RU2396282C1 - Способ получения гепарина с низкой молекулярной массой и антикоагулянтной активностью - Google Patents
Способ получения гепарина с низкой молекулярной массой и антикоагулянтной активностью Download PDFInfo
- Publication number
- RU2396282C1 RU2396282C1 RU2009112010/13A RU2009112010A RU2396282C1 RU 2396282 C1 RU2396282 C1 RU 2396282C1 RU 2009112010/13 A RU2009112010/13 A RU 2009112010/13A RU 2009112010 A RU2009112010 A RU 2009112010A RU 2396282 C1 RU2396282 C1 RU 2396282C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- heparin
- molecular weight
- low molecular
- lysozyme
- immobilized
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ получения низкомолекулярных гепаринов с помощью ферментативного расщепления. Для ферментной деполимеризации используют лизоцим и в иммобилизованном виде. Полученный низкомолекулярный гепарин обладает увеличенной ингибиторной активностью по отношению к фактору свертывания крови Ха и уменьшенной ингибиторной активностью по отношению к тромбину, в сравнении с исходным гепарином. 2 табл.
Description
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания эффективного средства профилактики и лечения тромботических состояний (инфаркты, инсульты, тромбозы различной локализации).
В последнее десятилетие низкомолекулярные гепарины (НМГ) с более узким молекулярно-массовым распределением 4-6 кДа начали вытеснять нефракционированный гепарин как лекарственный препарат. Главное преимущество НМГ следует из их фармакокинетических свойств: в 2-4 раза большее время полувыведения из организма, заметно лучшая биодоступность при подкожном введении и более стабильная дозовая реакция (доза может быть рассчитана только исходя из веса пациента, без дополнительного лабораторного исследования). Меньший токсический эффект связан с вызываемой нефракционированным гепарином тромбоцитопенией, что, в свою очередь, обусловлено меньшим взаимодействием НМГ с тромбоцитами.
Ранее была показана возможность получения НМГ под действием гидролитических ферментов, никогда с этой целью не использованных. Таких как папани, химотрипсин, «протеаза С» или целловиридин [1].
Цель изобретения - получение НМГ с помощью фермента лизоцима яичного белка. Данная цель достигается тем, что для гидролиза используется фермент лизоцим. Он легко доступен, дешев. Ранее НМГ с помощью лизоцима никто не получал.
Лизоцим - мураминидаза, фермент класса гидролаз способен разрушать стенку бактериальной клетки, в результате чего происходит ее растворение (лизис). Он действует на один из основных компонентов бактериальной клетки - сложный полисахарид, состоящий из двух типов аминосахаров [2]. Известно применение лизоцима для гидролиза хитозана [3].
Наиболее близким по технической сущности является способ получения НМГ путем частичной деполимеризации под действием иммобилизованных гидролаз [1].
Сущность предложенного способа заключается в том, что раствор гепарина в 0,1 М NaCl перемешивали с иммобилизованным лизоцимом при температуре 50°С в течение 3 ч. Иммобилизованный фермент отделяли либо на стеклянном пористом фильтре, либо с помощью центрифуги, промывали 0,1 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10. Высушивали лиофильно. С выходом около 70-80% получали гепарин с молекулярной массой на 25-30% ниже, чем у исходного гепарина.
Лизоцим в иммобилизованном виде с целью деполимеризации гепарина использованы впервые. При этом установлено, что анти Ха-активность целевого продукта составляет 159±16 ЕД/мг, что соответствует удельной активности такого препарата НМГ как фраксипарин 120-160 ЕД/мг.
Иммобилизацию лизоцима осуществляли на органическом сорбенте поливиниловом спирте, содержащем альдегидные группы (150-200 мкмолей/г сырого сорбента) осуществляли по следующей методике: к 3 г «сырого» (отжатого на стеклянном пористом фильтре) сорбента добавляли 17 мл раствора фермента в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,1 с концентрацией белка 1,8 мг/мл перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре и оставляли при охлаждении 4°С еще на 16 ч. Промывали на стеклянном пористом фильтре водой (200 мл), 1М NaCl (200 мл) и вновь водой. Количество иммобилизованного белка определяли по разности его содержания в исходном растворе фермента и в промывных растворах. Блокирование непрореагировавших альдегидных групп на сорбенте после ковалентного связывания ферментом осуществляли обработкой 0,1 М Трис-HCl буфером с рН 7,5 при перемешивании в течение 2 ч. Иммобилизованные ферменты хранили в холодильнике в воде.
Исследовали влияние низкомолекулярного гепарина (молекулярная масса 9,3 кДа, НМГи), полученного с помощью гидролиза нефракционированного гепарина (НФГ "Белмедпрепараты" ОАО, молекулярная масса 13,8 кДа) иммобилизованным лизоцимом, на изменение времени свертывания плазмы крови человека в тесте активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ, влияние на внутренний путь свертывания крови) и РеаКлот НПО "Ренам"(влияние на активность фактора Ха) [4]. Лиофильно высушенную плазму человека приобретали в НПО «Ренам». Для расчета специфических антитромбиновой (анти-фактор IIa, aIIa) и анти-фактор Ха (аХа) активностей использовали калибровочную кривую 1-го Международного стандарта низкомолекулярного гепарина (NIBSC).
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.
Пример 1. К 6 мл 1% раствора гепарина (из крупного рогатого скота, молекулярная масса 13,8 кДа) в 0,1 М NaCl добавляли 0,5 г иммобилизованного лизоцима а (содержание белка 6 мг/г). Весовое соотношение фермента к навеске гепарина 1:100. Суспензию перемешивали при 50°С в течение 3 ч. Иммобилизованный препарат отделяли центрифугированием, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10 (2,5×42 см), элюент вода, скорость элюции 80 мл/ч, высушивали лиофильно. Получали 48 мг (80% от исходного) с молекулярной массой 9,3 кДа (НМГи).
Пример 2. К смеси 0,099 мл плазмы и 0,06 мл аЧТВ-реагента (НПО "Ренам") добавляли 0,05 мл растворов НФГ и НМГи в конечных концентрациях 0,14-2,20 мкг/мл. Через 3 мин инкубации при 37°С добавляли 0,06 мл 0,025 М раствора CaCl2 и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов (Таблица 1). Антитромбиновые активности (aIIa) НФГ и НМГи при сравнении со стандартом составили 128±3 ЕД/мг и 109±10 ЕД/мг соответственно.
Таблица 1 | ||||||||||
Время появления сгустка плазмы (сек) в тесте активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ) | ||||||||||
шифр | Конечная концентрация, мкг/мл | |||||||||
0 | 0,22 | 0,27 | 0,3 | 0,36 | 0,43 | 0,54 | 0,72 | 1,1 | 2,2 | |
НФГ | 30,0±1,8 | 32,3±2,7 | 33,9±2,5 | 36,1±3,0* | 37,2±3,3* | 38±4,0* | 43,4±3,8** | 51,4±4,4** | 69,5±6,7*** | 114,7±12,3*** |
НМГи | 30,5±3,2 | 31,9±1,3 | 33±2,5 | 35,2±3,1 | 36,4±3,3* | 37,8±3,0* | 38,8±2,8* | 48±3,7** | 88,6±7,4*** | |
* - р<0.05 | ||||||||||
** - р<0.01 и | ||||||||||
*** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл |
Пример 3. К смеси 0,085 мл плазмы и 0,015 мл раствора фактора Ха (НПО "Ренам") добавляли 0,01 мл растворов НФГ, НМГр и НМГи в конечных концентрациях 0,07-0,47 мкг/мл. Через 2 мин инкубации при 37°С добавляли 0,06 мл 0,035 М раствора CaCl2 и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с ростом концентрации образцов (Таблица 2). Активности против фактора Ха (аХа) для НФГ и НМГи при сравнении со стандартом составили 117±10 ЕД/мг и 159±16 ЕД/мг.
Таким образом, при деполимеризации нефракционированного гепарина (отношение активностей aXa/aIIa=0,9) иммобилизованным лизоцимом мы получаем гепарин с молекулярной массой меньшей, в сравнении с исходным НФГ. При этом отношение активностей аХа /aIIa увеличивается в 1,5 раза.
Таблица 2 | ||||||||
Время появления сгустка плазмы (сек) в тесте РеаКлот | ||||||||
шифр | Конечная концентрация, мкг/мл | |||||||
0 | 0,07 | 0,14 | 0,18 | 0,23 | 0.28 | 0,35 | 0,47 | |
НФГ | 19,4±1,3 | 20,0±2,3 | 20,2±2,1 | 20,8±1,7 | 22,1±1,9 | 22,5±2,0 | 28,8±2,4** | 37,9±2,8*** |
НМГи | 21,5±1,8 | 25,4±2,2* | 27,3±2,3** | 29,4±3,0** | 34,6±2,9** | 40,1±3,8*** | 49±4,3*** | |
* - р<0.05 | ||||||||
** - р<0.01 и | ||||||||
*** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл |
Список литературы
1. Г.Е.Банникова, В.П.Варламов, Н.Н.Дрозд, В.А.Макаров, В.Е.Тихонов, К.Г.Скрябин, патент РФ №2295538 от 20 марта 2007 г., Бюл. Открыт., №5 (2007).
2. Бернхард С. Структура и функция ферментов. М., 1971.
3. Ильина А.В., Варламов В.П. Ферментативная деполимеризация N-сукцинилхитозана. Биоорг. Хим. 2007; 33(1):156-9.
4. Bates SM, Weitz JI // Circulation. 2005. V 112. N 4. P 53-60.
Claims (1)
- Способ получения низкомолекулярного гепарина, обладающего антитромбиновой активностью (aIIa) 109±10 ЕД/мг и активностью против фактора Ха (аХа) 159±16 ЕД/мг, с помощью ферментативной деполимеризации, характеризующийся тем, что иммобилизованный лизоцим добавляют в раствор гепарина в 0,1 М NaCl в весовом отношении 1:100 и перемешивают при 50°С в течение 3 ч, иммобилизованный фермент отделяют центрифугированием, супернатант обессоливают на колонке с сефадексом и лиофильно высушивают.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009112010/13A RU2396282C1 (ru) | 2009-04-02 | 2009-04-02 | Способ получения гепарина с низкой молекулярной массой и антикоагулянтной активностью |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009112010/13A RU2396282C1 (ru) | 2009-04-02 | 2009-04-02 | Способ получения гепарина с низкой молекулярной массой и антикоагулянтной активностью |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007141148/15A Division RU2377993C2 (ru) | 2007-11-08 | 2007-11-08 | Способ получения низкомолекулярного гепарина |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2396282C1 true RU2396282C1 (ru) | 2010-08-10 |
Family
ID=42699001
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009112010/13A RU2396282C1 (ru) | 2009-04-02 | 2009-04-02 | Способ получения гепарина с низкой молекулярной массой и антикоагулянтной активностью |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2396282C1 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2512768C1 (ru) * | 2012-12-18 | 2014-04-10 | Федеральное бюджетное учреждение "Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов (ФБУ "ГИКиМП") | Способ получения низкомолекулярного гепарина |
RU2670767C1 (ru) * | 2017-12-26 | 2018-10-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "МИРЭА - Российский технологический университет" (РТУ МИРЭА) | Способ получения низкомолекулярного гепарина |
RU2725545C1 (ru) * | 2020-01-30 | 2020-07-02 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "МИРЭА-Российский технологический университет" | Способ получения низкомолекулярного гепарина |
-
2009
- 2009-04-02 RU RU2009112010/13A patent/RU2396282C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2512768C1 (ru) * | 2012-12-18 | 2014-04-10 | Федеральное бюджетное учреждение "Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов (ФБУ "ГИКиМП") | Способ получения низкомолекулярного гепарина |
RU2670767C1 (ru) * | 2017-12-26 | 2018-10-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "МИРЭА - Российский технологический университет" (РТУ МИРЭА) | Способ получения низкомолекулярного гепарина |
RU2670767C9 (ru) * | 2017-12-26 | 2018-11-26 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "МИРЭА - Российский технологический университет" (РТУ МИРЭА) | Способ получения низкомолекулярного гепарина |
RU2725545C1 (ru) * | 2020-01-30 | 2020-07-02 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "МИРЭА-Российский технологический университет" | Способ получения низкомолекулярного гепарина |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Basa et al. | The pattern of acetylation defines the priming activity of chitosan tetramers | |
Wang et al. | Preparation and anticoagulation activity of sodium cellulose sulfate | |
Chandarajoti et al. | The design and synthesis of new synthetic low‐molecular‐weight heparins | |
TWI769176B (zh) | 生合成肝素 | |
US20240066048A1 (en) | Short-acting heparin-based anticoagulant compounds and methods | |
US5384398A (en) | High molecular mass N,O-sulphated heparosans, process for their preparation and the pharmaceutical compositions which contain them | |
JP5351770B2 (ja) | ビオチンまたはビオチン誘導体との少なくとも1つの共有結合を含む低分子量ヘパリン、これらの作製方法およびそれらの使用。 | |
CN1051564A (zh) | 由未加工褐藻类的脱氧半乳聚糖制得的多糖硫酸盐,抗凝血剂和抗互补剂,及其制备方法 | |
Kim et al. | Anticoagulating activities of low-molecular weight fuco-oligosaccharides prepared by enzymatic digestion of fucoidan from the sporophyll of Korean Undaria pinnatifida | |
FR2669932A1 (fr) | Nouvel heparosane-n,o-sulfate, son procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui le contiennent. | |
US20110076729A1 (en) | Methods of making low molecular weight heparin compositions | |
RU2396282C1 (ru) | Способ получения гепарина с низкой молекулярной массой и антикоагулянтной активностью | |
Bougatef et al. | Purification, compositional analysis, and anticoagulant capacity of chondroitin sulfate/dermatan sulfate from bone of corb (Sciaena umbra) | |
Cavalcante et al. | 2, 3-Di-O-sulfo glucuronic acid: An unmodified and unusual residue in a highly sulfated chondroitin sulfate from Litopenaeus vannamei | |
Sampaio et al. | Heparins and heparans sulfates. Structure, distribution and protein interactions | |
Warda et al. | Turkey intestine as a commercial source of heparin? Comparative structural studies of intestinal avian and mammalian glycosaminoglycans | |
TW200902036A (en) | Heparins comprising at least one covalent bond with biotin or a biotin derivative, preparation process therefor and use thereof | |
RU2377993C2 (ru) | Способ получения низкомолекулярного гепарина | |
US20020009782A1 (en) | Heparin and heparan sulfate derived oligosaccharides and a method for their manufacture | |
RU2295538C2 (ru) | Способ получения гепаринов с низкой молекулярной массой | |
CN108285498A (zh) | 一种抑制内源性凝血因子x酶复合物的寡糖化合物及其制备方法与用途 | |
Jaques et al. | The chemical and anticoagulant nature of heparin | |
Zhang et al. | Uncovering the detailed mode of cleavage of heparinase I toward structurally defined heparin oligosaccharides | |
RU2248801C2 (ru) | Способ получения низкомолекулярных гепаринов | |
RU2366441C2 (ru) | Антикоагулянтное средство на основе биологически активного комплекса из коры кедра сибирского |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20180921 |
|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201109 |