JPH07503847A - 新規の増殖／分化因子をコード化するｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ配列をコード化する新規の増殖／分化因子本発明は、ＴＧＦ−β系統群の ＤＮＡ配列をコード化する新規の増殖／分化因子に関する。殊に、本発明は、Ｄ ＮＡ配列をコード化する新規のＴＧＦ−β様蛋白質、ＤＮＡ配列の分離、ＤＮＡ を含有する発現プラスミド、発現プラスミドによって形質転換された微生物、形 質転換体の培養による蛋白質の生産、および蛋白質を含有する製薬学的組成物に 関する。ＢＭＰ、ＴＧＦおよびインヒビンに関連した蛋白質を有する増殖因子の ＴＧＦ−β系統群（Ｒｏｌ＋ｅｒｌｓ　ｔ＋＋ｄ　５ｐｏｒｎ、　Ｈｉｎｄｌ＋ ｏｏｋ　ｏｌ　Ｅｘｐｅ目ＩＩ＋ｅｎｔａｌ　Ｐｈｉ＋鵬ａｃｏｌｃ＋ｇｙ　９ ５　（１９９０）、　４１９−４７２）は、治療および適用の広い範囲内で特に 適切なものを示す。これらの因子は、傷病の治癒および組織の治療に関連する処 置に有用である。更に、ＴＧＦ−β系統群の幾つかのメンバーは、組織誘発的、 殊に骨誘発的であり、必然的に軟骨および骨の開発を導くのに決定的な役割を演 じる。

ウオズニイ　（Ｗｏ　ｔ　ｎ　ｅア）　、ＰｔｏＨｅｓｓ　ｉｎ　Ｇｒｏｖｌｈ 　ＦａｃｔｏｒＲｅｓｅａｔｃｈ　Ｉ　（１９８９）、　２６７−２８７および ペイル（Ｖ！ｌｅ）他、ｌ１ｉｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ！ 　Ｐｈａｒｍ＊ｃｏｌｏＨ７９５（１９９０）、　２１１−２４８には、異なる 増殖因子、例えばＢＭＰ　（骨形態形成蛋白質）に関連するものおよびインヒビ ン群が記載されている。これらの群のメンバーは、重要な構造的類似性を共有し ている。蛋白質の前駆物質は、アミノ末端シグナル配列、プロペプチドおよび事 後に前駆物質から切断されかつ成熟蛋白質を表わす約１１０個のアミノ酸のカル ボキシ末端配列から構成されている。更に、これらのメンバーは、アミノ酸配列 の同族性により定義される。成熟蛋白質は、最も保守された配列、殊に系統群の メンバーの中で保守されている７個のシスティン残基を含有する。ＴＧＦ−β様 蛋白質は、多官能性のホルモン的に活性の増殖因子である。

また、これらのＴＧＦ−β様蛋白質は、関連した生物活性、例えば細胞の走化性 誘引、細胞分化の促進および細胞の組織誘発能力、例えば軟骨誘引能力および骨 誘引能力を共有している。米国特許第５０１３６４９号明細書には、ＤＮＡ配列 をコード化する骨誘発蛋白質を末端に有したＢＭＰ−２蛋白質（骨形態形成蛋白 質）が開示されており、かつ米国特許第１７９１０１号明細書および同第１７９ １９７号明細書には、ＢＭＰ蛋白質ＢＭＰ−１およびＢＭＰ−３が開示されてい る。更に、数多くの細胞型は、ＴＧＦ−β様蛋白質を合成させることができ、実 質的に全ての細胞は、ＴＧＦ−β受容体を有する。

ひとまとめにして考えると、前記蛋白質は、構造の点で差を示し、詳細な生物学 的機能の点で著しい変形を導く。更に、前記蛋白質は、種々の種類の異なる組織 および開発段階で見い出されている。従って、前記蛋白質は、機能、詳細には例 えば必要とされる細胞の生理的環境、寿命、ターゲット、アクセサリ−因子に対 する要件および耐崩壊性に関する差を有する。従って、組織の誘発、殊に骨の誘 発電位を示す数多くの蛋白質が記載されているけれども、蛋白質の微生物におけ る天然の役割、より重要なことに蛋白質の医学的関連は、なお詳細に説明しなけ ればならない。骨形成または他の組織の分化／誘発に関連したＴＧＦ−β系統群 のまだよく知られていないメンバーの発生は、著しく疑わしいものである。しか し、この新規のＴＧＦ−β様蛋白質の分離における主な問題は、この蛋白質の機 能を識別による生物検定の設計にとって未だ十分正確に記載することができない ことにある。他面、前記系統群の公知のメンバーに対して予想されたヌクレオチ ド配列の相同性は、古典的な核酸ハイブリッド化技術によってスクリーニングさ せるためには低すぎるであろう。それにも拘わらず、さらに新規のＴＧＦ−β様 蛋白質の分離および特性決定は、所望の全ての医学的要件に適合する蛋白質を誘 発させかつ分化させる全ての組み合わせを把握するために、緊急に必要とされる ものである。これらの因子は、骨および／または例えば腎臓および肝臓のような 他の組織の退化性疾患の欠点のある治癒および治療の際に有用な医学的用途を生 じるかもしれない。

従って、本発明の基礎となる技術的な問題は、本質的に分裂促進因子および／ま たは分化誘発、例えば骨誘発電位を有するＴＧＦ−β蛋白質系統群の新規のメン バーをコード化するＤＮＡ配列を提供することである。

上記の技術的問題の解決は、請求項１から１７までのいずれか１項に特徴付けら れた実施態様を提供することによって達成される。本発明の他の特徴および利点 は、好ましい実施態様および図面の記載から明らかである。次に、配列表および 図面について簡単に記載する。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１は、ＭＰ−５２のヌクレオチド配列、即ち成熟ペプチド に相当する胎児に由来する配列およびＭＰ−５２のペプチドをコード化する大部 分の配列を示す。

ＭＰ−５２の５′末端の幾つかのペプチド配列は、もはや特性決定することがで きなかった。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２は、肝臓に由来する配列ＭＰ−１２１の著しく特性決定 されたヌクレオチド配列を示す。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ。

１から推論されるようなＭＰ−５２のアミノ酸配列を示す。

第１図は、幾つかの関連した蛋白質を有するＭＰ−５２およびＭＰ−１２１のア ミノ酸配列を示す、ｌａは、７個の保存されたシスティンの最初のシスティンか ら出発するＢＭＰ蛋白質系統群の幾つかのメンバーを有するＭＰ−５２の配列を 示し一１ｂは、インヒビン蛋白質系統群の幾つかのメンバーを有ｔ６ＭＰ−１２ １の配列を示す０本は、アミノ酸が比較された全ての蛋白質において同じもので あることを示し；＋は、アミノ酸がＭＰ−５２（第１ａ図）またはＭＰ−１２１ （第１ｂ図）と比較した蛋白質の少なくとも１つと同じものである。

第２図は、本発明で使用されたようなオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオ チド配列およびＴＧＦ−β系統群の公知のメンバーを有する前記配列を示す。

ＭはＡまたはＣを意味し；ＳはＣまたはＧを意味し；ＲはＡまたはＧを意味し； かつＫはＧまたはＴを意味する。２ｇは、プライマーＯＤの配列を示し：２ｂは 、プライマー０１Ｄの配列を示す。

本発明は、新規のＴＧＦ−β様蛋白質に関連し、かつ相応する遺伝子中に含まれ るＤＮＡ配列を提供する。

このような配列は、配列。

ＡＴＧＡＡＣＴＣＣＡＴＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＴＣＣＡＣＡおよび ＣＴＴＣＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＣ １殊にＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１および２に記載されたような配列、この配列の対 立遺伝子誘導体およびこの配列の遺伝子コードの結果として退化したＤＮＡ配列 を有するヌクレオチド配列を包含する。また、この配列は、厳しい条件下で上記 のＤＮＡ配列でハイブリッド化されかつ次のアミノ酸配列： Ｍｅｔ−Ａ３ｎ　Ｓｅｒ−Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｐｒ。

−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｔｈｒまたは Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＧＩＹ− Ｔｈｒ を有するＤＮＡ配列を包含する。

この対立遺伝子の退化されかつハイブリッド化される配列は、天然に生じる突然 変異、例えば小さな削除または置換に基づく構造的相違を有することができるの だけれども、この配列は、通常なお本質的に同じく有用な性質を示し、基本的に 同じ医学的用途に使用される。

本発明によれば、′ハイブリッド化”の用語は、常用のハイブリッド化条件、有 利に６２℃〜６６℃で６回のＳＳＣの塩濃度、引き続く６２℃〜６６℃でＳＤＳ 　０．１％、０．６回のＳＳＣで１時間の洗浄の条件を意味する。“ハイブリッ ド化”の用語は、有利に６２℃〜６６℃で４回のＳＳＣの塩濃度、引き続く６２ ℃〜６６℃で５Ｄ５０．１％、０．１回のＳＳＣで１時間の洗浄の厳しいハイブ リッド化条件に帰因する。

コード化蛋白質の重要な生物学的活性は、分裂促進および骨誘発性電位を有し、 かつロバーツ（Ｒｏｂｅ目Ｓ）他、ＰＮＡＳ　７８（１９８１）、５３３９〜５ ３４３、セイジン（Ｓｅｙｅｄｉｎ）他、ＰＮＡＳ　８２　（１９８５）、２２ ６７〜２２７１またはサンパス（Ｓｉｍｐｉｌｈ）およびレンジ（Ｒｅｄｄｉ） 　、　ＰＮＡＳ　７８　（１９８１）、７５９９〜７６０３による検定法で測定 することができる。

本発明の好ましい実施態様は、上記したようなりＮＡ配列であり、かつを推動物 、有利に哺乳類、例えば豚または牛および薩歯動物、例えばラットまたはマウス 、および殊に霊長類、例えばヒトから得ることができる。

本発明の特に好ましい実施態様は、ＳＥＱ　ＩＤＮｏ、１および２に示されてい るようにＭＰ−５２およびＭＰ−１２１を末端に有するＤＮＡ配列である。

ＭＰ−５２の相応する転写は、胎児形成組織およびＢＭＰ様蛋白質の成熟部分に 対して著しくアミノ酸相同性を示す１つの蛋白質のコードから得られた（第１ａ 図、参照）、ＢＭＰ２　（＝ＢＭＰ２Ａ）およびＢＭＰ４　（＝ＢＭＰ２Ｂ）の 蛋白質配列は、ウオズニイ（Ｗ。

＋ｎｅ７）他、５ｃｉｅｎｃｅ第２４２巻、第１５２８〜１５３４頁（１９８８ ）に記載されている。ＢＭＰ　５、ＢＭＰ６およびＢＭＰ　７のそれぞれの配列 は、セレステ（Ｃｅｌｅｓｌｅ）他、Ｐ【ｏｃ、　Ｎ１口、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ第８７巻、第９８４３〜９８４７頁（１９９０）に記載されている 。また、公知のＢＭＰ配列のみに対して特異的である幾つかの典型的な配列の相 同性は、ＭＰ−５２のプロペプチド部分に見い出され、これに対してＭＰ−５２ の前駆物質部分の他の部分は、ＢＭＰ前駆物質に対して著しい相違を示す。ＭＰ −１２１のｍＲＮＡは、肝臓組織内に検出され、その相応するアミノ酸配列は、 インヒビン蛋白質鎖のアミノ酸配列に対して相同性を示す（第１ｂ図、参照）。

ＴＧＦ−β様蛋白質をコード化するｃＤＮＡ配列は、恐らくこの組織中の僅かに 余るＴＧＦ−β特異的転写のために肝臓組織から未だなお分離されなかった。し かし、胎児形成性組織の場合には、公知のＴＧＦ−β様蛋白質をコード化する配 列は、比較的豊富に見い出すことができる。本発明者等は、最近、肝臓中で捕集 されたＴＧＦ−β様蛋白質の存在が十分であることを検出した。この群の公知の 因子に関連したクローンの高い背景レベルにより、前記の組織および恐らく他の 組織から新規のＴＧＦ−βに関連した配列を確立する場合には、大きな困難が存 在する。本発明の場合には、クローン化は、下記に記載した方法により実施され た。ＤＮＡ配列が１回クローン化された場合には、ＴＧＦ−β様蛋白質を生産す ることができる宿主細胞の製造およびこの蛋白質の生産は、蛋白質をコード化す る発現プラスミドを構成させかつ宿主細胞を発現プラスミドで形質転換し、形質 転換体を適当な培地中で培養し、かりＴＧＦ−β様活性を有する生産物を回収す ることからなる公知の組換えＤＮＡ技術を使用することにより容易に達成するこ とができる。

従って、本発明は、場合によっては発現対照配列に結合した、上記したようなり ＮＡ配列を有する組換え分子に関する。このようなベクターは、安定的または過 渡的に形質転換された細胞の場合にＴＧＦ−β様蛋白質を生産するのに有用であ ることができる。幾つかの動物系、植物系、真菌類系および細菌類系は、形質転 換およびその後の培養の方法に使用することができる。有利には、本発明に使用 することができる発現ベクターは、宿主細胞の場合の複製に必要とされる配列を 有し、かつ自己複製可能である。また、形質転換された細胞を容易に選択するこ とができる選択可能な標識遺伝子を含有するベクターを使用することは、有利で ある。必要な操作は、当業者によく知られている。

本発明のもう１つの目的は、本発明の発現プラスミドによって形質転換されかつ ＴＧＦ−β系統群の蛋白質を生産することができる宿主細胞を得ることである。

適当な宿主細胞の例は、穐々の真核細胞および原核細胞、例えばＥ、コリ、昆虫 細胞、植物細胞、哺乳類細胞および真菌類、例えばイースト菌を包含する。

本発明の別の目的は、上記のＤＮＡ配列によってコード化されかつ生物学的特徴 、例えば治療的処置に関連しうる組織誘発性能力、殊に骨誘発性能力および／特 表千７−５０３８４７　（５） または分裂促進能力を示すＴＧＦ−β系統群の蛋白質を得ることである。蛋白質 の上記特徴は、ホモ２量体またはヘテロダイマーの形成に依存して変化すること ができる。このような構造は、臨床的用途に十分に有用であることを証明するこ とができる。ＴＧＦ−β系統群（ＭＰ−５２）の特に好ましいアミノ酸配列は、 ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３に示されている。

本発明のもう１つの見地は、ＴＧＦ−β様蛋白質を生産する方法を得ることであ る。このような方法は、本発明によるＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を適 当な培地中で培養しかつ生産されたＴＧＦ−β様蛋白質を精製することにある。

従って、この方法は、医学的治療またはその実施に増殖因子を必要とする細胞培 養技術を使用する用途への使用に十分な量の所望の蛋白質を生産することができ る。宿主細胞は、細菌類、例えばパシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはエシェリ キア　コリ（Ｅｓｃｌ＋５ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　、真菌類、例えばイース ト菌、植物類、例えばタバコ、ジャガイモまたはアラビドプシス（Ａｒｓｂｉｄ ｏｐｓｉｓ）および動物類、殊にを椎動物細胞系列、例えばＭ　ｏ　−１ＣＯＳ −またはＣＨＯ細胞系列から得ることができる。

本発明のもう１つ別の見解は、重要な組織中の余り豊富でないｍＲＮＡに相応す るＤＮＡ配列を分離するための特に敏感な方法を提供することである。本発明に よる方法は、４つの異なる工程の組み合わせを有する。第１に、ｍＲＮＡは、オ リゴヌクレオチドプライマーを使用する増幅反応で分離されなければならずかつ 使用されなければならない。オリゴヌクレオチドブライマーの配列は、重要な遺 伝子に関連した蛋白質のアミノ酸配列に由来する退化したＤＮＡ配列を有する。

この工程は、重要な遺伝子系統群の既に知られているメンバーの増幅を導くこと ができ、したがってこの望ましくない配列は、除去されなければならない。この 目的は、遺伝子系統群の既に分析されたメンバーを消化することが知られている 制限エンドヌクレーゼを使用することによって達成される。増幅されたＤＮＡ集 団を制限エンドヌクレアーゼで処理した後に、残存する所望のＤＮＡ配列は、ゲ ル電気泳動によって分離され、かつ第３の工程で増幅反応によって再増幅され、 第４の工程でこの配列は、配列決定によって適当なベクター中にクローン化され る。感度および効率を増大させるために、工程は２．３回繰り返して実施され、 少なくとも２回はこの方法の１つの実施態様で実施される。

１つの好ましい実施態様の場合、上記の分離方法は、肝臓組織からのＤＮＡ配列 の分離に使用される。上記方法の１つの特に好ましい実施態様の場合には、ＰＣ Ｒ実験に使用される１つのプライマーは、ｍ　ＲＮ　Ａのポリへの尾と相同のも のである。この方法の異なる工程を実施する場合に使用される技術（例えば、増 幅反応または配列決定技術）は、当業者には知られており、かつ例えばサムプル ツク（Ｓａｍｌ＋ｒｏｏｋ）他、＋９１１９．　”Ｍｏ１ｅｃｕｌｉ＋　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ：　Ａ　ｌ＊ｂｏｒｉｌｏ＋７　ｍ＠ｎｕｉｌ″、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒ ｉｎＨＨｉ＋ｂｏｒ　Ｌａｂｏ＋＊ｌｏ＋７　Ｐｒｅｓｓに記載されている。

本発明の別の目的は、本発明によるＴＧＦ−β系統群の治療的有効量の蛋白質を 含有する製薬学的組成物を提供することである。場合によっては、このような組 成物は、製薬学的に認容性の担持剤を含有する。

このような治療的組成物は、傷の治療および組織の回復ならびに骨、軟骨もしく は歯の欠損の治療に単独でかまたは適当な担持剤との組合せ物で、可能な場合に は他の関連した蛋白質または増殖因子と一緒に使用することができる。従って、 本発明による治療的組成物は、ＭＰ−１２１をコード化する蛋白質と結合したＭ Ｐ−５２をコード化する蛋白質を、場合によっては他の公知の生物学的活性物質 、例えばＥＧＦ　（表皮増殖因子）またはＰＤＧＦ　（血小板由来増殖因子）と −緒に含有することができるが、しかし、これに限定されるものではない。ＴＧ Ｆ−β様蛋白質の別の可能な臨床的適用は、免疫応答のサプレッサーとしての使 用にあり、このことにより、臓器移植の拒絶は回避される。

また、本発明による蛋白質を有する製薬学的組成物は、予防的に使用することも できるし、化粧術のプラスチック外科手術に使用することもできる。更に、この 組成物の適用は、ヒトに限定されるのではなく、動物、殊に家畜類も同様に包含 することができる。

最後に、本発明の別の目的は、本発明による蛋白質に特異的に結合することがで きる抗体または抗体断片にある。このような特異的抗体を増殖させる方法は、一 般に公知である。有利に、このような抗体は、モノクロナール抗体である。この ような抗体または抗体断片は１診断的方法に有用である。

次の実施例は、開示された発明の詳細な説明するものであるが、本発明を限定す るものではない。

例Ｉ ＭＰ−１２１の分離 １．１　全ＲＮＡをチアウィン（Ｃｈｉｒ（ｗｉｎ）他、Ｂｉｏｃｂｅｍｉｓｌ Ｂ　１８　（＋９７９）、５２９４〜５２９９の方法によってヒト肝臓組織（４ ０歳の男性）から分離した。ポリＡ＋ＲＮＡを製造者の教示に従いオリゴ（ｄＴ ）クロマトグラフィーによって全ＲＮＡから分離した（層状遺伝子（Ｓｌｒｕｍ ｇｅｎｅ）ポリ　（Ａ）　ククィックカラム（Ｑｕｉｅｋ　ｃｏｌｕｍｎ）　） 　、１　、２　逆転写反応のために、肝臓組織に由来するポリＡ”　ＲＮＡ（１ 〜２，５μｇ）を５分間６５℃に加熱し、かつ迅速に氷上で冷却した。

ポリ　（Ａ”）ＲＮＡ　１ｐｇ当たりＲＮＡガード２７Ｕ　（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）　、オリゴｄ　（Ｔ）　１２〜＋１１２．５ｐ　ｇ、緩衝液５回（トリス／ ＨＣＩ　２５０ｍＭ　ｐ）（ｓ。

５　；ＭｇＣｌ２５０ｍＭ；ＤＴ７５０ｍＭ；それぞれｄＮＴＰ５ｍＭ；ＫＣＩ 　６００ｍＭ）および鳥類の骨髄芽球ウィルス逆転写酵素２０単位（＾ＭＹ、　 Ｂｏｅｈｒｉｎにｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を添加した。この反応混合物（２５ μｌ）を４２℃で２時間インキュベートした。肝臓ｃＤＮＡプールを一２０’Ｃ で貯蔵した。

１．３　増幅反応を準備するために設計したデオキシヌクレオチドプライマーＯ ＤおよびＱＩＤ　（第２図）を自動ＤＮＡ合成装置で発生させた（バイオサーチ ）。

変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動および等速電気泳動によるゲルからの主要 バンドの分離によって精製を行なった。オリゴヌクレオチドを、ＴＧＦ−β系統 群の幾つかの公知のメンバーの核酸配列を配列させかつ最も高度の保存領域を選 択することによって設計した。この領域の配列は、第２図に示されている。クロ ーン化を簡易化するために、双方のオリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩ制限部位 を含有し、かりＯＤは、付加的に５−末端でＮｃｏ　Ｉ制限部位を含有していた 。

１．４　ポリメラーゼ鎖反応の場合には、肝臓に由来するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプール を反応混合物５０μｍ中の鋳型として使用した。増幅をＰＣＲ緩衝液１回（（Ｎ Ｈ４）　ｚ３０４　１６．６ｍＭ；　トリス／ＭＣＩ　６７ｍＭ。

ｐＨ８，８；ＭｇＣ１２２ｍＭ：　ＥＤＴＡ６．７ｍＭ：β−メルカプトエタノ ール１０ｍＭ：Ｂ５Ａ１７０μｇ／ｍ　１　（Ｇｉｂｃｏ）　）　、それぞれｄ 　Ｎ　Ｔ　Ｐ　２００　ｐ　Ｍ（Ｐｈｓ＋＋ｏｓｃｉｓ）　、それぞれオリゴヌ クレオチド３０ｐｍｏｌ（ＯＤおよび０ＩＤ）およびＴａｑポリメラーゼ１．５ 単位（Ａ＋ａｐｌｉＴａｑ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌ＋ａｅ＋　Ｃｅ＋ｕｓ）中で 実施した。ＰＣＲ反応は、出発物質としてのポリ　（Ａ”）ＲＮＡ３０ｎｇに相 当するｃＤＮＡを包含した。

この反応混合物をパラフィンで被覆し、ＰＣＲの４０の作業周期（作業周期１： ９３℃　８０秒１５２℃４０秒／７２℃　４０秒：作業周期２〜９：９３℃６０ 秒１５２℃　４０秒／７２℃　４０秒；作業周期１０〜２９：９３℃　６０秒１ ５２℃　４０秒／７２’Ｃ６０秒；作業周期３０〜３１：９３℃　６０秒１５２ ℃　４０秒／７２℃　９０秒；作業周期４０：９３℃　６０秒１５２℃　４０秒 ／７２℃　４２０秒）を実施した。６つのＰＣＲ反応混合物をプールし、等量の フェノール、フェノール／クロロホルム（１：　１（Ｖ／Ｖ））およびクロロホ ルム／イソアミルアルコール（２４°１（ｖ／ｖ））を用いてのその後の抽出に よって精製し、かつエタノール沈殿によって濃縮した。

１．５　得られたＰＣＲブールの最初の半分は、制限酵素Ｓ　ｐ　ｈ　Ｉ　（Ｐ ｈａｒｏ＋ａｃｉｓ）およびＡｌｗＮＩ（Ｂｔｏｌｉｂｓ）を用いる消化にとっ て十分なものであった。

このＰＣＲプールの第２の半分を制限酵素ＡｖａＩ（ＢＲＬ）　、　ＡＩｗＮ　 Ｉ　（Ｂｉｏｌｓｂｓ）およびＴｆｉＩ　（Ｂｉｏｌｓｂｓ）によって一連の反 応で消化させた。

制限エンドヌクレアーゼの消化を、製造者によって推奨された緩衝液中で２〜１ ２時間の反応でそれぞれの酵素８単位を使用することにより、３７℃（６５℃で のＴｆｉ　Ｉを除く）で１００μｌで実施した。１゜６　それぞれＤＮＡ試料を 、トリス硼酸塩緩衝液（トリス塩基８９ｍＭ、硼酸８９ｍＭ、ＥＤＴＡ２ｍＭ、 ｐＨ８）中のアガロースゲル４％（ＦＭＣＮｕｓｉｅｖｅアガロース３％、Ｂｉ ｏｘ７ｍおよびアガロース１％、ＢＲＬ）を使用することにより電気泳動によっ て分別した。その後に、切断されていない増幅生成物を染色するエチジウムプロ ミド（約２００ｂｐ；サイズ標識を同時に流した）をゲルから除去し、かつフェ ノール抽出によって分離した°等量のフェノールを除去したアガロースに添加し 、これを小片に切断し、１０分間凍結させ、渦動させ、かつ遠心分離した。水相 を捕集し、中間相を等量のＴＥ緩衝液で再抽出し、遠心分離し、双方の水相を合 わせた。更に、ＤＮＡを２回フェノール／クロロホルムで抽出することによって 精製し、かつ１回クロロホルム／インアミルアルコールで抽出することによって 精製した。

１．７　エタノールの沈殿の後、分離したＤＮＡの４分の１または５分の１を、 １３までの作業周期の数を減少させることを除いて最初の増幅に使用したのと同 じ条件を使用して再増幅させた（作業周期１：９３℃８０秒１５２℃　４０秒／ ７２℃　４０秒；作業周期２〜１２：９３℃　６０秒１５２℃　４０秒／７２℃ 　６０秒：作業周期１３　：　９３℃　６０秒１５２℃４０秒／７２℃　４２０ 秒）。再増幅した生成物を精製し、上記と同じ酵素で制限させ、切断されていな い生成物を増幅生成物について上記したようにアガロースゲルから分離した。再 増幅。引き続く制限およびゲル分離を１回繰り返した。

１．８　ゲルからの前記分離の後、増幅生成物を製造者によって推奨される緩衝 液を使用することにより３７℃で２時間ＥｃｏＲＩ　４単位（Ｐｈａ＋ｍａｃｉ ｓ）によって消化した。制限混合物の４分の１を、同様にＥｃｏＲＩによって消 化されたベクターｐブルースクリプ１−ＩＩ　ＳＫ”（層状遺伝子（Ｓ＋ｒｕｉ ｇｅｎｅ）　）に結合させた。結合後、それぞれの酵素組合せ物からのクローン ２４個をさらに配列分析によって分析した。

ＡＩｗＮＩおよびｓｐｈ　Ｉによって制限された試料は、新規の配列を含有して おらず、ＢＭＰ６およびインヒビンβＡ　配列のみを含有していた。ＭＰ−１２ １と名付けられた１９個の同一の新規配列は、Ａｖａ　１．ＡｌｗＮ　Ｉおよび Ｔｒｉ　Ｉ制限試料によって見い出された。１つの配列は、２個のヌクレオチド 交換によって前記の主として見い出された配列とは異なるものであった。Ｅ、コ リ　ＨＢ　１０１の場合の結合反応および形質転換を、サムプルツク（Ｓｓ＋ａ ｂｒｏｏｋ）他、Ｍｏ１ｅｃｕｌｉ＋　ｅｌｏｎｉｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｌｏ ＋７　ｍｘｎｕｘｌ　（１９８９）の記載と同様に実施した。形質転換体をアン ピシリン特表千７−５０３８４７　（７） 耐性によって選択し、プラスミドＤＮＡを標準プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他 （１９８９）　）に従い分離した。分析を配列決定キット’５ｅｑｕｅｎａｓｅ 　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０″　（Ｕｎｉｌｅｄ　５ｌａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｃｉ ａ、１ｃａｌ　Ｃｏ＋ｐｏｒａ＋１ｏｎ）を用いて“ジデオキシリボヌクレオチ ド鎖末端配列決定”によって二重鎖プラスミドを配列決定することによって行な われた。

クローンをフローマン（Ｆ＋ｏｈｍｉｎ）　（Ａ＋ａｐｌｉｆｉｔｓｌｉｏｎｓ 、　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ社刊、第５版（１９９０）、第１１〜１５頁）に よって詳細に記載された方法によってＣ−ＤＮＡの３−一末端の完全形にした。

ＭＰ−１２１の第１の断片の分離に使用された同じ肝ＩＩ　ｍ　ＲＮ　Ａを、ア ダプタープライマー（ＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　ＣＧ 　Ａ　ＣＧ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｃ（Ｔ　）　＋　ｅ　）に結合したオリゴｄＴ（１６ 個の残基）からなるプライマーを使用することによって逆転写した。増幅をＭＰ −１２１のアダプタープライマー（ＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣ ＧＡＣＧ）および内部プライマー（ＧＧＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧ ＣＡＴＡ）を使用することにより実施した。増幅生成物をＭＰ−１２１の巣を形 成した（ｎｅｓｔｅｄ）内部プライマー（ＡＣＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＣＴ ＧＧＴＡＴＴＧ）およびアダプタープライマーを使用することにより再増幅した 。再増幅された生成物を同様に制限されたベクターｐ　Ｔ　７　／　Ｔ　３　（ Ｐｈａ＋ｍ５ｃｉａ社）の場合にＳｐｈ　Ｉを用いて制限後にクローン化し、か つ配列決定キット”５ｅｑｕｅｎｓｓｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０”　（Ｕｎｉ ｔｅｄ　ＳＩＮｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を用 いて配列決定した。

クローンは、公知のＭＰ−１２１配列の３′末端への配列の重なりによって特徴 付けられた。

例２ ＭＰ−５２の分離 池のｃＤＮＡ配列、ＭＰ−５２を、上記方法（例１）に従いヒトの胎児（生後８ 〜９週間）の組織からのＲ出発物質としてのポリ　（Ａ”）ＲＮＡ２０ｎｇに相 当するｃＤＮＡを包含していた。再増幅工程を双方の酵素組合せ物に対して２回 繰り返した。結合後、それぞれの酵素組合せ物からのクローン２４個をさらに配 列分析によって分析した。ＡｌｗＮＩおよび５ｐｈｌによって制限された試料は 、ＭＰ−５２ＴＯ名付けられた新規の配列を生じた。Ａｖａ　Ｉ、Ａ　ｌ　ｗ　 ＮＩおよびＴｆｉ　Ｉによって制限された試料は、新規の配列を含有せずに、主 としてＢＭＰ７および若干のインヒビンβＡ配列から構成されていた。

クローンを上記方法（例１）に従い３′−末端の完全形にした。ＭＰ−１２１の 第１の断片の分離に使用された同じ胎児ｍ　ＲＮ　Ａを例１の記載と同様に逆転 写した。増幅を、アダプタープライマー（ＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧ ＧＴＣＧＡＣＧ）および内部プライマー（ＣＴＴＧＡＧＴＡＣＧＡＧＧＣＴＴＴ ＣＣＡＣＴＧ）を使用することにより実施した。増幅生成物を巣を形成した（ｎ ｅｓｔｅｄ）アダプタープライマー（ＡＴＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡ ＣＧＡＡＧ）および巣を形成した（ｎｅｓｔｅｄ）内部プライマー（ＧＧＡＧＣ ＣＣＡＣＧＡＡＴＣＡＴＧＣＡＧＴＣＡ）を使用することにより再増幅した。再 増幅した生成物を同様に制限ベクター（独特のＮｃｏ　Ｉ制限部位を有する変化 した多重クローン化部位を有するｐＵｃ１９　（Ｐｈ暑「ＩＩＩ暑ｃｉｓ　Ｎｏ 、２７−４９５１−０１）　）で制限した後にクローン化し、かつ配列決定した 。クローンは、公知のＭＰ−５２配列の３′末端への配列の重なりによって特性 決定された。これらのクローンの幾つかは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に示された 配列の３−末端の最後の１４３番目の対塩基および０．５６ｋｂの３′非翻訳領 域（図示されていない配列）を有する。これらのクローンの１つを、アウスユー ベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他（Ｃ＋＋＋＋ｅｎｌ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａ「Ｂｉｏｌｏｇ７．　Ｇｒｅｅｎ　ｐｕｂｌｉｓｈｉｎＩＡｓｓ ｏｃｉｓｔｅｓ　＊ｎｄ　１ｉｌｅｙ−１＋＋ｅｔｓｃｉｅｎｃｅ　刊（］９８ ９））によって詳細に記載された一般的方法によりヒトのゲノムライブラリー（ 層状遺伝子（Ｓ口ａｔｉｇｔｎｔ）　Ｎｏ、９４６２０３）をスクリーニングす るための試料として使用した。λフアージ８Ｘ］、Ｏ’から、約２０ｋｂの挿入 断片を有することが証明された１つのファージ（λ２．７．４）を分離し、かつ ＤＳＭ（Ｎｏ。

７３８７）に寄託した。このクローンは、ｍ　ＲＮ　Ａから分離された配列以外 に記載された増幅方法によってさらに５′末端に対する配列形成を有する。配列 の分析のために、約７．５ｋｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片を同様に制限ベクター（ ＢＩｕｅｓｃ＋ｉｐｌ　ＳＫ、層状遺伝子（Ｓ＋＋ａ＋Ｂｅｎｅ）Ｎｏ、２１２ ２０６）中でサブクローン化した。また、ＳＫＬ　５２（Ｈ３）ＭＰ１２と呼ば れる前記プラスミドをＤＳＭ　（Ｎｏ、７３５３）に寄託した。このクローンに 由来する配列形成は、５ＥＱＩＤ　ＮＯ：１に示されている。ヌクレオチドＮｏ 。

１０５０について、測定されたｃＤＮＡおよびそれぞれのゲノム配列は、１つの 対塩基によって区別される（　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　：　Ｇ　；ゲノムＤＮＡ　：　 Ａ）、ｍＲＮＡ調製に使用された胎児組織からの増幅されたゲノムＤＮＡの配列 決定によって確認されるように、ゲノム配列は正確であると思われる。ゲノムＤ ＮＡは、ＳＥＱ　ＩＤＮ０：１の対塩基３３２と３３３との間に約３ｋｂのイン トロンを有する。イントロンの配列は、図示されていない、正確なエクソン／エ クソン結合は、この領域を有するｃＤＮＡに由来する増幅生成物を配列決定する ことによって確認された。この配列情報は、フローマン（Ｆτｏｈｍ＠ｎ）　（ Ａ＋ａｐ１口１ｃａｌｉｏｎｓ、　Ｐｅ＋ｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｔ社刊、第５版（１ ９９０１，第１１〜１５頁）によって詳細に記載された僅かに変えられた方法に より得ることができる。ＭＰ−５２の３−末端の分離に使用された同じ胎児ＲＮ Ａを、５′方向（ＡＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＡＣＴ）に方向を 定めたＭＰ−５２配列の内部プライマーを使用することにより逆転写した。ポリ Ａの尾を、末端トランスフェラーゼを使用することによって第１の鎖ｃＤＮＡの ５−に追加した。２つの工程の増幅を第１にオリゴｄＴからなるプライマーおよ びアダプターブライマー（ＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧ ＡＡＧＣ（Ｔ１６）　”Ｉ　を適用し、かつ第２にＭＰ−５２のアダプターブラ イマー（ＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧ）および内部プラ イマー（ＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＣＴＴＣＴＣＣ）を適用することによって 実施することができる。増幅生成物を同じアダプターブライマーおよびＭＰ−５ ２配列の巣を形成した（ｎｅｓｔｅｄ）内部プライマー（ＴＣＣＡＧＧＧＣＡＣ ＴＡＡＴＧＴＣＡＡＡＣＡＣＧ）を使用することにより再増幅させた。従って、 再増幅生成物を、巣を形成した（ｎｅｓｔｅｄ）アダプターブライマー（ＡＴＴ ＣＧＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＡＧ）およびＭ　Ｐ　−５２配列の巣 を形成した（ｎｅｓｌｅｄ）内部プライマー（ＡＣＴＡＡＴＧＴＣＡＡＡＣＡＣ ＧＴＡＣＣＴＣＴＧ）を使用することにより再び再増幅させた。

最終的に再増幅された生成物は、ＥｃｏＲＶで制限されたベクター（ブルースク リプト　ＳＫ、層状遺伝子（Ｓ＋＋ａ＋ａｇｅｎｅ）　Ｎ　ｏ　、２１２２０６ 　）中でクローン化された平滑断片でおった。クローンは、λ２，７．４のＤＮ Ａに対する配列の重なりによって特性決定された。

プラスミド　ＳＫＬ　５２　（Ｈ３）ＭＰ１２は、１９９２年１２月１０日付け で番号７３５３でＤＳＭ（ＤＣｕｌｓｃｈｃ　Ｓａａ＋ｍ１ｕｎ！マｏｎ　Ｍｉ ｋ＋ｏｏｒ（ｘｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　２ｅｌｌｋｕｌｌｕ＋ｅｎ）　、３３０ ０　Ｂ＋ａｕｎｓｃｈｖ’ｅｉｇ、　Ｍａｓｅｈｅ＋ｏｄｅ＋　Ｗｅｇ　ｌｂに 寄託された。

ファージλ２．７．４は、１９９３年１月１３日付けで番号７３８７でＤＳＭに 寄託された。

舒ＱＤ）Ｎｏ＝１ 配列型　ヌクレオチド 配列長さ１２０７傭の対塩基 鎮状　二本 形部：＃Ｉ状 分子型°ＤＮ＾ 起算 有機体　ヒト 即呻寓峡譚、胎ｙｔＡｌ麿 性質°ヒトＴＧＦ−βｌｌＷ白質をコード化する配列＋ＭＰ−５２＋ ！　１２０７ ｇｎユｌ■臣］ 配列型：ヌクレオチド 配列長さ：２６５−の対塩基 形態　線状 分子型ＣｍＲＮ＾に対するｃＤＮ＾ 起［ 有１ｍ＃Ｅ、ヒト 即時寓験諏：肝ｉ＊ａａ歳 性質：ヒトＴＧＦ−β様蛋白質（ＭＰ−１２１）Ｎ刀ｍ’ｍαｎ　ＧｒＩ％　２ ６５ はｎ１１瓦と」 起源 性質　ヒトＴＧＦ−７１４１１１白買（ＭＰ−５２１ｆｌ　ＬＳＰＩＳＩＩＦＤ ）　Ｑ　［Ｒ４０１Ｆｉｃｙｕｒｅ　１ａ ＨＰ　５２　Ｃ３ＲＫｋＬＨＶＮＦ　ＫＤＭＧＷＤＤＷＩＩ　ＡＰＬＥＹＥＡＦ ＨＣＥＧＬＣＥＦＰＬＲ５ＨＬＥＰＴＩＪ１４ＡＶＩＢＭＰ　２　ＣＫＲ）ｌＰ ＬＹＶＤｒ　５ＤＶＧＷＮＤＷＩＶ　ＡＰＰＧＹ）ＩＡＦＹｃ　）ｌＧＥｃＩ’ ＦＰＬＡＤ　Ｉ（ＬＮＳＴＮＨＡ窒u Ｂ澄　４　ＣＲＲ）ｌｓＬＹＶＤｒ　５ＤＶＧＷＮＤＷＩＶ　ＡＰＰＧＹＱＡｒ ＹＣＨＧＤＣＰＦＰＬＡＤ　）ＩＩＪＪＳＴＮ）ＩＡＩＶＢ！　５　ＣＫＫＨＥ ＩＪＶＳｒ　Ｐ、ＤＬＧＷＱＤＷＩ工　）−”ＥＧＹＡＡＦ’ＹＣＤＧＥＣ５ｒ ＰＬＮＡ　ＨＭＮＡＴＮＨＡＩＶｌｌＭＰ　６　ＣＲＫ）ｌＥＬＹＶｓｒ　ＱＤ ＬＧＷＱＤＷＩｒ　ＡＰＫＧＹＡＡＮＹＣＤＧＥＣ５ｒＰＬＮＡ　ｌ（ＭＮＡＴ Ｎ）ＬＡＩＶＢＭＩ！’　７　ＣＫＦＪＩＥＬＹＶＳＦ　ＲＤＬＧＷＱＤＷＩＩ 　ＡＰＥＧＹＡＡＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬＮＳ　ＹＭＮＡＴＮＨＡＩＶＭＰ　５ ２　ＱＴＬＭＮＳＭＤＰＥ　ＳＴ？ＰＴＣＣＶ？Ｔ　ＲＬＳＰＩＳＩＬＦＩ　Ｄ ＳＡＮＮＷＹＫＱ　ＹＥＤＭＷＥＳＣＧ　ＣＲＴＤＣＰ　２　ＱＴＬＶＮＳＶＮ Ｓ−ＫＩＰＫＡＣＣＶＰＴ　ＥＬＳｋＸＳＨＬＹＬ　ＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮ　Ｙ ＱＤＭＶＶＥＧＣＧ　ＣＲＩＤｆｆ　４　ＱＴＬｖＩＪＳＶＮＳ−５ＩＰＫＡＣ ＣＶＰＴ　ＥＬＳＡＩＳＭＬＹＬ　ＤＥＹＤＫＶＶＬＫＮ　ＹＱＥＭＩＡ’ＥＧ ＣＧ　bＲ ｌｌＭＰ　５　ＱＴＬＶＨＩＪｆｆＰＤ　ＨＶＰＫＰＣＣＡＰＴ　ＫＬＨＡＩＳ ＶＬＹｒ　ＤＤＳ５ＮＶ工ＬＫＫ　ＹＲＮＭＷＲ５ＣＧ　Ｃg ＢＫＰ　６　ＱＴＬＶＨＬＭＮＰＥ　ＹＶ？ＫＰＣＣＡＰＴ　ＫＬＮＡＺＳＶＬ ＹＦ　ＤＤＮＳＮＶＩＬＫＫ　ＹＲＮＭＷＲＡＣＧ　Ｃ）４ａＭＰ　７　ＱＴＬ ＶＭＦＩＮＰＥ　ＴＶＰＫＰＣＣｋ？Ｔ　ＱＬ＋？Ａｌ５ＶＬＹＦ　ＤＤＳＳＮ Ｖ！ＬＦ、に　ＹＲＮＭ’ｌ八［ＣＧ　bＨ Ｆｌａｕｒｅ　＋ｂ ）ｆｆ１２Ｘ　ＺＯＰＥＧＹＡＭＮＦ　ＣＨ；ＱＣＰＬＨＸＡ　Ｇ１４ＰＧＩ八 ＡＳＦＨＴＡＶＬＮＬＬＫＡＮ　ＴＡＡＧＴＴＧＧＧＳＩｎｈｉｂβＡ　ＩＡＰ ＳＧＹＨＡＮＹ　ＣＥＧＥＣＰＳ１４１Ａ　ＧＴＳＧ５ＳＬＳＦ’ＨＳＴＶＩＮ ＨＹＲＭＲＧＨ５ＰＦＡＮＬＫＳＩｎｈｉｂｐ！＋　！ＡＰＴＧＹＹＧＮＹ　Ｃ ＥＧＳＣＰＡＹＬＡ　ＧＶＰＧＳＡＳＳｒｌｌ　ＴＡＶＶ）ＪＱＹＲＭＲＧＬＮ Ｐ−ＧＴ■Ｓ工ｒｓｈｉＪ３ｃｔ　ＶＹＰＰＳｒｌＦＨＹ　ＣＨＧＧＣＧＬＨＩ Ｐ　−−−−ＰＨＩ、ＳＬＰ　ＶＰＧＡＪ’ＰＴＰＡＱ　ＰＹＳＬＬＰＧ`ＱＰ ＩｎｈｉｂβＡ　ＣＣ−−Ｖ？ＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧ　ＱＮＩＸＫＫＤ −ＸＱ　ＮＭＩ’ＶＥＥＣＧＣ５工ｎｈｉｂｐＢ　ＣＣ−−ＩＰＴＫＬＳ　ＴＭ ５ＭＬＹＦＤＤＥ　ＹＮ工ＶＫＲＤ−ｖＰ　ＮＭＩＶＥＥＣＧＣＡＩｚｍｉｂ（ Ｘ　ＣＣＡＡＩ、ＰＧＴＭＲＰＬＨＶＲＴＴＳＤＧ　ＧＹＳＦＫＹＥＴＶＰ　Ｎ ＬＬＴＱＨＣＡＣ！＋１″　今會＋　＋＋＋＋＋＋＋◆　＋＋◆倫　◆　＋◆　 ＋　今＋　彎十−十乙！忠ｌ」１ ９！辺ｌ−次 手続補正書 平成６年１０月７日

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．次の群： （ａ）ヌクレオチド： 【配列があります】 を有するＤＮＡ配列 （ｂ）ヌクレオチド： 【配列があります】 を有するＤＮＡ配列 （ｃ）（ａ）および（ｂ）のＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果として変性さ れているＤＮＡ配列（ｄ）（ａ）および（ｂ）のＤＮＡ配列の対立遺伝子誘導体 （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の場合のＤＮＡ配列にハイブリッド 化しかつアミノ酸配列【配列があります】 または 【配列があります】 を含有する蛋白質をコード化するＤＮＡ配列（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）また は（ｄ）の場合のＤＮＡ配列にハイブリッド化しかつ木質的に同じ生物学的性質 を有する蛋白質をコード化するＤＮＡ配列 から選択されるＴＧＦ−β系統群の蛋白質をコード化するＤＮＡ配列。
2. ２．脊椎動物ＤＮＡ配列、哺孔類ＤＮＡ配列、有利に霊長類、ヒト、ブタ、ウシ または有利にラットおよびマウスＤＮＡ配列を含めて■歯類ＤＮＡ配列である、 請求項１記載のＤＮＡ配列。
3. ３．ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示したようにヌクレオチドを有するＤＮＡ配列である 、請求項１または２に記載のＤＮＡ配列。
4. ４．ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示したようにヌクレオチドを有するＤＮＡ配列である 、請求項１または２に記載のＤＮＡ配列。
5. ５．請求項１から４までのいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を有する組換えＤＮ Ａ分子。
6. ６．ＤＮＡ配列が発現対照配列に機能的に結合している、請求項５記載の組換え ＤＮＡ。
7. ７．請求項５または６に記載の組換えＤＮＡ分子を含有する宿主。
8. ８．細菌類、真菌類、植物細胞または動物細胞である、請求項７記載の宿主。
9. ９．ＴＧＦ−β系統群の蛋白質を生産するための方法において、請求項７または ８に記載の宿主を培養し、ＴＧＦ−β蛋白質を培地から回収することを特徴とす る、ＴＧＦ−β系統群の蛋白質を生産するための方法。
10. １０．請求項１から４までのいずれか１項に記載のＤＮＡ配列によってコード化 されたＴＧＦ−β系統群の蛋白質。
11. １１．ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列を有する、請求項１０記載の蛋白質。
12. １２．場合によっては製薬学的に認容性の担持剤との組合せ物である、請求項１ ０または１１に記載のＴＧＦ−β系純群の蛋白質を含有する製薬学的組成物。
13. １３．種々の骨、軟骨または歯の疾患の治療、ならびに傷および組織の治癒への 使用のための請求項１２記載の製薬学的組成物。
14. １４．ｃＤＮＡ断片を生産する方法において、ｍＲＮＡを１つの組織から精製し 、プライマーとしての変性した関連したオリゴヌクレオチドを使用することによ り所望の配列を増幅させ、所望のｃＤＮＡ配列を、制限酵素を使用して望ましく ない増幅されたｃＤＮＡ配列を消化させることによって選択し、保存したｃＤＮ Ａ断片を増幅させ、場合によってはＤＮＡ配列を測定することを特徴とする、ｃ ＤＮＡ断片を生産する方法。
15. １５．請求項１０または１１に記載の蛋白質に対して特異的に結合することがで きる抗体または抗体断片。
16. １６．モノクロナール抗体である、請求項１５記載の抗体または抗体断片。
17. １７．診断的方法のための請求項１５または１６に記載の抗体または抗体断片の 使用。