KR102650233B1

KR102650233B1 - 폴리뉴클레오타이드의 분리 및 정제를 위한 용해 코일 장치 및 그것의 용도

Info

Publication number: KR102650233B1
Application number: KR1020207038119A
Authority: KR
Inventors: 자레드 넬슨; 스티븐 로드리게즈; 제프리 이. 다넬
Original assignee: 브이지엑스아이 인코포레이티드
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2024-03-21
Also published as: JP2021525521A; EP3802781A4; AU2019278943A1; BR112020023958A2; KR20210015973A; EP3802781A1; JP7457660B2; MX2020012910A; WO2019232324A1; CA3101009A1; US20210207075A1; CN112424337A

Abstract

본 발명은 DNA 플라스미드의 생산을 위한 시스템 및 공정에 포함될 수 있는 용해 코일 장치를 제공한다.

Description

폴리뉴클레오타이드의 분리 및 정제를 위한 용해 코일 장치 및 그것의 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018년 5월 31일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제 62/678,355호에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

생체분자는 보통 다양한 연구 및 개발 목적으로, 그리고 많은 경우에 환자를 치료하기 위한 바이오의약품의 제조를 위해 가공되고 정제된다. 특히, DNA 플라스미드를 포함한, 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포로부터 정제될 수 있다.

증가하는 관심이 유전자 질환의 치료 및 유전자 면역화를 위한 치료제로서 DNA의 전달(즉, DNA 유전자 요법)에 집중되었다. 잠재적으로 감염성인 바이러스를 사용함으로 인한 안전성 문제 때문에, 연구자들은 네이키드 DNA 또는 DNA 전달의 다른 비바이러스 방법을 사용하는, 바이러스에 대한 대체물을 연구하고 있다. 유전자 요법에 대한 수요가 증가함에 따라, 막대한 양의 플라스미드 또는 적절한 DNA가 필요하게 될 것이다. 그러나, 인간에 적용하기 위해 필요한 순도 수준에서 더욱 더 많은 양의 DNA를 분리하기 위한 현재 방법의 한계는 이 분야의 진전을 방해할 수 있다.

일반적으로, DNA 플라스미드 제조 방법은 플라스미드를 숙주 세포에서 복제하는 단계, 플라스미드를 그 세포로부터 용해시키고 방출시키는 단계, 및 그런 후 플라스미드를 분리시키는 단계를 포함한다. 이 모든 단계는 인간에서 임상 연구에 필요한 고순도 수준을 얻는 한편으로, 임상 연구를 위한, 궁극적으로 상업적인 공급을 위한 적절한 투여량 수준을 제공하기에 필요한 양으로 수행될 필요가 있다.

플라스미드를 정제하는 다양한 기존 방법이 있다; 그러나, 이들 방법은 대규모 제조에는 적합하지 않다. 실험실 규모 정제 기법은 대규모 플라스미드 제조에 포함된 부피로 간단하게 확대될 수 없다. 대규모 제조는 오염물질의 제거 및 플라스미드의 농축을 최대화하면서 수율 및 분자 통합성의 최적화를 필요로 한다. 다량의 플라스미드 DNA를 고농도로 제조함에 있어서, 문제는 플라스미드를 수퍼코일 및 개방 원형 풀린 형태로 유지하는 데 있다. 보관 조건은 일반적으로 고염을 필요로 하고, 시간 경과에 따른 분자 분해는 염의 존재 하에서도 여전히 문제로 남는다. 많은 기존의 정제 방법이 잠재적으로 위험한, 독성, 돌연변이 유발성 또는 오염된 물질, 및/또한 값비싼 물질 또는 장비의 사용에 의존하는데, 이것들은, 다시 말하면, 대규모 제조에는 바람직하지 않다. 일부 기존의 정제 방법이 궁극적 제거를 위해 단백질을 소화시키는 효소를 이용하며 이러한 효소는 대규모 생산을 위해서는 값비싸며 생물학적 오염의 위험을 유발할 수 있다.

숙주 박테리아 세포를 용해시키는 다양한 방법이 있다. 플라스미드 정제를 위해 실험실 규모로 사용되는 잘 알려져 있는 방법으로는 효소를 이용한 소화(예컨대 리소자임을 사용함), 열 처리, 압력 처리, 기계적 분쇄, 초음파 처리, 카오트로픽제(chaotropes)(예컨대 구아니디늄 이소티오시아네이트)로의 처리, 및 유기 용매(예컨대 페놀)로의 처리를 들 수 있다. 비록 이들 방법이 소규모로 쉽게 이루어질 수 있긴 하지만, 몇 가지는 플라스미드 제조에서 대규모 용도에 성공적으로 적응되었다. 현재, 플라스미드 정제를 위해 박테리아를 용해시키는 바람직한 방법은 알칼리 및 계면활성제의 사용을 통한다. 이런 기법은 원래 Birnboim 및 Doly에 의해 기술되었다(1979, Nucleic Acids Res. 7, 1513 1523). 이 과정의 일반적으로 사용된 변화는 Sambrook 등의 참고문헌(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) pp. 1.38 1.39에서 기술된다. 이 용해 방법은 뚜렷한 장점을 가지며; 세포로부터 플라스미드 분자의 효율적인 방출을 제공하는 것에 더불어, 이 과정은 많은 양의 숙주 단백질, 지질, 및 게놈 DNA를 제거함으로써 플라스미드의 실질적인 정제를 제공한다. 게놈 DNA의 제거는 특히 중요한데, 왜냐하면 그것이 다른 수단에 의해 플라스미드 DNA로부터 분리되는 것이 어려울 수 있기 때문이다. 이들 장점은 이것을 실험실 규모로 플라스미드를 정제하는 중에 박테리아 세포를 용해시키기 위한 바람직한 방법으로 만들어주었다.

이전에는 세포 현탁액과 용해 용액을 혼합하는 것이 매우 낮은 전단력에서 수행되어야 한다고 여겨졌다. 이것은 플라스미드-함유 박테리아의 현탁액을 알칼리 및 계면활성제를 포함하는 용해 용액과 혼합하는 것에 관련하여 기술되었다. 미국 특허 제 5,837,529호 및 미국 특허 출원 번호 2002/0198372. 각각은 연속적인 저전단 혼합을 이루기 위하여 정적 혼합기를 사용하는 것을 고려하는 한편, 미국 특허 제 6,395,516호는 배치(batch) 모드로 제어된 혼합을 위해 설계된 용기를 사용하는 것을 고려한다. 이러한 방법은 분명한 단점을 가진다. 한 가지 관점으로, 과잉 전단을 최소화하기 위하여 노력하는 한편으로, 용해 용액과 세포 현탁액의 혼합이 불완전해질 수 있다. 다른 관점으로, 정적 혼합기를 사용하는 것은 공정 유연성을 제한한다. 미국 특허 공보 번호 2002/0198372에서 기술된 것과 같이, 정적 혼합 요소의 수, 뿐만 아니라 그 요소들을 통과하는 유체의 유량을 최적화하는 것이 필요하다. 이러한 최적화는 최적화된 정적 혼합 장치로 주어진 시간 안에 처리될 수 있는 물질의 양을 제한한다. 이것은 새로운, 고용량의 정적 혼합 장치가 구성되고 최적화되지 않는 한, 공정 규모를 증가시키는 능력을 제한한다. 미국 특허 제 6,395,516호에서 기술된 배치 혼합 용기의 사용은 비슷한 단점을 가진다. 배치 혼합 용기의 모든 영역에서 완전한 혼합을 이루는 것은 기술분야의 지식을 가진 사람들에게 도전적인 것으로 잘 알려져 있다. 나아가, 배치 혼합 용기는 세포 현탁액이 용해 용액과 접촉되는 노출 시간의 제어를 필요로 하는 적용에는 잘 맞지 않는다. 특히, 플라스미드-함유 세포의 알칼리에 대한 연장된 노출이 과도한 양의 영구적으로 변성된 플라스미드의 형성으로 이어질 수 있고, 이것은 비활성이며, 바람직하지 못하고, 후속적으로 생물학적으로 활성인 플라스미드로부터 계속해서 분리하기 어렵다는 것이 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이러한 노출 시간을 약 10분 이하로 제한하는 것이 바람직하다. 이러한 제한된 노출 시간을 이루는 것은 대규모 배치 혼합을 사용해서는 어렵거나 불가능하다. 상기 문제에 대한 해결책은 부분적으로 미국 특허 공보 번호 2009/0004716 A1에서 기술되었다.

그러므로, 기술분야에는 관심 있는 생물학적 활성 분자, 예컨대 플라스미드의 대규모 생산 방법에 대한 필요성, 특히 대규모 생산을 위해 구성된, 휴대용, 일회용(1회 사용), 및/또는 경제적인 용해 코일 장치를 포함하는 제조 장치, 및 이러한 장치를 사용하는 제조 방법에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.

본 발명의 측면은 세포 현탁액의 용액 및 용해 용액을 유동적으로 수용할 수 있고, 상기 용액을 용액 혼합물로서 유동적으로 전달함으로써 세포 현탁액 중의 세포 내용물을 용해하고 방출시킬 수 있는 용해 코일 장치를 포함하며, 용해 코일 장치는 높이를 가지는 원주형 용해 코일 홀더, 및 제1 단부, 제2 단부, 및 그 사이의 길이를 가지는 유연한 용해 코일을 포함하고, 상기 유연한 용해 코일은 제1 단부로부터 세포 현탁액의 용액 및 용해 용액을 수용하여 제2 단부로부터 용해 코일 외부로 상기 혼합 용액을 전달하도록 구성되며; 상기 용해 코일 홀더는 유연한 용해 코일을 수용하고 상기 원주형 용해 코일 홀더의 외부 표면 위에 고정할 수 있다. 발명의 일부 측면으로, 용해 코일 홀더는 용해 코일 홀더의 높이를 가로지르는 길이를 가지는 균일한 나선형 홈이 내장된 표면을 가지며, 상기 유연한 용해 코일은 용해 코일이 용해 코일 홀더의 홈에 의해 수용되는 것을 가능하게 하고 상기 용해 코일 홀더의 홈의 길이를 가로지르는 크기의 내부 직경을 가진다.

일부 구현예에서, 상기 용해 코일의 내부 직경은 약 1 인치(inch) 미만이며, 7/8, 3/4, 5/8, 1/2, 3/8, 또는 1/4 인치를 포함할 수 있고, 바람직하게 상기 용해 코일의 내부 직경은 일부 구현예에서 3/4 인치, 일부 구현예에서 1/2 인치, 또는 다른 바람직한 구현예에서 3/8 인치이다. 일부 구현예에서, 용해 코일은 용액 혼합물이 용해 코일에서 약 4 내지 약 6분, 바람직하게 약 5분의 보유 시간을 초래할 선형 유량으로 흐르도록 구성된다. 한편 일부 구현예에서, 용해 코일은 용액 혼합물이 8 m/분 내지 약 12 m/분의 선형 유량, 바람직하게 약 9.95, 9.90, 9.85, 9.80, 9.75, 9.70, 9.65, 9.60, 9.55, 또는 9.50 m/분, 보다 바람직하게 9.80, 9.75, 또는 9.70 m/분의 선형 유량으로 흐를 수 있도록 구성된다. 용해 코일은 100 피트(feet)보다 큰, 바람직하게 140, 145, 150, 155, 160, 165, 또는 170 피트, 보다 바람직하게 150, 155 또는 160 피트의 길이를 가질 수 있다. 용해 코일 장치의 일부 구현예에서, 용해 코일은 단일 사용 후 폐기될 수 있다.

용해 코일 홀더는 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 인치, 바람직하게 23, 24, 또는 25 인치의 방사상 직경, 및 약 3 피트 내지 약 6.25 피트, 약 3.5 피트 내지 약 6.25 피트, 약 4 피트 내지 약 6.25 피트, 약 4.5 피트 내지 약 6.25 피트, 약 5.0 피트 내지 약 6.25 피트, 약 3.5 피트 내지 약 6.0 피트, 약 4 피트 내지 약 6.0 피트, 약 4.5 피트 내지 약 6.0 피트, 약 5.0 피트 내지 약 6.0 피트, 약 3.5 피트 내지 약 5.75 피트, 약 3.75 피트 내지 약 5.75 피트, 약 4 피트 내지 약 5.75 피트, 약 4.5 피트 내지 약 5.75 피트, 또는 약 5.0 피트 내지 약 5.75 피트, 바람직하게 약 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 또는 6.2 피트의 높이를 가질 수 있다. 용해 코일 장치의 일부 구현예에서, 용해 코일 홀더의 홈은 용해 코일 홀더의 원주를 약 2.15도 내지 약 3.43도의 피치(pitch)로 가로지른다. 용해 코일 홀더는 용해 코일 장치가 쉽게 운반될 수 있게 하는 휠 지지대를 가질 수 있다.

용해 코일 장치의 일부 바람직한 구현예에서, 용해 코일은 약 3/8 인치, 1/2 인치, 또는 3/4 인치의 내부 직경을 가지며, 용해 코일은 용액 혼합물이 약 9.70, 9.75, 또는 9.80 m/분의 선형 유량으로 흐를 수 있도록 구성된다. 용해 코일 장치의 일부 바람직한 구현예에서, 용해 코일은 약 150 피트, 155 피트, 또는 160 피트의 길이를 가지며 보유 시간은 약 4.8분, 4.9분, 5.0분, 5.1분, 또는 5.2분이다. 다른 바람직한 구현예에서, 선형 유량은 약 9.75 m/분이고 용해 코일의 길이는 약 150 피트이다. 추가로, 일부 바람직한 구현예에서, 길이는 약 150 피트이고 용해 코일은 용액 혼합물이 약 9.75 m/분의 선형 유량으로 흐를 수 있도록 구성된다. 다른 바람직한 구현예에서, 용해 코일 내부 직경은 3/8 인치이고 용해 코일 길이는 약 150 피트이다.

본 발명의 다른 측면은 세포 현탁액의 용액 및 용해 용액을 유동적으로 수용할 수 있고, 상기 용액을 용액 혼합물로서 중화 용액과 접촉하도록 유동적으로 전달함으로써 세포 현탁액 중의 세포 내용물을 용해시키고 방출시킬 수 있는 용해 코일 장치를 사용하여 원하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 세포를 용해시키는 방법이며, 상기 장치는 높이를 가지는 원주형 용해 코일 홀더, 및 제1 단부, 제2 단부, 및 그 사이의 길이를 가지는 유연한 용해 코일을 포함하고, 상기 유연한 용해 코일은 제1 단부로부터 세포 현탁액의 용액 및 용해 용액을 수용하여 제2 단부로부터 용해 코일 외부로 상기 혼합 용액을 전달하도록 구성되며; 상기 용해 코일 홀더는 일관된 피치로 용해 코일 홀더의 높이를 가로지르는 길이를 가지는 균일한 나선형 홈이 내장된 표면을 가지고; 상기 유연한 용해 코일은 용해 코일이 용해 코일 홀더의 홈에 의해 수용되는 것을 가능하게 하며 상기 용해 코일 홀더의 홈의 길이를 가로지르는 크기의 내부 직경을 가지고, 방법은 일회용 용해 코일을 용해 코일 홀더의 홈에 고정하는 단계; 세포 현탁액의 용액을 용해 코일의 제1 단부에 전달하는 단계; 세포 현탁액의 용액이 용해 용액과 혼합되는 것을 가능하게 하기 위해 용해 용액을 용해 코일의 제1 단부에 전달하는 단계; 및 용액 혼합물을 중화 용액과 함께 구획으로 유동적으로 전달하여 용해 공정을 종료하는 단계를 포함한다.

세포를 용해하는 방법의 일부 구현예에서, 전달 단계는 약 8 m/분 내지 약 12 m/분의 선형 유량으로 일어난다. 세포를 용해하는 방법의 다른 구현예에서, 혼합 용액은 약 4분 내지 6분 내에 용해 코일의 길이를 가로지른다. 일부 구현예에서, 전달 단계는 약 9.75 m/분의 선형 유량으로 일어난다.

발명의 바람직한 구현예의 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독될 때 더 잘 이해될 것이다. 발명을 예시할 목적으로 현재 바람직한 구현예들이 도면에 도시된다. 그러나, 발명은 도면에 나타낸 구현예들의 정확한 배열 및 수단에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
도 1은 예시의 용해 코일 장치의 측면도를 도시한다.
도 2는 예시의 용해 코일 장치의 평면도를 도시한다.
도 3은 예시의 용해 코일 장치의 상부 단부의 확대도를 도시한다.
도 4는 예시의 용해 코일 장치의 단면의 횡단면도를 도시한다.
도 5는 예시의 용해 코일 장치의 기술적 도표를 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 3/4 인치의 내부 직경 및 160 피트의 길이(도 6a); 및 3/8 인치의 내부 직경 및 150피트의 길이(도 6b)를 가지는 용해 코일에서의 코일 보유 시간, 유체 유량, 및 유체 선형 속도 사이의 관계를 측정한 결과를 도시한다.
도 7a 및 도 7b는 플라스미드 A에 대한 정제 데이터 결과를 도시한다.
도 8은 재현탁된 세포 및 용해물의 상이한 단계의 HPLC 분석 결과를 도시한다.
도 9는 6개의 플라스미드 로트에 대한 정제 데이터의 요약을 도시한다.
도 10a 내지 도 10c는 3개의 상이한 용해 코일 장치 구성을 사용한 플라스미드 정제 테스트의 결과를 도시한다.
도 11a 및 도 11b는 5개의 플라스미드 정제 로트에서 사용된 용액의 개관 결과를 도시한다.
도 12는 2개의 상이한 용해 코일 장치 구성을 사용한 6개의 플라스미드 정제 로트의 결과를 열거한 표를 도시한다.
도 13은 도 12의 6개의 플라스미드 정제 로트로부터의 플라스미드 농도의 HPLC 분석 결과를 열거한 표를 도시한다.
도 14는 도 12의 6개의 플라스미드 정제 로트에 대한 대량 방출 테스트 결과를 열거한 표를 도시한다.
도 15a 및 도 15b는 도 12의 6개의 플라스미드 정제 로트에 대한 용해 및 Q 과정의 겔 분석 결과를 열거한 표를 도시한다.
도 16a 내지 도 16f는 용해물 샘플의 HPLC 분석 결과를 도시한다.

정의

다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 발명이 속하는 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 및/또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에서 기술된다. 본 발명을 기술하고 청구함에 있어서, 다음의 용어가 정의가 제공되는 경우, 정의되는 방법에 따라 사용될 것이다.

또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술할 목적을 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아니라는 것이 이해되어야 한다.

본원에서 사용되는 바, "단수"를 나타내는 용어는 하나 또는 하나 이상을 나타낼 수 있다. 본원에서 청구범위에서 사용되는 것과 같이, 단어 "포함하는"과 함께 사용될 때, "단수"를 나타내는 단어는 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "알칼리"는 충분한 양의 물질이 물에 첨가될 때 약 8보다 큰 pH를 제공하는 물질을 나타낸다. 용어 알칼리로는, 한정하는 것은 아니지만, 수산화 나트륨(NaOH), 수산화 칼륨(KOH), 또는 수산화 리튬(LiOH)을 들 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "계면활성제"는 그것이 중성, 음이온성, 양이온성, 또는 양쪽성 이온성이든, 임의의 양친매성 또는 표면-활성제를 나타낸다. 용어 계면활성제로는, 한정하는 것은 아니지만, 도데실 황산 나트륨(SDS), 트리톤(폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르, Dow Chemical Co., Midland, Mich.), 플루로닉(에틸렌 옥사이드/프로필렌 옥사이드 블록 공중합체, BASF Corp., Mount Olive, N.J.), Brij(폴리옥시에틸렌 에테르, ICI Americas, Bridgewater, N.J.), 3-[(3-콜아미도프로필)다이메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS), 3-[(3-콜아미도프로필)다이메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트(CHAPSO), Tween.RTM.(폴리에틸렌 글리콜 소르비탄, ICI Americas, Bridgewater, N.J.), 담즙산 염, 세틸트라이메틸암모늄, N-라우로일사르코신, 쯔비터젠트(n-알킬-N,N-다이메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, Calbiochem, San Diego, Calif.), 등을 들 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "이온 교환"은 관심 있는 분자 또는 분자들과 적합한 이온 교환 물질 사이의, 주로 이온 상호작용을 토대로 한 분리 기법을 나타낸다. 비록 이온 교환 물질이 가장 일반적으로 크로마토그래피 수지 또는 막의 형태를 취할 수 있지만, 그것은 이온 상호작용을 토대로 분리를 수행하기에 적합한 임의의 물질일 수 있다. 용어 이온 교환은 음이온 교환, 양이온 교환, 및 음이온 및 양이온 교환 두 가지의 조합을 다 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "음이온 교환"은 주로 관심 있는 분자 또는 분자들 상의 하나 이상의 음전하와, 적합한 양전하 음이온 교환 물질 사이의 이온 상호작용을 토대로 한 분리 기법을 나타낸다. 비록 음이온 교환 물질이 가장 일반적으로 크로마토그래피 수지 또는 막의 형태를 취할 수 있지만, 그것은 기술된 이온 상호작용을 토대로 분리를 수행하기에 적합한 임의의 물질일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "양이온 교환"은 주로 관심 있는 분자 또는 분자들 상의 하나 이상의 양전하와, 적합한 음전하 양이온 교환 물질 사이의 이온 상호작용을 토대로 한 분리 기법을 나타낸다. 비록 양이온 교환 물질이 가장 일반적으로 크로마토그래피 수지 또는 막의 형태를 취할 수 있지만, 그것은 기술된 이온 상호작용을 토대로 분리를 수행하기에 적합한 임의의 물질일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "소수성 상호작용" 및 "HIC"는 주로 관심 있는 분자 또는 분자들과, 적합한 주로 소수성 또는 친수성 물질 사이의 소수성 상호작용을 토대로 한 분리 기법을 나타낸다. 비록 주로 소수성 또는 친수성 물질이 가장 일반적으로 크로마토그래피 수지 또는 막의 형태를 취할 수 있지만, 그것은 소수성 상호작용을 토대로 분리를 수행하기에 적합한 임의의 물질일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "플라스미드"는 숙주 세포의 일차 게놈의 일부분 또는 단편이 아닌 임의의 구별되는 세포-유래 핵산 실체를 나타낸다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "플라스미드"는 RNA 또는 DNA로 구성된 원형 또는 선형 분자를 나타낼 수 있다. 용어 "플라스미드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 분자를 나타낼 수 있고, 바이러스 및 파지와 같은 핵산 실체를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "게놈 DNA"는 숙주 세포의 게놈으로부터 유래된 DNA를 나타낸다. 본원에서 사용되는 바, 용어는 그것이 선형 또는 원형이든, 단일 가닥 또는 이중 가닥이든, 숙주 세포 일차 게놈의 전부 또는 임의의 일부를 포함하는 DNA 분자를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "내독소"는 그람-음성 박테리아로부터 유래되고 동물에서 유해 효과를 유발하는 리포다당 물질을 나타낸다. 내독소는 전형적으로 리물루스 아메보사이트(limulus amebocyte) 용해물("LAL") 검정에 의해 검출될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "크로마토그래피"는 매트릭스와 상호작용하는 분자 또는 분자들을 포함하는 임의의 분리 기법을 포함한다. 매트릭스는 고체 또는 다공성 비드, 수지, 입자, 막, 또는 임의의 다른 적합한 물질의 형태를 취할 수 있다. 다르게 명시되지 않는 한, 크로마토그래피는 흐름 관통 및 배치 기법 둘 다를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "침전"은 용액, 현탁액, 에멀션 또는 유사한 상태에 존재하는 하나 이상의 구성요소가 그로 인해 고체 물질을 형성하는 과정을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "침전 용액" 및 "침전시키는 용액"은 침전을 유도하는 임의의 용액, 현탁액, 또는 다른 유체를 나타낸다. 다르게 명시되지 않는 한, 침전 용액은 또한 중화를 제공할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "중화"는 산성 또는 알칼리성 물질의 pH가 그로 인해 중성에 가까워지는 과정을 나타낸다. 전형적으로, 중화는 pH를 약 6 내지 약 8의 범위로 가져간다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "중화 용액" 및 "중화시키는 용액"은 산성 또는 알칼리성 물질과 혼합될 때 중화를 초래하는 임의의 용액, 현탁액, 또는 다른 유체를 나타낸다. 다르게 명시되지 않는 한, 중화 용액은 또한 침전을 제공할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "중화/침전 용액"은 중화 및 침전을 둘 다 제공하는 임의의 용액, 현탁액 또는 다른 유체를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "세포 구성요소"는 세포로부터 유래된 임의의 분자, 분자들의 그룹, 또는 분자의 부분을 포함한다. 세포 구성요소의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, DNA, RNA, 단백질, 플라스미드, 지질, 탄수화물, 단당류, 다당류, 리포다당류, 내독소, 아미노산, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 등을 들 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "막"은, 크로마토그래피 또는 분리 방법 및 물질과 관련하여 사용되는 바, 그것을 통해 유체가 흐를 수 있는 다수의 기공 또는 채널을 가진 임의의 실질적으로 연속적인 고체 물질을 나타낸다. 막은, 제한 없이, 평평한 시트, 주름진 또는 접힌 층, 및 주조 또는 가교 결합된 다공성 모노리스와 같은 기하학적 구조를 포함할 수 있다. 대조적으로, 세포 구성요소와 관련하여 사용될 때, 용어 "막"은 세포를 둘러싸고 있는 지질-기반 외피의 전부 또는 일부를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "버블 혼합기"는 둘 이상의 미혼합 또는 불완전하게 혼합된 물질을 혼합하기 위해 버블을 사용하는 임의의 장치를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "세포 현탁액"은 세포, 세포 응집물, 또는 세포 단편을 포함하는 임의의 유체를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "세포 용해물"은 세포를 포함하는 임의의 물질을 나타내며, 세포의 실질적인 부분은 파괴되고 방출된 그것의 내부 구성요소를 가진다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "용해 용액"은 접촉된 세포의 용해를 유발하는 임의의 용액, 현탁액, 에멀션, 또는 다른 유체를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "정화된 용해물"은 가시적인 미립자 고체가 실질적으로 고갈된 용해물을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "매크로미립자"는 직경이 약 100 μm 이상인 입자를 포함하는 고체 물질을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "마이크로미립자"는 직경이 약 100 μm 미만인 입자를 포함하는 고체 물질을 나타낸다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "한외여과" 및 "UF"는 용액 또는 현탁액이 용매 및 작은 용질 분자가 통과할 수 있도록 하는 한편 거대분자는 보유하는 반투과성 막에 적용되는 임의의 기법을 나타낸다. 한외여과는 용액 또는 현탁액 중의 거대분자의 농도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 다르게 명시되지 않는 한, 용어 한외여과는 연속식 및 배치식 기법 둘 다를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "정용여과(diafiltration)" 및 "DF"는 거대분자의 용액 또는 현탁액에 존재하는 용매 및 작은 용질 분자가 한외여과에 의해 제거되고 상이한 용매 및 용질 분자로 대체되는 임의의 기법을 나타낸다. 정용여과는 거대분자의 용액 또는 현탁액의 pH, 이온 강도, 염 조성, 완충제 조성, 또는 다른 특성을 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 다르게 명시되지 않는 한, 용어 정용여과는 연속식 및 배치식 기법을 둘 다 포함한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "한외여과/정용여과" 및 "UF/DF"는 순차적으로 또는 동시에 한외여과 및 정용여과를 둘 다 이루는 임의의 기법 또는 기법의 조합을 나타낸다.

설명

본 발명의 측면은 플라스미드 생산 또는 제조를 위한 전체 시스템 또는 공정 또는 플라스미드 제조에 통합될 수 있는, 특히 DNA 플라스미드의 대규모 생산을 포함하는 것들을 위한 용해 코일 장치를 포함한다. 본원에 기술된 용해 코일 장치는 용해 용액, 예컨대 알칼리 용해 용액과 혼합되도록 의도된 세포 현탁액이 용해 코일 장치의 한 단부로 함께 흐를 수 있도록 제조 공정에 통합될 수 있다. 혼합물은 용해 코일 장치의 길이를 가로지른 후 용해 용액의 중화를 가능하게 하기 위해 상기 용해 코일 장치의 반대쪽 단부로부터 챔버 또는 다른 유사 장치로 유출될 수 있다. 바람직하게, 길이 및 시간은 거의 모든 세포가 원하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, DNA 플라스미드가 손상되지 않는 한편, 동시에 바람직하지 못한 게놈 폴리뉴클레오타이드의 절단을 피하면서 용해되는 것을 가능하게 한다. 용해 코일 장치는 용해 코일 홀더, 및 용해 코일로 구성된다. 바람직하게, 용해 코일 홀더는 대칭 기하학적 모양, 보다 바람직하게는 원주형의 것이다. 용해 코일 홀더는 용해 코일을 수용할 수 있는 외부 표면에 홈을 가진다. 바람직하게, 홈은 용해 코일을 수용하고 지지하기 위한 깊이 및 크기의 것이며, 보다 바람직하게, 홈은 용해 코일 홀더의 전체 높이에서 원하는 피치로 대칭적으로 배열된다. 상기 언급된 것은 용액이 세포를 효과적으로 용해시키기 위해 본원에 기술된 선형 유량으로 용해 코일의 길이를 가로지르기 위해 원하는 시간을 허용한다.

세포 배양은 배치식 발효 및 유가식(fed-batch) 발효를 포함한, 이용 가능한 발효 공정 중 어느 하나를 사용하여 생성될 수 있다. 나중에 세포 현탁액을 용해 용액과 조합하여 용해 코일 안으로 통과시키게 하는 발효 장치 및 공정의 한 구현예는 미국 공개 번호 2009/0004716 A1에서 기술된 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 세포는 높은 복사 수의 관심 있는 플라스미드를 함유한 대장균이고, 플라스미드-함유 세포는 배치식 또는 유가식 기법을 사용하여 고밀도로 발효된다. 세포는 임의의 수단, 예컨대 원심분리 또는 여과에 의해 수득되어 세포 페이스트가 형성된다. 이러한 수득 방법은 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있다. 이러한 플라스미드-함유 대장균 세포를 제조하는 방법 및 이러한 배치식 또는 유가식 발효를 수행하는 방법은 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있다. 세포는 원심분리 또는 여과와 같은 일상적인 수단에 의해 수득되어 세포 페이스트가 형성될 수 있다. 이러한 수득 방법은 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있다. 수득된 세포는 용해 용액을 사용하여 용해되어 관심 있는 생물학적으로 활성인 분자를 포함한, 그것의 내용물이 용해물 용액으로 방출될 수 있다. 나아가, 기술분야에 숙련된 사람들은 수득된 세포 또는 세포 페이스트가 즉시 가공되거나, 또는 나중에 가공하기 위하여 냉동 또는 냉장 상태로 보관될 수 있음을 인식할 것이다.

고수율 발효 공정은 DNA 플라스미드의 고수율을 생산하기 위해 중요한데, 고성장이 출발 물질의 고수준으로 이어질 수 있기 때문이다. 이들 고수율 발효 공정은 >500 mg/L 플라스미드 수율을 제공하는 것이며, 다른 것들 중에서도 Merck 공정(공보 WO2005078115(그 전문이 본원에 포함됨)에서 더 상세하게 설명됨), Boerhinger Ingleheim 공정(공보 WO2005097990(그 전문이 본원에 포함됨)에서 더 상세하게 설명됨), 및 Nature Technology Corporation 공정(공보 WO2006023546(그 전문이 본원에 포함됨)에서 더 상세하게 설명됨)을 예로 들 수 있다.

일반적으로, 용해 코일 장치를 통해 세포를 용해하기 전에, 세포 페이스트는 관심 있는 생물학적 활성 분자를 함유하는 세포의 현탁액을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 세포는 임의의 적합한 용액에 현탁될 수 있다. 현탁액 용액에 세포를 함유한 현탁액은 탱크 또는 다른 보관 용기에서 유지될 수 있다. 2개의 용기가 사용될 수 있는데 이 경우 제2 용기는 추가적인 양의 세포를 재현탁하기 위해 사용될 수 있는 한편 제1 용기는 용해 공정에 사용된다. 일부 구현예에서, 현탁액 용액은 약 25 mM의 Tris-염산염("Tris-HCl"), 및 약 10 mM의 에데트산 이나트륨("Na₂EDTA")을 약 8의 pH에서 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액은 공지 중량의 세포 페이스트를 공지 중량의 현탁액 완충제로 현탁시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 1부의 세포 페이스트가 약 4 내지 10부의 완충제, 일부 구현예에서는 약 6 내지 8부의 완충제에 재현탁될 수 있다. 일부 구현예에서, 그 결과의 세포 현탁액의 광학 밀도는 약 50-80 OD₆₀₀ 유닛일 수 있다. 일부 구현예에서, 그것은 약 60-70 OD₆₀₀ 유닛일 수 있다.

발효 공정에 이어서, 세포는 관심있는 세포 구성요소를 포함한 그것의 내용물을 용액에 방출시키기 위해 용해될 수 있다. 용해 용액은 탱크에 로딩될 수 있고, 용해 용액은 하나 이상의 용해제, 예컨대 알칼리, 산, 효소, 유기 용매, 계면활성제, 카오트로픽제, 변성제, 또는 둘 이상의 이러한 작용제의 혼합물을 함유한다. 보다 바람직하게, 용해 용액은 알칼리, 계면활성제, 또는 이것들의 혼합물을 포함한다. 적합한 알칼리로는, 한정하는 것은 아니지만, NaOH, LiOH, 또는 KOH를 들 수 있다. 계면활성제는 비이온성, 양이온성, 음이온성, 또는 양쪽이온성일 수 있다. 적합한 계면활성제로는, 한정하는 것은 아니지만, 도데실 황산 나트륨("SDS"), Triton, Tween, 플루로닉계 작용제(에틸렌옥사이드 및 프로필렌옥사이드 계 블록 공중합체), Brij, 및 CHAPS, CHAPSO, 담즙산염, 세틸트라이메틸암모늄, N-라우로일사르코신, 및 양쪽성이온 계면활성제를 들 수 있다. 적합한 알칼리 또는 계면활성제의 선택은 기술분야의 통상적인 지식 내에 있을 것이다. 일부 구현예에서, 용해 용액은 NaOH 및 SDS를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, NaOH의 농도는 약 0.1 내지 약 0.3 N일 수 있고, 일부 구현예에서, 약 0.2 N일 수 있다. 일부 구현예에서, SDS의 농도는 약 0.1% 내지 약 5%일 수 있고, 일부 구현예에서 약 1%일 수 있다. 일부 구현예에서, 용해 용액은 탱크 또는 다른 보관 용기에 보유될 수 있다. 이 단계를 수행하기 위한 바람직한 방법은 본원에서 개시되며, 하기에서 상세하게 기술된다.

세포 현탁액 및 용해 용액은 세포를 용해하고 용해물 용액을 생산하기 위해 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 이것들은 조합되고, 혼합되며 고수준의 세포 용해 및 생물학적 물질의 방출을 용이하게 하기에 충분한 시간 동안 혼합물로서 보유되고, 그로써 용해물 용액이 형성된다.

일부 구현예에서, 세포 현탁액 및 용해 용액은 별도의 용기에 보유되고 하나 이상의 펌프를 사용하여 그러한 탱크로부터 회수된다. 세포 현탁액 및 용해 용액은 "Y"자형 커넥터, 또는 세포 현탁액을 용해 용액과 함께 용해 코일의 수용 단부에 또는 근처에 도입하는 임의의 다른 커넥터를 사용하여 서로와 접촉하게 될 수 있다. 커넥터는 그런 후 용해 코일의 제1 단부, 바람직하게 용해 코일의 하부 단부를 통해 용해 코일 장치에 연결된다. 일부 구현예에서, 동등한 부피의 세포 현탁액 및 용해 용액이 이중 헤드 펌프를 사용하여 동등한 유량으로 펌핑될 수 있다. 그러나, 기술분야에 숙련된 사람들은 상이한 부피의 세포 현탁액 및 용해 용액이 필요에 따라, 개별 펌프를 사용하여, 상이한 속도로 펌핑될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액 및 용해 용액은 이중 헤드 펌프, 또는 2개의 별도의 펌프를 통해 약 0.3 L/분 내지 약 2 L/분으로 동시에 펌핑되고, 이때 접촉된 유체는 "Y"자형 커넥터를 약 0.6 L/분 내지 약 4 L/분의 속도로 빠져나간다. 기술분야에 숙련된 사람들은 임의의 관통 필요조건을 충족하기 위해, 이들 유량이 쉽게 증가되거나 감소될 수 있고, 튜빙 크기가 증가 또는 감소될 수 있음을 인식할 것이다. "Y"자형 커넥터를 빠져나온 후, 세포 현탁액 및 용해 용액은 함께 용해 코일의 제1 단부로 흘러가며 그것들이 용해 코일의 제2 단부를 빠져나갈 때가지 용해 코일의 전체 길이를 가로지른다.

본 발명의 한 측면은 관심 있는 세포 구성요소를 추출하기 위하여 제어된 방식으로 세포를 용해시키기 위한 방법에 관한 것이다. 세포는 관심 있는 세포 구성요소를 함유한 임의의 세포일 수 있다. 바람직하게, 그것은 미생물 세포이다. 보다 바람직하게, 그것은 대장균 세포이다. 본 발명은 세포로부터 관심 있는 임의의 세포 구성요소를 추출하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게, 이것들은 플라스미드 또는 단백질과 같은 거대분자일 것이다. 보다 바람직하게, 이것들은 플라스미드이다. 그러므로, 한 바람직한 구현예에서, 본 발명은 플라스미드를 추출하고 궁극적으로 분리하기 위해 플라스미드-함유 대장균 세포를 용해하기 위한 유리한 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 세포 용해물로부터 관심 있는 세포 구성요소를 정제하는 방법에 관한 것이다. 세포 용해물은 관심 있는 세포 구성요소를 함유하는 임의의 유형의 세포의 용해물일 수 있다. 추가로, 세포 용해물은 기술분야에 숙련된 사람에게 알려져 있는 임의의 수단에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게, 용해물을 용해된 플라스미드-함유 세포를 포함한다. 보다 바람직하게, 용해물은 알칼리, 계면활성제, 또는 이것들의 조합으로 용해된 플라스미드-함유 세포를 포함한다. 바람직하게, 관심 있는 세포 구성요소는 플라스미드이다.

일부 구현예에서, 용해 코일 장치는 단일 사용 제품 접촉 흐름 경로를 사용하면서, 본원에 제공되는 원하는 용해 코일 파라미터를 유지함으로써 공정의 일관성을 보장하도록 설계된다. 용해 코일 장치는 공정 유량으로 필요한 시간 동안 용액(또는 용액들)을 보유하기 위하여, 필요한 각에서 필요한 내부 직경 및 필요한 길이의 단일 사용 용해 코일을 보유하고, 원하는 피치를 이루도록 설계된다.

한 구현예에서, 재현탁된 대장균 및 용해 용액의 혼합 조합은 용해 코일의 하부 단부로 흐르고, 2.8 L/분의 공정 유량으로 5±1분 동안 보유되었다. 난류는 없었고, 유체의 밀도가 다른 유체의 유지 또는 분리가 없는 것으로 확인되었다. 코일을 통한 선형 흐름이 있었고, 유체는 대장균 세포 구성요소를 완전히 변성시킨 코일의 상부를 빠져나간다. 용해 코일 장치는 본원에 제공된 중요한 파라미터를 유지하는 일회용 유체 흐름 경로의 간단하고 신속한 설치 및 제거를 가능하게 하는 설계 요소를 포함한다. 용해 코일 장치의 구현예의 도면은 도 1 내지 4에서 제공된다.

도 1, 도 2, 및 도 5는 각각 예시의 용해 코일 장치(10)의 측면도, 평면도, 및 기술적 도표를 도시한다. 장치(10)는 상부 단부(11) 및 하부 단부(12)를 가지는 실질적으로 원주형 칼럼(14)을 포함한다. 칼럼(14)은 임의의 적합한 치수를 가지는 직경(26) 및 높이(28)를 가진다. 예를 들어, 직경(26)은 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 인치, 바람직하게 23, 24, 또는 25 인치일 수 있고, 높이(28)는 적어도 1 피트이거나 12피트보다 클 수 있고, 예컨대 약 6 피트일 수 있다. 일부 구현예에서, 칼럼(14)은 적층 가능하여, 둘 이상의 칼럼(14)이 원하는 대로 장치(10)의 높이를 늘리거나 줄이기 위해 조합될 수 있다. 칼럼(14)은 베이스(19)에 안정적으로 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 베이스(19)는 장치(10)의 이동 및 운반을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 바퀴달린 지지대(20)를 추가로 포함할 수 있다. 각각의 바퀴달린 지지대(20)는 장치(10)를 제자리에 두기 위하여 잠금 가능할 수 있다.

장치(10)는 용해 코일(15), 개방된 제1 단부(16) 및 개방된 제2 단부(18)를 연결시키는 루멘을 가지는 신장 튜브를 추가로 포함한다. 용해 코일(15)은 칼럼(14)의 외부 표면 주위로 나선형 방식으로 감겨져서, 용해 코일(15)의 제1 단부(16)가 칼럼(14)의 상부 단부(11) 가까이에 배치되고 용해 코일(15)의 제2 단부(18)가 칼럼(14)의 하부 단부(12) 가까이에 배치될 수 있다. 제1 단부(16) 및 제2 단부(18)는 원하는 용해 공정을 수행하기 위하여 각각 펌프, 밸브, 튜빙, 저장소, 용기, 탱크, 어댑터, 커넥터, 등에 유동적으로 연결될 수 있다. 도 3에서 나타낸 것과 같이, 제1 단부(16) 및 제2 단부(18)는 둘 다 장치(10)로부터 자유롭게 연장될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보유 클립(17)이 제1 단부(16) 및 제2 단부(18)를 칼럼(14)에 고정시키기 위하여 사용될 수 있다.

도 4 및 도 5에서 나타낸 것과 같이, 칼럼(14)은 용해 코일(15)의 외부 직경에 맞는 크기의 외부 표면 내에 내장된 홈(22)을 포함할 수 있다. 홈(22)은 용해 코일(15)의 코일링을 안내하기 위해 칼럼(14)의 외부 표면 주위로 나선형 패턴으로 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 홈(22)은 용해 코일(15)을 단단히 보유하기 위해 홈(22)의 직경보다 작은 홈 개구(24)를 가질 수 있다. 홈(22)은 높이(30)를 가지는 칼럼(14)의 단면에 걸쳐 있을 수 있다. 높이(30)의 치수는 장치(10)의 전체 높이(28), 용해 코일(15)의 길이, 및 홈 피치(32)의 크기(즉, 각 홈(22) 사이의 거리)에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 높이(30)는 적어도 6 인치 또는 11 피트 이상, 예컨대 약 5 피트일 수 있다.

단일 사용 용해 보유 코일을 사용하여 사용된 용해 코일 장치는 배치에서 배치로 제품 이월을 제거할 것이다. 본원에 기술된 원리의 사용을 통해 가능하였고 이런 장치의 사용을 통해 보장된, 명시된 시간 동안 용해 용액과 조합된 플라스미드 포함 대장균 세포의 일관된 보유는, 제어되지 않은 각에서 더 큰 내부 직경 튜빙의 사용과 비교하여 용해 공정으로부터 플라스미드 수율을 300% 및 전체 정제 공정 수율을 300% 증가시키는 것으로 입증되었다.

용해 코일 장치의 바람직한 구현예는 다음의 특성을 포함한다:

바람직한 구현예에 대한 유체 보유 시간:

용해 코일 중의 세포 현탁액 및 용해 용액의 혼합물의 보유 시간은 1분 내지 10분; 2분 내지 10분, 2분 내지 9분; 2분 내지 8분, 2분 내지 7분, 2분 내지 6분, 2분 내지 5분, 3분 내지 10분, 3분 내지 9분, 3분 내지 8분, 3분 내지 7분, 3분 내지 6분, 3분 내지 5분, 4분 내지 10분, 4분 내지 9분, 4분 내지 8분, 4분 내지 7분, 4분 내지 6분, 4분 내지 5분, 5분 내지 10분, 5분 내지 9분, 5분 내지 8분, 5분 내지 7분, 또는 5분 내지 6분이다. 바람직하게, 보유 시간은 4 내지 6분이고; 바람직하게 보유 시간은 약 4.8분, 4.9분, 5.0분, 5.1분, 또는 5.2분이다.

바람직한 구현예에 대한 유체 유량:

용해 코일을 통해 가로지르는 세포 현탁액 및 용해 용액의 혼합물의 유체 유량(부피/시간)은 균일한 용액을 초래하는 선형 유량(길이/시간)을 이루는 속도이다. 이러한 범위를 이루기 위한 선형 유량은 약 5 m/분 내지 약 25 m/분, 5 m/분 내지 약 20 m/분, 5 m/분 내지 약 19 m/분, 5 m/분 내지 약 18 m/분, 5 m/분 내지 약 17 m/분, 5 m/분 내지 약 16 m/분, 5 m/분 내지 약 15 m/분, 5 m/분 내지 약 14 m/분, 5 m/분 내지 약 13 m/분, 5 m/분 내지 약 12 m/분, 5 m/분 내지 약 11 m/분, 5 m/분 내지 약 10 m/분, 6 m/분 내지 약 25 m/분, 6 m/분 내지 약 20 m/분, 6 m/분 내지 약 19 m/분, 6 m/분 내지 약 18 m/분, 6 m/분 내지 약 17 m/분, 6 m/분 내지 약 16 m/분, 6 m/분 내지 약 15 m/분, 6 m/분 내지 약 14 m/분, 6 m/분 내지 약 13 m/분, 7 m/분 내지 약 12 m/분, 6 m/분 내지 약 11 m/분, 6 m/분 내지 약 10 m/분, 7 m/분 내지 약 25 m/분, 7 m/분 내지 약 20 m/분, 7 m/분 내지 약 19 m/분, 7 m/분 내지 약 18 m/분, 7 m/분 내지 약 17 m/분, 7 m/분 내지 약 16 m/분, 7 m/분 내지 약 15 m/분, 7 m/분 내지 약 14 m/분, 7 m/분 내지 약 13 m/분, 7 m/분 내지 약 12 m/분, 7 m/분 내지 약 11 m/분, 7 m/분 내지 약 10 m/분, 8 m/분 내지 약 25 m/분, 8 m/분 내지 약 20 m/분, 8 m/분 내지 약 19 m/분, 8 m/분 내지 약 18 m/분, 8 m/분 내지 약 17 m/분, 8 m/분 내지 약 16 m/분, 8 m/분 내지 약 15 m/분, 8 m/분 내지 약 14 m/분, 8 m/분 내지 약 13 m/분, 8 m/분 내지 약 12 m/분, 8 m/분 내지 약 11 m/분, 8 m/분 내지 약 10 m/분, 9 m/분 내지 약 25 m/분, 9 m/분 내지 약 20 m/분, 9 m/분 내지 약 19 m/분, 9 m/분 내지 약 18 m/분, 9 m/분 내지 약 17 m/분, 9 m/분 내지 약 16 m/분, 9 m/분 내지 약 15 m/분, 9 m/분 내지 약 14 m/분, 9 m/분 내지 약 13 m/분, 9 m/분 내지 약 12 m/분, 9 m/분 내지 약 11 m/분, 또는 9 m/분 내지 약 10 m/분; 보다 바람직하게 8 m/분 내지 10 m/분이고; 약 8 m/분, 8.25 m/분, 8.50 m/분, 8.75 m/분, 9 m/분, 9.25 m/분, 9.50 m/분, 9.55 m/분, 9.60 m/분, 9.65 m/분, 9.70 m/분, 9.75 m/분, 9.80 m/분, 9.85 m/분, 9.90 m/분, 9.95 m/분, 및 10 m/분의 구현예를 포함하며, 바람직하게 9.50 m/분, 9.70 m/분, 9.75 m/분, 9.80 m/분, 또는 10 m/분이다.

본원에 기술된 내부 직경을 가지는 용해 코일의 구현예에 포함된 이러한 선형 유량은 5000 mL/분, 4000 mL/분, 3000 mL/분, 2900 mL/분, 2800 mL/분, 2700 mL/분, 2600 mL/분, 2500 mL/분, 2400 mL/분, 2300 mL/분, 2200 mL/분, 2100 mL/분, 2000 mL/분, 1900 mL/분, 1800 mL/분, 1700 mL/분, 1600 mL/분, 1500 mL/분, 1400 mL/분, 1300 mL/분, 1200 mL/분, 1100 mL/분, 1000 mL/분, 900 mL/분, 800 mL/분, 700 mL/분, 600 mL/분, 또는 500 mL/분의 유량을 이룰 수 있다. 유량은 용해 코일의 내부 직경에 의해 영향을 받고, 용해 코일 장치로 사용된 유량은 본원에 기술된 내부 직경을 가진 용해 코일로 사용된 것이다. 예를 들어, 3/4 인치의 내부 직경을 가지는 용해 코일은 약 2317 mL/분 내지 3475 mL/분, 바람직하게 약 2780 mL/분의 전체 유체 유량을 가질 수 있다. 다른 예에서, 3/8 인치의 내부 직경을 가지는 용해 코일은 약 543 mL/분 내지 814 mL/분, 바람직하게 약 651.5 mL/분의 전체 유체 유량을 가질 수 있다.

바람직한 구현예에 사용된 용해 코일의 길이:

일부 구현예에서 용해 코일은 100 피트 이상, 105 피트 이상, 110 피트 이상, 115 피트 이상, 120 피트 이상, 125 피트 이상, 130 피트 이상, 135 피트 이상, 140 피트 이상, 145 피트 이상, 150 피트 이상, 155 피트 이상, 160 피트 이상, 165 피트 이상, 170 피트 이상, 175 피트 이상, 180 피트 이상, 185 피트 이상, 190 피트 이상, 195 피트 이상, 또는 200 피트 이상의 길이를 가진다. 바람직하게 길이는 150 피트, 155 피트, 또는 160 피트이다.

바람직한 구현예에 사용된 용해 코일의 높이:

일부 구현예에서, 용해 코일은 약 3 피트 내지 약 6.25 피트, 약 3.5 피트 내지 약 6.25 피트, 약 4 피트 내지 약 6.25 피트, 약 4.5 피트 내지 약 6.25 피트, 약 5.0 피트 내지 약 6.25 피트, 약 3.5 피트 내지 약 6.0 피트, 약 4 피트 내지 약 6.0 피트, 약 4.5 피트 내지 약 6.0 피트, 약 5.0 피트 내지 약 6.0 피트, 약 3.5 피트 내지 약 5.75 피트, 약 3.75 피트 내지 약 5.75 피트, 약 4 피트 내지 약 5.75 피트, 약 4.5 피트 내지 약 5.75 피트, 또는 약 5.0 피트 내지 약 5.75 피트의 높이를 가진다. 바람직하게, 높이는 약 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 또는 6.2 피트이다.

바람직한 구현예에 사용된 용해 코일의 피치:

일부 구현예에서 용해 코일은 용해 코일이 2.0도 내지 4.0도 각, 2.0도 내지 3.8도 각, 2.0도 내지 3.6도 각, 2.0도 내지 3.43도 각, 2.0도 내지 3.4도 각, 2.0도 내지 3.2도 각, 2.0도 내지 3.2도 각, 2.0도 내지 3.0도 각, 2.0도 내지 2.8도 각, 2.0도 내지 2.6도 각, 2.0도 내지 2.5도 각, 2.1도 내지 3.4도 각, 2.1도 내지 3.2도 각, 2.1도 내지 3.2도 각, 2.1도 내지 3.0도 각, 2.1도 내지 2.8도 각, 2.1도 내지 2.6도 각, 2.1도 내지 2.5도 각, 2.1 내지 2.25도 각, 2.15 내지 2.2도 각, 또는 2.1 내지 2.15도 각, 바람직하게 2.1, 2.15, 또는 2.2도 각의 피치를 유지하도록 하는 용해 코일 홀더의 홈에 정렬된다.

바람직한 구현예에 사용된 용해 코일의 내부 직경:

일부 구현예에서 용해 코일의 내부 직경은, 7/8, 3/4, 5/8, 1/2, 3/8, 또는 1/4 인치를 포함한, 약 1 인치 미만이다. 바람직하게, 상기 용해 코일의 내부 직경은 일부 구현예에서 3/4 인치, 일부 구현예에서 1/2 인치, 또는 다른 바람직한 구현예에서 3/8 인치이다.

용해 코일 장치의 구성요소는 임의의 적합한 물질을 사용하여 만들어질 수 있다. 칼럼(14) 및 베이스(19)와 같은 특정 구성요소는 플라스틱, 금속, 또는 목재와 같은 단단한 물질로부터 만들어질 수 있다. 실질적으로 금속을 포함하는 구성요소는 더 큰 금속 블록으로부터 밀링되거나 용융 금속으로부터 주조될 수 있다. 마찬가지로, 실질적으로 플라스틱 또는 중합체를 포함하는 구성요소는 더 큰 블록, 주조, 또는 사출 성형품으로부터 밀링될 수 있다. 일부 구현예에서, 구성요소는 3D 프린팅 또는, 한정하는 것은 아니지만 융합 증착, 스테레오리소그래피, 소결, 디지털 광 가공, 선택적 레이저 용융, 전자 빔 용융, 및 적층체 제조를 포함한, 기술분야에 일반적으로 사용된 다른 적층 제조 기법을 사용하여 만들어질 수 있다. 구성요소는 어셈블리를 최소화하기 위하여 개별적으로 프린팅되거나 또는 적어도 부분적으로 함께 프린팅될 수 있다. 임의의 수의, 적층 제조와 양립하는 물질, 예컨대 실리콘 및 ABS를 포함한 다양한 중합체; 알루미늄, 스테인레스 강, 및 티타늄을 포함한 금속; 및 세라믹 및 복합재를 포함하는 기타 물질이 사용될 수 있다.

용해 코일(15)과 같은 특정 구성요소는 실질적으로 유연한 물질, 예컨대 연성 또는 유연한 중합체로부터 만들어질 수 있다. 바람직하게 물질은 0.1-1N 알칼리 용액, 바람직하게 USP 클래스 VI 물질과 양립한다. 일부 구현예에서, 물질은 0.5 N NaOH 용액과 양립한다. 다양한 구현예에서, 중합체는 용해 용액의 존재 하에 생물학적으로 비활성일 수 있고 부식 및 분해에 내성일 수 있다. 적합한 중합체로는 한정하는 것은 아니지만 다음을 포함한 것들을 들 수 있다: 폴리(우레탄), 폴리(실록산) 또는 실리콘, 폴리(에틸렌), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(비닐 알코올), 폴리(아크릴산), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(메타크릴산), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA), 나일론, 폴리아미드, 다가 무수물, 폴리(에틸렌-코-비닐 알코올)(EVOH), 폴리카프로락톤, 폴리(비닐 아세테이트)(PVA), 폴리비닐하이드록사이드, 폴리(에틸렌옥사이드)(PEO), 폴리오르토에스테르, 폴리비닐 클로라이드(PVC) 등. 용해 코일(15)의 유연성은 그것의 구성을 토대로 변형될 수 있다. 예를 들어, 용해 코일(15)의 벽 두께를 증가시키는 것은 그것의 유연성을 감소시킬 수 있는 한편, 용해 코일(15)의 벽 두께를 감소시키는 것은 그것의 유연성을 증가시킬 수 있다. 다른 예에서, 용해 코일(15)의 벽은 유연성을 향상시키기 위한 물결 주름을 포함할 수 있으며, 여기서 물결 주름은 그 안에서의 유체 흐름을 방해하지 않기 위한 용해 코일(15)의 외부에서의 특징일 수 있다.

특정 구현예에서, 용해 코일(15)은 하나 이상의 코팅 또는 표면 처리로 변형될 수 있다. 코팅 또는 표면 처리는 용해 코일(15)의 내부 표면의 소수성 또는 친수성을 변경시킴으로써 유체의 흐름 또는 물질의 용해 및 분리를 향상시킬 수 있다. 코팅 또는 표면 처리는 스핀 코팅, 딥 코팅, 화학적 기상 증착, 화학적 용액 증착, 물리적 기상 증착, 액욕 침지, 등을 포함한, 임의의 적합한 수단을 사용하여 증착되거나 적용될 수 있다. 코팅 또는 표면 처리는 임의의 적합한 두께로 증착되거나 적용될 수 있다.

일부 구현예에서, 용해 코일(15)은 장치(10)로부터 제거 가능하다. 예를 들어, 용해 코일(15)은 버릴 수 있고 각각의 사용으로 대체될 수 있는 일회용 구성요소일 수 있다. 용해 코일(15)은 또한 다양한 내부 직경 및 물질 구성을 가지는 여러 상이한 형태로 제공될 수 있고, 여기서 다양한 용해 코일(15) 형태는 원하는 용해 공정을 토대로 상호교환될 수 있다.

용해 코일 장치(10)는 그것의 기능을 증대시키기 위하여 임의의 적합한 변형을 따를 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 칼럼(14)은 그것의 내부에 하나 이상의 디바이스를 하우징할 수 있다. 적합한 디바이스로, 한정하는 것은 아니지만 히터, 쿨러, 흐름 센서, 온도 센서, 오실레이터, 등을 들 수 있다. 다른 예에서, 칼럼(14)은 장치(10) 상에 용해 코일(15)을 코일링 및 언코일링하는 것을 용이하게 하기 위하여 베이스(19) 주변에서 회전 가능하다. 칼럼(14)은 수동으로, 예컨대 그것의 상부 단부(11)에 부착된 핸들에 의해 회전되거나, 또는 칼럼(14)은 기계식 회전을 위해 모터가 장착될 수 있다. 칼럼(14)은 용해 코일(15)이 완전히 코일링되거나 언코일링된 후에 회전을 정지시키기 위한 잠금 메커니즘을 추가로 포함할 수 있다.

용해 코일 장치로부터 발생되는 용해물 용액은 그런 후 중화된 용해물 용액 및 파편을 포함하는 분산액을 생성하기 위하여 그것을 중화 용액(또한 중화 침전 용액으로도 언급됨)과 조합시킴으로써 중화될 수 있다. 결과적으로 생성된 분산액은 그런 후 파편으로부터 중화된 용해물 용액의 분리를 용이하게 하기 위해 유지될 수 있다.

일부 구현예에서, 용해된 세포를 포함하는 용해물 용액은 중화 챔버에서 그것을 중화 용액과 혼합함으로써 중화될 수 있다. 용해물 용액의 이런 중화는 중화 챔버에서 혼합함으로써 용이하게 될 수 있다. 일부 구현예에서, 이런 중화는 버블 칼럼 혼합기에서 버블 혼합이 이어질 수 있다. 바람직하게, 중화는 버블 칼럼 혼합기에서 버블 혼합과 함께 일어난다. 일부 구현예에서, 보유 코일을 빠져 나오는 용해물 용액은 버블 칼럼 혼합기에 들어갈 수 있으면서 동시에 펌프가 다른 탱크로부터의 중화/침전 용액을 버블 칼럼 혼합기에 전달할 수 있다. 일부 예에서, 또한 동시에, 다른 탱크로부터의 압축 가스가 버블 칼럼 혼합기의 바닥에 살포될 수 있다. 일부 구현예에서, 용해물 용액은 한쪽으로부터의 바닥에서 칼럼에 들어갈 수 있는 한편, 중화/침전 용액은 반대쪽으로부터의 바닥에서 들어갈 수 있다. 압축 가스는 기포를 실질적으로 균일하게 칼럼 단면을 가로질러 전달하도록 설계된 소결된 스파저를 통해 살포될 수 있다. 용해된 세포를 포함하는 용해물 용액, 및 중화 용액은 칼럼의 수직 방향으로 흐르고 상부 가까운 쪽에서 출구 부분을 통해 빠져 나간다. 액체의 수직 칼럼을 통한 기포의 통과는 용해물 용액을 중화/침전 용액과 혼합하는 작용을 한다. 상승 기포에 의해 제공된 혼합은 철저하지만 부드럽고 전단력이 낮다. 중화/침전 용액이 용해물 용액의 용해된 세포와 혼합됨에 따라, 세포 구성요소는 용액으로부터 침전한다. 스노클이 과잉 가스를 배출시키기 위해 버블 칼럼 혼합기의 상부에 제공될 수 있다. 예는 공동 소유의 특허 출원 미국 공보 번호 20090004716A1(그것의 전문이 본원에 포함됨)에 상세하게 제공된다.

일부 구현예에서, 용해물 용액은 알칼리, 계면활성제, 또는 이것들의 혼합물로 용해된 플라스미드-함유 세포를 포함하고, 중화/침전 용액은 알칼리를 중화시키고 단백질, 막, 내독소, 및 게놈 DNA와 같은 숙주 세포 구성요소를 침전시킨다. 일부 구현예에서, 알칼리는 NaOH일 수 있고, 계면활성제는 SDS일 수 있으며, 중화/침전 용액은 아세트산 칼륨, 아세트산 암모늄, 또는 이것들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 중화/침전 용액은 약 1 M 아세트산 칼륨 및 약 3 M 내지 약 7 M 아세트산 암모늄을 함유하는 미완충 용액을 포함할 수 있다. 이러한 중화/침전 용액을 사용함으로써, 산성 조건이 DNA의 탈푸린화로 이어질 수 있기 때문에 산성 pH에 바람직한 약 7 내지 약 8의 pH를 가진 현탁액이 생성된다. 일부 구현예에서, 중화/침전 용액은 약 2℃ 내지 약 8℃의 냉장 형태로 제공될 수 있다.

버블 칼럼 혼합기는 저전단 방식으로의 혼합을 제공하고 그로써 게놈 DNA 및 내독소의 중화된 용해물 용액으로의 과잉 방출을 피할 수 있다. 기술분야에 숙련된 사람은 버블 칼럼 혼합기를 통한 가스 흐름을 위한 적합한 속도를 결정할 수 있을 것이다. 가스 유량은 분당 약 2 표준 리터 내지 분당 약 20 표준 리터에서 사용될 수 있다("slpm"). 한정하는 것은 아니지만, 공기, 질소, 아르곤, 및 이산화 탄소를 포함한 임의의 적합한 가스가 사용될 수 있다. 가스는 여과된 압축 가스일 수 있다.

용해물 용액 및 중화 용액의 조합은 중화된 용해물 용액 및 파편을 함유하는 분산액의 생성을 초래한다. 중화된 용해물 용액은 탱크 또는 다른 보관 용기에 수집될 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 5 내지 10℃로 냉장된다. 용기에서 중화된 용해물의 보유 시간은 필수적인 것은 아니며, 1시간 미만, 약 1시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 15시간, 또는 15시간 이상으로 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 사용된 시간은 약 12시간이며, 한편 일부 예는 약 15시간의 시간을 포함하며, 다른 예에서는 시간은 "밤새도록"(약 15시간 이상인 것으로 정의됨)이다. 한 구현예에서, 중화된 용해물 용액으로부터 세포 파편의 실질적으로 완전한 분리를 이루기 위하여 충분한 보유 시간이 사용되었고, 그 결과 후속 정화 공정에 유리한 한정된 고체 입자의 미정제 용해물이 얻어졌다. 그러나, 공정 규모는 미정제 용해물 보유 탱크로 한정되고 공정 시간은 이런 보유 기간에 의해 연장된다.

저수율 플라스미드 생성물의 대규모 정제를 이루기 위하여, 중화된 용해물의 보유 기간은 1시간 아래로 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 중화된 용해물 용액은 그것이 생성되는 것과 동시에 가공될 수 있고, 그로써 용기에서의 보유 시간은 무시할만하다. 일부 구현예에서, 용해물 용액은 용기에 용해물을 수집하는 약 5분 내지 약 60분의 기간 후에 다음의 공정에 의해 동시에 가공된다. 용해물 보유 시간의 감소 또는 제거는 또한 용해물이 생성되는 즉시 가공됨에 따라 용기에 의한 공정 용량 제한을 제거한다.

중화 후에, 중화된 용해물 용액은 고체/액체 분리의 임의의 접근법, 예컨대 백 여과, 카트리지 여과, 배치 원심분리, 연속 원심분리로 정화될 수 있다. 용액에서 입자의 완전한 제거는 다음의 정제 공정에서 막 또는 칼럼의 막힘을 피하기 위해 바람직하다. 동시에, 용해물은 게놈 DNA를 파쇄할 것이고 게놈 DNA, 파쇄된 게놈 DNA, 내독소 및 기타 오염물의 플라스미드-함유 용액으로의 방출을 유발할 과잉 전단을 받지 않을 수 있다. 배치 여과는 소량의 용해물을 가공하기 위해 사용될 수 있지만, 대규모에서는 비실용적이다. 침전이 고전단 응력을 받을 수 있고 고수준의 오염물을 용액으로 방출할 수 있기 때문에 연속 원심분리 또한 적합하지 않다. 일부 구현예에서 상이한 등급의 필터 배지를 사용하는 일련의 여과가 이용될 수 있다. 일차 여과는 마이크론 크기의 큰 세포 플록 범위의 대부분을 제거하기 위해 사용될 수 있는 한편, 연속적인 이차 여과는 남아 있는 미세한 입자를 보유한다. 선택적인 제3 여과는 엄격한 투명도가 다음 공정에 필요하고 이차 여과가 불충분할 때 수행될 수 있다.

정화된 용해물의 분리 후에, 관심 있는 세포 구성요소를 함유하는 용액은 일부 구현예에서 이온 교환 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 바람직하게, 이것은 막-기반 접근법을 사용하여 수행된다. 바람직하게, 이것은 음이온 교환 막 크로마토그래피이다. 이 단계를 수행하기 위한 특정 방법은 본원의 다른 곳에서 추가로 개시된다.

이온 교환 크로마토그래피 후에, 이온 교환 크로마토그래피로부터 발생되는 부분적으로 정제된 물질은 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용된다. 바람직하게, 이것은 막-기반 접근법을 사용하여 수행된다. 이 단계를 수행하기 위한 특정 방법은 본원의 다른 곳에서 추가로 개시된다. 특정 구현예에서, 이 단계는 생략될 수 있다.

그런 후, 소수성 상호작용 크로마토그래피(수행된 경우)로부터 또는 이온 교환 크로마토그래피(HIC가 생략되는 경우)로부터 발생되는 물질은 관심 있는 세포 구성요소를 농축하고 용액으로부터 과잉 염을 제거하기 위해 한외여과 및 정용여과에 적용된다. 한외여과/정용여과의 사용은, 특히 단백질 또는 플라스미드와 같은 생물학적 거대분자에 대해, 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있다.

여과 단계 후에, 일부 구현예에서 농축되고 탈염된 생성물은, 예를 들어, 그것을 제약학적 용도에 적합하게 하기 위해 선택적으로 멸균 여과가 적용된다. 다시, 이 단계를 수행하는 방법은 기술분야에 숙련된 사람들의 지식 내에 있다.

농축된, 탈염된 생성물은, 필요하다면, 멸균 여과에 추가로 적용될 수 있다. 이러한 작업을 수행하기 위한 다양한 방법은 잘 알려져 있고, 기술분야에 숙련된 사람들의 능력 내에 있을 것이다. 생성물이 플라스미드인 경우, 멸균 여과는 바람직하게 0.22 um 컷 오프를 가진 Pall AcroPak 200 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 그 결과의 정제된, 농축된, 탈염된, 멸균 여과된 플라스미드는 실질적으로 단백질, 게놈 DNA, RNA, 및 내독소와 같은 불순물이 없다. 비신코닌산 검정(Pierce Biotechnology, Rockford, Ill.)에 의해 측정된 바, 잔류 단백질은 바람직하게 약 1%(중량 기준) 미만, 보다 바람직하게 약 0.1% 이하일 것이다. 리물루스 아메보사이트 용해물("LAL") 검정에 의해 측정된 바, 잔류 내독소는 바람직하게 약 100 미만의 플라스미드의 밀리그램당 내독소 유닛(EU/mg)일 것이다. 보다 바람직하게, 내독소는 약 50 EU/mg 미만, 가장 바람직하게 약 20 EU/mg 미만일 것이다. 잔류 RNA는 바람직하게 약 5 중량% 이하, 보다 바람직하게 약 1% 이하이다(아가로스 겔 전기영동 또는 소수성 상호작용 HPLC에 의함). 잔류 게놈 DNA는 바람직하게 약 5 중량% 미만, 보다 바람직하게 약 1% 미만이다(아가로스 겔 전기영동 또는 슬롯 블롯에 의함).

기술분야에 숙련된 사람은 본 발명이 본원에 분명하게 언급되지는 않지만 기술분야에 알려져 있거나 이용할 수 있는 것들을 포함하여, 선택된 단계 또는 방법을 용해 코일 장치 주변에 첨가하거나, 빼거나, 또는 대체함으로써 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 모든 그러한 변형은 본 발명의 일부인 것으로 고려된다. 그러므로, 한 구현예에서, 발명은 세포 용해물, 또는 관심 있는 세포 구성요소를 함유하는 유체를 하나 이상의 추가 유체와 버블 혼합기를 사용하여 혼합하는 방법을 제공한다. 추가의 구현예에서, 발명은 버블 혼합기를 사용하여 세포 용해물을 침전 용액과 혼합시키는 동시에 기포를 침전된 세포 구성요소에 포획하는 것을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 상기 방법을 실시하기 위해 사용될 수 있는 버블 혼합기를 포함하는 디바이스를 제공한다. 또한 추가로, 본 발명은 세포 현탁액을 용해 용액과 제공된 용해 코일 장치를 사용하여 혼합하고, 이어서 용해된 세포를 침전 용액과 버블 혼합기를 사용하여 혼합하는 것을 조합하는 것을 포함하는, 세포 용해 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 발명은 버블 혼합기를 사용하여 침전된 세포 구성요소에 기포를 포획하는 단계, 물질을 탱크에 수집하는 단계, 침전된 세포 구성요소가 부유 층을 형성하도록 하는 단계, 침전된 구성요소를 압축하고 용해물을 탈기하기 위하여 선택적으로 진공을 적용하는 단계, 및 유체 용해물을 침전된 구성요소 아래에서 배출시키거나 펌핑함으로써 회수하는 단계를 포함하는, 유체 용해물로부터 침전된 세포 구성요소를 분리시키는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 용해물을 이온 교환 막, 선택적으로 소수성 상호작용 막, 한외여과/정용여과 과정 및 선택적으로, 멸균 여과 과정에 적용하는 단계를 포함하는, 세포 용해물로부터 관심 있는 세포 구성요소를 정제하는 방법을 제공한다. 현재의 각각의 구현예, 뿐만 아니라 하나 이상의 구현예의 임의의 조합이 추가로 본 발명에 포함된다.

본 발명의 혁신적인 교시는 플라스미드의 생산과 관련하여 본원에 개시된 단계들을 특히 참조하여 기술된다. 그러나, 기술분야에 숙련된 사람들은 플라스미드의 생산과 관련하여 이들 단계 및 공정의 사용이 많은 유리한 용도 및 본원의 혁신적인 교시 중 단지 한 예를 제공한 것임을 이해하고 인식해야 한다. 다양한 비실질적인 변경, 변형 및 대체가 발명의 사상 및 범주로부터 어떠한 방식으로든 벗어나지 않으면서 개시된 공정에 대해 이루어질 수 있다. 다음의 실시예는 본원에 개시된 방법 및 디바이스를 예시하기 위해 제공되며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.

실시예 1: 용해 코일 내부 직경(ID) 및 설치 각은 전체 공정 수율에 영향을 미치도록 결정되었다.

별도의 테스트는 3/4" ID 코일이 1" ID 코일과 비교하여 동등한 공정 유량으로 더 빠른 선형 속도를 통해 더 균일한 선형 흐름을 제공하였음을 나타냈다.

또 다른 세트의 테스트는 유량이 1" ID 코일과 동일한 선형 속도로 축척되었고, 3/4" ID 코일이 더 균일한 선형 흐름을 나타냈음을 나타냈다. 이것은 용해 코일에 대한 최적 최대 ID가 3/4"이며 코일의 길이를 증가 또는 감소시킴으로써 보다 빠른 유량에 대해 5 +/- 1분의 보유 시간이 조정되어야 하는 것을 입증한다. 감소된 유량으로의 가공은 더 작은 직경 및 동등한 길이를 가지는 용해 코일을 사용하여 보존된 선형 속도로 이루어질 수 있다.

코일의 최적 각을 측정하기 위하여 1" ID 및 3/4" ID 코일을 24" 직경 홀더에 3' 높이 및 6' 높이에서 테스트하였다. 1" 및 3/4" ID 코일은 둘 다 각각 3.43° 및 2.15°의 각에서 6' 총 높이에서 더 잘 수행되었다. 3/4" ID 코일은 코일을 통한 미정제 용해물의 보다 균일한 선형 흐름을 나타냈다.

이들 테스트 세트는 2.15-3.43°의 각에서 3/4" ID 코일이 용해 코일의 가장 최적의 성능을 초래할 수 있을 것임을 나타냈다.

단일 사용 용해 코일이 바람직하기 때문에, 3/4" ID 단일 사용 용해 코일의 빠르고, 간단하며, 일관된 설치를 위해, 4-6분의 보유 시간을 얻기에 필요한 길이, 및 균일한 선형 흐름을 용이하게 하기에 필요한 각을 가진 프로토타입 홀더를 설계하였다. 프로토타입을 다양한 생산 규모에서 다중 생산 로트에 대해 성공적으로 사용하였다.

프로토타입을 현재 디자인으로 추가로 개발하였다. 2.15° 각에서 3/4" ID 튜빙의 160 피트 길이를 보유하기 위한 폴리프로필렌 홈이 있는 실린더를 설계하였다. 이 디자인은 코일을 통한 미정제 용해물의 원하는 선형 속도 및 균일한 흐름을 유지하면서 프로토타입보다 더 빠르고 더 일관된 용해 코일의 설치를 용이하게 한다.

추가 세트의 테스트로 두 용해 코일에서 코일 보유 시간, 유체 유량, 및 유체 선형 속도 사이의 관계를 조사하였고, 이때 제1 코일은 160 피트 길이의 3/4 인치 ID 튜빙을 가지며 제2 코일은 150 피트 길이의 3/8 인치 ID 튜빙을 가진다. 그 결과를 각각 도 6a 및 도 6b에 도시한다.

실시예 2: DNA 플라스미드 제조 공정

400 L 발효 배치로부터 DNA 플라스미드 제조 공정은 다음을 포함하였다: i) 세포 용해 및 여과; ii) Mustang Q 음이온 교환 막 크로마토그래피; iii) 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피; 및 iv) 한외여과/정용여과(UF/DF). 플라스미드 A에 대한 정제 데이터를 도 7a 및 도 7b에 요약한다.

세포 페이스트 중의 초기 DNA 플라스미드를 미니프렙 방법에 의해 3.17 g/kg WCW(습식 세포 중량)로 추정하였고, 정제 전 초기 플라스미드는 71.3 g이었다. 최종 UF 생성물은 5.3 g으로, 7.4% 전체 정제 수율을 초래하였다. 이런 결과는 400 L 발효 배치에 대해 비정형적인 수율인 것으로 측정되었다.

수율 분석을 각 단계에 대해 수행하였다(도 7a 및 도 7b 참조). UF(iv)는 >100%의 단계 수율을 가졌고, 그러므로 단계 iv를 저수율의 원인으로서 배제하였다. 부틸 단계(iii)는 총 DNA에 대해 34.8%의 회수율을 나타냈고, 이것은 전형적인 60% 회수율보다 낮은 것으로 나타났다. 그러나, 겔 14Jul11-4(도 7a 및 도 7b)는 개방 원형(OC) 및 gDNA의 백분율이 3 M 황산 암모늄으로의 1:4 v/v 로드 희석으로 인해 관통 흐름에서 제거된 것을 나타냈다. 부틸 단계에서 수퍼코일 플라스미드 생성물의 손실을 시사하는 증거는 없었다. 부틸 로드에서 약 60% RNA를 고려한다면, 플라스미드의 회수율은 87.0%였다. 그러므로, 단계 iii은 감소된 수율의 근원이 아니었다. Q 단계(ii)는 14.3 g의 총 DNA를 얻었지만, Q 전의 초기 물질은 플라스미드 A 미정제 용해물의 HPLC 분석을 토대로 10.4 g의 총 DNA인 것으로 추정하였다(도 8). Q 생성물에서 추정된 5.7 g의 플라스미드는 약 58.1%의 플라스미드의 Q 단계 회수율에 기여하였고(5kb 플라스미드의 약 50% Q 회수율과 비슷함), 이것은 단계 ii의 성능이 전형적이었음을 보여준다. 단계 ii, iii, 및 iv가 배제되기 때문에, 단계 I은 주로 감소된 정제 수율에 기여하는 단계인 것으로 결론내렸다.

도 8에서와 같이, 재현탁된 세포 및 상이한 단계의 용해물의 HPLC 분석은 세포와 미정제 용해물 샘플 사이의 분명한 농도 강하를 입증하였다. 재현탁된 세포는 여전히 3.17 g/kg의 초기 추정값과 비슷한, 2.8 g/kg WCW의 수율을 나타냈다. 그러나 미정제 용해물은 농도에서 68% 더 낮은 0.9 g/kg WCW의 수율을 나타냈다. 여과로부터 추정된 35%의 부피 감소가 단계 i에서의 86% 플라스미드 손실에 첨가되었다. 조합된 용해/여과 회수율은 단지 13.8%였다. 질량 균형은 초기 용해 단계(여과가 아님)가 플라스미드 A 저수율의 근본 원인이었다고 결론내렸다.

a) 공기 흐름, b) 버블 칼럼 내부 직경, c) 공기 스파저, d) 용해 코일, e) 혼합기, f) 용액, g) 작업자, 및 h) 실온을 포함한, 세포 용해의 공정에 기여하는 가능한 요인을 연구하였다. 6개의 별도의 플라스미드 생산 로트(플라스미드 B, C, D, A, E, 및 F)로부터의 데이터를 리뷰하였다(도 9 참조). 요인 a, b, c, 및 e가, 그것들이 명세에 포함되었을 때 최소 영향을 가지는 것으로서 결론내렸다. 요인 f는 최소 요인인 것으로 간주되었고, 주변 온도가 25℃ 이하일 때 완전히 제거하였다. 요인 g는 인간 작업자와 관련하여 어떠한 경향도 나타내지 않았고, 따라서 저수율의 원인이 아니었다. 실온의 요인 h는 용액 보관 가변성에 기여할 수 있지만, 다른 정제 로트와 비교하여 한 플라스미드 정제에 대해 명확한 차이가 확인되지 않았다.

낮은 용해 수율로 이어지는 가장 가능한 원인은 요인 d - 용해 코일인 것으로 의심되었다. 플라스미드 E 및 플라스미드 F에 대한 생산 작동 전에, 용해 코일을 청소하고, 멸균하여 재사용하였다. 새로운 코일의 재조립을 이들 플라스미드에 대해 실행하였다. 코일 각 및 높이의 변화는 상이한 작업자에 의해 달라졌고, 이것은 상이한 작동 중에 미정제 용해물의 흐름 균일성에 영향을 줄 수 있었다. 5 +/- 1분의 미정제 용해물 보유 시간은 세포 통합 및 이후의 플라스미드 재생에 중요하다. 상이한 길이 및 각에서 상이한 코일을 사용한 3개의 생산 디자인 테스트를 수행하였다. 데이터 및 결론을 도 10a 내지 도 10c에 제공한다. 테스트 #2 - 1 인치 내부 직경 및 100 피트 길이와 비교하여, 더 작은 내부 직경 코일 - 3/4 인치 내부 직경 및 160 피트 길이를 사용하는 테스트 #3에서 미정제 용해물의 더 균일한 선형 흐름을 관찰하였다. 테스트 #3에서 작동 전체에서 5 +/ 1분의 보유 시간을 확인하였지만, 미정제 용해물 농도의 >30% 변화로부터 1 인치 내부 직경 용해 코일에 대해 일관되는지 의심되었다. 수율 증가가 3/4 인치 내부 직경 용해 코일에 대해 나타났고, 플라스미드 F를 사용한 생산 작동을 이러한 코일을 사용하여 계획하였다.

실시예 3: 플라스미드의 정제

플라스미드 F의 정제를 내부 직경(ID)이 3/4"이고 폴리비닐 클로라이드(PVC)로 만들어진 용해 코일을 사용하여 수행하였다(열가소성 공정). PVC 튜빙을 USP 클래스 VI을 따랐고 21 CFR 178.3740을 따라 제조하였다. 추가적으로, HDPE를 제조 공정에 사용한 커넥터에 대해 선택하였다. HDPE 커넥터는 Cole Parmer에 의해 분배되며 USP 클래스 VI 물질이고 21 CFR 177.1520에 따라 제조된다. 용해 코일은 5 +/- 1분의 용해 보유 시간을 생성하기에 충분히 길었고 각 단부 상에 스테인레스 강 1/2" 바브 피팅을 가졌다. 이것은 용해 코일이 160 피트의 길이를 가지는 결과를 초래하였다.

3/4" 내부 직경 용해 코일의 사용으로 1 인치 내부 직경의 사용과 비교하여 수율이 개선되었고 용해 공정에 대한 변화가 감소되었다. 보다 구체적으로, 생산 작동을 플라스미드 F, 플라스미드 G, 플라스미드 H 및 플라스미드 I에 대해 새로운 코일을 사용하여 수행하였다. 6개의 연속 로트에 대한 정제 데이터를 도 12에 요약하는데, 그 중 2개는 1인치 내부 직경 코일을 가지며 4개는 3/4 인치 내부 직경을 가진 것이다. 용해물 샘플 중의 플라스미드 농도의 HPLC 분석을 도 13에 요약한다. 6개의 로트에 대한 대용량 방출 테스트 결과의 요약을 도 14에 제공한다. 6개의 로트에 대한 용해 및 Q 공정의 겔 분석을 도 15a 및 15b에 도시한다. 6개의 로트에 대한 용해물 샘플의 HPLC 분석을 도 16a 내지 도 16f에 도시한다.

플라스미드 A는 전체 정제 공정에 대해 7.4%의 저수율을 나타냈다(도 12, 줄 24). Q 정제 단계에서의 생성물 수율은 초기 추정값보다 훨씬 더 낮았다(도 12, 줄 8 및 9). 근본 원인을 용해에서 확인하였다. 여과된 용해물에서의 플라스미드 수율은 미니프렙에 의한 초기 수율 추정값(도 13, 줄 4)과 비교하여 단지 20.8%였다(도 13, 줄 10). 이러한 플라스미드 손실은 일반적이지 않았고 대부분 1 인치 ID 용해 코일로부터의 일관되지 않은 보유 시간에 의해 유발되었다. 겔 분석으로 Q 용출물에서 감소된 플라스미드 농도 및 높은 게놈 바탕값을 확인하였다(도 15a 및 도 15b). 높은 gDNA 불순물은 1:4 v/v 3 M 황산 암모늄의 부틸 로드 조건에 의해 감소시킬 수 있었지만, 용해 단계에서 플라스미드의 손실은 나중에 회복할 수 없었다.

플라스미드 E는 15% 미만의 전체 정제 수율을 나타냈고(도 12, 줄 24) Q 수율은 초기 추정값보다 낮았다(도 12, 줄 8 및 9). 플라스미드 E와 관련된 추가적인 OOS는 대용량 생성물에서 높은 gDNA였다(도 14, 줄 14). 1 인치 ID 용해 코일의 사용은 여과된 용해물 중의 감소된 플라스미드 생산(48.9%), 및 gDNA의 불충분한 변성에 기여하였다. 용해물 및 Q 용출물 중의 높은 gDNA(도 15a 및 도 15b)는 1:5 v/v 3 M 황산 암모늄의 부틸 로드 조건에 의해 제거될 수 없었다. 그러므로, 최종 생성물은 전형적인 공정이 이룰 수 있는 것보다 10-100배 더 높은, 6% gDNA를 가졌다.

플라스미드 F는 3/4" ID 용해 코일을 실행한 제1 cGMP 로트였다. Q 단계에서의 실제 수율은 추정값(도 12, 줄 8)과 유사한 61.7%였다(도 12, 줄 9). 전형적인 전체 정제 수율은 약 30%이다. 전체 수율은 21.5%였지만, 대부분 부틸 단계에서의 생성물 손실에 의해 영향을 받았다. 여과된 용해물에서 플라스미드 수율은 미니프렙에 의한 초기 수율 추정값(도 13, 줄 4)과 비교하여 104%였다(도 13, 줄 10). 겔 분석으로 모든 용해물 중의 일관된 플라스미드 농도, 및 Q 용출물에서 낮은 게놈 바탕값을 확인하였다(도 15a 및 도 15b). 최종 대용량 방출 테스트 결과는 낮은 불순물 프로파일, 특히 gDNA: 0.03%를 입증하였다(도 14, 줄14). 3/4" 용해 코일의 사용은 플라스미드 F에 대한 낮은 용해 수율 및 높은 gDNA의 잠재적 문제를 방지하였다. 높은 수율(Q 단계의 최대) 및 고품질 생성물이 이루어졌다.

플라스미드 G 작동 또한 3/4" 용해 코일로 실행하였다. Q 단계에서의 실제 수율은 추정값(도 12, 줄 8)보다 높은 58.5%였다(도 12, 줄 9). 전체 정제 수율은 44.0%였는데, 이전의 3개의 정제 작동보다 높았다. 여과된 용해물 중의 플라스미드 수율은 초기 수율 추정값(도 13, 줄 4)과 일관된 90.9%였다(도 13, 줄 10). 겔 분석 또한 모든 용해물 샘플 중의 일관된 플라스미드 농도, 및 Q 용출물에서 낮은 게놈 바탕값을 입증하였다(도 15a 및 도 15b). 1:5 v/v 3 M 황산 암모늄의 부틸 로드 조건을 사용하였는데, 이것은 gDNA 감소에 거의 영향을 미치지 않았다. 그러나, 최종 대용량 gDNA는 0.2%였다(도 14, 줄 14). 다시, 3/4" ID 용해 코일의 사용은 플라스미드 G에 대해 고수율(Q 단계 및 전체) 및 고품질 생성물을 이루었다.

유사한 결과를 플라스미드 G와 비교하여 플라스미드 H에 대해 이루었다. 고수율(Q 단계 및 전체) 및 고품질 생성물은 3/4" ID 용해 코일을 사용함으로써 입증하였다.

플라스미드 I는 Q 단계에서 약간 더 낮은 수율을 나타냈지만(도 12, 줄 9), 그것은 특정 Q 캡슐과 관련된 것으로 추정하였다. Q 단계 및 전체 및 고품질. 여과된 용해물 중의 플라스미드 수율은 초기 수율 추정값(도 13, 줄 4)과 비교하여 88.2%였다(도 13, 줄 10). 여과에 의한 미니프렙 변화 및 농도 강하가 예상되었고, 80% 이상의 수율 백분율이 정상이다. 1:5 v/v 3 M 황산 암모늄의 부틸 로드 조건을 또한 사용하였고, 최종 대용량 gDNA는 0.2%였다(도 14). 그러므로, 3/4" ID 용해 코일의 사용은 또한 플라스미드 I에 대해 양호한 수율 및 고품질 생성물을 이루었다.

본원에서 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원, 및 공보물의 개시는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 발명이 특정 구현예를 참조로 개시되었지만, 본 발명의 다른 구현예 및 변화가 발명의 진정한 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 기술분야에 숙련된 다른 사람들에 의해 고안될 수 있는 것이 명백하다. 첨부된 청구범위는 모든 그러한 구현예 및 동등한 변화를 포함하는 것으로 해석될 것으로 의도된다.

Claims

세포 현탁액의 용액 및 용해 용액을 유동적으로 수용할 수 있고, 상기 용액을 용액 혼합물로서 유동적으로 전달함으로써 세포 현탁액 중의 세포 내용물을 용해하고 방출시킬 수 있는 용해 코일 장치로서,
높이를 가지는 원주형 용해 코일 홀더, 및 제1 단부, 제2 단부, 및 그 사이의 길이를 가지는 유연한 용해 코일을 포함하고, 상기 유연한 용해 코일은 제1 단부로부터 세포 현탁액의 용액 및 용해 용액을 수용하여 제2 단부로부터 용해 코일 외부로 상기 혼합 용액을 전달하도록 구성되며;
상기 용해 코일 홀더는 유연한 용해 코일을 수용하고 상기 원주형 용해 코일 홀더의 외부 표면 위에 고정할 수 있는, 용해 코일 장치.
제1항에 있어서, 상기 용해 코일 홀더는 용해 코일 홀더의 높이를 가로지르는 길이를 가지는 균일한 나선형 홈이 내장된 표면을 가지며, 상기 유연한 용해 코일은 용해 코일이 용해 코일 홀더의 홈에 의해 수용되는 것을 가능하게 하고 상기 용해 코일 홀더의 홈의 길이를 가로지르는 크기의 내부 직경을 가지는 것인, 용해 코일 장치.
제2항에 있어서, 상기 용해 코일의 내부 직경은 1 인치 미만인 것인, 용해 코일 장치.
제2항에 있어서, 상기 용해 코일은 4 내지 6분의 용해 코일에서의 보유 시간을 초래하는 선형 유량으로 용액 혼합물이 흐를 수 있도록 구성되는 것인, 용해 코일 장치.
제2항에 있어서, 상기 용해 코일은 8 m/분 내지 12 m/분의 선형 유량으로 용액 혼합물이 흐르도록 구성되는 것인, 용해 코일 장치.
제2항에 있어서, 상기 용해 코일의 길이는 100 피트보다 큰 것인, 용해 코일 장치.
제2항에 있어서, 상기 용해 코일은 단일 사용 후에 폐기되는 것인, 용해 코일 장치.
제2항에 있어서, 상기 용해 코일 홀더는 24 인치의 방사상 직경 및 3 피트 내지 6 피트의 높이를 가지는 것인, 용해 코일 장치.
제2항에 있어서, 상기 용해 코일 홀더의 홈은 용해 코일 홀더의 원주를 2.15도 내지 3.43도의 피치로 가로지르는 것인, 용해 코일 장치.
제9항에 있어서, 상기 용해 코일 홀더는 용해 코일 장치가 쉽게 운반될 수 있게 하는 휠 지지대를 가지는 것인, 용해 코일 장치.
제2항에 있어서, 상기 용해 코일의 내부 직경은 3/8 인치이고, 용해 코일은 용액 혼합물이 9.75 m/분의 선형 유량으로 흐를 수 있도록 구성되는 것인, 용해 코일 장치.
제4항에 있어서, 상기 보유 시간은 5분이고, 상기 용해 코일의 길이는 150 피트인 것인, 용해 코일 장치.
제5항에 있어서, 상기 선형 유량은 9.75 m/분이고 상기 용해 코일의 길이는 150 피트인 것인, 용해 코일 장치.
제6항에 있어서, 상기 길이는 150 피트이고 상기 용해 코일은 용액 혼합물이 9.75 m/분의 선형 유량으로 흐를 수 있도록 구성되는 것인, 용해 코일 장치.
제7항에 있어서, 상기 용해 코일 내부 직경은 3/8 인치이고 용해 코일 길이는 150 피트인 것인, 용해 코일 장치.
제2항에 있어서, 상기 용해 코일의 내부 직경은 3/4 인치이고, 용해 코일은 용액 혼합물이 9.75 m/분의 선형 유량으로 흐를 수 있도록 구성되는 것인, 용해 코일 장치.
제16항에 있어서, 상기 용해 코일의 길이는 160 피트인 것인, 용해 코일 장치.
세포 현탁액의 용액 및 용해 용액을 유동적으로 수용할 수 있고, 상기 용액을 용액 혼합물로서 중화 용액과 접촉하도록 유동적으로 전달함으로써 세포 현탁액 중의 세포 내용물을 용해시키고 방출시킬 수 있는 용해 코일 장치를 사용하여 원하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 세포를 용해시키는 방법으로서,
상기 장치는 높이를 가지는 원주형 용해 코일 홀더, 및 제1 단부, 제2 단부, 및 그 사이의 길이를 가지는 유연한 일회용 용해 코일을 포함하고, 상기 유연한 용해 코일은 제1 단부로부터 세포 현탁액의 용액 및 용해 용액을 수용하여 제2 단부로부터 용해 코일 외부로 상기 혼합 용액을 전달하도록 구성되며; 상기 용해 코일 홀더는 일관된 피치로 용해 코일 홀더의 높이를 가로지르는 길이를 가지는 균일한 나선형 홈이 내장된 표면을 가지고; 상기 유연한 용해 코일은 용해 코일이 용해 코일 홀더의 홈에 의해 수용되는 것을 가능하게 하며 상기 용해 코일 홀더의 홈의 길이를 가로지르는 크기의 내부 직경을 가지고,
상기 방법은
일회용 용해 코일을 용해 코일 홀더의 홈에 고정하는 단계;
세포 현탁액의 용액을 용해 코일의 제1 단부에 전달하는 단계;
세포 현탁액의 용액이 용해 용액과 혼합되는 것을 가능하게 하기 위해 용해 용액을 용해 코일의 제1 단부에 전달하는 단계; 및
용액 혼합물을 중화 용액과 함께 구획으로 유동적으로 전달하여 용해 공정을 종료하는 단계
를 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 전달하는 단계는 8 m/분 내지 12 m/분의 선형 유량으로 일어나는 것인, 방법.
제18항에 있어서, 상기 혼합 용액은 용해 코일의 길이를 4분 내지 6분 내에 가로지르는 것인, 방법.
제20항에 있어서, 상기 전달하는 단계는 9.75 m/분의 선형 유량으로 일어나는 것인, 방법.