RO121280B1 - Toxine proteice insecticide din photorhabdus - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la o metodă de control al unui dăunător insectă, prin hrănirea acestuia cu o proteină recombinată, obţinută din bacteria Photorhabdus cu activitate toxică, care codifică ni?te secvenţe de aminoacizi selectaţi dintre SEQ ID Nr.12 sau SEQ ID Nr. 47, ce se regăse?te într-o celulă de plantă transgenică ?i, respectiv, o plantă transgenică accesibilă dăunătorului-insectă.

Description

Prezenta invenție se referă la o polinucleotidă care este asociată operațional cu un promotor heterolog, la o celulă de plantă transgenică ce cuprinde polinucleotidă menționată, la o proteină recombinantă care are activitate de toxină împotriva unui dăunător insectă, la o metodă de control al unui dăunător insectă.

Numeroase insecte sunt considerate, în mare măsură, ca dăunătoare pentru deținătorii de locuințe, pentru cei care organizează sau participă la picnicuri, pentru grădinari, pentru fermieri și pentru alții ale căror investiții în agricultură sunt adesea distruse sau diminuate ca urmare a distrugerii de către insecte a recoltelor, în special în zonele unde sezonul de creștere este scurt, pagubele semnificative produse de insecte pot să însemne pierderea tuturor profiturilor pentru crescători și o scădere dramatică a recoltei.

împuținarea furnizării de produse agricole particulare are ca urmare, invariabil, costuri mai ridicate pentru prelucrătorii de alimente și apoi, în final, pentru consumatorii de plante alimentare și de produse derivate de la aceste plante.

Prevenirea distrugerii plantelor de cultură și florilor și eliminarea neplăcerii insectelor dăunătoare s-au bazat de obicei pe pesticide și insecticide organice puternice, cu toxicități largi. Aceste produse sintetice au devenit ținta atacului general al populației, ca fiind prea supărătoare pentru mediu și pentru cei expuși la astfel de agenți. Similar, în așezările neagricole, proprietarii de locuințe ar fi satisfăcuți să evite insectele în locuințele lor, atunci când iau masa afară, fără să fie nevoie să omoare insectele.

Utilizarea extinsă a insecticidelor chimice a dat naștere la preocupări privind sănătatea mediului pentru fermieri, companii care produc insecticidele, agenții guvernamentale, grupuri de interes public și pentru public, în general. Dezvoltarea de strategii de dirijare a pesticidelor mai puțin intruzive a fost impulsionată atât de preocuparea societății pentru mediu, cât și de dezvoltarea instrumentelor biologice care exploatează mecanismele dirijării insectelor. Agenții de combatere biologică reprezintă o promisiune alternativă pentru insecticidele chimice. La fiecare nivel de dezvoltare evolutivă, organismele sunt prevăzute cu mijloacele pentru sporirea succesului și supraviețuirii lor. Folosirea moleculelor biologice, ca instrumente de apărare și agresiune, este cunoscută în regnurile animal și vegetal. Suplimentar, instrumentele relativ noi ale ingineriei genetice permit modificări ale insecticidelor biologice pentru realizarea de soluții particulare pentru probleme particulare.

Un astfel de agent, Bacillus thuringiensis (Bt), este un agent insecticid eficient și este folosit comercial ca atare pe scară largă. De fapt, agentul insecticid al bacteriei Bt este o proteină care, având toxicitate limitată, se poate folosi pe culturile alimentare în ziua recoltării. Pentru organismele care nu sunt avute în vedere, toxina Bt este o proteină digestibilă netoxică.

Altă clasă cunoscută de agenți de combatere biologică a insectelor sunt anumite genuri de nematode cunoscute ca vectori de transmitere pentru simbionții bacterieni care omoară insecte. Nematodele care conțin bacterii insecticide invadează larvele de insecte. Apoi, bacteriile omoară larvele. Nematodele se reproduc în cadavrul larvar. Urmașii nematodei mănâncă apoi cadavrul din interior. Urmașii nematodei, conținând bacterii astfel produse, pot apoi să invadeze larve suplimentare.

în trecut, s-au folosit ca agenți de combatere a insectelor nematode, insecticide din genurile Steinernema și Heterorhabdis. Aparent, fiecare gen de nematode adăpostește o specie anume de bacterie. în nematodele genului Heterorhabditis, bacteria simbiotică este Photorhabdus luminescens.

Cu toate că aceste nematode sunt agenți eficienți de combatere a insectelor, în prezent, este dificil, scump și ineficient să se producă, mențină și să se distribuie nematode pentru combaterea insectelor.

RO 121280 Β1

Se cunoaște din domeniu că se poate izola o toxină insecticidă din Photorhabdus 1 luminescens care are activitate numai când se injectează în larvele insectelor Lepidoptere și Coleoptere (Bowen, D.J. și colaboratorii, Extracellular insecticidal factor produced by 3 Xenorhabdus luminiscens, abstract de la 89^,h. Annual meeting of the American Society for Microbiology (ASM) 1989, Ensign, J.C. și colaboratorii, Crystalline inclusion proteins as an 5 insecticidal toxin of Xenorhabdus luminiscens NC-19, abstract de la V¹ Internațional Colloquium on Intervertebrate Pathology and Microbial Control (ICIPMC), August 1990). 7

Aceasta face imposibilă exploatarea efectivă a proprietăților insecticide ale nematodelor sau simbiontului lor bacterian. Ar fi utilă, mai practică și mai puțin consumatoare de muncă o 9 metodă de eliberare pe o arie extinsă a unei toxine insecticide care ar păstra proprietățile sale insecticide după eliberare. Ar fi în mod clar de dorit să se descopere toxine cu activitate 11 orală produsă de către genul Photorhabdus. Izolarea și folosirea acestor toxine sunt dorite datorită motivelor de eficacitate. Până la descoperirile solicitanților, aceste toxine nu au fost 13 izolate sau caracterizate.

Toxinele native sunt proteine complexe care sunt produse și secretate de celulele 15 bacteriene în creștere ale genului Photorhabdus. De interes sunt proteinele produse de specia Photorhabdus luminescens. Complexele proteice, cu o mărime moleculară de aproxi- 17 mativ 1 000 kDa, potfi separate prin analiză pe gel SDS-PAGE, în numeroase componente proteice. Toxinele nu conțin activități hemolizină, lipază, fosfolipază de tip C sau nuclează. 19 Toxinele prezintă toxicitate semnificativă la administrare prin expunere, pentru numeroase insecte. 21

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția este găsirea unei polinucleotide care să conțină informația genetică necesară pentru sinteza unei proteine cu efect toxic asupra unor 23 insecte, care să fie administrată cu ușurință, care să păstreze proprietățile sale insecticide după eliberare și în special toxine cu activitate orală, produse de către genul Photorhabdus: 25

- stabilizarea modificărilor genei care codifică toxina sau a proteinei codificată de genă; 27

- a toxinelor care să inhibe inițial hrănirea larvelor, să mențină activitatea de inhibare a hrănirii, eliminând în același timp activitatea toxicității absolute asupra larvei, schimbare 29 care ar putea permite plantei transformate să supraviețuiască până la recoltare, precum și

- dirijarea toxinei spre anumite părți ale larvei insectei, pentru îmbunătățirea eficienței 31 acesteia.

într-un prim aspect, invenția se referă la o polinucleotidă care este asociată operabil 33 cu un promotor heterolog, în care respectiva polinucleotidă codifică o proteină care are activitate de toxină împotriva unui dăunător insectă, în care respectiva proteină cuprinde secvența 35 de aminoacizi aleasă dintre SEQ ID NR:12 sau SEQ ID NR:47.

într-un al doilea aspect, invenția se referă la o celulă de plantă transgenică ce cuprin- 37 de polinucleotidă menționată și exprimă polinucleotidă menționată.

într-un al treilea aspect, invenția se referă la o proteină recombinantă care are acti- 39 vitate de toxină împotriva unui dăunător insectă, în care proteina menționată cuprinde secvența de aminoacizi aleasă dintre SEQ ID NR:12, SEQ ID NR:47. 41 într-un al patrulea aspect, invenția se referă la o metodă de control al unui dăunător insectă, în care metoda cuprinde hrănirea cu o proteină care cuprinde secvența de amino- 43 acizi aleasă dintre SEQ ID NR:12, SEQ ID NR:47, proteina menționată fiind produsă de și fiind prezentă într-o plantă transgenică, care este accesibilă dăunătorului menționat. 45

Metoda de control al dăunătorului insectă cuprinde alimentarea dăunătorului menționat cu o proteină din Photorhabdus, în care proteina menționată are activitate de toxină (pe 47 cale) orală și în care proteina menționată este produsă de și este prezentă într-o plantă transgenică ce este accesibilă dăunătorului menționat. 49

RO 121280 Β1

Prezenta invenție este dirijată spre stabilirea unei clase unice de toxine proteice insecticide din genul Photorhabdus care au toxicitate orală împotriva insectelor. O trăsătură unică a Photorhabdus este bioluminescența sa. Photorhabdus se poate izola dintr-o diversitate de surse. O astfel de sursă o reprezintă nematodele, mai precis nematodele genului Heterohabditis. Altă asemenea sursă o reprezintă probele clinice de la plăgi umane, vezi Farmerși colaboratorii, 1989, J. Clin. Microbiol, pag. 1594-1600. Aceste tulpini saprofite sunt depozitate la Colecția Americană de Tipuri de Culturi (Rockville, MD) ATCC #s 43948, 43949, 43950, 43951 și 43952 și sunt încorporate aici prin referire. Este posibil ca și alte surse să poată adăposti bacterii Photorhabdus care produc toxine insecticide. Astfel de surse din mediu ar putea fi atât din mediu terestru, cât și din mediul acvatic.

Genul Photorhabdus este definit taxonomic ca un membru al familiei Enterobacteriaceae, deși are unele trăsături atipice acestei familii. De exemplu, tulpinile acestui gen nu sunt reducătoare de azotat, produc pigment galben și roșu și sunt bioluminescente. Această ultimă trăsătură este necunoscută la Enterobacteriaceae, numai de curând Photorhabdus a fost descris ca un gen separat de Xenorhabdus (Boemare și colaboratorii, 1993, Int. J. Syst. Bacteriol. 43.249-255). Această diferențiere se bazează pe studii de hibridizare ADN-ADN, diferențe fenotipice (de exemplu, prezența (Photorhabdus) sau absența (Xenorhabdus) a catalazei și bioluminescenței) și familia de nematode gazdă (Xenorhabdus: Steinemematide, Photorhabdus; Heterorhabdidae). Comparativ, analizele de acid gras celular (Janse și colaboratorii, 1990, Lett. Appl. Microbiol 10.131-135; Suzuki și colaboratorii,1990, J. Gen. Appl. Microbiol., 36. 393-401) stau la baza separării Photorhabdus de Xenorhabdus.

în vederea stabilirii dacă colecția tulpinii dezvăluită aici a cuprins tulpini Photorhabdus, tulpinile s-au caracterizat pe baza trăsăturilor care definesc Photorhabdus și îl diferențiază de alte Enterobacteriaceae și specii Xenorhabdus. (Farmer. 1984 Bergey's Manual of Systemic Bacteriology, voi. 1, p. 510-511: Akhurst și Boemare, 1988, J. Gen. Microbiol. 134, p. 1835-1845; Boemare și colaboratorii, 1993, Int. J. Syst. Bacteriol. 43, p. 249-255, care sunt încorporate aici prin referire). Trăsăturile studiate au fost următoarele: ramurile colorate gram negativ, mărimea organismului, pigmentația coloniei, corpi de incluziune, prezența catalazei, capacitatea de a reduce azotatul, bioluminescența, absorbția de colorant, hidroliza gelatină, creștere pe medii selective, temperatura de creștere, supraviețuirea în condiții anaerobe și mobilitatea. Analiza de acid gras s-a folosit pentru a confirma că toate tulpinile de aici aparțin la un singur gen Photorhabdus.

Curent, genul bacterian Photorhabdus cuprinde o singură specie definită, Photorhabdus luminescens (ATCC tulpina #29999, Poinar și colaboratorii, 1977, Nematologica 23, 97-102). în literatură, a fost descrisă o diversitate de tulpini înrudite (de exemplu, Akhurst și colaboratorii, 1988, J. Gen. Microbiol., 134,1835-1845; Boemare și colaboratorii, 1993, Int. J. Syst. Bacteriol. 43, p. 249-255; Putz și colaboratorii, 1990, Appl. environ. Microbiol., 56,181-186). Aici au fost caracterizate numeroase tulpini Photorhabdus. Asemenea tulpini sunt listate în tabelul 18 din exemple. Deoarece există curent numai o specie (luminescens) definită în genul Photorhabdus, trăsăturile speciei luminescens s-au folosit aici pentru caracterizarea tulpinilor. Așa cum se poate observa din fig. 5, aceste tulpini sunt în mod clar diverse. Nu se prevede că, în viitor, vor fi alte specii Photorhabdus care să aibă unele din atributele speciei luminescens, precum și unele caracteristici diferite care, în prezent, nu s-au definit ca o trăsătură a Photorabdus luminescens. Cu toate acestea, invenția de față se referă la orice specie sau tulpini Photorhabdus care produc proteine cu activitatea funcțională de agenți de combatere a insectelor, fără a se lua în considerare alte trăsături și caracteristici.

RO 121280 Β1

Mai mult, așa cum s-a demonstrat aici, bacteriile genului Photorhabdus produc pro- 1 teine care au activitate funcțională, așa cum s-a definit aici. De interes deosebit sunt proteinele produse de către specia Photorhabdus luminescens. Invențiile de aici nu vor fi în nici 3 un mod limitate la tulpinile care sunt descrise aici. Aceste tulpini ilustrează, pentru prima dată, că proteinele produse de către diverse specii izolate ale Photorabdus sunt toxice pentru 5 insecte la expunerea lor la acestea. Astfel, în invențiile descrise aici sunt incluse tulpinile specificate aici și toți mutanții acestora, precum și orice tulpini sau specii ale genului 7 Photorhabdus care au activitatea funcțională descrisă aici.

Există câțiva termeni folosiți care au o însemnătate particulară, după cum vom vedea 9 în cele ce urmează.

Prin activitate funcțională se înțelege aici că funcția toxinelor proteice, ca agenți de 11 combatere a insectelor, constă în aceea că proteinele sunt active oral sau au un efect toxic, sau sunt capabile să distrugă sau să deterioreze hrănirea, care poate cauza sau nu moartea 13 insectei. Când o insectă vine în contact cu o cantitate eficientă de toxină eliberată prin intermediul expresiei de către o plantă, cu o compoziție(i) formulată de proteină, compoziție(i) 15 pulverizate de proteină, o matrice momeală sau alt sistem de eliberare, urmările constă, de obicei, în moartea insectei sau insectele nu se hrănesc din sursa care face toxinele accesi- 17 bile pentru insecte. Toxinele proteice discutate aici sunt denumite tipic ca insecticide. Prin insecticide se înțelege că toxinele proteice au o activitate funcțională așa cum s-a definit 19 suplimentar aici și sunt folosite ca agenți de combatere a insectelor.

Prin folosirea termenului oligonucleotide se înțelege aici o macromoleculă care 21 constă dintr-o catenă scurtă de nucleotide fie de ADN, fie de ARN. Asemenea lungime ar putea fi de cel puțin o nucleotidă, dar de obicei este în domeniul de circa 10 la circa 12 23 nucleotide. Determinarea lungimii oligonucleotidei cade în sarcina unui lucrător și nu va fi o limitare aici. Prin urmare, oligonucleotidele pot fi mai mici decât 10 sau mai mari decât 12. 25

Prin folosirea termenului toxic sau toxicitate, așa cum s-a folosit aici, se înțelege că toxinele produse de către Photorhabdus au activitate funcțională, așa cum s-a definit 27 aici. Prin folosirea termenului material genetic se face referire la toate genele, acid nucleic, ADN și ARN. 29

Bulioanele de fermentare de la tulpinile selectate aici, raportate în tabelul 18, s-au folosit pentru a determina următoarele: mărimea producției toxinei insecticide de către genul 31 Photorhabdus, spectrul insecticid al acestor toxine și să asigure sursa materială pentru purificarea complexelor de toxină. Tulpinile caracterizate aici s-au dovedit a avea toxicitate 33 orală împotriva unei diversități de ordine de insecte. Astfel de ordine de insecte includ, dar nu sunt limitate la Coleoptera, Homoptera, Lepidoptere, Diptera, Acarina, Hymenoptera și 35 Dictyoptera.

La fel cu alte toxine bacteriene, rata de mutație a bacteriilor dintr-o populație produce 37 numeroase toxine înrudite, ușor diferite în secvență ca să existe. Toxinele de interes aici sunt cele care produc complexe proteice toxice pentru o diversitate de insecte la expunere, așa 39 cum s-a descris aici. De preferință, toxinele sunt active împotriva Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Diptera, Hymenoptera, Dictyoptera și Acarina. Prin invențiile din domeniu se 41 încearcă să se facă referire la toxinele proteice omoloage toxinelor proteice produse de tulpinile de aici și orice derivat al acestor tulpini, precum și toxine proteice produse de către 43 Photorhabdus. Aceste proteine omoloage pot să difere ca secvență, dar nu diferă în funcție de acele toxine descrise aici. Toxinele omoloage sunt înțelese ca incluzând complexe de 45 proteine între 300 kDa până la 2 000 kDa și cuprind cel puțin 2 subunități, unde o subunitate este o peptidă care poate sau nu poate să fie aceeași ca cealaltă subunitate. S-au identificat 47 diverse subunități proteice și s-au luat în considerare în exemplele de aici. De obicei, subunitățile proteice sunt între circa 18 kDa la circa 230 kDa; între circa 160 kDa la circa 230 kDa, 49

100 kDa la 160 kDa; circa 80 kDa la circa 100 kDa și circa 50 kDa la circa 80 kDa.

RO 121280 Β1

Prin folosirea termenului toxină Photorhabdus se înțelege orice proteină produsă de o tulpină a microorganismului Photorhabdus care are activitate funcțională împotriva insectelor, unde toxina Photorhabdus s-ar putea formula ca o compoziție pulverizabilă, exprimată printr-o plantă transgenică, formulată ca o momeală matrice, eliberată prin intermediul unui Baculovirus sau eliberată de către orice altă gazdă aplicabilă sau sistem de eliberare.

Așa cum s-a discutat mai sus, unele tulpini Photorhabdus pot fi izolate de la nematode. Unele nematode, viermi cilindrici alungiți, paraziți ai filumului Nematoda, au dezvoltat o capacitate de a exploata larve de insecte, ca un mediu favorabil de creștere. Larvele de insecte asigură o sursă de hrană pentru creșterea nematodelor și un mediu în care se reproduc. Un efect dramatic care urmează invadării larvelor de către anumite nematode este moartea larvară. Moartea larvară rezultă din prezența, în anumite nematode, a bacteriilor care produc o toxină insecticidă care oprește creșterea larvară și inhibă activitatea de hrănire. Interesant e faptul că fiecare gen de nematodă, care parazitează o insectă, găzduiește o specie anume de bacterie, adaptată unic pentru creștere simbiotică cu acea nematodă. Provizoriu, deoarece această cercetare a început, numele genului bacterian Xenorabdus s-a reclasificat în Xenorhabdus și Photorhabdus. Bacteriile genului Photorhabdus sunt caracterizate ca fiind simbionți ai nematodelor Heterorhabdtus, în timp ce speciile Xenorhabdus sunt simbionți ai speciei Steinemema. Această schimbare în nomenclatură se reflectă în această descriere, dar, în nici un mod, o schimbare în nomenclatură nu va modifica întinderea invențiilor descrise aici.

Peptidele și genele care sunt descrise aici sunt numite conform ghidurilor publicate recent în Journal of Bacteriology Instructions to Authors, p. l-xii (Jan. 1996), care este încorporată aici, prin referire. Următoarele peptide și gene s-au izolat din Photorhabdus tulpina W-14.

Nomenclatură peptidă/genă Complex toxină (Tc)

Nume peptidă	Nume genă	Secvență ID# brevet
regiune genomică tea
Tea A	tcaA	12
TcaAiH	tcaA	4
TcaBj	tcaB	3(19, 20)
TcaBi,·	tcaB	5
TcaC	tcaC	2
regiune genomică tcb
TcbA	tcbA	16
TcbAj	tcbA	(pro-peptidă)
TcbAjj	tcbA	1 (21,22,23, 24)
TcbABj	tcbA	40

RO 121280 Β1

Tabel (continuare) 1

Nume peptidă	Nume genă	Secvență ID# brevet
regiune genomică tcc
Tcc A	tccA	8
TccB	tccB	7
regiune genomică tcd
TcdAi	tcdA	(pro-peptidă)
TcdA,,	tcdA	13, (38, 39, 17, 18)
TcdAjjj	tcdA	41,(42, 43)
TcdB	tcdB	14

(Secvența din paranteză arată secvența aminoacidă internă, obținută prin digeste triptice).

(Secvența din paranteză arată secvența aminoacidă internă, obținută prin digeste triptice).

Secvențele listate mai sus sunt grupate prin regiunea genomică. Gena tcbAs-a exprimat în E. coli, ca două fragmente de proteină TcbAși TcbA^ așa cum s-a ilustrat în exemple. 15 Poate fi benefic să existe o scurtare proteolitică a unor secvențe, pentru a obține activitate mai mare a toxinelor pentru aplicații transgenice comerciale. 17

Toxinele descrise aici sunt în mod clar unice, prin aceea că toxinele au activitate funcțională care este cheia dezvoltării unei strategii de combatere a insectelor. în dezvoltarea 19 unei strategii pentru combaterea insectelor este posibil să se întârzie sau să se ocolească procesul degradării proteinei prin injectarea unei proteine direct într-un organism, evitând 21 tractul său digestiv. în astfel de cazuri, proteina administrată organismului va reține funcția sa, până când ea este denaturată, degradată nespecific sau eliminată de către sistemul imun 23 din organismele superioare.

Injectarea în insecte a unei toxine insecticide are aplicare potențială numai în labo- 25 rator și numai pe insecte mari care sunt injectate cu ușurință. Observația că toxinele proteice insecticide descrise aici prezintă activitate toxică, după ingestie orală sau contact cu toxinele, 27 permite dezvoltarea unui plan de control al insectelor, bazat numai pe capacitatea de a încorpora toxinele proteice în hrana insectei. Un astfel de plan ar putea avea ca rezultat produce- 29 rea de momeli pentru insecte.

Toxinele Photorahbdus se pot administra la insecte într-o formă purificată. De ase- 31 menea, toxinele pot fi eliberate în cantități de la circa 1 la circa 100 mg/l de mediu. Aceasta poate varia în funcție de condiția formulării, condițiile sursei inoculului, tehnicile pentru izo- 33 larea toxinei și altele. Toxinele se pot administra ca o secreție exudată sau proteină celulară, exprimată inițial într-o gazdă heteroloagă procariotă sau eucariotă. De obicei, bacteriile sunt 35 gazdele în care sunt exprimate proteine. Gazdele eucariote pot include, dar nu se limitează la plante, insecte și drojdie. Alternativ, toxinele pot fi produse în bacterii sau plante transge- 37 nice, în câmp sau în insectă, printr-un vector baculovirus. Tipic, toxinele vor fi introduse în insectă, prin încorporarea uneia sau mai multor toxine în hrana insectelor. 39

Letalitatea completă la hrănirea insectelor este utilă, dar nu este necesară pentru atingerea toxicității utile. Dacă insectele evită toxina sau încetează hrănirea, această evitare 41 va fi utilă în unele aplicații, chiar dacă efectele sunt subletale. De exemplu, dacă sunt dorite plante de cultură transgenice, rezistente la insecte, o neplăcere a insectelor să se hrănească 43 pe plante este la fel de utilă ca și toxicitatea letală, deoarece obiectivul final este mai degrabă protecția plantelor, și nu omorârea insectei. 45

RO 121280 Β1

Există numeroase alte căi în care toxinele pot fi încorporate în hrana unei insecte. Ca un exemplu, este posibil să se amestece sursa de hrană a larvei cu proteina toxică, prin stropirea hranei cu o soluție de proteină, cum s-a descris aici. Alternativ, proteina purificată ar putea fi prelucrată prin inginerie genetică într-o bacterie mai puțin dăunătoare, care apoi ar putea fi crescută în cultură și aplicată fie la sursa de hrană, fie s-ar lăsa să stea în sol, într-o zonă în care a fost dorită eradicarea insectei. De asemenea, proteina s-ar putea prelucra prin inginerie genetică într-o sursă de hrană pentru insectă. De exemplu, sursa principală de hrană pentru numeroase larve de insecte o reprezintă materialul vegetal.

Prin încorporarea materialului genetic care codifică proprietățile insecticide ale toxinelor Photorhabdus în genomul unei plante consumate de insecta dăunătoare particulară, adultul sau larva vor muri după consumarea ca hrană a plantei. Numeroși membri ai genurilor de monocotiledonate și dicotiledonate au fost transformați. Plante agricole transgenice, precum și fructe și legume sunt de interes comercial. Asemenea plante cultivate includ dar nu se limitează la porumb, orez, soia, rapiță, floarea-soarelui, lucernă, sorg, grâu, bumbac, arahide, tomate, cartof și altele. Există câteva tehnici pentru introducerea materialului genetic străin în celulele plantelor și pentru obținerea plantelor care mențin stabilă și exprimă gena introdusă. Astfel de tehnici includ accelerarea materialului genetic acoperit în microparticule direct în celule (brevete SUA 4 954 050 pentru Corneli și 5 141 131 pentru DowElanco). Plantele pot fi transformate folosind tehnologia Agrobacterium, vezi brevet SUA 5 177 010 pentru University of Toledo, 5 104 310 pentru Texas A&M, cererea de brevet european 0131624B1, cererile de brevet european 120516,159418B1 și 176 112 pentru Schilperoot, brevete SUA 5 149 645, 5 469 976, 5 464 763 și 4 940 838 și 4 693 976 pentru Scilperoot, cererile de brevet european 116718, 290799, 320500 toate pentru MaxPlanck, cererile de brevet european 604662 și 627752 pentru Japan Tobacco, cererile de brevet european 0267159 și 0292435 și brevetul SUA pentru Ciba Geigy, brevetele SUA 5 463 174 și 4 762 785, ambele pentru Calgene, și brevetele SUA 5 004 863 și 5 159 135 ambele pentru Agracetus. Altă transformare include tehnologia contactelor punctiforme, vezi brevetele SUA 5 302 523 și 5 464 765 ambele pentru Zeneca. Tehnologia electroporării a fost de asemenea folosită pentru transformarea plantelor, vezi WO 87/06614 pentru Boyce Thomson Institute, 5 472 869 și 5 384 253 ambele pentru Dekalb, WO 92/09696 și WO 93/21335 ambele pentru PGS. Toate aceste brevete și publicații asupra transformării sunt încorporate aici, prin referire. Suplimentar, la numeroasele tehnologii pentru transformarea plantelor, tipul țesutului care se contactează cu genele străine poate varia la fel de bine. Astfel de țesut va include, dar nu va fi limitat la țesut embriogenic, țesut calus de tip I și II, hipocotil, meristem și altele. Aproape toate țesuturile plantelor pot fi transformate în timpul diferențierii, folosind tehnici corespunzătoare cuprinse în pregătirea lucrătorului în domeniu.

Altă variabilă este alegerea unui markerselectabil. Preferința pentru un marker particular este la discreția specialistului, dar oricare dintre următorii markeri selectabili se pot folosi împreună cu oricare altă genă nemenționată aici, care ar putea să funcționeze ca un marker selectabil. Astfel de markeri selectabili includ dar nu se limitează la gena aminoglicozid fosfotransferază a transpozonuiui Tn5 (Aph II), care codifică rezistența la antibioticele kanamicină, neomicină și G418, precum și acele gene care codifică pentru rezistență sau toleranță la glifozat, higromicină, metotrexat, fosfinotricină (bialofos), imidazolinone, sulfoniluree și erbicide triazolopirimidină, cum ar fi clorosulfuron, bromoxinil, dalapon și altele.

în plus față de un marker selectabil, poate fi dorită folosirea unei gene reporter. în unele situații o genă reporter poate fi folosită fără un marker selectabil. Genele reporter sunt gene care de obicei nu sunt prezente sau exprimate în organismul sau țesutul receptor. în

RO 121280 Β1 mod obișnuit, gena reporter codifică pentru o proteină care asigură o schimbare fenotipică 1 sau proprietate enzimatică. Exemple de astfel de gene sunt date în K. Weising și colaboratorii, Ann. Rev. Genetics. 22, 421 (1988), care este încorporată aici prin referire. O genă 3 reporter preferată este gena glucuronidază (GUS). Indiferent de tehnica de transformare, gena este încorporată de preferință într-un vector de transfer genă, adaptat pentru a exprima 5 toxinele Photorhabdus în celula plantei prin includerea în vector a unui promotor de plantă. Suplimentar față de promotorii de plantă, se pot folosi eficient, în celule de plantă, promotori 7 dintr-o diversitate de surse pentru exprimarea genelor străine. De exemplu, pot fi folosiți promotori de origine bacteriană, cum ar fi promotorul octopin sintază, promotorul nopalin 9 sintază, promotorul mannopin sintază, promotori de origine virală, cum ar fi virusul mozaicul conopidei (35S și 19S) și alții. Promotorii de plantă includ, dar nu sunt limitați la 11 ribuloz-1,6-bifosfat (RUBP) carboxilază subunitatea mică (ssu), promotorul beta-conglicinină, promotorul fazeolină, promotorul ADH, promotorii șocului termic și promotori specifici țesu- 13 tului. De asemenea, promotorii pot să conțină elemente de secvență intensificatoare care poate îmbunătăți eficiența transcripției. Intensificatori tipici includ dar nu se limitează la 15 Adh-intron 1 și Adh-intron 6. Se pot folosi și promotori constitutivi. Promotorii constitutivi dirijează continuu expresia genei în toate tipurile de celule și la toate momentele (de exemplu, 17 actina, ubiquitina, CaMV 35S). Promotorii specifici țesutului sunt responsabili pentru expresia genei în tipuri specifice de celulă sau țesut, cum arfi frunze sau semințe (de exemplu, zeină, 19 oleozină, napină, ACP) și acești promotori se pot, de asemenea, folosi. De asemenea, promotorii pot să fie activi în timpul unui anumit stadiu al dezvoltării plantelor, precum și activi 21 în țesuturi și organe de plantă. Exemple de astfel de promotori includ dar nu se limitează la specific polenului, specific embrionului, specific mătasei porumbului, specific fibrei de bum- 23 bac, specific rădăcinii, promotori specifici endospermului seminței și alții.

în anumite circumstanțe, poate fi de dorit să se folosească un promotor inductiv. Un 25 promotor inductiv este responsabil pentru expresia genelor ca răspuns la un semnal specific, cum arfi: stimul fizic (gene șoc termic), lumină (carboxilază RUBP), hormon (Em), metaboliți 27 și stres. Se pot folosi alte elemente dorite de transcripție și translație, care funcționează în plante. în domeniu sunt cunoscuți numeroși vectori de transfer genă specifici plantelor. 29 în plus, se știe că pentru a obține expresia ridicată a genelor bacteriene în plante este de preferat să se refacă prin inginerie genele bacteriene, astfel încât acestea sunt mai efici- 31 ent exprimate în citoplasmă plantelor. Porumbul este o astfel de plantă la care se preferă să se refacă prin inginerie gena(le) bacteriene, înainte de transformare pentru creșterea nivelu- 33 lui expresiei toxinei în plantă. Un motiv pentru refacere prin inginerie este conținutul G+C foarte scăzut al genei(lor) bacteriene native (și în consecință corectarea față de conținutul 35 ridicat A+T). Aceasta are ca urmare generarea secvențelor care imită sau duplică secvențele de control ale genei plantei, care sunt cunoscute a fi puternic bogate A+T. Prezența unor 37 secvențe bogate A+T în ADN-ul genei(lor) introduse în plante (de exemplu, regiuni box TATA găsite în mod normal în promotorii genei) poate avea ca urmare transcripția aberantă a 39 genei(lor). Pe de altă parte, prezența altor secvențe regulatoare care aparțin mARN-ului transcris (de exemplu, secvențe semnal poliadenilare (AAUAAA), sau secvențe complemen- 41 tare la ARN-uri nucleare mici implicate în sphicing pre-mARN) poate duce la instabilitatea ARN-ului. Prin urmare, un scop în modelarea genei(lor) bacteriene prin inginerie, mai prefe- 43 rat cunoscute ca genă(e) de plantă optimizată, este să se genereze o secvență ADN care are un conținut de G+C mai ridicat și de preferință unul apropiat de cel al genelor plantei care 45 codifică pentru enzime metabolice. Alt scop în modelarea genei(lor) optimizate de plantă este generarea unei secvențe ADN care nu numai că are un conținut mai ridicat G+C, dar schim- 47 bările care modifică secvența vor fi astfel făcute încât să nu împiedice translația.

RO 121280 Β1

Un exemplu de o plantă care are un conținut ridicat G+C este porumbul. Tabelul de mai jos ilustrează cât de ridicat este conținutul G+C în porumb. La fel ca la porumb, se crede că și în alte plante conținutul G+C este de asemenea ridicat.

Tabelul 1

Alcătuirea conținuturilor G+C ale regiunilor genelor de la porumb care codifică proteină

Clasa proteinei3	Domeniul G+C%	Medie G+C%b
Enzime metabolice (40)	44,4 - 75,3	59,8 (8,0)
Proteine de depozitare
Grup I (23)	46,0-51,9	48,1 (1,3)
Grup II (13)	60,4-74,3	67,5 (3,2)
Grup I + II (36)	46,0-74,3	55,1 (9,6)c
Proteine structurale (18)	48,6-70,5	63,6 (6,7)
Proteine regulatoare (5)	57,2-68,9	62,0 (4,9)
Proteine necaracterizate (9)	41,5-70,3	64,3 (7,2)
Toate proteinele (108)	44,4-75,3	60,8 (5,2)

Numărul genelor din clasă este dat în paranteze.

Deviațiile standard sunt date în paranteze.

Medie grupuri combinate, ignorată în calculul mediei totale.

Pentru datele din tabelul 1, regiunile de codificare ale genelor s-au extras din iritările GenBank (Release 71), iar compozițiile de baze s-au calculat folosind programul MacVector^1M(IBI. New Haven, CT). Secvențele intron s-au ignorat în calcule. Grupul I și II al secvențelor genei proteinei de depozitare s-au remarcat prin diferența lor marcată în compoziția de baze.

Datorită plasticității permise de redundanța codului genetic (adică, unii aminoacizi sunt specificați prin mai mult decât un codon), evoluția genoamelor diferitelor organisme sau clase de organisme a avut drept rezultat folosirea diferențială a codonilor redundanți. Acest codon bias se reflectă în media compoziției de bază a regiunilor care codifică proteină. De exemplu, organisme având conținuturi relativ scăzute G+C utilizează codoni care au A sau T în poziția a treia a codonilor redundanți, în timp ce acelea care au conținuturi G+C utilizează codoni care au G sau C în a treia poziție. Se consideră că prezența codonilor minori într-o genă a mARN poate să reducă rata absolută de translație a acelui mARN, în special când abundența relativă a tARN-ului încărcat, care corespunde la codonul minor, este scăzută. O extindere a acesteia este că diminuarea ratei de translație de către codoni minori individuali va fi cel puțin cumulativă pentru codoni minori multipli. Ca urmare, mARN-uri care au conținuturi relativ ridicate de codoni minori vor avea rate reduse corespunzătoare de translație. Această rată va fi reflectată prin sinteza nivelurilor scăzute ale proteinei codificate.

în scopul refacerii prin inginerie a genei(lor) bacteriene, se determină codonul bias al plantei. Codonul bias este distribuția statistică a codonului pe care îl folosește planta pentru codificarea proteinelor sale. După determinarea bias-ului, se determină procentul frecvenței codonilor din gena(le) de interes. Se vor determina codonii primari preferați de plantă, precum și a doua și a treia opțiune de codoni preferați. Secvența aminoacidă a proteinei de interes este translatată invers, astfel că secvența de acid nucleic rezultată codifică pentru

RO 121280 Β1 aceeași proteină ca gena bacteriană nativă, dar secvența de acid nucleic rezultată cores- 1 punde primilor codoni preferați ai plantei dorite. Noua secvență se analizează pentru situri enzimatice de restricție, care s-au putut crea prin modificare. Siturile identificate sunt modi- 3 ficate în continuare prin înlocuirea codonilor cu a doua sau a treia opțiune de codoni preferați. Alte situri din secvență, care ar putea afecta transcripția sau translația genei de interes, 5 sunt joncțiuni exon: intron 5' sau 3', semnale suplimentare poliA sau semnale de terminare ARN polimerază. în continuare, secvența este analizată și modificată pentru reducerea frec- 7 venței dubletelor TA sau GC. Suplimentar la dubiete, secvența G sau C blochează ceea ce are mai mult decât circa 4 resturi, care sunt aceleași care pot afecta transcripția secvenței. 9 Prin urmare, aceste blocaje sunt de asemenea modificate prin înlocuirea codonilor de prima sau a doua opțiune etc., cu codonul de alegere preferat în continuare. Este de preferat ca 11 gena(ele) optimizată de plantă să conțină circa 63% din codonii primei opțiuni, între circa 22% până la circa 37% codoni de a doua opțiune și între 15% și 0% codoni de a treia opți- 13 une, în care procentul total este 100%. Cel mai preferat, gena(ele) optimizate de plantă conțin circa 63% codoni de prima opțiune, cel puțin circa 22% codoni de a doua opțiune, circa 15 7,5% codon de a treia opțiune și circa 7,5% codoni de a patra opțiune, în care procentul total este 100%. Metoda descrisă mai sus face posibil ca specialistul în domeniu să modifice 17 gena(ele) care sunt străine față de o plantă anume, astfel încât genele sunt exprimate optim în plante. Metoda este explicată suplimentar în cererea SUA aflată în curs de rezolvare, 19 60/005 405, depusă în 13 octombrie 1995, care este încorporată aici ca referință.

Astfel, în scopuLmodelării genei(lor) optimizate de plantă, secvența aminoacidă a 21 toxinelor se translatează invers într-o secvență ADN, utilizând un cod genetic neredundant stabilit de la un tabel de codon bias întocmit pentru secvența ADN pentru planta particulară 23 de transformat. Secvența ADN rezultată, care este complet omogenă în folosirea codonului, este modificată suplimentar pentru a stabili o secvență ADN care pe lângă un grad mai ridi- 25 cat de diversitate conține, de asemenea, siturile de recunoaștere a enzimelor de restricție, plasate strategic, compoziție dorită de baze și o absență a secvențelor care pot să interfe- 27 reze cu transcripția genei sau translația produsului mARN.

Teoretic, se consideră că genele bacteriene pot fi exprimate mai ușor în plante, dacă 29 genele bacteriene sunt exprimate în plastide. Astfel, poate fi posibil să se exprime gene bacteriene în plante, fără optimizarea genelor pentru expresia plantei și să obțină expresie ridi- 31 cată a proteinei. Vezi, brevete SUA 4 762 785, 5451 513 și 5 545 817, care sunt încorporate aici ca referință. 33

Una dintre opiniile luate în considerare în privința exploatării comerciale a plantelor transgenice este dirijarea rezistenței. Aceasta este o preocupare deosebită cu toxinele 35 Bacillus thunngiensis. Există numeroase companii care exploatează comercial Bacillus thunngiensis și există preocupare asupra faptului dacă toxinele Bt devin rezistente. O stra- 37 tegie pentru dirijarea rezistenței insectelor ar fi să se combine toxinele produse de Photorhabdus cu toxine cum ar fi Bt, proteine de insecte vegetative (Ciba Geigy) sau alte 39 toxine. Combinațiile s-ar putea formula pentru aplicare prin pulverizare sau ar putea fi combinații moleculare. Plantele s-ar putea transforma cu gene Photorhabdus, care produc 41 toxine de insecte și alte gene pentru toxine de insecte ca Bt cu alte gene toxine de insecte, precum Bt. 43

Cererea de brevet european 0400246A1 descrie transformarea a 2 Bt într-o plantă, care ar putea fi oricare 2 gene. Alt mod de a produce o plantă transgenică, care conține mai 45 mult decât o genă de rezistență la insectă, ar fi să se producă 2 plante, fiecare conținând o genă de rezistență la insectă. Aceste plante s-ar putea încrucișa folosind tehnici tradiționale 47 de selecție, pentru a produce o plantă care conține mai mult decât o genă de rezistență la insecte. 49

RO 121280 Β1

Suplimentar producerii unei plante transformate care conține genă(e) optimizată de plantă, există alte sisteme de eliberare unde se poate să se reconstruiască prin inginerie, genă(e) bacteriană. Urmând aceleași linii, poate fi obținută prin inginerie genetică o toxină proteică izolată cu ușurință, fuzionată împreună atât la o moleculă care atrage insecte, cât și la o sursă de hrană, iar activitatea insecticidă a toxinei poate fi prelucrată prin inginerie și exprimată în bacterii sau celule eucariote, folosind tehnici standard binecunoscute. După purificare în laborator, un asemenea agent toxic cu momeală încorporată ar putea fi împachetat în interiorul unei capcane standard pentru insectele din locuințe.

Altă schemă de eliberare este încorporarea materialului genetic al toxinelor într-un vector baculovirus. Baculovirusurile infectează insecte gazdă particulare, incluzând pe cele avute în vedere cu toxinele Photorhabdus. Baculovirus infecțios, care găzduiește un construct de expresie pentru toxinele Photorhabdus, s-ar putea introduce în zonele infestării cu insecte și prin aceasta ar intoxica sau otrăvi insectele infectate. Transferul proprietăților insecticide necesită secvențe de acid nucleic care codifică secvențele aminoacide pentu toxinele Photorhabdus integrate într-un vector de expresie proteină, corespunzător pentru gazda în care va fi vectorul. O cale pentru a obține o secvență de acid nucleic care codifică o proteină cu proprietăți insecticide este să se izoleze materialul genetic nativ, care produce toxinele din Photorhabdus, folosind informația dedusă din secvența aminoacidă a toxinei, ale cărei porțiuni mari sunt menționate în continuare. Așa cum s-a descris în continuare, sunt dezvăluite de asemenea, metode de purificare a proteinelor responsabile pentru activitatea toxinei. Folosind datele secvenței aminoacide N-terminale, cum sunt cele menționate mai jos, cineva poate construi oligonucleotide complementare la toate sau la o secțiune a bazelor ADN care codifică primii aminoacizi ai toxinei. Aceste oligonucleotide se pot radiomarca și folosi ca sonde moleculare pentru izolarea materialului genetic dintr-o bancă genetică genomică, construită de la materialul genetic izolat din tulpini de Photorhabdus. Banca genetică poate fi donată în vectori plasmid, cosmid, fag sau fagemid. Banca ar putea fi transformată în Escherichia coli și căutată pentru producerea toxinei de către celulele transformate, folosind anticorpi produși împotriva toxinei sau analize directe pentru toxicitate la insecte.

Această abordare necesită producerea unui set de oligonucleotide, deoarece codul genetic degenerat permite ca un aminoacid să poată fi codificat în ADN prin oricare dintre cele câteva combinații de 3 nucleotide. De exemplu, aminoacidul arginină poate fi codificat prin tripletele de acid nucleic CGA, CGC, CGG, CGT, AGA, și AGG. Deoarece nu se poate spune cu precizie care triplet este folosit la acele poziții în gena -toxinei, cineva trebuie să prepare oligonucleotide cu fiecare triplet potențial reprezentat. Pot fi necesare mai mult decât o moleculă de ADN corespondentă la o subunitate de proteină, pentru construirea unui număr suficient de sonde oligonucleotidice pentru recuperarea tuturor subunităților proteinei necesare pentru a obține toxicitate orală.

De la secvența aminoacidă a proteinei purificate se poate izola cu ușurință și dona, în totalitate sau parțial, materialul genetic responsabil pentru producerea toxinelor într-un vector de expresie, folosind oricare dintre cele câteva tehnici binecunoscute pentru specialistul în biologie moleculară. Un vector de expresie tipic este un plasmid ADN, cu toate că alte mijloace de transfer includ, dar nu se limitează la, cosmide, fagemide și fagi, care, de asemenea, sunt avute în vedere. în plus la trăsăturile necesare sau dorite pentru replicarea plasmidului, cum ar fi o origine a replicării și rezistență la antibiotic sau altă formă a unui marker selectabil, cum ar fi gena bar a Streptomyces hygroscopicus sau viridochromogenes, vectori de expresie a proteinei necesită suplimentar, în mod normal, o casetă de expresie care încorporează secvențele care acționează cis, necesare pentru transcripția și translația genei de interes. Secvențele care acționează cis, necesare pentru expresie la procariote, diferă de cele necesare la eucariote și plante.

RO 121280 Β1

O casetă de expresie eucariotă necesită un promotor transcripțional în amonte (5') 1 față de gena de interes, o regiune de terminare transcripțională, cum ar fi un sit de adiție poli-A și un sit de legare ribozom în amontele primului codon al genei de interes. în celule 3 bacteriene, un promotor transcripțional util care ar putea fi inclus în vector este promotorul legare polimerază ARN 17. Promotori, cum sunt cei descriși anterior aici, sunt cunoscuți pen- 5 tru inițierea eficientă a transcrierii mARN. De asemenea, în amonte de gena de interes, vectorul poate să includă o secvență nucleotidică care codifică o secvență semnal cunoscută 7 pentru dirijarea unei proteine legate covalent la un compartiment particular al celulelor gazdei, cum ar fi suprafața celulei. 9

Viruși ai insectelor sau baculoviruși sunt cunoscuți ca infectând și afectând în mod dăunător anumite insecte. Efectul virusurilor asupra insectelor este lent, iar virusurile nu 11 opresc hrănirea insectelor. Astfel, virusurile nu sunt avute în vedere ca fiind utile ca agenți de control al insectelor dăunătoare. Combinând genele toxinelor Photorhabdusîntr-un vector 13 baculovirus s-ar putea asigura un mod eficient de transmitere a toxinelor, crescând în același timp letalitatea virusului. Suplimentar, deoarece baculovirusuri diferite sunt specifice pentru 15 diferite insecte, poate fi posibil să se folosească o toxină particulară pentru țintirea selectivă a anumitor insecte dăunătoare. Un vector util în mod deosebit pentru genele toxinelor este 17 virusul poliedrozei nucleare. Vectori de transfer, care folosesc acest virus, au fost descriși și sunt acum vectorii opțiunii pentru transferarea genelor străine în insecte. Gena recombi- 19 nantă virus-toxină poate fi construită într-o formă transmisibilă oral. De obicei, baculovirusurile infectează insectele victimă, prin mucoasa intestinală a intestinului mediu. Gena toxinei 21 inserată în spatele unui promotor puternic de proteină de acoperire virală va fi exprimat și va omorî rapid insecta infectată. 23

Suplimentar, la un sistem de eliberare virus de insectă sau baculovirus, sau plantă transgenică pentru toxinele proteice ale prezentei invenții, proteinele pot fi încapsulate folo- 25 sind tehnologia de încapsulare Bacillus thuringiensis, cum ar fi, dar nelimitat la brevetele SUA 4 695 455, 4 695 462, 4 861 595, care toate sunt încorporate aici ca referință. Alt sis- 27 tem de eliberare pentru toxinele proteice ale prezentei invenții este reprezentat de formularea proteinei într-o matrice momeală, care s-ar putea folosi apoi ca momeli în locurile cu insecte, 29 deasupra solului și sub sol. Exemple de astfel de tehnologii includ, dar nu se limitează la, cererea de brevet PCT WO/93/23998, care este încorporată aici ca referință. 31

Așa cum s-a descris mai sus poate deveni necesar să se modifice secvența care codifică proteina, când se exprimă într-o gazdă non-nativă, deoarece preferințele codonutui 33 altor gazde pot să difere de cele ale Photorhabdus. într-un astfel de caz, translația poate fi chiar ineficientă într-o nouă gazdă, dacă nu sunt făcute modificările de compensare la sec- 35 vența de codificare. Suplimentar, pot fi dorite modificări la secvența aminoacidă pentru a evita reactivitatea încrucișată cu proteinele noii gazde sau pentru a rafina proprietățile insec- 37 ticide ale proteinei în noua gazdă. O genă a toxinei modificată genetic poate să codifice o toxină, care prezintă, de exemplu, toxicitate sporită sau redusă, dezvoltarea rezistenței insec- 39 tei modificate, stabilitate modificată sau specificitate modificată pentru speciile țintă.

în plus, la genele Photorhabdus care codifică toxinele, conținutul prezentei invenții 41 intenționează să includă secvențe înrudite de acid nucleic care codifică biopolimeri aminoacizi omologi la proteinele toxină și care păstrează efectul toxic al proteinelor Photorhabdus 43 la speciile de insecte, după ingestie orală.

De exemplu, toxinele folosite în prezenta invenție par să inhibe inițial hrănirea larvară, 45 înaintea de a urma moartea. Prin manipularea secvențelor de acid nucleic ale toxinelor Photorhabdus sau secvențelor sale de control, inginerii geneticieni care plasează gena 47 toxină în plante pot să moduleze potența sa sau modul său de acțiune, pentru ca să mențină,

RO 121280 Β1 de exemplu, activitatea de inhibare a hrănirii, eliminând în același timp activitatea toxicității absolute asupra larvei. Această schimbare ar putea permite plantei transformate să supraviețuiască până la recoltare, fără a avea un efect dramatic inutil asupra ecosistemului, nimicind toate insectele țintă. Toate aceste modificări ale genei care codifică toxina sau ale proteinei codificată de genă sunt avute în vedere să intre în cuprinsul prezentei invenții.

Alte modificări avute în vedere ale acidului nucleic se referă la suplimentarea secvențelor țintă pentru dirijarea toxinei spre părți anume ale larvei insectei, pentru îmbunătățirea eficienței sale.

Tulpinile ATCC 55397,43948,43949,43950,43951,43952 s-au depozitat la colecția americană de culturi tip 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 SUA. Datele secvenței aminoacide și nucleotidice pentru toxina nativă W-14 (ATCC 55397) sunt prezentate mai jos. De asemenea, aici, este exemplificată izolarea de ADN genomic pentru toxine din gazde bacteriene. Informații suplimentare pot fi găsite în Sambrook J., Fritsch, E.F., și Maniatis.T. (1989), Molecular Cloning. A Laborator’Manual. Cold Spring Harbor Press, care este încorporată aici ca referință.

Invenția prezintă următoarele avantaje:

- reducerea influențelor asupra ecosistemului;

- eficacitate superioară.

Se dau, în continuare, exemple de realizare a invenției în legătură și cu fig. 1-6 care reprezintă:

- fig. 1 este o ilustrare a unei perechi de izolate ADN donate, folosite ca o parte a secvenței genelor pentru toxina prezentei invenții;

- fig. 2 este o hartă a 3 plasmide folosite în procesul secvențierii;

- fig. 3 este o hartă care ilustrează interrelațiile a câteva fragmente ADN parțiale;

- fig. 4 este o ilustrare a unei analize de omologie dintre secvențele proteinelor TcbAji și TcaB,,;

- fig. 5 este o fenogramă a tulpinilor Photorhabdus. Relațiile tulpinilor Photovhabdus s-au definit prin rep-PCR.

Axa superioară din fig. 5 măsoară procentul similarității tulpinilor pe baza aprecierii produselor rep-PCR (adică. 0.0 [fără similaritate] la 1.0 [100% similaritate]). La dreapta axei, numerele și literele indică diversele tulpini testate; i4=W-14, Hm=Hm, H9=H9, 7=WX-7, 1=WX-1, 2=WX-2, 88=HP88, NC-1=NC-1, 4=WX-4, 9=WX-9, 8=WX-8, 10=WX-10, WIR=WIR, 3=WX-3, 11=WX-11, 5=WX-5, 6=WX-6, 12=WX-12, x14=WX-14, 15=WX-15, Hb=Hb, B2=B2, 48 la 52=ATCC 43948 la ATCC 43952. Liniile verticale care separă liniile orizontale arată gradul de înrudire (cum s-a citit din intersecția extrapolată a liniei verticale cu axa superioară) între tulpini sau grupuri de tulpini, la baza liniilor orizontale (de exemplu, tulpina W-14 este similară aproximativ 60% la tulpinile H9 și Hm).

- fig. 6 este o ilustrare a hărților genomice ale tulpinii W-14.

în exemple, sunt folosite următoarele abrevieri: Tris = tris (hidroximetil)amino metan; SDS = dodecilsulfat de sodiu; EDTA = acid etilendiamintetraacetic; IPTG = izopropiltio-Bgalactozidă; X-gal - 5-bromo-4-cloro-3-indoil-B-D-galactozidă; CTAB = bromură cetiltrimetilamoniu; kbp= kilobaze perechi; dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1 = 2'-deoxinucleozid 5*-trifosfații adeneinei, citozinei, guaninei, timinei și respectiv inozinei; ATP= adenozin 5'-trifosfat.

Exemplul 1. Purificarea toxinei de la P. luminescens și demonstrarea toxicității după eliberarea orală a toxinei purificate

Toxina proteică insecticidă a prezentei invenții s-a purificat de la P. luminescens tulpina W-14, ATCC număr de acces 55397. Culturile stoc de P. luminescens s-au menținut pe discuri Petri care conțin 2% Proteose Peptone nr. 3 (adică, PP3, Difco Laboratories, Detroit

RO 121280 Β1

Ml) în 1,5% agar, s-au incubat la 25’C și s-au transferat săptămânal. Colonii de formă prima- 1 ră ale bacteriilor s-au incubat în 200 ml de bulion PP3 suplimentat cu 0,5% polioxietilen sorbitan mono-stearat (Tween 60, Sigma Chemical Company, St. Louis MO) într-un balon 3 de 1 I. Culturile din bulion s-au crescut 72 h, la 30”C, pe un agitator rotativ. Proteinele toxină se pot recupera din culturi crescute în prezență sau absență de Tween; totuși, absența 5 Tween poate afecta forma bacteriei crescute și profilul proteinelor produse de către bacterii, în absență de Tween, se întâlnește o variantă în măsura în care greutatea moleculară a cel 7 puțin unei subunități de toxină identificată se schimbă de la circa 200 kDa la circa 185 kDa.

Culturile de 72 h s-au centrifugat la 10.000 x g, timp de 30 min, pentru a îndepărta 9 celulele și resturile celulare. Fracțiunea supernatantului, care a conținut activitatea insecticidă, s-a decantat și s-a adus la 50 mM K₂HPO₄, adăugând un volum corespunzător de 11 1,0 M K₂HPO₄. S-a ajustat pH-ul la 8,6 adăugând hidroxid de potasiu. Această fracțiune supernatantă s-a amestecat apoi cu DEAE-Sephacel (Pharmacia LKB Biotechnology), care 13 s-a echilibrat cu 50 mM K₂HPO₄. Activitatea toxică s-a adsorbit la rășina DEAE. Acest amestec s-a turnat apoi într-o coloană 2,6 X 40 cm și s-a spălat cu 50 mM K₂HPO₄ la temperatura 15 camerei, la o rată de curgere de 30 ml/h, până când efluentul a atins o absorbantă UV la o linie de bază constantă la 280 nm. Apoi, coloana s-a spălat cu KC1150 mM, până când eflu- 17 entul a atins din nou o linie de bază constantă la 280 nm. în final, coloana s-a spălat cu KC1 300 mM și fracțiunile s-au colectat. 19

Fracțiunile conținând toxina s-au colectat și s-au sterilizat prin filtrare, folosind o membrană de filtrare cu pori 0,2 μ. Apoi, toxina s-a concentrat și s-a echilibrat la 100 mM KPO4, 21 pH 6,9, folosind o membrană de ultrafiltrare cu separarea unei greutăți moleculare de 100 kDa, la 4°C (Centriprep 100, Amicon Division-W.R. Grace and Company). S-a aplicat 23 o probă de 3 ml de concentrat toxină, la partea superioară a unei coloane de filtrare în gel 2,6 x 95 cm Sephacryl S-400 HR (Pharmacia LKB Biotechnology). Tamponul efluent a fost 25 KPO₄100 mM, pH 6,9, care s-a migrat la o rată de curgere 17 ml/h, la 4°C. Efluentul s-a monitorizat la 280 nm. 27

S-au colectat fracțiunile și s-au testat pentru activitate toxică. Toxicitatea fracțiunilor cromatografice a fost examinată într-o analiză biologică, folosind larve de Manduca sexta. 29 Fracțiunile s-au aplicat fie direct pe hrana insectei (Gypsy, hrană granulată din germeni de grâu, ICN Biochemicals Division-ICN Biomedicals, Inc.), fie s-au administrat prin injectarea 31 intrahemocelică a unei probe de 5 μΙ în prima protuberantă abdominală a unei larve în stadiul al 4-lea sau al 5-lea, folosind un ac de mărimea 30. S-a înregistrat greutatea fiecărei larve 33 din grupul de tratament, la intervale de 24 h. Se asumă toxicitatea, dacă insecta a încetat hrănirea și a murit în câteva zile de consum al dietei, sau dacă moartea a avut loc în 24 h 35 după injectarea unei fracțiuni.

Fracțiunile toxice s-au colectat și s-au concentrat folosind Centriprep 100 și apoi s-au 37 analizat prin HPLC folosind o coloană cu gel de permeație de 7,5 mm x 60 cm TSK-GEL G-4000 SW cu fosfat de potasiu 100 mM, pH 6,9 tampon eluent care migrează la 0,4 ml/min. 39 Această analiză a arătat toxina proteică ca fiind conținută într-un singur maxim ascuțit care a eluat din coloană cu un timp de retenție de aproximativ 33,6 min. Acest timp de retenție a 41 corespuns la o greutate moleculară estimată de 1000 kDa. Maximul fracțiunilor a fost colectat pentru purificare ulterioară, în timp ce fracțiunile care nu conțin această proteină s-au elimi- 43 nat. Maximul eluat de la HPLC absoarbe lumina UV la 218 și 280 nm, dar nu absoarbe la 405 ran. Absorbanța la 405 nm s-a dovedit a fi un atribut al compușilor antibiotici 45 xenorhabdină.

Electroforeza fracțiunilor maxime colectate într-un gel de agaroză non-denaturată 47 (Metaphor Agarose, FMC BioProducts) a arătat că în maxim sunt prezente 2 complexe

RO 121280 Β1 proteice. Materialul maximului tamponat în Tris-HCI 50 mM, pH 7,0 s-a separat pe un gel suprapus de agaroză 1,5% tamponat cu Tris-HC1100 mM la pH 7,0 și gelul care separă agaroză 1,9% s-a tamponat cu Tris-borat 200 mM la pH 8,3, în condiții de tamponare standard (tampon anod Tris-HCI IM, pH 8,3; tampon catod Tris 0,025 M, glicină 0,92 M). Gelurile au migrat la curent constant 13 niA, la 15°C, până când colorantul de trasare roșu fenol a atins capătul gelului. S-au vizualizat în gelurile de agaroză 2 benzi proteice, folosind colorație Coomassie brilliant blue.

Banda cu migrare mai lentă s-a denumit banda proteică 1 și banda cu migrare mai rapidă s-a denumit banda proteică 2. Cele două benzi proteice au fost prezente în cantități aproximativ egale. Gelurile de agaroză colorate Coomassie s-au folosit ca ghid pentru a exciza precis cele două benzi proteice din porțiunile necolorate ale gelurilor. Bucățile excizate conținând benzile proteice s-au macerat și s-a adăugat o cantitate mică de apă sterilă. Pentru control, s-a excizat o porțiune a gelului care nu a conținut nici o proteină și s-a tratat în aceeași manieră ca bucățile de gel care conțin proteina. S-a recuperat proteina din bucățile de gel prin electroeluție în Tris-borat 100 mM, pH 8,3, la 100 volți (voltaj constant), timp de 2 h. Alternativ, s-a eluat proteina pasiv din bucățile de gel, prin adăugarea unui volum egal de Tris-HCI 50 mM, pH 7,0, la bucățile de gel, apoi incubare la 30’C, 16 h. Aceasta a permis proteinei să difuzeze din gel în tampon care apoi s-a colectat.

Rezultatele testelor de toxicitate la insecte folosind toxină purificată HPLC (33,6 min, maxim) și toxina purificată din gel de agaroză au demonstrat toxicitatea extractelor. Injectarea a 1,5 pg de proteină purificată HPLC omoară în 24 h. Ambele benzi proteice 1 și 2, recuperate din gelul de agaroză prin eluție pasivă sau electroeluție, au fost letale la injectare. Concentrația proteinei estimată pentru aceste probe a fost mai mică de 50 ng/larvă. O comparație a greutății câștigate și mortalitatea între grupurile de larvă, injectate cu benzile proteice 1 sau 2, arată că proteina banda 1 a fost mai toxică la eliberare prin injectare.

Când toxina purificată HPLC s-a aplicat la hrana larvară, la o concentrație de

7.5 pg/larvă, aceasta a produs o stopare a câștigului greutății larvare (s-au testat 24 de larve). Larvele au început să se hrănească, dar după consumarea numai unei mici părți din hrana tratată cu toxină, ele au început să prezinte simptomele patologice induse de toxină și larvele au încetat să se hrănească. Insecta devine incoloră și majoritatea larvelor prezintă semne de diaree. Mortalitatea semnificativă a insectei a rezultat când s-au aplicat câteva doze de 5 pg toxină la hrană, pe o perioadă de 7-10 zile.

Banda 1 de proteină separată pe agaroză a inhibat semnificativ câștigul greutății larvare la o doză 200 ng/larvă. Larvele hrănite cu concentrații similare ale proteinei banda 2 nu s-au inhibat și au câștigat în greutate la aceeași rată ca larvele de control. S-au hrănit 12 larve cu proteină eluată și 45 larve s-au hrănit cu proteina conținută în bucățile de agaroză. Aceste două seturi de date arată că proteina din banda 1 a fost toxică oral pentru Manduca sexta. în acest experiment, se pare că proteina din banda 2 nu a fost toxică pentru Manduca sexta.

Analizele suplimentare ale proteinei din benzile 1 și 2 prin SDS-PAGE, în condiții de denaturare, a arătat că fiecare bandă a fost compusă din câteva subunități proteice mai mici. Proteinele s-au vizualizat prin colorație Coomassie brilliant blue, urmată de colorație argint, pentru a atinge maximul de sensibilitate.

Subunitățile de proteină din cele două benzi au avut o similaritate foarte ridicată. Banda 1 de proteină conține 8 proteine de 25,1,56,2, 60,8, 65,6,166,171,184 și 208 kDa. Banda 2 de proteină a avut un profil identic, cu excepția că proteinele de 25,1, 60,8 și

65.5 kDa nu au fost prezente. Proteinele 56,2,60,8,65,6 și 184 kDa au fost prezente în complexul banda 1 de proteină la concentrații aproximativ egale și reprezintă 80% sau mai mult din conținutul total de proteină a acestui complex.

RO 121280 Β1

Toxina nativă purificată-HPLC s-a caracterizat în continuare, după cum urmează. 1 Toxina a fost labilă termic, prin aceea că, după ce a fost încălzită la 60°C, timp de 15 min, aceasta și-a pierdut capacitatea de a omorî sau de inhiba creșterea în greutate, când s-au 3 injectat sau s-au hrănit larve M.sexta. Testele au avut ca scop detectarea activităților lipazei, fosfolipazei tip C, nucleazelor sau hemolizei roșii de sânge și s-au realizat cu toxină purifi- 5 cată. Nici una din aceste activități nu a fost prezentată. De asemenea, s-au făcut teste de inhibare antibiotic zonă și toxina purificată nu a reușit să inhibe creșterea bacteriilor gram- 7 negative sau gram-pozitive, drojdii sau fungi filamentoși, arătând că toxicul nu este un antibiotic xenorhabdin. 9

Toxina nativă purificată - HPLC - s-a testat pentru capacitatea de a omorî alte insecte decât Manduca sexta. Tabelul 2 conține denumirile insectelor omorâte de către toxina P- 11 luminescens purificată-HPLC în acest studiu.

Tabelul 2

Insecte omorâte de către toxina P. luminescens 15

Nume comun	Ordin	Genuri sau specii	Cale de eliberare
Molia tutunului	Lepidoptera	Manduca sexta	Oral sau injectat
Gândac de făină	Coleptera	Tenebtio molitor	Oral
Pharaoh ant	Hymenoptera	Monomorium pharoanis	Oral
Gândac de bucătărie	Dictyoptera	Plettella germanica	Oral sau injectat
Țânțar 1 »	Diptera	Aedes aegypti	Oral

Exemplul 2. Utilizarea și toxicitatea Photorhabdus luminescens s-au caracterizat în 23 continuare. S-a produs bulionul de cultură Photorhabdus luminescens (tulpina W-14), așa cum urmează. Mediul de producție a fost 2% Bacto Proteose Peptone® nr. 3 (PP3, Difco 25 Laboratories, Detroit, Michigan)în apă deionizată Milli-Q®. Flacoanele culturi deînsămânțare constau din 175 ml mediu plasat într-un flacon cu trei șicane cu un gât Delong, acoperit cu 27 un Kaput și autoclavizat timp de 20 min, T=250°F. Flacoanele de producție constau din 500 ml din 2,81 500 ml într-un flacon cu trei șicane cu un gât Delong, acoperit de o spumă silicon 29 Shin-etsu. Acestea s-au autoclavizat timp de 45 min, T=250’F. Cultura de însămânțare s-a incubat la 28’C, la 150 rpm, într-un incubator giratoriu de agitare cu o deplasare de 2 inch. 31 După 16 h de creștere, 1% din cultura de însămânțare s-a plasat într-un flacon de producție care s-a lăsat să crească timp de 24 h înainte de recoltare. Producția toxinei a părut să fie 33 în timpul creșterii fază log. Bulionul microbian s-a transferat la o sticlă de centrifugă de 11 și biomasa celulară s-a peletat (30 min, la 2500 RPM, la 4°C, centrifugă [R.C.F.= —1600] 35

HG-4L Rotor RC3 Sorval, Dupont, Wilmington, Delaware). Bulionul primar s-a răcit brusc la 4°C, timp de 8-16 h, și s-a recentrifugat cel puțin 2 h (condiții de mai sus), pentru a clarifica 37 suplimentar bulionul prin îndepărtarea unei așa-zise mucopolizaharide care a precipitat la repaus. (O metodă alternativă de producere a combinat ambele etape și a implicat utilizarea 39 unei centrifugări de clarificare timp de 16 h, aceleași condiții de mai sus). Apoi, acest bulion s-a păstrat la 4°C, înainte de biotestare sau filtrare. 41

Bulionul de cultură Ptotorhabdus și toxina(ele) proteică care s-a purificat din acest bulion au prezentat activitate (mortalitatea și/sau inhibarea creșterii, apariția redusă a adultu- 43 lui) împotriva unui număr de insecte. Mai ales activitatea este împotriva corn rootworm (larvă sau adult), gândacului de Colorado al cartofului și turf grub, care sunt membrii ai ordinului 45

RO 121280 Β1 de insecte Coleoptera. Alți membri ai Coleoptera includ specii de wireworm, gândac al polenului, gândaci din genurile Haltica și Epitrix, gândaci din familia Bruchidae și gărgărițe. De asemenea, s-a observat activitate împotriva insectelor homeoptere Cicadellidae, care sunt membre ale ordinului Homoptera. Alți membri ai Homoptera includ planthoppers, pear pyslla, apple sucker, insecte homeoptere Ciccoidae, Aleyrodidae și Cercopidae, precum și numeroase gazde specifice speciilor afide. Bulionul și fracțiunile purificate sunt de asemenea active împotriva beet armyworm, cabbage looper, Noctuidae. Pyransta nubilatis Heliotis zea și Crpocapsa pomonella, care sunt membrii ai ordinului Lepidoptera. Alți membri tipici ai acestui ordin sunt Tineidae, Indian mealmoth, leaf roller, genul Pieris, cotton bollworm, bagworm, Eastern tent Caterpillar, sod webworm și fall armyworm. De asemenea, activitatea pare să fie împotriva larvelor de țânțari, care sunt membrii ordinului Diptera. Alți membrii ai ordinului Diptera sunt Chironomidae, carrot fly, cabbage root fly, turnip root fly, onion fly, Tipulidae, Musca domestica și diferite specii de țânțari. Activitatea pare să fie împotriva insectelor diptere din familia Camponotus și Iridemyrmex humilis, care sunt membrii ai ordinului care include de asemenea Lampyridae, oderous house ant și Monomorium minimum.

Bulionul/fracția este folositor pentru reducerea populațiilor de insecte și s-au folosit într-o metodă a inhibării unei populații de insecte. Metoda poate cuprinde aplicarea, la un locus al insectei, a unei cantități eficientă de inactivare a insectei de activ descris. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 3.

Activitatea împotriva lavelor corn root worm s-a testat după cum urmează. Bulion de cultură Photorhabdus (sterilizat pe filtru, celule libere) sau fracțiuni purificate HPLC s-au aplicat direct pe suprafața (~ 1,5 cm²) 0,25 ml de hrană artificială în 30 pl alicote, după diluția în mediu de control sau tampon 10 mM fosfat de sodiu, respectiv pH 7,0. Plăcile dietă s-au lăsat la uscare în aer, într-o învelitoare-curent sterilă, și godeurile s-au infestat cu o singură nou apărută Diabrotica undercimpunctata howardi (Southern corn rootworm, SCR) incubată din ouă sterilizate, cu a doua stare larvară SCR crescută pe dietă artificială sau cu a doua stare larvară Diabrotica virgifera virgifera (Western corn rootworm, WCR), crescute pe răsaduri de cereale în Metromix®. S-au cântărit larve în a doua stare larvară, înainte a adăugarea la hrană. Plăcile s-au izolat, s-au plasat într-o cameră de creștere umezită și s-au menținut la 27’C, pentru o perioadă corespuzătoare (4 zile pentru SCR nou apărut și adult, 2-5 zile pentru larve WCR, 7-14 zile pentru SCR în a doua stare embrionară). S-au măsurat determinările de greutate și mortalitate, așa cum s-a indicat. în general, în toate studiile s-au utilizat 16 insecte per tratament. Modalitățile de control au fost următoarele: larve nou apărute, < 5%, gândaci adulți, 5%.

Activitatea împotriva gândacului de Colorado al cartofului s-a testat după cum urmează. Bulion de cultură Photorhabdus sau mediul de control s-a aplicat la suprafața (-2,0 cm²)

1,5 ml dietei artificiale standard considerată în godeurile unei plăci de cultură țesut cu 24 godeuri. Fiecare godeu a primit 50 pl tratament și s-a lăsat să se usuce la aer. Apoi, larve individuale de gândac de Colorado al cartofului, în al doilea stadiu larvar (Leptinotarsa decemlineata, CPB), s-au plasat pe hrană și, după 4 zile, s-a înregistrat mortalitatea. Mortalitatea control a fost 3,3%.

Activitatea împotriva Japanese beetle grubs & beetles s-a testat după cum urmează. Brazde de pământ cu larve turf grub (Popillia japonica, al 2-3-lea stadiu larvar) s-au colectat de pe pajiști infestate și s-au menținut în laborator, în amestec sol/turbă cu felii de morcov adăugat ca hrană suplimentară. Gândacii truf s-au atras local în capcană-feromon și s-au menținut în laborator în containere de plastic cu frunze de arțar ca hrană. După aplicare de bulion de cultură nediluat Photorhabdus sau mediu de control la dieta artificială corn root worm (30 μΙ/1,54 cm², gândaci) sau felii morcov (larve), ambele stadii s-au plasat individual

RO 121280 Β1 într-un godeu dietă și s-au observat orice mortalitate și alimentație. în ambele cazuri, a 1 existat o reducere clară în cantitatea hranei (și producerea de excremente) observată.

Activitatea împotriva larvelor țânțarilor s-a testat cum urmează. Testul s-a realizat în 3 plăci de microtitrare cu 96-godeuri. Fiecare godeu a conținut 200 pl soluție apoasă (bulion de cultură Photorhabdus, mediu de control sau H₂O și aproximativ 20 larve în vârstă de 1 zi 5 (Aedes aegypti). Au fost 6 godeuri per tratament. Rezultatele s-au citit la 2 h după infestare și nu s-au schimbat după perioada de observare de trei zile. Nu a apărut mortalitate control. 7

Activitatea împotriva insectelor diptere din familia Trypetidae s-a testat după cum urmează. Mediul Drosophila melanogaster cumpărat s-a preparat folosind 50% mediu uscat 9 și 50% un lichid, fie apă, fie mediu control, fie bulion cultură Photorhabdus. Aceasta a fost realizată prin plasarea a 8,0 ml mediu uscat în fiecare dintre 3 flacoane ridicate per tratament 11 și adăugând 8,0 ml de lichid corespunzător. Apoi zece larve în stadii larvare târzii de Drosophila melanogaster s-au adăugat la fiecare flacon. Flacoanele s-au ținut pe o masă de 13 laborator, la temperatura camerei, sub lumină fluorescentă din plafon. Numărarea adulți și pupe s-a făcut după 3, 7 și 10 zile de expunere. încorporarea bulionului de cultură 15 Photorhabdus în mediul de dietă pentru larve de Trypetidae a produs o ușoară (17%) dar semnificativă reducere în apariția de adulți, în ziua -10, cum s-a comparat la apă sau mediu 17 control (reducere 3%).

Activitatea împotriva insectelor homeoptere Cicadellidae s-a testat după cum urmea- 19 ză. Testul ingestiei pentru insecte homeoptere Cicadellidae (Macrosteles severini) este destinat a face posibilă ingerarea activului fără alt contact extern. Rezervorul pentru soluția 21 activ/aliment este realizat prin 2 lăcașuri în centrul porțiunii de jos a unui vas Petri 35x10 mm. Un pătrat Parafilm M®de 2 inch este plasat peste vârful vasului și se asigură cu 23 un inel O. Un cub de plastic de 1 oz. s-a infestat apoi cu aproximativ 7 insecte homeoptere Cicadellidae și rezervorul s-a plasat la vârful cupei, sub Parafilm. Soluția test s-a adăugat 25 apoi la rezervor prin lăcașuri. în teste utilizând bulion de cultură Photorhabdus nediluat, bulionul și mediul control s-au dializat contra apă, pentru a reduce mortalitatea control. Morta- 27 litatea s-a raportat la 2 zile, când mortalitatea control a părut a fi 26,5%. în testele utilizând fracțiuni purificate (200 mg proteină/ml), o concentrație finală de sucroză 5% s-a utilizat în 29 toate tratamentele pentru a îmbunătăți supraviețuirea insectelor homeptere Cicadellidae. Testul s-a desfășurat într-un incubator la 28°C, 70% RH cu o fotoperioadă de 16/8. Testul 31 a atins gradul de mortalitate la 72 h. Mortalitatea control a fost 5,5%.

Activitatea împotriva insectelor Iridomyrmex humilis s-a testat după cum urmează. 33 Un alicot de 1,5 ml de bulion de cultură Photorhabdus 100%, mediu control sau apă, s-a pipetat în flacoane de sticlă transparentă de 2,0 ml. Flacoanele s-au vârât într-o bucată de 35 fitil dentar de bumbac, care s-a umezit cu tratamentul corespunzător. Fiecare flacon s-a plasat într-un vas Petri separat 60x16 mm cu 8 la 12 insecte adult Iridomyrmex humilis 37 (Linepithema humile). Au fost replicate trei per tratament. Plăcile de biotest s-au ținut pe o masă de laborator, la temperatura camerei, sub lumină fluorescentă din plafon. Citirile pentru 39 mortalitate s-au făcut după 5 zile de expunere. Mortalitatea de control a fost 24%.

Activitatea împotriva insectelor din genul Camponotus s-a testat după cum urmează. 41 S-au colectat femele nefertile de insecte (Camponotus pennsylvanicus) din copaci de pe plantația DowElancoîn Indianapolis, IN. Testele cu bulion cultură Photorhabduss-au realizat 43 după cum urmează. Fiecare container biotest de plastic (71/8x3) a ținut 15 femele infertile, un adăpost de hârtie și 10 ml bulion sau mediu control într-un vas mic de plastic. Un fitil de 45 bumbac a eliberat tratamentul, până la un lăcaș în capacul vasului mic. Toate tratamentele au conținut 5% sucroză. Biotestul s-a realizat la întuneric, la temperatura camerei, timp de 47 19 zile. Mortalitatea control a fost 9%. Testele care eliberează fracțiuni purificate utilizează

RO 121280 Β1 dietă artificială pentru furnici amestecată cu tratamentul (fracțiune purificată sau soluție control) la o rată de 0,2 ml tratament/2,0 g dietă într-o eprubetă test plastic. Concentrația finală de proteină a fracțiunii purificate a fost mai mică decât 10 pg/g dietă. Zece insecte per tratament, o sursă de apă, adăpost și dieta tratată s-au plasat în containere de plastic etanșe și s-au menținut la întuneric, la 27°C, într-un incubator umezit. S-a înregistrat mortalitatea în ziua 10. Nu a apărut mortalitate control.

Activitatea împotriva diferitelor larve lepidoptere s-a testat după cum urmează. Bulion de cultură Photorhabdus sau fracțiuni purificate s-au aplicat direct la suprafața (~1,5 cm²) de 0,25 ml dietei artificiale standard în 30 pl alicote după diluție, în mediu control sau tampon 10 mM fosfat de sodiu, pH 7,0, respectiv. Plăcile de dietă s-au lăsat să se usuce la aer într-o învelitoare-curent sterilă și godeurile s-au infestat cu larve nou ivite individual. Din surse comerciale s-au suplimentat ouă European corn borer (Ostrinia nubilalis) și corn earworm (Helicoverpa zea) și s-au incubat cu mijloace proprii și s-au suplimentat intern beet armyworm (Spodoptera exigua), cabbage looper (Trichoplusia ni), tabacco budworm (Heliothis viescens), codling moth (Laspeyresia pomonella) și black cutworm (Agrotis ipsilon). După infestare cu larve, plăcile cu dietă s-au etanșat, s-au plasat într-o cameră de creștere umezită și s-au menținut la întuneric, la 27’C, pentru perioada corespunzătoare. S-au înregistrat determinările de greutate și mortalitate la zilele 5-7 pentru bulion de cultură Photorhabdus și 4-7 zile pentru fracția purificată. în tot studiul s-au folosit, în general, 16 insecte per tratament. Mortalitatea control s-a situat între 4-12,5% pentru mediu control și a fost mai mică decât 10% pentru tampon fosfat.

Tabelul 3

Efectul bulionului de cultură Photorhabdus luminescens (Tulpina W-14) și fracțiunii toxină purificată, asupra mortalității și inhibării creșterii a diferite ordine/specii de insecte

Ordin/specie de insecte	Bulion	Fracțiune purificată
	Mort.%	G.l.%	Mort.%	G.l.%
COLEOPTERA
Vierme rădăcini cereale
Southern/larvă nou apărută	100	na	100	na
Southern/al 2-lea stadiu larvar	na	38,5	nt	nt
Southern/adult	45	nt	nt	nt
Western/al 2-lea stadiu larvar	na	35	nt	nt
Gândacul de Colorado al cartofului
al 2-lea stadiul larvar	93	nt	nt	nt
Vierme de gazon
al 3-lea stadiu larvar	na	a.f	nt	nt
adult	na	A.f	nt	nt
DIPTERA
Tripedidae (apariție adult)	17	nt	nt	nt
Larvă țânțar	100	na	nt	nt
HOMOPTERA
Cicadellidae	96,5	na	100	na

RO 121280 Β1

Tabelul 3 (continuare)

Ordin/specie de insecte	Bulion	Fracțiune	purificată
	Mort.%	G.l.%	Mort.%	G.l.%
HIMENOPTERA
Iridomyrmex humilis	75	na	nt	na
Camponotus	71	na	100	na
LEPIDOPTERA
Beet Armyworm	12,5	36	18,75	41,4
Black Cutworm	nt	nt	0	71,2
Cabbage Looper	nt	nt	21,9	66,8
Codling Moth	nt	nt	6,25	45,0
Corn Earworm	56,3	94,2	97,9	na
European Corn Borer	96,7	98,4	100	na
Tabacco Budworm	13,5	52,5	19,4	85,6

Mort.= mortalitate, G.l.= inhibare creștere, na= neaplicabil, nt= netestat, a.f.= anti-hrănitor 17

Exemplul 3. Utilitatea insecticidului pentru aplicare în sol 19

Bulionul de cultură Photorhabdus luminescens (tulpina W-14) s-a arătat a fi activ împotriva corn rootworm, când s-a aplicat direct pe sol sau pe un sol-mix (Metromix®). Activi- 21 tatea împotriva SCR și WCR nou apărut în Metromix® s-a testat după cum urmează (Tabelul 4). Testul s-a realizat utilizând răsaduri de cereale (United Agriseeds brand CL614), 23 care au germinat la lumină, pe hârtie filtru umed pentru 6 zile. Când rădăcinile au fost aproximativ de 3-6 cm lungime, o singură sămânță/răsad s-a plantat într-o cupă de plastic clar cu 25 50 mg de Metromix® uscat. Apoi, 20 SCR sau WCR nou apăruți s-au plasat pe rădăcinile răsadurilor și s-au acoperit cu Metromix®. Pe infestare, răsadurile s-au înmuiat apoi cu 50 ml 27 volum total de soluție bulion diluat. După înmuiere, cupele s-au etanșat și s-au lăsat la temperatura camerei, la lumină, timp de 7 zile. După aceea, răsadurile s-au spălat pentru a înde- 29 părta tot Metromix® și rădăcinile s-au excizat și s-au cântărit. Activitatea s-a evaluat ca procentul rădăcinilor de cereale rămase relativ la plantele de control și ca distrugerea frunzei 31 indusă prin hrănire. S-a înregistrat vizual distrugerea frunzei și s-a evaluat fie ca -, +, ++, sau +++, cu reprezentând lipsa distrugerii și ”+++ reprezentând distrugere gravă. 33

Activitatea împotriva SCR nou apărat în sol s-a testat după cum urmează (Tabelul 5).

Testul s-a realizat utilizând răsaduri de cereale (United Agriseeds brand CL614) care au ger- 35 minat la lumină, pe hârtie de filtru umedă, timp de 6 zile. După ce rădăcinile au fost de aproximativ 3-6 cm lungime, o singură sămânță/răsad s-a plantat într-o cupă de plastic clar 37 cu 150 gm sol dintr-un câmp din Lebanon, IN, plantat cu un an înainte cu cereale. Acest sol nu a fost tratat anterior cu insecticide. Apoi, 20 SCR nou apărați s-au plasat direct pe radă- 39 cinile răsadurilor și s-au acoperit cu sol. După infestare, răsadurile s-au îmbibat cu 50 ml volum total dintr-o soluție de bulion diluat. După înmuiere, cupele neetanșate s-au incubat 41 într-o cameră cu umiditate relativ ridicată (80%) la 78°F. După aceea, răsadurile s-au spălat pentru a îndepărta tot solul și rădăcinile s-au excizat și s-au cântărit. Activitatea s-a evaluat 43 ca procentul rădăcinilor de cereale rămase relativ la plantele control și ca distrugere frunză indusă prin hrănire. S-a înregistrat vizual distrugerea frunzei și s-a evaluat fie ca -, +. ++, sau 45 +++, cu reprezentând fără distrugere și+++ reprezentând distrugere gravă.

RO 121280 Β1

Tabelul 4

Efectul bulionului de cultură Photorhabdus luminescens (Tulpina W-14) asupra larvei rootworm după înmuiere postinfestare (Metromix®)

Tratament	Larvă	Distrugere frunză	Greutate rădăcină	%
Southern corn rootworm
Apă	-	-	0,4916 ±0,023	100
Mediu (2,0% v/v)	-	-	0,4416 ±0,029	100
Bulion (6,25% v/v)	-	-	0,4641 ± 0,081	100
Apă	+	+++	0,1410 ±0,006	28,7
Mediu (2,0% v/v)	+	+++	0,1345 ±0,028	30,4
Bulion (1,56% v/v)	+	-	0,4830 ± 0,031	104
Western corn rootworm
Apă	-	-	0,4446 ±0,019	100
Bulion (2,0% v/v)	-	-	0,4069 ± 0,026	100
Apă	+	-	0,2202 ±0,015	49
Bulion (2,0% v/v)	+	-	0,3879 ±0,013	95

Tabelul 5

Efectul bulionului de cultură Photorhabdus luminescens (Tulpina W-14) asupra

Southern corn root după înmuiere postinfestare (Sol)

Tratament	Larvă	Distrugere frunză	Greutate rădăcină	%
Apă	-		0,2148 ±0,014	100
Bulion (50% v/v)	-	-	0,2260 ±0,016	103
Apă	+	+++	0,0916 ±0,009	43
Bulion (50% v/v)	+	-	0,2428 ± 0,032	113

Activitatea bulionului de cultură Photorhabdus luminescens (tulpina W-14) împotriva larvelor turf grub în al doilea stadiu larvar în Metromix® s-a observat în teste realizate după cum urmează (tabelul 6). Aproximativ 50 gm de Metromix® s-a adăugat la o cupă de plastic clar de 591 ml. Metromix®, s-a înmuiat apoi cu 50 ml volum total dintr-o soluție de bulion Photorhabdus diluat 50% (v/v). Diluția bulionului brut s-a făcut cu apă, cu 50% bulion, fiind preparat prin adăugarea a 25 ml bulion brut la 25 ml apă pentru un volum total de 50 ml. O soluție 1% (g/v) de proteose peptone #3 (PP3), care este o diluție 50% a concentrației mediului normal, s-a utilizat ca un control bulion. După înmuiere, cinci larve turf grub, în al doilea stadiu larvar, s-au plasat pe vârful Metromix® umezit. O mulțime de larve turf grub în al doilea stadiu au săpat rapid în Metromix®. Acele larve care nu au săpat într-o oră, s-au îndepărtat și s-au înlocuit cu larve noi. Cupele s-au etanșat și s-au plasat într-un incubator la 28°C, la întuneric. După șapte zile, larvele s-au îndepărtat din Metromix® și s-a înregistrat mortalitatea. Activitatea s-a evaluat prin procentul mortalității relativ la control.

RO 121280 Β1

Tabelul 6

Efectul bulionului de cultură Photorhabdus luminescens (Tulpina W-14) asupra 3 larvei turfgrub după înmuiere postinfestare (Metromix®)

Tratament	Mortalitate*	Mortalitate %
Apă	7/15	47
Mediu control (1,0% g/v)	12/19	63
Bulion (50% v/v)	17/20	85

* - exprimată în raportul larvelor moarte pe insectele vii * - exprimată în raportul larvelor moarte pe insectele vii

Exemplul 4. Utilitatea insecticidului la aplicarea pe frunză

Activitatea bulionului Photorhabdus împotriva European corn borer s-a observat când 13 bulionul s-a aplicat direct pe suprafața frunzelor de porumb (tabelul 7). în aceste teste, bulionul Photorhabdus s-a diluat de 100 ori cu mediu de cultură și s-a aplicat manual la supra- 15 fața frunzelor de porumb excizate la o rată de ~6,0 μΙ/cm² pe suprafața frunzei. Frunzele s-au uscat la aer și s-au tăiat fâșii de mărime egală de aproximativ 2x2 inch. Frunzele s-au rulat, 17 s-au asigurat cu agrafe de hârtie și s-au plasat în vase mici de plastic de 1 oz cu 0,25 inch de agar 2% pe suprafața de sus, pentru a preveni umezirea. S-au plasat 20 European corn 19 borer nou apăruți pe frunzele rulate și cupa s-a sigilat. După incubare pentru 5 zile, la 27’C, la întuneric, s-au înregistrat probele, distrugerea hranei și larvele recuperate. 21

Tabelul 7 23

Efectul bulionului de cultură Photorabdus luminescens (Tulpina W-14) asupra larvei European corn borer după aplicarea preinfestării pentru a exciza frunzele de porumb 25

Tratament	Vătămare frunză	Larve recuperate	Greutate (mg)
Apă	întinsă	55/120	0,42 mg
Mediu control	întinsă	40/120	0,50 mg
Bulion (1,0% v/v)	urme	3/120	0,15 mg

Activitatea bulionului de cultură împotriva Heliothis virescens s-a demonstrat folosind 31 o metodologie a frunzei îndoite. Frunze de bumbac proaspete s-au excizat de la plante și discurile frunzei s-au tăiat cu un sfredel-dop de 18,5 mm. Discurile s-au imersat individual în 33 mediul de control (PP3) sau bulion de cultură Photorhabdus luminescens / tulpina W-14) care s-a concentrat de aproximativ 10 ori, folosind un sistem de filtrare tangențial Amicon 35 (Beverly, MA), Proflux M 12 cu un filtru de 10 kDa. S-a îndepărtat excesul de lichid și o agrafă de hârtie care întărește s-a plasat către centrul discului. Agrafa de hârtie s-a fixat apoi 37 într-un vas mic de 1,0 oz de plastic, care conține aproximativ 2,0 ml agar 1%. Aceasta servește pentru a suspenda discul frunzei deasupra agarului. După uscarea discului de frunză, 39 s-a plasat pe disc o singură larvă nou apărută și cupa s-a etanșat. Apoi, cupele s-au sigilat într-un sac de plastic și s-au plasat într-un incubator întunecos, 27°C, timp de 5 zile. La 41 această perioadă larvele și materialul din frunze rămas s-au cântărit pentru a stabili o măsură a distrugerii frunzei (tabelul 8). 43

RO 121280 Β1

Tabelul 8

Efectul bulionului de cultură Photorabdus luminescens (tulpina W-14) asupra Heliothis virescens nou apărute într-un test al frunzei de bumbac îndoită

Tratament	Discul frunzei	Greutatea finală a larvelor (mg)
Frunze control	55,7 ± 1,3	na*
Mediu control	34.0 ± 2,9	4,3 ±0,91
Bulion Photorhabdus	54,3 ± 1,4	0,00

* - neaplicabil ** - nu s-au găsit larve în viață

Exemplul 5. Partea A Caracterizarea componentelor peptidei toxină într-o analiză ulterioară, subunitățile proteinei toxină ale benzilor izolate ca în exemplul 1 s-au descompus printr-o electroforeză pe un gel de 7% SDS poliacrilamidă cu un raport 30:0,8 (acrilamidă: BIS-acrilamidă). Acest gel matrice favorizează mai bine rezoluția proteinelor mai mari. Sistemul de gel, folosit în exemplul 1 pentru a estima greutățile moleculare ale subunităților Banda 1 și Banda 2, a fost un gel 18% cu un raport 38:0,18 (acrilamidă:BIS-acrilamidă), care permite un domeniu larg al separării după mărime, dar rezoluție mai scăzută a componentelor cu greutate moleculară mai ridicată.

în această analiză, s-au descompus 10, mai degrabă decât 8, benzi de proteină.Tabelul 9 prezintă greutățile moleculare calculate ale celor 10 benzi descompuse și compară direct greutățile moleculare estimate în aceste condiții, cu cele din exemplul anterior. Nu este surprinzător că benzile adiționale s-au detectat sub condiții de separare diferite folosite în acest exemplu. Variațiile dintre estimările anterioare și cele noi ale greutății moleculare, de asemenea, sunt de așteptat să dea diferențe în condiții analitice. în analiza acestui exemplu, se crede că greutatea moleculară mai mare estimată este mai precisă decât în exemplul 1, ca un rezultat al rezoluției îmbunătățite. Totuși, acesta s-a estimat pe baza analizei SDS PAGE, care tipic nu are precizie analitică și are ca rezultat estimări de peptide care ar putea fi alterate în continuare, datorită modificărilor post- și cotranslaționale.

Secvențele aminoacide s-au determinat pentru porțiuni N-terminale ale cinci din cele 10 peptide descompuse. Tabelul 9 corelează greutatea moleculară a proteinelor și secvențelor identificate. în SEQ ID NR:2, anumite analize sugerează că pralina la restul 5 poate fi o asparagină (asn). în SEQ ID NR:3, anumite analize sugerează că resturile aminoacide la pozițiile 13 și 14 sunt ambele arginină (arg). în SEQ ID NR: 4, anumite analize sugereagă că restul aminoacid la poziția 6 poate să fie alanină (ala, fie serină (ser). în SEQ ID NR:5, anumite analize sugerează că restul aminoacid la poziția 3 poate fi acid aspartic (asp).

Tabelul 9

Estimat Exemplul 1	Estimat nou*	Lista SEQ
208	200,2 kDa	SEQ ID NR:1
184	175,0 kDa	SEQ ID NR:2
65,6	68,1 kDa	SEQ ID NR:3
60,8	65,1 kDa	SEQ ID NR:4
56,2	58,3 kDa	SEQ ID NR:5
25,1	23,2 kDa	SEQ ID NR:15

* Estimările noi se bazează pe SDS PAGE și nu se bazează pe secvențe genice. SDS PAGE nu are precizie analitică.

RO 121280 Β1

Exemplul 5. Partea B Caracterizarea componentelor peptidei toxină 1

Secvența N-terminală nouă, SEQ ID NR:15, Ala Gin Asp Gly Asn Gin Asp Tiu Phe Phe Ser Gly Asn Thr, s-a obținut prin secvențarea suplimentară a N-terminalului peptidelor 3 izolate de la toxină nativă purificată-HPLC, cum s-a descris în exemplul 5, Partea A, de mai sus. Această peptidă vine de la gena tcaA. Peptida marcată TcaAii3 începe la poziția 254 5 și continuă până la poziția 491, unde începe peptida TcaA,_(i, SEQ ID NR:4. Mărimea estimată a peptidei bazată pe secvența genei este 25,240 Da. 7

Exemplul 6. Caracterizarea componentelor peptidei toxină într-o altă analiză, complexul proteină toxină s-a reizolat din mediul de creștere 9 Photorhabdus lumiescens (după cultura fărăTween), prin realizarea unei precipitări cu sulfat de amoniu 10-80%, urmată de o etapă de cromatografie schimbătoare de ion (Mono Q) și 11 două etape de cromatografie după mărime moleculară. Aceste condiții au fost asemenea celor din exemplul 1. în timpul primei etape după mărime moleculară, s-a găsit un al doilea 13 peak biologic activ la aproape 100 ± 10 kDa. Pe baza măsurărilor proteinei, această fracțiune a fost de 20-50 ori mai puțin activă decât cea mai mare, sau inițial, peak activ la aproape 15 860 ±100 kDa (nativ). De asemenea, în timpul acestui experiment de izolare, s-a desprins un peak activ mai mic de aproape 325 ± 50 kDa care a reținut o parte considerabilă a acti- 17 vității biologice inițiale. Se crede că peak-ul 325 kDa este în legătură cu, sau derivat de la, peak-ul 860 kDa. 19

O proteină de 56 kDa s-a descompus în această analiză. Secvența N-terminală a acestei proteine este prezentată în SEQ ID NR:6. Este demn de reținut că această proteină 21 prezintă identitate și conservare semnificative cu SEQ ID NR:5 la N-terminus, sugerând că cele două pot fi codificate prin membrii separați ai familiei genei și că proteinele produse de 23 către fiecare genă sunt suficient similare ambelor pentru a fi operabile în complexul toxină insecticidă. 25

O a doua proteină evidentă 185 kDa a fost prezentă consistent în cantități comparabile cu cele ale proteinei 3 din tabelul 9, și poate fi aceeași proteină sau fragment de prote- 27 ină. Secvența N-terminală a acestei proteine 185 kDa este prezentată la SEQ ID NR: 7.

De asemenea, s-au obținut date suplimentare despre secvența aminoacidă 29 N-terminală de la proteine izolate. Nici una dintre secvențele N-terminale determinate nu pare identică proteinei identificată în tabelul 9. Alte proteine sunt prezente în preparare 31 izolată. O astfel de proteină are o greutate moleculară estimată de 108 kDa și secvența N-terminală cum se arată în SEQ ID NR:9. 33

Când materialul proteic s-a analizat după mărime în peak-ul activ de aproximativ

325 kDa, au fost observate benzi de aproximativ 51, 31, 28 și 22 kDa. Așa cum în toate 35 cazurile în care o greutate moleculară s-a determinat prin analiza mobilității electroforetice, aceste greutăți moleculare au fost supuse efectelor de eroare introduse prin diferențe de 37 tărie ionică a tamponului, diferențe de putere electroforetică și altele asemenea. Un specialist în domeniu va înțelege că valorile greutății moleculare definitivă nu pot fi determinate folosind 39 aceste metode standard și că fiecare este supusă variației. S-a presupus că proteinele acestor mărimi sunt produși de degradare ai speciilor de proteine mai mari (mărime de aproxima- 41 tiv 200 kDa), care s-au observat în complexul toxină inițial mai mare.

în final, câteva preparate au inclus o proteină care are secvența N-terminală prezen- 43 tată în SEQ ID NR:10. Această secvență are omologie puternică la proteine însoțitoare cunoscute, proteine auxiliare cunoscute a funcționa în ansamblul complexelor proteină mare. 45

Cu toate că cererile nu au putut atribui o astfel de funcționare de ansamblu proteinei identificate în SEQ ID NR: 10, aceasta a fost în concordanță cu existența complexului proteină 47

RO 121280 Β1 toxină descrisă, așa cum o proteină însoțitoare ar putea fi implicată în ansamblul ei. Mai mult, cu toate că astfel de proteine nu s-a sugerat direct că ar avea activitate toxică, această proteină poate fi importantă pentru determinarea întregii naturi structurale a toxinei proteice și, astfel, poate contribui la activitatea toxică sau durabilitatea complexului in vivo după administrare orală.

în continuare, s-a inițiat analiza stabilității complexului toxină proteică la proteinaza K. S-a determinat că după incubarea 24 h a complexului, în prezența a 10-ori exces molar de proteinaza K, activitatea s-a eliminat virtual (mortalitatea la aplicare orală în picături la aproape 5%). Aceaste date confirmă natura proteică a toxinei.

Activitatea toxică a fost reținută, de asemenea, printr-o membrană de dializă, confirmând din nou mărimea mare a complexului toxină nativă.

Exemplul 7 Izolarea, caracterizarea și secvențarea aminoacidă parțială a toxinelor Photorhabdus

Izolarea și secvențarea aminoacidă N-terminală: într-un ser de experimente desfășurate în paralel cu exemplele 5 și 6, s-a realizat precipitarea cu sulfat de amoniu a proteinelor Photorhabdus, prin ajustarea bulionului Photorhabdus, tipic 2-3 litri, la o concentrație finală fie de 10%, fie 20%, prin adăugarea lentă a cristalelor de sulfat de amoniu. După agitare timp de 1 h, la 4“C, materialul s-a centrifigat la 12000xg, timp de 30 min. Supernatantul s-a ajustat la 80% sulfat de amoniu, s-a agitat la 4°C, timp de 1 h și s-a centrifugat la 12000xg, timp de 60 min. Peletul s-a resuspendat în unu-zece volum de Na₂PO₄10 mM pH 7,0 și s-a dializat împotriva aceluiași tampon fosfat, peste noapte, la 4°C. Materialul dializat s-a centrifugat la 1.2000xg, timp de 1 h, înainte de cromatografie schimbătoare de ion.

O coloană schimb anion HR16/50 Q Sepharose (Pharmacia) s-a echilibrat cu 10 mM Na₂PO₄, pH 7,0. Peletul sulfat de amoniu centrifugat, dializat, s-a aplicat la coloană Q Sepharose la o rată de 1,5 ml/min și s-a spălat extensiv la 3,0 ml/min cu tampon de echilibrare până la densitate optică (O.D. 280), atingând mai puțin de 0,100. în continuare, s-a aplicat la coloană, fie 60 min, un gradient NaCI în domeniul de la 0 până la 0,5 M la 3 ml/min, fie o serie de etape de eluție utilizând 0,1 M, 0,4 M și în final 1,0 NaCI, timp de 60 min, fiecare. Fracțiunile s-au colectat și concentrat folosind un Centriprep 100. Alternativ, proteinele ar putea fi eluate printr-o singură spălare 0,4 M NaCI, fără eluție anterioară cu 0,1 M NaCI.

Alicote de 2 ml probe concentrate Q Sepharose s-au încărcat la 0,5 ml/min pe o coloană filtrare gel HR 16/50 Seperose 12 (Pharmacia) echilibrată cu 10 mM Na₂PO4, pH 7,0. Coloana s-a spălat cu același tampon pentru 240 min la 0,5 ml/min și 2 min probele s-au colectat. Materialul de volum liber s-a colectat și concentrat folosind un Centriprep 100. Alicote de 2 ml probe concentrate de Superose 12 s-au aplicat la 0,5 ml/min într-o coloană de filtrare gel HR 16/50 Sepharose 4B-CL (Pharmacia) cu 10 mM Na₂PO₄, pH 7,0. Coloana s-a spălat cu același tampon pentru 140 min la 0,5 ml/min și în 2 min s-au colectat probe.

Peak-ul de proteină exclus s-a supus la o a doua fracționare prin aplicarea la o coloană filtrare gel care folosește o rășină Sepharose CL-4B, care separă proteine de la ~ 30 kDa până la 1000 kDa. Această fracțiune s-a descompus în două peak-uri: un peak minor la volumul liber (>1000 kDa) și un peak major care a eluat la o greutate moleculară aparentă, la aproape 860 kDa. După o perioadă de o săptămână, probele supuse în continuare la filtrare gel au arătat apariția graduală a unui al treilea peak (aproximație 325 kDa), care pare să apară din peak-ul major, probabil prin proteoliză limitată. Biotestele realizate pe cel de-al treilea peak au arătat că peak-ul liber nu are activitate, în timp ce fracția complex toxină 869 kDa are activitate ridicată și peak-ul de 325 kDa are activitate scăzută, deși total puternică. Analiza SDS PAGE ale peak-urilor complex toxină Sepharose CL-4B de la diferite produse de fermentație a arătat două modele distincte de peptide, notate ”P și ”S. Cele

RO 121280 Β1 două modele au înregistrat diferențe în greutățile moleculare și concentrațiile componentei 1 peptidă în fracțiunile lor. Modelul S, produs mai frecvent, are 4 peptide cu greutăți moleculare ridicate (>150 kDa), în timp ce modelul P are 3 peptide cu greutăți moleculare ridicate. 3 în plus, fracția peptidă S s-a găsit a fi de 2-3 ori mai activă împotriva European Corn Borer. Această schimbare poate să se refere la variații în expresia proteinei datorate vârstei de 5 inoculare și/sau altor factori bazați pe creșterea parametrilor culturilor îmbătrânite.

Cantități în miligrame de fracțiuni complex toxină peak, determinate a fi modele de 7 peptidă P sau S, s-au supus la SDS PAGE preparativă și s-au transblotat cu TRIS-glicină (Seprabuff™ la membrane PVDF (ProBlott™, Applied Biosystems) pentru 3-4 h. Bloturile 9 s-au trimis pentru analize de aminoacid și aminoacid N-terminal, care secvențează la Harvard MicroChem și Cambridge ProChem, respectiv. Trei peptide în model S au sec- 11 vențe aminoacide unice N-terminale, comparativ cu secvențele identificate în exemplul anterior. O peptidă de 201 kDa (TcdAJ situată înaintea de SEQ ID NR:13, în cele ce urmează, 13 împarte între 33% identitate aminoacizi și 50% similaritate cu SEQ ID NR:1 (TcbA,) (Tabelul 10, în tabelul 10 liniile verticale denotă identități aminoacide și coloanele indică substituții 15 aminoacide conservative). O a doua peptidă de 197 kDa, SEQ ID NR: 14 (TcdB) a avut 42% identitate și 58% omologie cu SEQ ID NR:2 (TcaC). O a treia secvență de 205 kDa s-a denu- 17 mit TcdAjj. în plus, o secvență aminoacidă N-terminală limitată, SEQ ID NR:16 (TcbA) a unei peptide de cel puțin 235 kDa, a fost identică în homologie cu secvența aminoacidă, SEQ ID 19 NR:12, dedusă dintr-o genă donată (tcbA), SEQ ID NR:11, care conține o secvență aminoacidă dedusă corepunzând la SEQ ID NR:1 (TcbA,,). Aceasta arată că peptidă mai mare 21 235+ kDa s-a procesat proteolitic la peptidă 201 kDa, (TcbA,), (SEQ ID NR: 1), în timpul fermentației, care rezultă probabil în activarea moleculei. într-o altă secvență, secvența origi- 23 nală raportată ca SEQ ID NR:5 (TcaB„), raportată în exemplul 5 de mai sus, s-a găsit a conține un rest acid aspartic (Asp) la a treia poziție, mai degrabă decât glicină (Gly) și doi amino- 25 acizi adiționali Gly și Asp la pozițiile a 8-a și respectiv a 9-a. în alte două secvențe, SEQ ID NR:2 (TcaC) și SEQ ID NR: 3 (tCAB,), s-a obținut secvență aminoacidă adițională. Cantitatea 27 densitometrică s-a realizat folosind o probă care a fost identică preparatului S, necesitând analiză N-terminală. Această analiză a arătat că peptidele 201 kDa și 197 kDa reprezintă 29 7,0% și 7,2%, respectiv, din proteina totală colorată Coomassie briliant blue în modelul S și este prezentă în cantități similare altor peptide abundente. S-a apreciat că aceste peptide 31 pot reprezenta omologi de proteină, analog situațiilor găsite cu alte toxine bacteriene, precum diferite toxine Cryl Bt. Aceste proteine variază de la omologie 40-90% la secvența lor amino- 33 acidă N-terminală, care înconjoară fragmentul toxic.

Secvențarea aminoacidă internă pentru a facilita donarea genelor peptidei toxină, 35 secvențele aminoacide interne ale peptidelor selectate s-au obținut după cum urmează. Cantități în miligrame ale peak-ului fracțiunilor 2A, determinate a ft modele peptidă P sau S, 37 s-au supus la SDS PAGE preparativă și s-a transblotat TRIS-glicină (Seprabuff™ la membrane PVDF (ProBlott™, Applied Biosystems) pentru 3-4 h. Bloturile s-au trimis pentru ana- 39 lize aminoacide și secvențarea aminoacidul N-terminal, la Harvard MicroChem și, respectiv, Cambridge ProChem. Trei peptide menționate ca TcbA^ (care conține SEQ ID NR:1), TcdA, 41 și TcaBj (care conține SEQ ID NR:3) s-au supus digestiei tripsină prin Harvard MicroChem, urmată de cromatografia HPLC, pentru a separa peptidele individuale. Analize aminoacide 43 N-terminale s-au realizat pe fragmente de peptidă selectate triptic. Două peptide interne s-au secvențat pentru peptide TcaBj (peptidă 205 kDa) menționată ca TcaB-PTIH (SEQ ID 45 NR:17) și TcaB_rPT79 (SEQ ID NR:18). S-au secvențat două peptide interne pentru peptidă TcaBj (peptidă 68 kDa) menționată ca TcaBj-PT158 (SEQ ID NR:19) și TcaBj-PT108 (SEQ 47 ID NR:20). S-au secvențat patru peptide interne pentru peptidă TobA* (peptidă 201 kDa) menționată ca TCBAII-TP103 (SEQ ID NR:21), TcbAjjPT56 (SEQ ID NR:22), TcbA, PT81(a) 49 (SEQ ID NR:23) și TcbAjjPT81 (b) (SEQ ID NR:24).

RO 121280 Β1

Tabelul 10 Secvențe aminoacide N-terminale

201 kDa (identitate 33% & similaritate 50% la SEQ ID NR:1)

LIGYNNQFSG'A SEQIDNR:13

FIQGYSDLFGN-A SEQ ID NR:1

197 kDa (identitate 42% & similaritate 58% SEQ ID NR:2)

MQNSQTFSVGEL SEQIDNR:14

MQDSPEVSITTL SEQ ID NR.2

Exemplul 8. Construcția unei bănci cosmid a ADN genomic Photorhabdus luminescens W-14 și cercetarea acesteia pentru a izola gene care codifică peptide care cuprind prepararea proteinei toxice

Constituind o condiție pentru producerea proteinelor toxice insectă Photorhabdus în gazde heteroloage și pentru alte utilizări, este necesară izolarea și caracterizarea genelor care codifică aceste peptide. Acest obiectiv s-a urmărit în paralel. O abordare, descrisă mai târziu, s-a bazat pe utilizarea anticorpilor monoclonali și policlonali apăruți împotriva toxinei purificate, care s-au folosit apoi pentru a izola clone dintr-o bancă de expresie. O altă abordare, descrisă în acest exemplu, se bazează pe utilizarea datelor secvenței aminoacide N-terminale și interne, pentru a desemna oligonucleotide degenerate pentru utilizare în amplificare PCR. Fiecare metodă poate fi utilizată pentru a identifica clone ADN care conțin gene care codifică-peptidă, astfel încât să permită izolarea genelor respective și determinarea secvenței lor ADN bază.

IZOLARE ADN GENOMIC: Photorhabdus luminescens tulpina W-14 (ATCC număr de acces 55397) a crescut pe agar 2% proteose peptone #3 (Difco Laboratories, Detroit, Ml) și competența toxină insecticidă s-a menținut prin repetarea biotestului după transformare, folosind metoda descrisă în exemplul 1 de mai sus. O cultură de 50 ml agitată s-a produs într-un balon cu șicane de 175 ml în mediu 2% proteose peptone #3, crescut la 28°C și 150 rpm, pentru aproximativ 24 h. Din această cultură, 15 ml s-au peletat și congelat în mediul său, la -20’0, până când s-a dezghețat pentru izolarea ADN-ului. Cultura dezghețată s-a centrifugat (700xg, 30 min) și s-a îndepărtat materialul mucopolizaharid portocaliu care plutește. Materialul celular rămas s-a centrifugat (25000xg, 15 min) la pelet, celulele bacteriale și mediul s-au îndepărtat și înlăturat.

S-a izolat ADN genomic printr-o adaptare a metodei CTAB descrisă în secțiunea 2.4.1 din Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 1994) (modificată pentru a include o sare șoc și cu toate volumele crescute de 10 ori). Celule bacteriene peletate s-au resuspendat în tampon TE (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8,0) la un volum final de 10 ml, apoi s-au adăugat 12 ml de NaCI 5M; acest amestec s-a centrifugat 20 min, la 15000xg. Peletul s-a resuspendat în 5,7 ml TE și 300 ml SDS 10% și 60 ml proteinază K 20 mg/ml (Gibco BRL Products, Grand Island, NY; în apă distilată sterilă) s-au adăugat la suspensie. Acest amestec s-a incubat la 37°C, pentru o oră; apoi s-au adăugat aproximativ 10 mg lizozimă (Worthington Biocgemical Corp., Freehold, NJ). După încă 45 min, s-au adăugat 1 ml de NaCI 5M și 800 ml de soluție CTAB/NaCI (10% g/v CTAB,

RO 121280 Β1

0,7 MnaCI). Acest preparat s-a incubat 10 min, la 65C, apoi s-a agitat blând și s-a incubat 1 suplimentar și agitat pentru aproximativ 20 min, pentru a sprijini clarificarea materialului celular. S-a adăugat un volum egal de soluție cloroform/alcool izoamilic (24:1, v/v), s-a ames- 3 tecat blând și s-a centrifugat. După două extracții cu un volum egal de PCI (fenol/cloroform/ alcool izoamilic; 50:49:1, v/v/v; s-a echilibrat cu IM Tris-HCI, pH 8,0; Intermountain Scientific 5 Corporation, Kaysville, UT), a precipitat ADN-ul cu 0.6 volume de izopropanol, ADN-ul precipitat s-a îndepărtat blând cu o baghetă de sticlă, s-a spălat de două ori cu 70% etanol, s-a 7 uscat și s-a dizolvat în 2 ml STE (10 raM Tris-HCI pH 8,0, 10 mM NaCI, 1 mM EDTA). Acest preparat a conținut 2,5 mg/ml ADN, cum s-a determinat prin densitate optică la 260 nm (de 9 exemplu, OD₂₆₀).

Domeniul mărimii moleculare al ADN genomic izolat s-a evaluat pentru potrivire la 11 construirea băncii. Analiza gel CHSF s-a realizat în geluri de agaroză 1,5% (Seakem® LE, FMC BioProducts, Rockland, ME) cu tampon 0,5xTBE (44,5 mM Tris-HCI pH 8,0,44,5 mM 13 H₃BO₃, 1 mM EDTA) pe un aparat BioRad CHEF-DRii cu un Tulseware 760 Switcher (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, CA). Parametrii de funcționare sunt: timp inițial A, 15 3 s; timp final A, 12 s; 200 volți; temperatura de funcționare, 4-18°C; perioada de funcționare,

16,5 h. Colorarea bronură de etidiu și examinarea gelului sub lumină ultravioletă au arătat 17 că ADN-ul s-a întins de la 30-250 kbp în mărime.

CONSTRUCȚIA BĂNCII: O digestie Sau3 A parțială s-a făcut acestui preparat ADN 19 genomic Photorhabdus. Metoda s-a bazat pe secțiunea 3.1.3 a Ausubel (supra). Adaptările au inclus reacții de funcționare la scară mică, sub diferite condiții, până când s-au obținut 21 rezultate aproape optime. S-au realizat câteva reacții la scară mare, cu diferite condiții, rezultatele s-au analizat pe geluri CHEF și numai prepararea la scară mare, cea mai bună, s-a 23 continuat. în cazul optim, 200 pg ADN genomic Photorhabdus s-au incubat eu 1,5 unități de Sau3A 1 (New England Biolabs, NEB, Beverly, MA) pentru 15 min, în volum total de 2 ml 25 tampon 1 x NEB 4 (suplimentat ca 10x de către producător). Reacția s-a stopat prin adăugarea a 2 ml PCZ și centrifugare la 8000xg, timp 10 min. S-au adăugat la supematant 200 pl 27 de NaCI 5M, plus 6 ml gheață-etanol rece. Acest preparat s-a răcit timp de 30 min, la -20’C, apoi s-a centrifugat la 12000xg timp de 15 min. Supernatantul s-a îndepărtat și precipitatul 29 s-a uscat într-un cuptor cu vid, la 40’C, apoi s-a resuspendat în 400 μΙ STE. Testul spectrofotometric a indicat aproximativ 40% recuperare a ADN-ului absorbit. ADN-ul digerat s-a 31 fracționat după mărime pe un gradient de sucroză, conform secțiunii 5.3.2 a CPMB (op.cit.).

S-a preparat un gradient linear sucroză 10% la 40% (g/v) cu un gradient făcut în tuburi 33 Ultra-Clear™ (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) și proba ADN s-a stratificat la vârf.

După centrifugare, (26ppp rpm, 17 h, rotor Beckman SW41,20’C), fracțiunile (aproape 35 759 μΙ) s-au tras în jos de la vârful gradientului și s-au analizat prin electroforeză pe gel CHEF (cum s-a descris mai devreme). S-au selectat fracțiunile conținând fragmente Sau3A 37 1 în domeniul de mărime 20-40 kpb și s-au precipitat printr-o modificare (cantități ale tuturor soluțiilor crescute aproximativ de 6,3-ori) ale metodei descrise în secțiunea 5.5. a lui Ausubel 39 (supra.). După precipitare, peste noapte, s-a colectat ADN-ul prin centrifugare (17000xg, min), s-au uscat, s-au redizolvat în TE, s-au depozitat într-un volum total de 80 μΙ și repre- 41 cipitat cu încă 8 μΙ acetat de sodiu 3M și 220 μΙ etanol. Peletul colectat prin centrifugare ca mai sus s-a resuspendat în 12 μΙ TE. S-a determinat concentrația ADN-ului prin fluorometrie 43 Hoechst 33258 dye (Polysciences, Inc., Warrington, PA)într-un fluorimetru HoeferTKOIOO (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA). S-au recuperat aproximativ 2,5 pg ADN 45 fracționat după mărime.

S-au digerat 20 pg cosmid pWe 15 ADN (Stratagene, La Joi la, CA) la completare cu 47

100 unități enzimă de restricție BamHI (NEB) în tamponul fabricantului (volum final 200 μΙ,

RO 121280 Β1

37C, o oră). Reacția s-a extras cu 100 pl PCI și s-a precipitat ADN din faza apoasă, prin adiția a 20 ui acetat de sodiu 3M și 550 ui etanol absolut -20’C. După 20 min, la -70°C, s-a colectat ADN prin centrifugare (17000xg, 15 min), s-a uscat sub vid și s-a dizolvat în 180 pl Tris-HC110 mM, pH 8,0. La aceasta s-au adăugat 20 μΙ tampon 10x CIP (100 mM Tris-HCI, pH 8,3; 10 mM ZnCI₂; 10 mM MgCI₂) și 1 μΙ (0,25 unități) de fosfatază alcalină intestinală de vițel 1:4 (Boehringer mannheim Corporation, Indianapoli, IN). După 30 min, la 370°C, s-au făcut următoarele adiții: 2 μΙ 0,5 m EDTA, pH 8,0; 10 μΙ 10% SDS; 0,5 μΙ de proteinază K 20 mg/ml (ca mai sus), urmat de incubare la 55°C, timp de 30 min. După extracțiile secvențiale cu 100 μΙ de PCI și 100 μΙ fenol (Intermountain Scientific Corporation, echilibrat cu Tris-HC11 M, pH 8,0), s-a precipitat ADN-ul defosforilat prin adiția a 72 μΙ acetat de amoniu

7,5 M și 550 μΙ etanol -20°C, incubare pe gheață pentru 30 min și centrifugare ca mai sus. ADN-ul peletat s-a spălat o dată cu 500 μΙ -20°C 70%, s-a uscat sub vid și s-a dizolvat în 20 μΙ de tampon TE.

Ligarea fragmentelor Sau3A 1 fracționate după mărime la vectorul pWE15 digerat BamH 1 și fosfatazat s-a realizat folosind ligaza T4 (NEB) prin modificarea (adică, folosirea unui tampon de ligare 10X premixat furnizat de producător) protocolului în secțiunea 3,33 a lui Ausubel. Ligarea s-a realizat peste noapte, într-un volum total de 20 μΙ la 15°C, urmată de depozitare la -20°C.

μΙ din reacția de ligare ADN cosmid, conținând aproximativ 1 pg ADN, s-au împachetat în bacteriofag lambda, folosind un extract de împachetare comercial (Gigapack® III Gold Packaging Extract, Startagene), urmând instrucțiunile fabricantului. Preparatul de împachetare s-a depozitat la 4°C, până la folosire. Preparatul cosmid împachetat s-a utilizat pentru a infecta celule Escherichia coli XLI Blue MR (Stratagene) conform protocoalelor Gigapack® III Gold (Titerinh the Cosmid Library), după cum urmează. Celule XLI Blue MR s-au crescut în mediu LB (g/L:Bacto-triptonă, 10; extract Bacto-drojdii, 5; agar-Bacto, 15; NaCI, 5; [Difco Laboratories, detroit, Ml]) care conține 0,2% (g/v) maltoză plus 10 mM MgSO₄, la 37°C. După 5 h de creștere, celulele s-au peletat la 700xg (15 min) și s-au resuspendat în 6ml 10 mM MgSO₄. Densitatea de cultură s-a ajustat cu 10 mM MgSO₄ la OD₆₀₀=0;5. Banca cosmid împachetată s-a diluat 1:10 sau 1:20 cu mediu steril SM (0,1 M NaCI, 10 mM MgSO₄,50 mM Tris-HCI pH 7,5,0,01 % g/v gelatină) și 25 μΙ preparat diluat s-a amestecat cu 25 μΙ celule XL1 Blue MR diluate. Amestecul s-a incubat la 25’C, pentru 30 min (fără agitare), apoi s-au adăugat 200 μΙ bulion LB și incubarea a continuat aproximativ o oră, agitând blând, ocazional. Alicotele acestei culturi (20-40 μΙ) s-au împrăștiat pe plăci de agar LB care conțin 100 mg/l ampicilină (adică, LB-Amp₁₀₀) și s-au incubat peste noapte, la 37°C. Pentru a depozita banca fără amplificare, coloniile individuale s-au adunat și s-au inoculat în godeurile individuale ale plăcilor microgodeuri sterile cu 96-godeuri; fiecare godeu care conține 75 μΙ Terrific Broth (mediu TB: 12 g/l Bacto-triptonă, 24 g/l extract de Bacto-drojdie, 0,4% v/v glicerol, 17 mM KH₂PO₄, 72 mM K₂HPO₄) plus 100 mg/l ampicilină (adică, TB-Amp₁₀₀) și s-au incubat (fără agitare) peste noapte, la 37°C. După replicarea plăcii de 96-godeuri într-o placă copie, s-au adăugat la placă 75 μΙ/godeu TB sterilizat prin filtrare:glicerol (1:1, v/v; cu sau fără 100 mg/l ampicilină), s-a scuturat sumar la 100 rpm și s-a închis cu Parafilm® (American Național Can, Greenwich, CT) și s-au plasat la -70°C, într-un congelator pentru depozitare. Plăcile copie s-au crescut și s-au procesat identic cu placa mașter. S-a preparat un total de 40 de asemenea plăci mașter (și copiile lor).

CERCETAREA BĂNCII CU PROBE ADN RADIOMARCATE: Pentru a prepara filtre colonie pentru testarea cu probe radioactive marcate, zece plăci de 96 godeuri ale băncii s-au dezghețat la 25°C (reper vârf la temperatura camerei). Un instrument de acoperire șablon cu 96 vârfuri s-a folosit pentru a inocula o placă copie cu 96 godeuri, nouă, care conține

RO 121280 Β1 μΙ/godeu de TB-Amp₁₀₀. Placa copie s-a crescut peste noapte (staționar) la 37°C, apoi s-a 1 scuturat timp de 30 min, la 100 rpm la 37’C. Un total de 800 colonii a fost reprezentat în aceste plăci copii, datorită noncreșterii unor izolate. Instrumentul șablon s-a folosit pentru a 3 inocula amprente ale matricii de 96 godeuri pe membrane de naylon (0,45 μ, 200x250 mm) Magna NT (MSI, Westboro, MA) care fuseseră plasate pe LB-AmplOO solid (100 ml/vas) în 5 vase de plastic Bio-test (Nune, 243x243x18 mm; Curtin Mathison Scientific, Inc., Wood Dale, IL). Coloniile s-au crescut pe membrane la 37°C, timp de aproximativ 3h. 7

O colonie de control pozitivă (o clonă bacterială care conține un insert secvență GZ4, vezi mai jos) s-a crescut pe o membrană Magna NT (Nune, 0,45 μ, cerc 82 mm) separată 9 pe mediu LB suplimentat cu 35 mg/l cloramfenicol (adică, LB-Cam₃₅) și s-au procesat de-a lungul membranelor coloniei băncii. Coloniile bacteriale de pe membrană s-au lizat și ADN-ul 11 s-a denaturat și s-a neutralizat în conformitate cu protocolul luat de la Genius™ System User'sGuide Versiunea 2.0 (BoehringerMannheim, Indianapolis, IN). Membranele s-au pla- 13 sat cu partea cu colonia deasupra pe o hârtie de filtru îmbibată cu 0,5 N NaOH plus 1,5 M NaCI, timp de 15 min, pentru a denatura, și s-au neutralizat pe o hârtie de filtru îmbibată cu 15 IM Tris-HCI pH 8,0 1,5 M NaCI, timp de 15 min. După crossIinking-UV folosind un set Stratagene UV Stratalinker pe auto crosslink, membranele s-au depozitat la 25”C, până la 17 utilizare. Membranele s-au netezit în fâșii care conțin amprente duplicat ale unei singure plăci de 96-godeuri, apoi s-a spălat extensiv prin metoda secțiunii 6.4.1 în CPMB (op.cit.): 3 h, la 19 25°C, în 3x SSC, 0,1% (g/v) SDS, urmat de o oră, la 65°C, în aceeași soluție, apoi s-a clătit în 2x SSC în prepararea pentru etapa de hibridizare (20x SSC= 3M NaCI, 0,3 M citrat de 21 sodiu, pH 7,0).

Amplificarea unui fragment genomic specific al genei tcaC 23

Bazat pe secvența aminoacidă N-terminală, s-a determinat pentru fracția peptidă

TcaC purificată [descris aici ca SEQ ID NR:2], un depozit de oligonucleotide degenerate 25 (rezervă S4Psh) s-a sintetizat prin chimie standard p-cianoetil pe un Applied BioSystem ABI394 DN A/RN A Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City, CA). Oligonucleotidele s-au depro- 27 tejat 8 h, la 55”C, s-au dizolvat în apă, s-au determinat cantitativ prin măsurători de spectrofotometrie și s-au diluat pentru utilizare. Acest depozit corespunde secvenței aminoacide 29 N-terminale determinată peptidei TcaC.

Secvența aminoacidă determinată și secvența ADN degenerată sunt date mai jos, 31 unde A, C, G și T sunt baze ADN standard și I reprezintă inozină:

Aminoacid Met Gin Asp Ser Pro Glu Val

S4Psh 5' ATG CA(A/G) GA(T/C) (T/A)(C/G)(T/A) CCI GA(A/G) GT 3'35

S-a sintetizat alt set de oligonucleotide degenerate (depozit P2.3.5R), care reprezintă complementul catenei care codifică pentru secvența aminoacidă determinată în SEQ ID 37 NR:17:

Amino-39 acid Ala Phe Asp lle Asp Asp Val

Codonii 5' GCN TT(T/C)AA(T/C) AT(A/T/C) GA(T/C) GA(T/C) GT 3'41

P2.3.5R 3' CG(A/C/G/T) AA(A/G) TT(A/G) TA(T/A/G) CT(A/G) CT(A/G) CA 5'

Aceste oligonucleotide s-au folosit ca primeri în Polymerase Chain Reactions (PCR®, 43 Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ), pentru a amplifica fragmentul ADN specific din ADN genomic preparat din tulpila W-14 Photorhabdus (vezi mai sus). O reacție tipică (50 μΙ) 45 care conține 125 pmol din fiecare depozit primer P2Psh și P2.3.5R, 255 ng șablon ADN genomic, 10 nmol din fiecare din dATP, dCTP, dGTP și dTTP, tampon PCR IX GeneAmp® și 47

2,5 unități de ADN polimerază AmpliTaq® (ambele de la Roche Molecular Systems; tampon

RO 121280 Β1

10X GeneAmp® este 100 mM Tris-HCI pH 8,3,500 raM Kcl, 0,01 % g/v gelatină). Amplificările s-au realizat într-un Perkin ElmerCetus DNAThermalCycler(Perkin Elmer, FosterCity, Ca), folosind 35 cicluri de 94”C (1,0 mim), 55’C (2,0 min), 72°C (3,0 min), urmat de o perioadă de extinsie de 7,0 min, la 72°C. Produsele de amplificare s-au analizat prin electroforeză prin 2% g/v NuSieve® 3:1 agaroză (FMC Buo Products) în tampon TEA (40 mM Tris-acetat, 2mM EDTA, pH 8,0). Un produs specific, de mărime estimată 250 bp, s-a observat la numeroase alte produse amplificate prin bromură de etidiu (0,5 pg/ml), colorarea gelului și examinarea sub lumină ultraviolet.

Regiunea gelului care conține un produs de aproximativ 250 bp s-a excizat și un dop mic (0,5 mm dia.) s-a îndepărtat și s-a utilizat pentru a alimenta matrița pentru amplificarea PCR (40 cicluri). Reacția (50 pl) a conținut aceleași componente ca mai sus, minus matrița ADN genomic. După amplificare, capetele fragmentelor s-au teșit și s-au fosforilat prin incubare la 25‘C, pentru 20 min, cu o unitate ADN polimerază T4 (NEB), 1 nmol ATP și 2,15 unități de T4 kinază (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ).

Fragmentele ADN s-au separat din primeni reziduali prin electroforeză prin agaroză 1% g/v GTG® (FMC) în TEA. S-a excizat o felie de gel care conține fragmente de mărime aparentă 250 bp și s-a extras ADN-ul folosind un kit Qiaex (Qiagen Inc., Chatsworth, CA).

Fragmentele ADN extrase s-au ligat la vectorul plasmid pBC KS(+) (Stratagene) care a fost digerat la completare cu enzima de restricție Sma 1 și s-a extras într-un mod similat celui descris pentru ADN pW15, de mai sus. O reacție de ligare tipică (16,3 μΙ) a conținut 100 ng digest ADN pBC KS(+), 70 ng ADN fragment de 250 bp, 1 nmol [Co(NH₃)₆]CI₃ și 3,9 unități Weiss ANDIigază T4 (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA), în 1X tampon de ligare (50 mM Tris-HCI), pH 7,4; 10 mM MgCI₂; 10 mM ditiotreitol; 1 mM spermidină, 1 mM ATP, 100 mg/ml albumină serică bovină). După incubare peste noapte, la 14°C, produsele ligate s-au transformat la îngheț, celule competente Escherichia coli DH5a (Gico BRL) conform recomandărilor furnizorilor și s-au acoperit pe plăci LB-Cam₃₅, conținând IPTG (119 pg/ml) și X-gal (50 pg/ml). S-au străpuns colonii albe independente și s-a preparat ADN plasmidul, printr-o metodă modificată alcalinizare/precipitare PEG (Prism™ Ready Reaction Dyedeoxy™ Terminator Cyscle Sequencing Kit Protocols; ABI/Perkin Elmer). Secvența nucleidică a ambelor catene ale ADN insert s-au determinat folosind primeri T7 [pBC KS(+) baze 601-623:TAAAACGACGGCCAGTGAGCGCG)șiLacZ[pBCKS(+)baze792-816: ATGACCATGATTACGCCAAGCGCGC) și protocoale de alimentare cu kit de secvențare PRISM™ (ABI/Perkin Elmer). Dideoxiribonucleotidecolorant-terminatornonîncorporates-au îndepărtat prin trecere prin coloane Centri-Sep 100 (Princeton Separations, Inc., Adelphia, NJ), conform instrucțiunilor fabricantului. Secvența ADN s-a obținut prin analiza probelor pe un ABI Model 373 A DNA Sequencer (ABI/Perkin Elmer). Secvențele ADN ale celor două izolate, GZ4 și HB14, au rezultat așa cum sunt prezentate în fig. 1.

Această secvență ilustrează caracteristicile următoare: 1) bazele 1 -20 reprezintă una din cele 64 secvențe posibile ale oligonucleotidelor degenerate S4Psh, ii) secvența aminoacizilor 1 -3 și 6-12 corespunde exact celei determinate pentru N-terminus ale TcaC (descrisă ca SEQID NR:2), iii) al patrulea aminoacid codificat este un rest cisteină mai degrabă decât serină. Această diferență este codificată în degenerare pentru codonii serină (vezi mai sus), iv) al cincelea aminoacid codificat este pralină, corespunzător secvenței TcaC N-terminal dat ca SEQ ID NR:2, v) bazele 257-276 codifică una dintre cele 192 secvențe posibile desemnate în depozitul degenerat, vi) codonul terminare TGA introdus la bazele 268-270 este rezultatul complementarității la constructul degenerat în depozitul oligonucleotidic la poziția corespunzătoare și nu indică un cadru de citire micșorat pentru gena corespunzătoare.

RO 121280 Β1

Marcarea probei peptidă tcaC specific-genă. 1

Fragmente AND care corespund celor 276 date de mai sus s-au amplificat (35 cicluri) prin PCR® într-un volum de reacție de 100 pl, folosind 100 pmol fiecare dintre primerii P2Psh 3 și P2.3.5T, 10 ng de plasmizi GZ4 și HB14 ca matrițe, 20 nmol fiecare dintre dATP.dCTP, dGTOP și dTTP, 5 unități ADN polimerază AmpliTAq® și 1X concentrație tampon GeneAmp®, 5 sub aceleași regimuri de temperatură cum s-a descris mai sus. Produsele de amplificare s-au extras dintr-un gel agaroză 1% GTG® prin kit Qiaex și s-a determinat cantitativ prin 7 fluorometrie.

Produsele de amplificare extrase din matrița plasmid HB14 (aproximativ 400 ng) s-au 9 divizat în cinci alicote și s-au marcat cu ³²P-dCTP, folosind High Prime Labeling Mix (Boehringer Mannheim), conform instrucțiunilor producătorului. Radioizotopul neîncorporat 11 s-a îndepărtat prin trecere prin NucTrap® Probe Purification Clumns (Stratagene), conform instrucțiunilorfurnizorului. Activitatea specifică a produsului ADN marcat s-a determinat, prin 13 numărare scintilație, a fi 3,11 x 108 dpm/pg. Acest ADN marcat s-a utilizat pentru a proba membrane preparate dintre cei 800 membrii ai băncii genomice. 15

CERCETAREA CU O PROBĂ PEPTIDĂ-TCAC SPECIFIC GENĂ. Proba HB14 radiomarcată s-a fiert aproximativ 10 min, apoi s-a adăugat soluție hib minimal. [Notă: 17

Metoda minimal hyb este luată de la un protocol CERES; Restriction Fragment Length Polymorphism Laboratory Manual version 4,0, secțiuni 4-40 și 4.47; CERES/NPI, Salt Lake 19 City, UT. NPI, care acum este scos din uz, cu succesorii săi care funcționează ca Linkage Gebetics], soluția minimal hyb conține 10% g/v PEG (polietilen glicol, greutate moleculară 21 aproximativ 8000), 7% g/v SDS; 0,6X SSC, tampon 10 mM fosfat de sodiu (de la un stoc IX care conține 95 g/l NaH₂PO₄«1H₂O și 84,5 g/l Na₂HPO₄«7H₂O), 5 mM EDTA și 100 mg/ml 23 ADN denaturat din spermă de somon. Membranele s-au șters, s-au uscat scurt, apoi, fără prehibridizare, 5 fâșii ale membranei s-au plasat în fiecare din cele două cutii de plastic care 25 conțin 75 ml de minimal hyb și 2,6 ng/ml probă HB14 radiomarcat. Acesta s-a incubat peste noapte cu agitare ușoară (50 rpm), la 60’C, în soluție de spălare minimal hyb (0,25X SSC, 27 0,2% SDS), urmată de două spălări de 30 min, cu scuturare ușoară la 60’C în aceeași soluție. Filtrele s-au plasat pe hârtie acoperită cu Saran Wrap® (Dow Brands, Indianapolis, IN), 29 într-o casetă autoradiografică cu lumină densă și s-a expus la film raze X X-Omat (Kodak, Rochester, NY) cu doi amplificatori DuPont Cronex Lightning-Plus CI (Sigma Chemical Co., 31 St. Louis, MO), pentru 4 h, la -70°C. Pe developare (proceduri fotografice standard), s-au evidențiat semnale semnificative în ambele replicate, pe un fundal intens al semnalelor slabe 33 mai neregulate. Filtrele s-au spălat din nou pentru aproape 4 h la 68GC în soluție de spălare minimal hyb și s-au plasat apoi, din nou, în casete, iar filmul s-a expus peste noapte la 35 -70°C. S-au identificate 12 pozitive posibile datorate semnalelor puternice pe ambele amprente colonii duplicat 96-godeuri. Nu s-a văzut nici un semnal cu membrane negative de 37 control (colonii ale celulelor XLI Blue MR care conțin pWE 15), dar s-a observat un foarte puternic semnal cu membrane pozitive de control (celule DH5a care conțin GZ4 izolat al pro- 39 dusului PCR), care s-a procesat în mod curent cu probe experimentale. Cele 12 colonii putative hibridizare-pozitive s-au recuperat de la plăcile înghețate 96-godeuri ale băncii și s-au 41 crescut peste noapte la 37°C, pe mediu solid LB-AmplOO. Pentru hibridizare, s-au preparat două seturi de membrane (Magna NT nylon, 0,45 μ). Primul set s-a preparat prin plasarea 43 unui filtru direct în coloane pe o bucată placă rămasă, apoi s-a îndepărtat cu celule bacteriene aderente și s-a procedat ca mai jos. Filtrele celui de-al doilea set s-au plasat pe plăci 45 care conțin mediu LB-Amp₁₀₀, apoi s-au inoculat cu celule de transferare de la bucata placă rămasă la filtre. După creșterea peste noapte, la 37°C, filtrele s-au îndepărtat de pe plăci și 47 s-au procesat.

RO 121280 Β1

Celulele bacteriene de pe filtre s-au uzat cu ADN denaturat prin plasarea fiecărui filtru cu colonia în sus la un depozit (1,0 ml) de 0,5 N NaOH, într-o placă de plastic, pentru 3 min. Filtrele s-au șters uscat pe o hârtie prosop, apoi procesul s-a repetat cu NaOH 0,5 N proaspăt, După ștergere uscată, filtrele s-au neutralizat prin plasarea fiecăreia pe un depozit 1,0 ml de Tris-HCI IM, pH 7,5, timp de 3 min, s-au șters uscat și s-au reneutralizat cu tampon proaspăt. Aceasta a fost urmată de două îmbibări similare (5 min, fiecare) pe depozite cu 0,5 M Tr/s-HCI, pH 7,5 plus 1,5 M NaCI. După ștergere uscată, ADN-ul s-a crosslink-at UV pe filtru (ca mai sus) și filtrele s-au spălat (25°C, 100 rpm) în aproape 100 ml de 3X SSC plus 0,1% (g/v) SDS (4 ori, 30 min, fiecare cu soluție proaspătă pentru fiecare spălare). Apoi, s-au plasat într-un volum minim de soluție de prehibridizare [6X SSC plus 1 % g/v fiecare de Ficoll 400 (Pharmacia), polivinilpirolidonă (greutate moleculară medie 360000; Sigma) și albumină serică bovină Fracția V; (Sigma)] pentru 2 h, la 65°C, 50 rpm. Soluția de prehibridizare s-a îndepărtat și s-a plasat cu proba BH14 ³²P-marcat care a fost salvat de la hibridizarea anterioară a membranelor băncii și care s-au denaturat la 95°C, timp de 5 min. Hibridizarea s-a realizat la 60°, timp de 16 h, cu scuturare la 50 rpm.

După îndepărtarea soluției probei marcate, membranele s-au spălat de 2 ori la 25°C (50 rpm, 15 min) în 3X SSC (aproape 150 ml fiecare spălat). Apoi s-au spălat timp de 3 h, la 68°C (50 rpm) în 0,25X SSC plus 0,2% SDS (soluție de spălare minimal hyb) și s-au expus la film raze X, așa cum s-a descris mai sus, pentru 1,5 la 25°C (cercetări neaplicate). Această expunere a demonstrat semnale foarte puternice de hibridizare la izolații cosmid 22G12, 25A10, 16A5 și 16B10 și un semnal foarte slab cu izolatul cosmid 8B10. Nu s-a văzut nici un semnal la coloniile (pWE15) control negativ și s-a văzut un semnal foarte puternic cu membrane control pozitive (celule DH5a care conțin izolatul GZ4 al produsului PCR), care a fost procesat în mod curent cu probe experimentale.

AMPLIFICAREA UNUI FRAGMENT GENOMIC SPECIFIC AL GENEI TCAB. Pe baza unei secvențe aminoacide N-terminale determinată pentru fracția peptidă TcaBj purificată (descrisă aici ca SEQ ID NR:3), s-a sintetizat un depozit al oligonulceotidelor degenerate (depozit P8F), așa cum s-a descris pentru peptida TcaC. Secvența aminoacidă determinată și secvența ADN degenerată corespunzătoare sunt date mai jos, unde A, C, G și T sunt baze ADN standard și I reprezintă inozină:

Amino acid Leu Phe Thr Gin Thr Leu Lys Glu Ala Arg

P8F 5' TTT ACI CA (A/G) ACI (C/T)TI AAA GAA GCI (A/C)G3* (C/T)TI

Un alt set de oligonucleotide degenerate s-au sintetizat (depozit P8.108.3R), reprezentând complementul catenei care codifică pentru secvența aminoacidă a peptidei interne TcaB;PT108 (descrisă aici ca SEQ ID NR:20):

Amino acid Met Tyr Tyr Oe Gin Ala Gin Gin

Codon ATG TA(T/C) TA(T/C) AT(T/C/A) CA(A/G) GC(A/C/G/T) CA(A/G) CA(A/G) p8.108.3R 3 AT(A/G) AT(A/G) TA(A/G/T) GT(T/C) CGI GT(T/C) GT 5'

TAC

Aceste oligonucleotide s-au folosit ca primeri pentru PCR® folosind HotStart 50 Tubes™ (molecular Bio-products, Inc., San Diego. CA) pentru a amplifica un fragment ADN specific de la ADN genomic preparat de la Photorhabdus tulpina W-14 (vezi mai sus). O reacție tipică (50 pl) a conținut (linia de jos) 25 pmol din fiecare primer depozit P8F și P8.108.3R cu 2 nmol fiecare dintre dATP, dCTP, dGTP, și dTTP, în tampon IX GeneAmp® PCR și (linie vârf) 230 ng ADN matriță genomic, 8 nmol fiecare dintre dATP, dGTP și dTTP

RO 121280 Β1 și 2,5 unități ADN polimerază AmpliTaq®, în tampon IX GeneAmp®PCR. Amplificarea s-a 1 realizat prin 35 cicluri, așa cum s-a descris peptru peptida TcaC. Produsele de amplificare s-au analizat prin electroforeză prin agaroză 0,7% g/v SeaKem® LE (FMC) în tampon TE. S-a 3 observat un produs specific de mărime estimată de 1600 bp.

S-au depozitat patru astfel de reacții și ADN amplificat s-a extras dintr-un gel 1,0% 5

SeaKem® LE prin kit Qiaex, așa cum s-a descris pentru peptida TcaC. ADN-ul extras s-a utilizat direct ca matriță pentru determinarea secvenței (PRISM™ Sequencing Kit), folosind 7 depozitele de primeri P8F și P8.108.3R. Fiecare reacție a conținut aproape 100 ng ADN matriță și 25 pmol dintr-un depozit primerși s-a procesat conform protocoalelor standard, așa 9 cum s-a descris pentru peptida TcaC. O analiză a secvenței derivate de la extinsia primerilor P8F demonstrează că secvența ADN este scurtă (și secvența aminoacidă codificată):11

GAT GCA TTG CTT GCT

Asp Ala Leu (Val) Ala13 care corespunde la o porțiune a secvenței peptidei N-terminale descrisă ca SEQ ID NR:3 (TcaB,).15

Marcarea probei peptidă-tcaB, specifică genă

Aproximativ 50 ng ADN fragment TcaBj purificat pe gel s-a marcat cu ³²P-dCTP cum 17 s-a descris mai sus și radioizotopii neîncorporați s-au îndepărtat prin trecere prin NICK Column® (Pharmacia). Activitatea specifică a ADN s-a marcat de 6 x 109 dpm/pg. Acest ADN 19 marcat s-a folosit pentru a testa membranele colonii preparate de la membranele băncii genomice care s-au hibridizat la proba specifică peptidă-TcaC. 21

Membranele care conțin 12 colonii identificate în cercetarea băncii probă-TcaC (vezi mai sus) s-au îndepărtat de marcajul specific-TcaC radioactiv, prin fierbere de două ori timp 23 de aproximativ 30 min, de fiecare dată într-un litru de 0,1 X SSC plus 0,1% SDS. îndepărtarea radiomarcajului s-a verificat cu o expunere pe film de 6 h. Membranele îndepărtate s-au 25 incubat apoi cu proba specific-peptidă TcaBt preparată mai sus. ADN marcat s-a denaturat prin fierbere timp de 10 min și apoi s-a adăugat la filtratele care fuseseră incubate timp de 27 o oră, în 100 ml soluție minimal hyb, la 60°C. După hibridizarea peste noapte, la această temperatură, soluția probă s-a îndepărtat și filtratele s-au spălat așa cum urmează (toate în 29 0,3X SSC plus 0,1% SDS): o dată timp de 10 min, la 25’C, o dată timp de o oră, la 60°C în soluție proaspătă și o dată timp de oră la 63’C în soluție proaspătă. După 1,5 h de expunere 31 la film raze X, după procedurile standard, s-au observat 4 colonii puternic hibridizate. Acestea au fost, așa ca și în cazul probei specifice TcaC, izolatele 22G12,25A10,26A5 și 26B10. 33

Aceeași soluție probă TcaB; s-a diluat cu un volum egal (aproximativ 100 ml) soluție minimal hyb și apoi s-au folosit pentru a cerceta membranele care conțin 800 membrii ale 35 băncii genomice. După hibridizare, spălare și expunere la film raze X, așa cum s-a descris mai sus, s-au găsit doar patru clone cosmid 22G12, 25A10, 26A5 și 26b10, care să hibridi- 37 zeze puternic la această probă.

Izolarea sublonelor care conțin gene care codifică peptidele TcaC și TcaB, și deter- 39 minarea secvenței de bază ADN a acestora:

S-au crescut cu agitare peste noapte (200 rpm) la 30°C, în 100 ml TB-Amp₁₀₀ 3 41 cosmizi hibridizați pozitiv în tulpina XL1 Blue MR. După recoltarea celulelor prin centrifugare ADN cosmid s-a preparat folosind un kit accesibil comercial (BIGprep™, 5 Prime 3 Prime, 43 Inc., Boulder, CO), folosind protocolul producătorului. Doar un cosmid, 26A5, s-a izolat cu succes prin această procedură. Când s-a digerat cu enzima de restricție EcoR 1 (NEB) 45 și s-a analizat prin electroforeză pe gel, s-au detectat fragmente de mărimi aproximative 14, 10,8 (vector), 5, 3,3, 2,9 și 1,5 kbp. O a doua încercare de a izola ADN cosmid din aceleași 47 trei tulpini (8 ml cultură; TB-Amp₁₀₀, 30°C, folosind metoda miniprep fierbere (Evans G. și

RO 121280 Β1

G.Wahl., 1987, Cosmid vectors forgenomic walking and rapid restriction mapping în Guide to Molecular Cloning Techniques. Meth. Enzymology, voi. 152, S. Bergerși A. Kimmel, eds., pg. 604-610). Doar un cosmid, 25A10, s-a izolat cu succes prin această metodă. Când s-a digerat cu enzima de restricție EcoR 1 (NEB) și s-a analizat prin electroforeză pe gel, acest cosmid a arătat un model de fragmentare identic cu cel observat mai devreme la cosmidul 26 A5.

O probă de 0,15 pg ADN cosmid 26A5 s-a utilizat pentru a transforma 50 ml de celule DH5a E.coli (Gibco BRL) prin protocolul furnizorului. Un izolat colonie individual al acestei tulpini s-a inoculat în 4 ml de TB-Amp₁₀₀ și s-a crescut 8 h, la 37°C. S-a adăugat cloramfenicol până la concentrația finală de 225 pg/ml, incubarea s-a continuat pentru încă 24 h, apoi celulele s-au recoltat prin centrifugare și s-au înghețat la -20° C. Izolarea ADN-ului cosmid 26 A5 s-a făcut printr-o miniprep liză alcalină standard (Maniatis et al., op.cit, p.382), modificată prin creșterea tuturor volumelor prin 50% și cu agitare sau amestecare blândă, mai degrabă decât prin învârtire, la fiecare etapă. După spălarea peletului ADN în 70% etanol, s-a dizolvat în TE care conține 25 (ag/ml ribonuclează A (Boehringer Mannheim).

Identificarea fragmentelor EcoR 1 care hibridizează la probele GZ4-derivată și TcaB,. Aproximativ 0,4 pg de 25A10 cosmid (din celule XL1 Blue MR) și aproximativ 0,5 pg de 26A5 cosmid (din celule DH5a amplificate cloramfenicate) s-au digerat fiecare cu aproape 15 unități de EcoR 1 (NEB), timp de 85 min, s-au înghețat peste noapte, apoi s-au încălzit la 65°C, pentru 5 min, și s-au supus electroforezei în gel de agaroză 0,7% (Seakem®, 1X TEA, 80 volți, 90 min). ADN-ul s-a colorat cu bromură de etidiu, așa cum s-a descris mai sus, și s-a fotografiat sub lumină ultravioletă. Digerarea cu EeoR 1 a cosmidului 25A10 a fost o digerare completă, dar proba cosmidului 26A5 a fost digerată parțial în aceste condiții. Gelul de agaroză care conține fragmentele ADN s-a supus la depurinare, denaturare și neutralizare, urmate de Southem blot pe membrane de nylon Magna NT, utilizând un protocol sare ridicat (20X SSC), toate așa cum s-a descris în secțiunea 2.9 a lui Ausubel et al. (CPMB, op.cit). ADN-ul transfectat s-a crosslinkat UV la membrana de nylon ca mai înainte.

Un fragment ADN specific peptidei TcaC care corespunde insertului izolatului GZ4 plasmid, s-a amplificat prin PCR® într-un volum de reacție de 100 ml așa cum s-a descris mai sus mai devreme. Produsele amplificate de la 3 astfel de reacții s-au depozitat și s-au extras de la gel de agaroză 1 % GTG® prin kit Qiaex, așa cum s-a descris mai sus, și s-a determinat cantitativ prin fluorometrie. ADN-ul purificat-gel (100 ng) s-a marcat cu ³²P-dCTP, utilizând High Prime Labeling Mix (Boehringer Mannheim) așa cum s-a descris mai sus, la o activitate specifică de 6,3 4x108 dpm/pg.

Proba GZ4 marcată ³²P s-a fiert 10 min, apoi s-a adăugat la tampon minimal hyb” (la 1 ng/ml) și s-a adăugat membrana Southern blot care conține fragmentele ADN cosmid digerate și s-a incubat timp de 4 h, la 60°C, cu scuturare blândă la 50 rpm. Apoi, membrana s-a spălat de 3 ori la 25°C, aproape 5 min de fiecare dată (soluție de spălare minimal hyb), urmată de două spălări timp de 30 min, fiecare la 60°C. Blot-ul s-a expus la film (cu cercetare amplificată) timp de aproape 30 min, la -70°C. Proba GZ4 a hibridizat puternic la 5,0 kbp (mărime aparentă) fragmentul EcoR 1 al ambilor doi cosmizi, 26A5 și 25A10.

S-a îndepărtat radioactivitatea de pe membrană, prin fierbere timp de aproximativ 30 min în 0, IX SSC plus 0,1% SDS și absența radiomarcajului s-a verificat prin expunere la film. Apoi, s-a hibridizat la 60°C, timp de 3,5 h cu proba TcaBj (denaturată) în tampon minimal hyb folosit anterior pentru cercetarea membranelor colonii (mai sus), s-a spălat așa cum s-a descris mai devreme și s-a expus la film timp de 40 min, la -70°C, cu doi amplificatori de cercetare. ProbaTcaBj a hibridizat, cu ambii cosmizi, ușor cu un fragment EcoR 1 de aproximativ 5,0 kbp și puternic, cu un fragment de aproximativ 2,9 kbp.

RO 121280 Β1

Proba ADN cosmid 26A5 descrisă mai sus (din celule DH5a) s-a utilizat ca sursă a 1 ADN-ului de la care s-au subclonat benzile de interes. Acest ADN (2,5 pg) s-a digerat cu aproximativ 3 unități de EcoR 1 (NEB) într-un volum total de 30 pl pentru aproximativ 1,5 h, 3 pentru a obține o digestie parțială, așa cum s-a confirmat prin electroforeza pe gel. S-au digerat 10 pg ADN pBC KS (+) (Stratagene) timp de 1,5 h cu 20 unități EcoR 1 într-un volum 5 total de 20 μΙ, conducând la digestia totală, așa cum s-a confirmat prin electroforeză. Ambele preparate ADN EcoR 1 - tăiat sau diluat până la 50 μΙ cu apă, la fiecare s-a adăugat un 7 volum egal de PCI, suspensia s-a amestecat blând, s-a filat într-o microcentrifugă și s-a colectat supernatantul apos. S-a precipitat ADN cu 150 μΙ etanol și amestecul s-a plasat la 9 -20°C, peste noapte. Urmând centrifugarea și uscarea, pBC KS (+) digerat EcoR 1 s-a dizolvat în 100 μΙ TE; 26A5 digerat parțial s-a dizolvat în 20 μΙ TE. Recuperarea ADN-ului s-a 11 verificat prin fluorometrie.

în reacții separate, ADN pBC KS (+) digerat EcoR 1 s-a ligat cu aproximativ 180 ng 13 sau 270 ng de ADN cosmid 26A5 digerat parțial. Ligările s-au realizat într-un volum de 20 μΙ, la 15’C, timp de 5 h, folosind ligază T4 și tampon de la New England BioLabs. Amestecul 15 de ligare, diluat la 100 μΙ cu steril TE, s-a utilizat pentru a transforma celule DH5a competente, înghețate (Gibco BRL) în conformitate cu instrucțiunile furnizorului. Cantități variabile 17 (25-200 μΙ) de celule transformate s-au depus pe mediu LB-Cam₃₅ solid proaspăt preparat cu 1 mM IPTG și 50 mg/l X-gal. Plăcile s-au incubat la 37°C, aproape 20 h, apoi s-au răcit 19 în întuneric timp de aproximativ 3 h, pentru intensificarea culorii, în vederea selectării insertului. Coloniile albe s-au cules pe restul plăcii aceleiași compoziții și s-au incubat peste 21 noapte la 37°C.

Două proeminențe de colonii, de pe fiecare rest de placă selectată, s-au preparat 23 după cum urmează. După ridicarea coloniilor albe la plăci proaspete, membrane de nylon Magna NT rotunde s-au presat pe resturile plăcilor, membrana s-a desprins și s-a supus 25 denaturării, neutralizării și crosslink-ării UV, așa cum s-a descris mai sus pentru membranele colonie ale băncii. Proeminența coloniei crosslink-ate s-a spălat viguros incluzând eliminarea 27 prin ștergere blândă a reziduurilor celulare în exces cu un țesut. Un set s-a hibridizat cu soluție probă GZ4 (TcaC) descrisă mai devreme și celălalt set s-a hibridizat cu soluția probă 29 TcaB, descrisă mai devreme, în conformitate cu protocolul minimal hyb, urmând spălarea și expunerea la film, așa cum s-a descris pentru membranele colonie ale băncii. 31

Coloniile care au arătat semnale de hibridizare, fie numai cu proba GZ4, fie cu ambele probe GZ4 și TcaB, sau numai cu proba TcaBj, s-au selectat pentru prelucrare ulteri- 33 oară și celulele s-au striat pentru izolarea coloniei individuale pe mediu LB-Cam₃₅ cu IPTG și X-gal, ca mai înainte. Aproximativ 35 colonii individuale din 16 izolate diferite au fost sepa- 35 rate în mediul LB-Cam₃₅ lichid și s-au crescut peste noapte la 37°C; celulele s-au centrifugat prin centrifugare și s-a izolat ADN plasmid prin miniprep liză alcalină standard în conformitate 37 cu Maniatis et al., (ap.cit.p.368). Peletele ADN s-au dizolvat în TE + 25 pg/ml ribonuclează A și concentrația ADN s-a determinat prin fluorometrie. Modelul de digerare EcoR 1 s-a ana- 39 lizat prin electroforeză pe gel. Următoarele izolate s-au selectat ca folositoare. Izolatul A17.2 conține doar pBC KS (+) religat și s-a folosit pentru un control (negativ). Izolatele D38.3 și 41 C44.1 fiecare conținând doar 2,9 kpb, fragmentul TcaB, care hibridizează EcoR 1, s-au inserat în pBC KS (+). Acești plasmizi denumiți pDAB2000 și, respectiv, pDAB2001 sunt 43 ilustrați în fig. 2.

Izolatul A35.3 conține doar aproximativ 5 kbp, fragmentul GZ4- care hibridizează 45 EcoR 1 s-au inserat în pBC KS (+). Acest plasmid s-a denumit pDAB2002 (de asemenea, în fig. 2). Aceste izolate furnizează matrițe pentru secvențarea ADN. 47 ί

RO 121280 Β1

Plasmizii pDAB2000 și pDAB2001 s-au preparat folosind kitul BIGprep™, ca mai sus. Culturile (30 ml) s-au crescut peste noapte în TB-Cam₃₅, la un OD₆₀₀ din 2, apoi plasmidul s-a izolat conform cu îndrumările producătorului. Peletele ADN s-au dizolvat fiecare în 100 pl TE și integritatea probei s-a verificat prin digestie cu EcoR 1 și prin analiză electroforetică pe gelReacțiile de secvențare s-au efectuat în duplicat, cu un replicat folosind ca matriță ADN pDAB2000 și celălalt replicat folosind ca matriță ADN pDAB2001. Reacțiile s-au realizat folosind metoda de secvențare ciclu de terminare colorant dideoxi, așa cum s-a descris mai sus pentru secvențarea ADN-urilor GZ4/HB14. Secvențarea inițială s-a desfășurat utilizând, ca primeri, primerii LacZ și T7 descriși mai sus, plus primeri bazați pe secvența determinată a produsului amplificat POR TcaB, (TH1 = ATTGCAGACTGCCAATCGCTTCGG,TH12= GAGAGTATCCAGACGCCGGATGATCTG).

După alinierea și editarea fiecărui produs de secvențare, fiecare s-a truncat la între 250 la 350 baze, în funcție de integritatea datelor cromatografice, așa cum s-a interpretat prin software-ul Perkin Elmer Applied Biosystem Division SeqEd 675. Etapele de secvențare care au urmat s-au realizat prin selectarea secvenței corespunzătoare pentru noii primeri. Cu câteva excepții, primerii (sintetizați cum s-a descris mai sus) au fost lungi de 24 baze cu o compoziție G+C 50%. Secvențarea prin această metodă s-a realizat la ambele catene ale fragmentului EcoR 1 de aproximativ 2,9 kpb.

Pentru a servi în continuare ca matriță pentru secvențarea ADN, ADN plasmid din izolatul pDAB2002 s-a preparat prin kitul BIGperp™. Reacțiile de secvențare s-au realizat și analizat așa cum s-a descris mai sus. Inițial, un primer T3 (pBS SK (+) bazele 774-796:CGCGCAATTAACCCTCACTAAAG) și un primer T7 (pBS KS (+) bazele 621-643: GCGCGTAATACGACTCACTATAG) s-au utilizat pentru a prima reacțiile de secvențare de la secvențele vectorului de flancare citite în ADN inserat. Un alt set de primeri, (GZ4F: GTATCGATTACAACGCTGTCACTTCCC; TH13: GGGAAGTGACAGCGTTGTAA TCGATAC; TH14: ATGTTGGGTGCGTCGGCTAATGGACATAAC; și LW1-204: GGGAAGTGACAGC GTTGTAATCGATAC) s-a construit pentru a prima de la secvențele interne, care s-au determinat anterior prin secvențarea mediată-oligonucleotidă degenerată a produselor PCR peptide TcaC. De la datele generate în timpul rundelor inițiale de secvențare, s-a desemnat și s-a utilizat un nou set de primeri, pentru a străbate întreaga lungime a fragmentului de ~5 kbp. S-a utilizat un total de 55 oligoprimeri, care au permis identificarea tuturor celor 8432 bp ale secvenței contigue.

Când secvența ADN a fragmentului insert EcoR 1 a pDAB2002 se combină cu partea secvenței determinată a izolatelor pDAB2000 și pDAB2001, s-a generat un total de 6005 bp de secvență contiguă (descrisă aici ca SEQ ID NR: 25). Când cadrele de citire lungi, deschise, s-au translat în aminoacizii corespunzători, secvența arată clar peptida TcaB; N-terminală (descrisă ca SEQ ID NR: 3) codificată de bazele 19-75, urmând imediat restul metionihă. în sus, se află un sit de legare ribozom potențial (bazele 1-9) și în jos, la bazele 166-288, este codificată peptida internă TcaB,-PT158 (descrisă aici ca SEQ ID NR: 19). în continuare, în jos, în același cadru de citire, la bazele 1738-1773, există o secvență care codifică peptida internă TcaBj-PTIOS (descrisă aici ca SEQ ID NR: 20). De asemenea, în același cadru de citire, la bazele 1897-1923 este codificată peptida TcaBn N-terminală (descrisă aici ca SEQ ID NR: 5) și cadrul de citire continuă neîntrerupt, până la codonul de terminare translație la nucleotidele 3586-3588.

Lipsa unui codon stop în cadru, între sfârșitul secvenței care codifică TcaB- PT108 și începutul regiunii care codifică TcaB_a, și lipsa unui sit de legare ribozom imediat mai sus de regiunea care codifică TcaB,,, sugerează că peptidele TcaBi și TcaB_N sunt codificate de

RO 121280 Β1 un singur cadru de citire de 3567 bp, care începe la baza pereche 16 în SEQ ID NR:25, și, 1 foarte probabil, derivă dintr-un produs genă primar individual de 1198 aminoacizi (131.586 Daltoni; descris aici ca SEQ ID NR:26), printr-un clivaj posttranslațional. Dacă aminoacidul 3 care precedă imediat peptida TcaB^ N-terminală reprezintă aminoacidul C-terminal al peptidei TcaBi, atunci masa previzionată TcaB_H (627 aminoacizi) este 70.814 Daltoni (descrisă 5 aici ca SEQ ID NR: 28), ceva mai mare decât mărimea observată prin SDS-PAGE (68 kDa). Această peptidă ar fi codificată printr-o întindere contiguă de 1881 baze perechi (descrisă 7 aici ca SEQ ID NR: 27). S-a considerat că C-terminusul nativ al TcaB, este cumva mai apropiat de C-terminusul TcaB-PT108. Masa moleculară a PT108 (3,438 kDa; determinată în 9 timpul analizei secvenței aminoacide N-terminală a acestei peptide) prevede o mărime de aminoacizi. Utilizând mărimea acestei peptide pentru a desemna C-terminusul regiunii 11 care codifică TcaBi [Glu la poziția 604 a SEQ ID NR: 28], mărimea derivată a TcaBi este determinată a fi de 604 aminoacizi sau 68.463 Daltoni, în conformitate cu observațiile 13 experimentale.

Translarea regiunii de 1686 baze perechi, care codifică peptida TcaB* (descrisă aici 15 ca SEQ ID NR: 29), a dat o proteină de 562 aminoacizi (descrisă aici ca SEQ ID NR: 30), cu masa previzionată de 60.789 Daltoni, care corespunde bine cu cea observată de 61 kDa. 17

Un sit potențial de legare ribozom (bazele 3633-3638) este găsit 48 bp mai jos de codonul stop pentru cadrul deschis de citire tcaB. La bazele 3645-3677, s-a găsit o secvență 19 care codifică N-terminusul peptidei TcaC, (descrisă aici ca SEQ ID NR:2). Cadrul deschis de citire inițiat de peptida N-terminală continuă neîntrupt până la baza 6005 (2361 baze pe- 21 rechi, descrise aici ca primele 2361 baze perechi ale SEQ ID NR: 31). O genă (tcaC) care codifică întreaga peptidă TcaC, (mărime aparentă -165 kDa; -1500 aminoacizi) ar cuprinde 23 aproximativ 4500 bp.

Alt izolat care conține fragmentele EcoR 1 donate ale cosmidului 26A5, E20.6 s-a 25 identificat, de asemenea, prin omologie cu probele GZ4 și TcaBi menționate anterior. Analiza pe gel de agaroză, a digeratelor EcoR 1 ale ADN-ului plasmidului adăpostit de această tulpi- 27 nă (pDAB2004, fig. 2), a arătat fragmentele inserate ale mărimilor estimate 2.9, 5 și 3,3 kbp. Analiza secvenței ADN inițiată de la primerii desemnați de la secvența plasmidului 29 pDAB2002 a arătat că fragmentul de 3,3 kbp EcoR 1 al pDAB2004 este adiacent fragmentului de 5 kbp EcoR 1 reprezentat în pDAB2002. Cadrul deschis de citire de 2361 baze pere- 31 chi descoperit în pDAB2002 continuă neîntrerupt pentru încă 2094 baze în pDAB2004 [descrise aici ca bazele perechi de la 2362 la 4458 ale SEQ ID NR:31], Analiza secvenței ADN 33 utilizând ADN cosmid 26A5 primar ca matriță a confirmat continuitatea cadrului deschis de citire. împreună, cadrul deschis de citire (TcaC SEQ ID NR:31) cuprinde 4455 baze perechi 35 și codifică o proteină (TcaC) de 1485 aminoacizi [descrisă aici ca SEQ ID NR:32], Mărimea moleculară calculată de 166.214 daltoni este conformă cu mărimea estimată a peptidei TcaC 37 (165 kDa) și secvența aminoacidă derivată se potrivește exact cu cea descrisă pentru secvența TcaC N-terminală [SEQ ID NR:2]. 39

Lipsa unei secvențe aminoacide corespunzătoare SEQ ID NR:17, folosită pentru a descrie depozitul primeroligonucleotidă degenerată în secvența descoperită, arată că gene- 41 rarea produselor PCR® găsită în izolatele GZ4 și HB14, care s-au utilizat ca probe în cercetarea băncii inițiale, au fost generate întâmplător prin primarea catenei-inverse de unul din 43 primeri în depozitul degenerat. în continuare, secvența proteinei derivate nu include fragmentul intern descris aici ca SEQ ID NR:18. Aceste secvențe arată că plasmidul pDAB2004 con- 45 ține întreaga regiune care codifică pentru peptida TcaC.

f

RO 121280 Β1

Exemplul 9. Cercetarea bănciigenomice Photorhabdus pentru genele care codifică peptida TcbA^

Acest exemplu descrie o metodă utilizată pentru a identifica clonele ADN care conțin genele care codifică peptida TcbA,,, izolarea acestor gene și determinarea secvenței lor parțiale de baze ADN.

Polipeptida TcbA,, preparării active insectă este - 602 kDa. Secvența aminoacidă a N-terminusului acestei peptide este descrisă ca SEQ ID NR:1. Patru depozite de primeri oligonucleotide degenerate (primeri forward: TH-4, TH-5, TH-6 Șl TH-7) s-au sintetizat pentru a codifica o porțiune a acestei secvențe aminoacide, așa cum s-a descris în exemplul 8 și sunt descrise și mai jos.

Tabelul 11

Primerii și reacțiile PCR

Amino acid	Phe	lle	Gin	Gly	Tyr	Ser	Asp	Leu	Phe
TH-4	5'-TT(T/C)	ATI	CA(A/G)	GGI	TA(T/C)	TOI	GA(T/C)	CTI	TT-3'
TH-5	5'-TT(T/C)	ATI	CA(A/G)	GGI	TA(T/C)	AG(T/C)	GA(T/C)	CTI	TT-3'
TH-6	5'-TT(T/C)	ATI	CA(A/G)	GGI	TA(T/C)	TOI	GA(T/C)	TT(A/G)	TT-3'
TH-7	5'-TT(T/C)	ATI	CA(A/G)	GGI	TA(T/C)	AG(T/C)	CA(T/C)	TT(A/G)	TT-3’

în plus, o secvență primară (a) și una secundară (b) ale preparării peptidei interne (TcbAjj-PT81) s-au determinat și s-au descris aici ca SEQ ID NR:23 și, respectiv, SEQ ID NR:24. Patru depozite de oligonucleotide degenerate (primeri reverse: TH-8, TH-9, TH-10 și TH-11) s-au construit și s-au sintetizat pentru a codifica complementul invers al secvențelor care codifică o porțiune a peptidei SEQ ID NR:23, așa cum se arată mai jos.

Tabelul 12

Amino acid	Thr	Tyr	Leu	Thr	Ser	Phe	Glu	Gin	Val	Ala	Asn
TH-8	3'TGI	AT(A/G)	GAI	TGI	AGI	AA(A/G)	CT(T/C)	GT(T/C	CAI	CGI	TT(G/A)-5'
TH-9	3'TGI	AT(A/G)	TT(A/G)	TGI	AGI	AA(A/G)	CT(T/C)	GT(T/C	CAI	CGI	TT(G/A)-5'
TH-10	3‘TGI	AT(A/G)	GAI	TGI	TC(G/A)	AA(A/G)	CT(T/C)	GT(T/C	CAI	CGI	TT(G/A)-5'
TH-11	3'TGI	AT(A/G)	TT(A/G)	TGI	TC(G/A)	AA(A/G)	CT(T/C)	GT(T/C	CAI	CGI	TT(G/A)-5'

Seturi din acești primeri s-au utilizat în reacții PCR®, pentru a amplifica fragmentele de genă care codifică TcbA,, de la ADN genomic Photorhabdus luminescens W-14 preparat j în exemplul 6. Toate reacțiile PCR s-au realizat cu tehnica Hot Star folosind muguri AmpliWax™ și alți reactivi și protocoale Perkin Elmer, de obicei, un amestec (volum total μΙ) de MgCI₂, dNTP's, tampon PCR U10XGeneAmp®și s-au adăugat primerii la eprubete care conțin un singur bob de ceară, [tamponul PCR II10X GeneAmp® este compus din 10 mM Tris-HCI, pH 8,3 și 500 mM KC1J. Eprubetele s-au încălzit 2 min, la 80°C, și s-au lăsat să se răcească. S-a adăugat o soluție care conține tampon PCR 1110X GeneAmp®, matriță ADN și polimerază ADN, la vârful dopului etanș de ceară. După topirea dopului etanș

RO 121280 Β1 de ceară și amestecarea componentelor prin ciclare termică, condițiile de reacție finale 1 (volum de 50 pl) au fost: 10 mM Tris-HCI, pH 8,3; 50 mM KC1; 2,5 raM MgCI₂; 200 uM fiecare din dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 1,25 mM într-un singur depozit primer forward; 3 1,25 uM într-un singur depozit primer revers, 1,25 unități polimerază ADN AmpliTaq® și

170 ng matriță AND. 5

Reacțiile s-au plasat într-un termocicler (ca în exemplul 8) și s-au desfășurat cu următorul program: 7

Tabelul 13

Temperatură	Timp	Repere ciclu
94°C	2 min	1X
94°C 55-65°C 72°C	15 s 30 s 1 min	30X
72°C	7 min	1X
15°C	Constant

O serie de amplificări s-a desfășurat la aceste trei temperaturi normalizatoare (55°, 60°, 65°C), utilizând depozitele primeri degenerați. Reacțiile cu normalizare la 65’C nu au 19 avut produse de amplificare vizibile, după electroforeza pe gel de agaroză. Reacțiile având regim de normalizare de 60°C și care conțin primerii TH-5+TH-10 au avut drept rezultat un 21 produs de amplificare care a avut o mobilitate corespunzătoare la 2,9 kbp. O cantitate de produs mai mică de 2,9 kbp s-a produs în aceste condiții cu primerii TH-7+TH-10. Când 23 reacțiile s-au normalizat la 55°C, aceste perechi de primeri au produs mai mult decât un produs de 2,9 kbp și acest produs s-a produs, de asemenea, cu perechile de primeri TH-5+TH-8 25 și TH-5+TH-11. în plus, benzi de 2,9 kbp foarte pale s-au observat în pasajele care conțin produse amplificate de la perechile de primeri TH-7 plus TH-8, TH-10 sau TH-11. 27

Pentru a obține un produs amplificat PCR suficient pentru donarea și determinarea secvenței ADN, 10 reacții PCR separate s-au inițiat folosind primerii TH-5+TH-10 și s-au 29 desfășurat utilizând condițiile de mai sus cu normalizare la 55’C. Toate reacțiile s-au depozitat și produsul de 2,9 kbp s-a purificat prin extracție Qiaex de la gel de agaroză, așa cum 31 s-a descris mai sus.

Secvențe adiționale determinate pentru peptida internă TcbAj sunt descrise aici ca 33 SEQ ID NR: 21 și SEQ ID NR:22. Ca mai înainte, oligonucleotidele degenerate (primerii reverse TH-17 și TH-18) s-au realizat în conformitate cu complementul invers care codifică 35 o porțiune a secvenței aminoacide a acestor peptide.

Tabelul 14

De la SEQ ID NR: 21 39

Amino acid	Met	Glu	Thr	Gin	Asn	lle	Gin	Glu	Pro
TH-17	3-TAC	CTT/C	TGI	GTT/C	TTA/G	TAI	GTT/C	GTT/C	GG-5'

RO 121280 Β1

Tabelul 15

De la SEQ ID NR.22

Amino acid	Asn	Pro	lle	Asn	lle	Asn	Thr	Gly	lle	Asp
TH-18	3'-TT(A/G)	GGI	TAI	TT(A/G)	TAI	TT(A/G)	TGI	CCI	TAI	CT/A/G)-5’

Oligonucleotidele degenerate TH-18 și TH-17 s-au utilizat în experimentul de amplificare cu ADN Photorhabdus hammescens'V\l-14 ca matriță și primerii TH-4, TH-5, TH-6 sau TH-7 ca primeri 5'- (forward). Aceste reacții au amplificat produși de aproximativ 4 kbp și, respectiv, 4,5 kbp. Aceste ADN-uri s-au transferat de la gel de agaroză pe membrane nylon și s-au hibridizat cu proba marcată 32P (așa cum s-a descris mai sus), preparată de la produsul de 2,9 kbp amplificat prin perechea primer TH-5+TH-10. Atât produsul de amplificare de 4 kbp, cât și cel de 4,5 kbp au hibridizat puternic cu proba de 2.9 kbp. Aceste rezultate s-au utilizat pentru a construi o hartă pentru secvența peptidei interne TcbA„, așa cum s-a arătat în fig. 3. Distanța aproximativă dintre primeri este prezentată în fig. 3.

Secvența ADN a fragmentului de 2,9 kbp care codifică TcbA^

S-au precipitat cu etanol aproximativ 200 ng din fragmentul de 2,9 kbp (preparat mai sus) și s-au dizolvat în 17 ml apă. O jumătate din acesta s-a utilizat ca matriță de secvențare cu 25 pmol din depozitul TH-5 ca primer și cealaltă jumătate s-a utilizat ca matriță pentru primarea TH-10. Reacțiile de secvențare au fost așa cum s-a arătat în exemplul 8. Nu s-a produs nici o secvență de bază folosind depozitul primer TH-10; totuși, reacțiile cu depozit primer TH-5 au produs secvența descrisă mai jos:

AATCGTGTTG ATCCCTATGC CGNGCCGGGT TCGGTGGAAT CGATGTCCTC ACCGGGGGTT

TATTNGAGGG ANTNGTCCCG TGAGGCCAAA AANTGGAATG AAAGAAGTTC AAATTTNTTAC

121 CTAGATAAAC GTAGCCCGGN TTTAGAAAGN TTANTGNTCA GCCAGAAAATTTTGGTTGAG

181 GAAATTCCAC CGNTGGTTCT CTCTATTGAT TNGGGCCTGG CCGGGTTCGA ANNAAAACNA

241 GAAATNCAC AAGTTGAGGTGATGGNTTTGTNGCNANCTTNTCGTTTAGGT GGGGAGAAA

301 CCTTNTCANCACGNTTNTGAAACTGACCGGGAAATCGTCCATGANCGTGANC CAGGNTTN

361 CGCCATTGG

Bazat pe această secvență, un primer de secvențare (TH-21,5’CCGGGCGACGTTTATC TAGG-3'.) s-a proiectat pentru a inversa bazele complement 120-139 și a iniția polimerizarea spre capătul 5' (adică, TH-5) al fragmentului PCR de 2,9 kbp purificat-gel care codifică TobA^.

Secvența determinată este prezentată mai jos și este comparată cu secvența peptidei N-terminală determinată biochimic a TcbAfi SEQ ID NR: 1.

Confirmarea secvenței fragmentului PCR 2,9 kbp TcbA„ [Aminoacizii subliniați= codificați de oligonucleotidele degenerate].

SEQ FIQ GYS D L F G - - A

IDNR:1 | li llllll I I

GCATG CAG GGG TATAGTGAC CTGTTT GGT AATCGTGCT

M Q GY SDLFGNRA

RO 121280 Β1

De la omologia secvenței de aminoacizi, derivată cu cea determinată biochimic, a fost 1 clar că fragmentul PCR de 2,9 kbp reprezintă regiunea care codifică TcbA. Acest fragment de 2,9 kbp s-a utilizat apoi ca probă de hibridizare pentru cercetarea băncii genomice 3 PhotorhabdusW-W preparată în exemplul 8, pentru cosmizii care conțin gena care codifică TcbA,,. 5

Cercetarea băncii cosmid Pphotorhabdus

Fragmentul PCR purificat-gel de 2,9 kbp s-a marcat cu ³²P folosind kitul de marcare 7

Boehringer Mannheim High Prime, așa cum s-a descrid în exemplul 8. Filtrele care conțin remanenți de la aproximativ 800 de colonii din banca cosmidului s-au cercetat așa cum s-a 9 descris mai sus (exemplul 8) și clonele pozitive s-au dungat pentru izolarea coloniilor și s-au recercetat. 3 clone (8A11,25G8 și 26D1) au dat rezultate pozitive pe parcursul mai multor 11 etape de cercetare și caracterizare. Nu s-a observat hibridizarea probei specifice TcbA, cu nici unul dintre cei 4 cosmizi identificați în exemplul 8 și care conțin genele tcaB și tcaC. ADN 13 din cosmizii 8A11.25G8 și 26D1 s-au digerat cu enzimele de restricție Bgl 2, EcoR 1 sau Hind 3 (fiecare singur sau în combinație cu un altul) și fragmentele s-au separat pe un gel 15 de agaroză și s-au transferat pe o membrană nylon, așa cum s-a descris în exemplul 8. Membrana s-a hibridizat cu proba marcată ³²P preparată de la fragmentul de 4,5 kbp 17 (generat prin amplificarea ADN genomic de la Photorhabdus cu primerii TH-5+TH-17). Modelele generate de la ADN cosmizi 8A11 și 26D1 au fost identice cu acelea generate cu ADN 19 genomic tăiat-similar pe aceeași membrană. S-a conchis că respectivii cosmizi 8A11 și 26D1 sunt reprezentările precise ale TebA„ genomic care codifică locus. Totuși, cosmidul 25G8 are 21 un fragment individual Bg 1 care este puțin mai mare decât ADN-ul genomic. Aceasta poate rezulta din poziționarea insertului în vector. 23

Secvența ADN a genei care codifică tcBa

Analiza hibridizării membranei cosmidului 26D1 a relevat ca proba de 4,5 kbp a hibri- 25 dizat la un singur fragment EcoR 1 mare (mai mare decât 9 kbp). Acest fragment s-a purificat-gel și s-a ligat în situl EcoR 1 al pBC KS (+), așa cum s-a descris în exemplul 8, 27 pentru a genera plasmidul pBC-SI/RI. Secvența ADN parțială a insertului ADN a acestui plasmid s-a determinat prin plimbarea primerului de la secvența vectorului de flancare, utilizând 29 procedura descrisă în exemplul 8. în continuare, secvența s-a generat prin extinderea de la noile oligonucleotide proiectate de la secvența determinată mai devreme. Când s-a comparat 31 cu secvența ADN determinată pentru gena tcbA identificată prin alte metode (descrisă aici ca SEQ ID NR:11, așa cum s-a descris în exemplul 12 mai jos), s-a găsit omologie completă 33 la nucleotidele 1-272, 319-862, 2578-3036 și 3068-3540 (total de baze=1712). S-a conchis că ambele abordări pot fi utilizate pentru a identifica fragmentele ADN care codifică peptida 35 TcbAiAnaliza secvenței aminoacide derivate a genei tcbA 37

Secvența fragmentului ADN identificat ca SEQ ID NR:11 codifică o proteină a cărei secvență aminoacidă derivată este descrisă aici ca SEQ ID NR:12. Câteva trăsături verifică 39 identitatea genei cu cea care codifică proteina TcbAi· Peptida N-terminală TcbA,j (SEQ ID NR: 1; Phe lle Gin Gly Tyr Ser Asp Leu Phe Gly Asn Arg Ala) este codificată de aminoacizii 41 88-100. TcbArPT81 (a) peptida internă TcbAi (SEQ ID NR:23) este codificată de aminoacizii 1065-1077 șiTcbA_tt-PT81 (b)(SEQ ID NR:24) este codificată ca aminoacizii 1571-1592. Mai 43 departe, peptida internă TcbAjj-PTSG (SEQ ID NR: 22) este codificată ca aminoacizii 1474-1488 și peptida internă TcbAi-PT103 (SEQ ID NR:24) este codificată ca aminoacizii 45 1614-1639. Este evident că această genă este o clonă autentică care codifică peptida TcbA^ așa cum s-a izolat de la prepararea proteinei insecticide a Photorhabdus luminescens tulpina 47

W-14.

RO 121280 Β1

Proteina izolată ca peptida TcbA_a este derivată de la clivajul unei peptide mai lungi. O dovadă pentru aceasta este furnizată de faptul că nucleotidele care codifică peptida TcbA,) N-terminală SEQ ID NR:1 sunt precedate de 261 baze (care codifică 87 aminoacizii N-terminali-proximali) ale unui cadru deschis de citire mai lung (SEQ ID NR:11). Acest cadru de citire începe cu oligonucleotidele care codifică secvența aminoacidă Met Gin Asn Ser Leu, care corespunde cu secvența N-terminală a peptidei TcbA mai mari și descrisă aici ca SEQ ED NR: 16. S-a considerat că TcbA este proteina precursoare pentru TcbA,_r

Relațiile genelor tcbA, tcaB si tcaC

Genele tcaB și tcaC sunt linkate aproape și pot fi transcrise ca un singur mARN (exemplul 8). Gena tcbA este apărută pe cosmidul care aparent nu îi înfășoară pe cei care adăpostesc clusterul tcaB și tcaC, de vreme ce cercetarea băncii genomice respective a identificat cosmizi diferiți. Totuși, compararea secvențelor amino codificate de genele tcaB și tcaC cu gena tcbA a relevat un grad substanțial de omologie. Conservarea aminoacidului (Protein Alignment Mode of MacVector™ Sequence Analysis Software, care marchează matricea pam250, valoare tăiată=2; Kodak Scientific Imaging Systems, Rochester, NY) este prezentată în fig. 4. Pe linia de marcaj a fiecărui tablou din fig. 4, semnele ^Λ indică omologia sau conservarea schimbărilor aminoacide și semnele v indică nonomologia.

Această analiză arată că secvența aminoacidă a peptidei TcbA din resturile 1739 la 1894 este omoloagă ridicat cu aminoacizii 441 la 603 ai peptidei TcaBi (162 dintr-un total de 627 aminoacizi ai P8; SEQ ID NR:28). în plus, secvența aminoacizilor TcbA 1932 la 2459 este omoloagă înalt cu aminoacizii 12 la 531 ai peptidei TcaB_u (520 din totalul de 562 aminoacizi; SEQ ID NR: 30). Considerând că peptida TcbA (SEQ ID NR:12) cuprinde 2595 aminoacizi, un total de 684 aminoacizi (27%), la capătul C-proximal al acesteia, este omolog cu peptidele TcaBj și TcaB,, și omoloagele sunt aranjate coliniar pe aranjamentul preproteinei putative TcaB (SEQ ID NR;26). Un gol măsurabil în omologia TcaB_a; coincide cu joncțiunea dintre porțiunile TcaBi și TcaBa θΐθ preproteinei TcaB. Evident, produsele genei TcbA și TcaB sunt legate evolutiv și s-a propus că ele au funcție (i) comună în Photorhabdus.

Exemplul 10. Caracterizarea zinc-metaloproteazelor în bulion Photorhabdus: inhibarea proteazei, clasificare și purificare

Inhibarea proteazei și testele de clasificare: testele protează s-au realizat folosind cazeină-FITC dizolvată în apă ca substrat (concentrația finală a testului 0,08%). Reacțiile de proteoliză s-au realizat la 25”C, timp de o oră, în tamponul potrivit cu bulion Photorhabdus (volumul total al reacției 150 pl). Probele s-au testat, de asemenea, în prezența și absența ditiotreitolului. După incubare s-a adăugat un volum egal de 12% acid tricloracetic pentru a precipita proteina nedigerată. După precipitare timp de 0,5 h și centrifugarea care a urmat, s-au plasat 100 pg supernatant într-o placă de microtitrare cu 96-godeuri și pH-ul soluției s-a ajustat prin adăugarea unui volum egal de NaOH 4N. Proteoliză s-a cuantificat apoi utilizând un cititor de placă fluorometric Fluoroskan II la excitarea și emisia lungimii de undă de 485 și, respectiv 538 nm. Activitatea proteazei s-a testat într-un domeniu de la pH 5,0-10,0 în 5 unități crescute. S-au folosit următoarele tampoane la concentrația finală de 50 mM: acetat de sodiu (pH 5,0-6,5); Tris-HCI (pH 7,0-8,0) și bis-Tris propan (pH 8,5-10,0). Pentru a identifica clasa proteazei(lor) observate, bulionul brut s-a tratat cu o varietate de inhibitori protează (concentrație finală 0,5 pg/pg) și apoi s-a examinat pentru activitatea proteazei pH 8,0, folosind substratul descris mai sus. Inhibitorii proteazei utilizați includ E-64 (L-trans-expoxisaccinilleucilamino[4-,-guamdino]-butan), 3,4-dicloroizocumarin, Leupeptin, pepstatin, amastatin, acid etilendiamintetraacetie (EDTA) și 1,10 fenantrolin. Testele protează realizate peste domeniul pH relevă că proteaza(ele) au fost într-adevăr cele care prezintă activitatea maximă la -pH 8,0 (tabelul 16). Adiția de DTT nu a avut nici un efect asupra

RO 121280 Β1 activității proteazei. Bulionul brut s-a tratat apoi cu o varietate de inhibitori de protează (tabelul 17). Tratamentul bulionului brut cu inhibitorii descriși mai sus arată că 1,10 fenantroiin a cauzat inhibarea completă a întregii activității a proteazei, când s-a adăugat la o concentrație finală de 50 pg cu IC₅₀= 5 pg în 100 pl la o soluție de bulion brut 2 mg/ml. Aceste date arată că proteaza(ele) cea mai abundentă găsită în bulionul Photorhabdus este de forma clasei zinc-metaloproteazei a enzimelor.

Tabelul 16

Efectul pH-ului asupra activității din ziua 1 a Photorhabdus

pH	Activitate® unit.flu?	Procent
5,0	3013 ±78	17
5,5	7994 ± 448	45
6,0	12965 ±483	74
6,5	14390±1291	82
7,0	14386 ±1287	82
7,5	14135±198	80
8,0	17582 ±831	100
8,5	16183 ±953	92
9,0	16795 ±760	96
9,5	16279±1022	93
10,0	15225 ±210	87

a. Activitate=procent activitate relativă la maximum pH 8,0.

b. Unit. flu=unități fluorescente (maximum = -28,000; fundal = -2200).

Tabelul 17

Efectul diferiților inhibitori de protează asupra activității proteazei la pH 8 găsită în producția din ziua 1 a Photorhabdus luminescens (tulpina W-14)

Inhibitor	Unit. Fiu. corectate3	Procent de inhibare
Control	13053	0
E-64	14259	0
1-10 Fenantrolin®	15	99
3,4 Diclorizocoumarind	7956	39
Leupeptin	13074	0
Pepstatin®	13441	0
Amastatin	12474	4
Control DMSO	12005	8
Control Metanol	12125	7

a. Unit. fiu. corectate = unități fluorescente - fundal (2200 unit. fiu).

b. Procentul inhibării relative la activitatea proteazei la pH 8,0.

c. Inhibitorii s-au dizolvat în metanol.

d. Inhibitorii s-au dizolvat în DMSO.

RO 121280 Β1

Izolarea zinc-metalproteazei s-a realizat prin aplicarea peletului de sulfat de amoniu 10-80% dializat la o coloană Sepharose Q echilibrată la 50 mM Na₂PO₄, pH 7,0 așa cum s-a descris în exemplul 5 pentru toxina Photorhabdus. După spălare intensivă, un gradient 0 la 0,5 M NaCI s-a utilizat pentru a elua proteina toxinei. Majoritatea activității biologice și proteina s-au eluat de la 0,15-0,45 M NaCI. Totuși, s-a observat că majoritatea activității proteolitice a fost prezentă în fracția 0,25-0,35 M NaCI cu ceva activitate în fracția 0,15-0,25 M NaCI. Analiza SDS PAGE a fracțiunii 0,25-0,35 M NaCI a arătat o bandă importantă a peptidei de aproximativ 69 kDa. Fracția 0,15-0,25 M NaCI a conținut o bandă similară de 60 kDa, dar o concentrație relativă a proteinei mai scăzută. Filtrarea subsecventă pe gel a acestor fracțiuni folosind o coloană Superose 12 HR 16/50 a rezultat într-un peak major care migrează la 57,5 kDa, care a conținut banda de 58,5 kDa predominantă (>90% din total proteinei colorate) prin analiza SDS PAGE. Analiza ulterioară a acestui fragment, folosind diferiți inhibitori de protează, așa cum s-a descris mai sus, a determinat că proteaza a fost o zinc-metalprotează. Aproape toată activitatea proteazei prezentă în bulion Photorhabdus în ziua 1 de fermentare corespunde cu ~58 kDa zinc-metaloproteazei.

într-oaltă izolare secundară a zinc-metaloproteazei(ele), bulionul Photorhabdus crescut trei zile s-a colectat, iar activitatea proteazei s-a vizualizat cu electroforeză pe gel de sodiu dodecil sulfat-poliacrilamidă (SDS-PAGE), legat cu gelatină, așa cum s-a descris în Schmidt, T.M., Bleakley, B. și Nealson, K.M. 1988. Gelurile de migrare SDS (5,5x8 cm) s-au realizat cu 12,5% poliacrilamidă (40% soluție stoc de acrilamidă/bis-acrilamidă; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), în care concentrația finală de gelatină 0,1% (reactiv grad Biorad EIA; Richmond CA) s-a încorporat pe dizolvare în apă. Gelurile SDS de stivuire (1,0x8 cm) au fost construite cu 5% poliacrilamidă, au fost legate de asemenea cu 0,1% gelatină. în mod tipic, 2,5 pg de proteină de testat s-au diluat în 0,03 ml tampon de încărcare SDS-PAGE fără ditiotreitol (DTT) și s-au încărcat pe gel. Proteinele s-au supus electroforezei în tampon de migrare SDS (Laernmli, U.K. 1970, Nature 227,680) la 0°C și la 8 mA. După ce electroforeză a fost completă, gelul s-a spălat 2 h în 2,5% (v/v) Triton X-100. Gelurile s-au incubat apoi o oră, la 37°C, în 0,1 M glicină (pH 8,0). După incubare, gelurile s-au fixat și s-au colorat peste noapte 0,1% amido black în metanol-acid acetic-apă (30:10:60, vol./vol./vol.; Sigma Chemical Co.). Activitatea proteazei s-a vizualizat ca zone luminoase pe negru, amido black a colorat fundalul, datorită proteolizei și difuziei subsecvente a gelatinei încorporate. S-au observat cel puțin 3 benzi distincte produse de activitatea proteolitică la 58-. 41-și 38 kDa.

Teste de activitate ale diferitelor proteaze în bulion de cultură W-14, ziua a 3-a, s-au realizat utilizând cazeină FITC dizolvată în apă ca substrat (concentrația finală a testului 0,02%). Experimentele proteolizei s-au realizat la 37°C, timp de 0-0,5 h, în 0,1 M Tris-HCI (pH 8,0) cu diferite fracțiuni de proteină într-un volum total 0.4-5 ml. Reacțiile s-au terminat prin adăugarea unui volum egal de acid tricloracetic (TCA) 12% dizolvat în apă. După incubare la temperatura camerei, timp de 0,25 h, probele s-au centrifugat la 10000xg 0,25 h și s-au îndepărtat 10 ml alicote și s-au plasat pe plăci de microtitrare cu 96 godeuri. Soluția s-a neutralizat apoi prin adăugarea unui volum egal de hidroxid de sodiu 2N, urmată de cuantificare folosind un cititor de placă fluorometric Fluoroskan II cu excitare și emisie de lungimi de undă de 485 și, respectiv, 538 nm. Măsurarea activității s-a realizat folosind cazeină FITC cu diferite concentrații de protează la 37°C, 0-10 min. O unitate de activitate s-a definit arbitrar, precum cantitatea de enzimă necesară pentru a produce 1000 unități fluorescente/min și activitatea specifică s-a definit ca unități/mg de protează.

Studiile de inhibare s-au realizat folosind 2 inhibitori zinc-metaloprotează; 1,10 fenantrolin și N-(a-ramnopiranosiloxihidroxifosfinil)-Leu-Trp(fosforamidon) cu soluții stoc ale

RO 121280 Β1 inhibitorilor dizolvați în 100% etanol și, respectiv, apă. Concentrațiile stoc au fost de obicei 1 10 mg/ml și 5 mg/ml pentru 1,10 fenantrolin și respectiv fosforamidon, concentrația finală a inhibitorului de 0,5-1,0 mg/ml per reacție. Tratamentul de 3 zile al bulionului brut W-14 cu 3 1,10 fenantrolin, un inhibitor al tuturor zinc-metaloproteazelor, a rezultat în eliminarea completă a întregii activității a proteazei, în timp ce tratamentul cu fosforaminodin, un inhibitor al 5 proteazelor ca termolizina (Waver, L.H., Kester, W.R., și Matthews, B.W., 1977, J. Mol. Biol, 114,119-132) a rezultat în reducerea cu -56% a activității proteazei. Activitatea proteolitică 7 reziduală nu a putut fi redusă în continuare cu fosforamidon adițional.

Proteaza de 3 zile a bulionului Photorhabdus W-14 s-a purificat așa cum urmează: 9

4,0 1 bulion s-au concentrat folosind un cartuș de ultrafiltrare spirală Amicon tip SI Y100, atașat la un dispozitiv de filtrare Amicon M-12. Materialul care curge, având proteine native 11 mai mici în lungime decât 100 kDa (3,8 L), s-a concentrat la 0,375 L folosind un cartuș de ultrafiltrare spirală Amicon tip S1 Y10, atașat la un dispozitiv de filtrare Amicon M-12. Mate- 13 rialul reținut a conținut proteine variind în mărime de la 10-100 kDa. Acest material s-a încărcat pe o coloană Pharmacia HR 16/10 care s-a împachetat cu PerSeptive Biosystem 15 (Framington, MA) Poros®50 HQ, împachetare puternic schimbătoare anion, care s-a echilibrat într-un tampon de fosfat de sodiu 10 mM (pH 7,0). Proteinele s-au încărcat pe coloană 17 la o rată de curgere de 5 ml/min, urmată de spălarea proteinelor nelegate cu tampon, până când A₂₈₀= 0,00. După aceea, proteinele s-au eluat folosind gradient NaCI la 0-1,0 M NaCI, 19 în 40 min, la o rată de curgere de 7,5 ml/min. Fracțiunile s-au testat pentru o activitate a proteazei, supra., iar fracțiunile active s-au depozitat. Fracțiunile active proteolitic s-au diluat cu 21 50% (v/v) tampon fosfat de sodiu 10 mM (pH 7,0) și s-au încărcat pe o coloană Pharmacia HR 10/10 Mono Q, echilibrată în 10 mM fosfat de sodiu. După spălarea coloanei cu tampon, 23 până când A₂₈₀=0,00, proteinele s-au eluat folosind un gradient NaCI de 0-0,5 M NaCI, o oră, la o rată de curgere de 2,0 ml/min. Fracțiunile s-au testat pentru activitatea proteazei. Acele 25 fracțiuni care au avut cea mai mare cantitate de activitate a proteazei sensibilă la fosforamidon, activitatea sensibilă la fosforamidon fiind datorată proteazei 41/38 kDa, infra., s-au 27 depozitat. Aceste fracțiuni s-au găsit a elua la un domeniu de 0,15-0,25 M NaCI. Fracțiunile care conțin activitatea proteazei insensibilă la fosforamidon predominantă, proteaza 58 kDa, 29 de asemenea s-au depozitat. Aceste fracțiuni s-au găsit a elua la un domeniu de 0,25-0,35M NaCI. Fracțiunile proteaza sensibilă la fosforamidon s-au concentrat apoi la volumul final de 31 0,75 ml, folosind un dispozitiv centrifugal de filtrare Millipore Ultrafree®-15 membrană Biomax-5K NMWL. Acest material s-a aplicat la o rată de curgere de 0,5 ml/min pe o coloană 33 Pharmacia HR 10/30, care fusese împachetată cu Pharmacia Sephadex G-50 echilibrată într-un tampon de 10 mM sulfat de sodiu (pH 7,0)/0,1 M NaCI. Fracțiunile care au avut activi- 35 tatea proteazei sensibilă la fosforamidon, maximă, s-au depozitat apoi și s-au centrifugat pe un dispozitiv centrifugal de filtrare Millipore Ultrafree®-15 membrană Biomax-5K NMWL. Ana- 37 liza activității proteolitice, supra., indică acest material a avea doar activitate a proteazei sensibilă la fosforamidon. Depozitarea proteazei insensibile la fosforamidon, proteina 58 kDa 39 a fost urmată de concentrarea într-un dispozitiv centrifugal de filtrare Millipore Ultrafree®-15 membrană Biomax-5K NMWL și de separarea, în continuare, pe o coloană Pharmacia 41 Supredex-75. Fracțiunile care conțin protează s-au depozitat.

Analiza proteazelor purificate 58- și 41/38 kDa a relevat că, în timp ce ambele tipuri 43 de proteaze au fost complet inhibate cu 1,10 fenantrolin, doar protează 41/38 kDa a fost inhibată cu fosforamidon. Analiza ulterioară a bulionului brut a arătat că activitatea proteazei 45 bulionului W-14, din ziua 1, a fost 23% din totalul activității proteazei datorată proteazei 41/38 kDa, care a crescut la 44% în ziua 3-a a bulionului W-14. 47

RO 121280 Β1

Analiza SDS-PAGE standard pentru examinarea purității proteinei și obținerea secvenței terminale amino s-au realizat folosind 4-20% gradient MiniPlus SepraGels achiziționat de la Integrated Separation Systems (Natick, MA). Proteinele de secvențat amino-terminal s-au blott-at pe membrane PVDF, urmând purificarea, infra., (ProBlott™ Membranes; Applied Biosystems, Foster City, CA), s-au vizualizat cu 0,1 amido black, s-au excizat și s-au trimis la Cambridge Prochem., Cambridge, MA, pentru secvențare.

Secvențele terminale amino deduse ale proteazelor 58- (SEQID NR:45) și 41/38 kDa (SEQ ID NR:44)din bulion W-14, vechi de 3 zile, au fost DV-GSEKANEKLK (SEQ ID NR:45) și, respectiv, DSGDDDKVTNTDIHR (SEQ ID NR: 44).

Secvențarea proteazei 41/38 kDa a relevat mai mulți terminali amino, fiecare având un aminoacid adițional îndepărtat prin proteoliză. Examinarea secvențelor primară, secundară, terțiară și cuaternară pentru polipeptidele 38 și 41 kDa a permis deducerea secvenței arătată mai sus și a relevat că aceste două proteaze sunt omoloage.

Exemplul 11. Partea A. Cercetarea băncii genomice Photorhabdus via folosirea anticorpilor pentru genele care codifică peptida TcbA în paralel cu secvențarea descrisă mai sus, un experiment corespunzător și secvențare s-au făcut și pe baza peptidei TcbA^ (SEQ ID NR:1). Această secvențare s-a realizat prin prepararea bulionului de cultură bacterian și purificarea toxinei, cum s-a descris în exemplele 1 și 2, de mai sus.

S-a izolat ADN genomic de lei. Photorhabdus luminescens tulpina W-14 crescut în mediu de cultură țesut insectă al lui Grace. Bacteria s-a crescut în 5 ml mediu de cultură într-un pahar Erlenmeyer, la 28’C și 250 rpm, pentru aproximativ 24 h. Celulele bacteriene de la 100 ml mediul de cultură s-au peletat la 5000xg, timp de 10 min. Supernatantul s-a îndepărtat și peletele celulare s-au folosit apoi pentru izolarea ADN-ului genomic.

S-au izolat ADN genomic folosind o modificare a metodei CTAB descrisă în Secțiunea 2.4.3. a lui Ausubel (supra.), secțiune intitulată Large Scale CsCI prep of bacterial genomic DNA, s-a urmat prin etapa 6. La acest punct, s-a realizat o extracție suplimentară cloroform/alcool izoamilic (24:1), urmată de o etapă de extracție fenol/cloroform/izoamil (25:24:1) și o extracție finală cloroform/alcool izoamilic (24:1). S-a precipitat ADN-ul prin adăugarea unui volum 0,6 de izopropanol. ADN-ul precipitat s-a suspendat și a atins vârful unei baghete de sticlă întinsă, s-a afundat scurt în etanol 70% ca o spălare finală și s-a dizolvat în 3 ml tampon TE.

Concentrarea ADN-ului, exprimată prin densitate optică la 280/260 nm, s-a aproximat la 2 mg/ml.

Folosind acest ADN genomic s-a preparat o bancă. Aproximativ 50 pg de ADN genomic s-au digerat parțial cu Sau3 A. Apoi, centrifugarea gradientului de densitate NaCI s-a folosit pentru a măsura fragmentele ADN digerate, parțial fracționate. Fracțiunile care conțineau fragmente ADN, cu o mărime medie de 12 kb sau mai mare, așa cum s-a determinat prin electroforeză pe gel de agaroză, s-au ligatîn plasmidul BluScript, Stratagene, La Jolla, California și s-au transformat în tulpini DH5a sau DHB10 E.coli.

Separat, alicotele purificate ale proteinei s-au trimis la Centrul de biotehnologie hibridoma al Universității din Wisconsin, Madison, pentru producerea anticorpilor monoclonali la proteine. Materialul care a fost trimis s-a purificat HPLC, iar fracțiunile care conțin benzile native 1 și 2, care fuseseră denaturate la 65°C și din care 20 pg s-au injectat în fiecare dintre cei 4 șoareci. Liniile de celule hibridoma, producătoare de anticorpi monoclonali stabili, s-au recuperat de pe celule de splină de la șoareci imunizați, s-au topit cu o linie celulară mieloma stabilă. Anticorpii monoclonali s-au recuperat de la hibridoame.

RO 121280 Β1

Separat, anticorpii policlonali s-au creat prin luarea benzii 1 native, purificată pe gel 1 de agaroză (vezi exemplul 1) proteină, care s-a folosit apoi pentru a imuniza un iepure alb de Noua Zeelandă. Proteina s-a preparat prin excizarea benzii de la gelurile de agaroză nati- 3 ve, încălzirea sumară a bucăților de gel la 65’C, pentru a topi agaroza și emulsionarea imediată cu adjuvant. Adjuvantul Freund complet s-a folosit pentru imunizarea primară, iar Freund 5 incomplet s-a folosit pentru 3 injectări adiționale la intervale de 1 lună. Pentru fiecare injectare s-au administrat subcutanat, prin injectări multiple în spatele iepurelui, aproximativ 7 0,2 ml de bandă 1 emulsionată care conține 50 la 100 pg de proteină. Serul s-a obținut la 10 zile după ce ultima injecție și sângerările adiționale s-au realizat la intervale de 1 săptămână, 9 timp de 3 săptămâni. Complementul serului s-a inactivat prin încălzire la 56°C, timp de 15 min, și s-a stocat la -20°C. 11

Anticorpii monoclonali și policlonali s-au utilizat apoi pentru a cerceta banca genomică, pentru exprimarea antigenilor care ar putea fi depistați prin epitopi. Clonele pozitive 13 s-au detectat pe proeminențele coloniei de pe filtrul de nitroceluloză. S-a întreprins o analiză imunoblot a clonelor pozitive. 15

O analiză a clonelor definită prin imunoblot și analiză Southern a avut ca rezultat tentativa de identificare a cinci clase de clone. 17 în prima clasă de clone a fost o genă care codifică peptida desemnată aici ca TcbA,;.

S-a obținut întreaga secvență ADN a acestei gene (TcbA). Aceasta s-a prezentat ca SEQ 19 ID NR: 11. Confirmarea că această secvență codifică secvența internă a SEQ ID NR: 1 a fost demonstrată prin prezența SEQ ID NR:1 la aminoacidul numărul 88 din secvența aminoacidă 21 dedusă, creată prin cadrul deschis de citire al SEQ ID NR: 11. Aceasta poate fi confirmată prin referire la SEQ ID NR: 12, care este secvența aminoacidă dedusă creată prin SEQ ID 23 NR: 11.

A doua clasă de peptide toxină conține segmentele la care se face referință mai sus 25 ca TcaB;, TcaB;; și TcaC. Urmând cercetarea băncii cu antiseruri policlonale, această a doua clasă de genă toxină s-a identificat prin mai multe clone care au produs proteine de diferite 27 mărimi, dintre care toate au reacționat încrucișat cu anticorpul policlonal pe un imunoblot și s-au găsit, de asemenea, că au omologie ADN pe un Southern Blot. Compararea secvențe- 29 lor relevă că ele aparțin aceluiași complex de gene desemnat TcaB și TcaC, mai sus.

Trei alte clase de clone toxină anticorp s-au izolat, de asemenea, în cercetarea poli- 31 clonală. Aceste clase au produs proteine care reacționează încrucișat cu un anticorp policlonal și, de asemenea, au omologie ADN cu clasele, așa cum s-a determinat prin Southern 33 Blot. Clasele au fost desemnate Clasa III, Clasa IV și Clasa V. A fost de asemenea posibil să se identifice monoclonalii care reacționează încrucișat cu Clasele I, II, III și IV. Aceasta 35 sugerează că toate au regiuni de înaltă omologie proteină. Astfel, se pare că genele proteinei extracelulare P. luminescens nu prezintă o familie de gene care sunt înrudite în evoluție. 37 Pentru a putea continua conceptul că ar putea fi variații înrudite evolutiv în peptidele toxine conținute în acest organism, au fost întreprinse două abordări pentru a examina alte 39 tulpini P. luminesces pentru prezența proteinelor înrudite. Aceasta s-a realizat atât prin amplificarea PCR a ADN-ului genomic, cât și prin analiza imunoblot folosind anticorpi monoclonali 41 și policlonali.

Rezultatele arată că proteinele înrudite sunt produse de tulpinile P. luminescens 43 WX-2, WX-3, WX-4, WX-5, WX-6, WX-7, WX-8, WX-11, WX-12, WX-15 și W-14.

Exemplul 11. Partea B. Secvența și analiza clonelor toxină din Clasa III - tcc 45

Secvențarea ADN ulterioară s-a realizat pe plasmizi izolați din clone E.coli Clasa III, descriși în exemplul 11, partea A. Secvența de nucleotide s-a arătat a fi de trei ori linkată, 47 aproape cadru deschis de citire la acest locus genomic. Acest locus s-a denumit tec cu trei

RO 121280 Β1 cadre deschise de citire denumite tccA SEQ ID NR: 56, tccB SEQ ID NR:58 și tccC SEQ ID NR:60 (Fig. 6B).

Aminoacidul dedus de la cadrul deschis de citire tccA arată că gena codifică o proteină de 105.459 Da. Această proteină s-a denumit TccA. Primii 12 aminoacizi ai acestei proteine potriviți cu secvența N-terminală s-au obținut de la o proteină de 108 kDa, SEQ ID NR:7, identificată mai devreme ca parte a complexului toxină.

Aminoacidul dedus de la cadrul deschis de citire TccB arată că gena codifică o proteină de 157.716 Da. Această proteină potrivită cu secvența N-terminală s-a obținut de la o proteină cu greutatea moleculară estimată de 185 kDa, SEQ ID NR:8.

Secvența aminoacidă dedusă din tccC arată că acest cadru deschis de citire codifică o proteină de 111.694 Da și produsul proteină s-a denumit TccC.

Exemplul 12. Caracterizarea tulpinilor Photorhabdus

Pentru a stabili dacă respectiva colecție descrisă aici a fost cuprinsă de tulpinile Photorhabdus, tulpinile respective s-au evaluat pentru recunoașterea trăsăturilor microbiologice care sunt caracteristice la Photordabdus și care o diferențiază de alte Enterobacteriacee și Xenorhabdus spp. (Farmer, JJ. 1984, Bergey's Manual of Systemic Bacteriology, voi 1, pp. 510-511. (Ed. Kreig N.R. and Hoit, J. G.). Wiffiams & Wilkins, Baltimore.; Akhurstand Boemare, 1988, Boemare et al., 1993). Aceste trăsături caracteristice sunt după cum urmează: tijele negative colorate ale lui Gram, mărimea organismului de 0,5-2 pm în lățime și de 2-10 pm în lungime, pigmentarea coloniei roșu/galbenă, prezența corpurilor de incluziune cristalin, prezența catalazei, inabilitatea de a reduce nitrații, prezența bioluminescenței, abilitatea de a relua colorant din mediul de cultură, pozitiv pentru producerea proteazei, intervalul temperaturii de creștere sub 37°C, supraviețuire în condiții anaerobe și capacitate de mișcare pozitivă, (tabelul 18). Tulpini de referință Escherichia coli, Xenorhabdus și Photorhabdus s-au inclus în toate testele pentru comparare. Rezultatele de suprafață sunt consistente pentru toate tulpinile ce sunt parte a familiei Enterobacteriacee și a genului Photorhabdus.

S-a utilizat un luminometru pentru a stabili bioluminiscența fiecărei tulpini și pentru a furniza o măsurare cantitativă și relativă a producției de lumină. Pentru măsurarea unităților de emisie de lumină relative, bulioane din fiecare tulpină (celule și mediu) s-au măsurat la trei intervale de timp, după inoculare în lichid de cultură (6,12 și 24 h) și s-au comparat cu luminozitatea fundalului (mediu neinoculat și apă). înainte de a măsura emisiunea de lumină din diferite bulioane, densitatea celulelor s-a stabilit prin măsurarea absorbantei luminoase (560 nM) într-un spectometru Gilford Systems (Oberlin, OH), folosind o celulă de sorbție. S-au relizat apoi diluțiile adecvate (pentru a normaliza densitatea optică la 1,0 unități), înainte de a măsura luminozitatea. Alicotele bulioanelor diluate s-au plasat apoi în cuve (300 pl fiecare) și s-au citit în Bio Orbit 1251 Luminometer (Bio-Orbit Oy, Twiku, Finland). Perioada de integrare pentru fiecare probă a fost de 45 s. Probele s-au amestecat continuu (filat în cuve cu praguri), în timp ce a fost citit pentru a asigura disponibilitatea de oxigen. Un test pozitiv s-a determinat ca fiind > 5 ori luminescența fundalului (-5-10 unități). în plus, luminozitatea coloniei s-a detectat cu film de acoperire fotografic și vizual, după adaptarea la camera obscură. Caracteristicile de colorare ale lui Gram, ale fiecărei tulpini, s-au stabilit cu un kit de culoare a lui Gram comercial (BBL, Cockeysville, MD), utilizate cu diapozitive de control culoare a lui Gram (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Evaluarea microscopică s-a realizat apoi utilizând un microscop Zeiss (Cari Zeiss, Germania), obiective de imersie 100X (cu mărire 10X ocular și 2X corp). Examinarea microscopică a tulpinilor individuale pentru mărimea organismului, descrierea celulară și corpurile de incluziune (mai târziu după creșterea logaritmică) s-au realizat utilizând diapozitive cu montura umedă (mărire 10X ocular, 2X corp

RO 121280 Β1 și 40X obiectiv) cu imersiune în ulei și microscopia contrast fază cu un micrometru (Akhurst, 1 R. J. and Boemare, N. E. 1990, Entomopathogenic Nematodes in Biological Control (ed. Gaugler, R. and Kaya, H.), pp 75-90, ORC Press, Boca Raton, USA.; Baghdiguian S., 3

Boyer-Giglio Μ. H., Thaler, J. O., Bonnot G., Boemare N., 1993, Biol. Ce//79,177-185.). Pigmentarea coloniei s-a observat după inocularea pe agar nutrient Bacto (Difco 5 Laboratories, Detroit, Ml), preparat ca în instrucțiunile de pe etichetă. Incubarea a apărut la 28°C și caracterizarea s-a produs după 5-7 zile. Pentru a testa prezența catalazei enzimei, 7 o colonie din organismul test s-a îndepărtat pe mic tampon de la placa nutrientă de agar și s-a plasat pe fondul eprubetei de sticlă test. S-a adăugat blând, pe marginea eprubetei, 1 ml 9 de soluție de apă oxigenată obișnuită. S-a înregistrat o reacție pozitivă când au apărut, imediat sau în 5 min, bule de gaz (presupus oxigen). S-au examinat, de asemenea, controa- 11 lele agarului nutrient neinoculat și ale soluției de apă oxigenată. Pentru a testa reducerea nitratului, fiecare cultură s-a inoculat cu 10 ml Bacto Nitrate Broth (Difco Laboratories, 13 Detroit, Ml). După 24 h de incubare la 28°C, producerea de nitrit s-a testat prin adăugarea a două picături de reactiv acid sulfanilic și 2 picături de reactiv a/fa-naftilamină (vezi Difco 15 Manual, IO**¹ edition, Difco Laboratories, Detroit, Ml, 1984). Generarea unei culori roz sau roșu distincte indică formarea nitritului din nitrat. Capacitatea fiecărei tulpini de absorbi colo- 17 rant din mediul de cultură s-a testat cu agar Bacto MacConkey, care conține colorant natural roșu; agar Bacto Tergitol-7, care conține colorantul bromtimol albastru și agar Bacto EMB 19 care conține colorantul eosin-y (agaruri de la Difco Laboratories, Detroit, Ml, toate preparate în conformitate cu instrucțiunile de pe etichetă). După incubare pe aceste medii, colorantul 21 absorbit s-a înregistrat după incubare la 28°C, timp de 5 zile. Creșterea pe aceste medii din urmă este caracteristică pentru membrii familiei Enterobacteriacee. Mobilitatea fiecărei tulpini 23 s-a testat folosind o soluție de Bacto Motility Test Medium (Difco Laboratories, Detroit, Ml) preparată ca în instrucțiunile de pe etichetă. O inoculare punct de joncțiune-străpungere s-a 25 realizat cu fiecare tulpină și mobilitatea s-a apreciat macroscopic prin zona difuză a împrăștierii creșterii de la linia de inoculare. în multe cazuri, mobilitatea s-a observat microscopic din 27 lichidul de cultură sub diapozitive cu montura umedă. Evaluarea nutrientului biochimic pentru fiecare tulpină s-a realizat folosind BBL Enterotube II (Benton, Dickinson, Germania). S-au 29 urmat instrucțiunile produsului, cu excepția că incubarea s-a realizat la 28’C, timp de 5 zile. Rezultatele au fost asemănătoare cu raportul menționat anterior despre Photorhabdus. Pro- 31 ducerea de protează s-a testat prin observarea hidrolizei gelatinei, utilizând plăci gelatină Bacto (Difco Laboratories, Detroit, Ml), preparate ca în instrucțiunile de pe etichetă. Culturile 33 s-au inoculat și plăcile s-au incubat la 28’C, timp de 5 zile. Pentru a evalua creșterea la diferite temperaturi, plăcile de agar [2% proteose peptone #3 cu 2% Bacto-Agar (Difco, Detroit, 35 Ml) în apă deionizată] s-au striat de la sursa comună a inoculării. Plăcile s-au sigilat cu film Nesco® și s-au incubat la 20, 28 și 37°C, timp de 3 săptămâni. Plăcile care nu au arătat creș- 37 tere la 37°C nu au demonstrat viabilitatea celulelor după transfer într-un incubator la 28°C, timp de o săptămână. Necesarul de oxigen al tulpinilor Photorhabdus s-a testat în următorul 39 mod. S-a realizat o inoculare punct de joncțiune-străpungere în mediu de bulion tioglicolat fluid (Difco, Detroit, Ml). Eprubetele s-au incubat la temperatura camerei pentru o săptămână 41 și culturile s-au examinat pentru tipul și extinderea creșterii. Indicatorul resazurin demonstrează nivelul oxidării medii a zonelor aerobe (Difco Manual, 10^,h edition, Difco Laboratories, 43

Detroit, Ml). Rezultatele zonele de creștere obținute pentru tulpinile Photorhabdus testate au fost asemănătoare cu cele ale microorganismelor anaerobe facultative. 45

RO 121280 Β1

Tabelul 18

Trăsăturile taxonomice ale tulpinilor Photorhabdus - Evaluarea trăsăturilor*

Tulpina

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

L

M

N

0

P

Q

W-14

—

±

±

rd Ș

±

-

±

±

±

0

±

±

±

±

±

±

=

WX-1

±

±

rd Ș

±

±

±

±

o

±

±

±

±

±

±

=

WX-2

=

±

±

fd Ș

±

±

±

±

0

±

±

±

±

±

±

=

WX-3

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

îl

±

±

±

±

±

±

=

WX-4

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

yț

±

±

±

±

±

±

=

WX-5

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

LO

±

±

±

±

±

±

=

WX-6

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

LY

±

±

±

+

±

±

=

WX-7

=

±

+

rd Ș

±

=

±

±

±

R

±

±

±

±

±

±

=

WX-8

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

O

±

±

±

±

±

±

=

WX-9

-

±

±

rd Ș

±

=

±

±

+

îl

+

+

±

±

±

±

=

WX-10

=

±

±

rd Ș

±

=

+

+

+

RQ

±

±

+

±

+

±

=

WX-12

=

±

±

rd Ș

±

=

+

±

+

RO

±

±

±

±

+

±

=

WX-13

=

±

±

rd Ș

±

=

±

+

±

O

±

±

±

±

±

±

=

WX-14

=

±

±

rd Ș

±

=

+

±

±

LR

+

±

±

±

±

±

=

WX-15

-

+

+

rd Ș

+

--

+

+

+

LR

+

+

+

+

+

±

=

H9

=

+

±

rd Ș

+

=

+

+

+

LY

+

+

±

±

±

±

=

Hb

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

ÎI

±

±

±

±

±

±

RO 121280 Β1

A= colorantul lui Gram, B= corpuri cristaline de incluziune, C=bioluminescență, D= forma celulei, E=mobilitate, F= reducerea nitratului, G= prezența catalazei, H= hidroliza gelatinei, 1= absorbția colorantului, J= pigmentarea, K= creșterea pe agar EMB, L= creșterea pe agar MacConkey, M= creșterea pe agar Tergitol-7, N= anaerobe facultative, 0= creșterea la 28‘C, Q= creșterea la 37‘C, t - +/- = pentru trăsătură pozitivă sau negativă, rd= baghetă, S= măsurat cu descriptori Genus, RO= roșu-portocaliu, LR= roșu deschis, R= roșu, O= portocaliu, Y= galben, T= maroniu, LY= galben deschis, YT= galben maroniu și LO= portocaliu deschis.

Tabelul 18 (continuare)

Tulpina

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

L

M

N

O

P

Q

Hm

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

IX

±

±

±

±

±

±

=

HP88

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

LX

±

±

±

±

±

±

=

NC-1

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

O

±

±

±

±

±

±

=

W30

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

XI

±

±

±

±

±

±

=

WIR

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

RO

±

±

±

±

±

±

=

B2

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

R

±

±

±

±

±

±

=

43948

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

O

±

±

±

±

±

±

=

43949

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

O

±

±

±

±

±

±

=

43950

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

O

±

±

+

±

±

±

=

43851

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

O

±

±

±

±

±

±

=

42952

=

±

±

rd Ș

±

=

±

±

±

O

±

±

±

±

±

±

=

Analiza acizilor grași celulari este recunoscută ca un instrument pentru caracterizarea bacterială la nivel de genuri și specii (Tornabene, T.G., 1985, Lipid Analysis and the 33 Relationship to Chemotaxonomy in Methods in Microbiology, voi. 18, 209-234; Goodfellow,

M. and O'Donnell, A.G., 1993, Roots of Bacteria! Systematics in Handbook of New Bacterial 35 Systematicsțed. Goodfellow, M. & O'Donnell, A.G.), pp. 3-54, London: Academic Press Ltd), aceste referințe sunt încorporate aici prin referire și s-au utilizat pentru a confirma că, colec- 37 ția noastră s-a înrudit la nivel de gen. Culturile s-au transportat la un laborator extern cu contract pentru analiza metil esteracid gras (FAME), utilizând un Microbial ID (Midi, Newark, 39 DE, USA) Microbial Identification System (MIS). Sistemul MIS constă dintr-un cromatograf gaz Hewlett Packard HP5890A cu o coloană capilară 5% metilfenil silicon topit silica de 41 25 mm x 0,2 mm. Se folosește hidrogen, ca gaz purtător, și un detector ionizare cu flacără, funcționează împreună cu un aparat pentru luarea probelor automat, un integrator și un 43

RO 121280 Β1 computer. Computerul compară probele de metil ester acid gras cu o bancă de acizi grași microbiană și cu un amestec de calibrare de acizi grași cunoscuți. Așa cum au fost selectate de laboratorul contractant, tulpinile au crescut 24 h, la 28“C, pe un agar tripticază soia, înainte de analiză. Extragerea probelor s-a realizat de către laboratorul contractant în conformitate cu metodologia standard FAME. Nu s-au identificat direct tulpini din alt grup bacterial luminiscent, decât Photorhabdus. Când s-a realizat analiza pe grupuri care compară profilurile acizilor grași ai unui grup de izolate, profilurile acizilor grași ai tulpinei erau înrudite la nivel de gen.

Diversitatea evolutivă a tulpinilor Photorhabdus din colecția noastră s-a măsurat prin analiza PCR (Polymerase Chain Reaction) a amprentelor genomice mediate, folosind ADN genomic de la fiecare tulpină. Această tehnică este bazată pe familiile de secvențe ADN repetitive, prezente de-a lungul genomilor diverselor specii bacteriene (revăzută de Versalovic, J., Schneider, N., DE Bruijn, F.J. și Lupski, J.R., 1994, Methods Mol. Cell. Biol., 5,25-40.). Trei din aceste secvențe palindrome extragenice repetitive (REP), consens intergenic repetitiv enterobacterial (ERIC) și elementul BOX sunt considerate a juca un rol important în organizarea genomului bacterian. Organizarea genomică este considerată a fi formată prin selectarea și dispersia diferențială a acestor elemente în genomul tulpinilor bacteriene strâns înrudite, poate fi folosită pentru a diferenția aceste tulpini (de exemplu, Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. și DE Bruijn, F.J., 1994, Appl. Environ. Micro. 60, 2286-2295). REP-PCR utilizează primeri oligonucleotide complementari la aceste secvențe repetitive, pentru a amplifica fragmentele ADN de mărime variabilă, care se găsesc între ele. Produsele rezultate sunt separate prin electroforeză, pentru a stabili amprenta ADN pentru fiecare tulpină.

Pentru a izola ADN genomic pentru tulpinile noastre, peletele celulare s-au resuspendat în tampon TE (10 mM Tris- HCI, 1 mM EDTA, pH 8,0) până la un volum final de 10 ml și s-au adăugat 10 ml NaCI 5 M. Acest amestec s-a centrifugat 20 min, la 15000xg. Peletul rezultat s-a resuspendat în 5,7 ml TE și s-au adăugat 300 ui SDS și 60 pl 20 mg/ml proteinază K (Gibco BRL Products, Grand Island, NY). Acest amestec s-a incubat la 37’C, timp de o oră, apoi s-au adăugat aproximativ 10 mg lizozimă și amestecul s-a incubat pentru încă 45 min. S-a adăugat apoi 1 ml NaCI 5M și 800 pl soluție CTAB/NaCI (10% g/v CTAB, NaCI 0,7 M) și amestecul s-a incubat 10 min, la 65’C, agitând blând, apoi s-a incubat și s-a agitat pentru încă 20 min, pentru a ajuta limpezirea materialului celular. S-a adăugat un volum egal de soluție cloroform/alcool izoamilic (24:1, v/v), s-a amestecat blând și apoi s-a centrifugat. S-au realizat apoi 2 extracții cu un volum egal de fenal/cloroform/aleool izoamilic (50:49:1). ADN genomic s-a precipitat cu 0,6 volume de izopropanol. ADN precipitat s-a îndepărtat cu o baghetă de sticlă, s-a spălat de 2 ori cu 70% etanol, s-a uscat și s-a dizolvat în 2 ml STE (10 mM Tris-HCI pH 8,0, 10 mM NaCI, 1 mM EDTA). Apoi, ADN-ul s-a cuantificat prin densitate optică 260 iun. Pentru a realiza analiza rep-PCR a ADN-ului genomic Photorhabdus s-au utilizat următorii primeri: REP1R-I; S'-IIIICGICGICATCIGGC-S' și REP2-I; 5'-ICGICTTATCIGGCCTAC-3'. PCR s-a realizat folosind următorii 25 pl de reacție: 7,75 pl apă, 2,5 pl tampon 10X LA (PanVera Corp., Madison, Wl), 16 pl amestec dNTP (2,5 mM fiecare), 1 pl din fiecare primer la 50 pM/pl, 1 pl DMSO, 1,5 pl ADN genomic (domeniul concentrațiilor de la 0,075-0,480 pg/pl) și 0,25 pl TaKaRa EX Taq (PanVera Corp., Madison, Wl). Amplificarea PCR s-a realizat într-un Perkin Elmer DNA Thermal Cycler (Norwalk, CT), care a utilizat următoarele condiții: 97’C/7 min, apoi 35 cicluri la 94’C/1 min, 44’C/1 min, 65°C/8 min; urmate de 15 min, la 65’C. După ciclare, cei 25 pl de reacție s-au adăugat la 6x tampon de încărcare gel (0,25% albastru de bromfenol, 40% g/v sucroză în apă). Un gel de agaroză 1% 15x20 cm s-a trecut apoi în tampon TBE (0,09 M Tris-borat, 0,02 M EDTA),

RO 121280 Β1 folosind 8 μΙ din fiecare reacție. Gelul s-a trecut timp de aproximativ 16 h, la 45 v. Gelurile 1 s-au colorat apoi în 20 pg/ml bromură de etidiu, timp de o oră, și s-au decolorat în tampon TBE timp de aproximativ 3 h. S-au făcut apoi fotografii Polaroid® sub lumină UV ale gelurilor. 3 S-au măsurat de pe fotografii prezența și absența benzilor la mărime specifice pentru fiecare tulpină și s-a introdus ca o matrice de similaritate într-un program software de taxono- 5 mie numerică, NTSYS-pc (Exeter Software, Setauket, NY). Controale din tulpina HB 101

E.coli și Xanthomonas oryzae pv. Oryzae s-au testat în același timp ca amprentele PCR 7 produse, care corespund rapoartelor publicate (Versalovic, J., Koeuth, T. și Lupsky, J.R.,

1991, Nucleic Acids Res. 19,6823-6831; Vera Cruz, CM. Halda-Alija, L. Louws, F., Skinner, 9 D.Z., George, M.L., Nelson, R.J., DE Bruijn, F.J., Rice, C și Leach, J.E., 1995, Int. Rice Res.

Notes, 20, 23-24; Vera Cruz, CM., Ardales, E.Y., Skinner, D.Z., Talag, J., Nelson, R.J., 11

Louws, F.J., Leung, H., Mew, T.W. și Leach, J.E., 1996, Phytopathology (respectiv, în presă).

Apoi, s-au analizat date de la tulpini de Photorhabdus cu o serie de programe în NTSYS-pc; 13 SIMQUAL (Similarity for Qualitative data) pentru a genera o matrice a coeficienților de similaritate (folosind coeficientul Jaccard) și SAHN (Sequential, Agglomerative, heirarchical and 15 Nested) pentru a realiza grupări folosind metoda [UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Averages)] care grupează tulpini înrudite și pot fi exprimate ca o fenogramă 17 (fig. 5). Programele COPH (valori cofenetice) și MXCOMP (matrice comparare) s-au folosit pentru a genera o matrice valoare cogenetică și compară corelația dintre acesta și matricea 19 originală pe care s-a bazat gruparea. S-a generat o statistică Mantei (r) normalizată rezultată, care este o măsură a valorii armonizării pentru o analiză de grup (4=0,8-0,9 reprezintă o 21 valoarea foarte bună). în cazul nostru, r= 0,919. De aceea, colecția noastră este compusă dintr-un grup diferit al tulpinilor ușor de evidențiat, ale genului Photorhabdus. 23

Exemplul 13. Utilitatea insecticidă a toxineiflor produsă de tulpini diferite

Photorhabdus 25

Culturile semințe inițiale ale tulpinilor diferite Photorhabdus s-au produs prin inocularea a 175 ml de 2% Proteose Peptone #3 (PP3) (Difco Laboratories, Detroit, Ml) mediu 27 lichid cu o subclonă variată primară într-un flacon de 500 ml cu trei șicane cu un gât Delong, acoperit cu un Kaput. Inoculul pentru fiecare cultură de semințe a derivat de la culturi 29 înclinate agar acoperire-ulei sau culturi pe placă. După inoculare, aceste flacoane s-au incubat pentru 16 h, la 28’C, pentru agitator rotativ la 150 rpm. Aceste culturi de semințe 31 s-au folosit apoi ca surse de inocul uniform, pentru a da fermentație fiecărei tulpini. în plus, s-a acoperit cultura de semințe post-log cu ulei mineral steril, adăugând un agitator magnetic 33 steril pentru resuspendare ulterioară și stocând cultura la întuneric, la temperatura camerei, și asigurând păstrare pe termen lung a inoculului într-o stare competent-toxină. Bulioanele 35 produse s-au inoculat prin adăugarea a 1% de cultură de creștere activă a semințelor la mediu 2% PP3 proaspăt (de exemplu, 1,75 ml per 175 ml mediu proaspăt). Producția 37 bulioanelor s-a realizat fie în flacoane de 500 ml cu trei șicane (vezi mai sus), fie în flacoane cu fund convex de 2800 ml șicanate (volume 500 ml) acoperite printr-o spumă silicon. 39 Flacoanele de producție s-au incubat pentru 24-48 h, în condițiile menționate mai sus. După incubare, bulioanele s-au distribuit în sticle sterile de polietilenă de 11, filat la 2600xg pentru 41 o oră, la 1O°C, și s-a decantat de celule și resturi de pelet. Apoi, bulionul lichid s-a filtrat la vid, prin filtre de sticlă Whatman GF/D (2,7 uM reținere) și GF/B (1,0 fiM reținere), pentru a 43 îndepărta resturile. Clarificarea bulionului, suplimentară, s-a realizat cu un dispozitiv de microfiltrare cu curgere tangențială (Pali Fiitron, Northborough, MA), folosind un filtru cu 45 canal-deschis de 0,5 μΜ. Când este necesar, clarificarea suplimentară poate fi obținută prin răcirea bulionului (la 4°C) și centrifugare pentru câteva ore la 2600xg. După aceste 47 proceduri, bulionul s-a sterilizat prin filtrare folosind un filtru cu membrană de nitroceluloză

RO 121280 Β1

0,2 μΜ. Bulioanele sterile s-au folosit apoi direct pentru teste biologice, analize biochimice sau s-au concentrat (până la 15-ori) folosind o deconectare de 10000 MW, dispozitiv de ultra-filtrare MI2 (Amicon, Beverly, MA) sau concentratori centrifugali (Millipore, Bedford, MA și Pali Fltron, Northborough, MA) cu o mărime de por de 10000 MW. în cazul concentratoarelor centrifugale, bulionul s-a filat la 2000xg pentru aproximativ 2 h. Pătrunsul 10000 MW s-a adăugat la reținerea corespunzătoare, pentru a obține concentrația dorită a componentelor mai mari de 10000 MW. Inactivarea la cald a probelor de bulion procesat s-a realizat prin încălzirea probelor la 100°C, într-un bloc de încălzire umplut cu nisip, pentru 10 min.

Bulionul(le) și complexul(le) toxină de la diferite tulpini de Photorhabdus sunt utilizate pentru reducerea populațiilor de insecte și s-au folosit într-o metodă de inhibare a unei populații de insecte, care cuprinde aplicarea la un locul al insectei, a unei cantități eficiente de inactivare insectă din activul descris. O demonstrație a întinderii activității insecticide observată de la bulionul unui grup selectat al tulpinilor Photorhabdus fermentate, cum s-a descris mai sus, este arătată în tabelul 19. Este posibil ca activități insecticide suplimentare să poată fi detectate cu aceste tulpini, prin concentrația crescută a bulionului sau prin folosirea diferitelor metode de fermentare. Compatibil cu activitatea asociată cu o proteină, activitatea insecticidă a tuturor tulpinilor testate a fost termic labilă (vezi mai sus).

Bulionul(le) de cultură din diferite tulpini de Photorhabdus arată activitate insecticidă diferențială (mortalitatea și/sau inhibarea creșterii a redus emergența adultului) împotriva unui număr de insecte. Mai specific, activitatea se observă împotriva larvelor corn rootworm și boli weevil, care sunt membri ai ordinului Coleoptera. Alți membri ai Coleoptera includ wireworm, pollen beetles, flea beetles și gândacul cartofului de Colorado. Activitatea s-a observat de asemenea și împotriva insectelor homeoptere din familia Cicadellidae și corn plant hopper, care sunt membri ai familiei Homoptera. Alți membri ai Homoptera includ planthopper, pear psylla, apple sucker, scale insects, whitefly, spittle bug, la fel de bine ca numeroase gazde caracteristice speciilor afide. Bulioanele și complexele toxină purificată sunt de asemenea active împotriva tobacco budworm, tobacco hornworm și European corn borer, care sunt membri ai ordinului Lepidoptera. Alți membri tipici ai acestui ordin sunt beet armyworm, cabbage looper, black cutworm, corn earworm, codling moth, clothes moth, Indian mealmoth, leaf roller, cabbage worm, cotton bollworm, bagworm, Eastern tent caterpillar, sod webworm și fall armyworm. Activitatea s-a observat de asemenea împotriva larvelor fruitfly și țânțari care sunt membri ale ordinului Diptera. Alți membri ai ordinului Diptera sunt: pea midge, carrot fly, cabbage root fly, turnip root fly, onion fly, crane fly și musca de casă și diferite specii de țânțari. Activitatea cu bulion(e) și complex(e) toxină este de asemenea observată împotriva two-spotted spider mite, care este un membru al ordinului Acarina, care include strawberry spider mite, broad mite, citrus red mite, European red mite, pear rust mite și tomato russet mite.

Activitatea împotriva larvelor corn rootworm s-a testat cum urmează: bulion(e) de cultură Photorhabdus (concentrat de 0-15 ori, sterilizat prin filtrare), 2% Proteose Peptone #3, complex(e) toxină purificat [0,23 mg/ml] sau tampon 10 mM fosfat de sodiu, pH 7,0 s-au aplicat direct la suprafața (aproape 1,5 cm²) dietei artificiale (Rose, R.l. li McCabe, J.M. (1973), J. Econ. Entomol. 66, (398-400) în 40 ui alicote. Complexul toxină s-a diluat în tampon 10 mM fosfat de sodiu, pH 7,0. Plăcile cu dietă s-au lăsat la aer-uscat într-o nișă-curgere sterilă și godeurile s-au infestat cu individ nou apărut Diabrotica undecimpunctata howardi (Southern corn rootworm, SCR) crestat de pe suprafață de ouă sterilizate. Plăcile s-au etanșat, s-au plasat într-o cameră de creștere umezită și s-a menținut la 27°C, pentru perioada corespunzătoare (3-5 zile). Apoi, s-au înregistrat procente de mortalitate și determinări de greutate larvală. în general, în toate studiile s-au folosit 16 insecte per tratament. Mortalitatea control a fost în general mai puțin de 5%.

RO 121280 Β1

Activitatea împotriva boli weevil (Anthomonas grandis) s-a testat așa cum urmează. 1 Bulioane Photorhabdus concentrate (1-10 ori), mediu de control (2% Proteose Peptone#3), complex(e) toxină purificat [0,23 mg/ml] sau tampon 10 mM fosfat de sodiu, pH 7,0 s-au apli- 3 cat în 60 pl alicote la suprafața 0,35 g dietă artificială (Stoneville Yellow Lepidoptera dietă) și s-au lăsat să se usuce. O singură larvă boli weevil de 12-24 h s-a plasat pe dietă și gode- 5 urile s-au etanșat și s-au ținut la 25°C, 50% RH, timp de 5 zile. Apoi s-au evaluat mortalitatea și greutățile larvale. Mortalitatea control s-a situat între 0-13%. 7

Activitatea împotriva larvelor de țânțari s-a testat după cum urmează. Testul s-a condus într-o placă microtitroare cu 96-godeuri. Fiecare godeu a conținut 200 ui soluție apoasă 9 (concentrată de 10 ori) de bulion(e) de cultură Photorhabdus, mediu control (2% Proteose Peptone #3), tampon 10 mM fosfat de sodiu, complex(e) toxină 0,23 mg(ml sau apă) și 11 aproximativ 20 larve în vârstă de o zi (Aedes aegypti). Au fost 6 godeuri per tratament. Rezultatele s-au citit la 3-4 zile după infestare. Mortalitatea control a fost între 0-20%. 13

Activitatea împotriva fruitflies s-a testat după cum urmează. Mediu Drosophila melanogaster cumpărat s-a preparat folosind 50% mediu uscat și 50% lichid sau apă, mediu 15 control (2% Proteose Peptone #3), bulion(e) de cultură Photorhabdus concentrat de 10-ori, complex(e) toxină purificat [0,23 mg/ml] sau tampon 10 mM fosfat de sodiu, pH 7,0. Acesta 17 s-a acoperit prin plasarea a 4,0 ml mediu uscat în fiecare din 3 fiole de creștere per tratament și adăugare de 4,0 ml de lichid corespunzător. 10 larve de Drosophila melanogasterîn stadii 19 larvare târzii s-au adăugat la fiecare fiolă de 25 ml. Fiolele s-au ținut pe o masă de laborator, la temperatura camerei, sub un plafon cu lumină fluorescentă. După 15 zile de expunere, 21 s-au numărat adulții și pupele. Apariția adulților s-a comparat cu mediul control și apos (0-16% reducere). 23

Activitatea împotriva adulților aster leafhopper (Macrosteles severini) și nimfelor corn planthoppre (Peregrimis maidis) s-a testat cu un test de ingerare menit să permită ingerarea 25 activ fără alt contact extern. Rezervorul pentru soluția activ/^,'hrană^,, este construit prin realizarea a două găuri în centrul porțiunii de jos a unui vas Petri 35x10 mm. S-a plasat pe vârful 27 vasului un pătrat de Parafilm M® de 2 inch și s-a asigurat cu un inel Ό. Apoi s-a infestat o cană de plastic de 1 oz, cu aproximativ 7 indivizi și rezervorul s-a plasat deasupra vasului 29

Parafilm M®, în jos. Soluția test s-a adăugat apoi la rezervor, prin găuri. în testele care au folosit bulion(e) de cultură Photorhabdus concentrat de 10 ori, bulionul și mediu de control 31 (2% proteoză peptonă #3) s-au dializat pe un tampon de 10 mM fosfat de sodiu, pH 7,0 și la soluția rezultantă s-a adăugat sucroză (la 5%), pentru a reduce mortalitatea controlului. 33 Complexul(ele) toxină purificate [0,23 mg/ml] sau tampon fosfat de sodiu 10 mM, pH 7,0 s-au testat de asemenea. Mortalitatea s-a raportat în ziua a 3-a. Testele s-au ținut într-un incuba- 35 tor la 28’C, 70% RH cu o fotoperioadă 16/8. Testele s-au gradat pentru mortalitate la 72 h. Mortalitatea controlului a fost mai mică de 6%. 37

Activitatea împotriva larvelor lepidoteran s-a testat așa cum urmează. Bulion(e) de cultură Photorhabdus concentrat(e) (10 ori), mediu de control (2% proteoză peptonă #3), 39 complex(e) toxină purificate [0,23 mg/ml] sau tampon fosfat de sodiu 10 mM, pH 7,0 s-au aplicat direct pe suprafața (-1,5 cm²) regimului standard artificial lepidoteran (regimul 41 Stoneville Yellow) în 40 ui alicote. Plăcile cu hrană s-au lăsat să se usuce în aer, într-un curs steril acoperit, și fiecare godeu s-a infestat cu o singură larvă nou-apărută. Ouă European 43 corn borer (Ostrinia nubilalis) și tobacco hornworm (Manduca sexta) s-au obținut din surse comerciale și s-au incubat local, în timp ce larve de tobacco budworm (Heliothis virescens) 45 s-au furnizat intern. După infestarea cu larve, plăcile cu hrană s-au sigilat, s-au plasat într-o cameră de creștere umedă și s-au menținut la întuneric la 27°C, pentru o perioadă adecvată. 47 Determinările mortalității și greutății s-au făcut în ziua a 5-a. în general, s-au folosit 16 insecte per tratament în toate studiile. Mortalitatea contolului a fost în general în domeniul 49 4-12,5% pentru mediul de control și mai puțin de 10% pentru tamponul fosfat.

Activitatea împotriva two-spotted spider mite (Tetranychus urticae) s-a determinat așa 51 cum urmează. Plante tinere de dovlecel s-au tăiat la un singur cotiledon și s-au pulverizat

RO 121280 Β1 pentru golire cu bulion(e) concentrat, mediu de control (2% proteoză peptonă #3), complex(e) toxină purificate [0,23 mg/ml] sau tampon fosfat de sodiu 10 mM, pH 7,0. După uscare, plantele s-au infestat cu o populație mixtă de spider mite și s-au ținut la temperatura și umiditatea laboratorului, timp de 72 h. Insectele vii s-au numărat pentru a determina nivelul de combatere.

Tabelul 19

Spectrul insecticid observat la bulioane de la diferite tulpini Photorhabdus

Tulpina Photorhabdus	Speciile de insecte sensibile'
WX-1	3”, 4, 5, 6, 7, 8
WX-2	2,4
WX-3	1,4
WX-4	1,4
WX-5	4
WX-6	4
WX-7	3, 4, 5, 6, 7, 8
WX-8	1,2,4
WX-9	1,2,4
WX-10	4
WX-11	1,2,4
WX-12	2, 4, 5, 6, 7, 8
WX-14	1,2,4
WX-15	1,2,4
W30	3,4, 5, 8
NC-1	1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9
WIR	2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
HP88	1,3, 4, 5,7,8
Hb	3,4, 5, 7,8
Hm	1,2, 3, 4, 5, 7,8
H9	1,2, 3, 4, 5,6, 7,8
W-14	1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
ATCC 43948	4
ATCC 43949	4
ATCC 43950	4
ATCC 43951	4
ATCC 43952	4

* = î 25% mortalitate și/sau inhibare a creșterii vs. control “ =1; tobacco budworm, 2; European corn borer, 3; tobacco hornworm, 4; Southern corn rootworm, 5; bolL weevil, 6; țânțar, 7; fruit fly, 8; aster leafhopper, 9; horn planthopper, 10; two-spotted spider mite.

RO 121280 Β1

Exemplul 14. Tulpini non W-14 Photordabdus: purificare, caracterizare și spectru de1 activitate. Purificare.

Protocolul, așa cum urmează, este similar cu cel dezvoltat pentru purificarea W-143 și s-a stabilit pe baza purificării acelor fracțiuni care au cea mai mare parte a activității împotriva Southern corn root worm (SCR), așa cum s-a determinat în bioteste (vezi exemplul 13).5

De obicei, s-au primit și s-au concentrat 4-20 L bulion care a fost filtrat, așa cum s-a descris în exemplul 13, folosind un cartuș de ultrafiltrare spirală Amicon tip S1 Y100, atașat la un 7 dispozitiv de filtrare Amicon M-12. Retenentul a conținut proteine native care au greutatea moleculară mai mare de 100 kDa, în timp ce materialul de curgere a conținut proteine native 9 mai mici de 100 kDa în mărime. Majoritatea activității împotriva SCR a fost conținută în retenentul de 100kDa. Retenentul s-a diafiltrat, apoi, în continuu cu fosfat de sodiu 10 MM 11 (pH 7,0), până când filtratul a atins un A₂₈₀<0,100. Dacă nu s-ar fi început astfel, din acest punct, toate procedurile s-au desfășurat în tampon definit prin fosfat de sodiu 10 mM 13 (pH 7,0). Retenentul s-a concentrat apoi la un volum final de aproximativ 0,20 I și s-a filtrat utilizând o unitate de filtrare sterilă Nalgene™ Filterware 0,45 mm. Materialul filtrat s-a încăr- 15 cat 7,5 ml/min. pe o coloană Pharmacia HR16/10 care fusese împachetată cu PerSeptive Biosystem Poros® 50 HQ matrice de schimbare puternică anioni echilibrată în tampon, utili- 17 zând un sistem HPLC PerSeptive Biosystem Sprint®. După încărcare, coloana s-a spălat cu tampon, până când s-a atins A_28O0,100. Proteinele s-au eluat apoi de pe coloană la 19 2,5 ml/min, timp de 20 min, până s-a atins un volum de 50 ml folosind tampon cu 0,4 M NaCL. Coloana s-a spălat apoi folosind tampon cu 1,0 M NaCI la aceeași rată de curgere, 21 pentru încă 20 min (volum final = 50 ml). Proteinele eluate ce 0,4 M și 1,0 M NaCI s-au plasat apoi în truse de dializă separate (Spectra/Por® Membrane MWCO: 2.000) și s-au lăsat să 23 dializeze peste noapte, la 4’C, în 12 L tampon. Majoritatea activității împotriva SCR a fost conținută în fracțiunea 0,4 M. Fracțiunea 0,4 M s-a purificat în continuare prin aplicarea unei 25 coloane Pharmacia XK 26/100 care fusese preîmpachetată cu Sepharose CL4B (Pharmacia), folosind o rată de curgere de 0,75 ml/min. Fracțiunile s-au depozitat pe baza 27 profilului peak-ului A₂₈₀ și s-au concentrat la un volum final de 0,75 ml, utilizând un dispozitiv centrifugal de filtrare Millipore Ultrafree® -15 membrană Biomax-50 KNMWL. Concentrația 29 proteinelor s-a determinat folosind un kit Biorad Protein Assay cu globulină standard bovină.

Caracterizarea 31

Greutatea moleculară nativă a complexului toxină SCR s-a determinat folosind o Pharmacia HR16/50 care fusese preîmpachetată cu un tampon Sepharose CL4B. Coloana 33 s-a calibrat apoi utilizând proteine cu greutatea moleculară cunoscută, permițând astfel calcularea mărimii moleculare native, aproximativă, a toxinei. Așa cum se arată în tabelul 20, 35 mărimea moleculară a complexului toxină a fost în domeniul de la 777 kDa, cu tulpina Hb, până la 1.900 kDa cu tulpina WX-14. Randamentul complexului de toxine a variat, de aseme- 37 nea, de la tulpina WX-12 care a produs 0,8 mg/L, la tulpina Hb care a produs 7,0 mg/L.

Proteinele găsite în complexul toxină s-au examinat pentru mărimea polipeptidei indi- 39 viduale, utilizând analiza SDS-PAGE. Tipic, 20 mg proteină a complexului toxină de la fiecare tulpină s-au încărcat pe un gel poliacrilamidă 2-15% (Integrated Separation Systems) și s-au 41 supus electroforezei la 20 mA în tampon Biorad SDS-PAGE. După terminarea electroforezei, gelurile s-au colorat peste noapte în albastru Biorad Coomassie R-250 (0,2% în metanokacid 43 acetic:apă; 40:10:40 v/v/v). în continuare, gelurile s-au decolorat în metanokacid acetic:apă; 40:10:40 (v/v/v). Gelurile s-au limpezit apoi cu apă, timp de 15 min, și s-au scanat folosind 45 un Molecular Dynamucs Personal Laser Densitometer®. Benzile s-au cuantificat și mărimea moleculară s-a calculat așa cum s-a comparat cu standardele de greutate moleculară înaltă 47 Biorad, care au variat de la 200-45 kDa.

RO 121280 Β1

Mărimile polipeptidelor individuale care conțin complexul toxină SCR din fiecare tulpină sunt listate în tabelul 21. Mărimile polipeptidelor individuale au variat de la 230 kDa cu tulpina WX-1, la 16 kDa, așa cum s-a observat la tulpina WX-7. Fiecare tulpină, cu excepția tulpinii Hb, a avut polipeptide care cuprind complexul toxină care sunt în domeniul 160-230 kDa, domeniul 100-160 kDa și domeniul 50-80 kDa. Aceste date arată că respectivul complex toxină poate varia în compoziția peptidei și componentele de la tulpină la tulpină, totuși, în toate cazurile, atributele toxinei par să consiste într-un complex proteină oligameric.

Tabelul 20

Caracterizarea complexului toxină din tulpini Photorhabdhus non W-14

Tulpina	Gr. molec. nativă aprox.a	Producere fracțiune activă (mg/L)b
Hb	972.000	1,8
Hb	777.000	7,0
Hm	1.400.000	1,1
HP88	813.000	2,5
NCI	1.092.000	3,3
WIR	979.000	1.0
WX-1	973.000	0,8
WX-2	951.000	2,2
WX-7	1.000.000	1,5
WX-12	898.000	0,4
WX-14	1.900.000	1.9
W-14	860.000	7,5

³ Greutatea moleculară nativă determinată folosind o coloană Pharmacia HR 16/50 împachetată cu Sepharose CL4B;

^b Cantitatea de complex toxină recuperată de la bulionul de cultură.

Spectrul de activitate

Așa cum se prezintă în tabelul 21, complexele toxină purificate de la tulpini Hm și H9 s-au testat pentru activitatea împotriva unei varietăți de insecte, pentru comparare cu complexul toxină de la tulpina W-14. Testele s-au realizat așa cum s-a descris în exemplul 13. Complexul toxină de la toate trei tulpinile a arătat activitate împotriva tobacco budworm, European corn borer, Southern corn rootworm și aster leafhopper. în plus, complexul toxină de la tulpinile Hm și W-14 a arătat, de asemenea, activitate împotriva two-spotted spider mite. Mai mult, complexul toxină de la W-14 a arătat activitate împotriva larvelor de țânțar. Aceste date arată că, pe măsură ce ele au similarități în activitățile între diferite ordine de insecte, complexul toxină poate, de asemenea, arăta activități diferite împotriva altor ordine de insecte.

RO 121280 Β1

Tabelul 21

Mărimile aproximative (kDa) ale peptidelor într-un complex toxină purificat de la non W-14 Photorhabdus

H9	Hb	Hm	HP	NC-1	WIR	WX-1	WX-2	WX-7	WX-12	WX-14	W-14
			88
180	150	170	170	180	170	230	200	200	180	210	190
170	140	140	160	170	160	190	170	180	160	180	180
160	139	100	140	140	120	170	150	110	140	160	170
140	130	81	130	110	110	160	120	87	139	120	160
120	120	72	129	44	89	110	110	75	130	110	150
98	100	68	110	16	79	98	82	43	110	100	130
87	98	49	100		74	76	64	33	92	95	120
84	88	46	86		62	58	37	28	87	80	110
79	81	30	81		51	53	30	26	80	69	93
72	75	22	77		40	41		23	73	49	90
68	69	20	73		39	35		22	59	41	77
60	60	19	60		37	31		21	56	33	69
57	57		58		33	28		19	51		65
52	54		45		30	24		18	37		63
46	49		39		28	22		16	33		60
40	44		35		27				32		51
37	39				25				26		46
	37				23						40
	35										39
											29

Tabelul 22

Spectrul insecticid observat la un complex toxină purificat de la tulpini Photorhabdus

Tulplina Photorhabdus	Speciile de insecte sensibile*
Complex toxină Hm	1“, 2,3,5,6,7,8
Complex toxină H9	1,2,3, 6, 7,8
Complex toxină W-14	1,2, 3, 4, 5, 6,7,8

' = >25% mortalitate sau inhibarea creșterii;

** = 1; Tobacco bud worm, 2; European corn borer, 3; Southern corn root worm, 4) Mosquito, 5; Two-spotted spider mite, 6; Aster leafhopper, 7; fruit Fly, 8; Boli Weevil.

RO 121280 Β1

Exemplul 15. Subfracționarea complexului toxină proteină Photorhabdus

Complexul toxină proteină Photorhabdus s-a izolat așa cum s-a descris în exemplul 14. în continuare, s-au aplicat aproximativ 10 mg toxină la o coloană MonoQ 5/5 echilibrată cu 20 mM Tris-HCI, pH 7,0 la o rată de curgere de 1 ml/min. Coloana s-a spălat cu 20 mM Tris-HCI, pH 7,0, până când densitatea optică la 280 nm s-a întors la absorbanta liniei de bază. Proteinele legate la coloană s-au eluat cu un gradient linear de 0 la 1,0 M NaCI în 20 mM Tris- HCI, pH 7,0 la 1 ml/min pentru 30 min. S-au colectat fracțiuni de 1 ml și s-au supus la biotest Southern corn rootworm (SCR) (vezi exemplul 13). Peak-urile activității s-au determinat printr-o serie de diluții ale fiecărei fracțiuni în bioteste SCR. Două peak-uri de activitate împotriva SCR s-au observat și s-au numit A (eluat la aproape 0,2-0,3 M NaCI) și B (eluat la 0,3-0,4 M NaCI). Peak-urile de activitate A și B s-au depozitat separat și ambele peak-uri s-au purificat suplimentar folosind o procedură în 3 etape, descrisă mai jos.

(NH₄)₂SO₄ solid s-a adăugat la fracțiunea de proteină de mai sus, la o concentrație finală de 1,7 M. Apoi, proteinele s-au aplicat la o coloană fenil-Superose 5/5 echilibrată cu 1,7 M (NH₄)₂SO₄ în tampon 5 mM fosfat de potasiu, pH 7 la 1 ml/min. Proteinele legate la coloană s-au eluat cu un gradient liniar de 1,7 M (NH₄)₂SO₄, 0% etilen glicol, 50 mM fosfat de potasiu, pH 7,0, la 25% etilen glicol, 25 mM fosfat de potasiu, pH 7,0 (nu (NH₄)₂SO₄ la 0,5 ml/min. Fracțiunile s-au dializat peste noapte peste un tampon 10 mM fosfat de sodiu, pH 7,0. Activitățile în fiecare fracțiune împotriva SCR s-au determinat prin biotest.

Fracțiunile cu activitate mai ridicată s-au depozitat și s-au aplicat la o coloană MonoQ 5/5, care s-a echilibrat cu 20 mM Tris-HCI, pH 7,0 la 1 ml/min. Proteinele legate la coloană s-au eluat la 1 ml/min printr-un gradient linear de la 0 până la 1 M NaCI în 20 mM Tris-HCI, pH 7,0.

Pentru etapa finală de purificare, fracțiunile mai active, de mai sus, (determinate prin biotest SCR) s-au depozitat și s-au supus la o a doua coloană fenil-Superose 5/5. (NH₄)₂SO₄ solid s-a adăugat la o concentrație finală de 1,7 M. Apoi, soluția s-a încărcat la coloana echilibrată cu 1,7 M (NH₄)₂SO₄ în tampon 50 mM fosfat de potasiu, pH 7 la 1 ml/min. Proteinele legate la coloană s-au eluat cu un gradient linear de 1,7 M (NH₄)₂SO₄ mM fosfat de potasiu, pH 7,0, la 10 mM fosfat de potasiu, pH 7,0 la 0,5 ml/min. Fracțiunile s-au dializat peste noapte împotriva unui tampon 10 mM fosfat de sodiu, pH 7,0. Activitățile în fiecare fracțiune împotriva SCR s-au determinat prin biomasă.

Proteina finală purificată prin procedura în 3 etape de mai sus, de la peak-ul A, s-a numit toxina A, iar proteina finală purificată de la peak-ul B s-a numit toxina B.

Caracterizarea și secvențarea aminoacidă a toxinei A și toxinei B în SDS-PAGE Ambele toxine A și B au conținut două peptide majore (>90% din proteina totală colorată Commassie ): 192 kDa (numită Al și, respectiv, Bl) și 58 kDa (numite A2 și, respectiv, B2). Ambele toxine A și B relevă numai o bandă majoră în PAGE nativă, indicând că Al și A2 sunt subunități ale unui complex proteină, iar Bl și B2 sunt subunități ale unui complex proteină. Suplimentar, greutatea moleculară nativă a ambelor toxine A și B s-a determinat, prin cromatografie filtrare gel, a fi 860 kDa. Concentrațiile molare relative ale Al și A2 s-au apreciat a fi o echivalență 1 la 1, cum s-a determinat prin analiza densitometrică a gelurilor SDS-PAGE. în mod similar, peptidele Bl și B2 au prezentat aceeași concentrație molară.

Toxina A și toxina B s-au supus electroforezei în 10% SDS-PAGE și s-au transblott-at la membrane PVDF. Blott-urile s-au transmis pentru analiza aminoacidă și secvențarea aminoacidă N-terminală la Harvard MicroChem, și respectiv, Cambridge ProChem. Amino secvența N-terminală a lui Bl s-a determinat a fi identică la SEQ ID NR:1, regiunea TcbA^ a genei tcbA (SEQ ID NR: 12, poziția 87 la 99). O secvență N-terminală unică s-a obținut pentru peptidă B2 (SEQ ID NR:40). Secvența aminoacidă N-terminală a peptidei B2 a fost

RO 121280 Β1 identică cu regiunea TcbA^ a secvenței aminoacide derivate de la gena tcbA (SEQ ID NR:12, 1 poziția 1935 la 1945). De aceea, toxina B conținea predominant 2 peptide, TcbA;, și TcbA,,,, care s-a observat că sunt derivate de la același produs genă, TcbA. 3

Secvența N-terminală a A2 (SEQ ID NR:41) a fost unică în comparație cu peptida TcbAjji și alte peptide. Peptida A2 s-a denumit TcdA^ (vezi exemplul 17). SEQ ID NR:6 s-a 5 determinat a fi un amestec al secvențelor aminoacide SEQ ID NR: 40 și 41.

Peptidele A1 și A2 s-au supus în continuare secvențării aminoacide interne. Pentru 7 secvențarea aminoacidă internă s-au supus electroforezei 10 pg de toxină A în 10% SDS-PAGE și s-au transblott-at la o membrană PVDF. După ce blott-ul s-a colorat cu amido 9 black, peptidele A1 și A2, denumite TcdAj; și respectiv TcdA^, s-au excizat de pe blot și s-au trimis la Harvard MicroChem și la Cambridge ProChem. Peptidele s-au supus digerării trip- 11 șină, urmată de cromatografia HPLC, pentru a separa peptidele individuale. Analiza aminoacidului N-terminal s-a realizat pe fragmentele de peptidă triptic selectate. Două secvențe 13 aminoacide interne ale peptidei A (TcdA_ji-PK71, SEQ ID NR:38 și TcdAj|-PK44, SEQ ID NR:39) s-au găsit a avea omologii semnificative cu secvențele aminoacide deduse ale 15 regiunii Tcb^ a genei tcbA (SEQ IDNR:12), Similar, secvența N-terminală (SEQ ID NR:41) și 2 secvențe interne ale peptidelor A2 (TcdA_iij-PK57, SEQ ID NR:42 și TcdA_ijj-PK20, SEQ 17 ID NR:43) au prezentat, de asemenea, omologie semnificativă cu secvențele aminoacide deduse ale regiunii TcbA^ ale genei tcbA (SEQ ID NR.-12). 19 în rezumatul rezultatelor de mai sus, complexul toxină are cel puțin 2 complexe toxină proteină active împotriva SCR: toxina A și toxina B. Toxina A și toxina B sunt similare în gre- 21 utățile lor moleculare native și în subunități, totuși, compozițiile lor de peptide sunt diferite. Toxina A conține peptidele TcdAj, și TcdA,,, ca peptide majoritare și toxina B conține TcbA;; 23 și TcbA,,, ca peptide majoritare.

Exemplul 16. Clivarea și activarea peptidelor TcbA 25 în complexul toxină B, peptidele TcbA,, și TobA^ creează de la un singur produs genă

TcbA (exemplul 15). Procesarea peptidei TcbA la TcbAj, și TcbA,,; este prezumată prin acți- 27 unea proteazei(lor) Photorhabdus și, cel mai probabil, a metaloproteazelor descrise în exemplul 10. în unele cazuri, s-a notat că, atunci când bulionul W-14 Photorhabdus s-a procesat, 29 peptida TcbA s-a prezentat în complexul B toxină, ca o componentă majoră, în adiție cu peptidele TcbAjj și TcbAjj Proceduri identice, descrise pentru purificarea complexului toxină B 31 (exemplul 15), s-au folosit pentru a îmbogăți peptida TcbA de la fracțiunea complex toxină a bulionului W-14. Materialul final purificat s-a analizat într-un gradient 4-20% SDS-PAGE 33 și peptidele majore s-au cuantificat prin densitometrie. S-a determinat că TcbA, TcbAjj și TcbAjjj au cuprins 58%, 36% și respectiv 6% din proteina totală. Identitățile acestor peptide 35 s-au confirmat prin mărimile lor moleculare în analizele SDS-PAGE și Western Blot, folosind anticorpi specifici. Greutatea moleculară nativă a acestei fracțiuni s-a determinat a fi de 37 860 kDa.

Clivajul TcbA s-a evaluat prin tratarea materialului purificat de mai sus cu 38 kDa și 39 58 kDa metaloprotează W-14 Photorhabdus (exemplul 10) și Tripsină ca enzimă de control (Sigma, MO). Reacția standard a constat în 17,5 pg din fracția purificată de mai sus, 1,5 41 unități protează și 0,1 M tampon Tris, pH 8,0, într-un volum total de 100 pl. Pentru reacția de control s-a omis protează. Amestecul de reacție s-a incubat la 37°C, timp de 90 min. La sfâr- 43 șitul reacției, s-au luat 20 μΙ și s-au fiert cu tampon probă SDS-PAGE pentru analiza electroforetică în SDS-PAGE gradient 4-20%. Din SDS-PAGE s-a determinat că, atât în tratamentul 45 cu protează 38 kDa, cât și în cel cu protează 58 kDa, cantitatea de peptide tcbA,, și TcbA,,; a crescut de 3 ori, în timp ce cantitatea de peptidă TcbA a scăzut proporțional (tabelul 23). 47

Reducerea relativă și creșterea peptidelor selectate s-au confirmat prin analiză Western Blot.

RO 121280 Β1

Mai mult, filtrarea gelului materialului clivat a relevat că mărimea moleculară nativă a complexului a rămas aceeași. Prin tratament cu Trypsină, peptidele TcbA^ și TcbA,,, au fost digerate nonspecific în peptide mici. Aceasta arată că proteazele Photorhabdus 38 kDa și 58 kDa pot procesa specific peptida TcbA, în peptidele TcbA,, și TcbA,,,. Controlul protează tratat și netratat al celor 80 pl rămași din amestecul de reacție s-a diluat în serie cu 10 mM tompon fosfat de sodiu, pH 7,0 și s-a analizat prin biotest SCR. Prin compararea activității la diferite diluții, s-a determinat că tratamentul protează 38 kDa a crescut activitatea insecticidă SCR de aproximativ 3 până la 4 ori. Inhibarea creșterii insectelor rămase în tratament protează este, de asemenea, mai gravă decât cea a controlului (tabelul 23).

Tabelul 23

Conversia și activarea peptidei TcbA In peptidele TcbA,; și TcbA,,,, prin tratament protează

	Control	Tratament protează 38 kDa
S0 (% din total proteină)	58	18
S1 (% din total proteină)	36	64
S9 (% din total proteină)	6	18
LD 50 (pg proteină)	2,1	0,52
Greutate SCR (mg/insectă)*	0,2	0,1

*- un indicator al inhibării creșterii prin măsurarea greutății medii a insectelor vii, după 5 zile de regim în test.

Exemplul 17. Cercetarea băncii pentru gene care codifică peptida TcdA„

S-au finalizat donarea și caracterizarea genei care codifică peptida TcdA„, descrisă ca SEQ ID NR:17 (secvența peptidei interne TcdA„-PT111 N-terminală) și SEQ ID NR:18 (secvența peptidei interne TcdA_rPT79 N-terminală). S-au sintetizat așa cum s-a descris în exemplul 8, 2 depozite de oligonucleotide degenerate proiectate să codifice secvențele aminoacide a SEQ ID NR:17 (tabelul 24) și SEQ ID NR:18 (tabelul 25) și complementele inverse ale acestora două. Secvența ADN a oligonucleotidelor este dată mai jos:

CO

io

CD

T~

CO

lO

N-

CD

T-

CO

IO

T—

r—

CM

CM

CM

CM

'ΜCXl

RO 121280 Β1

co	I Ser						?·%
f—	5	g	5	Pi δ	Fn 8 <	8	£
10	£	!	S	g δ	5 i	5	$
V.	A 3	|	ă	g	I	E	£
•țf·	S	I	£	i	< g	ξ	£
-			ί	g s	£ < ϋ.	R	y <
	2	i	ί	I	£ i	g	o
-	«c	z 8 5n	I σ O w*l	o δ <; 8 Ol	O-.	Oi	o 5 O.
f	T> Ί5 §		**î si	Vț e«*î Si	oi Ό ♦·» si	g r*Î <1	CQ V ed 2

Ο

Oligonucleotida degenerată pentru SEQ ID NR:18	m	* 42	rn >	r*l P*	r~k ș	p>	K	2 *<7> O a <
2*	3 <	>-		i	$	P 5
-	e w CL·	§	g	S	s	O < 2	i ? >z /i o <5 n 7”
o		>		<		£
«λ	>		g	§	y	& GC
«*o	»· ϋ	s	8	>- 8	y	5 ar	i-’ => s? o i f-T i o < cu,
	3	*0	£	OC £	oi, < >·	O 3
Ό	5		g	>	y	8 c
V»	Js H	§		δ <	s 3	3
Μ-	£					£ <	«—< s o 3 1 8 <s * i o s E I <p c ·§ o
e-1	TI >	i	g	g	§	8 >
	«» e	ZE				t: <
-	c«	£ Oi	£ Οι	£ «Λ	t < Oi	< Oi
1	*H 8 ί 6	7g	0Î £	m ε si	2 0k £	8 ei ε si

co

RO 121280 Β1

Reacții polimerazice de lanț (PCR) s-au realizat în principal cum s-a descris în exemplul 8, utilizând ca primeri forward P2.3.6.CB sau P2.3.5 și ca primeri reverse P2.79.R.1. sau P2.79R.CB, în toate combinațiile forward/reverse, folosind ADN genomic Photohabdus W-14 ca matriță. în alt set de reacții, primerii P2.79.2 sau P2.79.3 s-au folosit ca primeri înainte și P.2.3.5R, P2.3.5RJ și P2.3R.CB s-au utilizat ca primeri inverși în toate combinațiile înainte/invers. Doar în reacțiile conținând P2.3.6.CB ca primeri înainte combinat cu P2.79.R. 1. sau P2.79R.CB ca primeri invers s-a observat un produs amplificat non-artefactual cu mărime estimată (mobilitate pe geluri agaroză) de 2500 perechi baze. Ordinul primerilor folosiți pentru a obține acest produs de amplificare arată că fragmentul peptidă TcdA^PTIH este situat amino-proximal la fragmentul peptidă TcdA_jj-PT79.

Produsele PCR 2500 bp s-au ligat la vectorul plasmid pCM™ll (Invitrogen, San Diego, CA), conform instrucțiunilor furnizorilor, iar secvențele ADN situate de-a lungul capetelor fragmentelor insert ale celor două izolate (HS24 și HS27) s-au determinat utilizând primerii recomandați de furnizori și metodele de secvențare descrise anterior. Secvența ambelor izolate a fost aceeași. Primerii noi s-au sintetizat pe baza secvenței determinate și s-au folosit la reacțiile de secvențare primer adițional, pentru a obține un total de 2557 baze ale insertului [SEQID NR;36]. Translația peptidei parțiale codificată prin SEQID NR:36 a dat secvența 845 aminoacidică descrisă ca SEQ ID NR.37. Analiza omologiei de proteină a acestei porțiuni a fragmentului de peptidă TcdA^A arată o omologie aminoacidă substanțială (68% similaritate; 53% identitate) la resturile 542 la 1390 ale proteinei TcbA [SEQ ID NR: 12], Cu toate acestea, se pare că gena reprezentată în parte prin SEQ ID NR:36 produce o proteină a secvenței aminoacide similare, dar nu identică, precum proteina TcbA și a cărei asemănare a avut activitate similară, dar nu identică cu proteina TcbA.

într-o altă realizare, o genă care codifică peptidele TcdA_ij-PK44 și peptidă N-terminală TcdAjjj de 58 kDa, descrisă ca SEQ ID NR:9 (secvența TcdA^ PK44 peptidă internă), s-a izolat SEQ ID NR:41 (secvența peptidei N-terminale TcdA^ de 58 kDa). Două depozite de oligonucleotide degenerate, desemnate a codifica secvențele aminoacide, descrise precum SEQ ID NR:39 (tabelul 27) și SEQ ID NR:41 (tabelul 26) și complemente reverse ale acestor secvențe, s-au sintetizat în exemplul 8 și secvențele lor AND.

<Ό

m

b-

σ>

τ—

CO

ιη

b-

σ>

τ-

CO

m

b-

X-

χ-

ν-

CXI

CXI

CXJ

CM

RO 121280 Β1

xt	Gin	< O	i CA 3'	?η Ο Ο ai	1CC 3'
m	s Q_	tti 8	8	δ Od	<
CM		£	>	8	fe
—	£	E	B	Ε οί	ο 5
ο	s	ξ	c£ £	£ ac	fe
σ'	1·	i< o	> < o	α: < >	Η cd
•ο	£	> <J <	ΰ <	ι	ο < ω
ο-	J	g	>	%	< < <
ο	u 12	δ <	ω <	θ' < >	ο < ο
W,	c -2	t- $	μ· < <		8
	.s <	ΰ o	ΰ ο	% >	g 0-,
m	&· Λ	>-		8 >
<Ν	ε· <	> o CJ		Cn
—	5	C*î
*4fc	32 Μ m 5 a <	o4 <	CM 3	α£ »η 3	A2.4.R

CM φ ο

,Ο) δ σ>

Οί

Q

Ο UJ

C0

<£	Ch	U	<-**> <	1 CC 3· ι	ΑΤ3·	ί CC3’
.·**» W»	©φ	«a <	Ξ ο	αζ ο ο	Ο ο	ο ο
μγ	r-	£	8 <	>ο <	ο <	ο <
(CI)	\©	1	t— < <		> < <	g
CM	4*Ί		ξ		& <	δ <
(II)		-2 Ο	$ ο	g	< ο
ο	<*>	J		i	1= ο	£ ο
S*	04	e Ou	αί 8	8 ο	8	ο ο
OQ*	-	-2> Ο	> 8 îH	F < ÎCj	ο ο ·**	F< wn>
«I ο C e <	ϊ* fi ο 3	3 ί <	X τ—1 <	Di w X ΰ	α 3	OC 04 χτ χ» 5

b<0

RO 121280 Β1

S-au realizat Polymerase Chain Reactions (PCR) în esență, așa cum s-a descris în exemplul 8, folosind ca primeri înainte Al.44.1 sau Al.44.2 și ca primeri inverși A2.3R sau A2.4R în toate combinațiile înainte/invers, folosind ca matriță ADN genomic Photorhabdus W-14. într-un alt set de reacții, primerii A2.1 sau A2.2 s-au folosit ca primeri înainte și A1.44.1R și AI.44.2R s-au folosit ca primeri inverși în toate combinațiile înainte/invers. Doar în reacțiile care au conținut Al.44.1 sau Al.44.2 ca primeri înainte combinați cu A2.3R ca primer invers, s-a observat un produs amplificat non-artefactual, de mărime estimată (mobilitate pe geluri de agaroză) de 1400 baze perechi. Ordinea primerilor utilizați pentru a obține acest produs de amplificare arată că fragmentul de peptidă TcdA^ TK44 este situat amino-proximal la fragmentul peptidă de 58 kDa al TcdA,,,.

Produsele PCR de 1400 bp s-au ligat la vectorul plasmid pCR™II conform instrucțiunilor furnizorului. Secvențele ADN de-a lungul capetelor fragmentelor insert a patru izolate s-au determinat utilizând primeri similari în secvență la primerii recomandați de furnizor și utilizând metode de secvențare descrise anterior. Secvența de acid nucleic a tuturor izolatelor diferă, așa cum s-a așteptat, în regiuni care corespund secvențelor primer degenerate, dar secvențele aminoacide deduse din aceste date au fost aceleași precum secvențele aminoacide actuale pentru peptide determinate anterior (SEQ ID NR:41 și 39).

Cercetarea băncii cosmid genomic W-1.4, așa cum s-a descris în exemplul 8 cu o probă radiomarcată, a cuprins ADN-ul preparat mai sus (SEQ ID NR:36), a identificat cinci cosmizi izolați care hibridizează 19D9,20B10,21D2.27B10 și 26D1. Acești compuși au fost diferiți de cei identificați anterior cu probe care corespund genelor descrise ca SEQ ID NR:11 sau SEQ ID NR:25. Analizele enzimă de restricție și hibridizări blot ADN au identificat fragmente EcoR I, de mărimi aproximative 3,7, 3,7 și 1,1 kbp, care cuprind regiunea cu ADN-ul SEQ ID NR:36. Cercetarea băncii cosmid genomic W-14, utilizând ca probă fragmentul ADN radiomarcat de 1,4 kbp preparat în acest exemplu, a identificat aceiași cinci cosmizi (17D9, 20B10,21D2,27B10 și 26D1). Hibridizarea blot ADN la EcoR l-digerat ADN-uri cosmid, de asemenea, a arătat hibridizare la același subset al fragmentelor EcoR I, cum s-a observat cu proba genă TcdAj, de 2,5 kbp, care arată că ambele fragmente sunt codificate pe ADN genomic.

Determinarea secvenței ADN a fragmentelor EcoR I donate a arătat un cadru de citire neîntrerupt de 7551 baze perechi (SEQ ID NR:46), care codifică o proteină de 282,9 kDa de 2516 aminoacizi (SEQ ID NR:47). Analiza secvenței aminoacide a acestei proteine a revelat toate fragmentele interne ale peptidelor TcdA^ SEQ ID NR:17, 18, 37, 38 și 39 și N-terminusul peptidă TcdA^ (SEQ ID NR:41) și toate peptidele interne TcdA^ (SEQ ID NR:42 și 43) așteptate. Peptidele izolate și identificate ca TcdA^ și TcdA^ sunt fiecare produs al cadrului deschis de citire, denumit tcdA, descris ca SEQ ID NR:46. în continuare, SEQ ID NR:47 arată, începând de la poziția 89, secvența descrisă ca SEQ ID NR:13 care este secvența N-terminală a unei peptide de mărime aproximativă 201 kDa, care arată că proteina inițială produsă de la SEQ ID NR:46 este procesată într-o manieră similară cu cea descrisă mai devreme pentru SEQ ID NR:12. în plus, proteina este mai departe clivată pentru a genera un produs cu mărimea 209,2 kDa, codificat de SEQ ID NR:48 și descris ca SEQ ID NR:49 (peptidă TcdA;;) și un produs cu mărimea de 63,6 kDa codificat de SEQ ID NR:50 și descris ca SEQ ID NR.51 (peptidă TcdAJ. Astfel, se consideră că activitatea insecticidă identificată ca toxina A (exemplul 15) derivată de la produsele SEQ ID NR.46 exemplificate prin proteina de lungime întreagă de 282,9 kDa, descrisă ca SEQ ID NR.47, este procesată pentru a produce peptidele descrise ca SEQ ID NR:49 și 51. Se consideră că activitatea insecticidă identificată ca toxina B (exemplul 15) derivă de la produsele SEQ ID NR:11, așa cum s-a exemplificat prin proteina de 280,6 kDa descrisă ca SEQ ID NR:12. Această proteină este procesată proteolitic pentru a obține peptidă de 207,6 kDa descrisă ca SEQ ID NR:53, care este codificată de SEQ ID NR:52 și peptidă de 62,9 kDa care are secvența

RO 121280 Β1

N-terminală descrisă ca SEQ ID NR:40 și mai departe descrisă ca SEQ ID NR:55, care este 1 codificată de SEQ ID NR:54.

Comparațiile secvenței aminoacide, între proteinele descrise ca SEQ ID NR:12 și 3 SEQ ID NR:47, au arătat că ele au similaritate 69% și identitate 54%. Acest grad înalt de relații în evoluție nu este uniform de-a lungul întregii secvențe aminoacide a acestor peptide, 5 dar este mai mare spre capătul carboxi-terminal al proteinelor, pe măsură ce peptidele descrise ca SEQ ID NR:51 (derivată de la SEQ ID NR:47) și SEQ ID NR:55 (derivată de la 7 SEQ ID NR:12) au similaritate 76% și identitate 64%.

Exemplul 18. Combaterea distrugerii de porumb 9

Capacitatea toxinei(lor) Photorhabdus de a reduce distrugerea plantei cauzată de larvele insectelor s-a demonstrat prin măsurarea distrugerii frunzei cauzată de European 11 comborer (Ostrinia nubilalis) infestată pe plante de porumb tratate cu bulion Photorhabdus. Fermentarea bulionului de la Photorhabdus tulpina W-14 s-a produs și s-a concentrat de 13 aproximativ 10 ori prin ultrafiltrare (10000 MW mărime por), așa cum s-a descris în exemplul 13. Bulionul concentrat rezultat s-a sterilizat apoi prin filtrare, folosind ca filtre membrane de 15 nitroceluloză 0,2 p. O probă preparată similar, de 2% proteose peptone #3 neinoculată, s-a folosit în scop de control. Plantele de porumb (o linie încrucișată proprietatea DowElanco) 17 s-au crescut din semințe la stadiul vegetativ 7 sau 8, în vase care conțin un amestec fără pământ, într-o seră (27°C ziua; 22°C noaptea, aproape 50% RH, 14 h zi-lumină, udate/fertilizate 19 după nevoie). Plantele test s-au aranjat într-o schemă bloc complet randomizat (3 repetiții/tratament, 6 plante/tratament), într-o seră cu temperatura de aproape 22°C ziua; 21 18°C noaptea, fără lumină artificială și cu umbrire parțială, aproape 50% RH și udate/fertilizate după nevoie. S-au aplicat tratamente (mediu neinoculat și bulion concentrat 23 Photorhabdus) cu o seringă spray, 2,0 ml aplicat direct (aproape 6 inch) deasupra verticilului și încă 2,0 ml aplicați într-o mișcare circulară de la aproximativ un picior deasupra verticilului. 25 în plus, un grup de plante nu a primit tratament. După ce tratamentele s-au uscat (aproximativ 30 min), 12 larve nou apărute, European corn borer (obținute din surse comerciale și incu- 27 bate cu mijloace proprii), s-au aplicat direct pe vedicii. După 1 săptămână, plantele s-au cercetat pentru distrugerea frunzelor, folosind o scală Guthrie modificată (Koziel, M.G., Belnad, 29 G.L., Bowman, C, Carozzi, N.B., Crenshaw, R., Crossland L., Dawson, 1, Desai, N., Hill, M„ Kadwell, S., Launis, K., Lewis, K-, Maddox, D., McPherson, K., Meghji, M.Z., Merlin. E., 31

Rhodes, R., Warren, G.W., Wright, M. și Evola, S.V., 1993, Bio/Technology, 11, 194-195) și măsurătorile s-au comparat statistic [T-test (LSD) p<0,05 și Tukey's Studentized Range 33 (HDS) Test p<0,1 ]. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 28. Ca referință, 1 înseamnă nici o distrugere, 2 reprezintă distrugere fină fereastră pe frunza nedesfăcută fără penetrație 35 por și 5 reprezintă penetrația frunzei cu leziuni alungite și/sau nervura de mijloc mâncată, evidentă la mai mult de 3 frunze (leziuni <1 inch). Aceste date arată că bulionul sau alte pro- 37 teine care conțin fracțiunile pot conferi protecție împotriva anumitor insecte parazite, când se administrează în formula spray sau când gena sau derivații acesteia care codifică prote- 39 ina, sau o parte a acesteia este administrată via o plantă trangenică sau un microb.

Tabelul 28

Efectul bulionului de cultură Photorhabdus pe distrugerea frunzei induse43

Tratament Măsurare Guthrie medie

Fără tratament 5,02^a45

Mediu neinoculat5,15

Bulion Photorhabdus 2,24^b47

Mediile cu litere diferite sunt diferite statictic (p<0,05 sau p<0,1).

RO 121280 Β1

Exemplul 19. Ingineria genetică a genelor pentru exprimarea în E.coli

Rezumatul construcțiilor

S-au construit o serie de plasmizi pentru a exprima gena Photorhabdus W-14 în Escherichia coli. în tabelul 29, este prezentată o listă a plasmizilor. S-au obținut date pentru o descriere pe scurt a fiecărui construct ca un rezultat al expresiei E.coli.

Tabelul 29

Plasmizi de expresie pentru gena tcbA

Plasmid	Genă	Vector /Selecție	Comportament
pDAB634	tcbA	pBC/Chl	Intracelular
pAcGP67/tcbA	tcbA	pAcG67B/Amp	Baculovirus secretat
PDAB635	tcbA	pET27b/Kan	Periplasm
pET 15-tcbA	tcbA	pET15-tcbA	Intracelular

Abrevieri: Kan=kanamicină, Chl=cloramfenicol, Amp=ampicilină

Construcția pDAB634 în exemplul 9, este descris un fragment mare EcoR I care hibridizează la proba TcbA_a. Acest fragment s-a subclonat în pBC (Stratagene, La Jolla CA). Analiza de secvență a arătat că acest fragment esteformat din 8816 perechi baze. Fragmentul codifică gena tcbA cu ATG care inițiază la poziția 571 și TAA care termină la poziția 8086. Prin urmare, fragmentul poartă 570 perechi baze de ADN Photorhabdusîn amontele ATG și 730 perechi baze în avalul TAA.

Construcția plasmidului pAcGP67BftcbA

Gena tcbA s-a amplificat PCR folosind primerii următori: 5' primer (S1Ac51) 5' TTT AAA CCA TGG GAA ACT CAT TAT CAA GCA CTA TC 3' primer (S1 Ac31) 5' TTT AAA GCG GCC GCT TAA CGG ATG GTA-TAA CGA TAT TG 3'. S-a realizat PCR folosind un kit TaKaRa LA PCR de la PanVera (Madison, Wisconsin) în reacția următoare: 57,5 ml apă, 10 ml tampon 10X LA, 16 ml dNTPs (2m5 mM fiecare soluție stoc), 20 ml fiecare primer la 10 pmoli/ml, 300 ng plasmid pDAB634 care conține gena tcbA și 1 ml polimerază TaKaRa LA Taq. Condițiile de ciclare au fost 98°C/20 s, 68°C/5 min, 72°C/10 min pentru 30 cicluri. Un produs PCR așteptat de aproape 7526 bp s-a izolat într-un gel de 0,8% agaroză în tampon TBE (100 mM Tris, 90 mM acid boric, 1 mM EDTA) și s-a purificat utilizând un kit Qiaex II de la Qiagen (Chatsworth, California). Gena tcbA purificată s-a digerat cu Nco I și Not I și s-a ligat în vectorul transfer baculovirus pAcGP67B (PharMingen (San Diego, California)) și s-au transformat în E.coli DH5a. Gena tcbA s-a tăiat apoi de la pAcGP67B și s-a transferat la pET27b pentru a crea plasmidul pDAB635. S-a reparat în pDAB635 o mutație în sens greșit, în gena tcbA.

Gena tcbA reparată conține 2 modificări de la secvența arătată în SEQID NR: 11; un A>G la schimbarea 212, o aspargină 71 laserină 71 și un G>Ala schimbarea 229, o alanină 77 la treonină 77. Aceste schimbări sunt amândouă mai sus de N-terminusul TcbA^ propus.

Construcția pET 15-tcbA

Regiunea care codifică tcbA a pDAB635 s-a transfectat la vectorul pET 15b. Aceasta s-a realizat utilizând ligări shotgun, ADN-urile s-au tăiat cu enzimele de restricție Nco I și Xho I. Recombinantul rezultat s-a denumit pET15-tcbA.

Exprimarea TcbA în E.coli de la plasmidul pET15-tcbA

RO 121280 Β1

Exprimarea tcbA în E.coli s-a obținut prin modificarea metodelor anterioare descrise de Studieret al. (Studier, F.W., Rosenberg, A., Dunn, J. și Dubendorff, J., (1990) Use ofT7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol., 185, 60-89). Celule corespunzătoare 2s.co//tulpina BL21 (DE3) s-au transformat cu plasmidul pET 15-tcbA și s-au depus pe agar LB care conține 100 pg ampicilina și 40 mM glucoza. Celulele transformate s-au depus la o densitate de câteva sute de colonii izolate/placă. După incubare peste noapte, la 37’C, celulele s-au curățat de pe plăci și s-au suspendat în bulion LB care conține 100 pg ampicilina. Volumele tipice de cultură au fost de 200-500 ml. La momentul zero, densitățile culturii (OD6GO) erau de la 0,15-0,5, în funcție de experiment. Culturile s-au scuturat la una din trei temperaturi (22°C, 30°C sau 37°C), până când densitatea de 0,15-0,5 s-a obținut la momentul în care ele s-au indus cu 1 mM izopropiltio-8-galactozidă (IPTG). Culturile s-au incubat la temperatura desemnată, timp de 4-5 h, și apoi s-au transfectat la 4*C până la procesare (12-72 h).

Purificarea și caracterizarea TcbA exprimată în E.coli de la plasmidul pET15-tcbA

Culturile E.coli care exprimă peptideTcbA s-au procesat așa cum urmează. Celulele s-au recoltat prin centrifugare la 17.000 x G și mediul s-a decantat și s-a păstrat într-un container separat.

Mediul s-a concentrat de aproape 8x folosind sistemul de filtrare M12 (Amicon, Beverly MA) și un filtru de separare cu masa moleculară 100 kDa. Mediul concentrat s-a încărcat pe o coloană schimb anion și proteinele legate s-au eluat cu 1,0 M NaCI. S-a constatat că peak-ul de eluție 1,0 M NaCI a cauzat mortalitatea larvelor Southern corn rootworm (SCR) (tabelul 30). Fracțiunea 1,0 M NaCI s-a dializat pe tampon 10 mM fosfat de sodiu pH 7,0, concentrat și s-a supus la filtrare pe gel pe Sepharose CL-4B (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Regiunea profilului de eluție CL-4B care corespunde masei moleculare calculate (aproape 900 kDa), precum complexul toxină W-14 nativă, s-a colectat, concentrat și biotestat împotriva larvelor. Fracțiunea colectată de 900 kDa s-a găsit a avea activitate insecticidă (vezi tabelul 30, mai jos) cu simptologie similară cu acea cauzată de complexul toxină W-14 nativ. Această fracțiune s-a supus la Proteinase K și tratament termic, activitatea în ambele cazuri fie s-a redus, fie a fost eliminată, furnizând dovada că activitatea este de natură proteică în natură. în plus, fracțiunea activă s-a testat imunologic pozitiv pentru peptidele TcbA și TcbA,, în analize imunoblot, când s-a testat un anticorp monoclonal antiTcbAii (tabelul 30).

Tabelul 30

Rezultatele biotestelor imunoblot și SCR

Fracțiunea	Activitate SCR	Imunoblot	Mărime nativă
	Mortalitate %	Inhibarea creșterii %	Peptide detectate	Mărime estimată CL-4B
Mediu Tcb 1,0 M	+++	+++	TcbA
Schimb de ioni
Mediu TcbA CL-4B	+++	+++	Tcb, TcbA,,,	-900 kDa
Mediu TcbA CL-4B + Proteinsase K	++	+++	NT
Mediu TcbA CL-4B + tratament termic	-	-	NT
Celule TcbA Sup CI-4B	-	+++	NT	-900 kD

PK= Tratament cu Proteinase K, 2 h; Tratament termic= 100*C, timp de 10 min; ND= nedetectat; NT= netestat. Sistemul de măsurare pentru mortalitate și inhibarea creșterii, așa cum s-a comparat cu probele de control; 5-24%= +, 25-49%= ++, 50-100%= +++.

RO 121280 Β1

Peletul de celule s-a resuspendat în tampon 10 mM fosfat de sodiu, pH 7,0 și s-a uzat prin trecere printr-un dispozitiv de pulverizare celule Bio-Neb™ (Glas-Col Inc., Terra Haute, IN). Peletele s-au tratat cu DNază pentru a îndepărta ADN-ul și s-au centrifugat la 17.000xg, pentru a separa celulele peletde supernatantul celulă. Fracțiunea supernatant s-a decantat și s-a filtrat printr-un filtru 0,2μ, pentru a îndepărta particulele mari și s-a supus la cromatografie schimb de anioni. Proteinele legate s-au eluat cu 1,0 M NaCI, s-au dializat și s-au concentrat utilizând concentratori Biomax™ (Millipore Corp, Bedford, MA) cu greutate moleculară îndepărtată de 50000Daltoni. Fracțiunea concentrată s-a supus cromatografiei filtrare gel, utilizând matriță granulată Sepharose CL-4B. Datele biotestului pentru materialul preparat în acest mod sunt prezentate în tabelul 30 și sunt denumite celule TcbA sup.

într-o altă metodă, pentru a mânui cantități mari de material, peletele celule s-au resuspendat în tampon fosfat de sodiu 10 mM, pH 7,0 și s-au omogenizat complet, utilizând un mecanism de lustruit țesut de 40 ml Kontes Glass Company (Vineland, NJ). Restul celular s-a peletat prin centrifugare la 25000xg și supernatantul celulă s-a decantat, s-a trecut printr-un filtru 0,2 μ și s-a supus cromatografiei schimb de anioni, utilizând o coloană Pharmacia 10/10 împachetată cu granule Poros HQ 50. Proteinele legate s-au eluat prin realizarea unui gradient NaCI de 0,0 la 1,0 M. Fracțiunile care conțin proteina TcbA s-au combinat și s-au concentrat utilizând un concentrator 50 kDa și s-au supus la cromatografie filtrare pe gel, utilizând o matrice granulată Pharmacia CL-4B. Fracțiunile care conțin oligomerTcbA, masă moleculară aproximativ 900 kDa, s-au colectat și s-au supus la cromatografie schimb de anioni, utilizând o coloană Pharmacia Mono Q10/10 echilibrată cu tampon Tris 20 mM, pH 7,3. S-a folosit un gradient de 0,0 la 1,0 M NaCI pentru a elua proteina TcbA recombinantă. TcbA recombinantă s-a eluat de la coloană la o concentrație salină de aproximativ 0,3-0,4 M NaCI, aceeași molaritate la care oligomerul TcbA s-a eluat de pe coloana Mono Q 10/10. Fracțiunea recombinantă TcbA s-a găsit a cauza mortalitatea SCR în experimentele biotest, similare cu acelea prezentate în tabelul 30.

Claims (7)

1. Revendicări

   1. Polinucleotidă care este asociată operabil cu un promotor heterolog, în care respectiva polinucleotidă codifică o proteină care are activitate de toxină împotriva unui dăunător insectă, în care respectiva proteină cuprinde secvența de aminoacizi aleasă dintre SEQ ID NR:12 și SEQ ID NR:47.
2. 2. Celulă de plantă transgenică, care cuprinde o polinucleotidă conform revendicării 1.
3. 3. Celulă de plantă transgenică, care exprimă o polinucleotidă conform revendicării 1.
4. 4. Proteină recombinantă care are activitate de toxină împotriva unui dăunător insectă, în care respectiva proteină cuprinde secvența de aminoacizi aleasă dintre SEQ ID NR:12 sau SEQ ID NR:47.
5. 5. Metodă de control al unui dăunător insectă, în care metoda respectivă cuprinde hrănirea cu o proteină conform revendicării 4, a dăunătorului menționat.
6. 6. Metodă conform revendicării 5, în care proteina menționată este produsă de o polinucleotidă și este prezentă într-o plantă transgenică, care este accesibilă dăunătorului menționat.
7. 7. Metodă de control al unui dăunător insectă, în care metoda respectivă cuprinde alimentarea respectivului dăunător cu o proteină din Photorhabdus, în care proteina menționată are activitate de toxină, pe cale orală, și în care proteina menționată este produsă de și este prezentă într-o plantă transgenică, care este accesibilă dăunătorului menționat.