PL219605B1

PL219605B1 - Dimeryczne mimetyki peptydów trombopoetynowych wiążące się z receptorem MP1 i wykazujące aktywność trombopoetyczną

Info

Publication number: PL219605B1
Application number: PL348041A
Authority: PL
Inventors: Chuan-Fa Liu; Ulrich Feige; Janet Cheetham
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-22
Publication date: 2015-06-30
Also published as: NO2012005I2; PT2319928E; NO331027B1; BRPI9914698B8; NO2012005I1; HK1042114A1; EP1124961B9; WO2000024770A2; CY2009012I1; DK1124961T3; US7994117B2; CY1114940T1; DE122009000039I1; CN1810832A; FR09C0030I2; EA003998B1; US20070142295A1; HU228582B1; JP2006230413A; NO20011962D0

Description

Opis wynalazku

Dziedzina techniki

Generalnie, wynalazek odnosi się do dziedziny związków, zwłaszcza peptydów i polipeptydów, które wykazują aktywność trombopoetyczną. Związki według wynalazku mogą być wykorzystywane do zwiększania produkcji płytek lub prekursorów płytek (przykładowo, megakariocytów) u ssaków.

Stan techniki

Obecny wynalazek odnosi się do związków, zwłaszcza peptydów, które wykazują zdolność do stymulowania in vitro oraz in vivo produkcji płytek oraz ich komórek prekursorowych takich, jak megakariocyty. Przed omówieniem natury związków według wynalazku, przedstawia się poniższe informacje dotyczące dwóch protein, które wykazują aktywność trombopoetyczną: trombopoetyny (TPO) oraz czynnika wzrostu i rozwoju megakariocytów (MGDF).

Klonowanie endogennej trombopoetyny (TPO) (Lok i wsp., Nature 369:568-571 (1994); Bartley i wsp., Cell 77:1117-1124 (1994); Kuter i wsp., Proc. Natl./Acad. Sci. USA 91:11104-11108 (1994); de Sauvage i wsp., Nature 369:533-538 (1994); Kato i wsp., Journal of Biochemistry 119:229-236 (1995); Chang i wsp., Journal of Biological Chemistry 270:511-514 (1995)) spowodowało szybki wzrost naszego rozumienia megakariopoezy (wytwarzania megakariocytów) oraz tromboezy (wytwarzania płytek).

Endogenna ludzka TPO, glikolizowana proteina wytwarzana przede wszystkim w wątrobie i nerkach (o 60 do 70 kDa), składa się z 332 aminokwasów (Bartley i wsp., Cell 77:1117-1124 (1994); Chang i wsp., Journal of Biological Chemistry 270:511-514 (1995)). Proteina ta jest zachowana w wysokim stopniu (niezmieniona) pomiędzy różnymi gatunkami i wykazuje 23% homologię z ludzką erytropoetyną (Gurney i wsp., Blood 85:981-988 (1995)) na końcu aminowym (aminokwasy od 1 do 172) (Bartley i wsp., Cell 77:1117-1124 (1994)). Wykazano, że endogenna TPO posiada wszystkie cechy charakterystyczne kluczowego biologicznego regulatora trombopoezy. Jej działanie in vitro obejmuje specyficzną indukcję kolonii megakariocytów zarówno z oczyszczonych mysich komórek hematopoetycznych pnia (Zeigler i wsp., Blood 84:4045-4052 (1994)), jak i z ludzkich komórek CD34⁺(Lok i wsp., Nature 369:568-571 (1994); Rasko i wsp., Stem Cells 15:33-42 (1997)), generowanie megakariocytów o zwiększonej ploidalności (Broudy i wsp., Blood 85:402-413 (1995)) oraz indukcję końcowego dojrzewania megakariocytów i wytwarzania płytek (Zeigler i wsp., Blood 84:4045-4052 (1994); Choi i wsp., Blood 85:402-413 (1995)). Przeciwnie, syntetyczne antysensowne oligodeoksynukleotydy względem receptora TPO (c-Mp1) znacząco inhibitują zdolność progenitorów megakariocytów do tworzenia kolonii (Methia i wsp., Blood 82:1395-1401 (1993)). Ponadto, myszy pozbawione c-Mp1 są wysoce trombocytopeniczne i moją niedobór megakariocytów (Alexander i wsp., Blood 87:2162-2170 (1996)).

Rekombinacyjny ludzki MGDF (rHuMGDF, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) jest innym trombopoetycznym polipeptydem pokrewnym TPO. Jest wytwarzany przy użyciu E. coli transformowanej plazmidem zawierającym cDNA, kodujący obciętą proteinę, obejmującą amino-końcową domenę wiążącą receptor ludzkiej TPO (Ulich i wsp., Blood 86:971-976 (1995)). Polipeptyd ekstrahowano, poddawano ponownemu fałdowaniu, oczyszczono i do końca aminowego przyłączono kowalencyjnie ugrupowanie poliglikolu etylenowego (PEG). Otrzymaną molekułę określa się w niniejszym opisie jako PEG-rHuMGDF albo w skrócie MGDF.

Różne badania z zastosowaniem modeli zwierzęcych (Ulich, T.R. i wsp., Blood 86:971-976 (1995); Hokom, M.M. i wsp., Blood 86:4486-4492 (1995)) w sposób jasny wykazały skuteczność terapeutyczną TPO oraz MGDF w przeszczepach szpiku kostnego oraz w leczeniu trombocytopenii, stanu będącego częstym następstwem chemioterapii lub leczenia przez naświetlania. Wstępne wyniki uzyskane u ludzi potwierdziły przydatność MGDF w zwiększaniu ilości płytek w różnych warunkach (Basser i wsp., Lancet 348:1279-81 (1996); Kato i wsp., Journal of Biochemistry 119:229-236 (1995); Ulich i wsp., Blood 86:971-976 (1995)). MGDF może być stosowany do pobudzania procesu dostarczania płytek, ponieważ podanie MGDF powoduje zwiększenie ilości cyrkulujących płytek do trzykrotnej wartości w porównaniu z ilością obserwowaną u zdrowych donorów płytek.

TPO oraz MGDF wywierają oddziaływanie przez wiązanie z receptorem c-Mp1 który jest eksprymowany głównie na powierzchni pewnych komórek hematopoetycznych takich, jak megakariocyty, płytki, komórki CD34⁺ oraz komórki prymitywnych progenitorów (Debili, N. i wsp., Blood 85:391-401 (1995); de Sauvage, F.J. et al, Nature 369:533-538 (1994); Bartley, T.D., i wsp., Cell 77:1117-1124 (1994); Lok, S. i wsp., Nature 369:565-8 (1994)). Podobnie jak większość receptorów interleukin

PL 219 605 B1 i hormonów proteinowych, c-Mp1 przynależy do klasy I superrodziny receptorów cytokin (Vigon, I. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5640-5644 (1992)). Aktywowanie receptorów tej klasy obejmuje homodimeryzację receptora indukowaną wiązaniem ligandu, która z kolei uruchamia kaskadę zdarzeń powodujących transdukcję sygnałów.

Generalnie, oddziaływanie ligandu proteinowego z jego receptorem często ma miejsce na relatywnie dużej powierzchni styku. Jednakże, jak to przedstawiono w przypadku ludzkiego hormonu wzrostu związanego z jego receptorem, jedynie kilka kluczowych reszt na tej powierzchni styku faktycznie ma udział w większości energii wiążącej (Clackson, T. i wsp., Science 267:383-386 (1995)). To oraz fakt, że pozostała część ligandu proteinowego służy tylko do ustawienia (prezentacji) epitopów wiążących w prawidłowej topologii czyni możliwym znalezienie aktywnych ligandów o znacznie mniejszych rozmiarach.

Przy podjęciu wysiłków w tym kierunku, system ustawienia (prezentacji) biblioteki peptydów fagowych okazał się skuteczną metodą identyfikacji małych peptydowych mimetyków dużych ligandów proteinowych (Scott, J.K. i wsp., Science 249:386 (1990); Devlin, J.J. i wsp., Science 249:404 (1990)). Dzięki zastosowaniu tej techniki, odkryto małe molekuły peptydowe, które działają jako agoniści receptora c-Mp1 (Cwirla, S.E. i wsp., Science 276:1696-1699 (1997)).

W takim badaniu, sekwencje przypadkowych małych peptydów ustawionych (zaprezentowanych) jako fuzje do powłokowych protein włóknistych fagów wyodrębniano metodą chromatografii opartej na powinowactwie do układu przeciwciało - immobilizowana domena zewnątrzkomórkowa c-Mp1, a zatrzymane fagi wzbogacono podczas drugiej rundy oczyszczania przez powinowactwo. Ten proces selekcji pod względem wiązania i ponownej propagacji powtarzano wielokrotnie w celu wzbogacenia zbioru związków silniej wiążących. W wyniku tego, na wstępie zidentyfikowano dwie rodziny peptydów wiążących c-Mp1, niezwiązanych ze sobą pod względem ich sekwencji. Następnie utworzono biblioteki mutagenetyczne w celu dalszej optymalizacji związków najlepiej wiążących, co w końcu doprowadziło do izolacji bardzo aktywnego peptydu o IC50 = 2 nM oraz EC50 = 400 nM (Cwirla, S.E. i wsp., Science 276:1696-1699 (1997)). Ten peptyd o 14 resztach, oznaczono jako TMP (peptydowy mimetyk TPO) nie wykazuje homologii sekwencji względem TPO lub MGDF. Struktura tego związku TMP przedstawia się jak następuje:

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala SEQ ID NO: 1 lub

IEGPTLRQ WLAARA przy użyciu jednoliterowej notacji skrótów nazw aminokwasów.

Poprzednio, w podobnych badaniach dotyczących peptydów mimetycznych EPO, odkryto peptydowy mimetyk EPO przy zastosowaniu takiej samej techniki (Wrighton, N.C. i wsp., Science 273:458-463 (1996)) i stwierdzono, że działa on jako dimer przy wiązaniu z receptorem EPO (EPOR). Tak utworzony kompleks (ligand)2/(receptor)2 wykazywał symetrię typu C2 według danych krystalograficznych w badaniach promieniami X. (Livnah, O. i wsp., Science 273:464-471 (1996)). Opierając się na tych strukturalnych informacjach, zaprojektowano kowalencyjnie związany dimer EMP, w którym C-końce dwóch monomerów EMP były połączone wiązaniami sieciującymi z elastycznym łącznikiem i stwierdzono, że ma on znacznie podwyższoną zdolność wiązania, jak również bioaktywność in vitro/in vivo (W right on, N.C., i wsp., Nature Biotechnology 15:1261-1265 (1997)).

Podobną strategię C-końcowej dimeryzacji zastosowano do peptydowego mimetyku TPO (TMP) (Cwirla, S.E. i wsp., Science 276:1696-1699 (1997)). Stwierdzono, że połączony C-końcami dimer TMP (połączenie C-C) miał ulepszone powinowactwo wiązania o wartości 0,5 nM i znacząco zwiększoną aktywność in vitro (EC50 = 0,1 nM) w próbach proliferacji komórek (Cwirla, S.E. i wsp., Science 276:1696-1699 (1997)). Strukturę tego dimeru C-C TMP określa sekwencja (SEQ ID NO: 2) przedstawiona poniżej:

PL 219 605 B1

W innym aspekcie obecnego wynalazku, tandemowe dimery mogą być następnie przyłączone do jednej lub więcej reszt, które pochodzą z protein immunoglobulinowych, generalnie określanych jako region Fc takich immunoglobulin. Otrzymane związki określa się jako fuzje Fc tandemowego dimeru TMP.

Poniżej krótko przedstawiono podstawowe informacje o regionach Fc przeciwciał, przydatnych w związku z niektórymi obecnymi związkami.

Przeciwciała obejmują dwie funkcjonalne niezależne części, zmienną domenę znaną jako „Fab”, która wiąże antygen oraz stałą domenę znaną jako „Fc”, która zapewnia połączenie z funkcjami efektorowymi takimi, jak ustalanie komplementu lub fagocytoza. Część Fc immunoglobuliny posiada długi czas półtrwania w plazmie, podczas gdy część Fab ma krótką żywotność. (Capon, i wsp., Nature 337:525-531 (1989)).

Terapeutyczne produkty proteinowe skonstruowano przy użyciu domeny Fc próbując zapewnić dłuższy okres półtrwania lub włączyć takie funkcje jak wiązanie receptowa Fc, wiązanie proteiny A, ustalanie komplementu, transfer łożyskowy, za które odpowiedzialny jest region Fc immunoglobulin (Capon, i wsp., Nature 337:525-531 (1989)). Przykładowo, obszar Fc przeciwciała IgG1 poddano fuzji z CD30-L - cząsteczką, która wiąże receptory CD30 eksprymowane na komórkach guza choroby Hodgkin'sa, na anaplastycznych komórkach chłoniaka, na białaczkowych komórkach T oraz na innych rodzajach złośliwych komórek. Patrz opis patentowy USA Nr 5,480,981. IL-10, środek przeciwzapalny i przeciwdziałający odrzutom poddano fuzji z mysim Fcy2a w celu zwiększenia krótkiego okresu półtrwania cyrkulacji tej cytokiny (Zheng, X. i wsp., The Journal of Immunology, 154: 5590-5600 (1995)). W badaniach oceniono również stosowanie receptora czynnika martwicy guza związanego z proteiną Fc ludzkiego IgG1 w leczeniu pacjentów z szokiem septycznym (Fisher, C. i wsp., N. Engl. J. Med., 334:1697-1702 (1996); Van Zee, K. i wsp., The Journal of Immunology, 156: 2221-2230 (1996)). Fc poddano również fuzji z receptorem CD4 otrzymując proteinę terapeutyczną do leczenia AIDS. Patrz Capon i wsp., Nature, 337:525-531 (1989). Ponadto, interleukinę-2 poddano fuzji z częścią Fc IgG1 lub IgG3 aby przezwyciężyć krótki okres półtrwania interleukiny 2 oraz jej toksyczność układową. Patrz: Harvill i wsp., Immunotechnology, 1:95-105 (1995).

Pomimo dostępności TPO oraz MGDF, istnieje nadal potrzeba zapewnienia dodatkowych związków, które posiadają biologiczną aktywność stymulowania wytwarzania płytek (aktywność trombopoetyczną) i/lub prekursorowych komórek płytek, zwłaszcza megakariocytów (aktywność megakariopoetyczna). Obecny wynalazek zapewnia nowe związki posiadające taką aktywność lub takie aktywności oraz realizuje pokrewne aspekty.

Podsumowanie wynalazku

Obecny wynalazek zapewnia grupę związków, które wykazują zdolność wiązania do i wywoływania sygnału transbłonowego przez - to znaczy aktywowania receptora c-Mp1, który jest tym samym receptorem, który pośredniczy w aktywności endogennej trombopoetyny (TPO). Zatem, związki według wynalazku wykazują aktywność trombopoetyczną, to znaczy zdolność do stymulowania, in vivo oraz in vitro, wytwarzania płytek, i/lub aktywność megakariocytopoetyczną, to znaczy zdolność do stymulowania, in vivo oraz in vitro, wytwarzania prekursorów płytek.

PL 219 605 B1

Obecny wynalazek zapewnia następujące rozwiązania:

1. Związek, który wiąże się z receptorem mp1, obejmujący sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO: 34.

2. Związek według pkt. 1, obejmujący sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO: 46.

3. Dimer związku według pkt. 1 albo 2.

4. Związek według dowolnego spośród pkt. 1-3, do stosowania do (a) zwiększania ilości megakariocytów lub płytek u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba, (b) leczenia trombocytopenii u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba, (c) leczenia idiopatycznej lub immunologicznej trombocytopenii u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba, lub (d) leczenia syndromu mielodysplazji u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba.

5. Zastosowanie związku według dowolnego spośród pkt. 1-3, do wytwarzania środka medycznego do:

(a) zwiększania ilości megakariocytów lub płytek u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba, (b) leczenia trombocytopenii u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba, (c) leczenia idiopatycznej lub immunologicznej trombocytopenii u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba, lub (d) leczenia syndromu mielodysplazji u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba.

6. Związek według pkt. 4 lub zastosowanie według pkt. 5, gdzie skuteczna ilość wynosi od 1,0 μg/kg do 100 mg/kg.

7. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek według dowolnego spośród pkt. 1-3, w mieszaninie z jego farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

8. Polinukleotyd kodujący związek według dowolnego spośród pkt. 1-3.

9. Wektor zawierający polinukleotyd według pkt. 8.

10. Komórka gospodarza zawierająca wektor według pkt. 9.

11. Komórka gospodarza według pkt. 10, którą jest komórka E. coli.

12. Komórka gospodarza według pkt. 11, którą to komórką E. coli jest E. coli GM221, zdeponowana w kolekcji ATTC pod numerem dostępu 98957.

13. Sposób wytwarzania związku według dowolnego spośród pkt. 1-3, obejmujący prowadzenie hodowli komórki gospodarza według dowolnego spośród pkt. 10-12 we właściwej pożywce oraz wyodrębnianie tego związku ze wskazanej komórki lub pożywki.

Pochodne powyższych związków (opisane niżej) są również objęte obecnym wynalazkiem.

Związki według obecnego wynalazku są korzystnie peptydami i mogą być wytwarzane w myśl standardowych syntetycznych metod lub dowolnymi innymi metodami wytwarzania peptydów. Związki według obecnego wynalazku, które obejmują części nie-peptydowe mogą być syntezowane na drodze standardowych reakcji chemii organicznej, w dodatku do standardowych reakcji chemii peptydów, kiedy może to mieć zastosowanie.

Związki według obecnego wynalazku mogą być stosowane w celach leczniczych lub profilaktycznych przez połączenie ich z odpowiednimi farmaceutycznie materiałami nośnikowymi i podawanie ich w skutecznych ilościach pacjentom takim, jak ludzie (lub inne ssaki). Inne pokrewne aspekty są również objęte obecnym wynalazkiem.

Krótki opis rysunków

Wiele innych aspektów oraz korzyści wynikających z obecnego wynalazku zostanie teraz opisanych w oparciu o poniższy szczegółowy jego opis, z odniesieniem do rysunków, na których:

FIG. 1 przedstawia przykładowe sekwencje polinukleotydu Fc oraz proteiny (SEQ ID NO: 3 jest nicią kodującą czytającą 5'-3', SEQ ID NO: 4 jest nicią komplementarną czytającą 3'-5', zaś SEQ ID NO: 5 jest kodowaną sekwencją aminokwasów) ludzkiej IgG1, które mogą być stosowane w związkach fuzyjnych Fc według obecnego wynalazku.

FIG. 2 przedstawia schemat syntezy dla wytwarzania pegylowanego peptydu 19 (SEQ ID NO: 17).

FIG. 3 przedstawia schemat syntezy dla wytwarzania pegylowanego peptydu 20 (SEQ ID NO: 18).

FIG. 4 prezentuje ilość płytek wytworzonych in vivo u normalnych myszy BDF1 płci żeńskiej, którym podawano iniekcyjnie pojedynczą dawkę 100 μg/kg różnych związków, jak następuje: PEG-MGDF oznacza PEG o średnim ciężarze cząsteczkowym 20 przyłączony do N-końcowej grupy aminowej metodą redukującego aminowania aminokwasów 1-163 rodzimej ludzkiej TPO, ekspresjonowanej w E. coli (tak, że nie jest glikozylowana) (Patrz: publikacja WO 95/26746 pod tytułem “Kompozycje i sposoby stymulowania wzrostu i różnicowania megakariocytów”); TMP oznacza związek o sekwencji

PL 219 605 B1

SEQ ID NO: 1; TMP-TMP oznacza związek o sekwencji SEQ ID NO: 21; PEG-TMP-TMP oznacza związek o sekwencji SEQ ID NO: 18, gdzie grupa PEG oznacza grupę o średnim ciężarze cząsteczkowym 5 kD przyłączoną jak przedstawiono na rysunku Fig. 3; TMP-TMP-Fc zdefiniowano tutaj poniżej, zaś związek Fc-TMP-TMP jest taki sam jak TMP-TMP-Fc z tym wyjątkiem, że grupa Fc jest podstawiona raczej do N-końca niż do C-końca peptydu TMP-TMP.

FIG. 5 prezentuje ilość płytek generowanych in vivo u normalnych myszy BDF1, którym przez implantowane pompy osmotyczne podawano w okresie 7 dni różne związki. Związki te zdefiniowane są w taki sam sposób jak powyżej w odniesieniu do rysunku Fig. 4.

Fig. 6A, 6B, oraz 6C przedstawiają schematycznie diagramy korzystnych związków ujawnionych w opisie obecnego wynalazku. Fig. 6A obrazuje związek fuzyjny Fc, w którym region Fc jest przyłączony fuzyjnie do N-końca dimeru TMP oraz gdzie fragment Fc ma postać monomeryczną (pojedynczy łańcuch). Fig. 6B przedstawia zawiązek fuzyjny Fc, w którym region Fc jest przyłączony fuzyjnie do N-końca dimeru TMP oraz w którym fragment Fc jest dimeryczny i jeden monomer Fc jest przyłączony do dimeru TMP. Fig. 6C przedstawia związek fuzyjny Fc, w którym region Fc jest przyłączony fuzyjnie do N-końca dimeru TMP oraz gdzie fragment Fc jest dimeryczny i każdy z monomerów Fc jest przyłączony do dimeru TMP.

Szczegółowy opis korzystnych przykładów realizacji wynalazku

Podejmując wysiłek poszukiwania małych struktur mogących odegrać wiodącą rolę w opracowaniu środków leczniczych o bardziej pożądanych właściwościach, zaprojektowano różne typy dimeru TMP oraz pokrewnych struktur, w których C-koniec jednego peptydu TMP przyłączony był do N-końca drugiego peptydu TMP albo bezpośrednio, albo przez łącznik (linker), a następnie badano wpływ tej strategii dimeryzacyjnej na bioaktywność otrzymanych dimerycznych molekuł. W niektórych przypadkach, te tak zwane dimery tandemowe (połączenie C-N), zaprojektowano z łącznikiem pomiędzy dwoma monomerami, przy czym korzystnie linkery zbudowane były z naturalnych aminokwasów, dzięki czemu osiągnięto możliwość wykorzystania technik rekombinacyjnych w ich syntezie.

Obecny wynalazek opiera się na odkryciu grupy związków, które wykazują aktywność trombopoetyczną i które przypuszczalnie przejawiają swą aktywność poprzez wiązanie z endogennym receptorem TPO, c-Mp1.

Związki oraz pochodne

W pierwszym korzystnym wykonaniu, związki ujawnione w opisie wynalazku obejmują następującą ogólną strukturę:

TMP1-(L1)n-TMP2 gdzie każdy z TMP1 oraz TMP2 jest niezależnie wybrany z grupy obejmującej związki posiadające strukturę rdzeniową o wzorze:

Χ2-Χ3-Χ4-Χ5-Χ6-Χ7-Χ8-Χ9-Χ10, gdzie,

X2 jest wybrany z grupy obejmującej Glu, Asp, Lys oraz Val;

Χ3 jest wybrany z grupy obejmującej Gly oraz Ala;

Χ4 oznacza Pro;

Χ5 jest wybrany z grupy obejmującej Thr oraz Ser;

X6 jest wybrany z grupy obejmującej Leu, Ile, Val, Ala oraz Phe;

Χ7 jest wybrany z grupy obejmującej Arg oraz Lys;

X8 jest wybrany z grupy obejmującej Gln, Asn oraz Glu;

X9 jest wybrany z grupy obejmującej Trp, Tyr oraz Phe;

X10 jest wybrany z grupy obejmującej Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met oraz Lys;

L1 oznacza łącznik jak opisany w niniejszym tekście; a „n” oznacza „0” lub „1”;

oraz ich fizjologicznie akceptowalne sole.

W pierwszym wykonaniu L1 obejmuje (Gly)n, gdzie n wynosi od 1 do 20, i kiedy n jest większy od 1, aż do połowy ilości reszt Gly, może być podstawione przez inny aminokwas wybrany spośród pozostałych 19 naturalnych aminokwasów lub ich stereoizomerów.

Poza strukturą rdzeniową X2-X10 określoną wyżej dla TMP1 oraz TMP2, inne pokrewne struktury są również możliwe, w których do struktury rdzeniowej TMP1 i/lub TMP2 wprowadzona jest dodatkowo jedna lub więcej z następujących konfiguracji: podstawnik X1 jest przyłączony do N-końca i/lub X11, X12, X13, i/lub X14 są przyłączone do C-końca, gdzie X1, X11, X12, X13 oraz X14 są jak następuje:

X1 jest wybrany z grupy obejmującej Ile, Ala, Val, Leu, Ser oraz Arg;

PL 219 605 B1

X11 jest wybrany z grupy obejmującej Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His oraz Glu;

X12 jest wybrany z grupy obejmującej Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser oraz Gln;

X13 jest wybrany z grupy obejmującej Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln oraz Gly; a

X14 jest wybrany z grupy obejmującej Ala, ILe, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu oraz Gly.

Określenie “TMP” jest stosowane do oznaczenia ugrupowania utworzonego z - to znaczy obejmującego - co najmniej 9 podjednostek (X₂-X₁₀), gdzie X₂-X₁₀ stanowi strukturę rdzeniową. Podjednostki X2-X14 są korzystnie aminokwasami niezależnie wybranymi z grupy 20 występujących w naturze aminokwasów, jednakże obecny wynalazek obejmuje także związki, w których X2-X14 są niezależnie wybrane z grupy atypowych, nie występujących w naturze aminokwasów dobrze znanych w stanie techniki. Szczegółowe korzystne aminokwasy zidentyfikowano dla każdej pozycji. Przykładowo, X2 może oznaczać Glu, Asp, Lys lub Val. Stosowane są tutaj obie - trzyliterowe i jednoliterowe, notacje; w każdym jednak przypadku, te notacje są skrótami i oznaczeniami standardowymi stosowymi dla 20 występujących w stanie naturalnym aminokwasów lub dla ich dobrze znanych modyfikacji. Te aminokwasy mogą posiadać stereochemię „L” albo „D” (za wyjątkiem Gly, która jest ani „L” ani „D”), a mimetyki TMP mogą obejmować kombinacje stereoizomerów. Jednakże, stereochemia „L” jest korzystna dla wszystkich aminokwasów w łańcuchu TMP. Wynalazek zapewnia również odwrócone cząsteczki TMP, w których od końca aminowego do końca karboksylowego sekwencja jest odwrotna. Przykładowo, odwrotnością cząsteczki posiadającej normalną sekwencję X1-X2-X3 byłaby sekwencja X3-X2-X1. Wynalazek obejmuje również retro-odwrócone cząsteczki TMP, w których, podobnie jak w odwróconych cząsteczkach od końca aminowego do końca karboksylowego sekwencja jest odwrotna, a reszty, które normalnie w TMP są enancjomerami „L” - są zastąpione stereoizomerami „D”.

Ponadto, fizjologicznie akceptowalne sole mimetyków TMP są również objęte wynalazkiem. Określenie „fizjologicznie akceptowalne sole” oznacza dowolne znane sole, jak również sole o których później okaże się, że są fizjologicznie akceptowalne. Niektórymi szczególnymi korzystnymi przykładami takich soli są: octan, trifluorooctan, chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, cytrynian, winian, glikolan, szczawian.

Uwzględnia się również, że „pochodne” mimetyków TMP mogą zastąpić wyżej opisane związki TMP. Takie pochodne mimetyków TMP obejmują cząsteczki, w których wprowadzono jedną lub więcej z następujących modyfikacji:

jedno lub więcej spośród połączeń (wiązań) peptydylowych [-C(O)NR-] zastąpiono przez niepeptydylowe połączenie takie jak połączenie -CH2-karbaminianowe [-CH2-OC(O)NR-]; połączenie fosfonianowe; połączenie -CH2-sulfonamidowe [-CH2-S(O)2NR-]; połączenie mocznikowe [-NHC(O)NH-]; połączenie -CH2-drugorzędowo-aminowe lub alkilowane połączenie peptydylowe [-C(O)NR⁶-, gdzie R⁶ oznacza niższy alkil];

₁ peptydy, w których N-koniec jest zderywatyzowany w grupę -NRR¹; w grupę -NRC(O)R; w gru₁ pę -NRC(O)OR; w grupę -NRS(O)2R; w grupę -NHC(O)NHR, przy czym R oraz R¹ oznaczają atom ₁ wodoru lub niższy alkil, z tym zastrzeżeniem, że R oraz R¹ nie są jednocześnie atomami wodoru; w grupę sukcynimidową; w grupę benzyloksykarbonylo-NH- (CBZ-NH-) lub w grupę benzyloksykarbonylo-NH-, z 1 do 3 podstawnikami w pierścieniu fenylowym, wybranymi z grupy obejmującej niższy alkil, niższy alkoksy, atom chloru oraz bromu; a także peptydy, w których wolny C-koniec jest zderywatyzowany w grupę -C(O)R², gdzie R² jest wybrany z grupy obejmującej niższe reszty alkoksy oraz) -NR³R⁴, gdzie R³ oraz R⁴ są niezależnie wybrane z grupy obejmującej atom wodoru i niższy alkil. Przez określenie „niższy” należy rozumieć grupy zawierające od 1 do 6 atomów węgla.

Ponadto, do cząsteczki TMP mogą być wprowadzane modyfikacje poszczególnych aminokwasów na drodze reakcji wybranych reszt aminokwasowych peptydu z organicznym środkiem derywatyzującym, zdolnym do reakcji z wybranymi bocznymi łańcuchami lub końcowymi resztami. Przykłady są następujące:

Reszty lizynylowe i końcowe reszty aminowe mogą być poddane reakcji z bezwodnikiem bursztynowym lub innymi bezwodnikami kwasów karboksylowych. Derywatyzowanie przy użyciu tych reagentów powoduje odwrócenie ładunku reszt lizynylowych. Inne odpowiednie reagenty dla derywatyzacji reszt z grupami alfa-aminowymi obejmują imidoestry takie jak: pikolinimidian metylu; fosforan pirydoksalu; pirydoksal; chloroborowodorek; kwas trinitrobenzenosulfonowy; O-metyloizomocznik; 2,4-pentanodion oraz reakcja z glioksylanem katalizowana transaminazą.

Reszty arginylowe mogą być modyfikowane w wyniku reakcji z jednym lub kilkoma konwencjonalnymi reagentami, między innymi z fenyloglioksalem, 2,3-butanodionem, 1,2-cykloheksanodionem

PL 219 605 B1 oraz ninhydryną. Derywatyzacja reszt argininowych wymaga prowadzenia reakcji w środowisku alkalicznym z uwagi na wysoką wartość pKa guanidynylowej grupy funkcyjnej. Ponadto, reagenty te mogą reagować z grupami guanidynowymi reszty lizynowej, jak również argininowej.

Specyficzne modyfikacje reszt tyrozylowych jako takich były szeroko badane, zwłaszcza pod katem wprowadzenia znaczników spektralnych do reszt tyrozylowych na drodze reakcji z aromatycznymi związkami diazoniowymi lub tetranitrometanem. Najpowszechniej można stosować N-acetyloimidizol oraz tetranitrometan do wytworzenia odpowiednio O-acetylootyrozylowych związków oraz pochodnych 3-nitro.

Karboksylowe grupy boczne (aspartylowa lub glutamylowa) mogą być selektywnie modyfikowane na drodze reakcji z karbodiimidami (R'-N=C=N-R') takimi jak 1-cykloheksylo-3-(2-morfolinylo-(4-etylo)-karbodiimid lub 1-etyl-3-(4-azonia-4,4-dimetylopentylo)karbodiimid. Ponadto, reszty aspartylowa oraz glutamylowa mogą być przekształcane w reszty asparaginylową oraz glutaminylową na drodze reakcji z jonami amoniowymi.

Reszty glutaminylowe oraz asparaginylowe są często deaminowane do odpowiednich reszt glutamylowych oraz aspartylowych. Alternatywnie, reszty te mogą być deaminowane w łagodnie kwaśnym środowisku. Obie postaci tych grup są objęte obecnym wynalazkiem.

Derywatyzacja bifunkcyjnymi reagentami jest stosowana w celu zespolenia - poprzez usieciowanie - peptydów lub ich funkcjonalnych pochodnych z nierozpuszczalną w wodzie matrycą nośnikową lub innymi wielkocząsteczkowymi nośnikami. Powszechnie stosowanymi reagentami do sieciowania są, przykładowo: 1,1-bis(diazoacetylo)-2-fenyloetan, glutaraldehyd, estry N-hydroksysukcynoimidu, przykładowo, estry z kwasem 4-azydosalicylowym, homobifunkcyjne imidoestry, obejmujące estry disukcynoimidylowe takie, jak 3,3'-ditiobis-(sukcynimidylopropionian) oraz bifunkcyjne maleimidy takie, jak bis-N-maleimido-1,8-oktan. Derywatyzujące środki takie, jak metylo-3-[(p-azydofenylo)ditio]propioimidan prowadzą do wytworzenia związków pośrednich ulegających fotoaktywacji, zdolnych do tworzenia wiązań sieciujących w obecności światła. Alternatywnie, reaktywne, nierozpuszczalne w wodzie matryce takie, jak węglowodany aktywowane bromocyjanem oraz reaktywne substraty opisane w opisach patentowych USA Nr 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 oraz 4,330,440 mogą być zastosowane w celu unieruchomienia protein.

Inne możliwe modyfikacje obejmują hydroksylowanie proliny oraz lizyny, fosforylowanie grup hydroksylowych reszt serylowych lub treonylowych, utlenianie atomu siarki w Cys, metylowanie grup alfa-aminowych w łańcuchach lizynowych, argininowych oraz histydynowych łańcuchach bocznych (Creighton, T.E., Proteins: Strukture and Molekule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, str. 79-86 (1983)), acetylowanie N-końcowej aminy oraz - w niektórych przypadkach - amidowanie C-końcowych grup karboksylowych.

Takie zderywatyzowane reszty korzystnie poprawiają jedną lub kilka charakterystyk związków według wynalazku, w tym aktywność trombopoetyczną, rozpuszczalność, absorpcję, biologiczny okres półtrwania i temu podobne. Alternatywnie, derywatyzacja ugrupowań prowadzi do związków, które wykazują takie same lub zasadniczo takie same charakterystyki i/lub właściwości jak związek, który nie jest zderywatyzowany. Takie ugrupowania mogą alternatywnie eliminować lub osłabiać dowolny niepożądany efekt uboczny obecnych związków itp.

Poza omówioną wyżej strukturą rdzeniową X2-X10, innymi szczegółowo rozważanymi strukturami są te, w których jedna lub kilka dodatkowych grup X jest przyłączona do wskazanej struktury rdzeniowej. A więc X1 i/lub X11, X12, X13 oraz X14 mogą być przyłączone do struktury rdzeniowej. Niektóre przykładowe dodatkowe struktury są następujące:

X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11;

Χ2-Χ3-Χ4-Χ5-Χ6-Χ7-Χ8-Χ9-Χ10-Χ11-Χ12;

Χ2-Χ3-Χ4-Χ5-Χ6-Χ7-Χ8-Χ9-Χ10-Χ11-Χ12-Χ13;

X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14;

Χ1-Χ2-Χ3-Χ4-Χ5-Χ6-Χ7-Χ8-Χ9-Χ10;

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11;

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Xg-X10-X11-X12;

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13;

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14, w których X1 do X14 są takie jak to opisano powyżej. Każdy z TMP1 oraz TMP2 może być taki sam lub różny pod względem sekwencji i/lub długości. W niektórych korzystnych przykładach realizacji TMP1 oraz TMP2 są takie same.

PL 219 605 B1

Szczególnie korzystnym TMP jest:

Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO: 1).

Stosowany w niniejszym opisie termin obejmujący(ca) oznacza między innymi, że związek może obejmować dodatkowe aminokwasy na każdym lub obu końcach, na - lub C-końcu danej sekwencji. Jednakże, jak długo w związku występuje struktura taka, jak X2 do X10, X1 do X14 lub jedna z innych przykładowych struktur, pozostała część struktury chemicznej jest stosunkowo mniej doniosła. Oczywiście, dowolna struktura poza rdzeniową strukturą X2 do X10 lub X1 do X14, nie powinna istotnie kolidować z trombopoetyczną aktywnością związku. Przykładowo, N-końcową resztę Met traktuje się jako objętą niniejszym wynalazkiem. Ponadto, jakkolwiek wiele z korzystnych związków według wynalazku jest dimerami tandemowymi w tym sensie, że posiadają dwa ugrupowania TMP, inne związki według obecnego wynalazku są multimerami tandemowymi wielu TMP, to znaczy związkami o następujących przykładowych strukturach:

TMP1-L-TMP2-L-TMP3;

TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4;

TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP5;

gdzie TMP1, TMP2, TMP3, TMP4 oraz TMP5 mogą mieć taką samą lub różne struktury oraz gdzie każdy TMP oraz „L” ma znaczenie jak określono w niniejszym tekście, a obecność każdego z linkerów ma charakter ewentualny. Korzystnie, związki według obecnego wynalazku będą miały od 2 do 5 ugrupowań TMP, szczególnie korzystnie 2-3, a najkorzystniej 2. Związki według pierwszego wykonania obecnego wynalazku będą korzystnie miały ogółem mniej niż około 60, bardziej korzystnie mniej niż około 40 aminokwasów (to znaczy, będą one peptydami).

Jak zauważono powyżej, związki według pierwszego przykładu realizacji obecnego wynalazku są korzystnie dimerami TMP, które są albo związane bezpośrednio lub są związane przez grupę łącznikowego linkera. Monomeryczne ugrupowania TMP przedstawiono w konwencjonalnej orientacji od N-końca do C-końca przy odczycie od lewej do prawej. Zgodnie z tym można zobaczyć, że wszystkie związki według wynalazku są zorientowane tak, że C-koniec TMP1 jest przyłączony albo bezpośrednio lub przez linker do N-końca TMP2. Orientacja taka jest określana jako orientacja tandemowa, a o związkach według wynalazku można generalnie mówić jako o „dimerach tandemowych”. Związki te określa się jako dimery nawet wówczas gdy TMP1 oraz TMP2 są strukturalnie odmienne. Oznacza to, że przewiduje się zarówno homodimery, jak i heterodimery.

Grupa “linkera” (“L1”) występuje ewentualnie. Gdy jest obecna nie jest istotne jaką ma strukturę chemiczną, gdyż przede wszystkim służy ona do zwiększenia odstępu. Linker powinien być dobrany tak, by nie wpływać na biologiczną aktywność końcowego związku i tak aby immunogeniczność końcowego związku nie wzrosła w sposób znaczący. Linker korzystnie składa się z aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi. Zatem, w korzystnym wykonaniu, linker obejmuje Yn, gdzie Y jest aminokwasem występującym w naturze lub jego stereoizomerem, zaś „n” jest liczbą całkowitą od 1 do 20. Stąd, linker jest utworzony od 1 do 20 aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi, w którym aminokwasy są wybrane spośród 20 aminokwasów występujących w naturze. W bardziej korzystnym wykonaniu 1 to 20 aminokwasów jest wybranych spośród Gly, Ala, Pro, Asn, Gln, Cys, Lys. Jeszcze bardziej korzystnie, linker jest utworzony w większości z aminokwasów, w których nie występuje zawada steryczna takich, jak Gly, Gly-Gly [(Gly)2], Gly-Gly-Gly [(Gly)3]... (Gly)2O, Ala, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala, etc. Innymi szczegółowymi przykładami linkerów są:

(Gly)3Lys(Gly)4 (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 6); (SEQ ID NO: 7) (ta struktura dostarcza miejsce dla glikozylacji, kiedy jest wytwarzana rekombinacyjnie w układzie komórek ssaków, zdolnym do glikozylacji takich miejsc);

(Gly)3Cys(Gly)4

GlyProAsnGly (SEQ ID NO: 8) i (SEQ ID NO: 9).

By wyjaśnić powyższe oznaczenia, przykładowo, (Gly)3Lys(Gly)4 oznacza Gly-Gly-Gly-Lys-GlyGly-Gly-Gly. Kombinacje Gly oraz Ala są również korzystne.

Linkery nie-peptydowe są również możliwe. Przykładowo, mogą być stosowane linkery alkilowe takie jak -HN-(CH2)s-CO-, gdzie s = 2-20. Te alkilowe linkery mogą być dalej podstawione przez dowolną, pozbawioną zawady sterycznej grupę taką, jak niższy alkil (przykładowo, C1-C6), niższy acyl, atom chlorowca (przykładowo Cl, Br), grupę CN, grupę NH2, grupę fenylową itd.

PL 219 605 B1

Inny typem nie-peptydowego linkera jest grupa glikolu polietylenowego taka, jak:

-HN-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)n-O-CH2-COgdzie „n” ma taką wartość, że całkowita masa cząsteczkowa linkera zawiera się w zakresie od około 101 do 5000, korzystnie od 101 to 500.

Generalnie odkryto, że linker o długości około 0-14 podjednostek (przykładowo, aminokwasów) jest korzystny w przypadku związków trombopoetycznych objętych pierwszym przykładem realizacji obecnego wynalazku.

Linkery peptydowe mogą być zmienione do postaci pochodnych w taki sam sposób jak opisano powyżej dla ugrupowań TMP.

Związki z tej pierwszej grupy mogą dodatkowo mieć budowę liniową lub cykliczną. Przez określenie “cykliczny” rozumie się, że co najmniej dwie oddzielone, to znaczy nie-sąsiednie, części molekuły linkera są połączone jedna z drugą. Przykładowo, aminowe i karboksylowe końce molekuły mogłyby być kowalencyjnie związane z wytworzeniem cyklicznej cząsteczki. Alternatywnie, molekuła mogłaby zawierać dwie lub więcej reszt Cys (przykładowo, w linkerze), które mogłyby ulec cyklizacji poprzez utworzenie wiązania disiarczkowego. Ponadto, przewidziano, że więcej niż jeden tandemowy dimer peptydowy mogą być przyłączone tworząc dimer dimerów. Tak więc, przykładowo, dimer tandemowy zawierający resztę Cys może utworzyć międzycząsteczkowe dwusiarczkowe wiązanie z resztą Cys z drugiego takiego dimeru. Patrz, przykładowo, związek o sekwencji SEQ ID NO: 20, poniżej.

Związki według wynalazku mogą być również związane kowalencyjnie lub nie-kowalencyjnie z cząsteczką nośnika taką, jak liniowy polimer (przykładowo, glikol polietylenowy, polilizyna, dekstran itd.), polimer o rozgałęzionym łańcuchu (patrz, przykładowo, opis patentowy USA nr 4,289,872 dla Denkenwalter i wsp., opublikowany 15 września, 1981; 5,229,490 dla Tam, opublikowany 20 lipca,

1993; dokument WO 93/21259 - Frechet i wsp., opublikowany 28 października, 1993), lipid, grupa cholesterolowa (taka jak steroid), lub węglowodan lub oligosacharyd. Inne możliwe nośniki obejmują jeden lub więcej rozpuszczalnych w wodzie polimerów mogących przyłączać się, takich jak glikol polioksyetylenowy lub glikol polipropylenowy, jak to opisano w opisach patentowych USA nr 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 oraz 4,179,337. Ponadto inne przydatne polimery znane w stanie techniki obejmują glikol monometoksy-polietylenowy, dekstran, celulozę lub inne polimery oparte na węglowodanach, glikol poli-(N-winylo-pirolidono)polietylenowy, homopolimery glikolu propylenowego, kopolimer tlenek polipropylenu/tlenek etylenu, polioksyetylowane poliole (przykładowo gliceryna) i alkohol poliwinylowy, jak również mieszaniny tych polimerów.

Korzystnym takim nośnikiem jest glikol polietylenowy (PEG). Grupa PEG może mieć dowolną dogodną masę cząsteczkową i może posiadać łańcuch prosty lub rozgałęziony. Przeciętna masa cząsteczkowa PEG korzystnie zawiera się w przedziale od około 2 kDa do około 100 kDa, bardziej korzystnie od około 5 kDa do około 50 kDa, a najbardziej korzystnie od około 5 kDa do około 10 kDa.

Grupy PEG będą generalnie przyłączane do związków według wynalazku przez acylowanie, redukujące alkilowanie, addycję Michaela, tiolowe alkilowanie lub przez inne chemoselektywne metody koniugowania/ligacji poprzez reaktywną grupę w reszcie PEG (przykładowo grupę aldehydową, aminową estrową, tiolową, α-haloacetyloową, maleimidową lub hydrazynową) do reaktywnej grupy wybranego związku (przykładowo do grupy aldehydowej, aminowej, estrowej, tiolowej, α-haloacetyloowej, maleimidowej lub hydrazynowej).

Grupy węglowodanowe (oligosacharydowe) mogą dogodnie być przyłączone do miejsc, które są znane jako miejsca glikozylacyjne w proteinach. Generalnie, oligosacharydy połączone przez atom tlenu są przyłączone do reszt seryny (Ser) lub treoniny (Thr) podczas gdy oligosacharydy przyłączone są przez atom azotu do reszt asparaginy (Asn) kiedy stanowią fragment sekwencji Asn-X-Ser/Thr, gdzie X może być jakimkolwiek aminokwasem za wyjątkiem proliny. Korzystnie „X” oznacza jeden spośród 19 aminokwasów występujących w naturze, nie wliczając w to proliny. Struktury N-związanych i O-związanych oligosacharydów i reszt cukrowych znalezione w każdym z typów są różne. Jednym rodzajem cukru, który powszechnie występuje w obu jest kwas N-acetyloneuraminowy (zwany kwasem sialowym). Kwas sialowy stanowi zwykle końcową resztę obu, N-związanych i O-związanych oligosacharydów i poprzez swój negatywny ładunek może nadawać kwasowe właściwości glikozylowanemu związkowi. Takie miejsce(a) mogą być włączone do linkera w związkach według obecnego wynalazku i są korzystnie glikozylowane w komórce podczas rekombinacyjnego wytwarzania związków polipeptydowych (przykładowo, w komórkach ssaków takich jak CHO, BHK, COS). Jednakże,

PL 219 605 B1 takie miejsca mogą dalej być glikozylowane na drodze syntetycznych lub semisyntetycznych procedur znanych w stanie techniki.

Niektóre przykładowe peptydy według obecnego wynalazku przedstawiono poniżej. Zastosowano jednoliterowe skróty nazw aminokwasów, a linker jest dla jasności oddzielony myślnikami. Dodatkowe oznaczenia: BrAc oznacza grupę bromoacetylową (BrCH2C(O)), natomiast PEG oznacza glikol polietylenowy.

IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cykliczny)

I-1

IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (liniowy)

IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGK(BrAc)GGGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGK(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGC(PEG)GGGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA

IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 10) (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 19)

IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 20)

IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ ID NO: 21)

W każdym z powyższych związków, N-końcowa reszta Met (lub reszta M, stosując notację jednoliterową) jest również przewidziana. Przewidziano również multimery (przykładowo, tandemowe i nie-tandemowe, kowalencyjnie związany i nie-kowalencyjnie związany) powyższych związków.

W drugim przykładzie realizacji obecnego wynalazku, opisane powyżej związki mogą następnie być poddane fuzji do jednej lub więcej grup Fc albo bezpośrednio lub przez grupy linkerowe. Generalnie, wzór tej drugiej grupy związków przedstawia się następująco:

(Fc)m-(L2)q-TMP1-(L1)n-TMP2-(L3)r-(Fc)p gdzie TMP1, TMP2 oraz „n” mają powyżej opisane znaczenie; L1, L2 oraz L3 oznaczają grupy linkera, z których każdą wybrano niezależnie z grup linkerów wyżej opisanych; Fc oznacza region Fc immunoglobuliny; każdy z symboli „m”, „p”, „q” oraz „r” jest wybrany niezależnie z grupy obejmującej „0” i „1”, gdzie co najmniej jeden z symboli „m” lub „p” wynosi „1”, a ponadto jeżeli „m” wynosi „0”, to „q” wynosi „0” i jeżeli „p” wynosi „0”, to „r” wynosi „0”; oraz obejmuje fizjologicznie akceptowalne sole tych związków.

Zgodnie z tym, związki tej drugiej grupy posiadają struktury takie, jak zdefiniowane w przypadku pierwszej grupy związków, jak to opisano powyżej, lecz związki te są następnie poddane fuzji do co najmniej jednej grupy Fc albo bezpośrednio albo przez jedną lub więcej grup linkerowych.

Sekwencja Fc w powyższych związkach może być wybrana z ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny IgG-1, patrz: Ellison, J.W. i wsp., Acids Res. 10:4071-4079 (1982), lub z jakiejkolwiek innej sekwencji Fc znanej w sztuce (przykładowo: inne klasy IgG obejmują, lecz nie ograniczają się do: IgG-2, IgG-3 oraz IgG-4, lub inne immunoglobuliny).

Jest powszechnie wiadomym, że obszary Fc przeciwciał składają się z monomerycznych segmentów polipeptydowych, które mogą być przyłączone w formy dimerycznych lub multimerycznych przez wiązania dwusiarczkowe, lub przez niekowalencyjne połączenie. Ilość międzycząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych pomiędzy monomerycznymi podjednostkami naturalnych molekuł Fc zawiera się między 1 a 4, w zależności od klasy (przykładowo, IgG, IgA, IgE) lub podklasy (przykładowo, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2) danego przeciwciała. Używane tu określenie “Fc” stanowi rodzajowe określenie monomerycznych, dimerycznych i multimerycznych form molekuł Fc. Powinno się zauważyć, że monomery Fc będą spontanicznie dimeryzować kiedy występują odpowiednie reszty Cys, jeśli tylko nie wystąpią szczególne warunki zapobiegające dimeryzacji poprzez tworzenie wiązań dwusiarczkowych. Nawet jeżeli reszty Cys, które normalnie tworzą wiązania dwusiarczkowe w dimerze Fc są usunięte lub zamienione przez inne reszty, monomeryczne łańcuchy będą generalnie dimeryzować przez niekowalencyjne oddziaływania. Używany tutaj termin “Fc” oznacza jakąkolwiek z podanych form: naturalny monomer, naturalny dimer (połączony wiązaniem dwusiarczkowym), modyfikowane

PL 219 605 B1 dimery (dwusiarczkowe i/lub niekowalencyjne połączenia) oraz modyfikowane monomery (przykładowo, pochodne).

Odmiany, analogi lub pochodne części Fc mogą być konstruowane przez, przykładowo, wykonywanie różnych podstawień reszt lub sekwencji.

Odmiany (lub analogi) polipeptydów obejmują odmiany ze wstawieniami, gdzie jedna lub więcej reszt aminokwasowych uzupełnia aminokwasową sekwencję Fc. Wstawienia mogą być umiejscowione na każdym lub obu końcach proteiny lub mogą być umiejscowione w obrębie wewnętrznych obszarów sekwencji aminokwasowej Fc. Odmiany ze wstawieniami z dodatkowymi resztami na każdym lub obu końcach mogą obejmować, przykładowo, proteiny fuzyjne oraz proteiny obejmujące aminokwasowe etykietki lub znaczniki. Przykładowo, molekuła Fc może ewentualnie zawierać N-końcową resztę Met, zwłaszcza gdy molekuła jest ekspresjonowana rekombinacyjnie w komórkach bakterii takich, jak E. coli.

W wariantach delecyjnych Fc, w polipeptydzie Fc usunięto jedną lub więcej reszt aminokwasowych. Usunięcia może zrealizować na jednym lub obu końcach polipetydu Fc, lub też usunąć jedną lub więcej reszt wewnątrz sekwencji aminokwasowej Fc. Dlatego też odmiany delecyjne obejmują wszystkie fragmenty sekwencji polipetydu Fc.

W wariantach Fc z podstawieniami, usunięto jedną lub więcej reszt aminokwasowych polipeptydu Fc i zastąpiono je alternatywnymi resztami. W jednym aspekcie, podstawienia mają charakter zachowawczy, jednakże wynalazek obejmuje podstawienia, które również są nie-zachowawcze.

Przykładowo, reszty cysteinowe mogą być usunięte lub zastąpione innymi aminokwasami aby zabezpieczyć przed tworzeniem dwusiarczkowych wiązań sieciujących sekwencje Fc. W szczególności, aminokwasy w pozycjach 7 oraz 10 w sekwencji SEQ ID NO:5 są resztami cysteinowymi. Można usunąć każdą z tych reszt cysteinowych lub podstawić jedną lub więcej takich reszt cysteinowych innymi aminokwasami takimi, jak Ala lub Ser. W innym przykładzie modyfikacje mogą również być tworzone w celu wprowadzenia podstawień aminokwasowych w celu (1) usunięcia miejsca wiążącego receptor Fc; (2) usunięcia miejsca wiążącego komplement (C1q); i/lub w celu (3) usunięcia miejsca mediowanej przez komórkę cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (ADCC). Takie miejsca są znane w stanie techniki i wszelkie znane podstawienia objęte są określeniem Fc w znaczeniu stosowanym w niniejszym tekście. Przykładowo, patrz Molecular Immunology, Vol. 29, Nr 5, 633-639 (1992) odnośnie miejsc ADCC w IgG1.

Podobnie, jedna lub więcej reszt tyrozynowych może być również zamieniona resztami fenyloalaniny. Ponadto, inne odmiany insertów aminokwasowych, delecji (przykładowo, od 1-25 aminokwasów) i/lub podstawień są również przewidziane i wchodzą w zakres obecnego wynalazku. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe będą generalnie uważane za korzystne. Ponadto, zmiany mogą być w formie zmienionych aminokwasów, takich jak peptydomimetyki lub D-aminokwasy.

Sekwencje Fc związku TMP mogą również być zderywatyzowane, to znaczy mogą posiadać modyfikacje inne niż wstawiania, delecje, lub podstawiania reszt aminokwasowych. Korzystnie, modyfikacje są kowalencyjne z natury i obejmują, przykładowo, wiązania chemiczne z polimerami, lipidami, innymi organicznymi i nieorganicznymi resztami. Pochodne według wynalazku mogą być wytworzone do zwiększania okresu półtrwania w obiegu lub mogą być zaprojektowane w celu poprawy docelowej zdolności do stanowienia przez peptyd celu dla pożądanych komórek, tkanek i organów.

Jest również możliwe stosowanie domeny wiążącej receptora „ratunkowego” nienaruszonej cząsteczki Fc w charakterze części Fc cząsteczki związku według wynalazku, takiej jak opisano w dokumencie WO 96/32478, zatytułowanym “Zmodyfikowane polipeptydy o zwiększonym okresie półtrwania”. Dodatkowymi członami klasy cząsteczek określonych jako Fc w niniejszym tekście są człony opisane w dokumencie WO 97/34631, zatytułowanym “Domeny immunoglobulino-podobne o zwiększonym okresie półtrwania”.

Fuzje Fc mogą występować przy N- lub C-końcu TMP1 lub TMP2, bądź przy obu końcach Noraz C- reszt TMP. Nieoczekiwanie okazało się, że peptydy, w których ugrupowanie Fc jest ligowane do końca -N reszty TMP są bardziej aktywne biologicznie niż inne, zatem fuzja mająca domenę Fc przy N-końcu TMP1 (to znaczy związek, w którym zarówno „r”, jak i „p” są równe „0”, a „m” oraz „q” są równe „1” we wzorze ogólnym) jest korzystna. Kiedy łańcuch Fc jest w stanie fuzji z N-końcem TMP lub linkera, taka fuzja generalnie wystąpi przy C-końcu łańcucha Fc i vice versa.

Korzystne również są związki które są dimerami (przykładowo tandemowymi i nie-tandemowymi) związków określonych ogólnym wzorem podanym wyżej. W takich przypadkach, każdy łańcuch Fc będzie związany z dimerem tandemowym peptydów TMP. Schematyczny przykład takiego

PL 219 605 B1 związku przedstawiono na rysunku Fig. 6 C. Korzystnym przykładem tego typu związku jest związek oparty na rysunku Fig. 6 C, gdzie Fc oznacza dimer związku o sekwencji SEQ ID NO: 5; każdy łącznik L2 oznacza (Gly)5; każdy TMP1 oraz TMP2 jest związkiem o sekwencji SEQ ID NO: 1, a każdy łącznik L1 oznacza (Gly)8. Związek ten jest również określony tutaj jako “Fc-TMP1-L-TMP2”. Jest również przedstawiony jako dimer (przez część Fc) o sekwencji SEQ ID NO: 34. Przewidziano również analogiczny związek, w którym grupa Fc jest przyłączona przez linker do C-końca grupy TMP2 na rysunku Fig. 6C, określany tutaj jako TMP1-L-TMP2-FC.

Kilka specyficznych przykładów związków z omawianej drugiej grupy obejmuje:

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA-Fc

IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cykliczny)

I-1

Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (liniowy)

Fc-IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ-ID-NO: 22) (SEQ-ID-NO: 23) (SEQ-ID-NO: 24) (SEQ-ID-NO: 25) (SEQ-ID-NO: 26) (SEQ-ID-NO: 27) (SEQ-ID-NO: 28) (SEQ-ID-NO: 29) (SEQ-ID-NO: 30) (SEQ-ID-NO: 31) (SEQ-ID-NO: 32) (SEQ ID NO: 33) (SEQ ID NO: 34)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA W każdym z powyższych związków, przewidziano również dodatkową N-końcową Met (lub resztę Μ, stosując notację jednoliterową). Reszta Met może być przyłączona do N-końca grupy Fc w tych przypadkach, gdzie grupa Fc przyłączona jest do N-końca TMP. W tych przypadkach, gdzie grupa Fc przyłączona jest do C-końca TMP, reszta Met mogłaby być przyłączona do N-końca grupy TMP.

W każdym z powyższych przypadków Fc oznacza korzystnie region Fc ciężkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny IgG1 lub biologicznie aktywny fragment, pochodną lub dimer tych reszt, patrz: Ellison, J.W. i wsp., Nucleic Acids Res. 10:4071-4079 (1982). Sekwencja Fc przedstawiona w sekwencji SEQ ID NO:5 jest najbardziej korzystną postacią Fc dla powyższych związków. Również korzystne są powyższe związki, w których Fc oznacza dimeryczną formę sekwencji SEQ ID NO:5, a każdy łańcuch Fc przyłączony jest do dimera tandemowego TMP.

Ponadto, jakkolwiek wiele spośród korzystnych związków według drugiego przykładu realizacji obejmuje jeden lub więcej dimerów tandemowych, w tym sensie, że posiadają one dwa połączone ugrupowania TMP, inne związki według obecnego wynalazku obejmują multimery tandemowe TMP, to znaczy związki o następującej przykładowej budowie:

FC-TMP1-L-TMP2-L-TMP3;

Fc-TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4;

FC-TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP5;

TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-Fc;

TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-Fc;

TMP1-L-TMP2-L-TMP3-L-TMP4-L-TMP-5-L-FC;

gdzie TMP1, TMP2, TMP3, TMP4, oraz TMP5, mogą posiadać taką samą lub różną budowę i gdzie Fc oraz każdy TMP i L zdefiniowano powyżej, przy czym linkery są członami występującymi ewentualnie. W każdym powyższym przypadku, grupa Fc może być monomeryczna lub dimeryczna i w przypadku, kiedy Fc jest dimerem, jeden lub więcej multimerów TMP może być przyłączonych do każdego łańcucha Fc. Przewidziano również inne przykłady, gdzie dimery lub multimery TMP przyłączone są do obu N- oraz C-końców jednego lub obu łańcuchów Fc, obejmując również przypadek, w którym dimery lub multimery TMP przyłączone są do wszystkich czterech końców dwóch łańcuchów Fc.

Korzystnie, związki według tego drugiego wykonania wynalazku będą miały ogólnie od około 200 do 400 aminokwasów (to znaczy będą one polipeptydami).

PL 219 605 B1

Sposoby wykonania

Związki według obecnego wynalazku mogą być wytwarzane różnymi sposobami. Ponieważ wiele obecnych związków będzie peptydami lub obejmować będzie peptydy, sposoby wytwarzania peptydów są tu szczególnie ważne. Przykładowo, mogą być stosowane techniki syntezy w fazie stałej. Odpowiednie techniki są dobrze znane w stanie techniki i mogą obejmować te opisane w: Merrifield, Chem. Polipeptydy, str. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds. 1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963); Davis i wsp., Biochem. Intl. 10:394-414 (1985); Stewart and Young, Solid Phase Peptyde Synthesis (1969); Patenty USA Nr 3,941,763; Finn i wsp., The Proteins, 3rd ed., vol. 2, str. 105-253 (1976); oraz Erickson i wsp., The Proteins, 3rd ed., vol. 2, str. 257-527 (1976). Synteza w fazie stałej jest korzystną techniką wytwarzania poszczególnych peptydów ponieważ jest najbardziej efektywnym pod względem kosztów sposobem wytwarzania małych peptydów.

Peptydy mogą być również wytwarzane w transformowanych komórkach gospodarza przy użyciu rekombinacyjnych technik DNA. Aby tego dokonać, wytworzono kodującą peptyd molekułę rekombinacyjnego DNA. Sposoby wytwarzania takich molekuł DNA i/lub RNA są dobrze znane w stanie techniki. Na przykład, sekwencje kodujące peptydy mogłyby być odcięte z DNA przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych. Odnośne sekwencje mogą być tworzone przy użyciu polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) z włączeniem użytecznych miejsc restrykcyjnych do klonowania następczego. Alternatywnie, molekuły DNA/RNA mogłyby być wytwarzane przy użyciu technik syntezy chemicznej, takich jak metoda fosforamidytowa. Również kombinacja tych technik mogłaby być stosowana.

Wynalazek obejmuje również wektor kodujący peptydy w odpowiednim gospodarzu. Wektor obejmuje molekułę DNA kodującą peptydy operacyjnie przyłączon e do odpowiednich sekwencji kontrolujących ekspresję. Sposoby realizacji tego połączenia operacyjnego albo przed albo po wprowadzeniu cząsteczki DNA kodującej peptyd do wektora, są dobrze znane. Sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują promotory, aktywatory, enhancery, operatory, wiążące miejsca rybosomalne, sygnały startowe, sygnały stopujące, sygnały cap, sygnały poliadenylowania oraz inne sygnały zaangażowane w kontrolowanie transkrypcji i translacji.

Otrzymany wektor obejmujący cząsteczkę DNA kodującą peptyd, jest stosowany do transformacji odpowiedniego gospodarza. Transformacja ta może być prowadzona przy użyciu sposobów dobrze znanych w stanie techniki.

Dowolne spośród dużej ilości dostępnych i dobrze znanych komórek gospodarza mogą być stosowane przy realizacji obecnego wynalazku. Wybór określonego gospodarza zależy od szeregu czynników rozpoznanych w stanie techniki. Czynniki te obejmują, przykładowo, zgodność z wybranym wektorem ekspresji, toksyczność peptydów kodowanych przez cząsteczkę DNA w stosunku do komórek gospodarza, szybkość transformacji, łatwość wyodrębniania peptydów, charakterystyki ekspresji, bezpieczeństwo biologiczne i koszty. Równowaga tych czynników musi zderzać się ze zrozumieniem, że nie wszystkie komórki gospodarza mogą być równie skuteczni w ekspresji określonej sekwencji DNA.

Uwzględniając powyższe wskazówki ogólne, użytecznymi mikrobowymi gospodarzami są bakterie (takie jak E. coli), drożdże (takie jak Saccharomyces sp. oraz Pichia pastoris) oraz inne hodowle komórek grzybów, insektów, roślin, ssaków (w tym komórki ludzkie) lub inni gospodarze znani w stanie techniki.

Następnie, transformowanego gospodarza poddaje się hodowli w konwencjonalnych warunkach fermentacji tak, że pożądane peptydy podlegają ekspresji. Takie warunki fermentacji są dobrze znane w stanie techniki.

Na koniec, peptydy wyodrębnia się i oczyszcza z brzeczki fermentacyjnej lub z komórek gospodarza, w których były ekspresjonowane. Te metody oczyszczania są również dobrze znane w stanie techniki.

Związki, które zawierają zderywatyzowane peptydy lub które zawierają grupy nie-peptydowe mogą być syntezowane dobrze znanymi technikami chemii organicznej.

Zastosowania obecnych związków

Związki według obecnego wynalazku posiadają zdolność wiązania do receptora c-Mp1 oraz jego aktywowania i/lub posiadają zdolność stymulowania wytwarzania (zarówno in vivo, jak i in vitro) płytek (“aktywność trombopoetyczna”) oraz prekursorów płytek (“aktywność megakariocytopoetyczna”). W celu zmierzenia aktywności tych związków, można wykorzystywać standardowe próby takie,

PL 219 605 B1 jak opisane w publikacji WO 95/26746 zatytułowanej “Kompozycje oraz sposoby stymulacji wzrostu i różnicowania megakariocytów”. Próby in vivo opisano w dalszej części opisu, obejmującej przykłady.

Stany przewidziane do leczenia sposobami i kompozycjami według wynalazki są generalnie tymi, które obejmują występowanie niedoboru megakariocytów/płytek lub oczekiwanego lub przewidywanego niedoboru megakariocytów/płytek w przyszłości (przykładowo z powodu planowanego zabiegu operacyjnego lub dawstwa płytek). Takie stany mogą być następstwem niedoboru (czasowego lub ciągłego) aktywnego ligandu Mp1 in vivo. Ogólnym określeniem niedoboru płytek jest trombocytopenia i dlatego sposoby i kompozycje według obecnego wynalazku są generalnie dostępne dla celów profilaktyki lub terapeutycznego leczenia trombocytopenii u pacjentów, którym jest to potrzebne.

Światowa Organizacja Zdrowia sklasyfikowała stopień trombocytopenii na bazie ilości cyrkulujących płytek u osobnika (Miller, i wsp., Cancer 47:210-211 (1981)). Przykładowo, osobnik bez żadnych ₃ objawów trombocytopenii (stopień „0”) będzie miały generalnie co najmniej 100.000 płytek/mm³.

Łagodną trombocytopenię (Stopień 1) wskazuje poziom cyrkulujących płytek pomiędzy 79.000 ₃ a 99.000/mm³. Przy średniej trombocytopenii (Stopień 2) obserwuje się pomiędzy 50.000 a 74.000 ₃ płytek/mm³, a ciężka trombocytopenia charakteryzuje się ilością pomiędzy 25.000 a 49.000 pły₃ tek/mm³. Zagrażająca życiu lub powodująca debilizację trombocytopenia charakteryzuje się stężeniem ₃ cyrkulujących płytek poniżej 25.000/mm³.

Trombocytopenia (niedobór płytek) może występować z wielu powodów, obejmujących chemioterapię oraz inne sposoby leczenia polegające na podawaniu różnych leków, radioterapię, operacje chirurgiczne, utratę krwi na skutek wypadków i inne specyficzne stany chorobowe. Przykładowe specyficzne stany chorobowe, które obejmują trombocytopenię i mogą być leczone zgodnie z obecnym wynalazkiem, są: aplastyczna anemia; idiopatyczna lub odpornościowa trombocytopenia (ITP), w tym idiopatyczna plamica trombocytopeniczna związana z rakiem piersi; ITP związana z HIV oraz pokrewna z HIV zakrzepowa plamica trombocytopenicza; metastatyczne guzy powodujące trombocytopenię; ogólnoustrojowy liszaj rumieniowaty; w tym neonatalny syndrom toczenia splenomegalia; syndrom Fanconiego; niedobór witaminy B12; niedobór kwasu foliowego; anomalia May-Hegglin'a; syndrom Wiskott-Aldrich'a; przewlekła choroba wątroby; syndrom mielodysplazji związany z trombocytopenią; napadowa hemoglobinuria nocna; ostra i głęboka trombocytopenia po terapii C7E3 Fab (Abciximab); alloimmuniczna trombocytopenia, w tym macierzyńska alloimmuniczna trombocytopenia; trombocytopenia związana z przeciwciałami antyfosfolipidowymi oraz zakrzepicą; autoimmuniczna trombocytopenia; spowodowana przez leki immuniczna trombocytopenia, w tym trombocytopenia wywołana przez karboplatynę, trombocytopenia indukowana heparyną, trombocytopenia płodowa; trombocytopenia ciążowa; syndrom Hughes'a; trombocytopenia toczeniowa; powypadkowa i/lub wydatna utrata krwi; zaburzenia mieloproliferacyjne; trombocytopenia u pacjentów z chorobami złośliwymi; zakrzepowa plamica trombocytopeniczna, w tym zakrzepowa mikroangiopatia przejawiająca się zakrzepową plamicą trombocytopeniczną/ syndromem hemolityczno-uremicznym u pacjentów z rakiem; autoimmuniczna anemia hemolityczna; okresowe perforacje uchyłka jelita czczego; czysta aplazja czerwonych krwinek; autoimmunologiczna trombocytopenia; epidemiczna nefropatia; ostra niewydolność nerek związana z rifampiciną; trombocytopenia Paris-Trousseau'a; neonatalna trombocytopenia alloimmuniczna; napadowa nocna hemoglobinuria; hematologiczne zmiany przy raku żołądka; hemolityczne uremiczne syndromy w dzieciństwie; hematologiczne objawy związane z infekcjami wirusowymi, w tym trombocytopenia związana z wirusem powodującym zapalenie wątroby A oraz CMV. Również, pewne sposoby leczenia AIDS powodują trombocytopenię (przykładowo, AZT). W pewnych zaburzeniach procesów gojenia ran dobroczynny wpływ może mieć zwiększenie ilości płytek krwi.

W związku z przewidywaniem niedoboru płytek, przykładowo, w wyniku przyszłej operacji, można podawać związek według obecnego wynalazku na kilka dni do kilku godzin przed wystąpieniem zapotrzebowania na płytki. W przypadkach ostrych, przykładowo, przy powypadkowej i/lub wydatnej utracie krwi, można podawać związek według obecnego wynalazku jednocześnie z krwią lub z oczyszczonymi płytkami.

Związki według obecnego wynalazku mogą również być stosowane do stymulowania pewnych rodzajów komórek innych niż megakariocyty, jeżeli zostanie stwierdzone, że komórki te znaleziono powodują ekspresję receptora Mp1. Stany związane z takimi komórkami, które powodują ekspresję receptora Mp1, które odpowiadają na stymulację ligandem Mp1 są również objęte obecnym wynalazkiem.

Związki według obecnego wynalazku mogą być stosowane w dowolnych sytuacjach, w których wytwarzanie płytek lub komórek prekursorowych płytek jest pożądane lub w których pożądane jest

PL 219 605 B1 stymulowanie receptora c-Mp1. W związku z tym, przykładowo, związki według obecnego wynalazku mogą być stosowane w leczeniu różnych stanów u ssaków, gdzie niezbędne są płytki, megakariocyty i tym podobne. Takie stany opisano szczegółowo w następujących przykładowych źródłach: WO

95/26746; WO 95/21919; WO 95/18858; WO 95/21920.

Związki według obecnego wynalazku mogą również być stosowane w celu utrzymania żywotności lub okresu przechowalności płytek i/lub megakariocytów i komórek pokrewnych. Zgodnie z tym, można dodawać skuteczną ilość jednego lub więcej takich związków do kompozycji zawierającej takie komórki.

Przez określenie „ssak” rozumie się dowolnego ssaka, w tym ludzi, domowe zwierzęta, w tym psy i koty; egzotyczne i/lub mieszkające w ZOO zwierzęta, w tym małpy; zwierzęta laboratoryjne w tym myszy, szczury i świnki morskie; zwierzęta hodowlane w tym konie, bydło, owce, kozy oraz świnie itp. Korzystnym ssakiem jest człowiek.

Kompozycje farmaceutyczne

Obecny wynalazek obejmuje również sposoby stosowania farmaceutycznych kompozycji związków według wynalazku. Takie farmaceutyczne kompozycje mogą być podawane w postaci iniekcji lub doustnie, donosowo, poprzez skórę, lub w innych formach podawania, obejmujących, przykładowo, iniekcyjne podawanie dożylne, śródskórne, domięśniowe, do gruczołu piersiowego, dootrzewnowe, doosierdziowe, śródocznie, pozagałkowe, dopłucne (przykładowo, lekarstwo w postaci aerozolu) lub podskórne (w tym podawanie depozytowe do powolnego uwalniania); podawanie podjęzykowe, doodbytnicze, dopochwowe lub przez operacyjne wszczepianie, przykładowo z umiejscowieniem pod kapsułą śledzionową, podawanie domózgowe lub dorogówkowe. Leczenie może obejmować pojedynczą dawkę lub wielokrotność dawek rozciągniętą w czasie. Generalnie, objęte obecnym wynalazkiem są farmaceutyczne kompozycje obejmujące efektywne ilości związku według wynalazku, razem z farmaceutycznie akceptowalnymi rozcieńczalnikami, środkami konserwującymi, solubilizatorami, emulgatorami, adiuwantami i/lub nośnikami. Takie kompozycje obejmują rozcieńczalniki o różnej zawartości buforów (przykładowo, Tris-HCl, octany, fosforany), różnym pH oraz mocy jonowej; dodatki takie jak detergenty oraz środki solubilizujące (przykładowo, Tween 80, Polisorbate 80), antyutleniacze (przykładowo, kwas askorbinowy, metadwusiarczyn sodu), środki konserwujące (przykładowo, Thimersol, alkohol benzylowy) oraz substancje zaróbkowe (przykładowo, laktoza, mannitol); włączenie materiału do cząstek preparatów związków polimerycznych takich jak kwas polilaktonowy, kwas poliglikolowy, etc. lub do liposomów. Kwas hialuronowy może być również stosowany, w celu przedłużenia okresu trwania w cyrkulacji. Kompozycje farmaceutyczne fakultatywnie mogą obejmować ciągle inne farmaceutycznie akceptowalne płyny, substancje półstałe lub rozcieńczalniki stałych substancji, które spełniają funkcję farmaceutycznych nośników, obojętnych dodatków lub mediów, w tym lecz nie wyłącznie, monolaurynian sorbitanopolioksyetylenowy, stearynian magnezu, propylohydroksybenzoesan metylu, skrobie, cukier trzcinowy, dekstrozę, gumę akacjową, fosforan wapnia, olej mineralny, masło kakaowe i olej teobromowy. Takie kompozycje mogą wpływać na stan fizyczny, stabilność, stopień uwalniania in vivo i stopień czystości in vivo obecnych protein i pochodnych. Patrz, przykładowo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) strony 1435-1712, które są przywołane tutaj jako odnośniki. Kompozycje mogą być wytwarzane w postaci ciekłej lub mogą być w postaci suchego proszku, takiego jak liofilizat. Przewidziano także implantowalne postaci o przedłużonym uwalnianiu takie, jak preparaty transdermiczne.

Przewidziano tu także do wykorzystania doustne dawki w postaci stałej, które opisano generalnie w Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) w Rozdziale 89, który jest przywołany tutaj jako odnośnik. Formy w postaci stałej obejmują tabletki, kapsułki, pigułki, pastylki lub pastylki pod język, saszetki lub proszki. Również, może być zastosowane zamykanie w liposomach oraz protenoidach przy sporządzaniu postaci galenicznych obecnych kompozycji (jak przykładowo proteinoidowe mikrokapsułki opisane w opisie patentowym USA Nr 4,925,673). Zamykanie w liposomach może być wykorzystywane, a liposomy mogą być zderywatyzowane różnymi polimerami (przykładowo, Patent USA Nr 5,013,556). Opis możliwych form w postaci stałej dla celów terapeutycznych podano w publikacji: Marshall, K., Modern Pharmaceutics, Edited by G. S. Banker and C. T. Rhodes Chapter 10, 1979, przywołanej tutaj jako odnośnik. Generalnie, kompozycja będzie obejmować związki według wynalazku oraz obojętne składniki, które zapewnią ochronę przed warunkami panującymi w żołądku oraz uwalnianie biologicznie aktywnych substancji w jelitach.

Również, szczegółowo przewidziano doustne postacie podawania powyższych związków według wynalazku. Jeżeli to konieczne, związki mogą być chemicznie modyfikowane w celu zapewnienia

PL 219 605 B1 skuteczności przy podawaniu doustnym. Generalnie, przewidziano chemiczną modyfikację polegającą na przyłączeniu co najmniej jednej reszty do cząsteczki obecnego związku, gdzie ta reszta pozwala na (a) inhibitowanie proteolizy oraz (b) wchłanianie do strumienia krwi z żołądka lub jelit. Również pożądane jest zwiększenie ogólnej stabilności obecnego związku i zwiększenie czasu obiegu w organizmie. Przykłady takich reszt obejmują: glikol polietylenowy, kopolimery glikolu etylenowego i glikolu propylenowego, karboksymetyloocelulozę, dekstran, alkohol poliwinylowy, pirolidon poliwinylowy oraz poliprolinę (Abuchowski i Davis, Rozpuszczalne Polimer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), str. 367-383; Newmark, i wsp., J. Appl. Biochem. 4:185-189 (1982)). Innymi polimerami, które mogą być stosowane, są poli-1,3-dioksolan oraz poli-1,3,6-tioksolan. Korzystnymi resztami do stosowania farmaceutycznego, jak wskazano powyżej, są reszty glikolu polietylenowego.

W przypadku postaci do podawania doustnego, możliwe jest również stosowanie soli zmodyfikowanego alifatycznego aminokwasu, takiej jak N-(8-[2-hydroksybenzoilo]amino)kaprylanian sodu (SNAC), jako nośnika zwiększającego absorpcję terapeutycznych związków według obecnego wynalazku. Kliniczną skuteczność preparatu heparynowego przy użyciu SNAC przedstawiono w badaniach drugiej fazy prowadzonych przez Emisphere Technologies. Patrz opis patentowy USA Nr 5,792,451 Oral drug delivery composition and methods.

Środek terapeutyczny może być włączony do kompozycji jako subtelne multicząstki w postaci granulek lub płatków o wielkości ziarna około 1 mm. Postacią materiału do podawania w kapsułkach może być również proszek, lekko sprasowane grudki lub nawet tabletki. Lekarstwa można wytwarzać poprzez sprasowanie.

Wszystkie substancje barwiące i zapachowe mogą wchodzić w skład kompozycji. Przykładowo, można przygotować kompozycję z obecną proteiną (lub pochodną) przykładowo w postaci kapsułek liposomowych lub mikrosfer, a następnie włączyć do produktu spożywczego, takiego jak napój chłodzący zawierający substancje barwiące i zapachowe.

Można rozcieńczyć lub zwiększyć objętość lekarstwa stosując substancje obojętne. Te rozcieńczalniki mogłyby obejmować węglowodany, zwłaszcza mannitol, α-laktozę, bezwodną laktozę, celulozę, cukier trzcinowy, modyfikowane dekstrany oraz skrobię. Pewne nieorganiczne sole mogą również być stosowane jako wypełniacze, w tym trifosforan wapnia, węglan magnezu i chlorek sodu. Niektóre dostępne handlowo rozcieńczalniki to: Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress oraz Avicell.

Środki dezintegrujące mogą wchodzić w skład kompozycji zawierającej substancję terapeutyczną, mającej stałą formę dawki jednostkowej. Substancje stosowane jako środki dezintegrujące obejmują, lecz nie wyłącznie, skrobię, w tym dostępny na rynku skrobiowy środek dezintegracyjny o nazwie, Explotab. Glikolan sodowo-skrobiowy, Amberlite, karboksymetyloceluloza sodu, ultramylopektyna, alginian sodu, żelatyna, skórka pomarańczowa, kwas karboksymetylocelulozowy, naturalna gąbka oraz bentonite - wszystkie mogą być stosowane. Inną formą środków dezintegrujących są nierozpuszczalne żywice kationo-wymienne. Sproszkowane gumy mogą być stosowane jako środki dezintegracyjne oraz lepiszcza i mogą one obejmować sproszkowane gumy takie jak agar, karaya lub tragakant. Kwas alginowy i jego sól sodowa są również stosowane jako przydatne dezintegranty.

Lepiszcza, które mogą być stosowane do utrzymywania zwartej postaci środka leczniczego i utworzenia twardej tabletki, obejmują substancje pochodzące z naturalnych produktów takie jak guma akacjowa, tragakantowa, skrobia i żelatyna. Inne obejmują metylocelulozę (MC), etylocelulozę (EC) oraz karboksymetylocelulozę (CMC). Oba związki, poliwinylopirolidon (PVP) oraz hydroksypropylometyloceluloza (HPMC) mogą być stosowane w postaci alkoholowych roztworów w celu zgranulowania środka terapeutycznego.

Środki zmniejszające tarcie mogą wchodzić w skład kompozycji środka terapeutycznego w celu zabezpieczenia przed sklejaniem podczas wytwarzania kompozycji. Środki smarne mogą być stosowane jako warstwa ochronna pomiędzy lekarstwem a ścianką dyszy i mogą one obejmować, lecz nie wyłącznie: kwas stearynowy oraz jego sole magnezowe i wapniowe, politetrafluoroetylen (PTFE), ciekłą parafinę, oleje roślinne i woski. Rozpuszczalne substancje smarne mogą być również stosowane takie, jak siarczan laurylowo-sodowy, siarczan laurylowo-magnezowy, glikol polietylenowy o różnej masie cząsteczkowej, Carbowax 4000 oraz 6000.

Można także dodawać substancje „poślizgowe” które mogą polepszać właściwości sypne leku podczas wytwarzania oraz wspomagać przemieszczanie podczas sprasowywania. Substancje „poślizgowe” mogą obejmować skrobię, talk, krzemionkę pyrogeniczną i uwodnione glinokrzemiany.

PL 219 605 B1

W celu zwiększenia rozpuszczalności środka leczniczego w wodnym środowisku można dodawać środek powierzchniowo czynny jako środek zwilżający. Środki powierzchniowo czynne mogą obejmować detergenty anionowe takie, jak siarczan sodowo-laurylowy, sulfobursztynian sodowo-dioktylowy oraz sulfonian sodowo-dioktylowy. Kationowe detergenty mogą być stosowane i mogłyby obejmować chlorek benzalkoniowy oraz chlorek benzetoniowy. Lista potencjalnych niejonowych detergentów, które mogłyby być dodane do kompozycji jako związki powierzchniowo czynne, obejmuje: lauromakrogol 400, stearynian polioksylu 40, olej rycynowy uwodorniony polioksyetylenem 10, 50 i 60, monostearynian gliceryny, polisorbitan 40, 60, 65 i 80, ester kwasu tłuszczowego i cukru trzcinowego, metyloceluloza oraz karboksymetyloceluloza. Te związki powierzchniowo czynne mogłyby być obecne w kompozycji zawierającej obecną proteinę lub jej pochodną albo same albo w mieszaninie w różnych proporcjach.

Dodatkami, które potencjalnie zwiększają wchłanialność obecnego związku są przykładowo kwasy tłuszczowe, kwas oleinowy, kwas linolowy i kwas linolenowy.

Mogą być pożądane kompozycje o kontrolowanym uwalnianiu substancji leczniczej. Lek mógłby być wprowadzany do inertnej matrycy, która pozwala go uwalniać w myśl mechanizmu dyfuzji albo ługowania, przykładowo, gumy. Matryce ulegające powolnej degeneracji mogą również stanowić składnik kompozycji, przykładowo, alginiany, polisacharydy. Inna forma kontrolowanego uwalniania obecnej substancji leczniczej obejmuje sposób oparty na terapeutycznym systemie Oros (Alza Corp.), to znaczy lek jest zamknięty w półprzepuszczalnej membranie, która pozwala wniknąć wodzie i wypchnąć lek przez pojedynczy mały otwór na skutek efektów osmotycznych. Niektóre powłoki jelitowe również dają skutek w postaci opóźnionego uwalniania.

Inne powłoki można stosować przy wytwarzaniu. Obejmują one różne cukry, które można nanosić w bębnie do powlekania. Środek leczniczy można dostarczać również jako tabletkę pokrytą błoną i materiały stosowane w takim przypadku są podzielone na dwie grupy. Pierwszą stanowią materiały niejelitowe, obejmujące metylocelulozę, etylocelulozę, hydroksyetylocelulozę, metylohydroksyetylocelulozę, hydroksypropylocelulozę, hydroksypropyl-metylocelulozę, sodu karboksymetylocelulozę, prowidon oraz glikol polietylenowy. Drugą stanowią materiały jelitowe, którymi powszechnie są estry kwasu ftalowego.

Mieszaniny materiałów można stosować w celu zapewnienia optymalnego pokrycia błoną. Powlekanie błoną może przebiegać w bębnie do powlekania lub w złożu fluidalnym, bądź też metodą powlekania przez sprasowanie.

Przewidziano również podawanie dopłucne obecnych protein (lub ich pochodnych). Proteina (lub pochodna) dostarczana jest do płuc ssaka podczas inhalacji i przechodzi przez płucną wyściółkę nabłonkową do strumienia krwi. Inne doniesienia o tym obejmują: Adjei i wsp., Pharmaceutical Research 7:565-569 (1990); Adjei i wsp., International Journal of Pharmaceutics 63:135-144 (1990) (leuprolide octan); Braquet i wsp., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl. 5): s. 143-146 (1989) (endothelin-1); Hubbard i wsp., Annals of Internal Medicine 3:206-212 (1989) (a1-antitrypsin); Smith i wsp., J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (1989) (a1-proteinase); Oswein i wsp., Aerosolization of Proteins, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990 (recombinant human growth hormone); Debs i wsp., The Journal of Immunology 140:3482-3488 (1988) (interferon-γ and tumor necrosis factor a) and Platz i wsp., U.S. Patent No. 5,284,656 (granulocyte colony stimulating factor).

Przewidziano do praktycznego wykorzystania obecnego wynalazku szeroki wachlarz urządzeń mechanicznych zaprojektowanych do dopłucnego podawania produktów terapeutycznych, w tym lecz nie wyłącznie: nebulizery, inhalatory z urządzeniem dawkującym oraz inhalatory proszkowe, wszystkie znane biegłym w sztuce.

Niektóre szczegółowe przykłady handlowo dostępnych urządzeń stosownych do stosowania w praktyce obecnego wynalazku to: nebulizery Ultravent, wytwarzany przez Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; nebulizer Acorn II, wytwarzany przez Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; inhalator Ventolin z urządzeniem dawkującym , wytwarzany przez Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina oraz inhalator proszkowy Spinhaler, wytwarzany przez Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Wszystkie takie urządzenia wymagają stosowania kompozycji odpowiednich do uwalniania związków według wynalazku. Typowo, każda kompozycja jest specyficzna dla wykorzystywanego urządzenia i może wymagać użycia odpowiedniego propelanta obok rozcieńczalników, środków pomocniczych i/lub nośników użytecznych w terapii.

PL 219 605 B1

Związki według wynalazku powinny najbardziej korzystnie być wytworzone w formie drobnocząsteczkowej o średniej wielkości ziarna mniejszej niż 10 μm (lub mikronów), najkorzystniej 0,5 to 5 μm, dla najskuteczniejszego dostarczenia do obwodowych obszarów płuc.

Nośniki obejmować mogą węglowodany takie jak trehaloza, mannitol, ksylitol, sacharozę, laktozę oraz sorbitol. Inne składniki do wykorzystania w kompozycjach mogą obejmować DPPC, DOPE, DSPC oraz DOPC. Naturalne lub syntetyczne środki powierzchniowo czynne mogą być stosowane. Glikol polietylenowy może być stosowany (nawet niezależnie od jego wykorzystania przy derywatyzacji proteiny lub jej analoga). Dekstrany, takie jak cyklodekstran, mogą również być stosowane. Sole kwasów żółciowych oraz inne pokrewne enhancery mogą być stosowane. Celuloza oraz pochodne celulozy mogą być stosowane. Aminokwasy mogą być stosowane, tak jak są wykorzystywane w buforowanych kompozycjach.

Przewidziano także używanie liposomów, mikrokapsułek lub mikrosfer, kompleksów inkluzyjnych lub innych typów nośników.

Kompozycje stosowne do użycia w nebulizerze, albo wtryskowym albo ultradźwiękowym, typowo będą zawierać związki według wynalazku rozpuszczone w wodzie w stężeniu około 0,1 to 25 mg biologicznie aktywnej proteiny na mL roztworu. Kompozycja taka może również zawierać bufor oraz prosty cukier (przykładowo, dla stabilizacji proteiny oraz regulacji ciśnienia osmotycznego). Kompozycja do nebulizera może również zawierać środek powierzchniowo czynny dla obniżenia lub zapobieżenia powierzchniowo indukowanej agregacji proteiny spowodowanej rozpyleniem roztworu podczas tworzenia aerozolu.

Kompozycje do stosowania w inhalatorze z urządzeniem dozującym generalnie będzie zawierać subtelnie rozdrobniony proszek zawierający związek według wynalazku zawieszony w substancji rozpylającej (propelancie) za pomocą środka powierzchniowo czynnego. Propelantem może być dowolny konwencjonalny materiał stosowany do tego celu taki, jak chlorofluorokarbon, hydrochlorofluorokarbon, hydro fluorokarbon lub węglowodór, w tym trichlorofluorometan, dichlorodifluorometan, dichlorotetrafluoroetanol oraz 1,1,1,2-tetrafluoroetan, bądź ich mieszaniny. Stosowne środki powierzchniowo czynne obejmują trioleinian sorbitanu oraz lecytynę sojową. Kwas olejowy może być także przydatny jako środek powierzchniowo czynny.

Kompozycje do uwalniania w inhalatorze proszkowym obejmować będą subtelnie rozdrobniony suchy proszek zawierający związek według wynalazku i mogą również obejmować substancję masotwórczą taką, jak laktoza, sorbitol, cukier trzcinowy, mannitol, trehaloza lub ksylitol w ilościach, które ułatwiają uwalnianie proszku z urządzenia, przykładowo 50 do 90% wagowych w przeliczeniu na masę kompozycji.

Donosowe podawanie związku według wynalazku zostało również przewidziane. Donosowe podawanie pozwala na przejście proteiny do krwioobiegu bezpośrednio po podaniu terapeutycznego środka do nosa, bez konieczności deponowania produktu w płucach. Kompozycje do podawania donosowego obejmują kompozycje z dekstranem lub cyklodekstranem. Podawanie z wykorzystaniem transportu skrośbłonowego przez inne błony śluzowe jest również uwzględnione.

Dawkowanie

Reżim dawkowania w sposobie leczenia stanów wskazanych wyżej będzie określony przez lekarza prowadzącego z uwzględnieniem różnych czynników modyfikujących działanie leków, przykładowo wieku, stanu, masy ciała, płci oraz dieta pacjenta, stopień ostrości infekcji, czasu podawania oraz innych czynników klinicznych. Generalnie, dawka powinna zawierać się w przedziale od 0,1 μg to 100 mg związku według wynalazku na kilogram masy ciała na dzień, korzystnie 0,1 to 1000 μg/kg; a bardziej korzystnie 0,1 to 150 μg/kg, przy podawaniu w dziennych dawkach lub w równoważnych dawkach w dłuższych lub krótszych przedziałach czasowych, przykładowo codziennie, 2 razy na tydzień, co tygodniowo lub dwukrotnie, lub trzykrotnie dziennie.

Związki według wynalazku mogą być podawane w początkowej dawce uderzeniowej i następnie w ciągłej infuzji by utrzymać poziom terapeutyczny krążącego leku. W innym przykładzie, związek według wynalazku może być podawany w postaci jednorazowej dawki. Posiadający zwykłą biegłość w sztuce z łatwością zoptymalizują efektywne dawkowanie oraz reżim podawania zgodnie z dobrą medyczną praktyką, stosownie do klinicznego stanu indywidualnego pacjenta. Częstotliwość dawkowania będzie zależała od farmakokinetycznych parametrów środka, jak również drogi podawania. Optymalna kompozycja farmaceutyczna będzie ustalona przez biegłego w sztuce, w zależności od drogi podawania oraz pożądanej dawki. Patrz na przykład, Remington's Farmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) str. 1435-1712, którego ujawnienie przywołuje się tu

PL 219 605 B1 na zasadzie odnośnika. Takie kompozycje mogą mieć wpływ na stan fizyczny, stabilność, szybkość ujawniania in vivo oraz szybkość usuwania z organizmu in vivo podawanego środka. W zależności od drogi podawania można obliczyć właściwą dawkę stosownie do masy ciała, powierzchni ciała lub rozmiarów organu. Dalsze przybliżenia w obliczeniach koniecznych do ustalenia odpowiedniej dawki dla leczenia uwzględniające wyżej wymienione kompozycje wykonywane są rutynowo przez posiadających zwykłą biegłość w sztuce bez zbędnego eksperymentowania, zwłaszcza w świetle informacji o dawkach oraz prób ujawnionych w niniejszym, jak również danych farmakokinetycznych obserwowanych u ludzi w badaniach klinicznych omówionych wyżej. Odpowiednie dawki mogą być ustalone w oparciu o wykorzystanie opracowanych prób na określenie poziomu we krwi w koniunkcji z odpowiednimi danymi o odpowiedzi na dawkę. Ostateczny reżim dawkowania będzie określony przez lekarza prowadzącego, z uwzględnieniem różnych czynników modyfikujących działanie leków, przykładowo aktywność właściwa leku, stopień uszczerbku oraz odpowiedź pacjenta, jego wiek, stan, masa ciała, płeć oraz dieta, nasilenie infekcji, czas podawania oraz inne czynniki kliniczne. Ponieważ prowadzone są badania, można spodziewać się dalszych informacji odnoszących się do odpowiedniego poziomu dawek oraz czasu trwania leczenia różnych schorzeń i stanów.

Terapeutyczne sposoby, kompozycje oraz związki według obecnego wynalazku mogą również być stosowane samodzielnie albo w kombinacji z innymi cytokinami, rozpuszczalnym receptorem Mp1, czynnikami hematopoetycznymi, interleukinami, czynnikami wzrostu lub przeciwciałami w leczeniu stanów chorobowych charakteryzującymi się innymi symptomami jak również niedoborem płytek. Przewiduje się, że związek według wynalazku okaże się użyteczny w leczeniu niektórych postaci trombocytopenii w połączeniu z ogólnymi stymulatorami hematopoezy, takimi jak IL-3 lub GM-CSF. Inne czynniki stymulujące megakariocyty, przykładowo, meg-CSF, czynnik komórek pnia (SCF), czynnik inhibitujący białaczkę (LIF), onkostatyna M (OSM), lub inne cząsteczki o działaniu stymulującym megakariocyty mogą również być wykorzystane z ligandem Mp1. Dodatkowe przykładowe cytokiny lub hematopoetyczne czynniki do takiego współpodawania obejmują IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, czynnik-1 stymulowania kolonii (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, czynnik stymulowania kolonii granulocytów (G-CSF), EPO, interferon-alfa (IFN-alfa), zgodny interferon, IFN-beta, IFN-gamma, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, trombopoetyna (TPO), angiopoetyny, przykładowo Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ludzkie angiopoetyno-podobne polipeptydy, naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF), angiogenina, kostna morfogeniczna proteina-1, kostna morfogeniczna proteina-2, kostna morfogeniczna proteina-3, kostna morfogeniczna proteina-4, kostna morfogeniczna proteina-5, kostna morfogeniczna proteina-6, kostna morfogeniczna proteina-7, kostna morfogeniczna proteina-8, kostna morfogeniczna proteina-9, kostna morfogeniczna proteina-10, kostna morfogeniczna proteina-11, kostna morfogeniczna proteina-12, kostna morfogeniczna proteina-13, kostna morfogeniczna proteina-14, kostna morfogeniczna proteina-15, receptor IA kostnej morfogenicznej proteiny, receptor IB kostnej morfogenicznej proteiny, czynnik neurotropowy mózgowo pochodny, neutropowy czynnik rzęskowy, receptor a neutropowego czynnika rzęskowego, cytokinowo indukowany neutrofilowy chemotaktyczny czynnik 1, cytokinowo indukowany neutrofilowy chemotaktyczny czynnik 2a, cytokinowo indukowany neutrofilowy chemotaktyczny czynnik 2β, czynnik wzrostu komórek β śródbłonowych, endotelina 1, epidermalny czynnik wzrostu, neutrofilowy atraktant śródbłonowo-pochodny, fibroblastowy czynnik wzrostu 4, fibroblastowy czynnik wzrostu 5, fibroblastowy czynnik wzrostu 6, fibroblastowy czynnik wzrostu 7, fibroblastowy czynnik wzrostu 8, fibroblastowy czynnik wzrostu 8b, fibroblastowy czynnik wzrostu 8c, fibroblastowy czynnik wzrostu 9, fibroblastowy czynnik wzrostu 10, kwasowy fibroblastowy czynnik wzrostu, zasadowy fibroblastowy czynnik wzrostu, receptor α1 pochodzącego z glialowej linii komórkowej czynnika neutrofilowego, receptor a2 pochodzącego z glialowej linii komórkowej czynnika neutrofilowego, proteina związana ze wzrostem, proteina α związana ze wzrostem, proteina β związana ze wzrostem, proteina γ związana ze wzrostem, epidermalny czynnik wzrostu wiążący heparynę, hepatocytowy czynnik wzrostu, receptor hepatocytowego czynnika wzrostu, insulinopodobny czynnik wzrostu I, receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu, insulinopodobny czynnik wzrostu II, proteina wiążąca insulinopodobny czynnik wzrostu, keratynocytowy czynnik wzrostu, czynnik hamujący białaczkę, receptor α czynnika hamującego białaczkę, nerwowy czynnik wzrostu, receptor nerwowego czynnika wzrostu, neurotrofina-3, neurotrofina-4, łożyskowy czynnik wzrostu, łożyskowy czynnik wzrostu 2, płytkowopochodny czynnik wzrostu komórek śródbłonkowych, płytkowopochodny czynnik wzrostu, łańcuch A płytkowopochodnego czynnika wzrostu, płytkowopochodny czynnik wzrostu AA, płytkowopochodny czynnik wzrostu AB, łańcuch B płytkowopochodnego czynnika wzrostu, płytkowopochodny czynnik wzrostu BB, receptor α płytkowopochoPL 219 605 B1 dnego czynnika wzrostu, receptor β płytkowopochodnego czynnika wzrostu, czynnik stymulujący wzrost komórek pre-B, receptor czynnika komórek pnia, TNF, w tym TNF0, TNF1, TNF2, transformujący czynnik wzrostu a, transformujący czynnik wzrostu β, transformujący czynnik wzrostu β1, transformujący czynnik wzrostu β1.2, transformujący czynnik wzrostu β2, transformujący czynnik wzrostu β3, transformujący czynnik wzrostu β5, utajony transformujący czynnik wzrostu β1, proteina I wiążąca transformujący czynnik wzrostu β, proteina II wiążąca transformujący czynnik wzrostu β, proteina III wiążąca transformujący czynnik wzrostu β, receptor typu I czynnika nekrozy nowotworu, receptor typu II czynnika nekrozy nowotworu, receptor aktywatora plasminogeny typu urokinazowego, naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu oraz proteiny chimeryczne i ich fragmenty aktywne biologicznie lub immunologicznie. Może być ponadto przydatne podawanie albo jednocześnie albo kolejno skutecznej ilości rozpuszczalnego piersiowego receptora Mp1, który zdaje się posiadać właściwość powodowania, że megakariocyty ulegają fragmentacji na płytki, gdy tylko megakariocyty osiągną dojrzałą postać. Zatem oczekuje się, że podawanie związku według obecnego wynalazku (aby wzmóc ilość dojrzałych megakariocytów), a następnie podawanie rozpuszczalnego receptora Mp1 (w celu inaktywacji ligandu i zezwolenie dojrzałemu megakariocytowi na wytwarzanie płytek) okaże się być szczególnie skutecznym środkiem do stymulacji produkcji płytek. Dawki podane wyżej powinny być dostosowane w celu skompensowania tych dodatkowych komponentów w leczniczej kompozycji. Postęp u leczonego pacjenta można monitorować znanymi sposobami.

W przypadkach gdy związki według wynalazku są dodawane do kompozycji płytek i/lub megakariocytów I komórek pokrewnych, ilość jaką należy wprowadzić do kompozycji będzie zasadniczo ustalana doświadczalnie z wykorzystaniem znanych technik oraz prób. Przykładowy przedział tych ilości wynosi 0,1 μg - 1 mg związku według wynalazku na 10⁶ komórek.

Zakłada się, że zastosowanie ujawnienia według obecnego wynalazku do szczególnego problemu lub sytuacji leży w granicach możliwości posiadającego zwykłą biegłość w sztuce na podstawie podanych tu informacji. Przykłady produktów według obecnego wynalazku oraz reprezentatywne sposoby ich izolowania, zastosowania oraz wytwarzania podane są poniżej.

P r z y k ł a d y

I. Poniżej przedstawiono przykładowe sposoby wytwarzania niektórych związków pierwszej grupy ujawnionych w niniejszym tekście.

A. Materiały i sposoby

Wszystkie pochodne aminokwasów (wszystkie o konfiguracji L) oraz żywice stosowane w syntezach peptydów zakupiono od firmy Novabiochem. Reagenty syntez peptydów (DCC, HOBt, etc.) zakupiono w postaci roztworów od firmy Applied Biosystems, Inc. Dwie pochodne-PEG pochodziły od firmy Shearwater Polimers, Inc. Wszystkie rozpuszczalniki (dichlorometan, N-metylopirolidinon, metanol, acetonitryl) pochodziły od firmy EM Sciences. Badania metodą analitycznej HPLC prowadzono w układzie Beckman'a przy użyciu kolumny Vydac (0,46 cm x 25 cm, C18 z odwróconą fazą, 5 mm), przy szybkości przepływu 1 ml/min oraz z podwójną detekcją UV przy 220 oraz 280 nm. Stosowano liniowe gradienty dla wszystkich operacji HPLC z dwiema mobilnymi fazami: Bufor A - H2O (0,1% TFA), oraz Bufor B - acetonitryl (0,1% TFA). Poniżej stosowana numeracja peptydów, przykładowo 17b, 18, 19, oraz 20, odpowiada numeracji użytej w Tablicy 1, a niektóre z nich są dalej przedstawione na rysunku Fig. 2 oraz 3.

Synteza peptydów. Wszystkie peptydy wytworzono dobrze znaną metodą etapowej syntezy w fazie stałej. Syntezy w fazie stałej z chemizmem Fmoc prowadzono przy użyciu urządzenia ABI Peptyd Synthesizer. W typowym rozwiązaniu, syntezy peptydów rozpoczynały się od wstępnie załadowanej żywicy Wang, w skali 0,1 mmol. Deprotekcję Fmoc prowadzono przy użyciu standardowego protokołu piperydyny. Sprzęganie realizowano przy użyciu DCC/HOBt. Grupami zabezpieczającymi łańcuchy boczne były: Glu(O-t-Bu), Thr(t-Bu), Arg(Pbf), Gln(Trt), Trp(t-Boc) oraz Cys(Trt). W przypadku pierwszego prekursora do pegylowania, stosowano Dde dla zabezpieczenia łańcucha bocznego w Lys z linkera, natomiast dla ostatniego sprzęgania stosowano Boc-Ile-OH. Przy użyciu bezwodnej hydrazyny usunięto Dde (2% w NMP, 3 x 2 min), a następnie przeprowadzono sprzęganie z bezwodnikiem kwasu bromooctowego, zrealizowane dzięki działaniu DCC. W przypadku peptydu 18, boczny łańcuch cysteinowy w linkerze zabezpieczono grupą tritylową. Końcowe usunięcie zabezpieczeń oraz oderwanie wszystkich ugrupowań peptydylowo-żywicowych prowadzono w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, przy użyciu kwasu trifluorooctowego (TFA) zawierającego 2,5% H2O, 5% fenolu, 2,5% triizopropylosilanu i 2,3% tioanizolu. Po usunięciu TFA, obcięty peptyd przeprowadzono w stan zawiesiny przy użyciu zimnego bezwodnego eteru. Tworzenie disiarczku cyklicznego peptydu

PL 219 605 B1 prowadzono bezpośrednio na surowym materiale przy użyciu 15% DMSO w H2O (pH 7,5). Wszystkie surowe peptydy oczyszczono metodą preparatywnej HPLC z odwróconymi fazami, a (ich) struktury potwierdzono metodą analizy ESI-MS i aminokwasowej.

Alternatywnie, wszystkie powyżej opisane peptydy mogły być również wytworzone przy użyciu metod z t-Boc. W tym przypadku, wyjściowymi żywicami powinny być klasyczne żywice Merrifield'a lub Pam'a, a grupami zabezpieczającymi łańcuchów bocznych byłyby: Glu(OBzl), Thr(Bzl), Arg(Tos), Trp(CHO), Cys(p-MeBzl). Fluorowodór (HF) byłby stosowany w celu końcowego rozerwania żywic peptydyIowych.

Wszystkie dimeryczne peptydy tandemowe - opisane w tych badaniach - które posiadają linkery zbudowane z naturalnych aminokwasów, mogą również być wytworzone metodą rekombinacyjnej technologii DNA.

PEG-ylowanie. Rozwinięto nową, zbieżną strategię dla pegylowania syntetycznych peptydów, która obejmuje łączenie, poprzez formowanie skoniugowanych wiązań w roztworze, peptydu i grupy PEG, z których każdy zawiera specjalne ugrupowanie funkcyjne wzajemnie reaktywne względem drugiego. Peptydy prekursorowe mogą być łatwo wytworzone konwencjonalną metodą syntezy w fazie stałej, jak opisano powyżej. Jak opisano poniżej, peptydy te są „wstępnie aktywowane” przy użyciu odpowiednich funkcjonalnych grup w specyficznym miejscu. Prekursory są oczyszczane i w pełni charakteryzowane przed reakcją z grupą PEG. Ligowanie peptydu przy użyciu PEG ma zwykle miejsce w wodnej fazie i może być łatwo monitorowane analityczną HPLC z odwróconymi fazami. Pegylowane peptydy mogą być łatwo oczyszczone preparatywną HPLC i charakteryzowane analityczną HPLC, analizą aminokwasową oraz metodą laserowej desorpcyjnej spektrometrii masowej.

Wytwarzanie peptydu 19. Peptyd 17b (12 mg) i MeO-PEG-SH 5000 (30 mg, 2 równoważniki) rozpuszczono w 1 ml wodnego roztworu buforu (pH 8). Mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez około 30 minut i reakcję sprawdzono metodą analitycznej HPLC, co wykazało ponad 80% przebieg reakcji. Pegylowany materiał wyodrębniono stosując metodę preparatywnej HPLC.

Wytwarzanie peptydu 20. Peptyd 18 (14 mg) i MeO-PEG-maleimid (25 mg) rozpuszczono w około 1,5 ml wodnego roztworu buforu (pH 8). Mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez około 30 minut, w którym to czasie transformacja przebiegła w około 70%, co zaobserwowano stosując metodę analitycznej HPLC przez umieszczenie części próbki na kolumnie HPLC. Pegylowany materiał oczyszczono metodą preparatywnej HPLC.

Próby bioaktywności. Biopróba TPO in vitro jest mitogeniczną próbą wykorzystującą zależny od IL-3 klon mysich komórek 32D, który transfekowano przy użyciu ludzkiego receptora mp1. Próbę tę opisano w szczegółowo w publikacji WO 95/26746. Komórki są utrzymywane w pożywce MEM zawierającej 10% Płodowy Klon II oraz 1 ng/ml mIL-3. Przed dodaniem próbki, komórki spreparowano przez dwukrotne przemycie przy użyciu pożywki wzrostu pozbawionej mIL-3. Wykonano rozszerzoną krzywą wzorcową TPO z 12 punktów obejmujących przedział od 3333 do 39 pg/ml. Dla każdej próbki sporządzono cztery rozcieńczenia dobrane tak, by znajdowały się w części liniowej krzywej standardowej (100 do 125 pg/ml) i powtórzono trzykrotnie. Do odpowiednich wgłębień płytki do mikromiareczkowania o 96 wgłębieniach, zawierających 10.000 komórek/wgłębienie dodano objętość 100 μΐ każdego rozcieńczenia próbki lub wzorca. Po upływie 44 godzin w temperaturze 37°C i 10% CO2, do każdego wgłębienia dodano MTS (tetrazoliowy związek, który jest bioredukowany przez komórki do formazanu). Około sześć godzin później, odczytano gęstość optyczną na płytce odczytu przy 490 nm. Sporządzono krzywą dawka/reakcja (log stężenia TPO względem O.D.-tło) i wykonano analizę regresji liniowej punktów należących do liniowej części krzywej standardowej. Stężenia badanych, nieznanych próbek, określano przy użyciu uzyskanego liniowego równania oraz poprawki na czynnik rozcieńczenia.

Skróty. HPLC: high performance liquid chromatography; ESI-MS: Electron spray ionization mass spectrometry; MALDI-MS: Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry; PEG: glikol polietylenowy. Wszystkie aminokwasy są przedstawione skrótowo w standardowej trzyliterowej i jednoliterowej notacji. t-Boc: tert-butoksykarbonyl; tBu: tert-butyl; Bzl: benzyl; DCC: Dicykloheksylokarbodiimid; HOBt: 1-Hydroksybenzotriazol; NMP: N-metylo-2-pirolidynon; Pbf: 2,2,4,6,7-pentametylodihydro-benzofuran-5-sulfonyl; Trt: trityl; Dde: 1-(4,4-dimetyl-2,6-diokso-cykloheksylideno)etyl.

B. Wyniki

Dimery tandemowe TMP z linkerami poliglicynowymi. Projekt sekwencyjnie związanych dimerów TMP oparto na założeniu, że dimeryczna postać TMP jest wymagana dla jej skutecznego oddziaływania z c-Mp1 (receptor TPO) oraz że w zależności od tego jak ulegną one zwinięciu względem

PL 219 605 B1 siebie w kontekście receptora, dwie molekuły TMP mogłyby być razem związane w konfiguracji C-koniec do N-końca w sposób, który nie zaburzałby ogólnej dimerycznej konformacji. Mówiąc jasno, aktywność dimerów połączonych tandemowo może również zależeć od właściwego doboru selekcji długości oraz kompozycji linkera, który wiąże C- oraz N-końce dwóch sekwencyjnie sąsiadujących ze sobą monomerów TMP. Ponieważ nie były dostępne żadne strukturalne informacje o wiązaniu TMP z c-Mp1, wykonano serię syntez dimerycznych peptydów z linkerami składającymi się od „0” do 10 oraz 14 reszt glicynowych (Tablica 1). Glicyna została wybrana z uwagi na jej prostotę i giętkość. Wywnioskowano, że giętki poliglicynowy łańcuch peptydowy może pozwalać na swobodne fałdowanie dwóch połączonych głowa-ogon powtórzeń TMP w żądanej konformacji, podczas gdy sekwencje aminokwasowe z większą zawadą steryczną mogą przyjmować niepożądane drugorzędowe struktury, których sztywność może rozrywać prawidłowe upakowanie dimerycznego peptydu w kontekście receptora.

Otrzymane peptydy są ławo dostępne dzięki użyciu konwencjonalnych metod syntezowania peptydów w fazie stałej (Merrifiled, R.B., Journal of the American Chemical Society 85:2149 (1963)) z chemizmem albo Fmoc albo t-Boc. W przeciwieństwie do syntezy dimeru równoległego połączonego końcami C (SEQ ID NO: 2), która wymaga stosowania ortogonalnie zabezpieczonej reszty lizynowej, jako początkowego punktu rozgałęziającego dla wytworzenia dwóch łańcuchów peptydowych w sposób pseudosymetryczny (Cwirla, S.E. i wsp., Science 276:1696-1699 (1997)), syntezy naszych dimerów tandemowych były prostym, etapowym montowaniem ciągłych łańcuchów peptydowych od C-końca do N-końca. Ponieważ dimeryzacja TMP wywiera bardziej dramatyczny wpływ na aktywność proliferacyjną niż na powinowactwo wiążące, jak to wykazano dla dimeru C-końcowego. (Cwirla, S.E. i wsp., Science 276:1696-1699 (1997)), syntetyczne peptydy przebadano bezpośrednio na biologiczną aktywność w próbie na proliferację komórek zależną od TPO, przy użyciu zależnego od 1L-3 klonu mysich komórek 32D transfekowanych przy użyciu c-Mp1 o pełnej długości (Palacios, R. i wsp., Cell 41:727 (1985)). Jak pokazały wyniki testów (patrz Tablica 1, poniżej), wszystkie dimery tandemowe połączone linkerem poliglicynowym wykazały ponad 1000-krotny wzrost potencji w porównaniu z monomerem i miały nawet wyższą potencję niż C-końcowy dimer w próbach na proliferację komórek. Bezwzględna aktywność C-końcowego dimeru w naszej próbie była niższa niż w przypadku rodzimej proteiny TPO, co różni się od uprzednio opisanych ustaleń, w których stwierdzono, że C-końcowy dimer okazał się równie aktywny jak naturalny ligand (Cwirla, S.E. i wsp., Science 276:1696-1699 (1997)). Tak mogło się zdarzyć ze względu na różne warunki stosowane w obu próbach. Pomimo tego, różnice w aktywności pomiędzy dimerami tandemowymi (z C-końcem pierwszego monomeru połączonym z N-końcem drugiego monomeru) i dimerami równoległymi (z C-końcem pierwszego monomeru połączonym z C-końcem drugiego monomeru) w tej samej próbie jasno demonstrują wyższość tandemowo zdimeryzowanego produktu w porównaniu z równoległymi produktami dimerowymi. Warto zauważyć, że szeroki przedział długości jest tolerowany dla linkera. Optymalny linker dla wybranych monomerów TMP (SEQ ID NO: 1) składa się z 8 glicyn.

Inne dimery tandemowe. Po pierwszej serii dimerów tandemowych TMP, kilka innych molekuł zaprojektowano kilka dalszych cząsteczek albo z różnymi linkerami, albo zawierających modyfikacje w obrębie monomeru jako takiego. Pierwsza z tych molekuł, peptyd 13, zawiera linker składający się z GPNG, znanej sekwencji, która posiada wysoką skłonność do tworzenia drugorzędowej struktury typu β-skrętnego. Jakkolwiek, z ciągle około 100-krotnie większą potencją w porównaniu z monomerem, peptyd ten wykazuje ponad 10-krotnie mniejszą aktywność w porównaniu z analogiem połączonym GGGG. Dlatego też, wprowadzenie stosunkowo sztywnego zakrętu β w obszarze linkera zdaje się powodować lekkie zaburzenie optymalnej konfiguracji agonistycznej w krótkich linkerach.

Trp9 w sekwencji TMP jest wysoce konserwatywną resztą wśród aktywnych peptydów wybranych z przypadkowych bibliotek peptydów. Jest również wysoce zabezpieczony Trp w zgodnych sekwencjach peptydów EPO-mimetycznych i stwierdzono, że ta reszta Trp jest zaangażowana w tworzenie hydrofobowego rdzenia pomiędzy dwoma peptydami EMO-mimetycznymi i ma udział w hydrofobowych oddziaływaniach z receptorem EPO. Livnah i in. (1996), Science 273: 464-71). W drodze analogii pomyślano, że reszta Trp9 w TMP może spełniać podobną funkcję w dimeryzacji ligandu peptydowego, usiłując modulować i oszacować efekty niekowalencyjnych hydrofobowych sił wywieranych przez dwa pierścienie indolowe, skonstruowano kilka analogów na drodze mutacji przy tym Trp. I tak, w peptydzie 14, resztę Trp zamieniono każdym z dwóch monomerów TMP na resztę Cys i wytworzono wewnątrzcząsteczkowe wiązanie disiarczkowe pomiędzy obu cysteinami na drodze utleniania, co było przewidziane w celu mimetycznego naśladowania oddziaływań hydrofobowych pomiędzy

PL 219 605 B1 dwiema resztami Trp w dimeryzacji peptydu. Peptyd 15 jest zredukowaną formą peptydu 14. W peptydzie 16, dwie reszty Trp zamieniono na Ala. Jak wykazują wyniki prób, wszystkie trzy analogi były nieaktywne. Wyniki te wykazały dalej, że Trp jest ważny dla aktywności peptydu TPO-mimetycznego, ale nie tylko dla utworzenia dimeru.

Każdy z następnych dwóch peptydów (peptydy 17a oraz 18) zawiera w swoim ośmioaminokwasowym linkerze resztę Lys lub Cys. Te dwa związki są prekursorami dla dwóch PEGylowanych peptydów (peptydy 19 oraz 20) w których boczny łańcuch Lys lub Cys jest zmodyfikowany przez ugrupowanie PEG. Zdecydowano się na wprowadzenie ugrupowania PEG po środku stosunkowo długiego linkera, tak aby duży komponent PEG (5 kDa) był dostatecznie daleko od miejsc wiążących w cząsteczce peptydu. PEG jest znanym biokompatybilnym polimerem, który jest coraz częściej stosowany jako kowalencyjny modyfikator w celu polepszenia farmakokinetycznych profili środków terapeutycznych opartych na peptydach i białkach.

Wzorcową, opartą na roztworze metodę zalecono dla dogodnego PEGylowania syntetycznych lub rekombinacyjnych peptydów. Metoda jest oparta na dobrze ugruntowanej strategii ligowania chemoselektywnego, która wykorzystuje specyficzną reakcję pomiędzy parą wzajemnie reaktywnych układów funkcjonalnych. A więc, by wykonać pegylowanie peptydu 19, boczny łańcuch lizyny wstępnie preaktywowano przy użyciu grupy bromoacetylowej, uzyskując peptyd 17b umożliwiający reakcję z pochodną tiolową PEG. Aby tego dokonać, ortogonalną grupę ochraniającą - Dde, włączono w celu zabezpieczenia reszty ε-aminowej w lizynie. Gdy zestawiono cały łańcuch peptydowy, N-końcową aminę ponownie zabezpieczono przy użyciu t-Boc. Następnie usunięto Dde w celu umożliwienia bromoacetylowania. Strategia ta dała surowy peptyd, który łatwo oczyszczono przy użyciu konwencjonalnej metody HPLC z odwróconymi fazami. Ligowanie peptydu z modyfikowanym grupą tiolową PEG miało miejsce w wodnym buforze przy pH 8, a reakcja przebiegła do końca w ciągu 30 minut. Analiza MALDI-MS oczyszczonego, pegylowanego materiału ujawniła charakterystyczne dzwonowe widmo z przyrostem 44 Da pomiędzy przylegającymi pikami. W przypadku układu PEG-peptyd 20, resztę cysteinową umieszczono w obszarze linkera i jej grupa tiolowa bocznego łańcucha powinna służyć jako miejsce „przyłączeniowe” dla PEG zawierającego maleimid. Podobne warunki stosowano w celu pegylowania tego peptydu. Jak ujawniły wyniki prób, te dwa pegylowane peptydy miały nawet większą bioaktywność in vitro niż z ich niepegylowane odpowiedniki.

Peptyd 21 ma w swoim ośmioaminokwasowym linkerze potencjalny motyw glikozylacyjny, NGS. Ponieważ nasze przykładowe dimery tandemowe wykonano z naturalnych aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi, ekspresja takiej cząsteczki w odpowiednim układzie komórek eukariotycznych powinna prowadzić do wytworzenia glikopeptydu z ugrupowaniem węglowodanowym dodanym do karboksyamidu bocznego łańcucha Asn. Glikozylowanie jest powszechną post-translacyjną modyfikacją które może posiadać bardzo pozytywny wpływ na biologiczną aktywność danej proteiny poprzez zwiększenie jej rozpuszczalności w wodzie oraz stabilności in vivo. Jak pokazują wyniki próby, włączenie tego motywu glikozylacyjnego do linkera utrzymuje wysoką aktywność biologiczną. Syntetyczny prekursor potencjalnego glikopeptydu miał w rezultacie aktywność podobną jak jego analog z Iinkerem-(Gly)8-. Oczekuje się, że po zglikozylowaniu, peptyd ten będzie posiadać aktywność tego samego rzędu co pegylowane peptydy, z powodu podobnych chemofizyczne właściwości wykazywanych przez ugrupowania PEG i reszty węglowodanowe.

Ostatnim peptydem jest dimer dimeru. Został wytworzony przez utlenienie peptydu 18, który utworzył wewnątrzcząsteczkowe wiązanie disiarczkowe pomiędzy dwiema resztami cysteinowymi umiejscowionymi w linkerze. Peptyd ten został zaprojektowany w celu zbadania czy TMP jest aktywny jako tetramer. Wyniki próby wykazały, że peptyd ten nie był bardziej aktywny niż przeciętny dimer tandemowy w przeliczeniu na cząsteczkę, co pośrednio stanowi poparcie dla tezy, że aktywna forma TMP jest rzeczywiście dimerem, w przeciwnym bowiem wypadku dimeryzacja dimeru tandemowego miałaby dodatkowy wpływ na aktywność biologiczną.

Poniższa Tablica 1 podaje względną aktywność wyżej opisanych związków w kategoriach EC50 na podstawie prób in vitro opisanych powyżej.

PL 219 605 B1

T a b l i c a 1

	Związek	Względna potencja (EC50)
	TPO	4,0
	TMP monomer (SEQ ID NO: 1)	1,0
	TMP C-C dimer (SEQ ID NO: 2)	3,5
	TMP-(Gly)n-TMP:
1	n = 0	4,5
2	n = 1	4,0
3	n = 2	4,0
4	n = 3	4,0
5	n = 4	4,0
6	n = 5	4,0
7	n = 6	4,0
8	n = 7	4,0
9	n = 8	4,5
10	n = 9	4,0
11	n = 10	4,0
12	n = 14	4,0
13	TMP-GPNG-TMP (SEQ ID NO. 10)	3,0
14	IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA I I	0,5
(SEQ ID NO. 11)
15	IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (SEQ ID NO. 12)	0,5
16	IEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ ID NO. 13)	0,5
17a	TMP-GGGKGGGG-TMP (SEQ ID NO. 14)	4,0
17b	TMP-GGGK(BrAc)GGGG-TMP (SEQ ID NO. 15)	ND
18	TMP-GGGCGGGG-TMP (SEQ ID NO. 16)	4,0
19	TMP-GGGK(PEG)GGGG-TMP (SEQ ID NO. 17)	5,0
20	TMP-GGGC(PEG)GGGG-TMP (SEQ ID NO. 18)	5,0
21	TMP-GGGNGSGG-TMP (SEQ ID NO. 19)	4,0
22	TMP-GGGCGGGG-TMP (SEQ ID NO. 20) 1 TMP-GGGCGGGG-TMP	4,0

U w a g a: W tablicy 1, kolejne liczby wskazują około 1 log aktywności tak, że różnica w aktywności pomiędzy “1” oraz “4” jest około 1000-krotna. Wzrost o 0,5 stanowi punkt pośredni tak, że różnica w aktywności pomiędzy “1” oraz “3,5” jest około 500-krotna.

Skrót “ND” oznacza nie oznaczano.

PL 219 605 B1

II. Poniżej przedstawiono przykładowe sposoby wytwarzania niektórych związków drugiej ujawnionej tu grupy.

A. Wytwarzanie związku fuzyjnego Fc typu przedstawionego na Fig. 6C.

Sekwencję DNA kodującą region Fc ludzkiej IgG1 poddany fuzji w ramce do dimeru peptydu TPO-mimetycznego (SEQ ID NO: 34) umieszczono pod kontrolą promotora luxPR w plazmidowym wektorze ekspresji pAMG21, jak następuje.

Gen fuzyjny skonstruowano przy użyciu standardowej technologii PCR. Szablonami dla reakcji PCR były wektor fuzyjny obejmujący sekwencję Fc i syntetyczny gen kodujący pozostałą część związku o sekwencji SEQ ID NO: 34. Syntetyczny gen skonstruowano z 4 zachodzących na siebie oligonukleotydów przedstawionych poniżej:

1830-52	AAA GGT GGA GGT GGT GGT ATC GAA GGT CCG ACT CTG CGT CAG TGG CTG GCT GCT CGT GCT	(SEQ ID NO: 35)
1830-53	ACC TCC ACC ACC AGC ACG AGC AGC CAG CCA CTG ACG CAG AGT CGG ACC	(SEQ ID NO: 36)
1830-54	GGT GGT GGA GGT GGC GGC GGA GGT ATT GAG GGC CCA ACC CTT CGC CAA TGG CTT GCA GCA CGC GCA	(SEQ ID NO: 37)
1830-55	AAA AAA AGG ATC CTC GAG ATT ATG CGC GTG CTG CAA GCC ATT GGC GAA GGG TTG GGC CCT CAA TAC CTC CGC CGC C	(SEQ ID NO: 38)

Te 4 oligonukleotydy wygrzewano aby utworzyły dupleks przedstawiony poniżej:

AAAGGTGGAGGTGGTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCT

1- — — — — — — — 4---------+-----— 4----------4---------4---------4 £jO

CCAGGCTGAGACGCAGTCACCGACCGACGAGCACGA

KGGGGGIEGPTLRQWLAARA

GGTGGTGGAGGTGGCGGCGGAGGTATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCA

---------4---------4---------₊---------₊---------4---------₊ 120

CCACCACCTCCACCGCCGCCTCCATAACTCCCGGGTTGGGAAGCGGTTACCGAACGTCGT

GGGGGGGGIEGPTLRQWLAA

CGCGCA

---------------------------₁₄₈

GCGCGTATTAGAGCTCCTAGGAAAAAAA

RA *

SEQ ID NO: 39 [współliniowe oligonukleotydy 1830-52 oraz 1830-54]

SEQ ID NO: 40 [współliniowe oligonukleotydy 1830-53 oraz 1830-55] i SEQ ID NO: 41 [kodowana sekwencja aminokwasowa]

Dupleks ten amplifikowano w reakcji PCR przy użyciu 1830-52 oraz 1830-55 jako primerów sensownego i antysensownego.

Część Fc molekuły generowano w reakcji PCR z Fc DNA przy użyciu primerów

1216-52 AAC ATA AGT ACC TGT AGG ATC G (SEQ ID NO: 42)

1830-51 TTCGATACCACCACCTCCACCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGC (SEQ ID NO: 43)

Oligonukleotydy 1830-51 oraz 1830-52 zawierają nakładające się 24 nukleotydy, pozwalające aby oba geny uległy fuzji w prawidłowej ramce odczytu przez połączenie powyższych produktów PCR w trzeciej reakcji przy użyciu zewnętrznych primerów, 1216-52 oraz 1830-55.

Końcowy produkt genowy PCR (gen fuzyjny o pełnej długości) wytrawiono z endonukleazami restrykcyjnymi Xbal i BamHI, a następnie ligowano do wektora pAMG21 (patrz poniżej), wytrawionego również przy użyciu Xbal i BamHI. Ligowany DNA transformowano do kompetentnych komórek gospodarza E. coli szczepu 2596 (GM221, opisany poniżej). Klony skrinowano na zdolność do wytwarzania rekombinacyjnego produktu proteinowego i posiadania genu fuzyjnego o prawidłowej sekwencji

PL 219 605 B1 nukleotydowej. Poziomy ekspresji proteiny określono badając zawartość kolby do wytrząsania o pojemności 50 ml. Cały lizat komórkowy analizowano na ekspresję fuzji przy użyciu barwionych żeli Coomassie metodą PAGE.

Sekwencję aminokwasową proteiny fuzyjnej przedstawiono poniżej odpowiedniej sekwencji nukleotydowej:

Xbal

I

TCTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGACAAAACTCACACATGTC 1 ---------₊---------₊---------+---------+---------₊---------+ go

AGATCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCTGTTTTGAGTGTGTACAG

MDKTHTCP

CACCTTGTCCAGCTCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAC 51 — ----— — + - — — — — — — — — +-------. — + — — — — —.--+-- ----(. 120

GTGGAACAGGTCGAGGCCTTGAGGACCCCCCTGGCAGTCAGAAGGAGAAGGGGGGTTTTG

PCPAPELLGGPSVFLFPPKP

CCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA 121 ---------+---------+---------+ -.......- +---------+---------+ 180

GGTTCCTGTGGGAGTACTAGAGGGCCTGGGGACTCCAGTGTACGCACCACCACCTGCACT

KDTLMISRTPEVTCVVVDVS

GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATG 181 ---------+----------i----------+---------+---------Ί----------+ 240

CGGTGCTTCTGGGACTCCAGTTCAAGTTGACCATGCACCTGCCGCACCTCCACGTATTAC

HEDPEVKFNWYVDGVEVHNA

CCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300

GGTTCTGTTTCGGCGCCCTCCTCGTCATGTTGTCGTGCATGGCACACCAGTCGCAGGAGT

KTKPREEQYNSTYRVVSVLT

CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAG 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360

GGCAGGACGTGGTCCTGACCGACTTACCGTTCCTCATGTTCACGTTCCAGAGGTTGTTTC

VLHQDWLNGKEYKCKVSNKA

CCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCAC 361 ---------+---------+---------+----------κ---------+---------+ 420

GGGAGGGTCGGGGGTAGCTCTTTTGGTAGAGGTTTCGGTTTCCCGTCGGGGCTCTTGGTG

LPAPIEKTISKAKGQPREPQ

AGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT 421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480

TCCACATGTGGGACGGGGGTAGGGCCCTACTCGACTGGTTCTTGGTCCAGTCGGACTGGA

VYTLPPSRDELTKNQVSLTC

GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC 481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540

CGGACCAGTTTCCGAAGATAGGGTCGCTGTAGCGGCACCTCACCCTCTCGTTACCCGTCG

PL 219 605 B1

LVKGFYPSDIAVEWESNGQP

CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT 541 ---------+---------+---------+---------+.---------+---------+ ego

GCCTCTTGTTGATGTTCTGGTGCGGAGGGCACGACCTGAGGCTGCCGAGGAAGAAGGAGA

ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

ACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG 601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660

TGTCGTTCGAGTGGCACCTGTTCTCGTCCACCGTCGTCCCCTTGCAGAAGAGTACGAGGC

SKLTVDKSRWQQGNVFSCSV

TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA 661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720

ACTACGTACTCCGAGACGTGTTGGTGATGTGCGTCTTCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCAT

MHEALHNHYTQKSLSLSPGK

AAGGTGGAGGTGGTGGTATCGAAGGTCCGACTCTGCGTCAGTGGCTGGCTGCTCGTGCTG 721 ----------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780

TTCCACCTCCACCACCATAGCTTCCAGGCTGAGACGCAGTCACCGACCGACGAGCACGAC

GGGGGIEGPTLRQWLAARAG

GTGGTGGAGGTGGCGGCGGAGGTATTGAGGGCCCAACCCTTCGCCAATGGCTTGCAGCAC 781 ----------h---------+---------+----------1----------+---------+ 840

CACCACCTCCACCGCCGCCTCCATAACTCCCGGGTTGGGAAGCGGTTACCGAACGTCGTG

GGGGGGGIEGPTLRQWLAAR

BaraHI

GCGCATAATCTCGAGGATCCG 841 ---------+---------+ - 861

CGCGTATTAGAGCT C CTAGGC A

SEQ ID NO: 44 [pojedyncza nitka czytająca 5'-3' powyżej],

SEQ ID NO: 45 [pojedyncza nitka czytająca 3'-5' powyżej] i

SEQ ID NO: 46 [sekwencja kodująca aminokwas] pAMG21

Plazmid ekspresji pAMG21 jest dostępny w ATCC pod numerem dostępu 98113, depozyt złożono 24 lipca, 1996.

GM221 (Amgen: Szczep Gospodarza #2596)

Szczepem gospodarza #2596 firmy Amgen jest szczep E. coli K-12, który zmodyfikowano tak, by zawierał zarówno wrażliwy na temperaturę represor lambda cI857s7 we wczesnym obszarze ebg oraz represor IacIQ w późniejszym obszarze ebg (68 minut). Obecność tych dwóch represorowych genów pozwala na stosowanie tego gospodarza z różnymi systemami ekspresji, jakkolwiek oba z tych represorów są nieodpowiednie do ekspresji przy użyciu IuxPR. Nietransformowany gospodarz nie posiada odporności na antybiotyki.

Rybosomowe miejsce wiążące genu cI857s7 zmodyfikowano tak, by zawierało wzmocniony RBS. Wstawiono go do operonu ebg pomiędzy pozycje nukleotydu 1170 i 1411, zgodnie z numeracją (depozytu) w Genbanku pod numerem dostępu M64441Gb_Ba, z delecją przeszkadzającej sekwencji ebg.

Konstrukt dostarczono do chromosomu przy użyciu rekombinacyjnego fagu o nazwie MMebgcI857s7 wzmocnionego RBS #4 w F'tet/393. Po rekombinacji i rozdziale tylko opisany powyżej insert chromosomowy pozostaje w komórce. Nadano mu nową nazwę F'tet/GM101.

Następnie zmodyfikowano F'tet/GM101 przez dostarczenie konstruktu IacIQ do operonu ebg pomiędzy pozycje nukleotydu 2493 i 2937, zgodnie z numeracją (depozytu) w Genbanku pod numerem dostępu M64441Gb_Ba, z delecją przeszkadzającej sekwencji ebg.

PL 219 605 B1

Konstrukt dostarczono do chromosomu przy użyciu rekombinacyjnego fagu o nazwie AGebgLacIQ#5 w F'tet/GM101. Po rekombinacji i rozdziale tylko opisany powyżej insert chromosomowy pozostaje w komórce. Nadano mu nową nazwę F'tet/GM221. Episom F'tet został oddzielony od szczepu przy użyciu oranżu akrydyny w stężeniu 25 gg/ml w LB. Oddzielony szczep zidentyfikowano jako wrażliwy na tetracyklinę i składowano jako GM221.

Konstrukt fuzyjny Fc znajdujący się w plazmidzie pAMG21 (oznaczony tu jako pAMG21-Fc-TMP-TMP), który z kolei jest zawarty w szczepie gospodarzu GM221 zdeponowano w ATCC pod numerem dostępu 98957, z datą depozytu 22 października 1998.

Ekspresja. Hodowle pAMG21-Fc-TMP-TMP w E. coli GM221 w pożywce Luria Broth zawierającej 50 gg/ml kanamycyny inkubowano w 37°C przed indukcją. Indukcję ekspresji produktu genowego Fc-TMP-TMP z promotora IuxPR osiągnięto po dodaniu syntetycznego autoinduktora laktonu N-(3-oksoheksanoilo)-DL-homoseryny do pożywki hodowli, do końcowego stężenia 20 ng/ml i hodowle inkubowano w 37°C przez dalsze 3 godziny. Po upływie 3 godzin, hodowle bakteryjne przebadano pod mikroskopem na obecność ciał inkluzyjnych, a następnie zebrano przez odwirowanie. W indukowanych hodowlach obserwowano refraktylne ciała inkluzyjne wykazujące, że Fc-TMP-TMP został najprawdopodobniej wytworzony w nierozpuszczalnej frakcji w E. coli. Płytki komórkowe poddano bezpośrednio lizie przez ponowne przeprowadzenia w stan zawiesiny w próbkowym buforze Laemmli'ego zawierającym 10% β-merkaptoetanolu i analizowano metodą SDS-PAGE. Obserwowano intensywnie zabarwione Coomassie pasmo o około 30 kDa na żelu SDS-PAGE. Oczekiwany produkt genowy powinien mieć 269 aminokwasów na długość i posiadać spodziewaną masę cząsteczkową około 29,5 kDa. Fermentację również prowadzono w warunkach standardowego wsadu w skali 10-cio litrowej, uzyskując podobne poziomy ekspresji Fc-TMP-TMP do tych otrzymanych w skali laboratoryjnej.

Oczyszczanie Fc-TMP-TMP

Komórki rozerwano w wodzie (1/10) metodą homogenizacyjną pod podwyższonym ciśnieniem (2 przebiegi przy 14,000 PSI = ok. 1,0 x 10⁸ Pa) i zebrano ciała inkluzyjne przez odwirowanie (4200 obr./min w urządzeniu J-6B w ciągu 1 godziny). Ciała inkluzyjne solubilizowano w 6 M guanidynie, 50 mM Tris, 8 mM DTT, pH 8,7 przez 1 godzinę w stosunku 1/10. Solubilizowaną mieszaninę rozcieńczono 20-krotnie w 2 M moczniku, 50 mM Tris, 160 mM argininy, 3 mM cysteiny, pH 8,5. Mieszaninę mieszano przez noc w chłodnych warunkach. W tym miejscu procedury podjednostka monomeru Fc-TMP-TMP dimeryzuje tworząc związek połączony wiązaniem disiarczkowym o strukturze przedstawionej na rys. Fig. 6C. Następnie zatężono (produkt) około 10-krotnie przez ultrafiltrację. Następnie rozcieńczono 3-krotnie za pomocą 10 mM Tris, 1,5 M mocznika, pH 9. Odczyn pH tej mieszaniny doprowadzono następnie do pH 5 za pomocą kwasu octowego. Osad usunięto przez odwirowanie i supernatant umieszczono na kolumnie SP-Sepharose Fast Flow zrównoważonej w 20 mM NaAc, 100 mM NaCl, pH 5 (10 mg/ml ładunku proteiny, temperatura pokojowa). Proteinę wymywano przy użyciu 20-kolumnowej objętości tego samego buforu o gradiencie stężenia od 100 mM NaCl do 500 mM NaCl. Zbiór z kolumny rozcieńczono 3-krotnie i umieszczono na kolumnie SP-Sepharose HP w 20 mM NaAc, 150 mM NaCl, pH 5 (10 mg/ml ładunku proteiny, temperatura pokojowa). Proteinę wymywano przy użyciu 20-kolumnowej objętości tego samego buforu o gradiencie stężenia od 150 mM NaCl do 400 mM NaCl. Zbiór pikowy zebrano i przesączono.

III. Poniżej zestawiono dane uzyskane in vivo dla myszy dla różnych związków według obecnego wynalazku.

Myszy. Normalne BDF1 płci żeńskiej w wieku około 10-12 tygodni.

Sposób skrwawiania. Dziesięć myszy w grupie poddanych zabiegowi w dniu „0”, dwie grupy po 20 myszy w grupie, rozpoczęły próby w odstępie 4 dni. Pięć myszy skrwawiano w każdym punkcie czasowym, myszy skrwawiano minimum trzy razy na tydzień. Myszy usypiano za pomocą izofluranu i całkowitą objętość krwi 140-160 μl uzyskiwano przez przebicie zatoki ocznej. Krew zliczano przy użyciu programu dla krwi mysiej dla analizatora krwi Technicon HlE. Mierzono następujące parametry: białe krwinki, czerwone krwinki, hematokryt, hemoglobinę, płytki oraz neutrofile.

Leczenie. Myszom albo poddano w iniekcji podskórnej jedną uderzeniową dawkę, albo implantowano 7-mio dniowe pompki mikro-osmotyczne do ciągłego dostarczania środka. Podskórne iniekcje podawano w objętości 0,2 ml. Osmotyczne pompki umieszczono w podskórnych nacięciach wykonanych w skórze pomiędzy łopatkami w uśpieniu. Związki rozcieńczono w PBS z 0,1% BSA. Wszystkie eksperymenty obejmowały jedną grupę kontrolną, określoną nazwą “nośnik”, której podawano jedynie powyższy rozcieńczalnik. Stężenie testowanych materiałów w pompkach tak dostosowano, że kalibrowany wypływ zapewniał poziomy lecznicze wskazane na załączonych wykresach.

PL 219 605 B1

Związki. Mianowane dawki związku podawano myszom przy użyciu 7-mio dniowej pompki mikroosmotycznej. Myszom podawano różne związki w postaci pojedynczej dawki 100 μg/kg w 7-mio dniowej pompce mikro-osmotycznej. Kilka spośród tych samych związków podano następnie myszom iniekcyjnie w postaci jednej dawki uderzeniowej.

Wyniki testów na aktywność. Wyniki eksperymentów na aktywność przedstawiono na rys. Fig. 4 oraz 5. W badaniach na zależność od dawki przy użyciu 7-dniowych pompek mikroosmotycznych (nie pokazano danych) maksymalny efekt zaobserwowano w przypadku związku o SEQ ID NO: 18 przy 100 μg/kg/dzień; dawka 10 μg/kg/dzień stanowiła około 50% maksymalnej aktywności, a dawka 1 μg/kg/dzień była najniższą z dawek, dla których można byłoby zaobserwować aktywność w tej próbie. Aktywność związku w dawce 10 μg/kg/dzień była prawie równa aktywności dawki 100 μg/kg/dzień niepegylowanego rHu-MGDF w tym samym eksperymencie.

IV. Dyskusja

Zostało przyjęte, że MGDF oddziaływuje w sposób podobny do ludzkiego hormonu wzrostu (hGH), przykładowo, jedna cząsteczka ligandu proteiny wiąże dwie cząsteczki receptora dla jego aktywacji (Wells, J. A. i in., Ann. Rev. Biochem. 65:609-634 (1996)). To oddziaływanie jest naśladowane mimetycznie przez działanie wielu mniejszych peptydów TMP. Jednakże, obecne badania sugerują, że to „naśladowanie” wymaga zgodnego działania dwóch cząsteczek TMP, ponieważ kowalencyjna dimeryzacja TMP albo równoległa C-C lub następcza C-N zwiększa biologiczną potencję in vitro ory₃ ginalnego monomeru o współczynnik większy niż 10³. Względnie niska biopotencja monomeru jest prawdopodobnie związana od nieskutecznego tworzenia niekowalencyjnego dimeru. Badany dimer kowalencyjny wykazuje zdolność do eliminowania bariery entropii dla tworzenia niekowalencyjnego dimeru, które zachodzi wyłącznie przez słabe, niekowalencyjne oddziaływania pomiędzy dwiema cząsteczkami małego peptydu o 14 resztach.

Interesującym jest zauważyć, że większość dimerów tandemowych wykazuje większą „moc” niż C-końcowe, równoległe dimery. Dimeryzacja tandemowa zdaje się dawać cząsteczkę o odpowiedniejszej konformacji, niż czyni to dimeryzacja równoległa C-C. Pozorna, niesymetryczna właściwość dimeru tandemowego może go zbliżać do naturalnego ligandu, który jako niesymetryczna cząsteczka, wykorzystuje dwa różne miejsca wiązania dwóch identycznych cząsteczek receptora.

Przewidywano, że wprowadzenie ugrupowania PEG wzmocni aktywność in vivo zmodyfikowanego peptydu przez zapewnienie mu zabezpieczenia przed proteolityczną degradacją oraz przez spowolnienie jego usuwania na drodze filtrowania w nerkach. Nieoczekiwanie okazało się, że pegylowanie mogło spowodować dalsze zwiększenie bioaktywności in vivo peptydu TMP dimeryzowanego tandemowo w próbie opartej na proliferacji komórek.

V. Poniższe stanowi podsumowanie danych in vivo w przypadku małp poddanych działaniu różnych związków według obecnego wynalazku.

W celu ocenienia hematologicznych parametrów w przypadku małp rhesus płci żeńskiej, związanych z podaniem AMP2 podskórnie, zaproponowano następujący protokół i go zrealizowano. Wybrano 5 grup małp, po 3 małpy w każdej grupie. Grupa 1 służyła jako grupa kontrolna i otrzymywała bufor octanowy (20 mM octan sodu, 0,25 M chlorek sodu, pH 5), nie zawierający ani AMP2 ani też pegylowanego, rekombinacyjnego ludzkiego MGDF (PEG-rHuMGDF). Grupa 2 otrzymywała jedną lub więcej dawek AMP2 w przedziałach czasowych wskazanych poniżej; Grupa 3 otrzymywała 1000 μg/kg AMP2 w przedziałach czasowych wskazanych poniżej; Grupa 4 otrzymywała 5000 μg/kg AMP2 w przedziałach czasowych wskazanych poniżej; a Grupa 5 otrzymywała 100 μg/kg PEG-rHuMGDF w przedziałach czasowych wskazanych poniżej.

Dzień, w którym pierwsza pojedyncza dawka została podana, określono jako Dzień „0” Cyklu „1”. W Cyklu 2, dawki podawano w Dniach 21, 23, 25, 28, 30 oraz 32. Podczas Cyklu 3, pojedynczą dawkę podano w Dniu 84, a w Cyklu 4, pojedynczą dawkę podano w Dniu 123. Zwierzęta obserwowano pod względem objawów klinicznych jeden raz dziennie podczas okresu aklimatyzacji, trzy razy dziennie (przed podawaniem, bezpośrednio do 30 minut po podawaniu oraz 2 do 3 godzin po podawaniu) w dniach podawania, i jeden raz dziennie w dniach bez podawania. Spożycie pożywienia obliczono codziennie w oparciu o ilość wydzielonych kawałków pożywienia i liczbę pozostawionych przez każde zwierzę, od 7-go dnia przed rozpoczęciem okresu podawania do końca okresu powrotu do zdrowia. Masę ciała każdego ze zwierząt mierzono dwukrotnie przed rozpoczęciem podawania i dwukrotnie podczas podawania i okresu powrotu do zdrowia. Próbki krwi dla hematologii sporządzono jeden raz przed zapoczątkowaniem podawania i jeden raz w dniach 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 22, 24, 26, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 55, 62, 69, 76, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105,

PL 219 605 B1

111, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 150. Dla analizy farmakokinetycznej, zebrano 0,5 ml próbki osocza jeden raz przed podawaniem i jeden raz po 1, 4 oraz po 24 godzinach po podawaniu. Próbki pobrano w dniach 0, 21, 32, 84 oraz 123 i przechowywano w temperaturze około -70° C aż do analizowania. W celu analizy przeciwciał, zebrano 2 ml próbek krwi na jeden tydzień przed pojedynczą dawką i jeden raz w Dniu „0” (przed podawaniem), 6, 13, 20, 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69, 76, 83, 90, 97, 104, 111, 118, 129, 136, 143 i 150. Próbki przechowywano w temperaturze -70°C aż do analizowania.

Wyniki wskazują, że ilość płytek zwiększyła się we wszystkich badanych grupach, a największe zwiększenie obserwowano w przypadku grup PEG-rHuMGDF i w grupach z dużą dawką AMP2. W Cyklu 1, pik ilości płytek zwiększył się około 3,3-krotnie oraz 3,1-krotnie w grupie PEG-rHuMGDF (Dzień 9) i w grupie 5000 pg/kg AMP2 (Dzień 9), odpowiednio, w porównaniu do średniej ilości płytek w grupie kontrolnej. Ilość płytek w przypadku grup z małą dawką AMP2 zwiększyła się około 1,5-krotnie bardziej w porównaniu z kontrolną w tych samych określonych dniach badania. Podobne wyniki zanotowano w przypadku wszystkich innych cykli.

Jednakże, w Cyklu 4, grupa PEG-rHuMGDF nie wykazała równie wysokiego podwyższenia ilości płytek jak poprzednich cyklach. Grupa PEG-rHuMGDF wykazała około 2-krotnie zwiększoną ilość płytek w porównaniu z kontrolną grupą, 9 dni po podaniu dawki w tym cyklu. Dla porównania, średnia ilość płytek w grupie o największej dawce AMP2 w Cyklu 4 była 3,3-krotnie większa niż w grupie kontrolnej. Ponadto, zwierzęta PEG-rHuMGDF posiadają średnią ilość płytek o 53% niższą w porównaniu ze średnią ilością płytek w grupie kontrolnej w chwili startu Cyklu 4 (na dawkę), a średnia ilość płytek dla tej grupy przy końcu Cyklu 4* (27 dni po podawaniu) była o 79% niższa w porównaniu z grupą kontrolną. Dla wszystkich zwierząt AMP2, średnia ilość płytek w chwili startu i zakończenia Cyklu 4 stanowiła ± 15% ilości płytek z grupy kontrolnej.

W Cyklu 1 i 2, trend w stronę zmniejszania się ilości czerwonych krwinek (RBC) zanotowano w przypadku wszystkich badanych grup w porównaniu z grupą kontrolną. Zmniejszenie było najbardziej ewidentne w Dniach od 41 do 43 i największe zmniejszenie RBC zanotowano w grupie PEG-rHuMGDF. Ilość płytek zaczęła powracać do normalnego poziomu (w porównaniu z grupą kontrolną) najwcześniej w Dniu 47. Poziomy białych krwinek (WBC) podczas Cykli 1 i 2 dramatycznie zwiększyły się (2,6-krotnie) w porównaniu do kontrolnych w Dniu 35. Lekkie zwiększenie zanotowano w grupie 5000 pg/kg AMP2 w Dniu 33. Wartości zbliżające się ku normalnym poziomom (kontrolnym) zaczynają się w Dniu 37. Podobny wynik zaobserwowano w Cyklu 3 bez widocznej zmiany w przypadku białych krwinek (WBC) w Cyklu 4 w dowolnej z badanych grup.

Podczas Cyklu 3, ilość czerwonych komórek krwi (RBC) lekko obniżyła się w Dniu 13 (po jednej dawce Cyklu 3) we wszystkich testowanych grupach, za wyjątkiem grupy 500 pg/kg AMP2. Wartości RBC zaczynają wracać do normalnego poziomu (w porównaniu do grupy kontrolnej) w 17 dniu.

W Cyklu 4, ilości RBC zmniejszają się we wszystkich testowanych grupach w porównaniu z grupą kontrolną, za wyjątkiem grupy 500 pg/kg AMP2. W przeciwieństwie do innych cykli, było to więcej w porównaniu z najniższym występującym w tym cyklu. To zmniejszenie pojawiło się od Dnia 1-9 po podawaniu i zaczęło powracać najwcześniej w Dniu 11.

Rezultaty wskazują, że zwiększenie ilości płytek, powyżej tej u kontrolnych zwierząt, mogłoby być wykryte od 7 do 9 dni po podawaniu w przypadku wszystkich badanych zwierząt we wszystkich cyklach. Okazało się, że faza z powtarzaną dawki powodowała wyższą odpowiedź w postaci produkcji płytek w porównaniu do fazy z pojedynczą dawką. W Cyklu 4-tym ujawniona odpowiedź płytkowa w grupie PEG-rHuMGDF była niższa w porównaniu do poprzednich cykli i w porównaniu do wyników z grupy o wysokiej dawce AMP2. Zmniejszenie ilości RBC zanotowano w Cyklach 1, 2, 3 i 4 w większości leczonych grup w pewnych punktach podczas każdego cyklu badań, jednakże wszystkie parametry hematologiczne powróciły do normalnych poziomów (w porównaniu z grupą kontrolną), po zaprzestaniu podawania.

Ogólnie, te rezultaty wskazują, że podawanie AMP2 było dobrze tolerowane przez małpy rhezus oraz że AMP2 powodował zwiększenie ilości płytek po różnych cyklach podawania. Nie okazało się, w oparciu o wyniki ilości płytek, że wystąpiła biologicznie istotna immuno-mediowana odpowiedź na AMP2. W przeciwieństwie do tego, podawanie PEG-rHuMGDF w różnych cyklach wykazało inhibitowanie odpowiednich płytek w Cyklu 4, co wskazuje, że wytworzono przeciwciała PEG-rHuMGDF i te przeciwciała anty-MGDF mogą reagować wzajemnie z endogennym TPO małp rhezus.

PL 219 605 B1

WYKAZ SEKWENCJI <170> Patent In Ver. 2,0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213 > Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 1

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 15 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <220>

<223> Peptyd jest podjednostką homodimeru: podjednostki w dimerze są kowalencyjnie związane z każdym końcem karboksylowym przez połączenie peptydowe z

NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(CONH2)-NH-CO-CH2-CH2-ΝΗ2 <400=· 2

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 15 10 <210> 3 <211> 684 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 3 atggacaaaa gtcttcctct acatgcgtgg gacggcgtgg taccgtgtgg aagtgcaagg aaagggcagc aagaaccagg gagtgggaga tccgacggct gggaacgtct agcctctccc ctcacacatg tccccccaaa tggtggacgt aggtgcataa tcagcgtcct tctccaacaa cccgagaacc tcagcctgac gcaatgggca ccttcttcct tctcatgctc tgtctccggg tccaccttgt acccaaggac gagccacgaa tgccaagaca caccgtcctg agccctccca acaggtgtac ctgcctggtc gccggagaac ctacagcaag cgtgatgcat taaa ccagctccgg accctcatga gaccctgagg aagccgcggg caccaggact gcccccatcg accctgcccc aaaggcttct aactacaaga ctcaccgtgg gaggctctgc aactcctggg tctcccggac tcaagttcaa aggagcagta ggctgaatgg agaaaaccat catcccggga atcccagcga ccacgcctcc acaagagcag acaaccacta gggaccgtca 60 ccctgaggtc 120 ctggtacgtg 180 caacagcacg 240 caaggagtac 300 ctccaaagcc 360 tgdgctgacc 420 catcgccgtg 480 cgtgctggac 540 gtggcagcag 600 cacgcagaag 660

684 <210> 4 <211> 684 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

PL 219 605 B1 <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: oligonucleotide <400> 4 tacctgtttt gagtgtgtac aggtggaaca ggtcgaggcc ttgaggaccc ccctggcagt 60 cagaaggaga aggggggttt tgggttcctg tgggagtact agagggcctg gggactccag 120 tgtacgcacc accacctgca ctcggtgctt ctgggactcc agttcaagtt gaccatgcac 180 ctgccgcacc tccacgtatt acggttctgt ttcggcgccc tcctcgtcat gttgtcgtgc 240 atggcacacc agtcgcagga gtggcaggac gtggtcctga ccgacttacc gttcctcatg 300 ttcacgttcc agaggttgtt tcgggagggt cgggggtagc tcttttggta gaggtttcgg 360

Łttcccgtcg gggctcttgg tgtccacatg tgggacgggg gtagggccct actcgactgg 420 ttcttggtcc agtcggactg gacggaccag tttccgaaga tagggtcgct gtagcggcac 480 ctcaccctct cgttacccgt cggcctcttg ttgatgttct ggtgcggagg gcacgacctg 540 aggctgccga ggaagaagga gatgtcgttc gagtggcacc tgttctcgtc caccgtcgtc 600 cccttgcaga agagtacgag gcactacgta ctccgagacg tgttggtgat gtgcgtcttc 660 tcggagaggg acagaggccc attt 684 <210> 5 <211> 228 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd c400> 5

Met 1

Asp

Lys

Thr

His 5

Thr

Cys

Pro

Cys 10

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu 15

Leu

Gly

Pro

Ser 20

Val

Phe

Leu

Phe

Pro 25

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 30

Thr

Leu

Met

Ile

Ser 35

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 40

Thr

Cys

Val

val 45

Asp

Val

Ser

His

Glu 50

Asp

Pro

Glu

Val

Lys 55

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 60

Asp

Gly

Val

Glu

Val 65

His

Asn

Ala

Lys

Thr 70

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu 75

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr 80

Tyr

Arg

Val

Ser 85

Val

Leu

Thr

Val

Leu 90

His

Gin

Asp

Trp

Leu 95

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr 100

Lys

Cys

Lys

Val

Ser 105

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro 110

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys 115

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala 120

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg 125

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr 130

Thr

Leu

Pro

Ser 135

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr 140

Lys

Asn

Gin

Val

Ser 145

Leu

Thr

Cys

Leu

Val 150

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro 155

Ser

Asp

Ile

Ala

Val 160

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

165 170 175

PL 219 605 B1

Pro	Val	Leu	Asp 180	Ser	Asp	Gly	Ser
Val	Asp	Lys 195	Ser	Arg	Trp	Gin	Gin 200
Met	His 210	Glu	Ala	Leu	His	Asn 215	His
Ser	Pro	Gly	Lys

Phe 185	Phe	Leu	Tyr	Ser	Lys 190	Leu	Thr
Gly	Asn	Val	Phe	Ser 205	Cys	Ser	Val
Tyr	Thr	Gin	Lys	Ser	Leu	Ser	Leu

220

225 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

<400> 6

Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

<400> 7

Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

<400> 8

Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:

<400> 9

Gly Pro Asn Gly 1 peptyd peptyd peptyd peptyd

PL 219 605 B1 <210> 10 <211> 32 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 10

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Pro 1 5 10 15

Asn Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 20 25 30 <210> 11 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <220>

<223> Cykliczny peptyd; Struktura drugorzędowa jest utrzymywana przez wiązanie disiarczkowe między wewnątrzcząsteczkowymi resztami Cys w pozycjach 9 i 31 <400> 11

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr Leu

Arg

Gin

Cys

Leu

Ala

Arg

Ala

Gly

1

5

10

15

Gly

Gly Gly

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Cys

Leu

20

25

30

Ala

Arg

Ala

35

<210> 12 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 12

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr Leu Arg

Gin

Cys

Leu

Ala

Arg

Ala

Gly

1

5

10

15

Gly

Gly Gly Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Arg

Leu

Gin

Cys

Leu

20

25

30

Ala

Arg

Ala

35

<210> 13 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja

PL 219 605 B1 <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 13

Ile 1

Glu

Gly

Pro

Thr Leu 5

Arg

Gin

Ala

Leu 10

Ala

Arg

Ala

Gly 15

Gly

Gly 20

Gly Gly

Ile

Glu

Gly 25

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin 30

Ala

Leu

Ala

Arg 35

Ala

<210> 14 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 14

Ile 1

Glu

Gly

Pro

Thr Leu Arg 5

Gin

Trp

Leu 10

Ala

Arg

Ala

Gly 15

Gly

Lys

Gly

Gly 20

Gly Gly Ile

Glu

Gly 25

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin 30

Trp

Leu

Ala

Arg 35

Ala

<210> 15 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> reszta Lys w pozycji 18 jest bromoacetylowana <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: derywatyzowany peptyd <400> 15

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

20	25	30
Ala Ala Arg Ala 35

<210> 16 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd

PL 219 605 B1

<400> 16

Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

Ile 1

Glu

Gly

Pro Thr Leu Arg 5

10

15

Gly

Cys

Gly

Gly 20

Gly Gly

Ile

Glu Gly 25

Pro

Thr

Leu Arg

Gin 30

Trp

Leu

Ala

Arg 35

Ala

<210> 17 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Lys w pozycji 18 jest pegylowana <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: derywatyzowany peptyd <400> 17

Ile Glu Gly 1	Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
5	10	15
Gly Lys Gly	Gly Gly Gly Ile	Glu Gly Pro	Thr Leu Arg Gin Trp Leu
	20	25	30
Ala Ala Arg	Ala
35

<210> 18 <211> 36 <212> PRT <213 > Sztuczna sekwencja <220>

<223> Cys w pozycji 18 jest pegylowana <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: derywatyzowany peptyd <400> 18

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 19 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd

PL 219 605 B1

<400> 19

Arg Gin

Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

Ile Glu 1

Gly

Pro Thr Leu 5

10

15

Gly

Asn

Gly

Ser 20

Gly Gly

Ile

Glu

Gly 25

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin 30

Trp Leu

Ala

Arg 35

Ala

<210> 20 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Monomeryczna podjednostka homodimeru; Podjednostki homodimeru jest związana przez wiązanie disiarczkowe pomiędzy resztami Cys w pozycji 18 w każdej podjednostce <220>

<223 > Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 20

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

²⁰	25	30
Ala Ala Arg Ala 35

<210> 21 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 21

Ile Glu Gly Pro Thr Leu

Arg Gin Trp

Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly

1

5

10

15

Gly

Gly Gly

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

20

25

30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 22 <211> 32 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Peptyd jest derywatyzowany przy końcu aminowym z kowalencyjnie związanym regionem Fc immunoglobuliny

PL 219 605 B1 <220>

<223 > Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 22

Ile Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

Gly

Pro

1

5

10

15

Asn Gly

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

20

25

30

<210> 23 <211> 32 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Peptyd jest kowalencyjnie związany przy końcach aminowym i karboksylowym do regionu Fc immunogłobuliny <220>

<223 > Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 23

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

Gly

Pro

1

5

10

15

Asn

Gly

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

20

25

30

<210> 24 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Peptyd jest kowalencyjnie związany przy końcu karboksylowym do regionu Fc immunogłobuliny <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 24

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

Gly

1

5

10

15

Gly

Gly Gly

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

20

25

30

Ala

Arg

Ala

35

<210> 25 <211> 34 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Peptyd jest kowalencyjnie związany przy końcu aminowym do regionu Fc immunogłobuliny

PL 219 605 B1 <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 25

Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala 15 10 15

Gly Pro Asn Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala

Arg Ala

20

25

30

<210> 26 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Peptyd jest kowalencyjnie związany przy końcu aminowym do regionu Fc immunoglobuliny <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 26

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu

20	25	30
Ala Arg Ala 35

<210> 27 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Cykliczny peptyd; Struktura drugorzędowa jest utrzymywana przez wiązanie disiarczkowe między wewnątrzcząsteczkowymi resztami Cys w pozycjach 9 i 31 <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 27

Ile 1

Glu

dy

Pro

Thr Leu 5

Arg

Gin

Cys

Leu 10

Ala

Arg Ala

Gly Gly 15

Gly

Gly 20

Gly Gly

Ile

Glu

Gly 25

Pro

Thr

Leu

Arg Gin 30

Cys Leu

Ala

Arg 35

Ala

PL 219 605 B1 <210> 28 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 28

Ile Glu Gly 1	Pro Thr Leu Arg Gin Cys Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
5	10	15
Gly Gly Gly	Gly Gly Gly Ile	Glu Gly Pro	Thr Leu Arg Gin Cys Leu
	20	25	30
Ala Ala Arg	Ala
35

<210> 29 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji; peptyd <220>

<223> Peptyd jest kowalencyjnie związany przy końcu aminowym do regionu Fc immunoglobuliny <400> 29

Ile 1

Glu

Gly

Pro

Thr 5

Leu

Arg

Gin

Ala

Leu 10

Ala

Arg

Ala

Gly Gly 15

Gly

Gly 20

Gly

Ile

Glu

Gly 25

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin 30

Ala Leu

Ala

Arg 35

Ala

<210> 30 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Peptyd jest kowalencyjnie związany przy końcu aminowym do regionu Fc immunoglobuliny <220=.

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400=. 30

Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly 15 10 15

PL 219 605 B1

Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu 20 25 30

Ala Ala Arg Ala 35 <210> 31 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 31

Ile Glu Gly 1	Pro Thr Leu Arg Gin Trp Leu Ala Ala Arg Ala Gly Gly
5	10	15
Gly Cys Gly	Gly Gly Gly Ile	Glu Gly Pro	Thr Leu Arg Gin Trp Leu
	20	25	30
Ala Ala Arg	Ala
35

<210> 32 <211> 36 <212> PRT ¢213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <220>

<223> Peptyd jest kowalencyjnie związany pr2y końcu aminowym do regionu Fc immunoglobuliny <400> 32

Ile 1

Glu

Gly

Pro

Thr 5

Leu Arg

Gin

Trp

Leu 10

Ala

Ala Arg

Ala

Gly Gly 15

Gly

Asn

Gly

Ser 20

Gly

Gly Ile

Glu

Gly 25

Pro

Thr

Leu Arg

Gin 30

Trp Leu

Ala

Arg 35

Ala

<210> 33 <211> 36 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <220>

<223> Peptyd jest podjednostką homodimeru; podjednostki w homodimerze są

PL 219 605 B1 kowalencyjnie związane przez połączenie disiarczkowe pomiędzy resztami Cys w pozycji 18 każdej podjednostki <220>

<223> Peptyd jest kowalencyjnie związany przy końcu aminowym do regionu Fc immunoglobuliny <400> 33

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Ala Arg

Ala

Gly

1

5

10

15

Gly

Cys

Gly

Gly Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu Arg

Gin

Trp

Leu

20

25

30

Ala

Arg

Ala

35

<210> 34 <211> 41 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223 > Opis sztucznej sekwencji: peptyd <220>

<223> Peptyd jest kowalencyjnie związany przy końcu aminowym do regionu Fc immunoglobuliny <400> 34

Gly

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

1

5

10

15

Ala

Arg

Ala

Gly

Gly Gly

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

20

25

30

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

35

40

<210> 35 <211> 60 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223 > Opis sztucznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 35 aaaggtggag gtggtggtat cgaaggtccg actctgcgtc agtggctggc tgctcgtgct 60 <210> 36 <211> 48 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: oligonukleotyd

PL 219 605 B1 <400> 36 acctccacca ccagcacgag cagccagcca ctgacgcaga gtcggacc 48 <210> 37 <211> 66 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 37 ggtggtggag gtggcggcgg aggtattgag ggcccaaccc ttcgccaatg gcttgcagca 60 cgcgca 66 <210> 38 <211> 76 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 38 aaaaaaagga tcctcgagat tatgcgcgtg ctgcaagcca ttggcgaagg gttgggccct 60 caatacctcc gccgcc 76 <210> 39 <211> 126 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 39 aaaggtggag gtggtggtat cgaaggtccg actctgcgtc agtggctggc tgctcgtgct 60 ggtggtggag gtggcggcgg aggtattgag ggcccaaccc ttcgccaatg gcttgcagca 120 cgcgca _ł26 <210> 40 <211> 124 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 40 ccaggctgag acgcagtcac cgaccgacga gcacgaccac cacctccacc gccgcctcca 60 taactcccgg gttgggaagc ggttaccgaa cgtcgtgcgc gtattagagc tcctaggaaa 120 aaaa 124 <210> 41 <211> 42 <212> PRT

PL 219 605 B1 <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 41

Lys

Gly

Ile

Glu

Gly

Pro Thr

Leu

Arg

Gin

Trp Leu

1

5

10

15

Ala

Arg

Ala

Gly

Gly Gly

Gly

Ile

Glu

Gly Pro

20

25

30

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

35

40

<210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 42 aacataagta cctgtaggat cg 22 <210> 43 <211> 52 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 43 ttcgatacca ccacctccac ctttacccgg agacagggag aggctcttct gc 52 <210> 44 <211> 861 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 44 tctagatttg ttttaactaa ttaaaggagg aataacatat ggacaaaact cacacatgtc 60 caccttgtcc agctccggaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 120 ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 180 gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 240 ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 300 ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 360 ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac 420 aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 480 gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc 540 cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 600 acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg 660

PL 219 605 B1 tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta 720 aaggtggagg tggtggtatc gaaggtccga ctctgcgtca gtggctggct gctcgtgctg 780 gtggtggagg tggcggcgga ggtattgagg gcccaaccct tcgccaatgg cttgcagcac 840 gcgcataatc tcgaggatcc g 861 <210> 45 <211> 861 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: oligonukleotyd <400> 45 agatctaaac aaaattgatt aatttcctcc ttattgtata cctgttttga gtgtgtacag 60 gtggaacagg tcgaggcctt gaggaccccc ctggcagtca gaaggagaag gggggttttg 120 ggttcctgtg ggagtactag agggcctggg gactccagtg tacgcaccac cacctgcact 180 cggtgcttct gggactccag ttcaagttga ccatgcacct gccgcacctc cacgtattac 240 ggttctgttt cggcgccctc ctcgtcatgt tgtcgtgcat ggcacaccag tcgcaggagt 300 ggcaggacgt ggtcctgacc gacttaccgt tcctcatgtt cacgttccag aggttgtttc 360 gggagggtcg ggggtagctc ttttggtaga ggtttcggtt tcccgtcggg gctcttggtg 420 tccacatgtg ggacgggggt agggccctac tcgactggtt cttggtccag tcggactgga 480 cggaccagtt tccgaagata gggtcgctgt agcggcacct caccctctcg ttacccgtcg 540 gcctcttgtt gatgttctgg tgcggagggc acgacctgag gctgccgagg aagaaggaga 600 tgtcgttcga gtggcacctg ttctcgtcca ccgtcgtccc cttgcagaag agtacgaggc 660 actacgtact ccgagacgtg ttggtgatgt gcgtcttctc ggagagggac agaggcccat 720 ttccacctcc accaccatag cttccaggct gagacgcagt caccgaccga cgagcacgac 780 caccacctcc accgccgcct ccataactcc cgggttggga agcggttacc gaacgtcgtg 840 cgcgtattag agctcctagg c 861 <210> 46 <211> 269 <212> PRT <213 > Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: peptyd <400> 46

Met 1

Asp

Lys

Thr

His 5

Thr

Cys

Pro

Cys 10

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu 15

Leu

Gly

Pro

Ser 20

val

Phe

Leu

Phe

Pro 25

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 30

Thr

Leu

Met

Ile

Ser 35

Arg

Thr

Pro

Glu

Val 40

Thr

Cys

Val

Val 45

Asp

Val

Ser

His

Glu 50

Asp

Pro

Glu

Val

Lys 55

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val 60

Asp

Gly

Val

Glu

Val 65

His

Asn

Ala

Lys

Thr 70

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu 75

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr 80

Tyr

Arg

Val

Ser 85

Val

Leu

Thr

Val

Leu 90

His

Gin

Asp

Trp

Leu 95

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr 100

Lys

Cys

Lys

Val

Ser 105

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro 110

Ala

Pro

PL 219 605 B1

Ile Glu Lys

Thr

Ile

Ser Lys

Ala 120

Lys

Gly Gin

Pro Arg Glu Pro 125

Gin

115

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

13 0

135

140

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

145

150

155

160

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

165

170

175

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

180

185

190

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

195

200

205

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

210

215

220

Ser

Pro

Gly

Lys

Gly

Ile

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

225

230

235

240

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

245

250

255

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Arg

Gin

Trp

Leu

Ala

Arg

Ala

260

265

Zastrzeżenia patentowe

Claims

2. Związek według zastrz. 1, obejmujący sekwencję aminokwasów określoną jako SEQ ID NO: 46.

3. Dimer związku określonego w zastrz. 1 albo 2.

4. Związek określony w dowolnym spośród zastrz. 1-3, do stosowania do (a) zwiększania ilości megakariocytów lub płytek u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba, (b) leczenia trombocytopenii u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba, (c) leczenia idiopatycznej lub immunologicznej trombocytopenii u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba, lub (d) leczenia syndromu mielodysplazji u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba.

5. Zastosowanie związku określonego w dowolnym spośród zastrz. 1-3, do wytwarzania środka medycznego do (a) zwiększania ilości megakariocytów lub płytek u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba, (b) leczenia trombocytopenii u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba, (c) leczenia idiopatycznej lub immunologicznej trombocytopenii u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba, lub (d) leczenia syndromu mielodysplazji u pacjenta, u którego zachodzi taka potrzeba.

6. Związek do stosowania określonego w zastrz. 4 lub zastosowanie określone zastrz. 5, gdzie skuteczna ilość wynosi od 1,0 gg/kg do 100 mg/kg.

7. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek określony w dowolnym spośród zastrz. 1-3, w mieszaninie z jego farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

8. Polinukleotyd kodujący związek określony w dowolnym spośród zastrz. 1-3.

9. Wektor zawierający polinukleotyd określony w zastrz. 8.

10. Komórka gospodarza zawierająca wektor określony w zastrz. 9.

PL 219 605 B1

11. Komórka gospodarza według zastrz. 10, którą jest komórka E. coli.

12. Komórka gospodarza według zastrz. 11, którą to komórką E. coli jest E. coli GM221, zdeponowana w kolekcji ATTC pod numerem dostępu 98957.

13. Sposób wytwarzania związku określonego w dowolnym spośród zastrz. 1-3, znamienny tym, że obejmuje prowadzenie hodowli komórki gospodarza określonej w dowolnym spośród zastrz. 10-12 we właściwej pożywce oraz wyodrębnianie tego związku ze wskazanej komórki lub pożywki.