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PT1802291E - Miméticos conformacionais de péptidos à base de calixareno, métodos de utilização e métodos de preparação - Google Patents

Miméticos conformacionais de péptidos à base de calixareno, métodos de utilização e métodos de preparação Download PDF

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PT1802291E
PT1802291E PT05817221T PT05817221T PT1802291E PT 1802291 E PT1802291 E PT 1802291E PT 05817221 T PT05817221 T PT 05817221T PT 05817221 T PT05817221 T PT 05817221T PT 1802291 E PT1802291 E PT 1802291E
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PT
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calixarene
mmol
quot
based peptide
composition
Prior art date
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PT05817221T
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English (en)
Inventor
Thomas R Hoye
Kevin H Mayo
Xuemei Chen
Original Assignee
Univ Minnesota
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Description

1
DESCRIÇÃO "MIMÉTICOS CONFORMACIONAIS DE PÉPTIDOS À BASE DE CALIXARENO, MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO E MÉTODOS DE PREPARAÇÃO"
ANTECEDENTES Péptidos de desintegração de membranas bacterianas, originários de péptidos catiónicos de ocorrência natural, oferecem alternativas promissoras como antibióticos do futuro. Estes novos agentes demonstram geralmente um largo espetro de atividade antibacteriana e atuam por destruição da integridade de toda a membrana celular bacteriana, desse modo reduzindo o risco de resistência a fármacos (M.L. Cohen, Science 257, 1050-55 (1992); e A. M. D. Virk et al., Mayo Clinic Proc. 15_, 200-214 (2000) . Os péptidos antibacterianos têm duas principais caracteristicas distintivas: uma carga positiva liquida, tipicamente desde +2 até +6, e um dobramento anfipático global que confere à molécula faces polares e hidrófobas (A. Giangaspero et al., Eur. J. Biochem. 2 68, 5589-5600 (2001) . A natureza catiónica de péptidos antibacterianos aparentemente promove a interação seletiva com a superfície de carga negativa de membranas bacterianas relativamente à superfície mais neutra de membranas eucarióticas (K. Matsuzaki et al., Biochemistry 3_6, 9799-9806 (1997). Depois de ser atraido para a superfície, o péptido, com a sua topologia anfipática, desencadeia a lise de células bacterianas (D. Andreu et al. Biochemistry 2_4, 1683-1688 (1985) .
Sepsia e choque sético são complicações sistémicas normalmente associadas a níveis aumentados da endotoxina lipopolissacárido (LPS) na corrente sanguínea. É conhecido que muitos péptidos bactericidas in vitro se ligam e 2 neutralizam LPS (por exemplo, cecropinas, magaininas, péptidos ricos em prolina-arginina, sapecina, taquiplesina e defensinas) (Andreu et al., Biopolymers, Al_; 415-33 (1998)), bem como, mais recentemente, péptidos βρθρ (Mayo et ai., Protein Sei., 5; 13001-1315 (1996); Mayo et al., Biochem. Bíophys. Acta, 1425; 81-92 (1998)). SC4 (Mayo et ai., Biochem. J., 349(3); 717-28 (2000)) e péptido à base de lactoferrina LF11 (Japelj et ai., J. Biol. Chem., 280; 16955-61 (2005)). Talvez o mais prototípico seja polimixina B (PmxB), um pequeno lipopéptido cíclico (Rifkind, J. Bacteriol., 93_; 1463-4 (1967)) . No entanto, devido à sua elevada neuro- e nefrotoxicidade, o PmxB está limitado a aplicação tópica, e a maior parte dos outros agentes bactericidas não é muito eficaz contra LPS in vivo.
Algumas proteínas bactericidas de ocorrência natural também possuem atividades neutralizadoras de endotoxinas. Também foram identificados vários destruidores de membranas não peptídicos (Lockwood et al., Drugs of the Future 2_8, 911-923 (2003). O mais predominante destes é a esqualamina, que é anfipático não pela natureza da sua estrutura dobrada mas pela presença de apêndices com carga (incluindo a triamina policatiónica) num núcleo esteroide (Moore et al. Proc Natl. Acad. Sei. USA 9_0, 1354-1358 (1993) . 0 mecanismo bactericida da esqualamina, apesar da sua pequena dimensão, é semelhante ao de péptidos de desintegração de membranas (Selinsky et al. , Biochim. Biophys. Acta 1370, 218-234 (1998); Selinsky et al., Biochim. Biophys. Acta 1464, 135-141 (2000)).
Uma análise estrutural destes péptidos revela que, independentemente da sua conformação dobrada, sobressaem duas características que são importantes para a ligação de 3 LPS: carácter antipático e uma carga positiva liquida (Lockwood et al., Drugs of the Future, 2_8; 911-923 (2003)) . Presumivelmente, resíduos com carga positiva do péptido promovem a interação com grupos de carga negativa em LPS, isto é, fosfatos nas glucosaminas lípido A e/ou aqueles presentes na unidade polissacarídica de núcleo interno, ao passo que resíduos hidrófobos do péptido interagem com cadeias acilo no lípido A. Estudos estruturais de péptidos em complexo com LPS suportam esta noção e têm proporcionado discernimento adicional quanto às origens moleculares da neutralização de LPS mediada por péptidos (Japelj et ai., J. Biol. Chem., 280; 16955-61 (2005); Ferguson et ai.,
Science, 2 82; 2215-20 (1998); Pristovsek et al., J. Med.
Chem., 4_2; 4604-13 (1999)). É interessante notar que o motivo de uma estrutura antipática de carga positiva (principalmente folha β antiparalela) também se encontra nalgumas proteínas e péptidos que funcionam como agentes antiangiogénicos (Dings et ai., Angiogenesis, _6; 83-91 (2003)) . Por exemplo, a angiostatina dobra-se numa estrutura em folha β antiparalela com um sítio de ligação rico em lisina altamente eletropositivo (Abad, J. Mol. Biol., 318; 1009- 17 (2002)). A endostatina tem uma estrutura predominantemente em folha β antiparalela (Hohenester et al., EMBO J., 1_7; 1656-1664 (1998)) e tem carga altamente positiva, particularmente devido à presença de múltiplos resíduos arginina. A angiogénese, o processo de formação de novos vasos sanguíneos, é chave para o desenvolvimento normal de órgãos, bem como para várias perturbações patológicas como cancro, artrite, endometriose, retinopatia diabética e restenose (Griffioen et al., Pharmacol. Rev., 52; 237-68 (2000)). A utilização de agentes que consigam 4 inibir a angiogénese, particularmente em investigação antitumoral, tem indicado que a terapia antiangiogénica é uma modalidade terapêutica promissora (Boehm et al., Nature, 390; 404-7 (1997).
Aproximadamente na última década, investigadores começaram a desenvolver péptidos modificados ou totalmente sintéticos (Sitaram et al., Int. J. Pept. Protein Res. 4_6, 166-173 (1995); Saberwal et al. , Biochlm. Bíophys. Acta 984, 360-364 (1989); Tossi et al., Eur. J. Biochem. 250, 549-558 (1997); Blondelle et al., Antimicrob. Agents Chemother. 40, 1067-1071 (1996); Dathe et al., Biochlm. Bíophys. Acta 14 62, 71-87 (1999); e Beven et al., Eur. J. Biochem. 270, 2207-2217 (2003)). Alguns péptidos anfipáticos resultantes exibem ampla atividade bactericida promissora e especificidade para bactérias em vez de células eucarióticas (R. E. Hancock, Lancet 349, 418-422 (1997); Hancock et al., Adv. Microb. Physiol. 37, 135-175 (1995).
Pouco foi feito para conceber compostos topomiméticos não peptidicos que imitem uma porção da superfície de uma proteína ou péptido. Ainda são necessários compostos topomiméticos adicionais.
RESUMO A presente invenção é dirigida a uma classe de compostos topomiméticos que proporcionam uma variedade de atividades biológicas. Estes compostos topomiméticos incluem miméticos de péptidos que empregam um esqueleto orgânico e grupos particulares para modelar as características de superfície de moléculas bioativas existentes. A utilização de um esqueleto orgânico permite a preparação de compostos que têm uma variedade de atividades biológicas e propriedades farmacocinéticas potencialmente superiores. Esta classe de 5 compostos inclui miméticos de péptidos à base de calixareno. Foi preparada uma biblioteca de miméticos de péptidos à base de calixareno, e é mostrado aqui que possuem atividade biológica (por exemplo, atividade bactericida; atividade antiangiogénica, e/ou atividade antitumoral).
Um aspeto da presente invenção assenta na capacidade para capturar de modo mais completo as conformações dobradas de pequenos segmentos da topografia de proteínas (por exemplo, hélice e folha beta), exemplificadas em dois péptidos (βρθρ-25 e SC4) com atividades biológicas um pouco diferentes, empregando calixareno num método de abordagem à base do esqueleto. Vantajosamente, uma biblioteca à base de calixareno de compostos análogos pode ser empregue para pesquisar atividades noutros sistemas, de modo que a atividade biológica possa ser imitada.
Em conformidade, num aspeto, a presente invenção proporciona os itens seguintes: 1. Um método in vitro para inibir a angiogénese, cujo método compreende contactar células com uma quantidade de uma composição eficaz para inibir a angiogénese, em que a composição compreende um mimético de péptido à base de calixareno selecionado dos seguintes:
NHS H composto 27 composto 40 6 ou derivados em ponte do composto 4, em que o composto 4 é:
2. Uma composição compreendendo um mimético de péptido à base de calixareno como definido no item 1, em que a composição se destina a utilização no tratamento ou prevenção de crescimento tumoral, artrite, restenose, aterosclerose, retinopatia diabética, glaucoma neovascular e endometriose. 3. Uma composição compreendendo um mimético de péptido à base de calixareno como definido no item 1, em que a composição se destina a utilização na inibição de tumorigénese. 4. Utilização de um mimético de péptido à base de calixareno como definido no item 1 para a preparação de um medicamento destinado a inibir a tumorigénese. 5. Utilização de um mimético de péptido à base de calixareno como definido no item 1 para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento ou prevenção de crescimento tumoral, artrite, restenose, aterosclerose, retinopatia diabética, glaucoma neovascular e endometriose. 7
Os termos "compreende" e suas variações não têm um sentido limitador quando estes termos aparecem na descrição e reivindicações.
Como usado aqui, "um", "uma", "o", "pelo menos um" e "um ou mais" são usados de forma intermutável. Assim, por exemplo, uma composição compreendendo "um" mimético de péptido à base de calixareno pode ser interpretado como significando que a composição inclui "um ou mais" miméticos de péptidos à base de calixareno. Além disso, uma "composição", como usado aqui, pode consistir apenas num mimético de péptido à base de calixareno sem quaisquer outros componentes (por exemplo, um transportador farmaceuticamente aceitável). "Tratar", "tratando" e "tratamento", etc., como usados aqui, referem-se a qualquer ação que proporciona um beneficio a um paciente afligido com uma doença, incluindo melhoria do estado por atenuação ou supressão de pelo menos um sintoma, retardamento da progressão da doença, prevenção ou retardamento do surgimento da doença, etc. A invenção inclui os compostos descritos aqui (incluindo intermediários) em qualquer das suas formas farmaceuticamente aceitáveis, incluindo isómeros (por exemplo, diastereómeros e enantiómeros) , tautómeros, sais, solvatos, polimorfos, pró-fármacos, e afins. Deve ser entendido que o termo "composto" inclui quaisquer ou todas essas formas, quer sejam ou não explicitamente enunciadas (apesar de, por vezes, "sais" serem explicitamente enunciados).
Além disso, o termo "composto" inclui a forma iónica do mimético de péptido à base de calixareno (por exemplo, um 8 mimético de péptido à base de calixareno de carga positiva). Como será entendido pelos profissionais, as formas iónicas de péptidos estão geralmente associadas a um contraião apropriado, originando um composto que tem carga global neutra. No entanto, um mimético de péptido à base de calixareno iónico retém, por si próprio, uma carga (apesar de ser uma carga que é complementada pela carga oposta do contraião correspondente), e geralmente encontrar-se-á numa forma carregada quando o sal é dissociado, como ocorrerá quando a forma de sal do mimético de péptido à base de calixareno for colocada num ambiente aquoso, tal como quando é administrado e libertado num ambiente ín vivo. "Farmaceuticamente aceitável", como usado aqui, significa que o composto ou composição é adequado para administração a um sujeito para se obterem os tratamentos descritos aqui.
Temperatura ambiente, como definido aqui, é a temperatura ambiente à qual é geralmente mantida uma sala para habitação humana e, em geral, é uma temperatura desde 20 até 25°C, sendo particularmente preferida 22,5°C.
Um grupo, como definido aqui, é um grupo de elementos que tradicionalmente é referido como uma entidade coletiva, com base na funcionalidade ou conveniência organizativa. Um grupo orgânico, como definido aqui, é um grupo que inclui pelo menos um átomo de carbono.
Como usados aqui, os termos "alquilo" e o prefixo "alc" incluem grupos de cadeia linear e cadeia ramificada e grupos ciclicos, por exemplo, cicloalquilo. Preferivelmente, estes grupos contêm desde 1 até 20 átomos de carbono. Nalgumas formas de realização, estes grupos têm 9 um total de até 10 átomos de carbono, até 8 átomos de carbono, até 6 átomos de carbono ou até 4 átomos de carbono. A dimensão preferida do grupo irá variar dependendo da topografia desejada da estrutura a ser imitada. Grupos cíclicos podem ser monocíclicos ou policíclicos e preferivelmente têm desde 3 até 10 átomos de carbono de anel. Grupos cíclicos exemplificativos incluem ciclopropilo, ciclopropilmetilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, adamantilo, e bornilo, norbornilo e norbornenilo substituídos e não substituídos. O termo "arilo", como usado aqui, inclui anéis ou sistemas em anel aromáticos carbocíclicos. Exemplos de grupos arilo incluem fenilo, naftilo, bifenilo, fluorenilo e indenilo. A menos que seja indicado em contrário, o termo "heteroátomo" refere-se aos átomos O, S ou N. O termo "heteroarilo" inclui anéis ou sistemas em anel aromáticos que contêm pelo menos heteroátomo de anel (por exemplo, O, S, N) . Nalgumas formas de realização, o termo "heteroarilo" inclui um anel ou sistema em anel que contém 2 até 12 átomos de carbono, 1 até 3 anéis, 1 até 4 heteroátomos, e O, S e/ou N como heteroátomos. Grupos heteroarilo adequados incluem furilo, tienilo, piridilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, isoindolilo, triazolilo, pirrolilo, tetrazolilo, imidazolilo, pirazolilo, oxazolilo, tiazolilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, carbazolilo, benzoxazolilo, pirimidinilo, benzimidazolilo, quinoxalinilo, benzotiazolilo, naftiridinilo, isoxazolilo, isotiazolilo, purinilo, quinazolinilo, pirazinilo, 1-óxidopiridilo, piridazinilo, 10 triazinilo, tetrazinilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, e assim por diante. 0 termo "heterociclilo" inclui anéis ou sistemas em anel não aromáticos que contêm pelo menos um heteroátomo de anel (por exemplo, O, S, N) e inclui todos os derivados totalmente saturados e parcialmente insaturados dos grupos heteroarilo mencionados acima. Nalgumas formas de realização, o termo "heterociclilo" inclui um anel ou sistema em anel que contém 2 até 12 átomos de carbono, 1 até 3 anéis, 1 até 4 heteroátomos, e O, S e N como heteroátomos. Grupos heterociclilo exemplificativos incluem pirrolidinilo, tetra-hidrofuranilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, 1,1-dioxotiomorfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, isotiazolidinilo, homopiperidinilo homopiperazinilo tiazolidinilo, imidazolidinilo, tetra-hidropiranilo, quinuclidinilo, (azepanilo), 1, 4-oxazepanilo, (diazepanilo), 1,3-dioxolanilo, aziridinilo, azetidinilo, di-hidroisoquinolin-(1H)-ilo, octa-hidroisoquinolin-(1H)-ilo, di-hidroquinolin-(2H)-ilo, octa-hidroquinolin- (2H)-ilo, di-hidro-lfí-imidazolilo, 3-azabiciclo[3.2.2]non-3-ilo, e afins.
Os termos éster, amida, amina, hidroxilo, haleto, sulfonato, fosfonato e guanidina referem-se a vários grupos funcionais opcionais diferentes que podem ser incluídos em grupos ligados aos substratos topomiméticos da invenção. Os grupos funcionais são adicionalmente descritos pelas seguintes fórmulas químicas: éster = -(CO)-O-; amida = -(CO)-NH-; amina = -NH2, hidroxilo = -OH; halogéneo é um elemento selecionado do grupo que consiste em F, Cl, Br e I; sulfonato = -O-SO3; fosfonato = -P(0) (OH)2, e guanidina = -NH-C(=NH)-NH2. Um exemplo de um grupo utilizado numa 11 forma de realização da invenção que inclui um grupo funcional halogéneo é um grupo trifluorometilo.
Como usados aqui, os termos "alcoxi" e "tioalcoxi" referem-se a grupos nos quais dois grupos alquilo hidrocarbonados estão ligados a um átomo de oxigénio ou de enxofre, respetivamente. Por exemplo, um grupo representado pela fórmula -0-R é um grupo alcoxi, ao passo que um grupo representado pela fórmula -S-R é um grupo tioalcoxi. Por exemplo, um grupo cicloalquilalcoxi é um grupo alcoxi ligado a um grupo cicloalquilo, ao passo que um grupo aralquiloxi é um grupo alcoxi ligado a um grupo aralquilo, como definido aqui. 0 R num grupo alcoxi ou tioalcoxi, descritos acima, pode ser qualquer grupo arilo ou alquilo, como descrito aqui.
Quando um grupo estiver presente mais do que uma vez em qualquer fórmula descrita aqui, cada grupo é independentemente selecionado, seja ou não explicitamente afirmado. Não é pretendido que o resumo acima da presente invenção descreva cada forma de realização divulgada ou cada implementação da presente invenção. A descrição seguinte exemplifica mais particularmente formas de realização ilustrativas. Em vários sitios ao longo do requerimento são proporcionadas diretrizes através de listas de exemplos, cujos exemplos podem ser utilizados em várias combinações. Em cada caso, a lista recitada serve apenas de grupo representativo e não deve ser interpretada como uma lista exclusiva. 12
DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS A Figura 1 mostra as características da conceção topológica que influenciam a escolha do esqueleto de calix[4]areno para dispor em série grupos hidrófobos e hidrófilos que imitam as caracteristicas estruturais e de composição de hélices e folhas anfipáticas. As estruturas dobradas de SC4 e βρθρ-25 estão mostradas no topo e na base esquerdos, respetivamente, estando indicados resíduos de aminoácidos hidrófobos e hidrófilos. A Figura 2 mostra as estruturas químicas dos análogos do calixareno na biblioteca topomimética hélice/folha. (a) Agentes contendo grupos amina terciários; (b) Agentes contendo grupos guanidina; (c) Agentes contendo outros grupos básicos e acídicos; (d) Topologia de uma estrutura em cone parcial genérica. A Figura 3 mostra dados de inibição da proliferação de células endoteliais (ECs) para 3 derivados do calixareno (40, 11 e 27) . A Figura 4 mostra secções transversais de tecidos tumorais corados com anticorpos anti-CD45 e anti-CD8, mostrando o efeito dos compostos de calixareno 40 e 27 na infiltração geral de leucócitos e células T auxiliadoras, respetivamente, em tumores. A Figura 4A mostra os resultados com anticorpos anti-CD8 e carcinoma do ovário humano MA148, ao passo que a Figura 4B mostra os resultados com anticorpos anti-CD45 e melanoma de ratinho B16. A Figura 5 proporciona gráficos que mostram que topomiméticos em hélice/folha protegem ratinhos de LPS. Foram utilizados três topomiméticos em hélice/folha (12, 42 13 e 46a) em modelos de endotoxemia de ratinho para avaliar a eficácia in vivo. (A) Sobrevivência de ratinhos após serem provocados com 600 pL de LPS do serotipo de E. coli 055:B5 com ou sem um dos compostos. As percentagens de sobrevivência ao tratamento com composto 12 e 42 estão significativamente melhoradas (p = 0,03 e 0,006 respetivamente). (B) Sobrevivência de ratinhos após serem provocados com 500 pL de LPS do serotipo de E. coli 0111:B4 com ou sem um dos compostos. A percentagem de sobrevivência ao tratamento com composto 42 está significativamente aumentada (p = 1,3 1CT5) . (C) Sobrevivência de ratinhos após serem provocados com 600 pL de LPS de Salmonella com ou sem um dos compostos. As percentagens de sobrevivência ao tratamento com composto 46a, 12 e 42 estão significativamente aumentadas (p = 9xlCT8, 0,008 e 0,002 respetivamente). Em todos os painéis, os símbolos são definidos do modo seguinte: controlo (□), 12 (·), 46a (A), 42 (▼) . A Figura 6 proporciona gráficos e ilustrações que mostram a bioatividade de topomiméticos em ensaios de angiogénese in vitro e in vivo. (A) A proliferação de culturas de HUVECs estimuladas com bFGF foi medida utilizando um ensaio de incorporação de [3H]-timidina. Construíram-se curvas de resposta à dose até 25 pM de composto para os derivados do calixareno e βρερ-25 de controlo. Os resultados estão expressos em contagens médias por minuto (± DP) de três experiências independentes de culturas em triplicado. (B) Determinou-se o efeito inibidor na migração utilizando o ensaio de cicatrização de feridas. Uma camada confluente de HUVECs foi lesionada e foi subsequentemente cultivada com ou sem compostos (25 pM). Os resultados estão expressos em larguras médias das feridas de culturas em duplicado de 14 três experiências independentes. (C) Inibição da angiogénese in vivo no ensaio de membranas corioalantoicas (CAM) . No dia 10 adicionaram-se compostos (25 μΜ) diariamente, tendo sido tiradas fotografias das CAMs no dia 14. A Figura 7 proporciona gráficos que mostram que topomiméticos inibem o crescimento tumoral em ratinhos. Ratinhos com tumor MA148 foram tratados com βρθρ-25 (10 mg/kg/dia) , bem como com as doses equivalentes farmacológicas e molares de 40 e 27. Em todas as experiências, o tratamento foi iniciado após estabelecimento dos tumores. (A) Resposta à dose para inibição do crescimento do tumor MA148 por 40. (B) 27 inibe o crescimento do tumor MA148. (C) O crescimento tumoral do melanoma BI6 é inibido por 40 e 27 quando administrados de modo continuo e sistémico (minibomba osmótica). (D) O crescimento tumoral do melanoma B16 é inibido por 40 e 27 quando administrados duas vezes por dia com injeções intraperitoneais. Em todos os estudos, os animais de controlo foram tratados com PBS contendo uma quantidade equivalente de DMSO (30% v/v). Os volumes tumorais (± EPM) estão representados graficamente em mm3 versus dias pós-inoculação. Para o modelo de MA 148, n = 5-7 ratinhos em cada grupo; para o modelo B16, n = 6-10 em cada grupo. Todos os grupos de tratamento inibiram o crescimento tumoral significativamente em comparação com os ratinhos tratados de controlo (p = 0,001 utilizando a análise ANOVA de duas vias). Em todos os painéis, os símbolos são definidos do modo seguinte: controlo ·, βρβρ-25 (βρθρ-25, 10 mg/kg) ·, 40 (2,4 mg/kg) Δ, 40 (10 mg/kg) A, 27 (2,7 mg/kg) V e 27 (10 mg/kg) T. 15 A Figura 8 proporciona imagens que mostram que topomiméticos inibem a angiogénese tumoral. Para análise histoquímica, secções transversais de tumores foram coradas quanto à densidade de microvasos (MVD) utilizando coloração com anticorpo anti-CD31 etiquetado com PE, e quanto a apoptose celular total utilizando análise TUNEL (etiquetado com FITC). Apresenta-se a coloração da secção tumoral MA148 (A-D) e coloração da secção tumoral B16F10 (E-H) para tratados com veiculo (A e E), tratados com βρερ-25 (B e F), tratados com 40 (C e G) e tratados com 27 (D e H) . As imagens são representativas das médias para a dose de 10 mg/kg. Ampliação original X200; barra de escala = 50 pm. A quantificação da densidade de microvasos e apoptose está apresentada na Tabela 3.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DE FORMAS DE REALIZAÇÃO
ILUSTRATIVAS A presente invenção é dirigida a certos compostos topomiméticos que proporcionam uma variedade de atividades biológicas. Um composto topomimético, como definido aqui, é um composto orgânico que proporciona uma topografia de superfície que se assemelha à de uma molécula bioativa existente. Compostos topomiméticos da presente invenção são miméticos de péptidos que empregam um esqueleto orgânico em conjunto com grupos particulares para modelar as características de superfície dos péptidos βρθρ-25 e SC4.
Compostos topomiméticos da presente invenção são miméticos de péptidos à base de calixareno como definidos acima. Foi preparada uma biblioteca de miméticos de péptidos à base de calixareno, e é mostrado aqui que possuem uma ou mais atividades biológicas. Estas atividades biológicas incluem, 16 por exemplo, atividade antibacteriana, atividade antiangiogénica e atividade antitumoral.
Um aspeto da presente invenção refere-se à capacidade de imitar de modo mais completo as conformações dobradas de pequenos segmentos da estrutura proteica secundária em hélices e folhas beta, exemplificadas em dois péptidos (βρερ-25 e SC4) com atividades biológicas um pouco diferentes, empregando calixareno num método de abordagem à base do esqueleto. 0 ppep-25, que tem a sequência ANMt^VQMK.U^KR.HLKWtCIlVKy^DCRltStD (SEQ ID NO: 1), é um péptido concebido de 33-meros formador de folha β do tipo citoquina (K. H. Mayo et al. , Angiogenesis, _4, 45-51 (2001); e S. Liekens et al., J. Biochem. Pharm., _61, 253-270 (2001)). 0 outro péptido, SC4, que tem a sequência KLFRRHlkwkh (SEQ ID NO: 2), é um 12-meros concebido que forma uma conformação em hélice anfipática, destrói membranas bacterianas de modo seletivo e exibe atividade bactericida (K. H. Mayo et al., Biochem. J. 2000, 349, 717-728) . Apesar de estes exemplos proporcionarem prova de principio, a invenção e a própria abordagem têm aplicações mais amplas. A este respeito, uma biblioteca à base de calixareno mais completa de compostos análogos pôde ser empregue para pesquisar atividades noutros sistemas, de modo que a atividade biológica possa ser imitada.
As estruturas em solução, derivadas por NMR, dos péptidos 3pep (por exemplo, 3pep-25) e SC (por exemplo, SC4) concebidos proporcionaram dimensões moleculares de onde se concebe um esqueleto de apresentação apropriado. Apesar de terem sido considerados alguns esqueletos potenciais, escolheu-se calix[4]areno com base, em parte, nos resultados da modelação molecular in silico, principalmente 17 porque representou a maior parte das dimensões moleculares apropriadas de um pequeno péptido em conformação de hélice ou folha beta, avaliado por NMR ou cristalografia de raios X. Além disso, o calix[4]areno está disponível no mercado e pode ser facilmente utilizado para a preparação de derivados.
Para exemplificar a abordagem de conceção topomimética da presente invenção utilizando o esqueleto de apresentação à base de calixareno, utilizaram-se os péptidos βρερ-25 e SC4. Para a conceção inteligente de compostos mais pequenos, a identificação de resíduos de aminoácidos específicos e as suas relações espaciais proporcionou o conhecimento inicial básico para escolher miméticos de péptidos à base de calixareno apropriados a serem sintetizados e testados. Em solução, o βρθρ-25 forma uma folha beta, ao passo que o SC4 forma uma conformação helicoidal. Com base na topologia de superfície anfipática e dimensões moleculares grosseiras destas conformações derivadas por NMR (estruturas 3-dimensionais) do SC4 e βρθρ-25, a conceção de miméticos utilizando um esqueleto de calixareno (ver esquema de conceção na Figura 1) demonstrou ser bem-sucedida. Estes miméticos são não peptídicos (estruturas listadas na Figura 2), têm potencial para serem oralmente ativos e exibem atividade bactericida, antiangiogénica e outras atividades biológicas na gama de μΜ até sub-μΜ.
De notar que as dimensões moleculares de ambos os péptidos dobrados e da molécula de calixareno são razoavelmente semelhantes, da ordem dos 5 Â até 10 Â em qualquer uma das 3 dimensões. A hélice de cerca de 3 voltas é um cilindro com cerca de 12 Â de comprimento (a-CN-term até a-Cc-term) e 18 cerca de 6 Ã de diâmetro, semelhante ao de uma pequena folha beta. 0 núcleo do calixareno tem forma de cone, com a borda superior (como desenhado) mais larga do que a borda inferior (cerca de 8-10 versus cerca de 4-5 Â). A altura do núcleo do calixareno (desde O até ao primeiro átomo de ligação do grupo para) é cerca de 6 Â. Esta caracteristica 3D diferencia esses miméticos à base de calixareno de outros conhecidos na área. O esqueleto do calixareno constitui um excelente modelo sobre o qual dispor em série conjuntos de qrupos polares (catiónicos e aniónicos) e não polares (hidrófobos). Por exemplo, um esqueleto de calixareno pode ser dotado de grupos polares e não polares de modo a imitar as duas superfícies do SC4, que incluem uma superfície hidrófila que apresenta resíduos lisina e arginina de carga positiva e uma superfície hidrófoba incluindo resíduos leucina, isoleucina, triptofano e fenilalanina. Não obstante uma forma de realização da invenção empregar como esqueleto uma estrutura com forma de cone de calixareno, uma forma de realização adicional da invenção emprega como esqueleto uma estrutura em cone parcial, como mostrado na Figura 2d. A estrutura em cone parcial diminui a diferença entre os dois lados da estrutura por inversão da orientação de um dos grupos arilo do anel calixareno, proporcionando uma estrutura alternativa que pode ser útil para imitar diferentes estruturas de polipéptidos.
Os miméticos de péptidos à base de calixareno baseiam-se nas relações estrutura-função de péptidos SC4 e/ou Ppep-25 (preferivelmente de βρερ-25). Em particular, uma vez que estes péptidos se dobram como estruturas anfipáticas, podem ser imitados por um esqueleto de composto químico que 19 inclui um lado hidrófobo da molécula e outro lado hidrófilo com carga positiva. Através do conhecimento das relações estrutura-atividade nestes dois péptidos podem ser identificadas as relações espaciais de grupos funcionais chave em ambos os péptidos, bem como as dimensões moleculares presentes nestes péptidos dobrados, um esqueleto orgânico. Aqui, o calixareno proporciona um esqueleto químico apropriado. 0 próprio esqueleto do calixareno proporciona grande parte das dimensões moleculares apropriadas de uma cadeia principal em hélice ou folha beta quando no estado dobrado.
Calix[4]arenos-bis-anéis são compostos macrociclicos frequentemente usados em extrações de metais. Também foi descrito que são úteis como agentes antitrombóticos na Patente U.S. N° 5,409,959. O calixareno só foi utilizado como esqueleto num estudo para apresentar e restringir pequenos péptidos em alça que se ligam ao fator de crescimento derivado de plaquetas (Blaskovich et al., Nat. Biotechnol., 1_8; 1065-1070 (2000)), mas não no contexto de compostos totalmente não peptídicos, como descrito aqui.
Miméticos de péptidos à base de calixareno que são divulgados na presente especificação incluem aqueles que têm as estruturas gerais seguintes, representadas pelas Fórmulas I e II:
20 ou
I?
Deve notar-se que a Fórmula I e Fórmula II representam diferentes conformações dos miméticos de péptidos à base de calixareno, mas no restante são iguais. Na estrutura acima, cada grupo R1 até R8 é independentemente hidrogénio ou um grupo orgânico, em que R1 até R4 são, cada um independentemente, hidrogénio ou um grupo orgânico de polaridade idêntica e R5 até R8 são, cada um independentemente, hidrogénio ou um grupo orgânico de polaridade idêntica cuja polaridade é oposta à dos R1 até R4. Preferivelmente, R1 até R8 são, cada um independentemente, hidrogénio, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, alcoxi, cicloalquilalcoxi, heterociclo-alquilo, aralquiloxi, trifluorometilo ou haleto, opcionalmente incluindo grupos éster, amida, amina, hidroxilo, sulfonato, fosfonato, guanidina, heteroarilo, heteroaril-alquilo e/ou tioalcoxi.
Por exemplo, R1 até R4 podem ser alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, alcoxi, cicloalquilalcoxi, heterociclo-alquilo, aralquiloxi, heterocicloalquilo, aralquiloxi, trifluorometilo ou haleto e R5 até R8 podem ser quaisquer destes grupos incorporando grupos éster, amida, amina, hidroxilo, sulfonato, fosfonato, guanidina, heteroarilo, heteroarilalquilo e/ou tioalcoxi. De igual modo, R5 até R8 21 podem ser alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, alcoxi, cicloalquilalcoxi, heterocicloalquilo, aralquiloxi, heterocicloalquilo, aralquiloxi, trifluorometilo ou haleto e R1 até R4 podem ser quaisquer destes qrupos incorporando grupos éster, amida, amina, hidroxilo, sulfonato, fosfonato, guanidina, heteroarilo, heteroarilalquilo e/ou tioalcoxi.
Esses miméticos de péptidos à base de calixareno são ativos no que se refere a pelo menos uma de algumas atividades biológicas. Isto é exemplificado pelos dados apresentados aqui. Podem ser tão eficazes ou mais eficazes do que βρερ-25 numa ou mais das suas atividades biológicas (por exemplo, na inibição da proliferação de células endoteliais e angiogénese in vitro). No entanto, mesmo que um mimético de péptido à base de calixareno não seja tão eficaz ou não seja mais eficaz do que o 3pep-25 numa ou mais das suas atividades biológicas, o composto pode ser útil. Isto é particularmente verdade se o composto estiver mais biodisponivel do que ο βρβρ-25, tiver menos efeitos secundários do que ο βρβρ-25 e/ou a sua produção for mais económica do que a do βρβρ-25, por exemplo.
Compostos como os miméticos de péptidos à base de calixareno descritos aqui podem ser identificados e preparados utilizando um método de conceção de miméticos de péptidos. Aqui, esses miméticos de péptidos possuem propriedades de superfície e topologia que imitam substancialmente pelo menos uma porção do péptido e têm pelo menos uma das funções biológicas do péptido.
Um método de preparação de um mimético de péptido está ilustrado na Figura 1 e envolve os passos seguintes: 22 identificar um péptido estruturado dobrado de interesse (βρθρ-25 (péptido em folha β) e SC4 (péptido em hélice) na Figura 1); determinar uma região biologicamente ativa do péptido e grupos funcionais chave na região biologicamente ativa responsáveis pela atividade biológica dessa região do péptido (elementos anfipáticos, isto é, uma superfície maioritariamente hidrófoba e uma maioritariamente hidrófila, neste caso superfície com carga positiva); identificar um esqueleto orgânico para apresentar os grupos funcionais chave, ou respetivos análogos, numa orientação espacial equivalente à da região biologicamente ativa (calix[4]areno, como mostrado na Figura 1, com grupos funcionais genéricos (grupos hidrófobos e hidrófilos de carga positiva) que variam como mostrado na Figura 2, ou afins, e sintetizar um composto compreendendo o esqueleto e grupos funcionais chave, ou respetivos análogos, para formar um mimético de péptido do péptido de interesse (ver Figura 2) . Exemplos de miméticos de péptidos preferidos à base de calixareno estão ilustrados na Figura 2. A região biologicamente ativa é, preferivelmente, a região mais pequena do péptido que pode induzir uma resposta biológica. Os grupos funcionais chave nesta região são aqueles grupos funcionais das cadeias laterais de aminoácidos maioritariamente responsáveis pela resposta biológica induzida pela região identificada. A região biologicamente ativa e grupos funcionais chave podem ser identificados utilizando métodos comuns de estrutura-atividade, como truncamento do péptido, utilizando varrimento de alanina, e afins. Estes grupos funcionais chave, ou respetivos análogos, são grupos hidrófobos, grupos alifáticos e/ou aromáticos e hidrófilos, com carga positiva ou negativa ou sem carga. Grupos orgânicos 23 análogos podem ser utilizados como grupos no anel calixareno para imitar várias cadeias laterais de aminoácidos. Por exemplo, um grupo alquilo pode ser utilizado para imitar as cadeias laterais de valina, isoleucina e leucina; grupos alquilamina imitam as cadeias laterais de lisina; grupos alquilguanidina imitam as cadeias laterais de arginina; grupos éster de alquilo imitam as cadeias laterais de aspartato e glutamato, grupos alquilamida imitam as cadeias laterais de asparaginas e glutamina, e grupos heteroarilo imitam as cadeias laterais de histidina e triptamina.
Estes grupos orgânicos são então combinados com um esqueleto orgânico. Para imitar uma molécula anfifilica, os grupos podem ser posicionados de modo a apresentarem grupos hidrófobos maioritariamente numa face de um esqueleto orgânico e grupos hidrófilos maioritariamente na face oposta de um esqueleto orgânico. Um esqueleto orgânico dotado de grupos hidrófobos e hidrófilos deve ter uma dimensão molecular semelhante à da região biologicamente ativa do péptido de interesse e deve ter grupos funcionais chave, ou respetivos análogos, numa orientação espacial que é substancialmente igual à dos grupos funcionais presentes na região biologicamente ativa do péptido de interesse. Neste contexto, "equivalente" não significa que grupos funcionais, ou respetivos análogos, tenham de ter precisamente a mesma orientação espacial do péptido de interesse, mas devem ter uma orientação substancialmente semelhante de modo que o mimético de péptido resultante possua pelo menos uma das mesmas funções biológicas do péptido de interesse (apesar de não ter de estar ao mesmo nível de atividade). 24 0 esqueleto orgânico pode ser constituído por uma grande variedade de estruturas, que podem ter uma grande variedade de configurações. É particularmente desejável que a configuração do esqueleto tenha a forma de disco. Preferivelmente, a espessura ou altura desse disco vai até 10 Angstroms (e tipicamente situa-se numa gama de 5-7,5 Angstroms). Preferivelmente, a dimensão maior (tipicamente, o diâmetro) do disco vai até 20 Angstroms (e tipicamente situa-se numa gama de 10-15 Angstroms (Ã)). Num mimético de péptido típico, pelo menos duas superfícies (tipicamente as superfícies com maiores áreas, e mais tipicamente as faces opostas de um disco) são modificadas de modo a incluírem os grupos funcionais chave, ou respetivos análogos. Tipicamente, independentemente da dimensão do núcleo do esqueleto, a "pele" superficial do esqueleto (formada pelos grupos funcionais presentes na(s) superfície(s)) é tipicamente semelhante de modo substancial ao 3pep-25 e/ou SC4 . O esqueleto orgânico consiste em calixareno e o mimético de péptido é um mimético de péptido à base de calixareno (ver Figura 1). O péptido de interesse é βρερ-25 ou SC4.
Num conjunto inicial de experiências, as atividades in vitro foram avaliadas utilizando maioritariamente ensaios bactericidas e de proliferação de células endoteliais, como descrito no Exemplo 36. Este exemplo empregou miméticos de péptidos à base de calixareno preparados como descrito nos Exemplos 1-35. A partir desta pequena biblioteca verificou-se que dois destes compostos têm atividade bactericida razoavelmente boa (Compostos 3 e 11) na gama micromolar (Tabela 1), e verificou-se que dois outros compostos têm atividade antiangiogénica excecional (Composto 27 e 40) 25 (Tabela 1 e Figura 3). Outros compostos mostrados na Tabela 1 foram muito menos ativos nestes ensaios, mas chegaram a ser ativos se avaliados noutros ensaios quanto a atividades biológicas diferentes. 26
Tabela 1: Proliferação % % Outras Atividade Hemó- Solubi- Composto e estrutura de ECs Apoptose Morte Células bacteriana lise lidade ICso de ECs celular 25 μΜ Em J96 (conc, μΜ) 25 μΜ total ICsi de ECs (conc, μΜ) Ρρφ$ M l)i 5,5 28¾ 60¾ Fibro Nenhuma 3 mM em i i V Mfí (75%, 85¾ a 10’’ 0,15 M BJ) MA148 30« M NaCl iii SCK 60« M Vil 25 Nenhum DMSO jjg M efeito H20 ipl iM ^ i SC4 Lf§ Liis Nenhuma até Nenhum 0,5 Nenhuma 3 mM em j Arg & 100 efeito a IO’’ 0,15 M M NaCl # 2,5 Nenhum Nenhum Fibro Nenhuma Nenhuma H20 até efeito efeito 0¾ até 3,8 a 10~s 30 mg/mL a .ytjKk MA148 M pH<7,0, i* 80¾ t.a. SCK 40« 27 41 X \ η n. ιγνγπ i JS δ ‘ ^ \ nro Nenhuma até 25 2,4 100S a 10's M Passa para a solução em H20 após dissolução em DMSO 1 l i Nenhuma até 1,6 100¾ a dmso/h2o Γ1 /\ 4'\ f S ' 25 10"6 M 1 i rçrO «03 *\A h,wf 1 | Nenhuma até Nenhum Nenhum Fibro 1,3 100¾ a dmso/h2o f> L· ' 1 25 efeito efeito 100¾ ht6m 54/v*% H iMl ó Λ. Λ ’' 4V Nenhuma até 25 0,7 100S a 10-6 M dmso/h2o 28 2 ' \ / S 4 \ Η Nenhuma até 25 u 100% a 10'® M dmso/h2o Λ iVv} „ 11 ο ύ ) 1 Nenhuma até 25 Nenhuma até 3,8 dmso/h2o 4 4' Ί 0>yv*í Η Nenhuma até 25 Nenhuma até 3,8 DMSO/HjO 4 f em ponte ( Λ η fν „ 0 |3/γνγΜ|. | * *4 ν/ 4 1 '** “1 /γν** Η ;ι±υ&Λοϊ an ponte 10 Nenhuma até 3,8 dmso/h2o 29
30
^ i ,/ ψ Aivv t i l h \ ! ϊ 'M ^ x ηΛ| Nenhuma até 25 1,4 dmso/h2o 32 Ί'’ V À Á i,[ i| i \ Nenhuma até 25 1,3 DMSO/HjO 21 c J W Ϋ^γ \ \ / s À> /4 vA/ | Nenhuma até 25 1,2 dmso/h2o •í ,-/¾ $f\ } » iUU ! i M !í il OH U H 31 31
3 mM em 100? DMSO -> 0,03 mM ei H20 3 mM em 100? etanol -> 0,03 mM em H20 32
Ratinhos com tumores foram tratados com dois dos compostos (KM0118 (40) e Composto 27) e verificou-se, em cada caso, que o crescimento tumoral (carcinoma de ovário humano MA148, e melanoma de ratinho B16) foi significativamente inibido (Figura 4A (MA148) e Figura 4B (B16) ) , de modo semelhante ou melhor do que com Ppep-25.
Noutro conjunto de experiências avaliaram-se atividades in vitro quanto à sua capacidade para neutralizar LPS (isto é, endotoxina), a sua capacidade para inibir a proliferação e migração de células endoteliais, a sua capacidade para inibir o crescimento tumoral e a sua atividade antiangiogénica, como descrito no Exemplo 47. A capacidade de vários compostos para inibir a ligação de LPS está apresentada na Tabela 2. Dados adicionais acerca da capacidade de compostos para inibir a ligação de LPS são apresentados na Tabela 3 e na secção de Exemplos. Estas experiências empregaram miméticos de péptidos à base de calixareno preparados como descrito nos Exemplos 1-35 e Exemplos 37-46. Desta biblioteca de 23 compostos, que estão apresentados na Figura 2, verificou-se que os compostos 12, 42, 43, 15, 46a e 19 são os mais eficazes para neutralizar LPS, ao passo que os compostos 27 e 40 foram muito ativos como agentes antiangiogénicos. Nenhum dos compostos testados exibiu toxicidade significativa. Miméticos de péptidos à base de calixareno que apresentaram grupos hidrófobos e de carga positiva foram particularmente eficazes para neutralizar endotoxina. Os compostos antiangiogénicos e antitumorais altamente eficazes 27 e 40 têm uma carga positiva liquida e também carácter anfipático.
33 Tabela 2. Derivados do Calixareno. Valores IC50 (μΜ) para ligação de LPS
Derivados ftminas Terciárias
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ND = sem atividade detetável a 5 x 10 M >5 = atividade mínima a 5 x 10 6 M; IC50 não determinado.
Os valores na gama submicromolar estão apresentados a cheio. 35 * Estrutura genérica do Calixareno na Conformação em Cone Parcial
Um mimético de péptido à base de calixareno preferido é caracterizado por ter pelo menos uma das atividades biológicas descritas aqui. A atividade biológica de um composto pode ser determinada, por exemplo, como descrito aqui ou por métodos bem conhecidos do profissional.
Composições que incluem um ou mais dos miméticos de péptidos à base de calixareno desta invenção com um transportador opcional (por exemplo, um transportador farmaceuticamente aceitável) podem ser adicionadas a células em cultura ou utilizadas para tratar pacientes, como mamíferos. Quando os miméticos de péptidos à base de calixareno forem utilizados para tratar um paciente, o mimético de péptido à base de calixareno é preferivelmente combinado, numa composição farmacêutica, com um transportador farmaceuticamente aceitável, como uma molécula maior para promover a estabilidade, ou um tampão farmaceuticamente aceitável que serve de transportador. 0 tratamento pode ser profilático ou terapêutico. Assim, o tratamento pode ser iniciado antes, durante ou após o desenvolvimento do estado (por exemplo, infeção bacteriana ou endotoxemia) . Como tal, as frases "inibição de" ou "eficaz para inibir" um estado, como uma infeção bacteriana e/ou endotoxemia, por exemplo, incluem tratamento profilático e terapêutico (isto é, prevenção e/ou reversão do estado). 36
Os miméticos de péptidos à base de calixareno da presente invenção podem ser administrados isoladamente ou num tampão farmaceuticamente aceitável, como um antigénio associado a outra proteína, como uma proteína imunoestimuladora ou com um transportador proteico, tal como mas não se limitando a hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina do soro bovino (BSA) , ovalbumina ou afins. Também pode ser utilizado em terapia adjuvante, em combinação, por exemplo, com um agente quimioterapêutico, como carboplatina, ou outros conhecidos do profissional.
Os miméticos de péptidos à base de calixareno podem ser combinados com uma variedade de transportadores fisiologicamente aceitáveis para distribuição num paciente, incluindo uma variedade de diluentes ou excipientes conhecidos dos profissionais. Por exemplo, para administração parentérica é preferida solução salina isotónica. Para administração tópica pode ser utilizado um creme, incluindo um transportador como dimetilsulfóxido (DMSO), ou outros agentes tipicamente presentes em cremes tópicos que não bloqueiem nem inibam a atividade do péptido. Outros transportadores adequados incluem mas não estão limitados a álcool, solução salina tamponada com fosfato e outras soluções salinas equilibradas.
Os miméticos de péptidos à base de calixareno desta invenção demonstram atividade biológica e podem ser administrados de uma variedade de modos, incluindo de forma intravenosa, tópica, oral e intramuscular, a uma variedade de mamíferos, incluindo humanos, ratinhos e coelhos. Os miméticos de péptidos à base de calixareno podem ser administrados numa única dose ou em múltiplas doses. Preferivelmente, a dose é uma quantidade eficaz, 37 determinada pelos métodos comuns descritos aqui, e inclui cerca de 1 micrograma até cerca de 1 000 microgramas para pré-tratamento, mais preferivelmente cerca de 50 até cerca de 250 microgramas para pré-tratamento. Os profissionais da área dos ensaios clínicos serão capazes de otimizar dosagens de miméticos de péptidos à base de calixareno particulares através de estudos de ensaios comuns.
Numa forma de realização, miméticos de péptidos à base de calixareno são antiangiogénicos. A angiogénese está envolvida em numerosas funções biológicas do corpo, desde processos normais, como embriogénese e cicatrização de feridas, até processos anormais, como crescimento tumoral, artrite, restenose, aterosclerose, retinopatia diabética, glaucoma neovascular e endometriose. A utilização de agentes que conseguem inibir a angiogénese in vitro e in vivo, particularmente em investigação antitumoral, tem indicado que a terapia antiangiogénica é uma modalidade terapêutica promissora. A investigação de inibidores angiogénicos tem-se centrado no controlo de dois dos processos que promovem a angiogénese: crescimento e adesão de células endoteliais (EC), principalmente porque ECs estão mais acessíveis do que as outras células a agentes farmacológicos distribuídos via o sangue, e ECs são geneticamente estáveis e não são facilmente mutadas em variantes resistentes a fármacos. A maior parte dos agentes antiangiogénicos foi descoberta por identificação de moléculas endógenas, principalmente proteínas, que inibem o crescimento de ECs.
Também foi postulado que o crescimento tumoral pode ser controlado por privação da neovascularização (Folkman J. Natl. Câncer. Inst. 82, 4-6 (1990); Folkman et al., J. 38
Biol. Chem., 2 67, 10931-10934 (1992)). Tem sido descrito um número crescente de inibidores endógenos da angiogénese, como fator de plaquetas-4 (PF4), proteína-10 indutivel por interferão-γ (IP-10), trombospondina-1 (TSP-1), angiostatina, bem como agentes sintéticos, por exemplo, talidomida, TNP-470 e inibidores de metaloproteinases. Alguns destes agentes estão presentemente a ser testados em ensaios clínicos de fase I/II. Investigação prévia descrita em Griffioen et al., Blood, 8_8, 667-673 (1996), e Griffioen et ai., Câncer Res., 5_6, 1111-1117 (1996) mostrou que fatores pró-angiogénicos em tumores induzem a regulação negativa de moléculas de adesão em células endoteliais na rede vascular tumoral e induzem anergia a sinais inflamatórios, como o fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleuquina-1 e interferão-γ. ECs expostas ao fator de crescimento de células vasculares endoteliais (VEGF) (Griffioen et ai., Blood, 8_8, 667-673 (1996)) e fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) (Griffioen et al. . Blood, 8_8, 667-673 (1996); e Melder et ai., Nature Med., 2_, 992-997 (1996)) exibem uma regulação positiva gravemente enfraquecida da molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e indução da molécula de adesão de células vasculares-1 (VCAM-1) e E-seletina. Este fenómeno, que foi denominado anergia de ECs induzida por tumores, é um modo pelo qual tumores com um fenótipo angiogénico podem escapar à infiltração por leucócitos citotóxicos.
Uma vez que a regulação negativa mediada pela angiogénese de moléculas de adesão endoteliais (EAM) pode promover a disseminação tumoral ao evitar a resposta imunológica (Griffioen et al., Blood, 8_8, 667-673 (1996); Kitayama et ai., Câncer. Res., 54_, 4729-4733 (1994); e Piali et al., J. Exp. Med., 181, 81 1-816 (1995)), crê-se que a inibição da 39 angiogénese poderá ultrapassar a regulação negativa de moléculas de adesão e a ausência de reatividade a sinais inflamatórios. Esta hipótese é suportada pelo relato de uma relação entre a regulação positiva de E-seletina e o agente angiostático AGM-1470 (Budson et al., Bíochem. Biophys. Res. Comm., 225, 141-145 (1996)). Também foi mostrado que a inibição da angiogénese pelo PF-4 regula positivamente ICAM-1 em Ecs estimuladas por bFGF. Adicionalmente, a inibição da angiogénese pelo PF4 ultrapassa a anergia de ECs associada a angiogénese a sinais inflamatórios.
Assim, a presente invenção proporciona os compostos para inibir a proliferação de células endoteliais num paciente (por exemplo, um mamífero, como um humano). Isto envolve administrar a um paciente uma quantidade de uma composição (tipicamente uma composição farmacêutica) eficaz para inibir o crescimento de células endoteliais, em que a composição inclui um ou mais miméticos de péptidos à base de calixareno descritos aqui. Analogamente, a presente invenção proporciona os compostos para inibir a proliferação de células endoteliais in vitro (por exemplo, numa cultura de células). Isto envolve contactar as células com uma quantidade de uma composição eficaz para prevenir e/ou reduzir o crescimento de células endoteliais, em que a composição inclui um ou mais miméticos de péptidos à base de calixareno descritos aqui.
Para determinar a quantidade de proliferação de células endoteliais in vivo podem ser utilizados vários métodos conhecidos do profissional. Por exemplo, para avaliação do crescimento de células endoteliais em tumores, secções de tecido podem ser apropriadamente coradas para quantificar a densidade de vasos. Para determinar a quantidade de 40 proliferação de células endoteliais in vitro pode utilizar-se um Ensaio de Proliferação de ECs que envolve a captação de timidina tritiada por células em cultura de células. Um mimético de péptido à base de calixareno que é "ativo" para inibir a proliferação de células endoteliais é preferivelmente tal que causa uma redução de pelo menos 10% da proliferação de células endoteliais a uma concentração menor do que 10“4 M. Alternativamente, a inibição da proliferação de células endoteliais para um mimético de péptido à base de calixareno "ativo" in vitro situa-se preferivelmente num nivel IC50 inferior a 80 μΜ (mais preferivelmente inferior a 50 μΜ e ainda mais preferivelmente inferior a 25 μΜ), determinado utilizando o ensaio descrito na Secção de Exemplos. A presente invenção também proporciona os compostos para inibir a regulação negativa da expressão da molécula de adesão intercelular (ICAM) mediada pelo fator angiogénico (e/ou promover a expressão de ICAM) num paciente (por exemplo, um mamífero, como um humano) . Isto envolve administrar a um paciente uma quantidade de uma composição eficaz para prevenir e/ou reduzir a quantidade de regulação negativa da expressão de ICAM, em que a composição inclui um ou mais miméticos de péptidos à base de calixareno descritos aqui. Analogamente, a presente invenção proporciona os compostos para inibir a regulação negativa da expressão da molécula de adesão intercelular mediada pelo fator angiogénico (e/ou promover a expressão de ICAM) in vitro (por exemplo, numa cultura de células) . Isto envolve contactar células com uma quantidade de uma composição eficaz para prevenir e/ou reduzir a quantidade de regulação negativa da expressão de ICAM, em que a 41 composição inclui um ou mais miméticos de péptidos à base de calixareno descritos aqui. A presente invenção também proporciona os compostos para aumentar a infiltração de leucócitos em tecido tumoral num paciente (por exemplo, um mamífero, como um humano) . Isto envolve administrar a um paciente uma quantidade de uma composição eficaz para aumentar a quantidade de qlóbulos brancos (leucócitos) que consequem infiltrar-se no tecido tumoral através de vasos sanquíneos, em que a composição inclui um ou mais miméticos de péptidos à base de calixareno descritos aqui. A utilização de aqentes que conseguem aumentar a infiltração de leucócitos em tecido tumoral, particularmente em investigação antitumoral, tem sido procurada desde há algum tempo e na área geral da imunoterapia, e será uma modalidade terapêutica promissora no futuro. Isto é exemplificado na Figura 4, que mostra os efeitos de dois destes agentes (KM0118 (40) e Composto 27) no aumento da infiltração de leucócitos em tumores de ratinhos com tumores. A presente invenção proporciona os compostos para inibir a angiogénese (isto é, formação de novos vasos sanguíneos) num paciente (por exemplo, um mamífero, como um humano). Isto envolve administrar a um paciente uma quantidade de uma composição eficaz para prevenir e/ou reduzir a angiogénese, em que a composição inclui um ou mais miméticos de péptidos à base de calixareno descritos aqui. Analogamente, a presente invenção proporciona os compostos para inibir a angiogénese in vitro (por exemplo, numa cultura de células). Isto envolve contactar células com uma quantidade de uma composição eficaz para prevenir e/ou reduzir a angiogénese, em que a composição inclui um ou 42 mais miméticos de péptidos à base de calixareno descritos aqui.
Para determinar a quantidade de angiogénese in vivo podem ser utilizados vários métodos conhecidos do profissional. Por exemplo, para avaliação da angiogénese em tumores, secções de tecido podem ser apropriadamente coradas para quantificar a densidade de vasos. Para determinar a quantidade de angiogénese in vitro pode utilizar-se um Ensaio de Angiogénese que envolve o desaparecimento de brotamentos de ECs em cultura de células. Um polipéptido que é "ativo" para inibição da angiogénese é preferivelmente tal que causa uma redução de pelo menos 10% do brotamento de células endoteliais a uma concentração inferior a 1CT4 M. Alternativamente, a inibição da angiogénese para um mimético de péptido à base de calixareno in vitro situa-se preferivelmente num nivel inferior a 85% de brotamento (mais preferivelmente inferior a 75% de brotamento, ainda mais preferivelmente 50% de brotamento e ainda mais preferivelmente inferior a 35%) , determinada utilizando o ensaio à base de gel de colagénio descrito na Secção de Exemplos.
De modo semelhante, essas composições antiangiogénicas podem ser utilizadas para controlar perturbações patológicas, como aterosclerose, restenose, retinopatia diabética, glaucoma neovascular, artrite reumatoide e endometriose. Isto pode ser demonstrado utilizando técnicas e modelos comuns conhecidos do profissional. A presente invenção proporciona os compostos para inibir a tumorigénese num paciente (por exemplo, um mamífero, como um humano) . Isto envolve administrar a um paciente uma 43 quantidade de uma composição eficaz para prevenir e/ou reduzir o crescimento tumoral, em que a composição inclui um ou mais miméticos de péptidos à base de calixareno descritos aqui. Métodos de determinação da inibição da tumorigénese são bem conhecidos dos profissionais, incluindo avaliação do retraimento tumoral, sobrevivência, etc. A presente invenção também proporciona os compostos para inibir a quantidade de TNF-α num paciente (por exemplo, um mamífero, como um humano). Isto envolve administrar a um paciente uma quantidade de uma composição eficaz para inibir a quantidade de TNF-α no sistema de um paciente, determinada por avaliação dos níveis no soro de TNF-α, em que a composição inclui um ou mais miméticos de péptidos à base de calixareno descritos aqui. Analogamente, a presente invenção proporciona um método para inibir a quantidade de TNF-α in vitro (por exemplo, numa cultura de células). Este método envolve incubar células com uma quantidade de uma composição eficaz para diminuir quantidades de TNF-α na cultura de células, em que a composição inclui um ou mais miméticos de péptidos à base de calixareno descritos aqui. Para métodos in vivo e in vitro pode utilizar-se o ensaio WEHI para a deteção de TNF-α (Battafarano et al., Surgery, 118, 318-324 (1995)) em cultura de células ou em soro de um paciente. Alternativamente, a quantidade de TNF-α numa amostra pode ser avaliada utilizando um anticorpo anti-TNF-oí. Um mimético de péptido à base de calixareno "ativo" para diminuir TNF-α pode ser avaliado utilizando um teste in vitro, e preferivelmente exibe uma diminuição de pelo menos 10% da quantidade de TNF-a. 44
EXEMPLOS A invenção será adicionalmente descrita com referência aos seguintes exemplos pormenorizados. Estes exemplos são oferecidos para ilustrar adicionalmente as várias formas de realização e técnicas especificas e preferidas.
Todos os reagentes foram obtidos da Sigma-Aldrich Co. ou Acros Organics, excetuando N,N-dimetiletilenodiamina, que foi obtida da Lancaster Synthesis, Inc.
Exemplos 1-35: Preparação de Compostos
Derivados calixareno exemplificativos podem ser preparados de acordo com os seguintes esquemas e exemplos. Apenas o composto 27, composto 40 e derivados em ponte do composto 4 são exemplos da presente invenção. Os outros compostos são apresentados para fins de referência.
Esquema 1
i. bromoacetato de etilo, K2CO3, acetona, refluxo; ii. para 3, N,N-dimetiletilenodiamina, tolueno, refluxo; para 4, a) N-Boc etilenodiamina, tolueno, refluxo; b) TFA, 5% anisolo em CH2C12.
Esquema 2 45 ϊ !íf^ 1 μ Λ, A, r H .A, f ^ Ás Χλ4- τ 1« * E<'V , J-VM. ' OR <>v Á (V i® í R»N ΐθφ Μ μ H (conformero ff) R = ff* d° can£) f / A ícS 1 Sf / f 4Í ξ s E 1 ΓτΗ Η
(coxt£óonexc do cone parcial) ff SsH í? i. a) AICI3, PhOH, tolueno, t.a.; b) para 5, NaH, brometo de alilo, THF, DMF; para 6, NaH, cloreto de metilalilo, THF, DMF; ii. N, N-dimetilanilina, 200°C; iii. a) bromoacetato de etilo, K2CO3, acetona, refluxo; b) Pd/C, H2, EtOAc; iv. para 11, AlMe3, N, N-dimetiletilenodiamina, CH2CI2, 40°C; para 12, N,N-dimetiletilenodiamina, tolueno, refluxo.
Esquema 3
\fX Cl 1 V4«— ÔH s M
ff 8 = CM, f? S » cm, i. cloreto de metilalilo, Nal, K2CO3, acetona, refluxo; ii. a) NaH, brometo de alilo, THF, DMF; b) bis-(trimetilsilil) ureia, N,N-dimetilanilina, 200°C; c) 3 N HCl; iii. a) bromoacetato de etilo, K2CO3, acetona, refluxo; b) para 15, 46 N,N-dimetiletilenodiamina, tolueno, refluxo; para 17, i) Pd/C, H2, EtOAc; ii. N,N-dimetiletilenodiamina, tolueno.
Esquema 4 &
ccTifonrero do cone paicial confómeio c s £ S S X f r 1 Xpf \ 80 : Íi<5 f' confonrero do cone paxcial confomsrc < CQ:B » i 1 Γ H 4 j. w & i. a) l-bromo-3-metilbutano, NaH, THF, DMF, refluxo; b) AgC02CF3, I2, CHCI3, refluxo; ii. acrilato de etilo, Pd(OAc)2, tri(O-tolueno)fosfina, EtsN, DMF, 80°C; iii. Pd/C, HC02NH4, EtOH, THF, 60°C; iv. N, N-dimetiletilenodiamina, 140°C, tubo selado.
Esquema 5
NaOH, v & , -y t A. i nn 1 * * —* 0^ JCU ·: $ $<* O^S>5 H >. m EtOH, H20, refluxo; ii. a) S02C12 puro, u , ’ ?í refluxo; b) i
Et3N, THF, 47Esquema 6 •φ'' 1 ig i r I i °-1 0B Çiíí
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OíS ^ SèS< κη^»% H V^AvVa/vV M í í i JL· o., o»« cl } *SH 1t Λ a ÍSS^ i. cloroacetoni trilo, Nal, K2C03, acetona, refluxo; n· a)
LiAlH4, Et20, THF; b) 1,3-Bis-(tert-butoxicarbonil)-2- metil-2-tiopseudoureia, HgCl2f Et3N, CH2C12; iii. TFA, 5% anisolo em CH2CI2
Esquema 7
.A l| 1 Λ ν,..Ά,Χ í s & OH V
2S
ιΠrV C-Sf 4-' si'·' isi ---------— .0 'V· s ÔH 1 ir 11 'X I. A « f«sS»í ts 3ΐ L- 1. 32
ÊiH Ί,,Α,.... W 5«·$, H 4-bromo-MeOH; b)
Acetona; ii. NaBH4, C0CI2, i. 4-bromo-butironitrilo, K2C03, butironitrilo, NaH, DMF; iii. a 1,3-Bis-(tert-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudoureia, HgCl2, Et3N, CH2CI2; iv. TFA, 5% anisolo em CH2CI2
Esquema 8 48
i. cloroacetonitrilo, Nal, K2CO3, acetona, refluxo, ii. a) LÍAIH4, Et20, THF; b) 1,3-Bis-(tert-butoxicarbonil)-2- metil-2-tiopseudoureia, HgCÍ2, Et3N, CH2CI2; ίϋ· TFA, 5¾ anisolo em CH2CI2
Esquema 9
fg ιΠ 1
OH
X
O' R 37 3# tu i. bromoacetato de etilo, K2CO3, acetona, refluxo; ii. para 40, N,N-dimetiletilenodiamina, tolueno, refluxo; para 41, a) N-Boc etilenodiamina, tolueno, refluxo; b) TFA, 5% anisolo em CH2C12
Exemplo 1
Tetraéster 2. 4-t-Butilcalix[4]areno 1 (3,2 g, 5,0 mmol) e K2C03 (4,1 g, 30 mmol) refluíram em acetona durante uma hora e depois adicionou-se bromoacetato de etilo (4,4 mL, 40 mmol). Esta mistura reacional refluiu durante 24 horas. 49
Após arrefecimento, a mistura reacional foi filtrada numa almofada de Celite e foi enxaguada com CH2CI2. 0 filtrado foi concentrado sob vácuo, dando origem um óleo amarelo. 0 tetraéster 2 (4,0 g, 81 %) foi obtido na forma de um cristal branco do tipo agulhas por cristalização a partir de uma solução de CH2CI2 e etanol (~ 1:4) . 1H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 6,78 (s, 8H) , 4,86 (d, J= 12,6 Hz, 4H) , 4,80 (s, 8H) , 4,21 (q, J= 7,3 Hz, 8H) , 3,19 (d, J= 12,6 Hz, 4H) , 1,29 (t, J= 7,3 Hz, 12 H), 1,07 (s, 36H).
Exemplo 2
Tetra-amina 3. Tetraéster 2 (198,6 mg, 0,2 mmol) e N,N- dimetiletilenodiamina (0,88 mL, 40 mmol) foram dissolvidos em tolueno (0,2 mL) e a reação foi monitorizada por ESI. Após agitação à temperatura ambiente durante 36 horas, os componentes voláteis foram removidos sob vácuo. O resíduo foi triturado em éter, dando origem à tetra-amina 3 ( 196, 6 mg, 85%) na forma de um sólido branco. 1H NMR (500 MHz, CDC1 3) δ 7,67 (t largo, J = 6,0 Hz, 4H) , 6, 77 (s, 8H) , 4,52 (s, 8H) , 4,49 (d, J = 13,0, 4H), 3,45 (dt largo, J = 6,5, 6, 0 Hz, 8H) , 3,23 (d, J = 13,0 Hz, 4H) , 2, 47 (t, J = 6,5 Hz, 8H) , 2,23 (s, 24 H ) , 1, 07 (s, 36 H); 13C NMR (125 MHz) δ 170,0 (4 C), 153,2 (4C), 145,8 (4C), 132,9 (8C), 125,9 (8 C) , 74,8 (4 C) , 67,6 (4C), 58,3 (4C) , 45,5 (8C), 37,3 (4C), 34,1 (4C), 31,5 (12C); HRMS (ESI) m/z calculado para CesHiosNgNaiOs (M+H+Na)2+ 592,3977, experimental 592,3992.
Exemplo 3
Tetra-amina 4. Tetraéster 2 (49,7 mg, 0,05 mmol) e iV-Boc etilenodiamina (A. Eisenfuhr et ai., Bioorg. Med. Chem. 2003, 1_1, 235-249) (320,2 mg, 2,0 mmol) foram dissolvidos em tolueno (0,4 mL). A solução límpida amarelo claro foi aquecida a 80 °C. Após duas horas, a mistura reacional 50 ficou turva. Após 18 horas, a reação estava completada, como indicado por ESI. A mistura reacional foi arrefecida e submetida a partição entre CH2C12 e água. A fase orgânica foi combinada, foi seca (Na2S04) e concentrada. O resíduo foi dissolvido numa quantidade mínima de CH2C12 e foi precipitado por éter, dando origem à tetra-amina protegida com Boc na forma de um sólido branco.
Este sólido foi dissolvido numa solução de CH2C12 com 40% TFA e 5% anisolo e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 15 horas. Os componentes voláteis foram removidos sob vácuo e o resíduo foi triturado em éter, dando origem ao sal TFA de tetra-amina 4 (52,5 mg, 70%) na forma de um sólido branco. 1H NMR (300 MHz, CD3OD, 55 °C) δ 6,95 (s largo, 8H) , 4,59 (s, 8H) , 4,50 (d, J — 12,9 Hz, 4 H) , 3,64 (t, J = 5,9 Hz, 8H) , 3,33 (d, J = 12,9 Hz, 4H) , 3,19 (t, J = 6,0 Hz, 8H) , 1,13 (s, 36H) / HRMS (ESI) m/z calculado para CgoHgoNgOs (M+2H)2+ 525, 3441, experimental 525,3446.
Exemplo 4 O-Alilcalix[4]areno 5. A uma suspensão de t-butil-calix [4 ] areno 1 (3,2 g, 5,0 mmol) em tolueno (30,0 mL) adicionaram-se AICI3 (5,2 g, 40 mmol) e fenol (3,8 g, 40 mmol). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas e depois adicionou-se 0,2 N HC1 (50,0 mL). Após 5 minutos, a mistura reacional foi extraída com CH2C12, e a fase orgânica combinada foi concentrada. Adicionou-se metanol (50,0 mL) aos resíduos para criar uma pasta, de onde foi recolhido calix[4]areno des-t-butilado (2,0 g, 94%) na forma de um sólido branco.
A uma solução deste tetrafenol (746 mg, 1,8 mmol) em THF 51 (45,0 mL) e DMF (4,5 mL) adicionou-se NaH (697 mg, 29 mmol). A mistura reacional refluiu durante 1 hora e adicionou-se brometo de alilo (7,6 mL, 88 mmol).
Continuamente aquecida durante 5 horas, a mistura reacional foi arrefecida e filtrada numa almofada de Celite. O filtrado foi diluído com EtOAc e lavado com solução salina. A fase orgânica foi separada, seca (Na2S04) e concentrada. Obteve-se O-alilcalix[4]areno 5 (703,2 mg), por cristalização a partir de etanol, na forma de cristais brancos do tipo agulhas. Depois de a água mãe ter sido adicionalmente purificada por cromatografia "flash" (1 %
EtOAc em hexanos), recolheu-se mais calix[4]areno 5 (277,9 mg), dando origem a 95% de rendimento total. O espetro de 1H NMR mostrou que a amostra era uma mistura de mais do que dois rotâmeros (cone e cone parcial) (CD Gutsche et al.,
Tetrahedron 1983, 39, 409) . 1H NMR (300 MHz, CD3C1) δ 7, 29 - 6,43 (m, 12 H, ArH) , 6,38 - 5, 80 (m, 4H, C=CH-C), 5, 44 - 4,74 (m, 8H, 0¾ =C) , 4,47 - 3, 87 (m, 8H, OCH2C) , 4,43 - 3,68 (muitos ds, J * 13 Hz, 4H, ArCH2Ar) , 3,62 - 3, 05 (muitos ds, <7 * 13 Hz, 4H, ArCH2Ar) .
Exemplo 5 O-Metalilcalix[4]areno 6. De acordo com o procedimento descrito para calix[4]areno 5, calix[4]areno (212,2 mg, 0,5 mmol) em THF (5,0 mL) e DMF (0,5 mL) foi tratado com NaH (200, 0 mg, 8,2 mmol) e cloreto de metilalilo (2,2 mL, 25 mmol) . Manipulação padrão e purificação por cromatografia "flash" (1 % EtOAc em hexanos) deram origem a 0- metilalilcalix[4]areno 6 (320,3 mg, 100%) na forma de um óleo incolor. 1H NMR (500 MHz, CD3C1) δ 7,30 - 6,21 (m, 12H, ArH) , 5,24 - 4, 68 (m, 8H, CH2=C) , 4, 49 - 3, 66 (muitos 4,03 (m, 8H, OCH2C) ds, J « 13 Hz, 4H, ArCH2Ar) , 4,41 - 52 3,61 - 3,07 (muitos ds, J * 13 Hz, 4H, ArCH2Ar) , 1,92 - 1,53 (m, 12H, C=CCH3-C) .
Exemplo 6 4-Alilcalix[4]areno 7. O-Alilcalix[4]areno 5 (338,8 mg, 0,58 mmol) foi dissolvido em N, N-dimetilanilina pura (6 mL) e agitado a 210 °C durante 2 horas. A mistura reacional foi arrefecida e derramada em água gelada (50,0 mL) com HC1 concentrado (50,0 mL) . A mistura foi agitada durante 10 minutos e extraída com CHC13. A fase orgânica foi separada, seca (Na2S04) e concentrada. Cristalização a partir de etanol deu origem a 4-alilcalix[4]areno 7 (271,0 mg) na forma de cristais brancos finos. A água mãe foi concentrada e cristalizada, dando origem a mais produto desejado (15,1 mg) com 84% de rendimento total. 1H NMR (500 MHz, CDC13) δ 10,16 (s, 4H) , 6,84 (s, 8H) , 5,86 (ddt, J= 17,0, 10,5, 6,8 Hz, 4H), 5,04 (d largo, J = 17,0 Hz, 4H), 5,03 (d largo, J = 10,5 Hz, 4H) , 4,19 (d largo, J = 9,0 Hz, 4H) , 3,45 (d largo, J= 9,0 Hz, 4H) , 3,18 (d, J= 6,8 Hz, 8H) .
Exemplo 7 4-metalilcalix[4]areno 8. De acordo com o procedimento descrito para 4-alilcalix[4]areno 7, O-metalilcalix[4]areno 6 (44,5 mg, 0,069 mmol) foi sujeito a um rearranjo de
Claisen em N, N-dimetilanilina pura (1 mL) . Manipulação padrão e cristalização deram origem a 4-metalilcalix [4] areno 8 (27,6 mg). A purificação adicional da água mãe deu origem a mais produto desejado (2,4 mg) com 67% de rendimento total. 3Η NMR (500 MHz, CDC13) δ 10,19 (s, 4H) , 6,88 (s, 8H), 4,77 (s largo, 4H), 4,68 (s largo, 4H), 4,21 (d largo, J = 12,5 Hz, 4H) , 3,45 (d largo, J = 12,5 Hz, 4H) , 3,10 (s, 8H) , 1,63 (s, 12H) ; 13C NMR (125 MHz) δ 147,3 (4 C), 145,4 (4 C), 133,3 (8C), 129,5 (8C), 128,2 (4C), 112,0 53 (4C), 44,0 (4C) , 32,0 (4C), 22,3 (4 C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C44H48Nai04 (M+Na)+ 663,3450, experimental 663,3446.
Exemplo 8
Tetraéster 9a e 9b. De acordo com o procedimento descrito para o tetraéster 2, 4-alilcalix[4]areno 7 (116,9 mg, 0,2 mmol) em acetona (4,0 mL) foi tratado com K2C03 (221,1 mg, 1,6 mmol) e bromoacetato de etilo (0,18 mL, 1,6 mmol) . Manipulação padrão deu origem ao produto em bruto na forma de um óleo que foi dissolvido em EtOAc (4 mL) . Após adição de Pd em carbono ativado (10%, 95,6 mg), a mistura reacional foi agitada sob uma atmosfera de H2 durante 2 horas e depois foi filtrada numa almofada de Celite. 0 filtrado foi concentrado, e cristalização a partir de uma solução de CH2C12 e metanol (~1:4) deu origem ao tetraéster 9a (111,9 mg) na conformação em cone na forma de cristais transparentes do tipo agulhas. A água mãe foi
adicionalmente purificada por MPLC (20% EtOAc em hexanos), dando origem a mais tetraéster 9a (4,2 mg) e 9b (na conformação em cone parcial, 4,0 mg) com 62% de rendimento total para o rotâmero em cone e 2% de rendimento para o rotâmero em cone parcial. Confórmero em cone 9a: 1 H NMR
(500 MHz, CDCI3) δ 6,48 (s, 8H) , 4,80 (d, J = 13,0 Hz, 4H) , 4, 73 (s, 8H) , 4,20 (q, J = 7,5 Hz, 8H) , 3,13 (d, J = 13, 0 Hz, 4H) , 2,24 (t, J = 7,3 Hz, 8H) , 1,40 (tq, J = 7,3, 7,3 Hz, 8H) , 1,28 (t, J = 7,5 Hz, 12H) , 0,81 (t, J = 7,3 Hz, 12H) . 13r r ^ NMR (125 MHz, CDC13) δ 170,6 (4C), 153,8 ( 40 , 136, 8 (4C), 134,2 (8C), 128,6 (8C), 71,6 (4C) , 60,6 ( 40 , 37,4 (4C) , 31,7 (4C), 24,7 (4C) , 14,4 (4C), 13 ,9 (4C); HRMS (ESI) m/z calculado para C56H72NaiOi2 (M+Na)+ 959, 4921, experimental 959,4921. Confórmero em cone parcial 9b: 1H NMR (500 MHz, CDC13) δ 7,23 (s, 2H) , 6, 83+ (d, J * 2, 2H) , 54 6, 83 (s, 2H) , 6, 12 (d, J = 2,1 Hz, : 2H), 4,40 (d, J = 14,0 Hz, 2H) , 4, 38 (s, 4H) , 4, 31-4 ,24 (m, 6H) , 4 ,21 (s , 2H) , 4, 07 (s, 2H) , 4, 01 (q, J = 7,0 Hz, 2H) , 3,80 (d, J = 13,4 Hz, 2H) , 3, 69 (d, J = 13, 4 Hz, 2H) , 3,08 (d, J = 14 , 0 Hz, 2H) , 2, 61 ( :t, J = 1 ,8 Hz, r 2H) , 2,54 (t, J = 7,3 Hz , 2H) , 2,22 (ddd f j = 14,0, 9, 1, 7 ,2 Hz , 2H) , 2,12 (ddd, J = 14,0, 8,8, 6, 9 Hz , 2H), 1, 70 (tq, J = 7,8, 7,4, 2H), 1, 65 (tq, J = 7, 4, 7, 3 Hz, 2H) , 1, 37 - 1,30 (m, 4H), 1,35 (t , J = 7,0 Hz, 3H) , 1, 33 (t, J = 6, 7 Hz, 6H) , 1,18 (t, J -- = 1 , 3 Hz, 3H) , 1,01 ( :t, J = 7 ,4 Hz, r 3H) , 0, 94 (t, J = 7,4 Hz , 3H), 0, 82 (t, J ^ = 7 ,4 Hz, 6H) .
Exemplo 9
Tetraéster 10. De acordo com o procedimento descrito para o tetraéster 2, 4-metalilcalix[4]areno 8 (96,1 mg, 0,15 mmol) em acetona (3,0 mL) foi tratado com K2C03 (165, 8 mg, 1,2 mmol) e bromoacetato de etilo (0,13 mL, 1,2 mmol). Manipulação padrão deu origem ao produto em bruto, que foi sujeito a hidrogenação com Pd em carbono ativado (10%, 70 mg) em EtOAc (3 mL) . Purificação do produto reduzido em bruto por cromatografia "flash" (15% EtOAc em hexanos) deu origem ao tetraéster 10 do tipo óleo (148,0 mg, 100%) na conformação em cone. 1H NMR (500 MHz, CDC13) δ 6,47 (s, 00 4,80 (d, J = 13,2 Hz, 4H) , 4,75 (s, 8H ), 4,20 (q, J = 7,4 Hz, 8H), 3,14 (d, J = 13,2 Hz, 4H), 2, 11 (d, J = 7,4 Hz, 8H) , 1,59 (m, 4H) , 1,28 (t, J = 7,4 Hz, 12H) , 0,75 (d, J = 6,1 Hz, 24H) ; 13 C NMR (75 MHz, CDC13) δ 170,7 ( 4C) , 153, 7 (4C) , 135,8 (4C) , 134 ,0 ( 8C), 129,4 ( 8C), 71,5 ( 40 , 60,5 (4 C), 44,9 (4 C), 31,6 (4C) , 30,4 (4C), 22,4 (8C), 14,4 (4C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para OoHsoNaiO^ (M+Na) + 1015,5547, experimental 1015,5575.
Exemplo 10 55
Tetra-amina 11a. N,N- Dimetiletilenodiamina (0,22 mL, 2,0 iratiol) em CH2CI2 (0,5 mL) foi tratada com Α1ΜΘ3 (2,0 M em tolueno, 1,0 mL) a 0 °C. A mistura reacional foi deixada aquecer para a temperatura ambiente e foi agitada durante 15 minutos. Adicionou-se tetraéster 9 (93,1 mg, 0,1 mmol) em CH2CI2 (1,0 mL) através de uma cânula, e a mistura foi aquecida para 40 °C e agitada durante a noite. A reação foi cuidadosamente arrefecida de modo rápido com 1 N HC1. Depois de a camada aquosa ter sido ajustada para pH=8 com NaHCCb aquoso saturado, a mistura foi extraída com CHCI3. A fase orgânica combinada foi lavada com solução salina, foi seca (Na2SC>4) e concentrada, dando origem à tetra-amina 11a na forma de uma espuma sólida amarelo claro (98,9 mg, 90%). 3H NMR (500 MHz, CDC13) δ 7,58 (t largo, J = 6,4 Hz, 4H) , 6,42 (s, 8H) , 4,46 (s, 8H) , 4, 41 (d, J = 13 , 8 Hz, 4H) , r 3,42 (dt, J = 6,9, 6,4 Hz, 8H) , 3, 15 (d, J = 13 ,8 Hz, 4H) , , 2,44 (t, J = 6, 9 Hz, 8H), 2,24 (t, J = 7, 4 Hz, 8H) , 2 / , 20 (s, 24 H), 1,44 (ap sexteto, J ~ 7 Hz, 8H) r 0, 84 (t , 7 = 7, ,2 Hz, 12H) ; 13C NMR (125 MHz, CDC13) δ 169,8 (4C) , 153,8 (4C), 137,0 (4C), 133,6 (8C), 128,8 (8C), 74,4 (4C), 58,2 (4C), 45,5 (8C), 37,4 (4C) , 37,2 (4C) , 31,3 (4C) , 24,6 (4C) , 13,8 (4C); HRMS (ESI) m/z calculado para C64H97N808 (M+H) + 1105,7429, experimental 1105,7471.
Exemplo 11
Tetra-amina 12. Tetraéster 10 (146,8 mg, 0,15 mmol) em tolueno (1,5 mL) e metanol (1,5 mL) foi tratado com N,N-dimetiletilenodiamina (0,32 mL, 2,96 mmol) e foi agitado num tubo selado a 80 °C durante 24 horas. Os componentes voláteis foram removidos sob vácuo (~ 60 °C temperatura do banho), para dar origem a um sólido viscoso castanho claro. O sólido foi dissolvido numa quantidade mínima de CH2CI2, e obteve-se tetra-amina 12 (103,6 mg, 60%) na forma de um 56 sólido amarelo claro pela sequência de adição gota-a-gota de éter (razão final -10:1 de Et20 : CH2CI2) , centrifugação, decantação e secagem. 1H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 7,74 (t largo, J = 5, 8 Hz, 4H), 6, 39 (s, 8H) , 4,48 (s, «·. 00 4,44 (d, J - = 13, 5 Hz, 4H) , 3,46 (dt, J = 6,2, 5,8 Hz, 8H) , . 3, 16 (d, J -- = 13, 5 Hz, 4H) , 2,50 (t, J = 6, 2 Hz, 8H) , 2, , 25 (s, 24 H) , 2, 10 (d, J = 7,0 Hz, 8H) , 1,65 (m, 4H), 0, 80 (d. , J = 6, 2 Hz , 24H) ; 13C NMR (125 MHz, CDCI3 ) δ 170, 0 (4C) , 153, 8 (4C) f 136,2 (4C) , 133,4 (8C), 129,7 (8C) , 74,5 (4C) , 58,2 (4C) f 45,4 (8C), 45,0 (4C), 37,1 ( 40 , 31,3 (4C) , 30, 5 (4C) , 22,4 (8C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para CesHiosNeOe (M+H)+ 1161,8055, experimental 1161,8091.
Exemplo 12 25,27-Di-(2-metaliloxi)-26,28-di-hidroxicalix[4]areno 14. À suspensão de calix[4]areno (42,4 mg, 0,1 mmol) em acetona (5 mL) adicionou-se K2C03 (221, 1 mg, 1,6 mmol) e a mistura refluiu durante 1 hora. Após arrefecimento adicionaram-se à mistura reacional Nal (749,4 mg, 5,0 mmol) e cloreto de 2-metilalilo (0,49 mL, 5,0 mmol), que depois refluiu durante a noite. A mistura reacional foi filtrada numa almofada de Celite e foi enxaguada com CH2CI2. O filtrado combinado foi lavado com solução salina, foi seco (Na2SC>4) e concentrado. Cristalização do resíduo a partir de uma solução de CH2CI2 e etanol (~1:4) deu origem a 25, 27-dimetaliloxi-26, 28-di-hidroxicalix [4]areno 14 na forma de um cristal amarelo em agulhas (40 mg, 75%). 1H NMR (500 MHz, CDC13) δ 8,03 (s, 2H) , 7,06 (d, J = 7,2 Hz, 4H) , 6,90 (d, J = 7,0 Hz, 4H) , 6,74 (t, J = 7,2 Hz, 2H) , 6,65 (t, J = 7,0 Hz, 2H) , 5,46 (s, 2H) , 5,12 (s, 2H) , 4,38 (s, 4H) , 4,32 (d, J= 13,3 Hz, 4H) , 3,38 (d, J = 13,3 Hz, 4H) , 2,07 (s, 6H) ; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 153,6 (2C) , 151,9 (2C) , 140,9 (2C) , 133,5 (2 C) , 129,2 (4C) , 128,7 (4C), 128,1 (4C), 125,6 (4C), 119,1 57
(2 C) , 113,6 (2C) , 80,4 (2C) , 31,5 (4C), 20,1 (2C) / HRMS (ESI) m/z calculado para C36H36Nai04 (M+Na)+ 555,2511, experimental 555,2520.
Exemplo 13 5,17-Di-(2-metalil)-11,23-dialilcalix[4]areno 15. De acordo com o procedimento descrito para calix[4]areno 5, calix[4]areno 14 (35,7 mg, 0,07 mmol) em THF (1,0 mL) e DMF (0,1 mL) foi tratado com NaH (26,5 mg, 1,1 mmol) e brometo de alilo (0,3 mL, 3,3 mmol) . Manipulação padrão e purificação por cromatografia "flash" (1 % EtOAc em hexanos) deram origem a 25, 27-dimetaliloxi-26, 28-dialiloxi-calix[4]areno (40,1 mg, 98%) na forma de um óleo incolor. O derivado calix[4]areno acima (122,6 mg, 0,2 mmol) e bis-(trimetilsilil)-ureia (327,1 mg, 1,6 mmol) em N,N-dimetilanilina (4 mL) foram agitados a 210 °C durante 4 horas. A mistura reacional foi arrefecida e derramada em água gelada (30,0 mL) com HCl concentrado (30,0 mL) . A mistura foi agitada durante 10 minutos, foi extraída com CHC13 e concentrada. 0 resíduo resultante foi dissolvido em MeOH-CH2Cl2 (2 mL, 1:1 ). Após adição de 3 N HCl (0,7 mL) , a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 10 horas. Após remoção dos componentes voláteis obteve-se 5,17-Di-(2-metalil)-11,23-dialilcalix[4]areno 15 (82,5 mg, 67% ) na forma de um sólido quase branco por tratamento do resíduo concentrado com MeOH . XH NMR (500 MHz, CDC13) δ 10,2 (s, 4H) , 6,84 (s, 4H), 6,83 (s, 4H) , 5, 85 (ddt, J = 17,1, 10,5, 6,9 Hz, 2H) , 5, 03 (d largo, J = 17,1 Hz, 2H) , 5, 02 (d largo, J = 10, 5 Hz, 2H) , 4,77 (s, 2H), 4,69 (s, 2H), 4,21 (d largo, J= 12,7 Hz, 4H), 3,45 (d largo, J= 12,7 Hz, 4H) , 3,17 (d, J= 6,9 Hz, 4H) , 3,11 (s, 4H) , 1,64 (s, 6H) ; 13C NMR (75 MHz, CDC13) δ 147,3 (2C), 58 147,2 (2C) , 145, 4 (2C) , 137,8 (2C) , 133, 7 (2C) , 133, 3 (2C) 129, 5 (4C) , 129, 2 (4C) , 128,4 (4C) , 128,2 (4C) , 115, 8 (2C) 112,0 (2C) , 43, 9 (2C) , 39, 6 (2C) , 32,0 (4C) , 22,3 (2C) HRMS (ESI) m/z calculado para C42H44Nai04 (M+H) + 635, 3137, experimental 635,3145.
Exemplo 14 5, 17-Di- (2-metalil) -ll,23-dialil-25,26,27,28-tetraquis-iV-{N, W-dimetil-2-aminoetil)carbamoílmetoxicalix[4]areno 16.
De acordo com o procedimento descrito para o tetraéster 2, calix [ 4 ] areno 15 (61,3 mg, 0,1 mmol) em acetona (2,0 mL) foi tratado com K2CO3 (110,5 mg, 0,8 mmol) e bromoacetato de etilo (0,09 mL, 0,8 mmol). Manipulação padrão e cromatografia (20% EtOAc em hexanos) deram origem ao tetraéster desejado (66,4 mg, 69%) na forma de um óleo. O tetraéster acima (30,7 mg, 0,03 mmol) em MeOH (0,3 mL) e tolueno (0,3 mL) foi tratado com N, N-dimetiletilenodiamina (0,14 mL, 1,28 mmol) e foi agitado num tubo selado a 80 °C durante 48 horas. Após remoção de componentes voláteis, o resíduo foi triturado com éter, dando origem à tetra-amina 16 (24,5 mg, 73%) na forma de um sólido amarelo claro. 1H NMR (500 MHz, CDC13) δ 7,94 (t largo, J= 6,5 Hz, 2H) , 7,33
(t largo, J = 6,5 Hz, 2H) , 6,73 (s, 4H) , 6 17 (s, 4H) , 5, 65 (ddt / J = 17,1 ., 10 ,5, 6, 8 Hz, 2H) , 4,91 (dd, J = 10,5, 1,4 Hz, 2H) , 4,85 (dd. , J = 17,1, 1,4 Hz, 2H) , 4,80 (s, 2H) , 4, 65 (s, 2H) , 4, 61 (s , 4H) , 4, 45 (d, J = 13,5 Hz, 4H) , 4,33 (s, 4H) , 3, 50 (dt, J » 6, 6 Hz / 4H), 3, ,37 (dt, J % 6,6 Hz, 4H) , 3, 17 (d, J = 14, 7 Hz, , 4H) / 3,16 ( s, 4H) , 2,8 6 (d, J = Oi 00 Hz, 4H), 2 , 52 (t, J = 6, 4 Hz, 4H), 2,40 (t, J = 6, 4 Hz, 4H) , 2,24 (s, 12H) , 2,19 (s, 12H) , 1, ,68 (s, 6H) ; 13c NMR (125 MHz, CDCI3) δ 170,2 (2C) , 169,5 (2C) , 154,9 (2C) , 153,4 (2C), 145,9 (2C) , 137,8 (2C) , 134,9 (4C), 134,4 (2C) , 59 134,3 (2 C) , 132,9 (4C), 130,1 (4C) , 128,5 (4C), 115,4 (2C) , 111,6 (2C), 74,7 (2C) , 74,2 (2C) , 58,3 (2C) , 58,1 (2C) , 45,5 (4C) , 45,4 (4C) , 44,1 (2C) , 39,6 (2C) , 37,1 (2C) , 37,1 (2C), 31,3 (4C), 22,3 (2C)/ HRMS (ESI) m/z calculado para C66H93N8O8 (M+H) + 1125,7116, experimental 1125, 7213.
Exemplo 15 5,17-Di-(2-metilpropi])-11,23-dipropil-25,26,27,28-tetra-quis-N- (N,N-dimetil-2-aminoetil)carbamoílmetoxicalix[4] areno 17. 0 tetraéster (35,1 mg, 0,04) descrito no procedimento para calix[4]areno 16 foi dissolvido em EtOAc (1 mL) e foi tratado com Pd em carbono ativado (10%, 20 mg) a uma atmosfera de H2. Após 2 horas, a mistura reacional foi filtrada numa almofada de Celite e foi enxaguada com CH2C12. 0 filtrado combinado foi concentrado e purificado por MPLC (15% EtOAc em hexanos), dando origem ao tetraéster saturado (32,6 mg, 91 %) na forma de um óleo incolor.
O tetraéster saturado acima (32,6 mg, 0,03 mmol) foi agitado em N, iV-dimetiletilenodiamina pura (0,15 mL, 1,37 mmol) à temperatura ambiente durante 24 horas. Depois de ser concentrado, o resíduo foi triturado com éter, dando origem à tetra-amina 17 (21,4 mg, 56%) na forma de um sólido amarelo claro. 1H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 7,87 (t, J = 6, 0 Hz, 2H), 7, 36 (' t, J = 5,9 Hz, 2H) , 6, 63 (s, 4H) , 6 , 20 (s, 4H), 4,58 ( s, 4H) , 4,43 (d, J = 13, 9 Hz, 4H) , 4, 36 (s, 4H) , 3,48 (td, J 7 ~ /, 6 Hz, 4H) , 3,38 (td , J x s 6, 6 Hz, 4H), 3, 15 (d, J = 13, ! 9 Hz, 4H) , 2,49 (t, J = 6, 6 Hz, 4H) , 2 ,39 (t, J = 6,2 Hz f 4H) , 2,28 (d, J = 2,7 Hz, 4H) , 2,23 (s, 12H) , 2,18 (s, 12H) , 2, 06 (t, J = 7,0 Hz, 4H) , 1, 78 (m, 2H) , 1,30 (tq, J = 7, 5, 7,C ) Hz, 4H) , 0,87 (d J = 6,8 Hz, 12H) , 0,78 (t, J = 7, ,5 Hz, 6H) ; 13C NMR (125 MHz, , CDCI3 ) δ 170,3 (2C) , 169,7 (2C) , 154,4 (2C) , 153,1 (2C) , 137,1 (2C) , 60 136,2 (2C) , 134,4 (4C), 132,7 (4C) , 130, 1 (4C) , 128,4 (4C) , 74,7 (2C) , 74,2 (2C), 58 !,3 (2C), 58, 1 (2C) , 45, 4 (4C), 45, 4 (4C) , 44, 9 (2C), 37,4 (2C) , 37, 1 (2C) , 37,1 (2C) , 31,3 (4C) , 30, 7 (2C), 24,5 (2C) , 22, 4 (4C) , 14,0 (2C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para εββΗιοιΝβΟδ 1 (M+H) + 1133, 7742, experimental 1133,7813.
Exemplo 16 5,11,17,23-Tetraiodo-25,26,27,28-tetra(3-metilbutoxi)calix [ 4]areno (18a e 18b). Cal ix[4]areno 13 (424,5 mg, 1,0 mmol) em THF (25 mL) e DMF (2,5 mL) foi tratado com NaH (384,0 mg, 16,0 mmol). A mistura reacional refluiu durante 1 hora seguido da adição de l-bromo-3-metilbutano (6,0 mL, 50,0 mmol), e a reação continuou durante 18 horas adicionais sob refluxo. Após arrefecimento, a mistura reacional foi filtrada numa almofada de Celite, e o filtrado foi lavado com solução salina, foi seco (Na2S04) e concentrado. 0 resíduo foi purificado por cromatografia "flash" (2% EtOAc em hexanos), dando origem a tetra-iso-amiloxicalix[4]areno (690,6 mg, 98%) na forma de um óleo incolor. À suspensão de Ag2CC>3 (711,4 mg, 2,6 mmol) e TFA (0,4 mL, 5,2 mmol) em CHCI3 (40 mL, qualidade reagente, etanol estabilizador não removido) adicionou-se o tetra-iso-amiloxicalix [ 4 ] areno (672,2 mg, 0,9 mmol) e a mistura reacional refluiu durante 3 horas. Após arrefecimento adicionou-se I2 (3324,9 mg, 13,1 mmol) e a mistura reacional refluiu durante 18 horas adicionais. Após arrefecimento removeu-se Agi por filtração em Celite e o filtrado violeta foi descorado por lavagem com 10% (p/v) hidrogenossulfito de sódio (50 mL) . O extrato orgânico foi recolhido, seco (Na2SC>4) e concentrado. Recolheram-se 4-iodo-3-metilbutoxicalix[4]areno 18a e 18b (881,9 mg, 77%) 61 na forma de um sólido rosa claro após cromatografia "flash" (2% EtOAc em hexanos) . 1H NMR indicou que se trata de uma mistura do confórmero em cone 18b e confórmero em cone parcial 18a numa razão de 1,8 para 1. Para o confórmero em cone 18b: 1H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 7,0 (s, «·. co 4,27 (d, J = 13,0 Hz, 4H) , 3, 89 (t largo, J = 7,6 Hz, 8H) , 3, 06 (d, J = 13,0 Hz, 4H) , 1/7 (m, 12H) , 0,94 (d, J = 6,3 Hz, 24H) f para o confórmero em cone parcial: 1H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 7, 54 (s, 2H) , 7,38 (s. , 2H) , 7,28 (d, J = 2,2 Hz, 2H) , 6, 64 (d, J = 2,2 Hz, 2H) , 3,97 (d, J = 13, 4 Hz, 2H) , 3, 81 (t, J = 6, 7 Hz, 2H) , 3, 75 (m, 2H) , 3, 63 - 3, 45 (m, 4H) , 3, 53 (d, J = 13, 0 Hz, 2h; ), 3,48 (d, J = 13, 0 Hz, 2H) , 2, 98 (d, J = 13, ,4 Hz, 2H) , 1/ 94 (nonet, 1H) , 1,85 (td / J = 6, 6 Hz, 2H) , 1/ 78-1 ,70 (m, 6H), 1, 31 - 1,26 > (m, 3H) , 1, 12 (d, J = 6, 9 Hz, 6H) , 1, 03 (d, J = 6, 6 Hz / 6H) / 0, 99 (d, J = : 6,1 Hz, 6H) , 0, 88 (d, J = 6, 3 Hz, 6H ); HRMS ( :esd m/z calculado para C48H60l4NaiO4 (M+Na)+ 1231,0568, experimental 1231, 0641.
Exemplo 17
Tetraéster insaturado 19a e 19b. Um tubo apto a ser selado com 4-iodocalix [4 ] arenos 18a e 18b (241,7 mg, 0,2 mmol) ,
Pd(0Ac)2 (27,0 mg, 0,12 mmol) e tri-o-tolilfosfina (121,8 mg, 0,4 mmol) foi tratado com vácuo e novamente cheio com Ar três vezes. Adicionaram-se DMF (2,0 mL), Et3N (0,66 mL, 4,8 mmol) e acrilato de etilo (0,52 mL, 4,8 mmol). A mistura reacional foi agitada a 80 °C e foi monitorizada por espetrometria de massa ESI. Passadas 6 horas adicionaram-se mais Pd(OAc)2 (13,5 mg, 0,12 mmol) e tri-o-tolilfosfina (30,5 mg, 0,1 mmol). Depois de terminada a reação como indicado por ESI, a mistura reacional foi arrefecida e filtrada em Celite. O filtrado foi lavado com solução salina, foi seco (Na2S04) e concentrado. Cromatografia "flash" (20% EtOAc em hexanos) do resíduo deu 62
origem ao tetraéster insaturado 19a em conformação em cone parcial (64,6 mg, 29%) e 19b em conformação em cone (111,5 mg, 51 %) . Para o confórmero em cone parcial 19a: 1H NMR (500 MHz, CDC13) δ 7,73 (d, J = 15,8 Hz, 1H) , 7,65 ( d, j = O \—1 Hz, 1H) , 7,46 (s, 2H) , 7,30 (s, 2H) , 7,1« 5 (d, J = 15, 6 Hz, 2H) , 7, 13 í (d, J = 2,0 Hz, 2H) , 6,43 (d, J = 15 ,8 Hz, 1H) , 6, 38 (d, J = 16, 0 Hz, 1H), 6,32 (d, J = 2, 0 Hz r 2H) , 5, 97 (d, J = 15, 6 Hz, 2H) , 4,31 (q, J = 7,2 Hz, 2H) f 4,26 (q, J = 7 ,4 H z, 2h; ) , 4, 23 - 4,15 (m, 4H) , 4,05 (d, J = 13, 5 Hz, 2H) , 3, 92 (t, J = 6, 9 : Hz, 2H), 3,80 (m, 2H) , 3, 64 (m, 6H) , 3, 38 (m, 2H) , 3, 08 (d, J = 13,5 Hz, 2H) , 2,03 (m, 1H) , 1, 92 (m, 4H) , 1, 80 (m, 4H) , 1,37 (t, J = 7,2 Hz, 3H) f 1,33 (t, J = 7,2 Hz, 3Η), 1,30 (t, J = 7,1 Hz, 6H) , 1/ 26 (m, 3H) , 1, 14 (d, J = 7,0 Hz, 6H) , 1,04 (d, J = 5,9 Hz f 6H) , 1, 01 (d, J = 6, 7 Hz, 6H) , 0 ,76 (d, J = 6 ,5 Hz, 6H) ; para 0 confórmero em cone 19b : XH NMR (500 MHz, CDCI3) δ 7, 35 (d, J = 16, 0 Hz, 4H) , 6, 80 (s, 8H) , 6,08 (d, J = 16, 0 Hz ' t 4H) , 4,41 (d, J = 13,3 Hz, 4H) , 4,22 (q, J = 7,1 Hz, 8H) f 3, 95 (t, J = < 5, 9 Hz, 8H) , 3, 17 (d, J = 13,3 Hz, 4H) , 1/ 77 (m, 12H) , 1,32 (t , J = 7,1 Hz, : 12H) , 0,96 (d, J = 6,7 Hz, 2 4H) ; 13C NMR ( 125 MHz, CDC1 3) δ 167,3 (4C), 158, 6 (4C), 1 44,7 (4C) , 135 ,5 ( 80 , 129, ] L (4C ), 128,5 (8C), , 116,4 ( 4C) r 74, 0 (4C) , 60, 4 ( 40 , 39, 0 (4C ), 31,2 (4C), 25, 5 (4C), f 23, 0 (8C) , 14,5 (4C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C68H88NaiOi2 (M+Na)+ 1119,6173, experimental 1119,6274.
Exemplo 18
Tetraéster 20. 0 tetraéster insaturado 19b em conformação em cone (86,5 mg, 0,08 mmol) em THF (0,6 mL) e EtOH (0,6 mL) sob N2 foi tratado com Pd em carbono ativado (10%, 20 mg) e formato de amónio (200 mg, 3,17 mmol) . A mistura reacional num tubo selado foi agitada a 60 °C e monitorizada por ESI. Depois de completada a hidrogenação 63 (~10 horas), a mistura reacional foi arrefecida e filtrada em Celite. 0 filtrado foi concentrado e purificado por MPLC (20% EtOAc em hexanos), dando origem ao tetraéster 20 (67,9 mg, 78%) na forma de um óleo incolor. 1H NMR (500 MHz, CDC13) δ 6,44 (ε 8H) , 4, 35 (d, J = 13,0 Hz, 4H) , 4,11 (q, J = 7 ,4 Hz, 8H) , 3,88 (t, J = 7,5 Hz, 8H) , 3, 04 (d, J = 13,0, 4H), 2, 62 (t largo, J = 8,2 Hz , 8H), 2,39 (t largo, J = 8,2 Hz, 8H ) , 1,77 (m, 2H ), 1,24 (t, J = 7,4 Hz, 12H), 0, 95 (d, J = 6, 1 Hz, 24H ); 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 173,3 (4C) , 155,0 ( 40 1, 134,9 ( :8c; 1, 133,8 (4C), 128,0 (8C), 73,7 (4C) , 60,4 ( 4C) , 39,0 ( 4C) , 36, 5 (4C), 31,2 (4C), 30,6 (4C) , 25, 6 ( :4c ), 23,0 (8C ), 14,5 (4C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para CesHgeNaiO^ (M+Na)+ 1127, 6799, experimental 1127,6825.
Exemplo 19
Tetra-amina 21. Tetraéster 20 (112,8 mg, 0,1 mmol) e N,N- dimetiletilenodiamina (0,44 mL, 4,0 mmol) num tubo selado foram agitados a 140 °C durante 20 horas. Após arrefecimento, a mistura reacional foi submetida a partição entre CH2CI2 e água. A fase orgânica foi separada, seca (Na2SC>4) e concentrada sob vácuo, dando origem à tetra-amina 21 (115,8 mg, 91 %) na forma de um sólido amarelo claro. 3H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 6, 56 (t, J = 5, 5 Hz, 4H) 6, 45 (s, 8H) , 4,35 (d, J = 13,2 Hz, 4H) , 3, 87 (t, J = 7, Hz, 8H) , 3,32 (td, J = 6,6 Hz, 8H) , 3,40 (d, J = 13, 2 Hz 4H) , 5, 27 (t largo , J = ‘ 7,8 Hz, 8H) , 2,41 (t, J = : 6, 1 Hz 8H), 2,27 (t largo, J = 7,8 Hz, 8H), 2,22 (s, 24H) , 1,79 (m, 12H), 0, 95 (d, J = 7, 0 Hz, 24H) ; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 173,0 (4C) , 154,9 ( 4C ), 134,9 (8C), 134,3 (4C) , 128,0 (8C), 73, 8 ( (40, 58,3 ( 4C), 45,4 (80 , 39,1 (4C) , 38,8 (4C), 37, 2 ( (40, 31,3 ( 4C), 31,2 (40, 25,6 (4C) , 23, 0 64 (8C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C76H122N8O8 (M+2H) 2+ 637,4693, experimental 637,4686.
Exemplo 20
Tetra-ácido 22. Tetraéster 2 (2,0 g, 2,0 mmol) em etanol (30 mL) e água (20 mL) foi tratado com NaOH (2,0 g, 50 mmol). A mistura reacional refluiu durante 24 horas. Após arrefecimento, a mistura reacional foi acidificada com 50% h2so4 para pH=l. 0 precipitado foi recolhido após filtração, foi lavado com água e seco sob vácuo, dando origem ao tetra-ácido 21 OO \—1 100%; ) na forma de um sólido branco. 2H NMR (300 MHz, DMSO) δ : 12,2 (s, 4H) , 6,93 (s, 8H: ) , 4, 77 (d, J = 12,5 Hz, 4H), 4,59 (s, 8H), 3, 21 (d, J = 12,5 Hz, 4H), 1,06 (s, 36H); HRMS (ESI) m/z calculado para C52H64NaiOi2 (M+Na) + 903, 4295, experimental 903, 4314.
Exemplo 21
Tetratriazolo 23. A suspensão do tetra-ácido 23 (264,3 mg, 0,3 mmol) em benzeno foi tratada com cloreto de tionilo (1,3 mL, 18,0 mmol). A mistura reacional refluiu durante 3 horas. Após remoção de componentes voláteis sob vácuo, o resíduo foi coevaporado com benzeno. O resíduo foi dissolvido em CH2CI2, foi filtrado em algodão e concentrado. Sem purificação adicional, o cloreto de acilo em bruto em THF (5,0 mL) foi tratado com 1H,1,2,4-triazolo-1-propanamina (Wright, Jr. et al., J. Med. Chem. 2_9, 523- 530 (1986)) (227,1 mg, 1,8 mmol) e EtsN (0,33 mL, 2,4 mmol)
a 0 °C e foi deixado aquecer para a temperatura ambiente. A reação foi monitorizada por ESI. Após 18 horas, a mistura reacional foi diluída com CH2CI2 e filtrada em Celite. O filtrado foi concentrado e depois foi submetido a partição entre CH2CI2 e solução aquosa de NH4CI. A camada aquosa foi ajustada para pH = 1 com 1 N HC1. A fase orgânica foi 65 recolhida e lavada com solução salina. Em seguida, a fase orgânica foi lavada com solução aquosa saturada de NaHCC>3 e solução salina, foi seca (Na2S04) e concentrada, dando origem ao tetratriazolo 23 (233, 0 mg, 59%) na forma de um sólido branco. HRMS (ESI) m/z calculado para C72H96Ni6Na208 (M+2Na)2+ 679, 3696, experimental 679, 3747.
Exemplo 22
Dinitrilo 24. A uma suspensão de 4-t-butilcalix|4]areno 1 (649, 0 mg, 1,0 mmol) em acetona (20 mL) adicionou-se K2CO3 (552,8 mg, 4,0 mmol) . Depois de a mistura reacional ter refluído durante 1 hora adicionaram-se cloroacetonitrilo (0,25 mL, 4,0 mmol) e Nal (599,6 mg, 4,0 mmol) e a mistura foi aquecida sob refluxo durante mais 15 horas. Após arrefecimento, a mistura reacional foi filtrada em Celite e o filtrado foi lavado com solução salina, foi seco (Na2S04) e concentrado. Obteve-se o dinitrilo 24 (418,8 mg) na forma de um cristal branco por cristalização a partir de uma solução de CH2C12 e etanol (~1:4). Recolheu-se mais dinitrilo 24 (62,3 mg) da água mãe por cromatografia "flash" (20% EtOAc em hexanos), com 66% de rendimento total. 1H NMR . (500 MHz, CDCI3) δ 7, 12 (s, 4H) , 6,72 (s, 4H), 5,55 (s, 2H) , 4,80 (s, 4H) , 4, 22 (d / J - = 13,1 Hz, 4H) , 3,44 (d, J = 13,1 Hz, 4H), 1,33 ( s, 18H), 0,88 (s, 18H) ; 13C NMR ( 125 MHz, CDCI3) δ 150,1 (2C) , 148 ,9 (2C), 148,7 (2C), 142 ,7 (2C), 132,0 (4C), 128,0 (4C) , 126,3 (4C), 125, 5 (4C), 115,3 (20 , 60,6 (20, 34,1 (20, 34,1 (20, 31,9 (60, 31,8 (40, 31,0 (60; HRMS (ESI) m/z calculado para C48H58N2Nai04 (M+Na) + 749, 4294, experimental 749, 4264.
Exemplo 23
Diguanidina protegida com Boc 25 e monoguanidina-monoamina protegida com Boc 26. A uma solução de dinitrilo 24 (746,3 66 mg, 1,0 mmol) em éter (10 mL) e THF (5,0 mL) a 0 °C adicionou-se LiAlH4 (0,8 M em éter, 3,8 mL) . A mistura reacional foi deixada aquecer para a temperatura ambiente e foi agitada durante 6 horas. A reação foi cuidadosamente arrefecida de modo rápido com água (360 pL) e 15% NaOH (120 pL) sequencialmente, a mistura reacional foi filtrada em papel de filtro e o filtrado foi lavado com solução salina, foi seco (Na2S04) e concentrado, dando origem à diamina na forma de um sólido branco. A diamina acima e 1,3-bis(tert-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudoureia (656,2 mg, 2,3 mmol) foram dissolvidos em CH2CI2 (5 mL) , seguido da adição de HgCl2 (613,6 mg, 2,3 mmol) e EtsN (0,9 mL, 6,8 mmol). Após agitação durante 15 horas, a mistura reacional foi filtrada em Celite. O filtrado foi lavado com solução salina, foi seco (Na2S04) e concentrado. O resíduo foi purificado por MPLC (14% EtOAc em hexanos), para dar origem à diguanidina protegida com Boc 25 (476,4 mg, 40%) e monoguanidina-monoamina protegida com Boc 26 (152,9 mg, 14%). Composto 25: 1H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 11,45 (s, 2H) , 8,94 (t, J = 6,3 Hz, 2H) , 7,00 (s, 4H) , 6,98 (s, 2H) , 6,74 (s, 4H) , 4,23 (d, J = 12,9 Hz, 4H) , 4,15 (t, J = 5,1 Hz, 4H) , 4,04 (dt, J = 6,3, 5,1 Hz, 4H) , 3.28 (d, J = 12,9 Hz, 4H) , 1,50 (s, 18H) , 1,37 (s, 18H) , 1.28 (s, 18H) , 0,93 (s, 18H) ; 13C NMR (75 MHz, CDC13) δ 163,7 (2C) , 156,6 (2C) , 152,8 (2C) , 150,9 (2C) , 149,8 (2C) , 147,0 (2 C), 141,3 (2C), 132,5 (4C), 127,8 (4C), 125,7 (4C), 125,2 (4C) , 83,0 (2C) , 79,4 (2C) , 74,6 (2C) , 41,1 (2C) , 34,1 (2 C) , 34,0 (2C), 31,9 (6C), 31,8 (4C), 31,2 (6C), 28,5 (6C), 28,1 (6C); HRMS (ESI) m/z calculado para Ο0Η104Ν6Ο12 (M+2H)2+ 610, 3856, experimental 610, 3785.
Composto 26: 2H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 11,46 (s, 1H), 8,99 67 (t, j = - 5 , 5 H: ó 1H ) , 7,80 (s, 2H) , \—1 0 (m, 4H) , 6, 91 (s, 2H) t 6, 87 (s, 2H ) , -P co lo = 5,0 Hz, 1H) , 4,23 (d, J = 13, 0 Hz , : 2H) , 4,23 II 1—' co 3, 2H) , 4, 16 (t , J = : 5, 0 Hz, 2H) t 4, 09 (t, J = 5, 0 Hz, 2H) , . 4,04 (dt , J = 5,5, 5, 0 Hz, 2H) r 3, 79 (dt, J = 5,0, 5,0 Hz , 2H) , 3,33 (d, J = 13, 0 Hz, 2H) r 3, 32 (d, J = = 1 3,3 Hz, 2H) , O LO \—1 (s, 9H) , 1,43 (s, 9H) , 1,34 (ε d 9H) , 1, 25 (s, 18H), LO O \—1 (s, 9H) , 1,03 (s, 9H) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C64H93N4O10 (M+H)+ 1077, 6892, experimental 1077,6906.
Exemplo 24
Sal do ácido trifluoroacético de 5,11,17,23-tetra-tert-butil-25,27-bis(2-guanidinoetoxi)-26,28-di-hidroxicalix[4] areno 27. Diguanidina 25 (476,4 mg, 0,39 mmol) foi dissolvida numa solução de CH2C12 com 40% TFA e 5% anisolo (5,0 mL) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 15 horas. Os componentes voláteis foram removidos sob vácuo. O resíduo foi submetido a partição entre CH2C12 e água e a fase aquosa foi ajustada para pH=8. A fase orgânica foi separada, seca (Na2S04) e concentrada, dando origem ao sal 2TFA de calixareno 27 (407, 8 mg, 100%) na forma de um sólido quase branco. 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7, 19 (s, 4H) , 7,02 (s, 4H), 4 ,26 (d, J = 3,2 Hz, 4H), 4,22 (t, J = 5,2 Hz, 4H) , 3,81 (t, J = 5,2 Hz, 4H) , 3,48 (d, J = 13,2 Hz, 4H ), 1,27 (s, 18H), 1,03 (S, : 18H) ; 13C NMR (125 MHz, CDCI3 6 s CD3OD) δ 157,6 i (2C) , 148,9 (2C) , 128,4 ( 20 , 148,1 (2C) , 143,9 ( 2C), 132,5 (4C) , 127,9 (4C) , 126,1 ( 40 , 125, 5 (4C) , 74,0 ( (2C), 41,5 (2C) , 34,1 (2C) , 33,8 ( 20 , 31,5 (4C), 31,3 (6C), 30,8 (6C); HRMS (ESI) m/z calculado para C5oH72N604 (M+2H)2+ 410,2808, experimental 410,2787.
Exemplo 25 68
Sal do ácido trifluoroacético de 5, 11, 17,23-tetra-tert-butil-25-(2-aminoetoxi)-27-(2-guanidinoetoxi)-26,28-di-hidroxiCalix[4]areno 28. De acordo com o procedimento descrito para o calixareno 27, monoguanidina-monoamina 26 (152,9 mg, 0,14 mmol) foi tratada com uma solução em CH2CI2 (2,0 mL) de TFA (40%) e anisolo (5%). Manipulação padrão e purificação deram origem ao sal 2TFA de calixareno 28 (139,6 mg, 99%) na forma de um sólido quase branco. 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7,21 (s, 4H) , 6,98 (m, 4H) , 4,26 (m,
4H) , 4,22 (d, J = 13,2 Hz, 2H), co \—1 (d, J = 13,2 Hz, 2H) , 3,80 (m, 2H) , 3, 61 (m, 2H), 3,50 (d, J = 13,2 Hz, 2H) , 3, 49 (d, J = 13,2 Hz, 2H) , 1,29 (s, 18H) , 1,00 (m, 18H); HRMS (ESI) m/z calculado para C49H70N4O4 (M+2H)2+ 389,2698, experimental 389,2686.
Exemplo 2 6 5,11,17,23-Tetra-tert-butil-25,27-bis(3-cianopropiloxi)-26, 28-di-hidroxicalix[4]areno 29. 4-tert-Butilcalixareno 1 (1,3 g, 2,0 mmol) em acetona (20 mL) foi tratado com K2CO3 (1,6 g, 12,0 mmol) . A mistura reacional refluiu durante 1 hora, seguido da adição de 4-bromo-butironitrilo (1,6 mL, 16,0 mmol). Após 16 horas, a mistura reacional foi arrefecida e filtrada em Celite. O filtrado foi lavado com solução salina, foi seco (Na2S04) e concentrado. Cristalização a partir de etanol deu origem ao dinitrilo 29 (1,3 g) na forma de um cristal branco. Recolheu-se mais produto desejado (158,6 mg, 91 % no total) da água mãe por cromatografia "flash" (20% EtOAc em hexanos) . 1H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 7,44 (s, 2H) , 7,06 (s, 4H) , 6,86 (s, 4H) , 4,17 (d, J = 13,2 Hz, 4H) , 4,09 (t, J = 5,5 Hz, 4H) , 3,38
(d, J = 13,2 Hz, 4H) , 3,05 (t, J = 7,0 Hz, 4H) , 2,34 (tt, J = 7,0, 5,5 Hz, 4H) , 1,28 (s, 18H) , 1,00 (s, 18H) ; HRMS 69 (ESI) m/z calculado para C52H66N2Nai04 (M+Na)+ 805, 4920, experimental 805,4908.
Exemplo 27 5,11,17,23-Tetra-tert-butil-25,26,27,28-tetraquis(3-ciano-propiloxi)calix[4]areno 30. Dinitrilo (1,4 g, 1,8 mmol) em DMF (20 mL) foi tratado com NaH (432 mg, 18,0 mmol) à temperatura ambiente durante 1 hora, seguido da adição de 4-bromo-butironitrilo (9,0 mL, 90,0 mmol). A mistura reacional foi agitada a 75 °C durante 20 horas, e depois foi submetida a partição entre CH2C12 e solução aquosa saturada de NH4C1. A camada orgânica foi lavada com solução aquosa saturada de NH4C1 (3x 100 mL) , foi seca (Na2S04) e concentrada. Após remoção do restante 4-bromo-butironitrilo a 68 °C sob vácuo, o resíduo foi purificado por cromatografia "flash" (35% EtOAc em hexanos), para dar origem ao tetranitrilo 30 (1,3 g, 81 %) na forma de um sólido branco. 1H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 6,80 (s, 8H) , 4,26 (d, J = 12, 3 Hz, 4H) , 4 ,02 (t, J = 7,5 Hz, 00 ) , 3, 22 ( d, J = 12,3 Hz, 4H) , 2, 62 ( t, J = 7, 5 Hz, 8H) , 2 ,2 8 (tt, J = 7,5, 7 , 5 Hz , 8H) co 0 \—1 (s, 3 6H) ; 13C NMR (75 MH z, CDCI3) δ 152, 6 (4C) , 145, 6 (4C), 133, 4 (80 1, 125, . 6 (8C) r 119 ', 6 ( 4C) r 73,1 ( 4C) , 34,1 (4C) , 31,5 (12C ) , 31, 2 (4C) r 26 ,0 ( 4C) r 14,4 (4C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C6oH76N4Nai04 (M+Na)+ 939,5764, experimental 939,5776.
Exemplo 28
Tetraguanidina protegida com Boc 31. À solução de tetranitrilo (458,5 mg, 0,5 mmol) e CoCl2 (519,4 mg, 4,0 mmol) em metanol (10 mL) adicionou-se em porções NaBH4 (756,6 mg, 20 mmol). Após agitação à temperatura ambiente durante 26 horas, a mistura reacional foi diluída com CH2CI2. Adicionou-se 3N HC1 (~30 mL) e o sistema foi 70 agitado vigorosamente até à dissolução completa do precipitado preto. A camada aquosa foi ajustada para pH=10 com 15% NaOH, e depois foi extraída com CH2C12. A fase combinada de CH2C12 foi seca (Na2SC>4) e concentrada, dando origem à tetra-amina em bruto (438,2 mg) na forma de um sólido rosa escuro. A uma solução da tetra-amina acima (166,5 mg, ~0,19 mmol) adicionou-se sequencialmente 1,3-bis(tert-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudoureia (227,4 mg, 0,8 mmol), HgCl2 (212,6 mg, 0,8 mmol) e Et3N (0,33 mL, 2,3 mmol) . Após agitação durante 15 horas, a mistura reacional foi filtrada em Celite e o filtrado foi submetido a partição entre CH2C12 e solução aquosa de NaHC03. A fase orgânica foi seca (Na2S04) e concentrada. Purificação por MPLC (15% EtOAc em hexanos) deu origem à tetraguanidina protegida com Boc 31 (103,6 mg, 29%) . 1H NMR (500 MHz, CDC1; i) δ 11,51 (s, 4H), 8 , 38 (t, J = O LO Hz, 4H), 6,75 ( s, 8H), 4,33 (d, J = 12,6 Hz , 4H) , 3,90 (t, J = 7, 6 Hz, 8H) i, 3,48 (td, J = 7,3, 5, 0 Hz , OH), 3,12 (d, J = 12,6 Hz, 4H ), 2,00 (m, 8H), 1, 68 (m, 8H) , 1,48+ (s, 36H) , 1,48- 1 ;s, 36h; l, 0 07 (s, 36H); 13C NMR (75 MHz, CDC13) δ 163,8 (4C) i , 156, 3 (4C), 153,5 ( 40 , 153, 4 (40, 144,6 (4C) , 133,9 (8C) , 125,1 (8C), 83,0 (4C) , 79,2 (4C), 74,6 (4C) , 41,1 (4C), 34,0 (4C) , 31,6 (12C) , 31,4 (40, 28,5 (12C ), 28,3 (12C), 27,7 ( 4C), 25, 9 (40 ) ; HRMS (ESI) m/z calculado para Cio4Hi65Ni2Na02o (M+H+Na) 2+ 962,6080, experimental 962,6090.
Exemplo 2 9
Sal do ácido trifluoroacético de 5, 11, 17,23-tetra-tert-butil-2 5, 2 6, 2 7-tris(4-guanidinobutiroxi)-2 8-hidroxicalix[4] areno 32. De acordo com o procedimento descrito para calixareno 27, tetraguanidina 31 (80,6 mg, 0,04 mmol) foi 71 tratada com uma solução em CH2CI2 (1,0 mL) de TFA (40%) e anisolo (5%). Manipulação padrão e purificação deram origem ao sal 3TFA de calixareno 32 (54,5 mg, 98%) na forma de um sólido quase branco. 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7,22 (s, 2H) , 7,14 (s, 2H) , 6,61 (d, J = 2,0 Hz, 2H) , 6,56 (d, J = 2,0 Hz, 2H) , 4,38 (d, J = 12,5 Hz, 2H) , 4,31 (d, J = 13,0
Hz, 2H) , 3,98 (m, 2H) , 3,88 (m, 2H) , 3,35 (m, 2H) , 3,28 (m, 4H) , 3,28 (d, J = 12,5 Hz, 2H) , 3,24 (d, J = 13,0 Hz, 2H) , 2,34 (m, 2H) , 2,05 (m, 2H) , 1,80 (m, 2H) , 1,75 (m, 2H) , 1,66 (m, 2H) , 1,59 (m, 2H) , 1,35 (s, 9H) , 1,33 (s, 9H) , 0,84 (s, 18H) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C59H91N9O4 (M+2H)2+ 494, 8597, experimental 494,8576.
Exemplo 30
Dinitrilo 33. De acordo com o procedimento descrito para o dinitrilo 24, calix[4]areno 13 em acetona (5,0 mL) foi tratado com K2C03 (138,2, 1,0 mmol), cloroacetonitrilo (0,13 mL, 2,0 mmol) e Nal (299,8 mg, 2,0 mmol). Manipulação padrão e purificação por cristalização deram origem ao dinitrilo 33 (106,8 mg, 43%) e ao análogo trissubstituido
(74,1 mg, 27,4%). Para o dinitrilo 33: 1H NMR δ 7,13 (d, J = 7,5 Hz, 4H) , 6,82 (d, J = 7,5 Hz, 4H) , 6,77 (t, J = 7,5
Hz, 2H) , 6,75 (t, J = 7,5 Hz, 2H) , 6,02 (s, 2H) , 4,85 (s, 4H) , 4,2 5 (d, J = 13,6 Hz, 4H), 3,52 (d, J = 13,6 Hz, 4H) .
Exemplo 31
Diguanidina protegida com Boc 34 e monoguanidina-monoamina protegida com Boc 35. De acordo com o procedimento descrito para a preparação da diguanidina 25 e monoguanidina-monoamina 26, dinitrilo 33 (106, 8 mg, 0,21 mmol) em THF (4,0 mL) foi tratado com L1AIH4 (0,8 M em éter, 0,8 mL) . Após manipulação padrão, a diamina correspondente foi obtida na forma de um sólido branco. Sem purificação 72 adicional, a diamina foi dissolvida em CH2CI2 (5 mL) e foi tratada com 1,3-Bis(tert-butoxicarbonil)-2-metil-2-tio-pseudoureia (133,6 mg, 0,46 mmol), HgCl2 (124,9 mg, 0,46 mmol) e EtsN (0,19 mL, 1,39 mmol) . Manipulação padrão e cromatografia (20% EtOAc em hexanos) deram origem à diguanidina 34 (54,1 mg, 2 6%) e monoguanidina-monoamina 35 (23,6 mg, 13%). Para a diguanidina 34: XH NMR (300 MHz, CDC1 3) δ : 11,48 (s , 2H) , 9,00 (t largo , J * 5 Hz, 2H) , 7,58 (s, 2H) , 7, 02 (d. , J = 7,9 Hz, 4H) , 6,83 (d, J = 7,5 Hz, 4H) , 6, 68 (dd, J = 7,8 , 6,9 Hz, 2H) , 6,62 (t , J = 7,5 Hz, 2H) , 4,24 (d, J = : 13,2 Hz, 4H), 4, 14 (m, 8H) , 3,35 (d, J = 13,2 Hz, 4H) , 1, 50 (s , 18H), 1,35 (s, 18H) ; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 163,7 (2C), 156,6 (2C) , 153,6 (2C) , 152,8 (2 C), 151,7 (2 C), 133,1 (4C), 129,2 (4C), 128,6 (4C), 127,9 (4C) , 125,6 (2C), 118,8 (2C) , 83,0 (2C) , 79,4 (2C) , 75,0
(2C) , 41,0 (2C), 31,5 (4C), 28,5 (6C), 28,0 (6C); HRMS (ESI) m/z calculado para C54H70N6NaiOi2 (M+Na)+ 1017, 4949, experimental 1017,5015.
Para a monoguanidina-monoamina 35: 1H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 11 ,49 ( S, 1H) , 9, 02 (t largo, J = 5,4 Hz, 1H) , 8, 07 (S, 2H) , 7, 04 (d , J = ^ 7,2 : Hz, 2H) , 7,03 (d, J = ^ 7,2 Hz, 2H) , 6, 93 (d, J : 7,3 Hz, 2H) , 6, 91 (d, J = 7,1 Hz, 2H) , 6, 76 (dd, J = 7, 3, , 7,1 Hz, 1H) , 6, 75 (dd, J = 7,3, , 7,1 Hz, 1H) , 6, 64 ( [, J = 7,4 Hz, 2H) , 6,44 (t largo, J K 5 Hz, 1H) , 4,26 (d, J = 12,9 Hz, 2H) , 4,24 (d, J = 12,9 Hz, 2H) , 4, 17 (m, 2H) , 4, 12 (m, 4H) , 3, 84 (dt largo, J -¾ 5, 5 Hz, 2H) , 3,39 (d, J 12,9 Hz, 4H) , 1,50 (s, 9H) , 1,42 (S, 9H) , 1,33 (s, 9H) ; 13 ‘c NMR (75 MHz , CDCl 3) δ 163 o7, 156, 6, 153,3, 152, 8, 151, 3 , 151 ,2, 133, 5 (2 C) , 133,4 (2C) , 12 9,4 ( 4C) , 128,7 (4C) , 128,2 (2C) , 127,7 (2C) , 126,0 (2C) , 125,9 (2C) , 119,4 (2C) , 83,0 (2C) , 79, 4, 75, 6, 75,2, 41,1, 40,9, 31,7
(2 C) , 31,6 (2 C) , 28,6 (3C), 28,5 (3C), 28,0 ( 3 C) ; HRMS 73 (ESI) m/z calculado para C48H6oN4NaiOio (M+Na)+ 875, 4207, experimental 875,4196.
Exemplo 32
Sal do ácido trifluoroacético de 25,27-bis(2-guanidino-etoxi)-26,28-di-hidroxicalix[4]areno 36. De acordo com o procedimento descrito para a preparação do derivado de calixareno 27, diguanidina 34 (53, 0 mg, 0,05 mmol) foi tratada com uma solução em CH2CI2 (1,0 mL) de TFA (40%) e anisolo (5%). Manipulação padrão e purificação deram origem ao sal de 2TFA de calixareno 36 (139,6 mg, 99%) na forma de um sólido branco (40,3 mg, 92%) . 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 7,14 (d, J = 7,3 Hz, 4H) , 6,79 (d, J = 7,3 Hz, 4H) , 6,74 . J = 7,3 Hz , 2H) , 6,60 (t, J = 7,3 Hz , 2H), 4,28 (d, J = . 0 Hz, 4H) , 4, 18 1 :t, J = 4,9 Hz, 4H) \—1 00 «·. 00 (t, J = 4,9 4H) , 3,47 (d, J = 13, 0 Hz, 4H) ; 13C NMR (75 MHz , CD3OD) 159, 4 (2C) , 153, 8 (20, 152,8 (2C), 134,3 (4C) , 130,5 (4 C) , 130,1 (4 C) , 129,6 (4C), 126,7 (2C) , 121,1 (2C) , 75,6 (2C), 42,9 (2C), 32,0 (4C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C34H39N6O4 (M+H) + 595, 3033, experimental 595, 2967.
Exemplo 33 25,27-Bis[(etoxicarbonil)metoxi]-26,28-di-hidroxicalix[4] areno 37. De acordo com o procedimento descrito para a preparação do tetraéster 2, calix[4]areno 13 (339,6 mg, 0,8 mmol) em acetona (10 mL) foi tratado com K2CO3 (221,1 mg, 1,6 mmol) e bromoacetato de etilo (0,35 mL, 3,2 mmol). Manipulação padrão e cromatografia (3% EtOAc em CH2CI2) deram origem ao derivado diéster de calixareno 37 (254,5 mg, 53%). 1H NMR (300 MHz, CDC13) δ 7,61 (s, 2H), 7,04 (d, J = 7,5 Hz, 4H) , 6,90 (d, J = = 7,5 Hz, 4H) , 6,74 (t, J = 7, 5 Hz , 2H) , 6, 65 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 4, 72 (s, 4H), 4,48 (d, J = 13,2 Hz, 4H) , 4,33 (t, J = 7,1 Hz, 4H) , 3,39 ( d, J = 13, 2 74
Hz, 4H), 1,35 (t, J = 7,1 Hz, 6H); HRMS (ESI) m/z calculado para C36Hi6Nai08 (M+H)+ 619, 2308, experimental 619, 2306.
Exemplo 34 25, 27-Bis [N- [N, iV-dimetil-2-aminoetil) carbamoí lmetoxi ] -26,28-di-hidroxicalix[4]areno 38. De acordo com o procedimento descrito para a preparação da tetra-amina 3, diéster 37 (29, 8 mg, 0,05 mmol) em tolueno (0,2 mL) foi tratado com N, JV-dimetiletilenodiamina (0,11 mL, 1,0 mmol) a 80 °C durante 36 horas. Após purificação padrão obteve-se a diamina 38 (24,0 mg, 70%) na forma de um sólido castanho claro. 3H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7,14 (d, J = 7, 5 Hz, 4H) , 6, 93 (d, J = 7,5 Hz, 4H) , 6, 73 (t, J = 1 ,5 Hz, 4H) , 4, 62 (s, 4H), 4,23 (d, J = 13,0 Hz, 4H) , 3, 61 (t, J = 6,6 Hz, 4H) , 3,51 (d, J = 13,0 Hz, 4H), 2, 65 (t, J = 6, 6 Hz, 4H) , 2,29 (s, 12H) ; 13C NMR (75 MHz, CD3OD) δ 170,6 (2C) , 153,2 (2 C) , 152,4 (2C) , 134,3 (4C), 130,6 (4C), 130,1 (4C) , 128,9 (4 C) , 127,4 (2C) , 121,4 (2C) , 75,4 (2C) , 59,2 (2C) , 45,5 (4C), 37,7 (2C), 32,3 (4C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C40H49N4O6 (M+H) + 681,3652, experimental 681,3628.
Exemplo 35 25, 27-Bis[N- (2-aminoetil)carbamoílmetoxi]-26, 28-di-hidroxi calix[4]areno 39. Diéster 37 (29,8 mg, 0,05 mmol) em tolueno (0,2 mL) foi tratado com N-Boc etilenodiamina (320,2 mg, 2,0 mmol) a 80 °C durante 24 horas. Após remoção do componente volátil, o resíduo foi dissolvido em éter. O precipitado foi removido por centrifugação e a solução de éter foi combinada e concentrada. O resíduo foi dissolvido numa solução de CH2CI2 (0,6 mL) com 40% TFA e 5% anisolo e foi agitado à temperatura ambiente durante 18 horas. Após remoção dos componentes voláteis, o resíduo foi submetido a partição entre água e CH2CI2. A fase aquosa foi ajustada 75 para pH = 10 e foi extraída com CH2CI2. A fase orgânica combinada foi seca (Na2S04) e concentrada. O resíduo foi dissolvido numa quantidade mínima de CH2CI2 e a diamina 39 (42,5 mg, 100%) foi precipitada com éter e recolhida na forma de um sólido branco. 1H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 9,00 (t largo, J = 4,8 Hz, 2H) , 8,16 (s, 2H) , 7,10 (d, J = 7,5 Hz, 4H) , 6,97 (d, J = 7,5 Hz, 4H) , 6,83 (t, J = 7,5 Hz, 2H) , 6, 75 (t, J = 7,5 Hz, 2H) , 4,60 (s, 4H) , 4,18 (d, J = 13,2 Hz, 4H), 3,48 (m, 8H) , 2,93 (t, J = 6, 0 Hz, 4H) , 1, 82 (s largo, 4H) ; 13C NMR (75 MHz, CDC1 3) δ 168,7 (20 , 152,0 (2 C), 151,2 (2C), 133, 0 (4C) , 129,9 ( [40 , 129,2 (4C), 127,8 (4C) , 126,9 (2C) , 120, 9 (2C) , 75,2 (2C) , 42,7 (2C), 41,8 (2C) , 31,8 (4C) / HRMS (ESI) m/z calculado para C36H41N4O6 (M+H)+ 625,3026, experimental 625,2997.
Exemplo 36:
Efeito Antibacteriano e outros efeitos de Miméticos de Péptidos à Base de Calixareno
Experimental
Estirpes bacterianas (não de acordo com a invenção)
Pseudomonas aeruginosa de tipo 1 é um isolado clínico da estirpe lisa submetido a serotipagem utilizando o esquema de Homma et al., Japan. J. Exp. Med. 46_, 329-336 (1976), e mantido no laboratório por transferência mensal em placas de agar sangue. E. coli J96, IA2 e H5 são isolados clínicos uropatogénicos da estirpe lisa amavelmente mantidos e fornecidos por J. R. Johnson e descritos em Johnson et al., J. Infect. Disease 173, 920-926 (1996) para J96 e IA2 e em
Johnson et al., J. Infect. Disease 173, 746-749 (1996) para H5. J5 é uma estirpe rugosa de E. coli inicialmente referida por G. R. Siber e discutida em Warren et al., Infect. Immunity _55, 1668-1673 (1987) e é análoga à estirpe 76 lisa de E. coli 0111 :B4 utilizada no estojo de deteção e quantificação de endotoxina LAL BioWhittaker descrito em baixo. MN8 e MNHO Gram-positivos são dois isolados de pacientes de Staphylococcus aureus, que foram amavelmente fornecidos por P.M. Schlievert e descritos em Bohach et al., Rev. Infect. Diseases 1_1, 75-82 (1989) para MNHO e em
Schlievert et al., J. Infect. Diseases 147, 236-242 (1983) para MN8. Todas as culturas são mantidas em placas de agar nutriente.
Ensaio bactericida (não de acordo com a invenção)
Utilizaram-se soluções sem pirogénios em todo o ensaio. Obtiveram-se bactérias na fase logarítmica por transferência de uma cultura durante a noite ou remoção de cristais por raspagem de lotes de glicerol a -85°C de culturas durante a noite. As bactérias foram lavadas e novamente suspensas em 0,9% cloreto de sódio com ajustamento para uma densidade ótica a 650 nm, que dá origem a 3 x 108 CFU/mL. Em seguida, as bactérias foram diluídas 1:10 em 0,08 M tampão de citrato fosfato, pH 7,0 (preparado por mistura de 0,08 M ácido cítrico com 0,08 M fosfato de sódio dibásico). As bactérias (0,15 mL) foram incubadas com o composto de teste num volume final de 1,0 mL de tampão. O ensaio foi realizado em tubos de polipropileno 17x 100 num agitador recíproco de banho de água a 37°C durante 30 minutos. Após esta incubação durante 30 minutos (min) efetuaram-se diluições de 10 vezes em 0,9% cloreto de sódio. As diluições foram feitas para 10”4 e 20 pL de cada diluição foram listrados através de uma placa de agar. Os organismos Gram-positivos foram plaqueados em placas de agar nutriente contendo 2% agar e organismos Gram-negativos foram plaqueados em agar MacConkey (2%). As placas foram incubadas durante a noite a 37°C e foram 77 contadas na manhã seguinte. Contou-se a diluição contendo 10-100 bactérias e o número foi multiplicado por 50, para ajustar todas as contagens ao número de bactérias mortas por mililitro. As concentrações de composto foram convertidas em logaritmo de base dez e foram representadas graficamente. Determinou-se a atividade bactericida por resposta à dose, tendo-se determinado valores LD50 por melhores ajustamentos de uma curva sigmoide aos dados de resposta à dose. Células, Culturas e Reagentes ECs derivadas da veia umbilical humana (HUVECs) foram recolhidas de cordões umbilicais humanos normais por perfusão com 0,125% tripsina/EDTA, como descrito em Groenewegen et al., J. Exp. Med. 164, 131-143 (1986). Para a determinação do fenótipo de ECs quiescentes, ECs isoladas foram imediatamente fixadas em 1 % paraformaldeido.
Isolaram-se ECs microvasculares (MVECs) humanas. As ECs foram cultivadas em balões de cultura de tecido revestidos com fibronectina em meio de cultura (RPM1-1640 com 20% soro humano (HS), suplementado com 2 mM glutamina e 100 U/mL de penicilina e 0,1 mg/mL de estreptomicina).
Ensaio de Proliferação de ECs
Mediu-se a proliferação de ECs utilizando um ensaio de incorporação de [3H]timidina. As ECs foram semeadas a 5000 células/cavidade em placas de cultura de tecidos de fundo plano e cresceram durante 3 dias, na ausência ou na presença de reguladores, em meio de cultura. Durante as últimas 6 horas do ensaio, a cultura foi pulsada com 0,5 pCi [metil-3H] timidina/cavidade.
Estudos de Modelos Tumorais 78
Empregaram-se ratinhos nus atímicos fêmeas (nu/nu, 5-6 semanas de idade). Estes ratinhos foram adquiridos ao National Câncer Institute e foram deixados aclimatar às condições locais durante pelo menos uma semana. Os animais receberam água e ração comum ad libitum, e foram mantidos num ciclo de 12 horas de luz/escuridão. Todas as experiências foram aprovadas pelo comité de ética do University of Minnesota Research Animal Resources. Os ratinhos foram distribuídos de modo aleatório e separados em três grupos: 1) albumina de soro humano (10 mg/kg/dia) , 2) βρθρ-25 (10 mg/kg/dia) e 3) agente mimético de péptido (5 mg ou 10 mg/kg/dia) . Os compostos de teste foram diluídos em DMSO e foram administrados utilizando minibombas osmóticas (Durect, Cupertino, CA) . Células de carcinoma de ovário humano MA148 em crescimento exponencial, amavelmente fornecidas pelo Prof. Ramakrishnan (R.P. Dings et al., Câncer Res., _63, 382-385 (2003)), ou células de melanoma de ratinho BI6 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Jsland, NY). Este meio foi suplementado com 10% soro fetal de bovino e 1 % penicilina/estreptomicina (Cellgro, Mediatech, Washington, DC) a 37°C e 5% CO2. Em seguida, cem microlitros (100 pL) desta suspensão de células tumorais (2 x 107 células/mL) foram injetados subcutaneamente no flanco direito de cada ratinho. Implantaram-se bombas no flanco esquerdo de ratinhos para administração subcutânea de composto ao longo de um período de tratamento de 28 dias.
Utilizaram-se duas variantes deste modelo: prevenção e intervenção. Para a variante de prevenção, o tratamento foi iniciado na altura da inoculação com células MA148. Para a variante de intervenção, deixaram-se crescer os tumores para uma dimensão média de 50 mm3 (habitualmente dia 7 pós- 79 inoculação) antes do início do tratamento. Com qualquer uma das variantes, os animais foram distribuídos aleatoriamente antes do início do tratamento. 0 tratamento foi administrado via minibombas osmóticas (Durect, Cupertino, CA) , que foram implantadas subcutaneamente no flanco esquerdo dos ratinhos. Formularam-se soluções concentradas de βρερ-25 ou análogos de DBF de modo que o período de tratamento de 28 dias pudesse ser abrangido por implantação de uma única bomba. Em cada estudo, grupos de animais de controlo receberam PBS ou PBS contendo albumina do soro humano.
Imuno—histoquímica
Tumores de dimensão semelhante sem necrose disseminada aparente foram embutidos em meio de congelação de tecidos (Miles Inc.; Elkart, IN) e foram instantaneamente congelados em azoto líquido. A preparação e procedimentos foram realizados como anteriormente descrito (17). As amostras foram subsequentemente incubadas numa diluição 1:50 com anticorpo monoclonal conjugado a ficoeritrina (PE) para CD-31 de ratinho (PECAM-1) (Pharmingen; San Diego, CA) ou um PCNA conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Ab-1) (Oncogene; San Diego, CA), para coloração da densidade de microvasos (MVD) ou proliferação, respetivamente. Simultaneamente, as secções também foram coradas quanto a morte celular utilizando um ensaio TUNEL (etiquetagem de extremidades cortadas por dUTP mediada por desoxirribonucleotidil transferase terminal) conduzido de acordo com as instruções do fabricante (estojo de deteção de morte celular in situ, fluoresceína; TUNEL, Roche). A densidade e arquitetura dos vasos foram quantificadas como anteriormente descrito [Griffioen et al., Biochemical Journal 354, 233-242 (2001)]. Para a infiltração de 80 leucócitos utilizou-se um procedimento semelhante com anticorpos anti-CD45 e anti-CD8.
Resultados
Presentemente foram sintetizados aproximadamente 12 miméticos de péptidos à base de calixareno, e as estruturas químicas de alguns destes estão ilustradas na Figura 2. Avaliaram-se atividades in vitro utilizando os ensaios bactericida e de proliferação de células endoteliais descritos acima. A partir desta pequena biblioteca verificou-se dois destes compostos têm atividade bactericida razoavelmente boa (Composto 3 e Composto 11a) na gama micromolar (Tabela 1), e verificou-se que dois compostos diferentes exibem excelente atividade antiangiogénica (Composto 27 e KM0118 (40)) (Figura 3 e
Tabela 1), que é cerca de 5 até 10 vezes melhor do que a do 3pep-25. A eficácia destes miméticos de péptidos como agentes intensificadores da infiltração de leucócitos in vivo é exemplificada pelos efeitos do KM0118 (40) e Composto 27 na infiltração de leucócitos em tumores de ratinhos com tumores durante os estudos descritos acima. Podem ser identificados leucócitos em secções transversais de tumores corados com anticorpos anti-CD45 (geral para leucócitos) e anti-CD8 (específico para células T auxiliadoras, uma subpopulação dos leucócitos) etiquetados de modo fluorescente (Figura 4) . No aumento da infiltração de leucócitos em tumores, estes agentes são claramente mais eficazes do que ο βρβρ-25 (isto é, "Anginex") (Figura 4).
Exemplos 37-47: Preparação de Compostos Adicionais 81
Outros derivados exemplificativos do calixareno podem ser preparados de acordo com os seguintes esquemas e exemplos. rifS i ~<·’Ή 1· 11 L 1 í»! A m "1 & u ! < * k H ·* y > «5 » 1 -c" Πι δ -Λ,ί
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Esquema 7c
Exemplo 37 Síntese de materiais de partida
Calix [4] areno 13 (Gutsche et ai., J. Am. Chem. Soc. 104, 2652-2653 (1982)), calix[4]arenotetra-accetato de tetra- etilo 50 (Arnaud-Neu, et ai. J. Am. Chem. Soc. Hl, 8681- 82 8691 (1989)) e calix[4]arenotetra-amida 40 (Briant, Jr. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 3_9' 1641-1643 (2000)) foram preparados de acordo com procedimentos da literatura.
Exemplo 38
Tetra-amina 45. De acordo com o procedimento da literatura (Wu et al., Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3928-3932 (2004)), NaBH4 (227,0 mg, 6,0 mmol) foi adicionado em porções à solução de tetranitrilo (137,5 mg, 0,15 mmol) e C0CI2 (155,8 mg, 1,2 mmol) em metanol (10 mL) . Depois de ser agitada à temperatura ambiente durante 26 horas, a mistura reacional foi diluída com CH2CI2. Adicionou-se 3 N HC1 (~30 mL) e o sistema foi vigorosamente agitado até à dissolução completa do precipitado preto. A camada aquosa foi ajustada para pH = 10 com NH4OH concentrado e depois foi extraída com CH2CI2. A fase combinada de CH2C12 foi lavada com solução salina, foi seca (Na2S04) e concentrada, dando origem à tetra-amina conhecida em bruto 45 (140,0 mg, 100%) na forma de um sólido quase branco. Sem purificação adicional, este sólido foi conduzido para o passo seguinte. !h NMR (500 MHz, CDCI3) δ 6,77 (s, , 8H ) , 4,37 (d r j = 12, Hz, 4H) , 3, 87 (t , J = 7,7 Hz, 8H) 1 , 3 ,12 (d, J = 12, 5 Hz 4H) , 2, 79 ( t, J = 7,4 Hz, 8H), 2, 02 ( tt, J % 7, 5, 7, 5 Hz 8H) , 1, 55 ( tt, J = 7,5, 7,5 Hz, 8H ), 1 ,07 (s, 36 h; 1.
Exemplo 39
Tetraguanidina protegida com Boc 31 e triguanidina-monoamina protegida com Boc 44. A uma solução de tetra-amina 45 (140,0 mg, 0,15 mmol) adicionou-se sequencialmente 1,3-bis(tert-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudoureia (191,6 mg, 0,66 mmol), HgCl2 (179,2 mg, 0,66 mmol) e EtsN (0,26 mL, 2,0 mmol). Depois de ser agitada durante 15 horas, a mistura reacional foi filtrada em Celite e o 83 filtrado foi submetido a partição entre CH2CI2 e solução aquosa de NaHC03. A fase orgânica foi seca (Na2S04) e concentrada. Purificação com MPLC (15% EtOAc em hexanos) deu origem à tetraguanidina protegida com Boc 31 (101,9 mg, 36%) e triguanidina-monoamina protegida com Boc 44 (35,4
mg, 13%) . Para 31: 2H NMR ( 500 MHz, CDCI3) δ 11,51 (s, 4H) , 8,38 (t, J = 5 , 0 Hz, 4H) , 6, 75 (S, 8H) , 4,33 (d, J = 12, 6 Hz, 4H) , 3, 90 (t, J = = 7,6 Hz, 8H) , 3,48 (td, J = 7,3, 5, 0 Hz, 8H) , 3, 12 (d, J = = 12,6 Hz, 4H) , 2,00 (m, 8H) , 1, 68 (m, «·. co 1,48 + (s, 36H) , 1,48“ (s, 36H) , 1,07 (s, 36H) ; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 163,8 (4C), 156,3 (4C), 153,5 (4C) , 153,4 (4C) , 144,6 (4C) , 133,9 (8C), 125,1 (8C), 83,0 (4C), 79,2 (4C) , 74,6 (4C) , 41,1 (4C), 34,0 (4C), 31,6 (12C), 31,4 (4C) , 28,5 (12C) , 28,3 (12C), 27,7 (4C) , 25,9 (4C); HRMS (ESI) m/z calculado para Oo4Hi65N2Na020 (M+H+Na)2+ 962, 6080, experimental 962, 6090. Para 44: 1H NMR (500 MHz, CDC13) δ 11,52 (s, 3H) , 8,39 (m, 3H) , 6,79 (s, 4H) , 6,74 (s, 4H) , 5,25 ( m, 1H) , 4,34 (d, J = 12, 5 Hz, 2H) f 4,33 (d, J = 12 ,5 Hz, 2H), 3 ,88 (m, 8H), 3,48 ( m, 6H :), 3, 21 ( m, 2H) , 3, 12 + (d, J = 12 ,5 Hz, 2H ), 3,12“ (d, , J = 12, 5 Hz, 2H), 2, 01 (: m, 8H) , 1 , 69 (m, 8H) , 1,48 (s, 54 H) , 1,4 1 (s, 9H), 1, 09 ( s, 18H) , 1, 05 (s, 18H) ; 13C NMR (75 MHz, CDCI3) 163, 8 (3C ) , 156, 3 (4C) , 153,7 (1C), 153, 4+(4C) r 153,4' (2C) , 144, 6+ (1C), 144, 6 (1C) , 144,5 (2 C :) , 134,0 (4C) , 133, 8 (2 C ) , 133, 7 (2C) , 125,1 ( 8C), 83,1 (40 , 79 ,3 (30 ), 74,7 (4 C ) , 41,2 1 :ic), 41,1 (3C), 34,0+ ( 20 , 34, 0' (2C) , 31,7 (6C ) , 31,6 ( 60 , 31,5 (2C) / 31,4 (20 , 28, 6 ( 3C ) , 26 1,5 (9C) , 28 ,3 (9C), 27,8 (4C) , 26,0 (3C) , 25,9 (1C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C98Hi54Ni0O18Na2 (M+2Na)2+ 902,5619, experimental 902,5723.
Exemplo 40 84
Sal do ácido trifluoroacético de 5,11, 17,23-tetra-tert-butil-25, 26,27,28-tetraquis(4-guanidinobutoxi)calix[4]areno 42. Tetraguanidina 31 (101,9 mg, 0,05 mmol) foi dissolvida numa solução de CH2CI2 com 40% TFA e 5% anisolo (1,0 mL) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas. Os componentes voláteis foram removidos sob vácuo. O resíduo foi submetido a partição entre CH2CI2 e água e a fase aquosa foi ajustada para pH=8 com solução aquosa de NaHC03. A fase orgânica foi separada, foi seca (Na2S04) e concentrada para dar origem ao sal de TFA de calixareno 42 (104,5 mg, 98% presumindo um sal octatrifluoroacetato) na forma de um sólido quase branco. 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 6,81 (s, 8H) , 4,42 (d, J = 12,8 Hz, 4H) , 3,96 (t, J = 7,2
Hz, 8H) , 3,29 (m, 8H) , 3,15 (d, J = 12,8 Hz, 4H) , 2,08 (m, 8H), 1,79 (m, 8H), 1,08 (s, 36H); HRMS (ESI) m/z calculado para C64H102N12O4 (M+2H) 2+ 551,4073, experimental 551, 4107.
Exemplo 41
Sal do ácido trifluoroacético de 5, 11, 17,23-tetra-tert-butil-25,26,27-tris(4-guanidinobutiroxi)-28-(4-amino-butiroxi)calix[4]areno 43. De acordo com o procedimento descrito para a tetraguanidina 42, a monoamino-triguanidina protegida com Boc 44 (34,5 mg, 0,02 mmol) em solução de 5% anisolo em CH2CI2 (0,6 mL) foi tratada com TFA (0,4 mL) à temperatura ambiente. Manipulação padrão e purificação deram origem ao sal TFA de calixareno 43 (30, 4 mg, 82% presumindo um sal heptatrifluoroacetato) . 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 6,97 (s, 4H) , 6,67 (s, 4H) , 4,42+ (d, J= 12,4 Hz, 2H) , 4,42“ (d, J = 12,4 Hz, 2H) , 4,07 (t, J = 8,0 Hz, 2H) , 3,91 (m, 6H) , 3,28 (m, 8H) , 3,15 (d, J = 12,4 Hz, 2H) , 3,13 (d, J = 12,4 Hz, 2H) , 2,17 (m, 2H) , 2,02 (m, 6H) , 1,77 (m, 6H) , 1,66 (m, 2H) , 1,20+ (s, 9H) , 1,20' (s, 9H) , 0,97 (s, 18H) ; 13C NMR (75 MHz, CDCI3 e CD3OD) 157,4 (3C), 153,5 85 (2C) f 153, 3 (1C), 153,2 (1C), 144,6+ (3C), 144,6' (1C) , 133, 7 + (2C) , 133,7" (2C), 133,4 (40, 125,1 (4C), 125, 0 (4C) r 74, 6 (4C), 41,8 (1C), 41,5 (30, 33, 8+ (2C), 33, 8" (2C) r 31,4 + (60, 31,4” (6C), 31,2 (40, 27,8+ (2C), 27,8" (2C) r 25, 9 (4C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C63H 100N10O4 (M+2H) 2+ 530, 3964, experimental 530,4001.
Exemplo 42 O-Propargil-4-tert-butilcalix[4]areno 51a e 51b. Uma suspensão de 4-tert-butilcalix[4]areno (649,0 mg, 1,0 mmol) em THF e DMF (15 mL, 10:1) foi tratada com NaH (192,0 mg, 8,0 mmol) e brometo de propargilo (80% em tolueno, 2,23 mL, 20 mmol). A mistura reacional refluiu durante 18 horas e foi arrefecida para a temperatura ambiente. Após filtração em Celite, o filtrado foi diluído com CH2C12, foi lavado com solução salina, seco (Na2S04) e concentrado. O resíduo foi primeiramente purificado por cromatografia "flash" (3% EtOAc em hexanos), dando origem ao confórmero em cone 51a (255, 9 mg) . Os componentes de confórmero em cone 51a e análogo em cone parcial 51b, na forma de uma mistura, foram adicionalmente purificados por MPLC, dando origem a mais composto 51a (146,3 mg, 50% no total) e composto 51b (297,3 mg, 37%). Para 51a, 1H NMR (300 MHz, CDC13) δ 6,79 (s, 8H) , 4,80 (d, J = 2,3 Hz, 8H) , 4,60 (d, J = 12,9 Hz, 4H) , 3,16 (d, J = 12,9 Hz, 4H) , 2,47 (t, J = 2,3 Hz, 4H) , 1,07 (s, 36H) ; 13C NMR (75 MHz) δ 152,6 (4C), 145,7 (4C), 134,5 (8C) , 125,2 (8C) , 81,4 (4C), 74,5 (4C), 61,2 (4C), 34,1 (4C), 32,6 (4C), 31,6 (12C); HRMS (ESI) m/z calculado para C56H64Nai04 (M+Na)+ 823, 4702, experimental 823, 4725. Para 51b, XH NMR (300 MHz, CDC13) δ 7,43 (s, 2H) , 7,06 (s, 2H) , 6,99 (d, J = 2,5 Hz, 2H) , 6,52 (d, J = 2,5 Hz, 2H) , 4,48 (dd, J = 15,3, 2,5 Hz, 2H) , 4,44 (dd, J = 15,3, 2,5 Hz, 2H) , 4,35 (d, J = 2,5 Hz, 2H) , 4,31 (d, J = = 13, 0 Hz, 2H) , 86 4,24 (d, J = 2,5 Hz, 2H) , 3,85 (d, J = 14,0 Hz, 2H) , 3,73 (d, J = 14,0 Hz, 2H) , 3,08 (d, J = 13,0 Hz, 2H) , 2,50 (t, J = 2,3, 2H) , 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 1H) , 2,24 (1, J = 2,5 Hz, 1H) , 1,45 (s, 9H) , 1,33 (s, 9H) , 1,04 (s, 18H) ; 13CNMR (75 MHz) δ 154,3 (1C), 153,3 (2C), 151,8 (1C), 146,1 (1C), 145,2 (2C), 144,3 (1C), 136,5 (2C) , 133,1 (2C) , 132,5 (2C) , 132,1 (2C), 128,8 (20, 126,3 (20, 125,7 (20, 125,6 (20, 82,2 (1C) , 81,2 (2C), 80,9 (1C), 74, 7 (2C) , 74,5 (1C), 73, 9 (1C) , 61,0 (2C) , 59,3 (1C), 58,8 (1C) , 37,9 (2C), 34,3 (2C) , 34,0 (2C) , 32,6 (2C), 32,0 (3C) , 31,8 (3C), 31, 6 (6C) .
Exemplo 43
Derivado 1,2,3-triazolo do calix[4]areno 52a. Adicionou-se água (0,4 mL) à solução do alcino 52a (80,1 mg, 0,1 mmol) e iV-Boc-2-azido-etilamina (149,0 mg, 0,8 mmol) em tBuOH (0,4 mL) e THF (0,2 mL) . A mistura reacional ficou turva, e depois adicionaram-se à suspensão ácido ascórbico (7,0 mg, 0,04 mmol), NaOAc (6,6 mg, 0,08 mmol) e CuS04.5H20 (5,0 mg, 0,02 mmol). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante 36 horas. Adicionou-se solução aquosa de NH4C1 (3 mL) para terminar a reação. Depois de ser agitada durante 5 minutos, a mistura reacional foi extraída com CH2CI2. A fase orgânica combinada foi seca (Na2S04) e concentrada. 0 resíduo foi purificado por cromatografia "flash" (4% MeOH em CH2CI2) , dando origem ao tetratriazolo 52a (75,7 mg, 50%) na forma de um sólido amarelo claro. 1H NMR (300 MHz, CDC13, 55 °C) δ 7,81 (s largo, 4H) , 6,77 (s, 8H), 5,68 (s largo, 4H), 5,00 (s largo, 8H), 4,45 (m largo, 8H) , 4,32 (d, J = 12,8 Hz, 4H) , 3,55 (m largo, 8H) , 3,09 (d, J = 12,8 Hz, 4H) , 1,42 (s, 36H), 1,08 (s largo, 36H) ; 13C NMR (75 MHz, CDC13) δ 156,3 (4C) , 152,6 (4C), 145,4 (4 C), 144,7 (4 C), 134,0 (8C), 125,3 (8C), 124,8 (4C), 79,7 87 (4C), 67,2 (4C), 49,9 (4C), 40,9 (4C), 34,0 (4C), 31,5 (16C), 28,6 (12C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C84Hi2oNi6Na2Oi2 (M+2Na)2+ 795, 4534, experimental 795, 4567.
Exemplo 44
Derivado 1,2,3-triazolo do calix[4]areno 52b. De acordo com o procedimento descrito para o tetratriazolo 52b, alcino 52a (58,6 mg, 0,07 mmol) e iV-Boc-2-azido-etilamina (114,3 mg, 0,58 mmol) em tBuOH (0,3 mL), THF (0,2 mL) e água (0,4 mL) foram tratados com ácido ascórbico (5,1 mg, 0,03 mmol), NaOAc (4,8 mg, 0,06 mmol) e CuS04.5H20 (3,6 mg, 0,01 mmol). A mistura reacional foi agitada durante 36 horas.
Manipulação padrão e purificação como descrito para o tetratriazolo 52a deram origem ao tetratriazolo 52b (80,0 mg, 88%) na conformação em cone parcial na forma de um sólido amarelo claro. 2H NMR (300 MHz, CD3C1) 8,04 (s largo, 2H), 7,49 (s largo, 2H), 7,13 (s, 2H), 6,92 (s, 2H) , 6,86 (d, J = 2,0 Hz, 2H) , 6,42 (d, J = 2,0 Hz, 2H) , 5,19 (s largo, 2H) , 4,99+ (d, J = 11,0 Hz, 2H) , 4,99“ (s largo, 1H) , 4,93 (s largo, 1H), 4, 88 ( s, 2H), 4,74 d. A II 11, 0 Hz, 2H) , 4,73 (s, 2H) , 4,44 (m, 6H) , 4,35 (m largo, 2H) , 4, 09 (d, J = 13,2 Hz, 2H), 3 ,79 (d, J = 13,8 Hz, 2H), 3,72 (d, J = 13,8 Hz, 2H) , 3, 67 (m largo, 2H) , 3,59 (m, 4H) , 3,35 (m largo, 2H) , 2,95 (d, J = 13,2 Hz, 2H) , 1,45+ (s, 9H) , 1,45· (S, 9h; 1, 1,43 (s, 18H) ! 1,25 (s, 9h; 1 , 0, 95 (s f 9H) , 0, 92 ( s, 18H) ; 13C NMR (75 : MHz) δ 156, : 1 (1C) , 156, 0 (3C) , 154, , 3 (1C) , 153,4 (2C) , 151, 0 (1C) , 145, 3 (1C) , 144, 7 (3C) , 144, , 6 (2C) , 144,2 (1C) , 143, 4 (1C) , 136, 6 (2C) , 133, 0 (20 , 132, r 2 (2C) , 132,1 (2C) , 128, 6 (2C) , 126, 2 (2C) , 125, 3 (30 , 125 ,0 (1C) , 124,8 (2C) , 124 1,2 (2C) , 80 ,2 (1C) , 80, 0 (20 , 79, 9 (1C) , 67, 0 (2C) , 65, 1 (1C) , 62, 3 (1C) , 50, 2 (30 , 49, 9 (1C) , 41,1 (1C) , 40, 6 (2C) , 40, 5 (1C) , 37, 4 (20 , 34, 2 (1C) , 33, 8 (2C) , 33, 7 (1C) , 32, 2 (2C) , 31, 7 88
(3C) , 31,4 (6C) , 31,3 (3C), 28,6 (3C), 28,5 (9C); HRMS (ESI) m/z calculado para C84Hi2oNi6Na20i2 (M+2Na)2+ 795, 4534, experimental 795,4547.
Exemplo 45
Derivado aminoetiltriazolo do calix[4]areno 46a. Tetratriazolo 52a (30,9 mg, 0,02 mmol) foi dissolvido numa solução de CH2CI2 com 5% anisolo (0,6 mL) , e depois foi arrefecido para 0 °C. Adicionou-se TFA (0,4 mL) gota-a-gota e a mistura reacional foi deixada aquecer para a temperatura ambiente. Passadas 3 horas, a mistura reacional foi concentrada sob vácuo. O resíduo foi triturado em éter, dando origem ao sal de TFA do aminoetiltriazolo 46a (24,8 mg, 77% presumindo um tetratrifluoroacetato) na forma de um sólido branco. 1H NMR (500 MHz, CD3OD) 8,08 ( s, 4H) , 6, 83 (s, 8H), 5,05 (s, 8H) , 4,81 (t, J = 6,0 Hz, 8H) , 4,15 (d, J = 12,7 Hz, 4H), 3, 58 ( t, J = 6,0 Hz, 8H) , 2,97 (d, J = 12 ,1
Hz, 4H) , 1,09 (s, 3 6H) ; 13C NMR (75 MHz) δ 153,7 (4C), 146,7 (4C) , 146,3 (4C) , 135,4 (8C), 127,0 (4C), 126,6 (8C), 67,8 (4C) , 48,6 (4C) , 40,5 (4C), 35,0 (4C), 32,7 (4C), 32,1 (12C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C64H89N16O4 (M+H) + 1145,7247, experimental 1145,7275.
Exemplo 4 6
Derivado aminoetiltriazolo do calix[4]areno 46b. De acordo com o procedimento descrito para aminoetiltriazolo 46a, tetratriazolo 52b (50,8 mg, 0,03 mmol) numa solução de CH2C12 com 5% anisolo (0,6 mL) foi tratado com TFA (0,4 mL) . Após 3 horas, a mistura reacional foi concentrada sob vácuo. O resíduo foi triturado em éter, dando origem ao sal de TFA do aminoetiltriazolo 46b (55,8 mg, 100% presumindo um tetratrifluoroacetato) na conformação em cone parcial na forma de um sólido branco. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) 8,28 (s, 89 8,22 (s, 1H) , , 8,16 (s, 1H), 7, 18 (s, 2H), 6,95 (s, 6, 94 (d, J = 2,4 Hz, 2H) , 6,42 (d, J =2,4 Hz, 2H), 4,93 (d, J = 11,6 Hz, 2H) , 4,90 (s, 4H) , 4,84 (d, J = 11,6 Hz, 2H) , 4,74 (m, 8H) , 3,96 (d, J= 12,9 Hz, 2H) , 3,81 (s largo, 4H) , 3,54 (m, 8H) , 2,85 (d, J = 12,9 Hz, 2H) , 1,27 (s, 9H) , 1,01 (s, 9H) , 0,91 (s, 18H); 13C NMR (75 MHz) δ 156.0 (1C), 154,7 (2C) , 152,3 (1C), 146,6 (1C), 146,1 (2C) , 146.0 (2C) , 145,8 (2C), 144,5 (1C), 137,7 (2C), 134,3 (2C), 133,4 (4 C) , 129,8 (2C), 127,8 (2C), 127,5 (1C), 127,2 (2C), 127.1 (1C), 126,8 (2C) , 126,4 (2C) , 67,5 (2C) , 65,9 (1C), 63,5 (1C), 48,9 (1C), 48,4 (2C) , 48,2 (1C), 40,4 (4C), 38,0 (2 C) , 35,0 (1C), 34,8+ (2C) , 34,8- (1C), 33,2 (2C) , 32,2 (3C), 32,1 (6C), 32,0 (3C); HRMS (ESI) m/z calculado para C64H90N16O4 (M+2H)2+ 573,3660, experimental 573,3675.
Exemplo 47:
Dados NMR da caracterização espetroscópica de derivados calixareno adicionais
Tetra-amina 41: 1H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 7,94 (t largo, J = 6, 5 Hz, , 2H) , 7, 33 (t largo, J = 6, 5 Hz, 2H) , 6, 73 (s, 4H) , 6, 17 (s, 4H) , 5, 65 (ddt, J = 17, 1, 10,5, 6, 8 Hz, 2H) , 4, 91 (dd, J = 10, 5, 1, 4 Hz , 2H) 1 , 4, 85 (dd, J = 17, 1, 1,4 Hz, 2H) , 4, 80 (s, 2H) , 4, 65 (s, 2H) , 4, 61 (s, 4H) , r 4, 45 (d, J = 13, 5 Hz, 4H), 4,33 (s, 4H) , 3, 50 (dt, J w 6, ( 5 Hz ' t 4H) , 3, 37 (dt, J « 6, 6 Hz, 4H) , 3, 17 (d, J = 14,7 Hz, 4H) r 3, 16 (s, 4H) , 2,86 (d, J = 6, 8 Hz, 4H) , 2 ,52 (t , J = 6 ,4 Hz, 4H) , 2,40 (t, J = 6, 4 Hz, 4H) , 2,: 24 (s, 12H), 2, 19 (s, 12H) , 1,68 (s, 6H) ; 13C NMR (125 MHz, CDC13) δ 170,2 (2C) , 169.5 (2C) , 154,9 (2C) , 153,4 (2C), 145,9 (2C), 137,8 (2C), 134,9 (4 C) , 134,4 (2C), 134,3 (2C), 132,9 (4C), 130,1 (4C), 128.5 (4 C) , 115,4 (2C), 111,6 (2C), 74,7 (2C), 74,2 (2C),
58,3 (2 C) , 58,1 (2C) , 45,5 (4C), 45,4 (4C), 44,1 (2C) , 39,6 (2 C) , 37,1 (2C) , 37,1 (2C) , 31,3 (4C), 22,3 (2C); HRMS 90 (ESI) m/z calculado para C66H93N8O8 (M+H)+ 1125,7116, experimental 1125,7213. 5,17-Di-(hidroxicarbonil)etil-25,27-di-(3-metilbutoxi)-26,28-di-hidroxicalix[4]areno 47: NMR (300 MHz, CD3OD) δ
6, 96 (d, J = 7,2 Hz, 4H) , 6, 95 (s, 4H) r 6,75 (t, J = 7,2 Hz, 2H) , 4,27 (d, J = ; 13, 0 Hz, 4H) , 4, 01 (t , J = 6,7 Hz, 4H) , 3, 37 (d, J = 13,0 , 4H), 2,77 ' (t, J = 7, 6 Hz, 4H), 2,52 (t, J = 7 , 6 Hz, 4H), 2,18 (tqq, J ~ Ί, 7, . 7 Hz, 2H), 1,97 (dt, J ~ 7, 7 Hz, 4H) , 1/ 11 (d, J = ' 6, 6 Hz, 12H) ; 13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ 177,3 (2C) , 153,6 (2C) , 152,7 (2C) , 135.1 (4C), 132,7 (2C) , 130,1 (4C), 129,6 (4C), 129,5 (4C), 126,3 (2C), 76,5 (2C) , 40,3 (2C) , 37,5 (2C) , 32,3 (4C) , 31,5 (2C) , 26,1 (2C) , 23,4 (4C) ; HRMS (ESI) m/z calculado para C44H51O8 (M-H) “ 707,3589, experimental 707,3568.
Ácido difosfónico 48: 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 6,96 (d, J = 7,8 Hz, 4H) , 6,93 (s, 4H) , 6,76 (t, J = 7,8 Hz, 2H) , 4,29
(d, J = 12,6 Hz, 4H) , 4,03 (t, J = 6,9 Hz, 4H) , 3,38 (d, J = 12,6 Hz, 4H) , 2,57 (t, J = 7,0 Hz, 4H) , 2,19 (tqq, J » 7, 6, 6 Hz, 2H) , 1,98 (dt, J « 7, 7 Hz, 4H) , 1,84 (nfom, 4H) , 1,61 (nfom incluindo JPH = 18,0 Hz, 4H), 1,12 (d, J = 6,5
Hz, 12H) ; 13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ 153,4 (2C), 152,4 (2C), 135,0 (4 C) , 133,1 (2C) , 129,9 (4C), 129,6 (4C), 129,4 (4C), 126.2 (2C) , 76,4 (2C) , 40,1 (2C) , 36,6 (d, JCP = 17,1 Hz, 2C) , 32,2 (6C) , 27,3 (d, JCP = 137,9 Hz, 2C) , 26,0 (2C) , 23, 4 (4C) ; 31P (121 MHz, CD3OD) δ 31 , 0; HRMS (ESI) m/z calculado para C44H56O10P2 (M-2H) 2~ 403 ,1680, experimental 403,1682.
Bis-sulfonato 49: 1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 6,96 (d, J =
7,5 Hz, 4H) , 6,95 (s, 4H) , 6,76 (t, J = 7,5 Hz, 2H) , 4,27 (d, J = 12,8 Hz, 4H) , 4,02 (t, J = 6,8 Hz, 4H) , 3,98 (t, J 91 = 6, 4 Hz, 4H) , 3,36 (d, J = 12, 8 Hz , 4H ) , 2,58 (t, J = : 7,6 Hz, 4H ) , 2 ,18 ( tqq, J % 7, 6, 6 H: z, 2H) , 1 ,97 ( td, J -¾ 7, 7 Hz, 4H ), 1 , 89 ( :tt, J & 7, 6 Hz r 4H) , 0 , 11 (d, J = 6,2 Hz, 12H) t 13C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 1 53, 6 ( 20 , 152 ,5 ( 20 , 135, 2 (4C) , 133 ,4 (, 20 , 130,1 ( 4C ) , 129, 8 (4C) , 12 S *,5 ( 40 , 126, 3 (2C) , 76 ,4 ( 20 , 68,5 ( 2C ) , 40, 4 (2C) , 32 ,8 ( 20 , 32,3 ( 4C) , 32,2 (2 C ), 2 6,1 (2C) r 23 ,5 ( 40 ); HRMS ( ESI) m/z calculado para C44H54O12S2 (M-2Na)2 419, 1534, experimental 419,1524.
Exemplo 48
Efeitos antitumorais e outros efeitos de Miméticos de Péptidos à Base de Calixareno
Este exemplo demonstra que compostos com esqueleto de calixareno não peptídicos que capturam a topologia de superfície anfipática comum a bactericidas, ligação de LPS, são biologicamente ativos in vitro e in vivo. Verificou-se que membros da biblioteca de compostos preparados neutralizam LPS de múltiplas espécies de bactérias Gram negativas e promovem a sobrevivência de ratinhos provocados com LPS e inibem a angiogénese e crescimento tumoral em ratinhos.
Experimental
Sintese de Péptidos 0 péptido βρθρ-25 foi sintetizado utilizando um sintetizador de péptidos em fase sólida Milligen/Biosearch 9600, utilizando química de fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), e foi purificado como previamente relatado (Mayo et al., Journal of Biological Chemistry 27 8, 45746-52 (2003)) . As sequências de aminoácidos dos péptidos foram confirmadas por sequenciação N-terminal e espetrometria de massa. 92
Ensaio de neutralização de LPS (não de acordo com a invenção) A capacidade de compostos para neutralizar endotoxina foi detetada in vitro utilizando o estojo cromogénico QCL-1000 da BioWhittaker. Inc. (Walkersville, MD), e como descrito no seu protocolo. Este ensaio de lisado de amebócitos de Limulus (LAL) é quantitativo para a endotoxina bacteriana Gram negativa (lipopolissacárido, LPS) . Neste ensaio, compostos que são ativos inibem a ativação mediada por LPS de uma proenzima cuja forma ativa liberta p-nitroanilina (pNA) a partir de um substrato sintético incolor (Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA) (SEQ ID NO: 3), produzindo uma cor amarela (pNA) cuja absorção é monitorizada de forma espetrofotométrica a 405-410 nm. A taxa inicial da ativação enzimática é proporcional à concentração de endotoxina presente.
Utilizaram-se variantes de LPS de seis bactérias Gram negativas: serotipos de E. coli 0111:B4 (Combrex,
Walkersville, MD) e 055:B5 (Sigma, St. Louis, MO);
Klebsiella pneumoniae (List Biologies, San Jose, CA) ;
Pseudomonas aeruginosa (List Biologies, San Jose, CA); Salmonella typhímuríum (List Biologies, San Jose, CA) e
Serratia marcascens (List Biologies, San Jose, CA). A concentração de composto requerida para neutralizar uma dada LPS e, assim, para inibir o lisado de amebócitos de Limulus dirigido por 0,04 unidades de qualquer LPS dado foi determinada por curvas de resposta à dose ajustadas utilizando uma função sigmoide comum para determinar o valor IC50 para cada composto topomimético. As 0,04 unidades correspondem a 0, 01 ng de LPS do serotipo de E. coli 055:B5, 0,01 ng de LPS do serotipo de E. coli 0111:B4, 0, 003 ng de LPS de K. pneumoniae, 0,01 ng de LPS de P. 93 aeruginosa, 0,03 ng de LPS de S. typhimurium e 0,03 ng de LPS de S. marcascens.
Em três estudos separados, estes compostos foram testados contra LPS derivado do serotipo de E. coli 0111 :B4, LPS do serotipo de E. coli 055:B5 e Salmonella. Os compostos (numa concentração final de 2 % DMSO v/v) foram, em primeiro lugar, misturados individualmente com LPS, e foram incubados durante 30 minutos antes da injeção i.p. em ratinhos C57/BL6 (n = 4-8/grupo). Os ratinhos de controlo foram tratados com DMSO (2% v/v) isoladamente. Cada ratinho recebeu uma dose letal de LPS, com ou sem um dos compostos.
Estudos de endotoxemia em ratinhos (não de acordo com a invenção)
Ratinhos pretos machos C57 foram injetados i.p. com uma solução que continha uma dose letal de LPS [600 pg de LPS de E. coli 055 :B5 e Salmonella, e 500 pg de LPS de E. coli 0111:B4] e 1,25 mg do composto topomimético (uma dose de 50 mg/kg) (Rifkind, D. J Bacteriol 93_, 1463-4 (1967)). Os ratinhos receberam alimentos e água como normalmente ad libitum, e foram monitorizados durante vários dias. Quando foi observado que os ratinhos estavam aflitos e que a morte estava iminente, os animais foram sacrificados; nalguns casos, os ratinhos faleceram durante a noite e foram encontrados mortos na manhã seguinte. Os dados estão representados graficamente como número de ratinhos sobreviventes versus tempo em horas. Efetuou-se análise estatística da quantidade média do tempo de sobrevivência por grupo, com um máximo de 120 horas (ratinhos sobreviventes), utilizando o teste t de Student.
Proliferação celular 94
Mediu-se a proliferação de ECs utilizando um ensaio de incorporação de [3H]-timidina. A proliferação de culturas de ECs vasculares umbilicais humanas (HUVECs) estimuladas com bFGF (10 ng/mL) foi medida por quantificação da incorporação de 3H-timidina. A proliferação está expressa em contagens médias por minuto (cpm) de culturas em quadruplicado em três experiências independentes (± MEP) . As ECs foram semeadas a 5000 células/cavidade em placas de cultura de tecidos de fundo plano, e cresceram durante 3 dias na ausência ou presença de reguladores, em meio de cultura. Durante as últimas 6 horas do ensaio, a cultura foi pulsada com 0,5 pCi [metil-3H] timidina/cavidade. ECs derivadas da veia umbilical humana (HUVECs) foram recolhidas de cordões umbilicais humanos normais por perfusão com 0,125% tripsina/EDTA. As HUVECs recolhidas foram cultivadas em balões de cultura de tecidos revestidos com gelatina e foram subcultivadas 1:3 uma vez por semana em meio de cultura (RPMI-1640 com 20% soro humano (HS), suplementado com 2 mM glutamina e 100 U/mL de penicilina e 0,1 mg/mL de estreptomicina). Efetuou-se análise estatística utilizando o teste t de Student.
Migração de células endoteliais
Mediu-se a migração de ECs no ensaio de cicatrização de feridas. HUVECs foram cultivadas, em triplicado, num revestimento de 1 mg/mL de fibronectina numa placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. As células cresceram durante 3 dias até à confluência. Depois de atingirem o estado confluente fez-se uma lesão na cavidade, utilizando uma pipeta de vidro de extremidade plana. O meio foi substituído por meio contendo 10 ng/mL de bFGF com ou sem 25 μΜ composto, e às 0, 2, 4, 6 e 8 horas mediu-se a 95 largura da lesão em quatro sítios predefinidos diferentes. Tiraram-se fotografias utilizando um microscópio invertido e uma câmara Contax 167 MT de 35 mm.
Ensaio de membranas corioalantoicas (CAM)
Ovos fertilizados de White Leghorn selecionadas para Lohman foram incubados durante 3 dias a 37 °C e 55% de humidade relativa e foram submetidos a rotação hora a hora. No dia 3 abriu-se uma janela retangular (1 cm x 2 cm) na casca dos ovos. A janela foi coberta com fita, para prevenir a desidratação. A janela permitiu a observação, sem perturbações, da rede vascular em desenvolvimento das CAMs. No dia 7 colocou-se um anel de silício (diâmetro de 10 mm) nas CAMs, para permitir a administração local de fármaco no interior do anel. Os compostos foram aplicados diariamente em alíquotas de 65 pL (25 μΜ) desde o dia 10 até ao dia 13. No dia 14, as CAMs foram fotografadas.
Estudos de modelos tumorais em ratinhos
Ratinhos nus atímicos fêmeas (nu/nu, 5-6 semanas de idade) ou ratinhos machos C57BL/6 foram adquiridos ao National Câncer Institute e foram deixados aclimatar às condições locais durante pelo menos uma semana. Os animais receberam água e ração comum ad libitum, e foram mantidos num ciclo de 12 horas de luz/escuridão. Todas as experiências seguiram protocolos aprovados pelo University of Minnesota Research Animal Resources Ethical Committee. Células de carcinoma de ovário humano MA148 em crescimento exponencial, amavelmente fornecidas pelo Prof. Ramakrishnan (R.P. Dings et al., Câncer Res., _63_, 382-385 (2003)) e células de melanoma murino B16F10, amavelmente fornecidas pelo Prof. Fidler, foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) (van der Schaft, et al., 96
Faseb J 16, 1991-1993 (2002)) . Este meio foi suplementado com 10% soro fetal de bovino e 1% penicilina/estreptomicina (Cellgro, Mediatech, Washington, DC) a 37°C e 5% CO2. Em seguida, 100 pL desta suspensão de células tumorais (2 x 107 células MA148/mL e 2 x 106 células B16F10/mL) foram injetados subcutaneamente no flanco direito traseiro de cada ratinho (atimico ou C57BL/6, respetivamente).
Deixaram-se crescer os tumores para uma dimensão média de pelo menos 50 mm3 antes do inicio do tratamento, e os animais foram distribuídos aleatoriamente antes do início do tratamento. O tratamento foi administrado por um de dois modos: s.c. a partir de minibombas osmóticas e injeção i.p. As minibombas osmóticas (Durect, Cupertino, CA) foram implantadas subcutaneamente no flanco esquerdo dos ratinhos, e formularam-se soluções concentradas de análogos do calixareno ou βρθρ-25 em PBS contendo 30% (v/v) de DMSO de modo que o período de tratamento de 14 dias ou 2 8 dias fosse abrangido pela implantação de uma única bomba. Em cada estudo, grupos de animais de controlo receberam PBS (30% DMSO v/v) ou PBS contendo albumina do soro humano, para controlar o teor proteico. Verificou-se que as curvas de crescimento tumoral eram idênticas em quaisquer destes casos de controlo.
Determinou-se o volume tumoral medindo os diâmetros dos tumores empregando um compasso (Scienceware, Pequannock, NJ) , utilizando a equação para o volume de um esferoide: (a2 x b x Π) /6, em que "a" é a largura e "b" é o comprimento do tumor. Efetuaram-se medições duas ou três vezes por semana. No final de uma experiência também se registaram os pesos tumorais após excisão dos tumores de animais submetidos a eutanásia. Os pesos tumorais estavam 97 bem correlacionados com os volumes tumorais calculados deste modo. Analisaram-se diferenças estatísticas das curvas de crescimento tumoral utilizando o teste de ANOVA de duas vias.
Imuno—histoquímica
Empregou-se imuno-histoquímica para avaliar a densidade de microvasos e a extensão da apoptose celular total. Selecionaram-se para processamento tumores aproximadamente da mesma dimensão e sem necrose aparente. No último dia do tratamento, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram excisados. 0 tecido tumoral foi embutido em meio de congelação de tecidos (Miles Inc.; Elkart, IN) e foi instantaneamente congelado em azoto líquido. Prepararam-se secções de tecido (10 pm de espessura) para análise imuno-histoquímica. Para esta finalidade, secções de tecido foram conduzidas para a temperatura ambiente, foram secas ao ar durante a noite e depois foram fixadas em acetona durante 10 minutos. Deixaram-se secar as lâminas ao ar durante pelo menos 30 minutos e foram lavadas três vezes, durante 5 minutos cada, em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) . Em seguida, as amostras foram bloqueadas com PBS contendo 0,1% albumina do soro bovino e 3% albumina do soro humano durante pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente numa caixa humidificada. As amostras foram subsequentemente incubadas com anticorpo monoclonal conjugado com ficoeritrina (PE) para CD31 (PECAM-1) numa diluição 1:50 (Pharmigen, San Diego, CA) , para a coloração da densidade de microvasos.
Para avaliar a extensão da apoptose celular total, secções de tecidos tumorais foram coradas utilizando o ensaio TUNEL (etiquetagem de extremidades cortadas por dUTP mediada por 98 desoxirribonucleotidil transferase terminal) , que foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (estojo de deteção de morte celular in situ, fluoresceina; TUNEL, Roche). Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, as lâminas foram lavadas com PBS e foram imediatamente submetidas a imagiologia utilizando um microscópio de fluorescência Olympus BX-60 a uma ampliação de 200X.
As imagens digitais foram armazenadas e processadas utilizando Adobe Photoshop (Adobe Inc., Mountain View CA) . A quantificação da densidade de microvasos foi determinada como previamente descrito (Dings et al., Câncer Res 63, 382-385 (2003)). Efetuou-se análise estatística utilizando o teste t de Student.
Ensaios de toxicidade
Como medição indireta da toxicidade geral, os pesos corporais dos ratinhos foram monitorizados duas vezes por semana utilizando uma balança digital (Ohaus Florham, NJ). Para determinar os níveis de hematócrito, amostras de sangue foram extraídas por hemorragia da veia da cauda um dia depois de terminado o tratamento, e o sangue foi recolhido em tubos capilares de micro-hematócrito heparinizados (Fisher; Pittsburgh, PA) . As amostras foram submetidas a rotação durante 10 minutos num centrifugador de micro-hematócrito (Clay-Adams; NY) , e determinou-se a quantidade de hematócrito utilizando um leitor microcapilar internacional (IEC; Needham, Mass).
Resultados
Conceção de topomiméticos em hélice/folha A conceção de topomiméticos em hélice/folha baseou-se nas estruturas dobradas de dois péptidos: SC4 (Mayo et al., 99
Biochem J 349 Parte 3, 717-28 (2000)) e βρθρ-25 (Griffioen et al., Biochem J 354, 233-42 (2001) ) . O SC4 é um péptido formador de hélice de 12-meros que principalmente é bactericida e liga-se e neutraliza LPS, e ο βρθρ-25 é um péptido formador de folha β de 33-meros que é angiogénico e aborda especificamente um recetor de adesão/migração em células endoteliais (ECs) ativadas de modo angiogénico. Em modelos de ratinho, o Ppep-25 inibe efetivamente a angiogénese tumoral e o crescimento tumoral. Tal como a maioria dos agentes antiangiogénicos, o 3pep-25 também é bactericida e pode ligar-se e neutralizar LPS. O SC4, que é derivado do Ppep-25, captura a maior parte das atividades bactericida e de ligação de LPS do βρθρ-25.
Estruturas representativas do SC4 e βρθρ-25 estão ilustradas na Figura 1, com as suas superfícies hidrófobas e hidrófilas salientadas. Os aminoácidos chave no aspeto funcional no Ppep-25 estão contidos no segmento do meio da sua folha β, cerca de 4 resíduos de comprimento em cada filamento β (Mayo et al., Journal of Biological Chemistry 278, 45746-52 (2003)). Isto traduz-se dimensionalmente numa unidade de cerca de 9 Á desde Ca(i) até Ca(i+3) ao longo do filamento β, e cerca de 5 Á no filamento transversal desde Cp até Cp. A espessura de um filamento β desde um Cp(i) até ao seguinte Cp(i+1) também é cerca de 5 Â. Estas dimensões são aproximadamente iguais para cerca de duas voltas da hélice oí do SC4, isto é, um cilindro com cerca de 5 Á de diâmetro da cadeia principal e 8 Ã ao longo do eixo. Em qualquer dos casos, estas dimensões da cadeia principal são bem aproximadas pelo esqueleto do calix[4]areno, como ilustrado à escala na parte do meio superior da Figura 1. A adição de vários grupos químicos (grupos alifáticos hidrófobos e grupos catiónicos hidrófilos) a este esqueleto 100 de calixareno produz compostos que aproximam as dimensões moleculares, topologia de superfície e polaridade de segmentos de folha β e hélice a, como em 3pep-25 e SC4, respetivamente. Foi sintetizada uma biblioteca de 23 compostos à base de calixareno, e as suas estruturas estão apresentadas na Figura 2. Reações químicas exemplificativas utilizadas para sintetizar estes análogos do calix[4]areno estão ilustradas nos Esquemas 7a-c, que apresentam métodos representativos para a preparação de vários dos derivados calixareno mais ativos. O Esquema 7(a) mostra a síntese de derivados calixareno de aminas terciárias 40 e 12. O Esquema 7 (b) síntese de derivados calixareno de guanidina 42 e 43 e derivado de calixareno de amina primária 45. O Esquema 7 (c) mostra a síntese de derivados calixareno de aminas primárias ligadas a triazolo 46a e 46b. As condições reacionais referidas por letras no esquema são: a) A1C13, PhOH, tolueno, temperatura ambiente (t.a.); b) bromoacetato de etilo, K2C03, acetona, refluxo; c) N,N-dimetiletileno-diamina, tolueno, refluxo; d) i. NaH, cloreto de metilalilo, THF, DMF, 80 °C; ii. N,N- dimetilanilina, 200 °C; e) Pd/C, H2, 1 atmosfera (atm) , EtOAc, t.a.; f) 4-bromobutironitrilo, K2CO3, acetona, refluxo; g) 4-bromobutironitrilo, NaH, DMF, 75 °C; h) NaBH4, CoCl2, MeOH; i) 1,3-bis(tert-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudoureia, HgCl2, Et3N, CH2C12; j) TFA, 5% anisolo em CH2C12, t.a.; k)
NaH, brometo de propargilo, THF, DMF, refluxo; 1) ácido ascórbico, NaOAc, CuS04, t-BuOH, H20, THF; m) TFA, 5% anisolo em CH2C12, 0 °C até t.a. A maior parte dos compostos apresentados na Figura 2 tem grupos alifáticos de cadeia curta (principalmente iso-butilo e tert-butilo) na sua face hidrófoba, e uma face hidrófila mais variada exibindo aminas primárias e 101 terciárias, grupos triazolo e guanidinio, ou, nalguns casos, grupos de carga negativa como controlos negativos.
Topomiméticos em hélice/folha neutralizam LPS (não de acordo com a invenção)
Inicialmente, a biblioteca foi rastreada quanto a atividade bactericida contra Pseudomonas aeruginosa, a bactéria Gram-negativa contra a qual foram muito eficazes SC4 e βρβρ-25, mas verificou-se que apenas alguns compostos tinham atividade meramente modesta (valores LD50) na gama de 10 micromolar. No entanto, utilizando o ensaio de neutralização de LPS, foi demonstrado que vários membros da biblioteca topomimética foram altamente eficazes na ligação e neutralização de LPS de seis espécies de bactérias. Os valores IC50 determinados a partir de curvas de resposta à dose para todos os análogos estão listados na Tabela 3. Apesar de muitos compostos terem valores IC50 na gama micromolar de um único digito, vários caiem na gama submicromolar e alguns são ativos na gama de 5 até 50 nanomolar. Os melhores compostos neutralizadores de LPS são 12, 42, 43, 15, 46a e 19. Valores IC50 na gama de 5 nM até 50 nM são excecionais, não só porque este nivel de atividade é melhor do que para SC4 e βρθρ-25 mas porque iguala a proteína de ligação de LPS de 55 quiloDalton, fator bactericida/indutor da permeabilidade e polimixina B (ver Tabela 3).
Tabela 3. Derivados do Calixareno. Valores IC50 (μΜ) para ligação de LPS* 102 B. i (h> B. cuB Composto mms mU:B4 Pí! Kkhwtetta Derivados Aminas Terciárias m %* >5 ND tf m >5 3 ND ND ND MJ ND MD itm 4,4 >5 ND %m· 4,S ND Hè 7,7 ND %4 ND n ¢,006 ' 3,1 4,2 1 0,4 m 4i -V* 4,7 >5 ND >5 ND 77 3,1 3,7 >5 3,1 V. ND tí >5· :>5 ND 1,4 3,2 ND JS >s >5 ND ND >5 ND Derivados Guanidina 17 >5 NO ND ND 4,4 ND 36 4,5 ND ND >S ND m 4,1 >3 NO . ND 2,6 ND 41 9,1 1,5 Ϊ i\ê ND 43 Wi Q,S 1,2
Derivado Triasolo 45 f^D Ni> ND ND ND ND . Derivados Aminas Primárias n 46» m 4 M V »,í 6,2 W? 2,2 2,6 5 M >5 1 0,7 ND ND * tf %8 «p í*> 1,1 >5 ND NP NP >H NP Derivados com Carga Negativa 47 41 47 >5 ND ND ND ND >5 NO ND ND ND Np ......5. 1 ND 2,1 NP 4,2 Péptidos SC4 M >5 41 ND 4 >i IW-ii ..........,2'?. ............ 3 tf 2 3,5 4,i ÍWK .3P a® Cpb 0,05 p ND ..... ND = sem atividade detetável a 5 x 10~6 M >5 = atividade mínima a 5 x 10“6 M; IC50 não determinado * estima-se que os erros sejam ± 30% do valor indicado na tabela.
Valores na gama submicromolar estão apresentados a cheio.
Topomiméticos em hélice/folha protegem ratinhos da endotoxina LPS (não de acordo com a invenção) 103
Para demonstrar a eficácia in vivo selecionou-se um composto de cada subconjunto de derivados (amina primária, amina terciária e grupo de guanidinio, ver Tabela 3 e
Figura 2) para tratar ratinhos provocados com LPS. A seleção baseou-se em quais os compostos que eram mais ativos in vitro contra LPS do serotipo de E. coli 055:B5, nomeadamente 12, 42 e 46a. Para este estudo in vivo, os ratinhos receberam uma dose letal de LPS de E. coli 055:B5 (600 pg) e foram tratados com cada composto a doses de 5 mg/kg e 50 mg/kg. Apesar de a dose de 5 mg/kg ter sido ineficaz, a dose de 50 mg/kg de 12 e 42 demonstrou proteção da provocação com LPS, com 60% e 40% de sobrevivência, respetivamente, em comparação com 0% para controlos (Figura 5A) . Este resultado encorajador levou ao teste destes compostos contra LPS da outra estirpe de E. coli 0111:B4, onde as atividades in vitro tinham sido significativamente menores (ver Tabela 3). Mais uma vez, os ratinhos receberam uma dose letal de LPS de E. coli 0111 :B4 (500 pg) e foram tratados (50 mg/kg) com cada um destes três compostos. Neste estudo, ratinhos tratados com 42 e 46a exibiram uma sobrevivência de 100% e 25%, respetivamente, em comparação com 0% para controlos (Figura 5B). Por fim, estes compostos foram testados em ratinhos provocados com uma dose letal de LPS de Salmonella (600 pg) . Neste caso, os três compostos foram eficazes, com 46a exibindo 100% de sobrevivência, e 5 e 42 exibindo 80% e 60% de sobrevivência, respetivamente, em comparação com 0% para controlos (Figura 5C) . Globalmente, o composto 42 foi o melhor.
Topomiméticos em hélice/folha retêm atividade antiangiogénica 104 O ensaio de proliferação de células endoteliais (ECs) com 3H-timidina é geralmente utilizado para avaliar o potencial angiogénico (Griffioen et al., Pharmacol Rev 52_, 237-68 (2000)). Utilizando este ensaio foi demonstrado que dois membros da biblioteca de 23 compostos (40 e 27) foram eficazes na inibição do crescimento de ECs. As curvas de resposta à dose para estes dois compostos estão apresentadas na Figura 6A, juntamente com as mesmas para o βρερ-25 como controlo positivo e 11a como controlo negativo. Apesar de o composto 11a ser inativo neste ensaio in vitro, pelo menos até à dose mais elevada testada (25 μΜ), alguns dos outros compostos exibem atividade mínima à dose de 25 μΜ. No que se refere aos dois compostos mais ativos, 40 (IC50 2 μΜ) é ligeiramente mais ativo do que βρθρ-25 (IC50 4 μΜ) e consideravelmente mais ativo do que 27 (IC50 8 μΜ). Como verificação inicial da toxicidade celular geral realizaram-se experiências de proliferação semelhantes utilizando fibroblastos, linhas de células de carcinoma do ovário humano MA14 8 e de tumor de melanoma BI 6 murino. Contra fibroblastos, 40 e βρθρ-25 não exibiram efeitos detetáveis, ao passo que 11a e 27 exibiram 50% de inibição do crescimento a cerca de 20 μΜ. Ο βρθρ-25 e 40 também foram eficazes contra células tumorais MA148 (IC50 de 10 μΜ e 1 μΜ, respetivamente) , ao passo que nenhum demonstrou atividade contra células tumorais B16F10. Por outro lado, 11a e 27 foram eficazes contra linhas de células tumorais MA14 8 (IC50 de 8 μΜ e 3 μΜ respetivamente) e B16F10 (IC50 de 15 μΜ e 10 μΜ respetivamente). A Figura 6B mostra os resultados destes compostos no ensaio de feridas, onde é avaliado o efeito na migração de ECs, outro prognóstico da angiogénese. Neste ensaio, o composto 105 27 é tão eficaz quanto βρβρ-25 e mais eficaz do que 40, ao passo que 11a e os outros análogos do calixareno foram ineficazes.
Uma vez que qualquer um destes ensaios in vitro proporciona apenas informação limitada em termos do potencial angiogénico, estes compostos também foram testados no ensaio de membranas corioalantoicas (CAM) em ovos de galinha fertilizados. Na Figura 6C é aparente que a angiogénese é inibida em embriões tratados com 40 e 27, mas não com 11a, em comparação com embriões de controlo não tratados. De notar que, apesar de alguns vasos ainda serem claros nestes grupos tratados, a arquitetura dos vasos está claramente afetada, como observado pelo aparecimento de vasos mais curtos e finos. Efeitos angiostáticos semelhantes no ensaio CAM foram observados com βρερ-25.
Os compostos 40 e 27 inibem a angiogénese tumoral e o crescimento tumoral em ratinhos
Uma vez que 40 e 27 são compostos antiangiogénicos eficazes in vitro, avaliou-se a sua eficácia in vivo utilizando dois modelos de crescimento tumoral em ratinhos. No modelo tumoral de carcinoma do ovário humano MA148 em ratinhos atimicos (Figuras 5A e 5B) , a terapia foi iniciada quando os tumores tinham aproximadamente 70 mm3 de tamanho. O tratamento com 40, 27 e βρερ-25 foi administrado subcutaneamente (s.c.) durante 28 dias via minibombas osmóticas implantadas. Ο βρερ-25 foi administrado a 10 mg/kg/dia, uma dose para a qual foi previamente mostrado neste modelo de ratinho que inibe o tumor MA148 em cerca de 60 até 70% (Dings et al., Câncer Lett 194, 55-66 (2003)).
Os agentes 40 e 27 foram administrados a duas doses: a dose 106 farmacologicamente equivalente (10 mg/kg/dia) e a dose equivalente molar (2,4 mg/kg/dia para 40 e 2,7 mg/kg/dia para 27). No final dos 28 dias de tratamento, 40 a 10 mg/kg e 2,4 mg/kg inibiu o crescimento tumoral em média em 81% e cerca de 65%, respetivamente. Os níveis de inibição do crescimento para 40 e βρβρ-25, numa base equivalente molar, são muito semelhantes (Figura 7A). Após 28 dias de tratamento, a taxa de crescimento tumoral começou a aumentar, mas mesmo duas semanas pós-tratamento, a inibição do crescimento tumoral permaneceu em níveis semelhantes aos observados no final do tratamento. No mesmo modelo de MA148, 27 inibiu o crescimento tumoral em cerca de 65% a qualquer das doses testadas (Figura 7B) . Este nível de inibição também foi igual ao do βρβρ-25 a 10 mg/kg.
Para avaliar a eficácia noutro modelo tumoral, 40 e 27 foram novamente testados contra o melanoma B16 mais agressivo, um modelo singeneico em ratinhos imunocompetentes. Deixaram-se crescer os tumores até aproximadamente 80 mm3, e o tratamento com 40, 27 e βρβρ-25 foi iniciado por administração s.c. via minibombas osmóticas implantadas (Figura 7C) e, noutro estudo, por injeção interperitoneal (i.p.) duas vezes por dia durante 7 dias (Figura 7D) . Os três compostos (βρερ-25, 40 e 27) foram administrados a uma dose de 10 mg/kg/dia. Neste modelo tumoral, 40 inibiu o crescimento tumoral em média em 80% quando administrado s.c. e em 75% quando administrado i.p., ao passo que 27 inibiu o crescimento tumoral em 55% e 75%, respetivamente. Ο βρερ-25 foi comparavelmente eficaz a 45% e 60% quando administrado s.c. e i.p., respetivamente. 0 potencial antiangiogénico in via imuno-histoquímica por vivo foi demonstrado pela n ~ 1 secções coloração de 107 transversais de tumores MA148 e B16F10 de animais tratados com 40 e 27, com anticorpo anti-CD31 etiquetado de modo fluorescente para identificar vasos sanguíneos. Como mostrado e quantificado na Figura 2 e Tabela 3, respetivamente, a densidade de vasos em tumores tratados relativamente à de tumores de controlo (Figs. 8Ά e 8E) foi significativamente diminuída por tratamento com βρερ-25 (Figs. 8B e 8F) , 40 (Figs. 8C e 8G) e 27 (Figs. 8D e 8H) . Estes compostos também tiveram um efeito significativo na arquitetura dos vasos, demonstrando uma quebra do número de pontos finais, pontos de ramificação e comprimento dos vasos (Tabela 3) . Adicionalmente, o tratamento antiangiogénico também aumentou a taxa de apoptose de células tumorais, determinado empregando coloração imuno-histoquímica por TUNEL em criossecções de tumores (Tabela 3) .
Tabela 3. Análise histológica da densidade de microvasos* NA 3 4» dos Vasosb Pontos Pinais" Pontos de Rand ficação^ Coirçriínento dos Vasose Apoptose£ €<*»irs)k> mi*n7 46,3*7,4 3,fe-(5,7 7,5 ±0,6 3604 * 258 ppep-25 3 10 36,6* ίβ* 2,0 *0,5* 4,9 ± 0#s 24!8± ??'· 40 (2,-4 'nm±M4* 35,7 *2,1* S,£* â 0,3* 3# ±0,7* 2910* 344* *0 23,0*2,0* !,© 4 0,2* 3,3* %5* 375* 27 {2,7 6046*533* 32,7 ± 6,0* í,i ?. 0,3* 4,2 *0,6* 24*8 ± 72* 2? 7403 -a n% 14,7 * 2β* 2,3*0# 5,0 :&(í,7;* 3333 * 173* Densidade dos Vasos Pontos Finais Pontos de Ramificação Corrçrimeiito dos Vasos Apoptose Commfo 34,4 * fV0 6/5 £ ϊβ 0,4 * 1,2 2336* B3 ppq>'23 ílOmg&g) 14050* 33,9*3,8 4,5*0#* 10,2* 5,2* 3303 * *506 * 40 ίθ>:η * B30* 21,9*2#* 5,2 ±0,7* 8,6 ± 1,2* 2807 * 340+ 27 30743 * 364'* 35,3 i 4,0 3# *0,5* 7,5 * 0,6* 235?* 303 108 a No último dia do tratamento, os tumores foram excisados. Tumores de tamanho semelhante sem necrose disseminada aparente foram embutidos em meio de congelação de tecidos (Miles Inc.; Elkart, IN) e foram instantaneamente congelados em azoto liquido. A preparação e procedimentos são como descritos na secção de Métodos. b Após binarização das imagens da coloração com CD31 estimou-se a densidade de microvasos por pontuação do número total de pixeis brancos por campo. c Número médio de pontos finais de vasos determinado após esqueletonização das imagens. d Número médio de pontos de ramificação/nodos de vasos por imagem. e Comprimento total médio de vasos por imagem. f Após binarização das imagens da coloração por TUNEL estimou-se a apoptose por pontuação do número total de pixeis brancos por campo.
Todos os resultados estão expressos em contagens médias de pixeis por imagem ± erro padrão de 20 imagens. p < 0,05; teste t de Student.
Ausência de toxicidade de compostos topomiméticos
Em todas as experiências in vivo, o tratamento com 40, 27 e Ppep-25 não exibiu geralmente sinais de toxicidade, avaliado por comportamento inalterado, ganho normal de peso durante as experiências e níveis de hematócrito no sangue. Alterações percentuais de pesos corporais estão apresentadas como inserções na Figura 7. Em geral, os pesos corporais aumentaram para animais em todos os grupos, com uma exceção. No modelo B16, a administração i.p. de 27 causou diminuição de pesos em cerca de 5% em média durante o tratamento (inserção na Figura 7D) . No último dia de tratamento com qualquer um dos modelos recolheu-se sangue e 109 determinaram-se níveis de hematócrito, como medida da toxicidade para a medula óssea. Os níveis de hematócrito, apresentados em percentagem de glóbulos vermelhos ± DP, foram os seguintes: veículo 47 ± 5,7, βρερ-25 47 ± 2,8, 40 (2,4 mg/kg) 50 ± 1,4, 40 (10 mg/kg) 49,5 ± 2,1, 27 (2,7 mg/kg) 46,5 ± 0,7 e 27 (10 mg/kg) 47 ± 4,2). O estudo com tumores BI 6 em ratinhos imunocompetentes revelou níveis semelhantes do hematócrito (veículo 51 ± 1,4, βρερ-25 52,5 ± 3, 5, 40 53 ± 0 e 27 49 ± 1,4 em percentagem de glóbulos vermelhos ± DP) . Por autópsia também foi observado que a morfologia macro- e microscópica de órgãos internos era normal em todos os grupos experimentais de animais.
Nas experiências do modelo de endotoxemia, os ratinhos não demonstraram qualquer sinal de toxicidade aguda por administração i.p. dos compostos 12, 42 ou 46a a uma única dose de 50 mg/kg. Apesar de estes ratinhos terem sido tratados simultaneamente com LPS, que por si próprio induz um efeito letárgico, em geral sobreviveram mais ratinhos quando tratados com os compostos topomiméticos. Além disso, 12, 42 e 46a pertencem à mesma classe de compostos à base de calixareno, tornando provável que sejam não tóxicos tanto quanto 40 e 27.
Discussão
Apesar de todos os miméticos de péptidos à base de calixareno preparados serem anfipáticos e terem dimensões moleculares globais semelhantes ao de um segmento de βρβρ-25 dobrado em folha β ou SC4 formador de hélice, nenhum corresponde exatamente à topologia de superfície de qualquer um dos péptidos. Por exemplo, as cadeias laterais chave em βρερ-25 (valina, leucina e isoleucina na superfície hidrófoba e lisina (maioritariamente) e arginina 110 no lado hidrófilo) estão misturadas e são heterogéneas no contexto da superfície anfipática. Os miméticos de péptidos à base de calixareno, por outro lado, exibem maioritariamente os mesmos grupos químicos em cada superfície respetiva do esqueleto de calixareno. Além disso, uma vez que compostos à base de calixareno não são tão flexíveis internamente como péptidos, a menor alteração de entropia conformacional negativa que ocorre por ligação ao seu alvo pode, de facto, contribuir para a sua atividade biológica.
Os topomiméticos 40 e 27 são agentes antiangiogénicos altamente eficazes e são capazes de inibir o crescimento tumoral in vivo. Mesmo apesar de estes dois compostos partilharem uma carga positiva líquida e carácter anfipático, têm diferenças estruturais e funcionais óbvias. Com base em respostas semelhantes de células em cultura, aparentemente o composto 40 aborda de modo seletivo o mesmo recetor do βρθρ-25, ao passo que 27 não o faz.
Outro dos compostos topomiméticos preparados claramente aborda LPS de modo seletivo. Estes compostos à base de calixareno apresentam grupos hidrófobos e com carga positiva de um modo que lhes permite ligarem-se efetivamente e neutralizar a endotoxina bacteriana melhor do que péptidos paternos SC4 e βρθρ-25. Apesar de a atividade de ligação de LPS de um dado topomimético depender da fonte bacteriana do LPS, a presença de cadeias alquilo na face hidrófoba do esqueleto calix[4]areno é importante. Globalmente, os melhores topomiméticos de ligação a LPS têm grupos tert-butilo na face hidrófoba do esqueleto calixareno e aminas primárias ou grupos guanidínio na face hidrófila. 111
Pelo menos ao comparar estes compostos com a sua variabilidade limitada de grupos alifáticos, diferenças de atividade de ligação de LPS são geralmente mínimas e aparentam depender mais de quais os grupos com carga positiva que estão na face hidrófila. De facto, a seleção de grupos com carga positiva aparenta ser muito mais importante para a ligação de LPS do que a escolha de quais os grupos alquilo de cadeia curta que estão na face hidrófoba. Isto pode implicar que os topomiméticos interagem com os grupos fosfato no lípido A, o que é consistente com estudos estruturais de péptidos que complexam com LPS de E. colí. Japelj et al. (2005) relataram que dois dos grupos guanidino de arginina no péptido LF11 estão posicionados próximos dos dois grupos fosfato da fração lípido A (Japelj et al., J Biol Chem 280, 16955-61 (2005) ) . A distância de cerca de 13 Á que separa os dois grupos fosfato em LPS corresponde à que existe entre estes dois grupos guanidínio no LF11, bem como entre grupos guanidínio no topomimético 42. Por outro lado, apesar de as separações de carga serem semelhantes, aminas primárias de resíduos lisina do péptido FhuA dominam a interação com a fração lípido A de LPS do serotipo de E. coli K-12 (Ferguson et al., Science 282, 2215-20 (1998)).
Pode afirmar-se o mesmo para PmxB em complexo com LPS do serotipo de E. coli 055:B5, em que quatro grupos ácido α,γ-diaminobutírico correspondem aos grupos catiónicos de arginina e lisinas em LFll e em FhuA.
Infelizmente, todos os complexos de péptidos e LPS preparados até à data têm utilizado apenas LPS de serotipos de E. coli (055:B5 ou K-12) . A maior parte dos compostos topomiméticos preparados demonstra as suas melhoras 112 atividades contra LPS das duas estirpes de E. coli que foram testadas. Para LPS derivado de outras bactérias Gram negativas, a ligação dos compostos a LPS é normalmente diminuída e talvez seja mais seletiva, possivelmente por a complexidade do seu LPS ser maior do que a presente em E. coli (Rietschel et al., Curr Top Microbiol Immunol 216, 39-81 (1996)). Por outro lado, os três compostos (12, 42, 46a) testados no modelo de endotoxemia em ratinhos demonstraram melhor atividade global contra LPS de Salmonella do que contra LPS de E. coli. 0 exemplo demonstra que um simples composto não peptidico pode ser concebido de modo a imitar as dimensões moleculares e topologia de superfície anfipática de péptidos em hélice e folha β que se ligam a LPS e inibem a angiogénese e crescimento tumoral. Estes agentes podem ser clinicamente úteis ao proporcionarem um meio para prevenir choque sético por infeção bacteriana e/ou para deter o crescimento canceroso. Como agentes antiangiogénicos, estes topomiméticos também podem ter utilidade contra outras perturbações patológicas que envolvem angiogénese, nomeadamente artrite, restenose, aterosclerose, endometriose e retinopatia diabética. Além disso, uma vez que os motivos estruturais em hélice e folha β são comuns a muitos outros péptidos (Laskowski et al., Nucleic Acíds Research 3_3, D266-268 (2005)), pode considerar-se que os compostos topomiméticos compreendem uma biblioteca genérica de topomiméticos da superfície de proteínas e podem demonstrar ser úteis no estudo de efeitos biológicos adicionais para além dos exibidos por proteínas neutralizadoras de LPS e antiangiogénicas.
Texto Livre de Listagem de Sequências 113
113 SEQ ID NO: 1; polipéptido artificial SEQ ID NO: 2; polipéptido artificial SEQ ID NO: 3; polipéptido artificial de : LAL βρθρ-25 SC4 do substrato do ensaio
Lisboa, 1 de Março de 2012

Claims (4)

  1. /1 6/9
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    1 REIVINDICAÇÕES 1. Método in vitro para inibir a angiogénese, em gue o método compreende contactar células com uma quantidade de uma composição eficaz para inibir a angiogénese, em que a composição compreende um mimético de péptido à base de calixareno selecionado dos seguintes:
    composto 27 composto 40 ou derivados em ponte do composto 4, em que o composto 4 é: sf '"'b: f i o. composto 4.
  2. 2/9
    2. Composição compreendendo um mimético de péptido à base de calixareno como definido na reivindicação 1, em que a composição se destina a utilização no tratamento ou prevenção de crescimento tumoral, artrite, restenose, aterosclerose, retinopatia diabética, glaucoma neovascular e endometriose. 2
  3. 3/9
    Ppep-25 e miméticos do ppfp~25 inibem a proliferação de ECs proliferação (% do controlo)
    4/9
    ίϊχ/Fmn οχ LZ# 1*0 ÍK(/fmi £'z LZ$ 1*0 OT Ottt ' Itlio fn(/f*u ç'g Ottt ' Itlio 01 ςζ-03άή OXOJ^UOD
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    3. Composição compreendendo um mimético de péptido à base de calixareno como definido na reivindicação 1, em que a composição se destina a utilização na inibição de tumorigénese.
    4. Utilização de um mimético de péptido à base de calixareno como definido na reivindicação 1 para a preparação de um medicamente i destinado a inibir a tumorigénese. 5. Utilização de um mimético de péptido à base de calixareno como definido na reivindicação 1 para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento ou prevenção de crescimento tumoral, artrite, restenose, aterosclerose, retinopatia diabética, glaucoma neovascular e endometriose.
    6. Método, composição ou utilização de qualquer das reivindicações precedentes, em que o mimético de péptido à base de calixareno é proporcionado na forma de um sal farmaceuticamente aceitável.
    7. Método, composição ou utilização de qualquer das reivindicações precedentes, em que o mimético de péptido à base de calixareno compreende uma forma iónica que tem carga positiva.
    8. Método da reivindicação 1, em que as células estão presentes numa cultura de células, num tecido, num órgão ou num organismo.
    9. Método da reivindicação 1, em que as células são células de mamífero. 3
    10. Método da reivindicação 9, em que as células são células humanas.
    11. Método, composição ou utilização de qualquer das reivindicações 1 até 10, em que o mimético de péptido à base de calixareno é o composto 27.
    12. Método, composição ou utilização de qualquer das reivindicações 1 até 10, em que o mimético de péptido à base de calixareno é o composto 40.
    13. Método, composição ou utilização de qualquer das reivindicações 1 até 10, em que o mimético de péptido à base de calixareno consiste nos derivados em ponte do composto 4. Lisboa, 1 de Março de 2012 1/9 Ό Conceção Topomiméti
  4. 4 0 tg> <Ϋ*ϊ# Lu sT^· 9/9
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