PT1713503E - Inibição do factor b, a via alternativa do complemento e métodos relacionados - Google Patents

Description

Descrição

INIBIÇÃO DO FACTOR B, A VIA ALTERNATIVA DO COMPLEMENTO E

MÉTODOS RELACIONADOS

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se, de um modo geral, a novos inibidores da via alternativa do complemento e, em particular a novos anti-corpos anti-factor B. A invenção também se refere de um modo geral à utilização desses inibidores na redução ou na prevenção da hipersensibilidade das vias aéreas e da inflamação das vias aéreas e, assim no tratamento de doenças, nas quais essas condições estão patentes.

Antecedentes da Invenção A activação do complemento ocorre primariamente através de três vias: a chamada via clássica, a via da lectina e a via alternativa. As principais proteínas envolvidas na activação da via alternativa são o factor B (fB) e o factor D (fD). Estas proteínas trabalham em conjunto para iniciar e/ou ampliar a activação de C3, o que depois leva à iniciação de um número de eventos inflamatórios. Uma terceira proteína, properdina, estabiliza o complexo de C3 e do factor B, mas não é absolutamente necessária para que a via alternativa funcione. 0 factor B também ajuda a solubilizar complexos imunes, e já se verificou que actua 1/146 como um factor de crescimento da célula B e pode activar monócitos (Takahashi, 1980; Hall, 1982; Peters, 1988). Geraram-se ratos sem o factor B (ratos -/- fB) e a reação dos anti-corpos IgGl aos antígene dependentes da célula T e a sensibilidade ao choque endotóxico parecem normais nestes ratos (Matsumoto, 1997). A via alternativa do complemento é normalmente iniciada por bactérias, parasitas, virus ou fungos, embora IgA Abs e algumas cadeias Ig L também já tenham mostrado ser capazes de activar esta via. A activação da via alternativa é iniciada quando o factor B circulatório se liga ao C3 activado (C3b ou C3H20) . Este complexo é depois segmentado através do factor D em circulação para produzir um fragmento activo de forma enzimática, o C3Bb. C3Bb segmenta C3, dando origem a C3b, o que leva à inflamação e também a uma maior ampliação do processo de activação, criando um circuito de resposta positivo. Ambos os componentes (factor B e factor D) são necessários para permitir a activação da via alternativa.

Estudos recentes mostraram que a via alternativa do complemento desempenha um papel importante na patogénese de vários modelos de animais exclusivamente através da via alternativa (Thurman) e a via alternativa desempenha um papel critico no desenvolvimento de artrite. Talvez surpreendentemente, os ratos sem a via alternativa revelaram estar protegidos de nefrite no modelo MRL / lpr de lupus nephritis (Watanabe) e da perda fetal mediata anti-fosfolípido, modelos que tradicionalmente teriam assumido ser mediatos através da via do complemento clássico. 2/146 Vários inibidores foram já desenvolvidos para inibir o sistema do complemento em vários estágios de activação (Holers), apesar de inibidores especificos da via alternativa não terem sido registados antes da presente invenção. A Publicação PCT WO 01 / 47963, publicada em 4 de Julho de 2001, descreve poliptídeos de sanguessugas ectoparasitas que inibem a via alternativa da activação do complemento e não têm substancialmente nenhum efeito na activação do complemento através da via clássica. Estes peptídeos revelaram ligar o factor D; no entanto, não se demonstrou nenhuma aplicação in vivo destes poliptídeos. Um reagente com a capacidade de inibir especificamente a via alternativa in vivo teria várias vantagens teoricamente, quando comparado com os inibidores existentes da cascata do complemento. Primeiro, para modelos como ο I / R renal e a perda fetal mediata antifosfolípida, que são primariamente mediados pela via alternativa, um inibidor desses deveria ser igualmente eficaz como um inibidor do complemento pan, no entanto teria menos efeitos secundários imunossupressores. Apesar de apenas um paciente humano com deficiência congénita do factor B ter sido registado (Densen) , estudos de ratos sem o gene do factor B alvo (fB -/-) ainda não revelaram um efeito imunomodulador para este factor (Densen; Matsumoto). Os pacientes com deficiências congénitas de componentes da via clássica, por outro lado, parecem ter um risco acrescido de infeção (mais habitualmente Staphylococcus e Streptococcus). A inibição de componentes da via clássica ou C3 (comum a todas as vias do complemento) poderá também estar associada à auto-imunidade (Figueroa), talvez explicando porque razão a deficiência do factor B protege os ratos MRL / lpr de desenvolverem glomerulonefrite, mas a deficiência de C3, não (Watanabe). Deste modo, a inibição da via alternativa pode ser mais bem tolerada e, em alguns casos, pode ser 3/146 mais eficaz do que a inibição do complemento da via clássica. A asma alérgica é uma síndroma comum associada à inflamação das vias aéreas e à hipersensibilidade das vias aéreas (AHR) (Busse) . Em pacientes com asma alérgica, a exposição a alergénicos inalados leva a um aumento de AHR e de inflamação das vias aéreas, e os estudos já demonstraram níveis de fragmentos biologicamente activos derivados do complemento da família de proteínas C3, C4 e C5, em especial C3a (Humbles) e C5a (Krug) e, fluído de lavagem broncoalveolar (BAL). Isto sugere que nestes pacientes, a seguir à exposição a alergénicos, a activação da via do complemento através de um mecanismo alergénico-induzido ocorre no pulmão. Os modelos animais forneceram um conhecimento mais profundo do papel do complemento no desenvolvimento de doença alérgica das vias aéreas. Os animais sem C3 ou animais receptores de C3a parecem estar protegidos do desenvolvimento de uma doença alergénica induzida das vias aéreas (Humbles, Drouin; Bautsch; Walters). Já foram propostas várias possibilidades diferentes para induzir a activação do complemento a seguir à exposição alergénica. Por exemplo, os complexos imuno-alergénico -IgG poderiam ligar a activação da via clássica e certos antígene podem activar directamente o C3 através da via alternativa (Kohl). Além disso, a triptase neutra de células mastócitas ou macrófagas pulmonares podem segmentar directamente (proteoliticamente) tanto C3 como C5 (Schwartz; Mulligan) . As três vias de activação do complemento (clássica, alternativa e lectina) convergem no 4/146 componente do complemento central C3. Por isso, a inibição da activação do C3 evita a segmentação em fragmentos de C3 activos mas também reduz consideravelmente a activação do fluxo de C5 e a libertação de fragmentos activados derivados de C5 (Sahu). Estudos recentes mostraram que a inibição da activação do complemento durante a exposição alergénica de animais sensibilizados através do uso de inibidores da convertase C3, e deste modo inibindo as três vias de activação, reduz a reação tardia das vias aéreas (Taube) . A Publicação PCT Nr. WO 2004 / 022096, publicada em 18 de Março de 2004, descreve a inibição da via da via do complemento, de preferência através dos componentes do complemento e terminais de C5 - C9 que são partilhados por todos as vias e, de maior preferência através da inibição de C5a.

Presentemente, a terapia para o tratamento de doenças inflamatórias que envolvem AHR, tal como asma moderada a grave e doença pulmonar obstrutiva crónica, envolve de forma predominante o uso de glucocorticosteróides e outros agentes anti-inflamatórios. No entanto, estes agentes têm o potencial de efeitos secundários graves, incluindo, mas não se limitando a, um aumento da susceptibilidade para a infeção, a toxicidade do fígado, a doença do pulmão induzida por medicamentos e a supressão da medula óssea. Deste modo, esses medicamentos estão limitados no seu uso clínico no tratamento de doenças pulmonares associadas à hipersensibilidade das vias aéreas. O uso de reagentes anti-inflamatórios e de alívio sintomático é um grave problema por causa dos seus efeitos secundários ou da sua falha em atacar a causa subjacente de uma reação inflamatória. Há uma necessidade contínua de reagentes menos prejudiciais para o tratamento da inflamação. Deste 5/146 modo, fica a necessidade de processos que usam reagentes com perfis de efeitos secundários mais fracos, menos toxicidade e mais especificidade para a causa subjacente das doenças alérgicas das vias aéreas, tal como a asma e a condição conhecida como AHR.

Resumo da Invenção

Uma realização da presente invenção refere-se a um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene que liga de forma selectiva ao factor B, pelo menos humano ou de ratos, dentro do terceiro domínio do consenso curto de repetição (SCR) , em que o anticorpo ou o fragmento de ligação de antigene impede a formação de um complexo C3bBb. Num aspecto, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene liga ao factor B e impede ou inibe a segmentação do factor B pelo facto D. Num outro aspecto, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene liga-se ao terceiro domínio do consenso curto de repetição (SCR) do factor B humano. Num outro aspecto, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene liga-se a um epítope no terceiro domínio SCR do factor B, selecionado de: (a) um epítope do factor B que inclui uma parte do facto B humano (SEQ ID NR: 2), compreendendo desde cerca da posição Tyr 139 a cerca da posição Ser 185, ou posições equivalentes àquelas numa sequência do factor B não humano; (b) um epítope do factor B que inclui pelo menos uma parte do factor B humano (SEQ ID NR: 2), compreendendo desde cerca da posição Tyr 139 a cerca da posição Ser 141, ou posições equivalentes àquelas numa sequência do factor B não humano; (c) um epítope do factor B que inclui pelo menos uma parte do factor B humano (SEQ ID NR: 2), compreendendo desde cerca da posição Glu 6/146 182 a cerca da posição Ser 185, ou posições equivalentes àquelas numa sequência do factor B não humano; (d) um epitope do factor B que inclui pelo menos uma parte do factor B humano (SEQ ID NR: 2), compreendendo uma ou mais das seguintes posições ou das suas posições equivalentes àquelas, numa sequência do factor B não humano: Tyr 139, Cys 140, Ser 141, Glu 182, Gly 184, ou Ser 185. Ainda num outro aspecto, o anticorpo ou o seu fragmento de ligação de antigene liga-se de forma selectiva a um epitope no terceiro domínio SCR do factor B (SEQ ID NR: 2) , compreendendo uma ou mais das seguintes posições de aminoácidos ou < das suas posições equivalentes numa sequência de factor B não humano: Ala 137, Tyr 139, Ser 141, Glu 182, Ser 185, Thrl 189, Glu 190 e Ser 192. Num outro aspecto, o anticorpo ou o seu fragmento de ligação de antigene liga-se de forma selectiva a um epitope no terceiro domínio SCR do factor B (SEQ ID NR: 2), compreendendo as seguintes posições de aminoácidos ou as suas posições equivalentes numa sequência de factor B não humano: Ala 137, Tyr 139, Ser 141, Glu 182, Ser 185, Thrl 189, Glu 190 e Ser 192. Ainda num outro aspecto, o anticorpo ou o seu fragmento de ligação de antigene liga-se de forma selectiva a um epitope no terceiro domínio SCR do factor B (SEQ ID NR: 2), consistindo nas seguintes posições de aminoácidos ou suas posições equivalentes na sequência do factor B não humano: Ala 137, Tyr 139, Ser 141, Glu 182, Ser 185, Thrl 189, Glu 190 e Ser 192. O anticorpo ou fragmento de ligação de antigene pode ligar-se a um epitope não linear dentro da estrutura tridimensional de uma parte do terceiro domínio SCR do factor B, em que a parte é definida por pelo menos as posições de aminoácidos Ala 137 - Ser 192 da SEQ ID NR: 2 ou posições equivalentes na sequência do factor B não humano. Num outro aspecto, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene liga-se 7/146 de forma selectiva ao factor B de várias espécies de mamiferos (por exemplo, humanos e animais selecionados do grupo que consiste em primatas não humanos, ratos, ratazanas, porcos, cavalos e coelhos). o anticorpo ou fragmento de ligação de antigene pode ser de um isótopo activador não do complemento ou subclasse, pode ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo bi-especifico, ou um anticorpo monovalente. 0 fragmento de ligação de antigene pode incluir um fragmento Fab. Numa realização preferida, o anticorpo é um anticorpo monoclonal 1379 (produzido por ATCC Depósito Nr. PTA - 6230).

Uma outra realização da presente invenção refere-se a um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene que se liga de forma selectiva ao factor B e impede a formação de um complexo CSbBb, em que o anticorpo ou um seu fragmento de ligação de antigene inibe de forma competitiva a ligação especifica do anticorpo monoclonal 1379 (produzido por ATCC Depósito Nr. PTA - 6230) ao factor B humano e em que, quando o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene se liga ao factor B humano, a capacidade do anticorpo monoclonal 1379 para inibir a via alternativa do complemento é inibida. Num aspecto, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene inibe de forma competitiva a ligação do anticorpo monoclonal 1379 ao factor B humano, onde a especificidade de ligação comparativa é determinada pelo ensaio de competição anticorpo - anticorpo na presença do factor B humano.

Outra realização da presente invenção refere-se a um anticorpo isolado ou um seu fragmento que se liga de forma selectiva ao factor B humano e impede a formação de um 8/146 complexo C3bBb, em que o anticorpo isolado ou um seu fragmento inibe de forma competitiva a ligação especifica de um anticorpo secundário ou seu fragmento de ligação de antigene ao factor B humano, e em que a anticorpo secundário ou um seu fragmento se liga ao terceiro domínio SCR do factor B humano e liga de forma selectiva ao factor b humano de pelo menos humanos e ratos.

Também incluídas na presente invenção estão composições que compreendem qualquer um dos anticorpos descritos anteriormente e fragmentos de ligação de antigene.

Ainda uma outra realização da presente invenção refere-se a um anticorpo ou fragmento de ligação de antigene para uso num método para a redução ou prevenção da hipersensibilidade das vias aéreas (AHR) ou inflamação das vias aéreas num animal. Um anticorpo ou um seu fragmento de ligação de antigene, tal como descrito anteriormente, é administrado a um animal que tem, ou está em risco de contrair, hipersensibilidade das vias aéreas associada a inflamação ou inflamação das vias aéreas. Num aspecto, o anticorpo ou um seu fragmento de ligação de antigene é administrado através de uma via selecionada a partir do grupo que consiste nas vias oral, nasal, tópica, inalada, intratraqueal, transdérmica, rectal e parenteral. Num outro aspecto, o anticorpo ou um seu fragmento de ligação de antigene é administrado ao animal numa quantidade eficaz para reduzir de forma mensurável a hipersensibilidade das vias aéreas no animal em comparação com a administração anterior do anticorpo ou um seu fragmento de ligação de antigene. Num outro aspecto, o anticorpo ou um seu fragmento de ligação de antigene é administrado ao animal 9/146 numa quantidade eficaz para reduzir de forma mensurável a hipersensibilidade das vias aéreas no animal, em comparação com um nivel de hipersensibilidade das vias aéreas numa população de animais com inflamação, em que o anticorpo ou um seu fragmento de ligação de antigene não foi administrado. Num aspecto, a administração do anticorpo ou de um seu fragmento de ligação de antigene diminui a reação do animal à metacolina ou ao histaminico. Num outro aspecto, o anticorpo ou um seu fragmento de ligação de antigene é administrado com um transmissor farmacologicamente aceite a partir do grupo que consiste em: um pó seco, dispersível; etanol anidroso; cápsulas pequenas; lipossomas; pulverizador nebulizado; e um excipiente injectável. Num outro aspecto, o anticorpo ou um seu fragmento de ligação de antigene é administrado num transmissor ou dispositivo selecionado a partir do grupo que consiste em: etanol anidroso; um sistema de inalação de pó seco; um sistema de inalação ultrasónico; um inalador de dose calibrada pressurizada; e um dispositivo de solução calibrada. Ainda num outro aspecto, o anticorpo ou um seu fragmento de ligação de antigene é administrado ao referido mamifero juntamente com um agente selecionado a partir do grupo que consiste em: corticosteróides, β-agonistas (de ação longa ou curta), modificadores de leucotrina, anti-histamínicos, inibidores de fosfodiesterase, cromoglicato de sódio, Nedocromil, teofilina, antagonistas de citoquina, antagonistas receptores de citoquina, anti-IgE e inibidores da função da célula T. Ainda num outro aspecto, a hipersensibilidade das vias aéreas ou inflamação das vias aéreas está associada com uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumonia de hipersensibilidade, pneumonia eosinofilica, enfisema, bronquite, bronquiectasia da bronquite alérgica, 10/146 fibrose cística, tuberculose, pneumonite hipersensível, asma ocupacional, sarcóide, síndroma da doença das vias aéreas reactivas, doença pulmonar intersticial, síndrome hipereosinofílica, rinite, sinusite, asma induzida pelo exercício físico, asma induzida pela poluição, asma da variante de tosse, doença pulmonar parasítica, infeção do vírus sincicial respiratório (RSV), infeção do vírus da parainfluenza (PIV), infeção do rinovírus (RV) e infeção do adenovírus. Num aspecto, a hipersensibilidade das vias aéreas está associada a inflamação alérgica. 0 anticorpo ou fragmento da presente invenção pode ser administrado, numa realização preferida, a mamíferos e, de maior preferência, a humanos.

Breve Descrição das Figuras A Fig. 1 é um diagrama esquemático que ilustra a construção de uma proteína de fusão do factor B-ig. A Fig. 2A é um gráfico de linhas que mostra que o anti-factor B inibiu completamente a via alternativa do complemento num ensaio de zimosano quando se acrescentou 3 yg a uma reação que continha 10 μΐ de soro. A Fig. 2B é um gráfico de linhas que mostra que o anti-factor B inibiu completamente a via alternativa do complemento num ensaio de lise eritrocito de um coelho quando se acrescentou 6 yg de anticorpo a 10 μΐ de soro humano. 11/146 que a A Fig. 3 é um gráfico de linhas que mostra administração do anti-factor B a ratos inibe a via alternativa do complemento. A Fig. 4 é um gráfico de linhas para resistência das vias aéreas (RL) que mostra que os ratos sensibilizados para alergénos e desafiados com fB +/+ mostraram um aumento da responsividade à metacolina, em comparação com os ratos desafiados apenas com fB +/+, enquanto os ratos com fB -/-demonstraram uma reação significativamente mais baixa à metacolina. A Fig. 5 é um gráfico de barras que caracteriza o fluido BAL e o tecido pulmonar de ratos com fB -/- a seguir à sensibilidade e ao desafio das vias aéreas. A Fig. 6A é um gráfico de linhas para a resistência das vias aéreas (RL) que mostra que os ratos sensibilizados com tasna e desafiados com fB -/- mostraram uma diminuição na responsividade à metacolina, enquanto os ratos com fB +/+ desenvolveram uma forte responsividade à metacolina. A Fig. 6B é um gráfico de linhas para a complacência dinâmica (Cdyn) que mostra que os ratos sensibilizados com tasna e desafiados com fB -/- mostraram uma diminuição na responsividade à metacolina, enquanto os ratos com fB +/+ desenvolveram uma forte responsividade à metacolina. 12/146 A Fig. 6C é um gráfico de barras que caracteriza o fluído BAL e o tecido pulmonar e que mostra que a inflamação das vias aéreas com fluído BAL foi reduzida nos ratos sensibilizados com tasna e desafiados com fB comparados com os ratos com fB +/+. A Fig. 7A é um gráfico de linhas que mostra que os ratos sensibilizados e desafiados com fB -/- tratados com o factor B antes de cada desafio mostraram uma reação inferior à metacolina, semelhante aos ratos sensibilizados e desafiados com fB -/- tratados com PBS, mas significativamente menor em comparação com os ratos sensibilizados e desafiados com fB +/+. A Fig. 7B mostra um gráfico de barras que mostra que a administração do factor B reconstitui a capacidade para desenvolver AHR e inflamação das vias aéreas em ratos com fB -/-. A Fig. 8A é um gráfico de linhas para a resistência das vias aéreas (RL) que mostra que tanto a administração sistémica como nebulizada de um anticorpo de neutralização do factor B inibe o desenvolvimento de AHR em ratos sensibilizados e desafiados. A Fig. 8B é um gráfico de linhas para a complacência dinâmica (Cdyn) que mostra que tanto a administração sistémica como nebulizada de um anticorpo de neutralização do factor B inibe o desenvolvimento de AHR em ratos sensibilizados e desafiados. 13/146 A Fig. 8C é gráfico de barras que caracteriza o fluído BAL e o tecido pulmonar e que mostra que o tratamento com o anti-factor B, tanto sistémico como nebulizado, reduziu o número de eosinófilos no fluído BAL, a inflamação peribronquial, os números de eosinófilos peribronquiais, assim como o número de células positivas mucosas no epitélio das vias aéreas. A Fig. 9 é um gráfico de linhas que mostra que os ratos sensibilizados e desafiados com C4 -/- (diamante fechado, n=10) mostraram uma reação semelhante ao MCh inalado, como os ratos sensibilizados e desafiados com C4 +/+ (quadrado fechado, n=10) e reações significativamente mais elevadas em comparação com os ratos desafiados apenas com C4 -/-(diamante aberto, n=10) e os ratos desafiados apenas com C4 +/+ (quadrado aberto, n=10) (*p<0,05 comparado com ratos sensibilizados e desafiados com fB -/-, desafiados com fB + /+ e desafiados com fB # p<0,05 comparado com ratos desafiados com fB +/+ e fB 5 p<0,05 comparado com ratos desafiados com C4 +/+ e C4 -/-). A Fig. 10 é um gráfico de linhas que mostra que os ratos sensibilizados e desafiados com C4 -/- (caixa sólida, n=8) mostraram um aumento na resistência das vias aéreas ao MCh inalado, em comparação com os ratos desafiados apenas com C4 -/- (caixa aberta, n=8), e que o tratamento de ratos sensibilizados e desafiados com C4 -/- com o anticorpo monoclonal do anti-factor B sistémico diminui a reação das vias aéreas ao MCh (circulo sólido, n=8). 14/146 A Fig. 11 é um desenho esquemático que mostra um modelo do mapeamento do epítope para mAbl379 na superfície do factor B humano. A Fig. 12 é um desenho esquemático que mostra um complexo modelado de mAB137 9 (um fragmento Fab) que liga ao factor B, com os lados de ligação do antigene tendo sido modelados para cobrir toda a região do mapeamento do epítope. os ratos ligeiros horas de do tipo A Fig. 13 é um gráfico de barras que mostra que que foram pré-tratados com 1379 demonstraram aumentos no nitrogénio da urea do soro após 24 reperfusão quando comparado com os controlos selvagem.

Descrição Pormenorizada da Invenção

Uma realização da presente invenção refere-se ao fornecimento de novos anticorpos do factor B que bloqueiam de forma selectiva a via alternativa do complemento, e o uso desses anticorpos para inibir a via alternativa do complemento em qualquer condição ou doença em que essa inibição é desejada, útil ou que se antecipa vir a ser útil. Especificamente, dado o benefício de grande potencial terapêutico de um inibidor específico para a via alternativa do complemento para uso em métodos de tratamento para muitas doenças, os inventores desenvolveram vários anticorpos monoclonais inibidores novos dirigidos contra o factor B. Vários destes anticorpos foram já caracterizados e um destes anticorpos já foi caracterizado 15/146 em grande pormenor. Este anticorpo foi testado in vitro, assim como in vivo tanto num modelo bem aceite de inflamação alérgica e asma, como num modelo de lesão de reperfusão de isquémia renal, que é habitualmente aplicável à lesão de reperfusão e isquémia. Para produzir esses anticorpos, os ratos sem o factor B dos genes alvo (fB -/-) foram injectados com uma proteina de fusão constituída pelos segundo e terceiro domínios de repetição de consenso curto (SCR) do factor B ligado a uma imunoglobulina. Os ratos foram rastreados para uma reação imune ao factor B, e as células do baço de um dos ratos injectados foram fundidas com células de mieloma. Um dos hibridomas resultantes, nomeado 1379, produz um anticorpo IgGi que inibe a activação da via alternativa do complemento in vitro e in vivo, embora os presentes inventores tenham produzido e caracterizado vários anticorpos monoclonais com a capacidade de inibir a via alternativa do complemento (ver Quadro 4). 0 anticorpo 1379 (também aqui referido como mAbl379) inibe a activação da via alternativa do complemento em soro de várias espécies animais incluindo ratos, ratazanas, humanos, babuínos, macacos rhesus, macacos cinomolgos, porcos, coelhos e cavalos. Fragmentos Fab feitos deste anticorpo também tiveram como resultado a completa inibição da via alternativa. Os inventores também mostraram que o anticorpo pode inibir completamente a lise de eritrócitos através do soro humano, confirmando assim a capacidade deste reagente de bloquear completamente a activação da via alternativa do complemento. 0 mapeamento do epítope oi usado para demonstrar que este anticorpo liga ao factor B dentro do terceiro domínio de repetição de consenso curto (SCR) e o anticorpo impediu a formação do complexo C3bBb. A seguir fornece-se uma descrição pormenorizada do epítope reconhecido por este anticorpo. Assim, encontram-se aqui descritos inibidores selectivos da 16/146 via alternativa do complemento e, em particular estes novos anticorpos do factor B, que têm uma ampla reactividade nas espécies, demonstraram eficácia in vitro e in vivo, e são ferramentas terapêuticas altamente eficazes em qualquer variedade de condições e doenças em que a inibição selectiva da via do complemento é útil, necessária e / ou preferida (por exemplo, condições associadas à hipersensibilidade das vias aéreas e da inflamação das vias aéreas (ver abaixo), lesão da reperfusão isquémia, etc.). Estes anticorpos podem também ser humanizados ou manipulados de outra forma para reduzir os potenciais efeitos secundários do sistema imunitário e são, por isso, um novo reaqente terapêutico valioso.

Os anticorpos que foram produzidos pelos presentes inventores reconhecem um sitio no factor B que é partilhado por várias espécies de mamíferos (incluindo humanos), nos quais são realizadas experiências para prova de principio pré-clinicas, permitindo deste modo descobertas em modelos de doenças humanas que podem ser prontamente traduzidas para terapias humanas. Antes desta invenção, os inventores não se tinham encontrado nenhum outro anticorpo contra o factor B que exibisse a inibição de tão variadas espécies da proteina, como o anticorpo da presente invenção. Deste modo, os presentes inventores também identificaram um único sitio no factor B contra o qual novos reagentes inibidores podem ser desenvolvidos. A identificação do factor B e de outras proteínas na via alternativa do complemento como alvos terapêuticos específicos fornece tanto uma estratégia terapêutica racional, como também compostos lideres que podem ser obtidos para tratar doenças inflamatórias das vias aéreas e outras doenças. Há vantagens em bloquear a via alternativa de forma selectiva. Por exemplo, os ratos 17/146 com C4 -/- (ratos que não têm o componente do complemento C4 que é qenérico nas vias do complemento clássica, alternativa e de lectina) , mas não os ratos fB -/- (sem o factor B) , parecem ser mais susceptíveis à infeção bacteriana experimental, sugerindo que ao deixar intacta a via clássica, um inibidor da via alternativa apresenta menos risco de uma infeção grave. 0 bloqueio da via clássica pode igualmente resultar em autoimunidade e os pacientes com deficiências de componentes da via clássica têm um risco aumentado de infeção e de autoimunidade. A inibição selectiva da via alternativa impede a criação dos ligantes derivados de C3 para o receptor C3a, assim como para os receptores 1 - 4 e C5a. Os efeitos do bloqueio da via alternativa podem ser na realidade mais directos, devido a aos receptores ainda pouco caracterizados para os produtos de activação Ba ou Bb do factor B que são criados durante o processo de activação.

Outra realização da presente invenção refere-se a uma surpreendente descoberta pelos presentes inventores em que a activação da cascata do complemento da via alternativa é fundamental e, de facto, necessária e suficiente para o desenvolvimento da hipersensibilidade das vias aéreas e da inflamação das vias aéreas. Mais particularmente, os presentes inventores apresentam aqui a descoberta de que a inibição da via alternativa, mas não da via clássica do complemenot, impede a hipersensibilidade das vias aéreas e reduz a inflamação das vias aéreas. Os inventores demonstram esta descoberta usando ratos sem o factor B (ou seja, através da tecnologia de supressão) e através da inibição do factor B com anticorpos monoclonais (administrados tanto sistematicamente como via aerossol) . Deste modo, os inventores apresentam aqui a inibição 18/146 selectiva da via alternativa do complemento através deste ou de qualquer outro meio (por exemplo, através da deficiência ou inibição do factor D ou properdina), para inibir a hipersensibilidade das vias aéreas e a inflamação das vias aéreas. Os presentes inventores demonstraram que o factor B é necessário para a indução da asma experimental. De especial importância, o factor B é essencial para a fase do desafio (ou efetuador) deste modelo, e a inalação de um anticorpo monoclonal que se liga deforma selectiva ao factor B nos pulmões, ou administrado sistemicamente, bloqueia o desenvolvimento da hipersensibilidade das vias aéreas (AHR) e da inflamação das vias aéreas associada a doença inflamatória alérgica, tal como se exemplifica num modelo de asma experimental. Além disso, os presentes inventores descobriram que esta inibição é especificamente conseguida através da inibição da via alternativa do complemento, uma vez que os resultados adicionais mostraram que os ratos com a supressão de C4 (C4 -/-) nãos estavam protegidos da AHR, enquanto os ratos com a supressão do factor B (fB -/-) estavam protegidos da AHR neste sistema de modelo. Deste modo, os presentes inventores descobriram que a inibição da via alternativa do complemento (por qualquer meio) é necessária e suficiente para inibir a AHR e a inflamação das vias aéreas e assim tratar ou prevenir condições e doenças relacionadas com aquelas. Além disso, os inventores mostram que a inibição da via clássica do complemento não é necessária para a inibição da AHR e da inflamação das vias aéreas e, por isso, tal como discutido anteriormente, as consequências indesejadas associadas à inibição da via clássica do complemento podem ser evitadas seguindo os ensinamentos da presente invenção

Anticorpos do factor B 19/146

Assim, uma primeira realização da presente invenção refere-se a um anticorpo ou um seu fragmento de ligação antigene que inibe de forma selectiva a via alternativa do complemento e, em particular, um anticorpo do factor B. Num aspecto, o anticorpo liga-se de forma selectiva à proteína da via alternativa do complemento de uma maneira tal que a proteína fica inibida ou impedida de se ligar a outra proteína com a qual normalmente (em condições naturais ou fisiológicas) interage. Num outro aspecto, o anticorpo liga-se de forma selectiva à proteína de tal maneira que a proteína fica inibida ou impedida de activar outra proteína com a qual normalmente interage, apesar de a proteína poder ligar-se pelo menos parcialmente a outra proteína. Os anticorpos e os seus fragmentos de ligação de antigene particularmente preferidos para uso na inibição selectiva da via alternativa do complemento incluem os anticorpos do factor B aqui descritos e, em particular o anticorpo mAbl379 aqui descrito em pormenor.

Os anticorpos (e os seus fragmentos de ligação de antigene) que se ligam de forma selectiva ao factor B e inibem a via alternativa do complemento, de acordo com a invenção, são aqui descritos e exemplificados em pormenor. Numa realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene liga-se a uma superfície ou um epítope de ligação conservada dessa proteína (por exemplo, factor B) que é conservada entre as espécies animais, e em particular nas espécies de mamíferos (isto é, o anticorpo tem uma reação cruzada com a proteína de duas ou mais espécies diferentes de mamíferos) . Em particular, a presente invenção inclui um anticorpo que se liga ao factor B de pelo menos duas, e de preferência várias, espécies diferentes de mamíferos incluindo mas não se limitando a, humanos, primatas não 20/146 humanos, ratos, porcos, cavalos e coelhos. A presente invenção inclui um anticorpo que se liga ao factor B de humanos e de ratos. Numa realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene liga-se ao terceiro dominio de repetição de consenso curto (SCR) do factor B. Numa realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene liga-se a uma região do factor B que impede a segmentação do factor B pelo factor D. Numa realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Numa realização, o anticorpo é o anticorpo referido aqui como 1379 (isto é, o anticorpo produzido pela linha de células hibridoma do mesma número, também com Designação de Depósito ATCC, PTA -6230), ou um seu fragmento de ligação de antigene. A hibridoma aqui descrita como 1379 (ou mAbl379) foi depositada em 21 de Setembro de 2004, com a American Type Cultura Collection (ATCC, localizada na Universidade de Boulevard 10801, Manassas, VA 20110 - 2209), sob os termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Efeitos do Procedimento de Patentes e recebeu a Designação de Depósito PTA - 6230.

De acordo com a presente invenção, o tamanho mínimo de uma proteína, parte de uma proteína (por exemplo, um fragmento, porção, domínio, etc.) ou região ou epítope de uma proteína, é um tamanho suficiente para servir como um epítope ou superfície de ligação conservada para a criação de um anticorpo ou como um alvo num teste in vitro. Numa realização, uma proteína da presente invenção tem pelo menos cerca de 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos de comprimento (por exemplo, apropriado para um epítope anticorpo ou como 21/146 um peptídeo detectável num teste), ou pelo menos cerca de 25 aminoácidos de comprimento, ou pelo menos cerca de 50 aminoácidos de comprimento, ou pelo menos cerca de 1000 aminoácidos de comprimento, ou pelo menos cerca de 150 aminoácidos de comprimento, e assim por diante, em qualquer comprimento entre 4 aminoácidos e até todo o comprimento de uma proteína ou sua porção ou mais comprido, em números inteiros (por exemplo, 8, 9, 10, ...25, 26, ... 500, 501, ...) . A sequência de nucleótideos para o gene e para a região codificadora que codifica o factor B humano e outras proteínas do complemento, assim como a sequência de aminoácidos dessas proteínas, são bem conhecidas nesta arte. Por exemplo, o gene que codifica o factor B humano e outras proteínas do complemento encontra-se na base de dados do código de registo NCBI Nr. NG_000013. A sequência de código para o factor B encontra-se na base de dados do código de registo NCBI Nr. NM_001710 e a sequência do aminoácido para a pré-proteína do factor B encontra-se na base de dados do código de registo NCBI Nr. NP_0013710 ou P00751. A sequência do aminoácido para a base de dados do código de registo NCBI Nr. P00751, que é uma sequência da pré-proteína do factor B, está aqui representada por SEQ ID NR: 1. Sequências de outras espécies animais são também conhecidas nesta arte. Para efeitos de comparação, na sequência do factor B do rato (por exemplo, ver a base de dados do código de registo NCBI Nr. P04186, aqui representado por SEQ ID NR:6), o terceiro domínio SCR está localizado nas posições 160 - 217 desta pré-proteína do aminoácido 7 61, e a proteína do factor B do murino adulto abrange as posições 23 - 761 da SEQ ID NR:6. 22/146 A pré-proteína do factor B humano representada pela SEQ ID Nr: 1 é uma proteína de aminoácido 7 64 com um peptídeo de sinal que abrange as posições 1 - 25 de aminoácidos. A cadeia adulta do factor B corresponde às posições 26 - 764 da SEQ ID NR: 1 e é aqui representada pela SEQ ID NR: 2. As três regiões SCR do factor B humano são aqui representadas por SEQ ID NR: SEQ ID NR: 3 (SCR1, também conhecida por Sushi 1, que abrange desde cerca da posição 35 até cerca da posição 100 de SEQ ID NR:1 ou desde cerca da posição 5 a cerca da posição 75 de SEQ ID NR:2), SEQ ID NR: 4 (SCR2, também conhecida por Sushi 2, que abrange desde cerca da posição 101 até cerca da posição 160 de SEQ ID NR: 1 ou desde cerca da posição 76 a cerca da posição 135 de SEQ ID NR:2), e SEQ ID NR:5 (SCR3, também conhecida por Sushi 3, que abrange desde cerca da posição 163 a cerca da posição 220 de SEQ ID NR:1, ou desde cerca da posição 138 a cerca da posição 195 de SEQ ID NR:2).

Com base no mapeamento dopara um epítope anticorpo exemplificativo da invenção usando os fragmentos descritos por Hourcade, 1995, J. Biol. Chem. (ver Exemplos), um anticorpo do anti-factor B da presente invenção liga-se de preferência a um epítope ou uma superfície de ligação conservada dentro ou contendo uma parte do terceiro domínio SCR e, de maior preferência, a um epítope do factor B humano que inclui pelo menos uma porção da sequência que compreende desde cerca da posição Tyrl39 a cerca da posição Serl85 no que respeita à proteína do factor B adulto (SEQ ID NR:2), a um epítope do factor B humano que inclui pelo menos uma porção da sequência que compreende desde cerca da posição Tyrl39 a cerca da posição Serl41, no que respeita à proteína do factor B adulto (SEQ ID NR:2), a um epítope do factor B humano que inclui pelo menos uma porção da 23/146 sequência que compreende desde cerca da posição Glul82 a cerca da posição Serl85, no que respeita à proteina do factor B adulto (SEQ ID NR:2), a um epitope do factor B que inclui pelo menos uma porção do factor B humano (SEQ ID NR:2) que compreende uma ou mais das posições ou posições equivalentes numa sequência do factor B humano: Tyrl39, Cys 140, Ser 141, Glu 182, Gly 184 ou Ser 185, ou a um epitope do factor B que inclui pelo menos uma porção das posições equivalentes, no que respeita a espécies animais não humanas. Um perito nesta arte sabe alinhar prontamente a sequência do factor B humano com a sequência do factor B de outra espécie animal e determinar as posições das reqiões de SCR e as porções especificas das reqiões do terceiro SCR que correspondem às posições dos aminoácidos referidos atrás. Por exemplo, duas sequências especificas podem ser alinhadas uma com a outra usando a sequência BLAST 2, tal como é descrito em Tatusova and Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparinq protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol. Lett. 174 : 247 - 250.

Com base nos modelos e no mapeamento do epitope adicional de um anticorpo exemplificativo da invenção, numa outra realização preferida, um anticorpo do factor B da presente invenção liqa-se de preferência a um epitope (superfície de liqação conservada) dentro ou contendo uma parte ou porção do terceiro domínio SCR do factor B que inclui pelo menos uma ou mais das seguintes posições de aminoácidos, no que respeita a SEQ ID Nr:2, ou suas posições equivalentes numa sequência do factor B humano: A 137, Y 139, S 141, E 182, S 185, T 189, E 190, e S 192. Num aspecto da invenção, o epitope encontra-se em, ou contendo uma parte ou porção do terceiro domínio SCR do factor B que inclui todos, ou substancialmente todos (pelo menos cinco, seis, ou sete de) 24/146 as seguintes posições de aminoácidos de SEQ ID Nr:2, ou suas posições equivalentes numa sequência do factor B não humano: Ala 137, Tyr 139, Ser 141, Glu 182, Ser 185, Thr 189, Glu 190, e Ser 192.

Numa realização, o epítope reconhecido pelo anticorpo do factor B da invenção pode também ser definido mais particularmente como epitope não-linear localizado dentro da estrutura tridimensional de uma porção do terceiro dominio SCR do factor B. A porção que contém o epitope é a estrutura tridimensional que é definida substancialmente (por exemplo, em pelo menos de cerca de 90%) pelas posições de aminoácidos Ala 137 - Ser 192 de SEQ ID Nr: 2, ou posições equivalentes numa sequência do factor B não humano. Um modelo da estrutura tridimensional do factor B que ilustra um epitope para mAbl379 está ilustrado na Fig. 11 e na Fig. 12, por exemplo. Tal como é usado aqui, a "estrutura tridimensional" ou "estrutura terciária" de uma proteína refere-se à disposição dos componentes da proteína em três dimensões. Esse termo é bem conhecido dos entendidos nesta arte. Tal como é usado aqui, o termo "modelo" refere-se a uma representação num meio tangível da estrutura tridimensional de uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo. Por exemplo, um modelo pode ser uma representação de uma estrutura tridimensional num ficheiro electrónico, num monitor de um computador, num pedaço de papel (isto é, num meio bidimensional) , e / ou como uma figura de modelo de bola e vara.

De acordo com a presente invenção, um "epítope" de uma dada proteína ou peptídeo, ou outra molécula é geralmente definida, no que respeita aos anticorpos, como uma parte de 25/146 ou um sítio numa molécula maior, à qual um anticorpo ou seu fragmento de ligação antígene se irá ligar, e contra o qual o anticorpo será produzido. 0 termo epítope pode ser usado de forma indistinta com o termo "determinante antigénico", "sítio de ligação do anticorpo", ou "superfície de ligação conservada" de uma dada proteína ou antígene. Mais especificamente, um epítope pode ser definido tanto pelos resíduos de aminoácido envolvidos numa ligação de anticorpo como pela sua conformação num espaço tridimensional (por exemplo, um epítope conformacional ou uma superfície de ligação conservada). Um epítope pode ser incluído em peptídeos tão pequenos como 4-6 resíduos de aminoácidos, ou pode ser incluído em segmentos maiores de uma proteína, e não necessita de compreender resíduos de aminoácidos contíguos quando se refere a uma estrutura tridimensional de um epítope, em particular no que respeita a um epítope de ligação a um anticorpo. Os epítopes de ligação a um anticorpo são frequentemente epítopes conformacionais, ao invés de um epítope sequencial (isto é, epítope linear), ou por outras palavras, um epítope definido pelos resíduos de aminoácidos dispostos em três dimensões na superfície de uma proteína ou um poliptídeo ao qual um anticorpo se liga. Tal como foi referido anteriormente, o epítope conformacional não compreende uma sequência contígua de resíduos de aminoácidos, mas ao invés, os resíduos são talvez separados na sequência primária da proteína e são unidos para formar uma superfície de ligação através da forma como a proteína se dobra na sua conformação nativa em três dimensões. 0 epítope reconhecido como mAbl379 é um epítope conformacional que não é um epítope linear.

Um perito nesta arte sabe identificar e / ou juntar epítopes conformacionais e / ou epítopes sequenciais usando 26/146 técnicas conhecidas, incluindo a análise de mutação (por exemplo, mutagénese dirigida); proteção da degradação proteolítica (impressão da proteína); análise de mimotopo usando, por exemplo, peptideos sintéticos e pepscan, BIACORE ou ELISA; mapeamento de competição de anticorpos; rastreio de biblioteca de peptideos combinatórios; espectrometria de massa de tempo de voo e ionização / dessorção a laser auxiliada por matriz; ou modelagem tridimensional (por exemplo, usando qualquer programa de software apropriado, incluindo, mas não se limitando a, MOLSCRIPT 2.0 (Avatar Software AB, Heleneborgsgatan 21C, SE - 11731 Estocolmo, Suécia), o programa de exibição gráfico O (Jones et al., Acta Crystallography, vol. A47, p. 110, 1991), o programa de exibição gráfica GRASP, ou o programa de exibição gráfica INSIGHT). Por exemplo, pode usar-se a substituição molecular ou outras técnicas e a conhecida estrutura tridimensional de uma proteína relacionada com para modelar a estrutura tridimensional do factor B e prever o epítope conformacional de uma ligação de anticorpos a esta estrutura. De facto, pode usar-se uma ou qualquer combinação dessas técnicas para definir o epitope de ligação ao anticorpo. As Fig. 11 e 12 ilustram o uso da modelação tridimensional, combinada com informação da análise de mimotopo e da análise de mutação, para identificar o epítope de um anticorpo do factor B da presente invenção.

Tal como é usado aqui, o termo "liga-se de forma selectiva a" refere-se à ligação específica de uma proteína a outra (por exemplo, um anticorpo, seu fragmento, ou parceiro de ligação a um antígene), em que o nível de ligação, tal como é medido por qualquer ensaio padrão (por exemplo, um imunoensaio), é estatística e significativamente mais 27/146 elevado do que o controlo de base do ensaio. Por exemplo, quando se efectua um imunoensaio, os controlos habitualmente incluem um tanque / tubo de reação que contém apenas o anticorpo ou o fragmento de ligação do antigene (isto é, na ausência do antigene), em que uma quantidade de reactividade (por exemplo, uma ligação não especifica ao tanque) pelo anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigene na ausência do antigene é considerada como sendo base. A ligação pode ser medida usando uma variedade de métodos padrão nesta arte, incluindo, mas não se limitando a: Western Blot, immunoblot, ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (ELISA), ensaio de radioimunidade (RIA), imunoprecipitação, ressonância plasmónica de superfície, quimioluminescência, polarização fluorescente, fosforescência, análise imunohistoquimica, espectrometria de massa de tempo de voo e ionização / dessorção a laser auxiliada por matriz (MALDI - TOF), micrometria, micrograma, microscópio, seleção celular activada por fluorescência (FACS) e citometria de fluxo.

Uma realização da presente invenção inclui um anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigene que é um inibidor competitivo do factor B de ligação ao anticorpo do anti-factor B (por exemplo, o anticorpo monoclonal 137 9) . De acordo com a presente invenção, um inibidor competitivo do factor B que se liga ao anticorpo do anti-factor B da presente invenção é um inibidor (por exemplo, outro anticorpo ou fragmento de ligação do antigene ou poliptideo) que se liga ao factor B no mesmo epítope, ou semelhante, que o conhecido anticorpo do anti-factor B da presente invenção (por exemplo, mAb 1379), de tal forma que a ligação do conhecido anticorpo do anti-factor B ao factor é inibida. Um inibidor competitivo pode ligar-se ao alvo 28/146 (por exemplo, factor B) com uma maior afinidade com o alvo do que o anticorpo do anti-factor B. Um inibidor competitivo pode ser usado de uma forma semelhante à descrita aqui para o anticorpo do anti-factor B 1379 (por exemplo, para inibir a via alternativa do complemento, para inibir a hipersensibilidade das vias aéreas num animal, etc.)· Por exemplo, uma realização da invenção refere-se a um anticorpo isolado ou um seu fragmento de ligação do antigene que se liga de forma especifica ao factor B, em que o anticorpo ou seu fragmento inibe de forma competitiva o mAb 1379 para uma ligação especifica com o factor B, e em que, quando o anticorpo ou seu fragmento se liga ao factor B, a via alternativa do complemento é inibida ou, em alternativa, a capacidade do mAb 1379 inibir a via alternativa do complemento é inibida. Uma outra realização refere-se a um anticorpo isolado ou seu fragmento que se liga ao factor B de forma específica, em que o anticorpo isolado, ou seu fragmento, inibi de forma competitiva um segundo anticorpo ou seu fragmento da ligação específica ao factor B, e em que o segundo anticorpo ou seu fragmento se liga ao terceiro domínio SCR do factor B.

Os ensaios de competição podem ser realizados usando técnicas padrão nesta arte (por exemplo, ELISA competitivo ou outros ensaios de ligação). Por exemplo, os inibidores competitivos podem ser detectados e quantificados pela sua capacidade de inibir o factor B de ligação a um conhecido anticorpo de anti-factor B rotulado (por exemplo, o mAb 1379). Os ensaios de competição de anticorpo - anticorpo na presença do factor B humano são descritos, por exemplo, no Exemplo 3. Os inibidores competitivos do factor B de ligação ao anti-factor B 1379 são descritos no Exemplo 3 e no Quadro 4. 29/146

De acordo com a presente invenção, os anticorpos são caracterizados pelo facto de compreenderem domínios de imunoglobulina e, como tal são membros da super-família de imunoglobulina de proteínas. De um modo geral, uma molécula de anticorpo compreende dois tipos de cadeias. Um tipo de cadeia é referido como a cadeia pesada ou H e a outra é referida como a cadeia leve ou L. As duas cadeias estão presentes numa razão equimolar, em que cada molécula de anticorpo tem normalmente duas cadeias H e duas cadeias L. As duas cadeias H estão ligadas por ligações de disulfidos e cada cadeia H está ligada a uma cadeia L através de uma ligação de disulfido. Há apenas dois tipos de cadeias L referidas como cadeias lambda (λ) e Kappa (K) . Por outro lado, há cinco classes de cadeias H principais referidas como isótipos. As cinco classes incluem imunoglobulina M (IgM ou μ), imunoglobulina D (IgD ou δ), imunoglobulina G (IgG ou λ), imunoglobulina A (IgA ou a) e imunoglobulina E (IgE ou ε). As características distintivas entre esses isótipos são definidas pelo domínio constante da imunoglobulina e são discutidas em pormenor a seguir. As moléculas de imunoglobulina compreendem nove isótipos, IgM, IgD, IgE, quatro subclasses de IgG incluindo IgGl (Y 1), IgG2 (Y 2), IgG3 (Y 3) e IgG4 (Y 4), e duas subclasses de IgA incluindo IgAl (α 1) e IgA2 (a 2) . Nos humanos, as subclasses IgG 3 e IgM são os ativadores do complemento mais potentes (sistema clássico do complemento), enquanto a subclasse IgG 1 e, até um nível menos extenso, a 2, é ativadora moderada a fraca do sistema clássico do complemento. A subclasse de IgG4 não activa o sistema do complemento (via clássica e alternativa). 0 único isótipo de imunoglobulina humano conhecido que activa o sistema alternativo do complemento é IgA. Nos ratos, as subclasses de IgG são IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3. 0 IgGl do murino não 30/146 activa o do complemento, enquanto o IgG2a, IgG2b e IgG3 são ativadores do complemento.

Cada cadeia H ou L de uma molécula de imunoglobulina compreende duas regiões referidas por dominios variáveis da cadeia L (dominios VL) e dominios constantes da cadeia H (dominios CH). Um dominio de CH completo compreende três subdominios (CHI, CH2, CH3) e uma região articulada.

Juntas, uma cadeia H e uma cadeia L podem formar uma molécula de imunoglobulina com uma região variável de imunoglobulina. Uma molécula de imunoglobulina completa compreende dois braços associados (por exemplo, ligados por di-sulfido). Deste modo, cada braço de uma imunoglobulina completa compreende uma região Vh+l, e uma região Ch+l· Tal como é usado aqui, o termo "região variável" ou "região V" refere-se a uma região Vh+l (também conhecida como um fragmento Fv) , uma região VL ou uma região VH. Também usado aqui, o termo "região constante" ou "região C" refere-se a uma região Ch+l/ a uma região CL ou a uma região CH. A digestão limitada de uma imunoglobulina com uma protease pode produzir dois fragmentos. Um fragmento de ligação do antigene é referido como um fragmento Fab , um Fab', ou um F(ab')2· Um fragmento sem a capacidade de se ligar a um antigene é referido como um fragmento Fc. Um fragmento Fab compreende um braço de uma molécula de imunoglobulina que contém uma cadeia L (dominios VL+ CL) que faz par com a região VH e uma porção da região CH (dominio CHI) . Um fragmento Fab' corresponde a um fragmento Fab com uma parte da região articulada ligada ao dominio CHI. Um fragmento F(ab')2 corresponde a dois fragmentos Fab' que estão normalmente ligados de forma covalente um ao outro através 31/146 de uma ligação de disulfido, habitualmente nas regiões articuladas. 0 domínio CH define o isótipo de uma imunoglobulina e confere características funcionais diferentes dependendo do isótipo. Por exemplo, as regiões constantes μ permitem a formação de agregados pentaméricos de Moléculas IgM e as regiões constantes α permitem a formação de dímeros. A especificidade do antigene de uma molécula de imunoglobulina é conferida pela sequência do aminoácido de uma região variável, ou V. Como tal, as regiões V de diferentes moléculas de imunoglobulina podem variar de forma significativa dependendo da sua especificidade do antigene. Algumas porções da região V são mais conservadas do que outras e são referidas como regiões de enquadramento (regiões FW). Por outro lado, algumas porções de uma região V são altamente variáveis e são designadas regiões hipervariáveis. Quando os domínios VL e VH fazem par com uma molécula de imunoglobulina, as regiões hipervariáveis de cada domínio associam-se e criam circuitos hipervariáveis que formam os sítios de ligação dos antigene. Deste modo, os circuitos hipervariáveis determinam a especificidade de uma imunoglobulina e são expressos como regiões de determinação de complementaridade (CDRs) porque as suas superfícies são complementares aos antigene. A variabilidade combinatória dos segmentos de genes que codificam uma região V de imunoglobulina conferem mais variabilidade à região V. Os genes da imunoglobulina 32/146 compreendem múltiplo segmentos de genes germinativos que se dispõem de forma somática para formar um gene de imunoglobulina reorganizado que codifica uma molécula de imunoglobulina. As regiões VL são codificadas por um segmento do gene V da cadeia L e um segmento do gene J (segmento de junção). As regiões VH são codificadas por um segmento do gene V da cadeia H, segmento do gene D (segmento de diversidade) e um segmento do gene J (segmento de junção).

Tanto a cadeia L como a cadeia H contêm três regiões com uma substancial variabilidade da sequência do aminoácido. Essas regiões são referidas como cadeia L CDR1, CDR2 e CDR3 e cadeia H CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente. 0 comprimento de uma cadeia L CDR1 pode variar substancialmente entre diferentes regiões VL. Por exemplo, o comprimento de um CDRl pode variar desde cerca de 7 aminoácidos até cerca de 17 aminoácidos. Por outro lado, os comprimentos das cadeias L CDR2 e CDR3 não costumam variar entre as diferentes regiões VL. 0 comprimento de uma cadeia H CDR3 pode variar substancialmente entre as diferentes regiões VH. Por exemplo, o comprimento de CDR3 pode variar desde cerca de 1 aminoácido até cerca de 20 aminoácidos. Cada região da cadeia H e L CDR é ladeada por regiões FW.

Outros aspectos funcionais de uma molécula da imunoglobulina incluem a valência de uma molécula da imunoglobulina, a afinidade da molécula da imunoglobulina e a avidez de uma molécula de imunoglobulina. Tal como é usada aqui, a afinidade refere-se à força com que uma molécula de imunoglobulina se liga a um antigene num único sitio numa molécula de imunoglobulina (isto é, um fragmento 33/146

Fab monovalente a ligar-se a um antigene monovalente). A afinidade difere da avidez, que se refere à soma total da força com que uma imunoglobulina se liga a um antigene. A afinidade de ligação da imunoglobulina pode ser medida usando técnicas padrão nesta arte, tais como técnicas de ligação competitiva, diálise de equilíbrio ou métodos de BIAcore. Tal como é usado aqui, a valência refere-se ao número de diferentes sítios de ligação de antigene por molécula de imunoglobulina (isto é, o número de sítios de ligação de antigene por molécula de anticorpo do fragmento de ligação de antigene) . Por exemplo, uma molécula monovalente pode apenas ligar-se a um antigene de cada vez, enquanto uma molécula de imunoglobulina monovalente pode ligar-se a dois ou mais antigene de cada vez, e assim por diante. Tanto os anticorpos monovalentes como os bivalentes que se ligam de forma selectiva a proteínas da via alternativa do complemento estão aqui englobados.

Numa realização, o anticorpo é um anticorpo bi- ou multi-específico. Um anticorpo bi-específico (ou multi-específico) é capaz de ligar dois (ou mais) genes, tal como um anticorpo divalente (ou multivalente), mas neste caso, os antigenes são antigenes diferentes (isto é, o anticorpo exibe uma especificidade dual ou maior) . Por exemplo, um anticorpo que se liga a uma proteína de forma selectiva na via alternativa do complemento, de acordo com a presente invenção (por exemplo, um anticorpo do anti-factor B, tal como descrito aqui) pode ser construído como um anticorpo bi-específico, em que a segunda especificidade de ligação do antigene é para um alvo desejado. Por isso, um anticorpo bi-específico englobado na presente invenção inclui um anticorpo com: (a) uma primeira porção (por exemplo, uma primeira porção de ligação do antigene) que se liga a uma 34/146 proteina na via alternativa do complemento (por exemplo, factor B) ; e (b) uma segunda porção que se liga a uma molécula da superfície da célula expressa por uma célula. Nesta realização, a segunda porção pode ligar-se a qualquer molécula da superfície da célula. Uma molécula da superfície da célula preferida é um receptor ou ligante, de modo a que o anticorpo esteja direcionado para um determinado tipo de célula ou de tecido e / ou um determinado sítio num animal, ao qual se administra o anticorpo. Numa realização, a segunda especificidade de ligação do antigene é para um receptor do complemento. Um receptor do complemento particularmente preferido inclui, mas não se limita a, o receptor do complemento tipo 2 (CR2). Os anticorpos que se ligam de forma selectiva a CR2 e poderiam por isso ser usados nesta realização da invenção são descritos, por exemplo, na Patente Norte-americana Nr. 6 820 011.

Numa realização, os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos humanizados. Os anticorpos humanizados são moléculas com um sítio de ligação dos antígenes derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana, sendo as restantes partes da molécula derivadas de uma imunoglobulina humana. O sítio de ligação do antigene pode compreender tanto, regiões variáveis completas fundidas em domínios constantes humanos, como apenas as regiões determinantes do complemento (CDRs) enxertadas em regiões de enquadramento humano apropriadas nos domínios variáveis. Os anticorpos humanizados podem ser produzidos, por exemplo, através da modelação dos domínios variáveis do anticorpo, e produzindo os anticorpos usando as técnicas de engenharia genética, tais como enxerto CDR (descrito abaixo). Uma descrição de várias técnicas para a produção 35/146 de anticorpos humanizados encontra-se, por exemplo em Morrison et al. (1984) proc. Natl. Acad. Sei. EUA 81 : 6851 - 55; Whittle et al. (1987) Prot. Eng. 1: 499 - 505; Co et al. (1990) J. Immunol. 148 : 1149 - 1154; Co et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 88 : 2869 - 2873; Cárter at al. (1992) proc. Natl. Acad. Sei. 89 : 4285 - 4289; Routledge et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21 : 2717 - 2725 e

Publicação de Patentes PCT Nrs- WO 91 / 09967; WO 91 / 09968 e WO 92 / 113831.

Os anticorpos isolados da presente invenção podem incluir soro contendo esses anticorpos, ou anticorpos que foram purificados em vários graus. Os anticorpos inteiros da presente invenção podem ser policlonais ou monoclonais. Como alternativa, os equivalentes funcionais de anticorpos inteiros, tais como fragmentos de ligação antigene, nos quais um ou mais domínios de anticorpos estão truncados ou ausentes (por exemplo, fragmentos Fv, Fab, Fab', ou F(ab)2), assim como anticorpos geneticamente manipulados ou seus fragmentos de ligação de antigene, incluindo anticorpos de cadeias simples, anticorpos humanizados (discutido acima), anticorpos que podem ligar-se a mais do que um epítope (por exemplo anticorpos bi-específicos) , ou anticorpos que podem ligar-se a um ou mais antigene diferentes (por exemplo, anticorpos bi- ou multi-específicos), podem também ser utilizados na invenção.

Os anticorpos geneticamente manipulados da invenção incluem aqueles produzidos através de técnicas padrão recombinantes de ADN que envolvem a manipulação e a re-expressão de ADN que codificam regiões variáveis e / ou constantes de anticorpos. Os exemplos principais incluem anticorpos 36/146 quiméricos, em que os domínios VH e / ou VL do anticorpo têm uma origem diferentes comparada com o resto do anticorpo e os anticorpos enxertados CDR (e seus fragmentos de ligação de antígene), em que pelo menos uma sequência CDR e, como opção, pelo menos um aminoácido de enquadramento da região variável tem (têm) origem numa fonte e as restantes porções das regiões variáveis e constantes (conforme apropriado) têm origem numa fonte diferente. A construção de anticorpos quiméricos e de enxerto CDR está descrita, por exemplo nos Pedidos de Patentes Europeias EP - A 0194276, EP - A 0239400, EP - A 0451216 e EP - A 0460617.

Numa realização, os anticorpos quiméricos são produzidos de acordo com a presente invenção, compreendendo domínios variáveis de anticorpos que se ligam a uma proteína na via alternativa do complemento (por exemplo, o factor B) e fundida a estes domínios, uma proteína que serve como segundo meio de direcionamento. Por exemplo, o meio de direcionamento pode incluir uma proteína que fica associada à célula ou ao tecido alvo ou a um determinado sistema num animal. Por exemplo, o meio de direcionamento pode ser uma porção de um receptor do complemento. Um receptor do complemento preferido para se usar neste aspecto da invenção inclui o tipo 2 de receptor do complemento (CR2). O uso de CR2 e suas porções numa proteína de fusão ou quimérica (por exemplo, como num sistema de administração) é descrito em pormenor na Patente Norte-americana Nr. 6 820 011.

De um modo geral, na produção de um anticorpo, um animal experimental apropriado, tal como, por exemplo, mas não se 37/146 limitando a, um coelho, uma ovelha, um hamster, uma cobaia, um rato, uma ratazana, ou uma galinha, é exposto a um antigene, contra o qual se deseja criar um anticorpo. Normalmente, um animal é imunizado com uma quantidade eficaz de antigene que é injectado num animal. Uma quantidade eficaz de antigene refere-se a uma quantidade necessária para induzir a produção de anticorpos por um animal. 0 sistema imunitário do animal pode então reagir durante um pré-determinado periodo de tempo. 0 processo de imunização pode ser repetido até que se perceba que o sistema imunitário está a produzir anticorpos para o antigene. De modo a obter anticorpos policlonais específicos para o antigene, o soro é tirado do animal que contém os anticorpos desejados (ou no caso de uma galinha, o anticorpos pode ser tirado dos ovos) . Esse soro é útil como um reagente. Os anticorpos policlonais podem ser mais purificados com o soro (ou ovos) através de, por exemplo, tratamento do soro com sulfato de amónio.

Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos de acordo com a metodologia de Kohler e Milstein (Nature 256 : 495 -497, 1975) . Por exemplo, os linfócitos são recuperados do baço (ou qualquer outro tecido apropriado) de um animal imunizado e depois são fundidos com células do mieloma para se obter uma população de células de hibridoma capazes de um crescimento continuo num meio de cultura apropriado. Os hibridomas que produzem os anticorpos desejados são selecionados testando-se a capacidade do anticorpo produzido pelo hibridoma para se ligar ao antigene desej ado. 38/146

Um método preferido para produzir anticorpos da presente invenção inclui (a) a administração a um animal de uma quantidade eficaz de uma proteina ou peptídeo (por exemplo, uma proteina do factor B ou peptídeo que inclua os seus domínios) para produzir os anticorpos e (b) a recuperação dos anticorpos. Num outro método, os anticorpos da presente invenção são produzidos de forma recombinante. Por exemplo, loqo que se obtenha uma linha de células, por exemplo, um hibridoma, que expresse um anticorpo, de acordo com a invenção, é possível clonar a partir daí o cADN e identificar os genes da região variável que codificam o anticorpo desejado, incluindo as sequências que codificam os CDRs. A partis daqui, os fragmentos de ligação dos anticorpos e antígenes, de acordo com a invenção, podem ser obtidos preparando-se um ou mais vectores de expressão replicáveis que contenham pelo menos a sequência de ADN que codifica o domínio variável da cadeia pesada ou leve de anticorpos como desejado, e transformar / fazer a transfecção de uma célula hospedeira apropriada, na qual irá ocorrer a produção do anticorpo. Os hospedeiros de expressão apropriados incluem bactérias (por exemplo, uma estirpe de E. coli), fungos (em particular leveduras, por exemplo elementos do género Pichia, Saccharomyces, ou Kluyveromyces), e linhas de células de mamíferos, por exemplo, uma linha de células de mieloma não produtiva, tal como uma linha NSO de rato, ou células CHO. De modo a obter-se uma transcrição e uma translação eficazes, a sequência de ADN em cada vector deverá incluir sequências reguladoras apropriadas, em particular uma sequência promotora e guia, ligada de forma operacional a uma sequência de domínio variável. Os métodos específicos para a produção de anticorpos desta maneira são normalmente bem conhecidos e usados de forma rotineira. Por exemplo, procedimentos de biologia molecular básica são descritos em 39/146

Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989); a sequenciação de AND pode ser realizada tal como é descrito em Sanger et al. (PNAS 74, 5463, (1977)) e no manual de Amersham International plc sequencing; e a mutagénese direcionada no local pode ser efectuada de acordo com o método de Kramer et al. (Nucl. Acids Res. 12, 9441, (1984)) e o manual Anglian Biotechnology Ltd. Além disso, há várias publicações, incluindo especificações de patentes, técnicas de pormenor apropriada para a preparação de anticorpos através da manipulação de ADN, criação de vectores de expressão e transformação de células apropriadas, por exemplo tal como é revisto por Mountain A e Adair, J R em Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, Μ P, 10, Capitulo 1, 1992, Intercept, Andover, Reino Unido) e nos Pedidos de Patentes Europeias referidas anteriormente.

Os métodos alternativos utilizando, por exemplo, tecnologia de exibição de fagos (ver por exemplo US 5969108, US 5565332, US 5871907, US 5858657), ou o método de anticorpos linfócitos selecionados de US 5627052 podem também ser usados para a produção de anticorpos e / ou fragmentos de antigene da invenção, como se tornará rapidamente claro para um perito nesta arte.

Assim, um outro aspecto da presente invenção refere-se de um modo geral a composições para uso na inibição selectiva da via alternativa do complemento num animal que tem, ou está em risco de vir a ter, uma condição ou doença em que a activação da via alternativa do complemento tem um papel (por exemplo, a activação da via alternativa do complemento contribui para a condição ou doença, agrava pelo menos um 40/146 sintoma da condição ou doença, ou provoca a condição ou doença). Inclui-se o uso dos novos anticorpos do factor B da presente invenção, que foram descritos em pormenor acima. Essas condições ou doenças incluem, mas não se limitam a, condições associadas com a hipersensibilidade das vias aéreas (incluindo a hipersensibilidade das vias aéreas que está associada a inflamação) , lesão de isquémia e reperfusão, e perda fetal. As composições e fórmulas que compreendem esses anticorpos e seus fragmentos de ligação de antígene, assim como os polipeptídeos de ligação de antigene que imitam a especificidade dos anticorpos do factor B aqui descritos, assim como a discussão de métodos de administração e doses, são descritos em pormenor a seguir. Método para a Prevenção ou Inibição da Hipersensibilidade das Vias aéreas e da Inflamação das Vias aéreas

Com base na presente descoberta dos inventores de que a via alternativa do complemento é necessária e suficiente para inibir a hipersensibilidade das vias aéreas e a inflamação das vias aéreas, outra realização da presente invenção refere-se a uma composição para uso na inibição da hipersensibilidade das vias aéreas e / ou da inflamação das vias aéreas num animal que tem ou está em risco de vir a desenvolver hipersensibilidade das vias aéreas associada a inflamação ou a inflamação das vias aéreas. 0 método aqui descrito inclui uma etapa da inibição selectiva da via alternativa do complemento num animal que tem ou está em risco de vir a desenvolver hipersensibilidade das vias aéreas incluindo hipersensibilidade das vias aéreas associada a inflamação (isto é, a hipersensibilidade das 41/146 vias aéreas ocorre como resultado de inflamação ou de um processo inflamatório, ou ocorre juntamente com inflamação simultânea ou anterior das vias aéreas).

Fornece-se a seguinte discussão para desenvolver o aspecto de tratar ou prevenir a hipersensibilidade das vias aéreas e / ou a inflamação das vias aéreas num animal, ou condições ou doenças relacionadas com aquelas. No entanto, deverá entender-se que a discussão geral de inibidores, vias de administração, doses, indicadores de tratamento, descrição de fórmulas e outros semelhantes, pode aplicar-se a qualquer uma das realizações da invenção aqui descrita (isto é, a outras condições ou doenças para além daquelas associadas com a hipersensibilidade das vias aéreas e a inflamação das vias aéreas). Por exemplo, muitos dos aspectos gerais da invenção descrita a seguir podem ser aplicados à inibição especifica da via alternativa do complemento para tratar outras condições, tais como a lesão isquémia e reperfusão.

De acordo com a presente invenção, inibir a via alternativa do complemento num animal refere-se a inibição da expressão e / ou da actividade biológica de pelo menos uma proteína que faz parte da via alternativa do complemento. Essas proteínas incluem, mas não se limitam ao factor B, factor D ou properdina. Inibir "de forma selectiva" a via alternativa do complemento significa que a presente invenção inibe de preferência ou em exclusivo a via alternativa do complemento, mas não inibe, ou pelo menos não de forma substancial outras vias para a activação do complemento, incluindo a via do complemento clássica ou a via de lectina. Por exemplo, os novos anticorpos do factor 42/146 B e seus fragmentos de ligação dos antígene da presente invenção são um exemplo de um reagente que inibe de forma selectiva a via alternativa do complemento. Esta definição aplica-se a outros métodos aqui descritos, em que a via alternativa do complemento é inibida de forma selectiva. A inibição da via alternativa do complemento, de acordo com a presente invenção, pode ser conseguida através da afectação directa da expressão (transcrição ou translação) ou da actividade biológica de uma proteína na via alternativa do complemento, ou da afectação directa da capacidade de uma proteína se ligar a uma proteína na via alternativa do complemento ou de outra forma contribuir para a activação do complemento através da via alternativa. Mais especificamente, numa realização, a expressão de uma proteína refere-se tanto à transcrição da proteína, como à translação da proteína. Deste modo, a presente invenção pode inibir a transcrição e / ou a translação de uma proteína no animal que expressa naturalmente a proteína (por exemplo, através da administração de um agente que inibe a expressão da proteína e da alteração genética de um animal para ter uma expressão reduzida de proteínas). Numa outra realização, a inibição da via alternativa do complemento é aqui definida como qualquer redução mensurável (detectável) (isto é, diminuição, regulação por baixo, inibição) da actividade da via, tal como através de qualquer redução mensurável na expressão e / ou actividade biológica de uma proteína dentro da via alternativa do complemento.

De acordo com a presente invenção, "hipersensibilidade das vias aéreas" ou "AHR" refere-se a uma anormalidade das vias 43/146 aéreas que faz com que estas se contraiam com muita facilidade e / ou que tenham uma reação exagerada a um estimulo capaz de induzir limitação do fluxo do ar. A AHR pode ser uma alteração funcional do sistema respiratório como resultado de inflamação das vias aéreas (isto é, a AHR que está associada à inflamação) ou como resultado de remodelação das vias aéreas (por exemplo, tal como a deposição de colágeno) . A limitação do fluxo do ar refere-se à contração das vias aéreas que pode ser reversível ou irreversível. A limitação das vias aéreas ou hipersensibilidade das vias aéreas pode ser provocada por deposição de colágeno, broncoespasmo, hipertrofia muscular suave das vias aéreas, contração muscular suave das vias aéreas, secreção de muco, depósitos celulares, destruição epitelial, alteração da permeabilidade epitelial, alterações da função ou da sensibilidade muscular suave, anormalidades do parênquima pulmonar e doenças infiltrativas nas e à volta das vias aéreas. Muitos destes factores causadores podem estar associados a inflamação, apesar de a AHR ser um sintoma que pode ser diferenciado da inflamação (isto é, a AHR é uma condição ou sintoma especifico, tal como descrito anteriormente, que pode ser, mas nem sempre é, associada a uma inflamação anterior ou concomitante das vias aéreas) . A AHR pode ser despoletada num paciente com uma condição associada aos factores causadores referidos acima, através da exposição ao agente ou estimulo causador, também aqui referido como um estimulo causador de AHR. Esses estímulos incluem, mas não se limitam a, um alergéno, metacolina, uma histamina, um leucotrina, salina, hiperventilação, exercício físico, dióxido sulfúrico, adenosina, propranolol, ar frio, um antigene, bradicinina, uma prostaglandina, poluentes ambientais do ar e suas misturas. A presente invenção é direcionada para a hipersensibilidade das vias aéreas 44/146 associada a qualquer condição respiratória que envolva inflamação, e em particular, à hipersensibilidade das vias aéreas induzida por alergénos. A hipersensibilidade das vias aéreas é habitualmente associada à inflamação alérgica e / ou inflamação induzida por virus. A hipersensibilidade das vias aéreas associada à inflamação alérgica pode ocorrer num paciente que tem, ou está em risco de desenvolver, uma condição que inclui, mas não se limita a, qualquer doença obstrutiva crónica das vias aéreas. Essas condições incluem, mas não se limitam a: asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, aspergilose broncopulmonar alérgica, hipersensibilidade, pneumonia, pneumonia eosinofilica, enfisema, bronquite, bronquiectasia, fibrose cistica, tuberculose, pneumonite hipersensivel, asma ocupacional, sarcóide, sindroma de doenças reactiva das vias aéreas, doenças pulmonar intersticial, sindroma hiper-eosinofilico, sinusite, asma induzida por exercício fisico, asma induzida pela poluição e doença pulmonar parasitica. A hipersensibilidade das vias aéreas associada à inflamação induzida por virus pode ocorrer num paciente que tem, ou está em risco de desenvolver uma infeção por um virus incluindo, mas não se limitando a, virus sincicial respiratório (RSV), virus parainfluenza (PIV), rinovirus (RV) e adenovirus. Outras doenças ou condições para tratar usando métodos e agentes da presente invenção incluem qualquer condição pulmonar que envolva inflamação e / ou hipersensibilidade das vias aéreas provocada por uma doença, tal como uma doença auto-imune sistémica. Por exemplo, em lúpus eritematoso sistémico, as complicações pulmonares podem ser tratadas usando a presente invenção. 45/146 A inflamação é habitualmente caracterizada pela libertação de mediadores inflamatórios (por exemplo, citoquinas ou quimiocinas) que recrutam células envolvidas na inflamação de um tecido. A inflamação das vias aéreas é uma inflamação que ocorre nas vias aéreas (tecido pulmonar, células respiratórias e tecido respiratório) de uma animal. Uma condição ou doenças associadas a inflamação alérgica é uma condição ou doença em que a elicitação de um tipo de reação imune (por exemplo, uma reação imune do tipo Th2) contra um agente sensibilizante, tal como um alergéno, pode resultar na libertação de mediadores inflamatórios que recrutam células envolvidas na inflamação num animal, podendo a sua presença levar à danificação do tecido e por vezes à sua morte. Tal como discutido acima, a AHR é frequentemente associada à (ocorre juntamente com ou talvez como resultado de) inflamação das vias aéreas. Saliente-se que o sintoma ou a condição da AHR pode por vezes ser tratada independentemente do sintoma de inflamação e vice-versa (por exemplo, um tratamento da AHR pode ou não ter impacto na inflamação - estas são condições diferentes). A AHR pode ser medida por um teste de stress que compreende a medição da função do sistema respiratório de uma animal como reação a um agente causador (isto é, estimulo). A AHR pode ser medida como uma alteração na função respiratória da linha de referência registada contra a dose de um agente causador (descreve-se por isso um procedimento para essa medição e um modelo de mamifero útil, em pormenor a seguir nos Exemplos) . A função respiratória (e, por isso, as caracteristicas biológicas de AHR) pode ser medida através de, por exemplo, espirometria, pletismografia, picos de fluxo, valores de sintomas, sinais fisicos (isto é, taxa respiratória), pieira, tolerância ao exercício, uso de 46/146 medicação de emergência (isto é, broncodilatadores) , tosse e gases com sangue. Nos humanos, a espirometria pode ser usada para aferir a alteração na função respiratória juntamente com um agente causador, tal como metacolina ou histamina. Nos humanos, a espirometria é realizada pedindo a uma pessoa que respire profundamente e expire, durante tanto tempo e com tanta força e tão rápido quanto possível para um medidor que mede o fluxo de ar e o volume. 0 volume de ar expirado no primeiro segundo é conhecido como volume expiratório forçado (FEVi) e a quantidade total de ar expirado é conhecida como a capacidade vital forçada (FVC). Nos humanos, a FEVi prevista normal e a FVC estão disponíveis e estandardizadas de acordo com o peso, altura, sexo e raça. Um indivíduo sem doenças tem uma FEVi e uma FEV de pelo menos 80% dos valores previstos normais para uma determinada pessoa (isto é, representando um estado de repouso do paciente) e após (isto é, representando um estado de resistência dos pulmões maior) inalação do agente causador. A posição da curva resultante indica a sensibilidade das vias aéreas do agente causador. O efeito de doses ou concentrações crescentes do agente causador na função pulmonar é determinado pela medição do volume expirado forçado em 1 segundo (FEVI) e FEVI sobre a capacidade vital forçada (razão de FEVI / FVC) do animal desafiado com o agente causador. Nos humanos, a dose ou concentração de um agente causador (isto é, metacolina ou histamina) que provoca uma queda de 20% na FEVI (PC20FEV1) é indicador do grau de AHR. Os valores de FEVI e FVC podem ser medidos usando métodos conhecidos pelos peritos nesta arte. 47/146

As medições da função pulmonar da resistência (RL) das vias aéreas e da observância e hipersensibilidade dinâmica (CL) podem ser determinadas pela medição da pressão transpulmonar como a diferença de pressão entre a abertura das vias aéreas e a pletismografia corporal. 0 volume é a alteração da pressão calibrada na pletismografia corporal e o fluxo é a diferenciação digital do sinal do volume. A resistência (RL) e a observância (CL) são obtidas usando-se métodos conhecidos dos peritos nesta arte (por exemplo, tal como usando uma solução de quadrados minimos recursivos da equação do movimento). Deverá realçar-se que a medição da resistência do valor das vias aéreas (RL) num mamífero não humano (por exemplo, um rato) pode ser usada para diagnosticar a obstrução do fluxo aéreo semelhante à medição do FEV1 e / ou razão de FEV1 / FVC num humano.

Uma variedade de agentes causadores é útil para medir os valores de AHR. Os agentes causadores apropriados incluem estímulos directos e indirectos e são agentes causadores típicos que acionam a AHR in vivo. Tal como é usado aqui, a expressão "agente causador" pode ser usada de forma indistinta com a expressão "estímulo causador de AHR". Os agentes ou estímulos causadores preferidos incluem, por exemplo, um alergéno, metacolina, uma histamina, irritantes orgânicos, gases e químicos irritantes, uma leucotrina, salina, hiperventilação, exercício físico, dióxido sulfúrico, adenosina, propranolol, ar frio, um antigene, bradicinina, acetilcolina, uma prostaglandina, ozono, poluentes de ar ambiental e suas misturas. De preferência, para a indução experimental de AHR, usa-se a metacolina (Mch) como agente causador. As concentrações preferidas de Mch para usar numa curva de concentração - reação são entre cerca de 0,001 e cerca de 100 miligramas por milímetro (mg 48/146 / ml) . De maior preferência, as concentrações de Mch para usar numa curva de concentração - reação são de cerca de 0,01 e cerca de 50 mg / ml. Concentrações ainda de maior preferência de Mch para usar numa curva de concentração -reação são de cerca de 0,02 e cerca de 25 mg / ml. Quando se usa Mch como agente causador, o grau de AHR é definido pela concentração provocadora de Mch necessária para provocar uma queda de 2 0% de FEVi de um animal (PC20metacoiinaFEVi) . Por exemplo, nos humanos a usando protocolos padrão nesta arte, uma pessoa normal tem habitualmente um PC20metacoiinaFEVi > 8 mg / ml de Mch. Assim, nos humanos, a AHR é definida como PC20metacoiinaFEVi < 8 mg / ml de Mch.

De acordo com a presente invenção, a função respiratória pode também ser avaliada através de vários testes estáticos que compreendem a medição da função do sistema respiratório num animal na ausência de um agente causador. Exemplos de testes estáticos incluem, por exemplo, espirometria, pletismografia, picos de fluxo, valores de sintomas, sinais físicos (isto é, taxa respiratória), pieira, tolerância ao exercício, uso de medicação de emergência (isto é, broncodilatadores), tosse e gases com sangue. A avaliação da função pulmonar com testes estáticos pode ser realizada através da medição, por exemplo, de Capacidade Pulmonar Total (TLC), Volume de gás Toráxico (TgV), capacidade Residual Funcional (FRC), Volume Residual (RV) e Condutância Específica (SGL) para volumes pulmonares, incluindo pH, P02 e PC02 para o intercâmbio de gás. Tanto o FEVi como FEVi / FVC podem ser usados para medir a limitação do fluxo de ar. Se a espirometria for usada em humanos, o FEVi de um indivíduo pode ser comparado aos valores previstos de FEVi. Os valores de FEVI previstos 49/146 estão disponíveis para nomogramas padrão baseados na idade, no sexo, no peso, na altura e na raça do animal. Um animal normal tem habitualmente um FEVi de pelo menos cerca de 80% do FEVi previsto para o animal. A limitação do fluxo de ar resulta num FEVi ou FVC de menos de 80% dos valores previstos. Um método alternativo para medir a limitação do fluxo de ar baseia-se na razão de FEVI e FVC (FEVi / FVC) . Os indivíduos livres de doenças são definidos como tendo uma razão de FEVi / FVC de pelo menos cerca de 80%. A obstrução do fluxo de ar faz cair a razão de FEVi / FVC para menos de 80% dos valores previstos. Assim, um animal com limitação do fluxo de ar é definido por um FEVi / FVC com menos de cerca de 80%.

Tal como é usado aqui, reduzir a hipersensibilidade das vias aéreas refere-se a qualquer redução mensurável na hipersensibilidade das vias aéreas e / ou qualquer redução da ocorrência ou frequência com que a hipersensibilidade das vias aéreas ocorre num paciente. Uma redução da AHR pode ser medida usando qualquer uma das técnicas descritas acima ou qualquer outro método apropriado conhecido nesta arte. De preferência, a hipersensibilidade das vias aéreas, ou o seu potencial, é reduzido, de forma óptima, até ao ponto do animal já não sofrer desconforto e / ou a função alterada como resultado de ou associado à hipersensibilidade das vias aéreas. Prevenir a hipersensibilidade das vias aéreas refere-se a prevenir ou acabar com a indução da hipersensibilidade das vias aéreas antes de se detectarem ou medirem de forma substancial características biológicas de hipersensibilidade das vias aéreas, tal como discutidas aqui, num paciente. Logo que uma ou mais das caracterí sticas biológicas de hipersensibilidade das vias aéreas seja detectada ou medida 50/146 de forma substancial, considera-se que ocorreu o surgimento agudo de hipersensibilidade das vias aéreas.

Numa realização, a presente invenção diminui a sensibilidade de metacolina no animal. De preferência, a presente invenção resulta numa melhoria do valor de PC20metacoiinaFEVi num animal, de tal modo que o valor de PC20metacoiinaFEVi obtido antes do uso do presente método, quando o animal é provocado com uma primeira concentração de metacolina, é o mesmo que o valor de PC2ometacoiinaFEVi obtido depois do uso do presente método, quando o animal é provocado com o dobro da quantidade da primeira concentração de metacolina. De preferência, a presente invenção resulta numa melhoria do valor de PC2ometacoiinaFEVi de um animal, de tal modo que o valor de PC2ometacoiinaFEVi obtido antes do uso do presente método, quando o animal é provocado com entre cerca de 0,01 mg / ml e cerca de 8 mg / ml de metacolina, é o mesmo que o valor de PC2ometacoi±naFEVi obtido depois do uso do presente método, quando o animal é provocado com entre cerca de 0,02 mg / ml e cerca de 16 mg / ml de metacolina.

Numa outra realização, a presente invenção melhora o FEVi de um animal em pelo menos cerca de 5% e, de maior preferência entre cerca de 6% e cerca de 100%, de maior preferência, entre cerca de 7% e cerca de 100%, e ainda de maior preferência entre cerca de 8% e cerca de 100% do FEVi previsto do animal. Numa outra realização, a presente invenção melhora o FEVi de uma animal em pelo menos cerca de 5%, e de preferência, pelo menos cerca de 10% e de maior preferência ainda, pelo menos cerca de 25%, e de maior 51/146 preferência ainda pelo menos cerca de 50% e de maior preferência ainda pelo menos cerca de 75%.

Ainda numa outra realização, a presente invenção resulta num aumento no PC20metacoiinaFEVi de uma animal em cerca do dobro da concentração em relação ao PC20metacoiinaFEVi de um animal normal. Uma animal normal refere-se a um animal que se sabe sofrer de ou ser susceptivel a AHR anormal. Um paciente, ou animal de teste refere-se a um animal suspeito de sofrer de ou estar susceptivel a AHR anormal.

Assim, um animal que tem uma hipersensibilidade das vias aéreas é um animal no qual a hipersensibilidade das vias aéreas pode ser medida ou detectada, tal como usando um dos métodos anteriores para medir a hipersensibilidade das vias aéreas, em que a hipersensibilidade das vias aéreas é normalmente induzida pela exposição a um estimulo que provoca AHR, tal como descrito anteriormente. Do mesmo modo, um animal que tem hipersensibilidade das vias aéreas alergéno - induzida é um animal no qual a hipersensibilidade das vias aéreas pode ser medida ou detectada, tal como usando um dos métodos anteriores para medir a hipersensibilidade das vias aéreas, em que a hipersensibilidade das vias aéreas é induzida pela exposição a um alergéno. Para ser induzido por um estimulo que provoca uma AHR, tal como um alergéno, a hipersensibilidade das vias aéreas é acionada (por exemplo, provocada por, um sintoma de, indicativo de, concorrente com) , de forma aparente ou óbvia, directa ou indirectamente, por uma exposição ao estimulo. Os sintomas, ou caracteristicas biológicas da AHR incluem, mas não se limitam a, indicadores da função respiratória alterada 52/146 (descrito em pormenor anteriormente), mudança no ritmo respiratório, pieira, baixa tolerância ao exercício físico, tosse e gases ensanguentados alterados. A deteção ou medição de um ou mais desses sintomas é indicativo do surgimento de AHR aguda.

No caso de um alergéno, a hipersensibilidade das vias aéreas é acionada de forma aparente ou óbvia, directa ou indirectamente, por um alergéno para o qual o animal ficou anteriormente sensibilizado. A sensibilização a um alergéno refere-se a ter ficado exposto anteriormente uma ou mais vezes a um alergéno, de tal modo que se desenvolve uma reação imune contra o alergéno. As reações associadas a uma reação alérgica (por exemplo, libertação de histamina, rinite, edema, vasodilatação, constrição bronquial ou hipersensibilidade das vias aéreas, inflamação das vias aéreas), habitualmente não ocorrem quando um indivíduo simples fica exposto ao alergéno pela primeira vez, mas logo que é produzida uma reação imune celular e humoral contra o alergéno, o indivíduo fica "sensibilizado" ao alergéno. As reações alérgicas ocorrem então quando o indivíduo sensibilizado voltar a estar exposto ao mesmo alergéno (por exemplo, um desafio alergénico). Logo que o indivíduo fica sensibilizado a um alergéno, as reações alérgicas podem ficar piores a cada exposição subsequente ao alergéno porque cada re-exposição não só produz sintomas alérgicos como ainda aumenta o nível de anticorpos produzidos contra o alergéno e o nível de reação da célula T contra o alergéno.

Normalmente, as condições associadas às reações alérgicas aos antígenes (isto é, alergénos) são pelo menos em parte 53/146 caracterizadas por uma inflamação dos tecidos pulmonares. Essas condições ou doenças estão discutidas atrás. Note-se que esta realização da presente invenção é especificamente direcionada para o tratamento de AHR, e como tal, não necessita que a condição relacionada ou o factor causador que provocou a AHR, tal como inflamação alérgica, seja reduzida ou "curada" de forma significativa, apesar de os efeitos do presente método provavelmente se estenderem a inflamação alérgica. A presente invenção é totalmente eficaz na redução da AHR mesmo depois da reação inflamatória nos pulmões do animal se ter restabelecido totalmente. Um animal que está em risco de desenvolver hipersensibilidade das vias aéreas é um animal que esteve exposto, ou está em risco de ser exposto a um estimulo causador de AHR que é suficiente para acionar a AHR, mas que ainda não revela caracteristicas ou sintomas mensuráveis ou detectáveis de hipersensibilidade das vias aéreas, tendo esses sintomas sido descritos anteriormente. Um animal que está em risco de desenvolver hipersensibilidade das vias aéreas induzida por alergénos é um animal que foi anteriormente sensibilizado por um alergéno e que já esteve exposto a, ou está em risco de vir a estar exposto a uma quantidade do alergéno suficiente para acionar a AHR (isto é, uma dose de acionamento ou de desafio do alergéno), mas que ainda não revela caracteristicas ou sintomas mensuráveis ou detectáveis de hipersensibilidade das vias aéreas. Um animal que está em risco de desenvolver hipersensibilidade das vias aéreas também inclui um animal que é identificado como estando predisposto ou susceptível a essa condição ou doença. A presente invenção também pode inibir ou reduzir a inflamação das vias aéreas num animal. A inflamação e, em 54/146 particular a inflamação eosinofilica, é uma marca distintiva de muitas doenças respiratórias, incluindo a asma. A inflamação das vias aéreas pode ser avaliada usando vários parâmetros incluindo, mas não se limitando a, acumulação de células inflamatórias (por exemplo, eosinófilas, macrofagas, neutrófilas, linfócitos) nos pulmões, niveis alterados de várias citoquinas (por exemplo, IL - 4, IL - 5, IL - 10, IL - 12, IL - 13 e IFN -y) no fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) e / ou uma mudança na produção de muco nos pulmões. A medição de muitos destes parâmetros está exemplificada nos Exemplos.

Os agentes e fórmulas para uso na presente invenção podem ser administrados a qualquer paciente animal e, de preferência a humanos. De acordo com a presente invenção, a administração de um agente ou uma fórmula é útil na inibição de AHR, inflamação das vias aéreas, ou no tratamento de uma doença associada com essas condições. Os pacientes que são candidatos apropriados para a presente invenção incluem, mas não se limitam a, pacientes que têm, ou estão em risco de vir a desenvolver (por exemplo, estão predispostos a) essa condição ou doença. Tal como discutido atrás, a presente invenção é antes de mais direcionada para o tratamento de AHR e / ou inflamação das vias aéreas e, como tal, não é necessário que a condição ou o factor causador que provocou a AHR ou a inflamação das vias aéreas, ou doença associada com estas condições seja significativamente reduzida ou "curada", apesar de os efeitos do presente método provavelmente se estendam a um beneficio terapêutico significativo para o paciente. Este conceito também se aplica de um modo geral a outras condições e doenças nas quais a via alternativa do complemento tem um papel. 55/146

Como tal, um benefício terapêutico não é necessariamente uma cura para uma determinada doença ou condição (incluindo qualquer doença ou condição aqui descrita), mas antes, de preferência enqloba um resultado que mais comummente inclui o alívio da doença ou condição, a eliminação da doença ou condição, a redução de um sintoma associado à doença ou condição, a prevenção ou o alívio de uma doença ou condição secundária que resulta da ocorrência de uma doença ou condição primária e / ou a prevenção da doença ou condição. Tal como é usado aqui, a expressão "protegido de uma doença" refere-se à redução dos sintomas da doença; redução da ocorrência da doença e / ou redução da gravidade da doença. Proteger um paciente pode referir-se à capacidade de uma composição da presente invenção, quando administrada a um paciente, de prevenir uma doença de ocorrer e / ou de curar ou aliviar os sintomas, sinais ou causas da doença. Como tal, proteger um paciente de uma doença inclui tanto a prevenção da ocorrência da doença (tratamento profilático), como o tratamento de um paciente que tem a doença (tratamento terapêutico). Um efeito benéfico pode facilmente ser avaliado por um perito nesta arte e / ou por um clínico treinado que está a treinar o paciente. 0 termo "doença" refere-se a qualquer desvio da saúde normal de um mamífero e inclui um estado quando os sintomas de doenças estão presentes, assim como condições nas quais um desvio (por exemplo, infeção, mutação do gene, defeito genético, etc.) ocorreu, mas os sintomas ainda não se manifestaram.

Assim, descreve-se aqui o uso de uma variedade de agentes (isto é, compostos reguladores) que, ao agir directamente numa proteína na via alternativa do complemento, inibe de forma selectiva a expressão e / ou a actividade biológica de uma ou mais proteínas na via alternativa do complemento, 56/146 de tal modo que a hipersensibilidade das vias aéreas e / ou a inflamação das vias aéreas é reduzida num animal. Os agentes úteis na presente invenção incluem, por exemplo, proteínas, moléculas do ácido nucleico, anticorpos e compostos que são produtos de concepção de medicamento racional (isto é, medicamentos). Esses agentes são geralmente aqui referidos como inibidores. De acordo com a presente invenção, um inibidor é qualquer agente que inibe, quer através da inibição directa ou da inibição competitiva, a expressão e / ou a actividade biológica de uma proteina (por exemplo, uma proteína na via alternativa de complemento), e inclui agentes que actuam no factor B, factor D ou properdina. Numa realização da presente invenção, a inibição da via alternativa do complemento ou uma proteína da via alternativa do complemento é aqui definida como qualquer redução mensurável (detectável) (isto é, diminuição, regulação por baixo, inibição) da actividade biológica de uma proteína na via alternativa do complemento. A actividade biológica ou a ação biológica de uma proteína refere-se a qualquer função manifestada ou realizada por uma forma da proteína, que ocorre naturalmente, tal como medido ou observado in vivo (isto é, no ambiente fisiológico natural da proteína) ou in vitro (isto é, em condições laboratoriais). Por exemplo, uma actividade biológica do factor B pode incluir, mas não se limita a, ligação ao C3 activado, solubilização de complexos de imunidade, actividade do factor do crescimento da célula B, e activação de monócitos. De acordo com a presente invenção, a actividade biológica de uma proteína pode ser inibida através de prevenção ou inibição directa (redução, diminuição) da capacidade da proteína se ligar a e / ou activar outra proteína (por exemplo, C3), inibindo dessa forma a corrente de acontecimentos que resulta dessa inibição. De preferência, a actividade biológica da via 57/146 alternativa do complemento é inibida através da administração de um agente que inibe pelo menos uma proteína na via, incluindo esse agente, mas não se limitando a, um agente que se liga a uma proteína na via ou que compete com a proteína na via, de tal modo que a capacidade da proteína se ligar a e / ou activar outra proteína fica inibida ou impedida. Esse agente inclui, mas não se limita a antagonistas da proteína, anticorpos (incluindo seus fragmentos de ligação de antígene), outros poliptídeos e pequenas moléculas (por exemplo, compostos sintéticos ou medicamentos).

Um agente útil na presente invenção é um antagonista da via alternativa complementar, incluindo um antagonista de uma proteína dentro da via. De acordo com a presente invenção, um "antagonista" refere-se a qualquer composto que iniba (por exemplo, que antagonize, reduza, diminua, bloqueie, reverta ou altere) o efeito de uma dada proteína. Mais particularmente, um antagonista é capaz de actuar de uma forma relativa à actividade da dada proteína, de tal modo que a actividade biológica da dada proteína diminui ou é bloqueada de uma forma que é antagonista (por exemplo, contra reversão de, contrário a) da ação natural de uma dada proteína. Os antagonista incluem, mas não se limitam a, um anticorpo ou seu fragmento de ligação do antígene, uma proteína, um peptídeo, ácido nucleico (incluindo ribossomas e antisense), ou um produto de projecto de medicamento / composto / peptídeo ou a seleção que fornece o efeito antagonista. Por exemplo, descreve-se aqui antagonistas das proteínas naturais, do factor B, factor D ou properdina, incluindo antagonistas de anticorpos, antagonistas de proteínas / peptídeos, antagonistas do 58/146 ácido nucleico, ou antagonistas de pequenas moléculas (por exemplo, um inibidor de pequena molécula). 0 agente usado para a inibição de uma proteína da via alternativa do complemento é um anticorpo ou um fragmento de ligação do antigene. Num aspecto, o anticorpo liga-se de forma selectiva à proteína da via alternativa do complemento de tal maneira que a proteína fica inibida ou impedida de se ligar a outra proteína com a qual interage habitualmente (em condições naturais ou fisiológicas). Num outro aspecto, o anticorpo liga-se de forma selectiva à proteína de tal maneira que a proteína fica inibida ou impedida de activar outra proteína com a qual interage habitualmente, apesar de a proteína poder estar pelo menos em parte ligada a outra proteína. Os anticorpos e seus fragmentos de ligação de antigene para uso na inibição selectiva da via alternativa do complemento já foram descritos em pormenor atrás (os anticorpos do factor B aqui descritos e, em particular, o anticorpo mAb 1379 aqui descrito em pormenor).

De preferência, um anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigene útil na presente invenção liga-se ao factor B. Os anticorpos (e seus fragmentos de ligação do antigene) que se ligam de forma selectiva ao factor B e inibem a via alternativa do complemento, de acordo com a invenção, são descritos e exemplificados aqui em pormenor. Numa realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigene liga-se, assim, a uma superfície conservadora de ligação ou epítope de uma proteína que é conservada entre a espécie animal e, em particular os mamíferos (isto é, o anticorpo é de reactividade cruzada com a proteína de duas 59/146 ou mais espécies diferentes de mamíferos). Em particular, a presente invenção inclui um anticorpo que se liga a uma proteína na via alternativa do complemento de pelo menos duas e, de preferência, várias espécies diferentes de mamíferos, incluindo, mas não se limitando a, humanos, primatas não humanos, ratos, ratazanas, porcos, cavalos e coelhos.

Descreve-se aqui polipeptídeos não - anticorpos, por vezes referidos como parceiros de ligação de antígene ou polipeptídeos de ligação de antígene que foram concebidos para se ligarem de forma selectiva a, e provocarem, a neutralização ou inibição de uma proteína de acordo com a presente invenção. Exemplos do conceito desses polipeptídeos que possuem uma especificidade de ligante prescrita são dados em Beste et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 96 : 1898 - 1903, 1999).

Descreve-se aqui, para além de anticorpos, seus fragmentos de ligação de antígene, e poliptídeos de ligação de antígene, outros agentes que inibem uma proteína na via alternativa do complemento. Esses agentes incluem, por exemplo, compostos que são produtos de concepção de medicamento racional, produtos naturais, e compostos com propriedades reguladoras parcialmente definidas. Um agente regulador, incluindo um antagonista de uma dada proteína pode ser um composto à base de proteínas, um composto à base de carbohidratos, um composto à base de lípidos, um composto à base de ácido nucleico, um composto orgânico natural, um composto orgânico derivado sinteticamente, um anticorpo ou seus fragmentos. 60/146

Esses agentes reguladores incluem medicamentos, incluindo peptideos, oligonucleótidos, carbohidratos e / ou moléculas orgânicas sintéticas que regulam a produção e / ou função de uma ou mais proteínas na via alternativa do complemento. Um agente desses pode ser obtido, por exemplo, a partir de estratégias de diversidade molecular (uma combinação de estratégias relacionadas que permitem a rápida construção de grandes bibliotecas de moléculas diversas quimicamente), bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais, em particular a partir de bibliotecas químicas ou combinatórias (isto é, bibliotecas de compostos que diferem em sequência ou tamanho mas que têm os mesmos blocos de construção) ou concepção de medicamento racional. Ver por exemplo, Maulik et al., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley - Liss, Inc.

Numa estratégia de diversidade molecular, são sintetizadas grandes bibliotecas de compostos, por exemplo, a partir de peptideos, oligonucleotídeos, carbohidratos e / ou moléculas orgânicas sintéticas, usando abordagens biológicas, enzimáticas e / ou químicas. Os parâmetros críticos no desenvolvimento de uma estratégia de diversidade molecular incluem a diversidade de subunidades, o tamanho molecular e a diversidade de bibliotecas. 0 objectivo geral de rastrear essas bibliotecas é o de utilizar a aplicação sequencial de seleção combinatória para obter ligantes de alta afinidade contra um alvo desejado e depois optimizar as moléculas líderes, quer através de estratégias de concepção direcionada, ou aleatória. Os métodos de diversidade molecular são descritos em pormenor em Maulik, et al., supra. 61/146

Num procedimento de projecto de medicamento racional, a estrutura tridimensional de um composto regulador pode ser analisado, por exemplo, através de ressonância magnética nuclear (NMR) ou cristalografia de raio-X. Esta estrutura tridimensional pode então ser usada para prever estruturas de potenciais compostos, tais como potenciais agentes reguladores através de, por exemplo, modelação de computador. A estrutura de composto prevista pode ser usada para optimizar os derivados de compostos lideres, por exemplo, através de métodos de diversidade molecular. Além disso, a estrutura de compostos previstos pode ser produzida através por exemplo de sintese quimica, tecnologia recombinante de ADN, ou através do isolamento de um mimotopo a partir de uma fonte natural (por exemplo, plantas, animais, bactérias e fungos). Vários outros métodos de conceitos de medicamentos à base de estruturas são apresentados em Maulik et al., 1997, supra. Maulik et al., apresenta, por exemplo, métodos de concepção direcionados, nos quais o utilizador direciona o processo de criação de novas moléculas a partir de uma biblioteca de fragmentos de fragmentos selecionados apropriadamente; concepção aleatória, na qual o utilizador usa um algoritmo genético, ou outro, para modificar fragmentos e as suas combinações aleatoriamente, enquanto em simultâneo aplica critérios de seleção para avaliar a aptidão de ligantes candidatos; uma abordagem à base de grelhas, na qual o utilizador calcula a energia de interação entre estruturas receptoras tridimensionais e pequenas sondas de fragmentos, seguido pela ligação de sítios de sondas favoráveis. 62/146

Uma molécula de ácido nucleico que é útil como um agente para a inibição de uma proteína na via alternativa do complemento é uma molécula de ácido nucleico antisense, um ribossoma ou siARN. Tal como é usado aqui, uma molécula de ácido nucleico antisense é definida como uma molécula de ácido nucleico isolada que reduz a expressão de uma proteína através da hibridação sob condições altamente rigorosas de um gene que codifica a proteína. Essa molécula de ácido nucleico é suficientemente semelhante ao gene que codifica a proteína para a molécula ser capaz de hibridizar sob condições altamente rigorosas para a codificação ou para o ramo de complemento do gene ou ARN que codifica a proteína natural. A interferência de ARN (ARNi) é um processo através do qual o ARN de dupla ramificação e, nos sistemas de mamíferos, ARN de curta interferência (siARN), é usado para inibir ou silenciar a expressão dos genes do complemento. Na célula alvo, os siARN são desenrolados e associados ao complexo de silenciamento induzido do ARN (RISC) , que é depois guiado para as sequências de mARN que são complementares ao siARN, em que o RISC segmenta o mARN. Um ribossoma é um fragmento de ARN que funciona através da ligação ao meio do ARN alvo e o inactiva através da segmentação do suporte principal do fosfodiéster num sítio específico de corte.

Um gene inclui regiões reguladoras que controlam a produção da proteína codificada por esse gene (tal como, mas não se limitando a, regiões de controlo de transcrição, translação ou pós - translação), assim como a própria região de codificação. Os genes que codificam as várias proteínas da via alternativa do complemento, incluindo o factor B, factor D ou properdina, foram identificados e são conhecidos nesta arte. Uma molécula de ácido nucleico 63/146 isolada é uma molécula de ácido nucleico que foi retirada do seu meio natural (isto é, que foi sujeita a manipulação humana) e pode incluir ADN, ARN, ou derivados tanto de ADN como de ARN. Assim, "isolado" não reflecte a dimensão a que a molécula de ácido nucleico foi purificada. Uma molécula de ácido nucleico isolada da presente invenção pode ser isolada da sua fonte natural ou produzida usando tecnologia de ADN recombinante (por exemplo, amplificação da reação da cadeia de polimerase (PCR), clonagem), ou sintese quimica.

Tal como é usado aqui, a referência a condições de hibridação refere-se a condições de hibridação padrão sob as quais as moléculas de ácido nucleico são usadas para identificar moléculas de ácido nucleico semelhantes. Essas condições padrão são apresentadas, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989 (ver especificamente páginas 9.31 -9.62). Além disso, as fórmulas para calcular a hibridação e as condições apropriadas para se conseguir uma hibridação que permita vários graus de incompatibilidade dos nucleótideos são apresentadas, por exemplo, em Meinkoth et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 267 - 284; Ischemia-Reperfusion Injury.

Ainda uma outra realização da presente invenção refere-se à descoberta dos inventores de que a inibição do factor B, por exemplo, usando anticorpos anti-factor B ou seus fragmentos de ligação de antigene aqui descritos, também inibe a lesão de isquémia e reperfusão. Isto foi demonstrado num modelo para a lesão de isquémia e reperfusão renal. Por isso, as composições da presente invenção também têm utilidade terapêutica em condições 64/146 relacionadas com a lesão de isquémia e reperfusão, e num aspecto da invenção, a lesão de isquémia e reperfusão renal. Outros tipos de lesão de isquémia e reperfusão que podem ser prevenidos ou reduzidos incluem, mas não se limitam a, lesão de isquémia e reperfusão, lesão de isquémia e reperfusão cardiaca, lesão de isquémia e reperfusão do sistema nervoso central, lesão de isquémia e reperfusão dos limbos ou digitos, lesão de isquémia e reperfusão dos órgãos internos, tais como o pulmão, figado ou intestino, ou lesão de isquémia e reperfusão de qualquer órgão ou tecido transplantado.

Descreve-se aqui um passo para a inibição selectiva da via alternativa do complemento num animal que tem, ou está em risco de passar por ou vir a desenvolver, isquémia e reperfusão. De preferência, pelo menos um sintoma ou tipo de lesão devida a isquémia e reperfusão é prevenida ou inibida. A lesão de isquémia e reperfusão pode provocar aumentos na produção de, ou oxidação de vários compostos potencialmente prejudiciais produzidos pelas células e pelos tecidos que podem levar a danos oxidativos ou à morte de células e tecidos. Por exemplo, a lesão de isquémia e reperfusão renal pode resultar em danos histológicos nos rins, incluindo dano tubular do rim e alterações caracteristicas da necrose tubular aguda. A disfunção renal resultante permite a acumulação de resíduos nitrogenados habitualmente excretados pelo rim, tais como nitrogénio de soro de ureia (SUN) . A isquémia e reperfusão pode também provocar lesão em órgãos remotos, tais como o pulmão. 0 método utiliza de preferência os novos anticorpos do factor B da presente invenção tal como descrito em pormenor anteriormente que, quando administrados a um animal que tem, ou está em risco de vir a desenvolver ou passar por, 65/146 isquémia - reperfusão, previne, reduz, ou inibe pelo menos um sintoma da lesão devido à isquémia - reperfusão. Qualquer um dos anticorpos do factor B da presente invenção tal como aqui descritos, ou seus fragmentos de ligação de antigene, é útil nesta realização da invenção. Uma descrição das doses, vias de administração preferidas e composições e fórmulas que compreendem esses anticorpos e reagentes relacionados é aqui fornecida e está englobada nesta realização.

Deverá realçar-se que esta realização da presente invenção é especificamente direcionada para o tratamento da lesão de isquémia e reperfusão, e como tal não é necessário que a condição relacionada ou o factor causador que provoca a lesão de isquémia e reperfusão seja significativamente reduzida ou "curada". A presente invenção é totalmente eficaz na prevenção ou redução de dano ou lesão associada à isquémia e reperfusão ou na melhoria ou redução de pelo menos um sintoma dessa lesão. Assim, a administração de um agente ou fórmula aqui descrita é útil na prevenção ou inibição da lesão de isquémia e reperfusão, apesar de não ser necessário que a totalidade dessa lesão seja completamente evitada, mas é preferível que o paciente experimente pelo menos um benefício do uso do agente ou da fórmula.

Descreve-se aqui uma fórmula ou composição que compreende um inibidor da via alternativa do complemento e, em particular, um inibidor selectivo da via alternativa do complemento, tal como aqui descrito. As fórmulas ou composições podem ser usadas em qualquer um dos métodos aqui descritos e com qualquer um dos reagentes aqui 66/146 descritos (por exemplo, os novos anticorpos do factor B aqui descritos). Numa realização, a composição é útil para reduzir ou prevenir a hipersensibilidade das vias aéreas num animal. Numa outra realização, a composição é útil para reduzir a lesão de isquémia e reperfusão num animal. Ainda numa outra realização, a composição é útil para tratar ou prevenir uma condição ou doença através da inibição selectiva da via alternativa do complemento. A fórmula compreende: (a) um inibidor da via alternativa do complemento tal como descrito aqui; e (b) um transmissor farmacologicamente aceite.

Numa realização, a fórmula ou composição pode incluir um ou mais agentes adicionais, tais como um agente anti-inflamatório apropriado para reduzir a inflamação num animal que tem, ou está em risco de vir a desenvolver hipersensibilidade das vias aéreas e, em particular, hipersensibilidade das vias aéreas associada a inflamação. 0 agente anti-inflamatório pode ser qualquer agente inflamatório apropriado para uso na redução da inflamação num paciente que tem uma condição inflamatória associada a hipersensibilidade das vias aéreas, incluindo, mas não se limitando a: corticosteróides (oral, inalação e injeção), β-antagonistas (de ação curta ou prolongada), modificadores de leucotrina (inibidores ou receptores antagonistas), citoquina ou antagonistas receptores de citoquina, inibidores de fosfodiesterase anti-IgE, cromoglicato de sódio, nedocrimal, teofilina, e inibidores da função da célula T. Os agentes anti-inflamatórios particularmente preferidos para uso na presente fórmula incluem corticosteróides, modificadores de leucotrina, e citoquina ou antagonistas receptores de citoquina. 67/146

Numa outra realização, a fórmula ou composição pode incluir um ou mais agentes adicionais, tais como um agente adicional apropriado para a prevenção ou redução da lesão de isquémia e reperfusão num animal. Esses agentes incluem, mas não se limitam a, agentes anti-inflamatórios; ou inibidores de oxidação e dano radical livre.

Numa outra realização, a fórmula ou composição pode incluir um ou mais agentes adicionais, tais como um agente adicional apropriado para o tratamento de outra doença ou condição associada com a activação da via alternativa do complemento.

De acordo com apresente invenção, um "transmissor farmacologicamente aceite" inclui excipientes farmacologicamente aceites e / ou veículos de libertação farmacologicamente aceites que são apropriados para uso na administração de uma fórmula ou composição a um sítio in vivo apropriado. Um sítio in vivo apropriado é de preferência qualquer sítio em que a via alternativa do complemento pode ser inibida. Numa realização preferida, quando o paciente tem ou está em risco de vir a ter hipersensibilidade das vias aéreas e / ou inflamação das vias aéreas, um sítio in vivo apropriado é de preferência no tecido pulmonar ou nas vias aéreas pulmonares. Outro sítio in vivo preferido é em qualquer sítio onde a lesão de isquémia e reperfusão ocorra, tal como no sistema do coração ou pulmonar, sistema nervoso central, membros ou dígitos, órgãos internos (por exemplo, pulmão, fígado ou intestino), ou em qualquer órgão ou tecido transplantado. Os transmissores farmacologicamente aceites são capazes de manter um agente usado numa fórmula da invenção numa forma 68/146 que, à chegada do agente no sítio alvo num paciente, a agente seja capaz de actuar no seu alvo (por exemplo, uma proteína que é um componente da via alternativa do componente) , de preferência resultando num benefício terapêutico para o paciente.

Os excipientes apropriados da presente invenção incluem excipientes ou fórmulas que transportem ou ajudem a transportar, mas que não têm especificamente como alvo uma composição de uma célula ou um tecido (também referido aqui como transmissores sem alvo). Exemplos de excipientes farmacologicamente aceites incluem, mas não se limitam a água, salina reforçada com fosfato, solução de Ringer, solução de dextrose, soluções que contenham soro, solução de Hank, outras soluções aquosas equilibradas fisiologicamente, óleos, ésteres e glicóis. As substâncias auxiliares apropriadas incluem, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, lactate de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e outras substâncias usadas para produzir reforço de fosfato, reforço Tris e reforço de bicarbonato. As substâncias auxiliares podem igualmente incluir conservantes, tais como timerosal, m- ou o-cresol, formalina e álcool benzol. As fórmulas da presente invenção podem ser esterilizadas através de métodos convencionais e / ou liofilizadas.

Um tipo de transmissor farmacologicamente aceite inclui uma fórmula de libertação controlada que é capaz de libertar lentamente uma composição da presente invenção num animal. Tal como é usada aqui, uma fórmula de libertação controlada compreende um agente da presente invenção num veículo de libertação controlada. Os veículos de libertação adequada 69/146 apropriados incluem, mas não se limitam a, polimeros biocompativeis, outras matrizes de polimeros, cápsulas, microcápsulas, preparações de pilulas, bombas osmóticas, dispositivos de difusão, lipossomas, lipoesferas e sistema de libertação transdérmica. Outros transmissores apropriados incluem qualquer transmissor que possa ser ligado a, ou incorporado com o agente que prolonga a meia vida do agente a ser administrado. Esse transmissor pode incluir qualquer transmissor de proteína apropriado ou até um segmento de fusão que prolonga a meia vida de uma proteína quando administrado in vivo. Os veículos de libertação apropriados já foram aqui previamente descritos e incluem, mas não se limitam a lipossomas, vectores virais ou outros veículos de libertação, incluindo ribossomas. Os veículos naturais de libertação que contêm lípidos incluem células e membranas celulares. Os veículos artificiais de libertação que contêm lípidos incluem lipossomas e micelas. Tal como discutido anteriormente, um veículo de libertação da presente invenção pode ser modificado para ter como alvo um determinado sítio num paciente, podendo assim ter como alvo e usar um agente inibidor nesse sítio. As modificações apropriadas incluem a manipulação das fórmulas químicas da porção de lípidos do veículo de libertação e / ou a introdução no veículo e um agente alvo capaz de ter como alvo especificamente um veículo de libertação num sítio preferido, por exemplo, um tipo preferido de célula. Outros veículos de libertação apropriados incluem partículas de ouro, conjugados moleculares de poli-L-lisina /ADN e cromossomas artificiais.

Numa realização, um agente útil nos presentes métodos é administrado numa fórmula apropriada para a libertação pulmonar ou nasal e, em particular, libertação por 70/146 aerossol, também referido aqui como fórmula aerossolizada. Essa via de administração num paciente é particularmente útil no método de prevenção ou inibição de AHR e / ou inflamação das vias aéreas num paciente, mas pode ser usado em outras condições quando se deseja administração nos pulmões ou nas vias aéreas. Além disso, estas fórmulas são particularmente úteis para a administração de anticorpos. Esse tipo de fórmula costuma incluir um transmissor e, de preferência, um transmissor farmacologicamente aceite. Os transmissores que são particularmente úteis para a administração por aerossol, de acordo com a presente invenção incluem, mas não se limitam a: etanol anidroso; pós secos e dispersiveis; pequenas cápsulas (por exemplo, microcápsulas ou micropartículas); lipossomas; excipientes injectáveis; e pulverizadores nebulizados. 0 etanol anidroso para a administração de proteínas e peptídeos é descrito, por exemplo em Choi et al., 2001, PNAS EUA 98 (20) : 11103 - 11107. Os pós secos e dispersiveis apropriados para a administração por aerossol de agentes são descritos em pormenor, por exemplo na Patente Norte-americana Nr. 6 165 463 (Ver também produtos de Inhale Therapeutic Systems, Inc., new Nektar, and Quadrant Technology). Os lipossomas apropriados para uso em aerossóis incluem qualquer lipossoma e, em particular, qualquer lipossoma suficientemente pequeno para ser administrado com aerossóis no método da invenção. As microcápsulas e micropartículas são conhecidas na arte. Por exemplo, a Alliance Pharmaceutical Corporation tem uma tecnologia de engenharia de partículas chamada PulmoSphere, preparada por um processo de secagem por pulverização patenteado e concebida para serem ocas e porosas. Um produto da Ventolin consiste em partículas de albuterol micronizado (base livre) suspensas numa mistura de propelantes à base de CFC. A Proventil HFA contém sulfato 71/146 de albuterol micronizado e uma pequena percentagem de um co-solvente de etanol para solubilizar o surfactante ácido oleico estabilizante. A incorporação de medicamentos em lipossomas tem várias vantagens na administração do aerossol. Como os lipossomas são relativamente insolúveis, o tempo de retenção de alguns medicamentos no pulmão pode ser prolongado para uma melhor eficácia. Os lipossomas também são absorvidos primeiramente pelas células fagócitas que os tornam particularmente apropriados para a administração de determinados medicamentos. As fórmulas nebulizadas estão descritas nos Exemplos. Os dispositivos apropriados para as fórmulas de aerossóis incluem, mas não se limitam a, inaladores de doses de medida pressurizados (MDI), inaladores de pós secos (DPI), dispositivos de solução de medida (MSI), e inaladores ultrasónicos, e incluem dispositivos que são nebulizadores e inaladores. Podem usar-se vários inaladores em fórmulas administradas por esses dispositivos como auxiliares de suspensão e solubilizadores que são particularmente úteis para a administração de proteínas (por exemplo, ácido oligoláctico, ácidos acil-amido, e M-PEGS mono-funcionalizados; ver, McKenzie and Oliver; 2000; Formulating Therapeutic Proteins and Peptides in Pressurized Metered Dose Inhalers For Pulmonary Delivery; 3M Health Care Ldt., Morley Street, Loughborough, Leicesteshire LE 11 1EP, Reino Unido).

Um transmissor farmacologicamente aceite capaz de ter um alvo é aqui referido como um "veículo de administração com alvo". Os veículos de libertação com um alvo da presente invenção são capazes de administrar uma fórmula, incluindo um agente inibidor, num sítio alvo num paciente. Um "sítio alvo" refere-se a um sítio num paciente ao qual se deseja 72/146 administrar uma fórmula terapêutica. Por exemplo, um sitio alvo pode ser qualquer célula ou tecido que é tomado como alvo por um anticorpo da presente invenção, ou através de injeção directa ou administração usando lipossomas, vectores virais ou outros veiculos de libertação, incluindo ribossomas. Um veiculo de administração ou anticorpo da presente invenção pode ser modificado para ter como alvo um sitio num determinado animal, tendo assim um alvo e fazendo uso de um determinado composto, anticorpo, proteína ou molécula de ácido nucleico nesse sítio. As modificações apropriadas incluem a manipulação das fórmulas químicas da porção de lípidos de um veículo de administração e / ou a introdução no veículo de um composto capaz de ter especificamente como alvo um veículo de administração a um sítio preferido, por exemplo, uma célula preferido ou um tipo de tecido. Especificamente, ter como alvo refere-se a fazer com que um veículo de administração se ligue a uma determinada célula através da interação do composto no veículo com uma molécula na superfície da célula. Os compostos apropriados que tomam alvos incluem ligantes capazes de ligarem de forma selectiva (isto é, especificamente) outra molécula a um determinado sítio. Exemplos desses ligantes incluem anticorpos, antígene, receptores e ligantes receptores. Exemplos particularmente úteis incluem quaisquer ligantes que estejam associados à via do complemento (por exemplo, CR2, C3, C3d, C3dg, iC3b, C3b) ou quaisquer ligantes associados com o tipo de célula, tipo de tecido ou o sítio no animal a ser tratado. A manipulação das fórmulas químicas da porção de lípidos do veículo de administração pode modular o alvo extracelular ou intracelular do veículo de administração. Por exemplo, um químico pode ser acrescentado às fórmulas de lípidos de um lipossoma que altera a carga da bicamada dos lípidos dos lipossomas, de modo a que o lipossoma se possa fundir com 73/146 determinadas células com determinadas caracteristicas de carga.

Um veiculo de administração útil para uma variedade de vias e agentes de administração é um lipossoma. Um lipossoma é capaz de permanecer estável num animal durante um período de tempo suficiente para se administrar uma molécula de ácido nucleico, ou até mesmo uma proteína ou um anticorpo, descritos na presente invenção, num sítio preferido no animal. Um lipossoma, de acordo com a presente invenção, compreende uma composição de lípidos que é capaz de administrar uma molécula de ácido nucleico descrita na presente invenção num sítio determinado, ou selecionado num animal. Um lipossoma de acordo com a presente invenção compreende uma composição de lípidos que é capaz de se fundir com a membrana da célula alvo para administrar uma molécula de ácido nucleico numa célula. Os lipossomas apropriados da presente invenção incluem os lipossomas usados habitualmente, por exemplo, em métodos de administração do gene conhecidos dos peritos nesta arte. Mais lipossomas preferidos compreendem lipossomas com uma composição policatiónica e / ou lipossomas com um suporte principal de colesterol conjugado com glicol de polietileno. Consegue-se complexar um lipossoma com uma molécula de ácido nucleico ou um agente inibidor da presente invenção usando métodos padrão nesta arte.

Outro veículo de administração útil compreende um vector virai. Um vector virai inclui uma molécula de ácido nucleico isolada, útil no método da presente invenção, no qual as moléculas do ácido nucleico são amontoadas num revestimento virai que permite a entrada de ADN numa 74/146 célula. Pode usar-se vários vectores virais, incluindo, mas não se limitando àqueles à base de alfavírus, poxvirus, adenovírus, vírus do herpes, lentivirus, vírus adeno associados e retrovírus.

De acordo com a presente invenção, a determinação de protocolos aceites para a administração de um agente, uma composição ou fórmula, incluindo a via de administração e a quantidade eficaz de uma agente a ser administrado a um animal, pode ser conseguida pelos peritos nesta arte. Um agente da presente invenção pode ser administrado in vivo ou ex vivo. As vias in vivo apropriadas podem incluir, mas não se limitam a, vias orais, nasais, de inalação, tópicas, intratraqueais, transdérmicas, rectais e parenterais. As vias parenterais preferidas podem incluir, mas não se limitam a, vias subcutâneas, intradérmicas, intravenosas, intramusculares e intraperitoneais. As vias tópicas preferidas incluem a inalação por aerossol (isto é, pulverização) ou administração de superfície tópica na pele de um animal. De preferência, um agente é administrado por vias nasais, de inalação, intratraqueais, tópicas ou sistémicas (por exemplo, intraperitoneal, intravenosa). Ex vivo refere-se à realização de parte do passo de administração fora do paciente. As vias preferidas de administração para anticorpos incluem vias parenterais e vias de aerossóis / nasais / de inalação.

As administrações intravenosas, intraperitoneais e intramusculares podem ser realizadas usando métodos padrão nesta arte. A administração (inalação) por aerossol pode ser realizada usando métodos padrão na arte (ver, por exemplo, Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 189 : 75/146 11277 - 11281, 1992). Os transmissores apropriados para a administração por aerossol estão descritos atrás. Os dispositivos para a administração de fórmulas com aerossóis incluem, mas não se limitam a, inaladores com doses de medida pressurizados (MDI), inaladores de pó seco (DPI), e dispositivos de solução de medida (MSI), e incluem dispositivos que são nebulizadores e inaladores. A administração oral pode ser realizada através da complexação de uma composição terapêutica da presente invenção para um transmissor capaz de suportar a degradação das enzimas digestivas no estômago do animal. Exemplos desses transmissores incluem cápsulas de plástico ou comprimidos, tais como os conhecidos na arte. As técnicas de injeção directa são particularmente úteis na administração de uma molécula de ácido nucleico recombinante numa célula ou num tecido que é acessível através de cirurgia e, em particular, na ou perto da superfície do corpo. A administração de uma composição localmente dentro da área de uma célula alvo refere-se à injeção da composição a centímetros e, de preferência milímetros da célula ou do tecido alvo. Vários métodos de administração e de veículos de libertação aqui apresentados mostraram ser eficazes para a libertação de uma molécula do ácido nucleico numa célula ou num tecido alvo, em que a molécula de ácido nucleico transfectou a célula e foi expressa. Em muitos estudos, a libertação e a expressão bem sucedidas de um gene heterólogo foi conseguida em tipos de células preferidas e / ou usando veículos de libertação preferidos e vias de administração da presente invenção. Por exemplo, usando a libertação do lipossoma, a patente norte-americana nr. 5 705 151, publicada a 6 de Janeiro de 1998, de Dow et al., demonstrou 76/146 a libertação intravenosa in vivo bem sucedida de uma molécula de ácido nucleico codificando um superantigeno e uma molécula de ácido nucleico codificando uma citoquina num veiculo de libertação de um lipossoma catiónico, em que as proteínas codificadas foram expressas em tecidos do animal e, em particular em tecidos pulmonares. Liu et al., 1997 demonstrou que a libertação intravenosa de lipossomas catiónicos contendo colesterol que continham genes preferencialmente tem como alvo, tecidos pulmonares e serve de mediador eficaz da transferência e expressão dos genes in vivo. A libertação de várias sequências de ácido nucleico já foi conseguida através da administração de vectores virais que codificam as sequências de ácido nucleico.

Uma dose simples preferida de um agente, incluindo proteínas, pequenas moléculas e anticorpos, para uso em qualquer método aqui descrito, compreende entre cerca de 0,01 micrograma x quilograma-1 e cerca de 10 micrograma x quilograma-1 do peso corporal de um animal. Uma dose simples mais preferida de um agente compreende entre cerca de 1 micrograma x quilograma-1 e cerca de 10 micrograma x quilograma-1 do peso corporal de um animal. Uma dose simples ainda mais preferida de um agente compreende entre cerca de 5 micrograma x quilograma-1 e cerca de 7 micrograma x quilograma-1 do peso corporal de um animal. Uma dose simples ainda mais preferida de um agente compreende entre cerca de 10 micrograma x quilograma-1 e cerca de 5 micrograma x quilograma-1 do peso corporal de um animal. Uma dose simples particularmente preferida de um agente compreende entre cerca de 0,1 micrograma x quilograma-1 e cerca de 5 micrograma x quilograma-1 do peso corporal de um animal, se o agente for libertado por um aerossol. Uma outra dose 77/146 simples preferida de um agente compreende entre cerca de 0,1 micrograma x quilograma-1 e cerca de 10 micrograma x quilograma-1 do peso corporal de um animal, se o agente for libertado de forma parenteral.

Numa realização, uma dose simples apropriada de um ácido nucleico : complexo de lipossomas da presente invenção é desde cerca de 0,1 yg até cerca de 100 yg por kg de peso corporal do paciente ao qual o complexo está a ser administrado. Numa outra realização, uma dose simples apropriada é de cerca de cerca de 1 yg até cerca de 10 yg por kg de peso corporal. Numa outra realização, uma dose simples apropriada de ácido nucleico : complexo de lípidos é de pelo menos cerca de 0,1 yg de ácido nucleico, de maior preferência pelo menos cerca de 1 yg de ácido nucleico, ainda de maior preferência de pelo menos 10 yg de ácido nucleico, ainda de maior preferência, de pelo menos cerca de 50 yg de ácido nucleico, e ainda de maior preferência, de pelo menos cerca de 100 yg de ácido nucleico.

Numa realização, a dose apropriada de um agente da presente invenção para uso em qualquer método aqui descrito é uma dose eficaz para inibir a expressão ou actividade de pelo menos uma proteína na via alternativa do complemento tal como descrito aqui (por exemplo, o factor B, o factor D, ou properdina), quando comparado com a ausência da administração do agente. Os métodos de medição da expressão ou actividade biológica já foram descritos anteriormente. Numa outra realização, uma dose apropriada de uma agente da presente invenção é uma dose que inibe de forma mensurável a via alternativa do complemento da invenção. A activação do complemento e a sua inibição pode ser medida usando 78/146 técnicas que são bem conhecidas na arte. Por exemplo, pode realizar-se a análise in vitro do depósito de C3 nas partículas de zimosano A, tal como descrito nos exemplos. Pode igualmente testar-se a capacidade do agente para inibir a lise de eritrócitos não sensibilizados através de soro humano. A exploração de resultados in vitro para doses in vivo baseada nestes ensaios está dentro da capacidade dos peritos nesta arte.

Nos humanos, sabe-se na arte, que usando métodos convencionais para a libertação por aerossol, apenas 10% da solução libertada entra habitualmente nas vias aéreas profundas, mesmo usando um inalador. Se a libertação com aerossol é através de inalação directa, pode assumir-se uma dosagem de cerca de 10% daquela que é administrada através de métodos de nebulização. Por fim, um perito nesta arte será prontamente capaz de converter uma dosagem de um rato numa dosagem de um humano usando a escala alométrica. Essencialmente, uma escala de dosagem de um rato para um humano é baseada na razão de intervalo de um composto e a superfície do corpo do rato. A conversão para mg / kg é de 1/12 avos do "nível de acontecimentos adversos não observados" (NOEL) para se obter a concentração para a dosagem humana. Este cálculo assume que a eliminação entre o rato e o humano é a mesma, que se crê ser o caso dos anticorpos.

Assim, uma dose simples preferida de qualquer anticorpo compreende entre cerca de 1 ng x quilograma-1 e cerca de menos de 1 mg x quilograma-1 do peso corporal de um animal. Uma dose simples mais preferida de um anticorpo compreende entre cerca de 20 ng x quilograma-1 e cerca de 600 yg x 79/146 quilograma-1 do peso corporal de um animal. Uma dose simples ainda mais preferida de um anticorpo, em particular quando a fórmula do anticorpo é libertada através de nebulização, compreende entre cerca de 20 ng x quilograma-1 e cerca de 600 yg x quilograma-1 do peso corporal de um animal, e de maior preferência ainda, entre cerca de 20 ng x quilograma-1 e cerca de 500 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 20 ng x quilograma-1 e cerca de 400 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 20 ng x quilograma-1 e cerca de 300 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 20 ng x quilograma-1 e cerca de 200 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 20 ng x quilograma-1 e cerca de 100 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 20 ng x quilograma-1 e cerca de 50 yg x quilograma-1 do peso corporal do animal.

Uma outra dose simples preferida de um anticorpo, em particular quando a fórmula do anticorpo é libertada através de nebulização, compreende entre cerca de 200 ng x quilograma-1 e cerca de 600 yg x quilograma-1 do peso corporal, de maior preferência, entre cerca de 200 ng x quilograma-1 e cerca de 500 yg x quilograma-1, de maior preferência, entre cerca de 200 ng x quilograma-1 e cerca de 400 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 200 ng x quilograma-1 e cerca de 300 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 200 ng x quilograma-1 e cerca de 200 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 200 ng x quilograma-1 e cerca de 100 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 200 ng x quilograma-1 e cerca de 50 yg x quilograma-1 do peso corporal do animal.

Uma outra dose simples preferida de um anticorpo, em particular quando a fórmula do anticorpo é libertada 80/146 através de inalação directa de um inalador, compreende entre 2 ng x quilograma-1 e cerca de 100 yg x quilograma-1 do peso corporal do animal, e de maior preferência, entre cerca de 2 ng x quilograma-1 e cerca de 50 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 2 ng x quilograma-1 e cerca de 10 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 2 ng x quilograma-1 e cerca de 5 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 2 ng x quilograma-1 e cerca de 1 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 2 ng x quilograma-1 e cerca de 0,5 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 2 ng x quilograma-1 e cerca de 0,25 yg x quilograma-1, e de maior preferência, entre cerca de 2 ng x quilograma-1 e cerca de 0,1 yg x quilograma-1 do peso corporal do animal.

Numa outra realização, o anticorpo é administrado numa dose de menos de cerca de 50 yg de anticorpo por milímetro da fórmula e de preferência menos de cerca de 250 yg de anticorpo por milímetro da fórmula, e de maior preferência, menos de cerca de 100 yg de anticorpo por milímetro da fórmula, e de maior preferência, menos de cerca de 50 yg de anticorpo por milímetro da fórmula, e de maior preferência, menos de cerca de 40 yg de anticorpo por milímetro da fórmula, e de maior preferência, menos de cerca de 30 yg de anticorpo por milímetro da fórmula, e de maior preferência, menos de cerca de 20 yg de anticorpo por milímetro da fórmula, e de maior preferência, menos de cerca de 10 yg de anticorpo por milímetro da fórmula, e ainda de maior preferência, entre cerca de 5 yg de anticorpo e cerca de 10 yg de anticorpo por milímetro da fórmula. 81/146

Dando mais atenção ao método de redução ou de prevenção da hipersensibilidade das vias aéreas e / ou inflamação das vias aéreas ou uma condição ou doença relacionadas com aquelas, uma dose simples apropriada de um agente inibidor para administrar num animal é uma dose que é capaz de reduzir ou prevenir a hipersensibilidade das vias aéreas e / ou inflamação das vias aéreas, ou de reduzir pelo menos um outro sintoma de uma doença a ser tratada (por exemplo, asma) , num animal quando administrada uma ou mais vezes durante um período de tempo apropriado. Quando um paciente tem ou está em risco de vir a ter AHR, uma dose simples apropriada de um agente compreende uma dose que melhora a AHR através da duplicação de uma dose de um agente causador ou que melhora a função respiratória estática de um animal.

De acordo com a presente invenção, uma quantidade eficaz de um agente que inibe a AHR para administrar num animal compreende uma quantidade que é capaz de reduzir a hipersensibilidade das vias aéreas (AHR ou inflamação das vias aéreas) sem ser tóxico para o animal. Uma quantidade que é tóxica para um animal compreende qualquer quantidade que provoca dano na estrutura ou na função de um animal (isto é, venenosa).

Numa realização, a eficácia de um agente inibidor de AHR para proteger um animal de AHR num animal com, ou em risco de vir a desenvolver AHR pode ser medida em quantidades duplas. Por exemplo, a capacidade de um animal ser protegido de AHR (isto é, ter uma redução de ou uma prevenção de) através da administração de um dado agente é significativa se o PC20metacoiinaFEVl do animal for de 1 mg / ml antes da administração do agente e for de 2 mg / ml de 82/146

Mch depois da administração do agente. Do mesmo modo, um agente é considerado eficaz se o PC20metacoiinaFEVl do animal for de 2 mg / ml antes da administração do agente e for de 4 mg / ml de Mch depois da administração do agente. Uma quantidade eficaz preferida de uma agente compreende uma quantidade que é capaz de aumentar o PC2ometacoiinaFEVl de um animal tratado com o agente através de uma duplicação da concentração em relação ao PC2ometacoiinaFEVl de um animal normal. Tal como discutido anteriormente, um animal normal refere-se a um animal que se sabe não sofrer de, ou ser susceptivel a AHR anormal. Um animal de teste refere-se a um animal que se suspeita sofrer de, ou ser susceptivel a AHR anormal.

Numa realização da presente invenção, num animal que tem AHR, uma quantidade eficaz de um agente para administrar num animal é uma quantidade que reduz de forma mensurável a AHR no animal quando comparado com a administração anterior do agente. Numa outra realização, uma quantidade eficaz de um agente para administrar num animal é uma quantidade que reduz de forma mensurável a AHR no animal quando comparado com um nivel de AHR das vias aéreas numa população de animais com inflamação que está associada a AHR, em que o agente não foi administrado. De preferência, o agente é capaz de reduzir a AHR num animal, mesmo quando o agente é administrado depois de os sintomas fisicos de AHR começarem (isto é, depois do começo de AHR aguda) . De maior preferência, uma quantidade eficaz de AHR do agente é uma quantidade que reduz os sintomas de AHR ao ponto de a AHR já não ser detectada no paciente. Numa outra realização, a quantidade eficaz do agente é a quantidade que previne, ou substancialmente inibe o começo de AHR quando o agente é administrado antes da exposição do paciente ao estimulo que 83/146 provoca AHR, tal como um alergéno, de uma forma que é suficiente para induzir AHR na ausência do agente.

Numa outra realização, uma quantidade eficaz de um agente para uso na presente invenção compreende uma quantidade que resulta na melhoria do valor de PC20metacoiinaFEVi de um animal, de tal modo que o valor de PC2ometacoiinaFEV1 obtido antes da administração do agente quando o animal é provocado com uma primeira concentração de metacolina é o mesmo valor de PC20metacoiinaFEVi obtido depois da administração do agente quando o animal é provocado com o dobro da quantidade da primeira concentração de metacolina.

Uma quantidade preferida de um agente compreende uma quantidade que resulta numa melhoria do valor de PC2 0metacolinaEEV i num animal de tal modo que o valor de PC2ometacoiinaEEVi obtido antes da administração do agente seja de entre cerca de 0,01 mg / ml e cerca de 8 mg / ml de metacolina, seja o mesmo que o valor de PC20metacoiinaFEVi obtido depois da administração, entre cerca de 0,02 mg / ml e cerca de 16 mg / ml de metacolina.

Tal como aqui descrito anteriormente, a eficácia de um agente para proteger um animal com ou susceptível de AHR pode ser determinada através da medição da percentagem de melhoria em FEVi e / ou da razão de FEVi / FVC antes e depois da administração do agente. Numa realização, uma quantidade eficaz de um agente compreende uma quantidade que é capaz de reduzir a limitação do fluxo de ar de um animal, de tal modo que o valor de FEVi / FVC do animal seja de pelo menos cerca de 80%. Numa outra realização, uma quantidade eficaz de um agente compreende uma quantidade que é capaz de reduzir a limitação do fluxo de ar de um 84/146 animal de tal modo que a valor de FEVi / FVC do animal melhore em pelo menos cerca de 5%, ou em pelo menos cerca de lOOcc ou PGFRG 10L / min. Numa outra realização, uma quantidade eficaz de um agente compreende uma quantidade que melhora o FEVi num animal em pelo menos 5%, e de maior preferência em entre cerca de 6% e cerca de 100%, de maior preferência em entre cerca de 7% e cerca de 100%, e ainda de maior preferência em entre cerca de 8% e cerca de 100% (ou cerca de 200 ml) do FEVi previsto do animal. Numa outra realização, a quantidade eficaz de um agente compreende uma quantidade que melhora o FEVi num animal em pelo menos cerca de 5% e de preferência, pelo menos cerca de 10%, e ainda de maior preferência, em pelo menos cerca de 25% e ainda de maior preferência, em pelo menos cerca de 50% e ainda de maior preferência, em pelo menos cerca de 75%.

Um perito na arte será capaz de determinar que o número de doses de um agente a ser administrado a um animal depende da extensão da hipersensibilidade das vias aéreas e da condição subjacente da qual a AHR é um sintoma e a reação de um paciente individual ao tratamento. Além disso, o clinico será capaz de determinar a temporização apropriada para a libertação do agente, de uma forma eficaz para reduzir a AHR no animal. De preferência, o agente é libertado dentro das 48 horas antes da exposição do paciente a uma quantidade de um estimulo que causa AHR eficaz para induzir AHR, e de maior preferência, dentro das 36 horas, e de maior preferência dentro das 24 horas, e de maior preferência, dentro das 12 horas, e de maior preferência, dentro das 6 horas, e de maior preferência, dentro das 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas ou 1 hora antes da exposição do paciente a uma quantidade do estimulo que causa AHR eficaz para induzir AHR. Numa realização, o 85/146 agente é administrado logo que é reconhecido (isto é, de imediato) pelo paciente ou clinico e, em especial por um estimulo que causa AHR ao qual o paciente é sensível (isto é, um alergéno). Numa outra realização, o agente é administrado ao primeiro sinal de desenvolvimento de AHR (isto é, o começo de AHR aguda) e, de preferência, dentro de pelo menos 12 horas do desenvolvimento dos sintomas de AHR e de maior preferência, dentro de pelo menos 1 hora, e de maior preferência, dentro de pelo menos 30 minutos, e de maior preferência, dentro de pelo menos 10 minutos, e de maior preferência, dentro de pelo menos 5 minutos de desenvolvimento dos sintomas de AHR. Os sintomas de AHR e os métodos para a medição ou detetação desses sintomas já foram descritos em pormenor anteriormente. De preferência, essas administrações são dadas até que os sinais de redução apareçam e depois como for necessário até a AHR desaparecer.

Com especial atenção ao método de inibição ou de prevenção da lesão de isquémia e reperfusão, uma quantidade eficaz de um agente, e em particular de um anticorpo do factor B ou seu fragmento de ligação de antígene (ou polipeptídeo de ligação de antígene) para administrar num animal é uma quantidade que inibe de forma mensurável a lesão histológica, incluindo a lesão oxidativa ou a morte celular, no animal quando comparado com a ausência de administração do agente. No caso da lesão de isquémia e reperfusão renal, uma quantidade eficaz de um agente para administrar num animal é uma quantidade que inibe de forma mensurável os aumentos no nitrogénio de urea do soro ou que diminui a lesão histológica de forma mensurável dos tecidos do rim do animal quando comparado com a ausência de administração do agente. Uma dose simples apropriada do 86/146 agente inibidor para administrar num animal é a dose que é capaz de reduzir ou prevenir pelo menos um sintoma, tipo de lesão ou dano resultante da lesão de isquémia e reperfusão num animal quando administrada uma ou mais vezes durante um período de tempo apropriado. Doses apropriadas de anticorpos incluindo para várias vias de administração estão descritas em pormenor acima. Num aspecto, uma quantidade eficaz de um agente que inibe a lesão de isquémia e reperfusão para administrar num animal compreende uma quantidade que é capaz de inibir pelo menos um sintoma ou dano causado pela lesão de isquémia e reperfusão sem ser tóxico para o animal.

Qualquer um dos métodos aqui descritos pode ser usado em qualquer animal e, em particular em qualquer animal da classe dos Vertebrados, Mamalia (isto é, mamíferos), incluindo, sem limitação, primatas, roedores, gado vivo e animais de estimação. Os mamíferos preferidos para tratar usando a presente invenção são os humanos.

Os seguintes exemplos são fornecidos para fins de ilustração e não pretendem limitar o âmbito da presente invenção.

Exemplos

Exemplo 1 87/146 0 seguinte exemplo descreve a produção de um novo inibidor da via alternativa do complemento.

Os presentes inventores criaram vários hibridomas que produzem anticorpos monoclonais de rato que se ligam ao factor B do rato. Neste estudo, os inventores propuseram-se caracterizar a capacidade de um destes anticorpos de inibir a via alternativa do complemento. Os inventores também testaram este anticorpo num modelo de perda fetal mediada por antifosfolipide. Como se relatou anteriormente (Girardi), os ratos com deficiência no factor B ficaram bastante protegidos da perda fetal neste modelo e os inventores formaram a hipótese de que um inibidor exógeno da via alternativa seria um agente terapêutico neste modelo de doença. Métodos

Construção de uma proteína de fusão do factor B-Ig e purificação do factor B em ratos. Construiu-se um plasmídeo codificando duas repetições de curto consenso (SCR) do gene do factor B ligado aos dominós de articulação CH2 e CH3 de um isótopo IgGI de rato (Fig. 1). Estes domínios SCR foram escolhidos porque fazem parte do segmento suprimido do gene do factor B nos ratos fB -/- usados nestes estudos.

Purificação do factor B de ratos. Purificou-se o factor B do complemento a partir de soro normal de rato através de purificação por afinidade. A coluna de afinidade foi criada através da ligação do factor B de properdina anti-humana de 88/146 cabra (Diasorin, Stillwater, MN) a Separose Activada por CNBr (Amersham, Arlington Heights, IL) de acordo com as instruções do fabricante. Os ratos C57 / B6J foram sangrados através de perfuração cardíaca e o sangue foi recolhido para seringas contendo 50 μΐ de 500 mM EDTA de modo a prevenir a activação da via alternativa. O sangue foi centrifugado a 2000 rpm durante 15 minutos e o plasma foi recolhido. O plasma foi depois diluído 1:1 em tampão (EACA 50 mM, EDTA 10 mM, benzamidina 2 mM m PBS, pH 7,4) e passado através de um filtro 0,22 ym (GE Water Technologies). Juntou-se o plasma à coluna de afinidade e a coluna de afinidade foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão. O factor B foi eluido usando 5 M LiC12 e dialisado durante a noite contra PBS. A pureza do factor B foi depois verificada através de eletroforese num gel de 10% Tris-Glycine e tingido com Coomassie (dados não disponibilizados).

Desenvolvimento de anticorpos monoclonais inibidores com o factor B do complemento como alvo. A supressão com alvo do factor B de ratos foi conseguida, tal como descrito previamente (Matsumoto). Os ratos com deficiência do factor B foram criados com células estaminais embrionárias da cadeia Sv 129 e foram depois cruzados com ratos C57BL/6 antes da expansão da colónia em F1. Os ratos com deficiência do factor B foram imunizados com 125 yg da proteína de fusão do factor B-Ig recombinante emulsionado com o auxiliar incompleto de Freund e depois estimulado quatro vezes em intervalos de três semanas. Os ratos foram rastreados para o desenvolvimento de anticorpos inibidores do factor B através de teste ao soro num ensaio de imunoabsorção ligada à enzima (ELISA) usando placas revestidas do factor B de ratos e um ensaio in vitro da 89/146 inibição da via alternativa do complemento (descrito abaixo) . Um dia após a última injeção, as células do baço de um rato, identificado como possuindo uma reação imune robusta em relação ao factor B, foram fundidas com a linha de células mieloma no Centro de Anticorpos Monoclonais da Universidade do Colorado. Os hibridomas candidatos foram clonados através de diluição limitada e os clones capazes de inibir a actividade da via alternativa do complemento foram identificados. Um dos hibridomas, A1379, foi usado nestas experiências. 0 A 1379 foi purificado a partir de supernados de cultura de tecido com uma coluna de Sefarose da Proteina-G (Pharmacia, Uppsala, Sweden). 0 LPS foi removido do mAb purificado usando polimixina (sigma). Usou-se o Ensaio de Lisato de Amebócitos de Limulus (BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD) de acordo com as instruções do fabricante para verificar que o mAb tinha níveis LPS abaixo de 1 EU / mg de mAb. A pureza do mAb foi depois verificada através de eletroforese em gel de 10% Tris-Glycine e tingido com Coomassie.

Análise ELISA dos níveis de anticorpos do anti-factor B.

Os ratos foram rastreados para uma reação imune às imunizações através de testes aos seus soros num ensaio de imunoabsorção ligada à enzima (ELISA) contra o factor B purificado. Noventa e seis placas de alvéolos ELISA (Costar, Corning, NY) foram revestidas com 125 ng de factor B purificado num tampão revestido (15 mM de Na2C03, 35 mM de Na2HC03) e armazenados durante a noite a 4 °C. As lacas foram depois lavadas com 200 μΐ de PBS. A ligação não específica foi bloqueada através da incubação das placas com 200 μΐ de 5% de BSA (Sigma - Aldrich, St. Louis, MO) em 90/146 PBS. As placas foram lavadas duas vezes com 200 μΐ de PBS com 0,1% de Tween 20, depois incubadas com soro diluído durante uma hora. As amostras foram diluídas 1 : 100 em PBS com 0,1% de Tween 20 e 0,1% de BSA, depois as amostras foram ainda diluídas em série 1 : 1 sete vezes. As placas foram depois lavadas duas vezes e incubadas com 50 μΐ de IgG de anti-rato de cabra conjugado com peroxidase (Cappel, Durham, NC). As placas foram a seguir lavadas quatro vezes e incubadas com 100 μΐ de ABTS contendo 1 : 1000 de 30% de H2H2 (Sigma) e a absorção a 405 nm foi lida com um leitor de microplacas (Biorad, Richmond, CA).

Ensaios de inibição da via alternativa do complemento. A seguir rastreou-se soros com titulação detectável de anticorpos do factor B para a capacidade de inibir a via alternativa. Isto foi realizado usando uma análise in vitro de depósito de C3 em partículas de zimosano A (Sigma) (Quigg). Ferveram-se cinquenta mg de partículas de zimosano em 10 ml de 0,15 M NaCl durante 60 minutos, depois lavou-se duas vezes em PBS. Os soros foram testados misturando-se 1 x 107 partículas de zimosano numa mistura de reação com uma concentração final de 10 mM EGTA e 5 mM de MgCl2. Juntou-se dez microlitros de soros de ratos C57 / B6 não manipulados como fonte de complemento. Os ensaios de inibição foram conduzidos até 70 μΐ de soros de ratos imunizados (para rastrear para a geração de anticorpos inibidores) ou com anticorpos purificados titulados de 0,0625 pg a 8 pg por reação. As amostras foram trazidas até 100 μΐ de volume final com PBS e foram incubadas a 37 °C durante 30 minutos. As partículas de zimosano foram lavadas duas vezes com PBS frio, 1% de soro bovino fetal e foram depois incubadas com C3 anti-rato de cabra conjugado com FITC (Cappel, Durham, NC) durante uma hora em gelo. As amostras foram lavadas 91/146 novamente duas vezes, foram suspensas novamente em 0,5 ml de PBS, 1% de soro bovino fetal e foram depois analisadas através de citometria de fluxo. A percentagem de inibição foi calculada usando a fórmula: 100 x [1 - (fluorescência do canal médio da amostra - fundo (sem soro)] (fluorescência do canal médio de controlo positivo - fundo)

Os fragmentos Fab do clone 1379 foram também testados para a capacidade de inibir a via alternativa usando o ensaio de zimosano. Os fragmentos foram gerados através da incubação de anticorpos purificados com papain - agarose (ICN Biomedicals, Aurora, OH) de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos Fc e IgG não digerido foram depois retirados aplicando-se o anticorpo digerido a uma coluna G de proteína. Os fragmentos Fab foram colhidos no fluxo e os fragmentos Fc e o IgG não digerido foram subseguentemente eluídos com 0,1 M glicina - HCI, pH 2,8. Um yg do Fab foi usado na reação de zimosano. O anticorpo C3 de anti-rato policlonal usado neste ensaio revelou ter reactividade cruzada com múltiplas espécies. A titulação do anticorpo inibidor realizada como descrito acima.

Como outro ensaio da capacidade do clone 1379 inibir a via alternativa do complemento, os inventores testaram a capacidade deste anticorpo inibir a lise dos eritrócitos do coelho não sensibilizado através de soro humano. Todo o sangue do coelho foi misturado 1:1 com uma solução em tampão composto por 20,5 g de dextrose, 8,0 g de citrato de 92/146 sódio (dihidrato) , 4,0 g de NaCl, 0,55 g de ácido citrico num litro de água destilada. Misturou-se então cinco ml da solução de eritrócitos 1:9 com uma solução de 1,1% de NaCl, 0,0025% de barbiturado dietil de Na-5,5, pH 7,35, 8 mM EGTA, 2 mM MgCl2. A mistura foi incubada a 37 °C durante vários minutos e depois centrifugada a 1000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Os eritrócitos foram lavados mais três vezes antes de voltarem a ser suspensos em 40 ml da mesma solução. Juntou-se então cinquenta μΐ da suspensão anterior a uma solução em tampão de soro humano (5 para 100 μΐ) para levar o volume final até 150 μΐ. Usaram-se eritrócitos em tampão sem soro como controlo negativo, e juntaram-se eritrócitos a 100 μΐ de água destilada que foram usados como controlos positivos (lise completa). As amostras foram incubadas a 37 0C durante 30 minutos com agitação ocasional para manter as células em suspensão. As reações foram paradas acrescentando-se 1,5 ml de PBS frio e as amostras foram giradas a 1000 x g durante cinco minutos. A densidade óptica de cada sobrenadante foi lida a 415 nm usando um espectófotometro (Biorad) . Dez μΐ de soro revelaram causar a lise completa dos eritrócitos. A mesma reação foi depois efectuada usando 10 μΐ do soro e aumentando as concentrações do clone 1379 (1 pg para 12 pg por reação). A percentagem de inibição da actividade da via alternativa do complemento foi determinada usando a fórmula: 10 0 X [1 (QDamostra_ODfundo) 1

(0DCOntrolo positivo - OD fundo)

Farmacocinética in vivo do clone 137 9. Os ratos foram sangrados previamente e depois foram injectados intraperitonealmente (IP) ou intravenosamente (IV) com 93/146 doses de uma ou duas mg do clone 137 9 do anticorpo. Estas doses foram escolhidas porque calculou-se que seriam equimolares com o factor B. 0 factor B está presente no soro a aproximadamente ~200 yg / ml (ou ~2,2 μΜ, dado que o factor B é uma proteína 90 kD) . Uma vez que o anticorpo 1379 é 150 kD e o volume intravascular de um rato adulto é de aproximadamente 3 ml, uma injeção de um mg (6,7 μΜ) deverá resultar numa concentração circulatória de ~2,2 μΜ. Uma vez que o anticorpo é divalente, antecipou-se que esta injeção equimolar seria mais do que suficiente para resultar na inibição completa da via alternativa. Os ratos foram sangrados 1, 2, 6, 24, 48 e 96 horas após a injeção do inibidor. Usou-se então os soros destes pontos no tempo no ensaio de zimosano para avaliar a actividade da via alternativa.

Resultados A geração de anticorpos inibidores monoclonais para a porção Ba do factor B. Geraram-se anticorpos monoclonais para o factor B do rato, tal como descrito na secção dos métodos. O soro dos ratos imunizados foi avaliado para a presença de anticorpos do factor B (dados não disponibilizados). Um clone, designado 1379, foi escolhido para uma maior caracterização devido ao facto de se verificar que o hibridoma estava a crescer rapidamente, o anticorpo ser da subclasse IgGl (activadora do não complemento) , e de o seu sobrenadante ter revelado ser um potente inibidor da via alternativa do complemento. Depois da purificação do anticorpo (dados não disponibilizados), o anticorpo foi testado em dois ensaios in vitro da actividade da via alternativa (Figs. 2A e 2B) . Usando o 94/146 ensaio de zimosano, o inibidor mostrou inibir completamente a via alternativa quando se juntaram três yg à reação que continha 10 μΐ de soro. O anti-factor B e o factor B são aproximadamente equimolares nesta concentração (assumindo que o factor B está presente em 200 yg / ml e tem um peso molecular de 90 000 kD igual a aproximadamente 0,02 nMol). No ensaio da lise dos eritrócitos do coelho, conseguiu-se a inibição completa com 6 yg de anticorpo por yl de soro humano na reação. A inibição da via alternativa foi depois testada usando fragmentos de Fab feitos a partir do clone 1379. Quando o excesso molar de Fab do clone 1379 foi usado, a inibição completa da actividade da via alternativa foi vista por este ensaio. A capacidade do 1379 de inibir a actividade da via alternativa em soros de várias espécies diferentes de mamíferos foi depois testada no ensaio de zimosano. O anticorpo 1379 foi capaz de inibir completamente a activação da via alternativa na maior parte das espécies testadas (Quadro 1) . O anticorpo inibiu completamente a actividade da via alternativa completamente no soro de ratos, ratazanas, humanos e várias espécies de macacos. No entanto, não demonstrou qualquer actividade inibidora em relação ao soro de cães ou de cobaias.

Quadro 1

Espécies nas quais a via alternativa é completamente inibida pelo mAb 1379 • Rato • Humanos 95/146 • Ratazanas • Babuinos • Macaco rhesus • Porco • Macaco cino • Cavalo Espécies nas quais a via alternativa não é inibida pelo mAb 1379 • Cão • Cobaia

Farmacocinética do anticorpo 1379. Os ratos foram testados para a inibição da via alternativa em vários momentos depois de uma única injeção do anticorpo inibidor. Um mg de anticorpo levou à inibição completa numa hora quando injectado IV e em duas horas quando injectado IP (Fig. 3). Os ratos que receberam a injeção IP de um mg retiveram a inibição completa da via alternativa em 24 horas e os que receberam a injeção IP de dois mg retiveram a inibição completa até 48 horas depois da injeção. Os inventores também injectaram 2 mg do anticorpo 1379 repetidamente dia sim, dia não durante 14 dias e mostraram que a inibição completa da via alternativa foi mantida durante pelo menos 48 horas após a última injeção (dados não disponibilizados). Estes dados sugerem claramente que este mAb de rato não é reconhecido como "estranho" e suporta o seu uso crónico in vivo. Por fim, as experiências usando fragmentos F (ab) do anticorpo mostraram que a inibição da via alternativa é conseguida em niveis aproximadamente equimolares assim como o anticorpo 1379 intacto (dados não disponibilizados). 96/146 1379 liga um epítope na região SCR3 de Ba. A capacidade do anticorpo 1379 para se ligar a um painel dos mutantes do factor B foi realizada, tal como descrito anteriormente (Hourcade, 1995, J. Biol. Chem,) de modo a caracterizar o sitio de ligação mAb. As experiências mostraram que a introdução de determinadas substituições de alanina nos SCRs 2 e 3 do factor B humano, mas não no SCR 1, resulta na perda de ligação do anticorpo 137 9 ao factor B. Dos 25 diferentes mutantes testados, o 1379 não teve virtualmente qualquer ligação aos mutantes B17 e B23 e reteve menos de 20% da sua capacidade de ligação ao mutante B18. Estas são todas mutações SCR3. Mais especificamente, os substitutos mutantes B17 1379 Tyr - 140 - Cys - 141 - Ser com His - Cys - Pro, sendo as posições relevantes para o factor humano maduro representados por SEQ ID NR : 2; os substitutos mutantes B23 182 - Glu - 183 - Gly - 184 - Gly - 185 - Ser com Gly - Asn - Gly - Vai, as posições também relevantes para o factor B humano maduro representado por SEQ ID NR: 2. Deste modo, o anticorpo 1379 liga-se ao terceiro domínio SCR do factor B.

Conclusões

Os presentes inventores geraram um novo anticorpo monoclonal para o factor B do rato, identificado como clone 1379. Este anticorpo é um inibidor específico da via alternativa do complemento e leva à completa inibição desta via in vitro e in vivo. Uma única injeção i.p. de 1 mg leva à completa inibição da via alternativa até 48 horas e múltiplas injeções resultaram na inibição prolongada desta via. 97/146

Usando ensaios in vitro, o 1379 demonstrou inibir completamente a actividade da via alternativa no soro de múltiplas espécies incluindo ratos, ratazanas, macacos e humanos. Usando ensaios da afinidade de ligação para o anticorpo a um painel de mutantes do factor B, determinou-se que o sitio antigénico seria o dominio SCR3 do factor B, parte da região suprimida nos ratos com fB -/-. Esta região da proteína do factor B é adjacente ao sítio de segmentação do factor D. A capacidade do fragmento Fab do 137 9 de inibir a actividade da via alternativa sugere que isso não é meramente um obstáculo estérico do 13879 que previne a segmentação, mas sim que o sítio de ligação específico é uma localização crítica na segmentação mediada do factor D da proteína. A eficácia do 1379 contra o soro de tantas espécies diferentes sugere que este sítio é altamente conservado entre os mamíferos superiores.

Muitos outros inibidores solúveis do complemento já foram desenvolvidos e caracterizados (Quigg; Weisman; Heller; Granger; Pratt), mas crê-se que o inibidor aqui descrito seja o primeiro a inibir de forma selectiva a via alternativa numa ampla variedade de espécies animais. Ao inibir de forma selectiva a via alternativa, o 1379 pode ter várias vantagens quando comparado com inibidores que trabalham ao nível da convertase C3. Ao deixar a via clássica intacta, este inibidor pode ter menos efeitos imunossupressores. Além disso, o bloqueamento da via clássica pode, na realidade, induzir a autoimunidade. 0 bloqueamento selectivo da via alternativa melhorou o modelo de rato de lúpus nefritis (Watanabe), enquanto a deficiência C3 não o fez. A via alternativa esteve especificamente implicada em vários modelos de doenças 98/146 (Thurman; Watanabe; Girardi), salientando o potencial terapêutico de um inibidor da via alternativa.

Referências 1. Thurman et al., 2003, J Immunol 170: 1517-1523 2.Watanabe et al., 2000, J Immunol 164:786-794 3. Girardi et al., 2003, J Clin Invest 112:1644-1654 4. Holers, v.: M. 2003, Clin Immunol 107:140-151 5. Densen et al., 1997, Mol Immunol 33:68 (abstract 270) 6. Matsumoto et al., 1997, Proc Natl Acad Sei USA 94:8720-8725 7. Figueroa and Densen, 1991, Clin Microbiol Rev 4: 359-395 8. Quigg et al., 1998, J Immunol 160:4553-4560 9. Weisman et al., 1990, science 249: 146-151 10. Heller et al., 1999, J Immunol 163:985-994 11. Granger et al., 2003, Circulation 108:1184-1190 12. Pratt et al., 2003, am J Pathol 163:1457-1465

Exemplo 2 O seguinte exemplo demonstra que a activação do complemento através da via alternativa é critica para o desenvolvimento da hipersensibilidade e inflamação das vias aéreas e demonstra ainda que a inibição da via alternativa para a 99/146 activação do complemento inibe a hipersensibilidade das vias aéreas.

Dada a eficácia da inibição da activação do complemento antes da exposição ao alergéno, os presentes inventores determinaram ainda a activação da via do complemento. No presente estudo, os inventores relatam que a activação da cascata do complemento através da via alternativa é critica para o desenvolvimento da hipersensibilidade e inflamação das vias aéreas. Métodos

Animais

Ratos fêmeas C57BL / 6, 8 a 12 semanas de idade, foram obtidos de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) . Tal como foi descrito anteriormente, os ratos com deficiência heterozigota do factor B (fB -/-) foram entrecruzados em F1 seguindo um cruzamento inicial para o ramo C57BL / 6 e depois entrecruzados para gerar um ramo fB -/-. Estes ratos foram depois retrocruzados para 7 gerações com ratos C57BL / 6. Como ratos de controlo, usaram-se irmãos de ninhada fB -/-. Os ratos com deficiência de C4 ( (C4 -/- ) retrocruzados por 17 gerações com ratos C57BL / 6) foram mantidos nas instalações dos animais. Todos os animais de experiências usados neste estudo foram mantidos a dietas livres de ovalbumina (OVA) e ficaram sob um protocolo aprovado pelos Institutional Animal Care and Use Committee do National Jewish Medicai and Research Center. 100/146

Protocolo Experimental

Os ratos foram sensibilizados através de injeção intraperitoneal (i.p.) de 20 yg de OVA (Grau V; Sigma Chemical Co. ; St. Louis, MO) ou tasna (Ambrósia artemisiifolia, Greer Laboratories, Lenoir, NC) suspensa em 2,25 mg de hidróxido de alumínio (Alum Imuject; Pierce, Rockford, IL) nos dias 1 e 14 e depois foram desafiados através das vias aéreas usando OVA ou tasna nebulizada (1% em PBS) com um nebulizador ultrasónico (DeVilbiss Health Care, Somerset, PA) durante 20 minutos diariamente nos dias 27, 28 e 29.

Para a reconstrução de fB administrou-se 10 yg, 1 yg ou 0,1 yg de fB purificado (50 yL em PBS) através de aplicação intranasal 1 hora antes de cada desafio das vias aéreas para ratos fB -/- não sensibilizados e sensibilizados. Administrou-se PBS como controlo.

Num estudo diferente, duas horas antes de cada desafio de OVA administrou-se um anticorpo fB (anti-fB) aos ratos sensibilizados tanto com injeção i.p. (2 mg / tratamento / rato) ou por nebulização. Para a nebulização, colocaram-se 4 ratos numa caixa de plexiglass e nebulizou-se 0,5 mg de anti-fB (em 5 ml de PBS) usando um nebulizador ultrasónico (DeVilbiss Health Care) . Como um controlo, o rato IgG foi injectado i.p. ou nebulizado com a mesma dose e volume e nos mesmos pontos de tempo. No dia 31, a AHR foi avaliada e os animais foram sacrificados no mesmo dia para a colheita de fluido BAL, sangue e tecido pulmonar. 101/146

Purificação do factor B

Para reconstruir a actividade da via alternativa em ratos B -/-, o factor B do complemento do rato foi purificado a partir do soro de um rato normal através da purificação por afinidade. A coluna de afinidade foi criada através da ligação do factor B de properdina anti-humano de cabra (Diasorin, Stillwater, MN) à Separose Activada por CNBr (Amersham, Arlington Heights, IL), de acordo com as instruções do fabricante. Os ratos C57 / B6J foram sangrados através de perfuração cardíaca e o sangue foi colhido em seringas contendo 50 μΐ de 500 mM EDTA de modo a prevenir a activação da via alternativa. O sangue foi centrifugado a 2000 rpm durante 15 minutos e o plasma foi colhido. O plasma foi depois diluído 1:1 com tampão (EACA 50 mM, EDTA 10 mM, benzamidina 2 mM em PBS, pH 7,4) e passado através de um filtro de 0,22 pm (GE Water

Technologies). O plasma foi acrescentado à coluna de afinidade e a coluna foi lavada com 10 volumes de coluna em tampão. O factor B foi eluido usando 5 M de LiC12 e dialisado durante a noite contra PBS. A pureza do factor B foi então verificada por eletroforese num gel de 10% de Tris - Glicina e tingido com Coomassie. A concentração de LPS foi determinada através do Ensaio de Lisato Amebocito de Limulus (Bio Whittaker, Inc., Walkersviller, MD) tendo-se revelado abaixo de 1 EU / mg de factor B purificado.

Geração de anticorpos do factor B

Os anticorpos monoclonais do factor B anti-rato foram produzidos, tal como descrito no Exemplo 1. Resumindo, os 102/146 ratos com deficiência do factor B foram imunizados com uma proteina de fusão recombinante criada a partir dos segundo e terceiro dominios do consenso curto de repetição (SCR) do gene do factor B e uma imunoglobulina. Os dominios SCR foram escolhidos porque fazem parte do segmento suprimido do gene do factor B nos ratos fB -/-. Os ratos fB -/- foram então imunizados com esta proteina e depois estimulados quatro vezes com intervalos de três semanas. Um dia depois da última injeção, as células do baço foram fundidas com células mieloma no Centro de Anticorpos Monoclonais da Universidade do Colorado. Os clones secretores do anticorpo monoclonal (mAb) do anti-factor B foram então identificados e caracterizados. Um dos hibridomas, A1379, foi usado para estas experiências. 0 A1379 foi purificado a partir de sobrenadantes da cultura de tecido com uma coluna de Sefarose da Proteina G (Pharacia, Uppsala, Sweden). 0 LPS foi retirado do mAb purificado usando polimixina (Sigma -Aldrich, St. Louis, MO) . 0 Ensaio de Lisato Amebocito Limulus (Biowhittaker, Inc., Walkersville, MD) foi usado de acordo com as instruções do fabricante para verificar que o mAb tinha níveis de LPS abaixo de 1 EU / mg de mAb. A pureza do mAb foi então verificada por eletroforese em gel de 10% Tris - Glicina e tingida com Coomassie.

Determinação da função das vias aéreas A sensibilidade das vias aéreas foi avaliada como uma alteração na função das vias aéreas depois do desafio com metacolina com aerossol (Mch) administrada durante 10 sec (60 inspirações / min, 500 μΐ de volume corrente) em concentrações crescentes (6,25, 12,5, 25, 50 e 100 mg / ml). Ratos anestesiados (sódio pentobarbital, i.p., 70 a 90 103/146 mg / kg) , traqueostomizados (18G cânula) foram ventilados mecanicamente (160 inspirações por min, volume de corrente de 150 μΐ, pressão final de expiração positiva de 2 - 4 cm H20) e a função pulmonar foi avaliada (Takeda, 1997) . A resistência das vias aéreas (RL) foi continuamente computorizada (Labview, National Instruments, TX) ajustando o fluxo, o volume e a pressão a uma equação de movimento. Os valores máximos de RL foram tirados e expressos como uma percentagem em valores de RL da linha de base entre os respectivos ratos com deficiência ou de controlo.

Lavagem Broncoalveolar e Medição de citocinas

Depois da avaliação da função das vias aéreas, os pulmões foram lavados através do tubo traqueial com solução de sal equilibrada de Hank (lxl ml, 37 °C). O número de células BAL foi obtido usando um contador de células (Coulter

Counter; Coulter Co., Hialeh, FL) . As contagens diferenciais de células foram feitas a partir de preparações citocentrifugadas e a percentagem e números absolutos de cada tipo de células foram calculados. Os niveis de citoquina foram avaliados com ELISA em fluido BAL (Tompkinson). Realizaram-se IFN-Y, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 (todos ParMingen, San Diego, CA) e IL-13 (R&D Systems, Mimmeapolis, MN) ELISAS de acordo com as instruções dos fabricantes.

Mediram-se os niveis de C3a desArg em fluido BAL com ELISA em ratos não sensibilizados e sensibilizados 24 horas após o primeiro ou o segundo desafios alergénicos e às 24 e 48 horas a seguir ao terceiro e último desafio seguindo as 104/146 instruções do fabricante (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Canada).

Estudos Histológicos e de imunohistoquimica

Depois de se obter o fluido BAL, os pulmões foram cheios de ar através da traqueia com 2 ml de 10% de formalina e depois fixos na mesma solução por imersão. As secções de tecido foram tingidas com hematoxilina e eosina, ácido periódico Schiff (PAS) e imunohistoquimicamente para células contendo a proteina básica maior eosinofilica (MPB), usando um anticorpo MBP anti-rato de coelho (fornecido por J.J. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ). As lâminas foram examinadas de forma cega e os números de eosinófilos no tecido peribronquial e nas células caliciformes foram analisados separadamente usando softwares NIH Scion Image (versão 1.62, desenvolvido no Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos e disponível na internet).

Medição do total dos anticorpos IgE e específicos de OVA

Mediram-se os níveis de soro totais de IgE, e IgE e IgGl específicos de OVA com ELISA, tal como descrito anteriormente (Tompkinson). As titulações de anticorpos específicos de OVA das amostras foram relacionadas com os padrões combinados internos que foram designados de forma aleatória de unidades de ELISA 500 (EU) . O nível total de IgE foi calculado através da comparação com um padrão conhecido de IgE de rato (55 3481, PharMingen). 105/146

Análise estatística A análise da variação (ANOVA) foi usada para determinar o nível de diferença entre todos os grupos. As comparações para todos os pares foram efectuadas pela diferença significativamente diferente de Tukey - Kramer (HSD). Ajustaram-se os valores de probabilidade (p) para a significância em 0,05. Os valores para todas as medições são expressos como a média de erro médio padrão (SEM).

Resultados A activação do complemento através da via alternativa é crítica para o desenvolvimento de AHR a seguir ao desafio de alergénos de ratos sensibilizados

De modo a avaliar o papel da via alternativa no desenvolvimento de AHR e da inflamação das vias aéreas, os ratos fB -/- sensíveis e não sensíveis a OVA e os ratos de controlo (fB +/+) correspondentes foram desafiados com um aerossol de 1% de OVA durante 3 dias consecutivos. Os ratos fB +/+ sensibilizados e desafiados mostraram um aumento da sensibilização a MCh quando comparados com os ratos apenas fB +/+ desafiados (Fig. 4). Por outro lado, os ratos fB -/-sensibilizados e desafiados demonstraram uma reação significativamente mais baixa (p< 0,01) a MCh durante a curva de dose - reação quando comparados com os ratos fB +/+ sensibilizados e desafiados e, assim, demonstram uma incapacidade acentuada para desenvolver AHR após a sensibilização e o desafio. 106/146 A activação do complemento através da via alternativa é crítica para o desenvolvimento da inflamação das vias aéreas a seguir ao desafio alergénico de ratos. A inflamação das vias aéreas é uma propriedade característica da doença alérgica das vias aéreas. De modo a avaliar a inflamação das vias aéreas obteve-se fluído BAL e tecido pulmonar 48 horas após o último desafio das vias aéreas. Os ratos fB +/+ sensibilizados e desafiados mostraram um aumento na contagem total de células e especialmente nos números eosinófilos no fluído BAL quando comparado com ratos apenas desafiados que não revelaram eosinófilos no seu fluído BAL (Fig. 5) . Os ratos fB -/-sensibilizados e desafiados mostraram uma contagem significativamente mais baixa do total de células, assim como dos números de eosinófilos (p< 0,01) no fluído BAL quando comparado com fB +/+ sensibilizados e desafiados, mas ainda assim significativamente mais altos quando comparado com os controlos apenas desafiados. De igual modo, Os ratos fB -/- mostraram também números eosinófilos mais baixos no fluído BAL a seguir à sensibilização e ao desafio com tasna quando comparado com os controlos desafiados (Fig. 5). A sensibilização alergénica e o desafio das vias aéreas leva a um aumento da inflamação peribronquial e especialmente a infiltração eosinófila quando comparado com desafio apenas (Fig. 3). No entanto, as ratos fB -/-sensibilizados e desafiados reduziram de forma acentuada a inflamação peribronquial (Quadro 2) quando comparado com os ratos de controlo sensibilizados e desafiados. De modo a quantificar a infiltração eosinófila no pulmão, tingiram-se 107/146 secções de tecido com proteína básica anti-maior (dados não disponibilizados). Em ratos apenas desafiados detectaram-se poucos eosinófilos no tecido peribronquial. A sensibilização e o subsequente desafio alergénico de ratos fB -/- resultou num aumento significativo dos números de eosinófilos peribronquiais (Quadro 2). Por outro lado, os ratos fB -/- sensibilizados e desafiados mostraram uma menor infiltração de eosinófilos (Quadro 2).

Outra característica distintiva da doença alérgica das vias aéreas é a hiperplasia das células caliciformes das células epiteliais das vias aéreas. Os pulmões foram tingidos com ácido periódico Schiff para identificar as células que contêm muco no epitélio das vias aéreas. Nos ratos sensibilizados e desafiados encontrou-se uma grande quantidade de células tingidas com positivo para muco (Quadro 2) ao contrário dos ratos apenas desafiados, nos quais não se detectaram nenhumas células positivas PAS (Quadro 2). fB -/- sensibilizados e desafiados revelaram significativamente (p< 0,001) menos células com muco no epitélio das vias aéreas quando comparado com os ratos de tipo selvagem sensibilizados e desafiados.

A activação do complemento através da via alternativa afecta a produção de citoquina no fluído BAL A produção de citoquina Th2 por células T tem um papel chave na indução da inflamação das vias aéreas e AHR. De modo a avaliar a reação da citoquina a seguir ao desafio alergénico, as concentrações de IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13 e IFN-Y foram avaliadas no fluido BAL 48 horas após o 108/146 último desafio de OVA. A sensibilização e o desafio de ratos do tipo selvagem resultou em aumentos (p< 0,05) significativos de IL-4, IL-5 e IL-13, e diminuições (p< 0,05) significativas em IL-10, IL-12 e IFN-Y quando comparado com os controlos apenas desafiados (dados não disponibilizados). Os niveis de citoquina Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) no fluido BAL decresceram nos ratos fB -/- (dados não disponibilizados). A deficiência fB não afecta os niveis de soro dos anticorpos específicos de antigene

Os niveis totais de soro de IgE, e IgE e IgGl específicos de OVA foram medidos 48 horas após o último desafio das vias aéreas. Os ratos fB +/+ sensibilizados e desafiados mostraram niveis totais superiores de IgE e IgE e IgGl específicos de OVA quando comparados com os ratos de controlo apenas desafiados (Quadro 3) . De igual modo, os ratos fB -/- mostraram níveis totais superiores de de IgE e IgE e IgGl específicos de OVA, que não foram estatisticamente diferentes dos ratos fB +/+ sensibilizados e desafiados, indicando que a reação humoral à sensibilização e ao desafio alergénicos permanece intacta nestes ratos. 109/146

Quadro 2. Quantificação da hiperplasia das células caliciformes e da inflamação eosinófila peribronquial fB + / + apen as desa f iad o fB +/ + sensib ilizad o e desafi ado fB -/-sensib ilizad o e desafi ado C4 +/ + sensib ilizad o e desafi ado C4 -/-sensib ilizad o e desafi ado Contro lo Ab sensib ilizad o e desafi ado Anti fB i.p. sensib ilizad o e desafi ado Anti fB neb. sensib ilizad o e desafi ado PAS- N.D. 132 ± 36 ± 156 ± 149 ± 153 ± 28 ± 43 ± célu las posi tiva s (cél ulas / mm Bm) 35 * 19# 27* 15* 33* 10 12# 0£ 1,3 80 ± 24 ± 95 ± 87 ± 95 ± 20 ± 33 ± MBP célu las posi tiva s (cél ulas / mm BM) ± 0,9 16* 14# 20* 21* 28* 9# 16#

Ratos sensibilizados e desafiados, tal como descrito em Métodos. 0 número de células caliciformes (PAS - células positivas) e eosinófilos peribronquiais (proteína básica anti-maior (MBP) - células positivas) foi avaliado 48 h após o último desafio. Os valores médios ± SEM estão disponíveis; fB ratos com deficiência do factor B; fB +/+: ratos de controlo do tipo selvagem congénitos; C4 ratos com deficiência do factor B do complemento; C4 +/+: ratos de controlo do tipo selvagem congénitos; Controlo Ab: ratos sensibilizados e desafiados C57BL/6 tratados com Ab i.p. de controlo; anti-fB i.p.: ratos sensibilizados e desafiados C57BL/6 tratados com anticorpo anti fB i.p.; anti-fB neb.: ratos sensibilizados e desafiados C57BL/6 110/146 tratados com anti-corpo anti-fB por inalação; BM (membrana basal). *p< 0,05 quando comparado com fB +/+ desafiados apenas, fB -/- desafiados apenas; anti-fB i.p. sensibilizados e desafiados e anti-fB neb. Sensibilizados e desafiados. #p< 0,05 quando comparado com fB +/+ desafiados apenas.

Quadro 3. Níveis de imunoqlobulina no soro fB + / + apen as desa f iad o fB +/ + sensib ilizad o e desafi ado fB - /- apen as desa f iad o fB -/-sensib ilizad o e desafi ado C57BL/ 6 sensib ilizad o e desafi ado Contro lo Ab sensib ilizad o e desafi ado Anti fB i.p. sensib ilizad o e desafi ado Anti fB neb. sensib ilizad o e desafi ado IgE 47,3 219, 8 38,5 198,36 241,1 238,5 189, 6 229, 5 total (ng / ml) ± 11,2 ± 48,4 k ± 12,5 # ± 31,2* ± 37,6* ± 41,1* ± 33,2 ± 44* IgE OVA-espec í f ico (EU/m D <10 145, 1 ± 36,7* <10 166,2 ± 42,1* 153, 8 ± 47,4* 128,1 ± 30,8* 99,1 ± 27,4# 122,5 ± 39,5* IgGl OVA-espec í f ico (EU/ ml) <10 189, 1 ± 20,5* <10 155, 9 ± 38,8* 171,8 ± 71,1* 146,5 ± 61,2* 106,5 ± 28,9* 120,1 ± 30,8*

Ratos sensibilizados e desafiados, tal como descrito em Métodos. Os níveis imunoglobulinas foram avaliados 48 h após o último desafio. Os valores médios ± SEM estão disponíveis; fB -/-: ratos com deficiência do factor B; fB +/+: ratos de controlo do tipo selvagem congénitos; Controlo Ab: ratos sensibilizados e desafiados C57BL/6 tratados com Ab i.p. de controlo; anti-fB i.p.: ratos sensibilizados e desafiados C57BL/6 tratados com anticorpo 111/146 anti fB i.p.; anti-fB neb.: ratos sensibilizados e desafiados C57BL/6 tratados com anti-corpo anti-fB por inalação; EU/ml (unidades de Elisa / ml). *p< 0,05 quando comparado com fB +/+ desafiados apenas e fB -/- desafiados. A activação da via clássica neste modelo não é essencial para o desenvolvimento da doença alérgica das vias respiratórias

Para definir mais a via do complemento critica para o desenvolvimento das reações alérgicas nos pulmões de ratos sensibilizados e desafiados, os inventores usaram ratos com deficiência no componente 4 do complemento (C4 -/-), que é essencial para a activação das vias clássica e de lecitina, quando comparado com os ratos fB -/-.

De modo a avaliar a activação da via do complemento, avaliaram-se os niveis de C3a e desArg em fluido BAL. Os ratos apenas desafiados mostraram baixos niveis de C3a desArg (dados não disponibilizados). Pelo contrário, os ratos sensibilizados mostraram níveis crescentes de C3a desArg em fluido BAL após o primeiro, o segundo e o terceiro desafios, com os valores mais altos 48 horas após o último desafio (dados não disponibilizados). Curiosamente, os ratos fB -/- C4 sensibilizados e desafiados mostraram níveis semelhantes de C3a quando comparado com os ratos de tipo selvagem sensibilizados e desafiados, ao contrário dos ratos fB -/- sensibilizados e desafiados, que mostram um diminuição nos níveis C3a desArg quando comparado com os seus respectivos ratos de tipo selvagem sensibilizados e desafiados (dados não 112/146 disponibilizados) . Estes dados sugerem que a seguir à exposição alergénica de ratos sensibilizados, a activação do complemento ocorre através da via alternativa.

Os ratos C4 -/- desenvolveram niveis semelhantes de AHR aos dos ratosC4 +/+ sensibilizados e desafiados (Fig.9). De igual modo, os ratos C4 -/- não mostraram qualquer diminuição nas contagens totais de células (média ± SEM, n= 10; 163 í 35 x 103 células), ou nos números de linfócitos (28 ± 9 x 103 células) e de eosinófilos (98 ± 23 x 103 células) no fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) quando comparado com os ratos de controlo sensibilizados e desafiados (n = 10; 175 ± 53; 35 ± 12 x 103 células, respectivamente) (dados não disponibilizados). Outros ratos C4 -/- sensibilizados e desafiados mostraram aumentos semelhantes nos números de eosinófilos peribronquiais e nos números de células caliciformes quando comparado com os respectivos ratos do tipo selvagem sensibilizados e desafiados (Quadro 2). Estas descobertas sugerem que a activação da via clássica neste modelo não é essencial para o desenvolvimento de doença alérgica das vias aéreas.

A falta de desenvolvimento da AHR e da inflamação das vias aéreas em ratos com deficiência de fB não é especifica para OVA

De modo a avaliar se a falta de hipersensibilidade das vias aéreas a seguir à sensibilização e ao desafio alergénicos é devido a uma não sensibilização especifica a OVA, os ratos de tipo selvagem fB -/- foram sensibilizados e desafiados com tasna. Os ratos sensibilizados e desafiados com tasna 113/146 mostraram uma diminuição na reação a McH, enquanto os fB + /+ desenvolveram uma forte reação a McH (figs. 6a e 6B) . De igual modo, a inflamação das vias aéreas no fluido BAL foi reduzida nos ratos fB -/- sensibilizados e desafiados com tasna quando comparado com os fB +/+ (Fig. 6C).

A administração do factor B reconstitui a capacidade de desenvolver AHR e a inflamação das vias aéreas em ratos fB

De modo a reconstituir o factor B no pulmão, os fB -/-receberam uma única aplicação intranasal, tanto de 10 pg, 1 pg, 0,1 pg de factor B purificado (Fig. 7), como de um PBS antes de cada desafio das vias aéreas. Os ratos fB -/-sensibilizados e desafiados tratados com 0,1 pg de factor B antes de cada desafio mostraram uma diminuição na reação de Mch semelhantes aos ratos fB -/- sensibilizados e desafiados tratados com PBS, mas significativamente mais baixa quando comparado com os ratos fB +/+ sensibilizados e desafiados (Fig. 7A) . Os ratos sensibilizados e desafiados tratados com 1 pg de factor B purificado mostraram um ligeiro, porém estatisticamente não diferente, aumento na reação das vias aéreas quando comparado com ratos fB -/-sensibilizados e desafiados, tanto tratados com PBS, como com 1 pg de factor B purificado (Fig. 7A). Por outro lado, os ratos fB -/- sensibilizados e desafiados tratados com 10 pg de factor B purificado antes de cada desafio das vias aéreas mostraram um aumento na reação a MCh, semelhante aos ratos fB +/+ sensibilizados e desafiados. 114/146

Também o tratamento de ratos fB -/- sensibilizados e desafiados com 10 yg de factor B purificado antes de cada desafio das vias aéreas mostrou um aumento da inflamação das vias aéreas e em espacial nos números eosinófilos no fluido BAL semelhante aos números observados em ratos fB +/+ sensibilizados e desafiados, enquanto o tratamento tanto com 0,1 yg como de 1 yg de factor B purificado não conseguiu aumentar os números de eosinófilos no fluido BAL (Fig. 7B). Se o factor B for dado antes de cada desafio das vias aéreas, mas a recipientes não sensibilizados, as reações de AHR e da inflamação das vias aéreas não foram observadas, indicando que a fase de sensibilização foi necessária para as reações se desenvolverem no desafio, assim como demonstrando que a fase da sensibilização nos ratos fB -/- ficou intacta. Estes dados nos ratos fB -/- demonstram directamente que o factor B da via alternativa é critico para o desenvolvimento de doença alérgica das vias aéreas. O tratamento com um anticorpo neutralizante de FB inibe o desenvolvimento de AHR em ratos sensibilizados e desafiados

De modo a avaliar o papel da activação do complemento através da via alternativa em ratos sem deficiência de genes, sensibilizados e desafiados, sensibilizaram-se C57BL / 5, tal como descrito nos Métodos. O anticorpo do factor B 1379 descrito no Exemplo 1 foi administrado tanto de forma sistemática como local através de nebulização, o que mostrou ser uma via eficaz para a administração de outros inibidores do complemento. Os ratos normais, tratados após a sensibilização, mas durante a fase de desafio tratados tanto com anti-factor B sistémico e local (nebulizado) 115/146 mostraram uma diminuição significativa na AHR (Figs. 8A e 8B), assim como uma inibição da inflamação das vias aéreas e de eosinófilos nas vias aéreas (Fig. 8C) . Além disso, a inflamação do tecido, os números de eosinófilos peribronquiais (Quadro 2), assim como os números de células caliciformes (Quadro 2) foram reduzidos nestes ratos anti fB tratados. Além disso, os níveis de IL-4, IL-5 e IL-13 foram significativamente mais baixos no fluido BAL de ratos tratados com o anticorpo fB (dados não disponibilizados). De igual modo, o tratamento de ratos C4 -/- sensibilizados e desafiados com anti-factor B diminuíram a sua reação das vias aéreas e da inflamação das vias aéreas (Fig. 10) . Estes resultados estão de acordo com os estudos usando inibidores de complemento que não discriminam entre as vias clássica e alternativa, mas que bloqueiam o desenvolvimento de uma reação tardia das vias aéreas, assim como de AHR.

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Exemplo 3 adicionais produzido

O seguinte exemplo descreve dados de ligação para um painel de anticorpos de anti-factor B 118/146 pelos presentes inventores. Usaram-se ensaios para testar a ligação e / ou inibição do factor B de ratos e do factor B de humanos para os vários anticorpos. Como se pode ver, o mAb 1379 tanto liga como inibe o factor B do rato e humano. Pelo contrário, o mAb designado por 624 pode ligar tanto o factor B do rato como o humano, mas não inibe a via alternativa humana. Usou-se uma ELISA de competição para avaliar mais os anticorpos. Como se pode ver, os anticorpos 624, 691 2 1231 não bloqueiam a ligação de 1379. Estes anticorpos têm de, por isso, ligar a proteina num sitio diferente, explicando assim porque é que ligam o factor B sem inibir a sua função in vitro. No entanto, os anticorpos 395, 1322 e 1060 são inibidores competitivos de 1379.

Quadro 4

Clone Isóto Lig Liga Inibe a Inibe a Compet po a o o fB via via e com fB human alternativ alternativ o 1379 de o a de rato a humana para a rat (ensaio de (ensaio de ligaçã o zimosano) lise o fB eritrócito humana de coelho) 1379 IgGl +++ +++ +++ +++ +++ k 395 IgGl +++ +++ ++ +++ +++ k 1322 IgG2b +++ +++ + ++ +++ k 624 IgGl +++ +++ + - - k 119/146

691 IgGl k + + + + + + + 1060 IgG2b k + + + + + + + ++ ++ 1231 IgGl +++ +++ + - - E 1128 - + + + - 0 ND

Exemplo 4 0 seguinte exemplo descreve o mapeamento do epítope para mAb 1379 na superfície do factor B humano.

As experiências iniciais para mapear o epítope para o anticorpo mAb 1379 indicou que o sítio de ligação do epítope ou anticorpo no factor B não foi linear. 0 anticorpo ligou-se de forma ávida a todo o comprimento da proteína quando aderiu a uma placa ELISA. Os peptídeos que tinham 10 aminoácidos de comprimento foram construídos para alargar a área da proteína onde se sabe que a ligação ocorre (SCR2 - 3). Quando estes peptídeos aderiram a uma placa ELISA, o anticorpo não os reconheceu, indicando que nenhuma destas sequências lineares foi reconhecida como o epítope. A superfície ou epítope de ligação conservada prevista do factor B humano que é reconhecida pelo mAb foi formada. Em resumo, a estrutura terciária do factor B humano foi construída com base na estrutura tridimensional resolvida de CR2 - SCR1 - 2 (Protein Data Bank (PDB) id. 1GHQ) . O modelo final foi aperfeiçoado ao estado mínimo de energia, com os constrangimentos fixos nos quatro resíduos Cys 120/146 absolutamente conservados de cada SCR. A identidade de sequência do factor B SCR2 - 3 com SCR1 - 2 é de 30% (o mais elevado), com o factor H SCR 15 - 16, 25%, com CD46, 20%. A Fig. 11 mostra o modelo da estrutura do factor B com as posições do amino ácido correspondentes ao epitope mAb 1379 (relativo à SEQ ID NR: 2) indicado. Os resíduos que se crê formar o epitope conformacional para o anticorpo mAb 1379 são: Ala 137, Tyr 139, Ser 141, Ser 185, Thr 189, Glu 190 e Ser 192, embora o epitope possa conter apenas alguns, substancialmente todos, ou mais resíduos do que se apresenta na Fig. 11.

Este modelo pode agora ser usado para prever os efeitos dos mutantes do factor B anteriormente discutidos, de Hourcade (Hourcade, 1995, J. Biol. Chem.) que forma inicialmente usados para caracterizar o epitope para o anticorpo mAb 1379 (ver Exemplo 1). A seguir mostra-se quatro mutantes deste painel que contêm resíduos que pertencem ao modelo de epitope mAb 1379, como se pode ver na Fig. 11. Como se pode ver a seguir, os mutantes B17 e B23, que mostraram no Exemplo 1 ser capazes de reduzir a ligação de mAb 1379, têm determinadas substituições (indicadas a negrito e itálico) que se prevê voltarem-se para o interior e, por isso, podem ser perturbadoras da estrutura do epitope ou superfície de ligação conservada para mAb 1379. O mutante B16/17, apesar de conter resíduos que se encontram dentro do âmbito do epitope do modelo para mAb 1379, não se prevê ter mutações que perturbem a estrutura do epitope, o que pode explicar porque é que este mutante se ligou ao anticorpo nas experiências de mapeamento iniciais. De igual modo, apesar de o mutante B23/24 também conter resíduos que se encontram dentro do âmbito do epitope do modelo para mAb 1379, este mutante também se ligou ao anticorpo nas experiências de 121/146 mapeamento iniciais, os resíduos que formam os sitios de contacto do anticorpo não parecem vir a ser perturbados pelas mutações. Esta experiência também ilustra o facto de o anticorpo da invenção poder ligar-se a proteínas do factor B, ou suas porções, tendo mutações conservadoras ou mutações que não interrompem substancialmente este epítope.

BI?: Y139-C14Ô-S141 Subs: Η P

B23: E182-G183-G184-S185 Subs: G N V B16/17: G136-Â137-G138

Subs: N S S B23/24: S187-G188-T189-E190-P191-S192

Subs: D E T A V A Fig. 12 é um desenho esquemático que mostra um modelo de complexo de mAbl379 (um fragmento Fab) de ligação ao factor B, tendo os lados de ligação do antigene do Fab sido modelados para cobrir toda a região do epítope mapeado, tal como definido anteriormente na Fig. 11.

Exemplo 5 0 seguinte exemplo demonstra que a inibição da via alternativa do complemento e, especificamente, a inibição do factor B, inibe e protege animais de lesões de isquémia e reperfusão renal.

As experiências foram efectuadas para testar a eficácia do mAb 1379 a melhorar a lesão no modelo de falha renal aguda 122/146 isquémica. Neste modelo, a falha renal aguda isquémica é induzida anestesiando os ratos e fixando os pedículos durante 24 minutos. Os ratos foram injectados intraperitonealmente com 1 mg do mAb uma hora antes da indução de lesão. Este protocolo provoca uma forma irreversível de falha renal aguda isquémica com o pico da lesão a ocorrer 24 horas depois de se retirar a fixação dos pediculos renais e o fluxo de sangue ter voltado ao rim. A lesão renal é então avaliada através da medição da acumulação de resíduos nitrogenados tais como SUN e soro de creatinina e a avaliação da lesão morfológica dos rins por um patologista renal. Os inventores demonstraram que a via alternativa do complemento é activada logo após a reperfusão dos rins e que esta activação contribui para a lesão renal dai resultante. 0 exame aos rins através de imunofluorescência e de análise de borrão Western confirmou que o anticorpo mAbl379 aqui descrito preveniu efectivamente a activação do complemento depois de I/R. Tal como se pode ver na Fig. 13, os ratos que foram pré-tratados com 1379 demonstraram aumentos mais suaves no nitrogénio do soro da urea (SUN) após 24 horas de reperfusão quando comparado com os controlos do tipo selvagem (78 ± 15 mg / dL vs. 119 ± 15 mg dL, P<0,05, n=ll para cada grupo). A lesão histológica foi também mais suave em ratos que foram tratados com 1379. Quando classificados por um patologista de maneira cega, os ratos tratados com 1379 demonstraram um dano tubular significativamente menor do que os ratos de controlo (3,3 ± 0,5 vs. 4,9 ± 0,1, p< 0,01, n=10 para cada grupo). Deste modo, o 1379 previne efectivamente a activação do complemento no rim do rato depois de I/R, e o pré-tratamento com 1379 melhora a lesão funcional e histológica depois de I/R. 123/146

Numa outra experiência, as células epiteliais tubulares renais na cultura foram sujeitas a duas horas de anóxia química através da sua incubação com antimicina. As células foram então expostas a soro fresco de rato (como fonte de complemento) e a desidrogenasse lactate (LDH) foi medida como um marcador de morte celular e expressa em unidades arbitrárias usando um ensaio comercial (Promega, Madison, WI) . As células que foram expostas a antimicina e soro libertaram significativamente mais LDH do que as células expostas apenas a soro (100,140 ± 3307 para antimicina + soro vs 69,255 ± 9754, p<0,05; dados não disponibilizados). No entanto, quando o soro foi incubado com o mAb 1379 antes da incubação com células, a libertação de LDH caiu para 76,471 ± 7720 (p<0,01 vs. células tratadas com antimicina + soro; dados não disponibilizados). O mAb 1379 protege, por isso, as células epiteliais tubulares renais hipoxicas que estão expostas a componentes da via alternativa, tanto in vivo como in vitro.

Enquanto várias realizações da presente invenção foram descritas ao pormenor, torna-se aparente para um perito nesta arte que poderão ocorrer modificações e adaptações destas realizações. Deverá ficar expressamente entendido que, no entanto, essas modificações e adaptações se encontram dentro do âmbito da presente invenção, tal como apresentado nas seguintes reivindicações. 124/146

Lista de sequências <110> Holers, Vernon Thurman, Joshua Taube, Christian Gelfand, Erwin Gilkeson, Gary <120> Inhibition of Factor B, The Alternative Complement Pathway and Methods Related The

<130> 2848-66-PCT <150> 60/543,594 <151 >2004-02-10 <150> 60/636,239 < 151 > 2004-12-14 <150> US04/015040 <151> 2004-05-13 <160>6 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 764

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 125/146

Met Gly Ser Asn Leu Ser Pro Gin 1 5

Leu Cys Leu Met Pro Phe Ile Leu 10 15

Gly Leu Leu Ser Gly Gly Vai Thr 20

Thr Thr Pro Trp Ser Leu Ala Arg 25 30

Pro Gin Gly Ser Cys Ser Leu Glu 35 40

Gly Vai Glu Ile Lys Gly Gly ser 45

Phe Arg Leu Leu Gin Glu Gly Gin 50 55

Ala Leu Glu Tyr Vai Cys Pro Ser 60

Gly Phe Tyr Pro Tyr Pro Vai Gin Thr Arg Thr Cys Arg Ser Thr Gly 65 70 75 80

Ser Trp Ser Thr Leu Lys Thr Gin Asp Gin Lys Thr Vai Arg Lys Ala 85 90 95

Glu Cys Arg Ala Ile His Cys Pro Arg Pro His Asp Phe Glu Asn Gly 100 105 110

Glu Tyr Trp Pro Arg Ser Pro Tyr Tyr Asn Vai Ser Asp Glu ile Ser 115 120 125

Phe His Cys Tyr Asp Gly Tyr Thr Leu Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr 130 135 140 126/146

Cys Gin Vai Asn Gly Arg Trp Ser Gly Gin Thr Ala Ile Cys Asp Asn 145 150 155 160

Gly Ala Gly Tyr Cys Ser Asn Pro Gly Ile Pro Ile Gly Thr Arg 1>ys 165 170 175

Vai Gly Ser Gin Tyr Arg Leu Glu Asp Ser Vai Thr Tyr His Cys Ser 180 - 185 190

Arg Gly Leu Thr Leu Arg Gly Ser Gin Arg Arg Thr Cys Gin Glu Gly 195 200 205

Gly Ser Trp Ser Gly Thr Glu Pro Ser Cys Gin Asp Ser Phe Met Tyr 210 215 220

Asp Thr Pro Gin Glu Vai Ala Glu Ala Phe Leu Ser Ser Leu Thr Glu 22S 230 235 240

Thr lie Glu Gly Vai Asp Ala Glu Asp Gly His Gly Pro Gly Glu Gin 245 250 255

Gin Lys Arg Lys Ile Vai Leu Asp Pro Ser Gly Ser Met Asn Ile Tyr 260 265 270

Leu Vai Leu Asp Gly Ser Asp Ser Ile Gly Ala Ser Asn Phe Thr Gly 275 280 285

Ala Lys Lys Cys Leu Vai Asn Leu Ile Glu Lys Vai Ala Ser Tyr Gly 290 295 300

Vai Lys Pro Arg Tyr Gly Leu Vai Thr Tyr Ala Thr Tyr Pro Lys Ile 305 310 315 320

Trp Vai Lys Vai Ser Glu Ala Asp Ser Ser Asn Ala Asp Trp Vai Thr 325 330 335

Lys Gin Leu Asn Glu Ile Asn Tyr Glu Asp His Lys Leu Lys Ser Gly 340 ' 345 350

Thr Asn Thr Lys Lys Ala Leu Gin Ala Vai Tyr Ser Met Met Ser Trp 355 360 365

Pro Asp Asp Vai Pro Pro Glu Gly Trp Asn Arg Thr Arg His Vai Ile 370 375 380

Ile Leu Met Thr Asp Gly Leu His Asn Met Gly Gly Asp Pro Ile Thr 385 390 395 400

Vai Ile Asp Glu Ile Arg Asp Leu Leu Tyr Ile Gly Lys Asp Arg Lys 405 410 415

Asn Pro Arg Glu Asp Tyr Leu Asp Vai Tyr Vai Phes Gly'Vai Gly Pro 420 425 430

Leu Vai Asn Gin Vai Asn Ile Asn Ala Leu Ala Seir Lys Lys Asp Asn 435 440 445

Glu Gin His Vai Phe Lys vai Lys Asp Met Glu Asrai Leu Glu Asp vai 450 455 460

Phe Tyr Gin Met Ile Asp Glu Ser Gin Ser Leu Serr Leu Cys Gly Met 455 470 475 480

Vai Trp Glu His Arg Lys Gly Thr Asp Tyr His Lym Gin Pro Trp Gin 485 490 495

Ala Lys Ile Ser Vai Ile Arg Pro Ser Lys Gly Glu Ser Cys Met 500 505 510

Gly Ala Vai Vai Ser Glu Tyr Phe Vai Leu Thr Ala Ala His Cys Phe 515 520 525

Thr Vai Asp Asp Lys Glu His Ser ile Lys Vai Serr Vai Gly Gly Glu 530 535 540

Lys Arg Asp Leu Glu Ile Glu Vai Vai Leu Phe His Pro Asn Tyr Asn 545 550 555 560

Ile Asn Gly Lys Lys Glu Ala Gly Ile Pro Glu Phea Tyr Asp Tyr Asp 565 570 575

Vai Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Leu Lys Tyrr Gly Gin Thr Ile 580 585 590

Arg Pro Ile Cys Leu Pro Cys Thr Glu Gly Thr Thrr Arg Ala Leu Arg 595 600 605

Leu Pro Pro Thr Thr Thr Cys Gin Gin Gin Lys Glu Glu Leu Leu Pro 610 615 620

Ala Gin Asp Ile Lys Ala Leu Phe Vai Ser Glu Glu. Glu Lys Lys Leu 625 630 635 640

Thr Arg Lys Glu Vai Tyr lie Lys Asn Gly Asp Lys Lys Gly Ser Cys 64S 650 655

Glu Arg Asp Ala Gin Tyr Ala Pro Gly Tyr Asp Lys Vai Lys Asp Ile 660 665 670 128/146

Ser Glu Vai Vai Thr Pro Arg Phe Leu Cys Thr Gly Gly Vai Ser Pro 675 680 685

Tyr Ala Asp Pro Asn Thr Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile 690 695 700

Vai His Lys Arg Ser Arg Phe Ile Gin Vai Gly Vai Ile Ser Trp Gly 705 710 715 720

Vai Vai Asp Vai Cys Lys Asn Gin Lys Arg Gin Lys Gin Vai Pro Ala 725 730 735

His Ala Arg Asp Phe His Ile Asn Leu Phe Gin Vai Leu Pro Trp Leu 740 745 750

Lys Glu Lys Leu Gin Asp Glu Asp Leu Gly Phe Leu 755 760 <210> 2 <211> 739 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>2 129/146

Thr Pro Trp Ser lieu Ala Arg Pro Gin Gly Ser Cys Ser Leu Glu Gly 1 5 10 15

Vai Gl-u Ile Lys Gly Gly Ser Phe Arg Leu Leu Gin Glu Gly Gin Ala 20 25 30

Leu Glu Tyr Vai Cys Pro Ser Gly Phe Tyr Pro Tyr Pro Vai Gin Thr 35 40 45

Arg Thr Cys Arg Ser Thr Gly Ser Trp Ser Thr Leu Lys Thr Gin Asp 50 55 60

Gin Lys Thr Vai Arg Lys Ala Glu Cys Arg Ala Ile His Cys Pro Arg 65 70 75 80

Pro His Asp Phe Glu Asn Gly Glu Tyr Trp Pro Arg Ser Pro Tyr Tyr 85 90 95

Asn Vai Ser Asp Glu Ile Ser Phe His Cys Tyr Asp Gly Tyr Thr Leu 100 105 110

Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr Cys Gin vai Asn Gly Arg Trp Ser Gly 115 120 125

Gin Thr Ala Ile Cys Asp Asn Gly Ala Gly Tyr Cys Ser Asn Pro Gly 130 135 140 130/146

Ile Pro Ile Gly Thr Arg Lys Vai Gly Ser Gin Tyr Arg Leu Glu Asp 145 150 155 150

Ser Vai Thr Tyr His Cys Ser Arg Gly Leu Thr Leu Arg Gly Ser. Gin 165 170 175

Arg Arg Thr Cys Gin Glu Gly Gly Ser Trp Ser Gly Thr Glu Pro Ser 180 185 190

Cys Gin Asp Ser Phe Met Tyr Asp Thr Pro Gin Glu Vai Ala Glu Ala 195 200 205

Phe Leu Ser Ser Leu Thr Glu Thr Ile Glu Gly Vai Asp Ala Glu Asp 210 215 220

Gly His Gly Pro Gly Glu Gin Gin Lys Arg Lys Ile Vai Leu Asp Pro 225 230 235 240

Ser Gly Ser Met Asn Ile Tyr Leu Vai Leu Asp Gly Ser Asp Ser Ile 245 25.0. 255

Gly Ala Ser Asn Phe Thr Gly Ala Lys Lys Cys Leu Vai Asn Leu Ile 260 265 270

Glu Lys Vai Ala Ser Tyr Gly Vai Lys Pro Arg Tyr Gly Leu Vai Thr 275 280 285

Tyr Ala Thr Tyr Pro Lys Ile Trp Vai Lys Vai Ser Glu Ala Asp Ser 290 295 300

Ser Asn Ala Asp Trp vai Thr Lys Gin Leu Asn Glu Ile Asn Tyr Glu 305 310 315 320

Asp His Lys Leu Lys Ser Gly Thr Asn Thr Lys Lys Ala Leu Gin Ala 325 330 335

Vai Tyr Ser Met Met Ser Trp Pro Asp Asp Vai Pro Pro Glu Gly. Trp 340 345 350

Asn Arg Thr Arg His Vai Ile Ile Leu Met Thr Asp Gly Leu His Asn 355 360 365

Met Gly Gly Asp Pro Ile Thr Vai Ile Asp Glu Ile Arg Asp Leu Leu 370 375 380

Tyr Ile Gly Lys Asp Arg Lys Asn Pro Arg Glu Asp Tyr Leu Asp Vai 385 390 395 400

Tyr Vai Phe Gly Vai Gly Pro Leu Vai Asn Gin Vai Asn Ile Asn Ala 405 410 415 131/146

Vai Lys Asp 430

Leu Ala Ser Lys Lys Asp Asn Qlu Gin His Vai Phe Lys 420 425

Met Glu Asn Leu Glu Asp Vai Phe 435 440

Tyr Gin Met lie Asp Glu Ser Gin 445

Ser Leu Ser Leu Cys Gly Met Vai 450 455

Trp Glu His Arg Lys Gly Thr Asp 460

Tyr His Lys Gin Pro Trp Gin Ala 465 470

Lys Ile Ser Vai Ile Arg Pro Serr 475 480

Lys Gly His Glu Ser Cys Met Gly 485

Ala Vai Vai Ser Glu Tyr Phe Vai 4 90 495

Leu Thr Ala Ala His Cys. Phe Thr 500

Vai Asp Asp Lys Glu His Ser Ile 505 510

Lys Vai Ser. Vai Gly Gly Glu Lys.Arg Asp Leu. Glu Ile. Glu. Vai Vai 515 520 525

Leu Phe His Pro Asn Tyr Asn Ile Asn Gly Lys Lys Glu Ala Gly Ile 530 535 540

Pro Glu Phe Tyr Asp Tyr Asp Vai Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys 545 550 555 560

Leu Lys Tyr Gly Gin Thr Ile Arg Pro Ile Cys Leu Pro Cys Thr Gin 565 570 575

Gly Thr Thr Arg Ala Leu Arg Leu Pro Pro Thr Thr Thr Cys Gin Gin 580 585 590

Gin Lys Glu Glu Leu Leu Pro Ala Gin Asp Ile Lys Ala Leu Phe Vai 595 600 605

Ser Glu Glu Glu Lys Lys Leu Thr Arg Lvs Glu Vai Tyr Ile Lys Asn 610 615 ' 620

Gly Asp Lys Lys Gly Ser Cys Glu Arg Asp Ala Gin Tyr Ala Pro Gly 625 630 635 64 0

Tyr Asp Lys Vai Lys Asp Ile Ser Glu Vai Vai Thr Pro Arg Phe Leu 645 650 655

Cys Thr Gly Gly Vai Ser Pro Tyr Ala Asp Pro Asn Thr Cys Arg Gly 660 665 670

Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Vai His Lys Arg Ser Arg Phe Ile Gin 675 680 685 132/146

Vai Gly Vai Ile Ser Trp Gly Vai Vai Asp Vai Cys Lys Asn Gin Lys S90 695 700

Arg Gin Lys Gin Vai Pro Ala His Ala Arg Asp Phe His Ile Asn Leu 705 7X0 715 720

Phe Gin Vai Leu Pro Trp Leu Lys Glu Lys Leu Gin Asp Glu Asp Leu 725 730 735

Gly Phe Leu <210 3 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Ala Arg Pro Gin Gly Ser Cys Ser Leu Glu Gly Vai Glu Xle Lys. Gly 1 5 10 15

Gly Ser Phe Arg Leu Leu Gin Glu Gly Gin Ala Leu Glu Tyr Vai Cys 20 25 30

Pro Ser Gly Phe Tyr Pro Tyr Pro Vai Gin Thr Arg Thr Cys Arg Ser 35 40 45

Thr Gly Ser Trp Ser Thr Leu Lys Thr Gin Asp Gin Lys Thr Vai Arg 50 55 60

Lys Ala Glu Cys Arg Ala 65 70 <210> 4 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 4 lie His Cys Pro Arg Pro His Asp Phe Glu Asn Gly Glu Tyr Trp Pro 1 S 10 15 Arg Ser Pro Tyr Tyr Asn Vai Ser Asp Glu Ile Ser Phe His Cys Tyr 20 25 30 Asp Gly Tyr Thr Leu Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr Cys Gin Val Asn 35 40 45 Gly Arg Trp Ser Gly Gin Thr Ala Xle Cys Asp Asn 50 55 60 133/146 <2105 <211> 48 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>5

Gly Tyr Cys Ser Asn Pro Gly Ile Pro Ile Gly Thr Arg Lys .Vai Gly 15 10 15

Ser Gin Tyr Arg Leu Glu Asp Ser Vai Thr Tyr His Cys Sex: Arg Gly 20 25 30

Leu Thr Leu Arg Gly Ser Gin Arg Arg Thr Cys Gin Glu Gly Gly Ser 35 40 45 <210 6 <211> 761 <212> PRT <213> Mus muscuius <400 6 134/146

Met Glu Ser Pro Gin Leu Cys Leu Vai Leu Leu Vai Leu Gly Phe Ser '1 5 10 15

Ser Gly Gly Vai Ser Ala Thr Pro 20

Vai Leu Glu Ala Arg Pro Gin Vai 25 30

Ser Cys Ser Leu Glu Gly Vai Glu 35 40

Ile Lys Gly Gly Ser Phe Gin Leu 45

Leu Gin Gly Gly Gin Ala Leu Glu 50 55

Tyr Leu Cys Pro Ser Gly Phe Tyr 60

Pro Tyr Pro Vai Gin Thr Arg Thr 65 70

Cys Arg Ser Thr Gly Ser Trp Ser 75 80

Asp Leu Gin Thr Arg Asp Gin Lys 85

Ile Vai Gin Lys Ala Glu Cys Arg 90 95

Ala Ile Arg Cys Pro Arg Pro Gin Asp Phe Glu Asn Gly Glu Phe Trp 100 105 lio

Pro Arg Ser Pro Phe Tyr Asn Leu Ser Asp Gin Ile Ser Pho Gin Cys 115 120 125

Tyr Asp Gly Tyr Vai Leu Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr Cys Gin Glu 130 135 140

Asn Gly Arg Trp Asp Gly Gin Thr Ala Ile Cys Asp Asp Gly Ala Gly 145 150 155 160 135/146

Tyr Cys Pro Asn Pro Gly Ile Pro Ile Gly Thr Arg Lys Vai Gly Ser 155 170 175

Gin Tyr Arg Leu Glu Asp Ile Vai Thr Tyr His Cys Ser Arg Gly Leu 180 185 190

Vai Leu Arg Gly Ser Gin Lys Arg Lys Cys Gin Glu Gly Gly Ser Trp 195 200 205

Ser Gly Thr Glu Pro Ser Cys Gin Asp Ser Phe Met Tyr Asp Ser Pro 210 215 220

Gin Glu Vai Ala Glu Ala Phe Leu Ser Ser Leu Thr Glu Thr Ile Glu 225 230 235 240

Gly Ala Asp Ala Glu Asp Gly His Ser Pro Gly Glu Gin Gin Lys Arg 245 250 255

Lys Ile Vai Leu Asp Pro Ser Gly Ser Met Asn Ile Tyr Leu Vai Leu 260 265. 270

Asp Gly Ser Asp Ser Ile Gly Ser Ser Asn Phe Thr Gly Ala Lys Arg 275 280 285

Cys Leu Thr Asn Leu Ile Glu Lys Vai Ala Ser Tyr Gly Vai Arg Pro -290 295 300

Arg Tyr Gly Leu Leu Thr Tyr Ala Thr Vai Pro Lys Vai Leu Vai Arg 305 310 3is 320

Vai Ser Asp Glu Arg Ser Ser Asp Ala Asp Trp Vai Thr Glu Lys Leu 325 330 * 335

Asn Gin Ile Ser Tyr Glu Asp His Lys Leu Lvs Ser Gly Thr Asn Thr 340 345 * 350

Lys Arg Ala Leu Gin Ala Vai Tyr. Ser Met Met Ser Trp Ala Gly Asp 355 360 365

Ala Pro Pro Glu Gly Trp Asn Arg Thr Arg His Vai Ile Ile Ile Met 370 375 3B0

Thr Asp Gly Leu His Asn Met Gly Gly Asn Pro Vai Thr Vai Ile Gin 385 390 395 400

Asp Ile Arg Ala Leu Leu Asp Ile Gly Arg Asp Pro Lys Asn Pro Arg 405 410 415

Glu Asp Tyr Leu Asp Vai Tyr Vai Phe Gly Vai Gly Pro Leu Vai Asp 420 425 430 136/146

Ser Vai Asn Ile Asn Ala Leu Ala Ser Lys Lys Asp Asn Glu His His 435 440 445

Vai Phe Lys Vai Lys Asp Met Glu Asp Leu Glu Asn Vai Phe Tyr Gin 4SG 455 460 Met Ile Asp Glu Thr Lys Ser Leu Ser Leu Cys 465 470 475 Gly Met vai Txrp Glu 480 His Lys Lys Gly Asn Asp Tyr His Lys Gin Pro 485 490 Trp Gin Ala Lys Ile 495 Ser Vai Thr Arg Pro Leu Lys Gly His Glu Thr 500 505 Cys Met Gly Ala Vai 510 Vai Ser Glu Tyr Phe Vai Leu Thr Ala Ala His 515 520 Cys Phe Met Vai Asp 52S Asp Gin Lys His Ser Ile Lys Vai Ser Vai Gly 530 535 Gly Gin . Arg Arg Asp 540 Leu Glu Ile Glu Glu Vai Leu Phe His Pro Lys 545 550 555 Tyx* Asn Ile Asn Gly 560 Lys Lys Ala Glu Gly Ile Pro Glu Phe Tyr Asp 565 570 Tyr Asp Vai Ala Leu 575 Vai Lys Leu Lys Asn Lys Leu Lys Tyr Gly Gin 580 585 Thr Leu Arg Pro Ile 590 Cys Leu Pro Cys Thr Glu Gly Thr Thr Arg Ala 595 600 Leu Arg Leu Pro Gin 605

Thr Ala Thr Cys Lys Gin His Lys Glu Gin Leu Leu Pro Vai Lys Asp 610 615 620 Vai Lys Ala Leu Phe Vai Ser Glu Gin Gly Lys 625 630 635 Ser Leu Thr Arg Lys 640

Glu vai Tyr Ile Lys Asn Gly Asp Lys Lys Ala Ser Cys Glu Arg Asp 645 650 655 Ala Thr Lys Ala Gin Gly Tyr Glu Lys Vai Lys 660 665 Asp Ala Ser Glu Vai 670 Vai Thr Pro Arg Phe Leu Cys Thr Gly Gly Vai 675 680 Asp Pro Tyr Ala Asp 685

Pro Asn Thr Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Vai His Lys 690 695 700 137/146

Arg Ser Arg Phe Ile Gin Val Gly Val Ile Ser Trp Gly Val Val Asp 705 710 715 720 Val Cys Arg Asp Gin Arg Arg Gin Gin Leu Val Pro Ser Tyr Ala Arg 725 730 735 Asp Phe His lie Asn Leu Phe Gin Val Leu Pro Trp Leu Lys ASp Lys 740 745 750 Leu Lys Asp Glu Asp Leu Gly Phe Leu 755 760

Lisboa, 31 de Outubro de 2013 138/146

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo Titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração se tenha tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a EPO não assume qualquer responsabilidade a este respeito.

Documentos de Pedidos de Patente citadas na descrição

wo 0147963 A wo 2004022C ) 9 6 us 6820011 B wo 9109967 A wo 9109968 A wo 92113831 . A EP 0194276 A EP 0239400 A EP 0451216 A EP 0460617 A US 5969108 A US 5565332 A US 5871907 A US 5858657 A US 5627052 A US 6165463 A US 5705151 A, us 60543594 B 139/146

US 60636239 B

US04015040 A

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Claims (11)

1. Reivindicações 1. Um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene que se liga de forma selectiva ao factor B dentro do terceiro domínio do consenso curto de repetição (SCR) e que se liga de forma selectiva ao factor B de pelo menos um humano e um rato, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene previne a formação de um complexo C3bBb. 2. 0 anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene se liga ao factor B e previne a segmentação do factor B pelo factor D. 3. 0 anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene se liga ao terceiro domínio de repetição de consenso curto (SCR) do factor B humano. 4. 0 anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene se liga de forma selectiva a um epítope no terceiro domínio de SCR do factor B, selecionado de um grupo que consiste em: (a) Um epítope do factor B que inclui pelo menos uma parte do factor B humano (SEQ ID NR: 2) compreendendo desde a posição Tyr 139 até à posição Ser 185, ou posições 1/9 equivalentes a estas numa sequência do factor B não humano; (b) Um epítope do factor B que inclui pelo menos uma parte do factor B humano (SEQ ID NR: 2) compreendendo desde a posição Tyr 139 até à posição Ser 141, ou posições equivalentes a estas numa sequência do factor B não humano; (c) Um epitope do factor B que inclui pelo menos uma parte do factor B humano (SEQ ID NR: 2) compreendendo desde a posição Glu 182 até à posição Ser 185, ou posições equivalentes a estas numa sequência do factor B não humano; e (d) Um epitope do factor B que inclui pelo menos uma parte do factor B humano (SEQ ID NR: 2) compreendendo qualquer uma ou mais das seguintes posições numa sequência do factor B não humano: Tyr 139, Cys 140, Ser 141, Glu 182, Gly 184 ou Ser 185. 5. 0 anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 1, em que o anticorpo é de um isótopo 0 anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 1, em que o anticorpo ou subclasse activadora de um não-complemento. 6. 0 anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal. 7. 0 anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 1, em que o fragmento de ligação de antigene é um fragmento Fab. 2/9 8. 0 anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado. 9. 0 anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo especificado.
2. 10. O anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo monovalente.
3. 11. O anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 1, em que o anticorpo é o anticorpo monoclonal 1379 produzido por ATCC Depósito Nr. PTA - 6230.
4. 12. O anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene se liga ao factor B no mesmo epítope que o anticorpo monoclonal 1379 produzido por ATCC Depósito Nr. PTA - 6230.
5. 13. Um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antigene que se liga de forma selectiva ao factor B, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene previne a formação de um complexo C3bBb; em que o anticorpo seu fragmento de ligação de antigene inibe de forma competitiva a ligação especifica do anticorpo monoclonal 1379 produzido por ATCC Depósito Nr. PTA - 6230 a um factor B humano ou de rato; e em que, quando o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene se liga ao factor B humano, a capacidade do anticorpo monoclonal 1379 ou seu fragmento de 3/9 ligação de antígene para inibir a via alternativa do complemento é inibida. 14. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígene de acordo com a reivindicação 13, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígene inibe de forma competitiva a ligação do anticorpo monoclonal 1379 ao factor B humano, onde a especificidade da ligação comparativa é determinada pelo ensaio de competição de anticorpo - anticorpo na presença do factor B humano.
6. 15. Um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígene que se liga de forma selectiva ao factor B humano, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígene previne a formação de um complexo C3bBb; em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígene inibe de forma competitiva a ligação específica de um segundo anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígene ao factor B humano; e em que o segundo anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígene se liga ao terceiro domínio SCR do factor B humano, e se liga de forma selectiva ao factor B de pelo menos um humano e um rato.
7. 16. Uma composição que compreende o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígene, de qualquer uma das reivindicações de 1 a 15.
8. 17. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígene de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12 para uso num método para reduzir ou prevenir a 4/9 hipersensibilidade das vias aéreas (AHR) ou a inflamação das vias aéreas num animal que tem, ou está em risco de vir a desenvolver hipersensibilidade das vias aéreas associada a inflamação ou inflamação das vias aéreas. 18. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 17 para uso tal como reivindicado na reivindicação 17, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene é administrado ao animal numa quantidade eficaz para reduzir de forma mensurável a hipersensibilidade das vias aéreas no animal, quando comparado com a administração anterior do anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene. 19. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 17 para uso tal como reivindicado na reivindicação 17, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene é administrado ao animal numa quantidade eficaz para reduzir de forma mensurável a hipersensibilidade das vias aéreas no animal, quando comparado com um nivel de hipersensibilidade das vias aéreas numa população de animais com inflamação em que o anticorpo seu fragmento de ligação de antigene não foi administrado.
9. 20. O anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 17 para uso tal como reivindicado na reivindicação 17, em que a administração do anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene diminui a sensibilidade do animal à metacolina ou a histamina. 5/9 21. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 17 para uso tal como reivindicado na reivindicação 17, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene é administrado com um transmissor farmacologicamente aceite selecionado do grupo que consiste em: um pó seco, dispersivel; etanol anidroso; pequenas cápsulas; lipossomas; um pulverizador nebulizado; e um excipiente injectável. 22. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 17 para uso tal como reivindicado na reivindicação 17, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene é administrado num transmissor ou dispositivo selecionado a partir do grupo que consiste em: etanol anidroso; um sistema de inalação de pó seco; sistema de inalação ultrasónica; inalador doseado pressurizado; e um dispositivo de medida de solução. 23. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 17 para uso tal como reivindicado na reivindicação 17, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene é administrado ao referido animal juntamente com um agente selecionado do grupo que consiste em: corticosteróides, β-agonistas (de curta ou de longa actuação), modificadores de leucotriene, antihistaminas, inibidores de fosfodiesterase, cromoglicato de sódio, Nedocromil, teofilina, antagonistas de citoquina, antagonistas receptores de citoquina, anti-IgE e inibidores da função da célula T. 6/9 24. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 17 para uso tal como reivindicado na reivindicação 17, em que o a referida hipersensibilidade das vias aéreas ou inflamação das vias aéreas está associada a uma doença seleccionada do grupo que consiste em asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumonia hipersensível, pneumonia de hipersensibilidade, pneumonia eosinofilica, enfisema, bronquiectasia da bronquite alérgica, fibrose cística, tuberculose, pneumonite hipersensível, asma ocupacional, sarcóide, síndroma da doença das vias aéreas reactivas, doença pulmonar intersticial, sindrome hipereosinofilica, rinite, sinusite, asma induzida pelo exercício físico, asma induzida pela poluição, asma da variante de tosse, doença pulmonar parasítica, infeção do vírus sincicial respiratório (RSV), infeção do vírus da parainfluenza (PIV), infeção do rinovírus (RV) e infeção do adenovírus. 25. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 17 para uso tal como reivindicado na reivindicação 17, em que a hipersensibilidade das vias aéreas está associada a inflamação alérgica. 26. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 17 para uso tal como reivindicado na reivindicação 17, em que a hipersensibilidade das vias aéreas está associada a asma. 27. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 17 para uso tal como reivindicado na 7/9 reivindicação 17, em que a hipersensibilidade das vias aéreas está associada a COPD. 28. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 para uso num método para reduzir ou prevenir a lesão isquémia e reperfusão num animal que tem, ou está em risco de vir a desenvolver, a lesão isquémia e reperfusão. 29. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene da reivindicação 28 para uso, tal como reivindicado na reivindicação 28, em que a lesão de isquémia e reperfusão é uma lesão de isquémia e reperfusão renal.
10. 30. O anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene de acordo com a reivindicação 28 para uso, tal como reivindicado na reivindicação 28, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene é administrado ao animal numa quantidade eficaz para inibir de forma mensurável os aumentos do nitrogénio da urea do soro no animal, quando comparado a situação de ausência de administração do anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene.
11. 31. O anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene de acordo com a reivindicação 28 para uso, tal como reivindicado na reivindicação 28, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene é administrado ao animal numa quantidade eficaz para diminuir de forma mensurável a lesão histológica dos tecidos do rim do animal, quando 8/9 comparado com a situação de ausência do anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene. 32. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene de qualquer uma das reivindicações de 17 a 31 para uso, tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações de 17 a 31, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene é administrado através da via selecionada do grupo que consiste em vias orais, nasais, tópicas, inaladas, intratraqueais, transdérmicas, rectais e parenterais. 33. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene de qualquer uma das reivindicações de 17 a 31 para uso, tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações de 17 a 31, em que o animal é um mamifero. 34. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação de antigene de qualquer uma das reivindicações de 17 a 31 para uso, tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações de 17 a 31, em que o animal é um humano. Lisboa, 31 de Outubro de 2013 9/9