EA029577B1

EA029577B1 - Клетки-предшественники мезодермальной линии

Info

Publication number: EA029577B1
Application number: EA201391773A
Authority: EA
Inventors: Томас Эверилл Хауз; Мартин Джон Эванс; Аджан Реджинальд; Ина Лаура Пипер; Брайан Ли Перкинс
Original assignee: Селл Терапи Лимитед
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2018-04-30
Also published as: CN104508124A; US20210032600A1; AU2017204559A1; CA2840307A1; EA201391773A1; WO2013005053A2; DK2729562T3; JP6607675B2; HRP20181152T1; AU2012279995B2; EP2729562A2; AU2012279995A1; ES2675693T3; IL230071B; HUE039236T2; CA2840307C; US10829739B2; LT2729562T; US20200048613A1; EP2729562B1

Abstract

Изобретение относится к клеткам-предшественникам мезодермальной линии и их применению в терапии.

Description

029577 Β1

029577

Область техники

Настоящее изобретение относится к клеткам-предшественникам мезодермальной линии и к их применению в терапии.

Предпосылки создания изобретения

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой мультипотентные стволовые клетки взрослого организма. МСК дифференцируются с образованием различных специализированных клеток, детектируемых в скелетных тканях. Например, они могут дифференцироваться в хрящевые клетки (хондроциты), костные клетки (остеобласты) и жировые клетки (адипоциты).

МСК применяют в различных видах терапии, таких как лечение возрастной макулярной дегенерации (ВМД) и инфаркта миокарда. После введения пациенту МСК обычно мигрируют (или направляются в процессе хоуминга) к поврежденным тканям и оказывают терапевтическое действие посредством паракринной передачи сигналов и способствуя выживанию, восстановлению и регенерации соседних клеток в поврежденной ткани.

Современные виды терапии обычно включают инфузию смеси подтипов МСК, некоторые из которых не мигрируют эффективно в ткани-мишени. Это обуславливает необходимость применения высокой дозы клеток, что может привести к нецелевым побочным эффектам и побочным эффектам, связанным с объемом. МСК обычно получают из костного мозга, соответственно, МСК трудно получить в больших количествах.

Краткое описание изобретения

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили новый класс клеток-предшественников мезодермальной линии (КПМЛ, РМЬ), обладающих специфическим паттерном экспрессируемых маркеров. Гомогенные популяции КПМЛ согласно настоящему изобретению могут быть выделены из мононуклеаров (МК), таких как МК периферической крови. КПМЛ способны эффективно мигрировать в поврежденные ткани и восстанавливать их.

Согласно настоящему изобретению предложена клетка-предшественник мезодермальной линии, которая: (а) экспрессирует детектируемые уровни СЭ29, СЭ44. СЭ73. СЭ90, СЭ105 и СЭ271 и (Ь) не экспрессирует детектируемые уровни СЭ14, СЭ34 и СЭ45.

Согласно настоящему изобретению также предложены

популяция, включающая две или больше клеток-предшественников согласно настоящему изобретению;

фармацевтическая композиция, включающая: (а) клетку-предшественника согласно настоящему изобретению или популяцию согласно настоящему изобретению и (Ь) фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель;

способ получения популяции согласно настоящему изобретению, включающий: (а) культивирование мононуклеаров (МК) в условиях, которые индуцируют дифференцировку МК в клеткипредшественники мезодермальной линии, и (Ь) сбор и культивирование тех клеток-предшественников, которые обладают паттерном экспрессии согласно настоящему изобретению и, что обеспечивает получение популяции согласно настоящему изобретению;

способ восстановления поврежденной ткани у пациента, включающий введение пациенту популяции согласно настоящему изобретению, причем популяция включает терапевтически эффективное количество клеток, что обеспечивает восстановление поврежденной ткани у пациента; и

популяция согласно настоящему изобретению для применения для восстановления поврежденной ткани у пациента.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показан гель после проведения ОТ-ПЦР, подтверждающий наличие СЭ44 и отсутствие СЭ34 в КПМЛ согласно настоящему изобретению.

На фиг. 2 показаны результаты анализа методом РАС8 КПМЛ согласно настоящему изобретению. Они подтверждают, что клетки являются положительными по как минимум СЭ73 и СЭ90 и отрицательными по СЭ14, СЭ34 и СЭ45.

На фиг. 3 также показаны результаты анализа методом РАС8, а именно гистограммы для СЭ90 (сверху) и СЭ73 (снизу).

На фиг. 4 показаны гистограммы РАС8 для отсутствия СЭ14, СЭ34 и СЭ45 в окрашенных (Фиг. 4а) и неокрашенных (фиг. 4Ь) клетках.

Фиг. 5 демонстрирует, что клетки-предшественники мезодермальной линии мигрируют в область перелома в зависимости от времени и в зависимости от градиента

СХСК4. Анализ биолюминесценции (БЛ) проводили в день 1 (первый ряд), 3 (второй ряд), 7 (третий ряд) и 14 (четвертый ряд) после перелома/трансплантации у мыши с переломом большой берцовой кости, которая получала трансплантат или 106 РМБ-Р-Ас1-Бис (КПМЛ) (левый столбец), РМБ-П-Ас1-БнсСХСК4+ (СХСК4(+)) (средний столбец) или РМБ-Р-Ас1-Бнс-СХСР4- (СХСК4(-)) (правый столбец).

Подробное описание изобретения

Необходимо понимать, что различные варианты применения раскрытых продуктов и способов могут быть адаптированы к конкретным техническим потребностям. Также необходимо понимать, что ис- 1 029577

пользуемая в настоящей заявке терминология предназначена исключительно для описания конкретных вариантов реализации настоящего изобретения и не предназначена для ограничения.

Кроме того, формы единственного числа, используемые в настоящей заявке и прилагаемой формуле изобретения, включают множественное число определяемых объектов, если контекст четко не диктует обратное. Таким образом, например, указание "клетка" включает "клетки", термин "ткань" включает две или более таких тканей, термин "пациент" включает двух или более таких пациентов и тому подобное.

Все публикации, патенты и заявки на патенты, цитируемые в настоящей заявке как выше, так и ниже, полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки.

КПМЛ согласно настоящему изобретению

В настоящем изобретении предложена клетка-предшественник мезодермальной линии (КПМЛ). КПМЛ экспрессирует детектируемые уровни СЭ29. СЭ44. СЭ73. СЭ90. СЭ105 и СЭ271. и не экспрессирует детектируемые уровни СЭ14. СЭ34 и СЭ45.

КПМЛ согласно настоящему изобретению обладает многочисленными преимуществами. Ключевые преимущества будут обобщены в настоящей заявке. Однако дальнейшие преимущества станут очевидными из обсуждения ниже.

КПМЛ согласно настоящему изобретению могут с преимуществом применяться для восстановления поврежденных тканей пациентов. КПМЛ способны эффективно мигрировать (или направляться в процессе хоуминга) к поврежденной ткани и проявлять противовоспалительное действие в ткани. Это более подробно обсуждается ниже. Одно из наиболее важных свойств КПМЛ заключается в способности к миграции (или хоумингу) к поврежденным сайтам, которая включает хемотаксис. Этот процесс основан на передаче сигналов посредством хемокинов и включает различные механизмы, такие как перекатывание (гоШпд), адгезию и трансмиграцию. Противовоспалительное действие КПМЛ стимулирует выживание, восстановление и регенерацию соседних клеток в поврежденной ткани. Клетки также способны оказывать паракринные эффекты, например, секретировать ангиогенные, хемотактические и антиапоптотические факторы.

Как более подробно обсуждается ниже, КПМЛ получают из мононулкеаров (МК), таких как периферические МК, выделенные из организма человека. Поскольку КПМЛ получают из МК, они могут быть легко получены (например, из периферической крови) и могут быть аутологичными для пациента, которого лечат, что позволяет избежать риска иммунологического отторжения пациентом.

В принципе, возможно получить неограниченное число КПМЛ от одного индивида, поскольку можно получить различные образцы МК (т.е. различные образцы крови). Естественно, возможно получить очень большое число КПМЛ от одного индивида. КПМЛ согласно настоящему изобретению могут, таким образом, быть получены в больших количествах.

КПМЛ согласно настоящему изобретению получают в клинически приемлемых условиях, например, в отсутствие следовых количеств эндотоксинов и других контаминантов внешней среды, а также продуктов животного происхождения, таких как фетальная бычья сыворотка. Это делает КПМЛ согласно настоящему изобретению особенно подходящими для введения пациентам.

Поскольку КПМЛ согласно настоящему изобретению получают из МК, они по существу гомологичны и могут быть аутологичными. Для них также не характерны различия в зависимости от донора, которые часто наблюдаются у мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Многочисленные популяции КПМЛ согласно настоящему изобретению могут быть получены из образца, отобранного от пациента до начала любой другой терапии, такой как хемиотерапия или радиотерапия. В результате этого КПМЛ согласно настоящему изобретению позволяют исключить все вредные эффекты этих видов лечения.

Получение КПМЛ согласно настоящему изобретению не представляет затруднений. КПМЛ могут быть получены из клеток МК в течение менее чем 30 дней, например в течение приблизительно 22 дней.

Получение КПМЛ из МК позволяет избежать моральных и этических трудностей, связанных с использованием мезенхимальных стволовых клеток (МСК) - производных эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК).

КПМЛ согласно настоящему изобретению обычно получают из МК человека. Таким образом, КПМЛ согласно настоящему изобретению обычно являются человеческими.

КПМЛ согласно настоящему изобретению можно идентифицировать как клетки-предшественники мезодермальной линии с использованием стандартных методов, известных в данной области техники, включая экспрессию маркеров, экспрессия которых ограничена этой линией, структурные и функциональные характеристики. КПМЛ будут экспрессировать детектируемые уровни маркеров клеточной поверхности, которые являются характерными для клеток-предшественников мезодермальной линии. В частности, в дополнение к маркерам, более подробное обсуждение которых приведено ниже, КПМЛ могут экспрессировать α-актин гладких мышц, а-цепь коллагена типа I, ΟΑΤΛ6, Мойа^к и виментин (8ад1 В е1 а1 81ет Се11з Эе\. 2012 Маг 20; 21(5): 814-28).

Можно успешно осуществить анализ КПМЛ согласно настоящему изобретению на способность осуществлять дифференцировку ίη νίίτο для подтверждения того, что они принадлежат к мезодермальной линии. Такие варианты анализа включают, но не ограничиваются ими, анализ адипогенной дифференцировки, анализ остеогенной дифференцировки и анализ нейрогенной дифференцировки (Ζηίιη М. еί а1 Αηη

- 2 029577

НешаЮ1. 2012 Аи§;91(8):1 175-86).

КПМЛ согласно настоящему изобретению не являются стволовыми клетками. В частности, они не являются мезенхимальными стволовыми клетками (МСК). Они терминально дифференцированы. Хотя при помощи соответствующих условиях может быть индуцирована их дифференцировка ίη νίίτο, например, в клетки хряща или кости, они не дифференцируются ίη νίνο. КПМЛ согласно настоящему изобретению оказывают свое действие путем миграции к поврежденной ткани и осуществления паракринной передачи сигналов в поврежденной ткани. В частности, КПМЛ предпочтительно способны к индукции противовоспалительного действия в поврежденной ткани. Это более детально обсуждается ниже.

КПМЛ согласно настоящему изобретению обычно обладают веретеновидной формой. КПМЛ являются обычно фибробластоподобными, т.е. они имеют небольшое тело клетки с несколькими длинными и тонкими клеточными отростками. Клетки обычно составляют от приблизительно 10 до приблизительно 20 мкм в диаметре.

КПМЛ согласно настоящему изобретению отличаются от известных КПМЛ паттерном экспрессируемых маркеров. КПМЛ согласно настоящему изобретению экспрессируют детектируемые уровни СИ29, СИ44, ΟΌ73, СИ90, СИ105 и СИ271. КПМЛ согласно настоящему изобретению могут сверхэкспрессировать один или более или все из следующих маркеров: СЭ29. СЭ44. СЭ73. СЭ90. СЭ105 и СЭ271. КПМЛ согласно настоящему изобретению сверхэкспрессируют один или более из маркеров СЭ29, СЭ44, СЭ73, СЭ90, СЭ105 и СЭ271, если они экспрессируют их больше, чем другие КПМЛ и/или МСК. КПМЛ согласно настоящему изобретению не экспрессируют детектируемые уровни СЭ14, СЭ34 и СЭ45.

СЭ29 (интегрин бета-4) является интегриновой единицей, связанной с очень рецепторами антигенов очень поздней стадии. Известно, что он объединяется с альфа-3 субъединицей с образованием α3β1 комплекса, который реагирует с нетрином-1 и рилином.

СЭ44 является гликопротеином клеточной поверхности, участвующим в межклеточных взаимодействиях, процессах клеточной адгезии и миграции. У человека антиген СЭ44 кодируется геном СЭ44 на хромосоме 11.

СИ73, также известный как экто-5'-нуклеотидаза (экто-5'-ЭТ, ЕС 3.1.3.5), является гликозилфосфатидилинозитол-связанным эктоферментом клеточной поверхности массой 70 кДа, присутствющим во многих типах рака человека и животных.

СЭ90 (или ТНу-1) является в высокой степени Ν-гликозилированным, гликофосфатидилинозитол (ГФИ) - заякоренным консервативным белком клеточной поверхности молекулярной массой 25-37 кДа с одним У-подобным иммуноглобулиновым доменом. Он был изначально обнаружен как антиген тимоцитов.

СЭ105 (или эндоглин) является мембранным гликопротеином I типа, расположенным на поверхности клеток, и представляет собой часть комплекса рецептора трансформирующего фактора роста бета (ТОР).

СИ271, также известный как низкоаффинный рецептор фактора роста нервов (ΕΝΟΡΚ) или ρ75ΝΤΚ, относится к низкоаффинным рецепторам нейротрофина и суперсемейству рецепторов фактора некроза опухоли.

СЭ14 является компонентом врожденной иммунной системы и существует в двух формах. Он либо заякорен в мембрану посредством гликозилфосфатидилинозитольного якоря (шСИ14), либо существует в растворимой форме (8СИ14). Растворимый СЭ14 появляется в результате шеддинга шСИ14 (48 кДа) либо напрямую секретируется из внутриклеточных везикул (56 кДа).

СЭ34 является гликопротеином поверхности клетки и функционирует как фактор межклеточной адгезии. Например, он опосредует присоединение стволовых клеток к внеклеточному матриксу костного мозга или непосредственно к стромальным клеткам.

СЭ45 является протеинтирозинфосфатазой (РТР), расположенной в гематопоэтических клетках, за исключением эритроцитов и тромбоцитов. СЭ45 также называют общим лейкоцитарным антигеном, соответствующим Т220 и В220 у мышей. Протеинтирозинкиназы образуют семейство рецептор-подобных индуцируемых цитоплазменных ферментов, которые катализируют дефосфорилирование остатков фосфотирозина и характеризуются гомологичными каталитическими доменами.

Стандартные способы, известные в данной области техники, могут быть использованы для определения детектируемой экспрессии, низкой экспрессии или отсутствия экспрессии различных маркеров, которые обсуждаются выше (и ниже). Подходящие методы включают, но не ограничиваются ими, иммуноцитохимию, иммунный анализ, проточную цитометрию, например, метод сортировки флуоресцентноактивированных клеток (РАС8) и полимеразную цепную реакцию (ПЦР), например, ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Подходящие варианты иммунного анализа включают, но не ограничиваются ими, вестерн-блоттинг, твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А), иммуноферментный спотанализ (ЕЬ18РОТ анализ), методики множественного ферментного иммуноанализа, радиоаллергосорбентный тест (КА8Т), радиоиммунный анализ, анализ радиосвязывания и иммунофлуоресценцию. Вестерн-блоттинг, ЕЬ18А и ОТ-ПЦР являются количественными анализами, вследствие чего их можно использовать для измерения уровня экспрессии различных маркеров при ее наличии. Применение метода

- 3 029577

РАС8 раскрыто в Примере. Антитела и флуоресцентно меченные антитела для каждого из различных маркеров, которые обсуждаются в настоящей заявке, являются коммерчески доступными.

КПМЛ согласно настоящему изобретению предпочтительно способны к миграции в специфичную поврежденную ткань пациента. Другими словами, когда клетки вводят пациенту с повреждением ткани, клетки способны к миграции (или хоумингу) в поврежденную ткань. Это является преимуществом, поскольку означает, что клетки можно инфузировать обычными путями, например, внутривенно, после чего они направятся в место повреждения. Таким образом, отсутствует необходимость доставлять клетки в поврежденную ткань. Повреждение может быть результатом хирургического вмешательства или заболевания, как более подробно обсуждается ниже.

Способность КПМЛ согласно настоящему изобретению мигрировать в поврежденную ткань можно оценить с использованием стандартных методов анализа, известных в данной области техники. Подходящие методы включают, но не ограничиваются ими, геномную полимеразную цепную реакцию с использованием обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР с или без репортерных генов) и методики мечения.

ОТ-ПЦР является наиболее непосредственным и простым способом выявить КПМЛ согласно настоящему изобретению в организме пациента. Для этой цели можно использовать трансдуцированный трансген или индивидуальные маркеры донора; сигналы, специфичные для трансплантированных клеток, уже были получены в некоторых исследованиях на пациентах. Результаты обычно являются полуколичественными.

В альтернативном варианте КПМЛ согласно настоящему изобретению могут быть помечены соответствующим красителем, например, флуоресцентным красителем, и их можно выявлять в организме пациента по сигналу от красителя. Конкретный способ такого мечения раскрыт в примере.

Миграцию (или хоуминг) обычно определяют путем измерения количества клеток, которые достигли поврежденной ткани. Этот процесс можно также оценить непрямыми методами с путем наблюдения количества клеток, которые аккумулируются в легких (а не в поврежденной ткани).

КПМЛ согласно настоящему изобретению, которые способны к миграции в конкретную поврежденную ткань пациента, предпочтительно (а) экспрессируют детектируемые уровни рецептора или сверхэкспрессируют рецептор СХС хемокинов типа 1 (СХСК1) и/или (Ь) экспрессируют детектируемые уровни рецептора или сверхэкспрессируют СХСК2. КПМЛ согласно настоящему изобретению более предпочтительно экспрессируют детектируемые уровни СХСК1 и СХСК2 или сверхэкспрессируют СХСК1 и СХСК2. Поврежденные ткани высвобождают множество растворимых воспалительных факторов, таких как фактор ингибирования миграции макрофагов (М1Р) и интерлейкин-8, и эти факторы могут привлекать КПМЛ согласно настоящему изобретению (и другие воспалительные клетки) к поврежденной ткани посредством связывания с СХСК1 и/или СХСК2.

КПМЛ согласно настоящему изобретению сверхэкспрессируют СХСК1 и/или СХСК2, если они продуцируют больше СХСК1 и/или СХСК2, чем другие КПМЛ и/или МСК. Экспрессия СХСК1 и/или СХСК2 может быть измерена как обсуждается выше. Клетки согласно настоящему изобретению, способные к хоумингу в ткань сетчатки, не экспрессируют детектируемые уровни СХСК1 и СХСК2. Это обсуждается более подробно ниже.

Конкретная поврежденная ткань, к которой способны мигрировать КПМЛ согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой ткань сердца, ткань сетчатки или костную ткань. Ткань сетчатки предпочтительно представляет собой макулу.

Если конкретная поврежденная ткань представляет собой ткань сердца или костную ткань, КПМЛ согласно настоящему изобретению предпочтительно экспрессируют детектируемые уровни рецептора СХС хемокинов типа 4 (СХСК4)или сверхэкспрессируют рецептор СХС хемокинов типа 4 (СХСК4). КПМЛ согласно настоящему изобретению сверхэкспрессируют СХСК4, если они экспрессируют больше СХСК4, чем другие КПМЛ и/или МСК. Если конкретная поврежденная ткань представляет собой ткань сердца или костную ткань, КПМЛ согласно настоящему изобретению более предпочтительно экспрессируют детектируемые уровни или сверхэкспрессируют (а) СХСК1 и СХСК4; (Ь) СХСК2 и СХСК4; или (с) СХСК1, СХСК2 и СХСК4. Экспрессия СХСК4 может быть измерена как обсуждается выше.

Поврежденная ткань сердца высвобождает воспалительные хемокины и цитокины, такие как фактор стромальных клеток 1 (8ΌΡ-1), интерлейкин-8 (ИЛ-8), фактор некроза опухоли альфа (ФНО альфа), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Р), васкулярный эндотелиальный фактор роста (УЕСР) и фактор роста гепатоцитов (НОР). Кроме того, инфаркт миокарда повышает уровень УЕСР и эритропоэтина (ЭПО). СХСК4 связывается со своим лигандом 8ΌΡ-1, в результате чего КПМЛ согласно настоящему изобретению, экспрессирующие СХСК4, будут мигрировать в направлении градиента 8ΌΡ1, образуемого поврежденной сердечной тканью. Другие поврежденные ткани, такие как костная, также высвобождают 8ΌΡ-1.

Если конкретная поврежденная ткань представляет собой ткань сетчатки, такую как макула, КПМЛ согласно настоящему изобретению предпочтительно экспрессируют детектируемые уровни СХСК4, фактора роста эндотелия сосудов (УЕСР), трансформирующего фактора роста бета 1 (ТФР-бета 1), инсулиноподобного фактора роста 1 (1СР 1), фактора роста фибробластов (РСР), фактора некроза опухоли альфа (ФНО альфа), интерферона гамма (ИФН гамма), интерлейкина-1 альфа (ИЛ-1 альфа), СХСЬ12,

- 4 029577

СЭ109, СЭ119, ядерного фактора каппа энхансера легких цепей активированных В-клеток (МРкарра В), СЭ140а, СЭ140Ь, СЭ221, СЭ222, СЭ304, СЭ309 и СЭ325. КПМЛ согласно настоящему изобретению, способные к хоумингу в ткань сетчатки, предпочтительно сверхэкспрессируют один или более или все эти факторы. КПМЛ сверхэкспрессируют эти факторы, если они экспрессируют больше факторов, чем другие КПМЛ и/или МСК. Варианты количественного анализа для клеточных маркеров описаны выше.

КПМЛ согласно настоящему изобретению, способные к хоумингу в ткань сетчатки, также предпочтительно экспрессируют детектируемые уровни фактора пигментного эпителия (ΡΕΌΡ) или сверхэкспрессируют его. Детектируемую экспрессию этих маркеров можно измерить, как описано выше. КПМЛ согласно настоящему изобретению сверхэкспрессируют ΡΕΌΡ, если они экспрессируют больше ΡΕΌΡ, чем другие КПМЛ и/или мезенхимальные стволовые клетки (МСК).

Если конкретная поврежденная ткань представляет собой костную ткань, КПМЛ согласно настоящему изобретению предпочтительно экспрессируют детектируемые уровни ТФР-бета 3, морфогенетического белка кости 6 (ВМР-6), 8ΘΧ-9, коллагена 2 типа, СЭ117 (с-кй), лиганда хемокинов (СС мотив) 12 (ССЬ12), ССЬ7, интерлейкина-8 (ИЛ-8), фактора роста тромбоцитов А (ΡΌΟΡ А), ΡΌΟΡ В, ΡΌΟΡ С, ΡΌΟΡ Ό, фактора ингибирования миграции макрофагов (ΜΙΡ), ЮР 1, фактора роста гепатоцитов (НОР), ΡΌΟΡ-Κα, ΡΌΟΡ-Κβ, СХСК4, рецептора Хемокинов СС типа 1 (ССК1), рецептора 1ОР 1 (1ОР 1К), рецептора фактора роста гепатоцитов (НОРК), СХСЬ12 и ОТкарраВ. КПМЛ согласно настоящему изобретению, способные к хоумингу в костную ткань, предпочтительно сверхэкспрессируют один или более или все эти факторы. КПМЛ сверхэкспрессируют эти факторы, если они экспрессируют больше этих факторов, чем другие КПМЛ и/или МСК. Детектируемую экспрессию этих маркеров можно измерить, как обсуждалось выше.

КПМЛ согласно настоящему изобретению предпочтительно способны оказывать противовоспалительное действие в поврежденной ткани у пациента. Способность КПМЛ согласно настоящему изобретению оказывать противовоспалительное действие можно также измерить с использованием обычных методов анализа, известных в данной области техники. Подходящие способы включают, но не ограничиваются ими, твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬРЗА) секреции цитокинов, повышенные реакции смеси лейкоцитов и активации костимуляторных молекул и маркеров созревания, измеренные методом проточной цитометрии. Конкретные способы, которые можно использовать, раскрыты в Примере. Цитокины, содержание которых измеряют, обычно представляют собой интерлейкины, например, интерлейкин-8 (ИЛ-8), селектины, молекулы адгезии, например, молекула межклеточной адгезии-1 (1САМ-1), и белки-хемоатрактанты, например, моноцитарный хемотаксический фактор 1 (МСР-1) и фактор некроза опухоли альфа (ФНО альфа). Варианты анализа для этих цитокинов коммерчески доступны.

Противовоспалительные КПМЛ предпочтительно экспрессируют детектируемые уровни СЭ120а (рецептор 1 фактора некроза опухоли (ФНО) альфа), СЭ120Ь (рецептор 2 ФНО альфа), СЭ50 (молекула межклеточной адгезии 3, 1САМ-3), СЭ54 (1САМ-1), СЭ58 (функционально связанный антиген лимфоцитов 1, ЬРА-1), СЭ62Е (Е-селектин), СЭ62Е (Ь-селектин), ί'.Ό62Ρ (Р-селектин), СЭ106 (васкулярный белок клеточной адгезии 1, УСАМ-1), СЭ102 (1САМ-2), СЭ166 (молекула клеточной адгезии активированных лейкоцитов), СЭ104 (интегрин бета-4), СЭ123 (рецептор интерлейкина-3), СЭ124 (рецептор интерлейкина-4), СЭ126 (рецептор интерлейкина-6), СЭ127 (рецептор интерлейкина-7) и рецептора фактора роста фибробластов (РОРК). Противовоспалительные КПМЛ предпочтительно сверхэкспрессируют один или более, или все эти факторы. КПМЛ сверхэкспрессируют эти факторы, если они экспрессируют больше одного или более факторов, чем другие КПМЛ и/или МСК. Детектируемая экспрессия этих маркеров может быть измерена как обсуждалось выше.

КПМЛ согласно настоящему изобретению более предпочтительно являются способными к миграции в поврежденную ткань пациента и оказанию противовоспалительного действия в поврежденной ткани. Это позволяет эффективно восстанавливать повреждение и уменьшает количество клеток, которые необходимо вводить.

КПМЛ согласно настоящему изобретению экспрессируют множество других различных маркеров помимо тех, которые обсуждались выше. Некоторые из них вносят вклад в способность КПМЛ мигрировать к поврежденной ткани и оказывать в ней противовоспалительное действие.

Все КПМЛ согласно настоящему изобретению могут также экспрессировать детектируемые уровни одного или более из (ΐ) инсулиноподобного фактора роста 1 (1ОР 1), (и) рецептора 1ОР 1; (ш) рецептора Хемокинов СС типа 1 (ССК1), (ίν) фактора стромальных клеток 1 (δΌΡ-1), (ν) индуцируемого гипоксией фактор 1 альфа (Н1Р-1 альфа), (νί) АкИ и (νίί) фактора роста гепатоцитов (НОР) и/или колониестимулирующего фактора гранулоцитов (О-С8Р).

Рецепторы 1ОР 1 стимулируют способность к миграции навстречу градиенту 1ОР 1. Одним из механизмов, посредством которого 1ОР 1 стимулирует миграцию, является активация СХСК4 на поверхности клеток, что делает их более чувствительными к передаче сигналов от 8ЭР-1. Это обсуждалось выше.

ССК1 представляет собой рецептор к ССЬ7 (первоначально известный как МСР3); он усиливает хоуминг и способность к приживлению трансплантата МСК (соответственно, ожидается, что он будет оказывать такое же влияние на КПМЛ согласно настоящему изобретению) и способен увеличивать плотность капилляров в поврежденном миокарде по механизму паракринной передачи сигналов.

- 5 029577

Н1Р-1 альфа активирует пути передачи сигналов, которые увеличивают доставку кислорода и обеспечивают развитие адаптивных ответов, способствующих выживанию. Среди множества генов-мишеней Н1Р-1 альфа выделяют эритропоэтин (ЭПО), эндотелии и УБОР (с его рецептором Р1к-1). У КПМЛ, которые экспрессируют или сверхэкспрессируют ΗΙΡ-1 альфа, активируется экспрессия паракринных стимулов, например, некоторых васкулогенных факторов роста, которые могут стимулировать более терапевтически приемлемый подтип. Как более подробно описано ниже, КПМЛ согласно настоящему изобретению могут быть заранее подготовлены для развития в более терапевтически приемлемый подтип путем культивирования в гипоксических условиях (менее 20% кислорода), таких как, например, приблизительно 2 или приблизительно 0% кислорода.

АкП представляет собой внутриклеточную серин/треониновую протеинкиназу, которая играет ключевую роль в многочисленных клеточных процессах, таких как метаболизм глюкозы, пролиферация клеток, апоптоз, транскрипция и миграция клеток. Было показано, что сверхэкспрессия АкП предотвращает апоптоз МСК крысы и, очевидно, будет оказывать такое же влияние на КПМЛ согласно настоящему изобретению. Защита от апоптоза повысит терапевтический эффект КПМЛ.

Было показано, что сверхэкспрессия НОР в МСК предотвращает постишемическую сердечную недостаточность путем ингибирования апоптоза посредством кальцийнейрин-опосредованного пути и ангиогенеза. НОР и О-С8Р демонстрируют синергитическое действие в этом отношении. МСК, которые характеризуются высокой экспрессией НОР и его рецептора е-тс1. также обладают повышенной способностью к миграции в поврежденную ткань, которая достигается за счет гормональной, паракринной и аутокринной передачи сигналов. Это справедливо и для КПМЛ согласно настоящему изобретению, экспрессирующих НОР и/или О-С8Р.

КПМЛ могут сверхэкспрессировать один или более из факторов (ί)-(νίί), указанных выше. КПМЛ согласно настоящему изобретению сверхэкспрессируют один или более факторов (ί)-(νίί), если они экспрессируют больше, чем другие КПМЛ и/или чем мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Варианты количественного анализа клеточных маркеров описаны выше. Детектируемая экспрессия этих маркеров и уровень их экспрессии могут быть измерены как обсуждалось выше.

Любые из КПМЛ согласно настоящему изобретению могут экспрессировать детектируемые уровни одного или более из (ί) фактора роста эндотелия сосудов (УЕОР), (ίί) трансформирующего фактор роста бета (ТОР бета), (ίίί) инсулиноподобного фактора роста 1 (1ОР 1), (ίν) фактора роста фибробластов (РОР), (ν) фактора некроза опухоли альфа (ФНО альфа), (νί) интерферона гамма (ИФН гамма) и (νίί) интерлейкина-1 альфа (ИЛ-1 альфа). Было показано, что кондиционная среда от клеток, сверхэкспрессирующих УЕОР, ослабляет сердечную недостаточность в модели с использованием хомяков. Следовательно, КПМЛ согласно настоящему изобретению, которые экспрессируют или сверхэкспрессируют УЕОР, будут оказывать такое же действие на поврежденную ткань сердца.

КПМЛ могут сверхэкспрессировать один или более из факторов (ί)-(νίί). КПМЛ согласно настоящему изобретению сверхэкспрессируют один или более из факторов (ί)-(νίί), если они экспрессируют больше, чем другие КПМЛ и/или чем мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Варианты количественного анализа клеточных маркеров описаны выше. Детектируемую экспрессию этих маркеров и уровень их экспрессии можно измерить, как обсуждалось выше.

В обеих наборах определений (ί)-(νίί), приведенных выше, может иметь место экспрессия или сверхэкспрессися любой комбинаций из одного или более факторов (ί)-(νίί). Например, для каждого определения (ί)-(νίί), КПМЛ могут экспрессировать детектируемые уровни следующих факторов или сверхэкспрессировать следующие факторы: (ί); (ίί); (ίίί); (ίν); (ν); (νί); (νίί); (ί) и (ίί); (ί) и (ίίί); (ί) и (ίν); (ί) и (ν); (ί) и (νί); (ί) и (νίί); (ίί) и (ίίί); (ίί) и (ίν); (ίί) и (ν); (ίί) и (νί); (ίί) и (νίί); (ίίί) и (ίν); (ίίί) и (ν); (ίίί) и (νί); (ίίί) и (νίί); (ίν) и (ν); (ίν) и (νί); (ίν) и (νίί); (ν) и (νί); (ν) и (νίί); (νί) и (νίί); (ί), (ίί) и (ίίί); (ί), (ίί) и (ίν); (ί), (ίί) и (ν); (ί), (ίί) и (νί); (ί), (ίί) и (νίί); (ί,), (ίίί) и (ίν); (ί), (ίίί) и (ν); (ί), (ίίί) и (νί); (ί), (ίίί) и (νίί); (ί), (ίν) и (ν); (ί), (ίν) и (νί); (ί), (ίν) и (νίί); (ί), (ν) и (νί); (ί), (ν) и (νίί); (ί), (νί) и (νίί); (ίί), (ίίί) и (ίν); (ίί), (ίίί) и (ν); (ίί), (ίίί) и (νί); (ίί), (ίίί) и (νίί); (ίί), (ίν) и (ν); (ίί), (ίν) и (νί); (ίί), (ίν) и (νίί); (ίί), (ν) и (νί); (ίί), (ν) и (νίί); (ίί), (νί) и (νίί); (ίίί), (ίν) и (ν); (ίίί), (ίν) и (νί); (ίίί), (ίν) и (νίί); (ίίί), (ν) и (νί); (ίίί), (ν) и (νίί); (ίίί), (νί) и (νίί); (ίν), (ν) и (νί); (ίν), (ν) и (νίί); (ίν), (νί) и (νίί); (ν), (νί) и (νίί); (ί), (ίί), (ίίί) и (ίν); (ί), (ίί), (ίίί) и (ν); (ί), (ίί), (ίίί) и (νί); (ί), (ϋ), (ίίί) и (νίί); (ί), (ίί), (ίν) и (ν); (ί), (ίί), (ίν) и (νί); (ί), (ίί), (ίν) и (νίί); (ί), (ίί), (ν) и (νί); (ί), (ίί), (ν) и (νίί); (ί), (ίί), (νί) и (νίί); (ί), (ίίί), (ίν) и (ν); (ί), (ίίί), (ίν) и (νί); (ί), (ίίί), (ίν) и (νίί); (ί), (ίίί), (ν) и (νί); (ί), (ίίί), (ν) и (νίί); (ί), (ίίί), (νί) и (νίί); (ί), (ίν), (ν) и (νί); (ί), (ίν), (ν) и (νίί); (ί), (ίν), (νί) и (νίί); (ί), (ν), (νί) и (νίί); (ίί), (ίίί), (ίν) и (ν); (ίί), (ίίί), (ίν) и (νί); (ίί), (ίίί), (ίν) и (νίί); (ίί), (ίίί), (ν) и (νί); (ίί), (ίίί), (ν) и (νίί); (ίί), (ίίί), (νί) и (νίί); (ίί), (ίν), (ν) и (νί); (ίί), (ίν), (ν) и (νίί); (ίί), (ίν), (νί) и (νίί); (ίί), (ν), (νί) и (νίί); (ίίί), (ίν), (ν) и (νί);

(ίίί), (ίν), (ν) и (νίί); (ίίί), (ίν), (νί) и (νίί); (ίίί), (ν), (νί) и (νίί); (ίν), (ν), (νί) и (νίί); (ί), (ίί), (ίίί), (ίν) и (ν); (ί), (ϋ), (ίίί), (ίν) и (νί); (ί), (ίί), (ίίί), (ίν) и (νίί); (ί), (ίί), (ίίί), (ν) и (νί); (ί), (ίί), (ίίί), (ν) и (νίί); (ί), (ίί), (ίίί), (νί) и (νίί); (ί), (ίί), (ίν), (ν) и (νί); (ί), (ίί), (ίν), (ν) и (νίί); (ί), (ίί), (ίν), (νί) и (νίί); (ί), (ίί), (ν), (νί) и (νίί); (ί), (ίίί), (ίν), (ν) и (νί); (ί), (ίίί), (ίν), (ν) и (νίί); (ί), (ίίί), (ίν), (νί) и νίί); (ί), (ίίί), (ν), (νί) и (νίί); (ί), (ίν), (ν), (νί) и (νίί); (ίί), (ίίί), (ίν), (ν) и (νί); (ίί), ίίί), (ίν), (ν) и (νίί); (ίί), (ίίί), (ίν), (νί) и (νίί); (ίί), (ίίί), (ν), (νί) и (νίί); (ίί), (ίν), (ν), (νί) и (νίί); (ίίί), (ίν), (ν), (νί) и νίί); (ί), (ίί), (ίίί), (ίν), (ν) и (νί); (ί), (ίί), (ίίί), (ίν), (ν) и (νίί); (ί), (ίί), (ίίί), (ίν), (νί) и (νίί); (ί), (ίί), (ίίί), (ν), (νί) и (νίί); (ί), (ίί), (ίν), (ν), (νί) и (νίί); (ί), (ίίί), (ίν), (ν), (νί) и (νίί); (ίί), (ίίί), (ίν),

- 6 029577

(ν), (νί) и (νίί); ог (ί), (ίί), (ίίί), (ίν), (ν), (νί) и (νίί). Комбинации для каждого определения (ί)-(νίί) независимо выбирают из этого списка.

Дополнительно к любому из маркеров, которые обсуждались выше, КПМЛ согласно настоящему изобретению предпочтительно также экспрессируют детектируемые уровни рецепторов или сверхэкспрессируют рецепторы ЫР и/или фактора роста тромбоцитов (ΡΌΟΡ). Рецепторы ΡΌΟΡ предпочтительно представляют собой рецепторы ΡΌΟΡ А и/или рецепторы ΡδΌΟΡ В. МСК, которые характеризуются высоким уровнем экспрессии этих рецепторов, могут эффективно мигрировать в области, в которых были активированы тромбоциты, такие как раны и тромботические сосуды. Это справедливо и для КПМЛ, которые экспрессируют или сверхэкспрессируют эти рецепторы.

КПМЛ согласно настоящему изобретению предпочтительно являются аутологичными. Другими словами, клетки предпочтительно происходят из организма пациента, которому их будут вводить. В альтернативном варианте КПМЛ предпочтительно являются аллогенными. Другими словами, клетки предпочтительно происходят из организма пациента, который является иммунологически совместимым с пациентом, которому они будут введены.

КПМЛ согласно настоящему изобретению может быть изолирована, по существу изолирована, очищена или по существу очищена. КПМЛ является изолированной (выделенной) или очищенной, если она полностью свободна от любых других компонентов, таких как культуральная среда, другие клетки согласно настоящему изобретению или другие типы клеток. КПМЛ является по существу выделенной, если она смешана с носителями или растворителями, такими как культуральная среда, которые не будут препятствовать ее предполагаемому применению. В альтернативном варианте КПМЛ согласно настоящему изобретению может присутствовать в ростовом матриксе или быть иммобилизована на поверхности, как обсуждается ниже.

КПМЛ согласно настоящему изобретению могут быть изолированы с использованием разнообразных методик, включая методики на основе антител. Клетки могут быть изолированы с использованием методик положительной и отрицательной селекции на основе связывания моноклональных антител с теми маркерами поверхности, которые представлены на КПМЛ (см. выше). Следовательно, КПМЛ могут быть изолированы с использованием любой методики на основе антител, включая метод сортировки флуоресцентно-активированных клеток (РАС8) и разделение клеток использованием магнитных бусин.

Как более подробно обсуждается ниже, КПМЛ могут быть обработаны ех νίνο. Так, клетки могут быть нагружены или трансфицированы терапевтическим или диагностическим агентом и затем могут быть использованы в терапевтических целях в способах согласно настоящему изобретению.

Популяция согласно настоящему изобретению

В настоящем изобретении также предложена популяция двух или более КПМЛ согласно настоящему изобретению. В популяции может присутствовать любое количество клеток. Популяция согласно настоящему изобретению в предпочтительном варианте включает по меньшей мере приблизительно 5 х 10⁵КПМЛ согласно настоящему изобретению. Популяция в более предпочтительном варианте включает по меньшей мере приблизительно 1 х 10⁶, по меньшей мере приблизительно 2 х 10⁶, по меньшей мере приблизительно 5 х 10⁶, по меньшей мере приблизительно 1 х 10⁷, по меньшей мере приблизительно 2 х 10⁷, по меньшей мере приблизительно 5 х 10⁷, по меньшей мере приблизительно 1 х 10⁸ или по меньшей мере приблизительно 2 х 10⁸ КПМЛ согласно настоящему изобретению. В некоторых случаях популяция может включать по меньшей мере приблизительно 1,0 х 10⁷, по меньшей мере приблизительно 1,0 х 10⁸, по меньшей мере приблизительно 1,0 х 10⁹, по меньшей мере приблизительно 1,0 х 10¹⁰, по меньшей мере приблизительно 1,0 х 10¹¹ или приблизительно 1,0 х 10¹² КПМЛ согласно настоящему изобретению или даже более.

Популяции согласно настоящему изобретению являются полезными для терапии, как обсуждается ниже. Возможность получать популяции, включающие большие количества КПМЛ согласно настоящему изобретению, является одним из ключевых преимуществ настоящего изобретения. Настоящее изобретение позволяет осуществлять лечение пациентов с использованием популяции клеток, из которой большинство, если не все, эффективно мигрируют в соответствующую ткань и там оказывают противовоспалительное действие. Это позволяет применять низкие дозы клеток и избегать нецелевых побочных эффектов и побочных эффектов, связанных с объемом.

Популяция согласно настоящему изобретению может включать другие клетки в дополнение к КПМЛ согласно настоящему изобретению. Однако по меньшей мере 70% клеток в популяции предпочтительно представляют собой КПМЛ согласно настоящему изобретению. Более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% клеток в популяции представляют собой КПМЛ согласно настоящему изобретению.

Популяция согласно настоящему изобретению предпочтительно является гомологичной. Другими словами, все КПМЛ в популяции предпочтительно являются генотипически и фенотипически идентичными. Популяция предпочтительно является аутологичой или аллогенной, как определено выше.

- 7 029577

Однако популяция может также быть семиаллогенной. Семиаллогенные популяции обычно продуцируются мононуклеарами от двух или более пациентов, которые являются иммунологически совместимыми с пациентом, которому будет введена популяция. Другими словами, все клетки в популяции предпочтительно являются генетически идентичными или по существу генетически идентичными настолько, что популяция является иммунологически совместимой с пациентом, которому она будет введена. Поскольку КПМЛ согласно настоящему изобретению могут происходить из организма пациента, они могут быть аутологичными для пациента, которого будут лечить (т.е. генетически идентичными пациенту или по существу генетически идентичными настолько, что они являются совместимыми для введения пациенту).

Популяция согласно настоящему изобретению может быть изолирована, по существу изолирована, очищена или по существу очищена. Популяция является изолированной или очищенной, если она полностью свободна от любых других компонентов, таких как культуральная среда и другие клетки. Популяция является по существу изолированной, если она смешана с носителями или растворителями, такими как культуральная среда, которые не препятствуют ее предполагаемому применению. Другие носители и растворители более детально обсуждаются ниже. По существу изолированная или по существу очищенная популяция не включает клеток, отличных от КПМЛ согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации популяция согласно настоящему изобретению может находиться в ростовом матриксе или быть иммобилизованной на поверхности, как обсуждается ниже.

Популяцию обычно культивируют ίη νίίτο. Методики культивирования клеток хорошо известны специалисту в данной области. Клетки можно культивировать в стандартных условиях при 37°С, 5% СО₂в бессывороточной среде. В предпочтительном варианте клетки культивируют в условиях с низким содержанием кислорода, как более подробно обсуждается ниже. Клетки можно культивировать в любом подходящем флаконе или сосуде, включая лунки плоского планшета, такого как стандартный 6луночный планшет. Такие планшеты доступны для приобретения в Р18йет каепййс, поставщиков У\УК.. Ыипс, ЕНагЧеФ или Ра1соп. Лунки обычно имеют емкость от приблизительно 1 до приблизительно 4 мл.

Флакон, сосуд или лунки, в которых содержат или культивируют популяцию, могут быть модифицированы для упрощения манипуляций с КПМЛ. Например, матрас, сосуд или лунки могут быть модифицированы для упрощения культивирования клеток, например, путем включения ростового матрикса. Флакон, сосуд или лунки могут быть модифицированы для обеспечения присоединения КПМЛ или для обеспечения иммобилизации КПМЛ на поверхности. Одна или более поверхностей могут быть покрыты белками внеклеточного матрикса, такими как ламинин или коллаген, или любыми другими иммобилизующими молекулами, которые связываются с клетками и иммобилизуют или фиксируют их на поверхности.

Популяция может быть модифицирована ех νίνο с использованием любой из методик, описанных в настоящей заявке. Например, популяцию можно трансфицировать или нагрузить терапевтическими или диагностическими агентами. Популяцию можно затем использовать в способах лечения, которые более подробно обсуждаются ниже.

Способ получения КПМЛ согласно настоящему изобретению

В настоящем изобретении также предложен способ для получения популяции согласно настоящему изобретению, т.е. популяции двух или более КПМЛ согласно настоящему изобретению. Способ включает культивирование мононуклеаров (МК) в условиях, которые стимулируют МК к дифференцировки в КПМЛ. Способ также включает сбор и культивирование КПМЛ, которые:

(a) экспрессируют детектируемые уровни СЭ29, СЭ44, СЭ73, СО90, СЭ105 и СЭ271 и не экспрессируют детектируемые уровни СЭ14, СЭ34 и СЭ45:

(b) экспрессируют детектируемые уровни СЭ29, СЭ44, СЭ73, СЭ90, СЭ105, СЭ271 и СХСК1 и не экспрессируют детектируемые уровни СЭ14, СЭ34 и СЭ45:

(c) экспрессируют детектируемые уровни СЭ29, СЭ44, СЭ73, СЭ90, СЭ105, СЭ271 и СХСК2 и не экспрессируют детектируемые уровни СЭ14, СЭ34 и СЭ45:

(6) экспрессируют детектируемые уровни СЭ29, СЭ44, СЭ73, СЭ90, СЭ105, СЭ271, СХСК1 и СХСК2 и не экспрессируют детектируемые уровни СЭ14, СЭ34 и СЭ45:

(е) экспрессируют детектируемые уровни СЭ29, СЭ44, СЭ73, СЭ90, СЭ105, СЭ271, СХСК1 и СХСК4 и не экспрессируют детектируемые уровни СЭ14, СЭ34 и СЭ45 (эти клетки являются КПМЛ, способными к хоумингу в ткань сердца и хоумингу в костную ткань):

(ί) экспрессируют детектируемые уровни СЭ29, СЭ44, СЭ73, СЭ90, СЭ105, СЭ271, СХСК2 и СХСК4 и не экспрессируют детектируемые уровни СЭ14, СЭ34 и СЭ45 (эти клетки являются КПМЛ, способными к хоумингу в ткань сердца и хоумингу в костную ткань):

(д) экспрессируют детектируемые уровни СЭ29, СЭ44, СЭ73, СЭ90, СЭ105, СЭ271, СХСК1, СХСК2 и СХСК4 и не экспрессируют детектируемые уровни СЭ14, СЭ34 и СЭ45 (эти клетки являются КПМЛ, способными к хоумингу в ткань сердца и хоумингу в костную ткань):

(й) экспрессируют детектируемые уровни СЭ29, СЭ44, СЭ73, СЭ90, СЭ105, СЭ271, СХСК4, фактора роста эндотелия сосудов (УБОР), трансформирующего фактора роста бета 1 (ТФР-бета 1), инсулиноподобного фактора роста 1 (1ОР 1), фактора роста фибробластов (РОР), фактора некроза опухоли аль- 8 029577

фа (ФНО альфа), интерферона гамма (ИФН гамма), интерлейкина-1 альфа (ИЛ-1 альфа), СХСЬ12, СИ109, СИ119, ядерного фактора каппа энхансера легких цепей активированных В-клеток (ИРкарра В), СИ140а, СИ140Ь, Си221, СИ222, СИ304, СИ309 и СИ325 и не экспрессируют детектируемые уровни СИ14, СИ34 и СИ45 (эти клетки являются КПМЛ, способными к хоумингу в ткань сетчатки); или

(ί) экспрессируют детектируемые уровни СИ29, СИ44, СИ73, СИ90, СИ105, СИ271, ТФР-бета 3, морфогенетического белка кости-6 (МБК-6), 8ОХ-9, коллагена 2 типа, СИ117 (с-к11), лиганда хемокинов (СС мотив) 12 (ССЬ12), ССЬ7, интерлейкина-8 (ИЛ-8), фактора роста тромбоцитов А (РИОР А), РИСР В, РИСР С, РИСР И, фактора ингибирования миграции макрофагов (ΜΙΡ), ЮР 1, фактора роста гепатоцитов (НОР), РИОР-Ка, РИОР-Κβ, СХСК4, рецептора Хемокинов СС типа 1 (ССК1), 1СР 1 рецептора (1СР 1К), рецептора фактора роста гепатоцитов (НОРК), СХСЬ12 и ИРкарраВ и не экспрессируют детектируемые уровни СИ14, СИ34 и СИ45 (эти клетки являются КПМЛ, способными к хоумингу в костную ткань).

Собранные клетки могут сверхэкспрессировать любой из факторов, как описано выше в отношении клеток согласно настоящему изобретению. Дополнительно к любому из пунктов с (а) по (ί) выше, способ предпочтительно включает сбор и культивирование КПМЛ, которые:

(ί) экспрессируют детектируемые уровни СИ120а (рецептор 1 фактора некроза опухоли (ΤΝΡ) альфа), СИ120Ь (рецептор 2 ФНО альфа), СИ50 (молекула межклеточной адгезии-3, 1САМ-3), СИ54 (1САМ1) , СИ58 (ассоциированный с функцией антиген лимфоцитов 1, ЬРА-1), СИ62Е (Е-селектин), СИ62Ь (Ьселектин), СИ62Р (Р-селектин), СИ106 (васкулярный белок клеточной адгезии, УСАМ-1), СИ102 (1САМ2) , СИ166 (молекула клеточной адгезии активированных лейкоцитов), СИ104 (интегрин бета-4), СИ123 (рецептор интерлейкина-3), СИ124 (рецептор интерлейкина-4), СИ126 (рецептор интерлейкина-6), СИ127 (рецептор интерлейкина-7) и рецептор фактора роста фибробластов (РОРК);

(k) экспрессируют детектируемые уровни одного или более из (ί) инсулиноподобного фактора роста 1 (1СР 1), (ίί) рецептора 1СР 1; (ίίί) рецептора Хемокинов СС типа 1 (ССК1), (ίν) стромального клеточного фактора 1 (8ИР-1), (ν) фактора, индуцируемого гипоксией, 1 альфа (Н1Р-1 альфа), (νί) АкИ и (νίί) фактора роста гепатоцитов (НОР) и/или колониестимулирующего фактора гранулоцитов (О-С8Р);

(l) сверхэкспрессируют один или более факторов (ί)-(νίί) в (к);

(т) экспрессируют детектируемые уровни одного или более из (ί) фактора роста эндотелия сосудов (УЕОР), (ίί) трансформирующего фактора роста бета (ТОР бета), (ίίί) инсулиноподобного фактора роста 1 (1ОР 1), (ίν) фактора роста фибробластов (РОР), (ν) фактора некроза опухоли альфа (ФНО альфа), (νί) интерферона гамма (ИФН гамма ) и (νίί) интерлейкина-1 альфа (ИЛ-1 альфа)

(п) сверхэкспрессируют один или более факторов (ί)-(νίί) в (т).

Мононуклеары (МК) и способы их выделения (изолирования) известны в данной области техники. МК могут представлять собой первичные МК, выделенные из костного мозга. МК предпочтительно представляют собой МК периферической крови (МНПК), такие как лимфоциты, моноциты и/или макрофаги. МНПК могут быть выделены из крови с использованием гидрофильных полисахаридов, таких как Фиколл®. Например, МНПК могут быть выделены из крови с использованием фиколл-пака® (коммерчески доступная плотная среда), как раскрыто в Примере.

До культивирования МК можно подвергнуть воздействию обогащающего коктейля для мезенхимальных стволовых клеток. Коктейль предпочтительно включает антитела, которые распознают СИ3, СИ14, СИ19, СИ38, СИ66Ь (которые присутствуют на нежелательных клетках) и компоненты красных кровяных клеток. Такой коктейль перекрестно сшивает нежелательные клетки с эритроцитами с образованием иммунорозеток, которые могут быть удалены из целевых МК. Предпочтительный коктейль представляет собой КокейеЗер®.

Условия, подходящие для индукции дифференцировки МК в мезенхимальные клетки (ткань, происходящую главным образом из мезодермы), известны в данной области техники. Например, подходящие условия раскрыты в СареШ, С, е1 а1. (Нитап р1а1е1е11уза1е а11о\\ъ ехрапкюп и сНшса1 дгайе ргойисйоп оГ те8епсйута1 8йота1 се1к Ггот §та11 8атр1е8 оГ Ьопе тагготе а8р1га1е8 ог тагготе ГШег теакйоШк Вопе Магготе ТгашркиНабоп. 2007, 40: р. 785-791). Эти условия можно также использовать для индукции МК к дифференцировки в КПМЛ в соответствии с настоящим изобретением.

Способ предпочтительно включает культивирование МК с лизатом плазмы для индукции дифференцировки МК в КПМЛ. Лизат тромбоцитов представляет собой комбинацию природных ростовых факторов, содержащихся в тромбоцитах, которые высвобождаются в ходе лизиса тромбоцитов. Лизис можно осуществить химическим способом (т.е. с использованием СаС1₂), осмотическим способом (с использованием дистиллированной Н₂О) или посредством процедур замораживания/оттаивания. Лизат тромбоцитов может быть получен из цельной крови, как описано в Патенте США Ио. 5,198,357. Лизат тромбоцитов предпочтительно готовят, как описано в Примере. Лизат плазмы предпочтительно представляет собой лизат плазмы человека.

В предпочтительном варианте реализации этап (а) способа согласно настоящему изобретению включает культивирование МК в среде, включающей лизат тромбоцитов, в течение времени, достаточного для индукции дифференцировки МК в клетки-предшественники мезодермальной линии. Достаточ- 9 029577

ное время обычно составляет от приблизительно 15 до приблизительно 25 дней, предпочтительно приблизительно 22 дня. Среда предпочтительно включает приблизительно 20% или менее лизата тромбоцитов по объему, например, приблизительно 15% или менее по объему или приблизительно 10% или менее по объему. Среда предпочтительно включает от приблизительно 5 до приблизительно 20% лизата тромбоцитов по объему, например от приблизительно 10 до приблизительно 15 об.%. Среда предпочтительно включает приблизительно 10% лизата тромбоцитов по объему.

В другом предпочтительном варианте реализации этап (а) способа согласно настоящему изобретению включает обработку МК обогащающим мезенхимальным коктейлем и последующее культивирование МК в среде, содержащей лизат тромбоцитов, в течение времени, достаточного для индукции дифференцировки МК в клетки-предшественники мезодермальной линии. Достаточное время обычно составляет от приблизительно 15 до приблизительно 25 дней, предпочтительно приблизительно 22 дня.

На этапе (а) среда представляет собой предпочтительно минимальную поддерживающую среду (МЕМ). МЕМ доступна для приобретения в различных источниках, включая 8щта-А1бпс1г Среда предпочтительно также включает один или более из гепарина, Ь-глутамина и пенициллина/стрептавидина (П/С). Ь-глутамин может быть заменен на Глутамакс® (который является коммерчески доступным от ЫГс Тсс1то1ощс5).

Как обсуждалось выше, некоторые из КПМЛ согласно настоящему изобретению экспрессируют детектируемые уровни СХСК4. Экспрессия СХСК4 является цитокин-зависимой и увеличивается, когда клетки подвергают воздействию фактора стволовых клеток (8СР), интерлейкина-6 (ИЛ-6), Ρίΐ-3 лиганда, фактора роста гепатоцитов (НОР) и ИЛ-3. Среда может включать один или более из (ί) 8СР (фактор стволовых клеток), (ίί) ИЛ-6, (ίίί) лиганда Р11-3. (ίν) фактора роста гепатоцитов и (ν) ИЛ-3, например, (ί); (ίί); (ίίί); (ίν); (ν); (ί) и (ίί); (ί) и (ίίί); (ί) и (ίν); (ί) и (ν); (ίί) и (ίίί); (ίί) и (ίν); (ίί) и (ν); (ίίί) и (ίν); (ίίί) и (ν); (ίν) и (ν); (ί), (ίί) и (ίη); (ί), (ίί) и (ίν); (ί), (ίί) и (ν); (ί), (ίίί) и (ίν); (ί), (ίίί) и (ν); (ί), (ίν) и (ν); (ίί), (ίίί) и (ίν); (ίί), (ίίί) и (ν); (ίί), (ίν) и (ν); (ίίί), (ίν) и (ν); ог (ί), (ίί), (ίίί), (ίν) и (ν). Любой из факторов с (ί) по (ν) может присутствовать в концентрации от приблизительно 10 до приблизительно 150 нг/мл.

Этап (а) предпочтительно включает культивирование МК в условиях, которые допускают адгезию КПМЛ. Подходящие условия более подробно обсуждаются выше.

На этапе (а) МК предпочтительно культивируют в условиях с низким содержанием кислорода. МК предпочтительно культивируют при менее чем приблизительно 20% кислорода (О₂), например, при менее чем приблизительно 19%, менее чем приблизительно 18%, менее чем приблизительно 17%, менее чем приблизительно 16%, менее чем приблизительно 15%, менее чем приблизительно 14%, менее чем приблизительно 13%, менее чем приблизительно 12%, менее чем приблизительно 11%, менее чем приблизительно 10%, менее чем приблизительно 9%, менее чем приблизительно 8%, менее чем приблизительно 7%, менее чем приблизительно 6%, менее чем приблизительно 5%, менее чем приблизительно 4%, менее чем приблизительно 3%, менее чем приблизительно 2% или менее чем приблизительно 1% кислорода (О₂). МК предпочтительно культивируют при от приблизительно 0% до приблизительно 19% О2, например, от приблизительно 1 до приблизительно 15% О2, от приблизительно 2 до приблизительно 10% О2 или от приблизительно 5% до приблизительно 8% О2. МК наиболее предпочтительно культивируют при приблизительно 0% О₂. Графики для % кислорода (или % О₂), приведенные выше, относятся к % по объему кислорода в газе, который подается к клеткам во время культивирования, например, с помощью инкубатора для клеток. Возможно, что некоторое количество кислорода может просочиться в инкубатор или проникнуть, когда дверь инкубатора будет открыта.

На этапе (а) МК наиболее предпочтительно культивируют в присутствии лизата тромбоцитов и в условиях с низким содержанием кислорода. Эта комбинация имитирует природные условия в поврежденной ткани благодаря этому позволяет получить более жизнеспособные и терапевтически действенные клетки. Обычно культивирование клеток проводят при 20 или 21% кислорода (приблизительное содержание в атмосферном воздухе), однако в организме человека не существует места, которое бы имело такой уровень кислорода. Эпителиальные клетки в легких будут "видеть" этот уровень кислорода, но когда кислород растворяется и покидает легкие, его концентрация падает до приблизительно 17%. В большинстве тканей этот уровень еще ниже (до приблизительно 1-2%), а в бессосудистых тканях, таких как хрящ в суставах, составляет лишь 0,1%.

На этапе (Ь) способ также включает отбор и культивирование КПМЛ, которые обладают необходимым паттерном экспрессии маркеров, как обсуждалось выше. КПМЛ, которые обладают паттерном экспрессии необходимых маркеров, могут быть отобраны с использованием любой методики на основе антител, включая метод сортировки флуоресцентно-активированных клеток (РАС8) и разделение клеток с магнитными бусинами. РАС8 является более предпочтительным.

Любой из способов культивирования КПМЛ, раскрытых по отношению этапа (а), равно применим к этапу (Ь). В частности, клетки культивируют на этапе (Ь) в присутствии лизата тромбоцитов и в условиях с низким содержанием кислорода, как обсуждалось выше в отношении этапа (а).

Как видно из приведенного выше обсуждения, способ согласно настоящему изобретению осуществляют в клинически допустимых условиях, т.е. в отсутствие следовых количеств эндотоксинов и других загрязняющих факторов окружающей среды, таких как липополисахариды, липопептиды и пептидогли- 10 029577

каны и т.п. Это делает КПМЛ согласно настоящему изобретению особенно подходящими для введения пациентам.

МК предпочтительно получают из организма пациента или аллогенного донора. Согласно настоящему изобретению предложен способ получения популяции согласно настоящему изобретению, которая является подходящей для введения пациенту, причем способ включает культивирование МК, полученных от пациента, в условиях, которые индуцируют дифференцировки МК в клетки-предшественники мезодермальной линии, и (Ь) отбор и культивирование тех клеток-предшественников, которые обладаютопределенным выше паттерном экспрессии, в результате чего получают популяцию согласно настоящему изобретению, которая пригодна для введения пациенту. Популяция является аутологичной для пациента и вследствие этого не будет отторгаться после трансплантации. В настоящем изобретении также предложена популяция согласно настоящему изобретению, которая пригодна для введения пациенту и которую получают таким образом.

В альтернативном варианте настоящего изобретения предложен способ получения популяции согласно настоящему изобретению, которая пригодна для введения пациенту, причем способ включает культивирование МК, полученных от другого пациента, который является иммунологически совместимым с пациентом, которому будут введены клетки, в условиях, которые индуцируют дифференцировку МК в клетки-предшественники мезодермальной линии, и (Ь) отбор и культивирование тех клетокпредшественников, которые обладают определенным выше паттерном экспрессии, с получением популяции согласно настоящему изобретению, которая пригодна для введения пациенту. Популяция является аллогенной для пациента, и что снижает риск отторжения после трансплантации. В настоящем изобретении также предложена популяция согласно настоящему изобретению, которая является подходящей для введения пациенту и которую получают таким образом.

Лекарственные средства, способы и терапевтическое применение

КПМЛ согласно настоящему изобретению можно использовать в способах терапии организма человека или животного. Таким образом, в настоящем изобретении предложены КПМЛ согласно настоящему изобретению или популяция согласно настоящему изобретению для применения в способе лечения организма человека или животного путем терапии. В частности, настоящее изобретение относится к применению КПМЛ согласно настоящему изобретению для восстановления поврежденной ткани у пациента. Настоящее изобретение также относится к КПМЛ согласно настоящему изобретению для лечения повреждения или заболевания сердца, возрастной макулярной дегенерации или повреждения кости или заболевания кости у пациента.

Согласно настоящему изобретению предложен способ восстановления поврежденной ткани у пациента, включающий введение пациенту популяции согласно настоящему изобретению, причем популяция включает терапевтически эффективное количество клеток, и посредством этого лечение поврежденной ткани у пациента. В настоящем изобретении также предложена популяция согласно настоящему изобретению для применения для восстановления поврежденной ткани у пациента. Согласно настоящему изобретению также предложено применение популяции согласно настоящему изобретению в получении лекарственного средства для восстановления поврежденной ткани у пациента.

Ткань предпочтительно происходит из мезодермы (имеет мезодермальное происходнение). В более предпочтительном случае ткань представляет собой ткань сердца, ткань сетчатки или костную ткань.

Повреждение ткани может быть вызвано травмой или заболеванием. Повреждение или заболевание представляет собой предпочтительно повреждение или заболевание сердца, возрастную макулярную дегенерацию (ВМД) или повреждение или заболевание кости у пациента. Соответственно, настоящее изобретение предусматривает способ лечения повреждения или заболевания сердца, возрастной макулярной дегенерации или повреждения или заболевания кости у пациента, включающий введение пациенту популяции согласно настоящему изобретению, причем популяция включает терапевтически эффективное количество клеток, и что обеспечивает лечение повреждения или заболевания сердца, возрастной макулярной дегенерации или повреждения или заболевания кости у пациента. В настоящем изобретении также предложена популяция согласно настоящему изобретению для применения в лечении повреждения или заболевания сердца, возрастной макулярной дегенерации или повреждения или заболевания кости у пациента. В настоящем изобретении также предложено применение популяции согласно настоящему изобретению в получении лекарственного средства для лечения повреждения или заболевания сердца, возрастной макулярной дегенерации или повреждения или заболевания кости у пациента.

Повреждение или заболевание сердца предпочтительно выбрано из инфаркта миокарда (ИМ), гипертрофии левого желудочка, гипертрофии правого желудочка, эмболии, сердечной недостаточности, врожденной сердечной недостаточности, заболевания сердечного клапана, аритмии и миокардита.

При ИМ увеличивается уровень УБОР и ЭПО, которые высвобождаются миокардом. Более того, ИМ связан с воспалительными реакциями, поэтому инфарктная ткань также высвобождает фактор ингибирования миграции макрофагов (М1Р), интерлейкин (ИЛ-6) и КС/Ого-альфа. ССЬ7 (первоначально известный как МСР3), СХС.Т-1. СХСБ2 являются в значительной степени активированными в сердце, в котором развивается инфаркт миокарда (ИМ), и могут быть вовлечены в процессы регуляции приживления и хоуминга МСК к инфарктному миокарду.

- 11 029577

На мышиной модели инфаркта миокарда было показано, что ИЛ-8 активирует экспрессию генов прежде всего в первые 2 дня после ИМ. Примечательно, что увеличенная экспрессия ИЛ-8 была локализирована преимущественно в инфарктной области и краевой зоне, и только в значительно меньшей степени в неповрежденном миокарде. Посредством активации СХСК2 ΜΙΡ демонстрирует хемокинподобные функции и выступает основным регулятором рекрутинга клеток воспаления и атерогенеза.

ВМД может представлять собой сухую ВМД или влажную ВМД. Сухая ВМД является следствием атрофии пигментированного эпителия сетчатки под сетчаткой, которая приводит к потери зрения из-за исчезновения фоторецепторов (палочек и колбочек) в центральной части глаза. Влажная ВМД вызывает потерю зрения из-за анормального роста кровеносных сосудов (неоваскуляризация хороидеи) в хориокапиллярах, через мембрану Бруха, в конечном счете приводя к недостатку крови и белка под макулой. Влажная ВМД связана с увеличением уровня фактора пигментного эпителия (ΡΕΌΡ) в макуле. КПМЛ, используемые в лечении влажной ВМД, предпочтительно экспрессируют детектируемые уровни ΡΕΌΡ или сверхэкспрессируют ΡΕΌΡ.

Повреждение или заболевание кости предпочтительно выбрано из перелома, перелома СалтераХарриса, перелома кости по типу «зеленой ветки», костной шпоры, краниосиностоза, синдрома Коффина-Лоури, прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазии, фиброзной дисплазии, болезни Фонга (или ногте-надколенногосиндрома), гипофосфатазии, синдрома Клиппеля-Фейля, метаболического заболевания костной ткани, синдрома «ногтей-наколенника», остеоартрита, деформирующего остита (или болезни костей Паджета), паратиреоидной остеодистрофии (или фиброзного остеита или болезни Фон Реклингхаузена костей), остеита лобковой кости, склерозирующего остеомиелита (или оЧейй сопбеп8аи5), склерозирующего остеомиелита подвздошной области, рассекающего остеохондрита, незавершенного остеогенеза, остеомаляции, остеомиелита, остеопении, остеопетроза, остеопороза, остеонекроза, поротического гиперостоза, первичного гиперпаратиреоза, нефрогенной остеодистрофии, рака кости, поражения кости, связанного с метатстатирующим раком, болезни Горхема-Стаута, первичного гиперпаратиреоза, парадонтоза и асептической нестабильности протеза сустава. Рак кости может представлять собой саркому Юинга, множественную миелому, остеосаркому (гигантскую опухоль кости), остеохондрому или остеокластому. Метастазирующий рак, который приводит к поражению кости, может представлять собой рак молочной железы, рак предстательной железы, рак почек, рак легкого и/или лейкимию зрелых Т -клеток.

Если поврежденная ткань представляет собой ткань сердца или костную ткань, КПМЛ в популяции предпочтительно экспрессируют детектируемые уровни СО29, СЭ44. СО73, СО90, СО105, СО271, СХСК1, СХСК2 и СХСК4 и не экспрессируют детектируемые уровни СЭ14, СЭ34 и СО45. Если поврежденная ткань представляет собой костную ткань, КПМЛ в популяции более предпочтительно экспрессируют детектируемые уровни СО29, СЭ44, СЭ73, СЭ90, СЭ105, ΕΌ271, ТФР-бета 3, морфогенетического белка кости 6 (ВМР-6), 8ОХ-9, коллагена 2 типа, СО117 (с-кй), лиганда хемокинов (СС мотив) 12 (ССЬ12), ССЬ7, интерлейкина-8 (ИЛ-8), фактора роста тромбоцитов А (ΡΌΟΡ А), ΡΌΟΡ В, ΡΌΟΡ С, ΡΌΟΡ Ό, фактора ингибирования миграции макрофагов (ΜΙΡ), ΙΟΡ 1, фактора роста гепатоцитов (ΗΟΡ), ΡΌΟΡ-Κα, ΡΌΟΡ-Κβ, СХСК4, рецептора хемокинов СС типа 1 (ССК1), рецептора ΙΟΡ 1 (ΙΟΡ 1Ρ), рецептора фактора роста гепатоцитов (ΗΟΡΚ), СХСЬ12 и ОТкарраВ и не экспрессируют детектируемые уровни СО14, СО34 и СО45.

Если поврежденная ткань представляет собой ткань сетчатки, КПМЛ в популяции предпочтительно экспрессируют детектируемые уровни ΕΌ29, СО44, СЭ73, СО90, СЭ105, ΕΌ271, СХСК4, фактора роста эндотелия сосудов (УЕОР), трансформирующего фактора роста бета 1 (ΤΟΡ бета 1), инсулиноподобного фактора роста 1 (ΙΟΡ 1), фактора роста фибробластов (ΡΟΡ), фактора некроза опухоли альфа (ФНО альфа), интерферона гамма (ИФН гамма), интерлейкина-1 альфа (ИЛ-1 альфа), СХСЬ12, СО109, СЭ119, ядерного фактора каппа энхансера легких цепей активированных В-клеток (ОТкарра В), СО140а, СО140Ь, СО221, СО222, СО304, СО309 и СО325 и не экспрессируют детектируемые уровни СО14, СО34 и СО45.

Во всех случаях КПМЛ согласно настоящему изобретению предпочтительно происходят из организма пациента или аллогенного донора. Получение КПМЛ согласно настоящему изобретению от пациента должно гарантировать, что КПМЛ сами по себе не будут отторгаться иммунной системой пациента. Любые различия между донором и реципиентом в конце концов приведут к выведению КПМЛ, но не ранее чем они восстановят по меньшей мере часть поврежденной ткани.

Настоящее изобретение относится к введению пациенту терапевтически эффективного количества КПМЛ согласно настоящему изобретению. Терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое улучшает один или более симптомов повреждения, заболевания или ранения. Терапевтически эффективное количество предпочтительно представляет собой количество, которое восстанавливает поврежденную ткань или излечивает заболевание или повреждение. Подходящие количества обсуждаются более подробно ниже.

КПМЛ согласно настоящему изобретению могут быть введены любому подходящему пациенту. Пациент обычно представляет собой пациента-человека. Пациент может представлять собой ребенка, подростка или взрослого человека. О пациенте может быть известно, что у него повреждена ткань, или

- 12 029577

можно предполагать, что у него повреждена ткань. Пациент может быть восприимчивым к соответствующему заболеванию или повреждению или находиться под угрозой его развития. Например, пациент может быть генетически предрасположенным к сердечной недостаточности.

Настоящее изобретение можно применять в комбинации с другими средствами или веществами для восстановления поврежденной ткани или облегчения боли. В некоторых случаях КПМЛ согласно настоящему изобретению можно вводить одновременно, последовательно или отдельно от других веществ, которые направлены на восстановление поврежденной ткани или облегчение боли. КПМЛ можно применять в комбинации с существующими вариантами лечения поврежденной ткани и можно, например, легко объединять с такими средствами лечения. Таким образом, настоящее изобретение можно применять для увеличения эффективности существующих вариантов лечения поврежденной ткани.

Предпочтительный вариант настоящего изобретения относите к применению КПМЛ, нагруженных или трансфицированных терапевтическими и/или диагностическими агентами. Терапевтический агент может способствовать восстановлению поврежденной ткани. Диагностический агент, такой как флуоресцентная молекула, может способствовать идентификации локализации КПМЛ в организме пациента. КПМЛ могут быть нагружены или трансфицированы с использованием любого метода, известного в данной области техники. Нагрузку КПМЛ можно осуществить ίη νίίτο или ех νίνο. В каждом случае КПМЛ может легко контактировать с агентом в культуре. В качестве альтернативы КПМЛ можно нагрузить агентом с применением носителя для доставки, такого как липосомы. Такие носители известны в данной области техники.

Трансфекцию КПМЛ можно осуществить ίη νίίτο или ех νίνο. В качестве альтернативы можно осуществить стабильную трансфекцию на стадии МК, что позволит отличить от них КПМЛ, которые экспрессируют трансген. КПМЛ трансфицируют нуклеиновой кислотой, кодирующей агент. Например, могут применяться вирусные частицы или другие векторы, кодирующие агент. Способы осуществления этого процесса известны в данной области техники.

Нуклеиновая кислота вызывает экспрессию агента в КПМЛ. Молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно включает промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей агент, который является активным в КПМЛ или который может быть индуцирован в КПМЛ.

В конкретном предпочтительном варианте реализации, нуклеиновая кислота, кодирующая агент, может быть доставлена с помощью вирусной частицы. Вирусная частица может включать молекулумишень для того, чтобы обеспечить эффективную трансфекцию.

Молекула-мишень обычно может быть представлена целиком или частично на поверхности вируса для того, чтобы молекула направляла вирус к КПМЛ.

В таких вариантах реализации можно применять любой подходящий вирус. Вирус может представлять собой, например, ретровирус, лентивирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус коровьей оспы или вирус простого герпеса. В конкретном предпочтительном варианте реализации вирус может представлять собой лентивирус. Лентивирус может представлять собой модифицированный вирус ВИЧ, подходящий для применения для доставки генов. Лентивирус может представлять собой вектор на основе вируса свиного гриппа (ВСГ), вируса кошачьего иммунодефицита (ВИК) или вируса инфекционной анемии лошадей (ИАЛ). Вирус может представлять собой вирус мышиного лейкоза Молони (ВМЛМ). Вирусы, применяемые согласно настоящему изобретению, предпочтительно являются репликативно дефицитными.

Вирусные частицы не должны быть использованы обязательно. Можно применять любой вектор, способный трансфицировать КПМЛ согласно настоящему изобретению, например, соответствующую трансфекцию с помощью ДНК и РНК плазмид.

Захват конструкций нуклеиновой кислоты можно стимулировать с помощью некоторых известных методик трансфекции, например, включающих применение трансфицирующих агентов. Примеры таких агентов включают катионные агенты, например, фосфат кальция и ДЭАЭ-декстран, и липофектанты, например, липофектамин, фуген и трансфектам.

Клетка может быть нагружена или трансфицирована в подходящих условиях. Например, можно осуществить контакт клетки и агента или вектора в течение от 5 мин до 10 дней, предпочтительно от одного часа до пяти дней, более предпочтительно, от пяти часов до двух дней и еще более предпочтительно от двенадцати часов до одного дня.

Согласно настоящему изобретению также предложены КПМЛ, которые были нагружены или трансфицированы агентом, как обсуждалось выше. Такие КПМЛ можно применять в терапевтических вариантах реализации настоящего изобретения.

В некоторых вариантах реализации МК могут быть взяты у пациента, преобразованы в КПМЛ с применением настоящего изобретения, нагружены или трансфицированы ίη νίίτο и затем возвращены этому же пациенту. В таких случаях КПМЛ применяемые в настоящем изобретении, будут аутологичными клетками и полностью сочетаться с пациентом. В предпочтительном случае, клетки, применяемые в настоящем изобретении, отбирают от пациента, используют ех νίνο и в последствии возвращают этому же пациенту.

- 13 029577

Фармацевтические композиции и введение

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, включающую (а) КПМЛ согласно настоящему изобретению или популяцию согласно настоящему изобретению и (Ь) фармацевтически приемлемый носитель или растворитель. Композиция может включать любые из КПМЛ или популяции, упомянутые в настоящей заявке, и, в некоторых вариантах реализации, молекулы нуклеиновой кислоты, векторы или вирусы, описанные в настоящей заявке. В настоящем изобретении предложен способ восстановления поврежденной ткани у пациента, который включает введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Любой из терапевтических вариантов реализации, которые обсуждались выше, эквивалентно применим к этому варианту реализации.

Различные композиции согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены с применением подходящих способов. Приготовление клеток со стандартными фармацевтически приемлемыми носителями и/или вспомогательными веществами можно осуществить, применяя рутинные способы фармацевтической области техники. Точная природа состава будет зависеть от некоторых факторов, включая клетки, которые будут вводить, и желаемый путь введения. Подходящие типы составов исчерпывающе описаны в Кетшд1оп'8 РЬаттассийса1 8с1спсс5. 19* Εάίΐίοη, Маек РиЫЫйпд Сотрапу, ЕаДсгп Рспп§у1уата, И8А.

Клетки можно вводить любым путем. Подходящие пути включают, но не ограничиваются ими, внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный или другие приемлемые пути введения. Если поврежденная ткань представляет собой ткань сетчатки, клетки можно ввести в глаз. Если поврежденная ткань представляет собой ткань сердца, клетки можно ввести через эндомиокардиальный, эпимиокардиальный, интравентрикулярный, интракоронарный, ретроградный коронарный синус, внутриартериальным, внутриперикардиальным или внутривенным путем. Если поврежденная ткань представляет собой кость, клетки можно ввести посредством внутрикостного пути или в место повреждения, например, перелома, или заболевания. Клетки предпочтительно вводят внутривенно.

Можно приготовить составы с физиологически приемлемым носителем или разбавителем. Обычно такие композиции готовят в виде жидких суспензий клеток. Клетки можно объединить со вспомогательным веществом, которое является фармацевтически приемлемым и совместимым с активным компонентом. Подходящие вспомогательные вещества представляют собой, например, воду, солевой раствор, декстрозу, глицерин и тому подобное и их комбинации.

Дополнительно при необходимости фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие компоненты, поддерживающие рН компоненты и/или адъюванты, повышающие эффективность. Композиция предпочтительно включает сывороточный альбумин человека.

Одним из подходящих носителей или разбавителей является Р1а8та-Ьу1е А®. Он представляет собой стерильный, апирогенный изотонический раствор для внутривенного введения. Каждые 100 мл содержат 526 мг хлорида натрия, качества Фармакопеи США (ЫаС1); 502 мг глюконата натрия (С₆Н₁₁ЫаО₇); 368 мг натрия ацетата тригидрата, качества Фармакопеи США (С₂Н₃ЫаО₂-3Н₂О); 37 мг хлорида калия, качества Фармакопеи США (КС1); и 30 мг хлорида магния, качества Фармакопеи США (М§С1₂-6Н₂О). Он не содержит противомикробных агентов. рН доводят с помощью гидроксида натрия. рН составляет 7,4 (от 6,5 до 8,0).

КПМЛ вводят способом, совместимым с лекарственной формой, и в том количестве, которое является терапевтически эффективным. Количество, которое вводят, зависит от субъекта, которого лечат, состояния иммунной системы субъекта и степени необходимого восстановления. Точные количества КПМЛ, необходимые для введения, могут зависеть от оценки практикующего врача и могут быть индивидуальными для каждого субъекта.

Субъекту может быть введено любое подходящее количество клеток. Например, можно вводить по меньшей мере или приблизительно 0,5 х 10⁶, 1,5 х 10⁶, 4,0 х 10⁶ или 5,0 х 10⁶ клеток на кг веса пациента. Например, можно вводить по меньшей мере или приблизительно 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ клеток. В качестве руководства количество вводимых клеток согласно настоящему изобретению может составлять от 10⁵ до 10⁹, предпочтительно от 10⁶ до 10⁸. Обычно каждому пациенту вводят более 2х10⁸ КПМЛ. Можно вводить любое из конкретных количеств, которые обсуждались выше по отношению к популяциям согласно настоящему изобретению. В тех случаях, когда клетки вводят или они уже присутствуют, культуральная среда может также присутствовать для облегчения выживаемости клеток. В некоторых случаях клетки согласно настоящему изобретению могут быть представлены в форме замороженных аликвот; могут присутствовать такие вещества, как ДМСО, для улучшения выживаемости в течение замораживания. Такие замороженные клетки следует затем оттаять и затем поместить в буфер или среду либо для поддерживания, либо для введения.

Ниже представлены примеры, иллюстрирующие настоящее изобретение.

- 14 029577

Примеры

Материалы и методы

После забора крови у пациента клетки-предшественники мезодермального происхождения получали в лаборатории стволовых клеток в гигиенических условиях, открытые контейнеры с клетками или другими материалами хранили в ламинарном боксе. На каждом этапе приготовления отбирали образцы и определяли количество и жизнеспособность стволовых клеток.

Мононуклеары выделяли из цельной крови путем центрифугирования с фиколл-пак® (ΡίοοίΐРадие®), плотность 1,073 и культивировали в α-ΜΕΜ-РЬ в течение 5 дней. Адгезивные клетки отбирали, определяли их иммунофенотип путем иммунофлуоресцентного окрашивания на несколько клеточных маркеров (см. ниже) с использованием анализа проточной цитометрии. Подходящие контроли изотипов использовали для каждой процедуры окрашивания.

Жизнеспособность клеток оценивали с использованием 1% раствора трипанового синего. Клетки подсчитывали методом РАС8 (РАСЗСайЬит, Веской Июкшкоп). Клетки также изучали на присутствие микоплазмы, стерильность (которую оценивали путем окрашивания по Граму), присутствие эндотоксинов, идентичность, чистоту, жизнеспособность и кариотип, чтобы исключить хромосомные аберрации.

Ниже приведено кратное описания фактического получения клеток.

1. 20 мл периферической крови отбирали у пациента.

2. 11,5 мл оставшейся крови затем пропустили через фиколл-пак®, плотность 1,073.

3. Образец центрифугировали для получения мононуклеаров, которые затем 4а. Выращивали в культуре в течение 8 дней при 0% кислорода или

4Ь. Пропускали через Кокейе 8ератайои и затем выращивались в культуре в течение 8 дней при 0% кислорода.

5. Заменяли среду, клетки культивировали в течение 14 дней при 0% кислорода.

6. Затем клетки собирали и пропускали через РАС8.

Исследовали различные маркеры с использованием ОТ-ПЦР и анализа РАС8. Основными исследуемыми маркерами были СИ14, СЭ29. СИ34, СЭ44. СИ45, СИ73, СИ90, СИ105, СИ271, СИ181, СИ182 и СИ184.

Ниже приведен использованный рабочий протокол.

Приготовление обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП)

1. Образец крови разделяли на 2 пробирки Фалькон объемом 15 мл, > 8 мл в каждой.

2. Центрифугировали при 120 х §, 15 мин, без перерыва, при комнатной температуре (КТ).

3. Супернатант, содержащий обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП), переносили в новую пробирку Фалькон объемом 15 мл.

4. Отмечали объем перенесенной ОТП.

5. Объем ОТП заменяли сбалансированным солевым раствором Хэнка (ССРХ).

Подготовка культуральной среды

1. 0,3 мл ОТП переносили в пробирку эппендорф для автоматического гематологического анализа с использованием прибора СеИ-Иуи. Подсчитывали теоретическое максимальное количество тромбоцитов.

Теоретическое максимальное количество тромбоцитов = Концентрация тромбоцитов х Объем ОТП

2. 0,25 мл ОТП переносили в пробирку эппендорф для криоконсервации (-80°С).

3. Оставшуюся ОТП центрифугировали при 1610 х д 10 мин, КТ, с перерывом.

4. Супернатант плазмы, свободной от тромбоцитов (ПСТ), переносили в отдельную пробирку Фалькон и ресуспендировали тромбоциты в объеме ПСТ для получения концентрации 1 х 10⁹ клеток/мл (использовали теоретическое максимальное количество тромбоцитов - стремились к 1,5 х 10⁹ для достижения 1 х 10⁹).

5. Оставшуюся ПСТ переносили в пробирки эппендорф в аликвотах по 0,25 мл для криоконсервации (-80°С).

6. Отверстие пробирки Фалькон с ОТП запечатывали парафильмом.

7. Пробирку Фалькон погружали в жидкий азот на 5 мин.

8. Пробирку Фалькон погружали в водяную баню с температурой 37°С до оттаивания.

9. Этапы 7 и 8 повторяли далее 3 раза.

10. Культуральную среду готовили путем добавления ЛТ (лизата тромбоцитов) в концентрации 10% к аМЕМ, 5 ЕД/мл гепарина, 2 мМ глутамакса, 1% П/С (т.е. добавили 1,5 мл ЛТ к 13,5 мл среды).

Выделение МНК

1. Объем разведенного образца крови (16,5 мл) переносили в новую пробирку Фалькон объемом 50 мл.

2. Образец крови затем разводили в соотношении 1:2 с помощью НВ§§ до объема ~ 33 мл.

3. 15 мл ИсоИ-Радие РКЕМШМ 1,073 добавляли в две новые пробирки Фалькон объемом 50 мл.

4. Разведенный образец крови аккуратно наслаивали на поверхность фиколл-пака путем вращения пробирки и медленного нанесения образца по стенке пробирки.

5. Образец центрифугировали при 400 х д 35 мин, без торможения, КТ.

- 15 029577

6. Отбирали как можно больше супернатанта (ΗΒδδ), не повреждая мутный слой мононуклеаров, с помощью легкой пастеровской пипетки.

7. Мутный слой мононуклеаров, который оставался на поверхности прозрачного фиколл-пака, отбирали в новую пробирку объемом 50 мл, объединяли.

8. Отмечали объем перенесенных МНК, отбирая их в пипетку объемом 10 мл.

9. Половину объема переносили в новую пробирку объемом 50 мл.

10. МНК разбавляли в обеих пробирках буфером ΗΒδδ в количестве по меньшей мере 3Х объема образца, приблизительно 13 мл.

11. Обе пробирки центрифугировали при 500 х д, 15 мин, с перерывом, КТ.

12. Отбирали супернатант.

13. Одну из пробирок ресуспендировали до приблизительно 1 миллиона МНК/мл, объем приблизительно 5 мл.

Обогащение с использованием Κθ8βίίβ-δβρ

1. Второй осадок МНК ресуспендировали в 660 мкл цельной крови из исходной аликвоты 0,75 мл.

2. Добавляли 33 мкл Кокейе^ер, перемешивали пипетированием.

3. Образец инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре.

4. Образец разводили в соотношении 1:2 добавлением 700 мкл ΗΒδδ, до конечного объема образца ~ 1,4 мл.

5. 1 мл фиколл-пака вносили в новую пробирку Фалькон объемом 15 мл.

6. Разведенный образец крови аккуратно наслаивали на поверхность фиколл-пака.

7. Образец центрифугировали при 400 х д, 35 мин, без торможения, КТ.

8. Супернатант отбирали с помощью одноканальной пипетки объемом 1 мл.

9. Мутный слой клеток на поверхности фиколла перенесли в новую пробирку Фалькон объемом 15 мл.

10. Объем обогащенных клеток записывали; клетки разводили с по меньшей мере 3 X объемом образца с помощью ΗΒδδ, приблизительно 3 мл.

11. Клетки центрифугировали при 500 х д, 15 мин, с перерывом, КТ.

12. Супернатант удаляли.

13. Осадок ресуспендировали в 0,5 мл.

Культивирование клеток

1. Клетки высевали при плотности посева 1,0 х 10⁵ клеток в среде, содержащей лизат аутологичных или аллогенных тромбоцитов.

2. Клетки заливали подходящим объемом среды.

3. Клетки инкубировали при 37°С, 0% О₂, 5% СО₂ в течение 8 дней.

4. Среду меняли на 8 день, клетки инкубировали до 14 дня.

5. Колонии отбирали и переносили в новые сосуды для культивирования. Добавляли среду, содержащую лизат аллогенных тромбоцитов.

6. Культивирование и пассирование клеток продолжали до получения приблизительно 5 х 10⁵ 1 х 10⁶ клеток.

7. Клетки собирали и исследовали методом проточной цитометрии; при необходимости клетки замораживали.

Исследование хоуминга и противовоспалительного действия

Изучали способность клеток, полученных в соответствии с настоящим изобретением, к хоумингу в конкретные поврежденные ткани у мыши и к индукции в них противовоспалительного действия. Для исследования хоуминга клетки метили флуоресцентным веществом и определяли их расположение в теле мыши биолюминесцентным методом.

Для исследования противовоспалительного действия проводили твердофазный иммуноферментный анализ (ΕΟδΆ) для выявления различных маркеров воспаления, включая интерлейкины (такие как ИЛ8), селектины, молекулы адгезии (такие как 1САМ-1) и белки-хемоаттрактанты (такие как МСР-1 и ΤΝΕα).

Результаты Все клетки

Все клетки-предшественники мезодермальной линии, полученные в соответствии с настоящим изобретением, экспрессировали СЭ29, СЭ44, СЭ73, СЭ90, ΟΌ105 и СЭ271, но не экспрессировали СЭ14, СЭ34 и СЭ45. Типичный гель после проведения ОТ-ПЦР, демонстрирующий наличие СЭ44 и отсутствие ΤΌ34. представлен На фиг. 1.

Типичные наборы результатов анализа методом ΡАСδ представлены На фиг. 2-4. Они подтверждают, что клетки являются положительными к по меньшей мере СО73 и СЭ90 и отрицательными к СЭ14, СЭ34 и СО45.

Клетки обычно составляют от 10 до 20 мкм в диаметре. Клетки обычно обладают веретенобидной формой и являются фибробластоподобными (т.е. имеют небольшое тело клетки с несколькими длинны- 16 029577

ми и тонкими клеточными отростками).

Клетки, способные к хоумингу

Клетки, способные к хоумингу в конкретные поврежденные ткани, как было показано, экспрессируют хемокиновый рецептор типов 1 и 2 (СХСК1 и СХСК2).

Было показано, что клетки, способные к хоумингу в поврежденную ткань сердца и костную ткань, экспрессируют СХСК4. Фиг. 5 демонстрирует, что СХСК4-положительные клетки способны к хоумингу в поврежденную кость. Результаты эксперимента, представленные на фиг. 5, суммированы ниже.

	КПМЛ	СХСК4+	СХСК4-	Р-значение (ΑΝΟνΑ)
День 3 после	5317±3468^а	6464=4814'’	546±433	0,0037
перелома	п=14	п=8	п=8
День 7 после	7093±2041^а	8526±4202^\|>	133±745	0,0057
перелома	г—6	п=4	п=3
День 14 после	6508±5350	18149±6100^ас	2440±806	0,0109
перелома	11=5	п=3	п=3

Таблица выше демонстрирует полуколичественный анализ биолюмнесцентных (БЛ) сигналов. Сигнал в месте перелома большой берцовой кости целевой области (ЦО), измеренный как фотоны/секунды/см²/ср, нормировали путем вычитания фонового сигнала, зарегистрированного в эквивалентной ЦО большой берцовой кости без перелома с противоположной стороны тела, а, р < 0,05 относительно группы СХСК4; Ь, р < 0,01 относительно группы СХСК4; с, р < 0,05 против КПМЛ согласно критерию Тьюки. Сокращения: ΑΝΟνΑ, дисперсионный анализ; КПМЛ, Клетка-предшественник мезодермальной линии.

Было показано, что клетки, способные к хоумингу в поврежденную ткань сетчатки, экспрессируют СХСК4, фактор роста эндотелия сосудов (νΈΟΡ), трансформирующий фактор роста бета 1 (ТФР-бета 1), инсулиноподобный фактор роста 1 (ЮР 1), фактор роста фибробластов (РСР), фактор некроза опухоли альфа (ФНО альфа), интерферон гамма (ИФН гамма), интерлейкин-1 альфа (ИЛ-1 альфа), СХСЬ12, СЭ109. СЭ119, ядерный фактор каппа энхансера легких цепей активированных В-клеток (ИРкарра В), СИ140а, СИ140Ь, СО221, СО222, СО304, СО309 и СО325.

Клетки, способные к хоумингу в поврежденную костную ткань, экспрессируют детектируемые уровни ТОР бета 3, морфогенетического белка кости 6 (ВМР-6), 8ОХ-9, коллагена 2 типа, СЭ117 (е-кй), лиганда хемокинов (СС мотив) 12 (ССЬ12), ССЬ7, интерлейкина-8 (ИЛ-8), фактора роста тромбоцитов Α (РИОР Α), РИОР В, РИОР С, РИОР Ό, фактора ингибирования миграции макрофагов (М1Р), 1ОР 1, фактора роста гепатоцитов (НОР), РИОР-Ка, ΡΌΟΡ-Κβ, СХСК4, рецептора Хемокинов СС типа 1 (ССК1), рецептора 1ОР 1 (1ОР 1К), рецептора фактора роста гепатоцитов (НОРК), СХСЬ12 и ИРкарраВ.

Противовоспалительное действие

Было показано, что клетки, полученные в соответствии с настоящим изобретением, экспрессируют следующие противовоспалительные маркеры: СЭ120а (рецептор 1 фактора некроза опухоли (ТИР)альфа), СЭ120Ь (рецептор 2 ФНО альфа), СЭ50 (молекула межклеточной адгезии-3, 1САМ-3), СЭ54 (1САМ-1), СЭ58 (ассоциированный с функцией антиген лимфоцитов 1, ЬРА-1), СЭ62Е (Е-селектин), СО62Б (Ь-селектин), СЭ62Р (Р-селектин), СЭ106 (васкулярный белок клеточной адгезии, VСΑМ-1), СЭ102 (1САМ-2), СО166 (молекула клеточной адгезии активированных лейкоцитов), СЭ104 (интегрин бета-4), СЭ123 (рецептор интерлейкина-3), СЭ124 (рецептор интерлейкина-4), СЭ126 (рецептор интерлейкина-6), СО127 (рецептор интерлейкина-7) и рецептор фактора роста фибробластов (РОРК).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Клетка-предшественник мезодермальной линии, выделенная из мононуклеарных клеток (МК) периферической крови или костного мозга, которая: (а) экспрессирует детектируемые уровни СЭ29. СЭ44. СИ73, СИ90, СИ105, СИ271, СИ120а (рецептор 1 фактора некроза опухоли (ТИР)-альфа), СИ120Ь (рецептор 2 ФНО альфа), СЭ50 (молекула межклеточной адгезии-3, 1САМ-3), СЭ54 (1САМ-1), СЭ58 (ассоциированный с функцией антиген лимфоцитов 1, ЬРА-1), СО62Е (Е-селектин), СО62Б (Ь-селектин), СИ62Р (Р-селектин), СЭ106 (васкулярный белок клеточной адгезии, VСΑМ-1), СЭ102 (1САМ-2), СЭ166 (молекула клеточной адгезии активированных лейкоцитов), СЭ104 (интегрин бета-4), СО123 (рецептор интерлейкина-3), СЭ124 (рецептор интерлейкина-4), СЭ126 (рецептор интерлейкина-6), СЭ127 (рецептор интерлейкина-7) и рецептор фактора роста фибробластов (РОРК), (Ь) не экспрессирует детектируемые уровни СЭ14. СО34 и СО45 и (с) способна оказывать противовоспалительное действие в поврежденной мезодермальной ткани у пациента.
2. Клетка-предшественник по п.1, отличающаяся тем, что указанная клетка способна к миграции в конкретную поврежденную мезодермальную ткань пациента и при этом указанная клетка дополнительно экспрессирует детектируемые уровни рецептора хемокинов СХС типа 1 (СХСК1) и рецептора хемокинов

- 17 029577

СХС типа 2 (СХСК2).
3. Клетка-предшественник по п.1 или 2, отличающаяся тем, что конкретная мезодермальная ткань представляет собой ткань сердца, ткань сетчатки или костную ткань.
4. Клетка-предшественник по п.3, отличающаяся тем, что конкретная мезодермальная ткань представляет собой ткань сердца или костную ткань и клетка дополнительно экспрессирует детектируемые уровни рецептора хемокинов СХС типа 4 (СХСК4).
5. Клетка-предшественник по п.3, отличающаяся тем, что конкретная мезодермальная ткань представляет собой ткань сетчатки и клетка дополнительно экспрессирует детектируемые уровни СХСК4, фактора роста эндотелия сосудов (УБОР), трансформирующего фактора роста бета 1 (ТФР-бета 1), инсулиноподобного фактора роста 1 (1ОР 1), фактора роста фибробластов (РОР), фактора некроза опухоли альфа (ФНО альфа), интерферона гамма (ИФН гамма), интерлейкина-1 альфа (ИЛ-1 альфа), СХСБ12. СИ109, СИ119, ядерного фактора - энхансера легких цепей каппа активированных В-клеток (ХРкарраВ), СИ140а, СИ140Ь, СИ221, СИ222, СИ304, СИ309 и СИ325.
6. Клетка-предшественник по п.3, отличающаяся тем, что конкретная мезодермальная ткань представляет собой костную ткань и клетка дополнительно экспрессирует детектируемые уровни ТФР-бета 3, морфогенетического белка кости 6 (ВМР-6), 8ОХ-9, коллагена 2 типа, СИ117 (ο-Κίί), лиганда хемокинов (С-С мотив) 12 (ССЬ12), ССЬ7, интерлейкина-8 (ИЛ-8), фактора роста тромбоцитов Α (РИОРА), РИОРВ, РИОРС, РИОРИ, фактора ингибирования миграции макрофагов (М1Р), 1ОР 1, фактора роста гепатоцитов (НОР), РИОР-Ка, РИОР-Κβ, СХСК4, рецептора хемокинов СС типа 1 (ССК1), рецептора 1ОР 1 (1ОР 1К), рецептора фактора роста гепатоцитов (НОРК), СХСБ12 и ХРкарраВ.
7. Клетка-предшественник согласно любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанная клетка дополнительно экспрессирует детектируемые уровни одного или более из: (ί) инсулиноподобного фактора роста 1 (1ОР 1), (ίί) рецептора 1ОР 1; (ίίί) рецептора хемокинов СС типа 1 (ССК1), (ίν) стромального клеточного фактора 1 (8ИР-1), (ν) фактора, индуцируемого гипоксией, 1 альфа (Н1Р-1 альфа), (νί) АкИ и (νίί) фактора роста гепатоцитов (НОР) и/или колониестимулирующего фактора гранулоцитов (О-С8Р).
8. Клетка-предшественник по п.7, отличающаяся тем, что указанная клетка сверхэкспрессирует один или более из факторов (ί)-(νίί).
9. Клетка-предшественник согласно любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанная клетка дополнительно экспрессирует детектируемые уровни одного или более из (ί) фактора роста эндотелия сосудов (УЕОР), (ίί) трансформирующего фактора роста бета (ТФР бета), (ίίί) инсулиноподобного фактора роста 1 (1ОР 1), (ίν) фактора роста фибробластов (РОР), (ν) фактора некроза опухоли альфа (ФНО альфа), (νί) интерферона гамма (ИФН гамма) и (νίί) интерлейкина-1 альфа (ИЛ-1 альфа).
10. Клетка-предшественник по п.9, отличающаяся тем, что указанная клетка сверхэкспрессирует один или более из факторов (ί)-(νίί).
11. Клетка-предшественник по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанная клетка является аутологичной.
12. Клетка-предшественник по любому из пп.1-10, отличающаяся тем, что указанная клетка является аллогенной.
13. Популяция, включающая две или более клеток-предшественников мезодермальной линии согласно любому из пп.1-12, для применения в восстановлении поврежденной мезодермальной ткани у пациента.
14. Популяция по п.13, отличающаяся тем, что указанная популяция включает по меньшей мере приблизительно 5 х 10⁵ клеток согласно любому из пп.1-12.
15. Фармацевтическая композиция, содержащая: (а) клетку-предшественник согласно любому из пп.1-12 или популяцию согласно п.13 или 14 и (Ь) фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, для применения в восстановлении поврежденной мезодермальной ткани у пациента.
16. Способ получения популяции клеток-предшественников мезодермальной линии по п.13 или 14, включающий: (а) культивирование мононуклеаров (МК) с лизатом тромбоцитов в условиях менее чем приблизительно 20% кислорода (О₂) и в условиях, которые допускают адгезию клетокпредшественников таким образом, что происходит дифференцировка МК в клетки-предшественники мезодермальной линии, и (Ь) сбор и культивирование тех клеток-предшественников, которые обладают паттерном экспрессии, определенным в любом из пп.1, 2, 4, 5, 6 и пп. 7-10, с получением популяции по п.13 или 14.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что МК являются мононуклеарами периферической крови (МНПК) или мононуклеарами костного мозга.
18. Способ по любому из пп. 16 или 17, отличающийся тем, что МК получают от пациента или аллогенного донора.
19. Способ восстановления поврежденной мезодермальной ткани у пациента, включающий введение пациенту популяции по п.13 или 14, причем популяция включает терапевтически эффективное количество клеток, что обеспечивает лечение поврежденной мезодермальной ткани у пациента, и в котором

- 18 029577

ткань происходит из мезодермы.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что мезодермальная ткань представляет собой ткань сердца, ткань сетчатки или костную ткань.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что способ предназначен: (а) для восстановления поврежденной ткани сердца и популяция включает терапевтически эффективное количество клеток согласно п.4, (Ь) для восстановления поврежденной ткани сетчатки и популяция включает терапевтически эффективное количество клеток согласно п.5 или (с) для восстановления поврежденной костной ткани, и популяция включает терапевтически эффективное количество клеток согласно п.6.
22. Способ согласно любому из пп.20, 21, отличающийся тем, что мезодермальная ткань повреждена в результате ранения или заболевания.
23. Способ по п.19, отличающийся тем, что способ предназначен для лечения повреждения или заболевания сердца, возрастной макулярной дегенерации, или повреждения или заболевания кости у пациента.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что повреждение или заболевание сердца выбрано из инфаркта миокарда (ИМ), гипертрофии левого желудочка, гипертрофии правого желудочка, эмболии, сердечной недостаточности, врожденной сердечной недостаточности, заболевания сердечного клапана, аритмии и миокардита.
25. Способ по п.23, отличающийся тем, что повреждение или заболевание кости выбрано из перелома, перелома Салтера-Харриса, перелома кости по типу "зеленой ветки", костной шпоры, краниосиностоза, синдрома Коффина-Лоури, прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазии, фиброзной дисплазии, болезни Фонга (или синдрома "ногтей-наколенника"), гипофосфатазии, синдрома КлиппеляФейля, метаболического заболевания костной ткани, ногте-надколенного синдрома, остеоартрита, деформирующего остита (или болезни костей Паджета), паратиреоидной остеодистрофии (или фиброзного остеита, или болезни Фон Реклингхаузена костей), остеита лобковой кости, склерозирующего остеомиелита (или οδΐβίΐίδ соибеизаиз), склерозирующего остеомиелита подвздошной области, рассекающего остеохондрита, незавершенного остеогенеза, остеомаляции, остеомиелита, остеопении, остеопетроза, остеопороза, остеонекроза, поротического гиперостоза, первичного гиперпаратиреоза, нефрогенной остеодистрофии, рака кости, поражения кости, связанного с метастазирующим раком, болезни ГорхемаСтаута, первичного гиперпаратиреоза, парадонтоза и асептической нестабильности протеза сустава.
26. Способ согласно любому из пп.23-25, отличающийся тем, что способ предназначен: (а) для лечения повреждения или заболевания сердца, и популяция включает терапевтически эффективное количество клеток согласно п.4, (Ь) для лечения возрастной макулярной дегенерации, и популяция включает терапевтически эффективное количество клеток согласно п.5, или (с) для лечения повреждения или заболевания кости и популяция включает терапевтически эффективное количество клеток согласно п.6.
27. Способ по любому из пп.19-26, отличающийся тем, что популяцию получают с использованием МК, полученных от пациента или аллогенного донора.
28. Применение популяции по п.13 или 14 для получения лекарственного средства для лечения повреждения или заболевания сердца, возрастной макулярной дегенерации, или повреждения или заболевания кости у пациента, нуждающегося в этом.

- 19 029577