А или С или Т, В обозначает С или G или Т, V обозначает А или С или G, D обозначает А или G или Т, а N обозначает А или С или G или Т.
Согласно одному аспекту настоящей заявки предлагается моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим IL-17A и содержит в своем составе вариабельный участок тяжелой цепи, включающий участки HCDR1, HCDR2 и HCDR3, причем HCDR1 имеет последовательность GX1X2X3X4X5Y, HCDR2 имеет последовательность NQDGX6E и HCDR3 имеет последовательность DYYDX7ISDYYIHYWYFDL; где последовательность Х1Х2Х3Х4Х5 представляет собой FTIDN, MSMSD или ITMDD, Х6 представляет собой N или D, а Х7 представляет собой V или L; и где участки HCDR определены согласно Chothia.
Согласно некоторым вариантам осуществления вариабельный участок тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность, указанную под SEQ ID NO: 24, 25 или 26.
Согласно одному аспекту настоящей заявки предлагается моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим IL-17A и содержит в своем составе вариабельный участок легкой цепи, включающий участки LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем LCDR1 имеет последовательность RASQNVHNRLT, LCDR2 имеет последовательность GASNLES и LCDR3 имеет последовательность QQYNGSPTT; где участки LCDR определены согласно Chothia.
Согласно некоторым вариантам осуществления вариабельный участок легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, указанную под SEQ ID NO: 21.
Согласно одному аспекту настоящей заявки предлагается моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим IL-17A и содержит в своем составе вариабельный участок тяжелой цепи, включающий участки HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и вариабельный участок легкой цепи, включающий участки LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем HCDR1 имеет последовательность GX1X2X3X4X5Y, HCDR2 имеет последовательность NQDGX6E, HCDR3 имеет последовательность DYYDX7ISDYYIHYWYFDL, LCDR1 имеет последовательность RASQNVHNRLT, LCDR2 имеет последовательность GASNLES и LCDR3 имеет последовательность QQYNGSPTT; где последовательность X1X2X3X4X5 представляет собой FTIDN, MSMSD или ITMDD, Х6 представляет собой N или D, а Х7 представляет собой V или L; и где участки HCDR и LCDR определены согласно Chothia.
Согласно некоторым вариантам осуществления вариабельный участок тяжелой цепи антитела имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 24, а вариабельный участок легкой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 21; или вариабельный участок тяжелой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 25, а вариабельный участок легкой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 21; или вариабельный участок тяжелой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 26, а вариабельный участок легкой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 21.
Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутых трех аспектов антитело представляет собой интактное антитело, по существу интактное антитело, Fab фрагмент, F(ab')2 фрагмент или одноцепочечный Fv фрагмент.
Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутых трех аспектов антитело представляют собой полностью человеческое антитело.
Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутых трех аспектов антитело дополнительно включает константный участок тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из подтипов IgG1 и IgG4, и/или константный участок легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из подтипов каппа и лямбда.
Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутых трех аспектов предлагаемое моноклональное антитело в концентрации менее 1 нМ способно ингибировать на 50% активность человеческого IL-17a в концентрации 2 нМ, где ингибирование активности измерено путем определения индуцированной человеческим IL-17A продукции IL-6 в дермальных фибробластах человека (HDFa).
Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутых трех аспектов предлагаемое антитело представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело и ослабляет или устраняет по меньшей мере одну биологическую активность in vitro или in vivo, в которой участвует IL-17 или его часть, или противодействует ей.
Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутых трех аспектов предлагаемое антитело характеризуется высокой аффинностью связывания с человеческим IL-17.
Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутых трех аспектов предлагаемое антитело характеризуется тем, что оно способно специфически связываться с человеческим IL-17, IL-17 Масаса mulatta и IL-17 Масаса fascicularis на уровне, превышающем фоновый, но не связывается с IL-17 Mus musculus.
Согласно некоторым вариантам осуществления вышеупомянутых трех аспектов антитело содержит в своем составе вариабельный участок и константный участок, причем константный участок тяжелой цепи может принадлежать к подтипу IgG1 (SEQ ID NO: 29) или подтипу IgG4 (SEQ ID NO: 30), а константный участок легкой цепи может принадлежать к подтипу каппа (SEQ ID NO: 31) или подтипу лямбда (SEQ ID NO: 32).
Согласно еще одному аспекту настоящей заявки предлагается полинуклеотид, кодирующий моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, описанные в вышеупомянутых аспектах, вектор, содержащий в своем составе указанный полинуклеотид, и клетка-хозяин, трансфицированная указанным вектором. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку линии СНО или HEK293.
Согласно одному аспекту настоящей заявки раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая в своем составе моноклональное антитело, описанное в любом из вышеупомянутых аспектов.
Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит в своем составе фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество и/или разбавитель.
Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит в своем составе моноклональное антитело в терапевтически эффективном количестве.
Согласно одному аспекту настоящей заявки раскрыто применение моноклонального антитела, описанного в любом из вышеупомянутых аспектов, для лечения заболевания, опосредованного человеческим IL-17A.
Согласно некоторым вариантам осуществления заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.
Согласно некоторым вариантам осуществления заболевание представляет собой псориаз, ревматоидный артрит или анкилозирующий спондилит.
Согласно одному аспекту настоящей заявки раскрыто применение моноклонального антитела, описанного в любом из вышеупомянутых аспектов, для производства лекарственного препарата, предназначенного для лечения заболевания, опосредованного человеческим IL-17A.
Согласно некоторым вариантам осуществления заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.
Согласно некоторым вариантам осуществления заболевание представляет собой псориаз, ревматоидный артрит или анкилозирующий спондилит.
Согласно одному аспекту настоящей заявки раскрыт способ лечения заболевания, опосредованного человеческим IL-17A, предусматривающий введение моноклонального антитела, описанного в любом из вышеупомянутых аспектов, нуждающемуся в том субъекту.
Согласно некоторым вариантам осуществления заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.
Согласно некоторым вариантам осуществления заболевание представляет собой псориаз, ревматоидный артрит или анкилозирующий спондилит.
Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая активность предлагаемого в настоящей заявке антитела может быть проверена с помощью стандартного для настоящей области метода анализа, см., например, Hwang SY, Kim JY, Kim KW, Park MK, Moon Y, Kim WU, Kim HY: IL-17 induces production of IL-6 and IL-8 in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts via NF-kappaB- and PI3-kinase/Akt-dependent pathways. Arthritis research & therapy 2004, 6(2): R120-128. Вкратце, рекомбинантный IL-17 применяют для стимуляции дермальных фибробластов человека (клеток HDFa) в присутствии разных концентраций антитела, предлагаемого в настоящей заявке. После стимуляции в течение 24 ч, отбирают культуральную жидкость и определяют содержание в ней IL-6 методом ELISA. При проведении описанного выше анализа предлагаемое в настоящей заявке антитело в отношении ингибирования продукции IL-6 предпочтительно характеризуется значением IC50 около 0,22 нМ или менее, более предпочтительно, около 0,12 нМ или менее и, еще более предпочтительно, 0,07 нМ или менее.
Согласно некоторым вариантам осуществления стабильность предлагаемого в настоящей заявке антитела в сыворотке человека может быть проверена с помощью стандартного для настоящей области метода анализа. Вкратце, образец моноклональных антител, простерилизованный методом фильтрации, разбавляют в объеме 200 мкл соответственно стерильной смеси на основе нормальной человеческой сыворотки или буфера PBS до конечной концентрации 30 мкг/мл, перемешивают и помещают в водяную баню с температурой 37°С на 8 дней (192 ч). После этого с помощью анализа ELISA оценивают связывание с человеческим IL-17 у моноклональных антител в образце с сывороткой, моноклональных антител в образце с буфером PBS и моноклональных антител из образца, хранившегося в замороженном состоянии. Сравнивают изменение значений способности к связыванию с IL-17 у моноклональных антител в различных образцах. При проведении описанной выше проверки предлагаемое в настоящей заявке антитело предпочтительно сохраняет около 87%, более предпочтительно, около 91% и, еще более предпочтительно, около 97% способности к связыванию с IL-17.
Согласно некоторым вариантам осуществления фармакокинетика предлагаемого в настоящей заявке антитела в организме мышей может быть оценена с помощью стандартного в настоящей области метода анализа. Вкратце, готовят растворы образцов моноклональных антител в буфере PBS (рН 7,0) в концентрации 0,5 мг/мл и вводят его мышам в дозе 5 мг/кг в виде однократной инъекции в хвостовую вену. В каждую группу включают восемь мышей BALB/c, в числе которых четыре самца и четыре самки. После этого осуществляют забор образцов крови из ретроорбитального синуса через 4, 24, 48, 96, 168, 240 и 336 часов после инъекции, собранные образцы хранят при -70°С. После завершения сбора образцов проводят количественное определение концентраций моноклонального антитела в образцах. Определение концентрации лекарственного средства в плазме проводят методом количественного анализа ELISA с иммобилизованным IL-17. В соответствии с моделью реакции первого порядка строят график зависимости натурального логарифма концентрации антител (lnC) от времени (t), таким образом получая угловой коэффициент k. После этого рассчитывают период полужизни (t1/2) моноклонального антитела к IL-17 у мышей по формуле t1/2=0,693/k. При проведении описанной выше проверки предлагаемое в настоящей заявке антитело имеет период полужизни (t1/2) у мышей предпочтительно около 6,7 ч, более предпочтительно, около 7,4 ч и, еще более предпочтительно, около 8,5 ч.
Согласно одному из аспектов настоящей заявки предлагается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая предлагаемое в настоящей заявке антитело или его легкую цепь или тяжелую цепь, вектор, содержащий в своем составе указанную молекулу нуклеиновой кислоты, клетка-хозяин, содержащая указанный вектор, и способ получения указанного антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторной последовательностью, которую способна распознавать клетка-хозяин, трансформированная указанным вектором. Согласно некоторым вариантам осуществления способ получения антитела предусматривает культивирование указанной клетки-хозяина, обеспечивающее экспрессию указанной нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам осуществления способ получения антитела дополнительно предусматривает выделение антитела из кулыуральной среды, в которой культивируют клетку-хозяина.
Согласно одному из аспектов настоящей заявки предлагаются IL-17 Mus musculus (SEQ ID NO: 9), IL-17 Масаса mulatta (SEQ ID NO: 10) или IL-17 Масаса fascicularis (SEQ ID NO: 11), выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая один из них, вектор, содержащий в своем составе указанную молекулу нуклеиновой кислоты, клетка-хозяин, содержащая указанный вектор, и способ получения IL-17 Mus musculus, IL-17 Масаса mulatta или IL-17 Масаса fascicularis.
Примеры
Следующие примеры приведены здесь лишь с целью дополнительных иллюстраций настоящего изобретения, при этом не следует рассматривать их как какое-либо ограничение для настоящего изобретения.
Пример 1
Создание высококачественных фаговых библиотек антител
Метод создания библиотек антител является одним из важных способов получения человеческих моноклональных антител. В настоящее время для получения человеческих моноклональных антител разработан и успешно применяется метод создания библиотек антител, основанный на применении фагового дисплея. В этом примере наглядно показана стратегия и методология создания фаговой библиотеки антител с применением методов генетической инженерии.
1.1 Получение генов вариабельного участка тяжелой цепи и легкой цепи антитела (VH и VL)
Для создания библиотеки человеческих антител прежде всего необходимо получить гены вариабельных участков тяжелых цепей (VH) и вариабельных участков легких цепей (VL) человеческих антител. Гены вариабельных участков антител могут быть получены из лимфоцитов периферической крови здоровых субъектов или могут быть полностью синтетическими.
1.1.1 Получение генов вариабельных участков естественных человеческих антител
Забор крови проводили у 19 здоровых добровольцев (50 мл от каждого). После этого выделяли лимфоциты с помощью раствора для выделения лимфоцитов (MP Biomedicals Inc., кат. №0850494). РНК получали с использованием набора для выделения суммарной РНК производства Omega Inc., (кат. № R6834-01). кДНК получали с использованием набора для обратной транскрипции производства TransGen Biotech Inc. (кат. № АТ301-03). Наконец, в ПЦР-реакции использовали наборы праймеров, приведенные ниже в таблице 1, для амплификации соответственно генов вариабельных участков тяжелых цепей (VH) и генов вариабельных участков легких цепей (VL, включая Vk и Vl) антител. Выделение и очистку амплифицированных продуктов ПЦР (VH, VK или Vl) проводили с помощью стандартного электрофореза в агарозном геле, после чего хранили их для дальнейшего использования при -20°С.
1.1.2 Получение генов вариабельных участков полностью синтетических человеческих антител
Основная стратегия получения генов полностью синтетических антител предусматривает использование вырожденных праймеров для введения необходимых мутаций в участки CDR выбранного в качестве матрицы гена антитела. Для создания библиотеки полностью синтетических человеческих антител в этом примере были выбраны три матрицы вариабельных участков тяжелой цепи человеческого антитела (VH1; VH3 и VH5) и две матрицы вариабельных участков легкой цепи человеческого антитела (VK1 и Vl3).
Пять генов вариабельных участков антител, а именно VH1 (SEQ ID NO: 1), VH3 (SEQ ID NO: 2), VH5 (SEQ ID NO: 3), VK1 (SEQ ID NO: 4) и Vl3 (SEQ ID NO: 5), были сконструированы и синтезированы в Ming Chen Zhi Yuan Inc. Для введения необходимых мутаций в участки CDR1, CDR2 и CDR3 пяти генов вариабельных участков были соответственно разработаны и синтезированы праймеры, приведенные в таблице 2. Необходимые мутации в соответствующие участки CDR вводили с использованием стандартного метода ПЦР и соответствующих наборов вырожденных праймеров, содержащих необходимые мутации. Затем с помощью 2-3 раундов ПЦР с перекрывающимися праймерами создавали полные гены вариабельных участков тяжелой цепи (VH1, VH3, VH5) или вариабельных участков легких цепей (VK1, VL3). Наконец, выделение амплифицированных продуктов ПЦР (VH, VK или Vl) генов вариабельных участков проводили с помощью электрофореза в агарозном геле, после чего сохраняли их для дальнейшего использования при -20°С.
1.2 Создание генов одноцепочечных антител (одноцепочечных Fv, ScFv)
Для создания генов одноцепочечных антител (ScFv) вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL) соединяли с помощью обычно используемого для этой цели гибкого линкера, состоящего из 15 аминокислот. Линкер имел аминокислотную последовательность GGGGSGGGGSGGGGS, которую кодирует последовательность ggtggaggcggttctggcggaggtgggagcggaggcggaggttca. Сконструированное одноцепочечное антитело имело структуру VН-линкер-VL.
С помощью способа, описанного в первом подразделе этого примера, было получено множество генов вариабельных участков тяжелой и легкой цепей, представленных в таблице 3 ниже, в том числе четыре различных гена вариабельных участков тяжелой цепи и три гена вариабельных участков легкой цепи.
Как видно из этой таблицы, использование описанной выше стратегии конструирования одноцепочечных антител и отработанного метода ПЦР с перекрывающимися праймерами позволяет успешно объединять различные тяжелые цепи и легкие цепи. В общей сложности было создано 12 различных генов одноцепочечных антител. Эти 12 генов одноцепочечных антител, амплифицированных с помощью ПЦР, очищали и выделяли с помощью электрофореза в агарозном геле, после чего сохраняли их для дальнейшего использования при -20°С.
1.3 Создание вектора для фагового дисплея на основе арабинозного промотора
В основе традиционных векторов для фагового дисплея лежат lac промоторы (Plac). Однако использование lac промоторов из-за их особенностей, в частности фоновой экспрессии в отсутствие индуктора, отрицательно влияет на размер и разнообразие библиотеки антител. Вектор pCANTAB5E (Amersham Biosciences/GE, Inc.), который обычно используют для фагового дисплея, был изменен нами с использованием стандартных методов молекулярной биологии как описано далее.
С помощью двойного расщепления вектора pCANTAB5E ферментами AflIII и NotI была осуществлена замена Plac промотора и участка сигнального пептида g3 на фрагмент, содержащий ген AraC, арабинозный промотор (Para) и лидерную последовательность PelB, где ген AraC и Para промотор представляли собой часть вектора pBADhis (Invitrogen Inc.), а лидерная последовательность PelB (SEQ ID NO: 6) представляла собой искусственную последовательность. Затем с помощью двойного расщепления ферментами NcoI и NotI между сайтами NcoI и NotI была клонирована спейсерная последовательность длиной около 750 п.н. (SEQ ID NO: 7), в результате чего был создан конечный новый вектор для фагового дисплея pADSCFV-S (фиг. 1). Сайты NcoI и NotI в этом векторе могут облегчать клонирование гена одноцепочечного антитела (ScFv).
1.4 Получение библиотеки одноцепочечных человеческих антител и фаговой библиотеки антител
С использованием стандартных молекулярно-биологических методов и двойного расщепления ферментами NcoI и NotI было проведено соответствующее клонирование в вектор pADSCFV-S 12 генов ScFvs, получение которых описано в разделе 1.2. Продукты лигирования были использованы для трансформации методом электропорации компетентных клеток TG1, при этом для получения каждой суб-библиотеки было проведено около 20 раундов трансформации, а в общей сложности было проведено около 240 раундов трансформации. Размер каждой суб-библиотеки определяли с использованием способов разведений. Для оценки точности каждой суб-библиотеки проводили секвенирование 30-40 колоний, отобранных случайным образом из каждой суб-библиотеки. Данные о размере и точности для 12 суб-библиотек приведены в таблице 4. Суммарный размер 12 суб-библиотек достигал 1,0* 10Е9 при средней величине точности более 75%.
Полученные 12 суб-библиотек соответственно высевали в жидкую среду 2YTAG (А: ампициллин, 100 мкг/мл; G: глюкоза, 2%) и инкубировали при 37°С на качалке при частоте вращения 220 об./мин. до достижения клетками логарифмической фазы роста (OD600=0,8). После этого клетки инфицировали фагами-помощниками М13 (M13KO7, NEB Inc.). После инфицирования среду заменяли на жидкую среду 2YTAKA (А: ампициллин, 100 мкг/мл; K: канамицин, 70 мкг/мл; А: арабиноза, 0,001%) и для размножения фага инкубировали клетки в течение ночи при 28°С на качалке при частоте вращения 220 об./мин. Затем, для получения препаратов очищенного фага (фаг-ScFv), использовали способ осаждения с PEG/NaCl, после чего проводили их титрование. После этого препараты фаг-ScFv, полученные из 12 суб-библиотек, смешивали пропорционально с учетом размера библиотек и, таким образом, получали фаговую библиотеку человеческих антител. Конечный титр фаговой библиотеки составлял 6*10Е12 КОЕ/мл. Полученную библиотеку хранили при -70°С. Данную фаговую библиотеку антител можно было использовать для скрининга специфических человеческих антител к различным представляющим интерес антигенам.
Пример 2
Получение рекомбинантных белковых антигенов
Получение моноклональных антител к IL-17 связано с необходимостью применения нескольких различных рекомбинантных белков, включая человеческий (Homo sapiens) IL-17 (huIL17, SEQ ID NO: 8), мышиный (Mus musculus) IL-17 (moIL17, SEQ ID NO: 9), IL-17 Масаса mulatta (mmIL17, SEQ ID NO: 10), IL-17 Масаса fascicularis (mfIL17, SEQ ID NO: 11) и внеклеточный участок рецептора IL-17 человека (IL17R, SEQ ID NO: 12). Поскольку эти белки содержат модификации, связанные с гликозилированием, предпочтительной для сохранения структур и функций рекомбинантных белков является система экспрессии на основе клеток млекопитающих. Кроме того, для осуществления очистки в структуру этих рекомбинантных белков со стороны С-конца вводили гистидиновую (His) метку (SEQ ID NO: 13) или Fc фрагмент человеческого антитела (SEQ ID NO: 14).
На основе аминокислотных последовательностей различных рекомбинантных белков, представленных в базе данных Uniprot, осуществляли конструирование и последующий синтез генов (содержащих последовательность, кодирующую гистидиновую метку или Fc фрагмент) вышеупомянутых рекомбинантных белков. Синтетические гены рекомбинантных белков с использованием стандартных молекулярно-биологических методов клонировали в векторы, пригодные для экспрессии в эукариотических клетках (например, pcDNA3.1, производства Invitrogen Inc.). Затем полученные плазмиды экспрессии рекомбинантных белков вводили в клетки линии HEK293 (например, клетки HEK293F, Invitrogen Inc.) путем трансфекции с использованием липосом (например, реагента 293fectin, Invitrogen Inc.) или других средств для трансфекции (например, PEI (полиэтиленимина)). Клетки инкубировали в суспензии в бессывороточных условиях в течение 3-4 дней. После этого собирали культуральную жидкость, осаждая клетки центрифугированием.
Для получения рекомбинантных белков, слитых с гистидиновой меткой, рекомбинантные белки в культуральной жидкости подвергали дополнительной очистке на колонках для металл-хелатной аффинной хроматографии (например, HisTrap FF, производства GE Inc.). Для получения рекомбинантных белков, слитых с фрагментом Fc, для дополнительной очистки использовали колонки для аффинной хроматографии с иммобилизованным белком А или G (например, Mabselect SURE, производства GE Inc.). Затем с использованием колонок для обессоливания (например, Hitrap desaulting, производства GE Inc.) проводили замену буферного раствора для хранения рекомбинантных белков на фосфатно-солевой буфер (PBS) (рН 7,0) или другой подходящий буфер. При необходимости, образцы антител могли быть подвергнуты стерилизации фильтрованием, после чего их делили на аликвоты и хранили при -20°С.
Пример 3
Получение моноклональных антител к человеческому IL-17 методом фаговой библиотеки антител
3.1 Обогащение фаговой библиотеки антител моноклональными антителами к человеческому IL-17
Белок huIL17-his (далее именуемый «IL17-His») (5 мкг/мл) использовали как антиген для иммобилизации на планшете для ELISA (по 150 мкл в лунку, всего четыре лунки). Планшет инкубировали в течение ночи при 4°С. После этого планшет для ELISA блокировали фосфатно-солевым буфером с 0,1% Твин 20 (PBST), с добавлением 1% BSA при 37°C в течение 1 ч. Вместе с тем, фаговую библиотеку антител (фаг-scFv), получение которой описано в примере 1, блокировали путем инкубации с PBST с 1% BSA при комнатной температуре в течение 1 ч, при этом количество вносимых фаговых частиц составляло приблизительно 1012. После блокирования фаговую библиотеку антител вносили в планшет для ELISA для проведения связывания антител с антигеном и оставляли на 1 ч при 37°С. Для удаления несвязанных фаговых частиц планшет промывали PBST/PBS. Наконец, связанных фагов элюировали 0,1 М раствором глицин-HCl (рН 2,2), элюат нейтрализовали 1,5 М раствором Трис-HCl (рН 8,8).
Нейтрализованный препарат фагов использовали для инфицирования бактериальных клеток TG1, которые выращивали до логарифмической фазы. Бактерии инкубировали 30 мин. при 37°С и еще 30 мин. при 37°С на качалке при частоте вращения 150 об./мин. Для подсчета количества клеток 1% суспензии бактерий высевали, а оставшуюся часть центрифугировали при 4000 об./мин. 5 мин. После удаления супернатанта бактерии высевали на твердую среду 2YTAG (А: ампициллин, 100 мкг/мл; G: глюкоза, 2%) в чашку и инкубировали в течение ночи при 33°С для проведения последующей процедуры скрининга.
Бактерии собирали с чашек. Необходимое количество собранных бактерий высевали в жидкую среду 2YTAG (А: ампициллин, 100 мкг/мл; G: глюкоза, 2%) и инкубировали на качалке до достижения логарифмической фазы роста. Бактерии инфицировали фагом M13KO7. После инфицирования среду заменяли на жидкую среду 2YTAKA (А: ампициллин, 100 мкг/мл; K: канамицин, 70 мкг/мл; А: арабиноза, 0,001%) и инкубировали бактерии для размножения фага в течение ночи при 28°С на качалке при частоте вращения 220 об./мин. Очистку фагов для проведения последующей процедуры скрининга проводили осаждением с PEG/NaCl. В общей сложности для обогащения фаговой библиотеки было проведено 3 раунда скрининга.
3.2 Выявление отдельных колоний с последовательностями антител к IL-17
После трех раундов скрининга отбирали хорошо различимые одиночные колонии и высевали их в лунки 96-луночного планшета, содержащие среду 2YTAG, и инкубировали при 37°С на качалке при частоте вращения 220 об./мин. до достижения логарифмической фазы роста. В каждую лунку добавляли около 1010 частиц фага-помощника M13KO7. Планшет с клетками инкубировали 30 мин. при 37°С и еще 30 мин. при 37°С на качалке при частоте вращения 150 об./мин., после чего центрифугировали 10 мин. при 2000 об./мин. при комнатной температуре. После удаления супернатанта бактериальные клетки повторно суспендировали в среде 2YTAKA (А: ампициллин, 100 мкг/мл; K: канамицин, 70 мкг/мл; А: арабиноза, 0,001%) и инкубировали в течение ночи при 28°С на качалке при частоте вращения 220 об./мин.
Для иммобилизации вносили IL17-Fc в карбонатном буфере (рН 9,6) и инкубировали в течение ночи при 4°С. После трехкратной промывки PBST, для блокировки при 37°С в течение 1 ч использовали 4% раствор сухого молока в PBST. Культуральную жидкость, собранную после инкубирования в течение ночи моноклональной фаговой культуры, пропорционально разводили в PBST с добавлением 4% сухого молока, который вносили в количестве 100 мкл на лунку блокированного планшета для ELISA для связывания при 37°С в течение 1 ч. Планшет для ELISA отмывали PBST. Конъюгат пероксидазы хрена (HRP) с антителом к М13 разводили в соотношении 1:5000 и вносили в количестве 100 мкл на лунку планшета для ELISA. После инкубации в течение 1 ч при 37°С добавляли проявляющий раствор OPD и проявляли 5-20 мин. Затем реакцию проявления останавливали добавлением 1 М H2SO4 по 50 мкл в лунку. Значения оптической плотности определяли с помощью спектрофотометра для микропланшетов на двух длинах волн 492 нм/630 нм.
После проведения описанных выше процедур были получены приблизительно 300 отдельных колоний, из числа которых были выявлены четыре линии с одноцепочечными антителами (scFv), имеющими различную последовательность и относительно высокую аффинность к IL-17, получившие название 11А, 9G, 3Е и 6D.
3.3 Предварительный функциональный анализ моноклональных антител к IL-17
Четыре моноклональных линии (11А, 9G, 3Е, 6D) высевали в жидкую среду 2YTAG и инкубировали до достижения логарифмической фазы роста. Для инфицировали добавляли фаг-помощник M13KO7 в количестве, превышавшем количество бактерий примерно в 20 раз. После инфицирования среду заменяли на среду 2YTAKA и инкубировали клетки для размножения фага в течение ночи при 28°С на качалке при частоте вращения 220 об./мин. Очистку фагов проводили способом осаждения с PEG/NaCl.
Для иммобилизации вносили IL17-his в карбонатном растворе (рН 9,6) и инкубировали в течение ночи при 4°С. После трехкратной промывки PBST, для блокировки при 37°С в течение 1 ч использовали 4% раствор сухого молока в PBST. Готовили разведение препаратов четырех фагов с титром 5*10Е11 КОЕ/мл. Разведения четырех фагов использовали для приготовления разведений IL17R-his. Начальная концентрация IL17R-his составляла 20 мкг/мл. Для каждого образца готовили по семь трехкратных серийных разведений. Подготовленные разведения вносили в лунки планшета для ELISA в объеме 100 мкл на лунку и инкубировали при 37°С 1 ч. После этого планшет для ELISA промывали раствором PBST. Конъюгат HRP с вторичным антителом к М13 разводили в соотношении 1:5000 и вносили в количестве 100 мкл на лунку планшета для ELISA. После инкубации в течение 1 ч при 37°С добавляли проявляющий раствор OPD и проявляли 5-20 мин. Затем реакцию проявления останавливали добавлением 1 М H2SO4 по 50 мкл в лунку. Значения оптической плотности определяли с помощью спектрофотометра для микропланшетов на двух длинах волн 492 нм/630 нм.
Из полученных результатов (см. фиг. 2) видно, что одноцепочечные антитела 11А и 9G были способны конкурировать с IL17R-his за связывание с IL17-his, что свидетельствует о том, что 11А (SEQ ID NO: 15) и 9G (SEQ ID NO: 16) имеют такой же сайт связывания с IL-17, что и IL17R. В то же время, одноцепочечные антитела 3Е и 6D не конкурировали с IL17R-his и представляют собой нефункциональные антитела.
Пример 4
Повышение аффинности моноклональных антител к IL-17 на основе стратегии замещения легких цепей
4.1 Создание системы фагового дисплея с двумя векторами, необходимой для повышения аффинности антител
Для облегчения введения мутаций в легкие и тяжелые цепи антител были созданы три набора (всего шесть) векторов прокариотической экспрессии, которые могут сосуществовать в одной клетке Е. coli. Этот процесс описан подробнее ниже.
С использованием плазмиды pADSCFV-S, описанной в примере 1, в качестве исходной плазмиды и с помощью двойного расщепления ферментами PmlI и XbaI, вместо гена gIII в изначальном векторе в вектор pADSCFV-S был клонирован ген константного участка легкой каппа-цепи синтетического человеческого антитела (SEQ ID NO: 17), в результате чего был создан вектор pADK-S (см. фиг. 3). Этот вектор можно было использовать для клонирования и экспрессии гена легкой каппа-цепи человеческого антитела.
Подобным образом, с использованием плазмиды pADSCFV-S, описанной в примере 1, в качестве исходной плазмиды и с помощью помощью двойного расщепления ферментами PmlI и XbaI, вместо гена gIII в изначальном векторе в вектор pADSCFV-S был клонирован слитый ген, кодирующий константный участок СН1 тяжелой цепи синтетического человеческого антитела и С-концевой домен белка gIII, (SEQ ID NO: 18) или константный участок легкой лямбда-цепи человеческого антитела (SEQ ID NO: 19), в результате чего были созданы векторы pADG-S и pADL-S.
Ген устойчивости к хлорамфениколу (CmR) был получен из плазмиды pACYC184 (NEB Inc.) путем амплификации с помощью ПЦР. Сайт инициации репликации плазмиды CDF (CDFori, SEQ ID NO: 20) был синтезирован искусственным путем. Затем с помощью стандартной методики ПЦР с перекрывающимися праймерами был создан слитый ген CmR-CDoriF (по разным концам которого соответственно были добавлены сайты XbaI и AflIII). Затем, после двойного расщепления ферментами XbaI и AflIII, слитый ген CmR-CDFori клонировали соответственно в каждый из векторов pADK-S, pADG-S и pADL-S вместо участка f1ori-Ampr-pBRori, в результате чего были созданы три новые плазмиды pAK-S (см. фиг. 3), pAG-S и pAL-S.
4.2 Создание библиотеки легких цепей человеческих антител для процедуры замены легких цепей
Для облегчения проведения процедуры замены легких цепей антител, в качестве исходных плазмид были использованы плазмиды pADK-S и pADL-S для создания высококачественной библиотеки легких цепей человеческих антител. Этот процесс описан подробнее ниже.
Гены VK1 получали путем амплификации по стандартному методу ПЦР с использованием в качестве матриц ДНК из четырех суб-библиотек, содержащих гены вариабельного участка VK1, получение которых описано в примере 1, и праймеров, приведенных в таблице 5. Затем, с помощью двойного расщепления ферментами NcoI и PmlI, амплифицированные последовательности генов VK1 клонировали в вектор pADK-S на место спейсерной последовательности. Продукты лигирования вводили методом электропорации в компетентные клетки TG1, в результате чего была создана библиотека легких цепей VK1 человека. Размер библиотеки рассчитывали с использованием способов разведений. Для оценки точности каждой библиотеки легких цепей VK1 случайным образом отбирали 30 колоний для проведения секвенирования. Результаты представлены в таблице 6.
Аналогичным образом, гены VL3 получали путем амплификации с использованием в качестве матриц ДНК из четырех суб-библиотек, содержащих гены вариабельного участка VL3, получение которых описано в примере 1, и праймеров, приведенных в таблице 5. Затем с помощью двойного расщепления ферментами NcoI и PmlI амплифицированные последовательности генов VL3 клонировали в вектор pADL-S на место спейсерной последовательности. Продукты лигирования вводили методом электропорации в компетентные клетки TG1, в результате чего была создана библиотека легких цепей VL3 человека. Размер библиотеки рассчитывали с использованием способов разведений. Для оценки точности каждой библиотеки легких цепей VL3 случайным образом отбирали 30 колоний для проведения секвенирования. Результаты представлены в таблице 6. Суммарный размер двух библиотек легких цепей составлял 1,0*10Е8 при точности более 90%.
Затем две полученные суб-библиотеки легких цепей соответственно высевали в жидкую среду 2YTAG (А: ампициллин, 100 мкг/мл; G: глюкоза, 2%) и инкубировали до достижения логарифмической фазы роста. После этого клетки инфицировали фагами-помощниками М13 (M13KO7). После инфицирования среду заменяли на жидкую среду 2YTAKA (А: ампициллин, 100 мкг/мл; K: канамицин, 70 мкг/мл; G: глюкоза, 2%) и инкубировали клетки для размножения фага в течение ночи при 28°С на качалке при частоте вращения 220 об./мин. Затем для получения препаратов очищенного фага использовали способ осаждения с PEG/NaCl, после чего проводили их титрование. После этого препараты фагов из двух полученных суб-библиотек смешивали пропорционально с учетом размера библиотек и таким образом получали фаговую библиотеку (фаг-VK1+VL3) для сборки легких цепей человеческих антител. Конечный титр фаговой библиотеки составлял 5,4*10Е11 КОЕ/мл. Полученную библиотеку хранили при -70°С. Эту фаговую библиотеку можно было использовать в процедурах замены легких цепей в различных антителах.
4.3 Процедуры замены легких цепей в антителах к IL-17
Легкие цепи (11AVK, 9GVK) и тяжелые цепи (11AVH, 9GVH) двух одноцепочечных антител 11А и 9G, полученных в результате скрининга из библиотеки человеческих антител, клонировали соответственно в векторы прокариотической экспрессии pADK-s и pAG-s, благодаря чему были получены плазмиды pADK-11AVK, pADK-9GVK, pAG-11AVH и pAG-9GVH, позволяющие экспрессировать соответствующие легкие и тяжелые цепи. Плазмиды с клонированными генами тяжелой цепи (pAG-HAVH, pAG-9GVH) использовали для трансформации клеток TG1. Затем клетки инфицировали фагом, обеспечивающим упаковку библиотеки легких цепей (фаг-VK1+VL3), тем самым получая библиотеки мутированных легких цепей двух антител (11AVH-VK1+VL3 и 9GVH-VK1+VL3).
После этого две библиотеки мутированных легких цепей (11AVH-VK1+VL3 и 9GVH-VK1+VL3) соответственно высевали в жидкую среду 2YTACG (А: ампициллин, 100 мкг/мл; С: хлорамфеникол, 34 мкг/мл; G: глюкоза, 2%) и инкубировали до достижения клетками логарифмической фазы роста. После этого клетки инфицировали фагами-помощниками М13 (M13KO7). После инфицирования среду заменяли на жидкую среду 2YTACKA (A: ампициллин, 100 мкг/мл; С: хлорамфеникол, 34 мкг/мл; K: канамицин, 70 мкг/мл; А: арабиноза, 0,001%) и инкубировали клетки для размножения фага в течение ночи при 28°С на качалке при частоте вращения 220 об./мин. Затем, для получения препаратов очищенной фаговой библиотеки (фаг-11AVH-VK1+VL3 и фаг-9GVH-VK1+VL3), использовали способ осаждения с PEG/NaCl, после чего проводили их титрование. Две фаговые библиотеки смешивали в равных пропорциях. Конечный титр фаговой библиотеки составлял 1,9*10Е13 КОЕ/мл. Полученную библиотеку хранили при -70°С.
Согласно стандартной методологии и метода фагового дисплея использовали IL17-His в двух раундах обогащения смешанной библиотеки фаг-11AVH-VK1+VL3 и фаг-9GVH-VK1+VL3. Затем использовали способ фагового ELISA для выявления обогащенных отдельных колоний (приблизительно 400 колоний). Колонии с высокими значениями сигнала в ELISA отбирали для секвенирования. Колонии, для которых секвенирование подтвердило правильность клонированной последовательности, использовали для получения препаратов очищенного фага. Тем временем плазмиды, с которых экспрессировались легкие цепи и тяжелые цепи двух антител (11А и 9G), были использованы для совместной трансформации клеток TG1. В качестве положительного контроля были использованы препараты очищенного фага.
4.4 Сравнение относительной аффинности моноклональных мутантных антител к IL-17 методом ELISA очищенного фага
Титры множества очищенных моноклональных фагов доводили до 1*10Е11 КОЕ/мл. Трехкратные серийные разведения готовили с использованием 4% раствора сухого молока в буфере PBST. Способность фаговых антител связывать IL-17 анализировали для отдельных разведений стандартным способом фагового ELISA с иммобилизованным IL17-Fc (2 мкг/мл). Из результатов фагового ELISA видно, что из нескольких фаговых антител, отобранных с помощью скрининга после проведения процедуры замены легких цепей на антителах 11А и 9G, все могли связываться с IL-17. Кроме того, С2 (SEQ ID NO: 21) и D5 (SEQ ID NO: 22) обладали значительно более высокой относительно аффинностью по сравнению с антителами от других колоний (см. фиг. 4). Было отмечено, что антитела С2 и D5 содержали тяжелые цепи 9GVH.
Пример 5
Создание и скрининг библиотеки мутантных последовательностей, кодирующих вариабельный участок тяжелой цепи 9G (9GVH)
В целях дополнительного повышения аффинности моноклональных антител к IL-17 была создана библиотека мутантных последовательностей, кодирующих вариабельный участок тяжелой цепи 9G. Для скрининга библиотеки мутантных тяжелых цепей была использована система фагового дисплея с двумя векторами.
В качестве матрицы использовали ген, кодирующий вариабельный участок тяжелой цепи 9G (9GVH, SEQ ID NO: 23). Различные запланированные мутации вводили в участки CDR 9GVH по стандартному методу ПЦР с использованием вырожденных праймеров, показанных в таблице 7. После этого в процедуре сборки с целью получения мутированных генов интактных вариабельных участков тяжелой цепи 9G использовали способ ПЦР с перекрывающимися праймерами. Мутированные гены 9GVH клонировали в вектор pADG-S с использованием двойного расщепления ферментами NcoI и PmlI. Продукты лигирования были использованы для трансформации методом электропорации компетентных клеток TG1, в результате чего была создана библиотека мутантных генов 9GVH с размером приблизительно 4*10Е6. Для секвенирования было случайным образом отобрано 20 отдельных колоний. По результатам секвенирования точность библиотеки мутантных генов составляла 70% (14/20).
Затем созданную библиотеку мутантных генов 9GVH (в бактериальных клетках TG1) высевали в жидкую среду 2YTAG (А: ампициллин, 100 мкг/мл; G: глюкоза, 2%) и инкубировали до достижения клетками логарифмической фазы роста. После этого клетки инфицировали фагами-помощниками М13 (M13KO7). После инфицирования среду заменяли на жидкую среду 2YTAKA (А: ампициллин, 100 мкг/мл; K: канамицин, 70 мкг/мл; G: глюкоза, 2%) и инкубировали клетки для размножения фага в течение ночи при 28°С на качалке при частоте вращения 220 об./мин. Затем, для получения препаратов очищенного фага, упаковывающего библиотеку мутантных генов 9GVH (фаг-9GVH), использовали способ осаждения с PEG/NaCl, после чего проводили их титрование. Конечный титр фаговой библиотеки составлял 1,4*10Е13 КОЕ/мл. Полученную библиотеку хранили при -70°С.
С использованием стандартного метода ПЦР два гена легкой цепи С2 и D5, скрининг которых описан в примере 4, клонировали в вектор pAK-S, который затем использовали для трансформации бактерий TG1, в результате чего были получены две линии pAK-C2/TG1 и pAK-D5/TG1. Затем клетки pAK-C2/TG1 и pAK-D5/TG1 в логарифмической фазе роста инфицировали фаговой библиотекой (фаг-9GVH), в результате чего были получены две библиотеки мутантных генов 9GVH (легкими цепями соответственно были С2 и D5).
Затем, согласно стандартным протоколам фагового дисплея, для инфицирования использовали M13KO7. Фаги экспонировали на своей поверхности две библиотеки Fab-фрагментов, содержащие мутированные цепи 9GVH, таким образом были созданы две библиотеки фагового дисплея Fab-фрагментов (фаг-С2-9GVH и фаг-D5-9GVH). Две библиотеки фагового дисплея смешивали в равных пропорциях. Было проведено два раунда скрининга смешанной библиотеки фаг-С2-9GVH и фаг-D5-9GVH с использованием IL-17. Для выявления с помощью моноклонального фагового ELISA было отобрано приблизительно 300 колоний. В итоге, для дальнейшего исследования были отобраны три мутантных линии 9GVH, которые были названы 9GA3 (SEQ ID NO: 24), 9GC2 (SEQ ID NO: 25) и 9GC5 (SEQ ID NO: 26). Кроме того, все три мутанта 9GVH содержали обладавшую наибольшей специфичностью легкую цепь С2 (SEQ ID NO: 21).
Пример 6
Экспрессия и очистка моноклональных антител
Поскольку антитела представляют собой большие белковые молекулы со сложными пост-трансляционными модификациями, для экспрессии рекомбинантных интактных антител обычно используют системы экспрессии на основе клеток млекопитающих. Кроме того, с помощью способа аффинной хроматографии с иммобилизованным белком А или G можно было легко очистить антитела до степени чистоты более 95%. В этом примере кратко описаны способы и методы получения обычных рекомбинантных антител.
Гены тяжелых и легких цепей представляющего интерес антитела с использованием стандартного молекулярно-биологического метода клонировали в векторы, пригодные для экспрессии в эукариотических клетках (например, pcDNA3.1, производства Invitrogen Inc.). Константный участок тяжелой цепи антитела мог принадлежать к подтипу IgG1 (SEQ ID NO: 29) или подтипу IgG4 (SEQ ID NO: 30), a константный участок легкой цепи мог принадлежать к подтипу каппа (SEQ ID NO: 31) или подтипу лямбда (SEQ ID NO: 32).
Затем полученные плазмиды, с которых экспрессировалась тяжелая цепь и легкая цепь, вводили совместно в клетки HEK293 (например, HEK293F от Invitrogen Inc.) или клетки СНО (например, CHO-S от Invitrogen Inc.) путем трансфекции с использованием липосом (например, реагента 293fectin от Invitrogen Inc.) или других средств для трансфекции (например, PEI). Клетки инкубировали в суспензии в бессывороточных условиях в течение 3-4 дней. После этого собирали культуральную жидкость, осаждая клетки центрифугированием. Для дополнительной очистки рекомбинантного антитела из культуральной жидкости использовали колонку для аффинной хроматографии с иммобилизованным белком А или G (например, Mabselect SURE, производства GE Inc.). Затем с использованием колонок для обессоливания (например, Hitrap desaulting, производства GE Inc.) проводили замену буферного раствора для хранения антитела на фосфатно-солевой буфер (PBS) (рН 7,0) или другой подходящий буфер (например, 0,1 М NaCl, 0,01 М цитрат натрия, рН 6,0). При необходимости, образцы антитела могли быть подвергнуты стерилизации фильтрованием, после чего их делили на аликвоты и хранили при -20°С.
Пример 7
Анализ связывания моноклональных антител к IL-17 с человеческим IL-17
Способность связываться с IL17-His четырех моноклональных антител к IL-17, 9GA3, 9GC2, 9GC5 и контрольного антитела секукинумаб (VH: SEQ ID NO: 27, VK: SEQ ID NO: 28), оценивали в ходе анализов ELISA.
IL17-His использовали для иммобилизации на планшетах в течение ночи при 4°С (0,5 мкг/мл, 100 мкл на лунку). Готовили серийные трехкратные разведения каждого моноклонального антитела с начальной концентрацией 300 нМ. Для каждого образца моноклонального антитела делали одиннадцать серийных разведений. Способность моноклональных антител к связыванию IL-17 в каждом разведении определяли с помощью конъюгата HRP с козьим антителом к человеческому IgG (см. фиг. 5).
Пример 8
Связывание моноклональных антител к IL-17 с IL-17 других видов животных
Четыре типа приготовленных IL-17 (huIL17, mIL17, mmIL17 и mfIL17) использовали для иммобилизации на 96-луночных планшетах для ELISA в течение ночи при 4°С (1 мкг/мл, 100 мкл на лунку). В планшеты добавляли блокирующий раствор (2% сухое молоко в PBST) и инкубировали планшеты при 37°С 1 ч. После этого на планшеты наносили различные моноклональные антитела к IL-17, в том числе 9GA3, 9GC2, 9GC5, секукинумаб и иксекизумаб (VH: SEQ ID NO:33, VK: SEQ ID NO: 34), и оставляли для прохождения связывания при 37°С 1 ч. Затем планшеты промывали четыре раза посредством PBST. После этого добавляли конъюгат HRP с антителом к человеческому IgG (вторичное антитело) и оставляли инкубироваться при 37°С на 1 ч. Затем планшеты промывали четыре раза посредством PBST. В лунки планшета вносили проявляющий раствор OPD и проявляли 5-10 мин. Реакцию проявления останавливали добавлением 1 М H2SO4. Значения оптической плотности при длине волны 492 нм определяли с помощью спектрофотометра для планшетов (Spectra Мах190, Molecular Device). Как видно из результатов на фиг. 6, моноклональные антитела к IL-17, предлагаемые в настоящем изобретении, и контрольные антитела были способны специфически распознавать человеческий IL-17, IL-17 Масаса mulatta и Масаса fascicularis, но не связывались с мышиным IL-17.
Пример 9
Конкурентное связывание IL-17 моноклональными антителами к человеческому IL-17 и рецептором IL-17 (IL17R)
Функциональное моноклональное антитело к IL-17 должно было быть способным блокировать связывание IL17R с IL-17 на уровне белка. В этом примере оценивали способность четырех моноклональных антител к IL-17 (9GA3, 9GC2, 9GC5 и секукинумаб) ингибировать связывание IL17R с IL-17.
IL17-Fc использовали для иммобилизации на планшетах в течение ночи при 4°С (0,5 мкг/мл, 100 мкл на лунку). Готовили серийные трехкратные разведения каждого моноклонального антитела (с начальной концентрацией 200 мкг/мл) с добавлением IL17R-his (2 мкг/мл). Для каждого образца моноклонального антитела делали десять серийных разведений. Для определения сигнала связывания IL17R-his с IL17-Fc использовали конъюгат HRP с мышиным моноклональным антителом к гистидиновой метке. Затем для анализа данных и построения графиков использовали ПО GraphPad Prism 6 (см. фиг. 7).
Клетки HDFa (взрослые дермальные фибробласты) были приобретены у Sciencell Inc. (кат. №2320). Клетки инкубировали и пересевали согласно инструкциям, предоставленным Sciencell Inc.
В случае оценки значений активности моноклональных антител к IL-17 с использованием клеток HDFa, клетки HDFa высевали в 96-луночные планшеты с плотностью клеток 1*10Е4 клеток в лунку. В среду FM добавляли 1% FBS, по содержанию остальных компонентов питательная среда не отличалась от полной среды FM. Клетки культивировали в течение ночи при 37°С. На следующий день среду заменяли на среду (FM+1% FBS) с добавлением 2 нМ IL17-His и моноклональных антител к IL-17 (9GA3, 9GC2, 9GC5 и секукинумаба) в разных концентрациях (0,01-10 нМ) и культивировали клетки в течение 24 ч. После этого собирали культуральную жидкость. Содержание IL-6 в культуральной жидкости каждой культуры определяли с использованием набора реагентов для количественного определения IL-6 (кат. №ЕНоо4-96), производства Excell Biology Inc. Затем для анализа данных и построения графиков использовали ПО GraphPad Prism 6 (см. фиг. 8). Значения IC50 для каждого моноклонального антитела к IL-17, определенные на основании ингибрования секреции IL-6, приведены в таблице 8.
Пример 11
Оценка стабильности моноклональных антител к IL-17 в сыворотке крови человека
С целью предварительной оценки специфичности различных моноклональных антител к IL-17 и их стабильности в сыворотке крови была проведена оценка стабильности моноклональных антител к IL-17 в сыворотке крови человека. Для этого исследования были использованы четыре моноклональных антитела к IL-17, а именно 9GA3, 9GC2, 9GC5 и секукинумаб. Готовили растворы образцов очищенных моноклональных антител в 0,01 М цитрате натрия, 0,1 М NaCl, рН 6,0. Образцы моноклональных антител, подвергнутые стерилизации фильтрованием, разводили в 200 мкл смеси на основе стерильной сыворотки, полученной от здоровых субъектов, или в PBS до конечной концентрации 30 мкг/мл. После тщательного перемешивания образцы помещали на водяную баню с температурой 37°С на восемь дней (192 ч). Спустя восемь дней с помощью анализов ELISA проводили оценку способности связываться с человеческим IL-17 у образцов в сыворотке (А), образцов в PBS (В) и образцов моноклональных антител, хранившихся в замороженном виде (С) (см. фиг. 9). Для каждого образца моноклонального антитела проводили сравнение (А/С) изменения IL-17-связывающей способности. Как видно из данных в приведенной ниже таблице 9, четыре моноклональных антитела к IL-17 обладали хорошей стабильностью в сыворотке крови.
Пример 12
Оценка фармакокинетики (pK) in vivo в организме мышей
Для определения метаболических свойств моноклональных антител к IL-17 in vivo в организме мышей различные моноклональные антитела к IL-17 вводили в виде однократной дозы в хвостовую вену мышей с целью оценки pK. Для этого исследования были использованы четыре моноклональных антитела к IL-17 (подтип IgG4), а именно 9GA3, 9GC2, 9GC5 и иксекизумаб. Готовили растворы образцов моноклональных антител в буфере PBS (рН 7,0) с концентрацией 0,5 мг/мл. Доза введения составляла 5 мг/кг. Однократную дозу вводили в хвостовую вену. В каждую группу вошло восемь мышей BALB/c, половина из которых были самцы, а половина - самки. Забор образцов крови осуществляли через 4, 24, 48, 96, 168, 240 и 336 часов после введения (из ретроорбитального синуса), собранные образцы хранили при -70°С. После завершения сбора образцов определяли концентрации моноклональных антител.
Определение значений концентрации в крови проводили с помощью анализа количественной ELISA на иммобилизованном IL-17. В качестве стандартных образцов в количественной оценке использовали образцы четырех очищенных моноклональных антител к IL-17 (9GA3, 9GC2, 9GC5 и иксекизумаба), на основании полученных данных соответственно строили калибровочные кривые для использования в ходе количественной оценки значений концентрации моноклональных антител в крови. Тенденции изменения концентраций четырех моноклональных антител in vivo в организме мышей показаны на фиг. 10.
В соответствии с моделью реакции первого порядка строили график зависимости натуральных логарифмов концентрации антител (lnC) от времени (t), таким образом рассчитывая угловой коэффициент k. После этого по формуле t1/2=0,693/k рассчитывали значения периода полужизни (t1/2) четырех моноклональных антител к IL-17 у мышей. Результаты представлены в таблице 10.
Claims (18)
1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с человеческим IL-17A и содержит вариабельный участок тяжелой цепи, включающий участки HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и вариабельный участок легкой цепи, включающий участки LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем
HCDR1 имеет последовательность GFTIDNY, HCDR2 имеет последовательность NQDGNE, HCDR3 имеет последовательность DYYDVISDYYIHYWYFDL или
HCDR1 имеет последовательность GMSMSDY, HCDR2 имеет последовательность NQDGDE, HCDR3 имеет последовательность DYYDLISDYYIHYWYFDL или
HCDR1 имеет последовательность GITMDDY, HCDR2 имеет последовательность NQDGNE, HCDR3 имеет последовательность DYYDLISDYYIHYWYFDL; и
LCDR1 имеет последовательность RASQNVHNRLT, LCDR2 имеет последовательность GASNLES и LCDR3 имеет последовательность QQYNGSPTT; и
где участки HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 определены согласно Chothia.
2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, причем
вариабельный участок тяжелой цепи антитела имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 24, а вариабельный участок легкой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 21; или
вариабельный участок тяжелой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 25, а вариабельный участок легкой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 21; или
вариабельный участок тяжелой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 26, а вариабельный участок легкой цепи имеет последовательность, указанную под SEQ ID NO: 21.
3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1,2, причем антитело представляет собой интактное антитело, по существу интактное антитело, Fab фрагмент, F(ab')2 фрагмент или одноцепочечный Fv фрагмент.
4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, причем антитело представляет собой полностью человеческое антитело.
5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4, причем антитело дополнительно включает константный участок тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из подтипов IgG1 и IgG4, и/или константный участок легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из подтипов каппа и лямбда.
6. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, причем моноклональное антитело в концентрации менее 1 нМ способно ингибировать на 50% активность человеческого IL-17А в концентрации 2 нМ, где ингибирование активности измерено путем определения индуцированной человеческим IL-17A продукции IL-6 в дермальных фибробластах человека (HDFa).
7. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, опосредованного человеческим IL-17A, содержащая моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в эффективном количестве по любому из пп. 1-6.
8. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-6 в производстве лекарственного препарата для лечения заболевания, опосредованного человеческим IL-17A.
9. Применение по п. 8, причем заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.
10. Применение по п. 8, причем заболевание представляет собой псориаз, ревматоидный артрит или анкилозирующий спондилит.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510097117.0A CN105315371B (zh) | 2015-03-05 | 2015-03-05 | 抗人il-17单克隆抗体 |
| CN201510097117.0 | 2015-03-05 | ||
| PCT/CN2016/074805 WO2016138842A1 (zh) | 2015-03-05 | 2016-02-29 | 抗人il-17单克隆抗体及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2663721C1 true RU2663721C1 (ru) | 2018-08-08 |
Family
ID=55243758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017123752A RU2663721C1 (ru) | 2015-03-05 | 2016-02-29 | Моноклональные антитела к человеческому il-17 и их применение |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10392436B2 (ru) |
| EP (1) | EP3181587B1 (ru) |
| CN (2) | CN108251431B (ru) |
| RU (1) | RU2663721C1 (ru) |
| WO (1) | WO2016138842A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201701920B (ru) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108251431B (zh) | 2015-03-05 | 2020-12-08 | 北京百特美博生物科技有限公司 | 双载体系统及其用途 |
| CN107236041B (zh) * | 2016-03-29 | 2020-07-24 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | Il-17抗体 |
| WO2018050028A1 (zh) * | 2016-09-14 | 2018-03-22 | 北京韩美药品有限公司 | 一种能够特异性地结合il-17a的抗体及其功能片段 |
| CN107698680B (zh) * | 2017-01-22 | 2019-03-01 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 抗pcsk9单克隆抗体 |
| CN109796534B (zh) * | 2017-11-16 | 2021-08-10 | 北京比洋生物技术有限公司 | 抗il-17抗体/tnfr ecd融合蛋白及其用途 |
| CN110551215A (zh) * | 2018-05-30 | 2019-12-10 | 中山康方生物医药有限公司 | 抗白细胞介素-17a抗体、其药物组合物及其用途 |
| CN109679920B (zh) * | 2018-12-26 | 2019-11-22 | 北京贝来生物科技有限公司 | 一种表达il-17a信号通路阻断剂的间充质干细胞 |
| EP3689907A1 (en) * | 2019-01-31 | 2020-08-05 | Numab Therapeutics AG | Antibodies targeting il-17a and methods of use thereof |
| CN113631574A (zh) | 2019-01-31 | 2021-11-09 | 努玛治疗有限公司 | 对TNFα和IL-17A具有特异性的多特异性抗体、靶向IL-17A的抗体及其使用方法 |
| CN112142841B (zh) * | 2020-09-27 | 2022-03-22 | 江苏荃信生物医药股份有限公司 | 一种新的抗人il-17a单克隆抗体、包含其的试剂盒及其检测方法 |
| CN112390890B (zh) * | 2020-11-06 | 2022-06-24 | 江苏荃信生物医药股份有限公司 | 一种定量检测血清中抗人白介素17单克隆抗体含量的酶联免疫分析方法 |
| WO2022144023A1 (zh) * | 2021-01-04 | 2022-07-07 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 抗il-17抗体治疗自身免疫性疾病和炎症的方法 |
| CN113896793B (zh) * | 2021-09-30 | 2023-05-26 | 港科鹏禾生物(苏州)有限公司 | 一种抗人il-17rc的单克隆抗体及其应用 |
| CN117106083A (zh) * | 2022-03-25 | 2023-11-24 | 南京融捷康生物科技有限公司 | 一种抗il-17a的单域抗体及其用途 |
| CN117327174A (zh) * | 2022-06-24 | 2024-01-02 | 广东菲鹏制药股份有限公司 | 抗新型冠状病毒人源化多价结合蛋白及其应用 |
| CN117430696A (zh) * | 2022-07-22 | 2024-01-23 | 北京智仁美博生物科技有限公司 | 用于表达Fab片段库的重组系统 |
| CN116987183B (zh) | 2022-07-22 | 2024-10-15 | 北京智仁美博生物科技有限公司 | 抗呼吸道合胞病毒中和性抗体及其用途 |
| CN118330232A (zh) * | 2024-04-17 | 2024-07-12 | 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) | 一种司库奇尤单抗游离药物检测试剂 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007117749A2 (en) * | 2006-01-31 | 2007-10-18 | Novartis Ag | Il-17 antagonistic antibodies fpr treating cancer |
| WO2007149032A1 (en) * | 2006-06-23 | 2007-12-27 | Astrazeneca Ab | Antibody molecules for human il-17 |
| RU2402569C2 (ru) * | 2004-03-19 | 2010-10-27 | Имклоун Элэлси | Человеческие антитела к рецептору эпидермального фактора роста |
| WO2011053763A2 (en) * | 2009-10-30 | 2011-05-05 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Il-17a antagonists |
| US8753843B2 (en) * | 2006-08-11 | 2014-06-17 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Antibodies to IL-17A |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT1527100E (pt) * | 2002-03-29 | 2009-08-25 | Schering Corp | Anticorpos monoclonais humanos para interleucina-5 e métodos e composições compreendendo os mesmos |
| GB0417487D0 (en) * | 2004-08-05 | 2004-09-08 | Novartis Ag | Organic compound |
| GB0612928D0 (en) * | 2006-06-29 | 2006-08-09 | Ucb Sa | Biological products |
| GB0620729D0 (en) * | 2006-10-18 | 2006-11-29 | Ucb Sa | Biological products |
| KR100958308B1 (ko) * | 2007-10-15 | 2010-05-19 | 주식회사 아이지세라피 | 항체 절편 발현용 벡터 및 이 벡터를 이용해 항체를디스플레이하는 재조합 파지를 생산하는 방법 |
| WO2009091912A2 (en) * | 2008-01-15 | 2009-07-23 | Abbott Laboratories | Improved mammalian expression vectors and uses thereof |
| MX2011003184A (es) | 2008-09-29 | 2011-04-21 | Roche Glycart Ag | Anticuerpos contra il17 humana y usos de los mismos. |
| ES2633145T3 (es) | 2010-08-05 | 2017-09-19 | Anaptysbio, Inc. | Anticuerpos dirigidos contra IL-17 |
| EP3033107A1 (en) * | 2013-08-15 | 2016-06-22 | Novartis AG | Methods of treating generalized pustular psoriasis (gpp) using il-17 antagonists |
| CN103936854B (zh) * | 2014-04-30 | 2016-08-17 | 北京精益泰翔技术发展有限公司 | 抗il-17a单克隆抗体及其制备与应用 |
| CN108251431B (zh) | 2015-03-05 | 2020-12-08 | 北京百特美博生物科技有限公司 | 双载体系统及其用途 |
-
2015
- 2015-03-05 CN CN201810041670.6A patent/CN108251431B/zh active Active
- 2015-03-05 CN CN201510097117.0A patent/CN105315371B/zh active Active
-
2016
- 2016-02-29 US US15/510,655 patent/US10392436B2/en active Active
- 2016-02-29 RU RU2017123752A patent/RU2663721C1/ru active
- 2016-02-29 WO PCT/CN2016/074805 patent/WO2016138842A1/zh active Application Filing
- 2016-02-29 EP EP16758458.0A patent/EP3181587B1/en active Active
-
2017
- 2017-03-17 ZA ZA2017/01920A patent/ZA201701920B/en unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2402569C2 (ru) * | 2004-03-19 | 2010-10-27 | Имклоун Элэлси | Человеческие антитела к рецептору эпидермального фактора роста |
| WO2007117749A2 (en) * | 2006-01-31 | 2007-10-18 | Novartis Ag | Il-17 antagonistic antibodies fpr treating cancer |
| WO2007149032A1 (en) * | 2006-06-23 | 2007-12-27 | Astrazeneca Ab | Antibody molecules for human il-17 |
| US8753843B2 (en) * | 2006-08-11 | 2014-06-17 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Antibodies to IL-17A |
| WO2011053763A2 (en) * | 2009-10-30 | 2011-05-05 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Il-17a antagonists |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3181587B1 (en) | 2019-08-28 |
| US10392436B2 (en) | 2019-08-27 |
| CN108251431A (zh) | 2018-07-06 |
| EP3181587A4 (en) | 2017-12-06 |
| CN108251431B (zh) | 2020-12-08 |
| EP3181587A1 (en) | 2017-06-21 |
| US20170327571A1 (en) | 2017-11-16 |
| CN105315371A (zh) | 2016-02-10 |
| WO2016138842A1 (zh) | 2016-09-09 |
| ZA201701920B (en) | 2018-07-25 |
| CN105315371B (zh) | 2018-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2663721C1 (ru) | Моноклональные антитела к человеческому il-17 и их применение | |
| JP7538721B2 (ja) | 抗インターロイキン１７ａ抗体、医薬組成物、およびその使用 | |
| JP2023075294A (ja) | 抗ｃｄ４７抗体及びその応用 | |
| TWI701259B (zh) | ４﹘１ｂｂ抗體及其製備方法和應用 | |
| TWI585105B (zh) | 抗ｔｎｆ／抗ｉｌ－２３雙特異性抗體 | |
| JP7499228B2 (ja) | 神経成長因子に対するモノクローナル抗体、並びにそれをコードする遺伝子及びその使用 | |
| JP6865826B2 (ja) | インターロイキン１７ａを標的とする抗体、その製造方法及び応用 | |
| CN111269315B (zh) | 针对bcma的单克隆抗体 | |
| WO2021017071A1 (zh) | 抗人st2抗体及其用途 | |
| WO2007139164A1 (ja) | ヒト化抗ヒトオステオポンチン抗体 | |
| KR20230118922A (ko) | 항lag-3의 단일 클론 항체, 이의 항원 결합 단편 및이의 응용 | |
| EP3024849A2 (en) | Novel antibodies for the diagnosis and treatment of rheumatoid arthritis | |
| JP7576022B2 (ja) | 抗ＩＬ－１β抗体およびその医薬組成物およびそれらの使用 | |
| CN116574189A (zh) | 针对人il-36r和/或人il-1r3的多种抗体及其用途 | |
| WO2024078288A1 (zh) | 一种抗rcp抗体及其制备方法 | |
| TWI843763B (zh) | 抗人類Fn14抗體 | |
| JP2022513224A (ja) | 抗ｉｌ‐１７ａ抗体及びその適用 | |
| JP6137169B2 (ja) | 新規抗ヒトｉｌ−２３受容体抗体 | |
| JP7510209B2 (ja) | ヘルパーＴ細胞ＴＧＦ－βシグナルを特異的に中和する二重特異性抗体、その薬物組成物およびその使用 | |
| CN109311988A (zh) | 一种BlyS抗体及其制备方法和应用 | |
| CN107840886B (zh) | Gm-csf抗体及其用途 | |
| WO2021209066A1 (zh) | 特异性抗原结合分子，其制备方法及医药用途 | |
| WO2023036215A1 (zh) | 双特异性抗原结合分子及其应用 | |
| TW202325739A (zh) | 新穎Nav1.7單株抗體 | |
| WO2021195116A1 (en) | Transferrin receptor 1 targeting for carcinogenesis prevention |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20210409 |