PL210546B1

PL210546B1 - Peptydy oraz pokrewne cząsteczki wiążące TALL-1

Info

Publication number: PL210546B1
Application number: PL369570A
Authority: PL
Inventors: Hosung Min; Hailing Hsu; Fei Xiong
Original assignee: Amgen
Priority date: 2001-05-11
Filing date: 2002-05-13
Publication date: 2012-01-31
Also published as: HK1207390A1; AU2002342669B2; CY1107131T1; US20030195156A1; NO20034980D0; NO20034980L; EP2292655A1; EP1385882A4; CN1535281A; PL393317A1; CZ20033291A3; HK1059269A1; HK1151545A1; NO331785B1; EE05294B1; EP1921088B1; AU2002342669C1; SK288175B6; HUP0700125A2; EP1385882B9

Description

Obecny wynalazek dotyczy peptydów i pokrewnych cząsteczek wiążących TALL-1, a także kwasów DNA kodujących te peptydy, wektorów ekspresji, zawierających wskazane kwasy DNA oraz komórek gospodarza, zawierających te wektory. Cząsteczki według wynalazku znajdują zastosowanie do leczenia chorób, w których pośredniczą komórki B.

Podstawy wynalazku

Po latach badań nad martwicą guzów, czynniki nekrozy nowotworów (TNFs) α i β zostały w koń cu sklonowane w roku 1984. Nast ę pne lata był y ś wiadkiem wył onienia się superrodziny cytokin TNF obejmującej ligand fas (FasL), ligand CD27 (CD27L), Hgand CD30 (CD30L), ligand CD40 (CD40L), pokrewny TNF ligand indukujący apoptozę (TRAIL, określany także, jako AGP-1), proteinę wiążącą osteoprotegerynę (ligand OPG-BP lub ligand OPG), ligand 4-lBB, LIGHT, APRIL, oraz TALL-1.

Smith i wsp. (1994), Cell 76: 959-962; Lacey i wsp. (1998), Cell 93: 165-176; Chichepotiche i wsp. (1997), J. Biol. Chem. 272: 32401-32410; Mauri i wsp. (1998), Immunity 8: 21-30; Hahne i wsp. (1998), J. Exp. Med. 188: 1185-90; Shu i wsp. (1999), J. Leukocyte Biology 65: 680-3. Rodzina ta ma wspólną strukturę, szczególnie przy końcu C. Ponadto, większość jej dotychczas poznanych członków jest eksprymowanych w przedziałach immunologicznych, aczkolwiek niektórzy jej członkowie podlegają ekspresji także w innych tkankach lub organach. Smith i wsp. (1994), Cell 76: 959-62. Wszystkie ligandy, z wyjątkiem LT-α są proteinami transmembranowymi typu II, charakteryzującymi się zachowawczym obszarem 150 aminokwasów w C-końcowej domenie pozakomórkowej. Choć ograniczona jest do jedynie 20-25% identyczności, wskazana zachowawcza domena 150 aminokwasów podlega sfałdowaniu w charakterystyczny sandwich z β-harmonijki oraz trimeryzuje. Ten zachowawczy obszar może być uwolniony proteolitycznie, z wytworzeniem rozpuszczalnej formy funkcjonalnej. Banner i wsp. (1993), Cell 73: 431-445.

Wielu członków w obrębie tej rodziny ligandów podlega ekspresji we wzbogaconych tkankach limfoidalnych i odgrywa ważną rolę w rozwijaniu i modulowaniu systemu immunologicznego. Smith i wsp. (1994). Przykładowo, TNFa jest głównie syntezowany przez makrofagi i jest ważnym mediatorem reakcji zapalnej i obrony immunologicznej. Tracey & Cerami (1994), Ann. Rev. Med. 45: 491-503. Fas-L, eksprymowany przede wszystkim w aktywowanych komórkach T, moduluje apoptozę tymocytów, w której pośredniczy TCR. Nagata, S. & Suda, T. (1995) Immunology Today 16: 39-43; Castrim I wsp. (1996), Immunity 5: 617-27. CD40L, również eksprymowany przez aktywowane komórki T dostarcza istotny sygnał dla przeżycia komórki B, proliferację oraz izotypowe przekształcenia immunoglobuliny. Noelle (1996), Immunity 4: 415-9.

Zidentyfikowano już pokrewne receptory dla większości członków rodziny ligandów TNF. Wspólną cechą tych receptorów są wielokrotne powtórzenia fragmentów bogatych w cysteinę wewnątrz ich domen zewnątrzkomórkowych oraz brak katalitycznych motywów w obszarach cytoplazmowych. Smith i wsp. (1994). Receptory sygnalizują przez bezpośrednie oddziaływania z białkami domeny śmierci (przykładowo TRADD, FADD oraz RIP) lub z proteinami TRAF (przykładowo TRAF2, TRAF3, TRAF5 oraz TRAF6), uruchamiając różnorodne i nakładające się na siebie ścieżki sygnałowe, przykładowo apoptozę, aktywację NF-kB lub aktywację JNK. Wallach i wsp. (1999), Annual Review of Immunology 17: 331-67. Te sygnałowe zdarzenia prowadzą do śmierci komórki, proliferacji, aktywacji lub różnicowania. Profil ekspresji każdego członka receptora jest inny. Przykładowo, TNFR1 podlega ekspresji w szerokiej gamie tkanek i komórek, podczas gdy występujący na powierzchni komórki receptor OPGL podlega ograniczeniu głównie do osteoklastów. Hsu i wsp. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 3540-5.

Wiele grup badawczych zidentyfikowało ostatnio ligandy rodziny TNF o takiej samej lub zasadniczo podobnej sekwencji. Ligand ten określano różnymi nazwami: neutrokiną α (WO 98/18921, publikacja: 7 maja, 1998), 63954 (WO 98/27114, publikacja: 25 czerwca, 1998), TL5 (opis EP 869 180, opublikowany 7 października, 1998), NTN-2 (WO 98/55620 oraz WO 98/55621, publikacja: 10 grudnia, 1998), TNRL1-alfa (WO 9911791, publikacja: 11 marca, 1999), ligand kluczowy (WO 99/12964, publikacja: 18 marca, 1999), oraz AGP-3 (tymczasowe zgłoszenie nr US 60/119 906, dokonane 12 lutego 1999 oraz 60/166 271, dokonane 18 listopada 1999) oraz TALL-1 (WO 00/68378, publikacja: 16 listopada, 2000). Poniżej, ligandy opisane w powyższych publikacjach określa się wspólnym terminem TALL-1.

TALL-1 jest członkiem superrodziny ligandu TNF funkcjonalnie zaangażowanym w przetrwanie komórek B oraz ich proliferację. Myszy transgeniczne z nadekspresją TALL-1 mają ostry rozrost koPL 210 546 B1 mórek B oraz chorobę autoimmunologiczną podobną do tocznia. Khare i wsp. (2000) PNAS 97 (7): 3370-3375). Zarówno TACI, jak i BCMA służą jako receptory TALL-1 na powierzchni komórki. Gross i wsp. (2000), Nature 404: 995-999; Ware (2000), J. Exp. Med. 192 (11): F35-F37; Ware (2000), Nature 404: 949-950; Xia i wsp. (2000), J. Exp. Med. 192 (1): 137-143; Yu i wsp. (2000), Nature Immunology 1 (3): 252-256; Marsters i wsp. (2000), Current Biology 10: 785-788; Hatzoglou i wsp. (2000) J. of Immunology 165: 1322-1330; Shu i wsp. (2000) PNAS 97 (16): 9156-9161; Thompson i wsp. (2000) J. Exp. Med. 192 (1): 129-135; Mukhopadhyay i wsp. (1999) J. Biol. Chem. 274 (23): 15978-81; Shu i wsp. (1999) J. Leukocyte Biol. 65: 680-683; Gruss i wsp. (1995) Blood 85 (12): 3378-3404; Smith i wsp. (1994), Cell 76: 959-962; patent nr US 5 969 102, wydany 19 października 1999; WO 00/67034, publikacja: 9 listopada 2000; WO 00/40716, publikacja: 13 lipca 2000; WO 99/35170, publikacja: 15 lipca 1999. Oba receptory ulegają ekspresji na komórkach B i sygnalizują na drodze oddziaływania na proteiny TRAF. Ponadto, zarówno TACI, jak i BCMA wiążą się również do innego członka rodziny ligandu TNF - APRIL. Yu i wsp. (2000), Nature Immunology 1 (3): 252-256. Wykazano, że APRIL także indukuje proliferację komórek B.

Dotychczas nie zostały ujawnione żadne rekombinacyjne lub modyfikowane proteiny wykorzystujące peptydowe modulatory TALL-1. Rekombinacyjne i modyfikowane proteiny stanowią nową klasę środków terapeutycznych. Użyteczne modyfikacje proteinowych środków terapeutycznych obejmują połączenia z domeną „Fc” przeciwciała oraz związanie z polimerami takimi jak glikol polietylenowy (PEG) oraz dekstran. Takie modyfikacje są szczegółowo omówione w zgłoszeniu patentowym zatytułowanym „Modyfikowane peptydy, jako środki terapeutyczne” opublikowanym jako WO 00/24782.

Całkiem odmienne podejście do opracowywania środków terapeutycznych polega na poddawaniu skriningowi biblioteki peptydów. Oddziaływanie ligandu proteiny z jej receptorem często zachodzi na stosunkowo dużej powierzchni oddziaływania. Jednakże, jak to wykazano w przypadku ludzkiego hormonu wzrostu i jego receptora, kilka zaledwie kluczowych reszt na powierzchni oddziaływania przyczynia się do większej części energii wiązania. Clackson i wsp. (1995), Science 267: 383-6. W swej masie ligand proteinowy jedynie przedstawia epitopy wiążące w prawidłowej topologii lub spełnia funkcje niezwiązane z wiązaniem. Dlatego też, molekuły o tylko „peptydowej” długości (2 do 40 aminokwasów) mogą wiązać się z białkiem receptorowym danego dużego ligandu proteinowego. Takie peptydy mogą naśladować bioaktywność dużych ligandów proteinowych („peptydowi agoniści”) lub przez konkurujące wiązanie, inhibitować bioaktywność dużych ligandów proteinowych („peptydowi antagoniści”).

Peptydowe biblioteki prezentacji fagowej pojawiły się jako bardzo skuteczne narzędzie identyfikacji takich peptydowych agonistów oraz antagonistów. Patrz, przykładowo, Scott i wsp. (1990), Science 249: 386; Deylin i wsp. (1990), Science 249: 404; patent nr US 5 223 409 wydany 29 czerwca 1993; patent nr US 5 733 731 wydany 31 marca 1998; patent nr 5 498 530 wydany 12 marca 1996; patent nr 5 432 018 wydany 11 lipca 1995; patent nr US 5 338 665 wydany 16 sierpnia 1994; patent nr US 5 922 545 wydany 13 lipca 1999; WO 96/40987 publikacja: 19 grudnia 1996; oraz WO 98/15833 publikacja: 16 kwietnia 1998. W takich bibliotekach, losowe sekwencje peptydowe przedstawione są w formie fuzji z proteinami płaszcza włóknistego faga. W typowym przypadku, udostępnione peptydy są eluowane na zasadzie powinowactwa wobec unieruchomionego białka docelowego. Zatrzymane fagi mogą być wzbogacone w kolejnych cyklach oczyszczania przez powinowactwo oraz repropagację. Najlepiej wiążące peptydy można zsekwencjonować w celu identyfikacji kluczowych reszt w obrębie jednej lub więcej strukturalnie spokrewnionych rodzin peptydów. Patrz, przykładowo, Cwirla i wsp. (1997), Science 276: 1696-9, gdzie zidentyfikowano dwie różne rodziny. Sekwencje peptydowe mogą również sugerować, które reszty mogą być bezpiecznie zamienione przez skanowanie alaniną lub przez mutagenezę na poziomie DNA. Można tworzyć biblioteki mutagenezy i poddawane skriningowi celem dalszej optymalizacji sekwencji najlepiej wiążących cząsteczek. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophvs. Biomol. Struct. 26: 401-24.

Analiza strukturalna oddziaływania proteina-proteina może również być podstawą do typowania peptydów naśladujących aktywność wiązania dużych ligandów proteinowych. W takiej analizie struktura kryształu może sugerować identyczność oraz względną orientację istotnych (krytycznych) reszt dużego ligandu proteinowego, na podstawie której można zaprojektować peptyd. Patrz, przykładowo, Takasaki i wsp. (1997), Nature Biotech. 15: 1266-70. Te metody analityczne można również wykorzystywać do badania oddziaływania pomiędzy proteiną receptorową a peptydami wybranymi na podstawie prezentacji fagowej, a uzyskane wyniki mogą sugerować dalsze modyfikacje peptydów w celu zwiększenia powinowactwa wiązania.

PL 210 546 B1

Inne sposoby konkurują z prezentacją fagową w badaniach nad peptydami. Bibliotekę peptydową można poddać fuzji do karboksylowego końca represora lac, a następnie ekspresji w E. coli. Inna metoda, oparta na wykorzystaniu E. coli pozwala na uwidocznienie na zewnętrznej błonie komórki w wyniku fuzji z lipoproteiną powiązana z peptydoglikanem (PAL). Poniżej, omówione tu metody oraz sposoby im podobne określane są zbiorczym terminem „prezentacja z E. coli”. W innej metodzie translację losowo wybranego RNA zatrzymuje się przed uwolnieniem rybosomu, w wyniku czego otrzymuje się bibliotekę polipeptydów z nadal przyłączonym odpowiadającym im RNA. Poniżej, metoda ta oraz sposoby jej podobne określane są zbiorczym terminem „prezentacja rybosomowa”. Inne metody wykorzystują peptydy przyłączone do RNA, jak przykładowo, technologia PRO-flizyjna, Phylos, Inc. Patrz, przykładowo, Roberts & Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 12297-303. Poniżej, metoda ta oraz sposoby jej podobne określane są zbiorczym terminem „skrining układów RNA-peptyd”. Opracowano biblioteki peptydów przekształconych w pochodne wytworzone chemicznie, w których peptydy są unieruchomione na stabilnych materiałach nie biologicznych, takich jak pręty polietylenowe lub żywice przepuszczalne dla rozpuszczalnika. Inna biblioteka chemicznie przetworzonych peptydów wykorzystuje fotolitografię w celu skanowania peptydów unieruchomionych na płytkach szklanych. Poniżej, omówione tu metody oraz sposoby im podobne określane są zbiorczym terminem „skrining chemicznie przetworzonych peptydów”. Skrining chemicznie przetworzonych peptydów może być korzystny, ponieważ pozwala na użycie D-aminokwasów oraz innych nie występujących w naturze analogów, a także elementów nie peptydowych. Przegląd zarówno metod biologicznych, jak i chemicznych można znaleźć w Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355-62. Stosując prezentację fagową, skrining układów RNA-peptyd oraz i inne metody opisane powyżej, można - w sferze koncepcyjnej - znaleźć peptydowe mimetyki dowolnej proteiny.

Istota wynalazku

Wynalazek dotyczy cząsteczki obejmującej sekwencję aminokwasową o wzorze:

I(f) f¹f²f³Kf⁵Df⁷Lf⁹f¹⁰Qf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 109), gdzie:

f¹, f² i f³ oznaczają, każdy niezależnie, reszty aminokwasowe lub ich brak, f⁵ oznacza W, Y lub F; f⁷ oznacza resztę aminokwasową; f⁹ oznacza T lub I;

f¹⁰ oznacza K, R lub H;

f¹² oznacza C, obojętną resztę hydrofobową lub resztę zasadową, korzystnie W, C lub R;

f¹³ oznacza C, obojętną resztę hydrofobową lub jej brak; a f¹⁴ oznacza dowolną resztę aminokwasową lub jej brak;

2 3 12 13 14 z tym jednak warunkiem, że tylko jeden z f¹, f² i f³ może oznaczać C oraz że tylko jeden z f¹², f¹³ i f¹⁴może oznaczać C.

W powyższej cząsteczce według wynalazku, f⁷ korzystnie oznacza L.

W cząsteczce tej, f⁹ korzystnie oznacza T.

W cząsteczce tej, f¹⁰ korzystnie oznacza K.

1 2 3

W powyższej cząsteczce według wynalazku, f¹² korzystnie oznacza C oraz jeden z f¹, f² i f³oznacza C.

W cząsteczce według wynalazku f¹³ korzystnie oznacza V.

Korzystnie, cząsteczka według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasową o wzorze:

I(f') f¹f²f³KWDf⁷Lf⁹KQf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 125).

Korzystnie, powyższa cząsteczka obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 32, 33, 58, 60, 63, 66, 67, 69, 114, 115, 122, 123, 124, 147-150, 152-177, 179, 180 oraz 187.

Szczególnie korzystnie, powyższa cząsteczka obejmuje sekwencję aminokwasową o wzorze:

LPGCKWDLLIKQWVCDPL (SEQ ID NO: 33).

Wynalazek obejmuje także cząsteczkę o wzorze:

(X¹)a - V¹ - (X²)_b oraz jej multimery, gdzie:

V¹ oznacza domenę Fc;

PL 210 546 B1

2 1 1 1 1 X¹ i X² oznaczają, każdy niezależnie, resztę wybraną z grupy obejmującej -(L¹)c-P¹, -(L¹)c-P¹-(L²)d-P², -(L¹)c-P¹-(L²)d-P²-(L³)c-P³, -(L¹)_c-P¹-(L²)d-P²-(L³)c-P³-(L⁴)_f-P⁴, gdzie jeden lub więcej niż jeden spośród P¹, P², P³ i P⁴, każdy niezależnie, zawiera sekwencję: f¹f²f³Kf⁵Df⁷Lf⁹f¹⁰Qf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 109, określoną jak wyżej;

L¹, L², L³ i L⁴ - każdy niezależnie, oznaczają linkery; zaś a, b, c, d, e oraz f - każdy niezależnie, oznaczają 0 lub 1, z tym warunkiem, że co najmniej jeden spośród indeksów a oraz b oznacza 1.

Korzystnie, powyższa cząsteczka według wynalazku jest określona wzorem:

P¹-(L¹)c-P²-(L²)d-V¹ albo V¹-(L¹)c-P¹-(L²)d-P²

W powyższej cząsteczce o wzorze (X¹)a-V¹-(X²)b, V¹ korzystnie oznacza domenę IgG Fc, a korzystniej domenę IgG1 Fc.

Szczególnie korzystnie, V¹ w powyższym wzorze obejmuje sekwencję SEQ ID NO: 2.

W omawianej cząsteczce według wynalazku, korzystnie f⁵ oznacza W;

f⁷ oznacza L;

f¹⁰ oznacza K; zaś f¹³ oznacza V.

₁

W omawianej czą steczce wedł ug wynalazku, korzystnie jeden lub wię cej niż jeden spoś ród P¹, P², P³ oraz P⁴ - każdy niezależnie, zawiera sekwencję o wzorze:

f¹f²f³KWDf⁷Lf⁹KQf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 125).

Korzystnie, cząsteczka ta jest określona wzorem:

P¹-(L¹)c-P²-(L²)d-V¹ albo V¹-(L¹)c-P¹-(L²)d-P²

Korzystnie również, cząsteczka ta ma sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 122, 123 oraz 124.

W powyższej cząsteczce o wzorze P¹-(L¹)c-P²-(L²)d-V¹, L² jest korzystnie większy niż 5 aminokwasów.

W szczególności, L² jest wybrany z grupy obejmującej:

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx¹x² (SEQ ID NO: 193) oraz

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx¹x²GSGSATGGSGSTASSGSGSATx³x⁴ (SEQ ID NO: 194), gdzie x¹ oraz x³ - każdy niezależnie, oznacza resztę zasadową lub hydrofobową, zaś x² oraz x⁴ - każdy niezależnie, oznacza resztę hydrofobową.

W powyższej cząsteczce o wzorze V¹-(L¹)c-P¹-(L²)d-P², L² jest korzystnie wybrany z grupy obejmującej:

GSGSATGGSGSTASSGSGSATH

GSGSATGGSGSTASSGSGSATGM

GSGSATGGSGSTASSGSGSATGS (SEQ ID NO: 59), (SEQ ID NO: 190), (SEQ ID NO: 191) oraz

GSGSATGGSGSTASSGSGSATHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHM (SEQ ID NO: 192).

Wynalazek dotyczy także DNA kodującego powyższą cząsteczkę określoną wzorem (X¹)a-V¹-(X²)b, w którym V¹ oznacza domenę IgG Fc.

Wynalazek obejmuje również wektor ekspresji zawierający DNA określony jak wyżej. Wynalazkiem objęta jest też komórka gospodarza zawierająca wektor ekspresji określony jak wyżej.

Korzystnie, komórką gospodarza według wynalazku jest komórka E. coli.

Wyżej określone cząsteczki według wynalazku przeznaczone są do stosowania w sposobie leczenia choroby autoimmunologicznej, w której pośredniczą komórki B. W szczególności, wspomnianą chorobą autoimmunologiczną, w której pośredniczą komórki B jest toczeń.

PL 210 546 B1

Wyżej określone cząsteczki według wynalazku przeznaczone są do stosowania w sposobie leczenia raka, w którym pośredniczą komórki B. W szczególności, wspomnianym rakiem, w którym pośredniczą komórki B jest chłoniak komórek B.

Obecnie zastrzegany wynalazek dotyczy środków terapeutycznych, które modulują aktywność TALL-1.

Zgodnie z obecnym ujawnieniem, modulatory TALL-1 mogą obejmować sekwencję aminokwasową Dz²Lz⁴ (SEQ ID NO: 108), gdzie z² oznacza resztę aminokwasową i z⁴ oznacza treonyl lub izoleucyl. Takie modulatory TALL-1 obejmują cząsteczki o następujących wzorach:

I(a) _a ¹a²a³CDa⁶La⁸a⁹a¹⁰Ca¹²a¹³a¹⁴ (SEQ. ID. NO: 100), gdzie:

a¹, a², a³ oznaczają, każdy niezależnie, reszty aminokwasowe lub ich brak; a⁶ oznacza resztę aminokwasową; a⁹ oznacza resztę zasadową lub hydrofobową; a⁸ oznacza treonyl lub izoleucyl;

a¹² oznacza obojętną resztę hydrofobową; a a¹³ i a¹⁴ oznaczają, każdy niezależnie, reszty aminokwasowe lub ich brak.

I(b) _b ¹b²b³Cb⁵b⁶Db⁸Lb¹⁰b¹¹b¹²b¹³b¹⁴Cb¹⁶b¹⁷b¹⁸ (SEQ. ID. NO: 104), gdzie:

b¹ i b² oznaczają, każdy niezależnie, reszty aminokwasowe lub ich brak; b³ oznacza resztę kwasową lub amidową; b⁵ oznacza resztę aminokwasową;

b⁶ oznacza resztę aromatyczną; b⁸ oznacza resztę aminokwasową; b¹⁰ oznacza T lub I;

b¹¹ oznacza resztę zasadową;

b¹² i b¹³ oznaczają, każdy niezależnie, resztę aminokwasową;

b¹⁴ oznacza obojętną resztę hydrofobową; oraz 16 17 18 b¹⁶, b¹⁷, b¹⁸ oznaczają, każdy niezależnie, reszty aminokwasowe lub ich brak.

I(c) _c ¹c²c³Cc⁵Dc⁷Lc⁹Lc¹⁰c¹¹c¹²c¹³c¹⁴Cc¹⁶c¹⁷c¹⁸ (SEQ. ID. NO: 105), gdzie:

c¹, c², c³ oznaczają, każdy niezależnie, reszty aminokwasowe lub ich brak; c⁵ oznacza resztę aminokwasową; c⁷ oznacza resztę aminokwasową; c⁹ oznacza T lub I;

c¹⁰ oznacza resztę zasadową;

c¹¹ i c¹² oznaczają, każdy niezależnie, resztę aminokwasową; c¹³ oznacza obojętną resztę hydrofobową; c¹⁴ oznacza resztę aminokwasową;

c¹⁶ oznacza resztę aminokwasową;

c¹⁷ oznacza obojętną resztę hydrofobową; a c¹⁸ oznacza resztę aminokwasową lub jej brak.

I(d) _d ¹d²d³Cd⁵d⁶d⁷WDd¹⁰Ld¹²d¹³d¹⁴Cd¹⁵d¹⁶d¹⁷ (SEQ. ID. NO: 106) gdzie:

d¹, d², d³ oznaczają, każdy niezależnie, reszty aminokwasowe lub ich brak; d⁵, d⁶, d⁷ oznaczają, każdy niezależnie, resztę aminokwasową; d¹⁰ oznacza, resztę aminokwasową;

d¹² oznacza T lub I;

d¹³ oznacza resztę aminokwasową;

d¹⁴ oznacza resztę aminokwasową; a 16 17 18 d¹⁶, d¹⁷, d¹⁸ oznaczają, każdy niezależnie, reszty aminokwasowe lub ich brak.

PL 210 546 B1

I(e) _e ¹e²e³Ce⁵e⁶e⁷De⁹Le¹¹Ke¹³Ce¹⁵e¹⁶e¹⁷e¹⁸ (SEQ. ID. NO: 107), gdzie:

e¹, e², e³ oznaczają, każdy niezależnie, reszty aminokwasowe lub ich brak; e⁵, e⁶, e⁷, e⁹ i e¹³ oznaczają, każdy niezależnie, resztę aminokwasową; e¹¹ oznacza T lub I; a e¹⁵, e¹⁶ oraz e¹⁷ oznaczają, każdy niezależnie, reszty aminokwasowe lub ich brak.

Związki o wzorach I(a) do I(f) - powyżej, obejmują Dz²Lz⁴, jak również SEQ ID NO: 63 określoną poniżej. Sekwencję I(f) uzyskano jako sekwencję zgodną, w sposób opisany w przykładzie 1, poniżej. Jak wspomniano wyżej, korzystnymi związkami spośród związków objętych wzorem I(f), są związki objęte wzorem:

I(f') f¹f²f³WDf⁷Lf⁹KQf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ. ID. NO: 125).

Do związków objętych wzorem I(f') należą związki o sekwencjach SEQ ID NO: 32, 58, 60, 62, 63, 66, 67, 69, 70, 114, 115, 122, 123, 124, 147-150, 152-177, 179, 180, 187.

Związkami objętymi obecnym ujawnieniem są również związki zawierające zgodny motyw: PFPWE (SEQ. ID. NO: 110), które również wiążą TALL-1.

Ponadto, obecnie ujawnionymi związkami są także związki o wzorze:

I(g) g¹g²g³Cg⁵PFg⁸Wg¹⁰Cg¹¹g¹²g¹³ (SEQ. ID. NO. 101), gdzie:

g¹, g² oraz g³ oznaczają, każdy niezależnie, reszty aminokwasowe lub ich brak; g⁵ oznacza obojętną resztę hydrofobową; g⁸ oznacza obojętną resztę hydrofobową; g¹⁰ oznacza resztę kwasową;

g¹² oraz g¹³ oznaczają, każdy niezależnie, resztę aminokwasową; a g¹⁴ oznacza resztę aminokwasową lub jej brak.

I(h) h¹h²h³CWh⁶h⁷WGh¹⁰Ch¹²h¹³h¹⁴ (SEQ. ID. NO: 102), gdzie:

h¹, h² i h³ oznaczają, każdy niezależnie, reszty aminokwasowe lub ich brak;

h⁶ oznacza resztę hydrofobową;

h⁷ oznacza resztę hydrofobową;

h¹⁰ oznacza kwasową lub polarną resztę hydrofobową; a 12 13 14 h¹², h¹³, h¹⁴ oznaczają, każdy niezależnie, reszty aminokwasowe lub ich brak.

I(i) i¹i²i³Ci⁵ⁱ⁶i⁷i⁸i⁹i¹⁰Ci¹²i¹³i¹⁴ (SEQ. ID. NO: 103), gdzie oznacza resztę aminokwasową lub jej brak;

oznacza obojętną resztę hydrofobową;

³ oznacza resztę aminokwasową;

, i⁶, i⁷, i⁸ oznaczają, każdy niezależnie, resztę aminokwasową;

oznacza resztę kwasową ;

¹⁰ oznacza resztę aminokwasową; oraz i¹³ oznaczają , każ dy niezależ nie, resztę aminokwasową ; a oznacza oboję tną resztę hydrofobową .

Związki zdefiniowane przez wzory od I(g) do I(i) również wiążą TALL-1.

Ponadto, zgodnie z obecnym ujawnieniem, modulatory TALL-1 obejmują: a) domenę modulującą TALL-1 (przykładowo, sekwencję aminokwasową o wzorze od I(a) do I(i)), korzystnie sekwencję aminokwasową Dz²Lz⁴ lub sekwencje pochodne uzyskane metodą prezentacji fagowej, skriningu układów RNA-peptyd lub innymi technikami wymienionymi powyżej oraz b) podłoże, takie jak polimer (przykładowo PEG lub dekstran) lub domena Fc, która jest korzystnym podłożem, gdzie podłoże jest kowalencyjnie połączone z domeną modulującą TALL-1.

PL 210 546 B1

Podłoże oraz domena modulująca TALL-1 mogą być połączone przez N- lub C-koniec domeny modulującej TALL-1, jak to opisano poniżej. Korzystnym podłożem jest domena Fc, a korzystną domeną Fc jest domena IgG Fc. Takie pep-tydy związane z Fc są określane dalej terminem „ciała peptydowe.” Do korzystnych domen modulujących TALL-1 należą sekwencje aminokwasowe opisane poniżej w tablicach 1 i 2. Dalsze domeny modulujące TALL-1 mogą być generowane metodą prezentacji fagowej, skriningu układów RNA-peptyd oraz innymi, wymienionymi tu technikami.

Ponadto, obecnym ujawnieniem objęty jest także sposób wytwarzania modulatorów TALL-1, który obejmuje:

a. wybranie co najmniej jednego peptydu, który wiąże się z TALL-1; oraz

b. kowalencyjne przyłączenie wybranego peptydu do podłoża.

Korzystnym podłożem jest domena Fc. Etap (a) korzystnie prowadzi się dokonując wyboru sekwencji peptydowych z tablicy 2 poniżej lub z prezentacji fagowej, skriningu układów RNA-peptyd lub spośród sekwencji dostępnych przy użyciu innych, wymienionych tu technik.

Związki według obecnego wynalazku można wytwarzać standardowymi metodami syntezy, technikami rekombinacyjnego DNA lub dowolnymi innymi metodami wytwarzania peptydów i protein fuzyjnych. Związki według obecnego wynalazku, obejmujące części nie peptydowe można syntezować na drodze standardowych reakcji chemicznych, w połączeniu ze standardowymi reakcjami chemii peptydów, jeśli może to mieć zastosowanie.

Głównym zastosowaniem przewidzianym dla związków według obecnego wynalazku jest w pierwszym rzędzie ich użycie w charakterze środków terapeutycznych lub profilaktycznych. Peptyd związany z podłożem może posiadać aktywność porównywalną - lub nawet większą - jak naturalny ligand „naśladowany” przez ten peptyd.

Związki według obecnego wynalazku można stosować w celach terapeutycznych lub profilaktycznych po ich zmieszaniu (formulacji) z odpowiednimi farmaceutycznymi materiałami nośnikowymi, przez podawanie ich w skutecznej ilości pacjentom, takim jak człowiek (lub inny ssak) potrzebujący takiego środka. Inne, związane z tymi aspekty rozwiązania są również objęte obecnym wynalazkiem.

Liczne dalsze aspekty i korzyści płynące z obecnego wynalazku staną się zrozumiałe po przeanalizowaniu rysunków oraz szczegółowego opisu wynalazku.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia przykładowe dimery Fc, które mogą pochodzić z przeciwciała IgG1. „Fc” na rysunku oznacza dowolną spośród odmian Fc objętych definicją „domena Fc”. „X¹” oraz „X²” przedstawiają peptydy lub kombinacje linker-peptyd, zdefiniowane poniżej.

Szczególnymi dimerami są następujące dimery:

A, D: Dimery związane pojedynczym wiązaniem dwusiarczkowym. Przeciwciała IgG1 typowo posiadają dwa wiązania dwusiarczkowe w rejonie zawiasowym przeciwciała. Domena Fc na fig. 1A oraz 1D może być utworzona przez obcięcie pomiędzy obu miejscami zdolnymi do tworzenia wiązań dwusiarczkowych lub przez podstawienie reszty cysteinylowej resztą nie reaktywną (jak przykładowo alanyl). Na fig. 1A, domena Fc jest przyłączona do końca aminowego peptydów, a na fig. 1D - do końca karboksylowego.

B, E: Dimery podwójnie związane wiązaniem dwusiarczkowym. Taką domenę Fc można uzyskać przez obcięcie macierzystego przeciwciała zatrzymując obie reszty cysteinylowe w łańcuchach domeny Fc lub w wyniku ekspresji z konstruktu obejmującego sekwencję kodującą taką domenę Fc. Na fig. 1B, domena Fc jest przyłączona do końca aminowego peptydów, a na 1E - do końca karboksylowego.

C, F: Niekowalencyjne dimery. Taka domena Fc może być wytworzona w wyniku eliminacji reszt cysteinylowych albo przez obcięcie lub podstawienie. Eliminacja reszt cysteinylowych może być pożądana, gdy zależy na uniknięciu zanieczyszczeń, jakie mogą powstać w wyniku reakcji reszty cysteinylowej z resztami cysteinylowymi innych protein obecnych w komórce gospodarza. Niekowalencyjne wiązanie domen Fc jest wystarczające do utrzymania dimeru w całości. Inne dimery można wytworzyć stosując domeny Fc pochodzące z różnych rodzajów przeciwciał (przykładowo, IgG2, IgM).

Figura 2 ilustruje strukturę korzystnych związków według wynalazku, których cechą jest tandemowe powtórzenie farmakologicznie aktywnego peptydu. Fig. 2A przedstawia cząsteczkę jednołańcuchową, a może również reprezentować konstrukt DNA dla tej cząsteczki. Fig. 2B przedstawia dimer, w którym sekwencja linker-peptyd występuje w dimerze w tylko w jednym łańcuchu. Fig. 2C przedstawia dimer zawierający część peptydową w obu łańcuchach. Dimer przedstawiony na rysunku fig. 2C powstaje spontanicznie w niektórych komórkach gospodarza w wyniku ekspresji konstruktu DNA koPL 210 546 B1 dującego cząsteczkę jednołańcuchową przedstawioną na rysunku fig. 3A. W innych komórkach gospodarza komórki mogą utrzymywane w warunkach sprzyjających tworzeniu dimerów lub dimery można formować in vitro.

Figura 3 przedstawia przykładową sekwencję kwasu nukleinowego i sekwencję aminokwasową (odpowiednio SEQ ID NO: 1 i 2) ludzkiej domeny IgG1 Fc, którą można wykorzystać w obecnym wynalazku.

Figury 4A do 4F przedstawiają sekwencje nukleotydów oraz sekwencje aminokwasowe (SEQ ID NO: 3 do 27) S fragmentów od Ndel do SalI kodujących peptyd oraz linker.

Figury 5A do 5M przedstawiają sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO: 28) wektora pAMG21-RANK-Fc, który stosowano do skonstruowania cząsteczek związanych z Fc według obecnego wynalazku.

Rysunki te identyfikują szereg cech kwasu nukleinowego, w tym:

• obszary promotora PcopB, PrepA, RNAI, APHII, luxPR oraz luxPL;

• mRNA dla APHII, luxR;

• sekwencje kodujące i sekwencje aminokwasowe białek: proteina copB, copT, repAI, repA4, APHII, luxR, RANK oraz Fc;

• miejsca wiążące dla białek copB, CRP;

• spinki T1, T2, T7 oraz spinki typu „toop”;

• miejsce operatora dla proteiny lux;

• enzymatyczne miejsca restrykcyjne dla Pf11108I, BgllL Scal, BmnI, Drdll, Dralll, BstBI, Acelll, ĄflU, PflMI, Bgll, Sfil, BstEIL, BspLullI, NspV, Bpil, EagI, Bcgl, Nsil, Bsal, Psp1406I, AatII, BsmI, Nrul, Ndel, ApaLI, Acc65, KpnI, Sall, AccI, BspEI, Ahdl, BspHI, EconI, BsrGI, BamI, Smal, SexAI, BamHI, oraz Blpl.

Figury 6A do 6B przedstawiają sekwencję DNA (SEQ ID NO: 97) wstawioną do pCFM1656 między unikalnymi miejscami restrykcyjnymi Aatll (pozycja #4364 w pCFM1656) oraz SacII (pozycja #4585 w pCFM1656) z wytworzeniem plazmidu ekspresji pAMG21 (ATCC numer dostępu 98113).

Figura 7 wykazuje, że ciało peptydowe TALL-1 (SEQ ID NO: 70) inhibituje proliferację komórek B, w której uczestniczy TALL-1. Prowadzono trzy hodowle oczyszczonych komórek B (10⁵) pochodzących od myszy B6 na płytkach 96-studniowych ze wskazanymi ilościami zgodnego ciała peptydowego TALL-1 w obecności 10 ng/ml TALL-1 plus 2 μg/ml przeciwciała anty-IgM. Proliferację mierzono na podstawie przyswajania radioaktywnej [³H]tymidyny w ostatnich 18 h pulsu. Podane dane stanowią średnią ± odchylenie standardowe (SD) z trzech identycznych studni.

Figura 8 wykazuje, że ciała peptydowe N-końcowego dimeru tandemowego TALL-1 (SEQ ID NO: 123 i 124 w tablicy 5B, poniżej) są korzystne z punktu widzenia inhibitowania proliferacji komórek B, w której uczestniczy TALL-1. Prowadzono trzy hodowle oczyszczonych komórek B (10⁵) pochodzących od myszy B6 na płytkach 96-studniowych ze wskazanymi ilościami ciała peptydowego TALL-1 12-3 oraz zgodnego ciała peptydowego TALL-1 (SEQ ID NO: 115 oraz 122 z tablicy 5B) lub ciał peptydowych wskazanego dimeru (SEQ ID NO: 123, 124) w obecności 10 ng/ml TALL-1 plus 2 μg/ml przeciwciała anty-IgM. Proliferację mierzono na podstawie przyswajania radioaktywnej [³H]tymidyny w ostatnich 18 h pulsu. Podane dane stanowią średnią ± odchylenie standardowe (SD) z trzech identycznych studni.

Figura 9. Ciało peptydowe AGP3 wiąże się z AGP3 z dużym powinowactwem. Stałą równowagi dysocjacji (KD) otrzymano z nieliniowej regresji krzywych konkurencji stosując homogeniczny model wiązania w jednym miejscu z użyciem podwójnej krzywej (program KinEx^TM). KD wynosi około 4 pM w przypadku wiązania ciała peptydowego AGP3 z AGP3 człowieka (SEQ ID NO: 123).

Figury 10A oraz 10B. Ciało peptydowe AGP3 blokuje zarówno AGP3 człowieka, jak i myszy w teście konkurencji Biacore. Rozpuszczalne ludzkie białko TACI immobilizowano na chipie B1. 1 nM rekombinacyjnego białka AGP3 człowieka (górny panel) lub 5 nM rekombinacyjnego białka AGP3 myszy (niższy panel) inkubowano ze wskazaną ilością ciała peptydowego AGP3 przed naniesieniem na całą powierzchnię receptora. Przedstawiono względną odpowiedź na wiązanie AGP3 człowieka oraz AGP3 myszy (SEQ ID NO: 123).

Figury 11A oraz 11B. Ciało peptydowe AGP3 blokowało wiązanie AGP3 do wszystkich trzech receptorów TACI, BCMA oraz BAFFR w teście konkurencji Biacore. Rekombinacyjne rozpuszczalne białka receptorów TACI, BCMA oraz BAFFR unieruchomiono na chipie CM5. 1 nM rekombinacyjnego ludzkiego AGP3 (górny panel) inkubowano ze wskazaną ilością ciała peptydowego AGP3 przed naniesieniem na całą powierzchnię każdego receptora. Zmierzono względne wiązanie AGP3. Podobnie,

PL 210 546 B1 nM rekombinacyjnego białka APRIL inkubowano ze wskazaną ilością ciała peptydowego AGP3 przed naniesieniem na całą powierzchnię każdego receptora. Ciało peptydowe nie inhibituje wiązania APRIL z wszystkimi trzema receptorami. (SEQ ID NO: 123).

Figury 12A oraz 12B. Ciało peptydowe AGP3 inhibituje wzrost poziomu immunoglobuliny w mysiej surowicy indukowany przez podanie AGP3 człowieka. Myszom Balb/c podano przez dootrzewnową iniekcję 7 dziennych dawek 1 mg/Kg białka AGP3 człowieka z: solanką, ludzką domeną Fc lub ciałem peptydowym AGP3 we wskazanych ilościach. Myszy skrwawiono w ósmym dniu. Ogólny poziom IgM oraz IgA w surowicy oznaczono stosując testy ELISA (SEQ ID NO: 123).

Figura 13. Podawanie peptydowego ciała AGP3 obniżało nasilenie zapalenia stawu w mysim modelu CIA. Samce myszy DBA/1 w wieku od ośmiu do 12 tygodni immunizowano śródskórnie u nasady ogona stosując bydlęcy kolagenem typu II (bCII) przeprowadzony w emulsję w kompletnym adiuwancie Freunda, a po 3 tygodniach od wstępnej immunizacji przyspieszano rozwój choroby stosując bCII przeprowadzony w emulsję w niekompletnym adiuwancie Freunda. Podawanie wskazanej dawki ciała peptydowego AGP3 rozpoczęto od dnia powtórnej immunizacji i kontynuowano przez 4 tygodnie.

Jak to uprzednio opisano (Khare i wsp., J. Immunol. 155: 3653-9, 1995), wszystkie cztery łapy osobno oceniano w skali 0-3 pod kątem nasilenia objawów zapalenia stawu (SEQ ID NO: 123).

Figura 14. Podawanie ciała peptydowego AGP3 inhibitowało generowanie przeciwciała antykolagenowego w mysim modelu CIA. Próbki surowicy pobrano jeden tydzień (dzień 35) po ostatnim zabiegu opisanym wyżej. Poziom przeciwciała anty-kolagen II oznaczono w surowicy stosując zestawy analityczne ELISA (SEQ ID NO: 123).

Figury 15A oraz 15B. Podawanie ciała peptydowego AGP3 opóźniało wystąpienie proteinurii i zwiększało przeżywalność dotkniętych toczniem myszy NZB/NZW. Pięciomiesięczne myszy z pronami tocznia NZBx NZBWF1 leczono przez 8 tygodni podając dootrzewnowo 3 x na tydzień PBS lub wskazane dawki białka ciała peptydowego AGP3 (SEQ ID NO: 123) lub ludzkiej domeny Fc. Zawartość białka w moczu oznaczano co miesiąc przez cały czas trwania eksperymentu stosując paski z reagentem Albustix (Bayer AG).

Figury 16A oraz 16B przedstawiają sekwencję kwasu nukleinowego oraz sekwencję aminokwasów korzystnego ciała peptydowego wiążącego-TALL-1 (SEQ ID NO: 189 oraz 123).

Szczegółowy opis wynalazku

Definicje

Określenia stosowane w niniejszym opisie mają niżej podane znaczenie chyba, że zostały odmiennie zdefiniowane w ściśle określonych przypadkach.

Definicje ogólne

Określenie „zawierający” oznacza, że związek może obejmować dodatkowe aminokwasy na jednym z dwóch lub na obu końcach N- lub C- danej sekwencji. Oczywiście, te dodatkowe aminokwasy nie powinny istotnie kolidować z aktywnością danego związku.

Ponadto, fizjologicznie akceptowalne sole związków według obecnego wynalazku są tu przewidziane. Określenie „fizjologicznie dopuszczalne sole” odnosi się do dowolnych soli, które są znane lub zostaną później odkryte jako farmaceutycznie dopuszczalne. Oto kilka specyficznych ich przykładów: octan, trifluorooctan, chlorowcowodorki, takie jak chlorowodorek i bromowodorek, siarczan, cytrynian, winian, glikolan i szczawian.

Aminokwasy

Określenie „reszta kwasowa” odnosi się do reszt aminokwasowych w postaci form D- lub L-, posiadających łańcuchy boczne zawierające grupy kwasowe. Przykładowe reszty kwasowe obejmują D oraz E.

Określenie „reszta amidowa” odnosi się do aminokwasu w postaci form D- lub L-, posiadających łańcuchy boczne zawierające pochodne amidowe grup kwasowych. Przykładowe reszty obejmują N oraz Q.

Określenie „reszta aromatyczna” odnosi się do reszt aminokwasowych w postaci form D- lub L-, posiadających łańcuchy boczne zawierające grupy aromatyczne. Przykładowe reszty aromatyczne obejmują F, Y oraz W.

Określenie „reszta zasadowa” odnosi się do reszt aminokwasowych w formie D- L-, zawierających łańcuchy boczne obejmujące grupy zasadowe. Przykładowe reszty zasadowe obejmują H, K oraz R.

PL 210 546 B1

Określenie „reszta hydrofilowa” odnosi się do reszt aminokwasowych w formie D- lub L-, zawierających łańcuchy boczne obejmujące grupy polarne. Przykładowe reszty hydrofilowe obejmują C, S, T, N oraz Q.

Określenie „reszta bezfunkcyjna” odnosi się do reszt aminokwasowych w formie D- lub L-, zawierających łańcuchy boczne w których nie występują grupy kwasowe, zasadowe lub aromatyczne. Przykładowe bezfunkcyjne reszty aminokwasowe obejmują M, G, A, V, I, L oraz norleucynę (NIe).

Określenie „obojętna reszta hydrofobowa” odnosi się do reszt aminokwasowych w formie D- lub L-, zawierających łańcuchy boczne, w których nie występują grupy zasadowe, kwasowe lub polarne. Przykładowe obojętne aminokwasowe reszty hydrofobowe obejmują A, V, L, I, P, W, M oraz F.

Określenie „polarna reszta hydrofobowa” odnosi się do reszt aminokwasowych w formie D- lub L-, zawierających łańcuchy boczne obejmujące grupy polarne. Przykładowe polarne aminokwasowe reszty hydrofobowe obejmują T, G, S, Y, C, Q oraz N.

Określenie „reszta hydrofobowa” odnosi się do reszt aminokwasowych w formie D- lub L-, zawierającej łańcuchy boczne w których nie występują grupy zasadowe lub kwasowe. Przykładowe aminokwasowe reszty hydrofobowe obejmują A, V, L, I, P, W, M, F, T, G, S, Y, C, Q oraz N.

Peptydy

Określenie „peptyd” odnosi się do cząsteczek zbudowanych z 1 do 40 aminokwasów, korzystnie molekuł o 5 do 20 aminokwasach. Przykładowe peptydy mogą zawierać domenę modulującą TALL-1 molekuły występującej w przyrodzie lub zawierają sekwencje randomizowane („losowe”).

Określenie „losowe (randomizowane)” używane przy omawianiu sekwencji peptydowych odnosi się do w pełni losowych sekwencji (przykładowo, wybranych stosując prezentację fagową lub skrining układów RNA-peptyd) oraz do sekwencji, w których jedna lub więcej reszt w cząsteczkach występujących w przyrodzie jest zastąpiona przez resztę aminokwasową nie wy stępującą w tej pozycji w molekule występującej w przyrodzie. Przykładowe metody identyfikacji sekwencji peptydowych obejmują prezentację fagową, prezentację z E. coli, prezentację rybosomową, skrining układów RNA-peptyd, chemiczny skrining i tym podobne.

Określenie „domena modulująca TALL-1” odnosi się do dowolnej sekwencji aminokwasowej, która wiąże do TALL-1 i obejmuje występujące w przyrodzie sekwencje lub sekwencje randomizowane („losowe”). Przykładowe domeny modulujące TALL-1 można zidentyfikować lub wyprowadzić z prezentacji fagowej lub innymi metodami tutaj wymienionymi.

Określenie „antagonista TALL-1” odnosi się do cząsteczki, która wiąże się z TALL-1 i podwyższa lub obniża jeden lub więcej parametrów w prowadzonych testach w przeciwieństwie do wpływu, jaki na te parametry ma natywny TALL-1 pełnej długości. Taka aktywność może być oznaczona, przykładowo, w takich testach lub próbach, jak opisane w podsekcji zatytułowanej „Biologiczna aktywność AGP-3” w sekcji Materiały i Sposoby w zgłoszeniu patentowym zatytułowanym „TNF-RELATED PROTEINS” - WO 00/47740, publikacja: 17 sierpnia 2000 r.

Podłoża i ciała peptydowe

Określenie „podłoże” odnosi się do cząsteczki, która zapobiega degradacji i/lub powoduje wzrost okresu półtrwania, redukuje toksyczność, redukuje immunogeniczność lub powoduje wzrost biologicznej aktywności proteiny terapeutycznej. Przykładowe podłoża obejmują domenę Fc (która jest korzystna), jak również polimer liniowy (przykładowo glikol polietylenowy (PEG), polilizynę, dekstran, itp.); polimer o rozgałęzionym łańcuchu (patrz, przykładowo, patenty nr US nr 4 289 872 na rzecz Denkenwalter i wsp., wydany 15 września 1981; US nr 5 229 490 na rzecz Tam, wydany 20 lipca 1993; WO 93/21259 autor: Frechet i wsp., publikacja: 28 października 1993); lipid; grupę cholesterolową (przykładowo steroid); węglowodan lub oligosacharyd (przykładowo dekstran); dowolną naturalną lub syntetyczną proteinę, polipeptyd lub peptyd, który wiąże się z receptorem ratunkowym; albuminę, obejmującą albuminę z surowicy ludzkiej (HSA), suwakową domenę (zipper domain) leucyny oraz inne takie białka i fragmenty protein. Podłoża opisano poniżej.

Określenie „natywny Fc” odnosi się do molekuły lub sekwencji obejmującej sekwencję fragmentu nie wiążącego się z antygenem, powstającego w wyniku trawienia całego przeciwciała, zarówno w postaci monomerycznej, jak i multimerycznej. Pierwotnym źródłem immunoglobulinowym natywnego Fc jest korzystnie źródło pochodzenia ludzkiego i może nim być dowolna immunoglobulina, aczkolwiek korzystnymi immunoglobulinami są IgG1 oraz IgG2. Natywne Fc są zbudowane z monomerycznych polipeptydów, które mogą być połączone w dimeryczne lub multimeryczne formy przez więzy kowalencyjne (przykładowo przez wiązania dwusiarczkowe) i niekowalencyjne. Ilość międzymolekulamych wiązań dwusiarczkowych pomiędzy monomerycznymi podjednostkami cząsteczek natywnego

PL 210 546 B1

Fc zawiera się w przedziale od 1 to 4, w zależności od klasy (przykładowo: IgG, IgA, IgE) lub podklasy (przykładowo: IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2). Jednym z przykładów natywnego Fc jest dimer z wiązaniami dwusiarczkowymi otrzymany z IgG trawionej papaina (patrz Ellizon i wsp. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). Określenie „natywny Fc” stosowane tutaj oznacza ogólnie formy monomeryczne, dimeryczne oraz multimeryczne.

Określenie „odmiana Fc” odnosi się do molekuły lub sekwencji, która jest modyfikowana z natywnego Fc, lecz ciągle obejmuje miejsce wiążące receptor ratunkowy (salvage receptor) - FcRn. Międzynarodowe zgłoszenia wynalazku WO 97/34631 (publikacja: 25 września 1997) oraz WO 96/32478 opisują przykładowe odmiany Fc, jak również oddziaływanie z receptorem ratunkowym. A więc, określenie „odmiana Fc” obejmuje molekułę lub sekwencję, którą humanizowano z nie ludzkiego natywnego Fc. Ponadto, natywny Fc zawiera miejsca, które mogą być usunięte, gdyż wprowadzają cechy strukturalne oraz biologiczną aktywność, które nie są potrzebne w cząsteczkach fuzyjnych według obecnego wynalazku. Tak więc, określenie „odmiana Fc” obejmuje molekułę lub sekwencję, w której brakuje jednego lub większej liczby miejsc lub reszt występujących w natywnym Fc, które mają wpływ lub udział w (1) tworzeniu wiązania dwusiarczkowego, (2) niekompatybilności z wybraną komórką gospodarza, (3) heterogeniczności N-końca po ekspresji w wybranej komórce gospodarza, (4) glikozylacji, (5) oddziaływaniu z komplementem, (6) wiązaniu z receptorem Fc innym niż receptor ratunkowy lub (7) cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciała (ADCC). Odmiany Fc opisano szczegółowo w dalszej części opisu.

Określenie „domena Fc” obejmuje cząsteczki i sekwencje natywnego Fc oraz odmian Fc, zdefiniowane powyżej. Jak w przypadku odmian Fc oraz natywnych Fc, określenie „domena Fc” obejmuje molekuły w monomerycznej lub multimerycznej postaci, zarówno wytrawione z całego przeciwciała, jak i otrzymane innymi środkami.

Określenie „multimer” używane w odniesieniu do domeny Fc lub molekuł zawierających domeny Fc, odnosi się do cząsteczek posiadających dwa lub więcej niż dwa polipeptydowe łańcuchy zasocjowane kowalencyjnie, niekowalencyjnie lub przez oba typy oddziaływań: kowalencyjne i niekowalencyjne. Molekuły IgG typowo tworzą dimery, IgM - pentamery, IgD - dimery, zaś IgA - monomery, dimery, trimery lub tetramery. Multimery można wytworzyć wykorzystując sekwencję i wynikającą stąd aktywność natywnej Ig stanowiącej źródło Fc lub ma drodze derywatyzacji (w sposób opisany poniżej) natywnego Fc.

Określenie „dimer” użyte w przypadku domen Fc lub molekuł zawierających domeny Fc, odnosi się do molekuł posiadających dwa łańcuchy polipeptydowe zasocjowane kowalencyjnie lub niekowalencyjnie. Tak więc, przykłady dimerów objętych zakresem obecnego wynalazku przedstawiono na rysunku fig. 1.

Określenia „derywatyzacja” oraz „pochodna” lub „przekształcone w pochodną” obejmują odpowiednio sposoby oraz końcowe związki, w których (1) związek posiada część cykliczną; przykładowo, wiązanie sieciujące pomiędzy resztami cysteinylowymi wewnątrz związku tego; (2) związek jest związany wiązaniem sieciującym lub posiada miejsce wiązania sieciującego; przykładowo, związek posiada resztę cysteinylową i dlatego tworzy dimery w wyniku tworzenia wiązań sieciujących w hodowli lub in vivo; (3) jedno lub więcej połączeń peptydylowych jest zastąpione przez nie peptydylowe połączenie; (4) N-koniec jest zastąpiony przez -NRR¹, NRC(O)R¹, -NRC(O)OR¹, -NRS(O)2R¹, -NHC(O)NHR, grupę sukcynimidową lub podstawioną, bądź nie podstawioną grupę benzyloksykarbonylo-NH-, gdzie R oraz R¹ i podstawniki przy pierścieniu mają niżej podane znaczenie; (5) C-koniec jest zastąpiony przez -C(O)R² lub -NR³R⁴, gdzie R², R³ oraz R⁴ mają znaczenie podane poniżej oraz (6) związki, w których indywidualne reszty aminokwasowe są modyfikowane w wyniku reakcji ze środkami zdolnymi do reagowania z wybranymi łańcuchami bocznymi lub resztami końcowymi. Pochodne bliżej opisano w dalszej części.

Określenie „ciało peptydowe” i „ciała peptydowe” odnosi się do molekuł zawierających domenę Fc i co najmniej jeden peptyd. Takie ciała peptydowe mogą być multimerami lub dimerami, bądź ich fragmentami i mogą być zderywatyzowane. W obecnym wynalazku, molekuły o wzorach II do VI wskazanych poniżej są ciałami peptydowymi, gdy V¹ oznacza domenę Fc.

Budowa związków

Część ogólna

Obecni twórcy zidentyfikowali sekwencje zdolne do wiązania z TALL-1 oraz do modulowania aktywności biologicznej TALL-1. Sekwencje te mogą być modyfikowane technikami omówionymi wyPL 210 546 B1 żej, w wyniku czego jeden lub więcej niż jeden aminokwas może być zmieniony przy zachowaniu lub nawet poprawie powinowactwa do wiązania danego peptydu.

W czą steczkach wytwarzanych zgodnie z obecnym wynalazkiem peptyd ten (peptydy) można przyłączyć do podłoża N-końcem lub C-końcem. Dowolne spośród tych peptydów mogą być połączone tandemowo (to znaczy sekwencyjnie, jeden za drugim) poprzez linker lub bez linkerów. Tak więc, cząsteczki podłoże-peptyd według obecnego wynalazku mogą być opisane następującym wzorem II:

(X¹)a - V¹ - (X²)b (wzór II) gdzie:

V¹ oznacza podłoże (korzystnie domenę Fc);

2 1 1 1 1

X¹ i X² oznaczają, każdy niezależnie, resztę wybraną z grupy obejmującej -(L¹)c-P¹, -(L¹)c-P¹-(L²)d-P², -(L¹)c-P¹-(L²)d-P²-(L³)c-P³, -(L¹)c-P¹-(L²)d-P²-(L³)c-P³-(L⁴)f-P⁴;

P¹, P², P³ oraz P⁴, oznaczają, każdy niezależnie, sekwencje domen modulujących TALL-1, jak sekwencje o wzorach I(a) do I(i);

L¹, L², L³ oraz L⁴ oznaczają, każdy niezależnie, linkery, zaś a, b, c, d, e oraz f oznaczają, każdy niezależnie, 0 lub 1, z tym warunkiem, że co najmniej jeden z symboli a oraz b oznacza 1.

A więc, związek II obejmuje korzystne związki o wzorach III do VI:

X¹ - V¹ (wzór III) i ich multimery, gdzie V¹ oznacza domenę Fc przyłączoną do C-końca A¹;

V¹ - X¹ (wzór IV) i ich multimery, gdzie V¹ oznacza domenę Fc przyłączoną do N-końca A¹;

V¹ - (L¹)_c - P¹ (wzór V) i ich multimery, gdzie V¹ oznacza domenę Fc przyłączoną do N-końca -(L¹)c-P¹; oraz

V¹ - (L¹)_e - P¹ - (L²)^d - P² (wzór VI) i ich multimery, gdzie V¹ oznacza domenę Fc przyłączoną do N-końca -L¹-P¹-L²-P².

Peptydy

Peptydy według obecnego wynalazku są przydatne jako peptydy modulujące TALL-1 lub jako domeny modulujące TALL-1 w cząsteczkach o wzorach II do VI. Zgodnie z wynalazkiem, cząsteczki zawierające te sekwencje peptydowe można wytwarzać znanymi metodami.

Korzystne sekwencje peptydowe mają wyżej podane wzory I, w których podstawniki mają niżej podane znaczenie.

T a b l i c a 1

Korzystne podstawniki peptydowe

1	2
Wzór I(a)	a⁸ oznacza T; a⁹ oznacza resztę zasadową (najkorzystniej K); a a¹² oznacza obojętną resztę hydrofobową (najkorzystniej F).
Wzór I(b)	b³ oznacza D, Q lub E; b⁶ oznacza W lub Y; 10 b oznacza T; b¹¹ oznacza K lub R; a b¹⁴ oznacza V lub L.
Wzór I(c)	₉ c⁹ oznacza T; c¹⁰ oznacza K lub R; c¹³ oznacza a I, L lub V; a c¹⁷ oznacza A lub L.
Wzór I(d)	d¹² oznacza T.
Wzór I(e)	e¹¹ oznacza T.

PL 210 546 B1 cd tablicy 1

1	2
Wzór I(f)	f⁹ oznacza T; f¹⁰ oznacza K; a f¹³ oznacza V.
Wzór I(g)	g⁵ oznacza W; 8 g oznacza P; 10 g oznacza E; a 13 g¹³ oznacza resztę zasadową.
Wzór I(h)	h¹ oznacza G; h⁶ oznacza A; h⁷ oznacza obojętną resztę hydrofobową; a h¹⁰ oznacza resztę kwasową.
Wzór I(i)	i² oznacza W; a i¹⁴ oznacza W.

Korzystne sekwencje peptydowe przedstawiono poniżej w tablicy 2.

T a b l i c a 2

Korzystne domeny modulowane TALL-1

Sekwencja	SEQ ID NO:
1	2
PGTCFPFPWECTHA	29
WGACWPFPWECFKE	30
VPFCDLLTKHCFEA	31
GSRCKYKWDVLTKQCFHH	32
LPGCKWDLLIKQWVCDPL	33
SADCYFDILTKSDYCTSS	34
SDDCMYDQLTRMFICSNL	35
DLNCKYDELTYKEWCQFN	36
FHDCKYDLLTRQMVCHGL	37
RNHCFWDHLLKQDICPSP	38
ANQCWWDSLTKKNVCEFF	39
YKGRQMWDILTRSWWSL	126
QDVGLWWDILTRAWM PN I	127
QNAQRVWDLLIRTWVYPQ	128
GWNEAWWDELTKIWVLEQ	129
RITCDTWDSLIKKCVPQS	130
GAIMQFWDSLTKTWLRQS	131
WLHSGWWDPLTKHWLQKV	132
SEWFFWFDPLTRAQLKFR	133
GVWFWWFDPLTKQWTQAG	134
MQCKGYYDILTKWCVTNG	135
LWSKEVWDILTKSWVSQA	136
KAAGWWFDWLTKYWYPAP	137

PL 210 546 B1 cd tablicy 2

1	2
AYQTWFWDSLTRLWLSTT	138
SGQHFWWDLLTRSWTPST	139
LGVGQKWDPLTKQWVSRG	140
VGKMCQWDPLIKRTVCVG	141
CRQGAKFDLLTKQCLLGR	142
GQAIRHWDVLTKQWVDSQ	143
RGPCGSWDLLTKHCLDSQ	144
WQWKQQWDLLTKQMVWVG	145
PITICRKDLLTKQWCLD	146
KTCNGKWDLLTKQCLQQA	147
KCLKGKWDLLTKQCVTEV	148
RCWNGKWDLLTKQCIHPW	149
NRDMRKWDPLIKQWIVRP	150
QAAAATWDLLTKQWLVPP	151
PEGGPKWDPLTKQFLPPV	152
QTPQKKWDLLTKQWFTRN	153
IGSPCKWDLLTKQMICQT	154
CTAAGKWDLLTKQCIQEK	155
VSQCMKWDLLTKQCLQGW	156
VWGTWKWDLLTKQYLPPQ	157
GWWEMKWDLLTKQWYRPQ	158
TAQVSKWDLLTKQWLPLA	159
QLWGTKWDLLTKQYIQIM	160
WATSQKWDLLTKQWVQNM	161
QRQCAKWDLLTKQCVLFY	162
KTTDCKWDLLTKQRICQV	163
LLCQGKWDLLTKQCLKLR	164
LMWFWKWDLLTKQLVPTF	165
QTWAWKWDLLTKQWIGPM	166
NKELLKWDLLTKQCRGRS	167
GQKDLKWDLLTKQYVRQS	168
PKPCQKWDLLTKQCLGSV	169
GOIGWKWDLLTKQWIQTR	170
VWLDWKWDLLTKQWIHPQ	171
QEWEYKWDLLTKQWGWLR	172
HWDSWKWDLLTKQWWQA	173
TRPLQKWDLLTKQWLRVG	174
SDOWQKWDLLTKQWFWDV	175

PL 210 546 B1 cd tablicy 2

1	2
QQTFMKWDLLTKQWIRRH	176
QGECRKWDLLTKQCFPGQ	177
GQMGWRWDPLIKMCLGPS	178
QLDGCKWDLLTKQKVCIP	179
HGYWQKWDLLTKQWVSSE	180
HQGQCGWDLLTRIYLPCH	181
LHKACKWDLLTKQCWPMQ	182
GPPGSVWDLLTKIWIQTG	183
ITQDWRFDTLTRLWLPLR	184
QGGFAAWDVLTKMWITVP	185
GHGTPWWDALTRIWILGY	186
VWPWQKWDLLTKQFVFQD	187
WQWSWKWDLLTRQYISSS	188
NQTLWKWDLLTKQFITYM	60
PVYQGWWDTLTKLYIWDG	61
WLDGGWRDPLIKRSVQLG	62
GHQQFKWDLLTKQWVQSN	63
ORVGQFWDVLTKMFITGS	64
QAQGWSYDALIKTWIRWP	65
GWMHWKWDPLTKQALPWM	66
GHPTYKWDLLTKQWILQM	67
WNNWSLWDPLTKLWLQQN	68
WQWGWKWDLLTKQWVQQQ	69
GQMGWRWDPLTKMWLGTS	70

Zauważono, że znane receptory TALL-1 wykazują pewną homologiczność sekwencji z korzystnymi peptydami:

12-3 LPGCKWDLLIKOWVCDPL

BAFFR MRRGPRSLRGRDAPVPTPCVPTECYDLLVRKCVDCRLL

TACI TICNHQSQRTCAAFCRSLSCRKEQGKFYDHLLRDCISCASI

BCMA FVSPSQEIRGRFRRMLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRC (odpowiednio, SEQ ID NO: 33, 195, 196 oraz 197).

Dowolny peptyd zawierający resztę cysteiny Iową można połączyć wiązaniem sieciującym z innym peptydem zawierającym resztę Cys, z których dowolny lub obydwa mogą być połączone z podłożem. Dowolny peptyd zawierający więcej niż jedną resztę Cys może również tworzyć wewnątrzpeptydowe wiązanie dwusiarczkowe. Każdy z tych peptydów może być zderywatyzowany w sposób niżej opisany.

Dodatkowe użyteczne sekwencje peptydów mogą być wynikiem konserwatywnych (zachowawczych) i/lub niekonserwatywnych (niezachowawczych) modyfikacji sekwencji aminokwasowych podanych w tablicy 2.

Konserwatywne (zachowawcze) modyfikacje mogą dawać peptydy zawierające funkcjonalne i chemiczne właściwości podobne do własności peptydów, które poddano takim modyfikacjom. W przeciwieństwie do tego, zasadnicze modyfikacje funkcjonalnych i/lub chemicznych charakterystyk peptydów można uzyskać w wyniku doboru podstawień w sekwencji aminokwasowej, które dają zaPL 210 546 B1 sadniczo różny wpływ na zachowanie (a) struktury szkieletu cząsteczki w obszarze podstawiania, przykładowo konformacji w formie arkusza lub helisy, (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczki w danym miejscu lub (c) rozmiarów (wielkości) cząsteczki.

Przykładowo, „konserwatywne podstawienie aminokwasu” może obejmować podstawienie natywnej reszty aminokwasowej resztą nie natywną taką, że ma jedynie niewielki wpływ lub nie ma żadnego wpływu na polarność lub ładunek reszty aminokwasowej w tej pozycji. Ponadto, dowolna natywna reszta w polipeptydzie może również być podstawiona alaniną, jak uprzednio opisano w odniesieniu do „mutagenezy skanowania alaniną” (patrz, przykładowo, Mac-Lennan i wsp., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643: 55-67; Sasaki i wsp., 1998, Adv. Biophys. 35: 1-24, gdzie omówiono mutagenezę skanowania alaniną).

Biegli w sztuce mogą ustalić pożądane podstawienia aminokwasowe (zarówno konserwatywne, jak też nie konserwatywne), gdy takie podstawniki okażą się pożądane. Przykładowo, podstawienia aminokwasowe można wykorzystać do identyfikacji ważnych reszt sekwencji peptydu lub w celu zwiększenia lub obniżenia powinowactwa peptydu lub cząsteczek podłoże-peptyd (patrz poprzednie wzory). Przykładowe podstawienia aminokwasowe podano w tablicy 3.

T a b l i c a 3

Podstawienia aminokwasowe

Oryginalne reszty	Przykładowe podstawienia	Korzystne podstawienia
Ala (A)	Val, Leu, Ile	Val
Arg (R)	Lys, Gin, Asn	Lys
Asn(N)	Gin	Gin
Asp(D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser, Ala	Ser
Gin (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro, Ala	Ala
His (H)	Asn, Gin, Lys, Arg	Arg
Ile (I)	Leu, Val, Met, Ala, Phe, norleucyna	Leu
Leu (L)	norleucyna, Ile, Val, Met, Ala, Phe	Ile
Lys (K)	Arg, kwas 1,4-diaminobutyrowy, Gin, Asn	Arg
Met (M)	Leu, Phe, Ile	Leu
Phe (F)	Leu, Val, Ile, Ala, Tyr	Leu
Pro (P)	Ala	Gly
Ser (S)	Thr, Ala, Cys	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr, Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val (V)	Ile, Met, Leu, Phe, Ala, norleucyna	Leu

W pewnych wykonaniach, konserwatywne podstawienia aminokwasowe również obejmują nie występujące naturalnie reszty aminokwasowe, które typowo są raczej wprowadzane w toku chemicznej syntezy peptydów niż w wyniku syntez w systemach biologicznych.

Jak zauważono we wcześniejszej sekcji „Definicje”, reszty pochodzenia naturalnego mogą być podzielone na klasy w oparciu o wspólne właściwości łańcuchów bocznych, które mogą być użyteczne przy modyfikowaniu sekwencji. Przykładowo, nie zachowawcze podstawienia mogą obejmować wy18

PL 210 546 B1 mianę członu przynależnego do jednej z tych klas na człon z innej klasy. Tak podstawione reszty mogą być wprowadzone do obszarów peptydów homologicznych z nieludzkimi ortologami lub do nie homologicznych obszarów danej cząsteczki. Ponadto, można również wprowadzać modyfikacje stosując P lub G w celu wpływania na orientację łańcucha.

Przy wprowadzaniu takich modyfikacji, można brać pod uwagę hydropatyczny współczynnik aminokwasów. Każdemu aminokwasowi przypisano współczynniki hydropatyczny na podstawie właściwej mu charakterystyki hydrofobowości i ładunku, a mianowicie: izoleucyna (+4,5), walina (+4,2), leucyna (+3,8), fenyloalanina (+2,8), cysteina/cystyna (+2,5), metionina (+1,9), alanina (+1,8), glicyna (-0,4), treonina (-0,7), seryna (-0,8), tryptofan (-0,9), tyrozyna (-1,3), prolina (-1,6), histydyna (-3,2), kwas glutaminowy (-3,5), glutamina (-3,5), kwas asparaginowy (-3,5), asparagina (-3,5), lizyna (-3,9) oraz arginina (-4,5).

W tej dziedzinie docenia się wagę współczynnika (indeksu) hydropatycznego aminokwasów przy potwierdzaniu interaktywnego biologicznego działania białka. Kyte i wsp., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982). Wiadomo, że pewne aminokwasy mogą być podstawione za inne aminokwasy posiadające podobny współczynnik hydropatyczny lub wynik, a mimo to zachowana jest podobna aktywność biologiczna. Przy dokonywaniu zmian w oparciu o indeks hydropatyczny, korzystne są podstawienia aminokwasów o współczynnikach hydropatycznych ± 2, a zwłaszcza ± 1, a jeszcze korzystniej ± 0,5.

W tej dziedzinie wiadomo również, że podstawienie podobnych aminokwasów może być wykonane skutecznie w oparciu o hydrofilowość. Największa lokalna przeciętna hydrofilowość białka, na którą wpływa hydrofilowość sąsiednich aminokwasów, koreluje z jego immunogenicznością i antygenicznością, to znaczy z biologicznymi własnościami proteiny.

Resztom aminokwasowym przypisano następujące wartości hydrofilowości: arginina (+3,0), lizyna (+3,0), asparaginian (+3,0 ± 1), glutaminian (+3,0 ± 1), seryna (+0,3), asparagina (+0,2), glutamina (+0,2), glicyna (0), treonina (-0,4), prolina (-0,5 ± 1), alanina (-0,5), histydyna (-0,5), cysteina (-1,0), metionina (-1,3), walina (-1,5), leucyna (-1,8), izoleucyna (-1,8), tyrozyna (-2,3), fenyloalanina (-2,5), tryptofan (-3,4). Przy dokonywaniu zmian w oparciu o podobne wartości hydrofilowości, korzystne są podstawienia aminokwasów o wartościach ± 2, a zwłaszcza ± 1, a jeszcze korzystniej ± 0,5. Można również zidentyfikować epitopy z pierwszorzędowych sekwencji aminokwasowych na podstawie hydrofilowości. Te regiony określane są również terminem „epitopowe regiony rdzeniowe”.

Biegli w sztuce będą mogli określić odpowiednie warianty polipeptydu określonego wcześniej podanymi sekwencjami stosując dobrze znane techniki. W celu identyfikacji odpowiednich obszarów molekuł, które mogą być zmienione bez zniszczenia aktywności, biegły w sztuce może wytypować obszary uważane za nieistotne z punktu widzenia aktywności. Przykładowo, kiedy znane są podobne polipeptydy o podobnej aktywności pochodzące z tego samego gatunku lub od innych gatunków, biegły w sztuce może porównać sekwencję aminokwasową peptydu z podobnymi peptydami. Po takim porównaniu można zidentyfikować reszty i części cząsteczek, które występują w podobnych polipeptydach. Zostanie dostrzeżone, że zmiany w obszarach peptydu, które nie stanowią obszarów zachowawczych w stosunku do tych podobnych peptydów, powinny - z mniejszym prawdopodobieństwem - wpływać na aktywność biologiczną i/lub strukturę danego peptydu. Biegły w sztuce powinien również wiedzieć, że nawet w relatywnie zachowawczych regionach, można podstawić chemicznie podobne aminokwasy za reszty występujące w przyrodzie, z zachowaniem aktywności (konserwatywne podstawienia reszt aminokwasowych). Tak więc, nawet obszary, które mogą być ważne dla aktywności biologicznej lub struktury mogą podlegać konserwatywnym podstawieniom aminokwasów bez zniszczenia aktywności biologicznej lub bez niekorzystnego wpływu na strukturę peptydu.

Ponadto, biegły w sztuce może dokonać przeglądu badań nad związkami funkcji i struktury, identyfikując w podobnych peptydach reszty ważne dla aktywności biologicznej lub dla struktury. W świetle takiego porównania, można przewidzieć wagę reszt aminokwasowych w peptydzie, odpowiadających resztom aminokwasowym ważnym z punktu widzenia aktywności lub budowy podobnych peptydów. Biegły w sztuce może dokonać wyboru i wskazać chemicznie podobne podstawienia aminokwasowe dla takich dających się przewidzieć, ważnych reszt aminokwasowych (modyfikowanych) peptydów.

Biegły w sztuce może również przeprowadzić analizę trójwymiarowej struktury oraz sekwencji aminokwasowej w porównaniu z trójwymiarową strukturą podobnych polipeptydów. W świetle uzyskanych informacji biegły w sztuce może przewidzieć ustawienie reszt aminokwasowych peptydu względem jego trójwymiarowej struktury. Biegły w sztuce może dokonać wyboru niedokonywania radykalnych zmian w odniesieniu do reszt aminokwasowych, co do których można przewidywać, że występuPL 210 546 B1 ją na powierzchni proteiny, ponieważ takie reszty mogą być zaangażowane w ważne oddziaływaniami z innymi molekułami. Ponadto, biegły w sztuce może generować testowe odmiany zawierające pojedyncze podstawienie aminokwasowe przy każdej wybranej reszcie aminokwasowej. Odmiany mogą być następnie poddane skriningowi przy użyciu prób na aktywność znanych biegłym w sztuce. Takie dane mogłyby być użyte do gromadzenia informacji o odpowiednich wariantach. Przykładowo, gdyby się okazało, że zmiana przy określonej reszcie aminokwasowej powoduje zniszczenie, niepożądane obniżenie lub nieodpowiednią aktywność, odmian z taką zmianą należałoby unikać. Innymi słowy, w oparciu o informacje zebrane na podstawie takich rutynowych eksperymentów, biegły w sztuce może z łatwością ustalić aminokwasy, przy których należy unikać dalszych podstawień zarówno występujących samodzielnie, jak i w kombinacji z innymi mutacjami.

Wiele naukowych publikacji poświęcono przewidywaniu drugorzędowej struktury. Patrz: Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7 (4): 422-427 (1996), Chou i wsp., Biochemistry. 13 (2): 222-245 (1974); Chou i wsp., Biochemistry. 113 (2): 211-222 (1974); Chou i wsp., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978); Chou i wsp., Ann. Rev. Blochem., 47: 251-276 oraz Chou i wsp., Biophys. J., 26: 367-384 (1979). Ponadto, obecnie dostępne są programy komputerowo wspomagające przewidywanie drugorzędowej struktury. Jedna z metod przewidywania drugorzędowej struktury oparta jest o modelowanie homologii. Przykładowo, dwa polipeptydy lub proteiny, które w stopniu większym niż 30% wykazują identyczność sekwencję, albo podobieństwo w stopniu większym niż w 40%, mają często podobne topologie strukturalne. Obserwowany ostatnio rozwój baz danych dotyczących struktury białek (PDB) zapewnia zwiększoną przewidywalność struktury drugorzędowej, łącznie z ilością potencjalnych fałdowań w obrębie struktury polipeptydu lub białka. Patrz Holm i wsp., Nucl. Acid. Res., 27 (1): 244-247 (1999). Zasugerowano (Brenner i wsp., Curr. Op. Struct. Biol., 7 (3): 369-376 (1997)), że jest ograniczona ilość fałd w danym polipeptydzie lub proteinie oraz że jeśli krytyczna ilość struktur zostanie rozwiązana przewidywania struktury zyskają dramatycznie na dokładności.

Dodatkowe metody przewidywania drugorzędowej struktury obejmują „tkanie (threading)” (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7 (3): 377-87 (1997); Sippl i wsp., Structure, 4 (1): 15-9 (1996)), „analiza profilowa (profile analysis)” (Bowie i wsp., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov i wsp., Meth. Enzym., 183: 146-159 (1990); Gribskov i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci., 84 (13): 4355-8 (1987)), oraz „ewolucyjne łączenie (evolutionary linkage)” (patrz Home, jak wyżej, oraz Brenner, jak wyżej).

Podłoża

Zgodnie z obecnym wynalazkiem wymagana jest obecność co najmniej jednego podłoża (V¹) przyłączonego do peptydu, do jego N-końca lub C-końca lub do łańcucha bocznego jednej z reszt aminokwasowych. Można stosować również wiele podłoży, mogą przykładowo podłoża Fc być przyłączone do każdego końca lub podłoże Fc - przy jednym końcu, a grupa PEG przy drugim końcu lub przy łańcuchu bocznym. Do przykładowych podłoży należą:

• domena Fc;

• inne proteiny, polipeptydy lub peptydy zdolne do wiązania z receptorem ratunkowym (salvage receptor);

• albumina ludzkiej surowicy (HSA);

• suwakowa domena leucynowa (leucine zipper - LZ);

• glikol polietylenowy (PEG), w tym PEG o wymiarach 5 kD, 20 kD, oraz 30 kD oraz inne polimery;

• dekstran;

oraz inne cząsteczki, o których powszechnie wiadomo, że wydłużają okres półtrwania oraz zapewniają ochronę przed degradacją proteolityczną i usuwaniem z organizmu.

Korzystnym podłożem jest domena Fc. Domena Fc może być przyłączona w wyniku fuzji do końców N lub C peptydów, bądź do obu końców N i C. Fuzja do N-końca jest korzystna.

Jak wskazano wyżej, zgodnie z obecnym wynalazkiem odmiany Fc są odpowiednimi podłożami. Możliwa jest ekstensywna modyfikacja natywnego Fc z wytworzeniem odmiany Fc zgodnie z obecnym wynalazkiem, pod warunkiem zachowania zdolności wiązania do receptora ratunkowego; patrz, przykładowo WO 97/34631 oraz WO 96/32478. W takich odmianach Fc, można usunąć jedno lub więcej miejsc właściwych natywnemu Fc, zapewniających cechy strukturalnie lub funkcjonalną aktywność, zbędne w przypadku cząsteczek fuzyjnych według obecnego wynalazku. Można usuwać te miejsca przez, przykładowo, podstawienie lub usunięcie reszt, wstawienie reszt do miejsca lub obcięcie części obejmującej dane miejsce. Wstawionymi lub podstawionymi resztami mogą być również zmienione aminokwasy, takie jak peptydomimetyki lub D-aminokwasy.

PL 210 546 B1

Odmiany Fc mogą być również pożądane dla wielu powodów, z których kilka opisano poniżej. Przykładowe odmiany Fc obejmują cząsteczki oraz sekwencje w których:

1. Usunięte zostały miejsca zaangażowane w tworzenie wiązań (mostków) dwusiarczkowych. Takie usunięcie pozwala uniknąć reakcji z innymi proteinami zawierającymi cysteinę występującymi w komórce gospodarza, stosowanej do wytwarzania cząsteczek według obecnego wynalazku. W tym celu, segment zawierający cysteinę przy N-końcu może być obcięty lub reszty cysteinowe mogą być usunięte lub podstawione przez inne reszty aminokwasowe (przykładowo alanyl, seryl). W szczególności, można obciąć N-końcowy 20-aminokwasowy segment w sekwencji SEQ ID NO: 2 lub usunąć, bądź podstawić reszty cysteinowe w pozycjach 7 i 10 w sekwencji SEQ ID NO: 2. Nawet, gdy reszty cysteinowe zostaną usunięte, jednołańcuchowa domena Fc może nadal wytworzyć dimeryczną domenę Fc, spojoną nie kowalencyjnie.

2. Natywna domena Fc została zmodyfikowana tak, by poprawić kompatybilność z wybraną komórką gospodarza. Przykładowo, można usunąć sekwencję PA przy N-końcu typowej natywnej domeny Fc, rozpoznawaną przez trawiący enzym w E. coli, taki jak iminopeptydaza prolinowa. Można również dodać resztę metioninową przy N-końcu, zwłaszcza gdy cząsteczka podlega rekombinacyjnej ekspresji w komórce bakteryjnej takiej jak E. coli. Domena Fc w sekwencji SEQ ID NO: 2 stanowi jedną z takich odmian Fc.

3. Część N-końca natywnego Fc została usunięta w celu zapobieżenia N-końcowej heterogeniczności podczas ekspresji w wybranej komórce gospodarza. W tym celu, dowolna spośród pierwszych 20 reszt aminokwasowych przy N-końcu może być usunięta, zwłaszcza reszty w pozycjach 1, 2, 3, 4 oraz 5.

4. Jedno lub więcej miejsc glikozylacji zostało usunięte. Reszty, które w typowych warunkach ulegają glikozylacji (przykładowo asparagina) mogą być odpowiedzialne za odpowiedź cytolityczną. Takie reszty mogą być usunięte lub podstawione nieglikozylowanymi resztami (przykładowo alaniną).

5. Miejsca biorące udział w interakcjach z komplementem, takie jak miejsce wiążące Clq zostały usunięte. Przykładowo, można usunąć lub podstawić sekwencję EKK ludzkiego IgG1. Dobór komplementu może nie być korzystny dla molekuł według obecnego wynalazku i można tego uniknąć stosując opisaną odmianę Fc.

6. Miejsca mające wpływ na wiązanie z receptorami Fc innymi niż receptor ratunkowy. Natywna domena Fc może zawierać miejsca do oddziaływań z pewnymi białymi krwinkami, zbędne w przypadku cząsteczek fuzyjnych według obecnego wynalazku i mogą być zatem usunięte.

7. Usunięte zostało miejsce ADCC. Miejsca ADCC są znane; patrz, przykładowo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) w związku z miejscami ADCC w IgG1. Miejsca te także są zbędne w przypadku molekuł fuzyjnych według obecnego wynalazku, mogą zatem być usunięte.

8. Gdy natywna domena Fc pochodzi z przeciwciała nie ludzkiego, domena Fc może być poddana humanizacji. Typowo w celu humanizacji natywnego Fc można podstawić wybrane reszty w innej niż ludzka natywna domena Fc resztami, które normalnie występują w natywnej ludzkiej domenie Fc. Techniki humanizacji przeciwciała są dobrze znane biegłym w sztuce.

Korzystne odmiany Fc obejmują następujące sekwencje: w SEQ ID NO: 2 (rysunek fig. 3), leucyna w pozycji 15 może być podstawiona glutaminianem, glutaminian w pozycji 99 - alaniną, a lizyny w pozycjach 101 i 103 - alaninami. Ponadto, jedna lub więcej niż jedna spośród reszt tyrozynowych może być zastąpiona resztami fenyalaninowymi.

Alternatywnymi podłożami mogłyby być białko, polipeptyd, peptyd, przeciwciało, fragment przeciwciała lub mała molekuła (przykładowo związek peptydomimetyczny) zdolna do wiązania z receptorem ratunkowym. Przykładowo, można użyć w charakterze podłoża polipeptyd opisany w patencie nr US 5 739 277 wydanym 14 kwietnia 1998 na rzecz Presta i wsp. Peptydy mogłyby również być wybrane przez prezentację fagową lub skrining układów RNA-peptyd pod kątem wiązania do receptora ratunkowego FcRn. Takie związki wiążące się z receptorem ratunkowym są również objęte terminem „podłoże” i leżą w zakresie obecnego wynalazku. Takie podłoża powinny być wybrane w celu zwiększenia okresu półtrwania (przykładowo, dzięki unikaniu sekwencji rozpoznawanych przez proteazy) i obniżenia immunogeniczności (przykładowo dzięki uprzywilejowaniu nie immunogenicznych sekwencji, jak to stwierdzono w przypadku humanizacji przeciwciał).

Jak zauważono powyżej, jako V¹ można także stosować podłoża polimerowe. Obecnie dostępne są różne środki do przyłączania chemicznych ugrupowań przydatnych w charakterze podłoża, patrz, przykładowo publikacja nr WO 96/11953, dokonana zgodnie z układem o współpracy patentowej (PCT), zatytułowana „Kompozycje zawierające N-końcowo, chemicznie modyfikowane białka oraz

PL 210 546 B1 sposoby” („N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods”). Ta publikacja PCT ujawnia, poza innymi zagadnieniami, selektywne przyłączanie rozpuszczonych w wodzie polimerów do N-końców białek.

Korzystnym podłożem polimerowym jest glikol polietylenowy (PEG). Grupa PEG może mieć dowobią dogodną masę cząsteczkową i może mieć charakter liniowy lub rozgałęziony. Korzystny przedział wartości masy cząsteczkowej PEG zawiera się w granicach od około 2 kilodaltonów („kD”) do około 100 kD, korzystniej od około 5 kD do około 50 kD, najkorzystniej od około 5 kD do około 10 kD. Grupy PEG będą zasadniczo przyłączane do związków według obecnego wynalazku na drodze acylowania lub redukcyjnego alkilowania z udziałem reaktywnej grupy obecnej w reszcie PEG (przykładowo grupy aldehydowej, aminowej, tiolowej lub estrowej) oraz reaktywnej grupy obecnej w związku według wynalazku (przykładowo grupy aldehydowej, aminowej lub estrowej).

Strategia przydatna przy PEGylowaniu syntetycznych peptydów polega na łączeniu - przez tworzenie skoniugowanego połączenia w roztworze, peptydu i PEG, z których każdy posiada specjalną grupę funkcyjną zdolną do reakcji z grupą obecną w drugim reagencie. Takie peptydy można z łatwością wytworzyć znaną metodą syntezy w fazie stałej. Takie peptydy są „wstępnie aktywowane” przez wprowadzenie odpowiedniej grupy funkcyjnej w określone miejsce. Prekursory poddaje się oczyszczeniu i ustala się ich pełną charakterystykę przed poddaniem reakcji z resztą PEG. Ligowanie peptydu z użyciem PEG zwykle zachodzi w fazie wodnej i może być z łatwością monitorowane stosując analityczną chromatografię HPLC z odwróconymi fazami. PEGylowane peptydy można z łatwością oczyszczać stosując preparatywną chromatografię HPLC i scharakteryzować wykorzystując analityczną chromatografię HPLC, analizę aminokwasów i laserową desorpcyjną spektrometrię masową.

Polimery polisacharydowe są innym rodzajem rozpuszczalnych w wodzie polimerów, które można stosować w celu modyfikacji białek. Dekstrany są polimerami polisacharydowymi zbudowanymi z poszczególnych podjednostek glukozy, połączonych w przeważającej mierze wiązaniami α1-6. Sam dekstran cechuje się szerokim wachlarzem wartości masy cząsteczkowej i łatwo dostępne są jego formy o masie cząsteczkowej od około 1 kD do około 70 kD. Dekstran jest odpowiednim polimerem rozpuszczalnym w wodzie do stosowania w obecnym wynalazku jako podłoże samodzielnie lub w połączeniu z innym podłożem (przykładowo Fc). Patrz, przykładowo, WO 96/11953 oraz WO 96/05309. Opisano już stosowanie dekstranu w połączeniu z immunoglobulinami terapeutycznymi lub diagnostycznymi; patrz, przykładowo publikacja nr EP 0 315 456. Gdy dekstran jest stosowany jako podłoże zgodnie z obecnym wynalazkiem, korzystnie jest to dekstran o masie około 1 kD do około 20 kD.

Linkery

Grupa „linkera” jest grupą opcjonalną. Gdy jest obecna, jej budowa chemiczna nie ma charakteru krytycznego, ponieważ służy ona przede wszystkim jako element dystansujący. Korzystnie, linker jest zbudowany z aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. A więc, w korzystnych wykonaniach, linker zbudowany jest z 1 do 30 aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi, przy czym aminokwasy są wybrane spośród 20 występujących w przyrodzie aminokwasów. Niektóre z tych aminokwasów mogą być glikozylowane, co jest w pełni zrozumiałe dla znawców tej dziedziny. W korzystniejszym wykonaniu, każdy z 1 do 20 aminokwasów jest wybrany z grupy obejmującej: glicynę, alaninę, prolinę, asparaginę, glutaminian, i lizynę. Jeszcze korzystniej, linker zbudowany jest w większości z aminokwasów wolnych od zawad sferycznych, takich jak glicyna and alanina. Tak więc, korzystnymi linkerami są poliglicyny (szczególnie (Gly)4, (Gly)5, poli(Gly-Ala) oraz polialaniny. Innymi szczególnymi przykładami linkerów są:

(Gly)3Lys(Gly)4 (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (Gly)3Cys(Gly)4

GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 40), (SEQ ID NO: 41), (SEQ ID NO: 42), (SEQ ID NO: 43).

Dla wyjaśnienia powyższej nomenklatury, przykładowo: (Gly)3Lys(Gly)4 oznacza Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 40). Kombinacje Gly oraz Ala są również korzystne. Przedstawione tutaj linkery są jedynie przykładami; linkery wchodzące w zakres obecnego wynalazku mogą być dużo dłuższe i mogą obejmować także inne reszty.

Korzystnymi linkerami są linkery aminokwasowe obejmujące więcej niż 5 aminokwasów, przy czym odpowiednie linkery zawierają do około 500 aminokwasów wybranych spośród aminokwasów,

PL 210 546 B1 takich jak: glicyna, alanina, prolina, asparagina, glutaminian, lizyna, treonina, seryna lub asparaginian. Najkorzystniejsze są linkery od około 20 do 50 aminokwasów. Jedną grupę korzystnych linkerów stanowią linkery o wzorze:

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx¹x² (SEQ ID NO: 193) oraz

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx¹x²GSGSATGGSGSTASSGSGSATx³x⁴(SEQ ID NO: 194) gdzie x¹ oraz x² oznaczają, każdy niezależnie, resztę zasadową lub hydrofobową a x³ oraz x⁴ oznaczają, każdy niezależnie, reszty hydrofobowe. Szczególnie korzystnymi linkerami są:

GSGSATGGSGSTASSGSGSATHM (SEQ ID NO: 59),

GSGSATGGSGSTASSGSGSATGM (SEQ ID NO: 190),

GSGSATGGSGSTASSGSGSATGS (SEQ ID NO: 191), oraz

GSGSATGGSGSTASSGSGSATHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHM (SEQ ID NO: 192).

Nie peptydowe linkery są również możliwe. Przykładowo, mogłyby być wykorzystane linkery alkilowe takie jak -NH-(CH2)s-C(O)-, gdzie s = 2-20. Te linkery alkilowe mogą być dodatkowo podstawione przez dowolną grupę nie stanowiącą zawady sterycznej, taką jak niższy alkil (przykładowo C1-C6) niższy acyl, chlorowiec (przykładowo Cl, Br), CN, NH2, fenyl i tp. Przykładem nie peptydowego linkera jest linker PEG o wzorze VII

w którym n przyjmuje taką wartość, że linker posiada masę cząsteczkową od 100 do 5000 kD, korzystnie 100 do 500 kD. Linkery peptydowe mogą być zmieniane, z wytworzeniem pochodnej, w ten sam sposób jak opisano powyżej.

Pochodne

Obecni wynalazcy uwzględnili również derywatyzację związków według wynalazku w części peptydowej i/lub części stanowiącej podłoże. Takie pochodne mogę poprawiać rozpuszczalność związków, absorpcję, okres biologicznego półrozpadu i temu podobne. Wprowadzane w ten sposób ugrupowania mogą alternatywnie eliminować lub osłabiać wszelkie niepożądane efekty uboczne tych związków i odgrywać tym podobne role. Przykładowe pochodne obejmują związki, w których:

1. Cały związek lub pewna jego część ma budowę cykliczną. Przykładowo, część peptydu może być modyfikowana tak, że zawiera dwie lub więcej niż dwie reszty Cys (przykładowo, w linkerze), które mogą cyklizować przez utworzenie wiązania dwusiarczkowego.

2. Związek jest połączony wiązaniem sieciującym lub zmodyfikowany tak, że jest zdolny utworzyć wiązanie sieciujące między różnymi cząsteczkami. Przykładowo, część peptydowa może być modyfikowana tak, aby zawierała jedną resztę Cys i skutkiem tego mogła utworzyć międzycząsteczkowe wiązanie dwusiarczkowe z drugą podobną cząsteczką. Związek może również być związany wiązaniem sieciującym utworzonym przez jego C-koniec, jak w cząsteczce o wzorze VIII, przedstawionej poniżej:

PL 210 546 B1

We wzorze VIII, każdy fragment „V¹” może typowo reprezentować jednoniciowe domeny Fc.

3. Jedno lub więcej niż jedno peptydylowe [-C(O)NR-] połączenie (wiązanie) jest zastąpione przez połączenie nie peptydylowe. Przykładami nie peptydylowych połączeń są: -CH2-karbaminian [-CH2-OC(O)NR-], fosfonian, -CH2-sulfonamid [-CH2-S(O)2NR-], mocznik [-NHC(O)NH-], -CH2-drugorzędowa amina oraz alkilowany peptyd [-C(O)NR⁶-, gdzie R⁶ oznacza niższy alkil].

4. N-koniec jest zderywatyzowany. W typowym przypadku, N-koniec może być zacylowany lub zmodyfikowany do podstawionej aminy. Przykłady pochodnych N-końcowych grup obejmują: -NRR¹(inne niż -NH2), -NRC(O)R¹, -NRC(O)OR¹, -NRS(O)2R¹, -NHC(O)NHR,¹ imid kwasu bursztynowego, lub benzyloksykarbonylo-NH-(CBZ-NH-), gdzie R oraz R¹ oznaczają, każdy niezależnie, wodór lub niższy alkil i gdzie pierścień fenylowy może być podstawiony przez 1 do 3 podstawników wybranych z grupy obejmującej: C1-C4 alkil, C1-C4 alkoksy, chloro oraz bromo.

5. Wolny C-koniec jest zderywatyzowany. W typowym przypadku C-koniec jest zestryfikowany lub zamidowany. Przykłady grup pochodnych grup C-końcowych obejmują, przykładowo, -C(O)R², gdzie R² oznacza niższą grupę alkoksy lub -NR³R⁴, gdzie R³ oraz R⁴ oznaczają, każdy niezależnie, wodór lub C1-C8 alkil (korzystnie C1-C4 alkil).

6. Wiązanie dwusiarczkowe jest zastąpione innym, korzystnie bardziej stabilnym, ugrupowaniem zdolnym do tworzenia wiązań sieciujących (przykładowo alkilenem). Patrz, przykładowo, Bhatnagar i wsp. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9; Alberts i wsp. (1993) Thirteenth Am. Pep. Svmp., 357-9.

7. Jedna lub więcej niż jedna pojedyncza reszta aminokwasowa jest zmodyfikowana. Znane są różne środki derywatyzujące, zdolne do reakcji z wybranymi łańcuchami bocznymi lub grupami końcowymi, jak szczegółowo opisano poniżej.

Reszty lizynylowe i końcowe grupy aminowe mogą być poddane reakcji z bezwodnikiem bursztynowym lub bezwodnikami innych kwasów karboksylowych, które odwracają ładunek reszt lizynylowych. Iime stosowne reagenty do derywatyzowania reszt zawierających grupy alfa-aminowe obejmują imidoestry takie jak metylopikolinoimidan; fosforan pirydoksalu; pirydoksal; chloroborowodorek; kwas trinitrobenzenosulfonowy; O-metyloizomocznik; 2,4 pentanodion; a także reakcja z glioksalanem katalizowana przez transaminazę.

Reszty arginylowe mogą być modyfikowane na drodze reakcji z dowolnym znanym reagentem lub z kombinacją konwencjonalnych reagentów, do których zalicza się fenyloglioksal, 2,3-butanodion, 1,2-cykloheksanodion oraz ninhydrynę. Derywatyzacja reszt arginylowych wymaga prowadzenia reakcji w środowisku alkalicznym z uwagi na dużą wartość pKa guanidynowej grupy funkcyjnej. Ponadto, reagenty te mogą reagować z grupami lizyny, jak również grupą epsilon-aminową argininy.

Obszernie badano specyficzne modyfikacje reszt tyrozylowych, ze szczegóbiym uwzględnieniem wprowadzania spektralnych znaczników do reszt tyrozylowych na drodze reakcji z aromatycznymi związkami dwuazoniowymi lub z tetranitrometanem. Najpowszechniej, N-acetyloimidizol oraz tetranitrometan są stosowane do otrzymywania, odpowiednio, układów O-acetylotyrozylowych i 3-nitropochodnych.

Grupy karboksylowe z łańcuchów bocznych (aspartyl lub glutamyl) mogą być selektywnie modyfikowane na drodze reakcji z karbodiimidami (R'-N=C=N-R'), takimi jak 1-cykloheksylo-3-(2-morfolinylo-(4-etylo)karbodiimid lub 1-etylo-3-(4-azonia-4,4-dimetylopentylo)karbodiimid. Ponadto, reszty aspartylowa i glutamylowa mogą być przekształcone w reszty asparaginylowe i glutaminylowe na drodze reakcji z jonami amonowymi.

Reszty glutaminylową i asparaginylową można zdeaminować do odpowiednich reszt glutamylowej i aspartylowej. Alternatywnie, reszty te są deaminowane w średnio kwaśnych warunkach. Każda z postaci tych reszt jest objęta zakresem obecnego wynalazku.

Reszty cysteinylowe mogą być zastąpione przez reszty aminokwasowe lub inne ugrupowania, bądź to w celu eliminowania możliwości tworzenia wiązań dwusiarczkowych lub odwrotnie - w celu stabilizowania wiązań sieciujących. Patrz, przykładowo, Bhatnagar i wsp. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9.

Derywatyzacja przy użyciu środków dwufunkcyjnych jest użyteczna w celu utworzenia wiązania sieciującego między peptydami lub ich funkcjonalnymi pochodnymi i nierozpuszczalnymi w wodzie matrycami lub innymi makromolekularnymi nośnikami. Powszechnie wykorzystywane środki sieciujące obejmują, przykładowo: 1,1-bis(diazoacetylo)-2-fenyloetan, aldehyd glutarowy, estry N-hydroksybursztynoimidowe, przykładowo estry kwasu 4-azydosalicylowego, homobifunkcyjne imidoestry, obejmujące estry dibursztynoimidylowe takie, jak 3,3'-ditiobis(bursztynoimidylopropionian) oraz bifunkcyjne imidy kwasu maleinowego, takie jak bis-N-maleimido-1,8-oktan. Środki derywatyzujące, takie jak me24

PL 210 546 B1 tylo-3-[(p-azydofenylo)ditio]propioimidan prowadzą do wytworzenia związków pośrednich ulegających fotoaktywacji, zdolnych do sieciowania w obecności światła. Alternatywnie, reaktywne matryce nierozpuszczalne w wodzie takie jak węglowodany aktywowane bromkiem dwucyjanu oraz reaktywne substraty opisane w patentach US nr 3 969 287; US nr 3 691 016; US nr 4 195 128; US nr 4 247 642; US nr 4 229 537 oraz US nr 4 330 440 wykorzystuje się do związania i unieruchomienia białek.

Grupy węglowodanowe (oligosacharydy) można dogodnie przyłączać do miejsc znanych jako miejsca glikozylacji w białkach. Ogólnie, połączenia oligosacharydów przez atom tlenu występują w przypadku reszt serynowych (Ser) lub treoninowych (Thr), podczas gdy połączenia oligosacharydów przez atom azotu występują w przypadku reszt asparaginowych (Asn), gdy są one częścią sekwencji Asn-X-Ser/Thr, gdzie X może być dowobym aminokwasem z wyjątkiem proliny. Korzystnie, X oznacza jeden z 19 występujących w przyrodzie aminokwasów innych niż prolina. Stwierdzono, że struktury N-połączonych oraz O-połączonych oligosacharydów i reszty cukrowe w każdym rodzaju są różne. Jednym rodzajem cukru spotykanym powszechnie w obu typach jest kwas N-acetyloneuraminowy (określany jako kwas sialowy). Kwas sialowy jest zwykle końcową resztą na oligosacharydach połączonych przez atom azotu oraz przez atom tlenu, a dzięki swemu negatywnemu ładunkowi, może nadawać właściwości kwasowe związkowi zglikozylowanemu. Takie miejsce(a) można wstawiać do linkerów związków według obecnego wynalazku i korzystnie glikozylacja następuje przez komórki podczas rekombinacyjnego wytwarzania związków polipeptydowych (przykładowo w komórkach ssaków takich jak CHO, BHK, COS). Jednakże, takie miejsca można dodatkowo glikozylować znanymi metodami syntetycznymi lub znanymi metodami semisyntetycznymi.

Inne możliwe modyfikacje obejmują hydroksylację proliny oraz lizyny, fosforylację grup hydroksylowych reszt serylowych lub treonylowych, utlenianie atomu siarki w Cys, metylowanie grup alfaaminowych w łańcuchach bocznych lizyny, argininy oraz histydyny. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pp. 79-86 (1983).

Związki według wynalazku mogą być także zmieniane na poziomie DNA. Sekwencja DNA jakiejkolwiek części związku może być zmieniona na kodony bardziej kompatybilne z wybraną komórką gospodarza. W przypadku E. coli, która jest korzystną komórką gospodarza, znane są zoptymalizowane kodony. Kodony mogą być podstawione w celu eliminacji miejsc restrykcyjnych lub w celu włączenia uśpionych miejsc restrykcyjnych, które mogą wspomagać przetwarzanie DNA w wybranej komórce gospodarza. Sekwencje DNA podłoża, linkera oraz peptydu można zmodyfikować tak, aby obejmowały one dowolną spośród wymienionych wyżej zmian sekwencji.

Sposoby wytwarzania

Związki według obecnego wynalazku w znacznej mierze można wytworzyć w transformowanych komórkach gospodarza przy użyciu technik rekombinacyjnych DNA. Aby to zrealizować, przygotowuje się rekombinacyjną cząsteczkę DNA kodującą dany peptyd. Sposoby wytwarzania takich molekuł DNA są znane w stanie techniki. Przykładowo, sekwencje kodujące peptydy mogłyby być wycięte z DNA przy użyciu właściwych enzymów restrykcyjnych. Alternatywnie, cząsteczkę DNA można zsyntezować przy użyciu technik syntezy chemicznej, takich jak metoda fosforamidonowa. Można także wykorzystywać kombinacje tych technik.

Wynalazkiem objęty jest również wektor do ekspresji peptydów w odpowiednim gospodarzu. Wektor zawiera cząsteczkę DNA, kodującą peptydy operacyjnie połączone z właściwymi sekwencjami kontroli ekspresji. Dobrze znane są sposoby realizacji takiego powiązania operacyjnego przed albo po wstawieniu molekuły DNA do wektora. Sekwencje kontroli ekspresji obejmują promotory, aktywatory, czynniki usprawniające, operatory, rybosomowe miejsca wiążące, sygnały startowe, sygnały stopujące, sygnały nakładkowe, sygnały poliadenylacji oraz inne sygnały obejmujące kontrolę transkrypcji i translacji.

Otrzymany wektor z zawartą w nim cząsteczką DNA stosuje się w celu transformowania odpowiedniego gospodarza. Transformację taką można prowadzić stosując metody dobrze znane w stanie techniki.

Przy realizacji obecnego wynalazku można wykorzystać dowolną z dużej ilości dostępnych i dobrze znanych komórek gospodarzy. Wyselekcjonowanie szczególnego gospodarza zależy od wielu czynników znanych w stanie techniki. Obejmują one, przykładowo, kompatybilność z wybranym wektorem ekspresji, toksyczność peptydów kodowanych przez molekułę DNA, toksyczność peptydów kodowanych przez daną cząsteczkę DNA, szybkość transformacji, łatwość wyodrębniania uzyskanych peptydów, charakterystyki ekspresji, bezpieczeństwo biologiczne i koszty. Równowagi tych czynników należy szukać rozumiejąc, że nie wszystkie komórki gospodarza mogą być równie efektywne dla eksPL 210 546 B1 presji danej szczególnej sekwencji DNA. W ramach tych ogólnych wytycznych, użyteczne komórki gospodarza spośród drobnoustrojów obejmują: bakterie (takie jak gatunku E. coli), komórki drożdży (takich jak gatunku Sacharomyces) i innych grzybów, owadów, roślin, ssaków (włącznie z człowiekiem) w hodowli, bądź inne znane w tej dziedzinie komórki gospodarzy.

Następnie, prowadzi się hodowlę transformowanego gospodarza i oczyszczanie. Komórki gospodarza można hodować w konwencjonalnych warunkach fermentacji tak, aby następowała ekspresja pożądanych związków. Takie warunki fermentacji są dobrze znane w stanie techniki. W końcu, peptydy oczyszcza się z hodowli metodami dobrze znanymi w stanie techniki.

Obecne związki można również wytwarzać metodami syntetycznymi. Przykładowo, mogą być stosowane techniki syntezy w fazie stałej. Odpowiednie techniki są dobrze znane w stanie techniki i obejmują metody opisane w: Merrifield (1973), Chem. Polipeptyds. str. 335-61 (Katsoyannis & Panayotis ed.); Merrifield (1963), J. Arn. Chem. Soc. 85: 2149; Davis i wsp. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart i Young (1969), Solid Fase Peptvd Synthesis: w patencie nr US 3 941 763; Finn I wsp. (1976), The Proteins (wydanie trzecie) 2: 105-253; oraz Erickson i wsp. (1976), The Proteins (wydanie trzecie) 2: 257-527. Synteza w fazie stałej jest korzystną techniką wytwarzania pojedynczych peptydów, gdyż jest ona najbardziej efektywna pod względem kosztów wytwarzania małych peptydów.

Związki, które obejmują zderywatyzowane peptydy lub które zawierają nie peptydowe grupy można otrzymywać na drodze syntezy dobrze znanymi technikami chemii organicznej.

Zastosowanie obecnych związków

Związki według obecnego wynalazku mogą być szczególnie przydatne w leczeniu chorób autoimmunologicznych, w których pośredniczą komórki B. W szczególności, związki według obecnego wynalazku mogą być przydatne w leczeniu, zapobieganiu, łagodzeniu, diagnozowaniu lub prognozowaniu stanów obejmujących toczeń, w tym ogólnoustrojowy toczeń rumieniowaty (SLE), a także choroby i stany towarzyszące toczniowi. Inne korzystne wskazania obejmują raki, w których pośredniczą komórki B, w tym chłoniaka komórek B.

Związki według obecnego wynalazku mogą również być stosowane w stanach zapalnych stawów. Stany zapalne stawów oraz przewlekłe choroby stawów dotykają i czynią kalekami, w zróżnicowanym stopniu, miliony ludzi na świecie. Reumatoidalne zapalenie stawów jest chorobą połączeń stawowych, w których chrząstka i kość ulegają powolnej erozji pod wypływem proliferującej, inwazyjnej tkanki łącznej, tak zwanej łuszczki, która pochodzi z błony mazi stawowej. Choroba może dotyczyć struktur okołostawowych, takich jak torebki, otoczki ścięgien i ścięgna, jak również tkanek pozastawowych, takich jak tkanka podskórna, tkanki układu sercowo-naczyniowego, płuc, śledziony, węzłów chłonnych, mięśni szkieletowych, układu nerwowego (centralnego i obwodowego) oraz oczu (Silberberg (1985), Anderson's Pathology, Kissane (ed.), 11: 1828). Osteoartroza stanowi powszechną chorobę zwyrodnieniową stawów, charakteryzującą się zwyrodnieniowymi zmianami w chrząstkach stawowych oraz odpowiedzią w formie proliferacji kości i chrząstki wokół zaatakowanego stawu. Zwyrodnieniowa choroba stawów jest aktywnym procesem zachodzącym z mediacją komórkową, który może stanowić nieprawidłową odpowiedź chondrocytów na bodźce kataboliczne i anaboliczne. Zgodnie z doniesieniami, we wczesnych fazach osteoartrozy występują zmiany w niektórych molekułach matrycy chrząstek stawowych (Thonar i wsp. (1993), Rheumatic disease clinics of North America, Moskowitz (ed.), 19: 635-657 oraz Shinmei i wsp. (1992), Arthritis Rheum., 35: 1304-1308). Panuje przekonanie, że TALL-1, TALL-1R i ich modulatory są użyteczne w leczeniu tych stanów i stanów z nimi związanych.

Związki według obecnego wynalazku mogą być również być przydatne w leczeniu szeregu innych chorób i zaburzeń chorobowych, wśród których należy wymienić następujące stany:

• ostre zapalenie trzustki, • ALS, • choroba Alzheimera, • astma, • arterioskleroza, • autoimmunologiczna anemia hemolityczna, • rak, w szczególności nowotwory związane z komórkami B, • kacheksja /anoreksja, • syndrom chronicznego zmęczenia, • marskość (przykładowo pierwotna marskość żółciowa), • cukrzyca (przykładowo cukrzyca insulinowa),

PL 210 546 B1 • gorączka, • zapalenie kłębuszkowe nerek, w tym zapalenie kłębuszkowe nerek związane z IgA oraz pierwotne zapalenie kłębuszkowe nerek, • syndrom Goodpasture'a, • syndrom Guillaina-Barre'a, • choroba odrzucenia przeszczepu, • zapalenie tarczycy Hashimoto, • szok krwotoczny, • przeczulica słuchowa, • zapalenie jelita, • stany zapalne stawów, w tym osteoartroza, łuszczycowe zapalenie stawów oraz reumatoidalne zapalenie stawów, • stany zapalne wynikające z wyczerpania, zwichnięcia, uszkodzenia chrząstki, urazu, operacji ortopedycznej, infekcji lub innych procesów chorobowych, • cukrzyca zależna od insuliny, • uszkodzenie z niedokrwieniem, łącznie z niedokrwieniem mózgu (przykładowo uszkodzenie mózgu na skutek urazu, epilepsji, wylewu lub udaru, z których każde może prowadzić do neurodegeneracji), • przeuczenie, • choroby płuc (przykładowo ARDS), • szpiczak rozsiany, • stwardnienie rozsiane, • ciężka miastenia, • białaczki mielogenniczne (przykładowo AML i CML) oraz inne, • miopatie (przykładowo metabolizm białka mięśni, zwłaszcza w sepsie), • neurotoksyczność (przykładowo wywołana przez HIV), • osteoporoza, • ból, • choroba Parkinsona, • pęcherzyca, • zapalenie wielomięśniowe/zapalenie skórno-mięśniowe, • zapalenie płuc, obejmujące autoimmunologiczne zapalenie płuc, • poród przedwczesny, • łuszczyca, • choroba Reitera, • defekt reperfuzyjny, • szok septyczny, • efekty uboczne towarzyszące radioterapii, • syndrom Sjogrena, • zaburzenie snu, • przejściowa choroba stawu żuchwowego, • trombocytopenia, wraz z idiopatyczną trombocytopenią oraz autoimmunologiczną trombocytopenią noworodków, • rak w fazie przerzutów, • zapalenie błony naczyniowej gałki ocznej oraz • zapalenie naczyń.

Związki według obecnego wynalazku mogą być podawane samodzielnie lub w połączeniu z terapeutycznie skuteczną ilością innych środków farmaceutycznych, obejmujących środki znieczulające, leki przeciwreumatyczne modyfikujące przebieg choroby (DMARD), nie sterydowe leki przeciwzapalne (NSAID) oraz dowolne modulatory immunologiczne i/lub modulatory stanów zapalnych. A więc, łącznie ze związkami według obecnego wynalazku mogą być podawane następujące środki:

• modulatory innych członków rodziny TNF/receptora TNF, obejmującej antagonisty TNF, takie jak etanercept (Enbrel™), sTNF-RI, onercept, D2E7 i Remicade™, • modulatory czynnika wzrostu nerwu (NGF),

PL 210 546 B1 • inhibitory IL-1, obejmują ce molekuł y IL-lra, takie jak anakinra i ostatnio odkryte czą steczki podobne do IL-lra, takie jak IL-lHyl oraz IL-lHy2; cząsteczki-„pułapki” IL-1 opisane w patencie nr US 5 844 099, wydanym 1 grudnia, 1998; przeciwciała IL-1; rozpuszczalny receptor IL-1 i tym podobne, • inhibitory IL-6 (przykładowo przeciwciała do IL-6), • inhibitory IL-8 (przykładowo przeciwciała do IL-8), • inhibitory IL-18 (przykładowo proteina wiążąca IL-18, rozpuszczony receptor IL-18 lub przeciwciała IL-18), • modulatory enzymu konwertują cego interleukinę -1 (ICE), • insulinopodobne czynniki wzrostu (IGF-1, IGF-2) i ich modulatory, • transformujący czynnik wzrostu -β (TGF-β), członkowie rodziny TGF-β ^oraz modulatory TGF-β, • czynniki wzrostu fibroblastów od FGF-1 do FGF-10 oraz modulatory FGF, • osteoprotegeryna (OPG), analogi OPG, czynniki osteoochronne oraz przeciwciała do ligandu OPG (OPG-L), • środki anaboliczne kości, takie jak hormon przytarczyc (PTH), fragmenty PTH i cząsteczki zawierające fragmenty PTH (przykładowo PTH (l-34)-Fc), • antagoniści PAF, • czynnik wzrostu keratynocytu (KGF), cząsteczki pokrewne KGF (przykładowo KGF-2) oraz modulatory KGF, • inhibitory COX-2, takie jak Celebrex™ oraz Vioxx™, • analogi prostaglandyny (przykładowo, prostaglandyny serii E), • modulatory matrycy metaloproteinazy (MMP), • modulatory syntazy tlenku azotu (NOS) obejmujące modulatory indukowalnej syntazy NOS, • modulatory receptora glukokortykoidu, • modulatory receptora glutaminianu, • modulatory poziomów lipopolisacharydów (LPS), • środki przeciwrakowe, obejmujące inhibitory onkogenów (przykładowo fos, jun) oraz interferony, • noradrenalina oraz jej modulatory i mimetyki.

Kompozycje farmaceutyczne

Część ogólna

Obecny wynalazek zapewnia również sposoby stosowania farmaceutycznych kompozycji związków według wynalazku. Takie farmaceutyczne kompozycje można podawać przez iniekcję lub doustnie, dopłucnie, donosowo, podskórnie lub innymi drogami podawania. Generalnie, obecny wynalazek obejmuje kompozycje farmaceutyczne zawierające skuteczne ilości związku według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalne rozcieńczalniki, środki konserwujące, solubilizujące, emulsyfikatory, adiuwanty i/lub nośniki. Takie kompozycje zawierają rozcieńczalniki o różnej zawartości buforów (przykładowo Tris-HCl, octan, fosforan), różnym pH oraz sile jonowej; dodatki, takie jak detergenty i środki solubilizujące (przykładowo Tween 80, Polisorbate 80), antyutleniacze (przykładowo kwas askorbinowy, metabisiarczyn sodu), środki konserwujące (przykładowo Thimersol, alkohol benzylowy) oraz substancje „objętościowe” (przykładowo laktozę, mannitol); a także uwzględniają włączenie materiału czynnego do preparatów drobnoziarnistych ze związków polimerycznych, takich jak kwas polimlekowy, kwas poliglikolowy i tp. lub do lipozomów. Można również wykorzystać kwas hialuronowy i w ten sposób uzyskać efekt przedłużonej obecności leku w organizmie. Takie kompozycje mają wpływ na stan fizyczny, stabilność, szybkość uwalniania in vivo oraz szybkość usuwania z organizmu in vivo obecnych białek i pochodnych. Patrz, przykładowo, publikacja Remington's Pharmaceutical Sciences, wydanie 18 (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) strony 1435-1712. Kompozycje mogą być wytwarzane w postaci ciekłej lub mogą być w postaci suchego proszku, takiego jak postać zliofilizowana. Uwzględniono także implantowalne formulacje o przedłużonym uwalnianiu, takie jak preparaty śródskórne.

Formy do podawania doustnego

Dla obecnych kompozycji właściwe są formy nadające się do podawania doustnego w postaci stałej, które opisano ogólnie w rozdziale 89 w publikacji Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), wydanie 18, Mack Publishing Co. Easton PA 18042. Formy do podawania w postaci stałej obejmują tabletki, kapsułki, pigułki, pastylki lub opłatki. Można również wykorzystać otoczki lipozomalne lub proteinoidowe przy formułowania obecnych kompozycji (jak, przykładowo, proteinoidowe mikrosfery opisane w patencie nr US 4 925 673). Można wykorzystywać otoczkowanie lipozomami, a lipozomy mogą być derywatyzowane przy użyciu różnych polimerów (przykładowo patent nr US 5 013 556).

PL 210 546 B1

Opis możliwych form do podawania leków w postaci stałej podano w rozdziale 10 pracy Marshalla, K., Modern Pharmaceutics (1979), w edycji G. S. Banker i C. T. Rhodes. Generalnie, forma galeniczna będzie obejmować związki według wynalazku oraz składniki obojętne, zapewniające ochronę przed środowiskiem żołądka i uwalnianie biologicznie aktywnego materiału w jelitach.

Szczególną uwagę poświęcono stałym postaciom do doustnego podawania związków według wynalazku. Jeżeli to konieczne, związki można chemicznie zmodyfikować, aby doustne podawanie było skuteczne. Generalnie, uwzględniono modyfikację chemiczną polegającą na przyłączeniu do cząsteczki obecnego związku co najmniej jednej innej reszty, pozwalającą na (a) inhibitowanie proteolizy oraz (b) przenikanie do strumienia krwi z żołądka lub jelit. Pożądany jest również ogólny wzrost stabilności związku i wydłużenia czasu cyrkulacji w organizmie. Cząsteczki przydatne zgodnie z obecnym wynalazkiem w charakterze podłoża przyłączanego kowalentnie do obecnych związków mogą również być wykorzystywane w obecnie omawianym celu. Przykłady takich ugrupowań obejmują: PEG, kopolimery glikolu etylenowego i glikolu propylenowego, karboksymetylocelulozę, dekstran, alkohol poliwinylowy, poliwinylopirolidon oraz poliprolinę. Patrz, przykładowo, Abuchowski i Davis, Soluble Polimer-Enzvme Adducts. Enzymes as Drugs (1981), Hocenberg i Roberts, ed., Wiley-Interscience, New York, NY, str. 367-83; Newmark i wsp. (1982), J. Appl. Biochem. 4: 185-9. Innymi polimerami, które mogą być użyte, są poli-1,3-dioksolan i poli-1,3,6-tioksokan. Do celów wykorzystania farmaceutycznego w wyżej omówionym zakresie korzystne są reszty PEG.

W przypadku form do podawania doustnego można również stosować sól zmodyfikowanego aminokwasu alifatycznego, takiego jak sól sodowa kwasu N-(8-[2-hydroksybenzoilo]amino)kaprylowego (SNAC), jako nośnik zwiększający wchłanianie terapeutycznych związków według wynalazku. Kliniczną skuteczność heparyny w kompozycji z SN AC wykazano w fazie II badań klinicznych prowadzonych przez Emisphere Technologies. Patrz, patent nr US 5 792 451 „Oral drug delivery composition and methods”.

Związki według obecnego wynalazku można włączać do finalnych form jako preparaty drobnocząsteczkowe w postaci granulek lub płatków o wymiarach cząstek około 1 mm. Do podawania w postaci kapsułek można przygotować te materiały w postaci proszku, lekko sprasowanych rdzeni, a nawet tabletek. Środek leczniczy można przeprowadzić w finalną postać przez sprasowanie.

Można dodać także środki barwiące oraz smakowo-zapachowe. Przykładowo, obecne białko (lub pochodna) może być włączone w kompozycję (przykładowo przez zamknięcie w lipozomie lub mikrosferze), a następnie w tej formie dodane do produktu jadabiego takiego jak napój schłodzony zawierający środki barwiące i smakowo-zapachowe.

Można rozcieńczać lub zwiększać objętość kompozycji związku według wynalazku przez dodanie materiału obojętnego. Rozcieńczalniki takie mogłyby obejmować węglowodany, zwłaszcza mannitol, α-laktozę, bezwodną laktozę, celulozę, sacharozę modyfikowane dekstrany i skrobię. Pewne nieorganiczne sole można także wykorzystywać jako wypełniacze. Zalicza się do nich trójfosforan wapnia, węglan magnezu i chlorek sodu. Mogą to również być handlowo dostępne rozcieńczalniki Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress i Avicell.

Dezintegranty mogą stanowić składnik środka leczniczego w postaci stałej. Materiały stosowane jako dezintegranty obejmują, lecz nie wyłącznie, skrobię, łącznie z handlowo dostępnym preparatem dezintegrującym opartym na skrobii - Explotab, sodowy glikolan skrobiowy, Amberlite, sól sodową karboksymetylocelulozy, ultramylopektynę, alginian sodu, żelatynę, skórkę pomarańczową, karboksymetylocelulozę w postaci kwasowej, naturalną gąbkę oraz bentonit. Inną grupę środków dezintegrujących stanowią nierozpuszczalne żywice kationowymienne. Jako substancje dezintegrujące oraz wiążące mogą być stosowane także sproszkowane gumy, do których zalicza się sproszkowane gumy takie jak agar, guma Karaya lub guma tragakantowa. Kwas alginowy oraz jego sól sodowa są także przydatne jako dezintegranty.

Lepiszcza mogą być stosowane, aby zlepić środek leczniczy w całość i uformować twardą tabletkę. Właściwymi materiałami z produktów naturalnych są guma akacjowa, tragakantowa, skrobia i żelatyna. Inne materiały do tego celu obejmują metylocelulozę (MC), etylocelulozę (EC) oraz karboksymetylocelulozę (CMC). Poliwinylopirolidon (PVP) oraz hydroksypropylmetylocelulozę (HPMC) można stosować w postaci roztworów alkoholowych, aby wytworzyć zgranulowany środek leczniczy.

Środek zmniejszający tarcie może także stanowić składnik środka leczniczego, w celu zapobiegania przywierania masy do urządzeń podczas wytwarzania form galenicznych. Na ścianach dysz, w celu oddzielenia ich od środka leczniczego można przy formulacji stosować środki smarujące, które mogą obejmować - lecz nie wyłącznie: kwas stearynowy oraz jego sole magnezową i wapniową, poliPL 210 546 B1 tetrafluoroetylen (PTFE), ciekłą parafinę, oleje roślinne i woski. Można również stosować rozpuszczalne środki smarujące takie jak siarczan sodowo-laurylowy, siarczan magnezowo-laurylowy, glikol polietylenowy o różnych masach cząsteczkowych, Carbowax 4000 i 6000.

Można także dodawać środki poślizgowe, które mogą poprawić przepływ (własności sypne) leku podczas formulacji i wspomagać zmianę postaci podczas sprasowywania. Środki takie obejmują skrobię, talk, pirogeniczną krzemionkę oraz uwodniony krzemoglinian.

W celu ułatwienia rozpuszczania związku aktywnego według obecnego wynalazku w środowisku wodnym można dodać środek powierzchniowo czynny jako środek zwilżający. Środki powierzchniowo czynne mogą obejmować detergenty anionowe takie jak siarczan sodowo-laurylowy, sulfobursztynian dioktylo-sodowy i sulfonian dioktylo-sodowy. Można stosować detergenty kationowe, takie jak chlorek benzalkoniowy lub chlorek benzetoniowy. Lista potencjalnych niejonowych detergentów, które można włączyć do kompozycji jako środki powierzchniowoczynne obejmuje: lauromacrogol 400, stearynian polioksylu 40, pohoksyetylen z uwodornionym olejem rącznikowym 10, 50 oraz 60, monostearynian gliceryny, polisorbat 40, 60, 65 oraz 80, estry sacharozy i kwasów tłuszczowych, metylocelulozę oraz karboksymetylocelulozę. Te środki powierzchniowoczynne mogą kompozycji zawierającej obecne białko lub pochodną występować samodzielnie albo w postaci mieszanin o różnych proporcjach.

Do kompozycji można wprowadzać także dodatki zwiększające wchłanianie związku aktywnego. Dodatkami potencjalnie mającymi te właściwości są, przykładowo, kwasy tłuszczowe, kwas oleinowy, kwas linolowy oraz kwas linolenowy.

Pożądana może być forma leku o kontrolowanym uwalnianiu. Związki według obecnego wynalazku mogą być osadzone w obojętnej matrycy, która umożliwia uwalnianie albo przez dyfuzję albo dzięki mechanizmom wymywania, przykładowo w gumy. Matryce ulegające powolnej degeneracji mogą być również wykorzystywane przy wytwarzaniu tej formy leku - formulacji. Przykładowo są to alginiany, polisacharydy, Inna postać zdolna do kontrolowanego uwalniania związków według obecnego wynalazku oparta jest na systemie terapeutycznym Oros (Alza Corp.), co oznacza, że lekarstwo jest otoczone półprzepuszczalną membraną, która pozwala na przenikanie do środka wody i wypieranie stamtąd lekarstwa przez jeden mały otwór, na zasadzie osmozy. Niektóre powłoki jelitowe również zapewniają efekt powolnego uwalniania.

Wykorzystywać można także inne powleczenia. Obejmują one różnorodne cukry, które można nanosić w powlekarce. Środek leczniczy może mieć również postać tabletki powleczonej cienką błoną, do wykonania której można użyć materiałów, które z kolei można podzielić na dwie grupy. Pierwsza zawiera materiały niejelitowe i obejmuje metylocelulozę, etylocelulozę, hydroksyetylocelulozę, metylohydroksyetylocelulozę, hydroksypropylocelulozę, hydroksypropylometylocelulozę, sól sodową karboksymetylocelulozy, prowidon oraz glikole polietylenowe. Druga grupa obejmuje materiały jelitowe, którymi są zwykłe estry kwasu ftalowego.

W celu uzyskania optymalnego powleczenia można stosować mieszanki materiałów. Nanoszenie powłoki w formie błonki można prowadzić w powlekarce talerzowej lub w złożu fluidalnym lub stosując powlekanie ciśnieniowe.

Formy do podawania dopłucnego

Uwzględniono tu również podawanie dopłucne obecnego białka (lub jego pocłiodnych). Proteina (lub pochodna) dostarczona do płuc ssaków podczas inhalacji przenika przez nabłonkowe wyścielenie płuc do krwioobiegu, (inne doniesienia na ten temat obejmują Adjei i wsp., Farma. Res. (1990) 7: 565-9; Adjei i wsp. (1990), Intematl. J. Farmaceutics 63: 135-44 (octan leuprolidu); Braquet i wsp. (1989), J. Cardiovasc. Farmacol. 13 (suplement 5): str.143-146 (endotelina-1); Hubbard i wsp. (1989), Annals Int. Med. 3: 206-12 (a1-antytrypsyna); Smith i wsp. (1989), J. Clin. Invest. 84: 1145-6 (a1-proteinaza); Oswein i wsp. (March 1990), „Aerosolization of Proteins”, Proc. Svmp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (rekombinacyjny ludzki hormon wzrostu); Debs i wsp. (1988), J. Immunol. 140: 3482-8 (interferon-γ oraz TNF-α) oraz Platz i wsp., patent nr US 5 284 656 (czynnik stymulujący kolonie granulocytów).

Rozważano odnośnie praktycznego wykorzystania obecnego wynalazku stosowanie szerokiego wachlarza mechanicznych urządzeń przeznaczonych do dopłucnego podawania środków leczniczych. Urządzenia te obejmują - lecz nie wyłącznie: nebulizery, inhalatory z dozownikami oraz inhalatory proszkowe, z których wszystkie są dobrze znane biegłym w sztuce. Niektórymi szczególnymi przykładami handlowo dostępnych urządzeń nadających się do wykorzystania w praktycznych realizacjach obecnego wynalazku są: nebulizer Ultravent, produkowany przez Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; nebulizer Acorn II, produkowany przez Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; inhala30

PL 210 546 B1 tor z dozownikiem typu Ventolin, produkowany przez Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina oraz inhalator proszkowy Spinhaler, produkowany przez Fizons Corp., Bedford, Massachusetts.

Wszystkie tego rodzaju urządzenia wymagają stosowania preparatów odpowiednich do uwalniania związków według obecnego wynalazku. Zazwyczaj, każdy preparat dostosowany jest do określonego typu stosowanego urządzenia i może obejmować wykorzystanie odpowiedniego materiału zapewniającego lotność i odpowiednie rozproszenie, obok rozcieńczalników, substancji pomocniczych i/lub nośników użytecznych w leczeniu.

Związek według obecnego wynalazku powinien najkorzystniej być przetworzony w postać drobnoziarnistą o wymiarach cząstek mniejszych niż 10 μm, najkorzystniej 0,5 do 5 μm, w celu najbardziej efektywnego podawania do dalekich obszarów płuc.

Farmaceutycznie akceptowalne nośniki obejmują węglowodany, takie jak trehaloza, mannitol, ksylitol, sacharoza, laktoza i sorbitol. Inne składniki do stosowania w preparatach mogą obejmować DPPC, DOPE, DSPC oraz DOPC. Mogą być stosowane naturalne lub syntetyczne środki powierzchniowoczynne. Można stosować PEG (nawet niezależnie od jego wykorzystania do derywatyzacji obecnego białka lub analoga). Można stosować też dekstrany, takie jak cyklodekstran. Sole żółciowe oraz inne środki wspomagające (enhancery) mogą być także wykorzystywane. Odpowiednim dodatkiem może też być celuloza lub pochodne celulozy. Mogą być stosowane aminokwasy, przykładowo w celu buforowania.

Uwzględniono również stosowanie lipozomów, mikrokapsułek lub mikrosfer, kompleksów inkluzyjnych lub innych rodzajów nośników.

Preparaty odpowiednie do stosowania w nebulizerze dyszowym lub też ultradźwiękowym, typowo obejmować będą związek według obecnego wynalazku rozpuszczony w wodzie w stężeniu od około 0,1 do 25 mg biologicznie czynnego białka na 1 ml roztworu. Preparat taki może również zawierać bufor i prosty cukier (przykładowo w celu stabilizacji proteiny i regulowania ciśnienia osmotycznego). Preparat do podawania w postaci mgły przy użyciu nebulizera może również zawierać środek powierzchniowo czynny, w celu zmniejszenia lub przeciwdziałania indukowanej powierzchniowej agregacji białka, powodowanej przez rozpylanie roztworu podczas tworzenia aerozolu.

Formulacja do stosowania urządzenia do inhalacji z dozownikiem będzie - generalnie - obejmować subtelnie rozdrobniony proszek zawierający związek według obecnego wynalazku zawieszony w ośrodku rozpraszającym, zapewniającym lotność, dzięki użyciu środka powierzchniowo czynnego. Ośrodkiem rozpraszającym zapewniającym lotność może być dowolny znany materiał stosowany w tym celu, taki jak węglowodór podstawiony chlorem i fluorem całkowicie lub częściowo, to jest chlorofluorowęglowodór, fluorowęglowodór albo węglowodór, w tym trichlorofluorometan, dichlorodifluorometan, dichlorotetrafluoroetanol oraz 1,1,1,2-tetrafluoroetan lub ich mieszaniny. Odpowiednie środki powierzchniowo czynne obejmują trioleinian sorbitanu oraz lecytynę sojową. Jako środek powierzchniowo czynny może być również stosowany kwas oleinowy.

Preparaty do podawania przy użyciu inhalatora proszkowego zawierają subtelnie rozdrobniony suchy proszek zawierający związek według obecnego wynalazku i mogą również zawierać środek zwiększający objętość i masę taki jak laktoza, sorbitol, sacharoza, mannitol, trehaloza lub ksylitol w ilościach, które ułatwiają dyspergowanie proszku z urządzenia, przykładowo od 50 do 90% wagowych w przeliczeniu na masę preparatu.

Formy do podawania donorowego

Uwzględniono również podawanie donosowe związków według obecnego wynalazku. Dostarczanie donosowe pozwala wprowadzać białko aktywne do krwioobiegu bezpośrednio po podaniu donosowo środka leczniczego, bez konieczności wprowadzania tego środka do płuc. Preparaty do podawania donosowego zawierają dekstran lub cyklodekstran. Uwzględniono także podawanie oparte na transporcie przez inne błony śluzowe,

Dawkowanie

Reżim dawkowania w leczeniu wyżej określonych stanów musi być określony przez lekarza prowadzącego, z uwzględnieniem różnych czynników, które modyfikują działanie leków, jak przykładowo wiek, stan, masa ciała, płeć i dieta pacjenta, ostrość infekcji, czas podawania i inne czynniki kliniczne. Generalnie, dzienna dawka powinna zawierać się w przedziale 0,1-1000 mikrogramów związku według obecnego wynalazku, na każdy kilogram masy ciała, korzystnie 0,1-150 mikrogramów na kilogram.

PL 210 546 B1

Szczególnie korzystne przykłady wykonania

Wynalazcy obecni określili korzystne struktury dla korzystnych peptydów wymienionych poniżej w tablicy 4. Symbol „Λ” oznacza dowolny linker opisany wyżej lub może po prostu reprezentować normalne wiązanie peptydowe (to znaczy, gdy nie ma żadnego linkera). Powtórzenia tandemowe i linkery wyodrębniono dla jasności przez użycie myślników.

T a b l i c a 4

Korzystne przykłady wykonania

Sekwencja/struktura	SEQ. ID. NO:
LPGCKWDLLIKQWVCDPL^-V¹	44
V¹^-LPGCKWDLLIKQWVCDPL	45
LPGCKWDLLIKQWVCDPL^-LPGCKWDLLIKQWVCDPL^-V¹	46
V¹^-LPGCKWDLLIKQWVCDPL^-LPGCKWDLLIKQWVCDPL	47
SADCYFDILTKSDVCTSS^-V¹	48
V¹^-SADCYFDILTKSDVCTSS	49
SADCYFDILTKSDVTSS^-SADCYFDILTKSDVTSS^-V¹	50
V^-SADCYFDILTKSDVTSS^-SADCYFDILTKSDVTSS	51
FHDCKWDLLTKQWVCHGL^-V¹	52
V¹^-FHDCKWDLLTKQWVCHGL	53
FHDCKWDLLTKQWVCHGL^-FHDCKWDLLTKQWVCHGL^-V	54
V¹-A-FHDCKWDLLTKQWVCHGL-A-FHDCKWDLLTKQWVCHGL	55

„V¹” oznacza domenę Fc jak to zdefiniowano uprzednio. Poza wskazanymi w tablicy 4, obecni wynalazcy uwzględniali heterodimery, w których każda nić dimeru Fc jest połączona z inną sekwencją peptydową; przykładowo takie, w których każda domena Fc jest połączona z inną sekwencją wybraną z tablicy 2.

Wszystkie związki według obecnego wynalazku można wytworzyć metodami opisanymi w publikacji nr WO 99/25044.

Wynalazek zostanie obecnie dodatkowo objaśniony w następujących przykładach realizacji, które stanowią raczej ilustrację niż ograniczenie zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1. Peptydy

Prezentacja fagowa peptydów

1. Wytwarzanie perełek magnetycznych

A. unieruchomienie Fc-TALL-1 na perełkach magnetycznych

Rekombinacyjną proteinę Fc-TALL-1 immobilizowano na perełkach Dynabeads z białkiem A (Dynal) w stężeniu 8 μg Fc-TALL-1 na 100 μl perełek w formie dostarczonej przez wytwórcę. Odciągając perełki na jedną stronę probówki przy użyciu magnesu oraz odpipetowując płyn przemyto je dwukrotnie stosując solankę w buforze fosforanowym (PBS) i ponownie przeprowadzono w zawiesinę w PBS. Białko Fc-TALL-1 dodano w powyższym stężeniu do przemytych perełek i inkubowano z rotacją przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Perełki z powłoką Fc-TALL-1 następnie zablokowano przez dodanie albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) do końcowego 1% stężenia i inkubowano z rotacją przez noc w temperaturze 4°C. Otrzymane perełki z powłoką Fc-TALL-1 przemyto następnie dwukrotnie przy użyciu PBST (PBS z 0,05% Tween-20) przed poddaniem procedurom selekcji.

B. Wytwarzanie perełek do selekcji negatywnej

Dodatkowe perełki wytworzono również do selekcji negatywnych. Dla każdych warunków panoramowania, 250 μl próbki perełek w postaci dostarczonej przez wytwórcę poddano powyższej procedurze (sekcja 1A) z wyjątkiem tego, że pominięto etap inkubacji z Fc-TALL-1. W ostatnim etapie przemywania perełki podzielono na pięć 50 μl części.

PL 210 546 B1

2. Selekcja fagów wiążących TALL-1

A. Strategia ogólna

Dwie biblioteki włóknistych fagów TN8-IX (5 x 10⁹ niezależnych transformantów) oraz TN12-I (1,4 x 10⁹ niezależnych transformantów) (Dyax Corp.), użyto do wybrania faga wiążącego TALL-1. Każdą bibliotekę poddano albo eluowaniu przy pH 2 lub „eluowaniu perełkowemu” (sekcja 2E). Stąd wynika, że w projekcie dotyczącym TALL-1 wykorzystano cztery różne warunki panoramowania (TN8-IX przy użyciu metody eluowania przy pH 2, TN8-IX przy użyciu metody perełkowego eluowania, TN12-I przy użyciu metody eluowania przy pH 2 oraz TN12-I przy użyciu perełkowej metody eluowania). Przeprowadzono trzy cykle selekcji w każdych warunkach.

B. Negatywna selekcja

Dla każdych warunków panoramowania pobrano próbki około 100 losowych ekwiwalentów biblioteki (5 x 10¹¹ pfu dla TN8-IX oraz 1,4 x 10¹¹ pfu dla TN12-I) z bazowej biblioteki rozcieńczono do objętości 300 μl przy użyciu PBST. Po odebraniu cieczy z ostatniego przemycia pierwszej 50 μl próbki perełek wytworzonych dla prowadzenia selekcji negatywnych (sekcja 1B), do perełek dodano powyższe 300 μl rozcieńczonej bazowej biblioteki. Tak otrzymaną mieszaninę inkubowano obracając przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Sklarowane fagi znad osadu oddzielono przy użyciu magnezu dodano do drugiej 50 μl próbki w celu wykonania drugiego etapu negatywnej selekcji. W ten sposób zrealizowano pięć etapów negatywnej selekcji.

C. Selekcja przy użyciu perełek powleczonych proteiną Fc-TALL-1

Sklarowane fagi po ostatnim etapie negatywnej selekcji (sekcja 1B) dodano do perełek powleczonych Fc-TALL-1 po ostatnim etapie przemywania (sekcja 1A). Mieszaninę tę inkubowano obracając przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, co pozwoliło na związanie specyficznego faga z docelowa proteiną. Po usunięciu sklarowanej cieczy znad osadu, perełki przemyto siedmiokrotnie przy użyciu PBST.

D. Eluowanie związanego faga przy pH 2

Po ostatnim etapie przemywania (sekcja 2C), związane fagi eluowano z magnetycznych perełek przez dodanie 200 μl CBST (50 mM cytrynianu sodu, 150 mM chlorku sodu, 0,05% Tween-20, pH 2). Po 5 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, ciecz zawierającą wymyte fagi oddzielono i przeniesiono do innej probówki. Etap eluowania powtórzono ponownie dodając 200 μl CBST i inkubując przez 5 minut. Ciecze z obu etapów eluowania połączono i dodano 100 μl 2 M roztworu Tris (pH 8) w celu neutralizacji pH. Dodano 1 ml 500 μl roztworu soli Min A Sahs (60 mM K₂HPO₄, 33 mM KH2PO4, 7,6 mM (NH4)SO4 i 1,7 mM cytrynian sodu) doprowadzając końcową objętość do 1 ml.

E. Eluowanie perełkowe

Po oddzieleniu cieczy z ostatniego przemycia (sekcja 2C), do perełek dodano 1 ml roztworu soli Min A Salts. Tę mieszaninę perełek dodano bezpośrednio do stężonej próbki bakterii w celu zainfekowania (sekcje 3A oraz 3B).

3. Amplifikacja

A. Wytwarzanie komórek do powleczenia

Świeżą hodowlę E. coli. (XL-1 Blue MRF') poddano wzrostowi do OD600 = 0,5 w pożywce LB zawierającej 12,5 μg/ml tetracykliny. Dla każdych z warunków panoramowania, 20 ml tej hodowli ochłodzono lodem i odwirowano. Placek z bakterii ponownie rozproszono w 1 ml roztworu soli Min A Salts.

B. Transdukcja

Każdą mieszaninę z różnych metod eluowania (sekcje 2D oraz 2E) dodano do stężonej próbki bakterii (sekcja 3A) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 15 minut. Do każdej z mieszanin dodano ml pożywki NZCYM (2 x NZCYM, 50 μg/ml ampicyliny) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Otrzymane 4 ml roztworu naniesiono na dużą płytkę agarową NZCYM zawierającą 50 μg/ml ampicyliny i inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C.

C. Zebranie fagów

Każdą z mieszanin bakteria/fag, którą poddano wzrostowi przez noc na dużej płytce agarowej NZCYM (sekcja 3B) zeskrobano do 35 ml pożywki LB, a płytkę agarową dodatkowo przemyto dodatkową porcją 35 ml pożywki LB. Otrzymaną mieszaninę bakteria/fagi w pożywce LB odwirowano, aby oddzielić bakterie w formie zbitego osadu. 50 ml sklarowanej cieczy fagowej przeniesiono do świeżej probówki, dodano 12,5 ml roztworu PEG (20% PEG 8000, 3,5M octan amonu) i inkubowano na lodzie przez 2 godziny w celu wytrącenia fagów. Wytrącone fagi odwirowano i ponownie rozproszono w 6 ml

PL 210 546 B1 buforu do suspendowania fagów (250 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA). Następnie, ten roztwór oczyszczono przez odwirowanie, usunięto pozostałe bakterie i wytrącono drugi raz fagi przez dodanie 1,5 ml roztworu PEG. Po odwirowaniu, zbitą masę fagów ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 400 μl PBS. Roztwór ten poddano końcowemu odwirowaniu w celu oddzielenia pozostałych szczątków bakterii. Końcowy preparat fagowy oznaczono w standardowej próbie tworzenia płytki (Molecular Cloning, Maniatis i wsp., wydanie 3).

4. Dwie dalsze rundy selekcji i amplifikacii

W drugiej rundzie, zamplifikowane fagi (10¹⁰ pfu) z pierwszej rundy (sekcja 3C) zastosowano jako wsad fagów przy prowadzenia dalszych etapów selekcji i amplifikacji (sekcje 2 i 3). Z kolei, zaplifi10 kowane fagi (10¹⁰ pfu) z przeprowadzonej drugiej rundy użyto jako wsad fagów w celu przeprowadzenia trzeciej rundy selekcji i amplifikacji (sekcje 2 i 3).

Po etapach eluowania (sekcja 2D oraz 2E) trzeciej rundy, małą frakcję wymytego faga osadzono stosując standardową próbę tworzenia płytki (sekcja 3C). Wybrano indywidualne płytki i umieszczono na płytkach do mikrooznaczeń o 96 wgłębieniach zawierających 100 μl buforu TE w każdym wgłębieniu. Te wzorcowe płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, co pozwoliło na wyeluowanie fagów do buforu TE.

5. Analiza klonalna (testy ELISA dla fagów i sekwencjonowanie)

Klony fagów analizowano stosując testy ELISA dla fagów oraz i metody oznaczania sekwencji. Sekwencje sklasyfikowano w oparciu o łączne wyniki z tych dwóch prób.

A. Test ELISA dla fagów

Prowadzono wzrost hodowli An XL-1 Blue MRP' do osiągnięcia OD₆₀₀ o wartości 0,5. 30 μl próbki tej hodowli wprowadzono do każdego wgłębienia płytki do mikrooznaczeń o 96 wgłębieniach. Do każdego wgłębienia dodano 10 μl wyeluowanego faga (sekcja 4) i dopuszczono infekowanie bakterii przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Do każdego wgłębienia dodano 130 μl pożywki LB zawierającej 12,5 μg/ml tetracykliny oraz 50 μg/ml ampicyliny. Następnie całą płytkę do mikrooznaczeń inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Rekombinacyjne białko TALL-1 (1 μg/ml w PBS) pozostawiono do osadzenia na płytkach Maxisorp o 96 wgłębieniach przez noc w temperaturze 4°C. Jako kontrolę przygotowano oddzielną płytkę Maxisorp powleczoną proteiną rekombinacyjnego Fc-Trail, w takim samym stężeniu molowym jak białko TALL-1.

Następnego dnia, usunięto ciecze z powleczonych białkami płytek Maxisorp i każde wgłębienie zablokowano przy użyciu 300 μl 2% roztworu BSA w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny. Roztwór BSA usunięto i wgłębienia przemyto trzykrotnie roztworem PBST.

Po ostatnim przemyciu do każdego wgłębienia płytek Maxisorp pokrytych białkami dodano 50 μl PBST. Każdą z prowadzonych przez noc 50 μl hodowli uzyskanych na tej płytce do mikrooznaczeń o 96 wgłębieniach przeniesiono do odpowiednich wgłębień płytek powleczonych TALL-1, jak również kontrolnych płytek pokrytych Fc-Trail.

Mieszaniny o objętości 100 μl z tych dwóch rodzajów płytek inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Ciecz usunięto z płytek Maxisorp i wgłębienia przemyto pięć razy stosując PBST. Skoniugowane z HRP przeciwciało anty-M13 (Farmacia) rozcieńczono do stężenia 1:7,500 i 100 μl tego rozcieńczonego roztworu dodano do każdego wgłębienia płytek Maxisorp i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

Ciecz ponownie usunięto i wgłębienia przemyto siedem razy stosując PBST. Do każdego wgłębienia dodano 100 μl substratu tetrametylobenzydyny (TMB) (Sigma) w celu wywołania barwnej reakcji i reakcję tę zatrzymano stosując 50 μl 5 N roztworu H₂SO₄. Wartość OD₄₅₀ odczytano na czytniku płytek (Molecular Devices).

A. Sekwencjonowanie klonów faga

Dla każdego klonu faga wytworzono wzorzec sekwencjonowania metodą PCR. Następującą parę oligonukleotydów stosowano do amplifikacji fragmentów około 500 nukleotydowych:

primer #1(5'-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3') (SEQ ID NO: 56), oraz primer #2 (5' -CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC- 3') (SEQ ID NO: 57).

Następującą mieszankę przygotowano dla każdego klonu.

PL 210 546 B1

Reagenty	Objętość ^L)/probówkę
dH2O	26,25
50% gliceryna	10
10B PCR Bufor (bez MgCfe)	5
25 mM MgCl2	4
10 mM mieszanki dNTP	1
100 μM primera 1	0,25
100 μM primera 2	0,25
Polimeraza Taq	0,25
Fag w TE (sekcja 4)	3
Końcowa objętość reakcji	50

W termocyklerze (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) zrealizowano następujący program: temperatura 94°C przez 5 minut; [temperatura 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund, 72°C przez 45 sekund.] x 30 cykli; temperatura 72°C przez 7 minut; chłodzenie do temperatury do 4°C.

Produkt PCR sprawdzano prowadząc każdą reakcję PCR w 5 μl na 1% żelu agarozowym.

Produkt PCR w pozostałych 45 μl z każdej reakcji poddano oczyszczeniu przy użyciu zestawu QIAquick Muhiwell PCR Purification kit (Qiagen), zgodnie z zaleceniami wytwórcy.

Otrzymany produkt poddano następnie sekwencjonowaniu przy użyciu urządzenia ABI 377 Sequencer (Perkin-Elmer) zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta.

6. Przegląd sekwencji i oznaczenie zgodnych sekwencji

A. Przegląd sekwencji

Sekwencje peptydowe, które uzyskano przez translację zmiennych sekwencji nukleotydowych (sekcja 5B) skorelowano z danymi ELISA.

Klony wykazywały wysoką wartość OD450 we wgłębieniach płytki pokrytej TALL-1 oraz niską wartość OD450 we wgłębieniach płytki pokrytej Fc-Trail uznano za ważniejsze.

Sekwencje, które wystąpiły wielokrotnie również uznano za ważne.

W oparciu o te kryteria wybrano sekwencje kandydackie do dalszych analiz w charakterze peptydu lub ciał peptydowych.

Odpowiednio pięć i dziewięć kandydackich sekwencji peptydowych wybrano spośród bibliotek TN-8-IX oraz TN12-I.

B. Oznaczenie zgodnej sekwencji

Większość sekwencji wybranych z biblioteki TN12-I zawiera bardzo konserwatywny motyw

DBL.

Motyw ten obserwowano również w sekwencjach wybranych także z biblioteki TN8-IB. Inny motyw, PFPWE (SEQ ID NO: 110) również obserwowano w sekwencjach otrzymanych z biblioteki TN8-IB.

Zgodny peptyd, FHDCKWDLLTKOWVCHGL (SEQ ID NO: 58), zaprojektowano w oparciu o motyw DBL.

Ponieważ peptydy otrzymane z biblioteki TN12-I były najbardziej aktywne, w oparciu o powyższe kryteria rankingowe (sekcja 5A) wyróżniono 26 najlepszych sekwencji peptydowych przez motyw DBL.

Podkreśloną „sekwencję rdzenia” aminokwasowego otrzymano przez oznaczenie aminokwasów występujących najczęściej w każdej pozycji.

Dwie cysteiny przyległe do sekwencji rdzenia były stałymi aminokwasami w bibliotece TN12-I.

Pozostała część sekwencji aminokwasowej w tym zgodnym peptydzie została wzięta z jednego z kandydackich peptydów -TALL-1-12-10 (tablica 2, SEQ ID NO: 37).

Peptyd oraz ciało peptydowe wyprowadzone z tej zgodnej sekwencji były najbardziej aktywne w próbach na proliferację komórek B.

PL 210 546 B1

P r z y k ł a d 2. Ciała peptydowe

Skonstruowano zestaw 12 ciał peptydowych inhibitujących TALL-1 (tablica 5), w których monomer każdego peptydu poddano fuzji w ramce z regionem Fc ludzkiej IgG1.

Każde ciało peptydowe inhibitujące TALL-1 skonstruowano przez wygrzewanie par oligonukleotydów przedstawionych w tablicy 6 w celu utworzenia dupleksu kodującego dany peptyd i linker zawierający 5 reszt glicynowych i jedną resztę walinową jako fragment od Ndel do SalI.

Te dupleksy cząsteczki ligowano do wektora (pAMG21-RANK-Fc, tu opisanego) zawierającego ludzki gen Fc, wytrawiony także przy użyciu Ndel oraz SalI.

Otrzymane mieszaniny ligacyjne transformowano na drodze elektroporezy do komórej E. coli, szczep 2596 (GM221, opisany tutaj).

Klony poddano skriningowi pod kątem zdolności do wytwarzania rekombinacyjnego produktu białkowego oraz posiadania fuzji genowej o poprawnej sekwencji nukleotydowej.

Wybrano pojedynczy taki klon dla każdego ciała peptydowego.

Sekwencje nukleotydów i sekwencje aminokwasowe białek fuzyjnych przedstawiono na rysunkach od fig. 4A do 4F.

T a b l i c a 5

Sekwencje peptydowe i oligonukleotydy stosowane do generowania ciał peptydowych inhibitujących TALL-1

Ciało peptydowe (C.P.)	SEQ ID NO (C.P.)	Sekwencja peptydu	Oligonukleotyd sensowny	Oligonukleotyd antysensowny
TALL-I-8-1-a	29	PGTCFPFPWECTHA	2517-24	2517-25
TALL-I-8-2-a	30	WGACWPFPWECFKE	2517-26	2517-27
TALL-I-8-4-a	31	YPFCDLLTKHCFEA	2517-28	2517-29
TALL-I-12-4-a	32	GSRCKYKWDVLTKQCFHH	2517-30	2517-31
TALL-I-12-3-a	33	LPGCKWDLLIKQWVCDPL	2517-32	2517-33
TALL-l-12-5-a	34	SADCYFDILTKSDYCTSS	2517-34	2517-35
TALL-l-12-8-a	35	SDDCMYDQLTRMFICSNL	2517-36	2517-37
TALL-l-12-9-a	36	DLNCKYDELTYKEWCQFN	2521-92	2521-93
TALL-l-12-10-a	37	FHDCKYDLLTRQMVCHGL	2521-94	2521-95
TALL-l-12-11-a	38	RNHCFWDHLLKQDICPSP	2521-96	2521-97
TALL-l-12-14-a	39	ANQCWWDSLTKKNVCEFF	2521-98	2521-99
Zgodny TALL-I	58	FHDCKWDLLTKQWVCHGL	2551-48	2551-49

PL 210 546 B1

T a b l i c a 5B

Ciała peptydowe inhibitujące TALL-1

Ciało peptydowe	SEQ ID NO (C.p.)	Sekwencja peptydu
TALL-l-8-l-a	111	MPGTCFPFPW ECTHAGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
TALL-l-8-2-a	112	MWGACWPFPW ECFKEGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
TALL-l-8-4-a	113	MVPFCDLLTK HCFEAGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
TALL-l-12-4-a	114	MGSRCKYKWD VLTKQCFHHG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SYMHEALHNH YTQKSLSLSP GK

PL 210 546 B1

Ciało peptydowe	SEQ ID NO (C.P.)	Sekwencja peptydu
TALL-l-12-3-a	115	MLPGCKWDLL IKQWVCDPLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-l-12-5-a	116	MSADCYFDIL TKSDVCTSSG GGGG VDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-l-12-8-a	117	MSDDCMYDQL TRMFICSNLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TAI,L-l-12-9-a	118	MDLNCKYDEL TYKEWCQFNG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-l-12-10-a	119	MFHDCKYDLL TRQMVCHGLG GGGGYDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK

PL 210 546 B1

Ciało peptydowe	SEQ ID NO (C.P.)	Sekwencja peptydu
TALL-l-12-ll-a	120	MRNHCFWDHL LEQDICPSPG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP EPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1 -12- 14-a	121	MANQCWWDSL TKKNVCEFFG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
zgodny TALL-1	122	MFHDCKWDLL TKQWVCHGLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
Dimer tandemowy TALL-1 12-3	123	MLPGCKWDLL IKQWVCDPLG SGSATGGSGS TASSGSGSAT HMLPGCKWDL LIKQWVCDPL GGGGGVDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
zgodny dimer tandemowy TALL-1	124	MFHDCKWDLL TKQWVCHGLG SGSATGGSGS TASSGSGSAT HMFHDCKWDL LTKQWVCHGL GGGGGVDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

PL 210 546 B1

T a b l i c a 6

Sekwencje oligonukleotydów stosowanych w konstruowaniu ciał peptydowych

Nr identyfikacyjny oligonukleotydu	SEQ ID NO:	Sekwencja
1	2	3
2517-24	71	TAT GCC GGG TAC TTG TTT CCC GTT CCC GTG GGA ATG CAC TCA CGC TGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-25	72	TCG ACC CCA CCG CCT CCT GGA GCG TGA GTG CAT TCC CAC GGG AAG CCG AAA CAA GTA CCC GGC A
2517-26	73	TAT GTG GGG TGC TTG TTG GCC GTT CCC GTG GGA ATG TTT CAA AGA AGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-27	74	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCT TCT TTG AAA CAT TCC CACGGG AAC GGC CAA CAAGCA CCC CAC A
2517-28	75	TAT GGT TCC GTT CTG TGA CCT GCT GAC TAA ACA CTG TTT CGA AGC TGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-29	76	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCA GCT TCG AAA CAG TGT TTA GTC AGC AGG TCA CAGAAC GGA ACC A
2517-30	77	TAT GGG TTC TCG TTG TAA ATA CAA ATG GGA CGT TCT GAC TAA ACA GTG TTT CCA CCA CGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-31	78	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCG TGG TGG AAA CAC TGT TTA GTC AGA ACG TCC CAT TTG TAT TTA CAA CGA GAA CCC A
2517-32	79	TAT GCT GCC GGG TTG TAA ATG GGA CCT GCT GAT CAA ACA GTG GGT TTG TGA CCC GCT GGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-33	80	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC AGC GGG TCA CAA ACC CAC TGT TTG ATC AGC AGG TCC CAT TTA CAA CCC GGC AGC A
2517-34	81	TAT GTC TGC TGA CTG TTA CTT CGA CAT CCT GAC TAA ATC TGA CGT TTG TAC TTC TTC TGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-35	82	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCA GAA GAA GTA CAA ACG TCA GAT TTA GTC AGG ATG TCG AAG TAA CAG TCA GCA GAC A
2517-36	83	TAT GTC TGA CGA CTG TAT GTA CGA CCA GCT GAC TCG TAT GTT CAT CTG TTC TAA CCT GGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-37	84	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC AGG TTA GAA CAG ATG AAC ATA CGA GTC AGC TGG TCG TAC ATA CAG TCG TCA GAC A
2521-92	85	TAT GGA CCT GAA CTG TAA ATA CGA CGA ACT GAC TTA CAA AGA ATG GTG TCA GTT CAA CGG TGG AGG CGG TGG GG
2521-93	86	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCG TTG AAC TGA CAC CAT TCT TTG TAA GTC AGTTCG TCG TAT TTA CAG TTC AGG TCC A
2521-94	87	TAT GTT CCA CGA CTG TAA ATA CGA CCT GCT GAC TCG TCA GAT GGT TTG TCA CGG TCT GGG TGG AGG CGG TGG GG
2521-95	88	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC AGA CCG TGA CAA ACC ATC TGA CGA GTC AGC AGG TCG TAT TTA CAG TCG TGG AAC A
2521-96	89	TAT GCG TAA CCA CTG TTT CTG GGA CCA CCT GCT GAA ACA GGA CAT CTG TCC GTC TCC GGG TGG AGG CGG TGG GG
2521-97	90	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC GGA GAC GGA CAG ATG TCC TGT TTC AGC AGG TGG TCC CAG AAA CAG TGG TTA CGC A
2521-98	91	TAT GGC TAA CCA GTG TTG GTG GGA CTC TCT GCT GAA AAA AAA CGT TTG TGA ATT CTT CGG TGG AGG CGG TGG GG
2521-99	92	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCG AAG AAT TCA CAA ACG TTT TTT TTC AGC AGA GAG TCC CAC CAA CAC TGG TTA GCC A

PL 210 546 B1 cd tablicy 6

1	2	3
2551-48	93	TAT GTT CCA CGA CTG CAA ATG GGA CCT GCT GAC CAA ACA GTG GGT TTG CCA CGG TCT GGG TGG AGG CGG TGG GG
2551-49	94	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC AGA CCG TGG CAA ACC CAC TGT TTG GTC AGC AGG TCC CAT TTG CAG TCG TGG AAC A

Wektor pAMG21-RANK-Fc pAMG21. Plazmid ekspresji pAMG21 (ATCC numer dostępu 98113) może być wyprowadzony z wektora ekspresji pCFM1656 (ATCC #69576) będącego własnością firmy Amgen, który z kolei może być wyprowadzony z systemu wektorów ekspresji należącego do firmy Amgen opisanego w patencie nr US 4 710 473. Plazmid pCFM1656 można wyprowadzić z wcześniej opisanego plazmidu pCFM836 (patent nr US 4 710 473), poprzez:

• zniszczenie dwóch endogennych miejsc restrykcyjnych Ndel przez końcowe wypełnienie enzymem polimerazy T4, a następnie ligację tępego końca;

• zastąpienie sekwencji DNA między unikalnymi miejscami restrykcyjnymi Aatll oraz Clal zawierającej syntetyczny promotor PL podobnym fragmentem otrzymanym z pCFM636 (patent nr US 4 710 473) obejmującym ten promotor PL (patrz SEQ ID NO: 95, poniżej); oraz • podstawienie małej sekwencji DNA między unikalnymi miejscami restrykcyjnymi Clal oraz KpnI oligonukleotydem posiadającym sekwencję SEQ ID NO: 96.

SEQ ID NO: 95:

AatII

5' CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCATAT3 ' TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGTATA-AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA_ TTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT-TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3'

-ATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGC 5'

Ciał

SEQ ID NO: 96:

' CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3'

3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5'

Ciał KpnI

Plazmid ekspresji pAMG21 można następnie otrzymać z pCFM1656 przez wykonanie serii zmian par zasad w wybranych miejscach metodą mutagenezy oligonukleotydów w zachodzących na siebie reakcjach PCR nakładanie mutagenezy oligonukleotydowej oraz podstawienia sekwencji DNA. Wychodząc z miejsca Bglll (w plazmidzie para zasad # 180) bezpośrednio 5' w stosunku do promotora PcopB replikacji plazmidu i kierując się ku genom replikacji plazmidu zmiany par zasad (pz) są zgodne z tym, co zawiera tablica 7, poniżej.

T a b l i c a 7

Zmiany par zasad prowadzące do powstania pAMG21

pAMG21 pz #	pz w pCFM1656	pz zmienione w pAMG21 na
1	2	3
# 204	T/A	C/G
# 428	A/T	G/C
# 509	G/C	A/T

PL 210 546 B1 cd tablicy 7

1	2	3
# 617	-	wstawienie 2 pz G/C
# 679	G/C	T/A
# 980	T/A	C/G
# 994	G/C	A/T
#1004	A/T	C/G
# 1007	C/G	T/A
# 1028	A/T	T/A
# 1047	C/G	T/A
#1178	G/C	T/A
# 1466	G/C	T/A
# 2028	G/C	delecja
# 2187	C/G	T/A
# 2480	A/T	T/A
# 2499-2502	AGTG	GTCA
TCAC	CAGT
# 2642	TCCGAGC AGGCTCG	delecja 7 pz
# 3435	G/C	A/T
# 3446	G/C	A/T
# 3643	A/T	A/T

Sekwencja DNA między unikalnymi miejscami restrykcyjnymi Aatll (pozycja # 4364 w PC-FM1656) oraz SacII (pozycja # 4585 w pCFM1656) jest podstawiona następującą sekwencją DNA (SEQ ID NO: 97):

[Aatll lepki koniec] 5' GCGTAACGTATGCATGGTCTCC(pozycja #4358 w pAMG21) 3' TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGG- CCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACT -GGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTTTATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGA-gggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgc

-CCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCACTTGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCG-CGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGC

-gccctcgcctaaacttgcaacgcttcgttgccgggcctcccaccgcccgtcctgcgggcg-CATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGT-GTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTCCGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCAAatll

-TTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGGACGTCGTACTTAAC-aagatgtttgagaaaacaaataaaaagatttatgtaagtttatacctgcagcatgaattg- TTTTAAAGTATGGGCAATCAATTGCTCCTGTTAAAATTGCTTTAGAAATACTTTGGCAGC -AAAATTTCATACCCGTTAGTTAACGAGGACAATTTTAACGAAATCTTTATGAAACCGTCG-ggtttgttgtattgagtttcatttgcgcattggttaaatggaaagtgaccgtgcgcttac -CCAAACAACATAACTCAAAGTAAACGCGTAACCAATTTACCTTTCACTGGCACGCGAATG- TACAGCCTAATATTTTTGAAATATCCCAAGAGCTTTTTCCTTCGCATGCCCACGCTAAAC -ATGTCGGATTATAAAAACTTTATAGGGTTCTCGAAAAAGGAAGCGTACGGGTGCGATTTGATTCTTTTTCTCTTTTGGTTAAATCGTTGTTTGATTTATTATTTGCTATATTTATTTTTC TAAGAAAAAGAGAAAACCAATTTAGC AACAAACTAAATAATAAACGATATAAATAAAAAG gataattatcaactagagaaggaacaattaatggtatgttcatacacgcatgtaaaaata·

CTATTAATAGTTGATCTCTTCCTTGTTAATTACCATACAAGTATGTGCGTACATTTTTAT

PL 210 546 B1

AACTATCTATATAGTTGTCTTTCTCTGAATGTGCAAAACTAAGCATTCCGAAGCCATTAT

TTGATAGATATATCAACAGAAAGAGACTTACACGTTTTGATTCGTAAGGCTTCGGTAATA

TAGCAGTATGAATAGGGAAACTAAACCCAGTGATAAGACCTGATGATTTCGCTTCTTTAA

ATCGTCATACTTATCCCTTTGATTTGGGTCACTATTCTGGACTACTAAAGCGAAGAAATT

TTACATTTGGAGATTTTTTATTTACAGCATTGTTTTCAAATATATTCCAATTAATCGGTG

AATGTAAACCTCTAAAAAATAAATGTCGTAACAAAAGTTTATATAAGGTTAATTAGCCAC

AATGATTGGAGTTAGAATAATCTACTATAGGATCATATTTTATTAAATTAGCGTCATCAT TTACTAACCTCAATCTTATTAGATGATATCCTAGTATAAAATAATTTAATCGCAGTAGTA

AATATTGCCTCCATTTTTTAGGGTAATTATCCAGAATTGAAATATCAGATTTAACCATAG

TTATAACGGAGGTAAAAAATCCCATTAATAGGTCTTAACTTTATAGTCTAAATTGGTATC

AATGAGGATAAATGATCGCGAGTAAATAATATTCACAATGTACCATTTTAGTCATATCAG

TTACTCCTATTTACTAGCGCTCATTTATTATAAGTGTTACATGGTAAAATCAGTATAGTC

ATAAGCATTGATTAATATCATTATTGCTTCTACAGGCTTTAATTTTATTAATTATTCTGTTATTCGTAACTAATTATAGTAATAACGAAGATGTCCGAAATTAAAATAATTAATAAGACAAAGTGTCGTCGGCATTTATGTCTTTCATACCCATCTCTTTATCCTTACCTATTGTTTGTCTTCACAGCAGCCGTAAATACAGAAAGTATGGGTAGAGAAATAGGAATGGATAACAAACAG-GCAAGTTTTGCGTGTTATATATCATTAAAACGGTAATAGATTGACATTTGATTCTAATAA-CGTTCAAAACGCACAATATATAGTAATTTTGCCATTATCTAACTGTAAACTAAGATTATT-ATTGGATTTTTGTCACACTATTATATCGCTTGAAATACAATTGTTTAACATAAGTACCTG-TAACCTAAAAACAGTGTGATAATATAGCGAACTTTATGTTAACAAATTGTATTCATGGAC-TAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTGTTATAGTCGATTAATCGATTTGATT-ATCCTAGCATGTCCAAATGCGTTCTTTTACCAAACAATATCAGCTAATTAGCTAAACTAA-CTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGA-GATCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTSacII

-GCTCACTAGTGTCGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAA-CGAGTGATCACAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTT-GAAGAAGAAGAAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATA-CTTCTTCTTCTTCTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTAT-ACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGG-TGATCGTATTGGGGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCC-AACCGCTCTTCACGCTCTTCACGC 3' [SacII lepki koniec]

-TTGGCGAGAAGTGCGAGAAGTG 5¹ (pozycja #5904 w pAMG21)

Podczas ligowania lepkich końców tej sekwencji podstawionego DNA części na zewnątrz w stosunku do miejsc Aatll oraz SacII są niszczone. W podstawionej sekwencji DNA są unikalne miejsca Aatll oraz SacII.

Gen kodujący ludzki RANK w fuzji przez N-koniec z Fc ligowano do pAMG21 jako fragment od Ndel do BamHI uzyskując szczep # 4125 należący do firmy Amgen. Ten konstrukt zmodyfikowano, aby wstawić kodon waliny w miejscu połączenia RANK i Fc. Sąsiadujące ze sobą kodony waliny i kwasu asparaginowego tworzą unikalne miejsce SalI. Pozwala to na fuzję peptydów przez N-koniec Fc3 między unikalnymi miejscami Ndel i SalI. Sekwencję RANK usuwa się po wprowadzeniu nowego fragmentu Ndel-SalI. Sekwencję wektora przedstawiono na rysunku fig. 5A do 5M.

PL 210 546 B1

GM221 (Amgen # 2596)

Szczep gospodarza należący do firmy Amgen # 2596 jest szczepem E. coli K-12 wyprowadzonym z należącego do firmy Amgen szczepu # 393, który jest wyprowadzony z E. coli W1485, otrzymanego z E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut (CGSC szczep 6159). Został on zmodyfikowany tak, aby obejmował wrażliwy na temperaturę represor lambda cI857s7 we wczesnym obszarze ebg oraz represor lacl^Q w późnym obszarze ebg (68 minut). Obecność tych dwóch represorów pozwala na wykorzystywanie tego gospodarza w różnorodnych układach ekspresji, jednakże oba te represory nie mają znaczenia przy ekspresji z IuxPR. Nie transformowany gospodarz nie ma jakiejkolwiek odporności na antybiotyki.

Miejsce wiązania rybosomu w genie cI857s7 zmodyfikowano, aby objęło uwydatnione RBS (miejsce wiązania rybosomu). Wprowadzono je do operonu ebg między pozycje nukleotydowe 1170 oraz 1411, według numeracji przyjętej w przypadku o numerze dostępu w Genbank w M64441Gb_Ba z delecją leżącej między nimi sekwencji ebg. Sekwencja insertu jest przedstawiona poniżej, gdzie małymi literami zapisano sekwencje ebg na flankach insertu (SEQ ID NO: 98):

ttattttcgtGCGGCCGCACCATTATCACCGCCAGAGGTAAACTAGTCAACACGCACGGTGTTAGATAT

TTATCCCTTGCGGTGATAGATTGAGCACATCGATTTGATTCTAGAAGGAGGGATAATATATGAG

CACAAAAAAGAAACCATTAACACAAGAGCAGCTTGAGGACGCACGTCGCCTTAAAGCAATTTAT

GAAAAAAAGAAAAATGAACTTGGCTTATCCCAGGAATCTGTCGCAGACAAGATGGGGATGGGGC

AGTCAGGCGTTGGTGCTTTATTTAATGGCATCAATGCATTAAATGCTTATAACGCCGCATTGCT

TACAAAAATTCTCAAAGTTAGCGTTGAAGAATTTAGCCCTTCAATCGCCAGAGAATCTACGAGA

TGTATGAAGCGGTTAGTATGCAGCCGTCACTTAGAAGTGAGTATGAGTACCCTGTTTTTTCTCA

TGTTCAGGCAGGGATGTTCTCACCTAAGCTTAGAACCTTTACCAAAGGTGATGCGGAGAGATGG

GTAAGCACAACCAAAAAAGCCAGTGATTCTGCATTCTGGCTTGAGGTTGAAGGTAATTCCATGA

CCGCACCAACAGGCTCCAAGCCAAGCTTTCCTGACGGAATGTTAATTCTCGTTGACCCTGAGCA

GGCTGTTGAGCCAGGTGATTTCTGCATAGCCAGACTTGGGGGTGATGAGTTTACCTTCAAGAAA

CTGATCAGGGATAGCGGTCAGGTGTTTTTACAACCACTAAACCCACAGTACCCAATGATCCCAT

GCAATGAGAGTTGTTCCGTTGTGGGGAAAGTTATCGCTAGTCAGTGGCCTGAAGAGACGTTTGG

CTGATAGACTAGTGGATCCACTAGTgtttctgccc

Konstrukt ten dostarczono do chromosomu stosując fag rekombinacyjny o nazwie MMebgcI857s7 enhancedRBS # 4 w F'tet/393. Po rekombinacji i rozdziale, w komórce pozostaje wyłącznie chromosomalny insert opisany powyżej. Nadano mu nową nazwę F'tet/GM101. F'tet/GM101 został następnie zmodyfikowany przez dostarczenie konstruktu lacl^Q do operonu ebg pomiędzy pozycje nukleotydowe 2493 i 2937 według numeracji przyjętej w przypadku o numerze dostępu w Genbank M64441Gb_Ba z delecją leżącej między nimi sekwencji ebg. Sekwencja insertu jest przedstawiona poniżej, gdzie małymi literami zaznaczono sekwencje ebg na flankach insertu (SEQ ID NO: 99):

ggcggaaaccGACGTCCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGA

GAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGT

GTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGG

AAAAAGTCGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGC

GGGCAAACAGTCGCTCCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAA

ATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAG

AACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGG

GCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAAT

GTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATG

AAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTT

AGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACT

CGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAAC

AAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGAT

GGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTA

GTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGG

ATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGT

GAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACG

CAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGAC

TGGAAAGCGGACAGTAAGGTACCATAGGATCCaggcacagga

PL 210 546 B1

Konstrukt ten dostarczono do chromosomu stosując fag rekombinacyjny o nazwie AGebg-LacIQ #5 w F'tet/GM101. Po rekombinacji i rozdzieleniu w komórce pozostaje wyłącznie cliromosomalny insert opisany powyżej. Nadano mu nową nazwę F'tet/GM221. Episom F'tet został zakonserwowany przy użyciu oranżu akrydynowego w stężeniu 25 μg/ml w LB. Tak przetworzony szczep został zidentyfikowany jako wrażliwy na tetracyklinę i zachowany jako GM221.

Ekspresja w E. coli

Prowadzono hodowle wszystkich konstruktów fuzyjnych pAMG21-Fc w E. coli GM221 w temperaturze 37°C w pożywce Luria Broth. Indukcję ekspresji produktu genowego z promotora luxPR uzyskano po dodaniu syntetycznego autoinduktora: laktonu N-(3-oksoheksanoylo)-DL-homoseryny do pożywki hodowlanej w ilości zapewniającej końcowe stężenie 20 ng/ml. Hodowle inkubowano w temperaturze 37°C przez dalsze 3 godziny. Po upływie 3 godzin, hodowle bakteryjne badano pod mikroskopem na obecność ciał inkluzyjnych, a następnie zebrano je przez odwirowanie. Refrakcyjne ciała inkluzyjne obserwowano w indukowanych hodowlach, co wskazuje, że fuzje Fc były najchętniej produkowane w nierozpuszczalnych frakcjach w E. coli. Zbrylone komórki bezpośrednio poddano lizie na drodze ponownego przeprowadzenia ich w zawiesinę w próbce buforu Laenimli'ego zawierającego 10% β-merkaptoetanolu i analizowano metodą SDS-PAGE. W każdym przypadku, na żelu SDS PAGE obserwowano pasmo intensywnie wybarwione odczynnikiem Coomassie, o odpowiedniej masie cząsteczkowej.

P r z y k ł a d 3. Ciało peptydowe TALL-1 inhibituje proliferację komórek B, w której pośredniczy TALL-1

Mysie limfocyty B wyodrębniono ze śledzion C57BL/6 na drodze selekcji negatywnej (MACS CD43 (Ly-48) Microbeads, Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Prowadzono trzy równoległe hodowle oczyszczonych komórek B (10⁵) w środowisku MEM (10% termicznie inaktywowanego FCS, 5 x 10^-5 M 2-merkaptoetanolu, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny) na płytkach do hodowli tkankowych o 96-zagłębieniach z płaskim dnem stosując 10 ng/ml białka TALL-1 oraz 2 μg/ml koziego F(ab')2 antymysiej IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, Pennsylvania) oraz wskazane ilości rekombinacyjnego ciała peptydowego TALL-1 przez okres 4 dni w temperaturze 37°C, 5%) CO2. Oznaczono proliferację metodą przyłączenia znaczonej radioaktywnie ³[H] tymidyny po 18 godzinach inkubowania.

P r z y k ł a d 4. Ciało peptydowe TALL-1 blokuje wiązanie TALL-1 z jego receptorami

Ludzkim AGP3 (znanym także jako TALL-1, Khare i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 3370-3375, 2000) wstępnie powleczono Reacti-Gel 6x (Pierce) i zablokowano BSA. Próbki 100 pM i 40 pM ciała peptydowego AGP3 inkubowano z dodatkiem ludzkiego AGP3 we wskazanych stężeniach w temperaturze pokojowej przez 8 godzin przez wprowadzeniem ich na perełki pokryte ludzkim AGP3. Ilości związanego z perełkami ciała peptydowego oznaczono ilościowo stosując fluorescencyjnie (Cy5) znaczone kozie przeciwciało przeciw ludzkiemu białku Fc (Jackson Immuno Research). Sygnał wiązania jest proporcjonalny do stężenia wolnego ciała peptydowego w stanie równowagi wiązania. Równanie stałej równowagi (KD) uzyskano w wyniku nieliniowej regresji krzywych konkurencji stosując model z podwójną krzywą dla jednomiejscowego homogenicznego wiązania (KinEx™ software). KD dla wiązania ciała peptydowego AGP3 (SEQ ID NO: 123) z ludzkim AGP3 (rysunek fig. 9) wynosi 4 pM.

Zastosowano próbę neutralizacji BIAcore, aby ustalić czy to ciało peptydowe AGP3 może neutralizować wiązanie mysiego AGP-3, podobnie jak ludzkiego AGP3. Wszystkie eksperymenty przeprowadzano stosując BIAcore 3000 w temperaturze pokojowej. Ludzkie białko TACI-Fc (Xia et al, J. Exp. Med. 192, 137-144, 2000) zostało unieruchomione na chipie B1 stosując 10 mM octan o pH 4,0 do poziomu 2900 RU. Ślepy przepływ komórek wykorzystano jako kontrolę tła. Stosując przepływ zbuforowanej solanki PBS (bez wapnia ani magnezu) zawierającej 0,005% P2O, 1 nM roztwór rekombinacyjnego ludzkiego AGP3 (w takim samym buforze z dodatkiem 0,1 mg/ml BSA) inkubowano bez dodatków oraz z dodatkiem wskazanych różnych ilości ciała peptydowego AGP3 (oś x) przed naniesieniem na powierzchnię receptora. Regenerację prowadzono stosując 8 mM glicyny o pH 1,5 przez 1 minutę, 25 mM kwas 3-cykloheksylamino]-1-propanosulfonowy (CAPS) o pH 10,5, 1 M NaCl przez 1 minutę. W celu oznaczenia wiązania mysiego AGP3, ludzki znaczony histydyną TAGI unieruchomiono do poziomu 1000 RU w wyżej podanym buforze. 5 nM rekombinacyjny mysi AGP3 (w tym buforze z dodatkiem 0,1 mg/ml BSA) inkubowano bez dodatku oraz z dodatkiem różnych ilości - wskazanych na rysunku fig. 11 - ciała peptydowego AGP3 (oś x) przed naniesieniem na powierzchnię receptora. Regenerację prowadzono stosując 10 mM HCl o pH 2, dwa razy po 30 sekund. Mierzono (oś y) względne wiązanie zarówno ludzkiego, jak i mysiego białka AGP3 w obecności i bez obecności ciała

PL 210 546 B1 peptydowego AGP3 (SEQ ID NO: 123). Oznaczono względną odpowiedź na wiązanie jako (RU-RU ślepej próby/RUo-RU ślepej próby). Ciało peptydowe AGP3 (SEQ ID NO: 123) inhibitowało wiązanie zarówno ludzkiego, jak i mysiego białka AGP3 do ich receptora TACI (rysunek fig. 10A i 10B).

W celu zbadania, czy to ciało peptydowe AGP3 blokuje wiązanie AGP3 ze wszystkimi trzema receptorami (TACI, BCMA oraz BAFFR), rekombinacyjne rozpuszczalne białka receptorów TACI, BCMA oraz BAFFR unieruchomiono na chipie CM5. Stosując 10 mM octan o pH4, ludzki TACI-Fc unieruchomiono do 6300 RU, ludzki BCMA-Fc - do 5000 RU, a BAFFR-Fc - do 6000 RU. 1 nM rekombinacyjne ludzkie AGP3 (w przepływającym buforze zawierającym 0,1 mg/ml BSA oraz 0,1 mg/ml heparyny) lub 1 nM rekombinacyjne białko APRIL (Yu, i wsp., Nat. Immunol., 1: 252-256, 2000) inkubowano wraz ze wskazanymi ilościami ciała peptydowego AGP3 przed naniesieniem na wszystkie powierzchnię receptora. Regenerację w doświadczeniu z AGP3 prowadzono stosując 8 mM glicyny o pH 1,5 przez 1 minutę, a następnie 25 mM CAPS o pH 10,5, 1M NaCl przez 1 minutę. Regenerację w doświadczeniu z APRIL prowadzono stosując 8 mM glicyny o pH 2 przez jedną minutę, a następnie 25 mM CAPS o pH 10,5, 1 M NaCl przez jedną minutę. Zmierzono względne wiązanie AGP3 lub APRIL. Ciało peptydowe AGP3 (SEQ ID NO: 123) blokowało wiązanie AGP3 ze wszystkimi trzema receptorami (rysunek fig. 11 A). Ciało peptydowe AGP3 nie miało wpływu na wiązanie APRIL z tymi receptorami (rysunek fig. 11B).

P r z y k ł a d 5. Ciało peptydowe AGP3 blokuje proliferację komórek B, w której pośredniczy

AGP3

Wyodrębniono mysie limfocyty B ze śledzion C57BL/6 w wyniku negatywnej selekcji. (MACS CD43 (Ly-48) Microbeads, Miltenyi Biotech, Aubum, CA). Prowadzono trzy równoległe hodowle oczyszczonych komórek B (10⁵) w minimalnej pożywce podstawowej (MEM), z dodatkiem 10% inaktywowanej termicznie cielęcej surowicy płodowej (FCS), 5 x 10⁺⁵ M 2-merkaptoetanolu, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny w płytkach do hodowli tkankowych o 96-zagłębieniach z płaskim dnem stosując 10 ng/ml białka AGP3 (TALL-1) oraz 2 μg/mL koziego F(ab')₂ antymysiej IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, Pennsylvania) ze wskazaniem ilości rekombinacyjnego ciała peptydowego AGP3 (SEQ ID NO: 123) przez okres 4 dni w temperaturze 37°C, 5% CO2. Proliferację oznaczono metodą przyłączenia znaczonej radioaktywnie ³[H] tymidyny po 18 godzinach inkubowania.

P r z y k ł a d 6. Wpływ ciała peptydowego AGP3 na produkcję Ig stymulowaną przez ciało peptydowe AGP3 u myszy

Myszy (Balb/c płci żeńskiej w wieku 9-14 tygodni i o masie ciała 19-21 gramów) zakupiono w firmie Charles River Laboratories, Wilmington, MA. Myszom (n = 10) podawano dootrzewnowo raz dziennie 1 mg/Kg ludzkiego AGP3 przez pięć kolejnych dni, a następnie 5 mg/Kg lub 0,5 mg/Kg ciała peptydowego AGP3 (SEQ ID NO: 123), bądź solanki lub 5 mg/Kg ludzkiego białka Fc. Inne myszy pozostawiono bez leczenia. Myszy uśmiercono szóstego dnia w celu zmierzenia poziomu IgM oraz IgA w surowicy, dokonując tych pomiarów metodą ELISA. Zwięźle, płytki powleczono przeciwciałami wyłapującymi, specyficznie IgM lub IgA (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), a następnie zablokowano, po czym dodano wzorzec w różnych rozcieńczeniach (IgM z firmy Calbiochem, San Diego, CA oraz IgA z firmy Southern Biotechnology Associates) lub badane próbki. Wychwyconą Ig uwolniono stosując biotynylowane przeciwciała specyficzne wobec IgM lub IgA (Southern Biotechnology Associates), peroksydazę sprzężoną z neutrawidyną peroksydazy (Pierce, Rockford, IL) oraz substrat peroksydazy do mikrostudni z tetrametylobenzydyną (TMB) (KPL, Gaithersburg, MD). Gęstości optyczne oznaczono ilościowo przy użyciu czytnika Thermomax ELISA (Molecular Devices, Menlo Park, CA).

Stymulowany ludzkim białkiem AGP3 wzrost poziomów IgM oraz IgA w surowicy był blokowany przy użyciu 5 mg/Kg ciała peptydowego anty-AGP3 (SEQ ID NO: 123), a przy 0,5 mg/Kg (rysunek fig. 12A oraz 12B) - nie był blokowany.

P r z y k ł a d 7. Ciało peptydowe AGP3 obniżało ilość komórek B śledziony u myszy

Myszom (jak wyżej, n = 7) podawano dootrzewnowo przez siedem kolejnych dni 5 mg/Kg lub 1,5 mg/Kg, lub 0,5 mg/Kg ciała peptydowego AGP3 (SEQ ID NO: 123), bądź też solankę lub 5 mg/Kg ludzkiego białka Fc. Myszy uśmiercono ósmego dnia w celu policzenia ilości komórek B w śledzionie. Śledziony zebrano, umieszczono w solance i delikatnie rozerwano prowadząc ręczną homogenizację, otrzymując zawiesinę komórek. Zliczono wszystkie komórki stosując licznik HIE (Teclmicon, Tarrytown, NY). Udział procentowy komórek B wyliczono stosując podwójne immunofluorescencyjne wybarwianie oraz cytometrię przepływową stosując przeciwciała wobec CD3 i B220 skoniugowane, od46

PL 210 546 B1 powiednio, z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) oraz fikoerytryną (PE) (FarMingen, San Diego, CA) i analizator FACScan (Becton and Dickinson, Mountain View, CA). Komórki B zidentyfikowano jako będące komórkami CD3-B220+. We wszystkich dawkach, ciało peptydowe AGP3 (SEQ ID NO: 123) obniżało ilość komórek B śledziony w sposób zależny od dawki (rysunek fig. 12A oraz 12B) (SEQ ID NO: 123).

T a b l i c a 8

Ciało peptydowe AGP3 obniża ilość komórek B u zwykłych myszy

n = 7	Dawka (1/dzień x 7)	Komórki B śledziony (1x10)	SD	t test
Solanka		51,3	9,6
Fc	5 mg/Kg	45,5	7,1
Ciało peptydowe	5 mg/Kg	20,1	3,8	1,37856E-05
	1,5 mg/Kg	22,6	6,9	5,10194E-05
	0,5 mg/Kg	25,8	3,6	0,000111409

P r z y k ł a d 8. Ciało peptydowe AGP3 obniżało nasilenie zapalenia stawów w mysim modelu CIA

Myszy DBA/1 w wieku od 8 do 12 tygodni (otrzymane z Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) immunizowano bydlęcym kolagenem typu II (bCII) (kupionym od University of Utah), przeprowadzonym w emulsję w kompletnym adiuwancie Freunda (Difco), wstrzykiwanym podskórnie w nasadę ogona. Za każdym razem wstrzykiwano 100 μg bCII w 100 pi. 3 tygodnie po wstępnej immunizacji przyspieszano rozwój choroby stosując bCII przeprowadzony w emulsję w niekompletnym adiuwancie Freunda. Leczenie rozpoczęto od dnia powtórnej immunizacji i kontynuowano przez 4 tygodnie. Myszy badano odnotowując rozwój zapalenia stawów. Jak uprzednio opisano (Khare i wsp., J. Immunol. 155: 3653-9, 1995), wszystkie cztery łapy oceniano indywidualnie stosując skalę od 0 do 3. Zatem, łączna ocena nasilenia objawów zapalenia stawów mogła się zmieniać od 0 do 12 w przypadku każdego zwierzęcia. Leczenie ciałem peptydowym AGP3 (SEQ ID NO: 123) wyraźnie obniżało nasilenie objawów zapalenia stawów (rysunek fig. 13).

Próbki surowicy pobrano jeden tydzień po ostatnim podaniu badanego środka leczniczego (dzień 35) w celu oznaczenia poziom przeciwciał antykolagen. Wysoko wiążące płytki ELISA (Immulon, Nunc) pokryto 50 μl roztworu bydlęcego CII w buforze węglanowym, o stężeniu 4 μg/ml i pokryte płytki przechowywano przez noc w chłodzie, w lodówce. Płytki przemyto trzykrotnie zimną wodą. Użyto 75 μl roztworu blokującego o składzie PBS/0,05% Tween 20/1% BSA przez godzinę do zablokowania niespecyficznego wiązania. Próbki rozcieńczono (buforem blokującym) przy użyciu płytek do rozcieńczeń, w stosunku 1:25, 1:100, 1:400 oraz 1:1600, a następnie 25 μl tych próbek dodano do każdego wgłębienia na płytce ELISA, aby końcowe rozcieńczenia wynosiły 100, 400, 1600 oraz 6400 przy ostatecznej objętości 100 μl/wgłębienie. Po inkubowaniu w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, płytki ponownie przemyto trzykrotnie. Dodano po 100 μl wtórnego przeciwciała rozcieńczonego w buforze blokującym (szczurze przeciwciało antymysia IgM, IgG2a, IgG2b, IgG1, IgG3-HRP) do każdego wgłębienia i płytki inkubowano przez co najmniej 2 godziny. Następnie, płytki przemyto czterokrotnie. Dodano 100 μl roztworu TMB (Sigma) do każdego wgłębienia i reakcję zatrzymano stosując 50 μl 25% kwasu siarkowego. Płytki odczytano stosując czytnik płytek ELISA przy 450 nm. OD porównano ze standardowym zbiorem danych wyrażonych w jednostkach/ml. Podawanie ciała peptydowego AGP3 (SEQ ID NO: 123) obniżało poziom przeciwciał antykolagen II IgG1, IgG3, IgG2a oraz IgG2b w surowicy w porównaniu z grupami kontrolnymi otrzymującymi PBS lub Fc (fig. 14).

P r z y k ł a d 9. Leczenie tocznia NZB/NZW u myszy ciałem peptydowym AGP3

Myszom ze skłonnością do tocznia NZBx NZBWF1, w wieku pięciu miesięcy podawano dootrzewnowo 3 x tydzień przez 8 tygodni PBS lub wskazane dawki ciała peptydowego AGP3, bądź ludzkiego białka Fc. Przed leczeniem wstępnie sprawdzono u zwierząt zawartość białka w moczu stosując paski z odczynnikiem Albustix (Bayer AG). Myszy, u których stwierdzono ponad 100 mg/dl białka w moczu nie zostały objęte badaniami. Białko w moczu oznaczano co miesiąc przez cały przez czas trwania eksperymentu. Podawanie ciała peptydowego AGP3 (SEQ ID NO: 123) opóźniało wystąpienie proteinurii oraz zwiększało przeżywalność (rysunek fig. 15A i 15B).

PL 210 546 B1

Lista Sekwencji <110> AMGEN INC.

<120> PEPTYDY ORAZ POKREWNE CZĄSTECZKI WIĄŻĄCE TALL-1 <130> A-743 (PCT) <140> PCT/US02/15273 <141> 2002-05-13 <150> US 60/290,196 <151> 2001-05-11 <160> 197 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 684 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(684) <400> 1

atg gac aaa

act Thr

cac aca

tgt Cys

cca Pro

cct Pro

tgt Cys 10

cca Pro

gct Ala

ccg Pro

gaa Glu

ctc Leu 15

ctg Leu

48

Met Asp 1

Lys

His 5

Thr

ggg

gga

ccg

tca

gtc

ttc

ctc

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

acc

ctc

96

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

20

25

30

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

gtc

aca

tgc

gtg

gac

gtg

agc

144

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

35

40

45

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

192

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

50

55

60

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

ccg

cgg

gag

cag

tac

aac

agc

acg

240

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

65

70

75

80

tac

cgt

gtg

gtc

agc

gtc

ctc

acc

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

288

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

85

90

95

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

gtc

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

gcc

ccc

336

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

100

105

110

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

gcc

aaa

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

384

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

115

120

125

PL 210 546 B1

gtg Val

tac Tyr 130

acc Thr

ctg Leu

ccc Pro

cca Pro

tcc Ser 135

cgg Arg

gat Asp

gag Glu

ctg Leu

acc Thr 140

aag Lys

aac Asn

cag Gin

gtc Val

432

agc

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

ggc

ttc

tat

ccc

agc

gac

atc

gcc

gtg

480

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

145

150

155

160

gag

tgg

gag

agc

aat

ggg

cag

ccg

gag

aac

tac

aag

acc

acg

cct

528

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

165

170

175

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

tcc

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

576

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

180

185

190

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

ggg

aac

gtc

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

624

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

195

200

205

atg

cat

gag

gct

ctg

cac

aac

cac

tac

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

672

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

210

215

220

tct

ccg

ggt

aaa

684

Ser

Pro

Gly

Lys

225 <210> 2 <211> 228 <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 2 Met Asp 1

> Lys

Thr

His 5

Thr

Cys

Pro

Cys 10

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu 15

Leu

Gly

Pro

Ser 20

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 25

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 30

Thr

Leu

Met

Ile

Ser 35

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 40

Thr

Cys

Val

Val 45

Asp

Val

Ser

His

Glu 50

Asp

Pro

Glu

Val

Lys 55

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 60

Asp

Gly

Val

Glu

Val 65

His

Asn

Ala

Lys

Thr 70

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu 75

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr 80

Tyr

Arg

Val

Ser 85

Val

Leu

Thr

Val

Leu 90

His

Gin

Asp

Trp

Leu 95

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

100 105 110

PL 210 546 B1

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220

Ser Pro 225

Gly Lys <210> 3 <211> 62 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Fragmenty Ndel do Sali <220>

<221> CDS <222> (2) .. (61) <400> 3 t atg ccg ggt act tgt ttc ccg ttc ccg tgg gaa tgc act cac gct ggt Met Pro Gly Thr Cys Phe Pro Phe Pro Trp Glu Cys Thr His Ala Gly 15 10 15 gga ggc ggt ggg g Gly Gly Gly Gly <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt Syntetyczny

PL 210 546 B1 <400> 4

Met Pro Gly Thr Cys Phe Pro Phe Pro Trp Glu Cys Thr His Ala Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly 20

<210> <211> <212> <213>	5 62 DNA Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Fragmenty Ndel do i
<220>
<221>	CDS
<222>	(2) . . (61)
<400>	5
t atg	tgg ggt gct tgt tgg
Met	Trp Gly Ala Cys Trp
1	5
gga ggc ggt ggg g

Gly Gly Gly Gly 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223>

Konstrukt Syntetyczny <400> 6

Met Trp Gly Ala Cys Trp Pro Phe Pro Trp Glu Cys Phe Lys Glu Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly 20

<210>	7
<211>	62
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Fragmenty Ndel do Salls
<220>
<221>	CDS
<222>	(2) . . (61)

PL 210 546 B1 <400> 7 t atg gtt ccg ttc tgt gac ctg ctg act aaa cac tgt ttc gaa get ggt Met Val Pro Phe Cys Asp Leu Leu Thr Lys His Cys Phe Glu Ala Gly 15 10 15 gga ggc ggt ggg g Gly Gly Gly Gly <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt Syntetyczny <400> 8

Met Val Pro Phe Cys Asp Leu Leu Thr Lys His Cys Phe Glu Ala Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly 20

<210> <211> <212> <213>	9 74 DNA Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Fragmenty Ndel do
<220>
<221>	CDS
<222>	(2)..(73)
<400>	9
t atg	ggt tct cgt tgt aaa
Met	Gly Ser Arg Cys Lys

ttc cac cac ggt gga ggc ggt ggg g Phe His His Gly Gly Gly Gly Gly

<210> <211> <212> <213>	10 24 PRT Sekwencja	sztuczna
<220> <223>	Konstrukt	Syntetyczny

PL 210 546 B1 <400> 10

Met Gly Ser Arg Cys Lys Tyr Lys Trp Asp Val Leu Thr Lys Gin Cys 15 10 15

Phe His His Gly Gly Gly Gly Gly 20

<210> <211> <212> <213>	11 74 DNA Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Fragmenty Ndel do ;
<220>
<221>	CDS
<222>	(2) . . (73)
<400>	11
t atg	ctg ccg ggt tgt aaa
Met	Leu Pro Gly Cys Lys

gac ccg ctg ggt gga ggc ggt ggg g Asp Pro Leu Gly Gly Gly Gly Gly <210> 12 <211> 24 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt Syntetyczny <400> 12

Met Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gin Trp Val Cys 15 10 15

Asp Pro Leu Gly Gly Gly Gly Gly 20

<210>	13
<211>	74
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Fragmenty Ndel do Salls
<220>
<221>	CDS
<222>	(2)..(73)

PL 210 546 B1 <400> 13 t atg tet gct gac tgt tac ttc gac atc ctg act aaa tet gac gtt tgt Met Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Cys 15 10 15 act tet tet ggt gga ggc ggt ggg g Thr Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

PRT

Sekwencja sztuczna

Konstrukt Syntetyczny <400> 14

Met Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Cys 15 10 15

Thr Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly 20

<210> <211> <212> <213>	15 74 DNA Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Fragmenty Ndel do !
<220>
<221>	CDS
<222>	(2)..(73)
<400>	15
t atg	tet gac gac tgt atg
Met	Ser Asp Asp Cys Met

tet aac ctg ggt gga ggc ggt ggg g Ser Asn Leu Gly Gly Gly Gly Gly <210> 16 <211> 24 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223>

Konstrukt Syntetyczny <400> 16

Met Ser Asp Asp Cys Met Tyr Asp Gin Leu Thr Arg Met Phe Ile Cys 15 10 15

PL 210 546 B1

Ser Asn Leu Gly Gly Gly Gly Gly 20

<210>	17
<211>	76
<212>	DNA
<213>	Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Fragmenty	Ndel	do :
<220>
<221>	CDS
<222>	(2) . . (73)
<400>	17
t atg	gac ctg aac	; tgt	aaa
Met	Asp Leu Asn	, Cys	Lys

cag ttc aac ggg gtg gag gcg gtg ggg Gin Phe Asn Gly Val Glu Ala Val

<210>	18
<211>	24
<212>	PRT
<213>	Sekwenc ja s z tuczna
<220>
<223>	Konstrukt Syntetyczny
<400>	18
Met Asp	i Leu Asn Cys Lys Tyr ,
1	5
Gin Phe	i Asn Gly Val Glu Ala '

<210>	19
<211>	74
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Fragmenty Ndel do Salls
<220>
<221>	CDS
<222>	(2) . . (73)

PL 210 546 B1 <400> 19 t atg ttc cac gac tgt aaa tac gac ctg ctg act cgt cag atg gtt tgt Met Phe His Asp Cys Lys Tyr Asp Leu Leu Thr Arg Gin Met Val Cys 15 10 15 cac ggt ctg ggt gga ggc ggt ggg g His Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly <210> 20 <211> 24 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt Syntetyczny <400> 20

Met Phe His Asp Cys Lys Tyr Asp Leu Leu Thr Arg Gin Met Val Cys 15 10 15

His Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly 20

<210>	21
<211>	74
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Fragmenty Ndel	do
<220>
<221>	CDS
<222>	(2)..(73)
<400>	21
t atg	cgt aac cac tgt	ttc
Met	Arg Asn His Cys	Phe

ccg tct ccg ggt gga ggc ggt ggg g Pro Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly <210> 22 <211> 24 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt Syntetyczny

PL 210 546 B1 <400> 22

Met Arg Asn His Cys Phe Trp Asp His Leu Leu Lys Gin Asp Ile Cys 15 10 15

Pro Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly 20 <210> 23 <211> 74 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Fragmenty Ndel do Salls <220>

<221> CDS <222> (2)..(73) <400> 23 t atg gct aac cag tgt tgg tgg gac tct ctg ctg aaa aaa aac gtt tgt Met Ala Asn Gin Cys Trp Trp Asp Ser Leu Leu Lys Lys Asn Val Cys 15 10 15 gaa ttc ttc ggt gga ggc ggt ggg g

Glu Phe Phe Gly Gly Gly Gly Gly 20 <210> 24 <211> 24 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt Syntetyczny <400> 24

Met Ala Asn Gin Cys Trp Trp Asp Ser Leu Leu Lys Lys Asn Val Cys 15 10 15

Glu Phe Phe Gly Gly Gly Gly Gly 20

<210>	25
<211>	74
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Fragmenty Ndel do Salls
<220>
<221>	CDS
<222>	(2) . . (73)

PL 210 546 B1 <400> 25 t atg ttc cac gac tgc aaa tgg gac ctg ctg acc aaa cag tgg gtt tgc Met Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Val Cys 15 10 15 cac ggt ctg ggt gga ggc ggt ggg g His Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly <210> 26 <211> 24 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Konstrukt Syntetyczny <400> 26

Met Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Val Cys 15 10 15

His Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly 20 <210> 27 <211> 7285 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> wektor pAMG21-Rank-Fc <400> 27

gatcagcagt	ccccggaaca	tcgtagctga	cgccttcgcg	ttgctcagtt	gtccaacccc	60
ggaaacggga	aaaagcaagt	tttccccgct	cccggcgttt	caataactga	aaaccatact	120
atttcacagt	ttaaatcaca	ttaaacgaca	gtaatccccg	ttgatttgtg	cgccaacaca	180
gatcttcgtc	acaattctca	agtcgctgat	ttcaaaaaac	tgtagtatce	tctgcgaaac	240
gatccctgtt	tgagtattga	ggaggcgaga	tgtogcagac	agaaaatgca	gtgacttcct	300
cattgagtca	aaagcggttt	gtgcgcagag	gtaagcctat	gactgactct	gagaaacaaa	360
tggccgttgt	tgcaagaaaa	cgtcttacac	acaaagagat	aaaagttttt	gtcaaaaatc	420
ctctgaagga	tctcatggtt	gagtactgcg	agagagaggg	gataacacag	gctcagttcg	480
ttgagaaaat	catcaaagat	gaactgcaaa	gactggatat	actaaagtaa	agactttact	540
ttgtggcgta	gcatgctaga	ttactgatcg	tttaaggaat	tttgtggctg	gccacgccgt	600
aaggtggcaa	ggaactggtt	ctgatgtgga	tttacaggag	ccagaaaagc	aaaaaccccg	660

PL 210 546 B1

ataatcttct	tcaacttttg	cgagtacgaa	aagattaccg	gggcccactt	aaaccgtata	720
gccaacaatt	cagctatgcg	gggagtatag	ttatatgccc	ggaaaagttc	aagacttctt	780
tctgtgctcg	ctccttctgc	gcattgtaag	tgcaggatgg	tgtgactgat	cttcaccaaa	840
cgtattaccg	ccaggtaaag	aacccgaatc	cggtgtttac	accccgtgaa	ggtgcaggaa	900
cgctgaagtt	ctgcgaaaaa	ctgatggaaa	aggcggtggg	cttcacttcc	cgttttgatt	960
tcgccattca	tgtggcgcac	gcccgttcgc	gtgatctgcg	tcgccgtatg	ccaccagtgc	1020
tgcgtcgtcg	ggctattgat	gcgctcttgc	aggggctgtg	tttccactat	gacccgctgg	1080
ccaaccgcgt	ccagtgctcc	atcaccacgc	tggccattga	gtgcggactg	gcgacggagt	1140
ctgctgccgg	aaaactctcc	atcacccgtg	ccacccgtgc	cctgacgttc	ctgtcagagc	1200
tgggactgat	tacctaccag	acggaatatg	acccgcttat	cgggtgctac	attccgaccg	1260
atatcacgtt	cacatctgca	ctgtttgctg	ccctcgatgt	atcagaggag	gcagtggccg	1320
ccgcgcgccg	cagccgtgtg	gtatgggaaa	acaaacaacg	caaaaagcag	gggctggata	1380
ccctgggcat	ggatgaactg	atagcgaaag	cctggcgttt	tgttcgtgag	cgttttcgca	1440
gttatcagac	agagcttaag	tcccgtggaa	taaagcgtgc	ccgtgcgcgt	cgtgatgcgg	1500
acagggaacg	tcaggatatt	gtcaccctgg	tgaaacggca	gctgacgcgc	gaaatcgcgg	1560
aagggcgctt	cactgccaat	cgtgaggcgg	taaaacgcga	agttgagcgt	cgtgtgaagg	1620
agcgcatgat	tctgtcacgt	aaccgtaatt	acagccggct	ggccacagct	tccccctgaa	1680
agtgacctcc	tctgaataat	ccggcctgcg	ccggaggctt	ccgcacgtct	gaagcccgac	1740
agcgcacaaa	aaatcagcac	cacatacaaa	aaacaacctc	atcatccagc	ttctggtgca	1800
tccggccccc	cctgttttcg	atacaaaaca	cgcctcacag	acggggaatt	ttgcttatcc	1860
acattaaact	gcaagggact	tccccataag	gttacaaccg	ttcatgtcat	aaagcgccat	1920
ccgccagcgt	tacagggtgc	aatgtatctt	ttaaacacct	gtttatatct	cctttaaact	1980
acttaattac	attcatttaa	aaagaaaacc	tattcactgc	ctgtccttgg	acagacagat	2040
atgcacctcc	caccgcaagc	ggcgggcccc	taccggagcc	gctttagtta	caacactcag	2100
acacaaccac	cagaaaaacc	ccggtccagc	gcagaactga	aaccacaaag	cccctccctc	2160
ataactgaaa	agcggccccg	ccccggtccg	aagggccgga	acagagtcgc	ttttaattat	2220
gaatgttgta	actacttcat	catcgctgtc	agtcttctcg	ctggaagttc	tcagtacacg	2280
ctcgtaagcg	gccctgacgg	occgctaacg	cggagatacg	ccccgacttc	gggtaaaccc	2340
tcgtcgggac	cactccgacc	gcgcacagaa	gctctctcat	ggctgaaagc	gggtatggtc	2400

PL 210 546 B1

tggcagggct	ggggatgggt	aaggtgaaat	ctatcaatca	gtaccggctt	acgccgggct	2460
tcggcggttt	tactcctgtt	tca ta ta tga	aacaacaggt	caccgccttc	catgccgctg	2520
atgcggcata	tcctggtaac	gatatctgaa	ttgttataca	tgtgtatata	cg tgg taa tg	2580
acaaaaatag	gacaagttaa	aaatttacag	gcgatgcaat	gattcaaaca	cgtaatcaat	2640
atcgggggtg	ggcgaagaac	tccagcatga	gatccccgcg	ctggaggatc	atccagccgg	2700
cgtcccggaa	aacgattccg	aagcccaacc	tttcatagaa	ggcggcggtg	gaatcgaaat	2760
ctcgtgatgg	caggttgggc	gtcgcttggt	cggtcatttc	gaaccccaga	gtcccgctca	2820
gaagaactcg	tcaagaaggc	gatagaaggc	gatgcgctgc	gaatcgggag	cggcgatacc	2880
gtaaagcacg	aggaagcggt	cagcccattc	gccgccaagc	tcttcagcaa	tatcacgggt	2940
agccaacgct	atgtcctgat	agcggtccgc	cacacccagc	cggccacagt	cgatgaatcc	3000
agaaaagcgg	ccattttcca	ccatgatatt	cggcaagcag	gcatcgccat	gagtcacgac	3060
gagatcctcg	ccgtcgggca	tgcgcgcctt	gagcctggcg	aacagttcgg	ctggcgcgag	3120
cccctgatgc	tcttcgtcca	gatcatcctg	atcgacaaga	ccggcttcca	tccgagtacg	3180
tgctcgctcg	atgcgatgtt	tcgcttggtg	gtcgaatggg	caggtagccg	gatcaagcgt	3240
atgcagccgc	cgcattgcat	cagccatgat	ggatactttc	tcggcaggag	caaggtgaga	3300
tgacaggaga	tcctgccccg	gcacttcgcc	caatagcagc	cagtcccttc	ccgcttcagt	3360
gacaacgtcg	agcacagctg	cgcaaggaac	gcccgtcgtg	gccagccacg	atagccgcgc	3420
tgcctcgtcc	tgcaattcat	tcaggacacc	ggacaggtcg	gtcttgacaa	aaagaaccgg	3480
gcgcccctgc	gctgacagcc	ggaacacggc	ggcatcagag	cagccgattg	tctgttgtgc	3540
ccagtcatag	ccgaatagcc	tctccaccca	agcggccgga	gaacctgcgt	gcaatccatc	3600
ttgttcaatc	atgcgaaacg	atcctcatcc	tgtctcttga	tctgatcttg	atcccctgcg	3660
ccatcagatc	cttggcggca	agaaagccat	ccagtttact	ttgcagggct	tcccaacctt	3720
accagagggc	gccccagctg	gcaattccgg	ttcgcttgct	gtccataaaa	ccgcccagtc	3780
tagctatcgc	catgtaagcc	cactgcaagc	tacctgcttt	ctctttgcgc	ttgcgttttc	3840
ccttgtccag	atagcccagt	agctgacatt	catccggggt	cagcaccgtt	tctgcggact	3900
ggctttctac	gtgttccgct	tcctttagca	gcccttgcgc	cctgagtgct	tgcggcagcg	3960
tgaagctaca	tatatgtgat	ccgggcaaat	cgctgaatat	tccttttgtc	tccgaccatc	4020
aggcacctga	gtcgctgtct	ttttcgtgac	attcagttcg	ctgcgctcac	ggctctggca	4080
gtgaatgggg	gtaaatggca	ctacaggcgc	cttttatgga	ttcatgcaag	gaaactaccc	4140

PL 210 546 B1

ataatacaag	aaaagcccgt	cacgggcttc	tcagggcgtt	ttatggcggg	tctgctatgt	4200
ggtgctatct	gactttttgc	tgttcagcag	ttcctgccct	ctgattttcc	agtctgacca	4260
cttcggatta	tcccgtgaca	ggtcattcag	actggctaat	gcacccagta	aggcagcggt	4320
atcatcaaca	ggcttacccg	tcttactgtc	gaagacgtgc	gtaacgtatg	catggtctcc	4380
ccatgcgaga	gtagggaact	gccaggcatc	aaataaaacg	aaaggctcag	tcgaaagact	4440
gggcctttcg	ttttatctgt	tgtttgtcgg	tgaacgctct	cctgagtagg	acaaatccgc	4500
cgggagcgga	tttgaacgtt	gcgaagcaac	ggcccggagg	gtggcgggca	ggacgcccgc	4560
cataaactgc	caggcatcaa	attaagcaga	aggccatcct	gacggatggc	ctttttgcgt	4620
ttctacaaac	tcttttgttt	atttttctaa	atacattcaa	atatggacgt	cgtacttaac	4680
ttttaaagta	tgggcaatca	attgctcctg	ttaaaattgc	tttagaaata	ctttggcagc	4740
ggtttgttgt	attgagtttc	atttgcgcat	tggttaaatg	gaaagtgacc	gtgcgcttac	4800
tacagoctaa	tatttttgaa	atatcccaag	agctttttcc	ttcgcatgcc	cacgctaaac	4860
attctttttc	tcttttggtt	aaatcgttgt	ttgatttatt	atttgctata	tttatttttc	4920
gataattatc	aactagagaa	ggaacaatta	atggtatgtt	catacacgca	tgtaaaaata	4980
aactatctat	atagttgtct	ttctctgaat	gtgcaaaact	aagcattccg	aagccattat	5040
tagcagtatg	aatagggaaa	ctaaacccag	tgataagacc	tgatgatttc	gcttctttaa	5100
ttacatttgg	agatttttta	tttacagcat	tgttttcaaa	tatattccaa	ttaatcggtg	5160
aatgattgga	gttagaataa	tctactatag	gatcatattt	tattaaatta	gcgtcatcat	5220
aatattgcct	ccatttttta	gggtaattat	ccagaattga	aatatcagat	ttaaccatag	5280
aatgaggata	aatgatcgcg	agtaaataat	attcacaatg	taccatttta	gtcatatcag	5340
ataagcattg	attaatatca	ttattgcttc	tacaggcttt	aattttatta	attattctgt	5400
aagtgtcgtc	ggcatttatg	tctttcatac	ccatctcttt	atccttacct	attgtttgtc	5460
gcaagttttg	cgtgttatat	atcattaaaa	cggtaataga	ttgacatttg	attctaataa	5520
attggatttt	tgtcacacta	ttatatcgct	tgaaatacaa	ttgtttaaca	taagtacctg	5580
taggatcgta	caggtttacg	caagaaaatg	gtttgttata	gtcgattaat	cgatttgatt	5640
ctagatttgt	tttaactaat	taaaggagga	ataacatatg	atcgctccac	catgcaccag	5700
tgagaagcat	tatgagcatc	tgggacggtg	ctgtaacaaa	tgtgaaccag	gaaagtacat	5760
gtcttctaaa	tgcactacta	cctctgacag	tgtatgtctg	ccctgtggcc	cggatgaata	5820
cttggatagc	tggaatgaag	aagataaatg	cttgctgcat	aaagtttgtg	atacaggcaa	5880

PL 210 546 B1

ggccctggtg	gccgtggtcg	ccggcaacag	tacgaccccc	cggcgctgcg	cgtgcacggc	5940
tgggtaccac	tggagccagg	actgcgagtg	ctgccgccgc	aacaccgagt	gcgcgccggg	6000
cctgggcgcc	cagcacccgt	tgcagctcaa	caaggacaca	gtgtgcaaac	cttgccttgc	6060
aggctacttc	tctgatgcct	tttcctccac	ggacaaatgc	agaccctgga	ccaactgtac	6120
cttccttgga	aagagagtag	aacatcatgg	gacagagaaa	tccgatgtgg	tttgcagttc	6180
ttctctgcca	gctagaaaac	caccaaatga	accccatgtt	tacgtcgaca	aaactcacac	6240
atgtccacct	tgtccagctc	cggaactcct	ggggggaccg	tcagtcttcc	tcttcccccc	6300
aaaacccaag	gacaccctca	tgatctcccg	gacccctgag	gtcacatgcg	tggtggtgga	6360
cgtgagccac	gaagaccctg	aggtcaagtt	caactggtac	gtggacggcg	tggaggtgca	6420
taatgccaag	acaaagccgc	gggaggagca	gtacaacagc	acgtaccgtg	tggtcagcgt	6480
cctcaccgtc	ctgcaccagg	actggctgaa	tggcaaggag	tacaagtgca	aggtctccaa	6540
caaagccctc	ccagccccca	tcgagaaaac	catctccaaa	gccaaagggc	agccccgaga	6600
accacaggtg	tacaccctgc	ccccatcccg	gga tgagc tg	accaagaacc	aggtcagcct	6660
gacctgcctg	gtcaaaggct	tctatcccag	cgacatcgcc	gtggagtggg	agagcaatgg	6720
gcagccggag	aacaactaca	agaccacgcc	tcccgtgctg	gactccgacg	gctccttctt	6780
cctctacagc	aagctcaccg	tggacaagag	caggtggcag	caggggaacg	tcttctcatg	6840
ctccgtgatg	catgaggctc	tgcacaacca	ctacacgcag	aagagcctct	ccctgtctcc	6900
gggtaaataa	tggatccgcg	gaaagaagaa	gaagaagaag	aaagcccgaa	aggaagctga	6960
gttggctgct	gccaccgctg	agcaataact	agcataaccc	cttggggcct	ctaaacgggt	7020
cttgaggggt	tttttgctga	aaggaggaac	cgctcttcac	gctcttcacg	cggataaata	7080
agtaacgatc	cggtccagta	atgacctcag	aactccatct	ggatttgttc	agaacgctcg	7140
gttgccgccg	ggcgtttttt	attggtgaga	atcgcagcaa	cttgtcgcgc	caatcgagcc	7200
atgtcgtcgt	caacgacccc	ccattcaaga	acagcaagca	gcattgagaa	ctttggaatc	7260
cagtccctct	tccacctgct	gac cg				7285

<210> 28 <211> 7285

<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	wektor pAMG21-Rank

PL 210 546 B1 <220>

<221> inne cechy <223> Xaa (Ροζ .1,2,3,15,16,17) oznaczają niezależnie reszty aminokwasowe lub ich brak,

Xaa (Poz.5,6,7,9,13) oznaczają niezależnie reszty aminokwasowe, <400> 28

Gly 1

Ala

Thr

Cys

Ala 5

Gly

Cys

Ala

Gly

Thr 10

Cys

Gly 15

Gly

Ala

Cys

Ala 20

Thr

Cys

Gly

Thr

Ala 25

Gly

Cys

Thr

Gly

Ala 30

Cys

Gly

Cys

Thr 35

Thr

Cys

Gly

Cys

Gly 40

Thr

Gly

Cys

Thr 45

Cys

Ala

Gly

Thr

Thr 50

Gly

Thr

Cys

Ala 55

Ala

Cys

Cys 60

Gly

Ala

Ala 65

Cys

Gly

Ala 70

Ala

Gly 75

Cys

Ala

Gly

Thr 80

Thr

Cys

Cys 85

Cys

Gly

Cys

Thr 90

Cys

Gly

Gly 95

Cys

Gly

Thr

Thr 100

Cys

Ala

Thr

Ala 105

Ala

Cys

Thr

Gly

Ala 110

Ala

Cys

Cys 115

Ala

Thr

Ala

Cys

Thr 120

Ala

Thr

Cys 125

Ala

Cys

Ala

Gly

Thr 130

Thr

Ala

Ala 135

Thr

Cys

Ala

Cys

Ala 140

Thr

Ala

Ala 145

Cys

Gly

Ala

Cys

Ala 150

Gly

Thr

Ala

Thr 155

Cys

Gly 160

Thr

Gly

Ala

Thr 165

Thr

Gly

Thr

Gly 170

Cys

Gly

Cys

Ala 175

Ala

Cys

Ala

Cys

Ala 180

Gly

Ala

Thr

Cys

Thr 185

Thr

Cys

Gly

Thr

Cys 190

Ala

Cys

Ala

Thr 195

Thr

Cys

Thr

Cys

Ala 200

Ala

Gly

Thr

Cys

Gly 205

Cys

Thr

Gly

Ala

Thr 210

Thr

Cys

Ala

Ala 215

Ala

Cys 220

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly 225

Thr

Ala

Thr

Cys

Cys 230

Thr

Cys

Thr

Gly

Cys 235

Gly

Ala

Cys 240

Gly

Ala

Thr

Cys

Cys 245

Cys

Thr

Gly

Thr

Thr 250

Thr

Gly

Ala

Gly

Thr 255

Ala

Thr

Gly

Ala

Gly

Ala

Gly

Cys

Gly

Ala

Gly

Ala

Thr

Gly

260 265 270

PL 210 546 B1

Thr

Cys

Gly 275

Cys

Ala

Gly

Ala

Cys 280

Ala

Gly

Ala

Ala 285

Ala

Thr

Gly

Cys

Ala 290

Gly

Thr

Gly

Ala

Cys 295

Thr

Cys

Thr 300

Cys

Ala

Thr

Gly 305

Ala

Gly

Thr

Cys

Ala 310

Ala

Gly

Cys 315

Gly

Thr

Thr 320

Gly

Thr

Gly

Cys

Gly 325

Cys

Ala

Gly

Ala

Gly 330

Gly

Thr

Ala

Gly 335

Cys

Thr

Ala

Thr 340

Gly

Ala

Cys

Thr

Gly 345

Ala

Cys

Thr

Cys

Thr 350

Gly

Ala

Gly

Ala

Ala 355

Ala

Cys

Ala

Ala 360

Thr

Gly

Cys

Cys 365

Gly

Thr

Gly

Thr 370

Thr

Gly

Cys

Ala

Ala 375

Gly

Ala

Ala 380

Cys

Gly

Thr

Cys

Thr 385

Thr

Ala

Cys

Ala

Cys 390

Ala

Cys

Ala

Ala 395

Gly

Ala

Gly

Ala

Thr 400

Ala

Gly 405

Thr

Thr 410

Gly

Thr

Cys

Ala

Ala 415

Ala

Thr

Cys 420

Cys

Thr

Cys

Thr

Gly 425

Ala

Gly

Ala 430

Thr

Cys

Thr

Cys

Ala 435

Thr

Gly

Thr

Thr 440

Gly

Ala

Gly

Thr

Ala 445

Cys

Thr

Gly

Cys

Gly 450

Ala

Gly

Ala

Gly

Ala 455

Gly

Ala

Gly

Gly 460

Gly

Ala

Thr

Ala

Ala 465

Cys

Ala

Cys

Ala

Gly 470

Gly

Cys

Thr

Cys

Ala 475

Gly

Thr

Cys

Gly 480

Thr

Gly

Ala

Gly 485

Ala

Thr 490

Cys

Ala

Thr

Cys

Ala 495

Ala

Gly

Ala

Thr 500

Gly

Ala

Cys

Thr 505

Gly

Cys

Ala

Ala 510

Gly

Ala

Cys

Thr

Gly 515

Gly

Ala

Thr

Ala

Thr 520

Ala

Cys

Thr

Ala

Ala 525

Ala

Gly

Thr

Ala

Ala 530

Ala

Gly

Ala

Cys

Thr 535

Thr

Ala

Cys

Thr 540

Thr

Gly

Thr

Gly 545

Gly

Cys

Gly

Thr

Ala 550

Gly

Cys

Ala

Thr

Gly 555

Cys

Thr

Ala

Gly

Ala 560

Thr

Ala

Cys

Thr 565

Gly

Ala

Thr

Cys

Gly 570

Thr

Ala

Ala 575

Gly

PL 210 546 B1

Gly Ala Ala Thr Thr Thr Thr Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys 580 585 590

Cys Ala Cys Gly Cys Cys Gly Thr Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys 595 600 605

Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ala 610 615 620

Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Cys Ala Gly Gly Ala Gly

625 630 635 640

Cys Cys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys

645 650 655

Cys Cys Cys Gly Ala Thr Ala Ala Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys 660 665 670

Ala Ala Cys Thr Thr Thr Thr Gly Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Gly 675 680 685

Ala Ala Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ala Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys 690 695 700

Cys Cys Ala Cys Thr Thr Ala Ala Ala Cys Cys Gly Thr Ala Thr Ala 705 710 715 720

Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Ala 725 730 735

Thr Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Thr Ala Thr Ala Gly Thr Thr 740 745 750

Ala Thr Ala Thr Gly Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Gly Thr 755 760 765

Thr Cys Ala Ala Gly Ala Cys Thr Thr Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly 770 775 780

Thr Gly Cys Thr Cys Gly Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys

785 790 795 800

Gly Cys Ala Thr Thr Gly Thr Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly

805 810 815

Ala Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Ala Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr 820 825 830

Thr Cys Ala Cys Cys Ala Ala Ala Cys Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys 835 840 845

Cys Gly Cys Cys Ala Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys 850 855 860

PL 210 546 B1

Cys 865

Gly

Ala

Thr

Cys 870

Cys

Gly

Thr

Gly 875

Thr

Ala

Cys 880

Ala

Cys

Cys 885

Gly

Thr

Gly

Ala

Ala 890

Gly

Thr

Gly

Cys 895

Ala

Gly

Ala

Ala 900

Cys

Gly

Cys

Thr

Gly 905

Ala

Gly

Thr

Thr 910

Cys

Thr

Gly

Cys

Gly 915

Ala

Ala 920

Cys

Thr

Gly

Ala

Thr 925

Gly

Ala

Ala 930

Ala

Gly

Cys

Gly 935

Gly

Thr

Gly

Gly 940

Cys

Thr

Cys

Ala 945

Cys

Thr

Cys

Cys 950

Cys

Gly

Thr

Thr 955

Thr

Gly

Ala

Thr

Thr 960

Thr

Cys

Gly

Cys

Cys 965

Ala

Thr

Cys

Ala 970

Thr

Gly

Thr

Gly

Gly 975

Cys

Gly

Cys

Ala

Cys 980

Gly

Cys

Gly 985

Thr

Cys

Gly

Cys 990

Gly

Thr

Gly

Ala

Thr

Cys

Thr

Gly

Cys

Gly

Thr

Cys

Gly

Cys

Gly

Thr

Ala

995 1000 1005

Thr

Gly 1010

Cys

Ala

Cys

Cys 1015

Ala

Gly

Thr

Gly

Cys 1020

Thr

Gly

Cys

Gly

Thr 1025

Cys

Gly

Thr

Cys

Gly 1030

Gly

Cys

Thr

Ala 1035

Thr

Gly

Ala

Thr 1040

Gly

Cys

Gly

Cys

Thr 1045

Cys

Thr

Gly

Cys 1050

Ala

Gly

Gly 1055

Cys

Thr

Gly

Thr

Gly 1060

Thr

Cys

Cys 1065

Ala

Cys

Thr

Ala

Thr 1070

Gly

Ala

Cys

Cys 1075

Gly

Cys

Thr

Gly

Gly 1080

Cys

Ala

Cys 1085

Cys

Gly

Cys

Gly

Thr 1090

Cys

Ala

Gly

Thr 1095

Gly

Cys

Thr

Cys

Cys 1100

Ala

Thr

Cys

Ala

Cys 1105

Cys

Ala

Cys

Gly

Cys 1110

Thr

Gly

Cys

Cys 1115

Ala

Thr

Gly

Ala 1120

Gly

Thr

Gly

Cys

Gly 1125

Gly

Ala

Cys

Thr

Gly 1130

Gly

Cys

Gly

Ala

Cys 1135

Gly

Ala

Gly

Thr 1140

Cys

Thr

Gly

Cys

Thr 1145

Gly

Cys

Gly

Gly 1150

Ala

Cys 1155

Thr

Cys

Thr

PL 210 546 B1

Cys

Cys 1160

Ala

Thr

Cys

Ala

Cys 1165

Cys

Gly

Thr

Gly 1170

Cys

Ala

Cys

Cys 1175

Cys

Gly

Thr

Gly

Cys 1180

Cys

Thr

Gly

Ala 1185

Cys

Gly

Thr

Cys 1190

Cys

Thr

Gly

Thr

Cys 1195

Ala

Gly

Ala

Gly

Cys 1200

Thr

Gly

Ala 1205

Cys

Thr

Gly

Ala

Thr 1210

Thr

Ala

Cys

Thr 1215

Ala

Cys

Ala

Gly 1220

Ala

Cys

Gly

Ala 1225

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly 1230

Ala

Cys

Gly 1235

Cys

Thr

Ala

Thr 1240

Cys

Gly

Thr 1245

Gly

Cys

Thr

Ala

Cys 1250

Ala

Thr

Cys

Cys 1255

Gly

Ala

Cys

Gly 1260

Ala

Thr

Ala

Thr

Cys 1265

Ala

Cys

Gly

Thr

Thr 1270

Cys

Ala

Cys

Ala

Thr 1275

Cys

Thr

Gly

Cys

Ala 1280

Cys

Thr

Gly

Thr

Thr 1285

Thr

Gly

Cys

Thr

Gly 1290

Cys

Thr

Cys 1295

Gly

Ala

Thr

Gly

Thr 1300

Ala

Thr

Cys

Ala

Gly 1305

Ala

Gly

Ala

Gly 1310

Gly

Cys

Ala

Gly

Thr 1315

Gly

Cys

Gly 1320

Cys

Gly

Cys

Gly 1325

Cys

Gly

Cys

Gly 1330

Cys

Ala

Gly

Cys

Cys 1335

Gly

Thr

Gly

Thr

Gly 1340

Gly

Thr

Ala

Thr

Gly 1345

Gly

Ala

Ala 1350

Ala

Cys

Ala

Ala 1355

Cys

Ala

Cys

Gly 1360

Cys

Ala

Ala 1365

Ala

Gly

Cys

AJ a

Gly 1370

Gly

Cys

Thr 1375

Gly

Ala

Thr

Ala 1380

Cys

Thr

Gly 1385

Gly

Cys

Ala

Thr 1390

Gly

Ala

Thr

Gly 1395

Ala

Cys

Thr

Gly 1400

Ala

Thr

Ala

Gly

Cys 1405

Gly

Ala

Gly 1410

Cys

Thr

Gly

Gly 1415

Cys

Gly

Thr

Thr 1420

Thr

Gly

Thr

Cys 1425

Gly

Thr

Gly

Ala

Gly 1430

Cys

Gly

Thr

Thr 1435

Thr

Cys

Gly

Cys

Ala 1440

Gly

Thr

PL 210 546 B1

Ala

Thr 1445

Cys

Ala

Gly

Ala

Cys 1450

Ala

Gly

Ala

Gly

Cys 1455

Thr

Ala

Gly 1460

Thr

Cys

Gly 1465

Thr

Gly

Ala

Ala 1470

Thr

Ala

Gly 1475

Cys

Gly

Thr

Gly

Cys 1480

Cys

Gly

Thr

Gly 1485

Cys

Gly

Cys

Gly

Thr 1490

Cys

Gly

Thr

Gly

Ala 1495

Thr

Gly

Cys

Gly

Gly 1500

Ala

Cys

Ala

Gly

Gly 1505

Gly

Ala

Cys

Gly 1510

Thr

Cys

Ala

Gly

Gly 1515

Ala

Thr

Ala

Thr

Thr 1520

Gly

Thr

Cys

Ala

Cys 1525

Cys

Thr

Gly

Gly 1530

Thr

Gly

Ala

Ala 1535

Cys

Gly

Cys

Ala 1540

Gly

Cys

Thr

Gly

Ala 1545

Cys

Gly

Cys

Gly

Cys 1550

Gly

Ala

Thr 1555

Cys

Gly

Cys

Gly

Gly 1560

Ala

Gly

Gly 1565

Cys

Gly

Cys

Thr

Thr 1570

Cys

Ala

Cys

Thr

Gly 1575

Cys

Ala

Thr 1580

Cys

Gly

Thr

Gly

Ala 1585

Gly

Cys

Gly

Gly 1590

Thr

Ala

Ala 1595

Cys

Gly

Cys

Gly

Ala 1600

Ala

Gly

Thr

Gly 1605

Ala

Gly

Cys

Gly

Thr 1610

Cys

Gly

Thr

Gly

Thr 1615

Gly

Ala

Gly

Gly 1620

Ala

Gly

Cys

Gly

Cys 1625

Ala

Thr

Gly

Ala

Thr 1630

Thr

Cys

Thr

Gly

Thr 1635

Cys

Ala

Cys

Gly

Thr 1640

Ala

Cys

Gly 1645

Thr

Ala

Thr

Thr 1650

Ala

Cys

Ala

Gly

Cys 1655

Cys

Gly

Cys

Thr 1660

Gly

Cys

Ala 1665

Cys

Ala

Gly

Cys

Thr 1670

Thr

Cys

Cys 1675

Cys

Thr

Gly

Ala

Ala 1680

Ala

Gly

Thr

Gly

Ala 1685

Cys

Thr

Cys

Cys 1690

Thr

Cys

Thr

Gly

Ala 1695

Ala

Thr

Ala

Thr 1700

Cys

Gly

Cys 1705

Cys

Thr

Gly

Cys

Gly 1710

Cys

Gly

Ala 1715

Gly

Cys

Thr

Thr 1720

Cys

Gly

Cys

Ala 1725

Cys

Gly

Thr

PL 210 546 B1

Cys

Thr 1730

Gly

Ala

Gly

Cys 1735

Cys

Gly

Ala

Cys 1740

Ala

Gly

Cys

Gly

Cys 1745

Ala

Cys

Ala

Ala 1750

Ala

Thr

Cys 1755

Ala

Gly

Cys

Ala

Cys 1760

Cys

Ala

Cys

Ala

Thr 1765

Ala

Cys

Ala

Ala 1770

Ala

Cys

Ala 1775

Ala

Cys

Thr

Cys 1780

Ala

Thr

Cys

Ala

Thr 1785

Cys

Ala

Gly

Cys 1790

Thr

Cys

Thr

Gly 1795

Gly

Thr

Gly

Cys

Ala 1800

Thr

Cys

Gly

Gly 1805

Cys

Cys 1810

Cys

Thr

Gly

Thr 1815

Thr

Cys

Gly 1820

Ala

Thr

Ala

Cys

Ala 1825

Ala

Cys

Ala 1830

Cys

Gly

Cys

Thr 1835

Cys

Ala

Cys

Ala

Gly 1840

Ala

Cys

Gly

Gly 1845

Gly

Ala

Thr

Thr 1850

Thr

Gly

Cys

Thr 1855

Thr

Ala

Thr

Cys

Cys 1860

Ala

Cys

Ala

Thr

Thr 1865

Ala

Cys

Thr 1870

Gly

Cys

Ala

Gly 1875

Gly

Ala

Cys

Thr 1880

Thr

Cys

Cys 1885

Ala

Thr

Ala

Gly 1890

Gly

Thr

Ala

Cys 1895

Ala

Cys

Gly 1900

Thr

Cys

Ala

Thr 1905

Gly

Thr

Cys

Ala

Thr 1910

Ala

Gly

Cys 1915

Gly

Cys

Ala

Thr 1920

Cys

Gly

Cys

Cys 1925

Ala

Gly

Cys

Gly

Thr 1930

Thr

Ala

Cys

Ala

Gly 1935

Gly

Thr

Gly

Cys 1940

Ala

Thr

Gly

Thr 1945

Ala

Thr

Cys

Thr

Thr 1950

Thr

Ala

Ala 1955

Cys

Ala

Cys

Thr 1960

Gly

Thr

Ala 1965

Thr

Ala

Thr

Cys

Thr 1970

Cys

Thr

Thr 1975

Ala

Cys

Thr 1980

Ala

Cys

Thr

Ala 1985

Ala

Thr

Ala

Cys 1990

Ala

Thr

Cys

Ala 1995

Thr

Ala

Ala 2000

Ala

Gly

Ala 2005

Ala

Cys

Cys 2010

Thr

Ala

Thr

PL 210 546 B1

Thr

Cys 2015

Ala

Cys

Thr

Gly

Cys 2020

Cys

Thr

Gly

Thr

Cys 2025

Cys

Thr

Gly

Gly 2030

Ala

Cys

Ala

Gly

Ala 2035

Cys

Ala

Gly

Ala

Thr 2040

Ala

Thr

Gly

Cys

Ala 2045

Cys

Thr

Cys

Cys 2050

Cys

Ala

Cys

Gly 2055

Cys

Ala

Gly

Cys 2060

Gly

Cys

Gly

Gly 2065

Gly

Cys

Cys 2070

Thr

Ala

Cys

Gly 2075

Gly

Ala

Gly

Cys

Cys 2080

Gly

Cys

Thr

Thr 2085

Ala

Gly

Thr

Ala 2090

Cys

Ala

Cys

Ala 2095

Cys

Thr

Cys

Ala

Gly 2100

Ala

Cys

Ala

Cys

Ala 2105

Ala

Cys

Ala

Cys 2110

Cys

Ala

Gly

Ala

Ala 2115

Ala

Cys

Cys 2120

Cys

Gly

Thr 2125

Cys

Ala

Gly

Cys 2130

Gly

Cys

Ala

Gly

Ala 2135

Ala

Cys

Thr

Gly

Ala 2140

Ala

Cys

Ala 2145

Cys

Ala

Gly 2150

Cys

Thr 2155

Cys

Thr

Cys 2160

Ala

Thr

Ala

Cys 2165

Thr

Gly

Ala

Ala 2170

Ala

Gly

Cys

Gly

Gly 2175

Cys

Gly 2180

Cys

Gly 2185

Gly

Thr

Cys

Gly 2190

Ala

Gly

Gly 2195

Cys

Gly

Ala 2200

Ala

Cys

Ala

Gly

Ala 2205

Gly

Thr

Cys

Gly

Cys 2210

Thr

Ala 2215

Ala

Thr

Ala

Thr 2220

Gly

Ala

Thr

Gly 2225

Thr

Gly

Thr

Ala 2230

Ala

Cys

Thr

Ala

Cys 2235

Thr

Cys

Ala

Thr 2240

Cys

Ala

Thr

Cys

Gly 2245

Cys

Thr

Gly

Thr

Cys 2250

Ala

Gly

Thr

Cys

Thr 2255

Thr

Cys

Thr

Cys

Gly 2260

Cys

Thr

Gly

Ala 2265

Ala

Gly

Thr

Cys 2270

Thr

Cys

Ala

Gly

Thr 2275

Ala

Cys

Ala

Cys

Gly 2280

Cys

Thr

Cys

Gly

Thr 2285

Ala

Gly

Cys

Gly 2290

Gly

Cys

Thr 2295

Gly

Ala

Cys

PL 210 546 B1

Gly

Gly 2300

Cys

Gly

Cys 2305

Thr

Ala

Cys

Gly 2310

Cys

Gly

Ala

Gly 2315

Ala

Thr

Ala

Cys

Gly 2320

Cys

Gly 2325

Ala

Cys

Thr

Cys 2330

Gly

Thr

Ala 2335

Ala

Cys

Cys 2340

Thr

Cys

Gly

Thr

Cys 2345

Gly

Ala

Cys 2350

Cys

Ala

Cys

Thr

Cys 2355

Cys

Gly

Ala

Cys

Cys 2360

Gly

Cys

Gly

Cys

Ala 2365

Cys

Ala

Gly

Ala

Ala 2370

Gly

Cys

Thr

Cys

Thr 2375

Cys

Thr

Cys

Ala

Thr 2380

Gly

Cys

Thr

Gly 2385

Ala

Gly

Cys 2390

Gly

Thr

Ala 2395

Thr

Gly

Thr

Cys 2400

Thr

Gly

Cys

Ala 2405

Gly

Cys

Thr 2410

Gly

Ala 2415

Thr

Gly

Thr 2420

Ala

Gly

Thr 2425

Gly

Ala

Thr 2430

Cys

Thr

Ala

Thr

Cys 2435

Ala

Thr

Cys

Ala 2440

Gly

Thr

Ala

Cys

Cys 2445

Gly

Cys

Thr

Thr 2450

Ala

Cys

Gly

Cys

Cys 2455

Gly

Cys

Thr 2460

Thr

Cys

Gly

Cys 2465

Gly

Thr

Thr 2470

Thr

Ala

Cys

Thr

Cys 2475

Cys

Thr

Gly

Thr

Thr 2480

Thr

Cys

Ala

Thr

Ala 2485

Thr

Ala

Thr

Gly

Ala 2490

Ala

Cys

Ala

Ala 2495

Cys

Ala

Gly

Thr 2500

Cys

Ala

Cys

Gly 2505

Cys

Thr

Cys 2510

Cys

Ala

Thr

Gly

Cys 2515

Cys

Gly

Cys

Thr

Gly 2520

Ala

Thr

Gly

Cys

Gly 2525

Gly

Cys

Ala

Thr

Ala 2530

Thr

Cys

Thr

Gly 2535

Gly

Thr

Ala

Cys 2540

Gly

Ala

Thr

Ala

Thr 2545

Cys

Thr

Gly

Ala

Ala 2550

Thr

Gly

Thr

Thr 2555

Ala

Thr

Ala

Cys

Ala 2560

Thr

Gly

Thr

Gly

Thr 2565

Ala

Thr

Ala

Thr

Ala 2570

Cys

Gly

Thr

Gly

Gly 2575

Thr

Ala

Thr

Gly 2580

Ala

Cys

Ala

PL 210 546 B1

Ala

Ala 2585

Ala

Thr

Ala

Gly 2590

Gly

Ala

Cys

Ala

Ala 2595

Gly

Thr

Ala

Ala 2600

Ala

Thr

Thr 2605

Thr

Ala

Cys

Ala

Gly 2610

Gly

Cys

Gly

Ala

Thr 2615

Gly

Cys

Ala

Thr 2620

Gly

Ala

Thr

Cys 2625

Ala

Cys

Ala 2630

Cys

Gly

Thr

Ala

Ala 2635

Thr

Cys

Ala

Thr 2640

Ala

Thr

Cys

Gly

Gly 2645

Gly

Thr

Gly 2650

Gly

Cys

Gly

Ala 2655

Ala

Gly

Ala

Cys 2660

Thr

Cys

Ala

Gly 2665

Cys

Ala

Thr

Gly

Ala 2670

Gly

Ala

Thr

Cys

Cys 2675

Cys

Gly

Cys

Gly 2680

Cys

Thr

Gly

Ala 2685

Gly

Ala

Thr

Cys 2690

Ala

Thr

Cys

Ala 2695

Gly

Cys

Gly

Gly 2700

Cys

Gly

Thr

Cys

Cys 2705

Cys

Gly

Ala

Ala 2710

Ala

Cys

Gly

Ala 2715

Thr

Cys

Gly 2720

Ala

Gly

Cys

Cys 2725

Cys

Ala

Cys

Cys 2730

Thr

Cys

Ala 2735

Thr

Ala

Gly

Ala

Ala 2740

Gly

Cys

Gly

Gly 2745

Cys

Gly

Thr

Gly 2750

Gly

Ala

Thr

Cys 2755

Gly

Ala

Thr 2760

Cys

Thr

Cys

Gly

Thr 2765

Gly

Ala

Thr

Gly

Gly 2770

Cys

Ala

Gly

Thr 2775

Thr

Gly

Cys 2780

Gly

Thr

Cys

Gly

Cys 2785

Thr

Gly

Thr 2790

Cys

Gly

Thr

Cys 2795

Ala

Thr

Cys 2800

Gly

Ala

Cys

Cys 2805

Cys

Ala

Gly

Ala 2810

Gly

Thr

Cys

Cys 2815

Gly

Cys

Thr

Cys

Ala 2820

Gly

Ala

Gly

Ala 2825

Ala

Cys

Thr

Cys

Gly 2830

Thr

Cys

Ala

Gly 2835

Ala

Gly

Cys 2840

Gly

Ala

Thr

Ala

Gly 2845

Ala

Gly

Cys 2850

Gly

Ala

Thr

Gly

Cys 2855

Gly

Cys

Thr

Gly

Cys 2860

Gly

Ala

Thr

Cys 2865

Gly

PL 210 546 B1

Ala

Gly 2870

Cys

Gly

Cys

Gly 2875

Ala

Thr

Ala

Cys

Cys 2880

Gly

Thr

Ala

Ala 2885

Gly

Cys

Ala

Cys

Gly 2890

Ala

Gly

Ala

Ala 2895

Gly

Cys

Gly

Thr 2900

Cys

Ala

Gly

Cys

Cys 2905

Cys

Ala

Thr

Cys 2910

Gly

Cys

Gly

Cys 2915

Cys

Ala

Gly

Cys 2920

Thr

Cys

Thr

Cys 2925

Ala

Gly

Cys

Ala

Ala 2930

Thr

Ala

Thr

Cys

Ala 2935

Cys

Gly

Thr 2940

Ala

Gly

Cys

Ala 2945

Ala

Cys

Gly

Cys

Thr 2950

Ala

Thr

Gly

Thr

Cys 2955

Cys

Thr

Gly

Ala

Thr 2960

Ala

Gly

Cys

Gly

Gly 2965

Thr

Cys

Gly

Cys 2970

Cys

Ala

Cys

Ala

Cys 2975

Cys

Ala

Gly

Cys 2980

Cys

Gly

Cys

Cys 2985

Ala

Cys

Ala

Gly

Thr 2990

Cys

Gly

Ala

Thr

Gly 2995

Ala

Thr

Cys

Cys 3000

Ala

Gly

Ala

Ala 3005

Ala

Gly

Cys

Gly

Gly 3010

Cys

Ala

Thr

Thr 3015

Thr

Cys

Ala 3020

Cys

Ala

Thr

Gly 3025

Ala

Thr

Ala

Thr

Thr 3030

Cys

Gly

Cys

Ala 3035

Ala

Gly

Cys

Ala

Gly 3040

Gly

Cys

Ala

Thr

Cys 3045

Gly

Cys

Ala

Thr 3050

Gly

Ala

Gly

Thr

Cys 3055

Ala

Cys

Gly

Ala

Cys 3060

Gly

Ala

Gly

Ala

Thr 3065

Cys

Thr

Cys

Gly 3070

Cys

Gly

Thr

Cys 3075

Gly

Cys

Ala 3080

Thr

Gly

Cys

Gly

Cys 3085

Gly

Cys

Thr

Thr 3090

Gly

Ala

Gly

Cys

Cys 3095

Thr

Gly

Cys

Gly 3100

Ala

Cys

Ala

Gly 3105

Thr

Cys

Gly

Gly 3110

Cys

Thr

Gly

Cys 3115

Gly

Cys

Gly

Ala

Gly 3120

Cys

Thr 3125

Gly

Ala

Thr

Gly

Cys 3130

Thr

Cys

Thr

Cys 3135

Gly

Thr

Cys

Ala 3140

Gly

Ala

Thr

Cys

Ala 3145

Thr

Cys

Thr

Gly 3150

Ala

Thr

Cys

PL 210 546 B1

Gly

Ala 3155

Cys

Ala

Gly

Ala 3160

Cys

Gly

Cys 3165

Thr

Cys

Ala 3170

Thr

Cys

Gly

Ala 3175

Gly

Thr

Ala

Cys

Gly 3180

Thr

Gly

Cys

Thr

Cys 3185

Gly

Cys

Thr

Cys

Gly 3190

Ala

Thr

Gly

Cys

Gly 3195

Ala

Thr

Gly

Thr

Thr 3200

Thr

Cys

Gly

Cys

Thr 3205

Thr

Gly

Thr

Gly 3210

Gly

Thr

Cys

Gly

Ala 3215

Ala

Thr

Gly

Gly 3220

Cys

Ala

Gly

Thr 3225

Ala

Gly

Cys

Gly 3230

Gly

Ala

Thr

Cys

Ala 3235

Ala

Gly

Cys

Gly

Thr 3240

Ala

Thr

Gly

Cys

Ala 3245

Gly

Cys

Gly

Cys 3250

Cys

Gly

Cys

Ala

Thr 3255

Thr

Gly

Cys

Ala

Thr 3260

Cys

Ala

Gly

Cys

Cys 3265

Ala

Thr

Gly

Ala

Thr 3270

Gly

Ala

Thr

Ala 3275

Cys

Thr

Cys 3280

Thr

Cys

Gly

Cys 3285

Ala

Gly

Ala

Gly 3290

Cys

Ala

Gly

Gly 3295

Thr

Gly

Ala

Gly

Ala 3300

Thr

Gly

Ala

Cys

Ala 3305

Gly

Ala

Gly

Ala 3310

Thr

Cys

Thr

Gly 3315

Cys

Gly 3320

Gly

Cys

Ala

Cys

Thr 3325

Thr

Cys

Gly

Cys

Cys 3330

Cys

Ala

Thr

Ala 3335

Gly

Cys

Ala

Gly

Cys 3340

Cys

Ala

Gly

Thr

Cys 3345

Cys

Thr

Cys 3350

Cys

Gly

Cys

Thr 3355

Thr

Cys

Ala

Gly

Thr 3360

Gly

Ala

Cys

Ala

Ala 3365

Cys

Gly

Thr

Cys

Gly 3370

Ala

Gly

Cys

Ala

Cys 3375

Ala

Gly

Cys

Thr

Gly 3380

Cys

Gly

Cys

Ala

Ala 3385

Gly

Ala

Cys 3390

Gly

Cys

Gly 3395

Thr

Cys

Gly

Thr

Gly 3400

Gly

Cys

Ala

Gly 3405

Cys

Ala

Cys

Gly 3410

Ala

Thr

Ala

Gly

Cys 3415

Cys

Gly

Cys

Gly

Cys 3420

Thr

Gly

Cys

Thr 3425

Cys

Gly

Thr

Cys

Cys 3430

Thr

Gly

Cys

Ala

Ala 3435

Thr

Cys

PL 210 546 B1

Ala

Thr 3440

Thr

Cys

Ala

Gly

Gly 3445

Ala

Cys

Ala

Cys

Cys 3450

Gly

Ala

Cys

Ala 3455

Gly

Thr

Cys

Gly 3460

Gly

Thr

Cys

Thr

Thr 3465

Gly

Ala

Cys

Ala

Ala 3470

Ala

Gly

Ala 3475

Ala

Cys

Gly

Gly 3480

Gly

Cys

Gly

Cys

Cys 3485

Cys

Thr

Gly

Cys 3490

Gly

Cys

Thr

Gly

Ala 3495

Cys

Ala

Gly

Cys

Cys 3500

Gly

Ala

Cys 3505

Ala

Cys

Gly

Cys 3510

Gly

Cys

Ala

Thr 3515

Cys

Ala

Gly

Ala

Gly 3520

Cys

Ala

Gly

Cys

Cys 3525

Gly

Ala

Thr

Gly 3530

Thr

Cys

Thr

Gly

Thr 3535

Thr

Gly

Thr

Gly

Cys 3540

Cys

Ala

Gly

Thr 3545

Cys

Ala

Thr

Ala

Gly 3550

Cys

Gly

Ala

Ala 3555

Thr

Ala

Gly

Cys

Cys 3560

Thr

Cys

Thr

Cys

Cys 3565

Ala

Cys

Ala 3570

Ala

Gly

Cys

Gly

Gly 3575

Cys

Gly

Ala 3580

Gly

Ala

Cys

Cys 3585

Thr

Gly

Cys

Gly

Thr 3590

Gly

Cys

Ala

Thr 3595

Cys

Ala

Thr

Cys 3600

Thr

Gly

Thr

Thr 3605

Cys

Ala

Thr

Cys 3610

Ala

Thr

Gly

Cys

Gly 3615

Ala

Cys

Gly 3620

Ala

Thr

Cys

Thr 3625

Cys

Ala

Thr

Cys

Cys 3630

Thr

Gly

Thr

Cys

Thr 3635

Cys

Thr

Gly

Ala 3640

Thr

Cys

Thr

Gly

Ala 3645

Thr

Cys

Thr

Gly 3650

Ala

Thr

Cys

Cys 3655

Cys

Thr

Gly

Cys

Gly 3660

Cys

Ala

Thr

Cys 3665

Ala

Gly

Ala

Thr

Cys 3670

Cys

Thr

Gly

Gly 3675

Cys

Gly

Cys

Ala 3680

Ala

Gly

Ala

Ala 3685

Gly

Cys

Ala

Thr 3690

Cys

Ala

Gly

Thr 3695

Thr

Ala

Cys

Thr 3700

Thr

Gly

Cys

Ala 3705

Gly

Cys

Thr 3710

Thr

Cys

Ala 3715

Ala

Cys

Thr

Thr 3720

Ala

Cys

PL 210 546 B1

Ala

Gly 3725

Ala

Gly

Cys 3730

Gly

Cys

Cys 3735

Ala

Gly

Cys

Thr

Gly 3740

Gly

Cys

Ala

Thr 3745

Thr

Cys

Gly

Gly 3750

Thr

Cys

Gly

Cys 3755

Thr

Gly

Cys

Thr 3760

Gly

Thr

Cys

Ala 3765

Thr

Ala

Ala 3770

Cys

Gly

Cys

Cys 3775

Cys

Ala

Gly

Thr

Cys 3780

Thr

Ala

Gly

Cys

Thr 3785

Ala

Thr

Cys

Gly

Cys 3790

Cys

Ala

Thr

Gly

Thr 3795

Ala

Gly

Cys

Cys 3800

Cys

Ala

Cys

Thr

Gly 3805

Cys

Ala

Gly

Cys 3810

Thr

Ala

Cys

Thr 3815

Gly

Cys

Thr

Thr 3820

Cys

Thr

Cys

Thr

Thr 3825

Thr

Gly

Cys

Gly

Cys 3830

Thr

Gly

Cys

Gly 3835

Thr

Cys 3840

Cys

Thr

Gly 3845

Thr

Cys

Ala

Gly 3850

Ala

Thr

Ala

Gly

Cys 3855

Cys

Ala

Gly

Thr 3860

Ala

Gly

Cys

Thr

Gly 3865

Ala

Cys

Ala

Thr

Thr 3870

Cys

Ala

Thr

Cys

Cys 3875

Gly

Thr 3880

Cys

Ala

Gly

Cys

Ala 3885

Cys

Gly

Thr

Thr 3890

Thr

Cys

Thr

Gly

Cys 3895

Gly

Ala

Cys

Thr 3900

Gly

Cys

Thr

Thr 3905

Thr

Cys

Thr

Ala

Cys 3910

Gly

Thr

Gly

Thr

Thr 3915

Cys

Gly

Cys

Thr 3920

Thr

Cys

Thr

Thr 3925

Thr

Ala

Gly

Cys

Ala 3930

Gly

Cys

Thr 3935

Thr

Gly

Cys

Gly

Cys 3940

Cys

Thr

Gly

Ala 3945

Gly

Thr

Gly

Cys

Thr 3950

Thr

Gly

Cys

Gly

Gly 3955

Cys

Ala

Gly

Cys

Gly 3960

Thr

Gly

Ala

Gly 3965

Cys

Thr

Ala

Cys

Ala 3970

Thr

Ala

Thr

Ala

Thr 3975

Gly

Thr

Gly

Ala

Thr 3980

Cys

Gly

Gly 3985

Cys

Ala

Thr 3990

Cys

Gly

Cys

Thr

Gly 3995

Ala

Thr

Ala

Thr 4000

Thr

Cys

Thr

Thr 4005

Thr

Gly

PL 210 546 B1

Thr

Cys 4010

Thr

Cys

Gly

Ala 4015

Cys

Ala

Thr

Cys 4020

Ala

Gly

Cys

Ala 4025

Cys

Thr

Gly

Ala 4030

Gly

Thr

Cys

Gly

Cys 4035

Thr

Gly

Thr

Cys

Thr 4040

Thr

Cys 4045

Gly

Thr

Gly

Ala

Cys 4050

Ala

Thr

Cys

Ala 4055

Gly

Thr

Cys

Gly 4060

Cys

Thr

Gly

Cys

Gly 4065

Cys

Thr

Cys

Ala

Cys 4070

Gly

Cys

Thr

Cys 4075

Thr

Gly

Cys

Ala 4080

Gly

Thr

Gly

Ala

Ala 4085

Thr

Gly

Gly 4090

Gly

Thr

Ala

Ala 4095

Thr

Gly

Cys

Ala 4100

Cys

Thr

Ala

Cys

Ala 4105

Gly

Cys

Gly

Cys 4110

Cys

Thr

Thr 4115

Ala

Thr

Gly

Ala 4120

Thr

Cys

Ala

Thr 4125

Gly

Cys

Ala

Gly 4130

Gly

Ala

Cys 4135

Thr

Ala

Cys

Cys 4140

Ala

Thr

Ala

Thr 4145

Ala

Cys

Ala

Gly 4150

Ala

Gly 4155

Cys

Gly

Thr 4160

Cys

Ala

Cys

Gly

Gly 4165

Gly

Cys

Thr

Cys 4170

Thr

Cys

Ala

Gly

Gly 4175

Gly

Cys

Gly

Thr

Thr 4180

Thr

Ala

Thr

Gly 4185

Gly

Cys

Gly

Gly 4190

Thr

Cys

Thr

Gly

Cys 4195

Thr

Ala

Thr

Gly

Thr 4200

Gly

Thr

Gly

Cys 4205

Thr

Ala

Thr

Cys

Thr 4210

Gly

Ala

Cys

Thr

Thr 4215

Thr

Gly

Cys 4220

Thr

Gly

Thr

Cys 4225

Ala

Gly

Cys

Ala

Gly 4230

Thr

Cys

Thr 4235

Gly

Cys

Thr 4240

Cys

Thr

Gly

Ala

Thr 4245

Thr

Cys

Cys 4250

Ala

Gly

Thr

Cys

Thr 4255

Gly

Ala

Cys

Ala 4260

Cys

Thr

Cys

Gly 4265

Gly

Ala

Thr

Ala 4270

Thr

Cys

Gly 4275

Thr

Gly

Ala

Cys

Ala 4280

Gly

Thr

Cys

Ala 4285

Thr

Cys

Ala

Gly 4290

Ala

Cys

Thr

PL 210 546 B1

Gly

Gly 4295

Cys

Thr

Ala

Thr 4300

Gly

Cys

Ala

Cys

Cys 4305

Cys

Ala

Gly

Thr

Ala 4310

Ala

Gly

Cys

Ala 4315

Gly

Cys

Gly

Thr 4320

Ala

Thr

Cys

Ala

Thr 4325

Cys

Ala

Cys

Ala 4330

Gly

Cys

Thr

Thr 4335

Ala

Cys

Gly 4340

Thr

Cys

Thr

Ala 4345

Cys

Thr

Gly

Thr

Cys 4350

Gly

Ala

Gly

Ala 4355

Cys

Gly

Thr

Gly

Cys 4360

Gly

Thr

Ala

Cys 4365

Gly

Thr

Ala

Thr

Gly 4370

Cys

Ala

Thr

Gly

Gly 4375

Thr

Cys

Thr

Cys

Cys 4380

Cys

Ala

Thr

Gly 4385

Cys

Gly

Ala

Gly

Ala 4390

Gly

Thr

Ala

Gly

Gly 4395

Gly

Ala

Cys

Thr 4400

Gly

Cys

Ala

Gly 4405

Gly

Cys

Ala

Thr

Cys 4410

Ala

Thr

Ala 4415

Ala

Cys

Gly 4420

Ala

Gly

Gly 4425

Cys

Thr

Cys

Ala

Gly 4430

Thr

Cys

Gly

Ala

Ala 4435

Ala

Gly

Ala

Cys

Thr 4440

Gly

Cys

Cys 4445

Thr

Cys

Gly 4450

Thr

Ala 4455

Thr

Cys

Thr

Gly

Thr 4460

Thr

Gly

Thr

Thr 4465

Gly

Thr

Cys

Gly

Gly 4470

Thr

Gly

Ala

Cys 4475

Gly

Cys

Thr

Cys

Thr 4480

Cys

Thr

Gly

Ala 4485

Gly

Thr

Ala

Gly

Gly 4490

Ala

Cys

Ala

Ala 4495

Thr

Cys

Gly

Cys 4500

Cys

Gly

Ala 4505

Gly

Cys

Gly

Ala 4510

Thr

Gly

Ala 4515

Ala

Cys

Gly

Thr

Thr 4520

Gly

Cys

Gly

Ala

Ala 4525

Gly

Cys

Ala

Cys 4530

Gly

Cys

Cys 4535

Gly

Ala

Gly

Gly 4540

Gly

Thr

Gly

Cys 4545

Gly

Cys

Ala 4550

Gly

Ala

Cys

Gly 4555

Cys

Gly

Cys 4560

Cys

Ala

Thr

Ala

Ala 4565

Ala

Cys

Thr

Gly

Cys 4570

Cys

Ala

Gly

Cys 4575

Ala

Thr

Cys

PL 210 546 B1

Ala

Ala 4580

Ala

Thr

Ala

Ala 4585

Gly

Cys

Ala

Gly

Ala 4590

Ala

Gly

Cys

Cys 4595

Ala

Thr

Cys

Thr 4600

Gly

Ala

Cys

Gly

Gly 4605

Ala

Thr

Gly

Cys 4610

Cys

Thr

Thr 4615

Thr

Gly

Cys

Gly

Thr 4620

Thr

Cys

Thr

Ala 4625

Cys

Ala

Cys 4630

Thr

Cys

Thr

Thr 4635

Thr

Gly

Thr

Thr 4640

Ala

Thr

Thr 4645

Thr

Cys

Thr

Ala

Ala 4650

Ala

Thr

Ala

Cys

Ala 4655

Thr

Cys

Ala

Ala 4660

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly 4665

Gly

Ala

Cys

Gly

Thr 4670

Cys

Gly

Thr

Ala

Cys 4675

Thr

Ala

Cys 4680

Thr

Ala 4685

Ala

Gly

Thr

Ala 4690

Thr

Gly

Cys 4695

Ala

Thr

Cys

Ala 4700

Ala

Thr

Gly

Cys 4705

Thr

Cys

Thr

Gly 4710

Thr

Ala

Ala 4715

Ala

Thr

Gly

Cys 4720

Thr

Ala

Gly 4725

Ala

Thr

Ala 4730

Cys

Thr

Gly 4735

Gly

Cys

Ala

Gly

Cys 4740

Gly

Thr

Thr 4745

Gly

Thr

Gly

Thr 4750

Ala

Thr

Gly

Ala 4755

Gly

Thr

Cys 4760

Ala

Thr

Gly 4765

Cys

Gly

Cys

Ala

Thr 4770

Thr

Gly

Thr

Thr 4775

Ala

Thr

Gly 4780

Gly

Ala

Gly 4785

Thr

Gly

Ala

Cys

Cys 4790

Gly

Thr

Gly

Cys

Gly 4795

Cys

Thr

Ala

Cys 4800

Thr

Ala

Cys

Ala

Gly 4805

Cys

Thr

Ala

Ala 4810

Thr

Ala

Thr

Thr 4815

Thr

Gly

Ala

Ala 4820

Ala

Thr

Ala

Thr

Cys 4825

Cys

Ala

Gly 4830

Ala

Gly

Cys

Thr

Thr 4835

Thr

Cys

Cys 4840

Thr

Cys

Gly

Cys 4845

Ala

Thr

Gly

Cys

Cys 4850

Cys

Ala

Cys

Gly

Cys 4855

Thr

Ala

Cys 4860

Ala

Thr

PL 210 546 B1

Cys

Thr 4865

Thr

Cys 4870

Thr

Cys

Thr

Thr 4875

Thr

Gly

Thr

Thr 4880

Ala

Thr

Cys 4885

Gly

Thr

Gly

Thr 4890

Thr

Gly

Ala

Thr 4895

Thr

Ala

Thr

Thr 4900

Ala

Thr

Gly 4905

Cys

Thr

Ala

Thr

Ala 4910

Thr

Ala

Thr 4915

Thr

Cys 4920

Gly

Ala

Thr

Ala

Ala 4925

Thr

Ala

Thr

Cys 4930

Ala

Cys

Thr

Ala 4935

Gly

Ala

Gly

Ala

Ala 4940

Gly

Ala

Cys 4945

Ala

Thr

Ala 4950

Ala

Thr

Gly

Thr 4955

Ala

Thr

Gly

Thr

Thr 4960

Cys

Ala

Thr

Ala

Cys 4965

Ala

Cys

Gly

Cys

Ala 4970

Thr

Gly

Thr

Ala

Ala 4975

Ala

Thr

Ala 4980

Ala

Cys

Thr

Ala 4985

Thr

Cys

Thr

Ala

Thr 4990

Ala

Thr

Ala

Gly

Thr 4995

Thr

Gly

Thr

Cys

Thr 5000

Thr

Cys

Thr

Cys 5005

Thr

Gly

Ala

Thr 5010

Gly

Thr

Gly

Cys

Ala 5015

Ala

Cys

Thr 5020

Ala

Gly

Cys

Ala 5025

Thr

Cys

Gly 5030

Ala

Gly

Cys

Cys 5035

Ala

Thr

Ala

Thr 5040

Thr

Ala

Gly

Cys

Ala 5045

Gly

Thr

Ala

Thr

Gly 5050

Ala

Thr

Ala

Gly 5055

Gly

Ala

Ala 5060

Cys

Thr

Ala

Ala 5065

Cys

Ala

Gly 5070

Thr

Gly

Ala

Thr

Ala 5075

Ala

Gly

Ala

Cys

Cys 5080

Thr

Gly

Ala

Thr

Gly 5085

Ala

Thr

Cys 5090

Gly

Cys

Thr

Cys 5095

Thr

Ala

Ala 5100

Thr

Ala

Cys

Ala 5105

Thr

Gly

Gly 5110

Ala

Gly

Ala

Thr

Thr 5115

Thr

Ala 5120

Thr

Ala

Cys 5125

Ala

Gly

Cys

Ala

Thr 5130

Thr

Gly

Thr

Thr 5135

Thr

Cys

Ala

Ala 5140

Thr

Ala

Thr

Ala

Thr 5145

Thr

Cys

PL 210 546 B1

Ala

Ala 5150

Thr

Ala

Thr 5155

Cys

Gly

Thr

Gly 5160

Ala

Thr

Gly

Ala 5165

Thr

Gly

Ala 5170

Gly

Thr

Ala

Gly 5175

Ala

Thr

Ala

Ala 5180

Thr

Cys

Thr

Ala

Cys 5185

Thr

Ala

Thr

Ala

Gly 5190

Gly

Ala

Thr

Cys

Ala 5195

Thr

Ala

Thr

Thr 5200

Thr

Ala

Thr

Ala 5205

Ala

Thr

Ala 5210

Gly

Cys

Gly

Thr

Cys 5215

Ala

Thr

Cys

Ala

Thr 5220

Ala

Thr

Ala

Thr 5225

Thr

Gly

Cys

Thr 5230

Cys

Ala

Thr

Thr 5235

Thr

Ala 5240

Gly

Thr

Ala 5245

Ala

Thr

Ala

Thr 5250

Cys

Ala

Gly

Ala 5255

Ala

Thr

Gly

Ala 5260

Ala

Thr

Ala

Thr 5265

Cys

Ala

Gly

Ala

Thr 5270

Thr

Ala

Cys 5275

Cys

Ala

Thr

Ala

Gly 5280

Ala

Thr

Gly

Ala 5285

Gly

Ala

Thr

Ala 5290

Ala

Thr

Gly

Ala 5295

Thr

Cys

Gly

Cys

Gly 5300

Ala

Gly

Thr

Ala

Ala 5305

Ala

Thr

Ala

Thr 5310

Ala

Thr

Cys

Ala 5315

Cys

Ala

Thr

Gly 5320

Thr

Ala

Cys

Ala 5325

Thr

Ala 5330

Gly

Thr

Cys

Ala

Thr 5335

Ala

Thr

Cys

Ala

Gly 5340

Ala

Thr

Ala

Gly 5345

Cys

Ala

Thr

Gly 5350

Ala

Thr

Ala

Ala 5355

Thr

Ala

Thr

Cys

Ala 5360

Thr

Ala

Thr

Thr 5365

Gly

Cys

Thr

Cys 5370

Thr

Ala

Cys

Ala

Gly 5375

Gly

Cys

Thr

Thr 5380

Ala

Thr

Thr 5385

Thr

Ala

Thr

Ala 5390

Ala

Thr

Ala

Thr 5395

Thr

Cys

Thr

Gly

Thr 5400

Ala

Gly

Thr

Gly 5405

Thr

Cys

Gly

Thr

Cys 5410

Gly

Cys

Ala

Thr 5415

Thr

Ala

Thr

Gly 5420

Thr

Cys

Thr

Thr 5425

Cys

Ala

Thr

Ala

Cys 5430

Cys

Ala

PL 210 546 B1

Thr

Cys 5435

Thr

Cys

Thr

Thr 5440

Ala

Thr

Cys

Thr 5445

Thr

Ala

Cys

Thr 5450

Ala

Thr

Gly

Thr 5455

Thr

Gly

Thr

Cys 5460

Gly

Cys

Ala

Gly 5465

Thr

Gly 5470

Cys

Gly

Thr

Gly

Thr 5475

Thr

Ala

Thr

Ala

Thr 5480

Ala

Thr

Cys

Ala

Thr 5485

Thr

Ala

Ala 5490

Cys

Gly

Thr

Ala 5495

Ala

Thr

Ala

Gly

Ala 5500

Thr

Gly

Ala

Cys 5505

Ala

Thr

Gly 5510

Ala

Thr

Cys

Thr 5515

Ala

Thr

Ala

Ala 5520

Ala

Thr

Gly

Gly 5525

Ala

Thr

Thr 5530

Thr

Gly

Thr

Cys

Ala 5535

Cys

Ala

Cys

Thr

Ala 5540

Thr

Ala

Thr

Ala 5545

Thr

Cys

Gly

Cys

Thr 5550

Thr

Gly

Ala

Ala 5555

Thr

Ala

Cys

Ala

Ala 5560

Thr

Gly

Thr

Thr 5565

Thr

Ala

Cys

Ala 5570

Thr

Ala

Gly

Thr 5575

Ala

Cys

Thr

Gly 5580

Thr

Ala

Gly

Ala 5585

Thr

Cys

Gly

Thr

Ala 5590

Cys

Ala

Gly

Thr 5595

Thr

Ala

Cys

Gly 5600

Cys

Ala

Gly

Ala 5605

Ala

Thr

Gly 5610

Gly

Thr

Gly 5615

Thr

Ala

Thr

Ala 5620

Gly

Thr

Cys

Gly

Ala 5625

Thr

Ala

Thr 5630

Cys

Gly

Ala

Thr

Thr 5635

Thr

Gly

Ala

Thr

Thr 5640

Cys

Thr

Ala

Gly

Ala 5645

Thr

Gly

Thr 5650

Thr

Ala

Ala 5655

Cys

Thr

Ala

Thr 5660

Thr

Ala

Gly 5665

Gly

Ala

Gly

Ala 5670

Ala

Thr

Ala

Cys 5675

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly 5680

Ala

Thr

Cys

Gly

Cys 5685

Thr

Cys

Ala

Cys 5690

Cys

Ala

Thr

Gly

Cys 5695

Ala

Cys

Ala

Gly 5700

Thr

Gly

Ala

Gly

Ala 5705

Ala

Gly

Cys

Ala

Thr 5710

Thr

Ala

Thr

Gly

Ala 5715

Gly

Cys

Ala

PL 210 546 B1

Thr

Cys 5720

Thr

Gly

Ala 5725

Cys

Gly

Thr

Gly 5730

Cys

Thr

Gly

Thr

Ala 5735

Ala

Cys

Ala

Ala 5740

Thr

Gly

Thr

Gly

Ala 5745

Ala

Cys

Ala

Gly 5750

Gly

Ala

Gly 5755

Thr

Ala

Cys

Ala

Thr 5760

Gly

Thr

Cys

Thr

Thr 5765

Cys

Thr

Ala

Ala 5770

Thr

Gly

Cys

Ala

Cys 5775

Thr

Ala

Cys

Thr

Ala 5780

Cys

Thr

Cys

Thr 5785

Gly

Ala

Cys

Ala

Gly 5790

Thr

Gly

Thr

Ala

Thr 5795

Gly

Thr

Cys

Thr

Gly 5800

Cys

Thr

Gly 5805

Thr

Gly

Cys

Cys 5810

Cys

Gly

Ala

Thr 5815

Gly

Ala

Thr

Ala 5820

Cys

Thr

Gly

Gly 5825

Ala

Thr

Ala

Gly

Cys 5830

Thr

Gly

Ala

Ala 5835

Thr

Gly

Ala

Gly 5840

Ala

Gly

Ala

Thr 5845

Ala

Thr

Gly 5850

Cys

Thr

Gly

Cys 5855

Thr

Gly

Cys

Ala

Thr 5860

Ala

Gly

Thr 5865

Thr

Gly

Thr

Gly 5870

Ala

Thr

Ala

Cys

Ala 5875

Gly

Cys

Ala

Ala 5880

Gly

Cys

Cys 5885

Thr

Gly

Thr

Gly 5890

Gly

Cys

Gly

Thr 5895

Gly

Thr

Cys

Gly 5900

Cys

Gly

Cys 5905

Ala

Cys

Ala

Gly 5910

Thr

Ala

Cys

Gly

Ala 5915

Cys

Cys 5920

Cys

Gly

Cys

Gly 5925

Cys

Thr

Gly

Cys

Gly 5930

Cys

Gly

Thr

Gly

Cys 5935

Ala

Cys

Gly

Cys 5940

Thr

Gly

Thr 5945

Ala

Cys

Ala

Cys 5950

Thr

Gly

Ala

Gly 5955

Cys

Ala

Gly

Gly 5960

Ala

Cys

Thr

Gly

Cys 5965

Gly

Ala

Gly

Thr

Gly 5970

Cys

Thr

Gly

Cys

Cys 5975

Gly

Cys

Gly

Cys 5980

Ala

Cys

Ala

Cys 5985

Cys

Gly

Ala

Gly

Thr 5990

Gly

Cys

Gly

Cys

Gly 5995

Cys

Gly

Gly 6000

Cys

Thr

PL 210 546 B1

Gly

Gly 6005

Gly

Cys

Gly

Cys

Cys 6010

Cys

Ala

Gly

Cys

Ala 6015

Cys

Gly

Thr 6020

Thr

Gly

Cys

Ala

Gly 6025

Cys

Thr

Cys

Ala

Ala 6030

Cys

Ala

Gly

Gly 6035

Ala

Cys

Ala

Cys

Ala 6040

Gly

Thr

Gly

Thr

Gly 6045

Cys

Ala

Cys 6050

Cys

Thr

Gly

Cys 6055

Cys

Thr

Gly

Cys 6060

Ala

Gly

Cys

Thr 6065

Ala

Cys

Thr

Cys 6070

Thr

Cys

Thr

Gly

Ala 6075

Thr

Gly

Cys

Thr 6080

Thr

Cys

Cys 6085

Thr

Cys

Ala

Cys 6090

Gly

Ala

Cys

Ala 6095

Ala

Thr

Gly

Cys 6100

Ala

Gly

Ala

Cys

Cys 6105

Cys

Thr

Gly

Ala 6110

Cys

Ala

Cys 6115

Thr

Gly

Thr

Ala

Cys 6120

Cys

Thr

Cys

Cys 6125

Thr

Gly

Ala 6130

Ala

Gly

Ala

Gly 6135

Ala

Gly

Thr

Ala

Gly 6140

Ala

Cys

Ala

Thr 6145

Cys

Ala

Thr

Gly

Gly 6150

Gly

Ala

Cys

Ala

Gly 6155

Ala

Gly

Ala

Ala 6160

Thr

Cys

Gly

Ala 6165

Thr

Gly

Thr

Gly

Gly 6170

Thr

Gly

Cys 6175

Ala

Gly

Thr

Cys 6180

Thr

Cys

Thr

Cys 6185

Thr

Gly

Cys

Ala 6190

Gly

Cys

Thr

Ala

Gly 6195

Ala

Cys 6200

Cys

Ala

Cys

Ala 6205

Ala

Thr

Gly

Ala 6210

Ala

Cys

Cys 6215

Ala

Thr

Gly

Thr

Thr 6220

Thr

Ala

Cys

Gly

Thr 6225

Cys

Gly

Ala

Cys

Ala 6230

Ala

Cys

Thr 6235

Cys

Ala

Cys

Ala

Cys 6240

Ala

Thr

Gly

Thr

Cys 6245

Cys

Ala

Cys

Thr 6250

Thr

Gly

Thr

Cys

Cys 6255

Ala

Gly

Cys

Thr

Cys 6260

Cys

Gly

Ala

Ala 6265

Cys

Thr

Cys

Thr 6270

Gly

Gly 6275

Gly

Ala

Cys

Gly 6280

Thr

Cys

Ala

Gly

Thr 6285

Cys

Thr

PL 210 546 B1

Cys

Cys 6290

Thr

Cys

Thr

Cys 6295

Cys

Cys 6300

Ala

Cys 6305

Cys

Ala

Gly 6310

Gly

Ala

Cys

Ala

Cys 6315

Cys

Thr

Cys

Ala 6320

Thr

Gly

Ala

Thr

Cys 6325

Thr

Cys

Gly 6330

Gly

Ala

Cys

Cys 6335

Cys

Thr

Gly

Ala

Gly 6340

Gly

Thr

Cys

Ala

Cys 6345

Ala

Thr

Gly

Cys

Gly 6350

Thr

Gly

Thr

Gly 6355

Gly

Thr

Gly

Ala 6360

Cys

Gly

Thr

Gly

Ala 6365

Gly

Cys

Ala

Cys 6370

Gly

Ala

Gly

Ala 6375

Cys

Thr

Gly 6380

Ala

Gly

Thr

Cys 6385

Ala

Gly

Thr

Thr 6390

Cys

Ala

Cys

Thr 6395

Gly

Thr

Ala

Cys 6400

Gly

Thr

Gly

Ala 6405

Cys

Gly

Cys

Gly 6410

Thr

Gly

Ala

Gly 6415

Gly

Thr

Gly

Cys

Ala 6420

Thr

Ala

Thr

Gly 6425

Cys

Ala

Gly 6430

Ala

Cys

Ala

Ala 6435

Gly

Cys

Gly

Cys 6440

Gly

Ala

Gly 6445

Gly

Ala

Gly

Cys

Ala 6450

Gly

Thr

Ala

Cys

Ala 6455

Ala

Cys

Ala

Gly

Cys 6460

Ala

Cys

Gly

Thr

Ala 6465

Cys

Gly

Thr

Gly 6470

Thr

Gly

Thr

Cys 6475

Ala

Gly

Cys

Gly

Thr 6480

Cys

Thr

Cys

Ala 6485

Cys

Gly

Thr

Cys 6490

Cys

Thr

Gly

Cys

Ala 6495

Cys

Ala

Gly

Gly 6500

Ala

Cys

Thr

Gly

Gly 6505

Cys

Thr

Gly

Ala

Ala 6510

Thr

Gly

Cys

Ala 6515

Ala

Gly

Ala

Gly 6520

Thr

Ala

Cys

Ala

Ala 6525

Gly

Thr

Gly

Cys

Ala 6530

Ala

Gly

Thr

Cys 6535

Thr

Cys

Ala

Ala 6540

Cys

Ala

Gly 6545

Cys

Thr

Cys 6550

Cys

Ala

Gly

Cys 6555

Cys

Ala 6560

Thr

Cys

Gly

Ala

Gly 6565

Ala

Cys 6570

Cys

Ala

Thr

PL 210 546 B1

Cys

Thr 6575

Cys

Ala

Ala 6580

Gly

Cys

Ala

Ala 6585

Ala

Gly

Cys 6590

Ala

Gly

Cys

Cys 6595

Cys

Gly

Ala

Gly

Ala 6600

Ala

Cys

Ala

Cys 6605

Ala

Gly

Thr

Gly 6610

Thr

Ala

Cys

Ala

Cys 6615

Cys

Thr

Gly

Cys 6620

Cys

Ala 6625

Thr

Cys

Gly 6630

Gly

Ala

Thr

Gly 6635

Ala

Gly

Cys

Thr

Gly 6640

Ala

Cys

Ala

Ala 6645

Gly

Ala

Cys

Cys 6650

Ala

Gly

Thr

Cys 6655

Ala

Gly

Cys

Thr 6660

Gly

Ala

Cys

Thr 6665

Gly

Cys

Thr

Gly 6670

Gly

Thr

Cys

Ala

Ala 6675

Ala

Gly

Cys

Thr 6680

Thr

Cys

Thr

Ala

Thr 6685

Cys

Ala

Gly 6690

Cys

Gly

Ala

Cys

Ala 6695

Thr

Cys

Gly

Cys

Cys 6700

Gly

Thr

Gly

Ala 6705

Gly

Thr

Gly

Gly 6710

Ala

Gly

Ala

Gly

Cys 6715

Ala

Thr

Gly

Gly 6720

Gly

Cys

Ala

Gly

Cys 6725

Cys

Gly

Ala

Gly 6730

Ala

Cys

Ala

Ala 6735

Cys

Thr

Ala

Cys

Ala 6740

Ala

Gly

Ala

Cys

Cys 6745

Ala

Cys

Gly

Cys

Cys 6750

Thr

Cys

Gly 6755

Thr

Gly

Cys

Thr

Gly 6760

Gly

Ala

Cys

Thr

Cys 6765

Cys

Gly

Ala

Cys

Gly 6770

Gly

Cys

Thr

Cys

Cys 6775

Thr

Cys

Thr

Thr 6780

Cys

Thr

Cys

Thr 6785

Ala

Cys

Ala

Gly

Cys 6790

Ala

Gly

Cys

Thr 6795

Cys

Ala

Cys

Gly 6800

Thr

Gly

Ala

Cys 6805

Ala

Gly

Ala

Gly 6810

Cys

Ala

Gly

Thr 6815

Gly

Cys

Ala

Gly 6820

Cys

Ala

Gly

Gly 6825

Gly

Ala

Cys

Gly 6830

Thr

Cys

Thr

Cys 6835

Thr

Cys

Ala

Thr

Gly 6840

Cys

Thr

Cys

Gly 6845

Thr

Gly

Ala

Thr

Gly 6850

Cys

Ala

Thr

Gly

Ala 6855

Gly

Cys

PL 210 546 B1

Thr

Cys 6860

Thr

Gly

Cys

Ala

Cys 6865

Ala

Cys

Ala 6870

Cys

Thr

Ala

Cys

Ala 6875

Cys

Gly

Cys

Ala

Gly 6880

Ala

Gly

Ala

Gly 6885

Cys

Thr

Cys

Thr 6890

Cys

Thr

Gly 6895

Thr

Cys

Thr

Cys

Cys 6900

Gly

Thr

Ala 6905

Ala

Thr

Ala

Ala 6910

Thr

Gly

Ala

Thr 6915

Cys

Gly

Cys

Gly 6920

Gly

Ala

Gly 6925

Ala

Gly

Ala

Ala 6930

Gly

Ala

Gly

Ala 6935

Ala

Gly

Ala

Gly 6940

Ala

Gly

Cys 6945

Cys

Gly

Ala

Ala 6950

Ala

Gly

Ala

Ala 6955

Gly

Cys

Thr

Gly

Ala 6960

Gly

Thr

Gly

Gly 6965

Cys

Thr

Gly

Cys

Thr 6970

Gly

Cys

Ala

Cys 6975

Cys

Gly

Cys

Thr

Gly 6980

Ala

Gly

Cys

Ala

Ala 6985

Thr

Ala

Cys

Thr 6990

Ala

Gly

Cys

Ala

Thr 6995

Ala

Cys

Cys 7000

Cys

Thr

Gly

Gly 7005

Gly

Cys

Thr 7010

Cys

Thr

Ala

Ala 7015

Cys

Gly

Thr 7020

Cys

Thr

Gly

Ala 7025

Gly

Thr 7030

Thr

Thr 7035

Gly

Cys

Thr

Gly

Ala 7040

Ala

Gly

Ala 7045

Gly

Ala

Cys 7050

Cys

Gly

Cys

Thr

Cys 7055

Thr

Cys

Ala

Cys 7060

Gly

Cys

Thr

Cys

Thr 7065

Thr

Cys

Ala

Cys

Gly 7070

Cys

Gly

Ala

Thr 7075

Ala

Thr

Ala 7080

Ala

Gly

Thr

Ala

Ala 7085

Cys

Gly

Ala

Thr

Cys 7090

Cys

Gly

Thr

Cys 7095

Cys

Ala

Gly

Thr

Ala 7100

Ala

Thr

Gly

Ala

Cys 7105

Cys

Thr

Cys

Ala

Gly 7110

Ala

Cys

Thr

Cys 7115

Cys

Ala

Thr

Cys

Thr 7120

Gly

Ala

Thr

Thr 7125

Thr

Gly

Thr

Cys 7130

Ala

Gly

Ala

Cys 7135

Gly

Cys

Thr

Cys

Gly 7140

Gly

Thr

PL 210 546 B1

Gly

Cys 7145

Cys

Gly

Cys

Gly 7150

Gly

Cys

Gly

Thr 7155

Thr

Thr 7160

Ala

Thr

Gly

Gly 7165

Thr

Gly

Ala

Gly

Ala 7170

Ala

Thr

Cys

Gly

Cys 7175

Ala

Gly

Cys

Ala

Ala 7180

Cys

Thr

Gly

Thr 7185

Cys

Gly

Cys

Gly

Cys 7190

Cys

Ala

Thr

Cys 7195

Gly

Ala

Gly

Cys

Cys 7200

Ala

Thr

Gly

Thr

Cys 7205

Gly

Thr

Cys

Gly

Thr 7210

Cys

Ala

Cys

Gly 7215

Ala

Cys

Cys 7220

Cys

Ala

Thr

Thr 7225

Cys

Ala

Gly

Ala 7230

Ala

Cys

Ala

Gly

Cys 7235

Ala

Gly

Cys

Ala 7240

Gly

Cys

Ala

Thr

Thr 7245

Gly

Ala

Gly

Ala

Ala 7250

Cys

Thr

Gly 7255

Gly

Ala

Thr

Cys 7260

Cys

Ala

Gly

Thr

Cys 7265

Cys

Thr

Cys

Thr 7270

Thr

Cys

Ala

Cys 7275

Cys

Thr

Gly

Cys

Thr

Gly

Ala

Cys

Gly

7280 7285

<210> <211> <212> <213>	29 14 PRT Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Korzystne	domeny modulujące TALL-1
<400>	29
Pro Gly Thr Cys :	Phe Pro Phe Pro Trp Glu Cys

10

Thr His Ala <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 30

Trp Gly Ala Cys Trp Pro Phe Pro Trp Glu Cys Phe Lys Glu 15 10

PL 210 546 B1 <210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 31

Val Pro Phe Cys Asp Leu Leu Thr Lys His Cys Phe Glu Ala 15 10 <210> 32 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 32

Gly Ser Arg Cys Lys Tyr Lys Trp Asp Val Leu Thr Lys Gin Cys Phe 15 10 15

His His <210> 33 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 33

Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gin Trp Val Cys Asp 15 10 15

Pro Leu <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 34

Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Cys Thr 15 10 15

Ser Ser

PL 210 546 B1 <210> 35 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 35

Ser Asp Asp Cys Met Tyr Asp Gin Leu Thr Arg Met Phe Ile Cys Ser 15 10 15

Asn Leu <210> 36 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 36

Asp Leu Asn Cys Lys Tyr Asp Glu Leu Thr Tyr Lys Glu Trp Cys Gin 15 10 15

Phe Asn <210> 37 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 37

Phe His Asp Cys Lys Tyr Asp Leu Leu Thr Arg Gin Met Val Cys His 15 10 15

Gly Leu <210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 38

Arg Asn His Cys Phe Trp Asp His Leu Leu Lys Gin Asp Ile Cys Pro 15 10 15

Ser Pro

PL 210 546 B1 <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 39

Ala Asn Gin Cys Trp Trp Asp Ser Leu Thr Lys Lys Asn Val Cys Glu 15 10 15

Phe Phe

<210> <211> <212> <213>	40 8 DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Linkery poliglicynowe
<400> 40 gggkgggg
<210> <211> <212> <213>	41 8 DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Linkery poliglicynowe
<220> <221> <222> <223>	inne cechy (4) . . (4> N oznacza asparginę
<400>	41
gggngsgg
<210> <211> <212> <213>	42 8 DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Linkery poliglicynowe
<400>	42
gggcgggg
<210>	43

PL 210 546 B1 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Linkery poliglicynowe <400> 43

Gly Pro Asn Gly Gly

1	5
<210>	44
<211>	19
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Wiązanie peptydowe
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(19) . . (19)
<223>	Xaa = wiązanie peptydowe domena Fc przyłączona w pozycji 19 do C-końca
<400>	44

Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gin Trp Val Cys Asp 15 10 15

Pro Leu Xaa <210> 45 <211> 19 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Wiązanie peptydowe <220>

<221> inne cechy <222> (1)..(1) <223> Xaa = wiązanie peptydowe domena Fc domain przyłączona w pozycji 1 do N-końca <400> 45

Xaa Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gin Trp Val Cys 15 10 15

Asp Pro Leu <210> 46 <211> 38 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

PL 210 546 B1

<220>
<223>	Wiązanie peptydowe
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(19)..(19)
<223>	Xaa = wiązanie peptydowe
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(38) . . (38)
<223>	Xaa = wiązanie peptydowe domena Fc przyłączona w pozycji 38 do C-końca
<400>	46

Leu 1

Pro

Gly

Cys

Lys 5

Trp

Asp

Leu

Ile 10

Lys

Gin

Trp

Val

Cys 15

Asp

Pro

Leu

Xaa

Leu

Pro

Gly

Cys

Lys

Trp

Asp

Leu

Ile

Lys

Gin

Trp

25 30

Val Cys Asp Pro Leu Xaa 35 <210> 47 <211> 38 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Wiązanie peptydowe <220>

<221> inne cechy <222> (1)..(1) <223> Xaa = wiązanie peptydowe domena Fc przyłączona w pozycji 1 do N-końca <220>

<221> inne cechy <222> (20) . . (20) <223> Xaa = wiązanie peptydowe <400> 47

Xaa 1

Leu

Pro

Gly

Cys 5

Lys

Trp

Asp

Leu

Leu 10

Ile

Lys

Gin

Trp

Val 15

Cys

Asp

Pro

Leu

Xaa 20

Leu

Pro

Gly

Cys

Lys 25

Trp

Asp

Leu

Ile 30

Lys

Gin

Trp

Val

Cys

Asp

Pro

Leu

PL 210 546 B1

<210>	48
<211>	19
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Wiązanie peptydowe
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(19) . . (19)
<223>	Xaa = wiązanie peptydowe domena Fc przyłączona w pozycji 19 do C-końca
<400>	48

Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Cys Thr 15 10 15

Ser Ser Xaa

<210> <211> <212> <213>	49 19 PRT Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Wiązanie peptydowe
<220> <221> <222> <223>	inne cechy (1) - · (1) Xaa = wiązanie peptydowe Domena Fc przyłączona w pozycji 1 do
<400>	49

Xaa Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Cys 15 10 15

Thr Ser Ser
<210>	50
<211>	36
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Wiązanie peptydowe
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(18) . . (18)
<223>	Xaa = wiązanie peptydowe
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(36)..(36)

PL 210 546 B1 <223> Xaa = wiązanie peptydowe

Domena Fc przyłączona w pozycji 36 do C-końca <400> 50

Ser

Ala

Asp

Cys

Tyr

Phe

Asp

Ile

Leu

Thr

Lys

Ser

Asp

Val

Thr

Ser

1

5

10

15

Ser

Xaa

Ser

Ala

Asp

Cys

Tyr

Phe

Asp

Ile

Leu

Thr

Lys

Ser

Asp

Val

25 30

Thr Ser Ser Xaa 35 <210> 51 <211> 36 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Wiązanie peptydowe <220>

<221> inne cechy <222> (1) . . (1) <223> Xaa = wiązanie peptydowe

Domena Fc przyłączona w pozycji 1 do N-końca <220>

<221> inne cechy <222> (19)..(19) <223> Xaa = wiązanie peptydowe <400> 51

Xaa 1

Ser

Ala

Asp Cys Tyr 5

Phe Asp

Ile Leu 10

Thr

Lys

Ser Asp

Val 15

Thr

Ser

Xaa

Ser

Ala Asp

Cys

Tyr

Phe

Asp

Ile

Leu

Thr

Lys

Ser

Asp

20

25

30

Val Thr Ser Ser 35

<210>	52
<211>	19
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223> <220>	Wiązanie peptydowe
<221>	inne cechy
<222>	(19) · (19)
<223>	Xaa = wiązanie peptydowe Domena Fc przyłączona w pozycji 19 do C-końca

PL 210 546 B1 <400> 52

Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Val Cys His 15 10 15

Gly Leu Xaa

<210> <211> <212> <213>	53 19 PRT Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Wiązanie peptydowe
<220> <221> <222> <223>	inne cechy (1) . · (1) Xaa = wiązanie peptydowe Domena Fc przyłączona w pozycji 1 do
<400>	53

Xaa Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Val Cys 15 10 15

His Gly Leu

<210> <211> <212> <213>	54 38 PRT Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Wiązanie peptydowe
<220> <221> <222> <223>	inne cechy (19) · · (19) Xaa = wiązanie peptydowe
<220> <221> <222> <223>	inne cechy (38) . . (38) Xaa = wiązanie peptydowe Domena Fc przyłączona w pozycji 38 do C-końca
<400>	54

Phe 1

His

Asp Cys

Lys 5

Trp

Asp

Leu Leu

Thr 10

Lys

Gin Trp Val

Cys 15

His

Gly

Leu

Xaa

Phe

His

Asp

Cys

Lys

Trp

Asp

Leu

Thr

Lys

Gin

Trp

20

25

30

Val

Cys

His

Gly

Leu

Xaa

35

PL 210 546 B1 <210> 55 <211> 38 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Wiązanie peptydowe <220>

<221> inne cechy <222> (1)..(1) <223> Xaa = wiązanie peptydowe

Domena Fc przyłączona w pozycji 1 do N-końca <220>

<221> inne cechy <222> (20)..(20) <223> Xaa = wiązanie peptydowe <400> 55

Xaa 1	Phe	His	Asp	Cys 5	Lys	Trp	Asp
His	Gly	Leu	Xaa 20	Phe	His	Asp	Cys
Trp	Val	Cys	His	Gly	Leu

Leu Thr Lys Gin Trp Val Cys 10 15

Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin 30 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd <400> 56 cggcgcaact atcggtatca agctg <210> 57 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd <400> 57 catgtaccgt aacactgagt ttcgtc <210> 58 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

PL 210 546 B1 <220>

<223> Peptyd zgodny <400> 58

Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Val Cys His 15 10 15

Gly Leu <210> 59 <211> 23 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystna sekwencja linkera <400> 59

Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly 15 10 15

Ser Gly Ser Ala Thr His Met 20 <210> 60 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 60

Asn Gin Thr Leu Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Phe Ile Thr 15 10 15

Tyr Met <210> 61 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 61

Pro Val Tyr Gin Gly Trp Trp Asp Thr Leu Thr Lys Leu Tyr Ile Trp 15 10 15

Asp Gly

PL 210 546 B1 <210> 62 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 62

Trp Leu Asp Gly Gly Trp Arg Asp Pro Leu Ile Lys Arg Ser Val Gin 15 10 15

Leu Gly <210> 63 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 63

Gly His Gin Gin Phe Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Val Gin 15 10 15

Ser Asn <210> 64 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 64

Gin Arg Val Gly Gin Phe Trp Asp Val Leu Thr Lys Met Phe Ile Thr ¹ 5 10 15

Gly Ser <210> 65 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 65

Gin Ala Gin Gly Trp Ser Tyr Asp Ala Leu Ile Lys Thr Trp Ile Arg ¹ 5 10 15

Trp Pro

PL 210 546 B1 <210>

<211>

<212>

PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 66

Gly Trp Met His Trp Lys Trp Asp Pro Leu Thr Lys Gin Ala Leu Pro 15 10 15

Trp Met <210> 67 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 67

Gly His Pro Thr Tyr Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Ile Leu 15 10 15

Gin Met <210>

<211>

<212>

PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 68

Trp Asn Asn Trp Ser Leu Trp Asp Pro Leu Thr Lys Leu Trp Leu Gin 15 10 15

Gin Asn <210> 69 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1

100

PL 210 546 B1 <400> 69

Trp Gin Trp Gly Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Val Gin 15 10 15

Gin Gin <210> 70 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 70

Gly Gin Met Gly Trp Arg Trp Asp Pro Leu Thr Lys Met Trp Leu Gly 15 10 15

Thr Ser

<210> 73 <211> 62 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy

PL 210 546 B1

101

<400> tatgtg gg	73
gggt gcttgttggc cgttcccgtg ggaatgtttc aaagaaggtg gaggcggtgg	60 62
<210>	74
<211>	64
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Oligonukleotydy
<400>	74
tcgaccccac cgcctccacc ttctttgaaa	cattcccacg	ggaacggcca	acaagcaccc	60
caca					64
<210>	75
<211>	62
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Oligonukleotydy
<400>	75
tatggttccg ttctgtgacc tgctgactaa	acactgtttc	gaagctggtg	gaggcggtgg	60
gg					62
<210>	76
<211>	64
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Oligonukleotydy
<400>	76
tcgaccccac cgcctccacc agcttcgaaa	cagtgtttag	tcagcaggtc	acagaacgga	60
acca					64
<210>	77
<211>	74
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Oligonukleotydy
<400>	77
tatgggttct cgttgtaaat acaaatggga	cgttctgact	aaacagtgtt	tccaccacgg	60

102

PL 210 546 B1 tggaggcggt gggg <210> 78 <211> 76 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 78 tcgaccccac cgcctccacc gtggtggaaa cactgtttag tcagaacgtc ccatttgtat ttacaacgag aaccca <210> 79 <211> 74 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 79 tatgctgccg ggttgtaaat gggacctgct gatcaaacag tgggtttgtg acccgctggg tggaggcggt gggg <210>

<211>

<212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 80 tcgaccccac cgcctccacc cagcgggtca caaacccact gtttgatcag caggtcccat ttacaacccg gcagca <210>

<211>

<212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 81 tatgtctgct gactgttact tcgacatcct gactaaatct gacgtttgta cttcttctgg tggaggcggt gggg

PL 210 546 B1

103 <210> 82 <211> 76 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 82 tcgaccccac cgcctccacc agaagaagta caaacgtcag atttagtcag gatgtcgaag taacagtcag cagaca <210> 83 <211> 74 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 83 tatgtctgac gactgtatgt acgaccagct gactcgtatg ttcatctgtt ctaacctggg tggaggcggt gggg <210> 84 <211> 76 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 84 tcgaccccac cgcctccacc caggttagaa cagatgaaca tacgagtcag ctggtcgtac atacagtcgt cagaca <210> 85 <211> 74 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 85 tatggacctg aactgtaaat acgacgaact gacttacaaa gaatggtgtc agttcaacgg tggaggcggt gggg

104

PL 210 546 B1 <210> 86 <211> 76 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 86 tcgaccccac cgcctccacc gttgaactga caccattett tgtaagtcag ttcgtcgtat ttacagttca ggtcca <210> 87 <211> 74 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 87 tatgttccac gactgtaaat acgacctgct gactcgtcag atggtttgtc acggtctggg tggaggcggt gggg <210>

<211>

<212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 88 tcgaccccac cgcctccacc cagaccgtga caaaccatct gacgagtcag caggtcgtat 60 ttacagtcgt ggaaca 76 <210>

<211>

<212>

DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 89 tatgcgtaac cactgtttct gggaccacct gctgaaacag gacatctgtc cgtctccggg tggaggcggt gggg

PL 210 546 B1

105 <210> 90 <211> 76 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 90 tcgaccccac cgcctccacc cggagacgga cagatgtcct gtttcagcag gtggtcccag 60 aaacagtggt tacgca 76 <210> 91 <211> 74 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 91 tatggctaac cagtgttggt gggactctct gctgaaaaaa aacgtttgtg aattcttcgg tggaggcggt gggg <210> 92 <211> 76 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 92 tcgaccccac cgcctccacc gaagaattca caaacgtttt ttttcagcag agagtcccac caacactggt tagcca <210> 93 <211> 74 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 93 tatgttccac gactgcaaat gggacctgct gaccaaacag tgggtttgcc acggtctggg tggaggcggt gggg

106

PL 210 546 B1 <210> 94 <211> 76 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotydy <400> 94 tcgaccocac cgcctccacc cagaccgtgg caaacccact gtttggtcag caggtcccat ttgcagtcgt ggaaca <210> 95 <211> 141 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> wektor pAMG21-Rank-Fc <400> 95 ctaattccgc tctcacctac caaacaatgc ccccctgcaa aaaataaatt catataaaaa 60 acatacagat aaccatctgc ggtgataaat tatctctggc ggtgttgaca taaataccac 120 tggcggtgat actgagcaca t 141 <210> 96 <211> 55 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> wektor pAMG21-Rank-Fc <400> 96 cgatttgatt ctagaaggag gaataacata tggttaaogc gttggaattc ggtac <210> 97 <211> 1546 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> pAMG21 <400> 97

tgcatggtct	ccccatgcga	gagtagggaa	ctgccaggca	tcaaataaaa	60
agtcgaaaga	ctgggccttt	ogttttatct	gttgtttgtc	ggtgaacgct	120
ggacaaatcc	gccgggagcg	gatttgaacg	ttgcgaagca	acggcccgga	180
caggacgccc	gccataaact	gccaggcatc	aaattaagca	gaaggccatc	240

PL 210 546 B1

107

ctgacggatg	gcctttttgc	gtttctacaa	actcttttgt	ttatttttct	aaatacattc	300
aaatatggac	gtcgtactta	acttttaaag	tatgggcaat	caattgctcc	tgttaaaatt	360
gctttagaaa	tactttggca	gcggtttgtt	gtattgagtt	tcatttgcgc	attggttaaa	420
tggaaagtga	ccgtgcgctt	actacagcct	aatatttttg	aaatatccca	agagcttttt	480
ccttcgcatg	cccacgctaa	acattctttt	tctcttttgg	ttaaatcgtt	gtttgattta	540
ttatttgcta	tatttatttt	tcgataatta	tcaactagag	aaggaacaat	taatggtatg	600
ttcatacacg	catgtaaaaa	taaactatct	atatagttgt	ctttctctga	atgtgcaaaa	660
ctaagcattc	cgaagccatt	attagcagta	tgaataggga	aactaaaocc	agtgataaga	720
cctgatgatt	tcgcttcttt	aattacattt	ggagattttt	tatttacagc	attgttttca	780
aatatattcc	aattaatcgg	tgaatgattg	gagttagaat	aatctactat	aggatcatat	840
tttattaaat	tagcgtcatc	ataatattgc	ctccattttt	tagggtaatt	atccagaatt	900
gaaatatcag	atttaaccat	agaatgagga	taaatgatcg	cgagtaaata	atattcacaa	960
tgtaccattt	tagtcatatc	agataagcat	tgattaatat	cattattgct	tctacaggct	1020
ttaattttat	taattattct	gtaagtgtcg	tcggcattta	tgtctttcat	acccatctct	1080
ttatccttac	ctattgtttg	tcgcaagttt	tgcgtgttat	atatcattaa	aacggtaata	1140
gattgacatt	tgattctaat	aaattggatt	tttgtcacac	tattatatcg	cttgaaatac	1200
aattgtttaa	cataagtacc	tgtaggatcg	tacaggttta	cgcaagaaaa	tggtttgtta	1260
tagtcgatta	atcgatttga	ttctagattt	gttttaacta	attaaaggag	gaataacata	1320
tggttaacgc	gttggaattc	gagctcacta	gtgtcgacct	gcagggtacc	atggaagctt	1380
actcgaggat	ccgcggaaag	aagaagaaga	agaagaaagc	ccgaaaggaa	gctgagttgg	1440
ctgctgccac	cgctgagcaa	taactagcat	aaccccttgg	ggcctctaaa	cgggtcttga	1500
ggggtttttt	gctgaaagga	ggaaccgctc	ttcacgctct	tcacgc		1546

<210> 98 <211> 872 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> GM221 <400> 98 ttattttcgt gcggccgcac cattatcacc gccagaggta aactagtcaa cacgcacggt 60 gttagatatt tatcccttgc ggtgatagat tgagcacatc gatttgattc tagaaggagg 120

108

PL 210 546 B1

gataatatat	gagcacaaaa	aagaaaccat	taacacaaga	gcagcttgag	gacgcacgtc	180
gccttaaagc	aatttatgaa	aaaaagaaaa	atgaacttgg	cttatcccag	gaatctgtcg	240
cagacaagat	ggggatgggg	cagtcaggcg	ttggtgcttt	atttaatggc	atcaatgcat	300
taaatgctta	taacgccgca	ttgcttacaa	aaattctcaa	agttagcgtt	gaagaattta	360
gcccttcaat	cgccagagaa	tctacgagat	gtatgaagcg	gttagtatgc	agccgtcact	420
tagaagtgag	tatgagtacc	ctgttttttc	tcatgttcag	gcagggatgt	tctcacctaa	480
gcttagaacc	tttaccaaag	gtgatgcgga	gagatgggta	agcacaacca	aaaaagccag	540
tgattctgca	ttctggćttg	aggttgaagg	taattccatg	accgcaccaa	caggctccaa	600
gccaagcttt	cctgacggaa	tgttaattct	cgttgaccct	gagcaggctg	ttgagccagg	660
tgatttctgc	atagccagac	ttgggggtga	tgagtttacc	ttcaagaaac	tgatcaggga	720
tagcggtcag	gtgtttttac	aaccactaaa	cccacagtac	ccaatgatcc	catgcaatga	780
gagttgttcc	gttgtgggga	aagttatcgc	tagtcagtgg	cctgaagaga	cgtttggctg	840
atagactagt	ggatccacta	gtgtttctgc	cc			872

<210> 99 <211> 1197 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> (34221 <400> 99

ggcggaaacc	gacgtccatc	gaatggtgca	aaacctttcg	cggtatggca	tgatagcgcc	60
cggaagagag	tcaattcagg	gtggtgaatg	tgaaaccagt	aacgttatac	gatgtcgcag	120
agtatgccgg	tgtctcttat	cagaccgttt	cccgcgtggt	gaaccaggcc	agccacgttt	180
ctgcgaaaac	gcgggaaaaa	gtcgaagcgg	cgatggcgga	gctgaattac	attcccaacc	240
gcgtggcaca	acaactggcg	ggcaaacagt	cgctcctgat	tggcgttgcc	acctccagtc	300
tggccctgca	cgcgccgtcg	caaattgtcg	cggcgattaa	atctcgcgcc	gatcaactgg	360
gtgccagcgt	ggtggtgtcg	atggtagaac	gaagcggcgt	cgaagcctgt	aaagcggcgg	420
tgcacaatct	tctcgcgcaa	cgcgtcagtg	ggctgatcat	taactatccg	ctggatgacc	480
aggatgccat	tgctgtggaa	gctgcctgca	ctaatgttcc	ggcgttattt	cttgatgtct	540
ctgaccagac	acccatcaac	agtattattt	tctcccatga	agacggtacg	cgactgggcg	600
tggagcatct	ggtcgcattg	ggtcaccagc	aaatcgcgct	gttagcgggc	ccattaagtt	660

PL 210 546 B1

109

ctgtctcggc	gcgtctgcgt	ctggctggct	ggcataaata	tctcactcgc	aatcaaattc	720
agccgatagc	ggaacgggaa	ggcgactgga	gtgccatgtc	cggttttcaa	caaaccatgc	780
aaatgctgaa	tgagggcatc	gttcccactg	cgatgctggt	tgccaacgat	cagatggcgc	840
tgggcgcaat	gcgcgccatt	accgagtccg	ggctgcgcgt	tggtgcggat	atctcggtag	900
tgggatacga	cgataccgaa	gacagctcat	gttatatccc	gccgttaacc	accatcaaac	960
aggattttcg	cctgctgggg	caaaccagcg	tggaccgctt	gctgcaactc	tctcagggcc	1020
aggcggtgaa	gggcaatcag	ctgttgcccg	tctcactggt	gaaaagaaaa	accaccctgg	1080
cgcccaatac	gcaaaccgcc	tctccccgcg	cgttggccga	ttcattaatg	cagctggcac	1140
gacaggtttc	ccgactggaa	agcggacagt	aaggtaccat	aggatccagg	cacagga	1197

<210> <211> <212> <213>	100 14 PRT Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Moduladory TALL-1
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(1, 2, 3, 13) . . (14)
<223>	Xaa (Poz. . 1,2,3,13,14) oznaczają lkażdy niezależnie aminokwasowe lub ich brak;
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(6) . . (6)
<223>	Xaa (Poz.6) oznacza resztę aminokwasową;
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(8) . . (8)
<223>	Xaa (Poz.8) oznacza treonyl lub izoleucyl;
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(9) . . (9)
<223>	Xaa (Poz. 9) oznacza resztę zasadową lub hydrofobową;
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(10) . . (10)
<223>	Xaa (Poz. 10) oznacza resztę aminokwasową;
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(12)..(12)
<223>	Xaa (Poz. 12) oznacza resztę obojętną lub hydrofobową;

110

PL 210 546 B1 <400> 100

Xaa Xaa Xaa Cys Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa

1	5	10
<210>	101
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Moduładory TALL-1
<220> <221>	inne cechy
<222>	(1, 2, 3, 12 i)..(13)
<223>	Xaa (Poz.1,2,3,12,13) ich brak;	oznaczają niezależnie reszty aminokwasowe lub
<220> <221>	inne cechy
<222>	(5 i) . . (8)
<223>	Xaa (Poz.5,8) oznacza	resztę obojętną lub hydrofobową;
<220> <221>	inne cechy
<222>	(10) . . (10)
<223>	Xaa (Poz.10) oznacza	resztę kwasową;
<220> <221>	inne cechy
<222>	(14) . . (14)
<223>	Xaa (Poz. 14) oznacza	resztę aminokwasową lub jej brak.
<400>	101
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Pro Phe	Xaa Trp Xaa Cys Xaa Xaa Xaa

10 <210> 102 <211> 14 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Modulador TALL-1 <220>

<221> inne cechy <222> (1, 2, 3, 12, 13 i)..(14) <223> Xaa (Poz. 1,2,3,12,13,14) oznaczają niezależnie reszty aminokwasowe lub ich brak;

PL 210 546 B1

111 <220>

<221> inne cechy <222> (6 i)..(7) <223> Xaa (Ροζ. 6,7) oznacza resztę hydrofobową;

<220>

<221> inne cechy <222> (10)..(10) <223> Xaa (Poz. 10) oznacza resztę kwasową lub polarną hydrofobową.

<400> 102

Xaa Xaa Xaa Cys Trp Xaa Xaa Trp Gly Xaa Cys Xaa Xaa Xaa

10 <210> 103 <211> 14 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Modulador TALL-1 <220>

<221> inne cechy <222> (1) . . (1) <223> Xaa (Ροζ. 1) oznacza resztę aminokwasową lub jej brak;

<220>

<221> inne cechy <222> (2 i)..(14) <223> Xaa (Poz. 2,14) oznacza obojętną resztę hydrofobową;

<220>

<221> inne cechy <222> (3 i)..(10) <223> Xaa (Poz. 3,10) oznacza resztę kwasową;

<220>

<221> inne cechy <222> (5, 6, 7, 8, 12 i)..(13) <223> Xaa (Poz. 5,6,7,8,12,13) oznaczają niezależnie reszty aainokwasowe;

<220>

<221> inne cechy <222> (9)..(9) <223> Xaa (Poz. 9) oznacza resztę kwasową;

<400> 103

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa

10 <210> 104 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

112

PL 210 546 B1 <220>

<223> Modulador TALL-1 <220>

<221> inne cechy <222> (1, 2, 12, 13, 16, 17 i)..(18) <223> Xaa (Ροζ. 1,2,12,13,16,17,18) oznaczają niezależnie reszty aminokwasowe lub ich brak;

<220>

<221> <222> <223>	inne cechy
(3) . Xaa	• (3) (Poz. 3) oznacza	resztę kwasową lub amidową;
<220>
<221>	inne	cechy
<222>	(5 i) . . (8)
<223>	Xaa	(Poz. 5,8) oznacza resztę aminokwasową;
<220>
<221>	inne	cechy
<222>	(6) .	(5)
<223>	Xaa	(Poz. 6) oznacza	resztę aromatyczną;
<220>
<221>	inne	cechy
<222>	(10)	• · (10)
<223>	Xaa	(Poz. 10) oznacza T lub I;
<220>
<221>	inne	cechy
<222>	(11)	• · dl)
<223>	Xaa	(Poz. 11) oznacza resztę zasadową;
<220>
<221>	inne	cechy
<222>	(14)	. · (14)
<223>	Xaa	(Poz. 14) oznacza	i obojętną resztę hydrofobową.
<400>	104
Xaa Xaa Xaa	Cys Xaa Xaa Asp	Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa
1		5	10 15
Xaa Xaa

<210>	105
<211>	18
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Modulador TALL-1
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(1, 2 i) . . (3)

PL 210 546 B1

113 <223> Xaa (Ροζ. 1,2,3) oznaczają niezależnie reszty aminokwasowe lub ich brak;

<220>

<221> inne cechy <222> (5, 7, 14 i)..(16) <223> Xaa (Poz. 5,7,14,16) oznacza resztę aminokwasową;

<220>

<221> inne cechy <222> (9)..(9) <223> Xaa (Poz. 9) oznacza T lub I;

<220>

<221> inne cechy <222> (10)..(10) <223> Xaa (Poz. 10) oznacza resztę zasadową;

<220>

<221> inne cechy <222> (11 i) . . (12) <223> Xaa (Poz. 11,12) oznaczają niezależnie reszty aminokwasowe;

<220>

<221> inne cechy <222> (13 i) .. (17) <223> Xaa (Poz. 13,17) oznacza obojętną resztę hydrofobową;

<220>

<221> inne cechy <222> (18)..(18) <223> Xaa (Poz. 18) oznacza resztę aminokwasową lub jej brak.

<400> 105

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 15 10 15

Xaa Xaa <210> 106 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Modulador TALL-1 <220>

<221> inne cechy <222> (1, 2, 3, 16, 17 i) . . (18) <223> Xaa (Poz. 1,2,3,16,17,18) oznaczają niezależnie reszty aminokwasowe lub ich brak;

<220>

<221> inne cechy <222> (5, 6, 7, 10 i) . . (14) <223> Xaa (Poz. 5,6,7,10,14) oznaczają niezależnie reszty aminokwasowe.

114

PL 210 546 B1

<220> <221> <222> <223>	inne cechy	12)	oznacza T lub I;
(12) Xaa	•·(12) (Poz .
<220> <221>	inne	cechy
<222>	(13)	•(13)
<223>	Xaa	(Poz.	13)	oznacza resztę	! aminokwasową;
<400>	106
Xaa Xaa Xaa	Cys Xaa Xaa Xaa Trp Asp	Xaa Leu Xaa Xaa	Xaa Cys Xaa
1		5			10	15
Xaa Xaa

<210> 107 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Modulador TALL-1 <220>

<221> inne cechy <222> (1,2,3,15,16,17)..(18) <223> Xaa (Ροζ. 1,2,3,15,16,17,18) oznaczają niezależnie reszty aminokwasowe lub ich brak ;

<220>

<221> inne cechy <222> (5, 6, 7, 9 i)..(13) <223> Xaa (Poz. 5,6,7,9 13) oznaczają niezależnie reszty aminokwasowe <220>

<221> inne cechy <222> (11)..(11) <223> Xaa (Poz. 11) oznacza T lub I;

<400> 107

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Leu Xaa Lys Xaa Cys Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa

<210> <211> <212> <213>	108 4 PRT Sekwencja	sztuczna
<220>
<223>	Modulador	TALL-1

PL 210 546 B1

115 <220>

<221> inne cechy <222> (2)..(2) <223> X w (Ροζ. 2) oznacza resztę aminokwasowa;

<220>

<221> inne cechy <222> (4)..(4) <223> X w (Poz. 4) oznacza treonyl lub izoleucyl <400> 108

Asp Xaa Leu Xaa

<210>	109
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Modulador TALL-1
<220>
<221>	inne cechy
<222>	(1, 2 i) . . (3)
<223>	X w (Ροζ. 1, 2, 3) oznaczają niezależnie reszty aminokwasowe lub ich brak; (przy czym jedna z grup XI, X2 i X3 oznacza korzystnie C gdy jedna z grup Χ12, Χ13 i Χ14 oznacza C);

<220>

<221> inne cechy

116

PL 210 546 B1 <222> (13)..(13) <223> X w (Ροζ. t 13) oznacza C, obojętną resztę hydrofobową lub jej brak (korzystnie V);

<220>

<221> inne cechy <222> (14) . . (14) <223> X w (Poz. 14) oznacza dowolną resztę aminokwasową lub jej brak.

<400> 109

Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Gin Xaa Xaa Xaa

10 <210> 110 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Modulador TALL-1 <400> 110

Pro Phe Pro Trp Glu 1 5

<210>	111
<211>	248
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Ciała peptydowe inhibitujące	TALL-1
<400>	111
Met Pro Gly Thr Cys Phe Pro Phe Pro	Trp Glu Cys Thr His Ala Gly

Ala

Pro

Val

Gin

PL 210 546 B1

117

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 115 120 125

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 130 135 140

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

145 150 155 160

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

165 170 175

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 180 185 190

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 195 200 205

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 210 215 220

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 225 230 235 240

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 <210> 112 <211> 248 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Ciała peptydowe inhibitujące TALL-1 <400> 112

Met Trp Gly Ala Cys Trp Pro Phe Pro Trp Glu Cys Phe Lys Glu Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 20 25 30

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 35 40 45

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 50 55 60

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

70 75 80

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin

90 95

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 100 105 110

118

PL 210 546 B1

Asp

Trp

Leu 115

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr 120

Lys

Cys

Lys

Val

Ser 125

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro 130

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys 135

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala 140

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 145

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr 150

Thr

Leu

Pro

Ser 155

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr 160

Lys

Asn

Gin

Val

Ser 165

Leu

Thr

Cys

Leu

Val 170

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro 175

Ser

Asp

Ile

Ala

Val 180

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn 185

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn 190

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr 195

Pro

Val

Leu

Asp 200

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe 205

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys 210

Leu

Thr

Val

Asp

Lys 215

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin 220

Gly

Asn

Val

Phe

Ser 225

Cys

Ser

Val

Met

His 230

Glu

Ala

Leu

His

Asn 235

His

Tyr

Thr

Gin

Lys 240

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

245 <210> 113 <211> 248 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Ciała peptydowe inhibitujące TALL-1 <400> 113

Met 1

Val

Pro

Phe

Cys 5

Asp

Leu

Thr

Lys 10

His

Cys

Phe

Glu

Ala 15

Gly

Gly 20

Val

Asp

Lys

Thr

His 25

Thr

Cys

Pro

Cys 30

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu 35

Leu

Gly

Pro

Ser 40

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 45

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 50

Thr

Leu

Met

Ile

Ser 55

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 60

Thr

Cys

Val

Val 65

Asp

Val

Ser

His

Glu 70

Asp

Pro

Glu

Val

Lys 75

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 80

Asp

Gly

Val

Glu

Val 85

His

Asn

Ala

Lys

Thr 90

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu 95

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr 100

Tyr

Arg

Val

Ser 105

Val

Leu

Thr

Val

Leu 110

His

Gin

PL 210 546 B1

119

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

115

120

125

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

130

135

140

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

145

150

155

160

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

165

170

175

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

180

185

190

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

195

200

205

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

210

215

220

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

225

230

235

240

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

245 <210> 114 <211> 252

<212> 1 <213> !	PRT Sekwencja sztuczna
<220> <223> Ciała peptydowe inhibitujące TALL-1 <400> 114
Met Gly 1	Ser Arg Cys Lys Tyr Lys Trp Asp Val Leu Thr Lys Gin Cys 5 10 15
Phe Hi s	His Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30
Pro Cys	Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 35 40 45
Pro Pro 50	Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 55 60
Thr Cys 65	Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 70 75 80
Asn Trp	Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 85 90 95
Arg Glu	Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 100 105 110

120

PL 210 546 B1

Val

Leu His 115

Gin

Asp

Trp

Leu Asn 120

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys 125

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

130

135

140

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

145

150

155

160

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

165

170

175

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

180

185

190

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

195

200

205

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

210

215

220

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

225

230

235

240

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

245 250 <210> 115 <211> 252 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Ciała	peptydowe inhibitujące TALL-1
<400> 115
Met Leu Pro 1	Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gin Trp Val Cys 5 10 15
Asp Pro Leu	Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30
Pro Cys Pro 35	Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 40 45
Pro Pro Lys 50	Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 55 60
Thr Cys Val 65	Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 70 75 80
Asn Trp Tyr	Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 85 90 95
Arg Glu Glu	Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 100 105 110

PL 210 546 B1

121

Val

Leu

His 115

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn 120

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys 125

Cys

Lys Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

130

135

140

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

145

150

155

160

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

165

170

175

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

180

185

190

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

195

200

205

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

210

215

220

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

225

230

235

240

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

245 250 <210> 116 <211> 252 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Ciała	peptydowe inhibitujące TALL-1
<400> 116
Met Ser Ala 1	Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Cys 5 10 15
Thr Ser Ser	Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30
Pro Cys Pro 35	Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 40 45
Pro Pro Lys 50	Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 55 60
Thr Cys Val 65	Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 70 75 80
Asn Trp Tyr	Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 85 90 95
Arg Glu Glu	Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 100 105 110

122

PL 210 546 B1

Val

Leu

His 115

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn 120

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys 125

Cys

Lys

Val

Ser

Asn 130

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala 135

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr 140

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys 145

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu 150

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr 155

Leu

Pro

Ser

Arg 160

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys 165

Asn

Gin

Val

Ser

Leu 170

Thr

Cys

Leu

Val

Lys 175

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser 180

Asp

Ile

Ala

Val

Glu 185

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly 190

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn 195

Tyr

Lys

Thr

Pro 200

Pro

Val

Leu

Asp

Ser 205

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe 210

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu 215

Thr

Val

Asp

Lys

Ser 220

Arg

Trp

Gin

Gly 225

Asn

Val

Phe

Ser

Cys 230

Ser

Val

Met

His

Glu 235

Ala

Leu

His

Asn

His 240

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

245 250 <210> 117 <211> 252 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Ciała	peptydowe inhibitujące TALL-1
<400> 117
Met Ser Asp 1	Asp Cys Met Tyr Asp Gin Leu Thr Arg Met Phe Ile Cys 5 10 15
Ser Asn Leu	Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30
Pro Cys Pro 35	Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 40 45
Pro Pro Lys 50	Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 55 60
Thr Cys Val 65	Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 70 75 80
Asn Trp Tyr	Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 85 90 95
Arg Glu Glu	Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 100 105 110

PL 210 546 B1

123

Val

Leu

His 115

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn 120

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys 125

Cys

Lys

Val

Ser

Asn 130

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala 135

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr 140

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys 145

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu 150

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr 155

Leu

Pro

Ser

Arg 160

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys 165

Asn

Gin

Val

Ser

Leu 170

Thr

Cys

Leu

Val

Lys 175

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser 180

Asp

Ile

Ala

Val

Glu 185

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly 190

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn 195

Tyr

Lys

Thr

Pro 200

Pro

Val

Leu

Asp

Ser 205

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe 210

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu 215

Thr

Val

Asp

Lys

Ser 220

Arg

Trp

Gin

Gly 225

Asn

Val

Phe

Ser

Cys 230

Ser

Val

Met

His

Glu 235

Ala

Leu

His

Asn

His 240

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

245 250 <210> 118 <211> 252 <212> PRT

<213>	Sekwencji	i sztuczna
<220> <223> Ciała peptydowe inhibitujące TALL-1 <400> 118
Met Asp 1	Leu Asn	Cys Lys Tyr Asp Glu Leu Thr Tyr Lys Glu Trp Cys 5 10 15
Gin Phe	Asn Gly 20	Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 25 30
Pro Cys	Pro Ala 35	Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 40 45
Pro Pro 50	Lys Pro	Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 55 60
Thr Cys 65	Val Val	Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 70 75 80
Asn Trp	Tyr Val	Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 85 90 95
Arg Glu	Glu Gin 100	Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 105 110

124

PL 210 546 B1

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

115

120

125

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

130

135

140

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

145

150

155

160

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

165

170

175

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

180

185

190

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

195

200

205

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

210

215

220

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

225

230

235

240

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

245

250

<210>	119
<211>	252
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Ciała peptydowe inhibitujące	TALL-1
<400>	119
Met Phe His Asp Cys Lys Tyr Asp Leu	Leu Thr Arg Gin Met Val Cys

10 15

His Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 20 25 30

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 35 40 45

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 50 55 60

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

70 75 80

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

90 95

Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 100 105 110

PL 210 546 B1

125

Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 115 120 125

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 130 135 140

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

145 150 155 160

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

165 170 175

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 180 185 190

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 195 200 205

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 210 215 220

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 225 230 235 240

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 250 <210> 120 <211> 252 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Ciała peptydowe inhibitujące TALL-1

<400> 120

Met 1

Arg

Asn

His

Cys 5

Phe

Trp

Asp

His

Leu 10

Leu

Lys

Gin

Asp

Ile 15

Cys

Pro

Ser

Pro

Gly 20

Gly

Val 25

Asp

Lys

Thr

His

Thr 30

Cys

Pro

Cys

Pro 35

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu 40

Gly

Pro

Ser

Val 45

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro 50

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr 55

Leu

Met

Ile

Ser

Arg 60

Thr

Pro

Glu

Val

Thr 65

Cys

Val

Asp 70

Val

Ser

His

Glu

Asp 75

Pro

Glu

Val

Lys

Phe 80

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp 85

Gly

Val

Glu

Val

His 90

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys 95

Pro

Arg

Glu

Gin 100

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr 105

Arg

Val

Ser

Val 110

Leu

Thr

126

PL 210 546 B1

Val

Leu

His 115

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn 120

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys 125

Cys

Lys

Val

Ser

Asn 130

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala 135

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr 140

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys 145

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu 150

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr 155

Leu

Pro

Ser

Arg 160

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys 165

Asn

Gin

Val

Ser

Leu 170

Thr

Cys

Leu

Val

Lys 175

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser 180

Asp

Ile

Ala

Val

Glu 185

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly 190

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn 195

Tyr

Lys

Thr

Pro 200

Pro

Val

Leu

Asp

Ser 205

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe 210

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu 215

Thr

Val

Asp

Lys

Ser 220

Arg

Trp

Gin

Gly 225

Asn

Val

Phe

Ser

Cys 230

Ser

Val

Met

His

Glu 235

Ala

Leu

His

Asn

His 240

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

245 250 <210> 121 <211> 252 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> (	Diała peptydowe inhibitujące	TALL-1
<400> :	121
Met Ala 1	Asn Gin Cys Trp Trp Asp Ser 5	Leu Thr Lys Lys Asn Val Cys 10 15
Glu Phe	Phe Gly Gly Gly Gly Gly Val 20 25	Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 30
Pro Cys	Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 35 40	Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 45
Pro Pro 50	Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 55	Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 60
Thr Cys 65	Val Val Val Asp Val Ser His 70	Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 75 80
Asn Trp	Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 85	His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 90 95
Arg Glu	Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 100 105	Arg Val Val Ser Val Leu Thr 110

PL 210 546 B1

127

Val

Leu

His 115

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn 120

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys 125

Cys

Lys

Val

Ser

Asn 130

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala 135

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr 140

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys 145

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu 150

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr 155

Leu

Pro

Ser

Arg 160

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys 165

Asn

Gin

Val

Ser

Leu 170

Thr

Cys

Leu

Val

Lys 175

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser 180

Asp

Ile

Ala

Val

Glu 185

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly 190

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn 195

Tyr

Lys

Thr

Pro 200

Pro

Val

Leu

Asp

Ser 205

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe 210

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu 215

Thr

Val

Asp

Lys

Ser 220

Arg

Trp

Gin

Gly 225

Asn

Val

Phe

Ser

Cys 230

Ser

Val

Met

His

Glu 235

Ala

Leu

His

Asn

His 240

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

245 250 <210> 122 <211> 252 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> (	Oiała peptydowe inhibitujące	TALL-1
<4oo> :	122
Met Phe 1	His Asp Cys Lys Trp Asp Leu 5	Leu Thr Lys Gin Trp Val Cys 10 15
His Gly	Leu Gly Gly Gly Gly Gly Val 20 25	Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 30
Pro Cys	Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 35 40	Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 45
Pro Pro 50	Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 55	Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 60
Thr Cys 65	Val Val Val Asp Val Ser His 70	Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 75 80
Asn Trp	Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 85	His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 90 95
Arg Glu	Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 100 105	Arg Val Val Ser Val Leu Thr 110

128

PL 210 546 B1

Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 115 120 125

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 130 135 140

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

145 150 155 160

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

165 170 175

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 180 185 190

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 195 200 205

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 210 215 220

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 225 230 235 240

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 250 <210> 123 <211> 293 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Ciała peptydowe inhibitujące TALL-1 <400> 123

Met Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp 1 5

Asp Pro Leu Gly Ser Gly Ser Ala 20

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr 35 40

Asp Leu Leu Ile Lys Gin Trp Val 50 55

Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys 65 70

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 85

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 100

Leu Leu Ile Lys Gin Trp Val Cys 10 15

Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala 25 30

His Met Leu Pro Gly Cys Lys Trp 45

Cys Asp Pro Leu Gly Gly Gly Gly 60

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 75 80

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 90 95

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 105 110

PL 210 546 B1

129

Ser

His

Glu 115

Asp

Pro

Glu

Val

Lys 120

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 125

Asp

Gly

Val

Glu

Val 130

His

Asn

Ala

Lys

Thr 135

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu 140

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr 145

Tyr

Arg

Val

Ser 150

Val

Leu

Thr

Val

Leu 155

His

Gin

Asp

Trp

Leu 160

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr 165

Lys

Cys

Lys

Val

Ser 170

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro 175

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys 180

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala 185

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 190

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr 195

Thr

Leu

Pro

Ser 200

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr 205

Lys

Asn

Gin

Val

Ser 210

Leu

Thr

Cys

Leu

Val 215

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro 220

Ser

Asp

Ile

Ala

Val 225

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn 230

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn 235

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr 240

Pro

Val

Leu

Asp 245

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe 250

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys 255

Leu

Thr

Val

Asp

Lys 260

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin 265

Gly

Asn

Val

Phe

Ser 270

Cys

Ser

Val

Met

His 275

Glu

Ala

Leu

His

Asn 280

His

Tyr

Thr

Gin

Lys 285

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

290

<210>	124
<211>	293
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Ciała peptydowe inhibitujące	TALL-1
<400>	124
Met Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu	Leu Thr Lys Gin Trp Val Cys

10 15

His Gly Leu Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala 20 25 30

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Met Phe His Asp Cys Lys Trp 35 40 45

Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Val Cys His Gly Leu Gly Gly Gly Gly 50 55 60

130

PL 210 546 B1

131

<223>	X w czym Χ12 ,	(Poz . jedna Χ13 i	1, 2, 3) oznaczają reszty aminokwasowe lub ich brak (przy z grup XI, X2 i X3 korzystnie oznacza C gdy jedna z reszt Χ14 oznacza C);
<220>
<221>	inne	cechy
<222>	(7) .	. (7)
<223>	X w	(Poz .	7) oznacza resztę aminokwasową (korzystnie L);
<220>
<221>	inne	cechy
<222>	(9) .	• (9)
<223>	X w	(Poz.	9) oznacza T lub I (korzystnie T);
<220>
<221>	inne	cechy
<222>	(12)	(12)
<223>	X w	(Poz .	12) oznacza C, obojętną resztę hydrofobowa lub resztę
	zasadową (korzystnie W, C, or R);
<220>
<221>	inne	cechy
<222>	(13)	.·(13)
<223>	X w	(Poz.	13) is C, oznacza C, obojętną resztę hydrofobowa lub jej
	brak	(korzystnie V) ;
<220>
<221>	inne	cechy
<222>	(14)	- (14)
<223>	X w	(Poz .	14) oznacza dowolną resztę aminokwasową lub jej brak.
<400>	125

Xaa Xaa Xaa Lys Trp Asp Xaa Leu Xaa Lys Gin Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 126 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 126

Tyr Lys Gly Arg Gin Met Trp Asp Ile Leu Thr Arg Ser Trp Val Val 15 10 15

Ser Leu <210> 127 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

132

PL 210 546 B1 <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 127

Gin Asp Val Gly Leu Trp Trp Asp Ile Leu Thr Arg Ala Trp Met Pro 15 10 15

Asn Ile <210> 128 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 128

Gin Asn Ala Gin Arg Val Trp Asp Leu Leu Ile Arg Thr Trp Val Tyr 15 10 15

Pro Gin <210> 129 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 129

Gly Trp Asn Glu Ala Trp Trp Asp Glu Leu Thr Lys Ile Trp Val Leu 15 10 15

Glu Gin <210> 130 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 130

Arg Ile Thr Cys Asp Thr Trp Asp Ser Leu Ile Lys Lys Cys Val Pro 15 10 15

Gin Ser

PL 210 546 B1

133 <210> 131 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 131

Gly Ala 1 Gin Ser	Ile Met Gin Phe 5	Trp Asp	Ser	Leu Thr Lys 10	Thr	Trp	Leu 15	Arg
<210>	132
<211>	18
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Korzystne domeny	modulujące '	TALL-1
<400>	132
Trp Leu	His Ser Gly Trp	Trp Asp	Pro	Leu Thr Lys	His	Trp	Leu	Gin
1	5			10			15
Lys Val

<210>	133
<211>	18
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Korzystne domeny modulujące	TALL-1
<400>	133
Ser Glu Trp Phe Phe Trp Phe Asp Pro	Leu Thr Arg Ala	Gin Leu Lys
1	5	10	15
Phe Arg

<210>	134
<211>	18
<212>	PRT
<213>	Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Korzystne domeny modulujące	TALL-	•1
<400>	134
Gly Val	. Trp Phe Trp Trp Phe Asp Pro	Leu	Thr Lys Gin	Trp Thr Gin
1	5	10		15

134

PL 210 546 B1

Ala Gly <210> 135 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 135

Met Gin Cys Lys Gly Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Lys Trp Cys Val Thr 15 10 15

Asn Gly <210> 136 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 136

Leu Trp Ser Lys Glu Val Trp Asp Ile Leu Thr Lys Ser Trp Val Ser 15 10 15

Gin Ala <210> 137 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 137

Lys Ala Ala Gly Trp Trp Phe Asp Trp Leu Thr Lys Val Trp Val Pro 15 10 15

Ala Pro <210> 138 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

PL 210 546 B1

135 <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 138

Ala Tyr Gin Thr Trp Phe Trp Asp Ser Leu Thr Arg Leu Trp Leu Ser 15 10 15

Thr Thr <210> 139 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 139

Ser Gly Gin His Phe Trp Trp Asp Leu Leu Thr Arg Ser Trp Thr Pro 15 10 15

Ser Thr <210> 140 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 140

Leu Gly Val Gly Gin Lys Trp Asp Pro Leu Thr Lys Gin Trp Val Ser 15 10 15

Arg Gly <210> 141 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 141

Val Gly Lys Met Cys Gin Trp Asp Pro Leu Ile Lys Arg Thr Val Cys 15 10 15

Val Gly

136

PL 210 546 B1 <210> 142 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 142

Cys Arg Gin Gly Ala Lys Phe Asp Leu Leu Thr Lys Gin Cys Leu Leu 15 10 15

Gly Arg <210> 143 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 143

Gly Gin Ala Ile Arg His Trp Asp Val Leu Thr Lys Gin Trp Val Asp 15 10 15

Ser Gin <210> 144 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 144

Arg Gly Pro Cys Gly Ser Trp Asp Leu Leu Thr Lys His Cys Leu Asp 15 10 15

Ser Gin <210> 145 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 145

Trp Gin Trp Lys Gin Gin Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Met Val Trp 15 10 15

PL 210 546 B1

137

Val Gly <210> 146 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 146

Pro Ile Thr Ile Cys Arg Lys Asp Leu Leu Thr Lys Gin Val Val Cys 15 10 15

Leu Asp <210> 147 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 147

Lys Thr Cys Asn Gly Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Cys Leu Gin 15 10 15

Gin Ala <210> 148 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 148

Lys Cys Leu Lys Gly Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Cys Val Thr 15 10 15

Glu Val <210> 149 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

138

PL 210 546 B1 <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 149

Arg Cys Trp Asn Gly Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Cys Ile His 15 10 15

Pro Trp <210> 150 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 150

Asn Arg Asp Met Arg Lys Trp Asp Pro Leu Ile Lys Gin Trp Ile Val 15 10 15

Arg Pro <210> 151 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 151

Gin Ala Ala Ala Ala Thr Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Leu Val 15 10 15

Pro Pro <210> 152 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 152

Pro Glu Gly Gly Pro Lys Trp Asp Pro Leu Thr Lys Gin Phe Leu Pro 15 10 15

Pro Val

PL 210 546 B1

139 <210> 153 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 153

Gin Thr Pro Gin Lys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Phe Thr 15 10 15

Arg Asn <210> 154 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 154

Ile Gly Ser Pro Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Met Ile Cys 15 10 15

Gin Thr <210> 155 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 155

Cys Thr Ala Ala Gly Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Cys Ile Gin 15 10 15

Glu Lys <210> 156 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 156

Val Ser Gin Cys Met Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Cys Leu Gin 15 10 15

140

PL 210 546 B1

Gly Trp <210> 157 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 157

Val Trp Gly Thr Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Tyr Leu Pro 15 10 15

Pro Gin <210> 158 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 158

Gly Trp Trp Glu Met Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Tyr Arg 15 10 15

Pro Gin <210> 159 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 159

Thr Ala Gin Val Ser Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Leu Pro 15 10 15

Leu Ala <210> 160 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1

PL 210 546 B1

141 <400> 160

Gin Leu Trp Gly Thr Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Tyr Ile Gin 15 10 15

Ile Met <210> 161 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 161

Trp Ala Thr Ser Gin Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Val Gin 15 10 15

Asn Met <210> 162 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 162

Gin Arg Gin Cys Ala Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Cys Val Leu 15 10 15

Phe Tyr <210> 163 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 163

Lys Thr Thr Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Arg Ile Cys 15 10 15

Gin Val <210> 164 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

142

PL 210 546 B1 <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 164

Leu Leu Cys Gin Gly Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Cys Leu Lys 15 10 15

Leu Arg <210> 165 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 165

Leu Met Trp Phe Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Leu Val Pro 15 10 15

Thr Phe <210> 166 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 166

Gin Thr Trp Ala Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Ile Gly 15 10 15

Pro Met <210> 167 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 167

Asn Lys Glu Leu Leu Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Cys Arg Gly 15 10 15

Arg Ser

PL 210 546 B1

143 <210> 168 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 168

Gly Gin Lys Asp Leu Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Tyr Val Arg 15 10 15

Gin Ser <210> 169 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 169

Pro Lys Pro Cys Gin Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Cys Leu Gly 15 10 15

Ser Val <210> 170 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 170

Gly Gin Ile Gly Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Ile Gin 15 10 15

Thr Arg <210> 171 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 171

Val Trp Leu Asp Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Ile His 15 10 15

Pro Gin

144

PL 210 546 B1 <210> 172 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 172

Gin Glu Trp Glu Tyr Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Gly Trp 15 10 15

Leu Arg <210> 173 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 173

His Trp Asp Ser Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Val Val 15 10 15

Gin Ala <210> 174 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 174

Thr Arg Pro Leu Gin Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Leu Arg 15 10 15

Val Gly <210> 175 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 175

Ser Asp Gin Trp Gin Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Phe Trp 15 10 15

PL 210 546 B1

145

Asp Val <210> 176 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 176

Gin Gin Thr Phe Met Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Ile Arg 15 10 15

Arg His <210> 177 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 177

Gin Gly Glu Cys Arg Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Cys Phe Pro ¹ 5 10 15

Gly Gin <210> 178 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 178

Gly Gin Met Gly Trp Arg Trp Asp Pro Leu Ile Lys Met Cys Leu Gly ¹ 5 10 15

Pro Ser <210> 179 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1

146

PL 210 546 B1 <400> 179

Gin Leu Asp Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Lys Val Cys 15 10 15

Ile Pro <210> 180 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 180

His Gly Tyr Trp Gin Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Trp Val Ser 15 10 15

Ser Glu <210> 181 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 181

His Gin Gly Gin Cys Gly Trp Asp Leu Leu Thr Arg Ile Tyr Leu Pro 15 10 15

Cys His <210> 182 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 182

Leu His Lys Ala Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Cys Trp Pro 15 10 15

Met Gin <210> 183 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

PL 210 546 B1

147 <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 183

Gly Pro Pro Gly Ser Val Trp Asp Leu Leu Thr Lys Ile Trp Ile Gin 15 10 15

Thr Gly <210> 184 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 184

Ile Thr Gin Asp Trp Arg Phe Asp Thr Leu Thr Arg Leu Trp Leu Pro 15 10 15

Leu Arg <210> 185 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 185

Gin Gly Gly Phe Ala Ala Trp Asp Val Leu Thr Lys Met Trp Ile Thr 15 10 15

Val Pro <210> 186 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 186

Gly His Gly Thr Pro Trp Trp Asp Ala Leu Thr Arg Ile Trp Ile Leu 15 10 15

Gly Val

148

PL 210 546 B1 <210> 187 <211> 18 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 187

Val Trp Pro Trp Gin Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gin Phe Val Phe 15 10 15

Gin Asp <210> 188 <211> 19 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystne domeny modulujące TALL-1 <400> 188

Trp Gin Gin Trp Ser Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Arg Gin Tyr Ile 15 10 15

Ser Ser Ser <210> 189 <211> 882 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

<220>

<223> TALL-1 12-3 dimer tandemowy <400> 189 atgcttccag gctgcaagtg ggatcttctt attaagcaat gggtatgcga tccacttgga 60 tccggttctg ctactggtgg ttccggctcc accgcaagct ctggttcagg cagtgcgact 120 catatgctgc cgggttgtaa atgggacctg ctgatcaaac agtgggtttg tgacccgctg 180 ggtggaggcg gtggggtcga caaaactcac acatgtccac cttgtccagc tccggaactc 240 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccot catgatctcc 300 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagacco tgaggtcaag 360 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 420 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 480 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 540 accatctoca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 600

PL 210 546 B1

149

cgggatgagc	tgaccaagaa	ccaggtcagc	ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctatccc	660
agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	gggcagccgg	agaacaacta	caagaccacg	720
cctcccgtgc	tggactccga	cggctccttc	ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	780
agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	840
cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	ccgggtaaat	aa		882

<210> 190 <211> 23 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystny linker <400> 190

Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly 15 10 15

Ser Gly Ser Ala Thr Gly Met 20

<210> <211> <212> <213>	191 23 PRT Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Korzystny linker
<400>	191
Gly Ser	Gly Ser Ala Thr Gly
1	5
Ser Gly	Ser Ala Thr Gly Ser
	20

<210> 192 <211> 46 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystny linker <400> 192

Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly 15 10 15

150

PL 210 546 B1

Ser

Gly

Ser

Ala 20

Thr

His

Met

Gly

Ser 25

Gly

Ser

Ala

Thr

Gly Gly Ser 30

Gly

Ser

Thr

Ala

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

His

Met

35

40

45

<210> 193 <211> 23 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystny linker <220>

<221> inne cechy <222> (22)..(23) <223> X w (Ροζ. 22) oznacza niezależnie resztę zasadową lub hydrofobową. X w (Poz. 23) oznacza niezależnie resztę hydrofobową.

<400> 193

Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly ¹ 5 10 15

Ser Gly Ser Ala Thr Xaa Xaa 20 <210>

<211>

<212>

194

PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Korzystny linker <220>

<221> inne cechy <222> (22, 23, 45 i) . . (46) <223> X w (Poz. 22) i w (Poz. 45) oznaczają niezależnie resztę zasadową lub hydrofobową, a X w (Poz. 23) i (Poz. 46) oznaczają niezależnie resztę hydrofobową

<400> :	194
Gly	Ser	Gly	Ser	Ala	Thr	Gly
1				5
Ser	Gly	Ser	Ala	Thr	Xaa	Xaa
			20
Gly	Ser	Thr	Ala	Ser	Ser	Gly
		35

PL 210 546 B1

151 <210> 195 <211> 38 <212> PRT <213> ludzka <400> 195

Met 1 Thr Val

Arg Arg Pro Cys

Gly Pro

Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala

Pro Val

Pro Cys

Val 20 Arg

5 Pro Leu

Thr Glu Leu

10

Leu

Val

Arg 30

15 Lys

Cys

Tyr 25

Asp Leu

Asp

Cys 35

<210>

196

<211>

41

<212>

PRT

<213>

ludzka

<400>

196

Thr

Ile

Cys

Asn

His

Gin Ser

Gin

Arg

Thr Cys

Ala

Phe

Cys

Arg

1

5

10

15

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys Glu

Gin

Gly

Lys Phe

Tyr

Asp

His

Leu

20

25

30

Arg

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys Ala

Ser

Ile

35

40

<210>

197

<211>

42

<212>

PRT

<213>

ludzka

<400>

197

Phe

Val

Ser

Pro

Ser

Gin Glu

Ile

Arg

Gly Arg

Phe

Arg

Met

Leu

1

5

10

15

Gin

Met

. Ala

Gly

Gin

Cys Ser

Gin

Asn

Glu Tyr

Phe

Asp

Ser

Leu

20

25

30

His

Ala

. Cys

Ile

Pro

Cys Gin

Leu

Arg

Cys

35

40

Zastrzeżenia patentowe

1. Cząsteczka obejmująca sekwencję aminokwasową o wzorze I(f):

Claims

1. Cząsteczka obejmująca sekwencję aminokwasową o wzorze I(f): f¹f²f³Kf⁵Df⁷Lf⁹f¹⁰Qf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 109), gdzie:

f¹⁰ oznacza K, R lub H;

152

PL 210 546 B1 f¹² oznacza C, obojętną resztę hydrofobową lub resztę zasadową, korzystnie W, C lub R;

z tym jednak warunkiem, że tylko jeden z f¹, f² i f³ może oznaczać C oraz że tylko jeden z f¹², f¹³ i f¹⁴ może oznaczać C.

2. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, ż e f⁷ oznacza L.

3. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, ż e f⁹ oznacza T.

4. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, ż e f¹⁰ oznacza K.

5. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, ż e f¹² oznacza C oraz jeden z f¹, f² i f³ oznacza C.

6. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, ż e f¹³ oznacza V.

7. Czą steczka wedł ug zastrz. 1, znamienna tym, ż e obejmuje sekwencję aminokwasową o wzorze I(f'):

f¹f²f³KWDf⁷Lf⁹KQf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 125).

8. Czą steczka wedł ug zastrz. 7, znamienna tym, ż e obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 32, 33, 58, 60, 63, 66, 67, 69, 114, 115, 122, 123, 124, 147-150, 152-177, 179, 180 oraz 187.

9. Cząsteczka według zastrz. 8, znamienna tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową o wzorze:

LPGCKWDLLIKQWVCDPL (SEQ ID NO: 33).

10. Cząsteczka o wzorze:

(X¹)a - V¹ - (X²)b oraz jej multimery, gdzie:

V¹ oznacza domenę Fc;

1 2 1 1 1 1

X¹ i X² oznaczają, każdy niezależnie, resztę wybraną z grupy obejmującej -(L¹)c-P¹, -(L¹)c-P¹-(L²)d-P², -(L¹)c-P¹-(L²)d-P²-(L³)c-P³, -(L¹)_c-P¹-(L²)d-P²-(L³)c-P³-(L⁴)_f-P⁴, gdzie jeden lub więcej niż jeden spośród P¹, P², P³ i P⁴, każdy niezależnie, zawiera sekwencję: f¹f²f³Kf⁵Df⁷Lf⁹f¹⁰Qf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 109określoną jak w zastrz. 1;

L¹, L², L³ i L⁴ - każdy niezależnie, oznaczają linkery; zaś a, b, c, d, e oraz f - każ dy niezależ nie, oznaczają 0 lub 1, z tym warunkiem, ż e co najmniej jeden spośród indeksów a oraz b oznacza 1.

11. Cząsteczka według zastrz. 10, znamienna tym, że jest określona wzorem:

P¹-(L¹)c-P²-(L²)d-V¹.

12. Cząsteczka według zastrz. 10, znamienna tym, że jest określona wzorem:

V¹-(L¹)c-P¹-(L²)d-P².

13. Cząsteczka według zastrz. 10, znamienna tym, że V¹ oznacza domenę IgG Fc.

14. Cząsteczka według zastrz. 10, znamienna tym, że V¹ oznacza domenę IgG1 Fc.

15. Cząsteczka według zastrz. 10, znamienna tym, że V¹ obejmuje sekwencję SEQ ID NO: 2.

16. Cząsteczka według zastrz. 10, znamienna tym, że: f⁵ oznacza W;

f⁷ oznacza L; f¹⁰ oznacza K; zaś f¹³ oznacza V.