PT1242442E - Processo para a purificação de adn de lasmídeo adaptável a outra escala - Google Patents

Description

ΡΕ1242442 1 DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DE ADN DE LASMIDEO ADAPTÁVEL A OUTRA ESCALA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com métodos, adaptáveis a outra escala, de isolamento de ADN de plasmideos de grau clinico, a partir de células microbianas . Os métodos exemplificados aqui descritos esboçam um protocolo adaptável a outra escala, economicamente favorável para a purificação de ADN de plasmideo de grau clínico de E. coli, o qual não se apoia em passos dispendiosos de cromatografia durante o processamento a jusante da preparação de plasmideos, tornando, dessa forma, esta metodologia especialmente adequada para procedimentos de purificação de plasmideos comerciais de grande escala.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os avanços na área de terapia de genes e vacinação de ADN criaram uma necessidade de produção e purificação em grande escala de ADN de plasmideos de grau clinico. Tal como foi apontado numa revisão recente (Prazeres et ai., 1999, TIBTech 17; 169-174), apesar de

trabalhos anteriores em metodologia de purificação de ADN 2 ΡΕ1242442 de plasmídeo em pequena escala, tem sido difícil fazer o "scale-up" da produção e da purificação de ADN de plasmídeo de grau clínico. Especialmente problemático têm sido os passos de processamento a jusante, os quais na sua maior parte se têm apoiado na lise alcalina das c'lulas colhidas, seguida de precipitação com acetato de amónio e outros passos de processamento mais a jusante apoiamdo-se fortemente em passos de exclusão dimensional, permuta aniónica e cromatografia de fase inversa. Adicionalmente, deve notar-se que o gasto de matérias primas, tais como resinas e tampões, para múltiplos passos de cromatografia se torna proibitivo devido ao alto custo unitário e baixa capacidade para as grandes moléculas de ADN. É sabido que o detergente catiónco CTAB e várias formas de sílica têm sido usados para as preparações de ADN de plasmídeos de pequena escala e não são concebidos para produzir vacina de plasmídeo de grau clínico. A capacidade de estes passos removerem certas impurezas não foi reconhecida nem o foi a sua utilidade para a concepção de processo adaptável a outra escala. Jones (1963, Nature, 199:280-2) revela o uso de CTAB para isolar ADN. Del Sal et al. (1989, Bio Techniques 7(5):514-519) e Gustincich et al., (1991, Bio Techniques 11(3):298-301) usam CTAB para precipitar ADN de plasmídeo a partir de lisados de E. coli em pequena escala e ADN genómico a partir de preparações de pequena escala de sangue humano inteiro, respectivamente. Ishaq et al (1990, Biotechniques 9(1):19-24) revelam a aplicação de ADN de plasmídeo precipitado com CTAB de pequena escala numa coluna PZ523 spin, resultando num produto purificado, o 3 ΡΕ1242442 qual é pelo menos adequado como um "template" para sub-clonagem e para sequenciamento dideoxi. Nenhuma desta técnica ensina ou sugere o uso de passos de precipitação com base em detergente para produzir lotes de ADN de plasmideo de grau clinico.

Vogelstein e Gillespie (1979, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 76(2): 615-619) revelam uma técnica para a separação de produtos digeridos de enzima de restrição de ADN a partir de géles de agarose, nos quais ADN na presença de iodeto de sódio concentrado é ligado a vidro (silica), lavado com etanol, e eluido a uma baixa concentração de sal. Boom et al. (1990, J. Clin. Microbiol. 28(3):495-503) e Cárter e Milton (1993, Nucleic Acid Res. 21(4):1044) revelam métodos para o isolamento de ADN de plasmideo os quais são adequados para o sequenciamento de ADN. O ADN de plasmideo na presença do agente caotrópico tiocianato de guanidium é ligado à silica na forma de uma terra de diatomáceas. O ADN de plasmideo imobilizado é lavado com etanol e eluido a baixas concentrações de sal. Variações subtis desta técnica são reveladas em (1) PCT Publication WO 91/10331; (2)PCT Publication WO 98/04730 bem como (3) Patente U.S No. 5 075 430, emitida para Little em 24 de Dezembro de 1999, a qual revela um método de isolar ADN de plasmideo o qual depende da adsorção do ADN em terra de diatomáceas na presença de um agente caotrópico seguido de separação e eluição do ADN; e (4) Patente U.S. No. 5 808 041, emitida para Padhye et al., em 15 de Setembro de 1998, a qual revela um método de isolamento de ácido nucleico 4 ΡΕ1242442 utilizando uma composição que inclui partículas de sílica gel e vidro na presença de um agente caotrópico. Novamente, estas técnicas não foram aplicadas com sucesso a metodologia para preparações de ADN de plasmídeo de grande escala requeridas para a geração de quantidades em gramas de ADN de plasmídeo para formulações de grau clínico, para administração a seres humanos e outros hospedeiros potenciais. A Patente U.S. No. 4 923 978, emitida para McCormick em 8 de Maio de 1990, revela o uso de sílica para purificar ADN por materiais proteicos preferencialmente ligantes. A Patente U.S. No. 5 576 196, emitida para Horn et al. Em 19 de Novembro de 1996, revela o uso de sílica para purificar ADN por ARN preferencialmente ligante.

As Patentes U.S. Nos. 5 523 392 e 5 525 319, emitidas para Woodard et al., em 4 de Junho de 1996 e 11 de Junho de 1996, respectivamente, revelam silicatos de boro, fosfosilicatos e silicatos de alumínio, os quais podem ser usados como superfícies de ligação para a purificação de ADN. O Pedido Internacional PCT/US96/20034 (número de publicação internacional wo 98/01464) revela o uso de silicato de cálcio hidratado para separar selectivamente compostos orgânicos de fluídos biológicos, tais como o 5 ΡΕ1242442 sangue. EP 0 832 897 revela uma composição de silicato de zircónio hidratado para a purificação de ácidos nucleicos.

De novo, nenhuma das referências acima identificadas fornece orientação adequada para o técnico com competência vulgar para fornecer uma metodologia para preparar lotes de ADN de plasmideo de grau clinico adaptáveis a outra escala, os quais sejam substancialmente livres de proteínas da célula hospedeira, endotoxinas da célula hospedeira, ADN genómico, ARN genómico e produtos de degradação de plasmídeos, tais como formas lineares e de círculo aberto. Com este fim, será extremamente útil identificar um processo de purificação de plasmideo adaptável a outra escala, o qual elimine o requisito de passos de cromatografia proibitivamente caros, enquanto que também fornece quantidades em gramas de uma preparação de ADN de plasmideo, a qual seja de grau clínico, para uso pelo menos em aplicações de vacinação humana e em de terapia de gene humana. A presente invenção aborda e satisfaz estas necessidades pela revelação de um processo de purificação de plasmideo adaptável a outra escala, o qual utiliza preferivelmente um detergente catiónico, tal como o CTAB, para precipitar selectivamente ADN de plasmideo, num passo a montante em combinação com passos a jusante de adsorção em descontínuo em grande escala usando silicato de cálcio cristalino, hidratado (aqui, "hcCaSi03"), ou qualquer composto de acção similar, para remover os contaminantes remanescentes, tais como ADN genómico, ARN genómico, proteína, endotoxina do hospedeiro e produtos de degradação 6 ΡΕ1242442 de plasmídeo, tais como formas lineares e de circulo aberto.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com métodos de isolamento de ADN de plasmídeo de grau clínico, a partir de células microbianas, métodos que representem um processo de produção adaptável a outra escala, económico, o qual forneça alternativas de grande escala para a produção e purificação de ADN de plasmídeo de grau clínico. A presente invenção relaciona-se, ainda, com vários processos de cerne de pós-lise, os quais contribuem para a natureza adaptável a outra escala, económica, do processo de purificação de ADN de plasmídeo. Mais especificamente, os passos de pós-lise incluem, mas não estão limitados a, (1) um passo de duas partes de precipitação/dissolução em que o ADN de plasmídeo é precipitado com um detergente (tal como o CTAB) de uma maneira quer em um passo quer em etapas, acoplada com a concentração e dissolução selectiva do ADN de plasmídeo precipitado por CTAB com uma solução de sal; (2) remoção de endotoxina e outras impurezas remanescentes por adsorção sobre silicato de cálcio cristalizado hidratado (hcCaSICb), de novo de uma forma quer em um só passo quer em etapas; e; (3) concentração do ADN de plasmídeo purificado por precipitação alcoólica (incluindo, mas não limitado a, etanol, metanol e isopropanol), ou um outro método de concentração, incluindo, mas não limitado a, ultrafiltração. Estes passos podem ser usados em combi- 7 ΡΕ1242442 nação, em outra combinação com passos de purificação adicionais conhecidos na técnica, e/ou em que pelo menos um dos passos acima mencionados é omitido, preferivelmente em combinação com outra metodologia conhecida na técnica como estando associada com a tecnologia de purificação de adn de plasmideo.

Os métodos da presente invenção permitem a purificação de ADN de plasmideo de grau clinico a partir de células microbianas, incluindo, mas não limitado a, células bacterianas, células de plantas, leveduras, baculovirus, sendo a E. coli o hospedeiro microbiano preferido. 0 ADN de plasmideo de grau clinico purificado pelos métodos descrito aqui é extremamente útil para a administração a seres humanos como um veiculo de terapia de gene ou vacina.

Uma vantagem do processo de purificação de plasmideo da presente invenção é em parte devida à descoberta de que a precipitação passo a passo de ADN com CTAB, em conjunto com a remoção de impurezas remanescentes por adsorção sobre hcCaSi03, remove impurezas problemáticas, incluindo ADN genómico, RN A, produtos de degradação de ADN, tais como ADN linear, com uma selectividade até agora desconhecida. Uma concepção de processo completo incorporando estes passos de precipitação/purificação está no cerne da invenção aqui revelada. 0 processo revelado também é adaptável a outra escala.

Uma outra vantagem do processo de purificação da ΡΕ1242442 presente invenção é a eliminação da necessidade de dispendiosas resinas de cromatografia com base em polímeros, através da abordagem alternativa de precipitação selectiva e adsorção para preparações de plasmídeos em grande escala.

Uma outra vantagem do processo de purificação da presente invenção é que é fundamentalmente passível de operação à escala de produção. As operações unitárias consistem de precipitação, filtração, adsorção e secagem. 0 uso de terra de diatomáceas fornece um bolo de filtração incompressível, ao mesmo tempo que evita problemas de obstrução frequentemente associados com os produtos de fermentação.

Uma outra vantagem do processo de purificação da presente invenção é que evita a necessidade de adicionar ARNase recombinante, uma enzima dispendiosa, para a remoção de ARN em cada vez mais passos durante o processo.

Uma outra vantagem do processo de purificação da presente invenção é que a precipitação com um detergente de cadeia longa, tal como o CTAB, fornece reduções nos volumes de processamento a jusante, as quais são importantes na deposição de correntes de residuos que contenham solventes à escala de produção.

Ainda uma outra vantagem do processo de purificação da presente invenção é que a precipitação com o álcool (tal como a etanólica) é uma forma ideal de obter um 9 ΡΕ1242442 produto, em volume, estável, o qual pode ser re-suspenso a elevadas concentrações sem o dano de corte antecipado, o qual ocorre durante a concentração com base em membranas. É um objecto da presente invenção fornecer um processo economicamente eficaz para a purificação em grande escala de ADN de plasmideo de grau clinico, a partir de hospedeiros procarióticos, tais como a E. coli. É ainda um outro objecto da presente invenção o fornecimento de passos de pós-lise, os quais resultem num processo adaptável a outra escala, económico, para a purificação de ADN de plasmideo em grande escala (i.e. adaptável a outra escala), incluindo mas não limitado aos passos de pós-lise de (i) precipitação do ADN de plasmideo com um detergente (tal como o CTAB) de uma maneira quer em um só passo quer em vários passos, acoplada com a concentração e a dissolução selectiva do ADN de plasmideo precipitado por CTAB com uma solução de sal; (II) remoção de endotoxinas e outras impurezas remanescentes por adsorção sobre silicato de cálcio cristalizado, hidratado (hcCaSi03) de uma maneira em um só passo ou em vários passos; e (III) concentração do ADN de plasmideo purificado por álcool (tal como uma precipitação por etanol) ou um outro método de concentração, incluindo mas não limitado a, ultrafiltração. Estes passos podem ser usados em combinação, em outra combinação com passos de purificação adicionais conhecidos na técnica, e/ou em que o primeiro dos passos acima mencionados é omitido, preferivelmente em combinação com 10 ΡΕ1242442 outra metodologia conhecida na técnica como estando associada com a tecnologia de purificação de ADN de plasmídeo. É ainda um outro objecto da presente invenção o fornecimento de métodos para um processo, eficaz em termos de custos, para a purificação em grande escala (i.e., adaptável a outra escala) de ADN de plasmídeo de grau clínico, a partir de hospedeiros procarióticos, o qual inclui os passo de: (i) lise de células; (ii) clarificação do lisado com filtração com auxílio de terra de diatomáceas; (iii) precipitação selectiva de ADN de plasmídeo usando brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB), seguida de filtração para recuperar um bolo de filtração contendo ADN de plasmídeo; (iv) dissolução selectiva do bolo de filtração contendo ADN de plasmídeo com solução de sal; (v) adsorção de impurezas residuais sobre silicato de cálcio hidratado seguida de filtração; e (vi) precipitação de ADN de plasmídeo purificado usando álcool (incluindo mas não limitado a álcool).

Tal como usados aqui interpermutavelmente, os termos "ADN de plasmídeo de grau clínico" e "ADN de plasmídeo de grau farmacêutico" referem-se a uma preparação de ADN de plasmídeo, isolado a partir de células procarióticas, a qual é de um grau de pureza aceitável para a administração a seres humanos para qualquer indicação profiláctica conhecida, incluindo mas não limitado a aplicações de terapia de gene e aplicações de vacinação de ADN. 11 ΡΕ1242442

Tal como usado aqui, "ADN de plasmídeo não super-enrolado" refere-se a qualquer ADN que não seja ADN de plasmídeo super-enrolado, incluindo qualquer outra forma de ADN de plasmídeo, tal como linear ou de círculo aberto fendido, bem como ADN genómico do hospedeiro.

Tal como usado aqui, "CTAB" refere-se a brometo de hexadeciltrimetilamónio ou — brometo de cetiltrimetilamónio — .

Tal como usado aqui, "hcCaSi03" refere-se a — silicato de cálcio cristalino hidratado —.

Tal como usado aqui, "tampão STET" refere-se a um tampão incluindo aproximadamente 50 mM de Tris-HCl (~pH 7,0 ~9,0), cerca de 50 - 100 mM EDTA, cerca de 8% de sacarose e cerca de 2% de Triton®-Xl00.

Tal como usado aqui, "IPA" refere-se a isopropanol --.

Tal como usado aqui, "ADNg" refere-se a — ADN genómico —.

Tal como usado aqui, "ARNg" refere-se a — ARN genómico—.

Tal como usado aqui, "LRA™" refere-se a

✓ TM agente de remoção de lipidos --. 12 ΡΕ1242442

Tal como usado aqui, "EDTA" refere-se a — ácido etilenodiaminotetraacético —.

Tal como usado aqui, "SC" refere-se a — super- enrolado —.

Tal como usado aqui, "OC" refere-se a — circular aberto —.

Tal como usado aqui, "NTU" refere-se a unidades de turbidez normalizadas —.

Tal como usado aqui, "1" refere-se a — litros —

Tal como usado aqui, "HPLC" refere-se a cromatografia liquida de alta eficiência —.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra o diagrama de fluxo do processo, incluindo um processo cerne de quatro passos, o qual remove os detritos de células por clarificação. A precipitação por CTAB passo a passo e a adsorção em silicato de cálcio removem o ARN, ADN, proteína e endotoxina do hospedeiro bem como produtos de degradação de plasmídeo ADN linear e de círculo aberto. É criado um pó, em volume, estável, por precipitação etanólica. 13 ΡΕ1242442 A Figura 2 mostra um perfil de concentração durante o passo de precipitação com CTAB. 0 ADN de plas-mídeo é precipitado sobre um incremento de detergente estreito. 0 passo é selectivo para a remoção de proteina, ARN e endotoxina que permaneçam solúveis. A Figura 3 mostra a dissolução selectiva de ADN de plasmideo por NaCl 0,2 M por electroforese em gel de agarose. O ADN genómico do hospedeiro é apenas parcialmente solúvel e é removido por filtração após a dissolução com NaCl 0,2 M. Em NaCl 1,2 Μ o ADNg é solúvel. A Figura 4A-D mostra a purificação por adsorção de impurezas em hcCaSi03 (LRA ) . (A) . Adsorção de equilíbrio de ADN de plasmideo vs concentração de cloreto de sódio. (B) . Adsorção de ADN genómico ou de hospedeiro, tal como medido por qPCR. LRA™ remove selectivamente o ADN após 5 hr de contacto com agitação a uma concentração de NaCl de 1,2 Μ. O rendimento em plasmideo é de cerca de 60%. (C). Adsorção selectiva de produtos de degradação de plasmideo em hcCaSi03 em NaCl 1,2 M. Electrof orese em gel de agarose de amostras da fase liquida em contacto com hcCaSi03 como função de concentração de hcCaSi03 (faixa 1: 32 g hcCaSi03/g ADN; faixa 2: 35 g hcCaSi03/g ADN; faixa 3: 40 g hcCaSi03/g ADN; faixa 4: 42 g hcCaSi03/g ADN; faixa 5: 45 g d hcCaSi03/ g ADN). São removidos multímeros (M), circulos abertos relaxados e lineares. (D) Adsorção selectiva de produtos de degradação de plasmideo sobre 14 ΡΕ1242442 hcCaSiC>3 em NaCl 0,5 Μ. A electroforese em gel e agarose de amostras de fase líquida em contacto com 32 g de hcCaSiC>3 por g de ADN total, como função do tempo (faixa 1: 3,3 hr, faixa 2: 6,2 hr, faixa 3: 10,8 hr, faixa 4: 21,5 hr). São removidos multímeros (M), círculos abertos relaxados e lineares. A Figura 5 mostra a precipitação de impurezas por meio de CTAB 0,25-0,30 % p/v usando um analisador de dimensão de partícula Lasentec®. A adição de CTAB 1% p/v em 40 mM de NaCl ao lisado clarificado em tampão STET é parada após 100 minutos com base na alteração brusca de contagens de partículas. As impurezas precipitadas são removidas por filtração. É adicionado CTAB adicional para precipitar o plasmídeo super-enrolado. A Figura 6 mostra a composição em ADN de amostras de passos de processo revelados na secção do Exemplo 1. O plasmídeo super-enrolado é visualizado na banda mais baixa. As bandas mais elevadas representam várias impurezas de ADN, incluindo plasmídeo de círculo aberto e linear, multímeros de plasmídeo e ADN genómico. Está representado o lisado clarificado de terra de diatomáceas (faixa 1, a partir da esquerda); filtrado passa alto de CTAB a 0,23% p/v (faixa 2); filtrado fracção passa baixo de CTAB a 0,30 % p/v, não contendo nenhum ADN (faixa 3); precipitado fracção passa baixo em NaCl 0,4 M (faixa 4); precipitado fracção passa baixo em NaCl 0,475 M (faixa 5); precipitado fracção passa baixo em NaCl 0,5 M (faixa 6); filtrado de 15 ΡΕ1242442 0,8 mícron a seguir ao passo de adsorção em hcCaSi03 (faixa 7); produto de hcCaSiC>3 sujeito a precipitação por etanol e re-dissolução em água esterilizada (faixa 8).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com uma metodologia adaptável a outra escala que representa alternativas de produção não dispendiosas para a produção de ADN de plasmideo de grau clinico. Mais especificamente, o cerne da invenção relaciona-se com vários passos a jusante (i.e., pós -lise) os quais incluem (1) um passo de duas partes de precipitação/dissolução, em que o ADN de plasmideo é precipitado com um detergente (tal como CTAB) de uma maneira quer num passo só quer em vários passos, acoplado com a concentração e dissolução selectiva, com uma solução de sal, do ADN de plasmideo precipitado com CTAB; (2) remoção de endotoxina e de outras impurezas remanescentes por adsorção sobre silicato de cálcio cristalizado, hidratado (hcCaSi03), novamente, de uma maneira quer em um só passo quer em vários passos; e; (3) concentração do ADN de plasmideo purificado por precipitação com base em álcool (incluindo mas não limitado a etanol-, metanol- ou isopropanol, ou outro método de concentração, incluindo mas não limitado a ultrafiltração. Tal como exemplificado aqui, os passos (1) e (2) estão associados com passos de filtração subsequentes para separar fisicamente várias impurezas de lisado de células do objecto do processo de purificação, o ADN de plasmideo super-enrolado. 16 ΡΕ1242442

Está dentro do âmbito da presente invenção adicionar ou subtrair elementos a estes três passos de cerne para formular um processo global de purificação, adaptável a outra escala, o qual resulte na recuperação de ADN de plasmideo de grau clinico. Por essa razão, tem-se a intenção de que o passo de precipitação de ADN de plasmideo com base em detergente possa ser omitido. Este processo simplificado pode incluir passos "não de cerne" adicionais para complementar o esquema de purificação global. No entanto, os passos de cerne de (1) precipitação por detergente e dissolução selectiva de sal, (2) adsorção em hcCaSiCb e (3) concentração de ADN de plasmideo, fornecerão mais provavelmente a base a partir da qual expandir os procedimentos de purificação, para resultar num processo global adaptável a outra escala que incorpore passos complementares adicionais. Estes passos complementares podem ser adicionados à discrição do técnico, dependendo da qualidade global de ADN de plasmideo que seja requerida para um lote especifico. Para este fim, são aqui apresentados vários exemplos de utilização destes três passos de cerne como uma base para um processo adaptável a outra escala global para exemplificar, mas certamente não limitar, a presente invenção. 0 técnico com competências pode voltar-se para passos de purificação de plasmideo conhecidos para fornecer um esquema o qual resulte numa pureza de ADN de plasmideo num grau apropriado. Por exemplo, Os Pedidos internacionais PCT Nos. PCT/US95/09749 (WO96/02658) e PCT/US96/07083 (WO96/36706) dão orientações para passos alternativos a jusante com base 17 ΡΕ1242442 em cromatografia, os quais podem ser utilizados em combinação com os passos de purificação de cerne mencionados neste parágrafo, para fornecer um protocolo de purificação eficaz. Ambas as revelações mostram eventos a jusante (subsequentes a um passo de permuta de calor) os quais incluem clarificação, ultrafiltração com benzonase para remoção de ADN e de proteína, permuta iónica para mais proteína e cromatografia de fase inversa para endotoxina, impurezas Lin/OC e uma ultrafiltração final para concentrar. De acordo com isto, se apenas for empregue hcCaSi03, um tal protocolo poderia ser precedido por clarificação, ultrafiltração e cromatografia de permuta iónica, tal como descrito em WO96/02658 e WO96/36706.

Um modelo de realização da presente invenção relaciona-se com um método de purificar ADN de plasmídeo super-enrolado a partir de um lisado de célula de uma fermentação microbiana, o qual inclui a precipitação de ADN de plasmídeo super-enrolado por uma precipitação induzida por detergente. Esta porção da invenção é exemplificada, mas não limitada a, pelo uso de detergente brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB). 0 detergente de interesse pode ser adicionado de uma maneira em um passo só ou em vários passos. Um exemplo da adição da maneira em vários passos do detergente é a adição passo a passo de CTAB (neste caso, alimentando uma solução de CTAB a 1% p/v a um lisado clarificado em tampão STET) com uma primeira precipitação induzida por CTAB de cerca de 0,25% a cerca de 0,28%, para separar por precipitação detritos e ADN de plasmídeo não 18 ΡΕ1242442

super-enrolado, seguida por uma segunda precipitação induzida por CTAB de cerca de 0,30% a cerca de 0,33%, para precipitar o ADN de plasmideo super-enrolado, coincidindo melhor estas gamas com o uso de um tampão de lise STET padrão (Tris-HCl aproximadamente 50 mM (- pH 7,0 - 9,0), EDTA a cerca de 50 - 100 mM, Sacarose a cerca de 8% e Triton(R) -X100 a cerca de 2%). Estará dentro da alçada do técnico com competências alterar as gamas de precipitação passo a passo para ajustar a quaisquer peculiaridades de vários sistemas tampão, incluindo mas não necessariamente limitado à inclusão de um detergente com base em Triton® ou do catião divalente EDTA dentro do tampão de lise, de forma tal que uma quantidade trabalhável de impurezas são primeiro separadas por precipitação da restante solução tampão incluindo ADN de plasmideo super-enrolado, o qual é então precipitado com uma precipitação adicional induzida por CTAB. Tal como foi notado acima em referência ao uso de um tampão STET padrão, também será útil adicionar compostos tais como EDTA e/ou detergentes com base em Triton® em concentrações úteis aos vários tampões para ajudar a promover a precipitação de ADN de plasmideo. Com este fim, é útil um tampão STET como um tampão de lise de células por conter quantidades eficazes de Triton® e de EDTA. Estes compostos estão, dessa forma, presentes durante o passo de lise, com o EDTA a inibir a actividade da ADNase por associação com iões de metal divalentes, os quais de outra forma activariam a ADNase. Adicionalmente, o Triton® dissolve a membrana da célula de E. coli. Ambos os componentes são levados para o(s) passo(s) de CTAB. O EDTA 19 ΡΕ1242442 continua a ter um papel favorável, dado que os iões de metal divalentes evitarão a complexação do plasmídeo com o CTAB. Mais importante é o efeito de Triton® em seleccionar uma concentração de CTAB eficaz, quer para uma fracção única ou passo a passo para precipitar o ADN de plasmideo super-enrolado. 0 Triton(R) interage com o CTAB, tornando necessário adicionar CTAB até um certo nivel limite (p. ex., 0,23%, 0,25%, 0,30%, etc com base numa solução de alimentação de CTAB a 1% adicionada a um lisado clarificado em tampão STET) antes de o ADN de plasmideo super-enrolado poder precipitar. Por essa razão, a gama de concentração de CTAB é dependente de ambas as concentrações de Triton® e de ADN. Com este fim, é atribuída uma gama passo a passo de, por exemplo, CTAB 0,25% - 0,28% e CTAB 0,28% - 0,33% (novamente com base numa alimentação de CTAB a 1% p/v), no seguinte: a quantidade de fracção passa alto é uma função da concentração de Triton®, dado que o Triton® se liga a 22 moléculas de CTAB por micela de Triton®, assumindo-se que cada micela contém 140 moléculas de Triton®, enquanto que a quantidade fracção passa baixo é uma função da concentração de ADN, dado que cada molécula de plasmídeo se liga a 0,9 equivalentes de CTAB por cada unidade de repetição de nucleótido de ADN. Neste caso particular, o qual é esquematizado no Exemplo 1, a gama citada de 0,25% - 0,28% de CTAB para a precipitação fracção passa alto corresponde à adição de uma solução de CTAB a 1% a um tampão STET de lisado o qual contém 1% de Triton®. A gama de fracção passa baixo de 0,28 - 0,33% corresponde à adição de uma solução de CTAB a 1% à solução de fracção passa alto filtrada, a 20 ΡΕ1242442 qual foi derivada de uma solução original de lisado clarificada, a qual continha 0,34 mg/ml de ADN de plasmideo de cerca de 84% de pureza. O técnico pode acertar melhor a quantidade de CTAB (quer para uma precipitação única ou passo a passo de ADN de plasmideo super-enrolado) com um tampão particular, tal como descrito quer na Secção do Exemplo 1 (inspecção visual da precipitação de ADN), quer na Secção do Exemplo 2 (usando um analisador de dimensão de partículas para inspeccionar a precipitação de ADN). No último exemplo, quando se usa um tampão STET padrão, o técnico verificará a precipitação com uma sonda de turbidez em tempo real Lasentec®, sabendo que está terminada a cerca de 0,25% por correlacção desta concentração de CTAB com a concentração de Triton®, a qual é constante de batelada para batelada (estabelecida na lise). O mesmo procedimento é então completado com Lasentec® à medida que o ADN precipita, sabendo que há cerca de 1 mg/ml de ADN o qual corresponde ao incremento de 0,03% (diferencial de 0,25 a 0,28) requerido para precipitar. O técnico estará ao corrente destes números no caso de não haver nenhum Triton® (ou concentrações de Triton® as quais difiram de um tampão STET padrão), bem como uma abordagem de lise NaOH/KOAc, ou se a fermentação resulta numa concentração de plasmideo muito diferente. Por essa razão, o primeiro afecta a quantidade fracção passa alto e o segundo afecta a quantidade fracção passa baixo de CTAB. É preferido que uma gama de fracção passa alto e de fracção passa baixo seja determinada por um analisador de dimensão de partícula, tal como um analisador de dimensão de partícula Lasentec®. Este 21 ΡΕ1242442 método aumenta a precisão para definir mais proximamente as gamas de fracção passa alto e pasa baixo, dado que a precipitação de plasmideo com base em CTAB ocorre numa gama apertada de CTAB. Por essa razão, estas gamas podem ser aproximadas pela medição de variáveis importantes (tais como concentração de Triton® e de ADN de plasmideo) e também podem ser identificadas especificamente quer visualmente quer, preferivelmente, por análise, conduzida por equipamento, das partículas em solução a várias concentrações de CTAB. É aqui exemplificado que o uso de um tampão STET padrão e de uma solução de CTAB a 1% p/v (em NaCl a 40 mM) resulta em fracções de CTAB passa baixo e passa alto óptimas de aproximadamente 0,25 - 0,28% p/v (baixo) e 0,30 - 0,33 % (alto). Será compreendido que tais valores se aplicam a situações nas quais o CTAB é alimentado ao lisado clarificado em tampão STET usando uma solução de alimentação de CTAB a 1% p/v. É aceitável, apenas por exemplo, duplicar a concentração da solução de alimentação de CTAB (p. ex., uma alimentação de CTAB a 2% p/v) e adicionar metade do volume (para a mesma massa de CTAB). Neste caso, as concentrações de fracção passa alto e de fracção passa baixo seriam aproximadamente 0,29 - 0,33 % e 0,35 - 0,40 %, respectivamente. Estes números são facilmente normalizados por conversão de um valor numérico com base numa percentagem peso/volume (% p/v) a um processo simples com base na massa de CTAB adicionada por litro de lisado clarificado. Por exemplo, no mesmo cenário que exemplificado na Secção do Exemplo 1 (um tampão STET padrão) uma concentração de CTAB de fracção passa alto 22 ΡΕ1242442 seria alcançada pela adição de 3,3 a 3,9 g de CTAB por litro de lisado clarificado, enquanto que uma concentração de CTAB de fracção passa baixo seria atingida pela adição (para além da adição inicial de fracção passa alto) de CTAB até uma quantidade final de desde 4,3 a 5,0 g de CTAB por litro de lisado clarificado. Um passo de detergente com base em CTAB, único ou passo a passo, será associado com um passo de filtração, para gerar um precipitado de bolo de filtração (contendo ADN de plasmideo super-enrolado) para dissolução subsequente do sal. Adicionalmente, a concentração de adn de plasmideo super-enrolado por meio de precipitação por etanol ou ultrafiltração permanece um passo a jusante adicional. O uso de uma precipitação com base em álcool (tal como o etanol) é preferido na medida em que é possivel, tal como mostrado aqui, precipitar finalmente e concentrar mais o ADN super-enrolado por meio de precipitação com etanol, resultando num precipitado em pó contendo o ADN de plasmideo super-enrolado. Será evidente que este passo a jusante pode ser utilizado com qualquer uma das várias combinações de passos anteriores, para purificar finalmente o ADN de plasmideo super-enrolado em relação a quaisquer impurezas remanescentes, enquanto que também se concentra o ADN de plasmideo e se permite a re-suspensão num volume de tampão mais fácil de trabalhar. Este modelo de realização também implica os processo(s) descrito(s) neste parágrafo, em combinação com pelo menos a adição de um passo, o qual inclua, mas não esteja necessariamente limitado a, clarificação do lisado de célula antes de adição de CTAB. É usada terra de 23 ΡΕ1242442 diatomáceas (DE) para exemplificar este passo, mas outros componentes podem substituir a DE para clarificar o lisado de célula, incluindo, mas não limitado a, outros auxiliares de filtração com base em celulose, tais como Solka Floc e Esosorb (Graver). A DE, ou outro material usado para clarificar o lisado de célula, pode ser removida por qualquer técnica de separação liquido-sólido conhecida na técnica, incluindo, mas não limitado de forma nenhuma a, filtração e centrifugação. Qualquer processo que incorpore um passo de clarificação de lisado também pode incorporar os passos de concentração aqui revelados, incluindo mas não limitado a precipitação com etanol ou ultrafiltração, tal como aqui discutido. A presente invenção fornece um método de purificação de ADN de plasmideo super-enrolado a partir de um lisado de célula de uma fermentação microbiana, em que o passo de cerne é a adição de um silicato de cálcio cristalizado, hidratado (hcCaSi03) ao lisado de célula. É mostrado aqui que uma adição única ou passo a passo de hcCaSi03 ao lisado de célula resulta em separação por adsorção de impurezas residuais em relação ao ADN de plasmideo super-enrolado. Tal como foi notado anteriormente, um outro aspecto desta porção da invenção relaciona-se com o (s) passo(s) de adsorção dos parágrafos prévios, em conjunto com pelo menos a adição de um passo, o qual inclua, mas não esteja necessariamente limitado a, clarificação do lisado de célula antes da adição de CTAB. De novo, a DE exemplifica, mas limita este passo adicional. Qualquer uma 24 ΡΕ1242442 das combinações de passos de processo referidas neste parágrafo também podem incorporar um passo de concentração de ADN de plasmideo super-enrolado, incluindo mas não limitado a precipitação com etanol ou ultrafiltração, tal como descrito aqui. A adição de um ou mais passos, para além de um passo de adição de hcCASiCb (tal como clarificação de lisado e/ou um passo de concentração com etanol ou ultrafiltração), pode ocorrer quer sejam utilizados passos de adsorção únicos ou passo a passo. Neste estágio do cerne de um esquema de purificação as principais impurezas são CTAB, endotoxina, adn genómico e produtos de degradação de plasmideos. Outras impurezas residuais (presentes a concentrações mais baixas) incluem proteínas, ARN e talvez Triton®. O silicato de cálcio hidratado ligar-se-á a todas estas impurezas. A quantidade exacta de hcCaSi03 requerida para adição é governada por (1) a quantidade de impureza presente; (2) as condições do tampão (i.e., concentração de sal) e (3) talvez outras variáveis, as quais incluem a temperatura e o tipo de sal utilizado ao longo do processo de purificação. A quantidade de impurezas presente pode depender de, mas não necessariamente limitado a, (i) quanto CTAB foi adicionado, se foi de todo usado algum, (ii) diferenças de lote para lote no caldo de fermentação, as quais podem afectar a massa de ADN genómico, produtos de degradação de plasmideo e endotoxina, e (iii) o procedimento de lise empregado, o qual também pode afectar a quantidade de ADN genómico, produtos de degradação de plasmideo e endotoxina. Tendo em vista estas variáveis, será evidente que a quantidade de hcCaSiCb a ser 25 ΡΕ1242442 adicionada durante um ensaio especifico pode variar. É antecipado que uma quantidade de hcCaSi03 a ser adicionada estaria na gama de até cerca 200 gramas/litro, dependendo das condições descritas acima, bem como de diferenças potenciais dependendo do lote de hcCaSi03 tornado disponível durante esse ensaio especifico. A secção de Exemplo 1 dá orientações para uma gama de desde cerca de 25 gramas/litro até cerca de 75 gramas/litro. Mas, de novo, as condições para a adsorção de hcCaSi03 podem alterar a escala, para cima ou para baixo, em relação às condições explicadas acima, necessitando, por essa razão, de adição de hcCaSi03 numa extremidade superior da gama, próximo de 200 gramas/litro. Adicionalmente, é mostrado aqui que uma concentração mais elevada de NaCl aumenta a capacidade de LRA™ para ADN e outras impurezas. O efeito de LRA™ apenas para o ADN de plasmideo é mostrado na Figura 4A, mas uma concentração elevada de sal também parece aumentar a capacidade do LRA™ para se ligar ao ADN genómico e outras impurezas. Por essa razão, será útil em algumas circunstâncias considerar concentrações de sal mais elevadas, o que permitiria o uso de uma quantidade menor do hcCaSi03 respectivo. É esperado que concentrações de sal úteis possam estar na gama de, por exemplo com NaCl, até cerca de 5 M de NaCl.

Um outro modelo de realização da presente invenção relaciona-se com uma purificação de um ADN de plasmideo super-enrolado a partir de um lisado de célula de uma fermentação microbiana, a qual inclui a incorporação de 26 ΡΕ1242442 três passos de processo distintos, nomeadamente (i) precipitação do ADN de plasmideo super-enrolado por meio de uma precipitação induzida por detergente e re-dissolução do bolo de filtração resultante numa solução de sal; (ii) adicionando hcCaSi03 ao plasmideo super-enrolado re-dissolvido para retirar por adsorção impurezas residuais do ADN de plasmideo super-enrolado, resultando numa solução contendo o ADN de plasmideo super-enrolado; e (iii) concentração do ADN de plasmideo super-enrolado. De novo, um exemplo de detergente é o CATB, o qual pode ser adicionado numa forma num passo único ou passo a passo, aqui exemplificado em parte por uma adição passo a passo do detergente (CTAB, como uma alimentação a 1% p/v) num tampão de lisado com base em STET com uma primeira fracção a um [CTAB] de desde cerca de 0,25% a cerca de 0,28% e uma segunda fracção a [CTAB] de desde cerca de 0,30% a cerca de 0,33%. Tal como notado ao longo desta especificação (e exemplificado na secção de Exemplo 1 (indicação visual) e secção de Exemplo 2) está na alçada do técnico com competências, em posse desta especificação, alterar as gamas de precipitação passo a passo para ajustar a quaisquer peculiaridades de vários sistemas de tampão, de forma tal que uma quantidade de impurezas passível de ser trabalhada é primeiro removida por precipitação da solução de tampão remanescente incluindo ADN de plasmideo super-enrolado, o qual é depois precipitado com uma precipitação adicional induzida por CTAB. De novo, também será útil adicionar componentes de tampão, tais como EDTA e/ou detergentes com base em Triton®, em concentrações úteis para os vários 27 ΡΕ1242442 tampões, para ajudar a promover a precipitação de ADN de plasmídeo. Uma dissolução de sal do bolo de filtração recuperado (incluindo ADN de plasmideo super-enrolado) é realizada numa solução tampão de força iónica e composição óptimas. 0 sal é adicionado até uma concentração óptima para dissolver o plasmideo, ao mesmo tempo que não dissolve o ADN genómico e outras impurezas. Esta concentração é determinada pela medição da concentração de plasmideo super-enrolado em solução para vários incrementos de sal ou, indirectamente pela medição da viscosidade da solução. Passos adicionais (um ou qualquer combinação) aos passos de cerne acima mencionados podem incluir, mas não estão limitados a, clarificação de lisado e/ou um passo de concentração com etanol ou ultrafiltração, tal como discutido aqui.

Um outro modelo de realização inclui a incorporação de passos adicionais, nomeadamente uma clarificação adicional do lisado de célula, ao processo de cerne para fornecer um esquema de purificação melhorado. Este modelo de realização da invenção particular inclui passos de processamento a jusante os quais incluem (i) clarificação de lisado, preferivelmente com filtração com auxilio de terra de diatomáceas, ou centrifugação (ii) precipitação única ou passo a passo de ADN de plasmideo com um detergente, tal como o CTAB, dissolução com sal do bolo de filtração resultante; (iii) remoção das impurezas remanescentes por adsorção única ou passo a passo sobre hcCaSi03; e (iv) precipitação alcoólica subsequente (p. 28 ΡΕ1242442 ex., com etanol) do ADN de plasmídeo purificado, o que fornece um produto, em volume, estável, a partir do qual podem ser preparadas facilmente soluções de formulações concentradas.

Um outro modelo de realização da presente invenção, o qual se apoia em passos adicionais para além do processo de cerne, inclui um passo a montante de lise de célula, o qual pode ser levado a cabo por qualquer número de processos agora disponíveis para o técnico com competências. Por essa razão, a combinação de passos de processo pode incluir um passo de lise de célula para incluir, por exemplo os processos seguintes: (i) lise de célula; (ii) clarificação de lisado, tal como discutido aqui, (iii) precipitação única ou passo a passo de ADN de plasmídeo com um detergente, tal como o CTAB; (iv) dissolução selectiva de plasmídeo com solução de sal; (v) remoção de impurezas remanescentes por adsorção única ou passo a passo sobre hcCaSi03; e (vi) precipitação alcoólica (p. ex., etanólica) do ADN de plasmídeo purificado, o que fornece um produto, em volume, estável, a partir do qual podem ser facilmente preparadas soluções de formulação concentradas. Quaisquer métodos de lise de células são contemplados para este passo de montante. A metodologia de lise de célula preferida é revelada aqui.

Um modelo de realização adicional da presente invenção relaciona-se com um processo pelo qual um passo adicional de clarificação de lisado é combinado com os 29 ΡΕ1242442 passos de cerne de processo, lise de célula e um passo dissolução com sal, resultando no seguinte processo passo a passo incluindo, mas não limitado aos passos de, (i) lise de célula; (ii) clarificação de lisado, preferivelmente com filtração com auxilio de terra de diatomáceas, ou centrifugação; (iii) precipitação selectiva de ADN de plasmideo com um detergente, tal como o CTAB; (iv) dissolução selectiva do adn do plasmideo com solução de sal; (v) adsorção de impurezas residuais sobre hcCaSi03; e (vi) precipitação de ADN de plasmideo purificado usando álcool (tal como o etanol). São discutidas aqui as alternativas ao uso de CTAB para precipitação de plasmideo, a precipitação alcoólica e os materiais de clarificação.

Os métodos da presente invenção permitem a purificação de ADN de plasmideo de grau clinico, a partir de células microbianas incluindo, mas não limitado a, células bacterianas, células de plantas, leveduras, baculovirus, sendo a E. coli o hospedeiro microbiano preferido. 0 ADN de plasmideo de grau clinico purificado pelos métodos aqui descritos é extremamente útil para a administração a seres humanos como um veiculo de terapia de gene ou uma vacina. A presente invenção relaciona-se com uma metodologia de grande escala, a qual representa alternativas de produção não dispendiosas para a produção de ADN de plasmideo de grau clinico. A essência da invenção centra-se à volta de vários passos de processo a jusante os 30 ΡΕ1242442 quais incluem (i) precipitação passo a passo de ADN de plasmídeo com CTAB; (ii) dissolução selectiva de plasmídeo com solução de sal; (iii) remoção das impurezas remanescentes por adsorção sobre silicato de cálcio cristalizado, hidratado; seguida de concentração do produto final. O cerne da presente invenção inclui os passos acima num processo de concepção adaptável a outra escala para gerar preparações de adn de plasmídeo adequadas para a administração a seres humanos. A presente invenção relaciona-se com métodos de isolamento de ADN de plasmídeo de grau clínico a partir de células microbianas. Os métodos de purificação de plasmídeo da presente invenção são baseados, em parte, em operações que incluem, mas não necessariamente limitadas a: (i) lise de célula; (ii) clarificação de lisado com filtração com auxílio de terra de diatomáceas; (iii) precipitação passo a passo de adn de plasmídeo com ctab, na presença de uma quantidade útil de terra de diatomáceas; (iv) dissolução selectiva da pélete de CTAB com uma solução de sal; (v) remoção das impurezas remanescentes por adsorção sobre silicato de cálcio cristalizado hidratado; e (vi) precipitação alcoólica subsequente do ADN de plasmídeo purificado, o que fornece um produto, em volume, estável, a partir do qual podem ser facilmente preparadas soluções de formulação concentradas.

Num aspecto preferido da invenção, a preparação de plasmídeo em grande escala envolve vários passos de 31 ΡΕ1242442 processamento a jusante os quais incluem (i) precipitação passo a passo de ADN de plasmídeo com CTAB; (ii) dissolução selectiva de plasmideo com solução de sal; (iii) remoção das impurezas remanescentes por adsorção sobre silicato de cálcio cristalizado hidratado; e, (iv) preferivelmente, a subsequente precipitação alcoólica (tal como etanólica) do ADN de plasmideo purificado, o que fornece um produto, em volume, estável, a partir do qual podem ser facilmente preparadas soluções de formulação concentradas. Será do conhecimento do técnico com competências que os aspectos do processo de concepção são interpermutáveis, incluindo o passo (iv), tal como revelado aqui.

Em um outro modelo de realização preferido da presente invenção, a lise de célula é seguida por filtração com terra de diatomáceas numa quantidade a qual clarifica efectivamente o lisado de célula. Este passo inicial é seguido, pelo menos, pelos passos a jusante adicionais, tal como notado acima; nomeadamente (i) precipitação passo a passo de ADN de plasmídeo com CTAB; (ii) dissolução selectiva de plasmídeo com solução de sal; (iii) remoção de impurezas remanescentes por adsorção sobre silicato de cálcio cristalizado hidratado; e (iv) preferivelmente, uma precipitação etanólica do ADN de plasmideo purificado.

Em um outro modelo de realização preferido da presente invenção, a lise completa de células antes de clarificação do lisado envolve a transferência de células colhidas do caldo de fermentação directamente, quer com 32 ΡΕ1242442 quer sem tratamento com lisozima, preferivelmente com um tratamento com lisozima, através de um equipamento de permuta de calor, tal como revelado nos Pedidos Internacionais PCT Nos. PCT/US95/09749 (WO96/02658) e PCT/US96/07083 (WO96/36706). Este passo de lise é seguido pela inclusão dos passos seguintes subsequentes à lise de célula, incluindo, mas não limitado a, (i) uma precipitação selec-tiva em dois passos de adn de plasmídeo usando detergente catiónico, preferivelmente CTAB; (ii) dissolução selectiva de plasmídeo com uma solução de sal; (iii) adsorção de impurezas residuais sobre silicato de cálcio hidratado; e (iv) precipitação de ADN de plasmídeo purificado usando um álcool (incluindo, mas não limitado a, etanol, metanol ou isopropanol) antes da formulação final da preparação de plasmídeo de grau clínico. Com este fim, este aspecto da invenção relaciona-se com um método para a purificação de ADN de plasmídeo super-enrolado a partir de uma fermentação microbiana, o qual inclui (a) colheita de células microbianas a partir de um caldo de fermentação; (b) re-suspensão das células colhidas em tampão STET padrão e adição às células microbianas colhidas uma quantidade suficiente de uma solução de lise; (c) aquecimento das células microbianas do passo b) a uma temperatura entre cerca de 60°C a cerca de 70°C até cerca de 100°C, num permutador de calor de fluxo contínuo para formar um lisado de célula; (d) arrefecimento do lisado de célula; (e) clarificação do lisado de célula usando filtração com terra de diatomáceas; (f) precipitação dos detritos de células residuais e impurezas com uma primeira precipitação 33 ΡΕ1242442 induzida por cetiltrimetilamónio; (g) precipitação selec-tiva de ADN de plasmideo super-enrolado com uma segunda precipitação induzida por cetiltrimetilamónio; re-disso-lução do ADN de plasmideo super-enrolado num tampão incluindo NaCl na gama de 0,2 m a 2 m; (i) adsorção de impurezas residuais sobre silicato de cálcio cristalizado, hidratado, dentro do passo do tampão (h); (j) precipitação do ADN de plasmideo super-enrolado com etanol; (k) filtração para recolher e lavar o precipitado; (1) secagem para remover o etanol; (m) re-dissolução do ADN de plasmideo super-enrolado purificado num tampão de formulação fisiologicamente aceitável; e, (n) esterilização por filtração através de um filtro de 0,22 pm. Também está dentro do âmbito desta porção da invenção omitir os passos (j) - (n), ao mesmo tempo que se esteriliza o tampão do passo (i), seguido de concentração do ADN por meio de precipitação com etanol, resultando num precipitado em pó contendo o ADN de plasmideo super-enrolado. Tal como descrito aqui, o primeiro e o segundo passos de precipitação induzida por CTAB (via uma alimentação de CTAB a 1% p/v num tampão STET padrão) podem efectivamente estar na gama de desde cerca de 0,25% a cerca de 0,28% primeira fracção e de desde cerca de 30% a cerca de 0,33% para uma segunda fracção. É notado, de novo, que está dentro da alçada do técnico com competências, em posse desta especificação, alterar as gamas de precipitação passo a passo para ajustar a quaisquer peculiaridades em vários sistemas de tampão, de uma forma tal que uma quantidade de impurezas passível de ser trabalhada é primeiro separada 34 ΡΕ1242442 por precipitação da solução de tampão remanescente que inclui o ADN de plasmideo super-enrolado, o qual é então precipitado com uma precipitação adicional induzida por CTAB. Podem ser adicionadas componentes, tais como EDTA e/ou detergentes com base em Triton, tal como discutido aqui, sendo úteis em concentrações biologicamente efectivas dentro dos vários tampões, para ajudar a promover a precipitação de ADN de plasmideo.

Num outro modelo de realização preferido da presente invenção, a lise completa antes da clarificação do lisado envolve a transferência de células colhidas do caldo de fermentação ou do caldo de fermentação directamente, quer com ou sem lisozima, preferivelmente na presença de lisozima, através de um equipamento de permuta de calor, tal como revelado nos Pedidos Internacionais PCT Nos. PCT/US 95/09749 (WO96/02658) e PCT/US96/07083 (WO96/36706) . Este procedimento de lise de células inicia o protocolo, o qual inclui, mas não está limitado a, (i) clarificação de lisado com filtração auxiliada por terra de diatomáceas; (ii) uma precipitação selectiva de um passo de ADN de plasmideo usando um detergente catiónico, preferivelmente CTAB; (iii) dissolução selectiva de plasmideo com uma solução de sal; (v) adsorção de impurezas residuais sobre silicato de cálcio hidratado; e (v) precipitação do ADN de plasmideo purificado usando um álcool, antes da formulação final da preparação de plasmideo de grau clinico. Com este fim, este aspecto da invenção relaciona-se com um método para a purificação de ADN de plasmideo super-enrolado a 35 ΡΕ1242442 partir de um lisado de célula de uma fermentação microbiana em grande escala, o qual inclui: (a) colheita de células microbianas de um caldo de fermentação; (b) re-suspensão das células colhidas num tampão STET padrão e adição, às células microbianas colhidas, de uma quantidade suficiente de uma solução de lise; (c) aquecimento das células microbianas do passo (b) até uma temperatura entre 60 °C e 70 °C até cerca de 100 °C num permutador de calor de fluxo continuo para formar um lisado de célula; (d) arrefecimento do lisado de célula; (e ) clarificação do lisado de célula usando filtração com terra de diatomáceas; (f) precipitação de ADN de plasmideo super-enrolado com brometo de cetiltrimetilamónio; (g) re-dissolução do ADN de plasmideo super-enrolado num tampão incluindo NaCl na gama de 0,2 m a 2 m; (h) adsorção de impurezas residuais sobre silicato de cálcio cristalino, hidratado, dentro do tampão do passo (g) ; (i) precipitação do ADN de plasmideo super-enrolado com etanol; (j) filtração para recolher e lavar o precipitado; (k) secagem para remover o etanol; (1) re-dissolução do ADN de plasmideo super-enrolado purificado num tampão de formulação fisiologicamente aceitável; e, (m) esterilização por filtração através de um filtro de 0,22 pm. Também está dentro do âmbito desta porção da invenção omitir os passos (i) - (m) enquanto se esteriliza o tampão do passo (h), seguido de concentração de ADN por meio de precipitação com etanol, resultando num precipitado em pó contendo o ADN de plasmideo super-enrolado. Uma temperatura de lise preferida do passo (b) é de desde cerca de 70 °C a cerca de 80 °C, enquanto que uma única fracção de CTAB pode 36 ΡΕ1242442 ser preferivelmente a uma concentração de CTAB de desde cerca de 0,30 % a cerca de 0,33 % (via uma alimentação de CTAB a 1% p/v num tampão STET padrão), sendo, de novo, possivelmente influenciado pelas condições do tampão. Tal como foi notado noutro local, os componentes do tampão tais como o EDTA e o Triton, estão disponíveis para adição a tampões para melhorar a recuperação de ADN de plasmídeo.

Em ainda um outro modelo de realização preferido, a lise de células é levada acabo por modificação das técnicas tal como descrito por Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acid res. 7: 1513 - 1523), a modificação na qual as células são lisadas usando hidróxido de sódio diluído seguido de neutralização com KOAc. Este passo de lise de células é então seguido por inclusão dos passos seguintes subsequentemente à lise de células, incluindo, mas não limitado a, (i) clarificação do lisado com filtração auxiliada por terra de diatomáceas, (ii) precipitação selectiva de ADN de plasmídeo usando um detergente catiónico, preferivelmente CTAB, (iii) dissolução selectiva de plasmídeo com uma solução de sal e (iv) adsorção de impurezas residuais sobre silicato de cálcio hidratado antes da formulação final da preparação de plasmídeo de grau clínico. Com este fim, um aspecto desta porção da invenção relaciona-se com um método para a purificação de ADN de plasmídeo super-enrolado a partir de um lisado de célula de uma fermentação microbiana em grande escala, a qual inclui: (a) colheita de células microbianas de um caldo de fermentação; (b) re-suspensão das células colhidas 37 ΡΕ1242442 num tampão de STE padrão e adição às células microbianas colhidas de uma quantidade suficiente de lisozima/solução alcalina/KOAc para promover a lise das células, formando um lisado de célula; (c) clarificação do lisado de células usando filtração com terra de diatomáceas; (d) precipitação de impurezas e dos detritos de célula residuais com uma primeira precipitação induzida por cetiltrimetilamónio; (e) precipitação selectiva de adn de plasmideo super-enrolado com uma segunda precipitação induzida por cetiltrimetilamónio; (f) re-dissolução do ADN de plasmideo super-enrolado num tampão incluindo NaCl na gama de 0,2 m a 2 m; (g) adsorção de impurezas residuais sobre silicato de cálcio cristalizado hidratado com o tampão do passo (f); (h) precipitação do ADN de plasmideo super-enrolado com etanol; (i) filtração para recolher e lavar o precipitado; (j) secagem para remover o etanol; (k) re-dissolução de ADN de plasmideo super-enrolado purificado num tampão de formulação fisiologicamente aceitável; e, (1) esterilização por filtração através de um filtro de 0,22 μηι. Também está dentro do âmbito desta porção da invenção omitir os passos (h) - (1) enquanto se esteriliza o tampão do passo (g), seguido por concentração de ADN por meio de precipitação com etanol, resultando num precipitado em pó contendo o ADN de plasmideo super-enrolado. Tal como foi aqui descrito, o primeiro e o segundo passos de precipitação induzida por CTAB (via uma alimentação de CTAB a 1% p/v num tampão STET padrão) pode efectivamente estar na gama de desde cerca de 0,25% a cerca de 0,28% primeira fracção e de desde cerca de 30% a cerca de 0,33% para uma segunda fracção. É de novo 38 ΡΕ1242442 notado que está dentro da alçada do técnico com competências, estando em posse desta especificação, alterar as gamas de precipitação passo a passo para ajustar a quaisquer peculiaridades de vários sistemas de tampão, de uma forma tal que uma quantidade de impurezas passível de ser trabalhada é primeiro retirada por precipitação da solução de tampão remanescente contendo o ADN de plasmídeo super-enrolado, o qual é então precipitado com uma precipitação adicional induzida por CTAB. Os componentes de tampão, tais como o EDTA e/ou detergentes com base em Triton, podem ser adicionados, sendo tais componentes úteis em concentrações biologicamente efectivas dentro dos vários tampões para ajudar a promover a precipitação de ADN de plasmídeo.

Em outro modelo de realização preferido; a lise de células é levada acabo pelo método modificado de Birnboim & Doly, onde, tal como foi notado acima, as células são lisadas usando hidróxido e sódio diluído seguido de neutralização com KOAc. Este passo de lise de células é então seguido pela inclusão dos seguintes passos subsequentes à lise de células, incluindo, mas não limitado a, (i) clarificação de lisado com filtração com auxílio de terra de diatomáceas, (ii) precipitação selectiva de ADN de plasmídeo usando um detergente catiónico, preferivelmente CTAB, (iii) dissolução selectiva de plasmídeo com uma solução de sal e (iv) adsorção de impurezas residuais sobre silicato de cálcio hidratado; e (v) precipitação do ADN de plasmídeo purificado usando etanol, antes da formulação 39 ΡΕ1242442 final da preparação de plasmídeo de grau clínico. Um aspecto desta porção da invenção relaciona-se com um método para a purificação de ADN de plasmídeo super-enrolado a partir de um lisado de célula de uma fermentação microbiana de grande escala, o qual inclui (a) colheita de células microbianas de um caldo de fermentação de grande escala; (b) re-suspensão das células colhidas num tampão STET padrão e adição às células microbianas colhidas de uma quantidade suficiente de lisozima/solução alcalina-e/KOAc para promover a lise das células, formando um lisado de célula; (c) clarificação do lisado de células usando filtração com terra de diatomáceas; (d) precipitação de ADN de plasmídeo super-enrolado com brometo de cetiltrimetil-amónio; (e) re-dissolução do ADN de plasmídeo super-enrolado num tampão incluindo NaCl na gama de 0,2 ma 2 m; (f) adsorção de impurezas residuais sobre silicato de cálcio cristalizado hidratado; (g) precipitação do ADN de plasmídeo super-enrolado com etanol; (h) filtração para recolher e lavar o precipitado; (i) secagem para remover o etanol; (j) re-dissolução de ADN de plasmídeo super-enrolado purificado num tampão de formulação fisiologi-camente aceitável; e, (k) esterilização por filtração através de um filtro de 0,22 μπι. Também está dentro do âmbito desta porção da invenção omitir os passos (g) - (k) enquanto se esteriliza o tampão do passo (f), seguido por concentração de ADN por meio de precipitação com etanol, resultando num precipitado em pó contendo o ADN de plasmídeo super-enrolado. Uma temperatura preferida para a lise do passo (b) é de desde cerca de 70 °C a cerca de 80 40 ΡΕ1242442 °C, enquanto que uma única fracção de CTAB (via uma alimentação de CTAB de 1% p/v num tampão STET padrão) pode preferivelmente ser uma concentração de CTAB de desde cerca de 0,30% a cerca de 0,33%, sendo, de novo, possivelmente influenciada pelas condições do tampão. Os componentes de tampão, tais como o EDTA e Triton estão, tal como notado noutro local, disponíveis para adição a tampões, para melhorar a recuperação de adn de plasmídeo.

As células microbianas colhidas são dissolvidas em tampão STET e é adicionada lisosoma, tal como foi descrito acima. É facilmente aparente para as pessoas com competências na técnica que podem ser feitas modificações nesta fórmula básica de tampão e que estas são adequadas para o uso na presente invenção. Tem-se a intenção de que as modificações a esta fórmula básica de tampão que afectem ou alterem substancialmente o resultado do presente processo estejam dentro do âmbito do processo da presente invenção. No entanto, num modelo de realização preferido da presente invenção, a precipitação selectiva de ADN de plasmídeo com CTAB, tal como foi descrito ao longo desta especificação, é levada a cabo na presença de um tampão fisiologicamente aceitável, o qual inclui um quelante, o qual remove efectivamente catiões divalentes, tais como Mg++ e Ca++. O magnésio é um co-factor essencial para os complexos de ADNase e cálcio com o ADN de plasmídeo, evitando a precipitação por CTAB. É aqui exemplificado e preferido que o quelante seja o EDTA. No entanto, qualquer quelante que remova catiões divalentes, tais como Mg++ e 41 ΡΕ1242442

Ca++, pode ser adicionado aos tampões utilizados para praticar os métodos de purificação de ADN de plasmídeo aqui revelados. Foi mostrado pelos inventores que as concentrações de EDTA de 1 mM, 5 mM, 10 M e 100 mM são eficazes na promoção de precipitação de ADN de plasmídeo induzida por CTAB. Por essa razão, pode ser utilizada qualquer concentração fisiologicamente aceitável do quelante de escolha, incluindo o EDTA, que promova a precipitação de ADN de plasmídeo induzida por CTAB, ao longo dos passos iniciais de precipitação passo a passo de ADN de plasmídeo. A terra de diatomáceas (DE) é um material pulvurulento fracamente coerente formado quase inteiramente de fragmentos de concha de diatomácea aquosa. Usualmente fina em textura e cinzenta ou branca na cor, a terra de diatomáceas é composta largamente de dióxido de silício ou sílica na sua forma pura, tendo um teor de sílica tão elevado quanto 94%. A terra de diatomáceas está disponível comercialmente em três formas: natural, calcinada e calcinada em fluxo. A forma calcinada de DE é gerada por calcificação a temperaturas elevadas enquanto que a DE calcinada em fluxo é preparada por calcinação em presença de fluxo, tal como carbonato de sódio ou cloreto de sódio. A terra de diatomáceas está disponível de múltiplas fontes comerciais e qualquer e todas as formas disponíveis são contempladas para o uso na prática dos métodos da presente invenção, incluindo, mas não limitado a, Celpure 65, Celpure 100, Celpure 300, Celpure 100 e LRA™ (todas de Advanced Materials), bem como auxiliares de filtração 42 ΡΕ1242442

Cellulosic tais como Solka Floc. Tal como foi notado acima e aqui exemplificado, a clarificação do lisado de célula via uma filtração com o auxilio de terra de diatomáceas é um passo de processamento a jusante preferido, dado que este passo parece ser mais adaptável a outra escala e o ADN de plasmideo menos propenso a efeitos de corte de centrifugação em grande escala. No entanto, podem ser utilizadas outras alternativas para remover detritos de células de hospedeiro e ADN genómico, tal como a centrifugação.

Num modelo de realização especialmente preferido da presente invenção, a precipitação selectiva de ADN de plasmideo com CTAB, descrita ao longo desta especificação, é atingida de uma forma passo a paso, precipitando selecti-vamente os detritos de célula, ADNg e alguns produtos de degradação de ADN a uma concentração de CTAB de fracção passa alto, seguida por uma segunda precipitação de fracção passa baixo de ADN de plasmideo induzida por CTAB. Enquanto que o CTAB é preferido para a precipitação selectiva, passo a passo, de ADN de plasmideo, outros compostos os quais podem ser úteis incluem, mas não estão limitados a, C16: cloreto de cetiltrimetilamónio; Cl6: brometo ou cloreto de cetildimetiletilamónio; C16: brometo ou cloreto de cetilpi-ridinio; C14: brometo ou cloreto de tetradeciltrimetil-amónio; C12: brometo ou cloreto de dodeciltrimetilamónio; C12: brometo de dodecildimetil-2-fenoxietilamónio; C16: hexadecilamina: sal de brometo ou de cloreto; C16: brometo ou cloreto de hexadecilpiridinio; e C12 sal de cloreto ou de amina dodecil. Estará dentro da alçada do técnico testar 43 ΡΕ1242442 substitutos potenciais para o detergente aqui exemplificado, para identificar um composto o qual precipite efectivamente o ADN de plasmídeo super-enrolado em relação às várias impurezas de lisado de célula.

Na presente invenção, a adsorção de impurezas em descontinuo, a jusante, é levada a cabo na presença de um silicato de cálcio hidratado (hcCaSi03), tal como o silica-

' / TM to de cálcio hidratado sintético LRA (Advanced Materials Corporation, Lompoc, CA93438). Também é possível substituir o passo de adsorção sobre silicato de cálcio hidratado (hcCaSiCg) por adsorção em modo de coluna. Por exemplo, se usando LRA™, realizar primeiro uma decantação para sedimentação para remover os finos de LRA™ seguida de empacotamento do LRA™ numa coluna. São aplicados à coluna dez volumes da coluna de NaCl (à mesma concentração de NaCl que a da solução de alimentação de plasmídeo), seguida pela aplicação da solução de plasmídeo. 0 ADN de plasmídeo super-enrolado é a primeira forma de ADN a eluír no efluente. As fracções mais tardias conterão produtos de degradação de plasmídeo e ADN genómico. A endotoxina e o CTAB também são eliminados por serem estreitamente ligados à coluna. As fracções que contêm impurezas de ácido nucleico não são reunidas em comum. Um material de silicato de cálcio hidratado é descrito no Pedido Internacional PCT PCT/US96/20034 (WO98/01464). Tal como foi apontado em WO 98/01464, muitos métodos são conhecidos na técnica para a preparação de compostos de hcCaSi03 (p. ex., ver Taylor, 1964, Ed., The Chemistry of Cements, Academic Press). Tal 44 ΡΕ1242442 como ainda notado em WO 98/01464, a dimensão de hcCaSi03 pode ser de desde cerca de 0,01 micron a cerca de 0,10 micron, tal como determinado por métodos conhecidos, tal como medição por raios-x e/ou microscopia electrónica. Destas partículas pequenas, agregados tão grandes como cerca de 100 microns podem estar presentes. Tal como é notado abaixo, um modelo de realização preferido mostra o hcCaSi03 com uma retenção sobre uma manga de 325 "mesh" como menos do que cerca de 10% em peso, mais preferivelmente menos do que cerca de 8% em peso. Em muitos modelos de realização que são preferidos, o hcCaSi03 está na forma de pó com uma área superficial maior do que cerca de 75 m2/g, e preferivelmente entre desde cerca de 75 m2/g a cerca de 200 m2/g. Um material de silicato de cálcio hidratado preferido aqui utilizado é um pó fino preparado por reacção hidrotérmica de terra de diatomácea, óxido de cálcio hidratado (hidróxido de cálcio) e água. O produto final está na forma cristalina, a qual inclui cerca de 47% de silício (Si02) em peso, uma quantidade estequiométrica de cálcio (CaO) a cerca de 32% em peso, cerca de 2,5% de alumínio em peso (AI2O3), cerca de 1,2% de sódio (Na20) e potássio (K20) em peso; cerca de 0,7% de ferro em peso (reportado como Fe203); cerca de 0,6% de magnésio em peso (MgO), com 0 remanescente (cerca de 16,6% de H20) . Esta forma preferida possui uma retenção num peneiro de 325 "mesh" de cerca de 6% em peso e uma área superficial de cerca de 120 m2/g (tal como determinado usando o método B.E.T.). As gamas de percentagem em peso dos componentes acima identificados de CaSi03 podem incluir mas não estão 45 ΡΕ1242442 necessariamente limitados a: S1O2 (45 - 95%); CaO (5 -35%); H2O (1 - 20%) e em alguns casos de desde cerca de 1% a cerca de 10% de várias impurezas, incluindo mas não necessariamente limitado a Al203, metais alcalinos tais como óxidos de sódio (Na20) e de potássio (K20), óxido de ferro (Fe203) e óxido de magnésio (MgO), bem como pequenas quantidades de alumínio solúvel. Estará dentro da alçada do técnico com competências substituir formas alternativas de materiais hidratados com base em cálcio para uso no passo da adsorção, o qual pode ligar selectivamente fragmentos de ADN maiores tal como exemplificado com LRA , Matrex (Amicon) e hidroxiapatite [fosfato de cálcio (dibásico)]. Não obstante, o silicato de cálcio hidratado sintético com caracteristicas similares ao LRA™ (tal como revelado em WO 98/01464) é um material adsorvente preferido para remover produtos de degradação de ADN residuais, tais como formas lineares de abertas relaxadas, ARN e ADN de hospedeiro, endotoxina, proteínas e remoção de aditivos de detergente, tais como o CTAB.

Por essa razão, os métodos aqui descritos resultam em atingir-se a separação entre várias formas de plasmídeo (ADN de plasmídeo super-enrolado [o produto que se pretende para uso como vacina de ADN ou veículo de terapia de gene], ADN de plasmídeo aberto relaxado, ADN de plasmídeo linear e concatómeros de plasmídeo) e e remoção de contaminantes de hospedeiro, tais como lps (endotoxina), ARNg, ADNg e proteínas residuais. -46 - ΡΕ1242442 0 plasmídeo a ser isolado e purificado pelo processo da presente invenção pode ser qualquer molécula de ADN extracromossómico. Os plasmideos podem ser de número de cópia elevado por célula ou número baixo de cópia por célula. Os plasmideos também podem ser, virtualmente, de qualquer dimensão. É facilmente aparente para aquelas pessoas com competências na técnica que virtualmente qualquer plasmideo nas células microbianas pode ser isolado pelo processo da presente invenção. 0 processo da presente invenção é adequado para o uso com fermentações microbianas em geral. É facilmente aparente para as pessoas com competências na técnica que uma larga variedade de células são adequadas para o uso no processo da presente invenção, incluindo, mas não limitado a, células bacterianas, células de plantas, células de fungos incluindo leveduras e baculovirus. Uma fermentação mcrobiana preferida é uma fermentação bacteriana de células contendo o plasmideo a ser isolado e purificado. Uma fermentação bacteriana preferida é uma fermentação de E. coli contendo o plasmideo a ser isolado e purificado. É facilmente aparente para as pessoas com competências na técnica que as fermentações bacterianas que não as fermentações de E. coli são adequadas para o uso na presente invenção. As fermentações microbianas de larga escala da presente invenção podem ser cultivadas em qualquer meio liquido o qual seja adequado para o crescimento das bactérias a serem utilizadas. Enquanto que a metodologia revelada é aplicável a volumes de fermentação mais peque- 47 ΡΕ1242442 nos, um aspecto especialmente útil da presente invenção é a adaptabilidade a outra escala para fermentação de células microbianas de grande escala. O termo "grande escala", tal como usado aqui, é considerado como sendo volumes totais de fermentação de células de mais do que cerca de 5 litros, ou as células colhidas de um volume de fermentação maior do que cerca de 5 litros. A metodologia de fermentação em grande escala da presente invenção é aplicável a lotes de dimensão clinica, os quais representam, mas não estão limitados a, fermentações de aproximadamente 100 - 200 litros.

Um modelo de realização da presente invenção o qual inclui cada um dos passos acima identificados consiste dos seguintes passos: (i) filtração de fluxo tangencial de caldo de fermentação para concentrar e diafiltrar as células que contêm ADN de plasmídeo; (ii) re-suspensão das células, (iii) incubação a 37°C de suspensão de células com lisozima recombinante, (iv) lise de células via aquecimento rápido, seguido pelo arrefecimento do lisado, (vi) clarificação do lisado usando filtração com terra de diatomáceas, (v) precipitação de impurezas e de detritos de células residuais, tais como ADN genómico com a adição de CTAB, (vi) precipitação selectiva de ADN de plasmídeo com CTAB, (vii) re-dissolução selectiva de ADN de plasmídeo, (viii) adsorção em descontínuo de endotoxina residual e CTAB sobre silicato de cálcio, (ix) adsorção em descontínuo de proteína residual, ácido nucleico e outras impurezas sobre silicato de cálcio cristalino hidratado, (x) 48 ΡΕ1242442 precipitação de ADN de plasmideo com etanol, (xi) filtração para recolher e lavar o precipiado; (xii) secagem por vácuo para remover o etanol; (xii) re-dissolução de ADN de plasmideo purificado em tampão de formulação; e (xiii) filtração estéril a 0,22 μιη.

Em um outro modelo de realização da presente invenção, as células não colhidas do caldo de fermentação são incubadas com lisozima a 37°C, durante aproximadamente 1 h, e a suspensão de células é bombeada através de um permutador de calor o qual atinge uma temperatura de saída de 75 - 80°C. Isto é seguido por bombagem através de um segundo permutador de calor, para arrefecer o lisado a 20 -25°C. O material lisado é sujeito a (i) clarificação do lisado usando filtração com terra de diatomáceas, (ii) precipitação de detritos de células residuais e impurezas, tais como ADN genómico com a adição de CTAB, (iii) precipitação selectiva de ADN de plasmideo com CTAB, (iv) dissolução selectiva de ADN de plasmideo, (v) adsorção em descontínuo de endotoxina residual e CTAB sobre silicato de cálcio cristalino hidratado, (vi) adsorção em descontínuo de proteína residual, ácido nucleico e outras impurezas sobre silicato de cálcio, (vii) precipitação de ADN de plasmideo com etanol, (viii) filtração para recolher e lavar o precipitado; (ix) secagem por vácuo para remover o etanol; (x) dissolução de ADN de plasmideo purificado em tampão de formulação; e (xi) filtação estéril a 0,22 μιη.

As células microbianas que contêm o plasmideo são 49 ΡΕ1242442 colhidas do meio de fermentação para fornecer uma pasta de células, ou suspensão. Qualquer meio convencional para colher as células a partir de um meio liquido é adequado, incluindo, mas não limitado a, centrifugação ou microfil-tração. Uma pasta de células é gerada por colheita de células microbianas contendo o ADN de plasmídeo do caldo de fermentação. A colheita consiste de (i) concentração das células por um factor de quatro, usando filtração de fluxo tangencial através de uma membrana A/G Tech de peso molecular nominal de 500 kDa e (ii) diafiltração das células concentradas com três volumes equivalentes de solução salina esterilizada a 120 mM. As células colhidas são re-suspensas em tampão STET esterilizado (8% p/v de sacarose, 50 mM de Tris-Hcl, 100 mM de EDTA, 2% v/v de Triton X-100, pH 8,5) até uma diluição que corresponde a uma densidade óptica de 30 a 600 nm. A suspensão é aquecida a 37°C e é adicionada lisozima Ready-Lyse™ de Epicentre Technologies até uma concentração de 500 kU/1. Após 45 minutos a 37°C, a suspensão de células é bombeada através de uma serpentina de permutador de calor submergida em água a ferver, de forma que a sua temperatura atinge os 70°C aqundo da saida da serpentina. O lisado é então arrefecido a aproximada-mente 20°C, por fluxo através de uma serpentina de permutador de calor submergida num banho de água gelada. O passo de lise incluindo a transferência da suspensão de células através de um equipamento de permuta de calor é revelado nos Pedidos de Patente internacional Nos. PCT/US95/09749 (WO96/02658) e PCT/US96/07083 (WO96/36706). Em resumo, as células microbianas colhidas são re-suspensas em tampão 50 ΡΕ1242442 STET e é adicionada lisozima, tal como foi descrito acima. É facilmente aparente para aquelas pessoas com competências na técnica que podem ser feitas modificações nesta fórmula de tampão básica, as quais são adequadas para o uso na presente invenção. Têm-se a intenção de que as modificações a esta fórmula de tampão básica que não afectem ou alterem substancialmente o resultado do presente processo estejam dentro do âmbito do processo da presente invenção. No entanto, é especificamente preferido que este passo tenha lugar na presença de um tampão fisiologicamente aceitável, incluindo um quelante que remova efectivamente catiões divalentes, tais como Mg++ e Ca++, tal como o EDTA. Tal como foi notado acima, pode ser usada qualquer concentração de quelante que promova a precipitação de ADN de plasmideo induzida por meio de CTAB, o que foi exemplificado sobre uma larga gama de concentração de desde cerca de 1 mM a mais do que 100 mM de EDTA. Estas gamas de concentração de EDTA resultam em precipitação óptima de ADN de plasmideo super-enrolado induzida por CTAB ao mesmo tempo que também inibem a actividade de ADNase. A gama de pH de tampão pode ser ajustada de acordo com os melhores resultados fornecidos para a estirpe particular de bactéria que está a ser usada. A gama de pH preferida é de cerca de 8,0 - 8,5. A suspensão é então aquecida a cerca de 60 - 100°C, sendo a preferida cerca de 70 - 80°C, num permutador de calor de fluxo continuo. Isto é seguido por arrefecimento a 20 -25°C, num segundo permutador de calor. É também contemplado um método de lise alternativo de Birnboim e Doly (1979, Nucleic Acid Res. 7: 1513 - 1523). Neste método, as células 51 ΡΕ1242442 são lisadas usando hidróxido de sódio diluído seguido de neutralização por KOAc. SDS é omitido do passo alcalino para prevenir a interferência com a precipitação de ADN induzida por CTAB. 0 rendimento de lise não foi afectado pela remoção de SDS. A terra de diatomáceas (Celpure™; Advanced Minerais) é então adicionada ao lisado arrefecido a uma concentração de 30 g/1. A suspensão resultante é filtrada e o bolo é lavado para recuperar o liquido de produto. Celpure™ é então misturado com um lisado clarificado a aproximadamente 10 g/1. Detritos de células finamente divididos e outras impurezas residuais, incluindo ADN genómico e produtos de degradação de ADN lineares e circulares relaxados são precipitados a partir do lisado clarificado pela adição de uma solução de CTAB a 1,0 % p/v em 40 mM de NaCl a uma concentração final de 0,1 - 0,3 % p/v CTAB. A suspensão resultante é filtrada, após providenciar-se recirculação inicial até que a sua turbidez seja menos do que 10 NTU. É adicionado Celpure™ ao filtrado a uma concentração de alimentação corporal de aproximadamente 10 g/1. Isto fornece uma matriz na qual o ADN de plasmídeo precipita aquando do aumento da concentração de CTAB para 0,25% - 0,45% p/v usando CTAb a 1,0% p/v em NaCl a 40 mM. A suspensão é filtrada, e o filtrado é recirculado até que a sua turbidez seja menos do que 10 NTU. No Exemplo 1 o bolo de filtração impregnado de ADN de plasmídeo resultante foi lavado com CTAB a 0,30 - 0,33% p/v em NaCl a 40 mM. O técnico com competências vulgares compreenderá que as gamas de CTAB de fracção passa alto e 52 ΡΕ1242442 de fracção passa baixo podem ser manipuladas dependendo de variações na concentração de ADN de plasmideo, força iónica e/ou temperatura. 0 bolo de filtração é então dissolvido em NaCl cerca de 0,2 Ma cerca de 2,0 M com Tris a 100 mM (pH 8,2). O ADN de plasmideo re-dissolve-se à medida que o NaCl permuta com o CTAB. De novo, o técnico com competências pode escolher várias concentrações de sal para lavar e/ou re-dissolver o bolo de filtração. A suspensão é filtrada sobre uma membrana de aço inoxidável para remover o Celpure , apos fornecer-se a recirculação inicial para atingir a baixa turbidez. O filtrado é sujeito a dois passos de adsorção em descontinuo usando hcCaSiCb (p. ex., LRA™ de Advanced Materials). O primeiro passo de adsorção remove a endotoxina residual e o CTAB; o segundo remove proteínas residuais, produtos de degradação de ADN lineares e circulares relaxados bem como ARN e ADN de hospedeiro. É adicionado LRA™ a 45 gramas por grama de ADN no primeiro passo de adsorção. A suspensão resultante é incubada a 20 °C durante uma hora e é filtrada. O bolo de filtração é lavado com NaCl 1,2 M, ou uma concentração de sal razoável, tal como foi notado acima. E adicionado LRA fresco ao filtrado e solução de lavagem a 50 gramas por grama de ADN, e a suspensão resultante é incubada a 20 °C durante aproximadamente cinco horas. A suspensão é então filtrada para remover o LRA™, e o bolo de filtração resultante é lavado com NaCl 1,2 M. Será evidente para o técnico com competências vulgares na técnica que os passos acima de adsorção em descontinuo podem ser levados a cabo de acordo com o que o silicato de cálcio é suspenso na solução contendo o precipitado de CTAB reconstituído, ou os passos 53 ΡΕ1242442 de adsorção em descontínuo podem ser completados usando uma coluna empacotada contendo hcCaSiCh, tal como notado acima em referência ao uso de coluna de hcCaSiC>3 para o uso no tratamento de CTAB dissolvido intermédio. É adicionado um volume equivalente de etanol absoluto ao filtrado e à lavagem do segundo passo de hcCaSiCh para precipitar o adn de plasmídeo purificado. 0 precipitado resultante é recuperado via filtração e é lavado imediatamente com etanol absoluto. 0 precipitado lavado é seco por vácuo a 20 °C para remover o etanol e é subsequentemente armazenado a 4 °C até a reformulação. Aquando da reformulação num tampão adequado para injecção, a solução de ADN de plasmídeo purificada é sujeita a filtração estéril a 0,22 μιη. alternativamente, o pó de produto em volume pode ser isolado de precipitado etanólico se um precipitado forma uma pasta não filtrável. A pasta precipitada é centrifugada e a pasta é adicionada a EtOH a 100% o qual é misturado com um homogeneizador de alta velocidade tal como um rotor-estator. A pasta é simultaneamente desidratada e bem moída em partículas rijas. Estas partículas são passíveis de serem filtradas e secas.

Tal como foi notado acima, em vez de precipitar um pó em volume, a preparação de ADN de plasmídeo purificado pode ser transferida para uma solução de tampão ou um veiculo farmaceuticamente aceitável. São conhecidas na técnica soluções de tampão ou veículos farmaceuticamente aceitáveis e incluem aqueles descritos numa variedade de textos, tais como Remington's Pharmaceutical Sciences. Qualquer método adequado para concentrar uma solução de ADN 54 ΡΕ1242442 é adequado para o uso na presente invenção. Tais métodos incluem a ultrafiltração, precipitação por álcool, liofi-lização e os seus semelhantes, sendo preferida a purificação por etanol. A preparação de plasmideo purificada pode ser esterilizada por qualquer método de esterilização que não afecte a utilidade do produto de adn, tal como a esterilização por passagem através de uma membrana tendo uma dimensão de poro suficientemente pequena, por exemplo 0,22 microns e mais pequena. O produto final contém cálcio o qual é libertado de um estado de ligação ligeira em hcCaSi03. Uma preparação tipica pode ter cerca de 1,6% p/p no produto precipitado. Para a preparação de formulações clinicas, o cálcio residual pode ser removido por métodos convencionais envolvendo EDTA. Por exemplo, a complexação do cálcio por adição de EDTA pode ser realizada em conjunto quer com a ultrafil-tração quer com a precipitação e o complexo cálcio-EDTA pode ser removido por lavagem com pressão com os licores de precipitação ou com as correntes de permeado de ultrafil-tração. Alternativamente, uma pequena coluna de quelação contendo EDTA removeria mais eficientemente o cálcio sem introduzir EDTA na corrente de processo.

Os métodos da presente invenção permitem a purificação de ADN de plasmideo de grau clinico a partir de organismos incluindo, mas de forma nenhuma limitado a, levedura e E. coli. O ADN de plasmideo de grau clinico purificado pelos métodos descritos aqui é extremamente útil 55 ΡΕ1242442 para a administração a seres humanos como um veículo de terapia de gene ou vacina.

Os exemplos seguintes são fornecidos para ilustrar o processo da presente invenção. EXEMPLO 1

Purificação de ADN de plasmídeo. 0 protocolo seguinte para a purificação de ADN de plasmideo de E. coli resultou no isolamento de aproxima-damente 730 mg de ADN de plasmídeo super-enrolado. Um esquema do cerne do processo de purificação de plasmídeo aqui revelado é mostrado na Figura 1.

Lise de células - 600 ml de pasta de células foi descongelada usando água de rede morna e re-suspensa em 5,4 1 de tampão STET. Uma diluição por um factor de dez forneceu uma suspensão com uma densidade óptica de 30 a 600 nm. Foi então adicionado 40 mel de Ready-Lyse Lysozyme (Epicentre, 30 kU/mcl) à suspensão de células. A temperatura da suspensão de células diluída foi aumentada para aproximadamente 40 °C. Após 45 minutos de mistura, as células foram lisadas termicamente através de uma serpentina de aço inoxidável electro-polida, imersa num banho de água a ferver. O caudal foi ajustado de forma a que a temperatura do fluído que saía do permutador de calor era aproximadamente 70 °C. A serpentina de lise foi então limpa 56 ΡΕ1242442 com água sem pirogéneos, imersa num banho de água gelada e usada para arrefecer o lisado quente a 30 °C. O lisado foi arrefecido dentro de 30 min após o completamento da lise das células. O volume total de lisado era de 5,6 1.

Clarificação - foi usado Celpure P300 (Advanced Minerais) a uma concentração de alimentação de corpo de 30 g/1 para clarificar o lisado arrefecido. O Celpure P300 foi misturado no lisado, e a suspensão resultante foi dividida em quatro porções. A quantidade de Celpure pode ser variada sobre uma larga gama dependendo da escala final de operação, da dimensão de filtro desejada e da configuração e taxa de produção de projecto da instalação de produção. Considerações similares ditam as quantidades de terra de diatomáceas nos passos de filtração de fracção passa alto e de fracção passa baixo aqui descritos. Cada porção foi filtrada separadamente através de um peneiro de aço inoxidável de 25 microns contido num suporte de filtro de 6 polegadas de diâmetro. O filtrado foi recirculado inicialmente até que a sua turbidez diminuiu até aproximadamente 10 NTU. A seguir a cada filtração, foi usado ar pressurizado para deslocar fluido intersticial dentro do bolo de filtração. O volume total de lisado clarificado era de 5,05 1. A concentração de ADN total e a pureza de ADN de plasmídeo super-enrolado, tal como medidas por um ensaio de HPLC analítico, foram de 0,338 g/1 e 83,6%, respectivamente.

Sonda de CTAB - foi empregue uma sonda de CTAB rápida para determinar as concentrações aproximadas de CTAB 57 ΡΕ1242442 de fracções passa alto e passa baixo. Quantidades incrementais de CTAB a 1,0% p/v em NaCl 40 mM foram adicionadas a aliquotas de 500 ml de lisado clarificado em frasquinhos de vidro de 1,5 ml. Os frasquinhos de vidro foram sujeitos a vórtex e inspecionados visualmente para verificar a presença de precipitados de ADN. Com base nos resultados da sonda, foram atibuidas concentrações de CTAB de fracção de passa alto e passa baixo de 0,23 e 0,30% p/v, respectiva-mente.

Passo de ctab de fracção passa alto - a 5,05 1 de lisado clarificado foi adicionado 1,5 1 de solução de CTAB a 1,0% p/v em NaCl 40 mM, à temperatura ambiente, ao longo de um período de tempo de 43 minutos. Foi então adicionado 34,2 g de Celpure. A suspensão foi então filtrada através de um peneiro de aço inoxidável de 25 mícrons contido num suporte de filtro de 6 polegadas de diâmetro. O filtrado foi inicialmente recirculado até a sua turbidez ser constante. O bolo de filtração não foi lavado mas foi seco usando ar comprimido. O volume final de filtrado contendo o produto foi de 6,44 1.

Passo de CTAB de fracção passa baixo - 29,3 g de Celpure P300 foram adicionados ao filtrado fracção passa alto. Foram então adicionados à suspensão, com agitação, 650 ml de CTAB a 1,0% p/v em NaCl 40 mM, ao longo de um período de tempo de aproximadamente de 30 min. Análises de HPLC analítico revelaram que todo o adn tinha precipitado. A suspensão de fracção passa baixo foi então filtrada 58 ΡΕ1242442 através de um peneiro de aço inoxidável de 25 microns contido num suporte de filtro de 6 polegadas de diâmetro. 0 filtrado foi recirculado até ser observada uma turbidez constante. 0 bolo de filtração foi lavado com uma solução de 1 1 de CTAB a 0,3% p/v após a filtração da suspensão de fracção passa baixo estar completa. Foram recolhidas duas fracções de lavagem de 500 ml. O bolo lavado foi então parcialmente seco usando ar comprimido, recolhido do suporte de filtro, e pesado para determinar a massa de liquido residual no bolo. A massa total de bolo foi de 113 g. O Celpure e ADN precipitado contribuíram com aproximadamente 29 e 2 g, respectivamente, indicando que havia aproximadamente 82 ml de liquido residual no bolo lavado. A Figura 2 mostra um perfil de concentração durante o passo de precipitação com CTAB. Estes dados mostram que o ADN de plasmídeo precipita ao longo de um incremento de detergente estreito. Este passo de precipitação com CTAB é selectivo para a remoção de proteína, ARN e endotoxina que permanecem solúveis.

Re-dissolução selectiva do bolo de fracção passa baixo lavado - 700 ml de água esterilizada foram adicionados ao bolo de fracção passa baixo lavado, levando o volume total de líquido a aproximadamente 782 ml. Aproximadamente 86 ml de NaCl 5 M foram adicionados à suspensão, resultando numa concentração de NaCl de aproximadamente 0,5 M e re-dissolvendo o ADN de plasmideo super-enrolado. A terra de diatomáceas residual foi filtrada através de um peneiro de aço inoxidável de 25 microns contido num suporte de filtro de 6 polegadas de diâmetro para separar o Celpure 59 ΡΕ1242442 do ADN de plasmídeo super-enrolado re-dissolvido. 0 filtrado foi recirculado até que foi obtido um filtrado limpido. 0 bolo de filtração foi filtrado com aproximada-mente 1 1 de NaCl 0,5 M para recuperar liquido intersticial contendo produto. A lavagem de NaCl 0,5 M foi recolhida em quatro fracções. Foi usado um ensaio de hplc analítico para testar o filtrado de produto e as quatro fracções de lavagem para concentração total de ADN e pureza de ADN de plasmídeo super-enrolado. O volume, concentração total de ADN, e composição de ADN super-enrolado do filtrado de produto e as lavagens de NaCl 0,5 M foram os seguintes: (i) filtrado de produto: 800 ml, 1, 933 g/1, (ii) fracção de lavagem 1: 200 ml, 0,203 g/i, 89,1 %, (iii) fracção de lavagem 2: 200 ml, 0,047 g/i, 70,3%, (iv) fracção de lavagem 3: 300 ml, 0,018 g/i, 61,4% e (V) fracção de lavagem 4: 300 ml, 0,015 g/1, 63,3%. As fracções de lavagem não foram adicionadas ao filtrado de produto devido à sua baixa pureza e concentração. A Figura 3 mostra a dissolução selectiva de ADN e plasmídeo por meio de NaCl 0,2 M por electroforese em gel de agarose. ADN genómico de hospedeiro é apenas parcialmente solúvel e é removido por filtração após re-dissolução com NaCl 0,2 M. Em NaCl 1,2 Μ o ADNg é solúvel. Será útil uma gama de NaCl de cerca de pelo menos 0,2 M até cerca de pelo menos 2 M para a dissolução selectiva do precipitado de CTAB.

Tratamento da batelada com quantidades incrementais de LRA™ - 735 ml de precipitado re-dissolvido em NaCl 60 ΡΕ1242442 0,5 M foram adicionados, à temperatura ambiente, a 45 g de LRA™ (Advanced Minerais). Amostras de 500 mel foram retiradas às 4,8, 9,9, 19,1 e 19,6 horas. A Tabela 1 mostra as concentrações totais de ADN e a composição de ADN de plasmídeo super-enrolado, tal como medido pelo ensaio de HPLC analítico.

Periodicamente, quantidades incrementais de lra™ fresco foram adicionadas à suspensão e foram tiradas amostras nos tempos seguintes: (i) 4,6 g de LRA™ foram adicionados a 19,9 h (para 35 g de LRA™/g ADN) . As amostras foram retiradas a 21,6, 23,8 e 25,4 h; (ii) 6,6 g de LRA™ foram adicionados a 25,8 h (para 39,5 g LRA™/g ADN). As amostras foram retiradas a 26,8, 27,8, 28,8 e 30,9 h; (iii) 3,7 g de LRA™ foram adicionados a 32,2 h (para 42 g LRA™/g ADN). As amostras foram retiradas a 32,4, 34,4 e 40,8 h; (iv) 3,98 g de LRA™ foram adicionados a 41 h (para 45 g LRA™/g ADN). As amostras foram retiradas a 41,8 e 42,6 h.

Tal como mostrado na Tabela 1, outros incrementos na pureza do plasmídeo (tal como medida por um ensaio de HPLC) podem ser correlaccionados com as adições periódicas de LRA™. ΡΕ1242442 61 TABELA 1 TM Adição incremental de LRA Tempo g LRA™/ Cone. Composição de Rendimento em (h) g ADN Total de ADN de Plasmideo ADN de Plasmideo ADN (g/1) Super-enrolado Super-enrolado (%) (%) 0 0 1, 93 93, 0 100 4,8 31, 7 1, 93 93, 5 100 9, 9 31, 7 1, 81 92, 6 93, 4 19,1 31, 7 1, 89 96,3 102 19, 6 31, 7 1, 89 91, 9 96,5 21,6 35 1, 97 93, 7 103 23, 8 35 1, 96 95, 6 104 25, 4 35 1, 96 94, 0 102 26,8 39,5 1, 80 93, 9 94, 1 27, 8 39,5 1, 83 95, 5 97, 6 28, 8 39,5 1, 68 95, 2 89, 4 o 00 39,5 1, 91 95, 8 102 32, 4 42 1, 86 96,2 99, 5 34, 4 42 1, 82 96,3 97, 6 O co 42 1, 83 96,3 98, 2 41, 8 45 1, 68 97, 9 91, 9 42, 6 45 1, 64 97, 1 88, 7 A Figura 4A mostra que a adsorção óptima de plasmideo em silicato de cálcio ocorre a uma concentração de NaCl de cerca de 0,6 m, quando comparada com concentrações de NaCl mais elevadas. Estará dentro da alçada do 62 ΡΕ1242442 técnico com competências manipular a concentração de NaCl dentro desta gama indicada sem afectar a capacidade de LRA™ de adsorver o ADN de plasmideo super-enrolado. A optimização deste passo envolveria uma investigação de todos os factores que dizem respeito ao fenómeno subjacente da ligação de hidrogénio, interacções hidrofóbicas e electrostáticas. Entre tais variáveis estão a concentração de sal, tipo de sal, temperatura, pH e tipo de adsorvente. Por exemplo, pode esperar-se que outros adsorventes com base em cálcio que ligam o ADN, resultem em separação sob um esquema de optimização que envolva as variáveis de fase de solução acima.

Remoção e lavagem de LRA™ - após 42,9 h, a suspensão de LRA™ foi centrifugada a 19 °C e 8 kRPM durante 25 min. Os 400 ml de sobrenadante resultante foram recolhidos. Foram adicionados 200 ml de NaCl 0,5 M fresco à pélete de LRA™. Uma espátula estéril e agitação vigorosa durante 10 seg foram usados para re-suspender a pélete de LRA . O LRA re-suspenso foi sujeito a centrifugação durante 10 min a 8 kRPM. Os sobrenadantes foram recolhidos, e a pélete de LRA™ foi lavada mais duas vezes desta maneira. O primeiro sobrenadante (400 ml) e as três lavagens (3 x 200 ml) foram avaliados em relação à concentração de ADN total e composição de ADN de plasmideo super-enrolado. Os resultados são mostrados na Tabela 2. As lavagens não foram adicionadas ao sobrenadante de produto. O sobrenadante de produto foi então filtrado em esterilização através de uma unidade descartável de filtração por vácuo de 0,8 micron para remover o LRA™ residual. ΡΕ1242442 63 TABELA 2 TM Sobrenadante de suspensão de LRA centnfugado e lavagens Amostra Volume Cone. De Composição de Massa de ADN de (ml) ADN total ADN de Plasmi- Plasmideo (mg/ml) deo Super- Super-enrolado enrolado (%) (g) Ppt CTAB 735 1, 93 93,0 1,32 recons. Sobrena- 400 1, 80 97,1 0,70 dante Lavagem 1 200 O oo 92,6 0,16 Lavagem 2 200 0, 55 84,1 0,09 Lavagem 3 200 0, 36 72,5 LO O o A Figura 4B mostra a adsorção de ADN genómico ou de hospedeiro ao longo do tempo. Mais especificamente, estes dados mostram que o LRA remove selectivamente o ADN após 5 h de contacto com mistura a uma concentração de NaCl de 1,2 M, resultando num rendimento de plasmideo de cerca de 60%. A Figura 4C é uma electroforese em gel de agarose de amostra de fase liquida durante contacto de LRA™ a 1,2 M de NaCl. Estes dados mostram a remoção de lineares (Lin), circulo aberto relaxado (OC) e multimeros (M), enquanto que o ADN de plasmideo super-enrolado permanece. As faixas 1-5 representam pontos de tempo crescentes e as faixas 6-8 representam lavagens de LRA™ filtrado. A Figura 4D mostra a adsorção selectiva de produtos de degradação de plasmideo 64 ΡΕ1242442 sobre hcCaSi03 em NaCl 0,5 M. É mostrada a electroforese em gel de agarose de amostras de fase líquida em contacto com 32 g de hcCaSi03 por g de ADN total, como uma função do tempo.

Produto de precipitação de LRA™ com etanol - 400 ml de etanol absoluto foram lentamente adicionados a 400 ml de filtrado pós-LRA™. A adição de etanol foi completada ao longo de um período de 2 h, resultando numa concentração final de etanol de 50% v/v. A solução tornou-se muito turva na gama de 36 a 38% v/v de etanol. Neste ponto, a adição de etanol foi parada durante 30 min para permitir o crescimento de partículas. Uma inspecção aprofundada revelou partículas finas, filtráveis. Após um envelhecimento com mistura de 30 minutos, a suspensão foi filtrada sobre um filtro estéril de 0,22 mícrons (Milipore, GP express membrane, 50 cm2). Foram usados aproximadamente 500 ml de etanol absoluto para lavar o bolo. A unidadede filtro foi então transferida para um forno de vácuo e seca durante 2 h a 27°C e 29 pol Hg. Foram recolhidos 730 mg de pó seco e armazenado num frasquinho de vidro colorido, estéril, a -20°C. A Tabela 3 resume a pureza e o rendimento (tal como medido por um ensaio de HPLC analítico) em cada passo do processo. Foram atingidos rendimentos de aproximadamente 100% ao longo de CTAB fracção passa alto, CTAB fracção passa baixo e re-dissolução de precipitado de fracção passa baixo. 65 ΡΕ1242442 A Tabela 4 resume a remoção de proteína e endoto-xina. 0 produto final precipitado po etanol é avaliado em relação à remoção de ARN residual, ADN genómico, endoto-xina, proteína, CTAB, lisozima, LRA™ e Celpure P300. TABELA 3

Pureza e rendimento em cada passo do processo Amostra Volume Conc. Pureza Conc. Massa Rendimento Rendimento (ml) ADN (mg/ml) SC (%) SC (%) SC (mg) do passo (%) cumulativo (%) UCL 5 600 — — _ _ _ — CL 5 050 0, 338 83,6 0,283 1429 100,0 100,0 LCF 6 440 0, 265 83,6 0,222 1429 100,0 100,0 HCF 7 100 O O - O O O O _ _ RHCP 800 1, 933 93, 0 1, 798 1438 100,6 100,6 RHCP* 735 1, 933 O 00 05 1, 798 1322 92,5 92,5 Pós- LRA™ 400 1, 800 97, 1 1, 748 6 99 52,8 48,9 UCL: lisado não clarificado. CL: lisado clarificado com terra de diatomáceas LCF: filtrado de CTAB fracção passa alto. HCF: filtrado de CTAB fracção passa baixo , tal como esperado não contém ADN. RHCP: precipitado de fracção passa baixo re-dissolvido em NaCl 0,5 M. RHCP*: 735 ml alimentados ao passo de LRA™, foram usados aproximadamente 65 ml em estudos de sonda de LRA™. Pós LRA™: filtrado de 0,8 microns a seguir ao passo de adsorção de LRA™. Foi usado um ensaio hplc analítico para medir a conc. de ADN, pureza SC e Conc SC. ΡΕ1242442 66 TABELA 4

As descrições das amostras estão listadas na Tabela 3. LOD: limite de detecção. NA: não ensaiado. 0 teor de proteína foi medido usando o método de Lowry. 0 teor de endotoxina foi medido usando o ensaio de LAL. *concentração de ARN foi medida usando o ensaio Orcinol. Concentrações elevadas de ADN de plasmídeo interferem com o ensaio de Orcinol; esta interferência reflecte-se nas concentrações de ARN listadas para as amostras RHCP e Pós LRA™. A proporção de A260/A280 do produto final era de 1,9, uma indicação de baixo teor de ARN fraccional.

Remoção de proteína, endotoxina e ARN

Amostra Proteína Endotoxina ARN CL 0,937 3,311 1,2e5 4,2e5 1,00 3,55 LCF 0, 709 3,193 9,2e6 4, le7 0, 714 3,22 HCF 0,625 _ NA _ 0,647 RHCP 0,049 0,027 1, le5 6, le4 0,093 0,052* PÓS LRA™ LOD — 0,05 0,03 0,075 0,043* A Figura 6 ilustra a composição em ADN de amostras de passos do processo descritos nesta secção de Exemplo. 0 plasmídeo super-enrolado é visualizado na banda mais baixa. As bandas mais elevadas representam várias impurezas de ADN, incluindo plasmídeo de círculo aberto e plasmídeo linear, multímeros de plasmídeo e ADN genómico. É mostrado um lisado clarificado com terra de diatomáceas (faixa 1, a partir da esquerda); filtrado de fracção passa alto a 0,23% p/v de CTAB (faixa 2); filtrado de fracção passa baixo a 67 ΡΕ1242442 0,30% p/v de CTAB, não contendo ADN (faixa 3); precipitado de fracção passa baixo em NaCl 0,4 M (faixa 4); precipitado de fracção passa baixo em NaCl 0,475 M (faixa 5); precipitado de fracção passa baixo em NaCl 0,5 M (faixa 6); filtrado de 0,8 mícrons a seguir ao passo de adsorção de LRA (faixa 7); produto de LRA sujeito a precipitação com etanol e re-dissolução em água esterilizada (faixa 8) . Uma comparação das faixas 1 e 8 revela que há uma redução substancial nas impurezas do tipo produtos de degradação de ADN. EXEMPLO 2

Uso de um Analisador de Dimensão de Partícula para Monitorizar a Precipitação CTAB A precipitação CTAB pode ser monitorizada pormenorizadamente usando, por exemplo, um analisador de dimensão de partícula Lasentec®. Os detritos residuais de células finamente divididos e outras impurezas, incluindo ADN genómico e produtos de degradação de ADN lineares e circulares relaxados são separados por precipitação do lisado clarificado por adição de uma solução de CTAB 1,0% p/v em NaCl 40 mM até uma concentração final de 0,25 - 0,28 % p/v de CTAB. A precipitação das impurezas é monitorizada em tempo real usando um analisador de dimensão de partículas Lasentec®. A adição do CTAB é parada após a contagem total de partículas cair abruptamente. Isto é exactamente o CTAB suficiente para precipitar o ADN linear e circular relaxado ao mesmo tempo que deixa o ADN super- 68 ΡΕ1242442 enrolado em solução. A batelada é então filtrada para remover as impurezas precipitadas. É adicionado CTAB à batelada até uma concentração final de 0,30 - 33% p/v de CTAB para precipitar o ADN super-enrolado. A Figura 5 mostra a precipitação de impurezas por CTAB a 0,25 - 0,30% p/v usando um analisador de dimensão de partículas Lasentec®. A adição de CTAB é parada aos 100 minutos com base na alteração abrupta de contagem de partículas. As impurezas precipitadas são removidas por filtração. É adicionado CTAB adicional para precipitar o plasmídeo super-enrolado. A presente invenção não deve ser limitada no âmbito pelos modelos de realização específicos aqui descritos .

Lisboa, 26 de Outubro de 2007

Claims (21)

1. ΡΕ1242442 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método de purificar ADN de plasmideo super-enrolado de um lisado de células de uma fermentação microbiana, o qual inclui a adição de silicato de sódio cristalizado, hidratado, ao lisado de células para adsorver impurezas residuais separando-as do ADN de plasmideo super-enrolado.
2. 2. Um método da reinvindicação 1, em que o lisado de células é clarificado antes de adição do silicato de cálcio cristalizado, hidratado.
3. 3. Um método de acordo com a reivindicação 1, o qual inclui: (a) precipitação de ADN de plasmideo super-enrolado por uma precipitação induzida por detergente; (b) re-dissolução do ADN de plasmideo super-enrolado precipitado numa solução de sal; (c) adição de silicato de cálcio cristalizado, hidratado, ao plasmideo super-enrolado re-suspenso para adsorver impurezas residuais separando-as do ADN de plasmideo super-enrolado, resultando numa solução contendo o ADN de plasmideo super-enrolado; e (d) concentração do ADN de plasmideo super-enrolado.
4. 4. Um método de acordo com a reivindicação 3, em que o detergente do passo (a) é um brometo de hexadecil-trimetilamónio. 2 ΡΕ1242442
5. 5. Um método de acordo com a reivindicação 4, em que o passo de precipitação induzida por brometo de hexadeciltrimetilamónio ocorre num tampão STET padrão.
6. 6. Um método de acordo com a reivindicação 4 ou a reivindicação 5, em que o brometo de hexadeciltrimetilamónio é adicionado num processo em dois passos, em que ocorre uma primeira precipitação induzida por brometo de hexadeciltrimetilamónio para retirar por precipitação resíduos e ADN de plas-mídeo não-super-enrolado, e em que ocorre uma segunda precipitação induzida por brometo de hexadeciltrimetilamónio para precipitar o ADN de plasmídeo super-enrolado.
7. 7. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, em que o lisado de células é clarificado antes da precipitação induzida por detergente.
8. 8. Um método de acordo com a reivindicação 2 ou a reivindicação 7, em que o lisado de células é clarificado por adição de terra de diatomáceas.
9. 9. Um método de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que o ADN de plasmídeo super-enrolado é concentrado por um processo seleccionado de entre o grupo que consiste de precipitação por álcool e ultrafiltração.
10. 10. Um método de acordo com a reivindicação 9, em que o ADN de plasmídeo super-enrolado é concentrado por precipitação com etanol. 3 ΡΕ1242442
11. 11. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes em que é adicionado silicato de cálcio cristalizado, hidratado, de uma maneira passo a passo.
12. 12. Um método de acordo com a reivindicação 6, o qual inclui: (a) colheita de células microbianas a partir de um caldo de fermentação; (b) adição de uma quantidade suficiente de solução de lise às células microbianas colhidas; (c) aquecimento das células microbianas do passo (b) a uma temperatura entre 70°C e 100°C num permutador de calor de fluxo continuo para formar um lisado de célula; (d) arrefecimento do lisado de célula; (e) clarificação do lisado de célula usando filtração com terra de diatomáceas; (f) precipitação de impurezas e dos detritos de células residuais com uma primeira precipitação induzida por brometo de hexadeciltrimetilamónio; (g) precipitação selectiva de ADN de plasmideo super-enrolado com uma segunda precipitação induzida por brometo de hexadeciltrimetilamónio; (h) re-dissolução do ADN de plasmideo super-enrolado num tampão incluindo NaCl na gama de 0,2 M a 2 M para dissolução selectiva de ADN de plasmideo; (i) adsorção de impurezas residuais sobre silicato de cálcio cristalizado, hidratado, dentro do tampão do passo (h); 4 ΡΕ1242442 (j) precipitação do ADN de plasmideo super-enrolado com etanol; (k) filtração para recolher e lavar o precipitado; (l) secagem para remover o etanol; (m) re-dissolução do ADN de plasmideo super-enrolado purificado num tampão de formulação fisiologica-mente aceitável; e, (n) esterilização da solução tamponizada do passo (m) contendo o ADN de plasmideo super-enrolado purificado por filtração através de um filtro de 0,22 pm.
13. 13. Um método de acordo com a reivindicação 6 incluindo os passos (a) a (i) da reivindicação 12, em que o tampão do passo (i) é esterilizado e o ADN é concentrado por precipitação com etanol, resultando num precipitado em pó contendo o ADN de plasmideo super-enrolado.
14. 14. Um método de acordo com a reivindicação 4 ou a reivindicação 5, o qual inclui: (a) colheita de células microbianas a partir de um caldo de fermentação; (b) adição de uma quantidade suficiente de solução de lise às células microbianas colhidas; (c) aquecimento das células microbianas do passo (b) a uma temperatura entre 70°C e 100°C num permutador de calor de fluxo continuo para formar um lisado de célula; (d) arrefecimento do lisado de célula; (e) clarificação do lisado de célula usando filtração com terra de diatomáceas; 5 ΡΕ1242442 (f) precipitação de ADN de plasmideo super-enrolado com brometo de hexadeciltrimetilamónio; (g) re-dissolução do ADN de plasmideo super-enrolado num tampão incluindo NaCl na gama de 0,2 M a 2 M para dissolução selectiva de ADN de plasmideo; (h) adsorção de impurezas residuais sobre silicato de cálcio cristalizado, hidratado, dentro do tampão do passo (g); (i) precipitação do ADN de plasmideo super-enrolado com etanol; (j) filtração para recolher e lavar o precipitado; (k) secagem para remover o etanol; (l) re-dissolução do ADN de plasmideo super-enrolado purificado num tampão de formulação fisiologica-mente aceitável; e, (m) esterilização da solução tamponizada do passo (1) contendo o ADN de plasmideo super-enrolado purificado por filtração através de um filtro de 0,22 pm.
15. 15. Um método de acordo com a reivindicação 4 ou a reivindicação 5, incluindo os passos (a) a (h) da reivindicação 14, em que o tampão do passo (h) é esterilizado e o ADN é concentrado por precipitação com etanol, resultando num precipitado em pó contendo o ADN de plasmideo super-enrolado .
16. 16. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, em que as células microbianas do passo (b) são aquecidas no passo (c) a uma temperatura de desde cerca de 70 °C a cerca de 80 °C. 6 ΡΕ1242442
17. 17. Um método de acordo com a reivindicação 6, o qual inclui: (a) colheita de células microbianas a partir de um caldo de fermentação; (b) adição de uma quantidade suficiente de lisozi-ma/solução alcalina/KOAc às células microbianas colhidas para promover a lise de células, formando um lisado de células; (c) clarificação do lisado de célula usando filtração com terra de diatomáceas; (d) precipitação dos detritos de células residuais e impurezas com uma primeira precipitação induzida por brometo de hexadeciltrimetilamónio; (e) precipitação selectiva de ADN de plasmídeo super-enrolado com uma segunda precipitação induzida por brometo de hexadeciltrimetilamónio; (f) re-dissolução do ADN de plasmideo super-enrolado num tampão incluindo NaCl na gama de 0,2 M a 2 M para dissolução selectiva de ADN de plasmídeo; (g) adsorção de impurezas residuais sobre silicato de cálcio cristalizado, hidratado, dentro do tampão do passo (f); (h) precipitação do ADN de plasmideo super-enrolado com etanol; (i) filtração para recolher e lavar o precipitado; (j) secagem para remover o etanol; (k) re-dissolução do ADN de plasmídeo super-enrolado purificado num tampão de formulação fisiologica-mente aceitável; e, 7 ΡΕ1242442 (1) esterilização da solução tamponizada do passo (k) contendo o ADN de plasmídeo super-enrolado purificado por filtração através de um filtro de 0,22 μπι.
18. 18. Um método de acordo com a reivindicação 6, incluindo os passos (a) a (g) da reivindicação 17, em que o tampão remanescente do passo (g) é esterilizado e o ADN de plasmideo super-enrolado é concentrado por precipitação com etanol, resultando num precipitado em pó contendo o ADN de plasmideo super-enrolado.
19. 19. Um método de acordo com a reivindicação 4 ou a reivindicação 5, o qual inclui: (a) colheita de células microbianas a partir de volume de fermentação maior do que 5 litros; (b) adição de uma quantidade suficiente de lisozi-ma/solução alcalina/KOAc às células microbianas colhidas para promover a lise de células, formando um lisado de células; (c) clarificação do lisado de célula usando filtração com terra de diatomáceas; (d) precipitação de ADN de plasmideo super-enrolado com brometo de hexadeciltrimetilamónio; (e) re-dissolução do ADN de plasmideo super-enrolado num tampão incluindo NaCl na gama de 0,2 M a 2 M para dissolução selectiva de ADN de plasmideo; (f) adsorção de impurezas residuais sobre silicato de cálcio cristalizado, hidratado, dentro do tampão do passo (e); ΡΕ1242442 (g) precipitação do ADN de plasmideo super-enrolado com etanol; (h) filtração para recolher e lavar o precipitado; (i) secagem para remover o etanol; (j) re-dissolução do ADN de plasmideo super-enrolado purificado num tampão de formulação fisiologica-mente aceitável; e, (k) esterilização da solução tamponizada do passo (j) contendo o ADN de plasmideo super-enrolado purificado por filtração através de um filtro de 0,22 pm.
20. 20. Um método de acordo com a reivindicação 4 ou a reivindicação 5, incluindo os passos (a) - (f) da reivindicação 19, em que o tampão do passo (f) é esterilizado e o ADN é concentrado por precipitação com etanol resultando num precipitado em pó contendo o ADN de plasmideo super-enrolado .
21. 21. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 20, em que o(s) passo (s) de precipitação induzida por brometo de hexadeciltrimetilamónio ocorre(m) num tampão STET padrão. Lisboa, 26 de Outubro de 2007