ES2633145T3 - Anticuerpos dirigidos contra IL-17 - Google Patents

Abstract

Un agente de unión a IL-17 aislado que comprende ambos de los siguientes: (a) un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la SEQ ID NO: 78 y (b) un polipéptido de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la SEQ ID NO: 24.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Anticuerpos dirigidos contra IL-17 Antecedentes de la invencion

La interleuquina-17 (IL-17) es una citoquina pro-inflamatoria secretada por las celulas T activadas. La familia IL-17 de citoquinas incluye IL-17b, IL-17C, IL-17D, IL-17E (tambien llamada IL-25) e IL-17F, y el miembro prototipo de la familia ha sido designado IL-17A (vease, por ejemplo, Moseley et al., Cytokine Growth Factor Rev., 14 (2): 155 - 74

(2003) ). Todos los miembros de la familia lL-17 tienen una estructura proteica similar, con cuatro residuos de cistema altamente conservados cnticos a su forma tridimensional, sin embargo, no tienen similitud de secuencia con otras citoquinas conocidas. Sin embargo, se ha encontrado un homologo vmco de IL-17A en el marco de lectura abierto 13 del virus del herpes saimiri (vease, por ejemplo, Yao et al., Immunity, 3: 811 (1995)), que tiene una identidad de residuos de aminoacidos del 72% con respecto a IL-17A.

Se han publicado multiples funciones para los miembros de la familia IL-17, que implican principalmente a la regulacion de la respuesta inmune. Por ejemplo, la IL-17 esta implicada en la regulacion positiva de las moleculas de adhesion y en la induccion de la produccion de multiples citoquinas inflamatorias y quimioquinas de diversos tipos celulares, incluyendo sinoviocitos, condroctos, fibroblastos, celulas endoteliales, celulas epiteliales, queratinocitos y macrofagos. Ademas, la IL-17 induce el reclutamiento de neutrofilos a un sitio inflamatorio mediante la induccion de la liberacion de quimioquinas, estimula la produccion de prostaglandinas y metaloproteinasas e inhibe la smtesis de proteoglicanos. La IL-17 juega un papel importante en la maduracion de las celulas progenitoras hematopoyeticas, y la IL-17 parece tener papeles de senalizacion en diferentes organos y tejidos incluyendo el pulmon, cartflago articular, hueso, cerebro, celulas hematopoyeticas, rinon, piel e intestino (vease, por ejemplo, Kolls y Linden, Immunity, 21: 467 - 476 (2004), y Fossiez, y col., Int. Rev. Immunol., 16: 541 (1998)). La IL-17 tambien induce la produccion de metaloproteinasas de matriz (MMP) y reduce el inhibidor tisular de las metaloproteinasas (TIMP) (vease, por ejemplo, Jovanovic et al., J. Rheumatol., 28: 712-718 (2001)) y el bloqueo de IL-1 e iL-17 tiene un efecto sinergico sobre la inflamacion y la destruccion osea in vivo (vease, por ejemplo, Chabaud et al, Arthritis Rheum., 44: 1293-1303 (2001)).

La produccion inadecuada o aumentada de IL-17 (es decir, IL-17A) se ha asociado con varias enfermedades, tales como la inflamacion de las vfas respiratorias, asma, artritis reumatoidea (AR), osteoartritis, osteoporosis, erosion osea, abscesos y adhesiones intraperitoneales, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), enfermedad de Addison, agammaglobulinemia, asma alergica, alopecia areata, pfcea celfaca, enfermedad de Chagas, fibrosis pulmonar idiopatica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, rechazo de aloinjerto (por ejemplo renal), artritis psoriasica, uveftis, enfermedad de Behcet, ciertos tipos de cancer, angiogenesis, aterosclerosis, esclerosis multiple (EM), lupus eritematoso sistemico, septicemia, choque septico o endotoxico, respuesta a la exposicion al alergeno, gastritis de Helicobacter pyloricida, asma bronquial, espondilitis anquilosante, nefritis lupica, psoriasis, isquemia, esclerosis sistemica, accidente cerebrovascular y otros trastornos inflamatorios (vease, por ejemplo, Witowski y col., Cell Mol. Life Sci., 61: 567 - 579 (2004); Antonysamy et al, J. Immunol, 162: 577 - 584 (1999), van Kooten y col., J. Am. Chem. Soc. Nephrol, 9: 1526 - 1534 (1998); Molet et al, J. Allergy Clin. Immunol, 108: 430 - 438 (2001); Teunissen et al, J. Invest. Dermatol, 111: 645 - 649 (1998); y Kurasawa y otros, Arthritis Rheum., 43: 2455 - 2463 (2000)).

Basandose en lo anterior, la IL-17 parece ser un objetivo para el tratamiento de varias enfermedades inflamatorias o autoinmunes. Con este fin, se han propuesto anticuerpos que se unen a IL-17 para su uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos mediados por IL-17 (vease, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional Nos. WO 2006/013107 y WO 2007/117749; y las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nos. 2008/0269467 A1 y 2009/0280131 A1). Ademas, el bloqueo de la bioactividad de IL-17 mediante un anticuerpo espedfico de IL-17 o la union del receptor soluble a IL-17 reduce la inflamacion y la erosion osea en diversos modelos de artritis animal (vease, por ejemplo, Lubberts y col., Arthritis & Rheumatism, 50: 650 - 659

(2004) ). Sin embargo, la utilidad terapeutica de los anticuerpos de IL - 17 actualmente disponibles esta limitada por su sub-optima farmacocinetica, estabilidad y eficacia in vivo.

El documento de EE.UU. 2009/0280131 A1 describe una molecula de union a IL-17, en donde las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras tienen secuencias de aminoacidos como se define en tal documento, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por IL-17, por ejemplo, la artritis reumatoide.

El documento WO 2011/056864 A1 describe un metodo de identificacion de un agente de union a antfgeno deseado que se une a un antfgeno de interes. El metodo utiliza un enfoque combinatorio en donde una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende un primer componente de un agente antfgeno se proporciona a una poblacion de celulas junto con una librena de secuencias de acido nucleico, cada una de las cuales codifica un polipeptido que comprende un segundo componente de un agente de union a antfgeno. El metodo comprende ademas someter una o mas secuencias del acido nucleico que codifica un primer componente, un segundo componente y/o un agente de union a antfgeno identificado a una hipermutacion somatica.

Por lo tanto, existe la necesidad de un agente de union a IL-17 (por ejemplo, un anticuerpo) que se una a IL-17 con una alta afinidad, exhiba estabilidad incrementada y farmacocinetica mejorada y neutralice eficazmente la actividad de IL-17 in vivo. La invencion proporciona tal agente de union a IL-17.

Breve resumen de la invencion

5 La presente invencion se refiere a un agente de union a IL-17 aislado que comprende ambos de los siguiente: (a) un polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende SEQ ID NO: 78, y (b) un polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende SEQ ID NO: 24.

Se describe en este documento un agente de union a IL-17 aislado que comprende ambos de los siguientes: (a) un polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende SEQ ID NO: 1 excepto que uno o mas de los 10 residuos 32, 53 y 59 de SEQ ID NO: 1 se sustituyen por un residuo diferente, y opcionalmente uno o mas de los residuos 30, 31, 35, 40, 50, 52, 53, 59, 62, 66, 69, 75, 79, 88 y 97 de SEQ ID No: 1 se sustituyen con un residuo diferente, o un fragmento del mismo que comprende al menos cinco aminoacidos, y (b) un polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la SEQ ID NO: 23, excepto que uno o mas de los residuos 9, 10, 11, 13, 17, 20, 21 y 22 de SEQ ID NO: 23 se sustituyen por un residuo diferente, o una secuencia de aminoacidos que es al 15 menos 85% identica a la misma.

Tambien se describe un agente de union a IL-17 aislado que comprende un polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 excepto que el residuo en la posicion 50 de SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo S, A o I, y opcionalmente uno o mas de los residuos 31, 32, 35, 40, 52, 62, 66, 88 y 97 de SEQ ID NO: 1 se sustituyen por un residuo diferente, o una secuencia de aminoacidos que es 20 al menos 85% identico a la misma.

Ademas se describe un agente de union a IL-17 aislado que comprende un polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 excepto que uno o mas de los residuos 104, 109 y 115 de SEQ ID NO: 1 se reemplazan con un residuo diferente, y opcionalmente uno o mas de los residuos 100, 101, 102, 106, 107, 108 y 111 de SEQ ID NO: 1 se reemplazan con un residuo diferente, o una 25 secuencia de aminoacidos que es al menos un 85% identica a la misma.

Breve descripcion de las diversas vistas de los dibujos

La Figura 1 es un grafico que ilustra los cambios en el perfil de KC (CXCL1) frente al tiempo que sigue a la administracion subcutanea de hIL-17 a 1, 3 y 10 |jg de dosis/raton.

La Figura 2 es un grafico que ilustra la supresion dependiente de la dosis de los niveles sericos de KC dos horas 30 despues de la administracion de hIL-17 en ratones por un anticuerpo anti-IL17 (SEQ ID NO: 4 emparejado con SEQ ID NO: 24).

La Figura 3 es un diagrama que ilustra las curvas de disociacion BIACORE™ A100 para las combinaciones HC y LC descritas en el Ejemplo 2.

La Figura 4 es un grafico que ilustra los resultados de un ensayo de liberacion de IL-6 en fibroblastos sinoviales de 35 AR humanos descritos en el Ejemplo 3.

La Figura 5 es un grafico que ilustra los resultados de un ensayo ELISA que se uso para medir la inhibicion de la union del receptor-ligando por los anticuerpos anti-IL17a descritos en el Ejemplo 4.

Descripcion detallada de la invencion

La invencion proporciona un agente de union a IL-17 aislado que comprende un polipeptido de cadena pesada de 40 inmunoglobulina y/o un polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina aislado. Por "agente de union a IL-17" se entiende una molecula, preferiblemente una molecula protemica, que se une espedficamente a la citoquina IL-17. Preferiblemente, el agente de union a IL-17 es un anticuerpo o un fragmento (por ejemplo, fragmento inmunogenico) del mismo. El termino "inmunoglobulina" o "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una protema que se encuentra en la sangre u otros fluidos corporales de vertebrados, que es utilizada por el sistema 45 inmune para identificar y neutralizar objetos extranos, tales como bacterias y virus. Una inmunoglobulina completa consiste tfpicamente en cuatro polipeptidos: dos copias identicas de un polipeptido de cadena pesada (H) y dos copias identicas de un polipeptido de cadena ligera (L). Cada una de las cadenas pesadas contiene una region N- terminal variable (Vh) y tres regiones C-terminales constantes (CH1, CH2 y CH3), y cada cadena ligera contiene una region N-terminal variable (Vl) y una region C-terminal constante (Cl). Las cadenas ligeras de anticuerpos se 50 pueden asignar a uno de dos tipos distintos, ya sea kappa (k) o lambda (A), basado en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes. En una inmunoglobulina tfpica, cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada por enlaces disulfuro, y las dos cadenas pesadas estan unidas entre sf por enlaces disulfuro. La region variable de la cadena ligera esta alineada con la region variable de la cadena pesada y la region constante de la cadena ligera esta alineada con la primera region constante de la cadena pesada. Las regiones constantes 55 restantes de las cadenas pesadas estan alineadas entre sf.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras y pesadas forman el sitio de union al antigeno de un anticuerpo. Las regiones Vh y Vl tienen la misma estructura general, comprendiendo cada region cuatro regiones marco, cuyas secuencias estan relativamente conservadas. Las regiones marco estan conectadas por tres regiones determinates de la complementariedad (CDR). Las tres CDR, conocidas como CDR1, CDR2 y CDR3, forman la "region hipervariable" de un anticuerpo, que es responsable de la union al antfgeno. Las cuatro regiones marco (FWs o FRs) adoptan en gran medida una conformacion de hoja beta y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos comprenden parte de, la estructura de hoja beta. Las regiones constantes de las cadenas ligera y pesada no estan directamente implicadas en la union del anticuerpo a un antfgeno, sino que exhiben diversas funciones efectoras, tales como la participacion en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos mediante interacciones con moleculas efectoras y celulas.

El agente de union a IL-17 de la invencion se une deseablemente a la interleucina-17 (IL-17, o IL-17A). La IL-17A es el miembro fundador de un grupo de citoquinas llamado la familia IL-17. La IL-17A se identifico originalmente como una transcripcion de un hibridoma de celulas T de roedor, y se conoce como CTLA8 en roedores (Rouvier y col., J. Immunol, 150 (12): 5445-5456 (1993)). La IL-17A se une a un receptor de superficie celular de tipo I denominado IL- 17R, de los cuales hay al menos tres variantes IL17RA, IL17RB e IL17RC (Starnes et al, J. Immunol, 169 (2): 642646 (2002)). Ademas de la IL-17A, la familia IL-17 incluye las citoquinas IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (tambien llamada IL-25) e IL-17F. Todos los miembros de la familia IL-17 tienen una estructura proteica similar, con cuatro residuos de cistema altamente conservados cnticos a su forma tridimensional, sin embargo, no tienen similitud de secuencia con ninguna otra citoquina conocida.

Como se discutio anteriormente, los miembros de la familia de protemas IL-17 presentan numerosas funciones reguladoras inmunes, que se deben principalmente a su capacidad para inducir moleculas de senalizacion inmune. En particular, IL-17 ha demostrado inducir y mediar respuestas proinflamatorias, y se asocia comunmente con respuestas alergicas. La IL-17 induce la produccion de citoquinas, tales como IL-6, G-CSF, GM-CSF, IL-lp, TGF-p, TNF -a, quimiocinas (por ejemplo, IL-8, GRO-a y MCP -1) y prostaglandinas (por ejemplo, PGE2) de muchos tipos de celulas (por ejemplo, fibroblastos, celulas endoteliales, celulas epiteliales, queratinocitos y macrofagos). La liberacion de citoquinas causa muchas funciones, como la remodelacion de las vfas aereas, que es una caractenstica de las respuestas de IL-17. La expresion aumentada de quimiocinas atrae a otras celulas incluyendo los neutrofilos pero no los eosinofilos. La funcion de IL-17 es tambien esencial para un subconjunto de celulas T CD4+ llamadas celulas T helper 17 (Th17). Como tal, la familia de protemas IL-17 se ha asociado con la patologfa de varias enfermedades inmunitarias y autoinmunes relacionadas, incluyendo, pero no limitadas a, artritis reumatoide, asma, lupus, rechazo de aloinjerto e inmunidad antitumoral (vease, por ejemplo, Aggarwal et al., J. Leukoc. Biol, 71 (1): 1-8 (2002)). El agente de union a IL-17 de la invencion puede unirse a cualquier miembro de la familia de protemas IL-17 descrita en la presente memoria, tal como, por ejemplo, IL-17A y/o IL-17F. En una realizacion preferida, el agente de union a IL-17 se une a la protema IL-17A. En otra realizacion, el agente de union a IL-17 puede unirse a, o reaccionar de forma cruzada con, ortologos humanos y/o no humanos de IL-17A.

El agente de union a IL-17 aislado comprende tanto el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina como el polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina. La secuencia de aminoacidos de varios polipeptidos de cadena pesada y de cadena ligera de inmunoglobulina que se unen a uno o mas miembros de la familia de protemas de IL- 17 son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional Nos. WO 2006/013107 y WO 2007/117749; y las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nos. 2008/0269467 A1 y 2009/0280131 A1).

Un ejemplo de un polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une a IL-17 comprende SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoacidos que es al menos 85% identica a la misma (por ejemplo, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88 %, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% %, al menos 99%, o 100% identico al mismo). En el contexto de la invencion, el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina comprende SEQ ID NO: 1 excepto que uno o mas de los residuos de SEQ ID NO: 1 se reemplazan con un residuo de aminoacido diferente. A este respecto, uno o mas de los residuos 32, 53 y 59 de la SEQ ID NO: 1 se sustituyen por un residuo diferente, y opcionalmente uno o mas de los residuos 30, 31, 35, 40, 50, 52, 53, 59 , 62, 66, 69, 75, 79, 88 y 97 de SEQ ID NO: 1 se sustituyen por un residuo diferente. Cada uno de los residuos de aminoacidos 30, 31, 35, 40, 50, 52, 53, 59, 62, 66, 69, 75, 79, 88 y 97 de SEQ ID NO: 1 puede reemplazarse con cualquier residuo de aminoacido adecuado, que pueden ser iguales o diferentes en cada posicion. Un “reemplazo” o “sustitucion” de aminoacido se refiere a la sustitucion de un aminoacido en una posicion o residuo dado por otro aminoacido en la misma posicion o residuo dentro de una secuencia polipeptfdica.

Los aminoacidos se agrupan ampliamente como "aromaticos" o "alifaticos". Un aminoacido aromatico incluye un anillo aromatico. Ejemplos de aminoacidos "aromaticos" incluyen histidina (H o His), fenilalanina (F o Phe), tirosina (Y o Tyr) y triptofano (W o Trp). Los aminoacidos no aromaticos se agrupan ampliamente como "alifaticos". Ejemplos de aminoacidos "alifaticos" incluyen glicina (G o Gly), alanina (A o Ala), valina (V o Val), leucina (L o Leu), isoleucina (I o Ile), metionina (M o Met), Serina (S o Ser), treonina (T o Thr), cistema (C o Cys), prolina (P o Pro), acido glutamico (E o Glu), acido aspartico (A o Asp), asparagina (N o Asn), Glutamina (Q o Gln), lisina (K o Lys) y arginina (R o Arg).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Los aminoacidos alifaticos pueden subdividirse en cuatro subgrupos. El "subgrupo alipatico no polar grande" consiste en valina, leucina e isoleucina. El "sub-grupo alifatico ligeramente polar" esta constituido por metionina, serina, treonina y cistema. El "sub-grupo polar/cargado alifatico" consiste en acido glutamico, acido aspartico, asparagina, glutamina, lisina y arginina. El "subgrupo de residuos pequenos" consiste en glicina y alanina. El grupo de aminoacidos cargados/polares puede subdividirse en tres subgrupos: el "subgrupo cargado positivamente" que consiste en lisina y arginina, el "subgrupo cargado negativamente" que consiste en acido glutamico y acido aspartico, y el "subgrupo polar" que consiste en asparagina y glutamina.

Los aminoacidos aromaticos se pueden subdividir en dos subgrupos: el "subgrupo de anillo de nitrogeno" que consiste en histidina y triptofano y el "subgrupo fenilo" que consiste en fenilalanina y tirosina.

La frase "sustitucion conservadora de aminoacidos" o "mutacion conservadora" se refiere a la sustitucion de un aminoacido por otro aminoacido con una propiedad comun. Una manera funcional de definir las propiedades comunes entre los aminoacidos individuales es analizar las frecuencias normalizadas de los cambios de aminoacidos entre protemas correspondientes de organismos homologos (Schulz, GE y RH Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, (1979)). De acuerdo con tales analisis, pueden definirse grupos de aminoacidos donde los aminoacidos dentro de un grupo se intercambian preferentemente entre sf y, por tanto, se parecen mas entre sf en su impacto sobre la estructura proteica global (Schulz, G.E. y R.H. Schirmer, supra).

Ejemplos de sustituciones de aminoacidos conservativas incluyen sustituciones de aminoacidos dentro de los subgrupos anteriores, por ejemplo, lisina por arginina y viceversa, de manera que se puede mantener una carga positiva; acido glutamico por acido aspartico y viceversa, de manera que se puede mantener una carga negativa; serina por treonina tal que se puede mantener un -OH libre; y glutamina por asparagina de tal manera que se puede mantener un -NH2 libre.

Las "mutaciones semi-conservativas" incluyen sustituciones de aminoacidos de aminoacidos con los mismos grupos enumerados anteriormente, que no comparten el mismo subgrupo. Por ejemplo, la mutacion del acido aspartico por la asparagina o la asparagina por la lisina implican aminoacidos dentro del mismo grupo, pero diferentes subgrupos. Las "mutaciones no conservadoras" implican sustituciones de aminoacidos entre diferentes grupos, por ejemplo, lisina por triptofano, o fenilalanina por serina, etc.

En una realizacion descrita en este documento, el agente de union a IL-17 aislado comprende un polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende SEQ ID NO: 1, excepto que el residuo 32 de SEQ iD NO: 1 se reemplaza con un residuo H (histidina), S (serina) o F (fenilalanina), el residuo 53 de SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo E (acido glutamico) o H (histidina), el residuo 59 de SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo H (histidina), o cualquier combinacion de los sustituyentes anteriores.

Ademas de las sustituciones de aminoacidos discutidas anteriormente, el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina descrito en este documento opcionalmente puede comprender sustituciones de aminoacidos adicionales. En una realizacion, el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina comprende SEQ ID NO: 1, excepto que uno o mas de los residuos 30, 31, 35, 40, 50, 52, 53, 59, 62, 66, 69, 75, 79, 88, y 97 de la SEQ ID NO: 1 se sustituyen por un residuo diferente. En otra realizacion, el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina comprende sEq ID NO: 1, excepto que el residuo 30 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza con un residuo de N (asparagina), el residuo 31 de sEq ID NO: 1 se reemplaza con una N (asparagina) o D (acido aspartico), se sustituye el residuo 35 de la SEQ ID NO: 1 por un residuo de T (treonina), N (asparagina) o D (acido aspartico), el residuo 40 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza con una T (treonina ), se sustituye el resto 50 de la SEQ ID NO: 1 por un residuo A (alanina), S (serina), I (isoleucina) o G (glicina), el residuo 52 de la SEQ ID NO: 1 se sustituye por un N (Asparagina) o R (arginina), se sustituye el residuo 53 de la SEQ ID NO: 1 por un residuo E (acido glutamico) o H (histidina), el residuo 59 de la SEQ ID NO: 1 se sustituye por una H (histidina), se sustituye el residuo 62 de la SEQ ID NO: 1 por un residuo G (glicina), el residuo 66 de la SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo V (valina), el residuo 69 de la SEQ ID NO: 1 se sustituye con una I (isoleucina), el residuo 75 de la SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo D (acido aspartico), el residuo 79 de SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo V (valina), el residuo 88 de SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo V (valina), el residuo 97 de SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo V (valina), T (treonina), L (leucina) o F (fenilalanina), o cualquier combinacion de los sustituyentes anteriores.

Los polipeptidos de cadena pesada de inmunoglobulina ejemplares pueden comprender cualquiera de las siguientes secuencias de aminoacidos: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3-5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10-20, SEQ ID NO: 35-72, SEQ ID NO: 76, y SEQ ID NO: 77.

Tambien se describe en este documento un agente de union a IL-17 aislado que comprende un polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 excepto que el residuo en la posicion 50 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza con un residuo diferente y opcionalmente uno o mas de los residuos 31, 32, 35, 40, 52, 62, 66, 88 y 97 de SEQ ID NO: 1 se sustituyen por un residuo diferente. A este respecto, el residuo de aminoacido en las posiciones 50, 31, 32, 35, 40, 52, 62, 66, 88 y 97 de SEQ ID NO: 1 puede ser reemplazado por cualquier residuo de aminoacido adecuado como se describe en este documento. En una realizacion, el residuo en la posicion 50 de SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo S, A o I. En otras realizaciones, el resto 31 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza con un residuo N o D, el residuo 35 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

un residuo N, T o D, el residuo 40 de SEQ ID NO: 1 es sustituido por un residuo T, el residuo 52 de SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo N o R, el residuo 62 de SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo G, el residuo 66 de SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo V, el residuo 88 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza con un residuo V, el residuo 97 de SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo V, T, L o F, o cualquier combinacion de las sustituciones anteriores. Por ejemplo, el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina puede comprender cualquiera de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 74 o SEQ ID NO: 75.

Ademas se describe en este documento un agente de union a IL-17 aislado que comprende un polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 excepto que uno o mas de los residuos 104, 109 y 115 de SEQ ID NO: 1 se reemplazan por un residuo diferente, y opcionalmente uno o mas de los residuos 100, 101, 102, 106, 107, 108 y 111 de SEQ ID No: 1 se sustituyen por un residuo diferente. A este respecto, el residuo de aminoacido en las posiciones 100, 101, 102, 104, 106, 107, 108, 109, 111 y 115 de SEQ ID NO: 1 puede ser reemplazado por cualquier residuo de aminoacido adecuado como se describe en este documento. En una realizacion, el residuo 104 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza con un residuo V, el residuo 109 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza con un residuo V, el residuo 115 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza con un residuo N o E, o cualquier combinacion de los reemplazos anteriores. En otras realizaciones, el resto 100 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza con un residuo H, el residuo 101 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza con un residuo H o F, el residuo 102 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza con un residuo E, el residuo 106 de SEQ ID NO: 1 se sustituye con un residuo N, el residuo 107 de SEQ ID NO: 1 se sustituye con un residuo S, el residuo 108 de SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo H o F, el residuo 111 de SEQ ID NO: 1 se sustituye por un residuo S, o cualquier combinacion de las sustituciones anteriores. Por ejemplo, el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina puede comprender SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 73.

En otra realizacion descrita en este documento, el agente de union a IL-17 puede comprender un polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 excepto que uno o mas residuos de aminoacidos se insertan en la SEQ ID NO: 1. Cualquier numero de residuos de aminoacidos se puede insertar en la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, al menos un residuo de aminoacido (por ejemplo, 2 o mas, 3 o mas, 5 o mas, u 8 o mas residuos de aminoacidos), pero menos de 20 residuos de aminoacidos (por ejemplo, 18 o menos, 15 o menos, 12 o menos, o 10 o menos residuos de aminoacidos) se insertan en la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 residuos de aminoacidos (por ejemplo, aproximadamente 3-5 residuos de aminoacidos, aproximadamente 5-10 residuos de aminoacidos, aproximadamente 10-15 residuos de aminoacidos, o aproximadamente 15-20 residuos de aminoacidos, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores) se insertan en la SEQ ID NO: 1. En una realizacion preferida, no se insertan mas de 8 residuos de aminoacidos en SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina puede comprender SEQ ID NO: 78 o SEQ ID NO: 79.

Un ejemplo de un polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina que es espedfico para IL-17 comprende SEQ ID NO: 23, o una secuencia de aminoacidos identica al menos al 85% (por ejemplo, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% identica al mismo). En el contexto de la invencion, el agente de union a IL-17 aislado comprende un polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende SEQ ID NO: 23 excepto que uno o mas de los residuos de SEQ ID NO: 23 se reemplazan con un residuo de aminoacido diferente. A este respecto, uno o mas de los residuos 9, 10, 11, 13, 17, 20, 21 y 22 de SEQ ID NO: 23 se sustituyen por un residuo diferente. Los restos de aminoacidos 9, 10, 11, 13, 17, 20, 21 y 22 de SEQ ID NO: 23 pueden reemplazarse con cualquier residuo de aminoacido adecuado como se describe en la presente memoria.

En una realizacion descrita en este documento, el polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina comprende SEQ ID NO: 23, excepto que el resto 9 de SEQ ID NO: 23 se reemplaza con un residuo Y (tirosina), el residuo 10 de SEQ ID NO: 23 se reemplaza con un R (Arginina), el resto 11 de SEQ ID NO: 23 se sustituye por un residuo T (treonina), el residuo 13 de SEQ ID NO: 23 se sustituye por un residuo L (leucina) o I (isoleucina), el residuo 17 de SEQ ID NO:23 se sustituye con un residuo de G (glicina), el residuo 20 de SEQ ID NO: 23 se sustituye con un residuo de K (lisina), el residuo 21 de SEQ ID NO: 23 se sustituye con un residuo de V (valina), el residuo 22 de SEQ ID NO: 23 se sustituye con un residuo D (acido aspartico), o cualquier combinacion de los reemplazos anteriores. Por ejemplo, el polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina puede comprender la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 80, o SEQ ID NO: 81.

La descripcion no se limita a un agente de union a IL-17 aislado que comprende un polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina o un polipeptido de cadena ligera que tiene sustituciones de los residuos de aminoacidos espedficos descritos en la presente memoria. De hecho, cualquier resto de aminoacido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 23 puede ser reemplazado, en cualquier combinacion, con un residuo de aminoacido diferente, o cualquier numero de residuos de aminoacido puede ser insertado en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 23, siempre y cuando la actividad biologica del agente de union a IL-17 se potencie o mejore como resultado de los reemplazos o inserciones de aminoacidos. La “actividad biologica” de un agente de union a IL-17 se refiere, por ejemplo, a la afinidad de union para un epttopo de IL-17 particular, a la neutralizacion de la actividad de IL-17 in vivo (por ejemplo, IC50), a la estabilidad in vivo (incluyendo pero no limitada a la estabilidad termica y la estabilidad proteolttica), la farmacocinetica, las propiedades inmunogenas del agente de union a IL-17 y la reactividad cruzada (por ejemplo,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

con homologos no humanos u ortologos de IL-17, o con otras protemas o tejidos). Otras propiedades o caractensticas biologicas de un agente de union al antigeno reconocido en la tecnica incluyen, por ejemplo, la avidez, selectividad, solubilidad, plegado, inmunotoxicidad, expresion, formulacion y actividad catalftica. Las propiedades o caractensticas antes mencionadas pueden observarse, medirse y/o evaluarse usando tecnicas estandar incluyendo, pero sin limitarse a, ELISA, ELISA competitivo, analisis de resonancia de plasmon de superficie BIACORE o KINEXA, ensayos de neutralizacion in vitro o in vivo, ensayos de union a receptores, ensayos de produccion y/o secrecion de citocinas o de factores de crecimiento y ensayos de transduccion de senales e inmunohistoqmmica.

Los terminos "inhibiT o "neutralizar", tal como se usan en este documento con respecto a la actividad de un agente de union a IL-17, se refieren a la capacidad de sustancialmente antagonizar, prohibir, prevenir, restringir, retardar, interrumpir, eliminar, detener o revertir la progresion o gravedad de, por ejemplo, la actividad biologica de IL-17, o una enfermedad o afeccion asociada con IL-17. El agente de union a IL-17 aislado de la invencion inhibe o neutraliza preferiblemente la actividad de una IL-17 en al menos aproximadamente un 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 100%, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores.

El agente de union a IL-17 aislado de la invencion puede ser un anticuerpo completo, como se describe en la presente memoria, o un fragmento de anticuerpo. Las expresiones "fragmento de un anticuerpo", "fragmento de anticuerpo" o "fragmento funcional de un anticuerpo" se usan indistintamente en el presente documento para significar uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse espedficamente a un antfgeno (vease, en general, Holliger et al, Nat. Biotech., 23 (9): 1126 - 1129 (2005)). El agente de union a IL-17 aislado puede contener cualquier fragmento de anticuerpo de union a IL-17. El fragmento de anticuerpo comprende deseablemente, por ejemplo, una o mas CDR, la region variable (o partes de la misma), la region constante (o partes de la misma), o combinaciones de las mismas. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, (i) un fragmento Fab, que es un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, que es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; y (iii) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un unico brazo de un anticuerpo.

En una realizacion descrita en este documento, el agente de union a IL-17 aislado es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende (a) un polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 2-22 o SEQ ID NO: 31-79, o un fragmento de las mismas, y (b) un polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 80 o SEQ ID NO: 81, o un fragmento de las mismas. En las realizaciones en las que el agente de union a IL-17 aislado comprende un fragmento del polipeptido de cadena pesada o de cadena ligera de inmunoglobulina, el fragmento puede ser de cualquier tamano siempre que el fragmento se una e inhiba preferiblemente la actividad de IL-17. A este respecto, un fragmento del polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina comprende deseablemente entre aproximadamente 5 y 18 aminoacidos (por ejemplo, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores). De forma similar, un fragmento del polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina comprende deseablemente entre aproximadamente 5 y 18 aminoacidos (por ejemplo, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o un intervalo definido por cualquiera de dos de los valores anteriores). Cuando el agente de union a IL-17 es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una region constante (Fc) de cualquier clase adecuada. Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una region constante que esta basada en los anticuerpos IgG1, IgG2 o IgG4 de tipo salvaje, o variantes de los mismos.

El agente de union a IL-17 tambien puede ser un fragmento de anticuerpo de cadena unica. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo de cadena unica incluyen, pero no se limitan a, (i) un Fv de cadena sencilla (scFv), que es una molecula monovalente que consiste en los dos dominios del fragmento Fv (es decir, Vl y Vh) unidos por un enlazante sintetico que permite que los dos dominios sean sintetizados como una unica cadena polipeptfdica (vease, por ejemplo, Bird et al, Science, 242: 423 - 426 (1988), Huston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879 - 5883 (1988); y Osbourn et al, Nat. Biotechnol, 16: 778 (1998)) y (ii) un diacuerpo, que es un dfmero de cadenas polipeptfdicas, en el que cada cadena polipeptfdica comprende una Vh conectada a una Vl por un enlazador peptfdico que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre la Vh y Vl en la misma cadena polipeptfdica, impulsando de este modo el emparejamiento entre los dominios complementarios sobre diferentes cadenas polipeptfdicas Vh-Vl para generar una molecula dimerica que tiene dos sitios funcionales de union a antfgeno. Los fragmentos de anticuerpo son conocidos en la tecnica y se describen con mas detalle en, por ejemplo, la Publicacion de Solicitud de Patente de EE.UU. 2009/0093024 A1.

El agente de union a IL-17 aislado tambien puede ser un anticuerpo intracelular o fragmento del mismo. Un anticuerpo intracelular es un anticuerpo que se expresa y que funciona intracelularmente. Los anticuerpos intracelulares carecen tfpicamente de enlaces disulfuro y son capaces de modular la expresion o actividad de genes diana a traves de su actividad de union espedfica. Los anticuerpos intracelulares incluyen fragmentos de dominio unico tales como los dominios Vh y Vl aislados y scFvs. Un anticuerpo intracelular puede incluir senales de trafico

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

subcelular unidas al extremo N o C del anticuerpo intracelular para permitir la expresion a altas concentraciones en los compartimentos subcelulares donde esta localizada una protema diana. Tras la interaccion con un gen diana, el anticuerpo intracelular modula la funcion de la protema diana y/o logra el knockout fenotipico/funcional mediante mecanismos tales como la aceleracion de la degradacion de la protema diana y el secuestro de la protema diana en un compartimento subcelular no fisiologico. Otros mecanismos de inactivacion genica mediada por el anticuerpo intracelular pueden depender del epftopo al que se dirige el anticuerpo intracelular, tal como la union al sitio catalftico en una protema diana o a epftopos que estan implicados en las interacciones protema-protema, protema-ADN o protema-ARN.

El agente de union a IL-17 aislado puede ser o puede obtenerse a partir de un anticuerpo humano, un anticuerpo no humano o un anticuerpo quimerico. Por “quimerico” se entiende un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende tanto regiones humanas como no humanas. Los anticuerpos no humanos incluyen anticuerpos aislados de cualquier animal no humano, tal como, por ejemplo, un roedor (por ejemplo, un raton o una rata). El polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina del agente de union a IL-17 puede obtenerse a partir de un anticuerpo humano, un anticuerpo no humano o un anticuerpo quimerico, independientemente de si se obtiene el polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina del agente de union a IL-17 a partir de un anticuerpo humano, un anticuerpo no humano, o un anticuerpo quimerico. En otras palabras, por ejemplo, el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina puede obtenerse a partir de un anticuerpo humano, y el polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina puede obtenerse a partir de un anticuerpo no humano. Por el contrario, el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina puede obtenerse a partir de un anticuerpo no humano, y el polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina puede obtenerse a partir de un anticuerpo humano. Alternativamente, el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina puede obtenerse a partir de un anticuerpo de roedor o fragmento del mismo, y el polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina puede obtenerse a partir de un anticuerpo humano o fragmento del mismo. Este escenario puede ser util, por ejemplo, para la humanizacion de un anticuerpo. En otra realizacion, el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina y el polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina se obtienen ambos a partir de un anticuerpo humano o un anticuerpo no humano. Alternativamente, el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina y el polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina son ambos anticuerpos quimericos.

Un anticuerpo humano, un anticuerpo no humano o un anticuerpo quimerico puede obtenerse por cualquier medio, incluso a traves de fuentes in vitro (por ejemplo, un hibridoma o una lmea celular que produce un anticuerpo de forma recombinante) y fuentes in vivo (por ejemplo, roedores). Los metodos para generar anticuerpos son conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511 - 519 (1976); Harlow y Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); y C.A. Janeway et al. (Eds.), Immunobiology, 5a Ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2001)). En ciertas realizaciones, se puede generar un anticuerpo humano o un anticuerpo quimerico utilizando un animal transgenico (por ejemplo, un raton) en el que uno o mas genes de inmunoglobulina endogena se reemplazan con uno o mas genes de inmunoglobulina humana. Ejemplos de ratones transgenicos en los que los genes de anticuerpos endogenos se reemplazan eficazmente con genes de anticuerpo humano incluyen, pero no se limitan a, el HUMAB-MOUSE™, el Kirin Tc MOUSE™ y el KM-MOUSE™ (vease, por ejemplo, Lonberg, Nat. Biotechnol., 23 (9): 1117 - 25 (2005), y Lonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 181: 69 - 97 (2008)).

En otra realizacion de la invencion, el agente de union a IL-17 aislado puede ser parte de una "estructura alternativa" o un fragmento del mismo. Por "estructura alternativa" se entiende un polipeptido no anticuerpo o dominio polipeptido que muestra una afinidad y especificidad hacia un antfgeno de interes similar al de un anticuerpo. Ejemplos de estructuras alternativas incluyen un dominio en beta-sandwich tal como de fibronectina (por ejemplo, adnectinas), lipocalinas (por ejemplo, anticalin), un dominio de Kunitz, tiorredoxina (por ejemplo, aptamero de peptido), protema A (por ejemplo, moleculas AFFIBODY™), una repeticion de ankyrina (por ejemplo, DARPins), Y-p- cristalina o ubiquitina (por ejemplo, moleculas AFFLIN™), CTLD3 (por ejemplo, tetranectina) y complejos multivalentes (por ejemplo, moleculas ATRIMER™ o SIMP™) . Las estructuras alternativas se describen, por ejemplo, en Binz et al, Nat. Biotechnol., 23: 1257 - 1268 (2005); Skerra, Curr. Opin. Biotech., 18: 295 - 304 (2007); y la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. 2009/0181855 A1.

En una realizacion, la estructura alternativa puede ser una molecula AVIMER™. Una molecula AVIMER™ es una clase de protemas terapeuticas de origen humano no relacionadas con anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, que estan compuestas de varios dominios de union modulares y reutilizables, denominados dominios A (tambien denominados modulo de clase A, repeticion del tipo de complemento, o dominio de clase A del receptor de LDL). Las moleculas AVIMER™ se desarrollaron a partir de dominios de receptores extracelulares humanos por barrido de exon in vitro y presentacion de fagos (Silverman et al, Nat. Biotechnol, 23: 1493 - 94 (2005), y Silverman et al, Nat. Biotechnol., 24: 220 (2006)). Las moleculas AVIMER™ pueden comprender multiples dominios de union independientes que pueden exhibir afinidad mejorada (en algunos casos sub-nanomolar) y especificidad en comparacion con protemas de union a un epftopo unico (vease, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos 2005/0221384 A1; 2005/0164301 A1; 2005/0053973 A1; 2005/0089932 A1; 2005/0048512 A1; y 2004/0175756 A1). Cada uno de los 217 dominios A humanos conocidos comprende aproximadamente 35 aminoacidos (aproximadamente 4 kDa). Los dominios A nativos se pliegan rapida y eficientemente a una estructura uniforme y estable, mediada principalmente por la union al calcio y la formacion de disulfuro. Para esta estructura comun se requiere un motivo de andamio conservado de solo doce aminoacidos. Una molecula AVIMER™ comprende multiples dominios A que estan separados entre sf por enlazadores que tienen un

promedio de cinco aminoacidos de longitud. El resultado final es una cadena de protemas unica que contiene multiples dominios, cada uno de los cuales representa una funcion separada. Cada dominio de una molecula AVIMER™ se une a un antigeno independientemente, y las contribuciones energeticas de cada dominio son aditivas.

5 El agente de union a IL-17 aislado de la invencion puede insertarse en otras moleculas (por ejemplo, polipeptidos) para generar nuevas moleculas que se unen a un antigeno de interes. A este respecto, la invencion comprende un metodo para producir un polipeptido que se une a IL-17, que comprende insertar el agente de union a IL-17 en un polipeptido diferente. Tales nuevas moleculas de union al antigeno pueden ser generadas usando tecnicas de biologfa molecular de rutina conocidas en la tecnica. Por ejemplo, el agente de union a IL-17, o una secuencia de 10 acido nucleico que codifica el agente de union a IL-17, puede insertarse en una molecula diferente (por ejemplo, un polipeptido o un polinucleotido) para generar una molecula recombinante que se une a IL- 17. En una realizacion, una CDR (por ejemplo CDR1, CDR2 o CDR3) o una region variable del polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina y/o el polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina descrito en la presente memoria pueden ser trasplantados (es decir, injertados) en otra molecula, tal como un anticuerpo o polipeptido no anticuerpo, utilizando 15 ya sea la qmmica de protemas o la tecnologfa del ADN recombinante. A este respecto, la invencion proporciona un agente de union a IL-17 aislado que comprende al menos una CDR de una cadena pesada de inmunoglobulina y/o un polipeptido de cadena ligera como se describe en la presente memoria. El agente de union a IL-17 aislado puede comprender una, dos o tres CDR de una region variable de cadena pesada de inmunoglobulina y/o de cadena ligera como se describe en la presente memoria. A este respecto, la CDR1 de los polipeptidos de cadena pesada de 20 inmunoglobulina descritos en la presente se encuentra entre los residuos de aminoacidos 25 y 35, inclusive, de las SEQ ID NO: 2-22 y SEQ ID NO: 31-79. La CDR2 de los polipeptidos de cadena pesada de inmunoglobulina descritos en la presente se encuentra entre los residuos de aminoacidos 50-67, inclusive, de las SEQ ID NO: 2-22 SEQ ID NO: 31-79. La CDR3 de los polipeptidos de cadena pesada de inmunoglobulina descritos en la presente se encuentra entre los residuos de aminoacidos 99 y 102, inclusive, de las SEQ ID NO: 2-22 y SEQ ID NO: 31-79. Las 25 ubicaciones de las CDR de cada uno de los polipeptidos de la cadena ligera de inmunoglobulina descritos en la presente memoria se exponen en la Tabla 1.

Tabla 1

SEQ ID NO

Localizacion de CDR1 (residuos de SEQ ID NO) Localizacion de CDR2 (residuos de SEQ ID NO) Localizacion de CDR3 (residuos de SEQ ID NO)

24

24-35 (inclusive) 51-57 (inclusive) 90-98 (inclusive)

25

24-35 (inclusive) 51-57 (inclusive) 90-98 (inclusive)

26

24-34 (inclusive) 50-56 (inclusive) 89-97 (inclusive)

27

24-40 (inclusive) 56-62 (inclusive) 95-104 (inclusive)

28

24-35 (inclusive) 51-57 (inclusive) 90-98 (inclusive)

En otra realizacion, la region variable entera del polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina y/o el polipeptido 30 de cadena ligera de inmunoglobulina descrito en este documento puede ser trasplantada en lugar de la region variable de un LC y/o un HC de otro anticuerpo.

Los metodos y moleculas antes mencionados pueden ser utiles, por ejemplo, para generar un anticuerpo que comprenda una region Fc de un isotipo diferente o una region Fc que este conjugada con una protema o un resto no proteico (por ejemplo, un marcador fluorescente o un agente quimioterapeutico). La invencion tambien proporciona 35 un conjugado de (1) un anticuerpo, una estructura alternativa, o fragmentos de los mismos, y (2) un resto de protema o no protema que comprende el agente de union a IL-17. Por ejemplo, el agente de union a IL-17 puede formar parte de un anticuerpo conjugado con un peptido, una molecula fluorescente o un agente quimioterapeutico.

La invencion proporciona ademas un vector que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica el agente de union a IL-17 aislado (por ejemplo, el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina y/o el polipeptido de 40 cadena ligera de inmunoglobulina descrito en el presente documento). Se pretende que un "acido nucleico" abarque un polfmero de ADN o ARN, es decir, un polinucleotido, que puede ser monocatenario o bicatenario y que puede contener nucleotidos no naturales o alterados. Los acidos nucleicos se unen tfpicamente mediante enlaces fosfato para formar acidos nucleicos o polinucleotidos, aunque muchos otros enlaces son conocidos en la tecnica (por ejemplo, fosforotioatos, boranofosfatos, y similares).

45 El vector puede ser, por ejemplo, un plasmido, episoma, cosmido, vector viral (por ejemplo, retroviral o adenoviral) o fago. Los vectores adecuados y metodos de preparacion de vectores son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3a edicion, Cold Spring Harbor Press, Cold

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Spring Harbor, NY (2001) y Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, New York, NY (1994)).

Ademas del acido nucleico que codifica el agente de union a IL-17, el vector preferiblemente comprende secuencias de control de la expresion, tales como promotores, potenciadores, senales de poliadenilacion, terminadores de la transcripcion, sitios internos de entrada de ribosomas (IRES) y similares, que proporcionan la expresion de la secuencia codificante en una celula huesped. Ejemplos de secuencias de control de la expresion son conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

Un gran numero de promotores, incluyendo promotores constitutivos, inducibles y reprimibles, de una variedad de diferentes fuentes son bien conocidos en la tecnica. Las fuentes representativas de promotores incluyen, por ejemplo, virus, mairnferos, insectos, plantas, levaduras y bacterias, y los promotores adecuados de estas fuentes estan facilmente disponibles o pueden hacerse sinteticamente, basandose en secuencias disponibles publicamente, por ejemplo, de depositarios tales como la ATCC, asf como otras fuentes comerciales o individuales. Los promotores pueden ser unidireccionales (es decir, iniciar la transcripcion en una direccion) o bidireccionales (es decir, iniciar la transcripcion en una direccion 3' o 5'). Ejemplos no limitantes de promotores incluyen, por ejemplo, el sistema de expresion bacteriana T7, el sistema de expresion bacteriana pBAD (araA), el promotor citomegalovirus (CMV), el promotor SV40, el promotor RSV. Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, el sistema Tet (Patentes de Estados Unidos 5.464.758 y 5.814.618), el sistema inducible Ecdysone (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346 - 3351 (1996)), el sistema T-REXtm (Invitrogen, Carlsbad, CA), el sistema LACSWITCH™ (Stratagene, San Diego, CA) y el sistema de recombinasa inducible de Cre-ERT tamoxifeno (Indra y col., Nuc. Acid. Res., 27: 4324 - 4327 (1999); Nuc. Acid. Res., 28: e99 (2000); Patente de EE.UU. 7.112.715; y Kramer y Fussenegger, Methods Mol. Biol, 308: 123 - 144 (2005)).

El termino potenciador, tal como se utiliza en este documento, se refiere a una secuencia de ADN que aumenta la transcripcion de, por ejemplo, una secuencia de acido nucleico a la que esta unida operativamente. Los potenciadores pueden estar localizados a muchas kilobases lejos de la region de codificacion de la secuencia de acido nucleico y pueden mediar la union de factores reguladores, patrones de metilacion del ADN o cambios en la estructura del ADN. Un gran numero de potenciadores de una diversidad de fuentes diferentes son bien conocidos en la tecnica y estan disponibles como o dentro de polinucleotidos clonados (de, por ejemplo, depositos tales como la ATCC asf como otras fuentes comerciales o individuales). Un numero de polinucleotidos que comprenden promotores (tales como el promotor CMV comunmente utilizado) tambien comprenden secuencias potenciadoras. Los potenciadores pueden estar situados aguas arriba, dentro o aguas abajo de las secuencias de codificacion. La expresion “potenciadores de Ig” se refiere a elementos potenciadores derivados de regiones potenciadoras mapeadas dentro del locus de inmunoglobulina (Ig) (tales potenciadores incluyen, por ejemplo, potenciadores 5' de cadena pesada (mu), potenciadores 5' de cadena ligera (kappa), potenciadores intronicos kappa y mu, y potenciadores 3' (vease generalmente Paul WE (ed), Fundamental Immunology, 3a Edicion, Raven Press, New York (1993), paginas 353 - 363; y la Patente de Estados Unidos 5.885.827).

El vector tambien puede comprender un “gen marcador seleccionable”. La expresion "gen marcador seleccionable", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia de acido nucleico que permite que las celulas que expresan la secuencia de acido nucleico sean seleccionadas espedficamente para o contra, en presencia de un agente selectivo correspondiente. Los genes marcadores seleccionables adecuados se conocen en la tecnica y se describen, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional WO 92/08796 y WO 94/28143; Wigler et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980); O'Hare et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981); Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981); Colberre - Garapin et al, J. Mol. Biol, 150: 1 (1981); Santerre et al, Gene, 30: 147 (1984); Kent y col., Science, 237: 901 - 903 (1987); Wigler et al, Cell, 11: 223 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962); Lowy et al, Cell, 22: 817 (1980); y las Patentes de Estados Unidos 5.122.464 y 5.770.359.

En algunas realizaciones, el vector es un "vector de expresion episomal" o "episoma", que es capaz de replicarse en una celula huesped y que persiste como un segmento extracromosomico de ADN dentro de la celula huesped en presencia de una presion selectiva apropiada (vease, por ejemplo, Conese et al, Gene Therapy 11: 1735-1742 (2004)). Los vectores de expresion episomal disponibles comercialmente representativos incluyen, pero no se limitan a, plasmidos episomales que utilizan el origen de replicacion (oriP) del antfgeno 1 de Epstein Barr Nuclear (EBNAl) y el virus de Epstein Barr (EBV). Los vectores pREP4, pCEP4, pREP7 y pcDNA3.1 de Invitrogen (Carlsbad, CA) y pBK-CMV de Stratagene (La Jolla, CA) representan ejemplos no limitativos de un vector episomico que usa el antfgeno T y el origen de replicacion de SV40 en lugar de EBNAl y oriP.

Otros vectores adecuados incluyen vectores de expresion de integracion, que pueden integrarse aleatoriamente en el ADN de la celula huesped, o pueden incluir un sitio de recombinacion para permitir la recombinacion espedfica entre el vector de expresion y el cromosoma de la celula huesped. Tales vectores de expresion de integracion pueden utilizar las secuencias de control de expresion endogena de los cromosomas de la celula huesped para efectuar la expresion de la protema deseada. Ejemplos de vectores que se integran de una manera espedfica de sitio incluyen, por ejemplo, componentes del sistema flp-in de Invitrogen (Carlsbad, CA) (por ejemplo, pcDNA™5/FRT), o el sistema cre-lox, tal como puede ser encontrado en los vectores de nucleo pExchange-6 de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Stratagene (La Jolla, CA). Ejemplos de vectores que se integran al azar en los cromosomas de celulas huesped incluyen, por ejemplo, pcDNA3.1 (cuando se introducen en ausencia del antfgeno T) de Invitrogen (Carlsbad, CA) y pCI o pFN10A (ACT) FLEXI® de Promega (Madison, WI).

Tambien pueden usarse vectores virales. Vectores de expresion vmca comercialmente disponibles representativos incluyen, pero no se limitan a, el sistema de Per.C6 basado en adenovirus disponible en Crucell, Inc. (Leiden, Pafses Bajos), el pLPl basado en lentivirales de Invitrogen (Carlsbad, CA), y los vectores retrovirales pFB-ERV mas pCFB- EGSH de Stratagene (La Jolla, CA).

La secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina y la secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina del agente de union a IL-17 puede proporcionarse a una celula en el mismo vector (es decir, en cis). Se puede usar un promotor bidireccional para controlar la expresion de ambas secuencias de acido nucleico. En otra realizacion, un promotor unidireccional puede controlar la expresion de ambas secuencias de acido nucleico. La secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina y la secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina puede proporcionarse alternativamente a la poblacion de celulas en vectores separados (es decir, en trans). El vector que comprende la secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina puede comprender las mismas o diferentes secuencias de control de expresion como el vector que comprende la secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina. Los vectores separados pueden proporcionarse a las celulas simultaneamente o secuencialmente.

El vector o vectores que comprenden el o los acidos nucleicos que codifican el agente de union a IL-17 se pueden introducir en una celula huesped que es capaz de expresar los polipeptidos codificados por la misma, incluyendo cualquier celula procariotica o eucariotica adecuada. Las celulas huesped preferidas son aquellas que pueden ser cultivadas facil y fiablemente, tienen tasas de crecimiento razonablemente rapidas, tienen sistemas de expresion bien caracterizados y pueden transformarse o transfectarse de manera facil y eficiente.

Ejemplos de celulas procariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulas de los generos Bacillus (tales como Bacillus subtilis y Bacillus brevis), Escherichia (tal como E. coli), Pseudomonas, Streptomyces, Salmonella y Erwinia. Las celulas procariotas particularmente utiles incluyen las diversas cepas de Escherichia coli (por ejemplo, K12, HB101 (ATCC n° 33694), DH5a, DH10, MC1061 (ATCC n° 53338) y CC102).

Preferiblemente, los vectores se introducen en una celula eucariota. Las celulas eucariotas adecuadas son conocidas en la tecnica e incluyen, por ejemplo, celulas de levadura, celulas de insecto y celulas de mairnfero. Ejemplos de celulas de levadura adecuadas incluyen las de los generos Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhinosporidium, Saccharomyces y Schizosaccharomyces. Las celulas de levadura preferidas incluyen, por ejemplo, Saccharomyces cerivisae y Pichia pastoris.

Las celulas de insecto adecuadas se describen, por ejemplo, en Kitts et al, Biotechniques, 14: 810-817 (1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol, 4: 564 - 572 (1993); y Lucklow y otros, J. Virol, 67: 4566 - 4579 (1993). Las celulas de insecto preferidas incluyen Sf-9 y HI5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Preferiblemente, se utilizan celulas de mai^ero en la invencion. Se conocen en la tecnica una serie de celulas huesped de marnffero adecuadas y muchas estan disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ejemplos de celulas de mamffero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulas de ovario de hamster chino (CHO) (ATCC n° CCL61), celulas CHO DHFR (Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4216 - 4220 (1980)), celulas 293 o 293T de rinon embrionario humano (HEK) (ATCC N° CRL1573) y celulas 3T3 (ATCC No. CCL92). Otras lmeas de celulas de marnffero adecuadas son las lmeas de celulas COS-1 de mono (ATCC N° CRL1650) y COS-7 (ATCC N° CRL1651), asf como la lmea celular CV-1 (ATCC N° CCL70).

Otras celulas huesped ejemplares de mam^era incluyen lmeas celulares de primates y lmeas de celulas de roedor, incluyendo lmeas celulares transformadas. Tambien son adecuadas las celulas diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, asf como explantes primarios. Otras lmeas celulares de mamffero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulas N2A de neuroblastoma de raton, HeLa, celulas L-929 de raton y lmeas celulares de hamster BHK o HaK, todas las cuales estan disponibles en la ATCC. En la tecnica se conocen procedimientos para seleccionar celulas huesped de mamffero adecuadas y metodos para la transformacion, cultivo, amplificacion, cribado y purificacion de celulas.

Una secuencia de acido nucleico que codifica el agente de union a IL-17 puede introducirse en una celula mediante "transfeccion", "transformacion" o "transduccion". La "transfeccion, "transformacion" o "transduccion", tal como se usa en la presente memoria, se refieren a la introduccion de uno o mas polinucleotidos exogenos en una celula huesped mediante metodos ffsicos o qmmicos. Muchas tecnicas de transfeccion son conocidas en la tecnica e incluyen, por ejemplo, coprecipitacion de ADN con fosfato de calcio (vease, por ejemplo, Murray E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-dextrano; electroporacion; transfeccion mediada por liposomas cationicos; bombardeo de micropartmulas facilitado por partmulas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776 - 777 (1990)); y coprecipitacion de ADN de fosfato de estroncio

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

(Brash y col., Mol. Cell Biol., 7: 2031 - 2034 (1987)). Pueden introducirse fagos o vectores virales en celulas huesped, despues del crecimiento de partmulas infecciosas en celulas de empaquetamiento adecuadas, muchas de las cuales estan comercialmente disponibles.

La invencion proporciona una composicion que comprende el agente de union a IL-17 aislado o el vector que codifica el agente de union a IL-17 descrito en el presente documento. Preferiblemente, la composicion es una composicion farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, fisiologicamente aceptable), que comprende un vehmulo, preferiblemente un vehmulo farmaceuticamente (por ejemplo, fisiologicamente aceptable), y el agente de union a IL- 17. Puede utilizarse cualquier vehmulo adecuado dentro del contexto de la invencion, y dichos vehmulos son bien conocidos en la tecnica. La eleccion del vehmulo se determinara, en parte, por el sitio particular al que se puede administrar la composicion y el metodo particular utilizado para administrar la composicion. La composicion opcionalmente puede ser esteril. La composicion puede ser congelada o liofilizada para su almacenamiento y ser reconstituida en un vehmulo esteril adecuado antes de su uso. Las composiciones se pueden generar de acuerdo con las tecnicas convencionales descritas en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edicion, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, PA (2001).

La invencion proporciona ademas el agente de union de IL-17 de la invencion para uso en un metodo para tratar una enfermedad mediada por IL-17 en un mairnfero. El metodo comprende administrar la composicion antes mencionada a un mamffero que tiene una enfermedad mediada por IL-17, despues de lo cual la enfermedad mediada por IL-17 se trata en el mamffero. La expresion "enfermedad mediada por IL-17", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad o trastorno en el que la presencia de IL-17 provoque o contribuya a los efectos patologicos de la enfermedad, o una disminucion de los niveles o la actividad de IL-17 tiene un beneficio terapeutico en mamfferos, preferiblemente humanos. Ejemplos de enfermedades mediadas por IL-17 incluyen, pero no se limitan a, inflamacion de las vfas respiratorias, asma, artritis reumatoidea (AR), osteoartritis, osteoporosis, erosion osea, abscesos y adhesiones intraperitoneales, trastorno inflamatorio intestinal (IBD), trastorno pulmonar obstructivo cronico (COPD), enfermedad de Addison, agammaglobulinemia, asma alergica, alopecia areata, pfcea celfaca, enfermedad de Chagas, fibrosis pulmonar idiopatica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, rechazo de aloinjerto (por ejemplo, renal), artritis psoriasica, uveftis, enfermedad de Behcet, ciertos tipos de cancer, angiogenesis, aterosclerosis, esclerosis multiple (EM), lupus eritematoso sistemico, septicemia, choque septico o endotoxico, respuesta a la exposicion al alergeno, gastritis asistida por Helicobacter pylori, asma bronquial, espondilitis anquilosante, nefritis lupica, psoriasis, isquemia, esclerosis sistemica, accidente cerebrovascular y otros trastornos inflamatorios.

Tal como se usa en este documento, los terminos "tratamiento", "tratar" y similares, se refieren a la obtencion de un efecto farmacologico y/o fisiologico deseado. Preferiblemente, el efecto es terapeutico, es decir, el efecto cura parcial o completamente una enfermedad y/o un smtoma adverso atribuible a la enfermedad. Con este fin, el metodo de la invencion comprende administrar una "cantidad terapeuticamente eficaz" del agente de union a IL-17. Una "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir un resultado terapeutico deseado. La cantidad terapeuticamente eficaz puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del agente de union a IL-17 para provocar una respuesta deseada en el individuo. Por ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente de union a IL-17 de la invencion es una cantidad que disminuye la bioactividad de IL-17 en un ser humano (por ejemplo, bloqueando la union a IL17R).

Alternativamente, el efecto farmacologico y/o fisiologico puede ser profilactico, es decir, el efecto evita total o parcialmente una enfermedad o smtoma del mismo. A este respecto, el metodo de la invencion comprende administrar una "cantidad profilacticamente eficaz" del agente de union a IL-17 a un mamffero que esta predispuesto a una enfermedad mediada por IL-17. Una "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir un resultado profilactico deseado (por ejemplo, la prevencion del inicio de la enfermedad).

Una dosis tfpica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 1000 |jg; sin embargo, las dosis por debajo o por encima de este intervalo de ejemplo estan dentro del alcance de la invencion. La dosis parenteral diaria puede ser de aproximadamente 0,1 jg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal total (por ejemplo, aproximadamente 5 jg/kg, aproximadamente 10 jg/kg, aproximadamente 100 jg/kg, aproximadamente 500 jg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, o un intervalo definido por cualquiera de dos de los valores anteriores), preferiblemente de aproximadamente 0,3 jg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal total (por ejemplo, aproximadamente ,5 jg/kg, aproximadamente 1 jg/kg, aproximadamente 50 jg/kg, aproximadamente 150 jg/kg, aproximadamente 300 jg/kg, aproximadamente 750 jg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, o un intervalo definido por cualquiera de dos de los valores anteriores), mas preferiblemente de aproximadamente 1 jg/kg a 1 mg/kg de peso corporal total (por ejemplo, aproximadamente 3 jg/kg, aproximadamente 15 jg/kg, aproximadamente 75 jg/kg, aproximadamente 300 jg/kg, aproximadamente 900 jg/kg o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores), e incluso mas preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 10 mg/kg de peso corporal por dfa (por ejemplo, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores). La eficacia terapeutica o profilactica puede monitorizarse mediante la evaluacion periodica de los pacientes tratados. Para administraciones repetidas durante varios dfas o mas,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

dependiendo de la condicion, el tratamiento se repite hasta que se produce una supresion deseada de los smtomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regfmenes de dosificacion pueden ser utiles y estan dentro del alcance de la invencion. La dosificacion deseada puede administrarse mediante una sola administracion en bolo de la composicion, por multiples administraciones en bolo de la composicion, o por la administracion de infusion continua de la composicion.

La composicion que comprende el agente de union a IL-17 de la invencion se puede administrar a un mamfero usando tecnicas de administracion estandar, incluyendo administracion oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutanea, pulmonar, transdermica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o en supositorio. La composicion preferiblemente es adecuada para la administracion parenteral. El termino "parenteral", como se usa en el presente documento, incluye administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, rectal, vaginal e intraperitoneal. Mas preferiblemente, la composicion se administra a un mai^ero utilizando un suministro sistemico periferico por inyeccion intravenosa, intraperitoneal o subcutanea.

Una vez administrado a un mamffero (por ejemplo, un humano), la actividad biologica del agente de union a IL-17 de la invencion se puede medir por cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica. Por ejemplo, la actividad biologica puede evaluarse determinando la estabilidad de un agente de union a IL-17 particular. En una realizacion de la invencion, el agente de union a IL-17 (por ejemplo, un anticuerpo) tiene una semivida in vivo entre aproximadamente 5 y 28 dfas (por ejemplo, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores). Preferiblemente, el agente de union a IL-17 tiene una semivida in vivo entre aproximadamente 21 dfas y 28 dfas (por ejemplo, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 dfas). La actividad biologica de un agente de union a IL-17 particular tambien puede evaluarse determinando su afinidad de union a IL-17 o un epftopo del mismo. El termino "afinidad" se refiere a la constante de equilibrio para la union reversible de dos agentes y se expresa como la constante de disociacion (KD).

La afinidad de un agente de union a un ligando, tal como la afinidad de un anticuerpo para un epftopo, puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nanomolar (nM) a aproximadamente 0,1 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 picomolar (pM), de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 pM, o desde aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 femtomolar (fM). En el contexto del metodo de la invencion, el agente de union a IL-17 se une a iL-17 con una KD inferior o igual a 1 nanomolar (por ejemplo, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,6 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,2 nM, 0,1 nM, 0,05 nM, 0,025 nM, 0,01 nM, 0,001 nM, o un intervalo definido por cualquiera de dos de los valores anteriores), y preferiblemente menor o igual a 200 picomolar (por ejemplo, 190 pmol, 175 pmol, 150 pmol, 125 pmol, 110 pmol, 100 pmol, 90 pmol, 80 pmol, 75 pmol, 60 pmol, 50 pmol, 40 pmol, 30 pmol, 25 pmol, 20 pmol, 15 pmol, 10 pmol, 5 pmol , 1 pmol, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores). La afinidad de inmunoglobulina para un antfgeno o epftopo de interes puede medirse usando cualquier ensayo reconocido en la tecnica. Tales metodos incluyen, por ejemplo, separacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), perlas separables (por ejemplo, perlas magneticas), filtracion de antfgenos y/o ELISA (vease, por ejemplo, Janeway y otros (eds.), Immunobiology, 5a Ed., Garland Publishing, Nueva York, NY, 2001).

El agente de union a IL-17 de la invencion puede administrarse solo o en combinacion con otros farmacos (por ejemplo, como adyuvante). Por ejemplo, el agente de union a IL-17 puede administrarse en combinacion con agentes inmunosupresores o inmunomoduladores u otros agentes anti-inflamatorios para el tratamiento o la prevencion de las enfermedades mediadas por IL-17 descritas en la presente memoria. A este respecto, el agente de union a IL-17 puede usarse en combinacion con farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad (DMARD) (por ejemplo, sales de oro, sulfasalazina, antimalarias, metotrexato, D-penicilamina, azatioprina, acido micofenolico, ciclosporina A , tacrolimus, sirolimus, minociclina, leflunomida, y glucocorticoides), un inhibidor de calcineurina (por ejemplo, ciclosporina A o FK 506), un modulador de la recirculacion de linfocitos (por ejemplo, FTY720 y analogos de FTY720), un inhibidor de mTOR (por ejemplo, rapamicina, 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, CCI779, ABT578, AP23573 o TAFA-93), una ascomicina que tiene propiedades inmunosupresoras (por ejemplo, ABT-281, ASM981, etc.), corticosteroides, ciclofosfamida, azatiopreno, metotrexato, leflunomida, mizoribina, acido micofenolico, micofenolato mofetil, 15-deoxispergualina, o un homologo inmunosupresor, analogo o derivado de los mismos, anticuerpos monoclonales inmunosupresores (por ejemplo, anticuerpos monoclonales contra receptores de leucocitos tales como MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28 , CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 o sus ligandos), otros compuestos inmunomoduladores, inhibidores de la molecula de adhesion (por ejemplo, antagonistas de LFA-1, antagonistas de ICAM-1 o -3, antagonistas de VCAM-4 o antagonistas de VLA-4), un agente quimioterapeutico (por ejemplo, paclitaxel, gemcitabina, cisplatino, doxorrubicina o 5-fluorouracilo), agentes anti-TNF (por ejemplo, anticuerpos monoclonales contra TNF tales como infliximab, adalimumab, CDP870 o construcciones receptoras a TNF-RI o TNF-RII, tales como ENBREL™ (Etanercept) o PEG-TNF-RI, bloqueadores de citocinas proinflamatorias, bloqueadores de IL-1 (por ejemplo, bloqueadores de KINERET™ (Anakinra) o trampa de IL-1, AAL160, ACZ 885 e IL-6), bloqueadores de quimioquinas (por ejemplo, inhibidores o activadores de proteasas), anticuerpos anti-IL-15, anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-CD20, AINEs y/o un agente anti-infeccioso.

Ademas de los usos terapeuticos, el agente de union a IL-17 descrito en este documento puede usarse en aplicaciones de diagnostico o de investigacion. A este respecto, el agente de union a IL-17 puede usarse en un metodo para diagnosticar una enfermedad o trastorno mediado por IL-17. Por ejemplo, la invencion proporciona un metodo para diagnosticar una enfermedad mediada por IL-17 en un marnffero que comprende administrar el agente de union a IL-17 a un mamfero sospechoso de tener una enfermedad mediada por IL-17, despues de lo cual la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

deteccion de IL-17 que se une a IL-17 es indicativo del mairnfero que tiene una enfermedad mediada por IL-17. De una manera similar, el agente de union a IL-17 puede usarse en un ensayo para monitorizar los niveles de IL-17 en un sujeto que se esta probando para una enfermedad o trastorno asociado a IL-17. Las aplicaciones de investigacion incluyen, por ejemplo, metodos que utilizan el agente de union a IL-17 y un marcador para detectar IL- 17 en una muestra, por ejemplo, en un fluido corporal humano o en un extracto de celulas o tejidos. El agente de union a IL-17 se puede usar con o sin modificacion, tal como marcaje covalente o no covalente con un resto

1 J 3 14 32 35 125

detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisotopo (por ejemplo, H, C, P, S o I), un compuesto fluorescente o quimioluminiscente (por ejemplo, isotiocianato de fluorescema, rodamina o luciferina) o una enzima (por ejemplo fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o peroxidasa de rabano picante). En el contexto de la invencion puede emplearse cualquier metodo conocido en la tecnica para conjugar por separado un agente de union al antfgeno (por ejemplo, un anticuerpo) a un resto detectable (vease, por ejemplo, Hunter et al, Nature, 144: 945 (1962), David y col., Biochemistry, 13: 1014 (1974), Pain et al, J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407 (1982)).

Los niveles de IL-17 se pueden medir utilizando el agente de union a IL-17 de la invencion por cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica. Tales metodos incluyen, por ejemplo, ELISA, radioinmunoensayo (RIA) y FACS. Los valores de expresion normales o estandar de IL-17 se pueden establecer usando cualquier tecnica adecuada, por ejemplo, combinando una muestra que comprende o se sospecha que comprende un polipeptido de IL-17 con un anticuerpo espedfico de IL-17 en condiciones adecuadas para formar un complejo antfgeno-anticuerpo. El anticuerpo esta marcado directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la deteccion del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos protesicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos (vease, por ejemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)). La cantidad de polipeptido de IL-17 expresada en una muestra se compara entonces con los valores patron.

El agente de union a IL-17 puede proporcionarse en un kit, es decir, una combinacion empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar un ensayo de diagnostico. Si el agente de union a IL-17 esta marcado con una enzima, el kit incluye deseablemente sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona un cromoforo o fluoroforo detectable). Ademas, se pueden incluir otros aditivos en el kit, tales como estabilizadores, tampones (por ejemplo, un tampon de bloqueo o tampon de lisis), y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos se pueden variar para proporcionar concentraciones en solucion de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos (tfpicamente liofilizados), incluyendo excipientes que al disolverse proporcionaran una solucion de reactivo que tiene la concentracion apropiada.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invencion pero, por supuesto, no deben ser interpretados como limitando de ningun modo su alcance.

EJEMPLO 1

Este ejemplo demuestra que un agente de union a IL-17 de acuerdo con la invencion puede bloquear la actividad de IL-17 humana in vivo.

La IL-17 humana (hIL-17) es capaz de unirse y estimular el receptor de IL-17 de raton que conduce a la posterior liberacion de quimioquina KC (CXCL1). Se realizaron experimentos de tiempo y dosis para identificar la dosis optima de hIL-17 que dio como resultado la induccion maxima de KC de raton in vivo. La IL-17 humana se administro subcutaneamente a ratones a 1, 3 y 10 pg/raton. En varios puntos de tiempo despues de la administracion de hIL-17 (Figura 1), los ratones se sacrificaron y los niveles de KC se determinaron por ELISA usando un kit disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante (KC Quantikine, R & D Systems, Minneapolis, MN). Estos experimentos indicaron que una dosis subcutanea de 10 pg/raton de IL-17 humana daba como resultado los niveles maximos de KC en suero de raton dos horas despues de la administracion de la citoquina humana (Figura 1).

Un anticuerpo IgG1 de longitud completa que comprende un polipeptido de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 4 y un polipeptido de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 24 se administro por via intravenosa a ratones a 1, 10 y 100 pg/raton dos horas antes de la inyeccion subcutanea de hIL-17. Dos horas despues de la administracion de IL-17 humana, los ratones se sacrificaron y los niveles de KC se determinaron por ELISA utilizando un kit comercialmente disponible. Se utilizo un anticuerpo igualado a isotipo (IgG1) como control negativo (NC). Como se muestra en la Figura 2, el anticuerpo que comprende SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 24 bloquea la capacidad de hIL-17 para estimular el receptor de IL-17 de raton dependiente de la dosis. A la dosis de 100 pg/raton, el anticuerpo disminuyo los niveles medios de KC en aproximadamente 75 a 80% en comparacion con el vehfculo y el anticuerpo NC, que no tuvo ningun efecto.

El resultado de este ejemplo demuestra que un anticuerpo espedfico de IL-17 que comprende SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 24 puede inhibir la actividad de IL-17 in vivo.

EJEMPLO 2

Este ejemplo demuestra que los polipeptidos de cadena pesada de inmunoglobulina (HC) y de cadena ligera (LC) descritos en la presente memoria pueden formar anticuerpos que se unen a IL-17 in vitro.

Se prepararon muestras de ADN que codificaban diversos polipeptidos de cadena pesada (HC) y de cadena ligera (LC) de inmunoglobulina como se describe en la presente memoria combinando lo siguiente: 20 jl de ADN maxi- 5 prepped (compuesto de 0,2 jg de plasmido HC y 0,2 jg de LC), 9,8 jl de OPTIMEM™ Invitrogen, Carlsbad, CA),

1,2 jl de Reactivo de Transfeccion GENEJUICE™ (Novagen, Gibbstown, NJ) y 13,8 jl de OPTIMEM™ (precalentado). Despues de una mezcla completa e incubacion (a temperatura ambiente) de las preparaciones de ADN, se anadieron 35 jl de mezcla de reactivo/ADN a 5 x 104 celulas HEK293-cl8. 18 horas antes de la transfeccion, las celulas se sembraron en 150 jl de medio Freestyle por pocillo de un plato de microvaloracion de 96 10 pocillos y se incubaron a 37°C en atmosfera humidificada al 8% de CO2. Despues de la transfeccion, las celulas se

devolvieron a 37°C en CO2 al 8%. Las combinaciones de secuencias de cadena pesada y cadena ligera que se ensayaron se exponen en la Tabla 2.

Tabla 2

Pocillo N°

SEQ ID NO de cadena pesada: SEQ ID NO de cadena ligera:

1

30 29

2

1 29

3

2 29

4

4

29

5

6 29

6

7 29

7

9 29

8

30 24

9

1 24

10

2 24

11

4 24

12

6 24

13

7 24

14

9 24

15

30 25

16

4 25

17

6 25

18

30 27

19

4 27

20

6 27

15 Los sobrenadantes en placas de 96 pocillos se cosecharon 5-7 dfas despues de la transfeccion. Antes de cargar en el BIACORE™ A100 y/o BIACORE™ 4000 (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido), las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos para eliminar las burbujas de aire. Los positivos, negativos, y los controles de los medios fueron anadidos a los pozos vados. Una IgG anti-Fc espedfica humana se acoplo con amina a la superficie de Sensor Chip CM5 a dos densidades diferentes en dos puntos de una celula de flujo dada 20 para 2 mas de 2 analisis. Las IgG de interes se capturaron en ambas densidades. Se fluyeron dos concentraciones de antfgeno (IL-17 humana) sobre cada anticuerpo a cada densidad (incluyendo un muestreo de "concentracion cero") y se monitorizaron las interacciones de union. La superficie se regenero con 10 mM de glicina a pH 1,7 para eliminar el material que estaba unido al anticuerpo de captura. El conjunto de datos se analizo con el modo de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

interaccion 1:1 de Langelier con el transporte de masas. Los polipeptidos de cadena pesada y cadena ligera ensayados formaron anticuerpos que se unieron a la IL-17 humana (vease la Figura 3).

Los resultados de este ejemplo demuestran que un agente de union a IL-17 que comprende los polipeptidos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina descritos en la presente memoria puede unirse a IL-17 humana in vitro.

EJEMPLO 3

Este ejemplo demuestra que los polipeptidos de cadena pesada (HC) y de cadena ligera (LC) de inmunoglobulina descritos en la presente memoria pueden formar anticuerpos que se unen a IL-17 humana in vitro.

El orden de clasificacion de la afinidad de union para los siguientes anticuerpos anti-IL17a se determino mediante un ensayo homogeneo de fluorescencia resuelta en el tiempo (HTRF): (a) un anticuerpo que comprende un polipeptido de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 55 y un polipeptido de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 24 (“APE508”), (b) un anticuerpo que comprende un polipeptido de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 78 y un polipeptido de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 24 ("APE755"), (c) un primer anticuerpo anti-IL17a de referencia (descrito en la publicacion de solicitud de patente internacional n° WO 2006/013107), y (d) un segundo anticuerpo anti-IL17a de referencia (descrito en la Patente de Estados Unidos N° 7.838.738). En el ensayo, se marco un antfgeno de IL-17 (APE349 - SEQ ID NO: 82) unido a la protema fluorescente wasabi (WFP) (vease, por ejemplo, Ai et al, BMC Biol, 6: 13 (2008)) con criptato activado con N-hidroxisuccinamida (Criptato Eu3+ -TBP-NHS) usando un Kit de Marcaje de Criptato HTRF® siguiendo el protocolo del fabricante (Cisbio Us, Bedford, MA). Una version biotinilada del segundo anticuerpo de referencia se unio a estreptavidina-XL665 (Cisbio US, Bedford, MA) y posteriormente se mezclo con cada uno de los anticuerpos anti-IL17a mencionados anteriormente a diversas concentraciones. Los anticuerpos se incubaron entonces con el antfgeno marcado durante una noche a temperatura ambiente. Al final del ensayo, la reaccion se leyo en un ProxiPlate-384 Plus (Perkin Elmer, Waltham, MA) usando un lector de placas EnVision Multilabel (PerkinElmer, Waltham, MA). La union del antfgeno marcado y el anticuerpo de referencia se determino como la relacion de 665 nm a 620 nm. Las relaciones se representaron frente a las concentraciones de los anticuerpos ensayados, y se determino la IC50 para cada anticuerpo probado por ajuste de la curva inhibitoria usando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Los resultados de este ensayo demuestran que los anticuerpos APE755 y APE508 se unen al mismo epttopo en IL-17 como los anticuerpos anti-IL17a de referencia.

Tambien se uso un ensayo de liberacion de citoquinas usando celulas HT1080, celulas NIH 3T3 o celulas de fibroblastos sinoviales primarias de pacientes con artritis reumatoide (AR SFB) para demostrar que los polipeptidos de cadena pesada (HC) y de cadena ligera (LC) de inmunoglobulina descritos en la presente memoria pueden formar anticuerpos que se unen a la IL-17 humana. La liberacion de IL-6 de celulas NIH3T3 y HT-1080 se cuantifico mediante ELISA. Las celulas se sembraron en una placa de ensayo de 96 pocillos a 1 x 104 celulas/pocillo y luego se trataron durante 24 horas con (i) Myc-IL-17a humana purificada (APE280, 52pM para celulas NIH3T3 o 200 pM para celulas HT1080), (ii) TNFa recombinante humana (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, 0,5 ng/ml, celulas NIH3T3 celulas solo) y (iii) los anticuerpos anti-IL17a descritos anteriormente a diversas concentraciones (todas en 100 pi DMEM/10% FCS). Despues del tratamiento, el sobrenadante de 10 pi de cada pocillo se analizo por ELISA (eBioscience, Inc., San Diego, CA) para la cuantificacion de IL-6 de raton siguiendo el protocolo del fabricante. Los niveles de IL-6 se normalizaron con el control negativo, en el que no estaba presente ningun anticuerpo anti-IL-17a durante el tratamiento. Los niveles de IL-6 normalizados se representaron frente a la concentracion de anticuerpos, y se determino la CI50 para cada anticuerpo por ajuste de la curva inhibitoria utilizando el software GraphPad Prism. Se estimo la liberacion de IL-8 estimulada por IL-17a a partir de celulas HT-1080 como se describio anteriormente, excepto que se usaron Myc-IL-17a de 800 pM y 0,05 ng/ml de TNFa recombinante humano. La cuantificacion de IL- 8 se realizo usando un kit ELISA de BioLegend (San Diego, CA) siguiendo el protocolo del fabricante.

El anticuerpo APE755 inhibio la liberacion de IL-6 de lmeas celulares estimuladas con IL-17 humana con una potencia de 5 a 10 veces mayor que el primer anticuerpo anti-IL17a de referencia. El anticuerpo APE755 inhibio la liberacion de IL-8 a partir de las lmeas celulares estimuladas con IL-17 humana con una potencia 2 veces mayor que el primer anticuerpo anti-IL17a de referencia.

La liberacion de IL-6 e IL-8 de celulas RA SFB se cuantifico mediante ELISA. Se sembraron celulas RA SFB en el paso 2-4 (Asterand, MI, aislado de la region enferma de la rodilla de una mujer caucasica de 63 anos con artritis reumatoide) en una placa de ensayo de 96 pocillos a 5x103 celulas/pocillo. Despues de un cultivo durante la noche, las celulas se trataron durante 24 horas con IL-17a humana (Humanzyme, IL, 200 pM) y varias concentraciones de uno de los siguientes anticuerpos anti-IL17a: (a) APE508, (b) APE755, (c) un primer anticuerpo de referencia anti- IL17a (descrito en la publicacion de solicitud de patente internacional n° Wo 2006/013107), (d) un segundo anticuerpo anti-IL17a de referencia (descrito en la Patente de Estados Unidos N° 7.838.738), y (e) un anticuerpo espedfico para el factor de crecimiento nervioso (NGF) ("APE409"), que sirvio como un control negativo (todos en 100 pi de DmEM/F-12/10% FBS). Despues del tratamiento, se sometieron 10 pi o 20 pl de sobrenadante de cada pocillo a ELISA de IL-6 humana (eBioscience, Inc., San Diego, CA) o IL-8 humana (BioLegend, San Diego, CA), respectivamente, siguiendo los protocolos del fabricante. Los niveles de IL-6 e IL-8 se normalizaron a los controles negativos (es decir, ningun anticuerpo anti-IL-17a presente durante el tratamiento). Los niveles normalizados se representaron como se ha descrito anteriormente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

El anticuerpo APE755 inhibio la liberacion de IL-6 e IL-8 de fibroblastos sinoviales de RA primarios humanos estimulados con IL-17 con una potencia 5 veces superior a los anticuerpos anti-IL-17a de referencia (vease la figura 4).

Los resultados de este ejemplo demuestran que un agente de union a IL-17 que comprende los polipeptidos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina descritos en la presente memoria puede unirse a IL-17 humana in vitro.

EJEMPLO 4

Este ejemplo demuestra que los polipeptidos de cadena pesada de inmunoglobulina (HC) y de cadena ligera (LC) descritos en la presente memoria pueden formar anticuerpos que bloquean la actividad de IL-17 in vitro.

La inhibicion de la union de receptor-ligando por anticuerpos anti-IL17a se cuantifico mediante ELISA de competicion. Se recubrio una placa de ensayo de 96 pocillos con myc-IL-17a 5nM (APE280) en 100 pi de tampon de recubrimiento (eBioscience, Inc., San Diego, CA). Se mezclo el receptor A de IL-17 1 nM biotinilado (IL-17RA) (R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN) con varias concentraciones de los anticuerpos anti-IL17a descritos en el Ejemplo 3 (todos en 100 pi de tampon de bloqueo (EBioscience, Inc., San Diego, CA)), y se incubaron durante 24 horas en la placa recubierta de IL-17A. La IL-17RA biotinilada capturada se cuantifico usando avidina-peroxidasa de rabano picante (HRP) siguiendo un protocolo ELISA estandar. Las senales se normalizaron con el control negativo, en el que no estaba presente ningun anticuerpo anti-IL17a para bloquear la union. Las senales de union receptor-ligando normalizadas se representaron frente a las concentraciones de los anticuerpos, y se determino la CI50 para cada anticuerpo por ajuste de la curva inhibitoria utilizando el software GraphPad Prism. El anticuerpo APE755 era 40 veces mas potente que el primer anticuerpo anti-IL-17a de referencia, y equivalente al segundo anticuerpo de referencia anti-IL-17a, al bloquear la interaccion IL-17/IL-17RA (Figura 5).

Los resultados de este ejemplo demuestran que un anticuerpo espedfico de IL-17 que comprende un polipeptido de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 78 y un polipeptido de cadena ligera que comprende sEq ID NO: 24 puede inhibir la actividad de IL-17 in vitro.

EJEMPLO 5

Este ejemplo demuestra que los polipeptidos de cadena pesada (HC) y de cadena ligera (LC) de inmunoglobulina descritos en la presente memoria pueden formar anticuerpos que se unen a IL-17 humana in vitro.

Las afinidades de union de diversos anticuerpos que comprenden los polipeptidos de la cadena pesada de la inmunoglobulina (HC) y de la cadena ligera (LC) descritos en este documento se evaluaron usando BIACORE™ y KINEXA®.

El BIACORE T100™ se usa para determinar la cinetica y la afinidad de union anticuerpo-antfgeno. La tecnologfa se basa en la resonancia de plasmon de superficie (SPR), un fenomeno optico que permite la deteccion de interacciones libres de marcadores en tiempo real dentro de una matriz de biosensor de dextrano. Por lo tanto, es adecuada para medir las constantes de velocidad de asociacion (kon), asf como la disociacion (koff). Todos los reactivos y materiales se adquirieron de GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). Los anticuerpos anti-IL17a se capturaron mediante un anticuerpo anti-Fc humano (GE Healthcare, numero de catalogo BR-1008-39) que se inmovilizo covalentemente en un chip sensor CM5 (GE Healthcare, numero de catalogo BR-1005-30) usando la qmmica de acoplamiento de amina. 3000 unidades de respuesta (RU) de anticuerpo de captura se unieron a la superficie de dextrano, y 30-50 RU de 500 ng/mL de anticuerpos anti-IL-17a fueron capturados posteriormente. Se utilizo tampon IX HBS-EP+ (de 0,01 M de HEPES, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05% de Polisorbato, pH 7,6) para reconstituir el antfgeno a diversas concentraciones (comenzando a 50 nM y utilizando diluciones en serie de dos veces para cada concentracion). Se inyectaron 210 pl de cada concentracion de antfgeno sobre el anticuerpo capturado a una velocidad de flujo de 30 pl/min, luego se dejo disociar durante 10 minutos. La superficie se regenero con 60 pl de MgCh 3 M despues de cada ciclo para establecer la lmea de base. Las constantes cineticas de asociacion y disociacion (ka y kd) se evaluaron con un modelo de union "1:1 con transporte de masa" en el Software de Evaluacion BIACORE™ T100. El grado de union para el ensayo BIACORE™ se midio como "++" (union fuerte), "+" (union) o "+/-" (cerca del fondo). Los resultados del ensayo BIACORE™ se exponen en la Tabla 3.

Tabla 3

SEQ ID NO de Cadena Pesada

SEQ ID NO de Cadena Ligera Nombre del Clon Union BIACORE™ 4000 +/-

1

24 546/773 +

4

25 817/772 +

4

27 817/842 +

9

24 843/773 +

SEQ ID NO de Cadena Pesada

SEQ ID NO de Cadena Ligera Nombre del Clon Union BIACORE™ 4000 +/-

8

24 846/773 +

10

25 847/772 +

10

27 847/842 +

12

25 878/772 +

12

27 878/842 +

13

25 887/772 +

13

26 887/841 +

13

27 887/842 +

14

24 1102/773 +

21

24 1103/773 +

33

24 1129/773 +

34

24 1134/773 +

32

24 1137/773 +

35

24 1139/773 +

17

24 1142/773 +

77

24 1143/773 +

76

24 1144/773 +

19

24 1146/773 +

15

24 1147/773 +

36

24 1153/773 +

84

24 MP4-2 +

85

24 MP4-4 + +

86

24 MP4-5 + +

87

24 MP4-6 +

88

24 MP4-7 +

89

24 MP4-8 +

90

24 MP4-9 +

91

24 MP4-10 +

92

24 MP4-11 +

93

24 MP4-14 +

94

24 MP4-16 +

95

24 MP4-17 +

96

24 MP4-19 +/-

97

24 MP4-20 +

SEQ ID NO de Cadena Pesada

SEQ ID NO de Cadena Ligera Nombre del Clon Union BIACORE™ 4000 +/-

98

24 MP4-21 +

99

24 MP4-22 +

100

24 MP4-23 + +

Los anticuerpos optimizados a <100 pM tambien se caracterizaron usando un ensayo KINEXA® 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID). La tecnologfa KINEXA® mide la molecula receptora no unida/libre en fase de solucion. La medicion de los eventos de union en la fase de solucion con microperlas para la superficie maximizada evita las 5 limitaciones de transporte de masa y los efectos de movilidad inherentes a los metodos que miden la union a una fase solida. Para cada experimento, 50 |jg de IL-17a humana se acoplaron con amina a 50 mg de perlas UltraLink Biosupport (Thermo Scientific, Waltham, MA, catalogo N° 53110). Se incubo una concentracion constante de anticuerpo (suficiente para producir 0,8 V -1,2 V de senal) durante un periodo de tiempo suficiente para aproximarse o alcanzar el equilibrio (el tiempo de incubacion vana para cada anticuerpo y depende de la afinidad) con el antigeno 10 titulado en la muestra Tampon (IX PBS, pH 7,4, NaN3 al 0,02%, BSA al 0,1%). La solucion de anticuerpo-antigeno se hizo paso entonces sobre las perlas acopladas al antigeno a una velocidad de 0,25 ml/min. El anticuerpo libre capturado por las perlas se detecto usando IgG anti-humano de burro AffiniPure conjugado con Cy5 (H + L) (Jackson ImmunoResearch, numero de catalogo: 709-175-149). La Kd y/o ABC (concentracion de union activa) del anticuerpo se obtuvo a partir del analisis de regresion no lineal usando un modelo de union homogenea de un solo 15 sitio en el Software KINEXA® Pro. Con el fin de conseguir la medicion mas precisa para cada anticuerpo, cada "curva controlada por Kd" (en la que la concentracion de anticuerpos es inferior a Kd) se combino con la "curva controlada por el receptor" (donde la concentracion de anticuerpos esta muy por encima de Kd) en el analisis de la curva N. Los resultados del ensayo KINEXA® se exponen en la Tabla 4.

Tabla 4

SEQ ID NO de Cadena Pesada

SEQ ID NO de Cadena Ligera Nombre del Clon Valores de KINEXA® promedio

Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD

2

24 APE253-771/773 no determinado (ND) ND ~60nM

4

24 APE265-817/773 ND ND 322 pM

12

24 APE318-878/773 ND ND 14,2 nM

13

24 APE319-887/773 ND ND 6,1 nM

10

24 APE320-847/773 ND ND 2,5 nM

6

24 APE321-844/773 ND ND 9,4 nM

48

24 APE422- 1141/773 3,60E+05 2,40E- 05 67 pM

37

24 APE467- 1138/773 ND ND 374 pM

20

24 APE470- 1150/773 ND ND 6,9 nM

64

24 APE480- 1261/773 ND ND 1,2 nM

67

24 APE490- 1263/773 ND ND 948 pM

53

24 APE498- 1330/773 ND ND 126 pM

SEQ ID NO de Cadena Pesada

SEQ ID NO de Cadena Ligera Nombre del Clon Valores de KINEXA® promedio

56

24 APE499- 1332/773 ND ND 92 pM

55

24 APE508- 1266/773 4,18E+05 1,80E- 05 43 pM

42

24 APE545- 1346/773 ND ND 270 pM

55

81 APE744- 1266/1540 ND ND 875 pM

83

24 APE860- 1723/773 ND ND 49 pM

78

24 APE755- 1574/773 1,20E+06 LU O °l(D LO O 4,9 pM

79

24 APE857- 1622/773 ND ND 4,8 pM

Los resultados de este ejemplo demuestran que un agente de union a IL-17 que comprende los polipeptidos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina descritos en la presente memoria puede unirse a IL-17 humana in vitro.

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   1. Un agente de union a IL-17 aislado que comprende ambos de los siguientes:

   (a) un polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la SEQ ID NO: 78 y

   (b) un polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la SEQ ID NO: 24.
2. 2. El agente de union a IL-17 aislado de la reivindicacion 1, que es un anticuerpo, un conjugado de anticuerpo, o un fragmento de union a antfgeno del mismo.
3. 3. El agente de union a IL-17 aislado de la reivindicacion 2, que es un anticuerpo humano, un anticuerpo no humano, o un anticuerpo quimerico.
4. 4. Un vector que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica el agente de union a IL-17 aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. 5. Una composicion que comprende el agente de union a IL-17 aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o el vector de la reivindicacion 4, y un vehnculo farmaceuticamente aceptable.
6. 6. La composicion de la reivindicacion 5 para su uso en un metodo de tratamiento de una enfermedad mediada por IL-17 en un mairnfero.
7. 7. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que la enfermedad mediada por IL-17 se selecciona del grupo que consiste en inflamacion de las vfas respiratorias, asma, artritis reumatoide (AR), osteoartritis, osteoporosis, erosion osea, abscesos y adhesiones intraperitoneales, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), enfermedad de Addison, agammaglobulinemia, asma alergica, alopecia areata, pfcea celfaca, enfermedad de Chagas, fibrosis pulmonar idiopatica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, rechazo de aloinjerto (por ejemplo, renal), artntis psoriatica, uveitis, enfermedad de Behcet, ciertos tipos de cancer, angiogenesis, aterosclerosis, esclerosis multiple (EM), lupus eritematoso sistemico, septicemia, choque septico o endotoxico, respuesta a la exposicion a alergenos, gastritis asociada a Helicobacter pylori, asma bronquial, espondilitis anquilosante, nefritis lupica, psoriasis, isquemia, esclerosis sistemica y accidente cerebrovascular.
8. 8. La composicion para uso segun la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7, en la que el agente de union a IL-17 (a) tiene una semivida en el marnffero entre 5 y 28 dfas, (b) se une a IL-17 con una KD menor o igual a 1 nanomolar y/o

   (c) se une a IL-17 con una KD menor o igual a 200 picomolar.

   Senal OD

   O.6-1
9. 0.5
10. 0.4
11. 0.3
12. 0.2-

    imagen1

    / /

    -*
13. 0.1

    1----------1----------r~

    0 1 2

    —•“ 1 M9

    —t- 3 Mg

    ^ -■■- 10 Mg

    X

    X

    \

    X

    X

    X

    X

    X

    X

    X

    __— x

    imagen2

    3 4 5 6 7 8

    Tiempo (horas)

    FIG. 1

    Lmea de base

    9

    Concentraciones de KC en suero (pg/ml)

    imagen3

    i--------------1--------------1--------------1--------------1--------

    0 1 10 100 Pre-dosis

    Dosis (^g/raton)

    FIG. 2

    imagen4

    FIG. 3

    Liberacion de IL-6 de RA SFB, 20110629

    F7 5000 Celulas RA SFB con IL-17 197 pM

    O) 24 h de incubacion

    imagen5

    •

    APE092

    ■

    APE508

    A

    APE755

    ▼

    APE102

    *

    APE409

    AIN457 APE508 APE755 APE102 APE409

    IC50 [nM)

    0.42 0.13 o.oai 0.09 No Inh

    FIG. 4

    Bloqueo ligando-receptor 20110510/18

    Competition con IL-17RA 2,1 nM, incubation de una noche

    imagen6

    •

    APEQ92

    T

    APE 508

    A

    APE 7 55

    •

    APE 102

    APE092 APE508 APE755 APE 102

    IC50 (n M)

    13.7 1.6 0.34 0.26

    FIG. 5