PT970213E - Receptor 5 contendo um domínio de morte - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

RECEPTOR 5 CONTENDO UM DOMÍNIO DE MORTE

Antecedentes da Invenção Domínio da Invenção A presente invenção tem por cbjecto um novo elemento da família dos receptores do factor de necrose do tumor. Mais especificamente, tem por objecto moléculas isoladas de ácidos nucleicos que codificam o receptor 5 humano que contém um domínio de morte ou simplesmente "DR5". Também tem por objecto polipéptidos de DR5, assim como, vectores, células hospedeiras e processos recombinantes para a produção dos mesmos. A presente invenção tem ainda por objecto processos de rastreio para identificar agonistas e antagonistas da actividade de DR5. Técnica Relacionada

Numerosas acções biológicas, por exemplo, as que respondem a certos estímulos e processos biológicos naturais, são controladas por factores, tais como, as citocinas. Muitas citocinas actuam através de receptores envolvendo o receptor e produzindo uma resposta intra-celular.

Por exemplo, os factores de necrose do tumor (FNT) alfa e beta são citocinas, que actuam através dos receptores de FNT para regular numerosos processos biológicos, incluindo a protecção contra a infecção e a indução de choque e de doenças inflamatórias. As moléculas do FNT pertencem à super-família dos "ligandos de FNT" e actuam em conjunto com os seus receptores ou contra-ligandos, a super-família dos 1 "receptores de FNT". Até agora, foram identificados nove membros da super-família dos ligandos de FNT e dez membros da super-família dos receptores de FNT, foram caracterizados.

Entre os ligandos, estão incluídos FNT-α, linfotoxina-a (LT-a, também conhecida por FNT-β), LT-β (encontrada no heterotrímero complexo Ι/Γ-α2-β), FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-IBBL, OX40L e o factor de crescimento do nervo (FCN). A super-família dos receptores de FNT inclui o receptor de FNTp55, o receptor de FNTp75, a proteína relacionada com o receptor de FNT, o antigénio de FAS ou APO-1, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, 0X40, p75 de baixa afinidade e o receptor de FCN (Meager, A., Biologícals, 22: 291-295 (1994)).

Muitos membros da super-família dos ligandos do FNT são expressos pelas células T activadas, implicando isso que eles são necessários para as interacções das células T com outros tipos de células subjacentes à ontogenia e às funções das células (Meager, A., supra). Já se ganhou uma considerável visão sobre as funções essenciais de vários membros da família dos receptores de FNT a partir da identificação e criação de mutantes que vão abolir a expressão dessas proteínas. Por exemplo, as mutações de ocorrência natural no antigénio FAS e no seu ligando causam uma doença linfoproliferativa (Watanabe-Fukunaga, R., et al., Nature 356: 314 (1992)), reflectindo talvez uma falha da morte programada das células. As mutações do ligando CD40 causam um estado de imunodeficiência ligado a X, caracterizado por elevados níveis de imunoglobulina M e baixos níveis de imunoglobulina G no plasma, indicando uma activação defeituosa das células B dependentes das células T (Allen, R. C. et al., Science 259: 990 (1993)). As mutações pretendidas do receptor do factor de crescimento do nervo de 2 baixa afinidade causam um distúrbio, caracterizado por uma deficiência da inovação sensória das estruturas periféricas (Lee, K. F. et al.f Cell 69: 737 (1992)). 0 FNT e a LT-α são capazes de se ligarem aos dois receptores de FNT (os receptores de FNT de 55 e 75 kd) . Um grande número de efeitos biológicos provocados pelo FNT e pela LT-α, actuando através dos seus receptores, incluem a necrose hemorrágica de tumores transplantados, a citotoxi-cidade, um papel no choque endotóxico, inflamação, imuno-regulação, proliferação e respostas antivirais, assim como, protecção contra os efeitos prejudiciais da radiação por ionização. 0 FNT e a LT-α estão envolvidos na patogénese de uma vasta gama de doenças, incluindo o choque endotóxico, a malária cerebral, tumores, doenças auto-imunes, SIDA e rejeição de enxertos pelo hospedeiro (Beutler, B. e Von Huffel, C., Science 264: 667-668 (1994)). As mutações no receptor p55 causam uma susceptibilidade acrescida para infecções microbianas.

Além disso, foi referenciado um domínio de cerca de 80 aminoácidos próximo da terminação C do R-l de FNT (p55) e Fas, como o "domínio de morte", que é responsável pelos sinais de transdução para a morte programada das células (Tartaglia et al., Cell 74: 845 (1993)). A apóptose ou morte programada das células é um processo fisiológico essencial para o normal desenvolvimento e a homecstase dos organismos multicelulares (H. Steller, Science 267: 1445-1449 (1995)). Alterações da apóptose contribuem para a patogénese de várias doenças humanas incluindo o cancro, distúrbios neurodegenerativos e síndroma de imuno-deficiência adquirida (C.B. Thompson, Science 267: 1456-1462 (1995)). Recentemente, tem-se focado muitíssima atenção na 3 transdução do sinal e na função biológica dos dois receptores do domínio da morte da superfície das células, Fas/APO-1 e R-1 de FNT (J. L. Cleveland et al., Cell 81: 479-482 (1995); A. Fraser, et al., Cell 85: 781-784 (1996); S. Nagata et al., Science 267: 1449-56 (1995)). Ambos são membros da família dos receptores de FNT que também incluem R-2 de FNT, R-FCN de baixa afinidade, CD40 e CD30, entre outros (C. A. Smith et al., Science 248: 1019-23 (1990); M. Tewari et al., em Modular Texts in Molecular and Cell Biology M. Purton, Heldin, Cari, Ed. (Chapman and Hall, London, 1995). Embora os membros da família sejam definidos pela presença de repetições ricas em cisteína nos seus domínios extra-celulares, Fas/APO-1 e R-l de FNT também partilham uma região de homologia intracelular, apropriadamente designada por "domínio da morte", que está relacionada, de uma forma distante, com o gene suicida reaper de Drosophila, (P. Golstein, et al., Cell 81: 185-186 (1995); K. White et al., Science 264: 677-83 (1994)). Este domínio de morte partilhado sugere que ambos os receptores interagem com um conjunto relacionado de moléculas de transdução do sinal que, até recentemente, permaneciam não identificadas. A activação de Fas/APO-1 recruta a molécula do adaptador contendo o domínio de morte FADD/MORT1 (A. M. Chinnaiyan et al., Cell 81: 505-12 (1995); Μ. P. Boldin et al., J. Biol Chem 270: 7795-8 (1995); F. C. Kischkel et al., EMBO 14: 5579-5588 (1995)), que, por sua vez, se liga e presumivelmente activa FLICE/MACHl, um membro da família de ICE/CED-3 das proteases pró-apoptóticas (M. Muzio et al., Cell 85: 817-827 (1996); Μ. P. Boldin et al., Cell 85: 803-815 (1996)). Embora o papel central de Fas/APO-1 seja alavancar a morte da célula, R-l de FNT pode assinalar um conjunto de diversas actividades biológicas, muitas delas caracterizadas pela sua capacidade para activar NF-kB (L. A. Tartaglia et al., Immunol Today 13: 151-3 (1992)). De acordo com isto, R-l de FNT recruta a molécula 4 adaptadora multivalente TRADD, que, tal como FADD, também contém um domínio de morte (H. Hsu et ai., Cell 81: 495-504 (1995); H. Hsu, et al., Cell 84: 299-308 (1996)). Através das suas associações com um certo número de moléculas de sinalização, incluindo FADD, TRAF2 e RIP, TRADD pode assinalar tanto a apóptose como a activação de NF-kB (H. Hsu et al., Cell 84: 299-308 (1996); H. Hsu, et al., Immunity 4:387-396 (1996)).

Recentemente, descobriu-se um novo ligando de FNT que induz a apóptose. S. R. Wiley et al. (Immunity 3: 673-682 (1995)) designando a molécula por "ligando que induz a apóptose relacionada com o FNT" ou, simplesmente, "LIART", TRAIL na terminologia inglesa. A molécula foi também designada por "ligando de Apo-2" ou "LApo-2". " R. M. Pitt et al., J. Biol. Chem. 271: 12687-12690 (1996). Esta molécula está também descrita no pedido de patente provisional co-pendente, norte-americano N°. 60/013.405, correspondente à patente de invenção WO 97/33899. Por conveniência, a molécula será então aqui referida como LIART.

Ao contrário do ligando de Fas, cujo os transcriptos parecem estar largamente restritos às células T estimuladas, detectam-se níveis significativos de LIART em muitos tecidos humanos (por exemplo, baço, pulmões, próstata, timo, ovários, intestino delgado, cólon, linfócitos do sangue periférico, placenta, rim) e é transcripto sob o ponto de vista constitutivo por algumas linhas de células. Tem-se demonstrado que LIART actua independentemente do ligando de Fas (Wiley et al., supra). Também tem sido demonstrado que LIART activa rapidamente a apóptose, dentro de um intervalo de tempo que é semelhante à sinalização de morte por Fas/LApo-1, mas muito mais rápida do que a apóptose induzida por FNT. S. A. Marsters et al., Current Bíology 6: 750-752 5 (1996) . A Incapacidade de LIART para se ligar a R-l de FNT, Fas ou ao recentemente identificado DR3, sugere que LIART pode interagir com um único receptor. Já se identificaram vários receptores únicos para LIART. No pedido de patente de invenção provisional co-pendente, norte-americano N°. 60/035.722, correspondente à patente de invenção WO 98/32856, DR4, um novo receptor contendo um domínio de morte para LIART, foi também descrito. Ver, Pan et al., Science 2Ί6, 111-113 (Abril 1997). O receptor TR5, que é o objecto do pedido de patente de invenção providencial, co-pendente, norte-americano N°. 60/035.496, correspondente à patente de invenção WO 98/30693, tem mostrado que se liga a LIART. No pedido de patente de invenção provisional, co-pendente, norte-americano N°. 60/050.36, correspondente à patente de invenção WO 98/54202, está previsto que o receptor TRIO também se ligará a LIART, devido à homologia da sequência com DR4.

Os efeitos dos ligandos da família de FNT e dos receptores da família de FNT são variados e influenciam numerosas funções, tanto normais como anormais, nos processos biológicos do sistema dos mamíferos. Há uma necessidade clara, por isso, de identificar e caracterizar esses receptores e ligandos que influenciam a actividade biológica, tanto normalmente como em estados de doença. Em particular, há uma necessidade de isolar e caracterizar mais novos receptores que se liguem a LIART.

Sumário da Invenção A presente invenção tem por objecto moléculas de ácido r.ucleico isoladas, compreendendo sequências de ácidos nucleicos que codificam a sequência de aminoácidos mostrada 6 na fig. 1 (SEQ ID N°. 2) ou a sequência de aminoácidos codificada pelo clone de ADNc depositado na ATCC com o N°. de depósito 97920, em 07 de Março de 1997. A presente invenção também tem por objecto vectores recombinantes, que incluem as moléculas de ácidos nucleicos isoladas da presente invenção e células hospedeiras contendo os vectores recombinantes, assim como, processos de produzir esses vectores e essas células hospedeiras e para a sua utilização para a produção de polipéptidos de DR5 ou péptidos de DR5 por meio de técnicas recombinantes. A presente invenção tem ainda por objecto um polipéptido de DR5 isolado com uma sequência de aminoácidos codificada por um polinucleótido aqui descrito.

Também tem por objecto ensaios de diagnóstico, tal como, ensaios quantitativos e ensaios de diagnóstico para a detecção dos níveis da proteína DR5. Assim, por exemplo, um ensaio de diagnóstico de acordo com a presente invenção para detectar a sobre-expressão de DR5 ou uma sua forma solúvel, comparado com as amostras de controlo de tecido normal, pode ser utilizado para detectar a presença de tumores.

Os ligandos da família do factor de necrose de tumor (FNT) são conhecidos por estarem entre as citocinas ma is pleiotrópicas, induzindo um grande número de respostas celulares, incluindo citotoxicidade, actividade antiviral, actividades imuno-reguladoras e a regulação transcricional de vários genes. A resposta celular aos ligandos da família dos FNT inclui não apenas respostas fisiológicas normais, mas também doenças associadas com o aumente da apóptose ou a inibição da apóptose. A apóptose - morte programada das células - é um mecanismo fisiológico envolvido na eliminação dos linfócitos T periféricos do sistema imunitário e a sua desregulação pode levar a um certo número de diferentes processos patogénicos. As doenças associadas com o aumento da sobrevivência das células ou a inibição da apoptose incluem cancros, distúrbios auto-imunes, infecções virais, inflamações, enxertos versus doença do hospedeiro, rejeição aguda de enxertos e rejeição crónica de enxertos. As doenças associadas com um aumento da apoptose incluem a SIDA, doenças neurodegenerativas, síndromas mielodisplásicos, feridas isquémicas, choque séptico, doenças do fígado induzidas por toxinas, caquexia e anorexia.

Assim, uma utilização de um agonista capaz de aumentar a sinalização mediada por DR5 para a preparação de uma composição farmacêutica para aumentar a apoptose induzida por um ligando da família de FNT é aquilo que se pretende, o que envolve a administração a uma célula que expressa o polipéptido de DR5, de uma quantidade efectiva da referida composição farmacêutica. Preferencíalmente, a sinalização mediada por DR5 é aumentada para tratar uma doença em que se verificou uma diminuição da apoptose.

Num outro aspecto, pretende-se a utilização de um antagonista capaz de diminuir a sinalização mediada por DR5 para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir a apoptose induzida por um ligando da família do FNT, o que envolve a administração a uma célula que expressa o polipéptido de DR5, de uma quantidade da referida composição farmacêutica. Preferencialmente, a sinalização mediada por DR5 é diminuída para tratar uma doença em que se verificou que a apoptose estava aumentada.

Pode-se determinar quando qualquer candidato a "agonista" ou a "antagonista", tal como se descreve aqui, pede aumentar ou inibir a apóptose, utilizando ensaios de resposta celular do receptor/ligando da família do FNT conhecidos na técnica, incluindo os descritos com mais detalhe a seguir. Assim, num outro aspecto, descreve-se um processo de avaliação para determinar se um agonista candidato ou um antagonista candidato é capaz de aumentar ou inibir uma resposta celular a um ligando da família dc FNT. 0 processo envolve o contacto das células que expressam o polipéptido DR5 com um composto candidato e um ligando da família dos FNT, ensaiando uma resposta celular e comparando a resposta celular com uma resposta celular padrão, sendo o padrão ensaiado quando o contacto é feito com o ligando na ausência do composto candidato, em que um aumento da resposta celular em relação ao padrão, indica que o composto candidato é um agonista da via de sinalização do ligando/receptor e uma diminuição da resposta celular comparada com o padrão, indica que o composto candidato é um antagonista da via de sinalização do ligando/receptor. Pela presente invenção, pode fazer-se contactar uma célula que expressa o polipéptido DR5 com um ligando da família dos FNT, administrado quer endogenamente quer exogenamente.

Breve Descrição das Figuras - A figura 1 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID N°. 1) e a sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID N°. 2) de DR5. É previsível que os aminoácidos 1-51 (sublinhados) constituam o péptido de sinal (resíduos de aminoácidos desde cerca de -51 até cerca de -1 na SEQ ID N°. 2); os aminoácidos 52-184 constituem o domínio extracelular (resíduos de aminoácidos desde cerca de 1 até cerca de 133 na SEQ ID N°. 2); os aminoácidos 185-208 (sublinhado) constituem o domínio da transmembrana (resíduos de aminoácidos desde cerca de 134 até cerca de 157 na SEQ ID NO: 2); e os aminoácidos 209-411 constituem o domínio intracelular (resíduos de aminoácidos desde cerca de 158 até cerca de 360 na SEQ ID NO: 2), do qual os aminoácidos 324-391 (em itálico) constituem o domínio de morte (resíduos de aminoácidos desde cerca de 273 até cerca de 340 na SEQ ID NO: 2). A figura 2 mostra as regiões de semelhança entre as sequências de aminoácidos de DR5 (HLYBX88), do receptor 1 do factor humano de necrose do tumor (R-l de FNT h) (SEQ ID NO: 3), proteína Fas humana (SEQ ID NO: 4) e o receptor 3 contendo o domínio de morte (SEQ ID NO: 5). A comparação foi feita com o programa Megalign que está contido no conjunto de programas Star de ADN, utilizando o processo Clustal. A figura 3 mostra uma análise da sequência de aminoácidos de DR5. Regiões alfa, beta e de anéis; hidrofilicidade e hidrofobicidade; regiões anfipátícas; regiões flexíveis; índice antigénico e probabilidade da superfície, são tudo parâmetros mostrados. No gráfico "Antigenic índex Jameson-Wolf" os resíduos de aminoácidos próximo de 62 até próximo de 110, próximo do 119 até próximo do 164, próximo do 224 até próximo do 271 e próximo do 275 até lpróximo do 370, tal como descrito na figura 1, correspondem às regiões altamente antigénicas mostradas da proteína DR5. Estes fragmentos altamente antigénicos na figura 1 correspondem aos seguintes fragmentos, respectivamente, na SEQ ID NO: 2: resíduos de aminoácidos próximo de 11 até próximo de 59, de próximo de 68 até próximo de 113, de próximo de 173 até próximo de 220 e de próximo de 224 até próximo de 319. 10 A figura 4 mostra as sequências de nucleótidos (HAPBU13R e HSBBU76R) das duas moléculas de ADNc, que estão relacionadas com a sequência de nucleótidos mostrada na figura 1 (SEQ ID NO: 1). A figura 5A é um gráfico de barras que mostra essa sobre-expressão de apóptose induzida por DR5 em células de carcinoma humano MCF7. A í~ mJLw g~u 3·^ Í3 !E^ é um gráfico de barras que mostra essa sobre-expressão da apóptose induzida por DR5 em células humanas de carcinoma epitlóide (Hela). A figura 5C representa um gráfico de barras que mostra que a apóptose induzida por DR5 foi bloqueada por inibidores de caspase, CrmA e z-VAD-fmk, mas FADD dominante negativo não teve efeito. A figura 5D representa uma análise de imuno-mancha que mostra que, tal como DR4, DR5 não interage com FADD e TRADD in vivo. A figura 5E representa um gráfico de barras que mostra que uma versão negativa dominante de uma molécula semelhante a FLICE recentemente identificada, FLICE2 (Vincenz, C. et al., J. Biol. Chem. 272: 6578 (1997)), bloqueia eficientemente a apóptose induzida por DR5, enquanto que FLICE dominante negativa tinha apenas um efeito parcial nas condições que bloqueava. Também mostra que R-l de FNT bloqueia efectivamente a apóptose. A figura 6A é uma análise de imuno-mancha que mostra que DR5-Fc (tal como DR4 e TRID) ligam-se especificamente a LIART, mas não se ligam ao ligando citotóxico relacionado FNTa. 0 painel do fundo da figura 6 mostra a entrada das fusões de Fc presentes nos ensaios de ligação. A figura 6B é um gráfico de barras que mostra que DR5-Fc bloqueou a capacidade de LIART para induzir a apóptose. Os dados (média + DP) mostrados na figura 6B são a 11 percentagem de núcleos apoptóticos entre os núcleos totais contados (n=4). A figura 6C representa um gráfico de barras que mostra que DR5-Fc não teve efeito na morte das células induzida por FNTa na apóptose, em condições em que R-l de FNT-Fc aboliu completamente a morte de FNTa.

Descrição Detalhada dos Enquadramentos Preferidos A presente invenção tem por objecto moléculas isoladas de ácidos nucleicos, compreendendo um polinucleótido que codifica um polipéptido DR5 com a sequência de aminoácidos mostrada na figura 1 (SEQ ID NO: 2) ou um fragmento do polipéptido. 0 polipéptido DR5 da presente invenção partilha homologia da sequência com outros receptores conhecidos que contêm o domínio de morte da família dos R de FNT incluindo R-l de FNT humano, DR3 e Fas {figura 2) . A sequência de nucleótidos mostrada na figura 1 (SEQ ID NO: 1) foi obtida sequenciando clones de ADNc, tal como, HLYBX88, que foi depositado em 07 de Março de 1997, na American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852 e a que foi dado o número de acesso 97920. O clone depositado estava contido no plasmido pSport 1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

Moléculas de Ácidos Nucleicos A menos que seja indicado de outra forma, todas as sequências de nucleótidos determinadas pela sequenciação de uma molécula de ADN, foram aqui determinadas utilizando um sequenciadcr automático de ADN (tal como o modelo 373 da

Applied Biosystems, Inc.) e todas as sequências de aminoácidos dos polipéptidos codificados pelas moléculas de ADN aqui determinadas, foram previstos por tradução de uma 12 sequência de ADN determinada tal como antes. Por isso, tal como é sabido na técnica para qualquer sequência de ADN determinada por esta abordagem automatizada, qualquer sequência de nucleótidos aqui determinada pode conter alguns erros. As sequências de nucleótidos determinadas por um processo automático, são normalmente pelo menos cerca de 90 % idênticas, mais normalmente, pelo menos cerca de 95 % até pelo menos cerca de 99,9 % idênticas à sequência de nucleótidos actual da molécula de ADN sequenciada. A sequência actual pode ser determinada mais precisamente por meio de outras abordagens incluindo processos manuais de sequenciação de ADN bem conhecidos na técnica. Também como é sabido na técnica, uma inserção ou eliminação simples numa determinada sequência de nucleótidos comparada com a sequência actual, vai causar uma deslocação dum fragmento na translação da sequência de nucleótidos, de tal maneira que a previsível a sequência de aminoácidos codificada por uma determinada sequência de nucleótidos, será completamente diferente da sequência de aminoácidos actualmente codificada pela molécula de ADN sequenciada, começando no ponto dessa inserção ou eliminação.

Utilizando a informação dada aqui, essa sequência de ácidos nucleicos estabelecida na SEQ ID NO: 1, uma molécula de ácidos nucleicos da presente invenção que codifica um polipéptido de DR5, pode obter-se utilizando processos de clonagem e avaliação normalizados, tal como os da clonagem de ADNcs utilizando ARNm como material inicial. Ilustrativa da presente invenção, a molécula de ácido nucleico da presente invenção tem sido identificada em bibliotecas de ADNc dos seguintes tecidos: células dendríticas primárias, tecido endotelial, baço, células de leucemia linfocítica crónica e células de estroma do timo humano. 13 A sequência de nucleótidos determinada do ADNc de DR5 da SEQ ID NO: 1, contém um fragmento de leitura aberta que codifica uma proteína de cerca de 411 resíduos de aminoácidos cujo codão de iniciação está na posição 130-132 da sequência de nucleótidos mostrada na figura 1 (SEQ ID NO: 1), com uma sequência líder de cerca de 51 resíduos de aminoácidos. Dos membros conhecidos da família de receptores de FNT, o polipéptido de DR5 da presente invenção partilha o maior grau de homologia com R de FNTl humano, Fas e polípéptidos de DR3 mostrados na figura 2, incluindo uma significativa homologia da sequência em relação aos múltiplos domínios ricos em cisteína. Uma forte homologia de DR5 com outros receptores contendo o domínio de morte, indica que DR5 é também um receptor contendo o domínio de morte com a capacidade de induzir a apóptose. DR5 mostrou também agora que se ligava a LIART.

Tal como indicado, a presente invenção também tem por objecto as formas maduras da proteína DR5 da presente invenção. De acordo com a hipótese de sinal, as proteínas segregadas por células de mamíferos têm uma sequência de sinal ou uma sequência líder secretora, que está clivada da proteína madura uma vez que se exporta da cadeia da proteína de crescimento ao longo do retículo endcplásmíco rugoso ter sido iniciado. A maior parte das células de mamíferos e mesmo as células de insectos clivam as proteínas segregadas com a mesma especificidade. Contudo, nalguns casos, a clivagem de uma proteína segregada não é completamente uniforme, o que resulta em duas ou mais espécies maduras na proteína. Além disso, sabe-se desde há muito tempo que a especificidade da clivagem de uma proteína segregada é em última análise determinada pela estrutura primária da proteína completa, isto é, inerente à sequência de aminoácidos do polipéptido. 14

Por isso, a presente invenção tem por objecto uma sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido de DR5 maduro, contendo a sequência de aminoácidos codificada pelo clcne de ADNc contido no hospedeiro identificado com o número de depósito na ATCC 97 920 e tal como se mostrou na figura 1 (SEQ ID NO: 2). Por proteína de DR5 madura com a sequência de aminoácidos codificada pelos clones de ADNc contidos no hospedeiro identificado com o número de depósito na ATCC 97920, entende-se as formas maduras da proteína DR5 produzidas por expressão numa célula de mamíferos (por exemplo, células de COS, tal como se descreve a seguir) do fragmento completo de leitura aberta codificado pela sequência de ADN humano do clone contido no vector no hospedeiro depositado. Tal como se indica a seguir, DR5 madura comportando a sequência de aminoácidos codificada pelo clone de ADNc com o número de depósito na ATCC 97920, pode ou não diferir da prevista proteína de DR5 "madura" mostrada na SEQ ID NO: 2 (aminoácidos desde cerca de 1 até próximo de 360) consoante a precisão do sítio de clivagem previsto com base na análise do computador.

Estão disponíveis processos para prever se uma proteína tem um líder segregador, assim como, o ponto de clivagem para essa sequência líder. Por exemplo, os processos de McGeoch (Vírus Res. 3:271-286 (1985)) e de von Heinje (Nucleic P.cids Res. 14:46834690 (1986)) podem ser utilizados. A precisão para prever os pontos de clivagem de proteínas secretoras conhecidas de mamíferos para cada um destes processos, está no intervalo de cerca de 75-80 %. von Heinje, supra. Contudo, os dois processos não produzem sempre os mesmos pontos de clivagem para uma dada proteína.

No presente caso, a sequência de aminoácidos prevista do polipéptido de DR5 completo da presente invenção foi 15 analisada por um programa de computador ("PSORT"). Ver, K. Nakai e M. Kanehisa, Genomics 14:897-911 (1992), PSORT é um sistema pericial para prever a localização celular de uma proteína com base na sequência de aminoácidos. Como parte desta previsão computacional da localização, incorporam-se aqui os processos de McGeoch e de von Heinje. A análise por meio do programa de previsão PSORT prevê os sítios de clivagem entre os aminoácidos 51 e 52 na figura 1 (-1 e 1 na SEQ ID NO: 2). Depois, as sequências de aminoácidos completas foram ainda analisadas por meio de inspecção visual, aplicando uma forma simples da regra (-1, -3) de von Heinje, von Heinje, supra. Assim, a sequência líder para a proteína DR5 previsivelmente consiste nos resíduos de aminoácidos desde cerca de 1 até cerca de 51, sublinhados na figura 1 (correspondendo a cerca de -51 até cerca de 1 na SEQ ID NO: 2), embora a proteína madura DR5 prevista consista nos resíduos de cerca de 52 até próximo de 411 na figura 1 (correspondendo a cerca de 1 até cerca de 360 na SEQ ID NO: 2) .

Tal como se indicou, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção, podem estar sob a forma de ARN, tal como, ARNm ou sob a forma de ADN, incluindo, por exemplo, ADNc e ADN genómico obtido por clonagem ou produzido por síntese. O ADN pode ser de estrutura helicoidal dupla ou estrutura helicoidal simples. O ADN de estrutura helicoidal simples pode ser a estrutura de codificação, também conhecido como a estrutura de um sentido (sense) ou pode ser a estrutura helicoidal de não codificação, também referida como a estrutura de sentido contrário (anti-sense) .

Por moléculas de ácido nucleico "isoladas" entende-se uma molécula de ácido nucleico, ADN ou ARN, que tenha sido eliminada do seu ambiente original. Por exemplo, as moléculas de ADN recombinante contidas num vector, são consideradas isoladas para os fins da presente invenção. Outros exemplos de moléculas de ADN isoladas incluem moléculas de ADN recombinante nas células hospedeiras heterólogas ou moléculas de ADN purificadas (parcialmente ou totalmente) em solução. As moléculas de ARN isoladas incluidas nos transcriptos de ARN in vivo ou in vitro das moléculas de ADN da presente invenção. As moléculas de ácido nucleico isoladas de acordo com a presente invenção incluem ainda essas moléculas produzidas por sintese.

As moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção incluem moléculas de ADN de DR5, que compreendem um fragmento de leitura aberta (FLA) mostrado na SEQ ID NO: 1; as moléculas de ADN, que compreendem a sequência de codificação para a proteína DR5 madura; e as moléculas de ADN que compreendem uma sequência substancialmente diferente das descritas antes, mas que devido à degenerescência do código genético, ainda codificam a proteína de DR5. Obviamente, o código genético é bem conhecido na técnica. Assim, será uma rotina para um especialista na matéria gerar essas variantes degeneradas.

Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto moléculas isoladas de ácido nucleico, que codificam o polipéptido de DR5 comportando uma sequência de aminoácidos codificada pelo clone de ADNc contido no plasmido depositado na ATCC com o número de depósito 97920, em 07 de Março de 1997. Num outro enquadramento, providenciam-se moléculas de ácido nucleico que codificam o polipéptido de DR5 maduro ou o polipéptido de DR5 de comprimento completo a que falta a metionina do terminal N. A presente invenção tem por objecto ainda uma molécula de ácido nucleico isolada comportando a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou a 17 sequência de nucleótidos do ADNc de DR5 contida no clone depositado descrito antes ou uma molécula de ácido nucleico comportando uma sequência complementar das sequências anteriores. Essas moléculas isoladas, particularmente, moléculas de ADN, são úteis como sondas para o mapeamento dos genes por meio da hibridação in situ com cromossomas e para a expressão da detecção do gene de DR5 no tecido humano, por exemplo, por análise de mancha de Northern. A presente invenção tem ainda por objecto fragmentos das moléculas de ácido nucleico isoladas aqui descritas. Por um fragmento de uma molécula de ADN isolada com a sequência de nucleótidos do ADNc depositados, a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou a estrutura helicoidal complementar, entende-se os fragmentos de ADN com pelo menos cerca de 15 nt e, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 20 nt, ainda mais preferencialmente, pelo menos cerca de 30 nt e, ainda mais preferencialmente, pelo menos cerca de 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400 ou 500 nt de comprimento. Estes fragmentos têm numerosas utilizações que incluem, mas não se limitam, a sondas de diagnóstico e iniciadores conforme se discute aqui. Obviamente que fragmentos de ADN maiores, com 500-1500 nt de comprimento, são também úteis de acordo com a presente invenção, dado que são fragmentos que correspondem à maior parte, se não a toda, a sequência de nucleótidos do ADNc depositado ou como se mostra na SEQ ID NO: 1. Por um fragmento com pelo menos 20 nt de comprimento, por exemplo, entende-se fragmentos que incluem 20 ou mais bases contíguas das sequências de nucleótidos do ADN depositado ou da sequência de nucleótidos conforme se mostra na SEQ ID NO: 1.

Os fragmentos de ácido nucleico preferidos da presente invenção incluem, mas não se limitam, a moléculas de ácidos nucleicos que codificam: um polipéptido que compreende o 18 domínio extracelular de DR5 (resíduos de aminoácidos desde cerca de 52 até cerca de 184 na figura 1 (desce cerca de 1 até cerca de 133 na SEQ ID NO:2) ; um polipéptido que compreende um domínio da transmembrana de DR5 (resíduos de aminoácidos desde cerca de 185 até cerca de 208 na figura 1 (desde cerca de 134 até cerca de 157 na SEQ ID NO: 2) ) ; um polipéptido que compreende o domínio intracelular de DR5 (resíduos de aminoácidos desde cerca de 209 até cerca de 411 na figura 1 (desde cerca de 158 até cerca de 360 na SEQ ID NO: 2)); e um polipéptido compreendendo um domínio de morte de DR5 (resíduos de aminoácidos desde cerca de 324 até cerca de 391 na figura 1 (desde cerca de 273 até cerca de 340 na SEQ ID NO: 2)). Dado que a localização destes domínios foi prevista por computação gráfica, um especialista na matéria compreenderá que os resíduos de aminoácidos que constituem estes domínios podem ser ligeiramente (por exemplo, cerca de 1 a 15 resíduos) dependentes dos critérios utilizados para definir cada domínio.

Os fragmentos de ácidos nucleicos preferidos da presente invenção codificam um polipéptido de DR5 de comprimento completo a que faltam os nucleótidos que codificam a metionina do terminal amino (nucleótidos 130-132 na SEQ ID NO: 1) , dado que se sabe que a metionina é clivada naturalmente e que essas sequências podem ser úteis nos vectores de expressão de DR5 em engenharia genética. Os polipéptidos codificados por esses polinucleótidos estão todos contemplados na presente invenção.

Os fragmentos de ácidos nucleicos preferidos da presente invenção incluem ainda moléculas de ácidos nucleicos que codificam as porções que se ligam ao epitopo da proteína de DR5. Em particular, esses fragmentos de ácidos nucleicos da presente invenção incluem, mas não se limitam, a moléculas de 19 ácidos nucleicos que codificam: um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 62 até cerca de 110 na figura 1 (cerca de 11 até cerca de 69 na SEQ ID NO: 2); um polipéptido que compreende resíduos de aminoácidos desde cerca de 119 até cerca de 164 na figura 1 (cerca de 173 até cerca de 220 na SEQ ID NO: 2); e um polipéptido que compreende resíduos de aminoácidos desde cerca de 275 até cerca de 370 na figura 1 (cerca de 224 até cerca 319 na SEQ ID NO: 2) . Os requerentes determinaram que os fragmentos de polipéptidos anteriores são regiões antigénicas da proteína de DR5. Os processos para a determinação para além das porções que se ligam ao epitopo da proteína de DR5, estão descritos com detalhe a seguir.

Além disso, as moléculas de ácidos nucleicos que têm sequências de nucleótidos relacionadas com porções extensas da SEQ ID NO: 1, que tenham sido determinadas a partir dos clones de ADNc relacionados que se seguem: HAPBU13R (SEQ ID NO: 6) e HSBBU76R (SEQ ID NO: 7), estão descritos aqui. As sequências de nucleótidos de HAPBU13R e HSBBU76R, estão indicadas na figura 4.

Além disso, a presente invenção inclui um polinucleótido que compreende qualquer porção de pelo menos cerca de 30 nucleótidos, preferencialmente, pelo menos cerca de 50 nucleótidos da SEQ ID NO: 1, desde o resíduo 284 até 1.362, preferencialmente, desde 284 até 681.

Também constitui um objecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico isolada, que compreende um polinucleótido, que híbrida em condições de hibridação severas com uma porção do polinucleótido numa molécula de ácido nucleico da presente invenção descrita antes, por exemplo, os clones de ADNc depositados na ATCC com o número 20 de depósito 97920. Por "condições de hibridação severas" entende-se a incubação durante a noite, a 42 °C, numa solução que compreende: formamida a 50 %, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato tri-sódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (a pH 7,6), 5 x de solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10 % e 20 g/mL de ADN de esperma de salmão cortado e desnaturado, seguido da lavagem dos filtros em 0,1 x SSC, a cerca de 65 °C.

Por um polinucleótido que híbrida com uma "porção" de um polinucleótido, entende-se um polinucleótido (quer ADN, quer ARN), que híbrida com pelo menos cerca de 15 nucleótidos (nt) e, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 20 nt, ainda mais preferencialmente, pelo menos cerca de 30 nt e, ainda mais preferencialmente, pelo menos cerca de 30-70 ou 80-150 nt ou todo o comprimento do polinucleótido de referência. Eles são úteis como sondas de diagnóstico e iniciadores, conforme se discutiu antes e em mais detalhe a seguir.

Por uma porção de um polinucleótido de "pelo menos 20 nt de comprimento", por exemplo, entende-se 20 ou mais nucleótidos contíguos da sequência de nucleótidos do polinucleótido de referência (por exemplo, o ADNc depositado ou a sequência de nucleótidos conforme se mostra na SEQ ID NO: 1) .

Obviamente, um polinucleótido que híbrida apenas com uma sequência de poli A (tal como, por exemplo, o trato de poli A do terminal 3' do ADNc de DR5 mostrado na figura 1 (SEQ ID NO: 1)) ou com uma extensão complementar de resíduos de T (ou U), não estaria incluído num polinucleótido da presente invenção utilizado para hibridízar com uma porção dc ácido nucleicc· da presente, dado que esse polinucleótido iria hibridízar com qualquer molécula de ácido nucleico contendo o 21 poli A estirado do seu complemento (por exemplo, praticamente qualquer clone de ADNc de estrutura helicoidal dupla).

Tal como se indicou, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção que codificam um polipéptido de DR5, podem incluir, mas não se limitam, a sequências de codificação do polipéptido maduro por ele próprio, a sequência de codificação para o polipéptido maduro e sequências adicionais, tais como, as que codificam uma sequência líder ou segregadora, tais como, sequências de pré- ou pró- ou pré-pró- proteína, a sequência de codificação do polipéptido maduro com ou sem as sequências de codificação adicionais mencionadas antes, em conjunto com sequências adicionais, não codificantes, incluindo, por exemplo, mas não se limitando, a intrões e sequências de 3' e 5' não codif icantes, tal como, as sequências não traduzidas transcríptas que desempenham um papel na transcrição, fragmentação incluindo o tratamento de ARNm e sinais de políadenílação, por exemplo, - ligação de ribossoma e estabilidade de ARNm -; sequências de codificação adicionais que codificam para aminoácidos adicionais, tal como, as que providenciam funcionalidades adicionais. Assim, por exemplo, o polipéptido pode fundir-se com uma sequência marcadora tal como um péptido, que facilita a purificação do polipéptido fundido. Em certos enquadramentos preferidos deste aspecto da presente invenção, a sequência marcadora é um péptido de hexa-histidina, tal como, um marcador providenciado por um vector pQE (Qiagen, Inc.), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Tal como descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, a hexa-histidina providencia uma purificação conveniente da proteína de fusão. 0 marcador "HA" é outro péptido útil para a purificação, que corresponde a um epitopo derivado da proteína hemaglutinina da gripe, que foi descrita por Wilson et al., Cell 37:767-778 (1984). Tal como 22 se discute a seguir, outras dessas proteínas de fusão incluem o receptor de DR5 fundido com Fc nas terminações N ou C.

Além disso, variantes das moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção que codificam porções, análogos ou derivados do receptor de DR5, estão aqui descritas. As variantes podem ocorrer naturalmente, tal como uma variante alélica natural. Por uma "variante alélica" entende-se uma das várias formas alternativas de um gene, que ocupa um dado local num cromossoma de um organismo. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985). As variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas utilizando técnicas de mutagénese conhecidas na técnica.

Essas variantes incluem as produzidas por substituições, eliminações ou adições de nucleótidos, que podem envolver um ou mais nucleótidos. As variantes podem ser alteradas nas regiões de codificação ou de não codificação ou em ambas. As alterações nas regiões de codificação podem produzir substituições, eliminações ou adições de aminoácidos conservadoras ou não conservadoras. Especialmente preferidas entre estas são as substituições, adições e eliminações silenciosas, que não alteram as propriedades e as actividades dos receptores de DR5 ou das suas porções. Também especialmente preferidas sob este ponto de vista são as substituições conservadoras.

Outros enquadramentos da presente invenção incluem moléculas isoladas de ácidos nucleicos, que são pele menos 95 % idênticas e, mais preferencialmente, pelo menos 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idênticas a (a) uma sequência de nucleótidos, que codifica o polipéptido, que comporta a sequência de aminoácidos na SEQ ID NO: 2; (b) uma sequência de nucleótidos, que codifica o polipéptido, que comporta a 23 sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, mas a que falta a metíonina do terminal amino; (c) uma sequência de nucleótidos, que codifica o polipéptido, que comporta a sequência de aminoácidos nas posições próximas de 1 até as próximas de 350 na SEQ ID NO: 2; (d) uma sequência de nucleótidos, que codifica o polipéptido, que comporta a sequência de aminoácidos codificada pelo clone de ADNc depositado na ATCC com o número de depósito 97920; (e) uma sequência de nucleótidos, que codifica o polipéptido maduro de DR5, que comporta a sequência de aminoácidos codificada pelo clone de ADNc depositado na ATCC com o número de depósito 97920; (f) uma sequência de nucleótidos, que codifica o domínio extracelular de DR5, que comporta as sequências de aminoácidos nas posições próximas de 1 até próximas de 133 na SEQ ID NO: 2 ou o domínio extracelular de DR5 codificado pelo ADNc depositado na ATCC com o número de depósito 97920; (g) uma sequência de nucleótidos, que codifica o domínio da transmembrana de DR5, que comporta as sequências de aminoácidos nas posições próximas de 134 até próximas de 157 na SEQ ID NO: 2 ou o domínio da transmembrana de DR5 codificado pelo ADNc depositado na ATCC com o número de depósito 97920; (h) uma sequência de nucleótidos, que codifica o domínio intracelular de DR5, que comporta as sequências de aminoácidos nas posições próximas de 152 até próximas de 360 na SEQ ID NO: 2 ou o domínio intracelular de DR5 codificado pelo ADNc depositado na ATCC com o número de depósito 37920; (i) uma sequência de nucleótidos, que codifica o domínio de morte de DR5, que comporta as sequências de aminoácidos nas posições próximas de 273 até próximas de 340 na SEQ ID NO: 2 ou o domínio de morte de DR5 codificado pelo ADNc depositado na ATCC com o número de depósito 97920; e (j) uma sequência de nucleótidos complementar a qualquer uma das sequências de nucleótidos nas 24 alíneas (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) , (h) , ou (i) ante riores .

Por um polinucleótido comportando uma sequência de nucleótido pelo menos, por exemplo, 95 % "idêntica" a uma sequência de nucleótidos de referência que codifica um polipéptido de DR5, entende-se que a sequência de nucleótidos do polinucleótido é idêntica à sequência de referência, excepto no facto da sequência de polinucleótidos puder incluir até cinco pontos de mutações por cada cem nucleótidos da sequência de nucleótidos de referência, que codifica o polipéptido de DR5. Por outras palavras, para obter um polinucleótido comportando uma sequência de nucleótidos pelo menos 95 % idêntica a uma sequência de nucleótidos de referência, até 5 % dos nucleótidos na sequência de referência podem ser eliminados ou substituídos com outros nucleótidos ou um certo número de nucleótidos até 5 % dos nucleótidos totais na sequência de referência, podem ser inseridos na sequência de referência. A sequência de referência (query) pode ser toda a sequência de nucleótidos de DR5 mostrada na figura 1 (SEQ ID NO: 1) ou qualquer fragmento de polinucleótido conforme descrito aqui.

Como uma matéria prática, se qualquer molécula particular de ácido nucleico é pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica a, por exemplo, a sequência de nucleótidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou a sequência de nucleótidos do clone de ADNc depositado, pode ser determinada de uma forma convencional ou utilizando programas de computador conhecidos, tais como, o programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 5^5 Science Drive, Madison, WI 53711) . 0 Bestfit utiliza o algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, Advances 25 in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Quando se utiliza o Bestfit ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95 % idêntica a uma sequência de referência de acordo com a presente invenção, os parâmetros são estabelecidos, obviamente, de tal modo que a percentagem de identidade é calculada em relação ao comprimento completo da sequência de nucleótidos de referência e essas falhas na homologia até 5 % no número total de nucleótidos na sequência de referência são permitidas.

Num enquadramento específico, a identidade entre uma sequência de referência (query) (uma sequência da presente invenção) e uma sequência objecto, são referidas como um alinhamento global das sequências, determina-se usando o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990)). Os parâmetros preferidos utilizados no alinhamento de FASTDB das sequências de ADN para calcular a identidade percentual são: matriz = unitária, k-tuple = 4, penalização de desemparelhamento = 1, penalização de junção = 30, comprimento do grupo aleatório = 0, pontuação de cut-off = 1, penalização de intervalos = 5, penalização da dimensão do intervalo - 0,05, dimensão da janela == 500 ou o comprimento da sequência de nucleótidos objecto, se for mais curto. De acordo com este enquadramento, se a sequência objecto for mais curta do que a sequência de query por causa das eliminações de 5' ou de 3', não por causa das eliminações internas, faz-se uma correcção manual dos resultados tendo em consideração c facto de que o programa FASTDB não conta para as truncagens de 5' e 3' da sequência objecto quando se calcula a percentagem de identidade. Para as sequências objecto truncadas nas extremidades 5' ou 3', relativamente à sequência de query, a identidade percentual é 26 corrigida calculando o número de bases da sequência de query que representam 5' e 3' da sequência objecto, que não estão emparelhadas/alinhadas, como uma percentagem do número total de bases da sequência de query. Uma determinação se uma sequência está emparelhada/alinhada, faz-se por meio dos resultados do alinhamento da sequência de FASTDB. Esta percentagem é então subtraída da percentagem da identidade, calculada pelo programa FASTDB anterior utilizando os parâmetros especificados, para chegar a um valor final da percentagem de identidade. Este valor corrigido é aquele que se usa para fins deste enquadramento. Apenas as bases fora das bases de 5' e 3' da sequência objecto, tal como é evidenciado pelo alinhamento da FASTDB, que não estão emparelhadas/alinhadas com a sequência de query, são calculadas com fins de ajustamento manual dc valor da identidade percentual. Por exemplo, uma sequência objecto de 90 bases, está alinhada com uma sequência query de 100 bases para determinar a identidade percentual. As eliminações ocorrem na extremidade 5' da sequência objecto e por isso o alinhamento de FASTDB não mostra um emparelhamento/alinhamento das primeiras 10 bases da extremidade 5' . As 10 bases não emparelhadas representam 10 % da sequência (número de bases nas extremidades 5' e 3' que não estão emparelhadas/número total de bases na sequência de query) , de modo que se subtrai 10 % do valor da percentagem de identidade calculado pelo programa FASTDB. Se as restantes 90 bases se emparelharem perfeitamente, a percentagem final de identidade seria de 90 %. Num outro exemplo, uma sequência objecto com 90 bases é comparada com uma sequência de query com 100 bases. Neste caso as eliminações são eliminações internas de modo que não há bases nas extremidades 5' ou 3' da sequência objecto, que não estejam emparelhadas/alinhadas com a sequência de query. Neste caso, a percentagem de identidade calculada por FASTDB não é corrigida manualmente. 27

Mais uma vez, apenas bases 5' e 3' da sequência objecto que não estão emparelhadas/alinhadas com a sequência de query, sãc manualmente corrigidas. Não se fazem outras correcções manuais com a finalidade deste enquadramento. 0 presente pedido de patente de invenção tem por objecto moléculas de ácido nucleico, pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idênticas com a sequência de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 1, a sequência de ácidos nucleicos dos ADNcs depositados ou os seus fragmentos, independentemente do facto de elas codificarem um polipéptido que tem actividade de DR5. Isto deve-se ao facto de quando uma molécula particular de ácido nucleico não codifica um polipéptido que tem actividade de DR5, um especialista na matéria saberá ainda como utilizar a molécula de ácido nucleico, por exemplo, como uma sonda de hibridizaçao ou como um iniciador de uma reacção em cadeia de polimerase (RCP). As utilizações das moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção, que não codificam um polipéptido que tem uma actividade de DR5, incluem, inter alia: (1) o isolamento do gene de DR5 ou das suas variantes alélicas numa biblioteca de ADNc; (2) hibridizaçao in sítu (por exemplo, "FISH") com extensões cromossómicas de metafase para providenciar uma localização cromossómica precisa do gene DR5, conforme descrito em Verma et al.f Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); e (3) análise de mancha de Northern para detectar a expressão de ARNm de DR5 em tecidos específicos.

Preferidas, contudo, são as moléculas de ácidos nucleicos que têm sequências pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idênticas à sequência de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 1, a sequência de ácidos nucleicos dcs ADNcs depositados ou os seus fragmentos que, de facto, codificam um 28 polipéptido que tem actividade da proteína DR5. Por "um polipéptído que tem a actividade de DR5" entende-se polipéptidos que exibem uma actividade semelhante mas não necessariamente idêntica a uma actividade da proteína de DR5 da presente invenção (quer a proteína de comprimento completo ou, preferencialmente, a proteína madura) conforme se mede num ensaio biológico particular. Por exemplo, a actividade da proteína DR5 pode ser medida utilizando os ensaios de morte de células realizado essenciaimente conforme descrito previamente (A.M. Chinnaiyan, et al., Cell 81: 505-12 (1995); M.P. Boldin, et al., J Biol Chem 270: 7795-8 (1995); F.C. Kischkel, et al., EMBO 14: 5579-5588 (1995); A.M. Chinnaiyan, et al., J Biol Chem 271: 4961-4965 (1996)) e conforme estabelecido no exemplo 5 a seguir. Nas células MCF7, os plasmidos que codificam DR5 de comprimento completo ou um domínio de morte candidato contendo o receptor, são co-transfectados com a estrutura relatora de pLantern codificando uma proteína fluorescente verde. Os núcleos das células transfectadas com DR5 vão exibir uma morfologia apoptótica conforme como pode ser analisado por meio da coloração por DAPI. Semelhante à apóptose induzida por R de FNT1 e Fas/APO-1 (M. Muzio, et al., Cell 85: 817-827 (1996); Μ. P. Boldin, et al., Cell 85: 803-815 (1996); M. Tewari, et al., J Biol Chem 270: 3255-60 (1995)), a apóptose induzida por DR5 é, preferencialmente, bloqueada pelos inibidores de proteases semelhantes a ICE, CrmA e z-VAD-fmk.

Obviamente, devido à degenerescência do código genético, um especialista na matéria reconhecerá ímediatamente que um grande número de moléculas de ácido nucleico têm uma sequência pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à sequência de ácidos nucleicos do ADNc depositado, às sequências de ácidos nucleicos mostradas na SEQ ID NO: 1 ou aos seus fragmentos, que vão codificar um polipéptido "com 29 actividade da proteína DR5". De facto, dado que as variantes degeneradas destas sequências de nucleótidos codificam todas o mesmo polipéptido, em muitos casos, isto estará bem claro para o técnico da matéria, mesmo sem a realização do ensaio de comparação descrito antes. É ainda reconhecido na técnica que, para essas moléculas de ácidos nucleicos que não são variantes degeneradas, um número razoável entre elas vai também codificar um polipéptido que tem actividade da proteína DR5. Isto verifica-se porque um técnico da matéria está completamente dentro das substituições de aminoácidos que são menos prováveis ou que é provável que afectem significativamente a função da proteína (por exemplo, substituindo um aminoácído alifático por um segundo aminoácido alifático).

Por exemplo, as indicações respeitantes à forma de produzir fenotipicamente substituições de aminoácidos silenciosas, são dadas em Bowie, J.U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247: 1306-1310 (1990), em que os autores indicam que as proteínas são surpreendentemente tolerantes às substituições dos aminoácidos.

Ensaios de Polinucleótidos

Também se descreve aqui a utilização dos polinucleótidos de DR5 para detectar polinucleótidos complementares, tais como, por exemplo, como um reagente de diagnóstico. A detecção de uma forma mutada de DR5 associada com uma disfunção fornecerá uma ferramenta de diagnóstico que pode adicionar ou definir um diagnóstico de uma doença ou de uma susceptibilidade para uma doença, que resulta da subexpressão ou da sobre-expressão da expressão alterada de DR5 ou de uma 30 sua forma solúvel, tal como, por exemplo, tumores ou doenças auto-imunes.

Os indivíduos que comportam mutações no gene DR5 podem ser detectados ao nível do ADN por uma variedade de técnicas. Os ácidos nucleiccs para diagnóstico podem ser obtidos de células de pacientes, tais como, células de sangue, urina, saliva, biopsia do tecido e material de autópsia. 0 ADN genómico pode ser utilizado directamente para a detecção ou pode ser amplificado enzimaticamente utilizando RCP antes da análise. (Saiki et al., Nature 324:163-166 (1986)). Pode-se também utilizar ARN ou ADNc da mesma forma. Como exemplo, os iniciadores de RCP complementares dc ácido nucleico que codifica DR5 podem ser utilizados para identificar e analisar as expressões e as mutações de DR5. Por exemplo, as eliminações e as inserções podem ser detectadas por meio de uma alteração da dimensão do produto amplificado em comparação com o genótipo normal. Podem-se identificar as mutações pontuais por hibridização do ADN amplificado com o ARN de DR5 marcado com rádio ou, alternativamente, sequências de ADN de sentido oposto de DR5 marcadas com rádio. As sequências perfeitamente emparelhadas podem distinguir-se das sequências duplas desemparelhadas por digestão de RNase A ou pelas diferenças nas temperaturas de fusão.

As diferenças das sequências entre um gene de referência e os genes com mutações podem também ser reveladas por sequenciação directa do ADN. Além disso, podem utilizar-se segmentos de ADN clonados como sondas para detectar segmentos específicos de ADN. A sensibilidade desses processos pode ser muitíssimo melhorada pela utilização apropriada de RCP ou outros processos de amplificação. Por exemplo, utiliza-se um iniciador de sequenciação com um produto de RCP de estrutura helicoidal dupla ou uma molécula matriz com uma estrutura 31 helicoidal simples, gerada por uma RCP modificada. A determinação da sequência realiza-se por processos convencionais com nucleótidos marcados com rádio ou por processos automáticos de sequenciação com marcadores fluorescentes. 0 ensaio genético com base nas diferenças das sequências de ADN pode ser feito por detecção da alteração na mobilidade electroforética de fragmentos de ADN em geles, com ou sem agentes de desnaturação. Podem visualizar-se eliminações e inserções em sequências pequenas por electroforese em gel de elevada resolução. Os fragmentos de ADN de diferentes sequências podem distinguir-se nos geles de gradiente de formamida de desnaturação, em que as mobilidades dos diferentes fragmentos de ADN estão retardadas no gel em diferentes posições de acordo com as suas temperaturas de fusão específicas ou com as temperaturas de fusão parciais (ver, por exemplo, Myers et al., Science 230: 1242 (1985)).

As alterações da sequência em localizações específicas, podem também ser reveladas por ensaios de protecção da nuclease, tais como, protecção de RNase e SI ou o processo de clivagem química (por exemplo, Cotton et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 4397-4401 (1985)).

Assim, a detecção de uma sequência de ADN específica, pode ser conseguida por processos que incluem, mas não se limitam, à hibridização, protecção de RNase, clivagem química, sequenciação directa do ADN ou a utilização de enzimas de restrição (por exemplo, polimorfismos compridos de fragmentos de restrição ("PCFR") e análise de mancha de Southern do ADN genómico). 32

Para além da electroforese em gel mais convencional e da sequência de ADN, também se podem detectar as mutações por análise in situ.

Vectores e Células Hospedeiras A presente invenção também tem por objecto vectores que incluem moléculas de ADN da presente invenção, células hospedeiras que são tratadas por engenharia genética com cs vectores da presente invenção e a produção de polipéptidos da presente invenção por meio de técnicas recombinantes.

As células hospedeiras podem ser alteradas por engenharia genética para incorporar moléculas de ácidos nucleicos e expressar os polipéptidos da presente invenção. Os polinucleótidos podem ser introduzidos isoladamente ou com outros polinucleótidos. Esses outros polinucleótidos podem ser introduzidos independentemente, co-introduzidos ou introduzidos em conjunto com os polinucleótidos da presente invenção.

De acordo com este aspecto da presente invenção, o vector pode ser, por exemplo, um vector de plasmido, um vector de fago de estrutura helicoidal simples ou dupla, um ARN de estrutura helicoidal simples ou dupla ou um vector virai de ADN. Esses vectores podem ser introduzidos nas células como polinucleótidos, preferencialmente, ADN, por técnicas bem conhecidas para a introdução de ADN e de ARN nas células. Os vectores virais podem ser eficazes na replicação ou ineficazes na replicação. Neste último caso, a propagação virai geralmente ocorre apenas nas células hospedeiras complementares. 3

Entre os vários vectores, prefere-se, em certos aspectos, aqueles que servem para a expressão de polinucleótidos e polipéptidos da presente invenção. Geralmente, esses vectores compreendem regiões de controlo activas em cis, efectivas para a expressão num hospedeiro ligado operacionalmente ao polinucleótido a ser expresso. Os factores de actuação "trans" apropriados, são fornecidos quer pelo hospedeiro, ou são fornecidos por um vector complementar ou fornecidos pelo próprio vector após introdução no hospedeiro.

Pode utilizar-se uma grande variedade de vectores de expressão para expressar um polipéptido da presente invenção. Esses vectores incluem vectores cromossómicos, epissómicos e derivados de vírus, por exemplo, vectores derivados de plasmidos bacterianos, de bacteriófagos, de epissomas de fungos, de elementos cromossómicos de fungos, de vírus, tais como, baculovírus, vírus papova, tais como, SV40, vírus de vaccinia, adenovírus, poxvírus de aves, virus pseudorrábico e retrovírus e vectores da combinação dos anteriores, tais como, aqueles que derivam de plasmidos e elementos genéticos de bacteriófagos, tais como, cósmidos e fósmidos, podendo todos eles serem utilizados para a expressão de acordo com este aspecto da presente invenção. Geralmente, qualquer vector apropriado para manter, propagar ou expressar polinucleótidos para expressar um polipéptido num hospedeiro, podem ser utilizados para a expressão aqui contemplada. A sequência de ADN no vector de expressão está ligada operacionalmente à sequência ou sequências de controlo de expressão apropriadas, incluindo, por exemplo, um promotor para dirigir a transcrição de ARNm. Representantes desses promotores incluem o promotor de fago lambda PL, os promotores lac, trp e tac de E. coli, os promotores SV40 34 precoces e tardios e os promotores de LTRs retroviral, para enumerar apenas alguns dos promotores bem conhecidos. Em geral, as estruturas de expressão deverão conter sítios para a transcrição, iniciação e terminação e, na região transcrita, um sítio de ligação do ribossoma para a tradução. A porção de codificação dos transcriptos maduros expressa pelas estruturas incluirá uma iniciação da tradução AUG no início e um codão de terminação (UAA, UGA ou UAG) apropriadamente posicionado na extremidade do polipéptido a ser traduzido.

Além disso, as estruturas podem conter regiões de controlo, que regulam, assim como, controlam a expressão. Geralmente, essas regiões vão operar por transcrição do controlo, tal como, sítios de ligação do repressor e potenciadores, entre outros.

Os vectores para a propagação e a expressão geralmente incluirão marcadores seleccionáveis. Esses marcadores também podem ser apropriados para a amplificação ou os vectores podem conter marcadores adicionais para este fim. A este respeito, os vectores de expressão contêm, preferencialmente, um ou mais genes de marcadores seleccionáveis para providenciar um traço fenotipico para a selecção de células hospedeiras transformadas. Esses marcadores incluem, mas não se limitam, a di-hidrofolato redutase ou resistência à neomicina para culturas de células eucaríóticas e genes de resistência à tetraciclina ou à ampicilina para a cultura de E. coli e outras bactérias. 0 vector que contém a sequência de ADN apropriada tal como se descreveu noutro sítio aqui, assim como, um promotor apropriado e outras sequências de controlo apropriadas, podem ser introduzidos num hospedeiro apropriado utilizando uma variedade de técnicas bem conhecidas apropriadas para a 35 expressão de um polipéptido desejado. Exemplos representativos de hospedeiros apropriados incluem células bacterianas, tais como, células de E. coli, Streptomyces e Salmonella typhimurium; células de fungos, tal como, células de levedura; células de insectos, tais como, células S2 de Drosophila e células Sf9 de Spodoptera; células de animais, tais como, células de OHC, COS e células do melanoma de Bowes; e células de plantas. Os meios e as condições de cultura apropriados para as células hospedeiras descritas antes são bem conhecidos na técnica.

Entre os vectores preferidos para serem utilizados em bactérias estão pQE70, pQE60 e pQE-9, disponíveis na Qiagen; vectores de pBS, vectores de Phagescript, vectores de Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponíveis na Stratagene; e ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRITS, disponíveis na Pharmacia. Entre os vectores eucarióticos preferidos estão pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG, disponíveis na Stratagene; e pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL, disponíveis na Pharmacia. Estes vectores são listados apenas a título ilustrativo de muitos dos disponíveis comercialmente e que são conhecidos dos especialistas na matéria. A selecção dos vectores e promotores apropriados para a expressão numa célula hospedeira, é um processo bem conhecido e os requisitos técnicos para a construção do vector de expressão, a introdução do vector num hospedeiro e a expressão no hospedeiro, são rotinas dos técnicos da matéria. A presente invenção também tem por objecto células hospedeiras contendo as estruturas descritas e discutidas antes. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica superior, tal como, uma célula de mamífero ou uma célula eucariótica inferior, tal como, uma célula de levedura ou a 36 célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como, uma célula bacteriana. A estirpe hospedeira pode ser escolhida de forma a modular a expressão das sequências de gene inseridas ou modifica e trata o produto do gene de uma forma especifica desejada. A expressão de certos promotores pode ser feita na presença de certos indutores; essa expressão do polipéptido tratado por engenharia genética pode ser controlada. Além disso, diferentes células hospedeiras têm caracteristicas e mecanismos específicos para o tratamento translacional e pós-translacional e para a modificação (por exemplo, fosforilação, clivagem) das proteínas. Podem escolher-se linhas de células apropriadas para assegurar as modificações e o tratamento desejados da proteína estranha expressa. A introdução da estrutura na célula hospedeira pode ser efectuada por transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lípidos catiónicos, electroporação, transdução, infecção ou outros processos. Esses processos estão descritos em muitos manuais de normalização laboratorial, tal como, Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986). 0 polipéptido pode ser expresso de uma forma modificada, tal como, uma proteína de fusão (compreendendo o polipéptido ligado por via de uma ligação peptídica a uma sequência heteróloga de proteínas (ou a uma proteína diferente)) e pode incluir não apenas os sinais de secreção mas também regiões funcionais heterólogas adicionais. Essa proteína de fusão pode ser feita por polinucleótidos de ligação da presente invenção e a sequência de ácidos nucleícos desejada codificando a sequência de aminoácidos desejada uma à outra, por processos conhecidos na técnica, no próprio fragmento de leitura e a expressão do produto da proteína de fusão por 37 processos conhecidos na técnica. Alternativamente, essa proteína de fusão pode ser preparada por técnicas de síntese de proteínas, por exemplo, utilizando um sintetizador de péptidos. Assim, por exemplo, pode-se adicionar uma região de aminoácidos adicionais, particularmente, aminoácidos carregados, à terminação N do polipéptido para melhorar a estabilidade e a persistência na célula hospedeira, durante a purificação ou durante o manuseamento e armazenagem subsequentes. Adicionalmente, pode também adicionar-se uma região ao polipéptido para facilitar a purificação. Essas regiões podem ser eliminadas antes da preparação final do polipéptido. A adição das partes de péptido aos polipéptidos para provocar a secreção ou a excreção, para melhorar a estabilidade e para facilitar a purificação, entre outras, são técnicas familiares e de rotina na técnica. Uma proteína de fusão preferida compreende uma região heteróloga da imunoglobulina que é útil para solubilizar proteínas. Por exemplo, a patente de invenção europeia EP-A-0 464 533 (contraparte canadiana 2045869) descreve proteínas de fusão que compreendem várias porções da região constante das moléculas de imunoglobulina em conjunto com outras proteínas humanas ou partes delas. Em muitos casos, a parte Fc numa proteína de fusão, é fortemente vantajosa para ser utilizada na terapia e no diagnóstico e isto resulta, por exemplo, em melhores propriedades farmacocinéticas (patente de invenção europeia EP-A 0232 262). Por outro lado, para algumas utilizações, será desejável ser capaz de eliminar a parte Fc da proteína de fusão à medida que tenha sido expressa, detectada e purificada, de uma forma vantajosa já descrita. Este é o caso quando a porção de Fc prova ser um problema para a utilização em terapia e diagnóstico, por exemplo, quando a proteína de fusão vai ser usada ccmo um antigénio para imunizações. Na descoberta do fármaco, por exemplo, proteínas humanas, tal como, o receptor de hIL5 têm sido 38 fundidas com porções de Fc para fins de ensaios de avaliação de alto rendimento para identificar antagonistas de hIL5. Ver, D. Bennett et al., Journal of Molecular Recognition, S: 52 — 58 (1995) e K. Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry, 270:9459-9471 (1995).

Os polipéptidos de DR5 podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes, por processos normalizados que incluem, mas não se limitam, a precipitação no seio de sulfato de amónio ou de etanol, extracção por ácidos, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia de interacção hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia em hidroxilapatite e cromatografia em leptina. Mais preferencialmente, utiliza-se para a purificação cromatográfica liquida de elevada resolução ("CLER"). Podem utilizar-se técnicas bem conhecidas para a redobragem das proteínas para regenerar a conformação activa quando o polipéptido é desnaturado durante o isolamento e/ou a purificação.

Os polipéptidos da presente invenção incluem produtos purificados de forma natural, produtos resultantes de processos de síntese química e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariótico ou eucariótico, incluindo, por exemplo, células de bactérias, fungos, plantas superiores, insectos e mamíferos. Consoante o hospedeiro utilizado num processo de produção recombinante, os polipéptidos da presente invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Além disso, os polipéptidos da presente invenção podem também incluir um resíduo inicial de metionina modificada, nalguns casos, como resultado de processos mediados pelo hospedeiro. 39

Os polinucleótidos e os polipéptidos de DR5 podem ser utilizados de acordo com a presente invenção, para uma variedade de aplicações, particularmente, aquelas que fazem uso das propriedades químicas e biológicas de DR5. Entre estas, estão as aplicações em tratamento de tumores, resistência a parasitas, bactérias e vírus, para induzir a proliferação de células T, células endoteliais e certas células hematopoiéticas, para tratar restenose, enxertos versus doenças do hospedeiro, para regular respostas antivirais e para prevenir certas doenças auto-imunes após a estimulação de DR5 por um agonista. As aplicações adicionais estão relacionadas com o diagnóstico e o tratamento de distúrbios de células, tecidos e organismos. Estes aspectos da presente invenção são discutidos melhor a seguir.

Polipéptidos e Fragmentos de DR5 A presente invenção tem ainda por objecto um polipéptido de DR5 isolado, comportando a sequência de aminoácidos codificada pelo ADNc depositado ou a sequência de aminoácidos na SEQ ID NO: 2 ou um polipéptido ou um péptido que compreende uma porção dos polipéptidos anteriores. É sabido da técnica que algumas sequências de aminoácidos de DR5 podem variar sem um efeito significativo na estrutura ou na função da proteína. Se essas diferenças na sequência estão contempladas, deve ser recordado que haverá áreas críticas nas proteínas que determinam a actividade. Essas áreas compreenderão normalmente resíduos, que fazem o sítio de ligação do ligando ou o domínio de morte ou que formam estruturas terciárias que afectam estes domínios. 40

Assim, a presente invenção inclui variações da proteína de DR5 que mostram uma actividade substancial da proteína de DR5 ou que incluem regiões de DR5, tal como, as porções de proteínas discutidas a seguir. Alguns mutantes incluem eliminações, inserções, inversões, repetições e substituições de vários tipos. Tal como se indicou antes, as normas respeitantes às alterações dos aminoácidos, são provavelmente silenciosas sob o ponto de vista fenotípico e podem ser encontradas em Bowie, J.U. et al., Science 247:1306-1310 (1990).

Assim, o fragmento, derivado ou análogo do polipéptido da SEQ ID NO: 2 ou o que é codificado pelo ADNc depositado, pode ser (i) um, em que pelo menos um ou mais dos resíduos de aminoácidos, são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (preferencialmente, um resíduo de aminoácido conservado e, mais preferencialmente, pelo menos um mas menos do que dez resíduos de aminoácidos conservados) e esses resíduos de aminoácidos substituídos podem ou não ser um dos resíduos codificados pelo código genético ou (ii) um, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos, inclui um grupo substituinte ou (iii) um, em que o polipéptido maduro está fundido com outro composto, composto esse que aumenta o semi-período de vida do polipéptido (por exemplo, polietileno-glicol) ou (iv) um, em que os aminoácidos adicionais, estão fundidos com o polipéptido maduro, tal como, um péptido da região de fusão Fc de IgG ou uma sequência líder ou secretora ou uma sequência que é utilizada para a purificação do polipéptido maduro ou uma sequência de pró-proteína. Esses fragmentes, derivados e análogos é suporto estarem dentro do âmbito dos conhecimentos dos especialistas na matéria a partir dos presentes ensinamentos. 41

De particular interesse, são as substituições dos aminoácidos carregados por outros amincácidos carregados e com aminoácidos carregados negativamente ou neutros. Estes últimos resultam nas proteínas com cargas positivas reduzidas, na melhoria das características da proteína de DR5. A prevenção da agregação é altamente desejável. A agregação das proteínas não resulta apenas numa perda de actividade mas pode também ser problemática quando se preparam formulações farmacêuticas, porque podem ser imunogénicas. (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2: 331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)). A substituição dos aminoácidos pode também alterar a selectividade da ligação aos receptores da superfície das células. Ostade et al., Nature 361: 266-268 (1993) descreve certas mutações que resultam na ligação selectiva de FNT-alfa apenas a um de dois tipos de receptores de FNT conhecidos. Assim, o receptor de DR5 da presente invenção, pode incluir uma ou mais substituições, eliminações ou adições de aminoácidos, quer de mutações naturais ou de manipulação humana.

Tal como se indicou, as alterações são preferencialmente de natureza menor, tal como, as substituições conservadoras de aminoácidos, que não afectam significativamente a dobragem ou a actividade da proteína (ver quadro 1). 42 QUADRO 1. Substituições Conservadoras de Aminoácidos

Aromático Fenilalanina Triptofano Tirosina Hidrofóbico Leucína Isoleucina Valina Polar Glutamina Asparagina Básico Arginina Lisina Histidina Ácido Ácido Aspartático Ácido Glutâmico Pequeno Alanina Serina Trionina Metionina Glicina

Os aminoácidos da proteína de DR5 da presente invenção que são essenciais para a função, podem ser identificados por processos conhecidos nesta técnica, tal como, a mutagénese dirigida ac sítio ou a mutagénese de avaliação da alanina (Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Este último processo introduz mutações de apenas de alanina em cada resíduo da molécula. As moléculas mutantes resultantes são então ensaiadas para pesquisar a sua actividade 43 biológica, tal como, a ligação do receptor ou a actividade proliferativa in vítro ou in vivo. Cs sítios que são críticos para a ligação de ligando-receptor, podem também ser determinados por análise estrutural, tal como, cristalização, ressonância magnética nuclear ou marcação por foto-afinidade (Smith et al.r J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) e de Vos et al. Science 255:306-312 (1992)).

Os polipéptidos da presente invenção são preferen-cíalmente produzidos sob uma forma isolada. Por "polipéptido isolado" entende-se um polipéptido que está separado do seu ambiente original. Assim, um polipéptido produzido e/ou contido dentro de uma célula hospedeira recombinante, é considerado isolado para os fins da presente invenção. Também se entende como um "polipéptido isolado" os polipéptidos que tenham sido purificados, parcialmente ou praticamente, totalmente, a partir de uma células hospedeira recombinante. Por exemplo, uma versão do polipéptido DR5 produzido de forma recombinante, pode ser praticamente purificada por um processo numa única etapa, descrito em Smith and Johnson, Gene 61: 31-40 (1988).

Os polipéptidos da presente invenção também incluem o polipéptido codificado pelo ADNc depositado, incluindo o polipéptido líder, maduro, codificado pelo ADNc depositado menos o líder (isto é, a proteína madura); um polipéptido que compreende os aminoácidos desde de cerca de -51 até cerca de 360 na SEQ ID NO: 2; um polipéptido que compreende os aminoácidos desde de cerca de -50 até cerca de 360 na SEQ ID NO: 2; um polipéptido que compreende os aminoácidos desde de cerca de 1 até cerca de 360 na SEQ ID NO: 2; um polipéptido que compreende o domínio extracelular; um polipéptido que compreende o domínio da transmembrana; um polipéptido que compreende o domínio intracelular; um polipéptido que 44 compreende os domínios extracelular e intracelular com todo ou parte do domínio da transmembrana eliminada; e um polipéptido que compreende um domínio de morte; assim como, polipéptidos que, são pelo menos 90 % ou 95 % idênticos, ainda mais preferencialmente, pelo menos 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idênticos aos polipéptidos descritos antes e também incluem porções desses polipéptidos com, pelo menos 30 aminoácidos e, mais preferencialmente, pelo menos 50 aminoácidos.

Por um polipéptido com uma sequência de aminoácidos de, pelo menos, por exemplo, 95 % "idêntica" a uma sequência de aminoácidos de referência de um polipéptido de DR5, entende-se que a sequência de aminoácidos do polipéptido é idêntica à sequência de referência, excepto no facto da sequência de polipéptido puder incluir até cinco alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de referência do polipéptido DR5. Por outras palavras, para se obter um polipéptido com uma sequência de aminoácidos pelo menos 95 % idêntica a uma sequência de aminoácidos de referência, pode-se eliminar ou substituir até 5 % dos resíduos de aminoácidos na sequência de referência, com outros aminoácidos ou um certo número de aminoácidos até 5 % do total dos resíduos de aminoácidos na sequência de referência, podem ser inseridos na sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência, podem ocorrer nas posições terminais amino ou carboxi da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer parte entre estas posições terminais, espalhados entre resíduos individualmente na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

Como matéria prática, se qualquer polipéptido em particular, é pelo menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % 45 idêntico a, por exemplo, à sequência de aminoácidos mostrada na figura 1 (SEQ ID NO: 2), a sequência de aminoácidos codificada pelos clones do ADNc depositado ou dos seus fragmentos, pode ser determinada de uma forma convencional utilizando programas de computador conhecidos, tais como, o programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Quando se utiliza o Bestfit ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95 % idêntica a uma sequência de referência, de acordo com a presente invenção, os parâmetros são estabelecidos de tal modo que obviamente a percentagem de identidade é calculada em relação ao comprimento total da sequência de referência de aminoácidos e que as falhas ou faltas na homologia até 5 % do número total de aminoácidos na sequência de referência é permitida.

Num enquadramento específico, a identidade entre uma sequência de referência (query) (uma sequência da presente invenção) e uma sequência objecto, também referida como um alinhamento global da sequência, determina-se utilizando o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). Os parâmetros preferidos utilizados num alinhamento de aminoácidos por FASTDB são: matriz = PAM 0, k-tuple = 2, penalização de desemparelhamento 1, penalização de junção 20, comprimento do grupo aleatório = 0, pontuação do cut-c-ff = - 1 - r dimensão da janela = comprimento da sequência, penalização do intervalo = 5, penalização da dimensão do intervalo = 0,05, dimensão da janela = 500 ou o comprimento da sequência de aminoácidos objecto, se for mais curto. De acordo com este enquadramento, se a sequência objecto é mais curta do que a sequência de query devido às eliminações no terminal C ou N, 46 não por causa das eliminações internas, faz-se uma correcção manual aos resultados para ter em consideração o facto do que o programa FASTDB não tem em conta as truncagens nos terminais N e C da sequência objecto, quando calcula a percentagem global de identidade. Para as sequências objecto, truncadas nos termi-nais N e C, relativamente à sequência de query, a percentagem de identidade é corrigida calculando o número de resíduos da sequência query que estão no terminal N e C da sequência objecto, que não estão emparelhados/alinhados com um resíduo objecto correspondente, como uma percentagem do total das bases da sequência de query. Uma determinação de que um resíduo está emparelhado/alinhado, determina-se pelos resultados do alinhamento da sequência de FASTDB. Esta percentagem é então subtraída da percentagem de identidade, calculada pelo programa FASTDB anterior, utilizando os parâmetros especificados, para chegar a uma pontuação final da percentagem de identidade. Este valor final da percentagem de identidade é o que é utilizado para os fins deste enquadramento. Apenas os resíduos das terminações N e C da sequência objecto que não estão emparelhados/alinhados com a sequência de query, são considerados para os fins de ajustamento manual do valor da percentagem de identidade. Isto é, apenas as posições dos resíduos da sequência de query fora dos resíduos mais afastados dos terminais N e C da sequência objecto. Por exemplo, uma sequência objecto com 90 resíduos de aminoácidos está alinhada com uma sequência query de 100 resíduos, para determinar a percentagem de identidade. A eliminação ocorre na terminação N da sequência objecto e por isso o alinhamento do FASTDB não mostra um emparelhamento/alinhamento dos primeiros 10 resíduos na terminação N. Os 10 resíduos não emparelhados representam 10 % da sequência (número de resíduos nas terminações N e C não emparelhados sobre o número total de resíduos na sequência de 47 são subtraídos do valor da query) , de modo que os 10 % percentagem de identidade calculado pelo programa FASTDB. Se os restantes 90 resíduos estão perfeitamente emparelhados, a percentagem final de identidade seria de 90 %. Noutro exemplo, uma sequência objecto de 90 resíduos é comparada com uma sequência de query de 100 resíduos. Neste momento as eliminações são eliminações internas de modo que não há resíduos nas terminações N ou C da sequência objecto, que não estejam emparelhados/alinhados com a sequência de query. Neste caso, a percentagem de identidade calculada pelo FASTDB não é corrigida manualmente. Novamente apenas as posições de resíduos fora das extremidades dos terminais N e C da sequência objecto, conforme mostrado no alinhamento do FASTDB, que não estão emparelhadas/alinhadas com a sequência de query, é que são corrigidas manualmente. Não se fazem mais correcções manuais para os fins deste enquadramento. O polipéptido da presente invenção pode ser utilizado como um marcador do peso molecular nos geles de EGPA-SDS ou nas colunas de filtração de gel com peneiros moleculares utilizando processos bem conhecidos pelos especialistas na matéria.

Os requerentes descobriram que o polipéptido DR5 é uma proteína com 411 resíduos, que exibe três domínios estruturais principais. O primeiro, o domínio de ligação ao ligando, foi identificado dentro dos resíduos de cerca de 52 até cerca de 184 na figura 1 (resíduos de amincácidos de cerca de 1 até cerca de 133 na SEQ ID NO: 2). O segundo, o domínio da transmembrana, foi identificado dentro dos resíduos de cerca de 185 até cerca de 208 na figura 1 (resíduos de aminoácidos de cerca de 134 até cerca de 157 na SEQ ID NO: 2) . O terceiro, o domínio intracelular, foi identificado dentro dos resíduos de cerca de 209 até cerca de 48 411 na figura 1 (resíduos de aminoácidos de cerca de 158 até cerca de 360 na SEQ ID NO: 2) . É importante notar que os domínios intracelulares incluem um domínio de morte nos resíduos de cerca de 324 até cerca de 391 (resíduos de aminoácidos de cerca de 273 até cerca de 340 na SEQ ID NO: 2) . Outros fragmentos preferidos do polipéptido mostrado na figura 1, incluem a proteína madura dos resíduos de cerca de 52 até cerca de 411 (resíduos de aminoácidos de cerca de 1 até cerca de 360 na SEQ ID NO: 2) e os polipéptidos solúveis que compreendem todo ou parte dos domínios extracelular e intracelular, mas a que falta o domínio transmembrana. A presente invenção tem ainda por objecto polipéptidos de DR5 codificados pelo clone de ADNc depositado, incluindo o líder e fragmentos de polipéptidos de DR5 seleccionados da proteína madura, do domínio extracelular, do domínio transmembrana, do domínio intracelular, do domínio de morte e todas as suas combinações.

Num outro aspecto, a presente invenção tem objecto um péptido ou um polipéptido que compreende uma porção ligada ao epitopo de um polipéptido aqui descrito. O epitopo desta porção de polipéptido, é um epitopo imunogénico ou antigénico de um polipéptido da presente invenção. Um "epitopo imunogénico" define-se como uma parte de uma proteína que provoca uma resposta dos anticorpos quando toda a proteína é o imunogénio. Por outro lado, uma região de uma molécula da proteína à qual um anticorpo se pode ligar, define-se como um "epitopo antigénico". O número de epitopos imunogénicos de uma proteína, é geralmente inferior ao número de epitopos antigénicos. Ver, por exemplo, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3998-4002 (1983). 49

Como para a selecção de péptidos ou de polipéptidos que se ligam a um epitopo antigénico (isto é, que contêm uma região de uma molécula de proteína à qual um anticorpo se pode ligar), é bem conhecido na técnica, que relativamente poucos péptidos sintéticos que simulam parte de uma sequência de proteína, são capazes, por rotina, de provocar um anti-soro que reage com a proteína parcialmente simulada. Ver, por exemplo, Sutcliffe, J. G., Shinnick, T. M., Green, N. e Learner, R.A., "Antibodies That React With Predetermined Sites on Proteins", Science 219:660-666 (1983). Os péptidos capazes de provocar soros reactivos à proteína, estão frequentemente representados na sequência primária de uma proteína e podem ser caracterizados por um conjunto de regras químicas simples e não estão confinados às regiões imuno-dominantes das proteínas intactas (isto é, epitopos imunogénicos) nem aos terminais amino ou carboxi.

Os péptidos e os polipéptidos da presente invenção, que se ligam ao epitopo antigénico, são por isso úteis para produzir anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais, que se ligam especificamente a um polipéptido da presente invenção. Ver, por exemplo, Wilson et al., Cell 37: 767-778 (1984) at 777. Os péptidos e polipéptidos da presente invenção, que se ligam ao epitopo antigénico contêm, preferencialmente, uma sequência de pelo menos sete, mais preferencialmente, pelo menos nove e, ainda mais preferencialmente, entre pelo menos cerca de 15 até cerca de 30 aminoácidos, contidos dentro da sequência de aminoácidos de um polipéptido da presente invenção.

Exemplos não limitativos de polipéptidos antigénicos ou de péptidos antigénicos que podem ser utilizados para gerar anticorpos específicos de DR5 incluem: um polipéptido que compreende resíduos de aminoácidos de cerca de 62 até cerca 50 de 110 na figura 1 (cerca de 11 até cerca de 59 na SEQ ID NO: 2); cerca de 119 até cerca de 164 na figura 1 (cerca de 68 até cerca de 113 na SEQ ID NO: 2); cerca de 224 até cerca de 271 na figura 1 (cerca de 173 até cerca de 220 na SEQ ID NO: 2); cerca de 275 até cerca de 370 na figura 1 (cerca de 224 até cerca de 319 na SEQ ID NO: 2). Tal como se indicou antes, os requerentes determinaram que os fragmentos de polipéptidos anteriores, são regiões antigénicas da proteína de DR5.

Os péptidos e polipéptidos da presente invenção que se ligam ao epitopo podem ser produzidos por quaisquer meios convencionais. Hougthen, R.A., "General Method for the Rapid Solid-Phase Synthesis of Large Numbers of Peptides: Specificity of Antígen-Antibody Interaction at the Levei of Individual Amino Acíds", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 5131-5135 (1985) . Este processo de "síntese simultânea de múltiplos péptidos (SSMP)", está ainda descrito na patente de invenção norte-americana U.S. NO: 4.631.211 para Hougthen et al. (1986).

Como será evidente para um especialista na matéria, os polipéptidos de DR5 da presente invenção e os seus fragmentos ligados a epitopos descritos antes, podem combinar-se com partes do domínio constante das imunoglobulinas (IgG), resultando em polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusão facilitam a purificação e mostram um aumento do semi-período de vida in vivo. Isto foi já mostrado, por exemplo, para proteínas quiméricas que consistem nos primeiros dois domínios do polipéptido humano CD4 e nos vários domínios das regiões constantes das cadeias pesadas ou leves das imunoglobulinas de mamíferos (patente de invenção europeia EPA 394.827; Traunecker et al., Nature 331: 84-86 (1988)). As proteínas de fusão que têm uma estrutura dimérica ligada a di-sulfureto devido à parte de IgG, podem também ser mais 51 eficientes na ligação e na neutralização de outras moléculas do que a proteína monomérica DR5 ou um fragmento de proteína isolado (Fountoulakis et ai., J Biochem 270: 3958-3964 (1995)) .

Ensaios dos Polipéptidos

Descrevem-se aqui ensaios de diagnóstico, tal como, ensaios quantitativos e de diagnóstico para a detecção dos níveis da proteína de DR5 ou das suas formas solúveis, em células e tecidos, incluindo a determinação dos níveis normais e anormais. Assim, por exemplo, um ensaio de diagnóstico de acordo com a presente invenção, para detectar a sobre-expressão de DR5 ou da sua forma solúvel, comparado com amostras de controlo de tecido normal, pode ser utilizados para detectar a presença, por exemplo, de tumores. As técnicas de ensaio que podem ser utilizadas para determinar os níveis de uma proteína, tal como, uma proteína de DR5 da presente invenção ou de uma sua forma solúvel, numa amostra derivada de um hospedeiro, são bem conhecidos dos especialistas na matéria. Esses processos de ensaio incluem ensaios rádio-imunitários, ensaios comparativos da ligação, análise de mancha de Western e ensaios por ELISA. A análise dos níveis da proteína de DR5 numa amostra biológica, podem ocorrer utilizando qualquer processo conhecido na técnica. Por "amostra biológica" entende-se qualquer amostra biológica obtida de um indivíduo, linha de células, cultura de tecido ou outra fonte contendo a proteína do receptor de DR5 ou ARNm. As técnicas preferidas para o ensaio dos níveis de proteína de DR5 numa amostra biológica, são técnicas à base de anticorpos. Por exemplo, a expressão de proteína de DR5 em tecidos pode ser estudada com processos ímuno-histológícos clássicos. (Jalkanen, M. et al., J. Cell. 52 J. Cell.

Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen, M. et al.,

Biol. 105: 3087-3096 (1987)). Outros processos à base de anticorpos úteis para a detecção da expressão dos genes da proteína de DR5 incluem imuno-ensaios, tais como, o ensaio imuno-absorvente ligado a enzimas (ELISA) e o rádio-imuno-ensaio (RIA).

Conhecem-se na técnica marcadores apropriados que incluem marcadores de enzimas, tal como, glicose-oxidase, rádio-isótopos, tal como, marcadores de iodo (I125, i121), carbono (C14) , enxofre (S35), trítio (H3) , índio (In 112) e * αο-η tecnecio iTc ) e marcadores fluorescentes, tal como, fluoresceína e rodamína e biotina.

Terapêutica

Os ligantes da família do factor de necrose do tumor (FNT) são conhecidos por estarem entre as citocinas mais pleiotrópicas, induzindo um grande número de respostas celulares, incluindo citotoxicidade, actividade antiviral, actividades imuno-reguladoras e a regulação transcricional de vários genes (Goeddel, D.V. et al., "Tumor Necrosis Factors: Gene Structure and Biological Activities", Symp. Quant. Biol. 51: 597-609 (1986), Cold Spring Harbor; Beutler, B., e

Cerami, A., Annu. Rev. Biochem. 57: 505-518 (1988); Old, L. J., Sei. Am. 258: 59-75 (1988); Fiers, W., FEBS Lett. 285: 199-224 (1991)). Os ligantes da família do FNT induzem essas várias respostas celulares por meio da ligação aos receptores da família do FNT, incluindo o DR5 da presente invenção. As células que expressam o polipéptido DR5 e que se crê que tenham uma potente resposta celular aos ligandos de DR5, incluem células dendríticas primárias, tecido endotelíal, baço, leucemia linfocítica crónica e células humanas do estroma do timo. Por "uma resposta celular a um ligando da 53 família do FNT" entende-se qualquer alteração genotípica, fenotípica e/ou morfológica de uma célula, linha de células, tecido, cultura de tecido ou de um paciente, que é induzida por um ligando da família do FNT. Tal como indicado, essas respostas celulares incluem não apenas respostas fisiológicas normais aos ligandos da família do FNT, mas também doenças associadas com um aumento da apóptose ou a inibição da apóptose. Apóptose (morte programada das células) é um mecanismo fisiológico envolvido na eliminação de linfócitos T periféricos do sistema imunitário e a sua desregulação pode levar a um certo número de diferentes processos patogénicos (Ameisen, J. C., AIDS 8: 1197-1213 (1994); Krammer, P. H. et al., Curr. Opin. Immunol. 6: 279-289 (1994)).

As doenças associadas com um aumento da sobrevivência das células ou com a inibição da apóptose incluem cancros (tais como, linfomas foliculares, carcinomas com mutações de p53 e tumores dependentes de hormonas, tais como, cancro da mama, cancro da próstata, sarcoma de Kaposi e cancro do ovário); distúrbios auto-imunitários (tais como, lúpus eritematoso agudo disseminado e artrite reumatóide da glomerulonefrite relacionada com o sistema imunitário) e infecções virais (tais como, vírus de herpes poxvírus e adenovírus), inflamação; enxerto versus doença de hospedeiro, rejeição aguda de enxerto e rejeição crónica de enxerto. Doenças associadas com um aumento da apóptose incluem SIDA; distúrbios neurodegenerativos (tais como, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, retinite pigmentosa, degeneração cerebeiar); síndromas rnielodisplásicos (tais como, anemia aplásica), feridas isquémicas (tais como, as causadas pelo enfarte do miocárdio, ataques cardíacos e feridas de reperfusão), doenças do fígado induzidas por toxinas (tais como, as causadas pelo álcool), choque séptico, caquexia e anorexia. 54

Assim, a utilização de um ligando de DR5, um seu análogo ou um agonista capaz de aumentar a sinalização mediada por DR5 para a preparação de uma composição farmacêutica para aumentar a apóptose induzida por um ligando da família do FNT, é pretendida e envolve a administração a uma célula que expressa o polipéptido de DR5, de uma quantidade efectiva da referida composição farmacêutica. Preferencialmente, a sinalização mediada por DR5 é aumentada para tratar uma doença em que existe uma diminuição da apóptose ou uma diminuição da citocina e da expressão da molécula de adesão. Um agonista pode incluir formas solúveis de DR5 e anticorpos monoclonais dirigidos contra o polipéptido DR5.

Num outro aspecto, visa-se a utilização de um antagonista capaz de diminuir a sinalização mediada por DR5, para a preparação de uma composição farmacêutica, para a inibição da apóptose induzida por um ligando da família do FNT, que envolve a administração a uma célula que expressa o polipéptido DR5 de uma quantidade efectiva da referida composição farmacêutica. Preferencialmente, a sinalização mediada por DR5 é diminuída para tratar uma doença em que a apóptose está aumentada ou em que há a expressão de NFkB. Um antagonista pode incluir formas solúveis de DR5 e anticorpos monoclonais dirigidos contra o polipéptido DR5.

Por "agonista" entende-se compostos sintéticos e de ocorrência natural, capazes de aumentar ou potenciar a apóptose. Por "antagonista" entende-se compostos sintéticos e de ocorrência natural, capazes de inibir a apóptose. Quando qualquer candidato a "agonista" ou a "antagonista", conforme se descreve aqui, que pode aumentar ou inibir a apóptose pode ser determinado, utilizando ensaios de resposta celular ao ligando/receptor da família do FNT conhecidos na técnica, 55 incluindo aqueles que são descritos com mais detalhe a seguir.

Um desses processos de rastreio envolve a utilização de melanóforos que são transfectados para expressar o receptor da presente invenção. Essas técnicas de rastreio estão descritas na patente de invenção PCT WO 92/01810, publicada em 06 de Fevereiro de 1992. Esse processo de ensaio pode ser utilizado, por exemplo, para rastrear um composto que inibe (ou potência) a activação do polipéptido receptor da presente invenção, por meio do contacto das células do melanóforo que codificam o receptor tanto com um ligando da família do FNT como com um "antagonista ou agonista" candidato. A inibição ou o aumento do sinal gerado pelo ligando indica que o composto é um antagonista ou um agonista da via de sinalização do ligando/receptor.

Outras técnicas de rastreio incluem a utilização de células que expressam o receptor (por exemplo, células de OHC (ovário de hamster chinês) transfectadas) num sistema que mede as alterações extracelulares do pH causadas pela activação do receptor. Por exemplo, pode-se fazer contactar os compostos com uma célula que expressa o polipéptido receptor da presente invenção e uma segunda resposta do mensageiro, por exemplo, transdução do sinal ou alterações do pH, podem ser medidas para determinar se o potencial composto activa ou inibe o receptor.

Outras técnicas de rastreio envolvem a introdução do ARN que codifica o receptor em oócitos de Xenopus, para expressar transientemente o receptor. Os oócitos do receptor podem então pôr-se em contacto com o ligando do receptor e um composto a ser rastreado seguido da detecçâo da inibição ou 56 da activação de um sinal de cálcio no caso do rastreio de compostos que se pensa que inibem a activação do receptor.

Outra técnica de rastreio envolve a expressão em células de uma estrutura em que c receptor está ligado a uma fosfolipase C ou D. Essas células incluem células endoteliais, células do músculo liso, células embrionárias do rim, etc. 0 rastreio pode ser realizado conforme se descreveu aqui antes, por meio da detecção da activação do receptor ou da inibição da activação do receptor a partir do sinal de fosfolipase.

Outro processo envolve o rastreio de compostos (antagonistas) que inibem a activação do polipéptido receptor da presente invenção, por meio da determinação da inibição da ligação do ligando marcado às células que têm o receptor na sua superfície. Esse método envolve a transfecçâo de uma célula eucariótica com ADN, que codifica o receptor, de tal modo que a célula expressa o receptor na sua superfície e contacta a célula com um composto na presença de uma forma marcada de um ligando conhecido. 0 ligando pode ser marcado, por exemplo, por radioactividade. A quantidade de ligando marcado ligado aos receptores é medida, por exemplo, medindo a radioactividade dos receptores. Se o composto se liga ao receptor conforme determinado por uma redução do ligando marcado que se liga aos receptores, a ligação do ligando marcado aos receptores está inibida.

Outros ensaios de rastreio para agonistas e antagonistas da presente invenção, estão descritos em Tartaglia, L.A., e Goeddel, D. V., J. Biol. Chem. 267: 4304-4307 (1992).

Assim, num outro aspecto, descreve-se um processo de rastreio para determinar se um agonista ou um antagonista 57 candidato é capaz de aumentar ou de inibir uma resposta celular a um ligando da família do FNT. 0 processo envolve o contacto das células que expressam o polipéptido de DR5 com um composto candidato e um ligando da família do FNT, ensaiando uma resposta celular e comparando a resposta celular a uma resposta celular padrão, sendo o padrão analisado quando se faz o contacto com o ligando na ausência do composto candidato, em que um aumento da resposta celular em relação ao padrão, indica que o composto candidato é um agonista da via de sinalização do ligando/receptor e uma diminuição da resposta celular comparada com o padrão, indica que o composto candidato é um antagonista da via de sinalização do ligando/receptor. Por "análise de uma resposta celular" entende-se a medição qualitativa ou quantitativa de uma resposta celular a um composto candidato e/ou um ligando da família do FNT (por exemplo, determinação ou estimativa de um aumento ou de uma diminuição na proliferação das células T ou na marcação de timidína tritiada). De acordo com a presente invenção, uma célula que expressa o polipéptido de DR5 pode ser contactada com um ligando da família do FNT administrado quer endogenamente, quer exogenamente.

Agonista, tal como descrito aqui, inclui compostos sintéticos e de ocorrência natural, tal como, por exemplo, fragmentos de péptidos de ligando da família do FNT, factor do crescimento da transformação, neuro-transmissores (tais como, glutamato, dopamina, N-metil-D-aspartato), supressores de tumor (p53), células T citolíticas e antimetabolitos. Os agonistas preferidos incluem fármacos quimioterapêuticos, tais como, por exemplo, cisplatina, doxorubicina, bleomicina, citosina arabinósido, mostarda de azoto, metotrexato e vincristina. Outros incluem péptidos de etanol e de amiióide. (Science 267: 1457-1458 (1995)). Outros agonistas preferidos incluem anticorpos policlonais e monocionais dirigidos contra 58 o polipéptido de DR5 ou um seu fragmento. Esses anticorpos agonistas dirigidos contra um receptor da família do FNT estão descritos em Tartaglia, L.A., et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 9292-9296 (1991); e Tartaglia, L.A., e Goeddel, D.V., J. Bíol. Chem. 267(7): 4304-4307 (1992), ver também, o pedido de patente de invenção PCT WO 94/09137.

Antagonista, tal como se descreve aqui, inclui compostos sintéticos e de ocorrência natural, tal como, por exemplo, o ligando CD40, aminoácidos neutros, zinco, estrogénio, androgénios, genes virais (tais como, adenovírus EIB, baculovírus p35 e IAP, poxvírus de vacas crmA, virus de Epstein-Barr BHRF1, LMP-1, vírus da febre suína africana LMW5-HL, e vírus do herpes yl 34.5), inibidores de calpaína, inibidores de cisteína protease e promotores de tumor (tais como, PMA, fenobarbital e alfa-hexaclorociclo-hexano).

Outros antagonistas potenciais incluem moléculas de sentido inverso. A tecnologia de sentido inverso (anti-sense) pode ser utilizada para controlar a expressão dos genes através do ADN ou do ARN anti-sense ou através da formação de hélices triplas. As técnicas de sentido inverso estão discutidas, por exemplo, em Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988) . A formação de hélices triplas discute- se, por exemplo, em Lee et ai., Nucleic Acíds Research 6: 3073 (1979); Cooney et al.r Science 241: 456 (1988) ; e Dervan et ai., Science 251: 1360 (1991). Os processos baseiam- se na ligação de um polínucleótido a um ADN ou ARN complementar. Por exemplo, a porção de codificação de 5' de um polínucleótido que codifica o polipéptido maduro da presente invenção, pode ser utilizado para desenhar um oligonucleótido de ARN de sentido inverso, desde cerca de 10 até cerca de 40 pares de bases de 59 comprimento. Desenha-se um oligonucleótido de ADN para ser complementar a uma região do gene envolvido na transcrição, prevenindo assim a transcrição e a produção do receptor. 0 oligonucleótido de ARN de sentido inverso hibridiza com o ARNm ín vivo e bloqueia a tradução da molécula de ARNm no polipéptido receptor. 0 ácido nucleico de sentido inverso de DR5 pode ser produzido intracelularmente por transcrição de uma sequência exógena. Por exemplo, transcreve-se ou um vector cu uma porção dele, produzindo um ácido nucleico de sentido inverso (ARN) da presente invenção. Esse vector vai conter uma sequência que codifica o ácido nucleico de sentido inverso de DR5. Esse vector pode permanecer epissómico ou tornar-se integrado sob o ponto de vista cromossómico, assim como, pode ser transcrito para produzir o ARN de sentido inverso desejado. Esses vectores podem ser construídos por processos de tecnologia de ADN recombinante, que estão normalizados nesta técnica. Os vectores podem ser plasmidos, virais ou outros conhecidos na técnica, utilizados para a replicação e a expressão em células de vertebrados. A expressão da sequência que codifica DR5 com os seus fragmentos pode ser feita por qualquer promotor conhecido na técnica para actuar em vertebrados, preferencialmente, em células humanas. Esses promotores podem ser indutíveis ou constitutivos. Esses promotores incluem, mas não se limitam, à região promotora precoce de SV40 (Bernoist and Chambon, Nature 29:304-310 (1981), o promotor contido na repetição do terminal longo de 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980), o promotor timidina do herpes (Wagner et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.Ã. 78: 1441-1445 (1981), as sequências reguladoras do gene de metalotioneína (Brinster, et al., Nature 296: 39-42 (1982)), etc. 60

Os ácidos nucleicos de sentido inverso compreendem uma sequência complementar e pelo menos a uma porção do transcripto de ARN de um gene de DR5. Contudo, não é necessária uma complementaridade absoluta, embora seja preferível. Uma sequência "complementar de pelo menos uma porção de um ARN" referida aqui, significa uma sequência que tem uma complementaridade suficiente para ser capaz de hibridizar com o ARN formando uma estrutura dupla estável; no caso de ácidos nucleicos de DR5 de sentido inverso de estrutura helicoidal dupla, pode-se então ensaiar um ADN de estrutura helicoidal simples ou uma formação tripla pode também ser analisada. A capacidade para hibridizar dependerá tanto do grau de complementaridade como do comprimento do ácido nucleico de sentido inverso. Geralmente quanto maior for a hibridização dos ácidos nucleicos, mais bases emparelham com o ARN de DR5 e ainda formam uma estrutura dupla estável (ou tripla, conforme for o caso). Um especialista na matéria pode acertar um grau tolerável de desemparelhamento por meio da utilização de processos padrão para determinar o ponto de fusão hibridizado.

Os antagonistas potenciais também incluem ARN catalítico ou uma ribozima (ver, por exemplo, a publicação da patente de invenção internacional PCT WO 90/11364, publicada em 04 de Outubro de 1990; Sarver et al, Science 247: 1222-1225 (1990). Embora se possam utilizar ribozimas que clivam ARNm em sítios específicos da sequência de reconhecimento para destruir os ARNms de DR5, prefere-se a utilização de ribozimas em forma de cabeça de martelo. As ribozimas em forma de cabeça de martelo clivam os ARNms em localizações ditadas pelas regiões de flanqueio que formam pares de bases complementares com o ARNm alvo. 0 único requisito é que o ARNm tenha a seguinte sequência de duas bases: 5'-UG-3'. A construção e a produção de ribozimas em forma de cabeça de marrelo é bem conhecida na 61 técnica e está descrita completamente em Haseloff e Gerlach, Nature 334:585-591 (1988). Há numerosos sítios potências de clivagem da ribozima em forma de cabeça de martelo dentro da sequência de nucleótidos de DR5 (figura 1). Preferencialmente, trata-se a ribozima por engenharia genética de modo a que o sítio de reconhecimento da clivagem esteja localizado próximo da extremidade 5' do ARNm de DR5; isto é, para aumentar a eficiência e minimizar a acumulação intracelular de transcriptos de ARNm não funcionais. As estruturas de ADN que codificam a ribozima, podem ser introduzidas na célula da mesma maneira que se descreveu antes para a introdução do ADN de codificação de sentido inverso. Dado que as ríbozimas, ao contrário das moléculas de sentido inverso são catalíticas, para a sua eficiência, é necessária uma concentração intracelular menor.

Outros antagonistas incluem formas solúveis de DR5, isto é, fragmentos de DR5 que incluem o domínio de ligação do ligando da região extracelular do receptor de comprimento completo. Essas formas solúveis do receptor, que podem ser sintéticas ou de ocorrência natural, antagonizam com a sinalização mediada por DR5 competindo com DR5 da superfície das células para a ligação aos ligandos da família do FNT. Assim, as formas solúveis do receptor que incluem o domínio de ligação do ligando, são citocinas novas capazes de inibir a apóptose induzida pelos ligandos da família de FNT. Estes podem ser expressos como monómeros mas, preferencialmente, são expressos como dímeros ou trímeros, dado que estes têm-se mostrado como sendo superior às formas monoméricas do receptor solúvel, como antagonistas, por exemplo, fusões da familia do receptor de FNT com IgGFc. Outras dessas citocinas são conhecidas na técnica e incluem Fas B (uma forma solúvel do receptor Fas de rato), que actua fisiologícamente para 62 limitar a apóptose induzida pelo ligando de Fas (Hughes, D.P. e Crispe, I.N., J. Exp. Med. 182: 1395-1401 (1995)). O termo "anticorpo" (Ac) ou "anticorpo monoclonal" (Acm), tal como se utiliza aqui, é suposto incluir moléculas intactas, assim como, os seus fragmentes (tais como, por exemplo, Fab e F(ab')2), que são capazes de se ligar a um antigénio Fab, Fab' e F(ab')2 a que falta o fragmento Fc do anticorpo intacto, desaparecem mais rapidamente da circulação e têm menos ligação ao tecido não especifico de um anticorpo intacto (Wahl et al., J, Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).

Os anticorpos de acordo com a presente invenção, podem ser preparados por qualquer uma da variedade dos processos normalizados utilizando imunogénios de DR5 da presente invenção. Tal como se indicou, esses imunogénios de DR5 incluem o polipéptido de DR5 de comprimento completo (que pode ou não incluir a sequência líder) e fragmentos do polipéptido de DR5, tal como, o domínio de ligação do ligando, o domínio da transmembrana, o domínio intracelular e o domínio de morte.

Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados em processos conhecidos na técnica, relacionados com a localização e a actividade das sequências de polipéptidos da presente invenção, por exemplo, obtendo a imagem destes polipéptidos, medindo os seus níveis em amostras fisiológicas apropriadas, etc. Os anticorpos também têm utilização em imuno-ensaios e em terapêutica como agonistas e antagonistas de DR5.

As proteínas e outros compostos que se ligam aos domínios de DR5 são também agonistas e antagonistas candidatos. Esses compostos de ligação podem ser "capturados" 63 utilizando o sistema híbrido de dois fungos (Fields e Song, Nature 340: 245-246 (1989)) . Uma versão modificada do sistema híbrido de dois fungos foi descrita por Roger Brent e os seus colegas (Gyuris, J. et al., Cell 75: 791-803 (1993); Zervos, A. S. et al., Cell 72: 223-232 (1993)). Preferencialmente, utiliza-se o sistema híbrido de dois fungos de acordo com a presente invenção, para capturar compostos que se ligam quer ao domínio de ligação do ligando de DR5, quer ao domínio intracelular de DR5. Esses compostos são bons candidatos a agonistas e a antagonistas da presente invenção.

Por um "ligando da família do FNT" entende-se ligandos de ocorrência natural, recombinantes e sintéticos, que são capazes de se ligarem a um membro da família dos receptores de FNT e induzir a via de sinalização do ligando/receptor. Os membros da família do FNT incluem, mas não se limitam, a ligandos de DR5, LIART, FNT-α, linfotoxina-a (LT-α, também conhecida como FNT-6), LT-β (encontrado no heterotrímero complexo Βϊ-α2-β), FasL, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, 0X40 e factor de crescimento do nervo (FCN). Um exemplo de um ensaio que pode ser realizado para determinar a capacidade de DR5 e dos seus derivados (incluindo os seus fragmentos) e os seus análogos para se ligarem a LIART, está descrito a seguir no exemplo 6.

Aplicações terapêuticas representativas da presente invenção são descritas com mais detalhe a seguir. 0 estado de imunodeficiência que define a SIDA é secundário a uma diminuição do número e da função dos línfócitos T de CD4 + . Recentes relatórios estimam que a perda diária das células T de CD4+ está entre 3,5 X 10' e 2 X 10d células (Wei X. et al., Nature 373: 117-122 (1995)). Uma causa da diminuição das células T de CD4+ no estabelecimento da infecção por VIH, crê-se que seja a apóptose induzida por VIH. Na verdade, a 64 morte apoptótica das células induzida por VIH, foi demonstrada não só ín vitro mas também, e o que é maís importante, em indivíduos infectados (Ameisen, J. C., AIDS 8: 1197-1213 (1994); Finkel, T. H., e Banda, N. K., Curr. Opin. Immunol. 6: 605-615 (1995); Muro-Cacho, C. A. et al., J.

Immunol. 154: 5555-5566 (1995)). Além disso, a apóptose e a diminuição dos linfócitos T de CD4+ está fortemente correlacionada em diferentes modelos animais, com a SIDA (Brunner, T., et al., Nature 373: 441-444 (1995); Gougeon, M. L., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9: 553-563 (1993)) e não se observou apóptose nesses modelos animais em que a replicação virai não resultou em SIDA (Gougeon, M. L. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9: 553-563 (1993)). Outros dados indicam que linfócitos T não infectados mas iniciados ou activados a partir de indivíduos infectados com VIH sofrem apóptose depois de encontrarem o ligando da família do FNT FasL. Utilizando linhas de células monocíticas que resultam na morte no seguimento da infecção por VIH, tem-se demonstrado que a infecção das células U937 com VIH, resulta na expressão de novo de FasL e que FasL medeia a apóptose induzida por VIH (Badley, A. D. et al., J. Virol. 70: 199-206 (1996)). Em seguida o ligando da família do FNT foi detectável em macrófagos não infectados e a sua expressão foi sobrerregulada no seguimento da infecção por VIH, resultando na morte selectiva de linfócitos T de CD4 não infectados (Badley, A. D. et al., J. Virol. 70: 199-206 (1996)). Assim, a utilização de um antagonista para reduzir a morte selectiva dos linfócitos T de CD4 para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar indivíduos positivos ao VIH, foi determinada. Os modos de administração e as dosagens estão discutidos em detalhe a seguir.

Na rejeição de um alo-enxerto o sistema imunitário do animal receptor não foi previarr.ente iniciado para responder 65 porque o sistema imunitário na sua maior parte é apenas desencadeado por antigénios ambientais. Os tecidos de outros membros ou das mesmas espécies não têm sido apresentados da mesma maneira que, por exemplo, os vírus e as bactérias se têm apresentado. No caso de rejeição dos alo-enxertos, os regimes ímunossupressores são desenhados de forma a prevenir que o sistema imunitário atinja o estado de infector. Contudo, o perfil imunitário da rejeição ao xeno-enxerto, pode simular a recorrência da doença mais do que a rejeição do alo-enxerto. No caso de recorrência da doença, c sistema imunitário já tinha sido activado, como se pode pôr em evidência pela destruição das células originais de isletos. Por isso, na recorrência da doença, o sistema imunitário está já no estado de infector. Os agonistas da presente invenção são capazes de suprimir a resposta imunitária tanto aos alo-enxertos como aos xeno-enxertos, porque os linfócitos activados e referenciados nas células infectoras vão expressar o polipéptido DR5 e assim são susceptíveis em relação aos compostos que aumentam a apóptose. Assim, pretende-se a sua utilização para a criação de tecidos privilegiadamente imunes.

Os antagonistas de DR5 podem ser úteis para o tratamento de doenças inflamatórias, tais como, artrite reumatóide, osteoartrite, psoriase, septicemia e doença inflamatória do intestino.

Além disso, devido à expressão dos linfoblastos de DR5, podem utilizar-se Acms agonistas ou antagonistas de DR5 solúvel para tratar esta forma de cancro. Além disso, o DR5 solúvel ou os Acms de neutralização, podem ser utilizados para tratar várias formas de inflamação crónica e aguda, tais como, artrite reumatóide, osteoartrite, psoriase, septicemia e doença inflamatória do intestino. 66

Modos de Administração 0 agonista ou os antagonistas descritos aqui podem ser administrados in vitro, ex vivo ou ín vive às células que expressam o receptor da presente invenção. Por administração de uma "quantidade efectiva" de um agonista ou de um antagonista da presente invenção, entende-se uma quantidade do composto que é suficiente para aumentar ou inibir uma resposta celular a um ligando da família do FNT e incluindo os polipéptidos. Em particular, por administração de uma "quantidade efectiva" de um agonista ou de antagonistas entende-se uma quantidade efectiva para aumentar ou inibir a apóptose mediada por DR5. Obviamente, quando é desejável que a apóptose seja aumentada, pode-se co-administrar um agonista de acordo com a presente invenção com um ligando da família do FNT. Um especialista na matéria entenderá que as quantidades efectivas de um agonista ou antagonista podem ser determinadas empiricamente e podem ser utilizadas na forma pura ou sob a forma de um sal, um éster ou um pró-fármaco aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 0 agonista ou o antagonista podem ser administrados em composições, em combinação com um ou mais excipientes (isto é, veículos) aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Deve entender-se que, quando administrados a um paciente humano, a utilização da área total dos compostos e das composições da presente invenção, será seguida pelo médico assistente dentro do âmbito da decisão médica. 0 nível da dose efectiva específica, sob o ponto de vista terapêutico, para qualquer paciente em particular, dependerá de factores bem conhecidos na medicina.

Como uma proposta genérica, a quantidade efectiva total do ponto de vista farmacêutico do polipéptído DR5 67 administrado parenterícamente, por dose, estará no intervalo de cerca de 1 pg/kg/día até cerca de 10 mg/kg/dia do peso do corpo do paciente, embora, tal como se fez notar antes, isto esteja sujeito a uma decisão terapêutica. Mais preferencialmente, esta dose é de pelo menos 0,01 mg/kg/dia e, mais preferencialmente, para seres humanos, é que esteja entre cerca de 0,01 e 1 mg/kg/dia para a hormona. Se forem dados continuamente, os agonistas ou os antagonistas de DR5 são normalmente administrados numa dose de cerca de 1 pg/kg/hora até cerca de 50 pg/kg/hora, quer por meio de 1-4 injecções por dia ou por infusões subcutâneas continuas, por exemplo, utilizando uma miní-bomba. Também se pode utilizar a solução do saco intravenoso. A dosagem pode também ser arranjada de uma forma especifica para o paciente para providenciar uma concentração pré-determinada de um agonista ou de um antagonista no sangue, conforme determinado pela técnica de RIA. Assim, a dosagem para um paciente pode ser ajustada de modo a regular a entrada nos niveis de sangue, conforme medido por RIA, por ordem de 50 até 1.000 ng/mL, preferencialmente, 150 até 500 ng/mL.

As composições farmacêuticas que compreendem o anticorpo da presente invenção e o veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, são providenciadas pela presente invenção. Além disso, as composições farmacêuticas que se descrevem compreendem um agonista ou um antagonista (incluindo polinucleótidos e polipéptidos de DR5) e um veículo ou um excipiente aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, que podem ser administrados oralmente, rectalmente, parentericamente, intracisternalmente, intravaginalmente, intraperitonialmente, topicamente (sob a forma de pós, pomadas, gotas ou adesivos transdérmicos), 68 bocalmente ou sob a forma de um aerossol oral ou nasal. É importante notar que por co-adminístração de um agonista e de um ligando da família dos FNT os efeitos colaterais podem ser reduzidos, utilizando doses mais baixas tanto dc ligando como do agonista. Deve entender-se que o agonista pode ser "co-administrado" quer antes, quer depois ou simultaneamente com o ligando da família do FNT, consoante as exigências de uma aplicação terapêutica em particular. Por ''veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico", entende-se uma carga nãc tóxica, sólida, semi-sólída ou líquida, um diluente, um material de encapsulação ou um auxiliar de formulação de qualquer tipo. Num enquadramento específico, "aceitável sob o ponto de vista farmacêutico" significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou do governo do estado ou listado na farmacopeia dos Estados Unidos ou noutra farmacopeia geralmente reconhecida para ser utilizada no caso de animais e, mais particularmente, em seres humanos. Exemplos não limitativos de veículos farmacêuticos apropriados de acordo com este enquadramento, estão indicados em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin e incluem líquidos esterilizados, tais como, água e óleos, incluindo os óleos de petróleo, de animais, de vegetais ou de origem sintética, tal como, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e similares. Prefere-se como veículo a água, quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Podem utilizar-se como veículos líquidos soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glíceral como veículos líquidos, particularmente, para soluções injectáveis. 0 termo "parentérico", tal como se utiliza aqui, refere-se aos modos de administração que incluem a administração intravenosa, intramuscular, íntraperitonial, íntra-esternal, subcutânea e intra-articular e a infusão. 69

As composições farmacêuticas da presente invenção para injecção parentérica podem compreender soluções, dispersões, suspensões ou emulsões aquosas esterilizadas ou não aquosas, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, assim como, pós esterilizados para reconstituir sob a forma de soluções ou dispersões esterilizadas, injectáveis, para reconstituição imediatamente antes da sua utilização.

Para além dos polipéptidos solúveis de DR5, o polipéptido de DR5 contendo a região da transmembrana pode também ser utilizado, quando apropriado, sob a forma solubilizada, incluindo detergentes, tais como, CHAPS ou NP-40, com um tampão.

Análise do Cromossoma

As moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção, são também valiosas para a identificação do cromossoma. A sequência é especificamente alvejada e pode hibridizar com uma localização particular num cromossoma de um ser humano. O mapeamento dos ADNs com cromossomas de acordo com a presente invenção, é uma primeira etapa importante na correlação dessas sequências com genes associados com a doença.

Em certos enquadramentos preferidos a este respeito, o ADNc e/ou os polinucleótidos aqui descritos, são utilizados para clonar o ADN genómico de um gene de DR5. Isto pode ser realizado utilizando uma variedade de técnicas bem conhecidas e bibliotecas que geralmente estão disponíveis comercialmente. Utiliza-se então o ADN genómico para o mapeamento do cromossoma in situ utilizando técnicas conhecidas para este fim. 70

Além disso, podem mapear-se as sequências com cromossomas preparando iniciadores de RCP (preferencialmente, 15-25 pb) a partir do ADNc. Utiliza-se a análise por computador da região 3' não traduzida do gene, para seleccionar rapidamente iniciadores que não distam mais do que um exão no ADN genómico, complicando assim o processo de amplificação. Estes iniciadores são então utilizados para o rastreio por RCP de híbridos de células somáticas contendo cromossomas de indivíduos humanos. A hibridização in situ por fluorescência ("FISH") de um clone de ADNc com um cromossoma em metáfase, pode ser utilizada para providenciar uma localização cromossomática precisa apenas numa etapa. Esta técnica pode ser utilizada com um ADNc tão pequeno como um que tenha 50 ou 60 pb. Para uma revisão desta técnica, ver Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988) .

Uma vez que uma sequência tenha sido mapeada com uma localização cromossomática precisa, a posição física da sequência no cromossoma pode ser correlacionada com os dados do mapa genético. Esses dados encontram-se, por exemplo, em V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponível em linha através da Johns Hopkins University, Welch Medicai Library. A relação entre os genes e as doenças que tinham sido mapeadas na mesma região cromossomática, são então identificadas através da análise de ligação (co-hereditariedade dos genes adjacentes fisicamente).

Em seguida, é necessário determinar as diferenças no ADNc ou na sequência genómica entre indivíduos afectados e não afectados. Se se observa uma mutação em algum ou em todos 71 os indivíduos afectados mas não em nenhum dos indivíduos normais, então é provável que a mutação seja o agente causador da doença.

Tendo descrito a presente invenção de uma forma geral, ela será mais facilmente entendida com referência os exemplos que se seguem, que são dados a título ilustrativo e não pretendem limitá-la.

Exemplo 1

Expressão e Purificação em E. coli A sequência de ADN que codifica a proteína de DR5 madura no clone de ADN depositado (ATCC NO: 97920) é amplificada utilizando iniciadores de oligonucleótidos na RCP, específicos para as sequências de terminal amino da proteína de DR5 e específicas das sequências 3' do vector com o gene. Adicionam-se mais nucleótidos contendo sítios de restrição para facilitar às sequências 5' e 3', respectivamente.

Os iniciadores que se seguem são utilizados para a expressão do domínio extracelular de DR5 em E. coli: o iniciador 5' tem a sequência 5'-CGCCCATGGAGTCT GCTCTGATCAC-3’ (SEQ ID NO: 8) e contém o sítio de Ncol sublinhado; e o iniciador 3' tem a sequência 5'-CGCAAGCTTTTAGCCTGATTC TTTGTGGAC-3' (SEQ ID NO: 9) e contém o sítio HindiII não sublinhado.

Os sítios de restrição são convenientes para a restrição dos sítios da enzima no vector de expressão bacteriana pQE60, que são utilizados para a expressão bacteriana neste exemplo (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). pQE60 codifica a resistência ao antibiótico ampicilina ("Amp") e 72 contém uma origem bacteriana de replicação ("ori"), um promotor indutível IPTG e um sítio de ligação do ribossoma ("SLR"). 0 ADN de DR5 amplificado e o vector pQE60, são ambos digeridos com Ncol e HindiII e os ADNs digeridos são então ligados em conjunto. A inserção do ADN da proteína de DR5 no vector pQE60 referido, coloca a região de codificação da proteína de DR5 a jusante e ligado operacionalmente ao promotor indutível do IPTG do vector e na mesma zona com uma AUG de iniciação apropriadamente posicionada para a tradução da proteína de DR5. A mistura de ligação é transformada nas células de E. coli concorrentes utilizando processos padrão. Esses processos estão descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). A estirpe ml5/rep4 de E. coli contendo múltiplas cópias do plasmido pREP4, que expressa o repressor lac e confere resistência à canamicina ("Kanr"), é utilizado na realização do exemplo ilustrativo aqui descrito. Esta estirpe, que é apenas uma das muitas que são apropriadas para a expressão da proteína de DR5, está disponível comercialmente na Qiagen, supra.

Os transformantes são identificados pela sua capacidade em crescer em placas de LB na presença de ampicilina e canamicina. Isola-se o ADN do plasmido a partir de colónias resistentes e a identidade do ADN clonado é confirmada por análise de restrição, RCP e sequenciação do ADN.

Os clcnes que contêm as estruturas desejadas crescem durante a noite ("0/N") em cultura líquida em meio LB complementado tanto com ampicilina (100 pg/mL) como com canamicina (25 μσ/mL). A cultura O/N é utilizada para inocular uma grande cultura, numa diluição de aproximadamente 73 1.100 até 1:250. As células crescem até a uma densidade óptica a 600 nm ("D0600") entre 0,4 e 0,6. Adiciona-se então o isopropil-B-D-tiogalactopiranósido ("IPTG") até a uma concentração final de 1 mM para traduzir a transcrição dos promotores sensíveis ao repressor lac, por inactivação do repressor lacl. Em seguida faz-se a incubação das células durante mais 3 a 4 horas.

Colhem-se então as células por centrifugação e abrem-se por processos normalizados. Os corpos de inclusão são purificados a partir das células abertas utilizando técnicas de recolha de rotina e solubiliza-se a proteína a partir dos corpos de inclusão em ureia 8 Μ. A solução de ureia 8 M contendo a proteína solubilizada, é passada numa coluna PD-10 em solução salina tamponada com fosfato ("STF"), duas vezes, eliminando-se assim a ureia, promotando o tampão e redobrando a proteína. Purifica-se a proteína por mais uma etapa de cromatografia para eliminar a endotoxina. Depois, filtra-se em meio esterilizado. A preparação da proteína filtrada em meio esterilizado, é armazenada no seio de 2 X STF a uma concentração de 95 μ/mL.

Exemplo 2

Expressão em Células de Mamíferos

Um vector de expressão em mamíferos típico contém o elemento promotor, que medeia a iniciação da transcrição de ARNm, a sequência de codificação da proteína e os sinais necessários para a terminação da transcrição e a poliadenilação do transcripto. Os elementos adicionais incluem melhoradores, sequências de Kozak e sequências de intervenção flanqueadas pelos sítios dadores e receptores para a segmentação de ARNm. Pode-se conseguir uma transcrição 74 altamente eficiente com os promotores precoces e tardios de SV40, as repetições de terminais longos (RPLs), de retrovírus, por exemplo, VSR, VI de HTL, HIVI e o promotor precoce do citomegalovírus (CMV). Contudo, podem utilizar-se sinais celulares (por exemplo, o promotor de actina humana). Os vectores de expressão apropriados para serem utilizados na prática da presente invenção, incluem, por exemplo, vectores, tais como, pSVL e pMSG {Pharmacia, Uppsala, Suécia), pRSVcat (ATCC NO: 37152), pSV2dhfr (ATCC NO: 37146) e pBC12MI (ATCC NO: 67109). As células dos hospedeiros em mamíferos que podem ser utilizadas incluem Hela 293 humana, células H9 e de Jurkat, células NIH3T3 e C127 de rato, Cos 1, Cos 7 e CV1, células QC1-3 de coelho, células L de rato e células de ovário de hamster chinês (OHC).

Alternativamente, o gene de interesse pode ser expresso em linhas de células estáveis, que contêm o gene integrado num cromossoma. A co-transfecção com um marcador seleccionável, tal como, dhfr, gpt, neomicina, higromicina, permite a identificação e o isolamento das células transfectadas. 0 gene transfectado pode também ser amplificado para expressar grandes quantidades da proteína codificada. O di-hidrofolato redutase (DHFR) é um marcador útil para desenvolver as linhas de células que comportam várias centenas ou mesmo vários milhares de cópias do gene de interesse. Outro marcador de selecção útil é a enzima glutarnina sintase (GS) (Murphy et al., Biochem. J. 227:211-279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)). Utilizando estes marcadores, As células de mamífero crescem meio selectivo e seleccionam-se as células com a resistência mais elevada. Estas linhas de células contêm os genes amplificados integrados num cromossoma. As células de ovário de hamster chinês (OHC) são muitas vezes utilizadas para a produção de proteínas.

Os vectores de expressão pCl e pC4 contêm o promotor forte (RTL) do vírus do sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology 5:438-447 (March 1985)), mais um fragmento do melhorador de CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Múltiplos sítios de clonagem, por exemplo, como os sítios de clivagem da enzima de restrição BamHI, Xbal e Asp718, facilitam a clonagem do gene de interesse. Os vectores que têm além disso o intrão 3', a poliadenilação e o sinal de transmissão do gene de pré-pró-insulina do rato.

Clonagem e Expressão em células de OHC 0 vector pC4 é utilizado para a expressão do polipéptido de DR5. O plasmido pC4 é um derivado do plasmido pSV2-dhfr (número de acesso na ATCC 37146) . O plasmido contém o gene DHFR de rato sob controlo do promotor precoce de SV40. As células de ovário de hamster chinês ou outras células que não têm actividade de di-hidrofolato, que são transfectadas com estes plasmidos, podem ser seleccionadas fazendo crescer as células num meio selectivo (MEM alfa menos, Life Technologies), complementado com o agente quimioterapêutico metotrexato (MTX). A amplificação dos genes de DHFR em células resistentes a metotrexato (MTX) tem sido bem documentada (ver, por exemplo, Alt, F. W., Keilems, R. M., Bertino, J. R. , e Schimke, R. T., J. Biol. Chem. 253: 1357- 1370 (1978) ; Hamlin, J. L. e Ma, C. ,, Biochem. et Biophys. Acta 1097: 107-143 (1990); Page, M. J Θ Sydenham, M. A. 1991, Biotechnology 9: 64-68(1991)). As células que crescem em concentrações crescentes de MTX desenvolvem resistência ao fármaco pela sobreprodução da enzima alvo, DHFR, como 76 resultado da amplificação do gene de DHFR. Se um segundo gene está ligado ao gene de DHFR, é normalmente co-amplificado e sobrexpresso. Sabe-se na técnica que esta abordagem pode ser utilizada para desenvolver linhas de células que comportam mais do que 1.000 cópias dos genes amplificados. Em seguida, quando o metotrexato desaparece, obtêm-se linhas de células que contêm o gene amplificado integrado em um ou mais dos cromossomas da célula hospedeira. 0 plasmido pC4 contém, para a expressão do gene de interesse, o promotor forte de repetição terminal longa (RTL) do vírus do sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology 5: 438-447 (March 1985)), mais um fragmento isolado do melhorador do gene precoce imediato de citomegalovírus (CMV) humano (Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985)). A jusante do promotor estão os seguintes únicos sítios de clivagem da enzima de restrição que permitem a integração dos genes: BamHI, Xbal e Asp718. Para além destes sítios de clonagem, o plasmido contém o intrão 3' e o sítio de poliadenilação do gene da pré-pró-insulina de rato. Põem utilizar-se para a expressão outros promotores altamente eficientes, por exemplo, o promotor de β-actina humano, os promotores precoces e tardios de SV40 ou as repetições de terminal longo de outros retrovírus, por exemplo, VIH e VI de HTL. Os sistemas de expressão de genes Tet-Off e Tet-On da Clontech e sistemas similares, podem ser utilizados para expressar o polipéptido de DR5 duma forma regulada em células de mamíferos (Gossen, M., & Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5547-5551 (1992). Para a poliadenilação de ARNm, podem-se utilizar também outros sinais, por exemplo, dos genes da hormona do crescimento humano ou da globina.

As linhas de células estáveis que comportam um gene de interesse integrado nos cromossomas, podem também ser 77 seleccionadas após seleccionável, tal como so utilizar mais do principio, por exemplo, co-transfecçâo com um marcador , gpt, G418 ou higromicina. É vantajo-que um marcador seleccionável no G418 mais metotrexato. com um 0 plasmido pC4 é digerido com a enzima de restrição BamHI e depois é desfosforilado utilizando fosfatos de intestino de bezerro por processos conhecidos na técnica. 0 vector é então isolado a partir de um gel de agarose a 1 %. A sequência de ADN que codifica o polipéptido completo é amplificada utilizando iniciadores de oligonucleótidos para RCP, correspondendo às sequências 5' e 3' da porção desejada do gene. 0 iniciador 5' contendo o sitio de BamHI sublinhado, uma sequência de Kozak e um codão inicial de AUG, tem a seguinte sequência: 5'-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGAAC-3' (SEQ ID NO: 10). O iniciador 3', contendo o sítio Asp718 sublinhado, tem a seguinte sequência: 5'-CGCGGTACCTTAGGACATGGCAGAGTC-3' (SEQ ID NO: 11). O fragmento amplificado é digerido com a endonuclease BamHI e Asp718 e depois é purificado num gel de agarose a 1 %. O fragmento isolado e o vector desfosforilado, são então ligados com ligase de ADN de T4. As células HB 101 ou XL-1 Blue de E. coli são então transformadas e identificam-se as bactérias que contêm o fragmento inserido no plasmido pC4 utilizando, por exemplo, a análise de restrição de enzimas.

As células de ovário de hamster chinês a que falta um gene de DHFR activo, são utilizadas para a transcrição. Faz- 78 se a co-transfecção de 5 pg do plasmido de expressão pC4 com 0,5 pg do plasmido pSV-neo utilizando o processo da lipofectina (Felgner et al., supra). O plasmido pSV2-neo contém um marcador seleccionável dominante, o gene de neo de Tn5, que codifica uma enzima que confere resistência a um grupo de antibióticos incluindo G418. As células são semeadas em meio MEM alfa menos, complementado com 1 mg/ml de G418. Passados 2 dias, as células são tripsinizadas e semeadas em placas de clonagem de hibridoma (Greiner, Alemanha) em meio MEM alfa menos complementado com 10, 25 ou 50 ng/mL de metotrexato mais 1 mg/mL de G418. Passados cerca de 10-14 dias, os clones isolados são tripsinizados e depois semeados em placas de Petri de 6 microtubos ou frascos com de 10 mL, utilizando diferentes concentrações de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 4 00 nM, 800 nM) . Os clones que crescem nas concentrações mais elevadas de metotrexato, são estão transferidos para placas de 6 microtubos contendo concentrações ainda mais elevadas de metotrexato (1 μΜ, 2 μΜ, 5 μΜ, 10 mM, 20 mM) . Repete-se o mesmo processo até se obterem clones que crescem a uma concentração de 100-200 μΜ. Analisa-se a expressão do gene desejado, por exemplo, por EGPA-SDS, análise de mancha de Western e por CLER de fase rex^ersa.

Clonagem e Expressão em células de COS O plasmido de expressão, pDR5-HA, é produzido por clonagem de um ADNc que codifica o domínio extracelular solúvel da proteína de DR5, no vector de expressão pcDNAI/Amp ou pcDNAIII (que podem ser obtidos da Invitrogen, Inc.). O vector de expressão pcDNAI/Amp contém: (1) uma origem de replicação de E. coli efectíva para a propagação em E. coli e noutras células procarióticas; (2) um gene de resistência à ampicilina para a selecção de células procarióticas contendo 79 plasmido; (3) uma origem de replicação de SV40 para a propagação em células eucarióticas; (4) um promotor de CMV, um poliligante, um SV40 e um sinal de poliadenilação arranjado de tal forma, que o ADNc pode ser convenientemente colocado sob o controlo de expressão do promotor de CMV e ligado operacionalmente ao intrão de SV40 e ao sinal de poliadenilação por meio de sítios de restrição no poliligante. Faz-se a clonagem de um fragmento de ADN que codifica o domínio extracelular do polipéptído DR5 e um marcador HA fundido na secção com a sua extremidade 3' na região do poliligante do vector, de modo que a expressão recombinante da proteína é dirigida pelo promotor de CMV. 0 marcador HA corresponde a um epitopo derivado da proteína da hemaglutinina da gripe, descrita por Wilson et ai., Cell 37:767 (1984). A fusão do marcador HA com a proteína alvo permite uma fácil detecção e recuperação da proteína recombinante com um anticorpo que reconhece o epitopo de HA. A estratégia de construção do plasmido é a seguinte. Faz-se a amplificação do ADNc de DR5 do clone depositado, utilizando iniciadores que contêm sítios de restrição convenientes, de forma que foi descrita antes para a produção de vectores para a expressão de DR5 em E. coli. Para facilitar a detecção, a purificação e a caracterização do DR5 expresso, um dos iniciadores contém um marcador de hemaglutinina ("marcador HA"), tal como se descreveu antes.

Os iniciadores apropriados incluem os seguintes que se utilizaram neste exemplo. 0 iniciador 5', contendo o sítio BamHI sublinhado tem a seguinte sequência: 5'-CGCGGATCCGCCATCATGGAACAACGGGGACAGÃAC-3' (SEQ ID MO: 10). O iniciador 3', contendo a sequência de restrição Asp718 sublinhada, tem a seguinte sequência: 80 5'-CGCGGTACCTTAGCCTGATTCTTTTGGAC-3' (SEQ ID NO: 12). O fragmento de ADN e o vector amplificados por RCP, pcDNAI/Amp, são digeridos com BamHI e Asp718 e depois ligados. A mistura de ligação é depois transformada na estirpe SURE de E. coli (disponível na Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) e a cultura transformada é colocada em placas com meio de ampicilina, que são depois incubadas para permitir o crescimento de colónias resistentes à ampicilina. 0 ADN do plasmido é isolado a partir das colónias resistentes e examinado por análise de restrição ou outros meios para rastrear a presença do fragmento que codifica o domínio extracelular do polipéptido DR5.

Para a expressão recombinante de DR5, transfectam-se as células COS com um vector de expressão, tal como se descreveu antes, utilizando DEAE-DEXTRANO, tal como se descreve, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Clowníng: a Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). As células são incubadas em condições para expressão de DR5 por meio do vector. A expressão da proteína de fusão de DR5-H*A é detectada por rádio-marcação e imunoprecipitação, utilizando processos descritos, por exemplo, em Harlow et al., Antíbodies: A Laboratory Manual, 2a Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988) . Com este fim, dois dias após a transfecção, as células são marcadas por incubação num meio contendo SJD-cisteína, durante 8 horas. Recolhem-se as células e o meio e lavam-se as células e faz-se a sua lise com tampão de RIPA contendo detergente: NaCl 150 mM, NP-40 a 1 %, SDS a 0,1 %, NP-40 a 1 %, DOC a 0,5 %, TRIS 50 rnM, a pH 7,5, tam como descrito por Wilson et al., 81 citados antes. As proteínas precipitam no seio do lisado das células e do meio de cultura, utilizando um anticorpo monoclonal especifico de HA. As proteínas precipitadas são então analisadas por meio de EGPA-SDS e são auto-radiografadas. Um produto de expressão com a dimensão esperada, é visto no lisado das células e não é visto nos controlos negativos.

Os conjuntos de iniciadores utilizados para a expressão neste exemplo, é compatível com o pC4 utilizado para a expressão de OHC neste exemplo, pcDNAI/Amp para a expressão de COS neste exemplo e pA2 utilizado para a expressão do baculovírus no exemplo que se segue. Assim, por exemplo, o fragmento que codifica o DR5 completo, amplificado para a expressão de OHC, pode também ser ligado num pcDNAI/Amp para a expressão de COS ou pA2 para a expressão do baculovírus.

Exemplo 3

Clonagem e Expressão do domínio Extracelular Solúvel de DR5 nvan Sistema de Expressão de Baculovírus

Neste exemplo ilustrativo, o vector de vai e vem do plasmido pA2 é utilizado para inserir o ADN clonado que codifica a proteína completa, incluindo a sua sequência de sinal associada naturalmente, num baculovírus, para expressar a proteína de DR5, utilizando processes padrão, tal como os descritos em Summers et al., A Manual of Methods for Baculovírus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin NO: 1555 (1987).

Este vector de expressão contém o promotor forte de poli-hedron do vírus poli-hedrose nuclear de Autograph californica (ACMNPV) seguido dos sítios de restrição convenientes. Para facilitar a selecção do vírus recombinante, o plasmido contém 82 o gene de beta-galactosidase de E. coli sob o controlo de um promotor fraco de Drosophila, na mesma orientação, seguido de sinal de poliadenilação do gene de pcli-hedrina. Os genes inseridos são flanqueados em ambos os lados por sequências virais para a recombinação homóloga mediada pelas células, com um ADN virai de tipo selvagem, para gerar vírus viáveis que expressam o pclinucleótido clonado. Muitos outros vectores de baculovírus podem ser utilizados no lugar de pA2, tais como, pAc373, pVL941 e pAcIMl, como será facilmente compreendido por um especialista na matéria, sendo que essa produção origina sinais localizados apropriadamente para a transcrição, tradução, secreção e similares, tal como, na secção AUG e um péptido de sinal, conforme requerido. Esses vectores estão descritos, por exemplo, em Luckow et al., Virology 170:31-39 (1989). A sequência de ADNc que codifica o domínio extracelular solúvel da proteína de DR5 no clone depositado (ATCC NO: 97920), é amplificada utilizando iniciadores de oligonucleótido de RCP correspondentes às sequências 5' e 3' do gene: 0 iniciador 5' para DR5 tem a sequência 5'-CGCGGATCCGCCATCATGGA ACAACGGGGACAGAAC-3' (SEQ ID NO: 10) , contendo o sítio de restrição de enzima BamHI sublinhado. Inserida num vector de expressão, tal como se descreve a seguir, a extremidade 5' do fragmento amplificado que codifica DR5, origina um péptido de sinal de clivagem eficiente. Um sinal eficiente para a iniciação da tradução nas células eucarióticas conforme descrito por Kozak, M., J. Mol. Biol. 196: 947-950 (1987), está apropriadamente localizado na porção de vector da estrutura. 83 0 iniciador 3' para DR5 tem a sequência 5'-CGCGGTACCTTAGCCT GATTCTTTGTGGAC-3' (SEQ ID NO: 12), contendo a restrição de Asp718 sublinhada seguida de nucleótidos complementares à sequência de nucleótidcs de DR5 na figura 1, seguido de um codão de paragem. 0 fragmento amplificado é isolado a partir de um gel de agarose a 1 %, utilizando um kit disponível comercialmente ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). 0 fragmento é então digerido com BamHI e Asp718 e é novamente purificado em gel de agarose a 1 %. Este fragmento é designado por "Fl". O plasmido é digerido com as enzimas de restrição BamHI e Asp718 e eventualmente pode ser desfosforilado utilizando fosfatase intestinal de bovino, utilizando processes de rotina conhecidos na técnica. O ADN é então isolado do gel de agarose a 1 % utilizando um kit disponível comercialmente ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). O ADN do vector é designado aqui por "VI". 0 fragmento Fl e o plasmido VI desfosforilado, são ligados em conjunto com ligase de ADN de T4. As células HB101 de E. coli ou outros hospedeiros apropriados de E. coli, tais como, XL-1 Blue (Stratagene Cloníng Systems, La Jolla, CA) são transformadas com a mistura de ligação e espalhadas nas placas de cultura. Identificam-se as bactérias que contêm o plasmido com DR5 humano, utilizando o processo de RCP, em que um dos iniciadores que é utilizado para amplificar o gene e o segundo iniciador provém bem de dentro do vector de modo que apenas essas colónias bacterianas que contêm o fragmento do gene de DR5 vão exibir uma amplificação do ADN. A sequência dos fragmentos clonados é confirmada pela sequencíação do ADN. Este plasmido é aqui designado por pBac DR5. 84

Faz-se a co-transfecção de 5 pg do plasmido pBac DR5 com 1,0 pg de um ADN de baculovírus linearizado, disponível comercialmente, ("BaculoGold™ baculovírus DNA", Pharmingen, San Diego, CA.), utilizando o processo da lipofectina descrito por Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 7413-7417 (1987) . Mistura-se 1 pg do ADN do vírus BaculoGold™ e 5 pg do plasmido pBac DR5 num microtubo esterilizado de uma placa de microlitros contendo 50 pL de meio de Grace isento de soro (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) . Depois adiciona-se 10 pL de Lipofectin plus, 90 microlitros de meio de Grace, mistura-se e incuba-se durante 15 minutos à temperatura ambiente. Depois a mistura de transfecção é adicionada, gota a gota, às células de insectos Sf9 (ATCC CRL 1711), semeadas numa placa de cultura de tecidos de 35 mm com 1 mL de meio de Grace sem soro. A placa é recoberta e mistura-se novamente com a solução recentemente adicionada. A placa é então incubada durante 5 horas, a 27 °C. Passadas 5 horas, a solução de transfecção é eliminada da placa e adiciona-se 1 mL de meio de insectos de Grace, complementado com soro bovino fetal a 10 %. Volta a pôr-se a placa num . incubador e a cultura continua a 27 °C, durante 4 dias.

Passados 4 dias, recolhe-se o sobrenadante e realiza-se um ensaio da placa, conforme descrito por Summers e Smith, citados antes. Utiliza-se um gel de agarose com "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) para permitir uma fácil identificação e isolamento dos clones que expressam gal, que produzem placas coradas de azul. (Pode-se encontrar uma descrição detalhada de um "ensaio de placa" deste tipo, no guia dc utilizador para as culturas de células de insectos e baculovirologia distribuído por Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, páginas 9-10). Depois de uma incubação apropriada, as placas coradas de azul são picadas com a ponta 85 de uma micrcpipeta (por exemplo, Eppendorf). 0 agar contendo os vírus recombinantes é então novamente suspenso num tubo de microcentrifugadora contendo 200 pL de meio de Grace e a suspensão contendo o baculovírus recombinante, é utilizada para infectar células Sf9 semeadas em placas de 35 mM. Quatro dias maís tarde, os sobrenadantes dos pratos destas culturas são colhidos e depois são armazenados a 4 °C. O vírus recombinante é designado por V-DR5.

Para verificar a expressão do gene de DR5, faz-se crescer células Sf9 em meio de Grace complementado com SBF a 10 % inactivado pelo calor. As células são infectadas com o baculovírus recombinante V-DR5 com uma multiplicidade de infecção ("MOI") de cerca de 2 (cerca de 1 até cerca de 3) . Seis horas mais tarde, o meio é eliminado e é substituído por meio SF900 II menos metionina e cisteína (disponível na Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Se se desejam proteínas radíomarcadas, 42 horas mais tarde, adiciona-se 5 pCi de S35-metionina e 5 pCi de S35-cisteína (disponíveis na Amersham) . As células são depois incubadas durante 16 horas e depois são colhidas por centrifugação. A proteína no sobrenadante, assim como, as proteínas intracelulares, foram analisadas por EGPA-SDS seguida da autoradiografia (se tiver sido rádio-marcada). A micro-sequenciação da sequência de aminoácidos da terminação amino da proteína purificada pode ser utilizada para determinar a sequência do terminal amino da proteína madura e assim o ponto de clivagem e o comprimento do péptido secretório de sinal.

Exemplo 4

Distribuição no Tecido da Expressão do Gene de DR5 86

Realizou-se a análise de mancha de Northern para examinar a expressão do gene DR5 em tecidos humanos, utilizando os processos descritos, entre outros, por Sambrook et al., citado antes. Marcou-se uma sonda de ADNc contendo toda a sequência de nucleótidos da proteína DR5 (SEQ ID NO: 1) com 32P, utilizando c sistema de marcação de ADN com rediprime™ (Amersham Life Science), de acordo com as instruções do fabricante. Depois da marcação, purificou-se a sonda utilizando uma coluna CHROMA SPIN-100iM (Clontech Laboratories, Inc.), de acordo com o número PT1200-1 do protocolo do fabricante. A sonda marcada, purificada, foi então utilizada para examinar vários tecidos humanos quanto ao ARNm de DR5.

As manchas de Northern em múltiplos tecidos (MNT) contendo vários tecidos humanos (H) ou tecidos do sistema imunitário humano (IM), foram obtidas da Clontech (Paio Alto, CA) e examinadas com sondas marcadas, utilizando a solução de hibridização ExpressHyb™ (Clontech), de acordo com o número PT1190-1 do protocolo do fabricante. No seguimento da hibridização e da lavagem, montaram-se as manchas e expôs-se o filme a -70 °C, durante a noite, revelaram-se os filmes de acordo com processos padrão. Detectou-se a expressão de DR5 no coração, cérebro, placenta, pulmão, fígado, músculo esquelético, rim, pâncreas, baço, timo, próstata, testículos, útero, intestino Delgado, cólon, leucócitos do sangue periférico (LSPs), nódulos linfáticos, medula óssea e fígado fetal.

Também se avaliou a expressão de DR5 por análise de mancha de Northern nas seguintes linhas de células de cancro, HL60 (leucemia promielocítica), célula S3 de Hela, K562 (leucemia mielogénica crónica), MOLT4 (leucemia linfoblás-tica), Raji (iinfoma de Burkitt), SW480 (adenocarcinoma 87 colorectal), A549 (carcinoma do pulmão) e G361 (melanoma) e detectou-se em todas as linhas de células analisadas.

Exemplo 5

Apóptose Induzida por DR5 em Células de Mamíferos A sobre-expressão de Fas/APO-1 e R-l de FNT em células de mamíferos simula a activação do receptor (M. Muzio et al., Cell 85: 817-827 (1996); Μ. P. Boldin et al., Cell 85: 803-815 (1996)). Assim, utilizou-se este sistema para estudar o papel funcional de DR5 na indução de apóptose. Este exemplo demonstra que a sobre-expressão de DR5 induziu a apóptose tanto em células de carcinoma da mama humana MCF7, como em células do carcinoma epitelóide humano (Hela).

Desenho da Experiência

Realizaram-se os ensaios de morte das células praticamente como foi descrito antes (A. M. Chinnaiyan, et al., Cell 81: 505-12 (1995); Μ. P. Boldin, et al., J Biol Chem 270: 7795-8 (1995); F. C. Kischkel, et al., EMBO 14: 5579-5588 (1995); A. M. Chinnaiyan, et al., J Biol Chem 271: 4961-4965 (1996)). Em resumo, fez-se a transfecção de linhas de células clonais do carcinoma da mama humana MCF-7 e de células Hela com vector DR5, DR5h (52-411) ou R-l de FNT, em conjunto com uma estrutura relatora de beta-galactosidase.

As células MCF7 e Hela foram transfectadas utilizando o processo da lipofectamina (GIBCC-BRL), de acordo com as instruções do fabricante. Transfectaram-se 293 células utilizando a precipitação no seio de CaP04. Após vinte e quatro horas da transfecção, fixaram-se as células e coraram-se com X-Gal conforme previamente descrito (A.M. Chinnaiyan, J Biol et al., Cell 81: 505-12 (1995); Μ. P. Boldin, et al.

Chem 270: 7795-8 (1995); F. C. Kischkel, et al., EMBO 14: 5579-5588 (1995)) e examínaram-se microscopicamente. Os dados (média + DP) apresentados na figura 5, representam a percentagem do ciclo, as células apoptóticas como uma função das células totais positivas de beta-galactosidase (n = 3). A sobre-expressão da apóptose induzida por DR5 tanto em MCF7 (figura 5A) como nas células Hela (figura 5B).

As células MCF7 fcram também transfectadas com uma estrutura de expressão de DR5, na presença de z-VAD-fmk (20 pL) (Enzvme Systems Products, Dublin, CA) ou co-transfectadas com um excesso triplicado de CrmA (M. Tewari et al., J Biol Chem 270: 325560 (1995)) ou a estrutura de expressão de FADD-DN ou apenas o vector. Os dados apresentados na figura 5C mostra que a apóptose induzida por DR5 foi atenuada por inibidores de caspase, mas não por FADD dominante negativo.

Tal como se mostra na figura 5D, DR5 não está associado com FADD nem com TRADD ín vivo. Co-transf ectaram-se 293 células com as estruturas de expressão indicadas, utilizando precipitação no seio de fosfato de cálcio. Após a transfecção (às 40 horas), prepararam-se lisados de células e imunoprecipitou-se com gel de afinidade do anticorpo M2 (IBI, Kodak) e detectou-se a presença de FADD ou TRADD marcado com mic (mic-TRADD) por imuno-mancha com anticorpo policlonal para FADD ou anticorpo conjugado com peróxidase de rábano (POR) com mic (BMB) (Baker, S. J. et al., Oncogene 12: 1 (1996); Chinnaiyan, A. M. et al., Science 274: 990 (1996)).

Tal como se descreve na figura 5E, FLICE 2-DN bloqueia a apóptose induzida por DR5. Co-transfectaram-se 293 células com a estrutura de expressão de DR5 ou R de FMTI e um excesso de quatro vezes de CrmA, FLICE-DN, FLICE 2-DN ou apenas um 89 vector, na presença de uma estrutura relatora de beta-galactosidase conforme indicado. Coraram-se as células e examinaram-se 25-30 horas mais tarde.

Resultados A sobre-expressão de DR5 induziu a apóptose tanto em células humanas de carcinoma da mama MCF7 (figura 5A) , como em células humanas de carcinoma epitelóidal (Hela) (figura 5B) . A maior parte das células transfectadas exibiram caracteristicas morfológicas alteradas das células que sofreram apóptose (Earnshaw, W. C., Curr. Biol. 7: 337 (1995)), tornando-se arredondadas, condensadas e destacando-se da placa. A eliminação do domínio de morte aboliu a capacidade de matar. A apóptose induzida por DR5, tal como, por DR4, foi bloqueada pelos inibidores de caspase, CrmA e z-VAD-fmk, mas o FADD negativo dominante não teve efeito (figura 5C). Consistente com isto, DR5 não interagiu com FADD e TRADD in vivo (figura 5D). Uma versão negativa dominante de uma molécula semelhante a FLICE recentemente identificada, FLICE2 (Vincenz, C. et al., J. Biol. Chem. 272: 6578 (1997)), bloqueou eficientemente a apóptose induzida por DR5, enquanto FLICE negativo dominante tinha apenas um efeito parcial no bloqueio. 0 R-l de FNT induziu eficazmente a apóptose (figura 5E). Consideradas em conjunto, as evidências sugerem que DR5 envolve um programa apoptótico, que envolve a activação de FLICE2 e das caspases a jusante, mas é independente de FADD.

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O Domínio Extracelular de DR5 Liga o Ligando-LXURT Citotóxico e Bloqueia a Apóptose Induzida por LIART 90

Tal como se discutiu antes, LIART/Apo2L é um ligando citotóxico que pertence à família dos ligandos do factcr de necrose do tumor (FNT) e induz a morte rápida das células de muitas linhas de células transformadas, mas não de tecidos normais, apesar do seu receptor conter um domínio de morte, DR4, ser expresso em ambos os tipos de células. Este exemplo mostra que o receptor presente, DR5, também se liga a LIART.

Dada a semelhança dos domínios de ligação do ligando extracelular, ricos em cisteína de DR5 e DR4, os requerentes teorizaram que DR5 se ligaria a LIART. Para confirmar isto, os domínios de ligação dos ligandos extracelulares, solúveis, de DR5, foram expressos como fusões com a porção Fc da imunoglobulina humana (IgG).

Tal como se mostra na figura 6A, DRS-Fc liga-se especialmente a LIART, mas não ao ligando citotóxico FNT-a com ele relacionado. Nesta experiência, os domínios extracelulares de Fc, DR5, DR4, TRID ou R de FNT1 e os correspondentes ligandos foram preparados e realizaram-se os ensaios de ligação, conforme descrito em Pan et al., Science 276: 111 (1997) . As respectivas fusões com Fc foram precipitadas com G-sefarose e proteína e co-precipitaram ligandos solúveis que foram detectados por imuno-mancha com anti-Flag (Babco) ou anti-mic-POR (BMB). O painel do fundo da figura 6 mostra a entrada de fusões de Fc presentes nos ensaios de ligação.

Adicionalmente, DR5-Fc bloqueou a capacidade de LIART para induzir a apóptose (figura 6B) . As células MCF7 foram tratadas com LIART solúvel (200 ng/mL) na presença de quantidades iguais das fusões de Fc ou de Fc isolada. Seis horas mais tarde, fixaram-se as células examinadas conforme descrito em Pan et al., Id. Os dados (média + DP) mostrados 91 na figura 6B, são a percentagem de núcleos apoptóticos entre os núcleos totais contados (n = 4).

Finalmente, DR5-Fc não teve efeito na apóptcse, a morte das células induzidas por FNT-α, nas condições em que R de FNTl-Fc aboliu completamente a morte de FNT-α (figura 6C). As células de MCF7 foram tratadas com FNT-a (40 ng/mL; Genentech, Inc.) na presença de quantidades iguais de fusões de Fc ou de Fc isolado. Os núcleos foram corados e examinados 11-15 horas mais tarde. A nova identificação de DR5 como um receptor para LIART adiciona mais complexidade à biologia da transduçâo dc sinal iniciada por LIART.

Estará claro que a presente invenção pode ser praticada de formas diferentes daquela que foi particularmente descrita na descrição anterior e nos exemplos. 92

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Ni, Jian

Gentz, Reiner Yu, Guo-Líang Su, Jeffrey Rcsen, Craíg A. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Receptor 5 Contendo o Domínio de Morte (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 12 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Human Genome Sciences, Inc. (B) RUA: 9410 Key West Avenue (C) CIDADE: Rockville (D) ESTADO: MD (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 20850 FORMA LIGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Floppy disk (B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS· -DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 DADOS DO PRESENTE PEDIDO DE PATENTE DE INVENÇÃO: (A) NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE DE INVENÇÃO: US (B) DATA DE REGISTO: (C) CLASSIFICAÇÃO: 93 (vii) DADOS DE PEDIDOS DE APLICAÇÃO ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE DE INVENÇÃO US 60/054.021 (B) DATA DE REGISTO: 29 de Julho de 1997 (vii) DADOS DE PEDIDOS DE APLICAÇÃO ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE DE INVENÇÃO US 60/040.846 (B) DATA DE REGISTO: 17 de Março de 1997 (viii) ADVOGADO/AGENTE DE INFORMAÇÃO: (A) NOME: Hoover, Kenley (B) NÚMERO DE REGISTO: 40.302 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE ETIQUETA: PF366 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 3013098504 (B) TELEFAX: 3013098439 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1600 pares de bases (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) ESTRUTURA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: síg_péptido (B) LOCALIZAÇÃO 130..283 CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 284..1.362 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 1: CACGCGTCCG CGGGCGCGGC CGGAGAACCC CGCAATC ΓΤΤ C-CGCCCACAA AATACACCGA 60 CGA rcccc GA TCTACTTTAA GGGCTGAAAC CC/aCGGGCCT GAGA oACTAT AAGAGCGTTC 120 CCTACCGCC ATG GfiA CAA CGG GGA CAG AAC GCC CCG GCC GCT TCG CGG 168 Met Glu Gin Arg Gli Gin Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gli -51 -50 - 45 -40 GCC CGG AAA AGG CAC GGC CCA GGA CCC AGG GAG GCG CGG GGA GCC AGG 216 Ala Arg Lis A.rg HiS Gli Pro Gli Pro Arg Glu Ala Arg Gli Ala Arg -35 -30 -25 CCT GGG CCC CGG GTC CCC AAC- ACC CTT GTG CTC GTT GTC GCC GCG GTC 264 Pro Gli Pro Arg Vai Pro Lis Tre Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val -20 -15 -10 CTG CTG TTG GTC TCA GCT GAG TCT GCT CTG ATC ACC CAA CAA GAC CTA 312 Leu Leu Leu Vai Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Tre C-ln Gin Asp Leu -5 1 5 10 GCT CCC CAG CAG AGA GCG GCC CCA CAA CAA AAG AGG TCC AGC CCC TCA 360 Ala Pro Gin Gin Arg Ala Alâ PIO Gin Gin Lis Arg Ser Ser Pro Ser 15 20 25 GAG GGA TTG TGT CCA CCT GGA CAC CAT ATC TCA GAA GAC GGT AGA GAT 408 Glu Gli Leu Cis Pro Pro Gli Eis His Ile Ser Glu Asp Gli Arg Asp 30 35 40 TGC ATC TCC TGC AAA TAT GGA CAG GAC TAT AGC ACT CAC TGG AAT GAC 456 CÍS Ile Ser Cis Lis Tir Gli Gin Asp Tir Ser Tre His Tru Asn Asp 45 50 55 CTC CTT TTC TGC TTG CGC TGC ACC AGG TGT GAT TCA GGT GAA GTG GAG 5C4 Leu Leu Fen Cis Leu Arg Cis Tre Arg Cis Asp Ser Gli Glu Val Glu 60 65 70 CTA AGT CCC TGC ACC ACG ACC AGA AAC ACA GTG TGT CAG TGC GAA GAA 552 Leu Ser Pro Cis Tre Tre Tre Arg Asn Tre Val Cis Glr. Cis Glu Glu 75 80 85 90 GGC ACC TTC CGG GAA GAA GAT TCT CCT GAG ATG TGC CGG AAG TGC CGC 600 Glx Tre Fen Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cis Arg Lis cis Arg 95 100 105 ACA GGb TGT CCC AGA GGG ATG GTC AAG GTC GGT GAT TGT ACA CCC TGG 648 Tre Gli Cis Pro Arg Gli Met Vai Lis Val Gli Asp Cis Tre Pro Trp 110 115 120 AGT GAC ATC GAA TGT GTC CAC AAA GAA TCA GGC ATC ATC ATA GuA. GTC 696 Ser Asp lie GlU Cis vai HiS Lis Glu Ser Gli Ile Ile Ile Gli Val 125 130 135 ACA GTT GCA GCC C-TA GTC TTG ATT GTG GCT GTG TTT GTT TGC AAG TCT 744 Tre Val Ala Ala Vdl Vdl Leu Ile Val Ala Val Fen Val Cis Lis Ser 140 145 150 TTA CTG TGG AAG AAA GTC /''«Jltp CCT TAC CTG AAA GGC ATC TGC TCA 0:GT 792 Leu Leu Irp Lis Lís Vai Leu Pro Ti - Leu Lis Gli Ile Cis Ser C-li 155 160 135 170 GGT GGT GGG GAC CCT GA3 CGT GTG GAC AGA AGC TCA CAA CGA CCT GGG 840 Gli Gli Gli Asp Pro Glu Arg val Asp Arg Ser Ser Gl n Arg Pro Gli 175 180 185 GCT GAG GAC AAT GTC CTC AAT GAG ATC GTG AGT ATC TTG CAG CCC ACC 888 Ala Glu Asp Asn Vai Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gin Pro Tre 190 195 200 CAG GTC CCT GAG CAG GAA ATG GAA CTC CAG GAG CCA GCA GAG CCA ACA 936 Gin Vdl Pro Glu Gin Glu Met Glu Val Gin Glu Pro Ala Glu Pro Tre 205 210 215 GGT GTC AAC ATG TTG TCC CCC GGG GAG TCA GAG CAT CTG CTG GAA CCC- 584 Gli Vax Asn Met Leu Ser Pro Gli Glu Ser Glu Hr s Leu Leu Glu Pro 220 230 GCA GAA GCT GAA AGG TCT CAG AGG AGG AGG CTG CTG GTT CCA GCA AAT i032 95 1080 1080 Ala Glu Ala Glu Arg Ser Gin Arg Arg Arg Leu Leu Vai Pro Ala Asn 235 240 245 250 GAA GGT GAT ccc ACT GAG ACT CTG AGA CAG TGC TTC GAT GAC TTT GCA Glu Gli Asp Pro Tre GlU Tre Leu Arg Gin Cis Fen Asp Asp Fen Ala 255 260 265 GAC TTG GTG CCC TTT GAC TCC TGG GAG CCG CTC ATG AGG AAG TTG GGC Asp Leu Vai Pro Fen Asp Ser Trp Glu Prc Leu Met Arg Lis Leu Gli 270 275 280 CXC ATG GAC AAT GAG ATA MG GTG GCT AAA GCT GAG GCA G^G GGC CAC Leu Met Asp Asn Glu Ile Lis Vai Ala Lis Ala Glu Ala Ala Gli His 285 2S0 295 AGG GAC âCC TTG TAC ACG ATG CTG ATA AAG TGG GTC AAC AAA ACC GGG Arg Asp Tre Leu Tir Tre Met Leu Ile Lis Trp Vai Asn Lis Tre Gli 300 305 310 CGA GAT GCC GTC CAC ACC CTG CTG GAT GCC TTG GAG ACG CTG GGA Arg Asp Ala Ser Vai His Tre Leu Leu Asp Ala Leu Glu Tre Leu Gli 315 320 325 330 GAG AGA CTT GCC AAG CAG AAG ATT GAG GAC CAC TTG TTG AGC TCT GGA Glu Arg Leu Ala Lis Gin Lis Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gli 335 340 345 AAG TTC ATG TAT CTA GAA GGT AAT C-CA GAC TCT GCC ATG TCC Lis Fen Met Tir Leu Glu G1 i Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 350 355 360 1128 1176 1224 1272 1320 1362 TAÃGTGTGAT TCTCTTCAGG AAGTGAGACC TTCCCTGGTT TACCTTTTTT CTGGAAAAAG 1422 C C cAACIGGA CTCCAGTCAG TAGGAAAGTG CCACAATTGT CAGAI GACCuí GTACTGGAAG 1482 AAACTCTCCC ATCCAACATC ACCCAGTGGA TGGAACATCC TGTAACTTTT CACTGCACT? 1542 GGCAT.ATTT TTATAAGCTG AAT G T GAT AA TAAGGACACT ATGGAAAAAA AAAAAAAA 1600 INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 1: (i) (íí) (xi) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 411 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: proteína DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 2:

Met -51 Glu -50 Gin Arg Arg His Gli Pro -35 Arg Vai Pro Lr s Vai Ser Al s. Glu 1 Glr. Arg 15 A± d Ala Cis 30 Pro Pro Gli

Gli Gin Asn -45 Ala Gli Pro Arg Glu -30 Tre -15 Leu Vai Leu Ser Ala Leu Ile 5 Pro Gin Gin 20 Lis His riX S Ile Ser

Pro Ala Ala Ser -40 Ala Arg Gli Ala -25 vai Vai -10 Ala Ala Tre Gin Gin Asp Arg Ser Ser Pro 25 Glu Asp bl 1 40 Arg

Gli Ala Arg Lis Arg Pro Gli Pro -20 Vai Leu Leu Leu -5 Leu 10 Ala Pro Gin Ser Glu Gli Leu Asp Cís Ile Ser 45 96

Cis Lis Tir Gli Gin Asp Tir Ser Tre His Trp Asn Asp Leu Leu Fen 50 55 60 Cis Leu Arg Cis Tre Arg Cis Asp Ser Gli Glu Val C-lu Leu Ser Pro 65 70 75 Cis Tre Tre Tre Arg Asn Tre Vai Cis Gin Cis Giu Glu Gli Tre Fen 80 85 90 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met uis Arg Lis Cis Arg Tre Gli Cis 95 100 105 Pro Arg Gli Met vai Lis Vai Gli Asp Cis Tre Pro Trp Ser Asp Ile 110 115 120 125 31u Cis Vai His Lis Glu Ser Gli Ile I] e Ile Gli Val Tre Val Ala 130 135 140 Ala Vai Vai Leu Ile Vai Ala Vai Fen Vai Cis Lis Ser Leu Leu Trp 145 150 155 Lis Lis Vai Leu Pro Tír Leu Lis Gli Ile Cis Ser Gli Gli Gli Gli 160 165 170 Asp Pro Glu Arg Vai Asp Arg Ser Ser Gin Arg Pro Gli Ala Glu Ap-P 175 180 185 Asn Vai Leu Asn G1 u lie Vai Ser lie Leu Gin Pro Tre Gin Val Pro 190 195 200 205 Glu Gin Glu Met Glu Vai Gin Glu Pro Ida Glu Pro Tre Gli Val Asn 210 215 220 Met Leu Ser Pro Gli Glu Ser Glu His Leu Leu Giu Pro Ala Glu Ala 225 230 235 Glu Arg Ser Gin Arg Arg Arg Leu Leu Vai Pro Ala Asn Glu Gli Asp 240 245 250 Pro Tre Glu Tre Leu Arg Gin Cis Fen Asp Asp Fen Ala As D Leu Val 255 260 265 Pro Fen Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lis Leu Gli Leu Met Asp 270 275 280 285 Asn Glu Ile Lis Vai Ala Lis Aid Glu Ala Ala Gli H i s Arg Asp Tre 290 295 300 Leu Tír Tre Met Leu Ile Lis Trp Vai Asn Lis Tre Gli Arg Asp Ala 305 310 315 Ser Vai ais Tre Leu Leu Asp Ala Leu Glu Tre Leu Gli Glu Arq Leu 320 325 330 Ala Lis Gin Lis Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gli Lis Fen Met 335 340 345 Tlr Leu. Glu Gli Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 350 355 360 (2) INFORMAÇÃO ir ARi\ SEQ ID N°. 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 455 aminoácidos (B) TIPO: aninoácído (C) ESTRUTURA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 97 (ii) TIPO DE MOLÉCULA : proteína (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° . 3: Meu Gli Leu I? Tre Vai Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Vai Leu Leu 1 5 10 15 C-lu Leu Leu Vai Gli Ile Tir Pro Ser Gli Vai Ile Gli Leu Vai Pro 20 25 30 His Leu Gli Asp Arg Glu Lis Arg Asp Ser Vai Cis Pro Gin Gli Lis 35 40 45 Tir Ile His Pro Gin Asn Asn Ser Ile Cis Cis Tre Lis Cis His Lis 50 55 60 Gii Tre Tir Leu Tii" Asn Asp Cis Pro Gli Pro Gli Gin Asp Tre Asp 65 70 75 80 Cis Arg Glu Cis Glu Ser Gli Ser Fen Tre AI a Ser Glu Asn His Leu 85 90 95 Arg His Cis Leu Ser Cis Ser Lis Cis Arg Lis Glu Met Gli Gin Vai 100 105 110 Glu Ile Ser Ser Cis Tre Vai Asp Arg Asp Tre Vai Cis Gli Cis Arg 115 120 125 Lis Asn Gin Tir Arg His Tir Trp Ser Glu Asn Leu Fen Gin Cis Fen 130 135 140 Asn Cis Ser Leu Cis Leu Asn Gli Tre Vai His Leu Ser Cis Gin Glu 145 150 155 160 Lis Gin Asn Tre Vai Cis T ne Cis His Ala 31 i Fen Fen Leu Arg Glu 165 170 175 Asn Glu Cis Vai Ser Cis Ser Asn Cis LÍS Lis Ser Leu Glu Cis "re 180 185 190 Lis Leu Cis Leu Pro G1 n Ile Glu Asn Vai Lis Gli Tre Glu Asp Ser 195 200 205 Gli Tre Tre Vai Leu Leu Pro Leu Vai Ile Fen Fen Gli Leu Cis Leu 210 215 220 Leu Ser Leu Leu Fen lie Gli Leu Met Tir Arg Tir Gin Arg Trp Lis 225 230 235 240 Ser Lis Leu Tir Ser Ile Vai Cis G1 i Lis Ser Tre Pro Glu Lis Glu 245 250 255 Gli Glu Leu Glu Gli Tre Tre Tre Lis Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser 260 265 270 Fen Ser Pro Tre Pro Gli Fen Tre Pro Tre Leu Gli Fen Ser Pro Vai 275 280 285 Pro Ser Ser Tre Fen Tre Ser Ser Ser Tre Tir Tre Pro Gli Asp Cis 2 90 295 300 Pro Asn Fen Ala Ala Pro Arg Arg Glu Vai Ala Pro Pro Viu Gin Gli 305 310 315 320 Ala Asp Pro Ile Leu Ala Tre Alâ Leu Alâ Ser Asp Pro lie Pro Asn 325 330 335 Pro Leu Gin Lis Trp Xs 1U. Asp Ser Ala His T,í s Pro Gin Ser Leu Asp 340 345 350 Tre Asp Asp Pro Ala Tre Leu Tir Ala Vâl Vâl Glu Asn Vai Pro Pro 355 360 365 Leu Arg Trp Lis Glu Fen Vai Arg Arg Leu Gli Leu Ser Asp His Glu 370 λ 7 5 380 Ile Asp Arg Leu Glu Leu Gin Asn Gli Arg Cis Leu Arg Glu Ala Gin 385 390 395 400 98

Tir Ser Met Leu Ala Tre Trp Arg Arg Arg Tre Pro Arg Arg ,, oiu Ala 405 410 415 Tre Leu Glu Leu Leu Gli Arg Vai Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gli 420 425 430 Cis Leu Glu Asp Ile Glu Giu Ala Leu Cis Gli Pro Ala Ala Leu Pro 435 440 445 Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arc 450 455 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 4: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (Ã) COMPRIMENTO >: 335 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 4:

Met 1 Leu Gli Ile Arg Leu Ser Ser 20 Lis Gli Leu 35 Glu Leu Glu 50 Gli Leu Pro 65 Gr i Glu Arg Asp Cis Vai Pro Fen Ser Ser Lis 100 Leu Glu Vai 115 Glu Cis Lis 130 Pro Asn Pro 145 Cis Tre Lis Ser Asm Tre Lis Leu Cis Leu Leu 185 Lis Glu Vai 135 Gin

Trp 5 Tre Leu Leu Lis Ser Vai Asn Leu Arg Li s Tre 40 His His Asp 55 Gli Lis Ala 7 0 Arg Asp Cis 85 Gin Glu Gli Cis Arg Arg Cis Ile Asn Cis Tre 120 Fen Fen Cis 135 Asn Cis Glu 150 His Gli Cis 165 Lis Glu Glu Leu Leu Pro Ile Lis Tre Cis Arg 200

Pro Leu 10 Vai Leu Ala 25 Gin Vai Tre Vai Tre Tre Vai Gin Fen Cis His 60 Cis Tre Vai 75 Asn Lis Glu 90 Tir Tre Arg 105 Leu Cis Asp Arg Tre Gin Asn Ser Tre vai Cis 140 Ile Ile Lis 155 Glu Gli Ser 170 Arg Ser Pro 190 Leu Ile Vai Lis His Arg Lis

Tre Ser Vai 15 Ala Asp Ile 30 Asn Ser Glu 45 Tre Gin Asn Lis Pro Cis Pro Gli Asp Glu Pro 80 Asp Lis AI d 35 His Glu Gli 110 His Gli Tre 125 Lis Cis Arg Glu Hi s Cis Asp C1 s Tre Leu Tre 160 Asn Leu G-ii 175 Trp Trp Vai 195 Lis Arg Glu 205 Asn Gin Gli 99

Ser His Glu Ser Pro Tre Leu Asn Pro Glu Tre Vai Ala Ile Asn Leu 210 215 220 Ser Asp Vai Asp Leu Ser Lis Tir Ile Tre Tre Ile Ala Gli Vai Met 225 230 235 240 Tre Leu Ser Gin Vai Lis Gli Fen Vai Arg Lis A.sn Gli Vai Asn Glu 245 250 255 Ala Lis Ile Asp Glu He Lis Asn Asp Asn Vai Gin Asp Tre Ala Glu 260 265 270 Gin Lis Vai Gin Leu Leu Arg Asn Trp His Gin Leu His Gli Lis Lis 275 280 285 Glu Ala Tir Asp Tre Leu Ile Lis Asp Leu Lis Lis Ala Asn Leu Cis 290 295 300 Tre Leu Ais Glu Lis Ile Gin Tre Ile Ile Leu Lis Asp Ile Tre Ser 305 310 315 320 Asp Ser Glu Asn Ser Asn Fen Arg Asn Glu Ile Gin Ser Leu Vai 325 330 335 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 417 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUTURA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (i i) TIPO DE MOLÉCULA : proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID ! 4o. 5: Met Glu Gin Arg Pro Arg Gli Cis Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu 1 10 15 Leu Vai Leu Leu Gli Ala Arg Ala Gin Gli Gli Tre Arg Ser Pro Arg 20 25 30 Cis Asp Cis Ala Gli Asp Fen His Lis Lis Ile Gli Leu Fen Cis Cis 35 40 45 Arg Gli Cis Pro Ala Gli His Tir Leu Lis Ala Pro Cis Tre Glu Pro 50 55 60 Cis Gli Asn Ser Tre Cis Leu Vai Cis Pro Gin Asp Tre Fen Leu Ala 65 70 75 80 Trp Glu Asn His His Asn Ser Glu Cl3 Ala Arg Cis Gin Ala Cis Asp 85 90 95 Glu Gin /Li-cL Ser Gin Vai Ala Leu Glu Asn Cis Ser Ala Val Aila Asp 100 105 110 Tre Arg Cis Gli ulS Lis Pro Gli Trp Fen Val Glu Cis Gin Val Ser 100 120 125 Gin Cis Vai Ser Ser Ser Pro Fen Tir Cis Gin Pro Cis Leu Asp 130 135 140 Gli Ala Leu His Arg His Tre Arg Leu Leu Cis Ser Arg Arg Asp 145 150 155 Asp Cis Gli Tre Cis Leu Pro Gli Fen Tir Glu His Gli Asp Gli 165 170 175 Vai Ser Cis Pro Tre Ser Tre Leu Gli Ser Cis Pro du Arg Cis 180 195 190 Ala Vai Cis Gli Trp Arg Gin Met Fen Trp Vai Gin Vai Leu Leu 195 200 205 Gli Leu Vai Vai Pro Leu Leu Leu Gli Ala Tre Leu Tre Tir Tre 210 215 220 Arg His Cis Trp Pro His Lis Pro Leu Vai Tre Ala Asp Glu Ala 225 230 235 Met Glu Ala Leu Tre Pro Pro Pro Ala Tre His Leu Ser Prc Leu 245 250 255 Ser Ala His Tre Leu Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser Glu Lis Ile 260 265 270 Tre Vai Gin Leu Vcl i. Gli Asn Ser Trp Tre Pro Gli Tir Pro Glu 275 280 285 Gin Glu Ala Leu Cis Pro Gin Vai Tre Trp Ser Trp Asp Gin Leu 290 295 300 Ser Arg Ala Leu Gd. jl Pro a! a Ala Ala Prc Tre Leu Ser Pro Glu 305 310 315 Fro Ala Gli Ser Pro Ala Met Met Leu Gin Pro Gli Pro Gin Leu 325 330 335 Asp Vai Met Asp Ala Vai Pro Ala Arg Arg Trp Lis Glu Fen Vai 340 345 350 Tre Leu Gli Leu Arg Glu A18 Glu ile Glu Ala Vai elu Vai Glu 355 360 365 Gli Arg Fen Arg Asp Gin Gin Tir Glu F.et Leu Lis Arg Trp Arg 370 375 380 Gin Gin Pro Ala Gli Leu Gli Ala Vai Tir Ala Ala Leu Glu Arg 385 390 395 Gli Leu Asp Gli Cis Vai Glu Asp Leu Arg Ser Arg Leu Gin Arg

Cis Tre 1 óC Cis Ala Ala Tir Gli 240 Asp Cis Tre Pro Ser 320 Tir Arg Ile Gin Met 400 Gll (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 507 pares de bases 101 (Β) (C) (D) TIPO: ácido nucleíco ESTRUTURA: simples TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 6:

AATTCGGCA AGCTCTTCA GAAGTCAGA C G C GCCCAACTG GACTCCAGT AGTAGGAAA G C G AGAAACTCT CCATCCAAC TCACCCAGT C A G ACTTGGCAI ATTTTTGTN AGCTGAATG T A T ATCATTCCG TTGTGCGTA TTTGAGATT Cr C T CACTTTTTT ATCCCTAAT TNAAATGCN N G T GTNAAGGNT CCCNTNTGA ACAGTAGNT N C G NATNANGAA CTTTTTTTG GTGGGGGGG C G T TTTGGNGTN CAATNGNGG ANNNTGG G A CTTCCCTGG TTACCTTTT TCTGGAAAA 60 T 7 A TGCCACAAT GTCACATGA CGGTACTGG 12 T C A 0 GNATGGGAA ACTGATGAA TTTTCACTG 18 C C C 0 GATAATAAG GCACTGATG AAATGTCTG 24 <3 G G 0 GNGTTTGGG ATGTNCATT TGTTTGACA 30 Q G G 0 NATTTGATT TGANTTGGG GINAACATT 36 G G G 0 GTNCCCGAC TANÃATNGN GAANANGAT 42 T N G 0 NNCGGGGCA TNKAANGNN NCTCCCCAG 48 G G G 0 50 1 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 226 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (Íi) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 7: 102 ITTTTTITG AGATGGATC TACAATGTA CCCAAATAA TAAATAAAG ATT?ACATT 60 T T G A C A G GAT AAAAA GTGCIGIGA AACAATGAC TCCCAAACC AATCTCAAA TACGCACAA 12 A A A A G A 0 CGGAATGA1 CAGACAITT CÃTAGGTCC TATTATCAC TTCAGCTTA AAAATAATG 18 C C T A 1 c 0 CAAGTGCAG T GAAAAGITA C AGGAIGTTC ATCCAC.TGG G TGGATT 22 6 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 8: CGCCCATGGA GTCTGCTCTG ATCAC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID M°. 9: 103

CGCAAGCTTT TAGCCTGAT7 CTTTGTGGAC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 10

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA: simples (D) TOPOLOGIA: linear iii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 10: CGCGGATCCG CCATCATGGA ACAACGGGGA CAGAAC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 11:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA: simples (D) TOPOLOGIA: linear Ui) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 11: CGCGGTACCT TAGGACATGG CAGAGTC 2) INFORMAÇÃO PARA Ã SEQ ID 11°. 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 piares de bases TIPO: ácido rrucleico ESTRUTURA: simples TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°

CGCG (Β) (C) (D)

GTACCT TAGGCTGATT CTTTGTGGAC SEQ ID N°. 2 da Patente de Invenção Europeia EP0870827 (Referência D6) vs.

Figura 1 (SEQ ID N° . 2) da Patente de Invenção Norte-Americana US 60/041.230 (documento de prioridade da Referência D6) 46 96 1 136 32 181 77 226 122 211 167 316 212 361 257 406 302

MEQRGQNAPAA.SGARKRHGPGPREARGARPGPRVPKTLVLWAAV

LLLVSAESALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISED

#### GRDCISCKYGQDYSTQWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNT --------------HASDDLLFCLRCTRCDSGEVE1SPCTTTRNT

vcqceegtfreedspemcrkcrtgcprgmvkvgdctpwsdiecvh VCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVH

KE3GIIIGVTVAAVVLIVAVFVCKSLLWKKVLPYLKGICSGGGGD KESGIIIGVTVAAVVLIVAVFVCKSLLWKKVLPYLKGICSGGGCO

PERVDRSSQRPGAEDNVLNEIVSILQPTQVPEQEMEVQEPAEPTG PERVDRSSQRPGAEDNVLNEIVSILQPTQVPEQEMEVQEPAEPTG

VNMLSPGESEHLLEPAEAERSQRRRLLVPANEGDPTETLRQCFDD VNMLSPGESEHLLEPAEAERSQRRRLLVPANEGDPTETLRQCFDD # FADLVPFDSWEPLMRKLGLMDNETKVAKAEAAGHRDTLYTMLIKW FADLVPFDSWEPLMRKLGLMDNEIEVAXAEAAGHRDTL-YTMLIKW

VNKTGRDASVHTLLDALETLGERLAKQKIEDHLLSSGKFMYLF.GN VNKTGRDASVHTLLDALETLGERLAKQKIEDHLLSSGKFMYLEGN ADSAMS ADSAMS

Do SEQ ID: 2 D6 prioridade Fig. . 1 (SEQ ID: 2} D6 SEQ ID: 2 D6 prioridade Fig. .1 (SEQ ID: 2) D6 SEQ ID: 2 D6 prioridade Fig. . 1 (SEQ ID: 2) D6 SEQ ID: 2 D6 prioridade Fig. . 1 (SEQ ID: 2) D 6 SEQ ID: 2 D6 prioridade Fig. , 1 {SI iQ ID: 2) D6 SEQ ID: 2 D6 prioridade Fig, , 1 (s: EQ ID: 2) D6 SEQ ID: 2 D6 prioridade Fig. .1 (SEQ ID: 2) D6 SEQ ID: 2 D6 prioridade Fig. 1 (SEQ ID: 2) D6 SEQ ID: 2 D6 prioridade Fiq. 1 (SEQ ID: 2) D6 SEQ ID: 2 D6 oriorídade Fio. 1 1 íSEQ ID: 2) # Variação da sequência SEQ ID N°. 4 da Patente de Invenção Europeia EP0870827 (Referência D6) vs.

Figura 1 (SEQ ID N°. 2) da Patente de Invenção Norte-Americana US 60/041.230 (documento de prioridade da Referência D6) 1 1 DLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNT HASDDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNT D6 SEQ ID: 4 D6 prioridade (SEQ ID: 2) Fig.l 28 32 VCQCESGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVH VCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVH D6 SEQ ID: 4 D6 prioridade (SEQ ID: 2} Fig. 1 73 77 KESGIIIGVTVAAWLIVAVFVCKSLLWKKVLPYLKGICSGGGGD KESGIIIGVTV7UWVLIVAVFVCKSLLWKKVLPYLKGICSGGGGD D6 SEQ ID: 4 D6 prioridade (SEQ ID: 2) Fig.l 118 122 PERVDRSSQRPGAEDNVLNEIVSILQPTQVPEQEMEVQEPAEPTG PERVDRSSQRPGAEDNVLNEIVSILQPTQVPEQEMEVQEPAEPTG D6 SEQ ID: 4 D6 prioridade (SEQ ID: 2} Fig. 1 163 167 VNMLSPGESEHLLEPAEAERSQRRRLLVPANEGDPTETLRQCFDD VNMLSPGESEHLLEPAEAERSQRRRLLVPANEGDPTETLRQCFDD D6 SEQ ID: 4 D6 prioridade (SEQ ID: 2) Fig. 1 208 212 # FADLVPFDSWEPLMRKLGLMDNEIKVAKAEAAGHRDTLYTMLIKW FADLVPFDSWEPLMRKLGLMDNEIEVAKAEAAGHRDTLYTMLIKW D6 SEQ ID: 4 D6 prioridade (SEQ ID: 2) Fig. 1 253 257 VNKTGRDASVHTLLDALETLGERLAKQKIEDHLLS3GXFMYLEGN VNKTGRDASVHTLLDALETLGERLAKQKIEDHLLSSGKFMYLEGN D6 SEQ ID: 4 D6 prioridade (SEQ ID: 2) Fig.l 298 302 ADSAMS ADSAMS D6 SEQ ID: 4 D6 prioridade (SEQ ID: 2) Fig.l # Variação da sequência

Lisboa 27 de Março de 2007

Claims (12)

1. REINVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo facto de compreender um polinucleótido com uma sequência de nucleótidcs seleccionada no grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que compreende os aminoácidos -51 a 360 na SEQ ID N°. 2; (b) uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que compreende os aminoácidos 1 a 360 na SEQ ID N°. 2; (c) uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que compreende os aminoácidos 1 a 133 na SEQ ID N°. 2; e (d) uma primeira sequência de nucleótidos que é pelo menos 95 % idêntica a uma segunda sequência de nucleótidos, tal como definido em uma qualquer das alíneas (a) a (c), em que a referida primeira sequência de nucleótidos codifica um polipéptido que induz apoptose; ou a estrutura helicoidal complementar desse polinucleótido.
2. 2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada peio facto de a sequência de nucleótido compreender ainda uma sequência de nucleótido, que codifica uma porção de Fc de uma molécula de imunoglobulina. 1
3. 3. Molécula de ácido nucleico, de acordo cora a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de ser ADN ou ARN.
4. 4. Processo para produzir um vector recombinante, caracterizado pelo facto de compreender a inserção num vector de uma molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3.
5. 5. Vector, caracterizado pelo facto de compreender a molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3.
6. 6. Processo de produção de uma célula hospedeira recombinante, caracterizado pelo facto de compreender a introdução de uma molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 ou o vector de acordo com a reivindicação 5, numa célula hospedeira.
7. 7. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo facto de compreender o vector de acordo com a reivindicação 5.
8. 8. Processo para a produção de um polipéptido isolado comportando uma sequência de aminoácidos codificada pela molécula de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações la 3, caracterizado pelo facto de compreender a cultura da célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 7, em condições tais que o referido polipéptido é expresso e se recupera o referido polipéptido.
9. 9. Polipéptido isolado, caracterizado peio facto de comportar uma sequência de aminoácidos codificada pela molécu- 2 la de ácido nucleico, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3.
10. 10. Anticorpo isolado, caracterizado por se ligar especifi-camente ao poiipéptido de acordo com a reivindicação 9, em que o referido poiipéptido consiste numa sequência de aminoácidos seieccionada no grupo que consiste em: (a) uma sequência de aminoácido que compreende os aminoácidos -51 a 360 na SEQ ID N° . 2; (b) uma sequência de aminoácido que compreende os aminoácidos 1 a 360 na SEQ ID N° . 2; (c) uma sequência de aminoácido que compreende os aminoácidos 1 a 133 na SEQ ID N° . 2; e (d) uma primeira sequência de aminoácido que é pelo menos 95 % idêntica a uma segunda sequência de nucleótidos, tal como definido em uma qualquer das alíneas (a) a (c), em que a referida primeira sequência de aminoácido codifica um poiipéptido que induz apoptose.
11. 11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pele facto de o referido anticorpo ser capaz de aumentar a apoptose.
12. 12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender o anticorpo de acordo com a reivindicação 10 ou a 11 e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Lisboa, 27 de Março de 2007 3