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MX2007000216A - Peptidos terapeuticos. - Google Patents

Peptidos terapeuticos.

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MX2007000216A
MX2007000216A MX2007000216A MX2007000216A MX2007000216A MX 2007000216 A MX2007000216 A MX 2007000216A MX 2007000216 A MX2007000216 A MX 2007000216A MX 2007000216 A MX2007000216 A MX 2007000216A MX 2007000216 A MX2007000216 A MX 2007000216A
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MX
Mexico
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compound
peptide
protein
peptides
myostatin
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Application number
MX2007000216A
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Inventor
Olaf B Kinstler
Kenneth William Walker
Karen Stiney
Original Assignee
Amgen Inc
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Abstract

La invencion se refiere a compuestos que exhiben bioeficacia mejorada en administracion de multiples dosis. De manera mas especifica, la invencion se refiere a polipeptidos o peptidos modificados para incluir una region Fc de anticuerpo y uno o mas polimeros solubles en agua.

Description

PEPTIDOS TERAPÉUTICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN En general, la invención se refiere a compuestos que exhiben bioeficacia mejorada en la administración de múltiples dosis. De manera más específica, la invención se refiere a polipéptidos o péptidos modificados para incluir una región Fe de anticuerpo y uno o más polímeros solubles en agua.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas recombinantes son una clase emergente de agentes terapéuticos. Estos agentes terapéuticos recombinantes han creado avances en la formulación y modificación química de proteínas. Se han identificado modificaciones que pueden proteger a las proteínas terapéuticas, principalmente al bloquear su exposición a enzimas proteolíticas . Las modificaciones de proteínas también pueden incrementar la estabilidad, tiempo en circulación y actividad biológica de las proteínas terapéuticas . Un artículo de revisión que describe la modificación de proteínas y proteínas de fusión es Francis (1992), Focus on Growth Factors 3:4-10 (Mediscript, Londres) , que se incorpora de este modo como referencia. Una modificación útil es la combinación de un REF.: 178816 polipéptido con un dominio "Fe" de un anticuerpo. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como "Fab", que se une al antígeno, y un dominio constante conocido como "Fe", que se enlaza a estas funciones efectoras como activación de complemento y ataque por células fagocíticas . Un Fe tiene una vida media prolongada en suero, en tanto que un Fab es de vida corta. Capón et al. (1989), Nature 337: 525-31. Cuando se construyen conjuntamente con una proteína terapéutica, un dominio Fe puede proporcionar una vida media más prolongada o incorporar funciones tal como unión a receptor Fe, unión a proteína A, fijación de complemento y quizá aún transferencia placentaria. Id. La Tabla 1 resume el uso de las fusiones de Fe conocidas en la técnica.
Tabla 1. - Fusión de Fe con proteínas terapéuticas Forma de Fe Compañero Implicaciones Referencia de fusión terapéuticas igGl N-término Enfermedad de Pat. U.S. No. de CD30-L Hodgkin; linfoma 5,480,981 anaplástico; leucemia de células T Fc?2 e murino IL-10 Anti-inflamatorio; Zhenq et al. (1995), rechazo de trasplante J^ Immunol . 154:5590-600 Forma de Fe Compañero Implicaciones Referencia de fusión terapéuticas IgGl Receptor Choque séptico Fisher et al . de TNF (1996), N. Ensl. J. Med. 334:1697-1702; Van Zee, K. et al. (1996), J. Immunol. 156:2221-30 IgG, IgA, IgM, Receptor Inflamación, Pat. U.S. No. o IgE de TNF trastornos 5,808,029, emitida (excluyendo el autoinmunitarios el 15 de septiembre primer dominio) de 1998 IgGl Receptor SIDA Capón et al. (1989), de CD4 Nature 337: 525-31 IgGl , IgG3 N-término Anticáncer, antiviral Harvill et al . de IL-2 (1995), Immunotech. 1: 95-105 IgGl C- érmino Osteoartritis; WO 97/23614, de OPG densidad ósea publicada el 3 de julio de 1997 IgGl N-término Anti-obesidad PCT/US 97/23183, de leptina presentada el 11 de diciembre de 1997 Ig humana Cl CTLA-4 Trastornos Linsley (1991) , J. inmunitarios Exp. Med. 174: 561-9 Se han estudiado también péptidos y proteínas de fusión de polietilenglicol ("PEG") para el uso en agentes farmacéuticos, en implantes artificiales, y en otras aplicaciones donde es de importancia la biocompatibilidad. Se han propuestos varios derivados de PEG que tienen una porción activa para permitir que el PEG se una a productos farmacéuticos e implantes y a moléculas y superficies en general. Por ejemplo, se han propuesto derivados de PEG para acoplar PEG a superficies para controlar humectación, acumulación estática, y unión de otros tipos de moléculas a la superficie, incluyendo proteínas o residuos de proteína. En otros estudios, se ha mostrado que el acoplamiento de PEG ("PEGilación") es deseable en la superación de obstáculos encontrados en el uso clínico de moléculas biológicamente activas. La publicación PCT publicada número WO 92/16221 señala, por ejemplo, que se ha encontrado que muchas proteínas potencialmente terapéuticas tienen una vida media corta en suero sanguíneo. La PEGilación disminuye la velocidad de depuración de la corriente sanguínea al incrementar el peso molecular aparente de la molécula. Hasta un cierto tamaño, la velocidad de filtración glomerular de las proteínas es inversamente proporcional al tamaño de la proteína. Por lo tanto, la capacidad de PEGilación para disminuir la depuración, en general no es una función de cuántos grupos PEG se unan a la proteína, sino del peso molecular total de la proteína alterada. La depuración disminuida puede conducir a eficacia incrementada con respecto al material no PEGilado. Ver, por ejemplo, Conforti et al., Pharm. Research Commun. Vol. 19, pág. 287 (1987) y Katre et . , Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. vol. 84, pág. 1487 (1987). Además, la PEGilación puede disminuir la agregación de proteínas, (Suzuki et al., Biochem. Biophys. Acta vol. 788, pág. 248 (1984)), alterar la inmunogenicidad de las proteínas (Abuchowski et al., J. Biol. Chem. Vol. 252 pág. 3582 (1977)), e incrementar la solubilidad de las proteínas como se describe, por ejemplo, en la publicación PCT número WO 92/16221. La PEGilación de proteínas ilustra algunos de los problemas que se han encontrado en la unión de PEG a las superficies y a las moléculas. La vasta mayoría de los reactivos de PEGilación reacciona con grupos amino primarios libres del polipéptido. La mayoría de estas aminas libres son el grupo amino epsilon de los residuos de aminoácido de lisina. Las proteínas típicas poseen un número grande de lisinas. En consecuencia, la unión aleatoria de múltiples moléculas de PEG frecuentemente conduce a pérdida de actividad de la proteína. Además, si la proteína PEGilada se propone para uso terapéutico, la mezcla de múltiples especies que resulta del uso de la PEGilación no específica conduce a dificultades en la preparación de un producto con propiedades reproducibles y caracterizables. Esta PEGilación no específica hace difícil evaluar los productos terapéuticos y establecer la eficacia e información de dosificación. La PEGilación selectiva al sitio de estas proteínas, sin embargo, conduce a materiales reproduciblemente modificados que ganan los atributos deseables de la PEGilación sin la pérdida de actividad. Se ha usado una variedad de medios para unir las moléculas de polietilenglicol a la proteína. Los grupos amino, tal como aquéllos en los residuos de lisina o en el N-término, son convenientes para esta unión. Por ejemplo, Royer (patente de los Estados Unidos número 4,002,531, incorporada en la presente como referencia en su totalidad) declara que la alquilación reductiva se usó para la unión de moléculas de polietilenglicol a una enzima. La EP 0,539,167 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad), publicada el 28 de abril de 1993, Wright, "PEG Imidates and Protein Derivates Thereof" declara que los péptidos y compuestos orgánicos con grupos amino libres se modifican por un derivado de PEG o polímeros orgánicos solubles en agua, relacionados. La patente de los Estados Unidos número 4,904,584 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) , Shaw, emitida el 27 de febrero de 1990, se refiere a la modificación de residuos de lisina en proteínas para la unión de moléculas de polietilenglicol mediante grupos reactivos de amina. Se ha descrito anteriormente un número creciente de proteínas terapéuticas modificadas de la manera descrita anteriormente para incluir PEG. Ver también, por ejemplo, publicaciones de solicitud de patente europea EP 0,401,384; EP 0,473,268; EP 0,335,423; EP 0,442,724; EP 0,154,316, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Otros métodos para unir un polímero a una proteína comprenden el uso de una porción para actuar como un grupo de enlace. Sin embargo, estas porciones pueden ser antigénicas. Está disponible un método de cloruro de tresilo que no comprende grupo de enlace, pero este método puede ser difícil de usar para producir productos terapéuticos puesto que el uso de cloruro de tresilo puede producir productos secundarios tóxicos. Ver Francis et al., in: Stability of protein pharmaceuticals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Eds. Ahern., T. y Manning, M. C.) Plenum, N. Y., 1991) y Delgado et al., "Copuling of PEG to Protein By Activation UIT Tresyl Chloride, Applications In Immunoaffinity Cell Preparation", In: Fisher et al., eds., Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y.N.Y., 1989 págs. 211-213, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En general, la interacción de un ligando de proteína con su receptor frecuentemente toma lugar en una interfaz relativamente grande. Sin embargo, como se demuestra en el caso de la hormona de crecimiento humana unida a su receptor, sólo unos pocos residuos claves en la interfaz contribuyen realmente a la mayoría de la energía de unión. Claxon, T. et al., Science 267: 383-386 (1995). Esta observación y el hecho que el volumen de ligando de proteína restante sirve sólo para exhibir los epítopos de unión en la topología correcta, es posible encontrar ligandos activos de tamaño mucho más pequeño. De esta manera, las moléculas de una longitud sólo "peptídica" (de 2 a 40 aminoácidos) pueden unirse a la proteína receptora de un ligando de proteína, grande, determinado. Estos péptidos pueden imitar la bioactividad de ligando de proteína grande ("agonista de péptido") o, a través de la unión competitiva, inhibir la bioactividad del ligando de proteína grande ("antagonistas de péptido"). Han emergido bibliotecas de péptidos de exhibición en fago como un método útil en la identificación de estos agonistas y antagonistas de péptidos. Ver, por ejemplo, Scout et al. (1990), Science 249: 386; Devlin et al. (1990), Science 249: 404; patente de los Estados Unidos número 5,223,409, emitida el 29 de junio de 1993; patente de los Estados Unidos número 5,733,731, emitida el 31 de marzo de 1998; patente de los Estados Unidos número 5,498,530, emitida el 12 de marzo de 1996; patente de los Estados Unidos número 5,432,018, emitida el 11 de julio de 1995; patente de los Estados Unidos número 5,338,665, emitida el 16 de agosto de 1994; patente de los Estados Unidos número 5,922,545, emitida el 13 de julio de 1990; WO 96/40987, publicada el 19 de diciembre de 1996; y WO 98/15833, publicada el 16 de abril de 1998, cada una de las cuales se incorpora como referencia. En estas bibliotecas, las secuencias peptídicas aleatorias se exhiben por fusión con proteínas de cubierta de fagos filamentosos. Típicamente, los péptidos exhibidos se eluyen por afinidad contra un dominio extracelular inmovilizado por anticuerpo de un receptor. Los fagos retenidos se pueden enriquecer por rondas sucesivas de purificación por afinidad y repropagación, y los péptidos de mejor unión se secuencian para identificar residuos clave dentro de una o más familias estructuralmente relacionadas de péptidos. Ver, por ejemplo, Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9, en la cual se identificaron dos familias distintas. Las secuencias peptídicas también pueden sugerir qué residuos se pueden reemplazar de forma segura por exploración de alanina o por mutagénesis al nivel de ADN. Se pueden crear bibliotecas de mutagénesis y detectar para optimizar adicionalmente la secuencia de los mejores aglutinantes. Lowman (1997, Ann. Rev. Biophys. Bio ol . Struct. 26: 401-24. Otros métodos compiten con la exhibición en fagos en la búsqueda de péptidos. Se puede fusionar una biblioteca de péptidos al término carboxilo del represor lac y expresar en E. coli. Otro método basado en E. coli permite la exhibición en la membrana exterior de la célula por fusión con una lipoproteína asociada a peptidoglicano (PAL) . Estos métodos y métodos relacionados se refieren colectivamente, "exhibición en E. coli". Otro planteamiento biológico para detectar mezclas de péptidos solubles usa levadura para la expresión y secreción. Ver Smith et al. (1993), Mol. Pharmacol. 43: 741-8. El método de Smith et al., y métodos relacionados se refieren como "detección basada en levadura". En otro método, la traducción de ARN aleatorio se detiene antes de la liberación de ribosoma, dando por resultado una biblioteca de polipéptidos con su ARN asociado aún unido. Este método y métodos relacionados se refieren colectivamente, "exhibición de ribosoma". Otros métodos emplean enlace químico de péptidos a ARN; ver, por ejemplo, Roberts & Szostak (1997), Proc. Nati. Acad. Sci.
EUA, 94: 12297-303. Este método y métodos relacionados se refieren colectivamente como "detección de ARN-péptido" . Se han desarrollado bibliotecas de péptidos químicamente derivados, en las cuales los péptidos se inmovilizan en materiales estables, no biológicos, tal como varillas de polietileno o resinas permeables a solvente. Otra biblioteca de péptidos químicamente derivados usa fotolitografía para explorar péptidos inmovilizados en portaobjetos de vidrio. Estos métodos y métodos relacionados se refiere colectivamente como "detección de péptidos químicos". La detección de péptidos químicos puede ser ventajosa ya que permite el uso de D-aminoácidos y otros análogos no naturales, así como elementos no peptídicos. Los métodos tanto biológicos como químicos se revisan en Wells & Lowan (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355-62. En el caso de péptidos bioactivos conocidos, se puede llevar a cabo el diseño racional de ligandos peptídicos con propiedades terapéuticas favorables. En este planteamiento, se hacen cambios graduales a una secuencia peptídica y se determina el efecto de la sustitución en la bioactividad o propiedad biofísica predictiva del péptido (por ejemplo, estructura en solución) . Estas técnicas se refieren colectivamente como "diseño racional". En esta técnica, se hace una serie de péptidos en los cuales un residuo individual al mismo tiempo se reemplaza con alanina. Esta técnica se refiere comúnmente como un "paseo de alanina" o una "exploración de alanina" . Cuando se reemplazan dos residuos (contiguos o separados) , se refiere como un "doble paseo de alanina" . Las sustituciones de aminoácidos resultantes se pueden usar solas o en combinación para dar por resultado una nueva entidad peptídica con propiedades terapéuticas favorables . También se puede usar análisis estructural de la interacción proteína-proteína para sugerir péptidos que imiten la actividad de unión de ligandos de proteína grande. En este análisis, la estructura de cristal puede sugerir la identidad de orientación relativa de residuos críticos del ligando de proteína grande, del cual se puede diseñar un péptido. Ver, por ejemplo, Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 1266-70. Estos métodos y métodos relacionados se refieren como "análisis estructural de proteína" . Estos métodos analíticos también se pueden usar para investigar la interacción entre una proteína receptora y péptidos seleccionados por exhibición en fagos, que puede sugerir adicionalmente la modificación de los péptidos para incrementar la afinidad de unión. De forma conceptual, los imitadores peptídicos de cualquier proteína se pueden identificar usando exhibición en fagos y los otros métodos mencionados anteriormente.
Estos métodos también se han usado para correlación de epítopos, para identificación de aminoácidos críticos en las interacciones proteína-proteína, y como guía para el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos. Por ejemplo, Córtese et al. (1996), Curr. Opin. Biotech. 7: 616-21. Ahora se están usando más frecuentemente en estudios inmunológicos las bibliotecas de péptidos, tal como correlación de epítopos. Kreeger (1996), The Scientist 10(13) : 19-20. De interés particular es el uso de bibliotecas de péptidos y otras técnicas en el descubrimiento de péptidos farmacológicamente activos . En la Tabla 2 se resumen varios de estos péptidos identificados en la técnica. Los péptidos se describen en las publicaciones listadas, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. La actividad farmacológica de los péptidos se describe, en muchos casos se sigue por un término taquigráfico para el mismo entre paréntesis. Alguno de estos péptidos se han modificado (por ejemplo, para formar dímeros C-terminalmente reticulados) . Típicamente, se detectaron bibliotecas de péptidos para la unión a un receptor para una proteína farmacológicamente activa (por ejemplo, receptor de EPO) . En al menos un caso (CTLA4) , la biblioteca de péptidos se detectó para la unión a un anticuerpo monoclonal .
Tabla 2. - Péptidos farmacológicamente activos Forma de Compañero de Actividad péptido unión/proteína farmacológica Referencia de interés1 Enlazado por Receptor de EPO-mimético Wrighton et al . disulfuro EPO (1996) , Science intrapeptídico 273: 458-63; Pat. U.S. No. 5,773,569, emitida el 30 de junio de 1998, a Wrighton et al .
Dimero C- Receptor de EPO-mimético Liban et al . terminalmente EPO (1996) , Science reticulado 273: 464-71; Wrighton et al . (1997) , Nature Biotechnoloqy 15 : 1261-5; solicitud de patente internacional WO 96/40772, publicada el 19 de diciembre de 1996 lineal Receptor de EPO-mimético Naranda et al . EPO (1999), Proc. Nati . Acad. Sci. USA, 96: 7569-74; WO 99/47151, publicada el 23 de septiembre de 1999 Forma de Compañero de Actividad péptido unión/proteína farmacológica Referencia de interés1 lineal c-Mpl TPO-mimético C irla et al . (1997) Science 276: 1696-9; Pat. U.S. No. 5,869,451, emitida el 09 de febrero de 1999; Pat. U.S. No. 5,932,946, emitida el 3 de agosto de 1999 Dímero C- c-Mpl TPO-mimético Cwirla et al . terminalmente (1997) , Science reticulado 276: 1696-9 Dímero Estimulación de Paukovits et al. enlazado por hematopoyesis ( "G- (1984) , Hoppe-disulfuro CSF-mimético") Seylers Z. Phvsiol. Chem. 365: 303-11; Laerum et al . (1988), Exp. Herat. 16: 274-80 Dímero G-CSF-mimetico Bhatnagar et al. enlazado por (1996) , J. Med. alquileno Chem. 39: 3814-9; Cuthbertson et al . (1997) , J. Med. Chem. 40: 2876-82; King et al. (1991) , Exp. Hematol. 19: 481; King et al. (1995) , Blood 86 (Suppl. 1) : 309 s Forma de Compañero de Actividad péptido unión/proteína farmacológica Referencia de interés1 lineal Receptor de Enfermedades Pat. U.S. No. IL-1 inflamatorias y 5,608,035; Pat. autoinmunitarias U.S. No 5,786,331; ("antagonista de Pat. U.S. No IL-1" o "IL-lra- 5,880,096; Yanofsky mimético" ) et al. (1996), Proc. Nati. Acad. Sci. 93: 7381-6; Akeson et al . (1996) , J. Biol. Chem. 271: 30517- 23; Wiekzorek et al. (1997), Pol. J. Pharmacol .
La proteína listada en esta columna se puede unir por el péptido asociado (por ejemplo, receptor de EPO, receptor de IL-1) o imitar por el péptido asociado. Las referencias listadas para cada uno ponen en claro si la molécula se une por o se imita por, los péptidos. Tabla 2 (continuación) Forma de Compañero de Actividad Referencia péptido unión/proteína farmacológica de interés1 Lineal Factor de Estimulación de Inagaki-Ohara et timidita sérico linfocitos ("FTS- al. (1996), (FTS) mimético" ) Cellular Immunol . 171: 30-40; Yoshida (1984) , Int. J. Immunopharmacol , Forma de Compañero de Actividad Referencia péptido unión/proteína farmacológica de interés1 Enlazado por CTLA4 MAb CTLA4-mimetico Fukumoto et al . disulfuro (1998) , Nature intrapeptídico Biotech. 16: 267- 70 Exocíclico Receptor de TNF- Antagonista de TNF- Takasaki et al . a a (1997) , Nature Biotech. 15: 1266-70; WO 98/53842, publicada el 3 de diciembre de 1998 Lineal Receptor de TNF- Antagonista de TNF- Chirinos-Rojas a a () , J. Imm. 5621- 5626 Enlazado por C3b Inhibición de Sahu et al . disulfuro activación de (1996) , J;_ intrapeptídico complemento; Immunol . 157:884- enfermedades 91; Morikis et antuoinmunitarias al. (1998), ("antagonista de Protein Sci. 7 : C3b") 619-27 Lineal Vinculina Proceso de adhesión Adey et al . celular-crecimiento (1997) , Biochem. celular, J. 324: 523-8 diferenciación, curación de heridas, metástasis de tumor ("unión a vinculina" ) Lineal Proteína de Anti-trombótico Linse et a .1. unión a C4 (1997) , J. Biol. (C4BP) Chem. 272: 14658- 65 Forma de Compañero de Actividad Referencia péptido unión/proteína farmacológica de interés1 Lineal Receptor de Procesos asociados Goodson et al . urocinasa con interacción de (1994), Proc. urocinasa con su Nati. Acad. Sci. receptor (por 91: 7129-33; ejemplo, solicitud angiogénesis, internacional WO invasión de células 97/35969, tumorales y publicada el 2 de metástasis) ; octubre de 1997 ("antagonista de UKR") Lineal Mdm2 , Hdm2 Inhibición de Picksley et al . inactivación de p53 (1994) , Oncogene mediada por Mdm2 o 9: 2523-9; hdm2; an i-tumor Bottger et al. ("antagonista de (1997) J. Mol. Mdm/hdm" ) Biol. 269: 744- 56; Bottger et al. (1996), Oncogene 13 : 2141-7 Lineal p21w Anti-tumor al Ball et al. imitar la actividad (1997) , Curr. de p21WAF1 Biol. 7:71-80 Lineal FarnesilAnti-cáncer al Gibbs et al. transferasa prevenir la (1994) , Cell. activación del 77:175-178 oncogen ras Lineal Dominio efector Anti-cáncer al Moodie et al . 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Sci. 93: 1540-4; Pat U.S. No. 5,886,150, emitida el 23 de marzo de 1999; Pat U.S. No. 5,888,763, emitida el 30 de marzo de 1999 Lineal pl6 INKÍ Anti-cáncer al Fahraeus et al . imitar la actividad (1996) , Curr. de pl6; por ejemplo Biol. 6: 84-91 al inhibir el complejo D-Cdk de ciclina ("pl6- mimético" ) Forma de Compañero de Actividad Referencia péptido unión/proteína farmacológica de interés1 Lineal Src, Lyn Inhibición de Stauffer et al. activación de (1997) , Biochem. células cebadas, 36: 9388-94 condiciones relacionadas a IgE, hipersensibilidad tipo I ("antagonista de células cebadas") Lineal Proteasa de Tratamiento de Solicitud células cebadas trastornos internacional WO inflamatorios 98/33812, mediados por publicada el 6 de liberación de agosto de 1998 triptasa-6 ( " inhibidores de proteasa de células cebadas" ) Lineal Antígeno de Tratamiento de Dyson & Murran núcleo de HBV infecciones virales (1995), Proc. (HBcAg) de HBV ("anti-HBV") Nati. Acad. Sci. 92: 2194-8 Lineal Selectinas Adhesión de Martens et al . neutrófilos; (1995) , J. Biol. enfermedades Chem. 270: 21129- inflamatorias 36; solicitud de ("antagonista de patente europea selectina" ) EP 0,714,912, publicada el 5 de junio de 1996 Forma de Compañero de Actividad Referencia péptido unión/proteína farmacológica de interés1 Lineal, Calmodulina Antagonista de Pierce et al . ciclizado calmodulina (1995) , Molec. Diversity 1: 259- 65; Dedman et al. (1993) , J. Biol. Chem. 268: 23025- 30; Adey & Kay (1996) , Gene 169: 133-4 Lineal- Integrmas Alojamiento de Solicitudes ciclizado tumor; tratamiento internacionales para condiciones WO 95/14714, relacionadas a publicada el 1 de eventos celulares junio de 1995; WO mediados por 97/08203, integrina, publicada el 6 de incluyendo marzo de 1997; WO agregación de 98/10795, plaquetas, publicada el 19 trombosis, curación de marzo de 1998; de heridas, WO 99/24462, osteoporosis, publicada el 20 reparación de de mayo de 1999; te ido, Kraft et al. angiogénesis (por (1999), J. Biol. ejemplo, para Chem. 274: 1979- tratamiento de 1985 cáncer) , e invasión tumoral ("unión a integrina" ) Forma de Compañero de Actividad Referencia péptido unión/proteína farmacológica de interés1 Cíclico, Componentes de Tratamiento de WO 98/09985, lineal matriz condiciones publicada el 12 extracelular y inflamatorias y de marzo de 1998 fibronectina de autoinmunitarias células T y macrófagos Lineal Somatostatina y Tratamiento o Solicitud de cortistatina prevención de patente europea tumores productores 0,911,393, de hormona, publicada el 28 acromegalia, de abril de 1999 gigantismo, demencia, úlcera gástrica, crecimiento tumoral, inhibición de secreción de hormona, modulación de sueño o actividad neural lineal Lipopolisacárido Antibiótico; choque Pat U.S. No. bacteriano séptico; trastornos 5,877,151, modulados por CAP37 emitida el 2 de marzo de 1999 Lineal o Pardaxina, Antipatogenico WO 97/31019, cíclico, melitina publicada el 28 incluyendo D- de agosto de 1997 aminoácidos Lineal, VIP Impotencia, WO 97/40070, cíclico trastornos publicada el 30 neurodegenerativos de octubre de 1997 Forma de Compañero de Actividad Referencia péptido unión/proteína farmacológica de interés1 Lineal CTL Cáncer EP 0,770,624, publicada el 2 de mayo de 1997 Lineal THF-gamma2 Burnstein (1998), Biochem. , 27 : 4066-71 Lineal Amilina Cooper (1987), Proc. Nati. Acad. Sci. 84: 8628-32 Lineal Adrenomedulina Kitamura (1993) , BBRC, 192: 553-60 Cíclico, VEGF Anti-angiogénico; Fairbrother lineal cáncer, artritis (1998), Biochem. , reumatoide, 37:17754-17764 retinopatía diabética, psoriasis ("antagonista de VEGR") Cíclico MMP Inflamación y Koivunen (1999) , trastornos Nature Biotech. , autoinmunitarios ; 17:768-774 crecimiento tumoral ( " inhibidor de MMP") Fragmento de HGH Tratamiento de Pat. U.S. No. obesidad 5,869,452 Equistatina Inhibición de Gan (1998), J. agregación de Biol. Chem., 263: plaquetas 19827-32 lineal Autoanticuerpo SLE WO 96/30057, SLE publicada el 3 de octubre de 1997 Forma de Compañero de Actividad Referencia péptido unión/proteína farmacológica de interés1 GDI alfa Supresión de Ishikawa et al . metástasis de tumor (1998), FEBS Lett. 441 (1) : 20-4 Anticuerpos Activación de Blank et al. anti- células (1999), Proc. fosfolípido, endoteliales, Nati. Acad. Sci. beta-2- síndrome EUA 96: 5164-8 glicoproteína-I antifosfolípido (ß2GPI) (APS) , fenómeno tromboembólico, trombocitopenia, y pérdida fetal recurrente Lineal Beta-cadena de Diabetes WO 96/11214, receptor de publicada el 18 células T de abril de 1996 Antiproliferativo, WO 00/01402, antiviral publicada el 13 de enero de 2000 Anti-isquémico, WO 99/62539, liberación de publicada el 9 de hormona de diciembre de 1999 crecimiento Anti-angiogénico WO 99/61476, publicada el 2 de diciembre de 1999 Forma de Compañero de Actividad Referencia péptido unión/proteína farmacológica de interés1 Lineal Agonista de WO 99/38526, apoptosis; publicada el 5 de tratamiento de agosto de 1999 trastornos asociados a células T (por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias, infección viral, leucemia de células T, linfoma de células T) lineal MHC clase II Tratamiento de Pat U.S. No. enfermedades 5,880,103, autoinmunitarias emitida el 9 de marzo de 1999 Lineal Andrógeno R, Proapoptótico, útil WO 99/45944, p75, MJD, DCC, en tratamiento de publicada el 16 huntingtina cáncer de septiembre de 1999 Lineal Factor de von Inhibición de WO 97/41220, Villebrand; interacción de publicada el 29 factor VIII factor VIII; de abril de 1997 anticoagulantes Lineal Lentivirus LLP1 antimicrobiano Pat. U.S. No. 5,945,507, emitida el 31 de agosto de 1999 Lineal Delta-péptido Trastornos de sueño Craf (1996), inductor de Peptides 7: 1165 sueño Forma de Compañero de Actividad Referencia péptido unión/proteína farmacológica de interés1 Lineal Proteína C- Inflamación y Barna (1994), reactiva (CRP) cáncer Cáncer Immunol . Immunother, 38: 38 (1994) Lineal Péptidos de Infertilidad Suzuki (1992), activación de Comp. Biochem. esperma Physiol. 102B: 679 Lineal Angiotensmas Factores Lundergan (1999), hematopoyéticos J. Periodontal para condiciones Res. 34(4) : 223- hepatocitopénicas 228 de cáncer, SIDA, etc. Lineal VIH-1 gp41 Anti-SIDA Chan (1998) , Cell 93: 681-684 Lineal PKC Inhibición de Moonga (1998), resorbción de hueso Exp. Physiol. 83 : 717-725 Lineal Defensinas (HNP- Antimicrobiano Harvig (1994), 1, -2, -3, -4) Methods Enz. 236: 160-172 Lineal p l 8 5HER2 /neU ( c_ Anti-tumor AHNP- Park (2000), Nat. erbB-2 mimético Biotechnol . 18: 194-198 Lineal gpl30 Antagonista de IL-6 WO 99/60013, publicada el 25 de noviembre de 1999 Forma de Compañero de Actividad Referencia péptido unión/proteína farmacológica de interés1 Lineal Colágeno, otras Enfermedades WO 99/50282, articulaciones, autoinmunitarias publicada el 7 de cartílago, octubre de 1999 proteínas relacionadas a artritis Lineal Proteína de Tratamiento de WO 99/51254, envoltura de enfermedades publicada el 14 VIH-1-1 degenerativas de octubre de neurológicas 1999 Lineal IL-2 Trastornos WO 00/04048, autoinmunitarios publicada el 27 (por ejemplo, de junio de 2000; rechazo de injerto, WO 00/11028, artritis publicada el 2 de reumatoide) marzo de 2000 Los péptidos identificados por detección de bibliotecas de péptido se han considerado como "guías" en el desarrollo de agentes terapéuticos en lugar de ser usados como agentes terapéuticos por sí mismos . Igual que otras proteínas y péptidos, se removerían rápidamente in vivo ya sea por filtración renal, mecanismos de depuración celular en el sistema reticuloendotelial, o degradación proteolítica. Francis (1992), Focus on Growth Factors 3: 4-11. Como resultado, la técnica usa actualmente los péptidos identificados para validar objetivos de fármaco o como núcleos moleculares para diseño de compuestos orgánicos que pueden no haber sido tan fácil o tan rápidamente identificados a través de detección de bibliotecas químicas. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol . Struct. 26: 401-24; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8. A pesar de la disponibilidad de proteínas terapéuticas recombinantes, de imitadores de péptidos identificados anteriormente, y de modificaciones de los mismos, permanece de esta manera una necesidad en la técnica de proporcionar compuestos adicionales que tengan bioeficacia mejorada, particularmente cuando se administran en un régimen de múltiples dosis.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a polipéptidos o péptidos modificados para incluir una región Fe de anticuerpo y uno o más polímeros solubles en agua. En un aspecto, se proporciona un compuesto sustancialmente homogéneo que comprende una estructura expuesta en la Fórmula I, Fórmula I: [ (X^-F1- (X2) - (L^^ SP, En donde: F1 es un vehículo; X1 se selecciona a partir de P2-(L3) -P1-(L2) - P3-(L4)g-P2-(L3)£-P1-(L2)e- y P4-(L5)h-P3-(L4)g-P2-(L3)£-P1-(L2)e- X2 se selecciona a partir de: -( 'l.-P'-IL^-P1, - (L -P1- (L3) £-P2- (L4)g-P3- (L5)h-P4 en donde P1, P2, P3, y P4 son cada una independientemente secuencias de péptidos farmacológicamente activos; L1, L2, L3, L4, y L5 son cada uno independientemente ligadores; a, b, c, e, f, g, y h son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición que al menos uno de a y b es 1; d es al menos 1; y WSP es un polímero soluble en agua, la unión del cual se efectúa en cualquier porción reactiva en F1; Este compuesto que tiene una propiedad de bioeficacia mejorada cuando se administra en un régimen de múltiples dosis. En un aspecto, el compuesto es un multímero, y en otro aspecto, el compuesto es un dímero. En una modalidad, la invención proporciona un compuesto de la Fórmula I que comprende una estructura expuesta en la Fórmula II Fórmula II: [x'-F1] - (L1) c-WSPd En donde F1 es un dominio Fe y está unido en el C-término de X1, y uno o más SWP está unido al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. Los compuestos que tienen esta estructura se proporcionan como un multímero en un aspecto y un dímero en otro aspecto. En otra modalidad, la invención proporciona un compuesto de la Fórmula I, que comprende una estructura expuesta en la Fórmula III Fórmula III: [F'-X1] - (L1)c-WSPd En donde F1 es un dominio Fe y está unido al N-Término de X2 , y uno o más WSP está unido al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. También se proporcionan multímeros y dímeros de un compuesto que tiene esta estructura. La invención también proporciona un compuesto de la Fórmula I, que comprende una estructura expuesta en la Fórmula IV Fórmula IV: [F1- (L1) ,-P1] - (L1) c-WSPa En donde F1 es un dominio Fe y está unido al N-término de - (L^-P1 y uno o más WSP está unido al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. Los multímeros y dímeros de un compuesto que tiene esta estructura también se proporciona. La invención contempla además un compuesto de la Fórmula I, que comprende una estructura expuesta en la Fórmula V.
Fórmula V: [F1- (L1)^?1- (L2) £-P2] - (L1) c-WSPd En donde F1 es un dominio Fe y está unido al N-término de -L^-P^L^-P2 y uno o más WSP está unido al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. También se proporcionan multímeros y dímeros de un compuesto que tiene esta estructura. En un aspecto, se proporciona un compuesto de la invención como se describe anteriormente, en donde P1 y/o P2 se seleccionan independientemente de un péptido expuesto en cualquiera de las tablas 4 hasta 20. En un aspecto, P1 y/o P2 tienen la misma secuencia de aminoácidos . En otro aspecto, se proporciona un compuesto de la invención como se describe anteriormente, en donde F1 es un dominio Fe. En otro aspecto, se proporciona un compuesto de la invención en donde WSP es PEG. En aún otro aspecto, se proporciona un compuesto como se describe anteriormente en donde F1 es un dominio Fe y WSP es PEG. En otra modalidad, se proporciona un compuesto sustancialmente homogéneo que comprende la estructura: WSP-Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG- IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 1) En donde WSP es un polímero soluble en agua, el compuesto que tiene una propiedad de unirse a c-Mpl y de estimular la producción de plaquetas, el compuesto que tiene una propiedad de bioeficacia mejorada en administración de múltiples dosis. También se contemplan multímeros y dímeros de un compuesto que tiene esta estructura. En otra modalidad, se proporciona un compuesto sustancialmente homogéneo que comprende la estructura: PEG-Fc-GGGGG-IEGPTLQRWLAARA-GGGGGGGG- IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 2) Este compuesto que tiene una propiedad de unirse a c-Mpl y de estimular la producción de plaquetas, este compuesto que tiene una propiedad de bioeficacia mejorada en administración de múltiples dosis. Se contemplan multímeros y dímeros de un compuesto que tiene esta estructura. En un aspecto, el componente PEG de un compuesto de la invención tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2 kDa y 100 kDa. En otro aspecto, el componente PEG de un compuesto de la invención tiene un peso molecular de entre aproximadamente 6 kDa y 25 kDa. La invención proporciona además una composición que comprende un compuesto de la invención en donde la composición comprende al menos 50% de compuesto PEGilado. En otro aspecto, la composición de la invención comprende al menos 75% de compuesto PEGilado, al menos 85% de compuesto PEGilado, al menos 90% de compuesto PEGilado, al menos 95% de compuesto PEGilado, y al menos 99% de compuesto PEGilado. En una modalidad, la invención también proporciona un compuesto sustancialmente homogéneo que tiene la estructura: PEG-Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG- IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 2) En donde PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kD, el compuesto de SEQ ID NO: 2 que es un dímero y que tiene una propiedad de unión a c-Mpl y de estimular la producción de plaquetas, el compuesto que tiene una propiedad de bioeficacia mejorada en la administración de múltiples dosis. La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende: (a) un compuesto sustancialmente homogéneo que tiene la estructura: PEG-Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG- ? IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 2) En donde PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kD, (b) al menos 95% de compuesto diPEGilado; y (c) un diluyente farmacéuticamente aceptable, adyuvante o portador, la composición que tiene una propiedad de bioeficacia mejorada en la administración de múltiples dosis. En una modalidad, se proporciona una composición farmacéutica que comprende: (a) un compuesto sustancialmente homogéneo que tiene la estructura: PEG-Fe-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 2) En donde PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kD y el compuesto de SEQ ID NO: 2 es un dímero, (b) al menos 95% de compuesto diPEGilado; y (c) un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable, la composición que tiene una propiedad de bioeficacia mejorada en la administración de múltiples dosis. La invención también proporciona un método para tratar un trastorno hematopoyético que comprende administrar un compuesto o composición de la invención en un régimen efectivo para tratar el trastorno. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA Numerosos aspectos y ventajas diferentes de la presente invención por lo tanto serán evidentes en la consideración de la siguiente descripción detallada de la misma, la referencia que se hace a la Figura en donde: La Figura 1 muestra el incremento en la producción de plaquetas in vivo en un régimen de administración de múltiples dosis con un PEG-Fc-TMP de la invención, en donde los resultados usando PEG-Fc-TMP se muestran con triángulos (A) y los resultados usando Fc-TMP se muestran con círculos (•) . Los cuadrados (") representan un control.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definición de términos El término "que comprende" significa que un compuesto puede incluir aminoácidos adicionales en cualquiera o ambos de los N- o C-términos de la secuencia determinada. Por supuesto, estos aminoácidos adicionales no deben interferir de forma significativa con la actividad del compuesto. "Suetancialmente homogéneo" como se usa en la presente con referencia a una preparación de la invención significa que la preparación incluye una especie individual de un compuesto terapéutico detectable en la preparación de moléculas terapéuticas totales en la preparación, a menos que se señale de otro modo a un porcentaje específico de moléculas terapéuticas totales. En general, una preparación sustancialmente homogénea es suficientemente homogénea para exhibir las ventajas de una preparación homogénea, por ejemplo, facilidad en la aplicación clínica en predectibilidad de farmacocinética de lote a lote. "Bioeficacia" se refiere a la capacidad para producir un efecto biológico deseado. La eficacia a diferentes compuestos, o diferentes dosis del mismo compuesto, o diferentes administraciones del mismo compuesto se normalizan en general a la cantidad de compuesto (s) para permitir la comparación apropiada. "Administración de múltiples dosis" se refiere al régimen de tratamiento terapéutico o profiláctico que incluye la administración de más de una cantidad de un compuesto durante un periodo de tiempo.
El término "vehículo" se refiere a una molécula que previene la degradación y/o incrementa la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad, o incrementa la actividad biológica de una proteína terapéutica. Los vehículos de ejemplo incluyen un dominio Fe así como un polímero lineal; un polímero de cadena ramificada (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos número 4,289,872 de Denkenwalter et al., emitida el 15 de septiembre de 1981; 5,229,490 de Ta , emitida el 20 de julio de 1993; WO 93/21259 por Frechet et al., publicada el 28 de octubre de 1993), un lípido; un grupo de colesterol; un carbohidrato u oligosacárarido; o cualquier proteína, polipéptido o péptido natural o sintético que se une a un receptor de salvamento. Los vehículos se describen adicionalmente más adelante en la presente. El término "Fe nativo" se refiere a una molécula o secuencia que comprende la secuencia de un fragmento de no unión a antígeno que resulta de la digestión del anticuerpo completo, ya sea en la forma monomérica o multimérica. La fuente de inmunoglobulina original del Fe nativo es en un aspecto de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas. Un Fe nativo es un polipéptido monomérico que se puede enlazar en las formas diméricas o multiméricas por asociación covalente (por e emplo, enlace de disulfuro) , asociación no covalente o una combinación de los mismos. El número de enlaces de disulfuros intermoleculares entre las subunidades monoméricas de las moléculas Fe nativas varía de uno a cuatro dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgE) o de la subclase (por ejemplo, IgGl, IgG2, lgG3, igAl, IgGA2) . Un ejemplo de un Fe nativo es un dímero unido por disulfuro que resulta de la digestión como papaína de una IgG. Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9. El término "Fe nativo" como se usa en la presente es genérico a las formas monoméricas, diméricas y multiméricas . El término "variante de Fe" se refiere a una molécula o secuencia que se modifica de un Fe nativo, pero aún comprende un sitio de unión para el receptor de salvamento, FcRn. Las solicitudes internacionales WO 97/34631 (publicada el 25 de septiembre de 1997) y WO 96/32478 describen variantes de Fe de ejemplo, así como interacción con el receptor de salvamento, y se incorporan de este modo como referencia. En un aspecto, el término "variante de Fe" comprende una molécula o secuencia que se humaniza a partir de un Fe nativo no humano. En otro aspecto, un Fe nativo comprende sitios que se pueden remover debido a que proporcionan características estructurales o actividad biológica que no se requieren para las moléculas de fusión de la presente invención. De esta manera, el término "variante de Fe" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos de Fe nativo que afectan o están comprendidos en (1) formación de enlace de disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula hospedadora seleccionada, (3) heterogeneidad N-terminal en la expresión en una célula hospedadora seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con el complemento, (6) unión a un receptor de Fe diferente de un receptor de salvamento, o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Las variantes de Fe se describen en detalle adicional más adelante en la presente. El término "dominio Fe" abarca moléculas y secuencias variantes de Fe y Fe nativo como se define anteriormente . Como con las variantes de Fe o los Fe nativos, el término "dominio Fe" incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sea digeridas del anticuerpo completo o producidas por otros medios. En una modalidad, por ejemplo, la región Fe puede ser: DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1696) . El término "multímero" como se aplica a los dominios o moléculas de Fe que comprende dominios Fe se refiere a moléculas que tienen dos o más cadenas de polipéptido asociadas covalentemente, de manera no covalente, o por interacciones tanto covalentes como no covalentes. Típicamente, las moléculas de IgG forman dímeros; la IgM, pentámeros; IgD, dímeros; e IgA, monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. Se pueden formar multímeros al aprovechar la secuencia y la actividad resultante de la fuente Ig nativa del Fe o al derivatizar (como se define más adelante) este Fe nativo. Los términos "que derivatiza", "derivado", o "derivatizado" comprenden procesos y compuestos resultantes en los cuales, por ejemplo y sin limitación, (1) el compuesto tiene una porción cíclica; por ejemplo, que se retícula entre residuos de cisteinilo dentro del compuesto; (2) el compuesto se retícula o tiene un sitio de reticulación; por ejemplo, el compuesto tiene un residuo de cisteinilo y de esta manera forma dímeros reticulados en cultivo o in vivo; (3) uno o más enlaces de peptidilo se reemplazan por un enlace no de peptidilo; (4) el N-término se reemplaza por -NRR,, NRC(0)R1( -NRC (OJOR^ -NRSfO)^, -NHC(0)NHR, un grupo succinimida, o un benciloxicarbonil-NH-sustituido o insustituido, en donde R y Rx y los sustituyentes de anillo son como se definen más adelante en la presente; (5) el C-término se reemplaza por -C(0)R2 o -NR3R(1 en donde R2, R3 y R4 son como se define más adelante en la presente; y (6) compuestos en los cuales se modifican las porciones de aminoácidos individuales a través del tratamiento con agentes capaces de reaccionar con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados. Los derivados se describen adicionalmente más adelante en la presente. El término "péptido" se refiere a moléculas de 2 a 40 aminoácidos, moléculas de 3 a 20 aminoácidos, y aquéllas de 6 a 15 aminoácidos. Por ejemplo, los péptidos que tienen un tamaño seleccionado de no más de 35, no más de 30, no más de 25, no más de 20 aminoácidos y/o no más de 15 aminoácidos, se contemplan en la presente. Los péptidos de ejemplo se pueden generar aleatoriamente por cualquiera de los métodos citados en la presente, transportados en una biblioteca de péptidos (por ejemplo, una biblioteca de exhibición de fagos) , derivados por digestión de proteínas, o químicamente sintetizados. Los péptidos incluyen la forma D y L, ya sea purificados o en mezcla de las dos formas. El término "aleatorizado" como se usa para referirse a secuencias peptídicas se refiere a secuencias completamente aleatorias (por ejemplo, seleccionadas por métodos de exhibición en fago) y secuencias en las cuales se reemplaza uno o más residuos de una molécula que se presenta de forma natural por un residuo de aminoácido que no aparece en esta posición en la molécula que se presenta de forma natural. Los métodos de ejemplo para identificar secuencias peptídicas incluyen exhibición en fago, exhibición en E. coli, exhibición en ribosoma, detección basada en levadura, detección de ARN-péptido, detección química, diseño racional, análisis estructural de proteína, y similares. El término "farmacológicamente activo" significa que una sustancia descrita de este modo se determina que tiene actividad que afecta un parámetro médico (por ejemplo, presión sanguínea, cuenta de células sanguíneas, nivel de colesterol) o estado de enfermedad (por ejemplo, cáncer, trastornos autoinmunitarios) . De esta manera, los péptidos farmacológicamente activos comprenden péptidos agonísticos o miméticos y antagonísticos como se define más adelante. Los términos "péptido mimético" y "péptido agonista" se refieren a un péptido que tiene actividad biológica comparable a una proteína (por ejemplo, EPO, TPO, G-CSF) que interactúa con una proteína de interés. Estos términos incluyen además péptidos que imitan indirectamente la actividad de una proteína de interés, tal como al potenciar los efectos del ligando natural de la proteína de interés; ver, por ejemplo, los péptidos G-CSF-miméticos listados en las tablas 2 y 7. Como un ejemplo, el término "péptido EPO-mimético" comprende cualquier péptido que se puede identificar o derivar como se describe en Wrighton et al. (1996), Science 273: 458-63, Naranda et al. (1999), Proc. Nati. Acad. Sci EUA 96: 7569-74, o cualquier otra referencia en la Tabla 2 identificada como que tiene materia EPO-mimética. Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos que aquéllos realmente descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos. Como otro ejemplo, el término "péptido TPO-mimético" o "TMP" comprende péptidos que se pueden identificar o derivar como se describe en Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9, patentes de los Estados Unidos números 5,869,451 y 5,932,946 y cualquier otra referencia en la Tabla 2 identificada como que tiene materia TPO-mimética, así como la publicación internacional WO 00/24770 publicada el 4 de mayo de 2000, incorporada de este modo por referencia. Aquellos expertos en la técnica aprecian que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos que los descritos realmente en la presente al seguir los siguientes procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos. Como un ejemplo, el término "péptido G-CSF-mimético" comprende cualquier péptido que se puede identificar o describir en Paukovits et al. (1984), Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 365: 303-11 o cualquiera de las referencias en la Tabla 2 identificada como que tiene materia G-CSF-mimética. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos que los realmente descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos. El término "péptido CTLA4-mimético" comprende cualquier péptido que se puede identificar o derivar como se describe en Fukumoto et al. (1998), Nature Biotech. 16: 267-70. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos que los realmente descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos . El término "péptido antagonista" o "péptido inhibidor" se refiere a un péptido que bloquea o interfiere de alguna manera con la actividad biológica de la proteína asociada de interés, o tiene actividad biológica comparable a un antagonista o inhibidor conocido de la proteína asociada de interés. De esta manera, el término "péptido antagonista de TNF" comprende péptidos que se pueden identificar o derivar como se describe en Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 1266-70 o cualquiera de las referencias en la Tabla 2 identificada como que tiene materia TNF-antagonística. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos que los realmente descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos. Los términos "antagonista de IL-1" y "péptido IL-lra-mimético" comprenden péptidos que inhiben o reducen la activación del receptor de IL-1 por IL-1. La activación del receptor de IL-1 resulta de la formación de un complejo entre IL-1, el receptor de IL-1 y la proteína secundaria del receptor de IL-1. El antagonista de IL-1 o péptidos IL-Ira-miméticos se unen a IL-1, el receptor de IL-1, o proteína secundaria de receptor de IL-1 y obstruyen la formación del complejo entre cualquiera de dos o tres componentes del complejo. El antagonista de IL-1 o péptidos IL-lra-miméticos de ejemplo se pueden identificar o derivar como se describe en las patentes de los Estados Unidos números 5,608,035, 5,786,331, 5,880,096, o cualquiera de las referencias en la Tabla 2 identificadas como que tiene materia IL-lra-mimética o IL-1-antagonística. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos que los realmente descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos . El término "péptido antagonista de VEGF" comprende péptidos que se pueden identificar o derivar como se describe en Fairbrother (1998), Biochem. 37: 17754-64, y cualquiera de las referencias en la Tabla 2 identificadas como que tienen materia VEGF-antagonística. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos que los realmente descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos. El término "péptido inhibidor de MMP" comprende péptidos que se pueden identificar o derivar como se describe en Koivunen (1999), Nature Biotech. 17: 768-74 y en cualquiera de las referencias en la Tabla 2 identificadas como que tienen materia inhibitoria de MMP. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias permite seleccionar diferentes péptidos que los realmente descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con diferentes bibliotecas de péptidos. El término "péptido inhibidor de miostatina" comprende péptidos que se pueden identificar por su capacidad para reducir o bloquear la actividad o señalización de miostatina como se demuestra en ensayos in vi tro tal como por ejemplo, el ensayo de actividad de miostatina basado en células pMARE C2C12 o por pruebas en animales in vivo como se describe en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos número US20040181033A1 y la publicación de solicitud de PCT número WO2004/058988. Los péptidos inhibidores de miostatina de ejemplo se exponen en las tablas 21-24. El término "antagonista de integrina/adhesión" comprende péptidos que inhiben o reducen la actividad de integrinas, selectinas, moléculas de adhesión celular, receptores de integrina, receptores de selectina, o receptores de moléculas de adhesión celular. Los antagonistas de integrina/adhesión de ejemplo comprenden laminina, equistatina, los péptidos descritos en las tablas 25-28. El término "inhibidor de resorción ósea" se refiere a moléculas tal como se determina por los ensayos de los ejemplos 4 y 11 de la WO 97/23614; que se incorpora de este modo por referencia en su totalidad. Los inhibidores de resorción ósea de ejemplo incluyen anticuerpos de OPG y OPG-L, que se describen en WO 97/23614 y WO 9846751, respectivamente, que se incorporan de este modo como referencia en su totalidad. El término "inhibidor de factor de crecimiento de nervio" o "agonista de factor de crecimiento de nervio" comprende un péptido que se une a e inhibe la actividad o señalización del factor de crecimiento de nervios (NGF) . Los péptidos de ejemplo de este tipo se exponen en la Tabla 29. El término "dominio modulador de TALL-1" se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos que se una al TALL-1 y comprende secuencias que se presentan de manera natural o secuencias aleatorizadas . Los dominios moduladores de TALL-1 de ejemplo se pueden identificar o derivar por exhibición en fagos u otros métodos mencionados en la presente. Los péptidos de ejemplo de este tipo se exponen en las tablas 30 y 31. El término "antagonista de TALL-1" se refiere a una molécula que se une al TALL-1 e incrementa o disminuye uno o más parámetros de ensayo opuestos al efecto de estos parámetros por TALL-1 nativo de longitud completa. Esta actividad se puede determinar, por ejemplo, por ensayos tal como se describe en la subsección titulada "actividad biológica de AGP-3" en la sección de materiales y métodos de la solicitud de patente titulada "proteínas relacionadas con TNF", WO 00/47740, publicada el 17 de agosto de 2000. El término "péptido antagonista de Ang 2" comprende péptidos que se pueden identificar o derivar como que tienen características antagonistas de Ang-2. Los péptidos de ejemplo de este tipo se exponen en las tablas 32-38. Adicionalmente, las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de esta invención también se contemplan. Por "sales fisiológicamente aceptables" se quiere decir cualquiera de las sales que se conozcan o descubran posteriormente que son farmacéuticamente aceptables. Algunos ejemplos específicos son: acetato; trifluoroacetato; hidrohaluros, tal como clorhidrato y bromohidrato; sulfato; citrato; tartrato; glicolato; y oxalato. El término "WSP" se refiere a un polímero soluble en agua que previene que un péptido, proteína u otro compuesto al cual se une se precipite en un ambiente acuoso, tal como, a manera de ejemplo, un ambiente fisiológico. Sigue a continuación una descripción más detallada de varias modalidades de WSP contempladas por la invención. Estructura de los compuestos. En general . En preparaciones de acuerdo con la invención, un péptido se une a un vehículo a través del N-término o C-término del péptido, y la estructura resultante modificada de esta manera con un WSP covalentemente unido que se une a la porción de vehículo en el producto de vehículo-péptido. De esta manera, las moléculas de WSP-vehículo-péptido de esta invención se pueden describir por la siguiente Fórmula I: I: [ ( X1 ) a-F1- ( X2 ) b] - ( h1 ) c-^SPá En donde: F1 es un vehículo; X1 se selecciona a partir de ^-(L2) - P2-(L3)£-P1-(L2)e- ?-(l,t) -P2-(l.3)í-?-(h2) - y P4- (L5)h-P3- (L4)g-P2- (L3) £-P1- (L2)e- X2 se selecciona a partir de: -(L2)e-P1-(L3)£-P2, - h2)^1-^3)^2-^)^3, y - (L^-P1- (L3) £-P2- (L4)g-P3- (L5)h-P4 en donde P1, P2, P3, y P4 son cada una independientemente secuencias de péptidos farmacológicamente activos; L1, L2, L3, L4, y L5 son cada uno independientemente ligadores; a, b, c, e, f, g, y h son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición que al menos uno de a y b es 1; d es al menos 1 ; y WSP es un polímero soluble en agua, la unión del cual se efectúa en cualquier porción reactiva en F1; De esta manera, el compuesto I comprende compuestos de la Fórmula II [X1-F1]-{L1)c-WSPd incluyendo multímeros de los mismos, en donde F1 es un dominio Fe y está unido al C-término de X1, y uno o más WSP se une al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1,-III [F1_?1]_(L1) WSP Incluyendo multímeros de los mismos, en donde F1 es un dominio Fe y está unido al N-Término de X2, y uno o más WSP se unen al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1; IV [F1-(L1)e-pl]-(Ll)=-WSPd Incluyendo multímeros de los mismos, en donde F1 es un dominio Fe y está unido en el N-término de -(L1)c-P1 y uno o más WSP se unen al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1; y V [F1- (L^-P1- (L2) £-P2] - (L^-WSP, Incluyendo multímeros de los mismos, en donde F1 es un dominio Fe y está unido en el N-término de -L^P^L2-?2 y uno o más WSP se unen al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1. Péptidos . Se puede usar cualquier número de péptidos en unión con la presente invención. De interés particular son péptidos que imitan la actividad de EPO, TPO, hormona de crecimiento, G-CSF, GM-CSF, IL-lra, leptina, CTLA4, TRAIL, TGF-oc, y TGF-ß. También son de interés los antagonistas peptídicos, particularmente aquellos antagonistas a la actividad de TNF, leptina, cualquiera de las interleucinas (IL-1, 2, 3, ...) , y proteínas comprendidas en la activación de complemento (por ejemplo, C3b) . Los péptidos de selección de objetivo también son de interés, incluyendo péptidos de alojamiento de tumor, péptidos de transporte en membrana, y similares. Todas estas clases de péptidos se pueden descubrir por métodos descritos en las referencias citadas en esta especificación y otras referencias . La exhibición en fagos, en particular, es útil en la generación de péptidos para el uso en la presente invención. Se ha declarado que la selección por afinidad a partir de bibliotecas de péptidos aleatorios se puede usar para identificar ligandos peptídicos para cualquier sitio de cualquier producto génico. Dedman et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 23025-30. La exhibición en fagos es particularmente muy adecuada para identificar péptidos que se unen a estas proteínas de interés así como receptores de superficie celular o cualquier proteína que tenga epitopos lineales. Wilson et al. (1998), Can. J. Microbiol. 44: 313-29; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8. Estas proteínas se revisan extensivamente en Herz et al. (1997), J. Receptor & Signal Transduction Res. 17(5): 671-776, que se incorpora de este modo como referencia. Estas proteínas de interés se prefieren para el uso en esta invención. A manera de ejemplo y sin limitación, se proporciona un grupo de péptidos que se une a los receptores de citocinas. Las citocinas se han clasificado recientemente de acuerdo a su código de receptor. Ver, Inglot (1997), Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 45: 353-7, que se incorpora de este modo como referencia. Entre estos receptores están las CKR (familia I en la Tabla 3). La clasificación de receptor aparece en la Tabla 3.
Tabla 3.- Receptores de citocina clasificados por código de receptor IL-17R- corresponde a la familia de CKR pero está sin asignar a 4 subfamilias indicadas. 2 Otros subtipos de IFN tipo I permanecen sin asignar. Citocinas hematopoyéticas, ligandos de IL-10 e interferones no poseen proteína-cinasas intrínsecas funcionales. Las moléculas de señalización para las citocinas son JAK, STAT y moléculas no receptoras relacionadas. Se han clonado IL-14, IL-16 e IL-18 pero de acuerdo al código de receptor permanecen no asignadas. 3 Receptores de TNF usan múltiples moléculas intracelulares distintas para transmisión de señales incluyendo "dominio muerto" de FAS R y 55 kDa TNF-a R que participa en sus efectos citotóxicos. NGF/TNF R puede unirse tanto a NGF y factores relacionados así como a ligandos de TNF. Los receptores de quimiocina son siete receptores de dominio transmembrana (7TM, serpentina) . Están acoplados a proteína G. El antígeno de grupo sanguíneo Duffy (DARC) es un receptor de eritrocito que puede unirse a varias quimiocinas diferentes. IL-1R corresponde a la superfamilia de inmunoglobulinas pero sus características de evento de traducción de señal permanecen no claras. Otras proteínas de interés como objetivos para generación de péptidos en la presente invención incluyen los siguientes : avß3 avßl Ang-2 B7 B7RP1 CRP1 Calcitonina CD28 CETP cMet Factor B de complemento C4b CTLA4 Glucagon Receptor de glucagon LIPG MPL Variantes de empalme de moléculas preferentemente expresadas en células tumorales; por ejemplo, CD44, CD30 Variantes no glicosiladas de mucina y glicoproteínas de superficie Y de Lewis CD19, CD20, CD33, CD45 Metaloproteinasas de matriz de antígeno de célula específico de próstata y antígeno de membrana específico de próstata (MMP) , ambas segregadas y unidas a membrana (por ejemplo, MMP-9) Catepsinas 5 Las citocinas neurotrópicas pueden asociarse también con los receptores de NGF/TNF. 6 STKS puede abarcar muchos otros factores relacionados a TGF-ß que permanecen sin asignar. Las proteína-cinasas son parte intrínseca del dominio intracelular de la familia de receptor-cinasa (RKF) . Las enzimas participan en la transmisión de señales mediante los receptores, receptor de TIE-2 heparanasa activador de plasminógeno de urocinasa (UPA) , receptor de UPA hormona paratiroide (PTH) , proteína relacionada a hormona paratiroide (PTHeP) , PTH-RI, PTH-RII Her2 Her3 Insulina Miostatina TALL-1 Factor de crecimiento de nervios Integrinas y receptores Selectinas y receptores de las mismas Moléculas de adhesión celular y receptores de las mismas Los péptidos de ejemplo aparecen en las Tablas 3 hasta 38 posteriores. Estos péptidos se pueden preparar por cualquiera de los métodos descritos en la técnica, muchos de los cuales se describen en la presente. En la mayoría de las Tablas que siguen, se usan abreviaciones de aminoácidos de letra individual. La X en estas secuencias (y a todo lo largo de esta especificación, a menos que se especifique de otro modo en un caso particular) significa que pueden estas presentes cualquiera de los 20 residuos de aminoácido que se presentan de forma natural. Cualquiera de estos péptidos se pueden enlazar en tándem (es decir, secuencialmente) , con o sin ligadores, y se proporcionan en la tabla unos pocos ejemplos enlazados en tándem. Los ligadores se listan como "?" y pueden ser cualquiera de los ligadores descritos en la presente. Las repeticiones y ligadores en tándem se muestran separados por guiones por claridad. Cualquier péptido que contenga residuos de cisteinilo se puede reticular con otro péptido que contenga Cys, cualquiera o ambos de los cuales puede estar enlazado a un vehículo. Se proporcionan en la tabla unos pocos ejemplos reticulados. Cualquier péptido que tenga más de un residuo Cys puede formar un enlace de disulfuro intrapeptídico, también; ver, por ejemplo, péptidos imitadores de EPO en la Tabla 5. Se especifican en la tabla unos pocos ejemplos de péptidos unidos a disulfuro intrapeptídico. Cualquiera de estos ejemplos se puede derivatizar como se describe en la presente, y se proporcionan en la tabla unos pocos ejemplos derivatizados. Los péptidos derivatizados en las tablas son de ejemplo en lugar de ser limitantes, puesto que los péptidos no derivatizados asociados se pueden emplear en esta invención también. Para derivados en los cuales el término carboxilo puede estar rematado con un grupo amino, el grupo amino de remate se muestra como -NH2. Para derivados en los cuales los residuos de aminoácido están sustituidos por porciones diferentes de residuos de aminoácido, las sustituciones se denotan por s, que significa cualquiera de las porciones descritas en Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9 y Cuthbertson et al. (1997), J. Med. Che,. 40: 2876-82, que se incorporan por referencia. El sustituyente J y los sustituyentes Z (Z5, Z6, ...Z40) son como se definen en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,608,035; 5,786,331 y 5,880,096, que se incorporan como referencia. Para las secuencias imitadoras de EPO (Tabla 5) , los sustituyentes X2 hasta Xu y el número entero "n" son como se definen en la WO 96/40772, que se incorpora por referencia. También para las secuencias imitadoras de EPO, los sustituyentes Xna, Xla, X2a, X3a» x«a' xsa Y Xc siguen las definiciones de Xn, X1# X2, X3, X4, X5, y Xc, respectivamente, de WO 99/47151, que también se incorpora como referencia. Los sustituyentes "?", "?", y "+" son como se definen en Sparks et al. (1996), Proc, Nati, Acad. Sci. 93: 1540-4, que se incorpora de este modo como referencia. X4, X5, X6 y X7 son como se definen en la patente de los Estados Unidos No. 5,773,569, que se incorpora de este modo como referencia, excepto que: para péptidos de unión a integrina, X^ X2, X3, X4, X5, X6, X7, y X8 son como se definen en las solicitudes Internacionales WO 95/14714, publicada el 01 de junio de 1995 y WO 97/08203, publicada el 06 de marzo de 1997, que también se incorporan como referencia; y para péptidos imitadores de VIP, X1# X^, X1, , , ?2, ?3, ?4, ?5, x6 y z y los números enteros m y n son como se definen en la WO 97/40070, publicada el 30 de octubre de 1997, que también se incorpora como referencia. Zaa y Yaa más adelante son como se definen en la WO 98/09985, publicada el 12 de marzo de 1998, que se incorpora como referencia. AA^ AA2, ABj, AB2, y AC son como se definen en la solicitud Internacional WO 98/53842, publicada el 03 de diciembre de 1998, que se incorpora como referencia, X1, X2, X3 y X4 en la Tabla 17 son sólo como se define en la solicitud Europea EP 0,911,393, publicada el 28 de abril de 1999. Los residuos que aparecen en negritas son D-aminoácidos . Todos los péptidos se enlazan a través de enlaces peptídicos a menos que se señale de otro modo. Las abreviaciones se listan al final de esta especificación. En la columna "SEQ ID NO.", WNR" significa que no se requiere listado de secuencias para la secuencia determinada.
Tabla 4.- Secuencias peptídicas antagonistas de IL-1 Secuencia/estructura SEQ ID NO: ACFEWTPAYYQJY 415 Tabla 5.- Secuencias peptídicas de EPO-miméticas Tabla 6. - Secuencias peptídicas de EPO-miméticas Tabla 7.- Secuencias peptídicas G-CSF-miméticas Tabla 8. - Secuencias peptídicas antagonistas de TNF Tabla 9. - Secuencias peptídicas de unión a integrina Tabla 10.- Secuencias peptídicas antagonistas de selectina Tabla 13. - Secuencias peptídicas antagonistas de Mdm/hdm Secuencia/estructura SEQ ID NO: TFSDLW 778 QETFSDLWKLLP 779 QPTFSDLWKLLP 780 Tabla 14.- Secuencias peptídicas antagonistas de calmodulina Tabla 15.- Secuencias peptídicas inhibidoras de proteasa de células cebadas/Antagonistas de células cebadas Tabla 16.- Secuencias peptídicas antagonistas de SH3 Tabla 17.- Secuencias peptídicas somatostatina- o cortistatina-miméticas Secuencia/estructura SEQ ID NO: YHXLXXGYMYT 914 Tabla 19.- Secuencias peptídicas inhibidoras de macrófagos y/o células T Tabla 20.- Péptidos farmacológicamente activos, adicionales de ejemplo Tabla 21 Péptidos Inhibidores de Miostatina Nombre de Pepticuerpo SEQ ID Secuencia Peptídica Miostatina-TN8 -ll 1056 ANWCVSPNWFCMVM Miostatina-TN8 -12 1057 TECYQQEFWCWNL Miostatina-TN8-13 1058 ENTCERWKWMCPPK MiostatIna-TN8-14 1059 WLPCHQEGFWCMNF Miostatina-TN8-15 1060 STMCSQWHWMCNPF Miostaüna-TN8-16 1061 TFGCHWWDVDCYQF Miostatina-TN8-17 1062 IYGCKWWDIQCYDI Miostatina-TN8-18 1063 PDWCIDPDWWCKFW Miostatína-TN8-19 1064 QGHCTRWPWMCPPY Miostaüna-TN8-20 1065 WQECYREGFWCLQT Miostatina-TN8-21 1066 WFDCYGPGFKCWSP Miostaüna-TN8-22 1067 GVRCPKGELWCLYP Miostatina-TN8-23 1068 HWACGYWPWSCKWV Miostatlna-TN8-24 1069 GPACHS PWWWCVFG Miostatina-TN8-25 1070 TTWCISPMWFCSQQ Miostaüna-TN8-26 1071 HKFCPPWAIFCWDF Miostaüna-TN8-27 1072 PDWCVS PRWYCNMW Miostatina-TN8-28 1073 VWKCHWFGMDCEPT Miostatlna-TN8-29 1074 KKHCQTWTWMCAPK Miostatina-TN8-30 1075 WFQCGSTLFWCYNL Miostaüna-TN8-31 1076 WSPCYDHYFYCYTI Miostatina-TN8 - 32 1077 SWMCGFFKEVCMWV Miostatina-TN8-33 1078 EMLCMIHPVFCNPH Nombre de Pepticuerpo SEQ ID Secuencia Peptídica Miostatina-TN8-34 1079 LKTCNLWPWMCPPL Miostatina-TN8-35 1080 WGCKWYEAWCYNK Miostatina-TN8-36 1081 PIHCTQWAWMCPPT Miostatina-TN8-37 1082 DSNCPWYFLSCV1F Miostatina-TN8-38 1083 HIWCNLAMMKCVEM Miostatina-TN8-39 1084 NLQCIYFLGKCIYF Miostatina-TN8-40 1085 AWRCMWF SDVCTPG Miostatina-TN8-41 1086 WFRCFLDADWCTSV Miostatina-TN8-42 1087 EKICQMWSWMCAPP Miostatina-TN8-43 1088 WFYCHL KSECTEP Miostatina-TN8-44 1089 FWRCAIGIDKCKRV Miostatina-TN8-45 1090 NLGCKWYEVWCFTY Miostatina-TN8-46 1091 IDLCNMYVDGMCYPP Miostatina-TN8-47 1092 EMPCNIWGWMCPPV Miostatina-TNl2-l 1093 WFRCVLTGIVDWSECFGL Miostatina-TNl2-2 1094 GFSCTFGLDEFYVDCSPF Miostatina-TNl2-3 1095 LPWCHDQVNADWGFCMLW Miostatina-TN 12-4 1096 YPTCSEKFWIYGQTCVLW Miostatina-TN12-5 1097 LGPCPIHHGPWPQYCVYW Miostatina-TNl2-6 1098 PFPCETHQISWLGHCLSF Miostatina-TNl2-7 1099 HWGCEDLMWSWHPLCRRP Miostatina-TNl2-8 1100 LPLCDADMMF?GFCVAY Miostatina-TNl2-9 1101 SHWCETTFWMNYAKCVHA Nombre de Pepticuerpo SEQ ID Secuencia Peptídica Miostatina-TN12 -I0 1102 LPKCTHVPFDQGGFCLWY Miostatina-TNl2-ll 1103 FSSCWSPVSRQDMFCVFY Miostatina-TNl2-13 1104 SHKCEYSGWLQPLCYRP Miostatina-TNl2-14 1105 PWWCQDNYVQHMLHCDSP Miostatina-TNl2-15 1106 WFRCMLMNSFDAFQCVSY Miostatina-TNl2 -16 1107 PDACRDQPWYMFMGCMLG Miostatina-TNl2 -17 1108 FLACFVEFELCFDS Miostatina-TNl2 -18 1109 SAYCIITESDPYVLCVPL Miostatina-TNl2 -19 1110 PSICESYSTMWLPMCQHN Miostatina-TN12-20 1111 WLDCHDDSWAWTKMCRSH Miostatina-TNl2-21 1112 YLNCVMMNTSPFVECVFN Miostatina-TNl2 -22 1113 YPWCDGFMIQQGITCMFY Miostatina-TN 12-23 1114 FDYCTWLNGFKDWKCWSR Miostaüna-TN 12-24 1115 LPLCNLKEI SHVQACVLF Miostatina-TN12-25 1116 S PECAFARWLGI EQCQRD Miostaüna-TN 12-26 1117 YPQCFNLHLLEWTECDWF Miostatina-TN 12-27 1118 RWRCEIYDSEFLPKCWFF Miostaüna-TN 12-28 1119 LVGCDNVWHRCKLF Miostaüna-TN 12-29 1120 AGWCHVWGEMFGMGC SAL Miostaüna-TN 12-30 1121 HHECEWMARWMSLDCVGL Miostaüna-TN 12-31 1122 FPMCGIAGMKDFDFCVWY Miostaüna-TN 12-32 1123 RDDCTFWPEWLWKLCERP Miostatina-TN 12-33 1124 YNFCSYLFGVSKEACQLP Nombre de Pepticuerpo SEQ ID Secuencia Peptídica Miostaüna-TN 12-34 1125 AHWCEQGPWRYGNICMAY Miostaüna-TN 12-35 1126 NLVCGKI S AWGDEACARA Miostaüna-TN 12-36 1127 HNVCTIMGPSMKWFCWND Miostaüna-TN 12-37 1128 NDLCAMWGWRNTIWCQNS Miostaüna-TN 12-38 1129 PPFCQNDNDMLQSLCKLL Miostaüna-TN 12-39 1130 WYDCNVPNELLSGLCRLF Miostaüna-TN 12-40 1131 YGDCDQNHWMWPFTCLSL Miostaüna-TNl2 - 41 1132 GWMCHFDLHDWGATCQPD Miostatina-TNl2 -42 1133 YFHCMFGGHEFEVHCESF Miostatina-TNl2 -43 1134 AYWCWHGQCVRF Míos tat ina-Linear- 1135 S EHWTFTDWDGNEWWVRPF 1 Míos tat ina-Linear- 1136 MEMLDSLFELLKDMVPI SKA 2 Mios tat ina-Linear- 1137 SPPEEALMEWLGWQYGKFT 3 Miostatina-Linear- 1138 S PENLLNDLYI LMTKQEWYG 4 Mios tat ina-Linear- 1139 FHWEEGI PFHWTPYSYDRM 5 Mios tat ina-Linear- 1140 KRLLEQFMNDLAELVSGHS 6 Mios tat ina-Linear- 1141 DTRDALFQEFYEFVRSRLVI 7 Nombre de Pepticuerpo SEQ ID Secuencia Peptídica Miostatina-Linear- 1142 RMSAAPRPLTYRDIMDQYWH 8 Miostatina-Linear-9 1143 NDKAHFFEMFMFDVHNFVES Miostatina-Linear-10 1144 QTQAQKIDGLWELLQSIRNQ Miostatina-Linear-11 1145 MLSEFEEFLGNLVHRQEA Miostatina-Linear-12 1146 YTPKMGSEWTSFWHNRMYL Miostatina-Linear-13 1147 LNDTLLRELKMVLNSLSDMK Miostatina-Linear-14 1148 FDVERDLMRWLEGFMQSAAT Miostatina-Linear-15 1149 IMGWNYLRKGSAPQWFEAWV Miostatina-Linear-16 1150 VESLHQLQMWLDQKLASGPH Miostatina-Linear-17 1151 RATLLKDFWQLVEGYGDN Miostatina-Linear-18 1152 EELLREFYRFVSAFDY Miostatina-Linear-19 1153 GLLDEFSHFIAEQFYQMPGG Miostatina-Linear-20 1154 YREMSMLEGLLDVLERLQHY Miostatina-Linear-21 1155 HNISSQMELLSELIMLVGSMMQ Miostatina-Linear-22 1156 WREHFLNSDYIRDKLIAIDG Miostatina-Linear-23 1157 QFPFYVFDDLPAQLEYWIA Mioetatina-Linear-24 1158 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN Miostatina-Linear-25 1159 EALFQNFFRDVLTLSEREY Miostatina-Linear-26 1160 QYWEQQWMTYFRENGLHVQY Miostatina-Linear-27 1161 NQRMMLEDLWRIMTPMFGRS Miostatina-Linear-29 1162 FLDELKAELSRHYALDDLDE Miostatina-Linear-30 1163 GKLIEGLLNELMQLETFMPD Miostatina-Linear-31 1164 ILLLDEYKKDWKSWF Nombre de Pepticuerpo SEQ ID Secuencia Peptídica QGHCTRWPWMCPPYGSGSATGGSGST Miostatina-2xTN8-19 c 1165 ASSGSGSATG QGHCTRWPWMCPPY WYPCYEGHFWCYDLGSGSTASSGSGS Miostatina-2xTN8-con6 1166 ATGWYPCYEG HFWCYDL HTPCPWFAPLCVEWGSGSATGGSGST Miostatina-2xTN8-5 kc 1167 ASSGSGSATGH TPCPWFAPLCVEW PDWCIDPDWWCKFWGSGSATGGSGST Miostatina-2xTN8-18 kc 1168 ASSGSGSATG PDWCIDPDWWCKFW ANWCVSPNWFCMVMGSGSATGGSGST Miostatina-2xTN8-ll kc 1169 ASSGSGSAT GANWCVSPNWFCMVM PDWCIDPDWWCKFWGSGSATGGSGST Miostatina-2xTN8-25 kc 1170 ASSGSGSATG PDWCIDPDWWCKFW HWACGYWPWSCKWVGSGSATGGSGST Miostatina-2xTN8-23 kc 1171 ASSGSGSAT GHWACGYWPWSCKWV KKHCQIWTWMCAPKGSGSATGGSGST Miostatina-TN8-29-19 kc 1172 ASSGSGSATG QGHCTRWPWMCPPY QGHCTRWPWMCPPYGSGSATGGSGST Miostatina-TN8-19-29 kc 1173 ASSGSGSATG KKHCQIWTWMCAPK KKHCQIWTWMCAPKGSGSATGGSGST Miostatina-TN8-29-19 kn 1174 ASSGSGSATG QGHCTRWPWMCPPY KKHCQIWTWMCAPKGGGGGGGGQGHC Miostatina-TN8-29-19-8g 1175 TRWPWMCP PY Miostatina-TN8-19-29-6gc 1176 QGHCTRWPWMCPPYGGGGGGKKHCQI WTWMCAPK Tabla 22 Péptidos Inhibidores de Miostatina Tabla 23 Péptidos Inhibidores de Miostatina Tabla 24 Péptidos Inhibidores de Miostatina Tabla 25 Secuencias peptídicas anta onistas de inte rina Secuencia/estructura SEQ ID NO: RGDLAALSAPPV 1386 Tabla 26 Secuencias pe tídicas anta onistas de selectina Tabla 27 Pé tidos de unión a vinculina Tabla 28 Secuencias peptídicas relacionadas a laminina Tabla 29 Péptidos de Modulación de NGF SEQ ID Secuencia de Porción Peptídica del Producto de NO: Fusión Fc-Péptido 1455 SFDCDNPWGHKLQSCFGF Tabla 30 Péptidos Moduladores de TALL Tabla 31 Pepticuerpos inhibidores de TALL-1 Pepticuerpos PeptiSecuencia peptídica cuerpos SEQ ID NO TALL-l-8-l-a 1468 MPGTCFPFPW ECTHAGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK Pepticuerpos PeptiSecuencia peptídica cuerpos SEQ ID NO TALL-l-8-2-a 1469 MWGACWPFPW ECFKEGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK TALL-l-8-4-a 1470 MVPFCDLLTK HCFEAGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK Pepticuerpos PeptiSecuencia peptídica cuerpos SEQ ID NO TALL-1-12-5- 1473 MSADCYFDIL TKSDVCTSSG GGGG VDKTHT a CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK TALL-1-12-8- 1 1474 MSDDCMYDQL TRMFICSNLG GGGGVDKTHT a CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK Pepti.cuerpos Pepti- Secuencia peptídica cuerpos SEQ ID NO TÁLL--1-12-9- 1475 MDLNCKYDEL TYKEWCQFNG GGGGVDKTHT a CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK TALL--1-12- 1476 MFHDCKYDLL TRQMVCHGLG GGGGVDKTHT -a CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK Pepticuerpos PeptiSecuencia peptídica cuerpos SEQ ID NO TALL-1-12- 1477 MRNHCFWDHL LKQDICPSPG GGGGVDKTHT 11-a CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK TÁLL-1-12- 1478 MANQCWWDSL TKKNVCEFFG GGGGVDKTHT 14-a CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK Pepticuerpos PeptiSecuencia peptídica cuerpos SEQ ID NO TALL-1- 1479 MFIIDCKWDLL TKQWVCHGLG GGGGVDKTHT consenso CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP 3K TALL-1 12-3 1480 MLPGCKWDLL IKQWVCDPLG SGSATGGSGS dímero en TASSGSGSATHMLPGCKWDL LIKQWVCDPL tándem GGGGGVDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYR S VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK Pepticuerpos PeptiSecuencia peptídica cuerpos SEQ ID NO TALL-1 1481 MFHDCKWDLL TKQWVCHGLG SGSATGGSGS consenso TASSGSGSAT BMFEIDCKWDL LTKQWVCHGL dímero en GGGGGVDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP tándem PKPKDTLMIS RTPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV BNAKTICPREE QYNSTYR S VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK Tabla 32 Péptidos Inhibidores de ANG-2 Tabla 33 Péptidos Inhibidores de ANG-2 Tabla 34 Péptidos Inhibidores de ANG-2 Tabla 35 Péptidos Inhibidores de ANG-2 Tabla 36 Péptidos de Unión a Ang-2 Tabla 37 Péptidos de Unión a Ang-2 Tabla 38 Péptidos de Unión a Ang-2 Además de los compuestos de TMP expuestos en la Tabla 6, la invención proporciona numerosos compuestos de TMP diferentes. En un aspecto, los compuestos de TMP comprenden la siguiente estructura general: donde TMP1 y TMP2 son cada uno seleccionados independientemente del grupo de compuestos que comprenden la estructura de núcleo: X2-X3-X4-X5-X6-X7-Xß-X9-X10, donde X2 se selecciona del grupo que consiste de 31u , Asp, Lys, y Val; X3 se selecciona del grupo que consiste de Gly y Ala; X4 es Pro; ?5 se selecciona del grupo que consiste de Thr y Ser X6 se selecciona del grupo que consiste de Leu, lie, Val, Ala, y Phe; X7 se selecciona del grupo que consiste de Arg y Lys; X8 se selecciona del grupo que consiste de Gln, Asn, y Glu; X9 se selecciona del grupo que consiste de Trp, Tyr, y Phe; X10 se selecciona del grupo que consiste de Leu, lie, Val, Ala, Phe, Met, y Lys; h1 es un ligador como se describe en la presente; y n es 0 o 1; y sales fisiológicamente aceptables de los mismos. En una modalidad, h1 comprende (Gly)n, en donde n es de 1 hasta 20, y cuando n es mayor que 1, hasta la mitad de los residuos de Gly pueden estar sustituidos por otro aminoácido seleccionado de los restantes 19 aminoácidos naturales o un estereoisómero de los mismos. Además de la estructura núcleo X2~x?o expuesta anteriormente para TMPj y TMP2, también son posibles otras estructuras relacionadas, en donde uno o más de los siguientes se adiciona a la estructura núcleo de TMPj y/o TMP2: Xx se une al N-término y/o Xu, X12, X13, y/o X14 se unen a C-término, en donde Xn, X12, X13 y X14 son como sigue: X1 se selecciona del grupo que consiste de lie, Ala, Val, Leu, Ser, y Arg; Xn se selecciona del grupo que consiste de Ala, lie, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His, y Glu; X12 se selecciona del grupo que consiste de Ala, lie, Val, Leu, Phe, Gly, Ser, y Gln; X13 se selecciona del grupo que consiste de Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln, y Gly; y X14 se selecciona del grupo que consiste de Ala, lie, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu, y Gly. Los compuestos de TMP de la invención están constituidos de, es decir, que comprende, al menos 9 subunidades (X2-X10) , en donde X2-X10 comprende la estructura de núcleo. Las subunidades X2"x?. son aminoácidos independientemente seleccionados de entre los 20 aminoácidos que se presentan de forma natural, sin embargo, la invención abarca compuestos donde ?2~x?4 se seleccionan independientemente a partir del grupo de aminoácidos atípicos que no se presentan en forma natural bien conocidos en la técnica. Se identifican para cada posición aminoácidos específicos. Por ejemplo, X2 puede ser Glu, Asp, Lys, o Val. Ambas abreviaciones de tres letras y de una letra para los aminoácidos se usan en la presente; en cada caso, las abreviaciones son las normales usadas para los 20 aminoácidos que se presentan de manera natural o variaciones de los mismos. Estos aminoácidos pueden tener ya sea la estereoquímica L o D (excepto para Gly, que no es L ni D) , y los TMP (así como todos los otros compuestos de la invención) pueden comprender una combinación de estereoquímicas. La invención también proporciona moléculas de TMP inversas (así como para todos los otros péptidos descritos en la presente) en donde la secuencia aminoterminal a carboxi-terminal de los aminoácidos está invertida. Por ejemplo, la inversión de una molécula que tiene la secuencia normal X1-X2-X3 será X3-X2-X1. La invención también proporciona moléculas de TMP retro-inversas (así como para todas las otras moléculas de la invención descrita en la presente) en donde, igual que TMP inverso, está invertida la secuencia amino-terminal a carboxi-terminal de aminoácidos y los residuos que normalmente son enantiómeros "L" en TMP se alteran a la forma de estereoisómero "D" . Los compuestos de TMP de ejemplo de la invención por lo tanto incluyen sin limitación los siguientes compuestos . ffiGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 993) ffiGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cíclico) | | (SEQ. ID NO: 994) EGPTl.-RQCI^ARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAA.RA (lineal) (SEQ. ID NO: 995) IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ. ID NO: 996) EGPTL.RQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQ LAARA (SEQ. ID NO: 997) ffiGPTLRQWLAARA-GGGK(BrAc)GGGG-ffiGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 998) ffiGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-ffiGPTIJIQWLAARA (SEQ. ID NO: 999) EGPTIJiQWLAARA-GGGK(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 1000) ffiGPTL_RQWLAARA-GGGC(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 1001) ffiGPTU^QWLAARA-GGGNGSGG-ffiGPTIJtQWIAARA (SEQ. ID NO: 1002) ffiGPTLRQ\\O \ RA-GGGCGGGG-ffiGPTUlQ LAARA I IffiGPTI lQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTI lQWLAARA (SEQ. ID NO: 1003) ffiGPTIJlQ I^ ARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 1004) Fc-ffiGPTLRQWlAARA-GPNG-IEGPTIJIQWLAARA (SEQ. ID NO: 1005) Fc- GFTLRQWI ARA-GPNG-IEGPTIJlQWLAARA-Fc (SEQ. ID NO: 1006) ffiGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-EGPTIJIQWLAARA-Fc (SEQ. ID NO: 1007) Fc-GG-ffiGPTDlQWI ARA-GPNG-ffiGPTI.RQWLAARA (SEQ. ID NO: 1008) Fc-ffiGPTI RQ?VLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 1009) Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cíclico) | | (SEQ. ID NO: 1010) Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (lineal ) (SEQ. ID NO: 1011) Fc-IEGPTLRQA AARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ. ID NO: 1012) Fc-ffiGPTI ^QWLAAllA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 1013) Fc-ffiGPTlJlQWI ^RA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 1014) Fc-IEGPT QWIAARA-GGGNGSGG-IEGPTXRQWLAARA (SEQ. ID NO: 1015) Fc-ffiGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-rEGPT RQWLAARA Fc-EGFTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 1016) Fc-GGGGG-IEGPTIJtQWI ARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWIAARA (SEQ. ID NO: 1017) La presente invención también es particularmente útil con péptidos que tienen actividad en el tratamiento de: - cáncer, en donde el péptido es un VEGF-mimético o un antagonista de receptor de VEGF, un agonista o antagonista de HER2 , un antagonista de CD20 y similar; - asma, en donde la proteína de interés es un antagonista de CKR3, un antagonista de receptor de IL-5, y similar; - trombosis, en donde la proteína de interés es un antagonista de GPIIb, un antagonista de GPIIIa, y similares; enfermedades autoinmunitarias y otras condiciones que comprenden inmuno-modulación, en donde la proteína de interés es un antagonista de receptor de IL-2, un agonista o antagonista de CD40, un agonista o antagonista de CD40L, un imitador de timopoyetina y similares. Derivados . La invención también contempla derivatizar el péptido y/o porción de vehículo (como se analiza más adelante) de los compuestos. Estos derivados pueden comprender la solubilidad, absorción, vida media biológica y similar de los compuestos. Las porciones pueden eliminar o atenuar alternativamente cualquier efecto secundario deseable de los compuestos y similar. Los derivados de ejemplo incluyen compuestos en los cuales: 1. El compuesto o alguna porción del mismo es cíclico. Por ejemplo, la porción de péptido se puede modificar para que contenga dos o más residuos de Cys (por ejemplo, en el ligador) , que pueden ciclizarse por formación de enlace de disulfuro. Para citas a referencias en la preparación de derivados ciclizados, ver Tabla 2. 2. El compuesto se retícula o se vuelve capaz de reticulación entre moléculas. Por ejemplo, la porción de péptido se puede modificar para que contenga un residuo Cys y de este modo sea capaz de formar un enlace de disulfuro intermolecular con una molécula similar. El compuesto también se puede reticular a través de sus C-términos, como en la molécula mostrada a continuación. 3. Uno o más enlaces (uniones) de peptidilo [-C(0)NR-] se reemplazan por un enlace no de peptidilo. Los enlaces no de peptidilo de ejemplo son -CH2-carbamato [-CH2-OC(0)NR-], fosfonato, -CH2-sulfonamida [-CH2-S (0) 2NR-] , urea [-NHC(0)NH-] , -CH2-amina secundaria, y péptido alquilado [-C(0)NR6- en donde R6 es alquilo inferior]. 4. El N-término se derivativa. Típicamente, el N-término se puede acilar o modificar a una amina sustituida. Los grupos derivados N-terminales de ejemplo incluyen -NRRl (diferente de -NH2) , NRC(0)R1, -NRC(0)0R1, -NRS(0)2Rl, -NHC(0)NHR1, succinimida, o benciloxicarbonil-NH- (CBZ-NH-) , en donde R y Rl son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo inferior y en donde el anillo de fenilo puede estar sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de C1-C4 alquilo, C1-C4 alcoxi, cloro y bromo. 5. El C-término libre se derivativa. Típicamente, el C-término se esterifica o amida. Por ejemplo, se pueden usar métodos descritos en la técnica para adicionar (NH-CH2-CH2-NH2)2 a los compuestos de la invención. Igualmente, se pueden usar métodos descritos en la técnica para adicionar -NH2 a los compuestos de esta invención. Los grupos derivados C-terminales de ejemplo incluyen, por ejemplo, -C(0)R2 en donde R2 es alcoxi inferior o -NR3R4, en donde R3 y R4 son independientemente hidrógeno o C1-C8 alquilo (de manera preferente C1-C4 alquilo) . 6. Se reemplaza un enlace de disulfuro con otra porción de reticulación, preferentemente más estable, (por ejemplo, un alquileno). Ver, por ejemplo, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9. 7. Se modifican uno o más residuos de aminoácido individuales . Se conoce que varios agentes de derivatización reaccionan específicamente con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados, como se describe en detalle más adelante. Los residuos de lisinilo y residuos a ino-terminales se pueden hacer reaccionar con anhídridos de ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico, que invierte la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tal como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y reacción catalizada con transaminasa con glioxilato. Se pueden modificar los residuos de arginilo por reacción con cualquiera o combinación de varios reactivos convencionales, incluyendo fenilglioxal, 2, 3-butanodiona, 1, 2-ciciohexanodiona, y ninhidrina. La derivatización de los residuos de arginilo requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido a la alta pKa del grupo funcional de guanidina. Adicionalmente, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como el grupo de epsilon-amino de arginina. La modificación específica de los residuos de tirosilo se ha estudiado de forma extensiva con interés particular al introducir masas espectrales en los residuos de tirosilo por reacción con compuestos de diazonio aromático o tetranitrometano. Más comúnmente, se usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de 0-acetil-tirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los grupos de cadena lateral de carboxilo (aspartilo o glutamilo) se pueden modificar selectivamente por reacción con carbodiimidas (F' -N=C=N-R' ) tal como 1-ciclohexil-3- (2-morfolinil- (4-etil) carbodiimida o l-etil-3- (4-azonia-4, 4-dimetilfenil) carbodiimida. Adicionalmente, se pueden convertir residuos de aspartilo y glutamilo a residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se pueden desaminar a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo. De manera alternativa, estos residuos se desaminan bajo condiciones moderadamente acidas. Cualquier forma de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención.
Los residuos de cisteinilo se pueden reemplazar por residuos de aminoácido u otras porciones ya sea para eliminar el enlace de disulfuro, o por el contrario, para estabilizar la reticulación. Ver, por ejemplo, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9. La derivatización con agentes bifuncionales es útil para la reticulación de los péptidos o sus derivados funcionales a una matriz de soporte insoluble en agua o a otros vehículos macromoleculares . Los agentes de reticulación comúnmente usados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehido, esteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, esteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo esteres de disuccinimidilo tal como 3 , 3 ' -ditiobis (succinimidilpropionato) , y maleimidas bifuncionales tal como bis-N-maleimido-1, 8-octano. Los agentes de derivatización tal como metil-3- [ (p-azidofenil) ditio]propioimidato producen compuestos intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones con la presencia de luz. De manera alternativa, se emplean para inmovilización de proteínas las matrices reactivas insolubles en agua tal como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes de los Estados Unidos números 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; y 4,330,440. Los grupos de carbohidrato (oligosacárido) se pueden unir de manera conveniente a sitios que se conoce que son sitios de glicosilación en proteínas. En general, los oligosacáridos O-enlazados se unen a los residuos de serina (Ser) o treonina (Thr) en tanto que los oligosacáridos N-enlazados se unen a los residuos de asparagina (Asn) cuando son parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es de manera preferente uno de los 19 aminoácidos que se presentan de forma natural diferente de prolina. Las estructuras de los oligosacáridos N-enlazado y O-enlazados y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos es ácido N-acetilneuramínico (referido como ácido siálico) . El ácido siálico usualmente es el residuo terminal tanto de los oligosacáridos N-enlazados y O-enlazados y, en virtud de su carga negativa, puede conferir propiedades acidas al compuesto glicosilado. Estos sitios se pueden incorporar en el ligador de los compuestos de esta invención y de manera preferente están glicosilados por una célula durante la producción recombinante de los compuestos de polipéptido (por ejemplo, en células de mamífero tal como CHO, BHK, COS) . Sin embargo, estos sitios se pueden glicosilar adicionalmente por procedimientos sintéticos o semisintéticos conocidos en la técnica. Otras modificaciones posibles incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, oxidación de átomo de azufre Cys, metilación de los grupos alfa-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), págs. 79-86 (1993). Los compuestos de la presente invención se pueden cambiar al nivel de ADN, también. La secuencia de ADN de cualquier porción del compuesto se puede cambiar a codones más compatibles con la célula hospedadora elegida. Para E. coli, que es la célula hospedadora preferida, se conocen en la técnica los codones optimizados. Los codones se pueden sustituir para eliminar sitios de restricción o para incluir sitios de restricción imperceptibles, que pueden ayudar en el procesamiento del ADN en la célula hospedadora seleccionada. El vehículo, ligador y secuencias de ADN peptídicas se pueden modificar para incluir cualquiera de los anteriores cambios de secuencia. Derivados conjugados en isotipo y toxina. Otro conjunto de derivados útiles son las moléculas descritas anteriormente conjugadas a toxinas, trazadores o radioisótopos. Esta conjugación es especialmente útil para moléculas que comprenden secuencias peptídicas que se unen a tumores sólidos o patógenos. Estas moléculas se pueden usar como agentes terapéuticos o como una ayuda para cirugía (por ejemplo, cirugía radioinmunoguiada o RIGS) o como agentes de diagnóstico (por ejemplo, radioinmunodiagnóstico o RID) . Como agentes terapéuticos, estos derivados conjugados poseen varias ventajas. Facilitan el uso de toxinas y radioisótopos que serán tóxicos si se administran sin la unión específica proporcionada por la secuencia peptídica. También pueden reducir los efectos secundarios que concurren al uso de radiación y quimioterapia al facilitar menores dosis efectivas del compañero de conjugación. Los compañeros de conjugación útiles incluyen: radioisótopos, tal como 90Ytrio, 13lYodo, 225Actinio, y 213Bismuto; toxina de ricina A, toximas microbianamente derivadas tal como endotoxina de Pseudomonas (por ejemplo, PE38, PE40) , y similares; - moléculas compañeras en sistemas de captura (ver posteriormente) ; biotina, estreptavidina (útil como ya sea moléculas compañeras en sistemas de captura o como trazadores, especialmente para uso de diagnóstico); y agentes citotóxicos (por ejemplo, doxorrubicina) .
Otra adaptación útil de estos derivados conjugados es el uso en un sistema de captura. En este sistema, la molécula de la presente invención comprenderá una molécula benigna de captura. Esta molécula de captura será capaz de unirse específicamente a una molécula efectora separada que comprende, por ejemplo, una toxina o radioisótopo. Tanto la molécula conjugada a vehículo como la molécula efectora se administrarán al paciente. En este sistema, la molécula efectora tendrá una vida media corta excepto cuando se una a la molécula de captura conjugada a vehículo, reduciendo de este modo cualquier efecto secundario tóxico. La molécula conjugada a vehículo tendrá una vida media relativamente prolongada pero será benigna y no tóxica. Las porciones de unión específica de ambas moléculas pueden ser parte de un par conocido de unión específica (por ejemplo, biotina, estreptavidina) o pueden resultar de métodos de generación de péptidos tal como aquellos descritos en la presente. Estos derivados conjugados se pueden preparar por métodos conocidos en la técnica. En el caso de moléculas efectoras de proteína (por ejemplo, endotoxina de Pseudomonas; estas moléculas se pueden expresar como proteínas de fusión a partir de construcciones de ADN correlativas. Los derivados conjugados de radioisótopo se pueden preparar, por ejemplo, como se describe por el anticuerpo BEXA (Coulter) . Derivados que comprenden agentes citotóxicos o toxinas microbianas se pueden preparar, por ejemplo, como se describe para el anticuerpo BR96 (Bristol-Myers Squibb) . Moléculas empleadas en sistemas de captura se pueden preparar, por ejemplo, como se describe por las patentes, solicitudes de patente, y publicaciones de NeoRx. Se pueden preparar moléculas empleadas para RIGS y RID, por ejemplo, por las patentes, solicitudes de patente, y publicaciones de NeoProbe. Vehículos . La invención requiere la presencia de al menos un vehículo unido a un péptido a través del N-término, C-término o una cadena lateral de uno de los residuos de aminoácido. También se pueden usar múltiples vehículos. En un aspecto, un dominio Fe es el vehículo. El dominio Fe puede estar fusionado al N- o C-término de los péptidos o a tanto el N- como el C-término. En varias modalidades de la invención, el componente Fe es ya sea un Fe nativo o una variante de Fe. La fuente de inmunoglobulina del Fe nativo es, en un aspecto, de origen humano y puede, en modalidades alternativas, ser de cualquier clase de inmunoglobulina. Los dominios Fe nativos están constituidos de polipéptidos monoméricos que se pueden enlazar a las formas diméricas o multiméricas por asociación covalente (es decir, enlaces de disulfuro) y/o no covalente. El número de enlaces de disulfuro intermoleculares entre las subunidades monoméricas de las moléculas Fe nativo varía de uno a cuatro dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgE) o subclases (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 , IgAl, IgGA2) . Un ejemplo de un Fe nativo es un dímero unido a disulfuro que resulta de la digestión con papaína de una IgG (ver Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). Se debe señalar que los monómeros de Fe se dimerizarán espontáneamente cuando estén presentes los residuos apropiados de cisteína, a menos que estén presentes condiciones particulares que impidan la dimerización a través de la formación de enlaces de disulfuro. Aún si los residuos de cisteína que normalmente forman enlaces de disulfuro en el dímero Fe se remueven o reemplazan por otros residuos, las cadenas monoméricas formarán en general un dímero a través de interacciones no covalentes. El término "Fe" se usa en la presente para querer decir cualquiera de estas formas: el monómero nativo, el dímero nativo (enlazado por enlace de disulfuro) , dímeros modificados (enlazados por disulfuro y/o de forma no covalente) , y monómeros modificados (por ejemplo, derivatizados) . Como se señala, las variantes de Fe son vehículos adecuados dentro del alcance de esta invención. Un Fe nativo se puede modificar extensivamente para formar una variante de Fe, con la condición que se mantenga la unión al receptor de salvamento; ver, por ejemplo, WO 97/34631 y WO 96/32478.
En estas variantes de Fe, se pueden remover uno o más sitios de un Fe nativo que proporcionen características estructurales o actividad funcional no requerida por las moléculas de fusión de esta invención. Se pueden remover estos sitios por ejemplo al sustituir o suprimir residuos, al insertar residuos en el sitio, o porciones de truncamiento que contengan el sitio. Los residuos insertados o sustituidos también pueden ser aminoácidos alterados, tal como peptidomiméticos o D-aminoácidos. Las variantes de Fe pueden ser deseables por varias razones, varias de las cuales se describen más adelante. Las variantes de Fe de ejemplo incluyen moléculas y secuencias en las cuales : 1. Se remueven los sitios comprendidos en la formación de enlace de disulfuro. Esta remoción puede evitar la reacción con otras proteínas que contienen cisteína presentes en la célula hospedadora usada para producir las moléculas de la invención. Para este propósito, el segmento que contiene cisteína en el N-término se puede truncar o se pueden suprimir o sustituir residuos de cisteína con otros aminoácidos (por ejemplo, alanilo, servilo) . Aún cuando se remuevan los residuos de cisteína, los dominios Fe de cadena individual pueden formar aún un dominio Fe dimérico que se mantengan conjuntamente de forma no covalente. 2. Un Fe nativo se modifica para hacerlo más compatible con una célula hospedadora seleccionada. Por ejemplo, se puede remover la secuencia PA cerca del N-término de un Fe nativo típico, que se puede reconocer por una enzima digestiva en E. coli tal como prolina-iminopeptidasa. También se puede adicionar un residuo de metionina N-terminal, especialmente cuando la molécula se expresa de manera recombinante en una célula bacteriana tal como E. coli. 3. Una porción del N-término de un Fe nativo se remueve para prevenir la heterogeneidad N-terminal cuando se expresa en una célula hospedadora seleccionada. Para este propósito, se puede suprimir cualquiera de los primeros 20 residuos de aminoácido en el N-término, particularmente aquellos en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5. 4. Se remueven uno o más sitios de glicosilación. Los residuos que típicamente se glicolizan (por ejemplo, asparagina) pueden conferir respuesta citolítica. Estos residuos se pueden suprimir o sustituir con residuos no glicosilados (por ejemplo, alanina) . 5. Sitios comprendidos en la interacción con el complemento, tal como el sitio de unión de Ciq, se remueven. Por ejemplo, se puede suprimir o sustituir la secuencia de EKK de igGl humana. El reclutamiento de complemento no puede ser ventajoso para las moléculas de esta invención y de este modo se puede evitar con esta variante de Fe. 6. Se remueven sitios que afectan la unión a los receptores Fe diferentes de un receptor de salvamento. Un Fe nativo puede tener sitios para interacción con ciertas células sanguíneas blancas que no se requieren para las moléculas de fusión de la presente invención y de este modo se pueden remover. 7. Se remueve el sitio ADCC. Los sitios ADCC se conocen en la técnica; ver, por ejemplo, Molec. Immunol . 29 (5): 633-9 (1992) con respecto a los sitios ADCC en IgGl . Estos sitios, también, no se requieren para las moléculas de fusión de la presente invención y de este modo se pueden remover . 8. Cuando el Fe nativo se deriva de un anticuerpo no humano, el Fe nativo se puede humanizar. Típicamente, para humanizar un Fe nativo, se sustituirán los residuos seleccionados en el Fe nativo no humano con residuos que normalmente se encuentran en un Fe nativo humano. Son bien conocidas las técnicas para humanización de anticuerpo. Un vehículo alternativo será una proteína, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o molécula pequeña (por ejemplo, un compuesto peptidomimético) capaz de la unión a un receptor de salvamento. Por ejemplo, se puede usar como un vehículo un polipéptido como se describe en la patente de los Estados Unidos número 5,739,277, emitida el 14 de abril de 1998 de Presta et al. Los péptidos también se pueden seleccionar por exhibición en fago para la unión al receptor de salvamente FcRn. Estos compuestos de unión a receptores de salvamento también se incluyen dentro del significado de "vehículo" y están dentro del alcance de esta invención. Estos vehículos se deben seleccionar para vida media incrementada (por ejemplo, al evitar secuencias reconocidas por proteasas) e inmunogenicidad disminuida (por ejemplo, al favorecer secuencias no inmunogénicas, como se describe en la humanización de anticuerpos) . Las variantes, análogos o derivados de la porción Fe se pueden construir por ejemplo al hacer varias sustituciones de residuos o secuencias. Los polipéptidos variantes (o análogos) incluyen variantes de inserción, en donde uno o más residuos de aminoácido complementan una secuencia de aminoácidos Fe. Las inserciones se pueden localizar en ya sea o ambos términos de la proteína, o se pueden colocar dentro de regiones internas de la secuencia de aminoácidos de Fe. Las variantes de inserción, con residuos adicionales en ya sea o ambos términos, pueden incluir por ejemplo, proteínas de fusión y proteínas que incluyen marcas o marbetes de aminoácido. Por ejemplo, la molécula de Fe puede contener opcionalmente un Met N-terminal, especialmente cuando la molécula se expresa de manera recombinante en una célula bacteriana tal como E. coli. En variantes de supresión de Fe, se remueven uno o más residuos de aminoácido en un polipéptido Fe. Las supresiones se pueden efectuar en uno o ambos términos del polipéptido de Fe, o con la remoción de uno o más residuos dentro de la secuencia de aminoácidos de Fe. Por lo tanto, las variantes de supresión incluyen todos los fragmentos de una secuencia de polipéptidos de Fe. En variantes de sustitución de Fe, se remueven uno o más residuos de aminoácido del polipéptido de Fe y se reemplazan con residuos alternativos. En un aspecto, las sustituciones son de naturaleza conservadora y las sustituciones conservadoras de este tipo también se conocen en la técnica. De manera alternativa, la invención abarca sustituciones que también no son conservadoras. Por ejemplo, los residuos de cisteína se pueden suprimir o reemplazar con otros aminoácidos para prevenir la formación de algunas o todas las reticulaciones de disulfuro de las secuencias de Fe. Cada residuo de cisteína se puede remover y/o sustituir con otros aminoácidos, tal como Ala o Ser. Como otro ejemplo, también se pueden hacer modificaciones para introducir sustituciones de aminoácidos para (1) extraer el sitio de unión a receptor Fe; (2) extraer el sitio de unión a complemento (Ciq); y/o para (3) extraer el sitio de citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) . Estos sitios se conocen en la técnica, y cualquier sustitución conocida está dentro del alcance de Fe como se usa en la presente. Por ejemplo ver Molecular Immunology, Vol. 29, No. 5, 633-639 (1992) con respecto a los sitios ADCC en igGl . Igualmente, se pueden reemplazar uno o más residuos de tirosina por residuos de fenilalanina. Además, también se contemplan otras inserciones, supresiones y/o sustituciones de aminoácidos variantes y están dentro del alcance de la presente invención. En general se preferirán sustituciones conservadoras de aminoácidos. Adicionalmente, las alteraciones pueden estar en la forma de aminoácidos alterados, tal como peptidomiméticos o D-aminoácidos. Las secuencias de Fe del compuesto también se pueden derivatizar como se describe en la presente para péptidos, es decir, que tienen modificaciones diferentes de inserción, supresión o sustitución de residuos de aminoácido. De manera preferente, las modificaciones son de naturaleza covalente, e incluyen por ejemplo, unión química con polímeros, lípidos, otras porciones orgánicas e inorgánicas. Los derivatizados de la invención se pueden preparar para incrementar vida media en circulación, o se pueden diseñar para mejorar la capacidad de selección de objetivo para el polipéptido a células, tejidos u órganos deseados . También es posible usar el dominio de unión a receptor de salvamento de la molécula intacta de Fe como la parte de Fe de un compuesto de la invención, tal como se describe en WO 96/32478, titulada "Polipéptidos Alterados con Vida Media Incrementada" . Los miembros adicionales de la clase de moléculas designadas como Fe son aquellos que se describen en la WO 97/34631, titulada "Dominios Tipo Inmunoglobulina con Vidas Medias Incrementadas". Ambas de las solicitudes PCT publicadas, citadas en este párrafo, se incorporan de este modo como referencia. Componentes de WSP. Los compuestos de la invención incluyen además al menos un WSP. La porción de WSP de la molécula se puede ramificar o no ramificar. Para uso terapéutico de la preparación del producto final, el polímero es farmacéuticamente aceptable. En general, se selecciona un polímero deseado en base a consideraciones tal como si el conjugado de polímero se usará de manera terapéutica, y si es así, la dosis deseada, tiempo de circulación, resistencia a proteólisis, y otras consideraciones. En varios aspectos, el peso molecular promedio de cada polímero soluble en agua está entre 2 kDa y aproximadamente 100 kDa, entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa, entre aproximadamente 12 kDa y aproximadamente 40 kDa y entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 35 kDa. En aún otro aspecto, el peso molecular de cada polímero está entre aproximadamente 6 kDa y aproximadamente 25 kDa. El término "aproximadamente" como se usa en la presente y a todo lo largo, indica que en las preparaciones de un polímero soluble en agua, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular señalado. En general, entre mayor sea el peso molecular o haya más ramificaciones, mayor será la relación de polímero/proteína. Se pueden usar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado incluyendo, por ejemplo, la duración de la liberación sostenida; los efectos, si los hay, en la actividad biológica; la facilidad de manejo; el grado o carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos de un polímero soluble en agua en una proteína terapéutica. El WSP se debe unir a un péptido o proteína con consideración dada a los efectos en dominios funcionales o antigénicos del péptido o proteína. En general, se pueden realizar la derivatización química bajo cualquier condición adecuada usada para hacer reaccionar una proteína con una molécula de polímero activada. Los grupos de activación que se pueden usar para enlazar el polímero soluble en agua a una o más proteínas incluyen sin limitación sulfona, maleimida, sulfhidrilo, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano y 5-piridilo. Si se une al péptido por alquilación reductiva, el polímero seleccionado debe tener un aldehido reactivo individual de modo que se controle el grado de polimerización. Los polímeros solubles en agua, adecuados, clínicamente aceptables incluyen sin limitación, PEG, polietilenglicol-propionaldehído, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, monometoxi-polietilenglicol, carboximetilcelulosa, poliacetales, alcohol polivinílico (PVA), polivinil-pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3 , 6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poli (beta-aminoácidos) (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios), poli (n-vinil-pirrolidona) , polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol (PPG) y otros óxidos de polialquileno, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (POG) (por ejemplo, glicerol) y otros polioles polioxietilados, sorbitol polioxietilado, o glucosa polioxietilada, ácidos colónicos u otros polímeros de carbohidrato, Ficoll o dextrano y mezclas de los mismos . Los polímeros de polisacárido son otro tipo de polímero soluble en agua que se pueden usar para modificación de proteínas. Los dextranos son polímeros de polisacárido comprendidos de subunidades individuales de glucosa predominantemente enlazadas por enlaces de al-6. El dextrano mismo está disponible en muchas variedades de peso molecular, y está fácilmente disponible en pesos moleculares de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 70 kD. El dextrano es un polímero soluble en agua adecuado para el uso en la presente invención como un vehículo por sí mismo o en combinación con otro vehículo (por ejemplo, Fe) . Ver, por ejemplo, WO 96/11953 y WO 96/05309. El uso de dextrano conjugado a inmunoglobulinas terapéuticas o de diagnóstico se ha reportado; ver, por ejemplo, publicación de patente Europea número 0,315,456, que se incorpora de este modo como referencia. El dextrano de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD se prefiere cuando se usa dextrano como un vehículo de acuerdo con la presente invención. En una modalidad, el WSP es PEG y la invención contempla preparaciones en donde se modifica un compuesto para que incluye cualquiera de las formas de PEG que se hayan usado para derivatizar otras proteínas, tal como y sin limitación mono- (C1-C10) alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol . El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la elaboración debido a su estabilidad en agua. El grupo PEG puede ser de cualquier peso molecular conveniente y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio de PEG contemplado para el uso en la invención varía entre aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 10 kDa. En otro aspecto, la porción PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 6 kDa a aproximadamente 25 kDa. En general, los grupos DE PEG se unen a péptidos o proteínas mediante acilación o alquilación reductiva a través de un grupo reactivo en la porción PEG (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, tiol o éster) a un grupo reactivo en el péptido o proteína objetivo (por ejemplo, un grupo aldehido, amino o éster) . Usando los métodos descritos en la presente, se puede preparar una mezcla de moléculas de conjugado de polímero/péptido, y la ventaja proporcionada en la presente es la capacidad para seleccionar la proporción de conjugado de polímero/péptido para incluir en la mezcla. De esta manera, si se desea, se puede preparar una mezcla de péptidos con varios números de porciones de polímero unidas (por ejemplo cero, uno o dos) con una proporción predeterminada de conjugado de polímero/proteína. Una estrategia útil para la PEGilación (se analizan otros métodos en más detalle más adelante) de péptidos sintéticos consiste de combinar, a través de la formación de un enlace de conjugado en solución, un péptido y una porción de PEG, cada uno que tiene una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva entre sí . Los péptidos se pueden preparar fácilmente con síntesis convencional en fase sólida. Los péptidos se "preactivan" con un grupo funcional apropiado en un sitio específico. Los precursores se purifican y caracterizan completamente antes de reaccionar con la porción de PEG. La ligación del péptido con PEG usualmente toma lugar en fase acuosa y se pueden monitorizar fácilmente por HPLC analítica de fase inversa. Los péptidos PEGilados se pueden purificar fácilmente por HPLC preparativa y caracterizar por HPLC analítica, análisis de aminoácidos y espectrometría másica de desorbción de láser. Ligadores. Cualquier grupo "ligador" es opcional, ya sea colocado entre péptidos, péptido y vehículo o vehículo y WSP. Cuando está presente, su estructura química no es crítica, puesto que sirve principalmente como un separador. El ligador está constituido de manera preferente de aminoácidos enlazados conjuntamente con enlaces peptídicos. De esta manera, en modalidades preferidas, el ligador está constituido de 1 a 20 aminoácidos enlazados por enlaces peptídicos, en donde los aminoácidos se seleccionan de los 20 aminoácidos que se presentan de manera natural. Algunos de estos aminoácidos pueden estar glicosilados, como es bien entendido por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad más preferida, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. De manera aún más preferente, un ligador que está constituido de una mayoría de aminoácidos que están estéricamente no impedidos, tal como glicina y alanina. De esta manera, los ligadores preferidos son poliglicinas (particularmente (Gly) 4, (Gly) 5), poli (Gly-Ala) , y polialaninas . Otros ejemplos específicos de ligadores son: (Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO:: 1018); (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 1019); (Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO: 1020); y GlyProAsnGlyGlu (SEQ ID NO: 1021) . Para explicar la nomenclatura anterior, por ejemplo, (Gly) 3Lys (Gly) 4 significa (Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. También se prefieren combinaciones de Gly y Ala. Los ligadores mostrados aquí son de ejemplo; los ligadores dentro del alcance de esta invención pueden ser mucho más largos y pueden incluir otros residuos. También son posibles ligadores no peptídicos. Por ejemplo, se pueden usar ligadores de alquilo tal como -NH- (CH2)s-C(0) -, en donde s = 2-20. Estos ligadores de alquilo se pueden sustituir adicionalmente por cualquier grupo de no impedimento estérico tal como alquilo inferior Ipor ejemplo, C1-C6) , acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br) , CN, NH2, fenilo, etc. Un ligador no peptídico de ejemplo es un ligador de PEG.
En donde n es tal que el ligador tiene un peso molecular de 100 a 5000 kD, de manera preferente 100 a 500 kD. Los ligadores peptídicos se pueden alterar para formar derivados de la misma manera como se describe anteriormente. Producción de péptido. Un péptido que se ha identificado se puede elaborar de células hospedadoras transformadas usando técnicas de ADN recombinante. Si el componente de vehículo es un polipéptido, el producto de fusión de péptido-vehículo se puede expresar como uno. Para hacer esto, una molécula de ADN recombinante que codifica para el péptido se prepara primero usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden escindir secuencias que codifican para los péptidos a partir del ADN usando enzimas de restricción adecuada. De manera alternativa, la molécula de ADN se puede sintetizar usando técnicas de síntesis química, tal como el método de fosforamidato. También, se puede usar una combinación de esta técnica. La invención proporciona por lo tanto polinucleótidos que codifican para un compuesto de la invención. La invención también proporciona vectores que codifican para compuestos de la invención en un hospedador apropiado. El vector comprende el polinucleótido que codifica para el compuesto operativamente enlazado a secuencias de control de expresión apropiadas. Son bien conocidos los métodos para efectuar este enlace operativo, ya sea antes o después que el polinucleótido se inserte en el vector. Las secuencias de control de expresión incluyen promotores, activadores, intensificadores, operadores, sitios de unión ribosomal, señales de inicio, señales de detención, señales de remarque, señales de poliadenilación, y otras señales comprendidas con el control de transcripción o traducción. El vector resultante que tiene el polinucleótido en el mismo se usa para transformar un hospedador apropiado. Esta transformación se puede realizar usando métodos bien conocidos en la técnica. En la práctica de esta invención, se puede usar cualquiera de un gran número de células hospedadoras disponibles y bien conocidas . La selección de un hospedador particular es dependiente de varios factores reconocidos por la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, compatibilidad con el vector de expresión elegido, toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, velocidad de transformación, facilidad de recuperación de los péptidos, características de expresión, bio-seguridad y costos. Un equilibrio de estos factores se debe acuñar con el entendimiento que no todos los hospedadores pueden ser igualmente efectivos para la expresión de una secuencia de ADN particular. Dentro de estas guías generales, los hospedadores microbianos útiles incluyen bacteria (tal como E. coli), levadura (tal como Saccharomyces) y otras células de hongos, insectos, plantas, de mamífero (incluyendo de humano) en cultivo, u otros hospedadores conocidos en la técnica. Entonces, el hospedador transformado se cultiva y purifica. Las células hospedadoras se pueden cultivar bajo condiciones convencionales de fermentación de modo que se expresen los compuestos deseados. Estas condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica. Finalmente, los péptidos se purifican de cultivo por métodos bien conocidos en la técnica. Dependiendo de la célula hospedadora utilizada para expresar un compuesto de la invención, los grupos de carbohidrato (oligosacárido) se pueden unir convenientemente a sitios que se conoce que son sitios de glicosilación en proteínas. En general, los oligosacáridos O-enlazados se unen a residuos de serina (Ser) o treonina (Thr) en tanto que los oligosacáridos N-enlazados se unen a residuos de asparagina (Asn) que son parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es de manera preferente uno de los 19 aminoácidos que se presenta de forma natural, no contando prolina. Las estructuras de los oligosacáridos N-enlazados y O-enlazados y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos de ácido N-acetilneuramínico (referido como ácido siálico) . El ácido siálico usualmente es el residuo terminal de oligosacáridos tanto N-enlazados como 0-enlazados y, en virtud de su carga negativa, puede conferir propiedades acidas al compuesto glicosilado. Estos sitios se pueden incorporar en el ligador de los compuestos de esta invención y de manera preferente se glicosilan por una célula durante la producción recombinante de los compuestos polipeptídicos (por ejemplo, en células de mamífero tal como CHO, BHK, COS) . Sin embargo, estos sitios se pueden glicosilar adicionalmente por procedimientos sintéticos o semisintéticos conocidos en la técnica. De manera alternativa, los compuestos se pueden hacer por métodos sintéticos. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de síntesis en fase sólida. Las técnicas adecuadas son bien conocidas, e incluyen aquellas descritas en Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pág. 335-61 (Katsoyannis y Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am.
Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart y Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; patente de los Estados Unidos número 3,941,763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; y Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527.
La síntesis de fase sólida es la técnica preferida para elaborar péptidos individuales puesto que es el método más efecto en el costo de elaborar péptidos pequeños. Los compuestos que contienen péptidos derivatizados o que contienen grupos no peptídicos son particularmente tratables a la síntesis por técnicas de química orgánica bien conocidas . Modificación de WSP. Para obtener un compuesto unido covalentemente a un WSP, se emplea cualquier método descrito en la presente o conocido de otro modo en la técnica. Los métodos para preparar derivados químicos de polipéptidos comprenderán en general los pasos de (a) hacer reaccionar el polipéptido con la molécula de polímero activada (tal como un derivado de éster o aldehido reactivo de la molécula de polímero) bajo condiciones por las que el polipéptido se llega a unir a una o más moléculas de polímero, y (b) obtener los productos de reacción. Las condiciones de reacción óptimas se determinarán en base a parámetros conocidos y al resultado deseado. Por ejemplo, entre mayor sea la relación de moléculas de polímero: proteína, mayor será el porcentaje de molécula de polímero unida. Una molécula biológicamente activa se puede enlazar a un polímero a través de cualquier grupo funcional disponible usando métodos normales bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de grupos funcionales en ya sea el polímero o molécula biológicamente activa que se pueden usar para formar enlaces incluyen grupos amina y carboxi, grupos tiol tal como en residuos de cisteína, aldehidos y cetonas, y grupos hidroxi como se puede encontrar en residuos de serina, treonina, tirosina, hidroxiprolina e hidroxilisina. El polímero se puede activar al acoplar un grupo reactivo tal como tricloro-s-triazina [Abuchowski, et al. (1977), J. Biol. Chem. 252:3582-3586, incorporado en la presente como referencia en su totalidad] , carbonilimidazol [Beauchamp, et al., (1983), Anal. Biochem. 131:25-33, incorporado en la presente como referencia en su totalidad] , o succinimidil-succinato [Abuchowski et al., (1984), Cáncer Biochem. Biphys . 7:175-186, incorporado en la presente como referencia en su totalidad] a fin de reaccionar con una funcionalidad de amina en la molécula biológicamente activa. Otro método de acoplamiento comprende la formación de un grupo glioxililo en una molécula y un grupo amino-oxi, hidrazida o semi-carbazida en la otra molécula que se va a conjugar [Fields y Dixo, (1968), Biochem. J. 108:883-887 Gaertner, et al., (1992), Bioconjugate Chem. 3:262-268 Geoghegan y Stroh, (1992), Bioconjugate Chem. 3:138-146 Gaertner, et al., (1994), J. Biol. Chem. 269:7224-7230, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad] . Otros métodos comprenden la formación de un éster activo en un grupo de alcohol libre de la primera molécula que se va a conjugar usando cloformiato o disuccinimidilcarbonato, que entonces se puede conjugar a un grupo amina en la otra molécula que se va a acoplar [Veronese, et al., (1985), Biochem. Y Biotech. 11: 141-152; Nitecki, et al., patente de los Estados Unidos número 5,089,261; Nitecki, patente de los Estados Unidos número ,281,698, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad] . Otros grupos reactivos que se pueden unir mediante grupos de alcohol libres se exponen en Wright, EP 0539167A2 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) , que también describe el uso de imidatos para acoplamiento mediante grupos amina libres . Otra química comprende acilación de las aminas primarias de un objetivo usando el NHS-éster de metoxi-PEG (O- [ (N-succinimidiloxicarbonil) -metil] -0' -metilpolietilenglicol) . La acilación con metoxi-PEG-NHS da por resultado un enlace de amida que eliminará la carga de la amina primaria original. Otros métodos utilizan oxidación moderada de un objetivo bajo condiciones seleccionadas para seleccionar como objetivo el diol colgante de la penúltima unidad de glicosilo de ácido siálico para oxidación a un aldehido. El glicoaldehído resultante entonces se hizo reaccionar con un metoxi-PEG-hidrazida (0- (Hidrazinocarbonilmetil) -O' -metilpolietilenglicol) para formar una hidrazona semiestable entre PEG y el objetivo. La hidrazona se reduce de manera subsiguiente por cianoborohidruro de sodio para producir un conjugado de PEG estable. Ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos número 6,586,398 (Kinstler et al . , 1 de julio de 2003), incorporada en la presente como referencia en su totalidad. En aplicaciones específicas de técnicas para modificación química, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos número 4,002,531 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) declara que se usó alquilación reductiva para unión de moléculas de polietilenglicol a una enzima. La patente de los Estados Unidos número 4,179,337 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) describe conjugados de PEG: proteína que comprende, por ejemplo, enzimas e insulina. La patente de los Estados Unidos número 4,904,584 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) describe la modificación del número de residuos de lisina en proteínas para la unión de moléculas de polietilenglicol mediante grupos amina reactivos. La patente de los Estados Unidos número 5,834,594 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) describe conjugados de PEG: proteína solubles en agua, sustancialmente no inmunogénicos, que comprenden por ejemplo, las proteínas IL-2, interferon-alfa, e IL-lra. Los métodos de Hakimi et al., comprenden la utilización de ligadores únicos para conectar los varios grupos amino libres en la proteína a PEG. Las patentes de los Estados Unidos números 5,824,784 y 5,985,265 (cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) enseña métodos que permiten proteínas químicamente modificadas, y selectivamente N-terminales y análogos de las mismas, utilizando G-CSF e interferón de consenso. De manera importante, estas proteínas modificadas tienen ventajas puesto que se refieren a la estabilidad de proteína, así como al proporcionar ventajas de procesamiento . Se usa la modificación de WSP que se describe también en Francis et al., In: Stability of protein pharmaceuticals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Eds. Ahern. , T. y Manning, M. C.) Plenum, N. Y., 1991 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) . En aún otro aspecto, el método descrito en Delgado et al., "Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chloride, Applications In Immunoaffinity Cell Preparation", In: Fisher et al., eds., Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y.N.Y., 1989 págs. 211-213 (incorporada en la presente como referencia en su totalidad) , que comprende el uso de cloruro de tresilo, que no da por resultado grupo de enlace entre la porción de WSP y la porción de polipéptido. En otros aspectos, la unión de un WSP se efectúa a través del uso de esteres de N-hidroxi-succinimidilo de carboximetil-metoxi-polietilenglicol, como bien conocido en la técnica. Para otras descripciones de modificación de un objetivo con un WSP, ver, por ejemplo, solicitud de patente de los Estados Unidos número 20030096400; EP 0 442724A2; EP 0154316; EP 0401384; WO 94/13322; patentes de los Estados Unidos números 5,362,852; 5,089,261; 5,281,698; 6,423,685 6,635,646; 6,433,135; solicitud internacional WO 90/07938 Gaertner y Offord, (1996), Bioconjugate Chem. 7:38-44 Greenwald et al., Crit Rev Therap Drug Carrier Syst. 2000 17:101-161; Kopecek et al., J Controlled Reléase., 74:147-158, 2001; Harris et al., Clin Pharmacokinet. 2001; 40(7): 539-51; Zalipsky et al., Bioconjug Chem. 1997; 8:111-118; Nathan et al., Macromolecules . 1992;25:4476-4484; Nathan et al., Bioconj . Chem. 1993; 4:54-62; y Francis et al., Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992), las descripciones de los cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Alquilación reductiva. En un aspecto, la unión covalente de un WSP se llevó a cabo por procedimientos de modificación química de alquilación reductiva como se proporciona en la presente para modificar selectivamente el grupo a-amino N-terminal, y probar el producto resultante para la característica biológica deseada, tal como los ensayos de actividad biológica proporcionados en la presente. La alquilación reductiva para la unión de un WSP a una proteína o péptido aprovecha la reactividad diferencial de los diferentes tipos de grupos amino primarios (por ejemplo, lisina versus el N-terminal) disponibles para derivatización en una proteína particular. Bajo las condiciones de reacción apropiadas, se logra derivatización sustancialmente selectiva de la proteína en el N-término con un polímero que contiene grupos carbonilo. Para alquilación reductiva, los polímeros seleccionados pueden tener un grupo aldehido reactivo individual. Un aldehido reactivo es, por ejemplo, polietilenglicol-propionaldehído, que es estable en agua, o derivados de mono-Cj-C^ alcoxi o ariloxi de los mismos (ver patente de los Estados Unidos número 5,252,714, incorporada en la presente como referencia en su totalidad) . En un planteamiento, la alquilación reductiva se emplea para conjugar un PEG-aldehído (O- (3-Oxopripil) -O' -metilpolietilenglicol) a una amina primaria. Bajo condiciones apropiadas, este planteamiento se ha demostrado que produce conjugados de PEG predominantemente modificados a través de la a-amina en el N-término de la proteína.
Una funcionalidad de aldehido útil para conjugar la molécula biológicamente activa se puede generar a partir de una funcionalidad que tiene grupos amino y alcoholes adyacentes. En un polipéptido, por ejemplo, una serina, treonina o hidroxilisina N-terminal se puede usar para generar una funcionalidad de aldehido mediante escisión oxidativa bajo condiciones moderadas usando periodato. Estos residuos, o sus equivalentes, pueden estar normalmente presentes, por ejemplo en el N-término de un polipéptido, se pueden exponer mediante digestión química o enzimática, o se pueden introducir mediante métodos recombinantes o químicos . Las condiciones de reacción para generar el aldehido comprende típicamente la adición de un exceso molar de meta-periodato de sodio y bajo condiciones moderadas para evitar la oxidación a otras posiciones en la proteína. El pH es de manera preferente cerca de 7.0. Una reacción típica comprende la adición de un exceso molar de 1.5 veces de meta-periodato de sodio, seguido por incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. El grupo funcional de aldehido se puede acoplar a un polímero activado que contiene una funcionalidad de hidracida o semicarbazida para formar un enlace de hidrazona o semicarbazona. Los polímeros que contienen hidracida están comercialmente disponibles, y se pueden sintetizar, si es necesario, usando técnicas normales. Las PEG-hidrazidas para el uso en la invención se pueden obtener a partir de Shearwater Polymers, Inc., 2307 Spring Branch Road, Huntsville, Ala. 35801 (ahora parte de Néktar Therapeutics, 150 Industrial Road, San Carlos, CA 94070-6256) . El aldehido se acopla al polímero al mezclar la solución de los dos componentes de forma conjunta y al calentar a aproximadamente 37°C hasta que la reacción está sustancialmente completa. Un exceso de la hidracida polimérica se usa típicamente para incrementar la cantidad de conjugado obtenida. Un tiempo de reacción típico es de 26 horas. Dependiendo de la estabilidad térmica de los reactivos, la temperatura y tiempo de reacción se pueden alterar para proporcionar resultados adecuados. La determinación detallada de las condiciones de reacción tanto para la oxidación como para el acoplamiento se exponen en Geoghegan y Stroh, (1992), Bioconjugate Chem. 3:138-146, y en Geoghegan, patente de los Estados Unidos número 5,362,852, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Usando alquilación reductiva, el agente reductor debe ser estable en solución acuosa y de manera preferente debe ser capaz de reducir sólo la base de Schiff formada en el proceso inicial de alquilación reductiva. Los agentes de reducción se seleccionan de, y sin limitación, borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, borato de dimetilamina, borato de trimetilamina y borato de piridina. El pH de la reacción afecta la relación de polímero a proteína que se va a usar. En general, si el pH de la reacción es menor que la pKa de un grupo reactivo objetivo, será deseable un gran exceso de polímero a proteína. Si el pH es mayor que la pKa objetivo, la relación polímero: proteína no necesita ser tan grande (es decir, están disponibles más grupos reactivos, de modo que se necesitan menos moléculas de polímero) . Por consiguiente, la reacción se realiza en un aspecto a un pH que permite aprovechar las diferencias de pKa entre los grupos e-amino de los residuos de lisina y aquél del grupo a-amino del residuo N-terminal de la proteína. Por esta derivatización selectiva, se controla la unión de polímero soluble en agua a una proteína; la conjugación de polímeros toma lugar predominantemente en el N-término de la proteína y no se presenta modificación significativa de otros grupos reactivo, tal como los grupos amino de cadena lateral de lisina. Por lo tanto, en un aspecto, se proporcionan métodos para la unión covalente de un WSP a un compuesto objetivo y que proporciona una preparación sustancialmente homogénea de moléculas de conjugado de WSP/proteína, en la ausencia de purificación extensiva adicional como se requiere usando otras químicas de modificación química. De manera más específica, si se usa polietilenglicol, los métodos descritos permiten la producción de una proteína N-terminalmente PEGilada que carece posiblemente de grupos de enlace antigénicos, es decir, la porción de polietilenglicol se acopla directamente a la porción de proteína sin subproductos potencialmente tóxicos . Dependiendo del método de unión de WSP elegido, la proporción de moléculas de WSP unidas a la molécula de péptido a proteína objetivo variará, como lo harán sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la relación óptima (en términos de eficacia de reacción es que no hay proteína o polímero sin reaccionar en exceso) se determina por el peso molecular del WSP seleccionado. Además , cuando se usan métodos que comprenden unión no específica y purificación posterior de una especie deseada, la relación puede depender del número de grupos reactivos (típicamente grupos amino) disponibles. Purificación. El método para obtener una preparación modificada con WSP sustancialmente homogénea es, en un aspecto, por purificación de una especie predominantemente individual del compuesto modificado de una mezcla de especies. A manera de ejemplo, una especie sustancialmente homogénea se separa primero por cromatografía de intercambio iónico para obtener material que tiene una característica de carga de una especie individual (aunque pueden estar presentes otras especies que tienen la misma carga aparente) , y entonces la especie deseada se separa usando cromatografía de exclusión de tamaño. Se reportan otros métodos y se contemplan por la invención, esto incluye, por ejemplo, PCT WO 90/04606, publicada el 3 de mayo de 1990, que describe un proceso para accionar una mezcla de aductos de PEG-proteína que comprende dividir los aductos de PEG/proteína en un sistema bifásico acuoso que contiene PEG. De esta manera, un aspecto de la presente invención es un método para preparar un conjugado del compuesto modificado con WSP comprendido de (a) hacer reaccionar un compuesto que tiene más de un grupo amino con una porción de polímero soluble en agua bajo condiciones de alquilación reductiva, a un pH adecuado para activar selectivamente el grupo a-amino en el amino-término de la porción de proteína de modo que el polímero soluble en agua se une selectivamente al grupo a-amino; y (b) obtener el producto de reacción. Opcionalmente, y particularmente para un producto terapéutico, los productos de reacción se separan de porciones sin reaccionar. Como se determina por correlación de péptidos y secuenciación N-terminal, se proporciona una preparación que comprende al menos 50% de péptido PEGilado en una mezcla de péptido PEGilado y péptido sin reaccionar. En otras modalidades, se proporcionan preparaciones que comprenden al menos 75% de péptido PEGilado en una mezcla de péptido PEGilado y péptido sin reaccionar; al menos 85% de péptido PEGilado en una mezcla de péptido PEGilado y péptido sin reaccionar; al menos 90% de péptido PEGilado en una mezcla de péptido PEGilado y péptido sin reaccionar; al menos 95% de péptido PEGilado en una mezcla de péptido PEGilado y péptido sin reaccionar; y al menos 99% de péptido PEGilado en una mezcla de péptido PEGilado y péptido sin reaccionar. Composiciones farmacéuticas. La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden una preparación de la invención. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser para administración por inyección, o para formas oral, nasal, transdérmica u otras formas de administración, incluyendo, por ejemplo, por inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, intraocular, retrobulbar, intrapulmonar (por ejemplo, fármacos aerolizados) o subcutánea (incluyendo administración de depósito para liberación a largo plazo) ; por implantación sublingual, anal, vaginal, o quirúrgica, por ejemplo, incrustada bajo la cápsula esplénica, cerebro o en la córnea. El tratamiento puede consistir de una dosis individual o una pluralidad de dosis durante un periodo de tiempo. En general, comprendidas por la invención están composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de un compuesto de la invención junto con diluyentes, conservadores, solubilizadores, emulsionadores, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables . Estas composiciones incluyen diluyentes de varios contenidos de amortiguador (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y concentración iónica; aditivos tal como detergentes y agentes solubilizadores (por ejemplo, Tween 80, Polisorbato 80) , anti-oxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio) , conservadores (por ejemplo, timersol, alcohol bencílico) y sustancias de volumen (por ejemplo, lactosa, mannitol) ; incorporación del material en preparaciones de proteínas de compuestos poliméricos tal como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en liposomas. También se puede usar ácido hialurónico, y esto puede tener el efecto de promover duración- prolongada en la circulación. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir opcionalmente aún otros diluyentes líquidos, semisólidos o sólidos farmacéuticamente aceptables que sirven como vehículos, excipientes o medios farmacéuticos, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, monolaurato de polioxietilen-sorbitan, estearato de magnesio, metil- y propil-hidroxibenzoato, almidones, sacarosa, dextrosa, goma de acacia, fosfato de calcio, aceite mineral, manteca de cacao, y aceite de teobroma. Estas composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de depuración in vivo de las presentes proteínas y derivados. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712 que se incorpora en la presente como referencia. Las composiciones se pueden preparar en forma líquida, o pueden estar en polvo seco, tal como forma liofilizada. Las formulaciones de liberación sostenida implantables también se contemplan, puesto que son formulaciones transdérmicas . Dosis oral. Contempladas para el uso en la presente están formas de dosis sólidas orales, que se describen en general en el capítulo 89 de Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18th Ed. , Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042, incorporada en la presente como referencia. Las formas de dosis sólidas incluyen tabletas, cápsulas, pildoras, trociscos o pastillas, sobres o comprimidos. De manera alternativa, se puede usar encapsulación protenoide (por ejemplo como microesferas protenoides reportadas en la patente de los Estados Unidos número 4,925,673), o se puede usar encapsulación liposomal, los liposomas opcionalmente derivatizados con varios polímeros (por ejemplo, patente de los Estados Unidos número 5,013,556). Una descripción de formas de dosis sólidas para agentes terapéuticos en general se da en el capítulo 10 de Marshall, K., Modern Pharmaceutics (1979), editado por G. S. Banker y C. T. Rhodes, incorporado en la presente como referencia. En general, la formulación incluirá una preparación de la invención e ingredientes inertes que permiten la protección contra el ambiente del estómago, y la liberación del material biológicamente activo en el intestino . Si es necesario, los compuestos se pueden modificar químicamente de modo que sea eficaz la distribución oral. En general, la modificación química contemplada es la unión de al menos una porción a la molécula del compuesto misma, donde la porción permite (a) la inhibición de la proteólisis; y (b) la captación en la corriente sanguínea del estómago o intestino. También deseable es el incremento en la estabilidad total del compuesto el incremento en el tiempo de circulación en el cuerpo. Los ejemplos de estas porciones incluyen polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetil celulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinil-pirrolidona y poliprolina (Abuchowski y Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, Hocenberg andy Roberte, ed. , Wiley-Interscience, Nueva York, NY, (1981), páginas. 367-383; Newmark, et al., j. Appl. Biochem. 4:185-189 (1982)). Otros polímeros que se pueden usar son poli-1, 3-dioxolano y poli-1, 3 , 6-tioxocano. Para formas de dosis de distribución oral, también es posible usar una sal de un aminoácido alifático modificado, tal como N- (8- [2-hidroxibenzoil]amino) caprilato de sodio (SNAC) , como un portador para mejorar la absorción del compuesto terapéutico. La eficacia clínica de una formulación de heparina usando SNAC se ha demostrado en un ensayo de Fase II llevado a cabo por Emisphere Technologies. Ver patente de los Estados Unidos número 5,792,451, "Composición y métodos de distribución de fármacos orales" . Se pueden incluir preparaciones de la invención en la formulación como multipartículas finas en la forma de granulos o comprimidos de tamaño de partícula de aproximadamente, por ejemplo, un mm. La formulación del material para administración en cápsula también puede ser como un polvo, tapones ligeramente comprimidos o aún tabletas . Las composiciones se preparan opcionalmente por compresión. Se pueden incluir colorantes y agentes saborizantes. Por ejemplo, la preparación se puede formular (tal como por encapsulación en microcápsula o liposoma) y luego contener adicionalmente dentro de un producto comestible, tal como una bebida refrigerada que contiene colorantes y agentes saborizantes.
Las preparaciones de la invención, en un aspecto, se diluyen o incrementan en el volumen con un material inerte. Los diluyentes de ejemplo incluyen carbohidratos, especialmente mannitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidón. También se pueden usar ciertas sales inorgánicas como agentes de relleno incluyendo trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes comercialmente disponibles son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicel1. Las preparaciones que incluyen desintegrantes se contemplan adicionalmente en las composiciones en forma de dosis sólida. Los materiales usados como desintegrantes incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, almidón (incluyendo el desintegrante comercial basado en almidón, Explotab) , almidón-glicolato de sodio, amberlita, carboximetilcelulosa sódica, ultramilopectina, alginato de sodio, gelatina, cascara de naranja, carboximetil celulosa acida, esponja natural y bentonita. Otra forma de desintegrante es una resina de intercambio catiónico insoluble. También se pueden usar gomas en polvo como desintegrantes y como aglutinantes y éstos pueden incluir gomas en polvo tal como agar, Karaya o tragacanto. También son útiles ácido algínico y su sal sódica como desintegrantes.
Las composiciones farmacéuticas que incluyen aglutinantes se contemplan adicionalmente para retener el agente terapéutica conjuntamente para formar una tableta dura y aglutinantes de ejemplo incluyen materiales de productos naturales tal como acacia, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metil celulosa (MC) , etil celulosa (EC) y carboximetil celulosa (CMC) . Se pueden usar tanto polivinil-pirrolidona (PVP) como hidroxipropilmetil-celulosa (HPMC) en soluciones alcohólicas para granular el agente terapéutico. Un agente antifriccional en una composición farmacéutica se contempla adicionalmente para prevenir la pegajosidad durante el proceso de formulación. Los lubricantes incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, ácido esteárico, incluyendo sus sales de magnesio y calcio, politetrafluoroetileno (PTFE) , parafina líquida, aceites vegetales y ceras. Los lubricantes solubles también se pueden usar tal como lauril sulfato de sodio, lauril sulfato de magnesio, polietilenglicol de varias pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000. También se proporcionan deslizantes que pueden mejorar las propiedades de flujo de una composición farmacéutica durante la formulación y para ayudar en el rearreglo durante la compresión. Los deslizantes de ejemplo incluyen almidón, talco, sílice pirogénica y silicoaluminato hidratado . Para ayudar en la disolución de una composición en el ambiente acuoso, se contempla la incorporación de un agente activo como un agente humectante. Los agentes tensoactivos de ejemplo incluyen detergentes aniónicos tal como lauril sulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctil-sodio y sulfonato de dioctil-sodio. Se contemplan detergentes catiónicos, incluyendo, por ejemplo, y sin limitación, cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. En otro aspecto, las composiciones se usan como agentes tensoactivos que incluyen lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso de sacarosa, metil-celulosa y carboximetil celulosa. También se proporcionan además por lo tanto composiciones que comprenden estos agentes tensoactivos, ya sea solos o como una mezcla en diferentes relaciones. Opcionalmente, se incluyen aditivos en una composición farmacéutica para mejorar la captación del compuesto, estos aditivos que incluyen, por ejemplo y sin limitación, ácido oleico de ácidos grasos, ácido linoleico y ácido linolénico. Composiciones de liberación controlada. En otro aspecto, se proporcionan formulaciones de liberación controlada. Se incorpora una preparación de la invención en una matriz inerte que permite la liberación ya sea por difusión o por mecanismos lixiviación, por ejemplo, gomas. Las matrices que se degeneran lentamente, por ejemplo, alginatos, polisacáridos también se pueden incorporar en la formulación. Otra forma de una liberación controlada es por un método basado en el sistema terapéutico Oros (Alza Corp.), es decir, el fármaco se encierra en una membrana semipermeable que permite que el agua entre y empuje al fármaco a través de una abertura pequeña individual debido a los efectos osmóticos. Algunos revestimientos entéricos también tienen un efecto de liberación retrasada. Se pueden usar otros revestimientos en las composiciones de la invención, incluyendo por ejemplo, una variedad de azúcares que se pueden aplicar en una bandeja de revestimiento. Las composiciones también incluyen una tableta revestida con película y los materiales usados en este caso se dividen en dos grupos. El primero incluye los materiales no entéricos, tal como y sin limitación metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxi-etilcelulosa, hidroxipropil-celulosa, hidroxipropil-metil-celulosa, carboxi-metil-celulosa sódica, providota y los polietilenglicoles. El segundo grupo consiste de los materiales entéricos que son comúnmente esteres de ácido itálico.
Una mezcla de materiales también se contempla para proporcionar el revestimiento de película óptima. El revestimiento de película se puede llevar a cabo en un revéstidor de bandeja o en un lecho fluidizado o por revestimiento de compresión. Distribución pulmonar. También se contempla en la presente la distribución pulmonar de una preparación de la invención. El compuesto se distribuye a los pulmones de un mamífero en tanto que inhala y atraviesa a través del forro epitelial del pulmón a la corriente sanguínea. La distribución pulmonar se describe en Adjei et al., Pharma. Res. (1990) 7: 565-9; Adjei et al. (1990), Internatl . J. Pharmaceutics 63: 135-44; Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (suppl. 5): s.143-146; Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3: 206-12; Smith et al. (1989), J. Clin. Invest. 84: 1145-6; Oswein et al. (Marzo 1990), "Aerosolization of Proteins", Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Coló.; Debs et al. (1988), J. Immunol . 140: 3482-8 y Platz et al., patente de los Estados Unidos número 5,284,656, las descripciones de los cuales se incorpora en la presente como referencia. Dispositivos mecánicos. También contemplados para la práctica de la invención están una amplia variedad de dispositivos mecánicos diseñados para distribución pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación nebulizadores, inhaladores de dosis medida, e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para aquellos expertos en la técnica. Los ejemplos específicos de dispositivos comercialmente disponibles adecuados para la práctica de esta invención son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Mo.; el nebulizador Acorn II, elaborado por Marquest Medical Products, Englewood, Coló.; el inhalador de dosis medida Ventolín, elaborado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.; y el inhalador de polvo Spinhaler, elaborado por Fisons Corp., Bedford, Mass. Todos estos dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para la distribución de una preparación de la invención. Típicamente, cada formulación es específica al tipo de dispositivo empleado y puede comprender el uso de un material propulsor apropiado, además de diluyentes, adyuvantes y/o portadores útiles en terapia. Para distribución efectiva al pulmón distante, la composición se prepara de forma de partículas con un tamaño promedio de partícula en un aspecto de menos de 10 µm (o micrones), y en un aspecto alternativo 0.5 a 5 µm. Las formulaciones adecuadas para el uso con un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasónico, comprenderán típicamente el compuesto inventivo disuelto en agua a una concentración de aproximadamente 0.1 a 25 mg de proteína biológicamente activa por mL de solución. La formulación también puede incluir un amortiguador y un azúcar simple (por ejemplo, para estabilización de proteína y regulación de presión osmótica) . La formulación de nebulizador también puede contener un agente tensoactivo, para reducir o prevenir la agregación inducida de superficie de la proteína provocada por la atomización de la solución en la formación del aerosol . Las formulaciones para el uso con un dispositivo inhalador de dosis medida comprenderán un polvo finamente dividido que contiene el compuesto inventivo suspendido en un propulsor con la ayuda de un agente tensoactivo . El propulsor puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, tal como un clorofluorocarburo, un hidroclorofluorocarburo, un hidrofluorocarburo, o un hidrocarburo, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol, y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos. Los agentes tensoactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitano y lecitina de soya. También puede ser útil ácido oleico como un agente tensoactivo. Las formulaciones para distribución desde un dispositivo inhalador de polvo comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene el compuesto inventivo y también puede incluir un agente de volumen, tal como lactosa, sorbitol, sacarosa, mannitol, tehalosa, o xilitol en cantidades que facilitan la dispersión del polvo desde el dispositivo, por ejemplo, 50 a 90% en peso de la formulación. Distribución nasal. La distribución nasal de las preparaciones de la invención también se contempla. La distribución nasla permite el paso de la proteína a la corriente sanguínea directamente después de administrar el producto terapéutico a la nariz, sin la necesidad de depósito del producto en el pulmón. Las formulaciones para distribución nasal incluyen aquéllas con dextrano o ciclodextrano. La distribución mediante transporte a través de otras membranas mucosas también se contempla. Formas de distribución bucal. También se contempla la distribución bucal del compuesto inventivo. Se conocen en la técnica, para el uso con péptidos, formulaciones de distribución bucal. Portadores . Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen carbohidratos tal como trehalosa, mannitol, xilitol, sacarosa, lactosa, y sorbitol. Otros ingredientes para el uso en formulaciones incluyen DPPC, DOPE, DSPC y DOPC . Se pueden usar agentes tensoactivos naturales o sintéticos. Se puede usar PEG (aún separado de su uso en la derivatización de un compuesto de la invención) . Dextranos, tal como ciclodextrano, se puede usar. Se pueden usar sales biliares y otros intensificadores relacionados. Se puede usar celulosa y derivados de celulosa. Se pueden usar aminoácidos, tal como el uso en una formulación amortiguadora. Otras formulaciones . El uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión, u otros tipos de portadores también se contempla. Dosis . El régimen de dosis comprendido en un método para tratar una condición descrita en la presente se determinará por el facultativo que atiende, considerando varios factores que modifican la acción de fármacos, por ejemplo, la edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. En varios aspectos, el régimen diario está en el intervalo de 0.1-1000 µg de una preparación por kilogramo de peso corporal (calculando la masa de la proteína sola, sin modificación química) o 0.1-150 µg/kg. Las preparaciones de la invención se pueden administrar por un bolo inicial seguido por una infusión continua para mantener niveles terapéuticos en circulación del producto de fármaco. Como un ejemplo, el compuesto inventivo se puede administrar como una dosis de una vez. Aquellos expertos en la técnica optimizarán fácilmente las dosis efectivas y los regímenes de administración como se determina por la buena práctica médica y la condición clínica del paciente particular. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de los agentes y la ruta de administración. La formulación farmacéutica óptima se determinará por un experto en la técnica dependiendo de la ruta de administración y la dosis deseada. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712, la descripción de lo cual se incorpora de este modo como referencia. Estas formulaciones pueden influenciar el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de depuración in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la ruta de administración, se puede calcular una dosis adecuada de acuerdo al peso corporal, área superficial de cuerpo o tamaño de órgano. El refinamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosis apropiada para el tratamiento que comprende cada uno de las formulaciones mencionadas anteriormente se hace por rutina por aquellos expertos en la técnica sin experimentación indebida, especialmente en vista de la información de dosis y los ensayos descritos en la presente, así como los datos farmacocinéticos observados en los ensayos clínicos humanos analizados anteriormente. Se pueden determinar dosis apropiadas a través del uso de ensayos establecidos para determinar las dosis de niveles sanguíneos en unión con datos apropiados de dosis-respuesta. El régimen de dosis final se determinará por el facultativo que atiende, considerando varios factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la actividad específica del fármaco, la severidad del daño y la sensibilidad del paciente, la edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. Conforme se llevan a cabo los estudios, emergerá información adicional con respecto a los niveles apropiados de dosis y con respecto a la duración del tratamiento para las varias enfermedades y condiciones . Los métodos terapéuticos, composiciones y compuestos de la presente invención también se pueden emplear, solos o en combinación con otras citocinas, receptor de c-Mpl soluble, factores hematopoyéticos, interleucinas, factores de crecimiento o anticuerpos en el tratamiento de estados de enfermedad caracterizados por otros síntomas así como deficiencia de plaquetas. Se anticipa que las preparaciones de la invención probarán ser útiles en el tratamiento de algunas formas de trombocitopenia en combinación con estimuladores generales de hematopoyesis, tal como IL-3 o GM-CSF. También se contemplan con el ligando de Mpl otros factores estimuladores megacariocíticos, es decir, meg-CSF, factor de células madre (SCF) , factor inhibitorio de leucemia (LIF) , oncostatina M (OSM) , u otras moléculas con actividad estimuladora de megacariocitos . Las citocinas o factores hematopoyéticos de ejemplo adicionales para esta coadministración incluyen IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, factor-1 estimulador de colonias (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , EPO, interferón-alfa (IFN-alfa), interferón de consenso, IFN-beta, IFN-gamma, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, trombopoyetina (TPO), angiopoyetinas, por ejemplo Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, el polipéptido tipo angiopoyetina humana, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , angiogenina, proteína-1 morfogénica ósea, proteína-2 morfogénica ósea, proteína-3 morfogénica ósea, proteína-4 morfogénica ósea, proteína-5 morfogénica ósea, proteína-6 morfogénica ósea, proteína-7 morfogénica ósea, proteína-8 morfogénica ósea, proteína-9 morfogénica ósea, proteína-10 morfogénica ósea, proteína-11 morfogénica ósea, proteína-12 morfogénica ósea, proteína-13 morfogénica ósea, proteína-14 morfogénica ósea, proteína-15 morfogénica ósea, receptor IA de proteína morfogénica ósea, receptor IB de proteína morfogénica ósea, factor neurotrófico derivado de cerebro, factor neurotrófico ciliar, receptor de factor neurotrófico ciliar, factor 1 quimiotáctico de neutrófilos inducido por citocina, neutrófilo inducido por citocina, factor quimiotáctico 2a, factor 2ß quimiotáctico de neutrófilo inducido por citocina, factor de crecimiento de células endoteliales ß, endotelina 1, factor de crecimiento epidérmico, atrayente de neutrófilo derivado de epitelio, factor 4 de crecimiento de fibroblastos, factor 5 de crecimiento de fibroblastos, factor 6 de crecimiento de fibroblastos, factor 7 de crecimiento de fibroblastos, factor 8 de crecimiento de fibroblastos, factor 8b de crecimiento de fibroblastos, factor 8c de crecimiento de fibroblastos, factor 9 de crecimiento de fibroblastos, factor 10 de crecimiento de fibroblastos, factor ácido de crecimiento de fibroblastos, factor básico de crecimiento de fibroblastos, receptor al de factor neurotrófico derivado de línea de células gliales, receptor a2 de factor neurotrófico derivado de línea de células gliales, proteína relacionada a crecimiento, proteína a relacionada a crecimiento, proteína ß relacionada a crecimiento, proteína ? relacionada a crecimiento, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, receptor de factor de crecimiento de hepatocitos, factor I de crecimiento tipo insulina, receptor de factor de crecimiento tipo insulina, factor II de crecimiento tipo insulina, proteína de unión a factor de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor inhibitorio de leucemia, receptor a de factor inhibitorio de leucemia, receptor de factor de crecimiento de nervios, neurotrofina-3, neurotrofina-4, factor de crecimiento de placenta, factor 2 de crecimiento de placenta, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, cadena de factor A de crecimiento derivado de plaquetas, factor AA de crecimiento derivado de plaquetas, factor AB de crecimiento derivado de plaquetas, cadena de factor B de crecimiento derivado de plaquetas, factor BB de crecimiento derivado de plaquetas, receptor a de factor de crecimiento derivado de plaquetas, receptor ß de factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de estimulación de crecimiento de células pre-B, receptor de factor de células madre, TNF, incluyendo TNFO, TNFl, TNF2, factor a de crecimiento de transformación, factor ß de crecimiento de transformación, factor ßl de crecimiento de transformación, factor ßl.2 de crecimiento de transformación, factor ß2 de crecimiento de transformación, factor ß3 de crecimiento de transformación, factor ß5 de crecimiento de transformación, factor ßl de crecimiento de transformación latente, proteína I de unión a factor ß de crecimiento de transformación, proteína II de unión a factor ß de crecimiento de transformación, proteína III de unión a factor ß de crecimiento de transformación, receptor tipo I de factor de necrosis tumoral, receptor tipo II de factor de necrosis tumoral, receptor de activador de plasminógeno tipo urocinasa, factor de crecimiento endotelial vascular, y proteínas quiméricas y fragmentos biológica o inmunológicamente activos de los mismos. Adicionalmente, puede ser útil administrar, ya sea de manera simultánea o secuencial, una cantidad efectiva de un c-Mpl soluble de mamífero, que parece tener un efecto de hacer que los megacariocitos se fragmenten en plaquetas una vez que los megacariocitos han alcanzado la forma madura. De esta manera, la administración de una preparación de la invención (para mejorar el número de megacariocitos maduros) seguido por la administración del c-Mpl soluble (para inactivar el ligando y para permitir que los megacariocitos maduros produzcan plaquetas) se espera que sea un medio particularmente efectivo para estimular la producción de plaquetas. La dosis citada anteriormente se ajustará para compensar los componentes adicionales en la composición terapéutica. El progreso del paciente tratado se puede monitorizar por métodos convencionales. Condiciones en general . Los compuestos de esta invención tienen actividad farmacológica que resulta de su capacidad para unirse a proteínas de interés como agonistas, miméticos o antagonistas de los ligandos nativos de estas proteínas de interés. La utilidad de los compuestos específicos se muestra en la Tabla 2. La actividad de estos compuestos se puede medir por ensayos conocidos en la técnica. Para los compuestos TPO-miméticos, un ensayo in vivo se describe adicionalmente en la sección de ejemplos de la presente. Además de los usos terapéuticos, los compuestos de la presente invención son útiles en el diagnóstico de enfermedades caracterizadas por disfunción de su proteína de interés asociada. En una modalidad, un método para detectar en una muestra biológica una proteína de interés (por ejemplo, un receptor) que es capaz de ser activado, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto la muestra con un compuesto de esta invención; y (b) detectar la activación de la proteína de interés por el compuesto. Las muestras biológicas incluyen especímenes de tejido, células intactas, o extracto de los mismos. Los compuestos de esta invención se pueden usar como parte de un equipo de diagnóstico para detectar la presencia de sus proteínas de interés asociadas en una muestra biológica. Estos equipos emplean los compuestos de la invención que tienen una marca unida para permitir la detección. Los compuestos son útiles para identificar proteínas de interés normales o anormales. Para los compuestos EPO-miméticos, por ejemplo, la presencia de proteína de interés anormal en una muestra biológica puede ser indicativa de trastornos tal como anemia de Diamond Blackfan, donde se cree que el receptor de EPO es disfuncional . Usos terapéuticos de compuestos EPO-miméticos. Los compuestos EPO-miméticos de la invención son útiles para tratar trastornos caracterizados por bajos niveles de células sanguíneas rojas. Incluidos en la invención están métodos para modular la actividad endógena de un receptor de EPO en un mamífero, de manera preferente métodos para incrementar la actividad de un receptor de EPO. En general, también se puede tratar cualquier condición tratable por eritropoyetina, tal como anemia, por los compuestos EPO-mimético de la invención. Estos compuestos se administran por una cantidad y ruta de distribución que es apropiada para la naturaleza y severidad de la condición que se trata y se puede determinar por un experto en la técnica. De manera preferente, la administración es por inyección, ya sea de manera subcutánea, intravenosa o intramuscular. Usos terapéuticos de compuesto TPO-miméticos. Para los compuestos EPO-miméticos, se pueden utilizar ensayos normales tal como aquellos descritos en la WO 95/26746 titulada "Composiciones y Métodos para Estimular Crecimiento y Diferenciación de Megacariocitos". Los ensayos in vivo también aparecen en los ejemplos más adelante en la presente. Las condiciones que se van a tratar son en general aquéllas que comprenden una deficiencia de megacariocitos/plaquetas existentes o una deficiencia esperada de megacariocitos/plaquetas (por ejemplo, debido a cirugía planeada o donación de plaqueta) . Estas condiciones usualmente serán el resultado de una deficiencia (temporal o permanente) del ligando Mpl activo in vivo. El término genérico para deficiencia de plaquetas es trombocitopenia, y por lo tanto los métodos y composiciones de la presente invención en general están disponibles para tratar trombocitopenia en pacientes en necesidad del mismo. La trombocitopenia puede estar presente por varias razones, incluyendo quimioterapia y otra terapia con una variedad de fármacos, terapia de radiación, cirugía, pérdida sanguínea accidental, y otras condiciones específicas de enfermedad. Las condiciones específicas de enfermedad de ejemplo que comprenden trombocitopenia y que se pueden tratar de acuerdo con esta invención son: anemia aplástica, trombocitopenia idiomática o inmunitaria (ITP) , incluyendo púrpura trombocitopénica idiomática asociada con cáncer de mama; púrpura trombocitopénica trombótica relacionada a VIH e ITP asociada a VIH; tumores metastáticos que dan por resultado trombocitopenia, lupus eritematoso sistémico, incluyendo síndrome de lupus neonatal, esplenomegalia, síndrome de Fanconi, deficiencia de vitamina B12, deficiencia de ácido fólico, anomalía de May-Hegglin, síndrome de Wiskott-Aldrich, enfermedad crónica de hígado; síndrome mielodisplástico asociado con trombocitopenia; hemoglobinuria nocturna paroxismal, trombocitopenia profunda aguda después de terapia con C7E3 Fab (Abciximab) ; trombocitopenia aloinmunitaria, incluyendo trombocitopenia aloinmunitaria maternal; trombocitopenia asociada con anticuerpo antifosfolípido y trombosis; trombocitopenia autoinmunitaria; trombocitopenia inmunitaria inducida por fármacos, trombocitopenia inducida por carboplatina, trombocitopenia inducida por heparina; trombocitopenia fetal; trombocitopenia gestacional; síndrome de Hughes, trombocitopenia lupoide; pérdida sanguínea accidental y/o masiva; trastornos mieloproliferativos; trombocitopenia en pacientes con malignidades; trombocitopenia púrpura trombótica, incluyendo microangiopatía trombótica que se manifiesta como púrpura trombocitopenia trombótica/síndrome urémico hemolítico en pacientes con cáncer; anemia hemolítica autoinmunitaria; perforación oculta de divertículo yeyunal; aplasia de células rojas puras; trombocitopenia autoinmunitaria; neuropatía epidémica; falla renal aguda asociada con rifampicina; trombocitopenia de Paris-Trousseau; trombocitopenia aloinmunitaria neonatal; hemoglobinuria nocturna paroxismal; cambios hematológicos en cáncer de estómago; síndromes urémicos hemolíticos en niñez; manifestaciones hematológicas relacionadas a infección viral que incluyen virus de hepatitis A y trombocitopenia asociada con CMV. También, ciertos tratamientos para SIDA que da por resultado trombocitopenia (por ejemplo, AZT) . Ciertos trastornos de curación de heridas que pueden beneficiarse de un incremento en el número de plaquetas. También, ciertos tratamientos para SIDA que dan por resultado trombocitopenia (por ejemplo, AZT) . Ciertos trastornos de curación de heridas también pueden beneficiarse de un incremento del número de plaquetas . Los compuestos TPO-miméticos de esta invención se pueden usar en cualquier situación en la cual se desee producción de plaquetas o células precursoras de plaquetas, o en la cual se desee la estimulación del receptor de c-Mpl . De esta manera, por ejemplo, los compuestos de esta invención se pueden usar para tratar cualquier condición en un mamífero en donde exista la necesidad de plaquetas, megacariocitos, y similares. Estas condiciones se describen en detalle en las siguientes fuentes de ejemplo: WO 95/26746; WO 95/21919; WO 95/18858; WO 95/21920 y se incorporan en la presente. Los compuestos TPO-miméticos de esta invención también pueden ser útiles en el mantenimiento de la viabilidad o vida de almacenamiento de las plaquetas y/o megacariocitos y células relacionadas. Por consiguiente, podría ser útil incluir una cantidad efectiva de uno o más de estos compuestos en una composición que contenga estas células . Los métodos terapéuticos, composiciones y compuestos de la presente invención también se pueden emplear, solos o en combinación con otras citocinas, receptor de Mpl soluble, factores hematopoyéticos, interleucinas, factores de crecimiento o anticuerpos en el tratamiento de estados de enfermedad caracterizados por síntomas diferentes así como deficiencias de plaquetas. Se anticipa que el compuesto inventivo probará ser útil en el tratamiento de algunas formas de trombocitopenia en combinación con estimuladores generales de hematopoyesis, tal como IL-3 o GM-CSF. Otros factores estimuladores megacariocíticos, es decir, meg-CSF, factor de células madre (SCF) , factor inhibitorio de leucemia (LIF) , oncostatina M (OSM) , u otras moléculas con actividad estimuladora de megacariocitos también se pueden emplear con el ligando de Mpl. Las citocinas de ejemplo adicionales o factores hematopoyéticos para esta co-administración incluyen IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, factor-1 estimulador de colonias (CSF-1) , SCF, GM-CSF, factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , EPO, interferón-alfa (IFN-alfa) , interferón de consenso, IFN-beta, o IFN-gamma. Además, puede ser útil administrar, ya sea de manera simultánea o secuencial, una cantidad efectiva de un receptor soluble de Mpl de mamífero, que parece tener un efecto en provocar que los megacariocitos se fragmenten en plaquetas una vez que los megacariocitos han alcanzado la forma madura. De esta manera, la administración de un compuesto inventivo (para mejorar el número de megacariocitos maduros) seguida por la administración del receptor de Mpl soluble (para inactivar el ligando y para permitir que los megacariocitos maduros produzcan plaquetas) se espera que sea un medio particularmente efectivo de estimular la producción de plaquetas. La dosis citada anteriormente se ajustará para compensar estos componentes adicionales en la composición terapéutica. El progreso de pacientes tratados se puede monitorizar por métodos convencionales. En casos donde los compuestos inventivos se adicionen a composiciones de plaquetas y/o megacariocitos y células relacionadas, la cantidad que se va a incluir en general se determinará de forma experimental por técnicas y ensayos conocidos en la técnica. Un intervalo de ejemplo de las cantidades es 0.1 µg a 1 mg del compuesto inventivo por 106 células. Las condiciones que se van a tratar en general son aquéllas que comprenden una deficiencia existente de megacariocitos/plaquetas o una deficiencia esperada de megacariocitos/plaquetas (por ejemplo, debido a cirugía planeada o donación de plaqueta) . Estas condiciones usualmente serán el resultado de una deficiencia (temporal o permanente) de trombopoyetina activa in vivo. El término genérico para deficiencia de plaqueta es trombocitopenia, y los métodos y preparaciones de la presente invención en general están disponibles para tratar trombocitopenia en pacientes en necesidad de esto. Con respecto a las deficiencias anticipadas de plaqueta, por ejemplo, debido a futura cirugía, un compuesto de la presente invención se puede administrar varios días o varias horas antes de la necesidad de plaqueta. Con respecto a situaciones agudas, por ejemplo, pérdida accidental y masiva de sangre, se administra opcionalmente una preparación o composición de la invención junto con sangre o plaquetas purificadas. Los compuestos TPO-miméticos de la invención son útiles en estimular ciertos tipos de células diferentes de megacariocitos si estas células se encuentra que expresan c-Mpl . Las condiciones asociadas con estas células que expresan el c-Mpl, que son sensibles a la estimulación por una preparación o composición descrita en la presente también están dentro del alcance de esta invención. Los siguientes ejemplos no se propone que sean limitantes sino sólo de ejemplo de las modalidades específicas de la invención.
Ejemplo 1 Montaje de construcción de expresión Un polinucleótido que codifica para una proteína de fusión de TMP que comprende una región Fe murina (mFc-TMP) se construyó al combinar secuencias de nucleótidos que de manera individual codifican para Fe murino y un TMP (descrito en EP01124961A2) . En la primera ronda de PCR, el componente que codifica para Fe murino se amplificó con los cebadores 3155-58 de PCR (SEQ ID NO: 1022) y 1388-00 (SEQ ID NO: 1023) . 3155-58: CCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTATCGA (SEQ ID NO: 1024) 3155-59: CCACCTCCACCTTTACCCGGAGAGTGGGAG (SEQ ID i NO: 1025) . En una reacción separada, se amplificó un polinucleótido que codifica para TMP con los cebadores 1209-85 (SEQ ID NO: 1026) y 3155-59 (SEQ ID NO: 1027). 1209-85: CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG (SEQ ID NO: 1028) 1388-00: CTAGTTATTGCTCAGCGG (SEQ ID NO: 1029). Los fragmentos de PCR resultantes se purificaron en gel y se combinaron en un tubo individual durante una segunda ronda de PCR con los cebadores 1209-85 (SEQ ID NO: 1039) y 1388-00 (SEQ ID NO: 1031) . El producto de PCR de esta segunda ronda de amplificación se purificó en gel y digirió con enzimas de restricción Ndel y Xhol. El fragmento de digestión se purificó y ligó en el vector pAMG21, anteriormente digerido con las mismas enzimas. Esta mezcla de ligación se transformó mediante electroporación en la cepa de E. coli Amgen 393 y se colocó en placa en el medio LB + Kanamicina. Las colonias se detectaron mediante PCR y secuenciación de ADN. Se identificó y designó 6397 un clon positivo con una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1032) que codifica para la proteína de fusión mFc-TMP (SEQ ID NO: 1033) . Polipéptido que codifica para proteína de fusión de FC murino-TMP (SEQ ID NO: 1034) 1 GATTTGATTC TAGATTTGTT TTAACTAATT AAAGGAGGAA TAACAT RF abierto: ATGGTCGACGGTTG TAAGCCATGC ATTTGTACAG TCCCAGAAGT ATCATCTGTC 101 TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG CTCACCATTA CTCTGACTCC 151 TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG CAAGGATGAT CCCGAGGTCC 201 AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG TGCACACAGC TCAGACGCAA 251 CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC CGCTCAGTCA GTGAACTTCC 301 CATC TGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA 351 ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAACCAAA 401 GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC ATTCCACCTC CCAAGGAGCA 451 GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG CATGATAACA GACTTCTTCC 501 CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC 551 TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA GATGGCTCTT ACTTCGTCTA 601 CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG GGAGGCAGGA AATACTTTCA 651 CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA ACCACCATAC TGAGAAGAGC 701 CTCTCCC CT CTCCGGGTAA AGGTGGAGGT GGTGGTATCG AAGGTCCGAC 751 TCTGCGTCAG TGGCTGGCTG CTCGTGCTGG TGGTGGAGGT GGCGGCGGAG 801 GTATTGAGGG CCCAACCCTT CGCCAATGGC TTGCAGCACG CGCATAA Secuencia 3 ' TCTCGAGGATCCG CGGAAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAAGCCCG AAAGG Péptido de proteína de Fe urino-TMP (SEQ ID NO: 1035) 1 MVDGCKPCIC TVPEVSSVFI FPPKPKDVLT ITLTPKVTCV WDISKDDPE 51 VQFS FVDDV EVHTAQTQPR EEQFNSTFRS VSELPIMHQD WLNGKEFKCR 101 VNSAAFPAPI EKTISKTKGR PKAPQVYTIP PPKEQMAKDK VSLTCMITDF 151 FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG SYFVYSKLNV QKSWEAGNT 201 FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGKGGGGG IEGPTLRQWL AARAGGGGGG 251 GGIEGPTLRQ WLAARA* Ejemplo 2 Fermentación de cepa 6397 La fermentación de la cepa 6397 se inició por inoculación de 500 mL de caldo Luria esterilizado con cultivo de siembra de la cepa en un matraz agitado. Cuando la densidad celular alcanzó 0.9 a 600 nm, los contenidos se usaron para inocular un fermentador de 15 L que contiene 10 L de medio de crecimiento basado en complejo (800 g de glicerol, 600 g de tripticasa, 3 g de citrato de sodio, 40 g de KH2P04, 20 g de (NH4)2S04, 5 ml de de antiespuma Fluka P-2000, 10 ml de metales traza (cloruro férrico 27.0 g/L, cloruro de zinc 2.00 g/L, cloruro de cobalto 2.00 g/L, molibdato de sodio 2.00 g/L, cloruro de calcio 1.00 g/L, sulfato cúprico 1.90 g/L, ácido bórico 0.50 g/L, cloruro de manganeso 1.60 g/L, citrato de sodio dihidratado 73.5 g/L), 10 ml de vitaminas (biotina 0.060 g/L, ácido fólico 0.040 g/L, riboflavina 0.42 g/L, piridoxina HCl 1.40 g/L, niacina 6.10 g/L, ácido pantoténico 5.40 g/L, hidróxido de sodio 5.30 ml/L), adicionar agua para llevar a 10 L) . El fermentador se mantuvo a 37°C y pH 7 con niveles de oxígeno disuelto mantenidos a un mínimo de 30% de saturación. Cuando la densidad celular alcanzó 13.1 unidades OD a 600 nm, el cultivo se indujo por la adición de 10 ml de 0.5 mg/ml de N- (3-oxo-hexanoil)homoserina-lactona. A las 6 horas después de la inducción, el caldo se enfrió a 10°C, y las células se recolectaron por centrifugación a 4550 g durante 60 minutos a 5°C. La pasta celular entonces se almacenó a -80°C.
Ejemplo 3 Replegado de proteína La pasta de E. coli (300 g) de la cepa 6397 que expresa mFc-TMP se disolvió en 2250 ml de amortiguador de lisis (tris-HCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8.0) y se pasó a través de un microfluidizador enfriado dos veces a 13000 libras/pulg2. El producto homogenado entonces se centrifugó a 11,300 g durante 60 minutos a 4°C. El sobrenadante se descartó, y el sedimento se volvió a suspender en 2400 ml de agua usando un triturador de tejido. El producto homogenado entonces se centrifugó a 11,300 g durante 60 minutos a 4°C. El sobrenadante se descartó, y el sedimento se volvió a suspender en volúmenes de 200 ml de agua usando un triturador de tejido. El producto homogenado se centrifugó a 27,200 g durante 30 minutos a 4°C, y el sobrenadante se descartó. Se dispersaron aproximadamente 12.5% del sedimento en 28 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8.0 con 35 mg de lisozima de clara de huevo de gallina (Sigma, St Louis, MO) usando una trituradora de tejido y se incubó a 37°C durante 20 minutos. Después de la incubación, la suspensión se centrifugó a 27,200 g durante 30 minutos a 22°C, y se descartó . el sobrenadante. El sedimento se volvió a suspender en 35 ml de guanidina-HCl 8 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, después de lo cual se adicionaron 350 µl de DTT M (Sigma, St Louis, MO) y el material se incubó a 37°C durante 30 minutos. La solución entonces se centrifugó a 27,200 g durante 30 minutos a 22°C. El sobrenadante entonces se transfirió a 3.5 L de amortiguador de replegado (base Tris 50 mM, arginina-HCl 160 mM, urea 3 M, glicerol al 20%, pH 9.5, cisteína 1 mM, cistamina-HCl 1 mM) a 1 ml/min con agitación suave a 4°C.
Ejemplo 4 Purificación de construcción Después de aproximadamente 40 horas de incubación a 4°C con agitación suave, la solución de replegado descrita en el Ejemplo 3 se concentró a 500 µl usando un aparato de ultrafiltración de flujo tangencial con un cartucho de 30 kDa (Satorius, Goettingen, Alemania) seguido por diafiltración contra 3 L de Q-amortiguador A (tris-HCl 20 mM, pH 8.0). El material concentrado se filtró a través de un filtro Whatman GF/A y se cargó en una columna de flujo rápido Q-Sepharose de 86 ml (2.6 cm de diámetro interno) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a 15 ml/min. Después del lavado la resina con varios volúmenes de columna de Q-amortiguador A, la proteína se eluyó usando un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna a 60% de Q-amortiguador B (Tris HCl 20 mM, NaCl 1 M, pH 8.0) a 10 ml/min. Las fracciones pico se mezclaron, y la mezcla se pasó a través de un filtro de jeringa Mustang E (Pall Corporation, East Hills, NY) a 1 ml/min. El material filtrado se filtró una segunda vez a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.22 µm y se almacenó a -80°C.
Ejemplo 5 PEGilación de proteína A una solución agitada, enfriada (4°C) , de mFc-TMP (3.5 ml, 0.8 mg/ml) en un amortiguador de acetato de sodio 100 mM, pH 5, que contiene NaCNBH3 20 mM, se adicionó un exceso molar de 3.8 veces de metoxipolietilenglicol-aldehído (MPEG) (peso molecular promedio, 20 kDa) (Nektar) . Agitación de la mezcla de reacción se continuó a la misma temperatura. El grado de la modificación de proteína durante el transcurso de la reacción se monitorizó por SEC HPLC usando una columna Superóse 6 HR 10/30 (Amersham Biosciences) eluída con un amortiguador de fosfato 0.05 M con NaCl 0.15 M, pH 7.0 a 0.4 ml/min. Después de 16 horas, el análisis por SEC HPLC indicó que la mayoría de la proteína se ha conjugado a MPEG. En este momento, la mezcla de reacción se intercambió con amortiguador en un amortiguador de Tris/HCl 20 mM, pH 8.12. Los conjugados de MPEG-mFc-AMP2 se aislaron por cromatografía de intercambio iónico usando una columna Hi Trap HP Q de 1 ml (Amersham Biosciences) puesto en equilibrio con un amortiguador de Tris/HCl 20 mM, pH 8.12. La mezcla de reacción se cargó en una columna a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min y el aldehido MPEG sin reaccionar se eluyó con tres volúmenes de columna del amortiguador de inicio. Un gradiente de 20 volúmenes de columna, lineal desde 0% a 100% de amortiguador de Tris/HCl 20 mM, pH 8.12, que contiene NaCl 0.5 M se usó para eluir los conjugados de proteína-polímero. Las fracciones (2 ml) recolectadas durante la separación por cromatografía de intercambio iónico se analizaron por HPLC SEC como se describe anteriormente . Una fracción que contiene los conjugados de mono- y di-MPEG-mFc-TMP en una relación aproximada de 2.3 a 1 (como se determina por SEC HPLC) se concentró, y se filtró estéril.
Ejemplo 6 Prueba in vivo Ratones BDFl (Charles River Laboratories, Wilmington, Massachussets) se dividieron en grupos de 10 y se inyectaron en los días 0, 21, y 42 de forma subcutánea con ya sea el agente diluyente (PBS de Dulbecco con 0.1% de albúmina de suero bovino) o un agente diluyente con 50 µg de la proteína conjugada de mono- y di-MPEG-mFc-TMP (como se describe anteriormente) por kg de animal. Cada grupo se dividió a la mitad y se sangró (140 µl) del seno retro-orbital en puntos de tiempo alternados (días 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 19, 24, 26, 28, 31, 33, 40, 45, 47, 49, 52 y 59).
En el día 59, los ratones se anestesiaron con isoflurano antes del sangrado. La sangre recolectada se analizó para una cuenta completa diferencial usando un adaptador sanguíneo automatizado ADVIA 120 con software murino (Bayer Diagnostics, Nueva York, NY) . Los resultados mostraron que la administración de los conjugados de mono- y di-MPEG-mFc-TMP en los días 0, 21 y 41 dieron por resultado incrementos subsiguientes en los niveles de plaqueta a esencialmente el mismo grado con cada dosis. Ver Figura 1. En comparación, la administración de mFc-TMP (que carece de una porción de PEG) en los mismos días (es decir, días 0, 21 y 41) también dio por resultado niveles incrementados de plaquetas, pero el incremento después de la administración en el día 21 fue significativamente menor (es decir, atenuado) que el incremento después de la administración en el día 0, y el incremento después de la administración en el día 41 fue menor (es decir, atenuado adicionalmente) que aquél observado después de la administración en el día 21. En conjunto, estos resultados indican que el Fc-TMP modificado para incluir una porción de WSP (es decir, PEG) fue capaz de inducir producción de plaquetas que no se incrementa cuando se administra en un régimen de múltiples dosis. La presente invención se ha descrito en términos de modalidades particulares encontradas o propuestas para comprender modos preferidos para la práctica de la invención. Se apreciará por aquéllos expertos en la técnica que, en vista de la presente descripción, se pueden hacer numerosas modificaciones y cambios en las modalidades particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance o propuesta de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (27)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Compuesto sustancialmente homogéneo que comprende una estructura expuesta en la Fórmula I, Fórmula I: [ (X1) ,-F1- (X2) - (Ll)e-WSPa caracterizado porque: F1 es un vehículo; X1 se selecciona a partir de p'- - P3-(L4)g-P2-(L3)(-P1-(L2)e- y P4- (L5)h-P3- (L4)g-P2- (L3) f-P1- (L2)e- X2 se selecciona a partir de:
  2. -(L2)e-P1-(L3)£-P2-(L4)g-P3, y - (L -P1- (L3) £-P2- (L5)h-P4 en donde P1, P2, P3, y P4 son cada uno independientemente secuencias de péptidos farmacológicamente activos; L1, L2, L3, L4, y L5 son cada uno independientemente ligadores; a, b, c, e, f, g, y h son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición que al menos uno de a y b es 1; d es al menos 1; y WSP es un polímero soluble en agua, la unión del cual se efectúa en una porción reactiva en F1; este compuesto que tiene una propiedad de bioeficacia mejorada cuando se administra en un régimen de múltiples dosis. 2. Compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un multímero.
  3. 3. Compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque es un dímero.
  4. 4. Compuesto de conformidad con la reivindicación 1, que comprende una estructura expuesta en la Fórmula II Fórmula II: [x'-F1] - (L1) c-WSPd caracterizado porque F1 es un dominio Fe y está unido en el C-término de X1, y uno o más WSP se une al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1.
  5. 5. Compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque es un multímero.
  6. 6. Compuesto de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque es un dímero.
  7. 7. Compuesto de conformidad con la reivindicación 1, que comprende una estructura expuesta en la Fórmula III Fórmula III: [F'-X2] - (L1) c-WSPd caracterizado porque F1 es un dominio Fe y está unido en el N-Término de X2, y uno o más WSP se une al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1.
  8. 8. Compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque es un multímero
  9. 9. Compuesto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque es un dímero.
  10. 10. Compuesto de conformidad con la reivindicación I, que comprende una estructura expuesta en la Fórmula IV Fórmula IV: [F1- (L1)-,-P1] - (L1)c-WSPd caracterizado porque F1 es un dominio Fe y está unido al N-término de -(L1)c-P1 y uno o más WSP está unido al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1.
  11. 11. Compuesto de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque es un multímero
  12. 12. Compuesto de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque es un dímero.
  13. 13. Compuesto de conformidad con la reivindicación 1, que comprende una estructura expuesta en la Fórmula V Fórmula V: [F1- (L^-P1- (L2) £-P2] - (L^.-WSP, caracterizado porque F1 es un dominio Fe y está unido al N-término de -L^P^L2-?2 y uno o más WSP está unido al dominio Fe, opcionalmente a través del ligador L1.
  14. 14. Compuesto de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque es un multímero.
  15. 15. Compuesto de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque es un dímero.
  16. 16. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado porque P1 y/o P2 se seleccionan independientemente a partir de un péptido expuesto en cualquiera de las tablas 4 hasta 20.
  17. 17. Compuesto de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque P4 y/o P2 tienen la misma secuencia de aminoácidos .
  18. 18. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 15, caracterizado porque F1 es un dominio Fe.
  19. 19. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 15, caracterizado porque WSP es PEG.
  20. 20. Compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 15, caracterizado porque F1 es un dominio Fe y WSP es PEG.
  21. 21. Compuesto de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque PEG tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2 kDa y 100 kDa.
  22. 22. Compuesto de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque PEG tiene un peso molecular de entre aproximadamente 6 kDa y 25 kDa.
  23. 23. Composición que comprende el compuesto de la reivindicación 19, caracterizada porque comprende al menos 50% de compuesto PEGilado.
  24. 24. Composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque comprende al menos 75% de compuesto PEGilado.
  25. 25. Composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque comprende al menos 85% de compuesto PEGilado.
  26. 26. Composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque comprende al menos 90% de compuesto PEGilado.
  27. 27. Composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque comprende al menos 95% de compuesto PEGilado.
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