RU2146049C1 - Method of diagnosing specific allergen sensitization of bodies of workers in hydrolytic-yeast production plants - Google Patents
Method of diagnosing specific allergen sensitization of bodies of workers in hydrolytic-yeast production plants Download PDFInfo
- Publication number
- RU2146049C1 RU2146049C1 RU94024336A RU94024336A RU2146049C1 RU 2146049 C1 RU2146049 C1 RU 2146049C1 RU 94024336 A RU94024336 A RU 94024336A RU 94024336 A RU94024336 A RU 94024336A RU 2146049 C1 RU2146049 C1 RU 2146049C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- sensitization
- immune complexes
- concentration
- chemiluminescence
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
В настоящее время существуют разнообразные иммунологические методы изучения иммунного ответа. Наиболее перспективными являются биохемилюминесцентные методы, позволяющие непосредственно определять функциональные изменения активности клеток в процессе иммунных реакций, в отличие от классических, оценивающих лишь результаты иммунного взаимодействия. Один из хемилюминесцентных методов предложен Н.И. Якуба с соавторами с целью оценки специфичности антигенного взаимодействия на иммунокомпетентные клетки (Якуба Н.И., и др. Новое применение метода биохемилюминесценции для изучения специфического клеточного иммунитета. // Всесоюзное совещание по хемилюминесценции г. Юрмала, 11-13 мая 1990 г, Тезисы докладов, Рига-латв. Унив. - 1990 г, с. 69). Currently, there are a variety of immunological methods for studying the immune response. The most promising are bio-chemiluminescent methods, which make it possible to directly determine the functional changes in the activity of cells in the process of immune reactions, in contrast to the classical methods, which evaluate only the results of immune interaction. One of the chemiluminescent methods proposed by N.I. Yakuba et al. To assess the specificity of antigenic interaction on immunocompetent cells (Yakuba N.I. et al. New application of the bio-chemiluminescence method to study specific cellular immunity. // All-Union Meeting on Chemiluminescence, Jurmala, May 11–13, 1990, Abstracts reports, Riga-Latvian Univ. - 1990, p. 69).
Способ заключается в введении в суспензию лейкоцитов частиц латекса, что приводит к усилению хемилюминесценции лейковзвеси за счет неспецифической активации фагоцитов, в то время как нагруженные антигеном частицы определяют специфичность взаимодействия с сенсибилизированными фагоцитами и в большей степени активируют фагоциты, что сопровождается более интенсивной вспышкой хемилюминесценции. Метод позволяет определить изменения рецепторного аппарата клеток, но сложность формирования комплексов латекс-антиген и изолированная оценка лишь фагоцитарного звена иммунного ответа ограничивают его использование в целях диагностики. The method consists in introducing latex particles into the leukocyte suspension, which leads to increased chemiluminescence of the leukoprecipitate due to non-specific activation of phagocytes, while antigen-loaded particles determine the specificity of interaction with sensitized phagocytes and activate phagocytes to a greater extent, which is accompanied by a more intense outbreak of chemiluminescence. The method allows you to determine changes in the receptor apparatus of cells, but the complexity of the formation of latex-antigen complexes and an isolated assessment of only the phagocytic link of the immune response limit its use for diagnostic purposes.
Еще одним способом изучения функциональной активности клеток является определение спонтанной и стимулированной иммунными комплексами хемилюминесценции полиморфно-ядерных лейкоцитов. (Клебанов Г.И., Корейкина М.В., Активация полиморфно-ядерных лейкоцитов крови больных ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда // Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Сб. Рига - РМИ 1988 с. 132-152). Сформированные из лиофилизированного иммуноглобулина G человека и моноспецифических антител кролика против IgG человека, меченных ФИТЦ, иммунные комплексы специфически активируют фагоциты и изменяют кинетику хемилюминесцентного ответа, что улавливается прибором. Another way of studying the functional activity of cells is the determination of spontaneous and chemiluminescence-stimulated immune complexes polymorphic nuclear leukocytes. (Klebanov G.I., Koreykina M.V., Activation of polymorphic nuclear blood leukocytes in patients with coronary heart disease and myocardial infarction // Oxygen radicals in chemistry, biology and medicine. Sat. Riga - RMI 1988 p. 132-152). Formed from lyophilized human immunoglobulin G and monospecific rabbit antibodies against human IgG labeled with FITC, immune complexes specifically activate phagocytes and alter the kinetics of the chemiluminescent response, which is captured by the device.
Недостатком данного метода является узкое назначение: определение фагоцитарной активности ПМД лишь по отношению к одному антигену. The disadvantage of this method is its narrow purpose: the determination of the phagocytic activity of PMD only in relation to one antigen.
В качестве прототипа был взят иммунохемилюминесцентный метод выявления специфического аллергена при антопической бронхиальной астме. An immunochemiluminescent method for detecting a specific allergen in anthopic bronchial asthma was taken as a prototype.
Способ основан на инкубации сыворотки больного и исследуемого аллергена в концентрации 5-10 PNV /мл, последующем добавлении указанной смеси к суспензии мононуклеарных клеток пациента и регистрации взаимодействия клеток с образовавшимися в сыворотке иммунными комплексами методом люминолзависимой хемилюминесценции. The method is based on incubation of the patient’s serum and the test allergen at a concentration of 5-10 PNV / ml, the subsequent addition of this mixture to a suspension of patient’s mononuclear cells and registration of the interaction of cells with the immune complexes formed in serum by luminol-dependent chemiluminescence.
Этапы выполнения способа включают:
- приготовление среды для измерения хемилюминесценции, содержащей 110 мМ NaCI, 20 мМ трис-НС (pH 7,6); 5 мМ глюкозы, 2,5, MgCl2; 0,65 мМ люминола,
- приготовление растворов исследуемых аллергенов путем разведения в 5% растворе глюкозы до концентрации 5-10 PNV/мл,
- выделение мононуклеарных клеток из венозной крови в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3),
- приготовление иммунных комплексов путем инкубации сыворотки больного с раствором исследуемых аллергенов в соотношении 5:1,
- изменение спонтанной хемилюминесценции 50 мкл суспензии мононуклеарных клеток (2•106/мл) при введении ее в термостатируемую при 37oC измерительную кювету прибора, содержащую 800 мкл среды. После выхода кривой интенсивности свечения на плато в кювету добавляют 20 мкл смеси сыворотки больного с исследуемым аллергеном и определяют максимум интенсивности свечения активизированных мононуклеарных клеток.The steps of the method include:
- preparation of a medium for measuring chemiluminescence containing 110 mm NaCl, 20 mm Tris-NS (pH 7.6); 5 mM glucose, 2.5, MgCl 2 ; 0.65 mm luminol,
- preparation of solutions of the investigated allergens by dilution in a 5% glucose solution to a concentration of 5-10 PNV / ml,
- the allocation of mononuclear cells from venous blood in a single-stage density gradient of ficoll-verographin (1,077 g / cm 3 ),
- the preparation of immune complexes by incubating the patient's serum with a solution of the investigated allergens in a ratio of 5: 1,
- change in spontaneous chemiluminescence of 50 μl of a suspension of mononuclear cells (2 · 10 6 / ml) when it is introduced into a measuring cell of a device thermostatically controlled at 37 ° C containing 800 μl of medium. After the luminosity intensity curve reaches a plateau, 20 μl of the patient's serum mixture with the studied allergen are added to the cuvette and the maximum luminescence intensity of activated mononuclear cells is determined.
Недостатками данного метода являются:
- неполная оценка иммунного ответа организма, неучитывающая заключительную эффекторную базу этого ответа, направленную на разрушение и элиминацию антигенного материала из организма по средствам фагоцитоза (В.П. Шабалин, Л. Д. Серова, 1988 г.).The disadvantages of this method are:
- an incomplete assessment of the body's immune response, not taking into account the final effector base of this response, aimed at destroying and eliminating antigenic material from the body by means of phagocytosis (V.P. Shabalin, L.D. Serova, 1988).
Без оценки функциональной активности фагоцитов также невозможно определить патогенность иммунных комплексов, циркулирующих в организме, и их биологических аналогов сформированных in vitro, так как именно полиморфно-ядерные лейкоциты инактивируют соединения антиген-антитело, блокируя запуск цепи патологических реакций. Только в случае неполноценности фагоцитарного звена иммунные комплексы оказывают повреждающее воздействие на ткани организма, вызывая манифестацию процесса. Without assessing the functional activity of phagocytes, it is also impossible to determine the pathogenicity of the immune complexes circulating in the body and their biological analogues formed in vitro, since it is polymorphic-nuclear leukocytes that inactivate antigen-antibody compounds, blocking the launch of a pathological reaction chain. Only in case of inferiority of the phagocytic link do immune complexes have a damaging effect on body tissues, causing a manifestation of the process.
Наличие высокого содержания специфических антител в сыворотке и сенсибилизированных к определенному антигену лимфоцитов еще не дают права говорить об этиологическом значении данного антигена в развитии аллергической реакции, так как иммунные комплексы являются также продуктом нормаргической реакции организма на антиген и проявляют патогенность только при несвоевременной элиминации фагоцитами. The presence of a high content of specific antibodies in the serum and lymphocytes sensitized to a particular antigen does not yet give the right to speak about the etiological significance of this antigen in the development of an allergic reaction, since immune complexes are also the product of a normal reaction of the body to an antigen and are pathogenic only when untimely elimination by phagocytes.
Наши исследования были направлены на создание модельной системы, позволяющей одновременно оценить напряженность гуморального иммунитета и завершенность иммунного ответа по уровню активации фагоцитов. Our studies were aimed at creating a model system that allows us to simultaneously assess the intensity of humoral immunity and the completeness of the immune response by the level of phagocyte activation.
В процессе формирования иммунного ответа выделяют афферентную фазу (распознавание антигена и активации иммуннокомпетентных клеток, центральную фазу и эффекторную (Шабалин В. Н., Серова Л.Д., 1988 г), направленную на разрушение и элиминацию антигенного материала из организма. Реактивность организма определяются конечной фазой иммуннного ответа и зависит от выполнения полиморфно-ядерными лейкоцитами фагоцитарной функции. In the process of formation of the immune response, the afferent phase (recognition of antigen and activation of immunocompetent cells, the central phase and the effector phase (Shabalin V.N., Serova L.D., 1988), aimed at the destruction and elimination of antigenic material from the body, is isolated. The body's response is determined the final phase of the immune response and depends on the performance of the polymorphonuclear leukocyte phagocytic function.
Сформированные in vitro иммунные комплексы специфически активируют мононуклеарные клетки в процессе распознавания антигеном материала и в то же время являются специфическим объектом фагоцитоза для полиморфно-ядрных лейкоцитов. Специфичность антигенного воздействия, оценивается по кратности нарастания интенсивности хемилюминесцентного ответа суспензии лейкоцитов в сравнении со спонтанным уровнем хемилюминесценции клеток. Formed in vitro immune complexes specifically activate mononuclear cells in the process of antigen recognition of a material and at the same time are a specific object of phagocytosis for polymorphic-nuclear leukocytes. The specificity of the antigenic effect is estimated by the multiplicity of the increase in the intensity of the chemiluminescent response of the leukocyte suspension in comparison with the spontaneous level of cell chemiluminescence.
Этапы выполнения способа. The stages of the method.
1. Подготовка среды для хемилюминесценции. 1. Preparation of a medium for chemiluminescence.
Реакционная смесь включает в себя 400 мкл фосфатного буфера (pH 7,6), 100 мкл MgSO4 (0,37 мМ), 200 мкл люминола (0,65 мМ). Буфер необходим для поддержания кислотно-основного состояния среды, изменения которой происходят в процессе активной жизнедеятельности клеток. Повышенное потребление глюкозы через гексозомонофосфатный шунт наблюдается у всех фагоцитов при активации фагоцитоза и связано с усиленным потреблением кислорода в системе НАДФН оксидазы.The reaction mixture includes 400 μl of phosphate buffer (pH 7.6), 100 μl of MgSO 4 (0.37 mmol), 200 μl of luminol (0.65 mmol). The buffer is necessary to maintain the acid-base state of the medium, changes of which occur during the active life of cells. Increased glucose uptake through the hexose monophosphate shunt is observed in all phagocytes upon activation of phagocytosis and is associated with increased oxygen uptake in the NADPH oxidase system.
Ионы Mg необходимы для усиления рецепторных способностей - фагоцитов. Люминол вводится для усиления естественных, фотохимических процессов, протекающих в живых клетках, но из-за низкой интенсивности трудноуловимых. Mg ions are necessary for enhancing receptor abilities - phagocytes. Luminol is introduced to enhance the natural, photochemical processes that occur in living cells, but because of the low intensity of the elusive.
2. Приготовление лейковзвеси. 2. Preparation of watering suspension.
Лейковзвесь готовят из цельной гепаринизированной крови методом лизиса эритроцитов. Leukemia suspension is prepared from whole heparinized blood by erythrocyte lysis.
Для анализа 1 мл венозной крови вносят в пробирку, содержащую 100 мкл разведенного гепарина (1:12 физ.р-ра). Этого объема достаточно для проведения анализа с 5-7 разведениями аллергена. For analysis, 1 ml of venous blood is introduced into a test tube containing 100 μl of diluted heparin (1:12 fiz.r-ra). This volume is sufficient for analysis with 5-7 dilutions of the allergen.
В дальнейшем каждые 300 мкл крови гемолизируют 3 мл 0,083% MH4Cl раствора, начиная с экспозиции в 40 с и уменьшая ее до 20 с, 10 с и 1 с соответственно. Прекращение действия хлористого аммония добиваются введением в смесь 7 мл фосфатного буфера (pH 7,2) с последующей отмывкой клеток путем центрифугирования при 1 000 об/мин в течение 7 мин. Лизис проводят до полного визуального исчезновения эритроцитов.Subsequently, every 300 μl of
Необходимую для исследования концентрацию клеток в суспензии 2•106 кл/мл доводят фосфатным буфером.The concentration of cells in suspension of 2 • 10 6 cells / ml, necessary for the study, is adjusted with phosphate buffer.
3. Формирование иммунных комплексов. 3. The formation of immune complexes.
Получают сыворотку больного из 3 мл негепаринизированной венозной крови отстаиванием и последующим центрифугированием при 200 g в течение 10 мин. The patient's serum is obtained from 3 ml of non-heparinized venous blood by sedimentation and subsequent centrifugation at 200 g for 10 minutes.
Готовят растворы исследуемых антигенов путем разведения стандартных антигенов в 5% растворе глюкозы в различных соотношениях. Solutions of the studied antigens are prepared by diluting standard antigens in a 5% glucose solution in various ratios.
В лунки иммунологического планшета разливают по 100 мкл сыворотки больного, добавляют по 20 мкл раствора антигена и инкубируют в термостате при температуре 37oC в течение 30-40 мин. Это время необходимо, для образования в среде иммунных комплексов, при условии содержания в сыворотке специфических антител. Концентрация в сыворотке C3b фракции комплемента, выполняющей роль опсонина в иммунном агрегате, вполне достаточна для включения в иммунный комплекс.100 μl of the patient's serum is poured into the wells of the immunological tablet, 20 μl of the antigen solution are added and incubated in an incubator at a temperature of 37 ° C for 30-40 minutes. This time is necessary for the formation of immune complexes in the environment, provided that specific antibodies are contained in the serum. The concentration in serum C3b of the complement fraction, which plays the role of opsonin in the immune aggregate, is quite sufficient for inclusion in the immune complex.
4. Этап определения спонтанной и активированной хемилюминесценции суспензии клеток складывается из введения 50 мкл готовой лейковзвеси в термостатируемую кювету прибора, содержащую 800 мкл реакционной среды и последующем измерении хемилюминесценции клеток. После выхода кривой интенсивности свечения клеток на станционарный уровень вносят 20 мкл сыворотки из иммунологического планшета и определяют динамику изменения интенсивности свечения на протяжении 7-8 минут. 4. The step of determining the spontaneous and activated chemiluminescence of a cell suspension is the sum of introducing 50 μl of the finished white suspension into a thermostatic cuvette of the device containing 800 μl of the reaction medium and then measuring the chemiluminescence of the cells. After the curve of cell luminescence intensity reaches a stationary level, 20 μl of serum is added from the immunological tablet and the dynamics of the luminescence intensity change is determined over a period of 7-8 minutes.
В качестве контроля измеряют хемилюминесценцию лейковзвеси с аутологической сывороткой без антигена и раствора антигена без сыворотки. As a control, the chemiluminescence of a suspension with autologous serum without antigen and a solution of antigen without serum is measured.
Определяя уровень спонтанной хемилюминесценции невозбужденных клеток оценивают суммарное значение интенсивности свечения за каждые 30 с, а не максимальное значение интенсивности за единицу времени, так как именно сумма является интегральным показателем, определяющим уровень функционирования клеток, и не зависит от случайно совпавших во времени выбросов в межклеточную среду возбужденных частиц. Determining the level of spontaneous chemiluminescence of unexcited cells, the total value of the luminescence intensity for every 30 s is estimated, and not the maximum value of the intensity per unit time, since it is the sum that is an integral indicator that determines the level of cell functioning and does not depend on emissions randomly coinciding in time to the intercellular medium excited particles.
Кинетика естественной хемилюминесценции клеток выражается в постепенном усилении интенсивности свечения и дальнейшем выходе на стационарный уровень. The kinetics of natural chemiluminescence of cells is expressed in a gradual increase in the intensity of luminescence and further exit to a stationary level.
Увеличение хемилюминесценции связано с протеканием в попавших в новые условия клетках адаптационных процессов, а выход интенсивности свечения на плато говорит о наступившем равновесии между утилизацией кислорода и выделением АФК в межклеточную среду. The increase in chemiluminescence is associated with the occurrence of adaptation processes in the cells that have come under new conditions, and the output of the luminescence intensity on the plateau indicates the onset of equilibrium between the utilization of oxygen and the release of ROS into the intercellular medium.
Если в результате инкубации сыворотки с антигеном сформировались иммунные комплексы, являющиеся специфическими активаторами фагоцитоза, их введение в клеточную среду вызывает значительное и продолжительное во времени усиление ХЛ, фиксируемое прибором. If, as a result of the incubation of the serum with the antigen, immune complexes are formed that are specific activators of phagocytosis, their introduction into the cell medium causes a significant and long-term increase in CL recorded by the device.
Использование различных концентраций антигена в условиях инкубации с сывороткой приводят к формированию нескольких классов иммунных комплексов. The use of various concentrations of antigen under incubation conditions with serum leads to the formation of several classes of immune complexes.
При небольшом избытке концентрации антител над антигенами образуются крупнорешетчатые иммунные комплексы, в наибольшей степени активирующие фагоциты. Эквивалентные количества антител и антигенов образуют средних размеров, хорошо растворимые иммунные комплексы, в меньшей степени активизирующие фагоциты. With a small excess of the concentration of antibodies over antigens, coarse-grained immune complexes are formed that activate phagocytes to the greatest extent. Equivalent amounts of antibodies and antigens form medium-sized, highly soluble immune complexes that activate phagocytes to a lesser extent.
Минимальной возможностью активировать фагоциты обладают мелкодисперстные иммунные комплексы, которые образуются при взаимодействии избытка антигенов с низкими концентрациями антител и оказывают прямое токсическое действие на фагоциты. The finest dispersed immune complexes, which are formed by the interaction of excess antigens with low concentrations of antibodies and have a direct toxic effect on phagocytes, have the minimal ability to activate phagocytes.
В используемой модели по мере увеличения разведения антигена (то есть уменьшения его концентрации) у сенсибилизированных лиц ожидается проявление сначала мелкодисперсных, а затем крупнорешетчатых иммунных комплексов. Соответственно, интенсивность хемилюминесцентного ответа специфически активированных фагоцитов будет увеличиваться по мере снижения концентрации антигена. In the model used, with increasing dilution of the antigen (i.e., decreasing its concentration), sensitized individuals are expected to manifest first finely dispersed and then coarse-grained immune complexes. Accordingly, the intensity of the chemiluminescent response of specifically activated phagocytes will increase with decreasing antigen concentration.
Примеры конкретного выполнения способа. Examples of specific performance of the method.
Обследована группа рабочих биохимзавода в количестве 40 человек на степень сенсибилизации к антигену кормовых дрожжей-продуцентов. A group of workers at a biochemical plant in the amount of 40 people was examined for the degree of sensitization to the antigen of fodder yeast-producers.
Исходный раствор антигена содержал 0,33 г/л общего белка, что в пересчете на единицы белкового азота составляет 5.555 PNV в 1 мл. The initial antigen solution contained 0.33 g / l of total protein, which in terms of protein nitrogen units is 5.555 PNV in 1 ml.
Для анализа были приготовлены следующие разведения антигена в 5% растворе глюкозы 1:5.000, 1:50.000, 1:150.000, 1:300.000. For analysis, the following dilutions of antigen in a 5% glucose solution 1: 5.000, 1: 50.000, 1: 150.000, 1: 300.000 were prepared.
В зависимости от характера хемилюминестентного ответа пациенты были разбиты на группы:
1) с высокой степенью сенсибилизации и яркими клиническими проявлениями аллергического характера,
2) с высокой степенью сенсибилизации и развернутой картиной общесоматического заболевания (иммунные маски),
3) здоровые лица, контактирующие с кормовыми дрожжами,
4) группа доноров из числа лиц 18-25 лет, не имеющих по роду деятельности контакта с дрожжами.Depending on the nature of the chemiluminescent response, the patients were divided into groups:
1) with a high degree of sensitization and vivid clinical manifestations of an allergic nature,
2) with a high degree of sensitization and a detailed picture of somatic disease (immune masks),
3) healthy individuals in contact with feed yeast,
4) a group of donors from among people aged 18-25 who do not have contact with yeast by type of activity.
При анализе графиков интенсивности свечения взвеси активированных фагоцитов обнаружено, что после введения в лейковзвесь сыворотки, инкубированной с аллергеном, интенсивность свечения быстро возрастает, а затем постепенно снижается. Подобная динамика хемилюминесцентного ответа прослеживается во всех случаях введения стимуляторов в клеточную среду. When analyzing the graphs of the luminescence intensity of the suspension of activated phagocytes, it was found that after the introduction of serum incubated with the allergen into the leukemia suspension, the luminescence intensity rapidly increases, and then gradually decreases. A similar dynamics of the chemiluminescent response is observed in all cases of the introduction of stimulants into the cellular environment.
Основной оценочной характеристикой специфичности реакции являются кратность прироста суммарной интенсивности свечения активированных клеток (К), которая определяется отношением уровня максимальной интенсивности хемилюминесцентного ответа гранулоцитов на введение иммунных комплексов (IАГ) к уровню спонтанной хемилюминесценции гранулоцитов в стандартных условиях (IСП)
Кратность прироста различна при использовании разных концентраций антигена для формирования иммунных комплексов. Кривая, отражающая динамику хемилюминесцентного ответа гранулоцитов на концентрацию антигена 1:5.000 обозначается цифрой 1, 1:50.000 - цифрой 2, 1:100.000 - цифрой 3.The main evaluation characteristic of the specificity of the reaction is the multiplicity of the increase in the total luminescence intensity of activated cells (K), which is determined by the ratio of the maximum intensity level of the chemiluminescent response of granulocytes to the introduction of immune complexes (I AH ) to the level of spontaneous chemiluminescence of granulocytes under standard conditions (I SP )
The growth rate is different when using different concentrations of antigen for the formation of immune complexes. The curve reflecting the dynamics of the chemiluminescent response of granulocytes to an antigen concentration of 1: 5.000 is indicated by the
Анализ хемилюминесцентного ответа одного из доноров, не контактирующего с кормовыми дрожжами, продемонстрирован на фиг. 1. Кратность прироста интенсивности свечения клеток при разведении антигена 1:5.000 составила 1,57 раза, при разведении 1:50.000 - 1,23 раза, при разведении 1:1000.000 - 1,19 раза. Максимальный уровень интенсивности свечения наблюдался на 5 мин при концентрации антигена 1:5.000 и на третьей минуте при концентрациях 1:50.000 и 1:100.000, то есть наступал быстрее. An analysis of the chemiluminescent response of one of the donors not in contact with feed yeast is shown in FIG. 1. The multiplicity of the increase in the luminescence intensity of the cells when diluting 1: 5.000 antigen was 1.57 times, when diluting 1: 50.000 - 1.23 times, when diluting 1: 1000.000 - 1.19 times. The maximum level of luminescence intensity was observed for 5 min at an antigen concentration of 1: 5.000 and in the third minute at concentrations of 1: 50.000 and 1: 100.000, i.e., it came faster.
Концентрация антигена, взятого для анализа, и интенсивность свечения взаимосвязаны. Чем меньше разведения антигена, то есть чем выше его концентрация, тем сильнее и продолжительнее во времени реагируют на него клетки. Это может быть объяснено присутствием в инкубированной сыворотке у каждого пациента небольшого количества иммунных комплексов. Их образование связано с взаимодействием антигенных частиц (антигенов) и неспецифических антител, которые существуют в любой сыворотке и вступают в перекрестные реакции с антигеном. При увеличении разведения антигена количество образующихся иммунных комплексов снижается и, следовательно, меньшее количество фагоцитов активируется. Интенсивность хемилюминесцентного ответа уменьшается, максимум свечения достигается быстрее. The concentration of antigen taken for analysis and the intensity of the glow are interconnected. The less dilution of the antigen, that is, the higher its concentration, the stronger and longer in time the cells react to it. This can be explained by the presence of a small amount of immune complexes in each patient's incubated serum. Their formation is associated with the interaction of antigenic particles (antigens) and nonspecific antibodies that exist in any serum and enter into cross-reactions with the antigen. With an increase in antigen dilution, the number of formed immune complexes decreases and, therefore, a smaller number of phagocytes is activated. The intensity of the chemiluminescent response decreases, the maximum luminescence is achieved faster.
Таким образом, характер иммунного ответа говорит об отсутствии специфической сенсибилизации к кормовым дрожжам, а прирост хемилюминесцентного ответа обусловлен активацией фагоцитоза небольшим количеством иммунных комплексов, концентрация которых уменьшается по мере разведения антигена. Thus, the nature of the immune response indicates the absence of specific sensitization to fodder yeast, and the increase in the chemiluminescent response is due to the activation of phagocytosis by a small number of immune complexes, the concentration of which decreases as the antigen is diluted.
У всех обследованных рабочих с яркими клиническими проявлениями аллергии отмечается прирост хемилюминесценции клеток в ответ на введение инкубированной с антигеном сыворотки. Кратность прироста при отдельных разведениях антигена составляет 5-10 раз, причем увеличение, интенсивности свечения связано с уменьшением исходной концентрации антигена, у доноров увеличение интенсивности свечения не превышает 1,5-2,0 раз. All examined workers with vivid clinical manifestations of allergy have an increase in cell chemiluminescence in response to the administration of serum incubated with antigen. The multiplicity of growth in individual dilutions of the antigen is 5-10 times, and the increase in luminescence intensity is associated with a decrease in the initial concentration of antigen, in donors the increase in luminescence intensity does not exceed 1.5-2.0 times.
Анализ хемилюминесцентного ответа гранулоцитов больной с ярко выраженной аллергической симптоматикой показывает (фиг.2), что кратность прироста интенсивности свечения при разведении аллергена 1:50.000 выше, чем при разведении 1: 5.000 и составляет 7,72 и 6,05 раз, соответственно. Это достоверно выше, чем у доноров. Analysis of the chemiluminescent response of granulocytes in a patient with pronounced allergic symptoms shows (Fig. 2) that the multiplicity of the increase in luminescence intensity when diluting allergen 1: 50,000 is higher than when diluting 1: 5.000 and is 7.72 and 6.05 times, respectively. This is significantly higher than that of donors.
Скорость нарастания интенсивности свечения составляет 4-6 мин, что определяет достаточно высокую функциональную активность фагоцитов и косвенно свидетельствует о возможной реализации защитных механизмов при попадании в организм ксенобиотиков. The rate of increase in luminescence intensity is 4-6 minutes, which determines a rather high functional activity of phagocytes and indirectly indicates the possible implementation of protective mechanisms when xenobiotics enter the body.
Заключение: характер иммунного ответа предполагает высокий уровень сенсибилизации к кормовым дрожжам и, следовательно, именно дрожжи могли стать причиной проявления аллергических заболеваний у данной больной. Conclusion: the nature of the immune response suggests a high level of sensitization to fodder yeast and, therefore, it was yeast that could cause allergic diseases in this patient.
Хемилюминесцентный ответ гранулоцитов рабочего, контактирующего породу профессиональной деятельности с низкими концентрациями кормовых дрожжей, не отмечающего жалоб на аллергические проявления, но страдающего хроническими воспалительными заболеваниями желудка, кишечника, анализируется следующим образом (фиг.3). The chemiluminescent response of granulocytes of a worker in contact with a breed of professional activity with low concentrations of fodder yeast that does not notice complaints of allergic manifestations, but suffers from chronic inflammatory diseases of the stomach, intestines, is analyzed as follows (Fig. 3).
Характер иммунного ответа пациента отличается своеобразностью при разведении аллергена 1:5.000, прирост интенсивности хемилюминесценции составляет 1,43 раза (в пределах нормы), но при разведении 1:50.000 наблюдается резкий скачок интенсивности свечения в 6,9 раз. Следовательно, в сыворотке больного присутствуют специфические антитела, но иммунный ответ на данном этапе не реализуется в форме аллергической реакции, хотя такая возможность не исключается при снижении функциональной активности фагоцитов. The nature of the patient’s immune response is peculiar when allergen 1: 5,000 is diluted, the increase in chemiluminescence intensity is 1.43 times (within normal limits), but when diluted 1: 50,000, there is a sharp jump in luminous intensity by 6.9 times. Therefore, specific antibodies are present in the patient’s serum, but the immune response at this stage is not realized in the form of an allergic reaction, although this possibility is not excluded with a decrease in the functional activity of phagocytes.
Заключение: сенсибилизация к кормовым дрожжам средней степени, при снижении резистентности организма возможно развитие аллергических реакций. Conclusion: sensitization to fodder yeast of an average degree, with a decrease in the body's resistance, the development of allergic reactions is possible.
Пример оценки результата представлен третьей группой (фиг.4). Клинически здоровый рабочий, контактирующий на протяжении 12 лет с высокими концентрациями кормовых дрожжей, отвечал закономерным увеличением кратности прироста интенсивности свечения клеток на уменьшение концентрации антигена, при разведении 1:5.000 кратность прироста составила 1,1 раза, при разведении 1: 50.000 - 1,99 раза, при разведении 1:75.000 - 2,9 раза, при разведении 1: 100.000 - 3,1 раза. An example of evaluating the result is presented by the third group (figure 4). A clinically healthy worker who had been in contact for 12 years with high concentrations of fodder yeast responded with a natural increase in the multiplicity of the increase in the intensity of luminescence of cells to a decrease in the concentration of antigen, at a dilution of 1: 5.000, the multiplicity of growth was 1.1 times, at a dilution of 1: 50.000 - 1.99 times, with a dilution of 1: 75.000 - 2.9 times, with a dilution of 1: 100.000 - 3.1 times.
Таким образом, динамика изменения интенсивности свечения говорит о наличии в сыворотке специфических антител к кормовым дрожжам, но в очень низкой степени. Thus, the dynamics of changes in luminous intensity indicates the presence in the serum of specific antibodies to fodder yeast, but to a very low degree.
Заключение: сенсибилизация к кормовым дрожжам в низкой степени, реактивность организма высокая, прогноз благоприятный. Conclusion: sensitization to fodder yeast to a low degree, the reactivity of the body is high, the prognosis is favorable.
Наиболее показательными при оценке сенсибилизации организма являются результирующие кривые на графиках зависимости кратности прироста хемилюминесцентного ответа гранулоцитов от исходной концентрации раствора антигена, используемой при формировании иммунных комплексов (фиг.5, фиг.6). The most indicative when assessing the sensitization of the body are the resulting curves on the graphs of the dependence of the growth rate of the chemiluminescent response of granulocytes on the initial concentration of the antigen solution used in the formation of immune complexes (figure 5, 6).
При наличии сенсибилизации организма кратность прироста хемилюминесцентного ответа гранулоцитов увеличивается по мере снижения концентрации антигена (разведения 1:5,000, 1:50.000, 1:100.000), и кривая идет вверх. In the presence of sensitization of the body, the multiplicity of the increase in the chemiluminescent response of granulocytes increases with decreasing antigen concentration (dilutions of 1: 5,000, 1: 50,000, 1: 100,000), and the curve goes up.
Причем уровень сенсибилизации определяется высотой расположения результирующей кривой, чем выше кривая, тем выраженнее степень сенсибилизации организма к антигену кормовых дрожжей. Moreover, the level of sensitization is determined by the height of the resulting curve, the higher the curve, the more pronounced the degree of sensitization of the body to the feed yeast antigen.
У несенсибилизированных лиц (группа доноров) вход результирующей кривой противоположен, с уменьшением концентрации антигена снижается и уровень хемилюминесцентного ответа гранулоцитов. In non-sensitized individuals (group of donors), the input of the resulting curve is opposite, with a decrease in antigen concentration, the level of the chemiluminescent response of granulocytes also decreases.
Таким образом, предлагаемый способ отличается рядом преимуществ:
1) достигнуто увеличение чувствительности способа в 100 раз по сравнению с прототипом,
2) появилась возможность выявления ранних стадий специфической сенсибилизации организма за счет смены воспринимающего звена хемилюминесцентной реакции, в то время как сенсибилизированные после первой встречи с антигеном клоны мононуклеаров (лимфоциты) находятся в периферической крови в следовых количествах, содержание гранулоцитов, также определяющих специфичность взаимодействия с антигеном, всегда велико,
3) использование различных разведений антигена при формировании иммунных комплексов и анализ хемилюминесцентного ответа гранулоцитов позволяет косвенно судить о концентрации специфических антител в сыворотке, в малых разведениях исходного раствора антигена, при относительном избытке концентрации антигена над антителами образуются мелкодисперсные токсичные для клеток иммунные комплексы, а при недостатке антигена образуются крупнорешетчатые иммунные комплексы, в значительно большей степени активирующие гранулоциты и вызывающие многократное увеличение хемилюминесцентного ответа.Thus, the proposed method has several advantages:
1) achieved an increase in the sensitivity of the method by 100 times compared with the prototype,
2) it became possible to identify the early stages of specific sensitization of the body due to a change in the receiving element of the chemiluminescent reaction, while mononuclear clones (lymphocytes) sensitized after the first encounter with the antigen are in peripheral blood in trace amounts, the content of granulocytes, which also determine the specificity of interaction with the antigen always great
3) the use of various dilutions of the antigen in the formation of immune complexes and the analysis of the chemiluminescent response of granulocytes allows you to indirectly judge the concentration of specific antibodies in serum, in small dilutions of the initial solution of the antigen, with a relative excess of the concentration of antigen above the antibodies, finely dispersed immune complexes toxic to cells are formed, and with a deficiency coarse-grained immune complexes are formed, which activate granulocytes to a much greater extent and cause m ogokratnoe increase of the chemiluminescence response.
4) способ отличается высокой достоверностью результатов за счет исключения ложноположительных реакций ходом результирующей кривой зависимости кратности прироста хемилюминесцентного ответа гранулоцитов от концентрации антигена, у сенсибилизированых лиц при снижении концентрации антигена кратность хемилюминесцентного ответа гранулоцитов увеличивается, а у несенсибилизированных лиц - уменьшается. 4) the method is characterized by high reliability of the results due to the exclusion of false positive reactions by the course of the resulting curve of the increase in the chemiluminescent granulocyte response versus antigen concentration, in sensitized individuals with a decrease in antigen concentration, the multiplicity of the chemiluminescent granulocyte response increases, and in non-sensitized individuals it decreases.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94024336A RU2146049C1 (en) | 1994-06-29 | 1994-06-29 | Method of diagnosing specific allergen sensitization of bodies of workers in hydrolytic-yeast production plants |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94024336A RU2146049C1 (en) | 1994-06-29 | 1994-06-29 | Method of diagnosing specific allergen sensitization of bodies of workers in hydrolytic-yeast production plants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94024336A RU94024336A (en) | 1996-09-27 |
| RU2146049C1 true RU2146049C1 (en) | 2000-02-27 |
Family
ID=20157842
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94024336A RU2146049C1 (en) | 1994-06-29 | 1994-06-29 | Method of diagnosing specific allergen sensitization of bodies of workers in hydrolytic-yeast production plants |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2146049C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2470298C2 (en) * | 2011-04-01 | 2012-12-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека" (ФБУН "Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека") | Method of early (prenosological) diagnostics of development of sensitisation to allergens in air of poultry complex working zone |
-
1994
- 1994-06-29 RU RU94024336A patent/RU2146049C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. Якуба Н.И. и др. Новое применение метода хемилюминесценции для изучения специфического клеточного иммунитета. III Всесоюзное совещание по хемилюминесценции г.Юрмала. - Рига: Латвийский университет, 1990, с.69. 2. Клебанов Г.И. и др. Активация полиморфно-ядерных лейкоцитов крови больных ишемической болезнью сердца и инфарктом миокарда. Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига, 1988, с.132-152. 3. Фрадкин В.А. Диагностика аллергии реакциями нейтрофилов крови. - М.: Медицина, 1985, с.119-132. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2470298C2 (en) * | 2011-04-01 | 2012-12-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека" (ФБУН "Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека") | Method of early (prenosological) diagnostics of development of sensitisation to allergens in air of poultry complex working zone |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU94024336A (en) | 1996-09-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Johansson et al. | In vitro diagnosis of atopic allergy: III. Quantitative estimation of circulating IgE antibodies by the radioallergosorbent test | |
| Brown et al. | Simultaneous determination of total IgE and allergen-specific IgE in serum by the MAST chemiluminescent assay system. | |
| CA2084883C (en) | Method for detecting immune dysfunction in asymptomatic aids patients and for predicting organ transplant rejection | |
| NO159820B (en) | PROCEDURE FOR DETERMINING ANTI-ANTIBODY REACTIONS. | |
| US5480778A (en) | Determination of lymphocyte reactivity to specific antigens in blood | |
| Salazar et al. | Allergen-based diagnostic: Novel and old methodologies with new approaches | |
| EP0070278A1 (en) | A method of diagnosis. | |
| EA031771B1 (en) | Biological microchip for the quantitative determination of immunoglobulins of e and g levels in biological fluids and method of assay using the same | |
| Savory et al. | Kinetics of the IgG—Anti-IgG Reaction, as Evaluated by Conventional and Stopped-Flow Nephelometry | |
| RU2146049C1 (en) | Method of diagnosing specific allergen sensitization of bodies of workers in hydrolytic-yeast production plants | |
| JPH0630633B2 (en) | Method for detecting allergy, reagent and device suitable for the method, and method for measuring drug for allergy and anti-inflammatory agent | |
| CN112098646B (en) | Kit for quantitatively detecting lymphocyte subpopulation and detection method thereof | |
| CN104569390A (en) | Quantitative detection method for gamma-interferon and kit | |
| RU2289138C2 (en) | Method for allergodiagnostics by the values of chemiluminescent phosphorescence of neutrophils | |
| RU2523418C1 (en) | Method of assessment of disorder of cellular immunity in exposed to phenol | |
| RU2206092C2 (en) | Method for in vitro detecting intolerance to nutrient antigen | |
| Sirchia et al. | Red cell acetylcholinesterase activity in autoimmune haemolytic anaemias | |
| Aceti et al. | The serological diagnosis of human hydatid disease by time-resolved fluoroimmunoassay | |
| RU2115118C1 (en) | Method of assay of iron prelatent deficiency in children | |
| Richardson et al. | Antibody to Aspergillus fumigatus antigens in normal sera: influence on positive-negative discrimination in ELISA | |
| RU2470298C2 (en) | Method of early (prenosological) diagnostics of development of sensitisation to allergens in air of poultry complex working zone | |
| Bloch et al. | Use and interpretation of diagnostic immunologic laboratory tests | |
| JPH08193999A (en) | Immune measuring method | |
| SU1691751A1 (en) | Method for diagnosis of allergy | |
| RU2079137C1 (en) | Method of diagnosis of fast type allergy |