PT1028737E

PT1028737E - Células estaminais mesenquimatosas humanas de sangue periférico

Info

Publication number: PT1028737E
Application number: PT98935544T
Authority: PT
Inventors: Mireya Fernandez; Jose J Minguell
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1997-07-03
Filing date: 1998-07-01
Publication date: 2007-07-11
Also published as: ES2285779T3; DE69837491T2; EP1028737B1; ATE358493T1; CY1106798T1; EP1028737A4; EP1028737A1; CA2294944A1; AU8476698A; WO1999001145A1; US6261549B1; DE69837491D1; DK1028737T3

Description

DESCRIÇÃO "CÉLULAS ESTAMINAIS MESENQUIMATOSAS HUMANAS DE SANGUE PERIFÉRICO"

Antecedentes da Invenção

Este pedido reivindica a prioridade do pedido provisório U.S. com o n° de série 60/051651, apresentado em 3 de Julho de 1997. Este trabalho foi apoiado por bolsas da FONDECYT - Chile (N° 1950-238) e Fundação Vitae - Brasil (N° B-11487/4B001) . Estas podem ter criado determinados direitos em relação à invenção.

As células estaminais mesenquimatosas (MSC) são as células blásticas pluripotenciais formativas que se encontram inter alia na medula óssea, sangue, derme e periósteo que são capazes de se diferenciar em mais do que um tipo específico de tecidos mesenquimatosos ou conjuntivos (i. e. os tecidos do corpo que suportam os elementos especializados; e. g. tecidos adiposo, ósseo, estromal, cartilaginoso, conjuntivo elástico e fibroso) dependendo de várias influências de factores bioactivos, tal como citocinas. As células estaminais mesenquimatosas humanas (hMSC) são reactivas com certos anticorpos monoclonais, conhecidos como SH2, SH3 e SH4. (Ver patente U.S. N° 5486359).

As células estaminais hematopoiéticas (HSC) são as células blásticas pluripotenciais formativas encontradas inter alia namedula óssea e sangue periférico que são capazes de se diferenciar em qualquer dos tipos específicos de células hematopoiéticas ou sanguíneas, tais como eritrócitos, 1 linfócitos, macrófagos e megacariócitos. Após a mobilização de HSC da medula óssea por administração de determinados factores, tais como G-CSF e GM-CSF, e recuperação subsequente do sangue periférico, as HSC também passaram a ser referidas como células progenitoras de sangue periférico (PBPC). As células estaminais hematopoiéticas humanas (hHSC) e as PBPC são reactivas com determinados anticorpos monoclonais que são agora reconhecidos como sendo específicos para células hematopoiéticas, por exemplo, CD34.

Assim, as hMSC e hHSC podem ser facilmente distinguidas pelos seus perfis imunoespecíficos e, para efeitos de clareza, serão aqui referidas como SH2+-CD14- hMSC ou SH2--CD14+ hHSC consoante necessário. 0 transplante de células estaminais hematopoiéticas humanas (hHSC), ou de células progenitoras de sangue periférico (PBPC), tornou-se um método aceite para intensificação da dose no tratamento de várias doenças neoplásicas-*-' 2. Foram utilizados vários processos para mobilização e remoção de hHSC da circulação por aferese. Actualmente, a maioria dos métodos explora o incremento em progenitores circulantes que ocorre após a quimioterapia citotóxica.3 Conjuntamente, a administração a curto prazo de GM-CSF ou G-CSF, aumenta o rendimento de hHSC, determinada pelo número de células CD34+4,5,6 que, quando utilizadas para autoenxerto a 22,5 x 106 hHSC CD34 + /kg de receptor, assegura uma rápida recuperação hematopoiética 4,5,6 Vários mecanismos parecem estar envolvidos na libertação mediada por factor de crescimento de células progenitoras de medula7. Entre eles, parece que após exposição a G-CSF ou GM-CSF, moléculas de adesão se soltam da superfície de células de múltiplas linhagens primitivas residentes na medula, 2 permitindo-lhes assim que entrem na circulação5. Este conceito tem sido reforçado por várias observações que mostram que factores de crescimento (como G-CSF, GM-CSF, IL-3 e SCF) modulam a expressão ou função de várias moléculas citoadesivas na superfície de células progenitoras hematopoiéticas8,9. Além disso, vários trabalhos referem que as citocinas produzem profundas alterações morfológicas e imuno-histoquímicas em estroma da medula e na matriz extracelular contígua10,11. 0 documento US 5486359 divulga um método para isolamento, purificação e expansão por meio de cultura de células estaminais mesenquimatosas humanas não diferenciadas que têm aptidão para se diferenciar em mais do que um tipo de tecido. 0 documento US 5486359 divulga ainda os anticorpos monoclonais SH2, SH3 e SH4, que reconhecem células estaminais mesenquimatosas que são SH2+, SH3+ e SH4+. 0 documento US 5199942 é dirigido a um método de transplante autólogo de células hematopoiéticas num doente que recebe terapêutica citorredutora. 0 método envolve a expansão de células progenitoras hematopoiéticas ex vivo com um factor de crescimento.

Sumário da Invenção A invenção é dirigida à utilização de um factor de crescimento seleccionado do grupo consistindo em G-CSF e GM-CSF para o fabrico de uma composição farmacêutica para aumentar a quantidade de células estaminais mesenquimatosas em sangue periférico em que as células estaminais mesenquimatosas humanas são SH2+, SH3+ e/ou SH4+.

De acordo com uma forma de realização preferida da 3 invenção, as células estaminais mesenquimatosas são ainda CD14-e CD34-. 0 referido factor do crescimento pode ser utilizado num método para obtenção de células estaminais mesenquimatosas humanas em que as células estaminais mesenquimatosas humanas são recuperadas de sangue periférico obtido de um indivíduo. Mais particularmente, o referido factor de crescimento pode ser utilizado num método para recuperação de sangue periférico contendo uma população de células aumentada em células estaminais mesenquimatosas humanas de um indivíduo compreendendo esse método (i) a administração ao referido indivíduo de pelo menos, um factor de crescimento e, em seguida, (ii) a recuperação de hMSC do sangue periférico do referido indivíduo. Os factores de crescimento que podem ser utilizados de acordo com a invenção são G-CSF, GM-CSF e as suas associações. 0 referido factor de crescimento pode ser utilizado num método para recuperação de uma população de células estaminais mesenquimatosas humanas expandida por cultura de sangue periférico enriquecido em células estaminais mesenquimatosas, isolada de um indivíduo por (i) administração ao referido indivíduo de, pelo menos, um factor de crescimento; (ii) recuperação de sangue periférico enriquecido em células estaminais mesenquimatosas do referido indivíduo; (iii) cultura do sangue periférico enriquecido em células estaminais mesenquimatosas ou de uma sua fracção; e (iv) isolamento de uma população expandida por cultura de células estaminais mesenquimatosas humanas de outras células do referido sangue periférico enriquecido em células estaminais mesenquimatosas. Os passos de cultura e isolamento de também podem ser por ordem invertida. Isto é, as células estaminais mesenquimatosas podem ser isoladas do sangue periférico e depois expandidas por cultura. As abordagens para esse isolamento incluem 4 fraccionamento por gradiente de densidades, imunosselecção e separação por adesão diferencial. Os meios de cultura podem ser meios quimicamente definidos isentos de soro ou podem ser um "meio completo", tal como DMEM ou DMEM-lg contendo soro. Os meios definidos quimicamente isentos de soro adequados estão descritos no documento U.S. N° de série 08/464599, apresentado em 5 de Junho de 1995, e "meios completos" estão descritos na patente U.S. N° 5486359, publicada em 23 de Janeiro de 1996. O referido factor de crescimento pode ainda ser utilizado num método para conservação ex vivo de uma população isolada, expandida por cultura de células estaminais mesenquimatosas humanas de sangue periférico enriquecido em células estaminais mesenquimatosas de um indivíduo por (i) administração ao referido indivíduo de, pelo menos, um factor de crescimento; (ii) recuperação do sangue periférico enriquecido em células estaminais mesenquimatosas do referido indivíduo; (iii) cultura do sangue periférico enriquecido em células estaminais mesenquimatosas; (iv) isolamento de uma população expandida por cultura de células estaminais mesenquimatosas humanas de outras células no referido sangue periférico enriquecido em células estaminais mesenquimatosas; e (v) conservação da população isolada expandida por cultura de células estaminais mesenquimatosas humanas. De um modo preferido, a conservação é feita por crioconservação. 0 referido factor de crescimento pode ainda ser utilizado num método para tratamento de um indivíduo necessitado de tratamento com uma população isolada, expandida por cultura de células estaminais mesenquimatosas humanas por (i) administração ao referido indivíduo de, pelo menos, um factor de crescimento; (ii) recuperação do sangue periférico enriquecido em células estaminais mesenquimatosas do referido indivíduo; (iii) cultura do sangue periférico enriquecido em células estaminais 5 mesenquimatosas; (iv) isolamento de uma população expandida por cultura de células estaminais mesenquimatosas humanas de outras células no referido sangue periférico enriquecido em células estaminais mesenquimatosas; e (v) administração da referida população isolada expandida por cultura de células estaminais mesenquimatosas humanas ao referido indivíduo. As células podem ser administradas, por exemplo, por perfusão sistémica ou implantação local num sítio em que é desejada a geração de tecido de novo, tal como por um processo aberto ou artroscópico. As células podem ser conservadas antes da readministração.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1. Fotomicrografias de contraste de fase de células estromais de cultura de colheitas de PBPC mobilizadas.

Figura IA. Após cultura (10 dias) de PBPC a baixa densidade em meio suplementado com 20% de FCS, foi produzida uma camada aderente contendo células semelhantes a fibroblastos, colónias e pequenas células redondas (a). (x 10) .

Figura 1B. As colónias são formadas por células semelhantes a fibroblastos, células redondas grandes e achatadas e células redondas pequenas dispersas ou localizadas sobre células redondas grandes e achatadas (x 100) .

Figura 1C. Após 20 dias de cultura, observa-se uma monocamada aderente praticamente confluente de células semelhantes a fibroblastos (x 10). 6

Figura 2. Imunocoloração de fibronectina, colagénio I, ICAM-1, VCAM-1 e antigénio mesenquimatoso SH2 em culturas de células estromais derivadas de colheitas de PBPC mobilizadas.

As micrografias mostram a coloração por imunofluorescência in situ de fibronectina (Figura 2A), colagénio I (Figura 2B), ICAM-1 (Figura 2C), VCAM-1 (Figura 2D) e antigénio mesenquimatoso SH2 (Figura 2E). Ampliação 40 x do original.

Figura 3. Histogramas representativos de FACScan para a expressão de antigénios na superfície de células estaminais mnesenquimatosas. Células aderentes de culturas com 10 dias de células progenitoras de sangue periférico (PBPC) e medula óssea, foram libertadas com EDTA e analisadas quanto à expressão de antigénios de superfície associados a células estaminais mesenquimatosas identificadas por anticorpos monoclonais SH-2 e SH-3. Apresenta-se o espectro de dispersão de FSC vs. SSC para MSC de sangue periférico (Figura 3A) e MSC de medula óssea (Figura 3D) para permitir a passagem de SH-2+/CD14-. O perfil de fluorescência em cada uma das Figuras 3B, 3C, 3E e 3F mostra o controlo negativo sem coloração (pico esquerdo de cada uma) e o controlo positivo de células coradas (pico direito de cada uma). 7

Figura 4. Correlação entre o número de células CD34+ e SH-2+ em produtos de aférese mobilizados por factor de crescimento.

Foram analisados dados dos produtos de aferese de 14 doentes de cancro da mama. Os números de CD34+ e SH-2+ foram normalizados para 10^ células mononucleares por mL de cada colheita. A linha representa a tendência (coeficiente de correlação de 0,92).

Descrição Pormenorizada de Formas de Realização Preferidas

Os seguintes são exemplos representativos de citocinas que podem ser utilizadas: a IL-1 pode ser utilizada numa quantidade eficaz para enriquecer a população de hMSC em sangue periférico, geralmente essa quantidade é de pelo menos 20 pg/mL e não precisa de exceder 1 ng/mL, de um modo preferido 1 ng/mL; a IL-6 pode ser utilizada numa quantidade eficaz para enriquecer a população de hMSC em sangue periférico, geralmente essa quantidade é de, pelo menos, 1 pg/mL e não precisa de exceder 50 ng/mL de um modo preferido 10 ng/mL; a IL-3 pode ser utilizada numa quantidade eficaz para enriquecer a população de hMSC em sangue periférico, geralmente essa quantidade é de, pelo menos, 500 pg/mL e não precisa de exceder 50 ng/mL, de um modo preferido 500 pg/mL; o G-CSF pode ser utilizado na presente invenção numa quantidade eficaz para enriquecer a população de hMSC em sangue periférico, e geralmente essa quantidade é de pelo menos 100 pg/mL e não precisa de exceder 1 ng/mL, de um modo preferido 200 pg/mL. O GM-CSF pode ser utilizado na presente invenção numa quantidade eficaz para enriquecer a população de hMSC em sangue periférico, geralmente essa quantidade é de, pelo menos, 100 pg/mL e não precisa de exceder 1 ng/mL, de um modo preferido 200 pg/mL; o ligando c-kit pode ser utilizado numa quantidade eficaz para enriquecer a população de hMSC em sangue periférico, geralmente essa quantidade é de, pelo menos, 1,0 ng/mL e não precisa de exceder 500 ng/mL, de um modo preferido 100 ng/mL. Essas citocinas podem ser utilizadas sós ou em combinação umas com as outras. Outras citocinas, como LIF e SCF, e as suas combinaçõess também podem ser utilizadas para mobilizar hMSC em sangue periférico.

As hMSC recuperadas de sangue periférico podem ser utilizadas de várias maneiras. Por exemplo, essas hMSC podem ser utilizadas como parte de uma terapêutica de substituição celular. Especificamente as hMSC expandidas e cultivadas podem ser infundidas sós ou adicionadas a células de medula óssea para processos de transplante de medula óssea. Também estão contempladas outras aplicações, particularmente ortopédicas. Essas incluem, por exemplo, o tratamento de osteoartrite, osteoporose, estados traumáticos ou patológicos envolvendo quaisquer dos tecidos conjuntivos. Também está contemplado que material genético exógeno seja introduzido nas células enquanto ex vivo e que as células sejam readministradas como parte de um regime de terapia génica. A engenharia genética de células estaminais mesenquimatosas está discutida de modo aprofundado na patente U.S.N° 5591625, publicada em 7 de Janeiro de 1997.

As células podem ser expandidas, tal como pelo processo ensinado em Caplan et al., patente U.S. N° 5486359 (publicada em 23 de Janeiro de 1996), antes ou depois de serem congeladas. Após a quimioterapia, as células expandidas são reinfundidas num doente por processos conhecidos na matéria.

Os exemplos seguintes são proporcionados para ilustrar mais e descrever a presente invenção; contudo, não se pretende com eles limitar o âmbito da presente invenção. 9

Exemplo 1

Isolamento de hNSC de Sangue Periférico Humano

No presente estudo, detectou-se a presença de hMSC em colheitas de hHSC mobilizadas por factor de crescimento de doentes com cancro da mama. Para este fim, utilizou-se um processo que inclui a cultura de hMSC e a sua quantificação por citometria de fluxo, utilizando anticorpos monoclonais contra antigénios de superfície expressos por hMSC derivadas de medula, i. e., SH2 e SH3. Uma abordagem semelhante já tinha sido seguida para demonstrar que as células de medula incluem a célula estaminal mesenquimatosa primitiva.

População de doentes e processo de colheita de hHSC

Catorze doentes do sexo feminino com cancro da mama de fase II confirmado histologicamente com 10 ou mas nódulos linfáticos axilares envolvidos, foram tratados com (i) quimioterapia^, e depois (ii) com G-CSF humano recombinante (Neupogen®, F.

Hoffmann-La Roche Ltd., Basileia, Suíça) ou com GM-CSF (Leucomax®, Schering Plough-Sandoz Pharma Ltd., Basileia, Suíça) a 5 pg/kg/dia subcutaneamente, um dia depois do final da quimioterapia. Em seguida efectuou-se uma colheita de hHSC durante a recuperação da medula logo que foi detectável uma população distinta de CD34+(^ 10/1) no sangue periférico, utilizando um separador de sangue Haemonetics (Braintree, MA) V50. Uma alíquota da colheita de hHSC foi contada e processada para exame morfológico, doseamento de CFU-GM-*-^ e teor de CD34 por imunofluorescência directa (ver adiante). Outra alíquota foi 10 posta de parte para cultura e análise fenotípica de hMSC SH2+. As colheitas de hHSC foram reduzidas em volume por centrifugação, diluídas numa mistura de plasma autólogo e DMSO a 10%, congeladas num congelador com velocidade controlada (Cryomed; Forma Scientific, Marietta, OH, EUA) e crioconservadas na fase de vapor de azoto líquido até à reinfusão.

Colheita de medula óssea

Material remanescente foi obtido de células de medula óssea (BM) heparinizadas retiradas de indivíduos normais submetidos a colheita de BM para transplantação alogénica. Células em meio 199 contendo 20 U/mL de heparina foram lavadas duas vezes, ressuspensas em meio só e utilizadas para cultura de hMSC derivadas de medula.

Todos os processos foram realizados cumprindo as orientações do comité de ética da Clínica Las Condes. Obteve-se a autorização de cada doente após informação prévia.

Cultura de hHSC de sangue periférico e de hMSC derivadas de medula.

As hMSC foram cultivadas utilizando métodos descritos anteriormente-*--*-' 13. Resumidamente, células mononucleares de produtos de aferese e de colheitas de BM foram separadas por centrifugação de densidade em Ficoll-Hypaque a 1,077 g/cm^ (Sigma, St. Louis, MO, EUA). As células de baixa densidade foram suspensas em a-MEM contendo soro fetal de vitelo a 20% (FCS, Sigma, St.Louis, MO, EUA) e cultivadas em placas de Petri de 35 mm numa concentração de 10^ células/placa, a 37 °C, numa 11 atmosfera humedecida contendo 5% de C02· Após 10 dias em cultura, com uma mudança de meio ao dia 4, as células da camada aderente foram utilizadas para análise fenotípica in situ ou após separação das células com EDTA a 0,02% em soro fisiológico tamponado com fosfato.

Análise fenotípica. O exame ao microscópio de luz foi realizado em células coradas com Wright Giemsa na placa de cultura ou em preparações citocentrifugadas de células deslocadas com EDTA. A coloração histoquimica foi realizada por protocolos correntes utilizando kits de diagnóstico (Sigma) para Negro de Sudão, Ácido Periódico-Schiff (PAS), butirato de α-naftilo esterase, fosfatase ácida e fosfatase alcalina.

Para estudos de imunofluorescência, as células foram processadas com um reagente de fixação/permeabilização (Cytoperm®, Serotech Ltd., Oxford, Inglaterra) e marcadas com anticorpos monoclonais apropriados livres ou conjugados com FITC (ver adiante) e lidas com iluminação ultravioleta a 50 nm com uma lâmpada de vapor de mercúrio num microscópio Nikon. Para análise por citometria de fluxo, as células deslocadas com EDTA ou células nos produtos de aferese foram coradas com anticorpos monoclonais puros ou conjugados com FITC ou PE. Utilizou-se anticorpos não específicos compatíveis com o isotipo para determinar a fluorescência de fundo. As células foram analisadas num citómetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson, BD) e a aquisição de dados foi feita com o software de investigação FACScan Lysis II (BD). Cada determinação incluiu pelo menos 30000 células. 12

Utilizou-se os seguintes anticorpos: anti-CD-45-FITC, anti-CD14-PE, anti-CD34-PE, foram adquiridos a Becton Dickinson; anti-colagénio I, anti-colagénio III e anti-fibronectina eram da Sigma; anti-colagénio VI era da Gibco BRL (Grand Island, NI, EUA); anti-ICAM-1 (CD54) e anti-VCAM-1(CD106) eram de R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA). IgGi-PE, IgGi-FITC, IgG2a_PE e F(ab')2-PE de murganho, para controlo, foram adquiridos a Becton Dickinson. Os anticorpos monoclonais SH-2 (IgGi) e SH-3 (lgG2b) foram gentilmente cedidos pelo Dr. A.I. Caplan (Case Western Reserve University, Cleveland, OH, EUA) e por Osiris Therapeutics, Inc. (Baltimore, MD, EUA). Estes anticorpos reconhecem antigénios na superfície de células, de células progenitoras mesenquimatosas derivadas de medula, mas não reagem com células hematopoiéticas derivadas de medula bem como com a superfície celular de osteoblastos ou osteocitos.12,14,15

RESULTADOS

Geração de hMSC ex vivo a partir de colheitas de hHSC mobilizadas. Células mononucleares de baixa densidade de colheitas de hHSC foram cultivadas em cultura na presença de FCS mas na ausência de glucocorticóides ou factores de crescimento que favorecem a replicação/diferenciação de precursores estromais e hematopoiéticos, respectivamente.15,17 Após remoção de células não aderentes por substituição do meio (dia 4 de cultura) , uma pequena porção de células nucleadas aderentes foram visualizadas na placa de cultura, que pelo dia 10 de cultura se tinham desenvolvido numa camada aderente contendo abundantes células semelhantes a fibroblastos dispersas e várias colónias grandes (Figura IA). 13

Quando examinado por microscopia de contraste de fase, o núcleo de cada colónia era predominantemente formado por várias células semelhantes a fibroblastos e por poucas células grandes redondas e achatadas. Também se observou células redondas pequenas, dispersas pelas colónias ou sobre as células redondas grandes e achatadas (Figura 1B) . Todos os tipos de células que formam uma colónia eram fracamente positivas ao Negro de Sudão e negativas para fosfatase alcalina. Ao dia 20 de cultura, as células tinham proliferado e tendiam a formar uma camada praticamente continua compreendendo sobretudo células semelhantes a fibroblastos. Nesta altura as células grandes e achatadas estavam dispersas e representavam apenas uma população minoritária (Figura 1C).

Como evidenciado por análise histoquimica (não ilustrada), as células estromais eram positivas a butirato de a-naftilo esterase, Ácido Periódico-Schiff (PAS) e fosfatase ácida; fracamente positivas a Negro de Sudão e negativas a fosfatase alcalina de membrana. Não se observou diferenças histoquímicas significativas entre células semelhantes a fibroblastos e células redondas grandes e achatadas. A caracterização imunológica de células estromais derivadas de PBPC foi realizada por imunofluorescência indirecta, utilizando um painel de anticorpos monoclonais correntemente utilizados para detectar células estromais de medula óssea. Os resultados destes estudos estão sumariados na Tabela 1. 14 TABELA 1

Estudos de imunofluorescência em células estromais de cultura geradas a partir de colheitas de PBPC mobilizadas. tipo de célula: marcador semelhantes a fibroblastos redondas grandes e achatadas fibronectina +++ ++* colagénio I ++ + * colagénio III + + colagénio VI ++ + ICAM-1 +++ ++ VCAM-1 ++ + células mesenquimatosas (SH2) ++ ++ células mesenquimatosas (SH3) +++ ++ CD14 - - CD34 - - Após coloração in situ com o anticorpo apropriado, as células foram classificadas quanto a coloração positiva (+) e negativa (-). *: alta expressão em torno do núcleo

Analogamente, micrografias mostrando colorações por imunofluorescência seleccionadas (i. e., fibronectina, colagénio I, ICAM-1, VCAM-1 e antigénio mesenquimatoso SH-2) estão ilustradas na Figura 2. Em geral, o padrão de coloração revelou a produção de moléculas de matriz extracelular e a expressão de ligandos de adesão. Conjuntamente, as células estromais que são CD14- e CD34- exprimem antigénios mesenquimatosos reconhecidos por anticorpos monoclonais SH2 e SH3. Sem excepção, não foram observadas diferenças imunofenotipicas entre as células semelhantes a fibroblastos e 15 as células redondas grandes e achatadas. Células redondas pequenas, observadas no seio de colónias, demonstraram ser CD45+ e CD34- e não foram adicionalmente analisadas. A análise por citometria de fluxo de células estromais libertadas com EDTA ao dia 10 indicou que mais do que 85% das células exprimem proteínas únicas na superfície de células estaminais mesenquimatosas humanas, que foram detectadas por anticorpos monoclonais SH-2 e SH-3 (Figura 3A) . Conjuntamente, a análise por citometria de fluxo de células estromais libertadas por EDTA revelou ausência de expressão de antigénio associados a células hematopoiéticas progenitoras ou maduras como CD34, CD45 e CD14. A Figura 3B mostra o padrão de coloração de células estromais de medula óssea libertadas com EDTA após marcação com anticorpos SH2 e SH3.

Portanto, com base na morfologia e fenotipo da membrana da superfície, hMSC geradas ex vivo a partir de colheitas de hHSC mobilizadas são indistinguíveis de células estaminais mesenquimatosas humanas derivadas de medula óssea.

Quantificação de hMSC em colheitas de hHSC mobilizadas por factores de crescimento. O teor de hMSC em colheitas de hHSC mobilizadas por factor de crescimento foi determinado por citometria de fluxo utilizando anticorpo monoclonal SH2. SH2+-hMSCs foram localizadas na gama superior de contagem de linfócitos e na gama inferior de agregados de células de monócitos num gráfico de pontos da dispersão frontal e lateral. Para evitar a fraca 16 sobreposição entre células SH2+ e CD14 + e a ligação não especifica do anticorpo secundário (igGi) a monócitos, foi feita uma delimitação em torno da zona acima referida, para excluir células CD14+ e contar as células SH-2+/CD14-.

Foram detectadas hMSCs SH2+ em 11/14 colheitas de hHSC. A percentagem média de células SH2+ em produtos de aférese era 0,63% (gama de 0,02-2,32). Não se observou correlação entre a percentagem de células SH2+ ou a quantidade total de células SH2+ por colheita e o tipo de factor de crescimento (GM-CSF ou G-CSF) utilizado para mobilizar as colheitas de hHSC.

Para determinar se a eficácia de mobilização de hHSC (determinada como a quantidade de células CD34+ colhidas), se correlacionava com a quantidade de células SH2+ por aférese,

analisou-se o tipo de relação entre ambas as variáveis. Como se observa na Figura 4, considerando todo o grupo de 14 doentes estudados, constatou-se uma correlação muito forte (r = 0,92, P < 0,001) entre o número absoluto de células CD34+ e o de células SH2+, em cada produto de aférese. Estes resultados sugerem que o número de SH2+ pode ser previsto a partir do número de células CD34+ com alto nivel de confiança.

As células mononucleares preparadas a partir do sangue de três dadores normais eram negativas para células SH2+, enquanto que células mononucleares preparadas a partir de uma amostra de sangue colhida de uma doente sem cancro da mama após 5 dias de estimulação com G-CSF continha 0,11% de hMSC SH2+. 17

DISCUSSÃO

Enquanto que em produtos de aférese mobilizados com factor de crescimento está bem documentada a presença de progenitor hematopoiético, bem como a de células imunes e tumorais acessórias,5'618,19,29 tanto quanto se conhece, não existe informação anterior quanto à presença de hMSC em colheitas de hHSC.

Aqui utilizou-se uma abordagem dupla, que incluiu a geração ex vivo de hMSC e a sua caracterização fenotipica, para investigar quanto à presença de hMSC em colheitas de hHSC mobilizadas por factor de crescimento em doentes de cancro da mama.

As células mononucleares de baixa densidade de colheitas de hHSC, quando cultivadas na presença de FCS dão origem a uma população de células fortemente aderentes compreendendo células semelhantes a fibroblastos tanto isoladas como formadoras de colónias, que no último caso se desenvolvem conjuntamente com células redondas grandes e achatadas. Os marcadores típicos de diferenciação de estroma de medula, tais como positividade para Negro de Sudão e fosfatase alcalina,23 são fracamente expressos ou estão ausentes em células aderentes derivadas de colheitas de PBPC. Os antigénios progenitores mielóides precoces ou tardios, como CD34, CD45, CD14, não são expressos por estas células. Por outro lado, hMSC derivadas de colheitas de hHSC são reconhecidas pelos anticorpos SH2 e SH3 que reagem com antigénios na superfície de células estaminais mesenquimatosas humanas derivadas de medula, mas não reagem com células hematopoiéticas derivadas de medula.-*-3 Além disso, os presentes estudos demonstraram que as características fenotípicas de hMSC derivadas de colheitas de hHSC são semelhantes às de hMSC 18 derivadas de medula óssea.

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Lisboa, 29 de Junho de 2007 23

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de células estaminais mesenquimatosas humanas que são SH2 + , SH3+ e/ou SH4 + para o fabrico de uma composição farmacêutica para terapia de substituição celular, terapia génica, transplante de medula óssea, aplicações ortopédicas, tratamento de osteoartrite, osteoporose, e estados traumáticos ou patológicos do tecido conjuntivo, em que as referidas células estaminais mesenquimatosas foram obtidas a partir de sangue periférico após a administração de uma quantidade eficaz de um factor de crescimento seleccionado do grupo consistindo em G-CSF e GM-CSF.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 em que as células estaminais mesenquimatosas são também CD14- e CD34- Lisboa, 29 de Junho de 2007 1