PT625989E

PT625989E - Sequencias de adn que codificam novos factores de crescimento/diferenciacao

Info

Publication number: PT625989E
Application number: PT93903966T
Authority: PT
Inventors: Helge Neidhardt; Gertrud Hoetten
Original assignee: Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh
Priority date: 1992-02-12
Filing date: 1993-02-12
Publication date: 2000-06-30
Also published as: EP0625989A1; JP3493105B2; EP0625989B1; CZ287810B6; HU218845B; CZ287715B6; WO1993016099A2; HU9402143D0; CZ194294A3; DE69327645D1; JPH09182593A; UA48105C2; JPH07503847A; DE69327645T2; GR3032482T3; ATE188996T1; KR950700331A; AU666170B2; KR0172186B1; HUT67683A

Description

83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ

DESCRICÃO "Sequências de ADN que codificam novos factores de crescimento/diferenciação" O presente invento refere-se a sequências de ADN que codificam novos factores de crescimento/diferenciação da família TGF-β. Em particular, refere-se a novas sequências de ADN que codificam proteínas semelhantes a TGF-β, ao isolamento das referidas sequências de ADN, a plasmídeos de expressão contendo o referido ADN, a microorganismos transformados pelo referido plasmídeci de expressão, à produção da referida proteína através da cultura do referido transformante e a composições farmacêuticas contendo a referida proteína. A família de factores de crescimento TGF-β compreendendo BMP, TGF e proteínas relacionadas com Inibina (Roberts e Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 419-472) é de particular relevância num grande número de tratamentos e aplicações médicas. Estes factores são úteis em processos relacionados com cicatrização de feridas e reparação de tecidos. Para além disso, vários membros da família TGF-β são indutores de tecidos, especialmente osteo-indutores e consequentemente desempenham um papel crucial na indução do desenvolvimento de cartilagem e osso.

Wozney, Progress in Growth Factor Research 1 (1989), 267-280 e Vale et a!., Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 211-248 descrevem diferentes factores de crescimento tais como os que estão relacionados com o grupo de BMP (proteínas morfogenéticas do osso) e Inibina. Os membros destes grupos partilham uma significativa semelhança estrutural. O precursor da proteína é composto por uma sequência sinal no terminal amino, um propéptido e uma sequência no terminal carboxilo de cerca de 110 aminoácidos, a qual é subsequentemente clivada do precursor e representa a proteína madura. Para além disso, os seus membros são definidos em virtude da homologia da sequência de aminoácidos. A proteína madura contém as sequências mais conservadas, especialmente sete resíduos de cisteína os quais são conservados entre os membros da família. As proteínas semelhantes a TGF-β são factores de crescimento multifuncionais, hormonalmente activos. Estes partilham também actividades biológicas relacionadas tais como atracção quimiotáctica de células, ' promovendo a diferenciação celular e a sua capacidade de indução de tecidos,

83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ 2 tal como a capacidade de indução de cartilagem e osso. A Patente U.S. N° 5013649 divulga sequências de ADN que codificam proteínas osteo-indutoras denominadas proteínas BMP-2 (proteína morfogenética do osso) e os pedidos de patente U.S. nos de série 179 101 e 179 197 divulgam as proteínas BMP, BMP-1 e BMP-3. Para além disso, muitos tipos de células são capazes de sintetizar proteínas semelhantes a TGF-β e praticamente todas as células possuem receptores de TGF-β.

Em conjunto, estas proteínas apresentam diferenças na sua estrutura, que conduzem a uma variação considerável na sua função biológica particular. Para além disso, estas encontram-se numa grande variedade de diferentes tecidos e estádios de desenvolvimento. Consequentemente, podem possuir diferenças no que se refere à sua função particular, por exemplo o ambiente fisiológico celular necessário, o seu tempo de vida, os seus alvos, a sua necessidade de factores acessórios e a sua resistência à degradação. Assim, embora sejam descritas várias proteínas que exibem potencial indutor de tecidos, especialmente osteo-indutor, o seu papel natural no organismo e, mais importante, a sua relevância médica têm ainda que ser elucidados em pormenor. Suspeita-se fortemente da ocorrência de membros ainda não conhecidos da família TGF-β relevantes para a osteogénese ou diferenciação/indução de outros tecidos. No entanto, um dos principais problemas no isolamento destas novas proteínas semelhantes a TGF-β é que as suas funções não podem ser ainda descritas com precisão suficiente para a concepção de um bioensaio discriminativo. Por outro lado, a esperada homologia da sequência nucleotídica para com os membros conhecidos da família seria demasiado baixa para permitir uma pesquisa através das técnicas clássicas de hibridação de ácidos nucleicos. No entanto, o isolamento e caracterização adicionais de novas proteínas semelhantes a TGF-β é urgentemente necessário de forma a obter todo o conjunto de proteínas de indução e diferenciação que vão de encontro a todas as necessidades médicas desejadas.. Estes factores podem ser úteis em aplicações médicas na cicatrização deficiente e tratamentos de distúrbios degenerativos do osso e/ou outros tecidos como, por exemplo, rim e fígado.

Assim, o problema técnico subjacente ao presente invento é essencialmente o de proporcionar sequências de ADN que codifiquem para novos membros da família de proteínas TGF-β possuindo potencial mitogénico

83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ 3 e/ou indutor da diferenciação, p. ex. osteo-indutor. A solução para o problema técnico de cima é alcançada proporcionando as concretizações caracterizadas nas reivindicações 1 a 18. Outras características e vantagens do invento serão aparentes a partir da descrição das concretizações preferidas e dos desenhos. As listagens de sequências e desenhos serão agora brevemente descritos. SEQ ID NO: 1 mostra a sequência nucleotídica de MP-52, i.e. a sequência derivada de embrião que corresponde ao péptido maduro e a maior parte da sequência que codifica para o propéptido de MP-52.

Uma parte da sequência do propéptido na extremidade 5' de MP-52 não foi ainda caracterizada. SEQ ID NO: 2 mostra a sequência nucleotídica caracterizada até ao momento da sequência de MP-1 21 derivada de fígado. SEQ ID NO: 3 mostra a sequência de aminoácidos de MP-52 tal como deduzida de SEQ ID NO: 1. A Piaura 1 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos de MP-52 e MP-121 com algumas proteínas relacionadas. 1a mostra o alinhamento de MP-52 com alguns membros da família de proteínas BMP começando pela primeira das sete cisteínas conservadas; 1b mostra o alinhamento de MP-121 com alguns membros da família de proteínas Inibina. * indica que o aminoácido é o mesmo em todas as proteínas comparadas; + indica que o aminoácido é o mesmo em pelo menos uma das proteínas comparadas com MP-52 (Fig. 1a) ou MP-121 (Fig. 1b). A Figura 2 mostra as sequências nucleotídicas do iniciador oligonucleotídico tal como utilizado no presente invento e um alinhamento destas sequências com membros conhecidos da família TGF-β. M significa A ou C; S significa C ou G; R significa A ou G; e K significa G ou T. 2a apresenta a sequência do iniciador OD; 2b mostra a sequência do iniciador OID.

83849 ΕΡ Ο 625 S89/PT

4 Ο presente invento refere-se a novas proteínas semelhantes a TGF-β e proporciona sequências de ADN contidas nos genes correspondentes. Tais sequências incluem sequências nucleotídicas compreendendo a sequência ATGAACTCCATGGACCCCGAGTCCACAe CTTCTCAAGGCCAACACAGCTGCAGGCACC e em particular sequências tais como ilustradas em SEQ ID NO: 1 e 2, derivados alélicos das referidas sequências e sequências de ADN degeneradas devido ao código genético para as referidas sequências. Estas incluem também sequências de ADN que hibridam sob condições rigorosas com as sequências de ADN acima mencionadas e que contêm as seguintes sequências de aminoácidos: Met-Asn-Ser-Met-Asp-Pro-Glu-Ser-Thr ou Leui-Leu-Lys-Ala-Asn-Thr-Ala-Ala-Gly-Thr.

Embora as referidas sequências alélicas, degeneradas e de hibridação possam ter divergências estruturais devido a mutações de ocorrência natural, tais comc pequenas deleções ou substituições, estas ainda irão exibir normal e essencialmente as mesmas propriedades úteis, permitindo a sua utilização em basicamente as mesmas aplicações médicas.

De acordo com o presente invento, o termo "hibridação" significa condições de hibridação convencionais, de preferência condições com uma concentração salina de 6x SSC de 62° a 66°C seguido por uma lavagem de uma hora com 0,6x SSC, 0,1% de SDS de 62° a 66°C. O termo "hibridação" refere-se de preferência a condições de hibridação rigorosas com uma concentração salina de 4x SSC de 62°-66°C seguida por uma lavagem de uma hora com 0,1x SSC, 0,1 % de SDS de 62°-66°C.

As actividades biológicas importantes das proteínas codificadas compreendem um potencial mitogénico e osteo-indutor e podem ser determinadas em ensaios de acordo com Roberts et aí., PNAS 78 (1981), 5339-5343, Seyedin et a/., PNAS 82 (1985), 2267-2271 ou Sampath e Reddi, PNAS 78 (1981), 7599-7603.

Concretizações preferidas do presente invento são sequências de ADN tal como acima definidas e disponíveis a partir de vertebrados, de preferência mamíferos tais como porco ou vaca e a partir de roedores tais como rato ou

83849 ΕΡ Ο 625 S'89/ΡΤ 5 ratinho, e em particular a partir de primatas tais como humanos.

Concretizações particularmente preferidas do presente invento são as sequências de ADN denominadas MP-52 e MP-121 as quais são mostradas em SEQ ID NO: 1 e 2. Os transcritos de MP-52 correspondentes foram obtidos a partir de tecido embriogénico e codificam para uma proteína que apresenta uma considerável homologia de aminoácidos com a parte madura das proteínas semelhantes a BMP (ver Fig. 1a). As sequências proteicas de BMP2 ( = BMP2A) e BMP4 ( = BMP2B) estão descritas em Wozney et a!., Science Vol. 242, 1528-1534 (1988). As sequências respectivas de BMP5, BMP6 e BMP7 estão descritas em Celeste et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA Vol. 87, 9843-9847 (1990). Algumas homologias de sequências típicas, as quais são específicas apenas de sequências de BMP conhecidas, foram também encontradas na parte propéptido de MP-52, enquanto que outras partes da parte precursora de MP-52 mostram diferenças marcadas em relação aos precursores de BMP. O ARNm de MP-121 foi detectado em tecido hepático e a sua sequência de aminoácidos correspondente apresenta homologia com as sequências de aminoácidos das cadeias proteicas de Inibina (ver Fig. 1b). Não foram ainda isoladas a partir de tecido hepático sequências de ADNc que codifiquem proteínas semelhantes a TGF-β, provavelmente devido a uma baixa abundância de transcritos específicos de TGF-β neste tecido. Em tecido embriogénico, no entanto, podem ser encontradas com relativa abundância sequências que codificam proteínas semelhantes a TGF-β conhecidas. Os inventores detectaram recentemente a presença de uma colecção de proteínas semelhantes a TGF-β também no fígado. O elevado nível de fundo de clones relacionados com factores conhecidos deste grupo apresenta a principal dificuldade no estabelecimento de novas sequências relacionadas com TGF-β a partir destes e provavelmente de outros tecidos. No presente invento, a clonagem foi efectuada de acordo com o método abaixo descrito. Após a sequência de ADN ter sido clonada, a preparação de células hospedeiras capazes de produzir as proteínas semelhantes a TGF-β e a produção das referidas proteínas podem ser facilmente conseguidas utilizando técnicas de ADN recombinante conhecidas compreendendo a construção dos plasmídeos de expressão que codificam a referida proteína e a transformação de uma célula hospedeira com o referido plasmídeo de expressão, a cultura do transformante num meio de cultura adequado e a recuperação do produto possuindo actividade semelhante a TGF-β.

83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ

Assim, ο invento refere-se também a moléculas recombinantes compreendendo sequências de ADN tal como acima descritas, opcionalmente ligadas a uma sequência de controlo de expressão. Tais vectores podem ser úteis na produção de proteínas semelhantes a TGF-β em células transformadas de forma estável ou transiente. Podem ser empregues vários sistemas animais, vegetais, fúngicos e bacterianos para a transformação e subsequente processo de cultura. De preferência, os vectores de expressão que podem ser utilizados no invento contêm sequências necessárias para a replicação na célula hospedeira e são replicáveis de forma autónoma. É também preferível utilizar vectores contendo genes marcadores seleccionáveis os quais podem ser facilmente seleccionados em células transformadas. A operação necessária é bem conhecida dos peritos na arte. É outro objectivo do invento proporcionar uma célula hospedeira transformada por um plasmídeo de expressão do invento e capaz de produzir uma proteína da família TGF-β. Exemplos de células hospedeiras adequadas incluem várias células eucarióticas e procarióticas, tais como E. coli, células de insecto, células vegetais, células de mamífero e fungos tais como leveduras.

Outro objectivo do presente invento é proporcionar uma proteína da família TGF-β codificada pelas sequências de ADN acima descritas e que apresente características biológicas tais como indutora de tecidos, em particular osteo-indutora e/ou capacidades mitogénicas possivelmente relevantes para tratamentos terapêuticos. As características acima mencionadas da proteína podem variar dependendo da formação de homodímeros ou heterodímeros. Tais estruturas podem-se também mostrar úteis em aplicações clínicas. A sequência de aminoácidos de uma proteína especialmente preferida da família TGF-β (MP-52) é mostrada em SEQ ID NO: 3. É outro aspecto do invento proporcionar um processo para a produção de proteínas semelhantes a TGF-β. Tal processo compreende a cultura de uma célula hospedeira estando transformada com uma sequência de ADN do presente invento num meio de cultura adequado e purificação da proteína semelhante a TGF-β produzida. Assim, este processo permitirá a produção de uma quantidade suficiente da proteína desejada para utilização em tratamentos

83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ 7 ou aplicações médicos utilizando técnicas de cultura de células que requerem factores de crescimento para a sua realização. A célula hospedeira é obtenível a partir de bactérias tais como Bacillus ou Escherichia coli, a partir de fungos como leveduras, a partir de plantas tais como tabaco, batata ou Arabidopsis e a partir de animais, em particular linhas celulares de vertebrados tais como a linha celular Mo, COS ou CHO.

Ainda um outro aspecto do presente invento é proporcionar um processo particularmente sensível para o isolamento de sequências de ADN correspondendo a ARNm de baixa abundância nos tecidos de interesse. O processo do invento compreende a combinação de quatro passos diferentes. Primeiro, o ARNm tem que ser isolado e utilizado numa reacção de amplificação utilizando iniciadores oligonucleotídicos. A sequência dos iniciadores oligonucleotídicos contém sequências de ADN degeneradas derivadas da sequência de aminoácidos de proteínas relacionadas com o gene de interesse. Este pass;o pode conduzir à amplificação de membros já conhecidos da família génica de interesse e estas sequências não desejadas teriam por isso que ser eliminadas. Este objectivo é alcançado utilizando endonucleases de restrição as quais se sabe que digerem os membros já analisados da família génica. Após o tratamento da população de ADN amplificada com as referidas endonucleases de restrição, as restantes sequências de ADN desejadas são isoladas por electroforese em gel e novamente amplificadas num terceiro passo através de uma reacção de amplificação e num quarto passo são clonadas em vectores adequados para sequenciação. Para aumentar a sensibilidade e eficiência, os passos dois e três são efectuados de forma repetida, pelo menos duas vezes numa concretização deste processo.

Numa concretização preferida, o processo de isolamento acima descrito é utilizado para o isolamento de sequências de ADN a partir de tecido hepático. Numa concretização particularmente preferida do processo acima descrito, um iniciador utilizado para a experiência de PCR é homólogo à cauda poli-A do ARNm, enquanto que o segundo iniciador contém uma sequência específica do gene. As técnicas empregues na realização dos diferentes passos deste processo (tais como reacções de amplificação ou técnicas de sequenciação) são conhecidas dos peritos na arte e descritas, por exemplo, em Sambrook et a!., 1989, "Molecular Cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory

83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ 8

Press. É outro objectivo do presente invento proporcionar composições farmacêuticas contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína da família TGF-β do presente invento. Opcionalmente, tal composição compreende um transportador farmaceuticamente aceitável. Tal composição terapêutica pode ser utilizada em cicatrização de feridas e reparação de tecidos assim como na cicatrização de osso, cartilagem ou defeitos nos dentes, individualmente ou em conjunto com transportadores adequados e possivelmente com outras proteínas ou factores de crescimento relacionados. Assim, uma composição terapêutica do invento pode incluir, mas não se lhe limita, a proteína codificada MP-52 em conjunto com a proteína codificada MP-121 e opcionalmente com outras substâncias biologicamente activas conhecidas tais como EGF (factor de crescimento epidérmico) ou PDGF (factor de crescimento derivado de plaquetas). Outra possível aplicação clínica de uma proteína semelhante a TGF-β é a utilização como supressora da resposta imunitárici, o que preveniria a rejeição de transplantes de órgãos. A composição farmacêutica compreendendo as proteínas do invento pode também ser utilizada profilacticamente ou pode ser empregue em cirurgia plástica cosmética. Para além disso, a aplicação da composição não está limitada a humanos mas pode também incluir animais, em particular animais domésticos.

Finalmente, outro objectivo do presente invento é um anticorpo ou fragmento de anticorpo, o qual seja capaz de se ligar especificamente às proteínas do presente invento. Os métodos para criar tal anticorpo específico são do conhecimento geral. De preferência, tal anticorpo é um anticorpo monoclonal. Tais anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ser úteis para métodos de diagnóstico.

Os seguintes exemplos ilustram em pormenor o invento divulgado, mas não devem ser entendidos como limitando do invento.

83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ 9

Exemplo 1

Isolamento de ΜΡ-121 1.1 Foi isolado ARN total a partir de tecido hepático humano (homem de 40 anos de idade) pelo método de Chirgwin et a!., Biochemistry 18 (1979), 5294-5299. O ARN poli-A" foi separado do ARN total por cromatografia com oligo (dT) de acordo com as instruções do fabricante (Stratagene Poli (A) Quick columns). 1.2 Para a reacção de transcrição inversa, o ARN poli-A+ (1-2,5 pg) derivado de tecido hepático foi aquecido durante 5 minutos a 65°C e arrefecido rapidamente em gelo. Foram adicionados os reagentes de transcrição inversa contendo 27 U de ARN-guarda (Pharmacia), 2,5 pg de oligo d(T)12.18 (Pharmacia), tampão 5x (Tris/HCI 250 mM pH 8,5; MgCI2 50 mM; DTT 50 mM; 5 mM de cada dNTP; KCI 600 mM) e 20 unidades de transcriptase inversa do vírus da mieloblastose de aves (AMV, Boehringer Mannheim) por pg de ARN poli-(A~). A mistura reaccional (25 pl) foi incubada durante 2 horas a 42°C. O banco de ADNc de fígado foi armazenado a -20°C. 1.3 Os iniciadores desoxinucleotídicos OD e OID (Fig. 2) concebidos para iniciarem a reacção de amplificação foram criados num sintetizador de ADN automático (Biosearch). A purificação foi feita por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante e isolamento da banda principal do gel por isotacoforese. Os oligonucleótidos foram desenhados através do alinhamento das sequências de ácido nucleico de alguns membros conhecidos da família TGF-β e selecção das regiões mais conservadas. Urm alinhamento desta região é mostrado na Fig. 2. De forma a facilitar a clonagem, ambos os oligonucleótidos continham locais de restrição fcoRl e o OD continha adicionalmente um local de restrição Nco\ no seu terminal 5'. 1.4 Na reacção em cadeia com polimerase, foi utilizado um banco de ADNc derivado de fígado como molde numa mistura reaccional de 50 pl. A amplificação foi efectuada em tampão de PCR 1x ( (NH4)2S04 16,6 mM;

83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ 10

Tris/HCI 67 mM ρΗ 8,8; MgCI2 2 mM; EDTA 6,7 μΜ; β-mercaptoetanol 10 mM; 170 pg/ml de BSA (Gibco)), 200 μΜ de cada dNTP (Pharmacia), 30 pmol de cada oligonucleótido (OD e OID) e 1,5 unidades de polimerase Taq (AmpliTaq, Perkin Elmer Cetus). A reacção de PCR continha ADNc correspondendo a 30 ng de ARN poli-A" como material de partida. A mistura reaccional foi coberta por uma camada parafina e foram efectuados 40 ciclos de PCR (ciclo 1: 80 s 93°C/40 s 52°C/40 s 72°C; ciclos 2-9: 60 s 93°C/40 s 52°C/40 s 72°C; ciclos 10-29: 60 s 93°C/40 s 52°C/60 s 72°C; ciclos 30-31: 60 s 93°C/40 s 52°C/90 s 72°C; ciclo 40: 60 s 93°C/40 s 52°C/420 s 72°C). Foram reunidas seis misturas reaccionais de PCR, purificadas por extracções subsequentes com iguais volumes de fenol, fenol/clorofórmio (1:1 (v/v)) e clorofórmio/álcool isoamílico (24:1 (v/v)) e concentradas por precipitação com etanol. 1.5 Metade do banco de PCR obtido foi suficiente para digestão com as en2:imas de restrição Sph\ (Pharmacia) e AlwH\ (Biolabs). A segunda metade foi digerida numa série de reacções pelas enzimas de restrição Ava\ (BRL), A!wH\ (Biolabs) e 77/Ί (Biolabs). As digestões com as endonucleases de restrição foram efectuadas em 100 μΙ a 37°C (excepto Tfi\ a 65°C) utilizando 8 unidades de cada enzima numa reacção de 2 a 12 horas num tampão recomendado pelo fabricante. 1.6 Cada amostra de ADN foi fraccionada por electroforese utilizando um gel de agarose a 4% (agarose FMC Nusieve a 3%, Biozym e agarose a 1%, BRL) em tampão Tris-borato (Trisbase 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8). Após coloração com brometo de etídio, os produtos da amplificação não clivados (cerca de 200 pb; o marcador de tamanho foi corrido em paralelo) foram excisados do gel e isolados por extracção com fenol: um volume igual de fenol foi adicionado à agarose excisada, a qual foi fragmentada em pequenos pedaços, congelada durante 10 minutos, agitada no vórtex e centrifugada. A fase aquosa foi recolhida, a interfase re-extraída com o mesmo volume de tampão TE, centrifugada e ambas as fases aquosas foram combinadas. O ADN foi ainda purificado por extracção duas vezes com fenol/clorofórmio e uma vez com clorofórmio/álcool isoamílico.

83849 ΕΡ Ο 625 939/ΡΤ 11 1.7 Após precipitação com etanol, um quarto ou um quinto do ADN isolado foi novamente amplificado utilizando as mesmas condições utilizadas para a primeira amplificação excepto diminuindo o número de ciclos para 13 (ciclo 1: 80 s 93°C/40 s 52°C/40 s 72°C; ciclos 2-12: 60 s 93°C/40 s 52cC/60 s 72°C; ciclo 13: 60 s 93°C/40 s 52°C/420 s 72°C). Os produtos da nova amplificação foram purificados, cortados com as mesmas enzimas de restrição tal como acima e os produtos não clivados foram isolados dos geles de agarose tal como acima mencionado para os produtos da amplificação. A nova amplificação seguida de restrição e o isolamento do gel foram repetidos uma vez. 1.8 Após o último isolamento do gel, os produtos da amplificação foram digeridos por 4 unidades de EcoR\ (Pharmacia) durante 2 horas a 37°C utilizando o tampão recomendado pelo fabricante. Um quarto da mistura de restrição foi ligada ao vector pBluescriptll SK+ (Stratagene) o qual foi igualmente digerido por £coRI. Após a ligação, 24 clones de cada combinação de enzimas foram ainda analisados por análise de sequências. A amostra cortada por A!wH\ e Sph\ não continha novas sequências, apenas as sequências de BMP6 e Inibina βΑ. Foram encontradas 19 novas sequências idênticas, as quais foram denominadas MP-121, nas amostras cortadas por Ava\, AtwHI e 77/1. Uma sequência era diferente desta sequência encontrada com maior frequência em duas trocas de nucleótidos. A reacção de ligação e a transformação em E. coli HB101 foram efectuadas tal como descrito em Sambrook et a!., Molecular cloning: A laboratory manual (1989). Os transformantes foram seleccionados pela resistência à Ampicilina e os ADN plasmídicos foram isolados de acordo com protocolos padrão (Sambrook et ai. (1989)). A análise foi feita por sequenciação dos plasmídeos de cadeia dupla através de "sequenciação da terminação da cadeia didesoxirribonucleotídica" com o estojo de sequenciação "Sequenase Versão 2.0" (United States Biochemical Corporation). O clone foi completado na extremidade 3' do ADNc através de um método descrito em pormenor por Frohman (Amplifications, publicado por Perkin-Elmer Corporation, número 5 (1990), págs. 11-15). O mesmo ARNm de fígado que foi utilizado para o isolamento do primeiro fragmento de MP-121 foi

83849

ΕΡ Ο 625 S89/PT 12 transcrito de forma inversa utilizando um iniciador consistindo em oligo dT (16 resíduos) ligado a um iniciador adaptador (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC (T)16). A amplificação foi efectuada utilizando o iniciador adaptador (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) e um iniciador interno (GGCTACGCCATGAACTTCTGCATA) da sequência de MP-121. Os produtos da amplificação foram novamente amplificados utilizando um iniciador interno "aninhado" (ACATAGCAGGCATGCCTGGTATTG) da sequência de MP-121 e o iniciador adaptador. Os produtos da nova amplificação foram clonados após restrição com Sph\ no vector cortado de forma semelhante pT7/T3 U19 (Pharmacia) e sequenciados com o estojo de sequenciação "Sequenase Version 2.0" (United States Biochemical Corporation). Os clones foram caracterizados pela sua sobreposição de sequências com a extremidade 3' da sequência de MP-121 conhecida.

Exemplo 2

Isolamento de MP-52

Outra sequência de ADNc, MP-52, foi isolada de acordo com o método acima descrito (Exemplo 1) utilizando ARN de tecido de embrião humano (8-9 semanas de idade). A reacção de PCR continha ADNc correspondendo a 20 ng de ARN poli-(A+) como material de partida. O passo de nova amplificação foi repetido duas vezes para ambas as combinações de enzimas. Após a ligação, 24 clones de cada combinação de enzimas foram ainda analisados por análise de sequéincias. A amostra cortada por AlwN\ e Sph\ originou uma nova sequência a qual foi denominada MP-52. Os outros clones compreendiam principalmente BMP6 e uma sequência de BMP7. A amostra cortada por Ava\, AlwN I e 7771 não continha sequências novas, mas consistia principalmente em BMP7 e nalgumas sequências de Inibina βΑ. O clone foi completado na extremidade 3' de acordo com o método acima descrito (Exemplo 1). O mesmo ARNm de embrião, o qual foi utilizado para o isolamento do primeiro fragmento de MP-52, foi transcrito de forma inversa tal como no Exemplo 1. A amplificação foi efectuada utilizando o iniciador adaptador (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) e um iniciador interno (CTTGAGTACGAGGCTTTCCACTG) da sequência de MP-52. Os produtos da

83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ 13 amplificação foram novamente amplificados utilizando um iniciador adaptador "aninhado" (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) e um iniciador interno "aninhado" (GGAGCCCACGAATCATGCAGTCA) da sequência de MP-52. Os produtos da nova amplificação foram clonados após restrição com Nco\ num vector cortado do mesmo modo (pUC19 (Pharmacia #27-4951-01) com um local de clonagem múltiplo alterado contendo um único local de restrição Nco\) e sequenciados. Os clones foram caracterizados pela sua sobreposição de sequências com a extremidade 3' da sequência de MP-52 conhecida. Alguns destes clones continham os últimos 143 pares de bases da extremidade 3' da sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 e a região 3' não traduzida de 0,56 kb (sequência não mostrada). Uma destas foi utilizada como sonda para pesquisar uma biblioteca genómica humana (Stratagene #946203) através de um método comum descrito em pormenor por Ausubel et ai. (Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Associates e Wiley-lnterscience (1989)). De 8x105 fagos λ, um fago (λ 2.7.4), o qual se provou conter uma inserção de cerca de 20 kb, foi isolado e depositado no DSM (#7387). Este clone contém, em adição à sequência isolada a partir de ARNm através dos métodos de amplificação descritos, informação quanto à sequência mais para a extremidade 5'. Para a análise das sequências, um fragmento Hind\\\ de cerca de 7,5 kb foi subclonado num vector cortado do mesmo modo (Bluescript SK, Stratagene #212206). Este plasmídeo, chamado SKL 52 (H3) MP12, foi também depositado no DSM (# 7353). A informação sobre a sequência derivada deste clone é mostrada em SEQ ID NO: 1. No nucleótido n° 1050, o ADNc determinado e a respectiva sequência genómica diferem num par de bases (ADNc: G; ADN genómico: A). Nós assumimos que a sequência genómica está correcta, tal como foi também confirmado por sequenciação do ADN genómico amplificado a partir de tecido embrionário o qual tinha sido utilizado para a preparação do ARNm. O ADN genómico contém um intrão de cerca de 2 kb entre os pares de bases 332 e 333 de SEQ ID NO: 1. A sequência do intrão não é mostrada. A junção exão/exão correcta foi confirmada pela sequenciação de um produto de amplificação derivado do ADNc que compreende esta região. Esta informação de sequenciação foi obtida com a ajuda de um método ligeiramerte modificado descrito em pormenor por Frohman (Amplifications, publicado por Perkín-Elmer Corporation, número 5 (1990), págs. 11-15). O mesmo ARN de embrião que foi utilizado para o isolamento da extremidade 3' de MP-52 foi transcrito de forma inversa utilizando um iniciador 83849 ΕΡ Ο 625 939/ΡΤ

14 interno da sequência de MP-52 orientado na direcção 5' (ACAGCAGGTGGGTGGTGTGGACT). Uma cauda poli-A foi adicionada à extremidade 5' da primeira cadeia de ADNc utilizando uma transferase terminal. Uma amplificação em dois passos foi efectuada primeiro por aplicação de um iniciador consistindo em oligo dT e um iniciador adaptador (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC (T16)) e em segundo lugar um iniciador adaptador (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) e um iniciador interno (CCAGCAGCCCATCCTTCTCC) da sequência de MP-52. Os produtos da amplificação foram novamente amplificados utilizando o mesmo iniciador adaptador e um iniciador interno "aninhado" (TCCAGGGCACTAATGTCAAACACG) da sequência de MP-52. Consecutivamente, os produtos da nova amplificação foram mais uma vez amplificados utilizando um iniciador adaptador "aninhado" (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) e um iniciador interno "aninhado" (ACTAATGTCAAACACGTACCTCTG) da sequência de MP-52. Os produtos finais da nova amplificação foram clonados com extremidades lisas num vector (Bluescript SK, Stratagene #212206) cortado com EcoRV. Os clones foram caracterizados pela sua sobreposição de sequências com o ADN de λ 2.7.4. 0 plasmídeo SKL 52 (H3) MP12 foi depositado com o número 7353 em DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, em 10.12.1992. 0 fago λ 2.7.4. foi depositado com o número 7387 em DSM em 13.1.1993.

15 83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ SEQ ID ΝΟ: 1 TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleotídica COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 1207 pares de bases

TIPO DE CADEIA: Dupla TOPOLOGIA: Linear TIPO MOLECULAR: ADN ORIGEM: — ORGANISMO: Humano ORIGEM EXPERIMENTAL IMEDIATA: Tecido embrionário

PROPRIEDADES: Sequência semelhante a TGF-β (MP-52) ACCGG3CGGC CCTCftfiCCCA AGOCAGGSCA GAcioiGacc: ccaamggbc Aacncccxss ccccãgcicc: ticcigctsa AS^GxeaG occGmcGc: ccaccccocA TcacaraccA. OTCCGftlGCT GZOGAAAG3 caccaicacc AGomairG acaaaggqca GAGjEACCTO TTIGACAITA GIGCCCT3GA GRTCTIGCGC? AÃGRÃQCCCT CQ3ftCftCG30 TQCCCAGCTC; AftGCTTCJIECA GOIQOCCCAG qcgciccgt:; ocãosoctog Acoaiuros CCGAAftOT:: MGftaCTOGG CCCfiGCroiG Gaccsrasac ctccgigscc TSGGcriccA CCICTlCClVà GTGmGGCC GOBCCAftGftA ccGocioa: CÃGGacGKEA «acccrsiA GCGG3Q0CCA CTQQOCftCTC GCXZÃG3GCAA CAGICGGAÃG GGACTCCATC TCAêCTICAA ADC0CnGfií3 TftCGBQQCIT TCCACT3CGA CCIGGRGGa: 2TGAAICATG CAGTCKDOCA cacaocfica: adctqctoig tooccaoqog CICTGCCAfiC AfiCGTOGTCT AIRÃGCAGEA CAGCTftG que codifica para uma proteína humana OCdOCCCAA J£»AG3C»G3 CEfiOGOOCG 60 ASSCAAGGOa. CCCCCAAAaG 0^303 120 K3GCCCG3S CCOCCaCOG A3COCZAAGGA 180 cgagiscatg craosorsr AcaocaarT 240

CfiGCGTGAftG TT33G3CTG GCCIG3XAA 300 AGMXaCCGA G3ICCCCT3G ΤΏβΏΑΟΏ. 360 GAftGGAIGSS CT3TTGGGG3 CCGRGCT3CG 420 CaAGOCaGCG GOCCOOGGRG G33G30333Z 480 CQ30CGC3CAG CCCXgCICCT TGCIGGKTGT 540 CTG3GAGGTG TICSOJCT GGAAQTICTT 600 CdGãêGCTS GaGSCCTGGS AÃCG333CÃG 660 CCGCGCCGCC CKXBGSICC AO»GftÃGX 720 ACGGffiCCTG TldTIAATO ÃGATTAÃGSC 780 TG&GI2CCTG TTCfiGXftGC GQCGAAAfiCG 840 GCGêCOCAGC AfiGMGCTTA AGQCTOGCTG 900 Q3OT033C TQSGBCGfiCT GGAICATCGC 960 GGQ3CTSIGC GAGTiCOCAT T3CGCTCCCA 1020 GROOCTGATG AftCTXKTGS ACOOOGW3IC 1080 GCTGAGTOCC ATCMGAICC 'ICTiCATTGA 1140 TCAGC3ACATG GICGTOGAGT CGTGIGGCTS 1200 1207 83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ 16

SEQ ID ΝΟ: 2

TliPO DE SEQUÊNCIA: Nucleotídica COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 265 pares de bases TIPO DE CADEIA: Simples TOPOLOGIA: Linear TIPO MOLECULAR: ADNc para ARNm ORIGEM: — ORGANISMO: Humano ORIGEM EXPERIMENTAL IMEDIATA: Tecido hepático PROPRIEDADES: Proteína humana semelhante a TGF-β (MP-121) CATCCAGCCT GSG33CTRCG CCA3X»ACIT CTGCZAIAQ33 CAG1G30CAC T30CATRG2 60 AQ3catocct oararraciG cccccitíca cAcrocaGrc ctcaatcttc tcaagsxaa 120 CACA3CT3ZA G3CACCACTS GAQGG33CIC MOCIGIUIA CXTAOSTiOC ΓΤΤΥΤΤΤΎΤΤ 180 GICICTOCIC TKFEKTGACA G33CAGZAA. OOTGTCAAG CEGACATOST 240 AGIAGftG3CC TC7IG33IGCA. GITAG 265 83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ 17

SEQ ID ΝΟ: 3 TIPO DE SEQUÊNCIA: Aminoácidos COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 401 aminoácidos ORiiGEM: — ORGANISMO: Humano ORIGEM EXPERIMENTAL IMEDIATA: PROPRIEDADES: Proteína humana semelhante a TGF-β (MP-52) PG3PEPKFGE: PPCflPQKnRR TVIPKGQLPG GKSPPKaGSV FSSFUZXKR EFGPEREPKE 60 PFRPPP1TPB: EXMLSLXRIL SDADRXGGNS SVKLEAGLAN TITSFIDKGQ ddrgfwrhq 120 RYVFDISALE KDGLLGAEUR HRKKPSUIA KPAAF03GRA AQLKLSSCPS GRQPASLLDV 180 RSVPGLDGSG WEVFDIWFXF KNEXNSAQD2 IELEAHERGR AVDIRGD2FD RAARQVHEKA 240 LFLVPGREKK. RDLETHEIKA BSG2DDKT7Y EYLFSQRRKR RAFIAIRQGK RPSXNEZMC 300 SRKALHVNEK DtGWDDWIIA PIZXEAFBCE GD2EH=LRSH LEPUJHAVIQ TLMNSMDPES 360 TPP1CCVPTP. LSPISILFID SANNWYKQY EDMWESCG2 R 401 18 18 83849 ΕΡ Ο 625 939/ΡΤ

Lisboa, 10. tBR.

Por BIOPHARM GESELLSCHAFT ZUR BIOTECHNOLOGISHEN ENTWICKLUNG VON PHARMAKA mbH - O AGENTE OFICIAL -

Claims

83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Sequência de ADN que codifica uma proteína da família TGF-β seleccionada de entre o seguinte grupo: (a) uma sequência de ADN compreendendo os nucleótidos ATG AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA com a estrutura de leitura para a proteína a começar no primeiro nucleótido (b) uma sequência de ADN compreendendo os nucleótidos CTT CTC AAG GCC AAC ACA GCT GCA GGC ACC com a estrutura de leitura para a proteína a começar no primeiro nucleótido (c) sequências de ADN as quais são degeneradas como resultado do código genético a partir das sequências de ADN de (a) e (b) (d) derivados alélicos das sequências de ADN de (a) e (b) que codificam proteínas exibindo essencialmente as mesmas propriedades que as proteínas codificadas por (a) e (b) (e) sequências de ADN que hibridam com as sequências de ADN em (a), (b), (c) ou (d) e que codificam uma proteína contendo a sequência de aminoácidos Met-Asn-Ser-Met-Asp-Pro-Glu-Ser-Thr ou Leu-Leu-Lys-Ala-Asn-Thr-Ala-Ala-Gly-Thr (f) sequências de ADN que hibridam com as sequências de ADN em (a), (b), (c) sob condições rigorosas.
2. Sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1 a qual é uma sequência de ADN de vertebrado ou uma sequência de ADN de mamífero.
3. Sequência de ADN de acordo com a reivindicação 2, em que a sequência de mamífero é uma sequência de ADN de primata, humano, suíno, bovino ou roedor.
4. Sequência de ADN de acordo com a reivindicação 3, em que a sequência de roedor é uma sequência de ADN de rato ou ratinho.
5. Sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1 ou 2 a qual é uma sequência de ADN compreendendo os nucleótidos tal como mostrado em SEQ ID NO: 1. 83849 ΕΡ Ο 625 91Β9/ΡΤ

2/3
6. Sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1 ou 2 a qual é uma sequência de ADN compreendendo os nucleótidos tal como mostrado em SEQ ID NO: 2.
7. Molécula de ADN recombinante compreendendo uma sequência de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. Molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 7 na qual a referida sequência de ADN está funcionalmente ligada a uma sequência de controlo da expressão.
9. Hospedeiro contendo uma molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 7 ou 8.
10. Hospedeiro de acordo com a reivindicação 9 o qual é uma bactéria, um fungo, uma célula vegetal ou uma célula animal.
11. Processo para a produção de uma proteína da família TGF-β compreendendo a cultura de um hospedeiro de acordo com a reivindicação 9 ou 10 e a recuperação da referida proteína TGF-β a partir da cultura.
12. Proteína da família TGF-β codificada por uma sequência de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
13. Proteína de acordo com a reivindicação 12 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
14. Composição farmacêutica contendo uma proteína da família TGF-β de acordo com a reivindicação 12 ou 13 opcionalmente em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.
15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14 para o tratamento de vários defeitos no osso, cartilagem ou dentes e para utilização em processos de reparação de feridas e de tecidos.
16. Anticorpo ou fragmento de anticorpo o qual é capaz de se ligar 83849 ΕΡ Ο 625 989/ΡΤ 3/3 especificamente a uma proteína de acordo com as reivindicações 12 ou 13 mas que não se liga a outras proteínas semelhantes a BMP ou Inibina.
17. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 16 o qual é um anticorpo monoclonal.
18. Agente de diagnóstico compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 ou 17. Lisboa, Por BIOPHARM GESELLSCHAFT ZUR BIOTECHNOLOGISHEN ENTWICKLUNG VON PHARMAKA mbH - O AGENTE OFICIAL -