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KR20240099469A - 핵산의 대상 염기 서열 중에 있어서의 변이를 검출하기 위한 방법, 핵산의 증폭을 선택적으로 저해하는 방법, 및 이것들을 실시하기 위한 키트 - Google Patents

핵산의 대상 염기 서열 중에 있어서의 변이를 검출하기 위한 방법, 핵산의 증폭을 선택적으로 저해하는 방법, 및 이것들을 실시하기 위한 키트 Download PDF

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KR20240099469A
KR20240099469A KR1020247019353A KR20247019353A KR20240099469A KR 20240099469 A KR20240099469 A KR 20240099469A KR 1020247019353 A KR1020247019353 A KR 1020247019353A KR 20247019353 A KR20247019353 A KR 20247019353A KR 20240099469 A KR20240099469 A KR 20240099469A
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nucleic acid
group
base sequence
cationic
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KR1020247019353A
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나호히로 후지무라
아미 다치바나
도모아키 우치키
미노루 다케우치
요코 데루우치
고지 와타나베
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니토 보세키 가부시기가이샤
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Abstract

클램프-PCR 법에 의한 변이형 유전자의 검출 한계보다 낮은 변이형 유전자 함유율로 변이형 유전자를 검출할 수 있는 간편한 방법 및 그것을 실시하는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또, 핵산 증폭 반응에 있어서, 대상으로 하는 염기 서열의 증폭을 선택적으로 저해할 수 있는 간편한 방법 및 그것을 실시하는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
핵산 증폭 반응에 있어서, 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는 양쪽성 공중합체를 클램프 핵산과 공존시켜, 클램프 핵산에 의한 이것과 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭 저해를 증강시킨다.

Description

핵산의 대상 염기 서열 중에 있어서의 변이를 검출하기 위한 방법, 핵산의 증폭을 선택적으로 저해하는 방법, 및 이것들을 실시하기 위한 키트
본 발명은, 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열 중에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하기 위한 방법, 핵산 증폭 반응에 있어서, 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 선택적으로 저해하는 방법, 및 이것들을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 클램프 핵산 (블로커 핵산이라고 불리는 경우도 있다) 을 사용하는 핵산 증폭 반응에 있어서, 특정한 양쪽성 공중합체의 존재하에서 핵산 증폭을 실시함으로써, 대상 염기 서열 중에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하는 방법, 및 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 선택적으로 저해하는 방법, 그리고 이것들을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다.
유전자의 돌연변이가 암의 기인이 되는 경우가 있어, 그러한 유전자의 돌연변이를 조기에 발견함으로써, 암의 조기 치료로 이어지는 것이 기대되고 있다. 또한, 어떤 특정한 유전자의 변이가 어떤 종류의 질병에 걸리기 쉬움, 약의 치료 효과, 부작용의 강약 등에 크게 관여하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 상피 증식 인자 수용체 (EGFR) 의 티로신 키나아제 저해제인 게피티닙 (상품명 : 이레사) 은, 특정한 유전자 변이를 갖는 일부의 폐암 환자에게는 큰 주효성 (奏效性) 을 나타내는 한편, 약 0.5 ％ 정도의 환자에게 위독한 간질성 폐렴을 일으키는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 1). 또한, 대장암에 있어서는, KRAS 유전자에 변이가 있으면 분자 표적약 세툭시맙 (상품명 : 얼비툭스) 의 주효율은 낮고, 변이가 없으면 주효율이 높은 것이 알려져 있다. 이 때문에, 환자마다 주효성이나 부작용을 예측할 수 있으면, 주효성을 기대할 수 없는 환자나 위독한 부작용이 예상되는 환자에 대한 투여를 앞두고, 부작용이 적은 효과적인 치료를 실시하는 것이 가능해진다.
이러한 점에서부터, 유전자의 변이를 밝히는 것은, 암의 조기 발견, 치료 효율의 향상 등의 면에서 중요한 것으로 인식되어, 이러한 니즈에 부응하기 위해, 유전자의 변이를 검출하는 다양한 기술 개발이 이루어지고 있다. 특히, PCR 법과 같은 유전자 증폭 기술 및 NGS 등의 망라적인 유전자 해석 기술에서는, 눈부신 진전이 보인다.
무엇보다, 종양 검체로부터 추출한 유전자에서는 대량의 야생형 유전자와 미량의 변이형 유전자를 포함하는데, 종래의 변이형 유전자를 검출하는 방법에서는, 여전히 미량의 변이형 유전자를 검출하는 데에는 충분한 감도를 갖지 않는 경우가 많다. 예를 들면, 유전자의 변이를 검출하는 수법의 하나로서, 변이형 유전자와 야생형 유전자를 비선택적으로 증폭시킨 후에, 전기 영동법 또는 하이브리다이제이션법 등으로 변이형 유전자를 야생형 유전자와 구별하는 방법이 있지만, 이 방법으로는, 야생형 유전자 중에 포함되는 극히 소량의 변이형 유전자를 충분한 감도 및 정밀도로 검출하는 것이 곤란하다.
이에 대해, 유전자 증폭의 단계에 있어서, 야생형 유전자의 기준 서열과 상보적인 염기 서열을 갖는 인공적인 올리고뉴클레오티드를 사용하여 야생형 유전자의 증폭을 저해하고 변이형 유전자를 선택적으로 증폭시키는, 이른바 「클램프법」이 개발되었다. 이 방법에서 사용되고 있는 인공 핵산은 클램프 핵산이라고 불리우며, 핵산 증폭 과정에서 (i) 야생형 유전자와 강하게 하이브리다이즈되지만, (ii) 변이형 유전자와는 강하게 하이브리다이즈되지 않고, (iii) 핵산 증폭 과정에서 분해되기 어렵다, 는 특성을 가지며, 이것을 이용하여 real-time PCR 을 실시하면, 변이형 유전자의 빈도가 1 ％ 까지 변이를 검출할 수 있고, 또한 real-time PCR 의 증폭 산물을 주형으로 다이렉트 시퀀스법을 실시하면 변이형 유전자의 빈도가 0.1 ％ 까지 변이를 검출할 수 있다고 되어 있다 (예를 들면, 특허문헌 1, 비특허문헌 2, 비특허문헌 3). 클램프 핵산으로는, peptide nucleic acid (PNA), locked nucleic acid (LNA) 및 bridged nucleic acid (BNA) 가 개발되고, PNA-LNA clamp PCR 법, BNA clamp PCR 법 등의 증폭법이 개발되어 있다 (예를 들면, 비특허문헌 2, 3, 6 및 특허문헌 1 ∼ 9 참조).
그러나 이 클램프법에 의해서도, 시료 중의 야생형 유전자의 비율에 대하여 변이형 유전자의 비율이 매우 낮은 경우에는, real-time PCR 을 실시하면 야생형 유전자를 증폭시켜 버려, 야생형 유전자와 변이형 유전자를 구별할 수 없는 경우가 있다. 또한, clamp PCR 의 증폭 산물을 주형으로 다이렉트 시퀀스법을 실시하면 변이형 유전자의 검출 감도를 높일 수는 있지만, 시퀀스 결정은, 방대한 검체를 즉석에서 처리하는 것이 요구되는 임상의 경우에는 적합하지 않다.
일본 특허 제6242336호 일본 특허 제5813263호 일본 특허 제4731324호 일본 특허 제4383178호 일본 특허 제5030998호 일본 특허 제4151751호 일본 공개특허공보 제2001-89496호 국제 공개 제2003/068795호 팜플렛 국제 공개 제2005/021570호 팜플렛 일본 특허 제3756313호 국제 공개 제2016/167320호 팜플렛
Thomas J., et.al., 2004, The NEW ENGLAND JURNAL of MEDICINE, 350 ; 21 Nagai K., et.al., 2005, Cancer Research, 65 : 7276-7282 Nishino K. et al., 2019, 폐암 환자에 있어서의 EGFR 유전자 변이 검사의 안내 제4.1판 Luming Z. et al., 2011 BioTechniques, 50 : 311-318 Nagakubo Y. et al., 2019, BMC Medical Genomics, 12 : 162 Murina F. F. et al., 2020, Molecules, 25(4) : 786
이와 같이, 임상이나 연구의 현장에 있어서, 시료 중의 야생형 유전자의 비율에 대하여 변이형 유전자의 비율이 매우 낮은 경우에도 변이형 유전자를 검출할 수 있는 방법에 대한 요구가 있어, 이것에 대응하는 수법의 연구가 진행되고 있다 (특허문헌 2, 비특허문헌 4, 비특허문헌 5). 그러나 종래의 방법은, 변이형 유전자를 고감도로 검출하기 위해서 고가의 기기나 2 단계 이상의 복잡한 해석 스텝을 필요로 하여 (비특허문헌 2), 임상의 현장이나 연구 현장에서는 간이한 방법으로 시료 중의 변이형 유전자를 고감도로 검출 가능한 방법이 요구되고 있다.
따라서 본 발명은, 클램프-PCR 법에 의한 변이형 유전자의 검출 한계보다 낮은 변이형 유전자 함유율로 변이형 유전자를 검출할 수 있는 간편한 방법 및 그것을 실시하는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 핵산 증폭 반응에 있어서, 대상으로 하는 염기 서열의 증폭을 선택적으로 저해할 수 있는 간편한 방법 및 그것을 실시하기 위한 키트를 제공하는 것도 목적으로 한다.
본 발명자들은, 클램프법에 의한 변이형 유전자의 검출 감도를 올리는 수법에 대해 검토를 거듭하는 와중에, 클램프 핵산과 특정한 양쪽성 공중합체의 존재하에서 핵산 증폭 반응을 실시한 결과, 클램프 핵산에 의한 야생형 유전자의 증폭을 선택적으로 저해하는 효과가 당해 양쪽성 공중합체의 존재에 의해 증강되고, 이로써 변이형 유전자의 검출 감도를 높이는 것에 성공하여, 본 발명에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 방법, 키트, 증강제, 및 사용을 제공한다.
[1] 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하는 방법으로서,
상기 표준 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,
구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체를 사용하여, 상기 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하고,
상기 핵산 증폭 반응에 의해 얻어진 핵산 증폭 산물의 총량, 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수, 상기 핵산 증폭 산물 중의 상기 변이를 갖는 핵산의 양, 또는 상기 핵산 증폭 산물 중의 상기 변이를 갖는 핵산의 양이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수에 기초하여, 상기 변이의 존재를 판정하는, 방법.
[2] 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가, 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기를 갖는, [1] 에 기재된 검출 방법.
[3] 상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, [1] 또는 [2] 에 기재된 검출 방법.
[4] 상기 양쪽성 공중합체에 있어서, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
[화학식 1]
Figure pct00001
(식 중, R1 은, 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.)
로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1) 이고,
상기 아니온성 구성 단위 (2) 의 적어도 일부가 일반식 (II-a)
[화학식 2]
Figure pct00002
(식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 이다.) 로 나타내는 구성 단위 (2-1) 인, [1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법.
[5] 상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, [1] ∼ [4] 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법.
[6] 상기 핵산 증폭을 리얼타임 PCR 로 실시하는, [1] ∼ [5] 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법.
[7] 상기 핵산 샘플이 게놈 DNA 인, [1] ∼ [6] 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법.
[8] 또한, 상기 표준 염기 서열을 갖는 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을, 예를 들어 상기 핵산 증폭 반응을 실시할 때, 실시하여,
상기 시료 중의 핵산을 주형으로 사용한 경우의 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수가, 상기 표준 염기 서열을 갖는 핵산을 주형으로 사용한 경우의 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수와 비교하여 적었던 경우에, 상기 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 상기 변이가 존재한다고 판정하는, [1] ∼ [7] 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법.
[9] 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하기 위한 키트로서,
상기 표준 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,
구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체를 포함하는 키트.
[10] 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가, 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기를 갖는, [9] 에 기재된 키트.
[11] 상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, [9] 또는 [10] 에 기재된 키트.
[12] 상기 양쪽성 공중합체에 있어서, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
[화학식 3]
Figure pct00003
(식 중, R1 은, 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.)
로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1) 이고,
상기 아니온성 구성 단위 (2) 의 적어도 일부가 일반식 (II-a)
[화학식 4]
Figure pct00004
(식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 이다.)
로 나타내는 구성 단위 (2-1) 인, [9] ∼ [11] 중 어느 한 항에 기재된 키트.
[13] 상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, [9] ∼ [12] 중 어느 한 항에 기재된 키트.
[14] 핵산 증폭 반응에 있어서, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 시료 중의 핵산의 증폭을 저해하는 방법으로서,
상기 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 핵산을 포함하는, 클램프 핵산과,
구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체를 사용하여, 상기 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하는, 방법.
[15] 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가, 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기를 갖는, [14] 에 기재된 방법.
[16] 상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, [14] 또는 [15] 에 기재된 방법.
[17] 상기 양쪽성 공중합체에 있어서, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
[화학식 5]
Figure pct00005
(식 중, R1 은, 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.)
로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1) 이고,
상기 아니온성 구성 단위 (2) 의 적어도 일부가 일반식 (II-a)
[화학식 6]
Figure pct00006
(식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 이다.)
로 나타내는 구성 단위 (2-1) 인, [14] ∼ [16] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[18] 상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, [14] ∼ [17] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[19] 핵산 증폭 반응에 있어서, 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하기 위한 키트로서,
상기 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,
구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체를 포함하는, 키트.
[20] 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가, 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기를 갖는, [19] 에 기재된 키트.
[21] 상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, [19] 또는 [20] 에 기재된 키트.
[22] 상기 양쪽성 공중합체에 있어서, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
[화학식 7]
Figure pct00007
(식 중, R1 은, 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.)
로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1) 이고,
상기 아니온성 구성 단위 (2) 의 적어도 일부가 일반식 (II-a)
[화학식 8]
Figure pct00008
(식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 이다.)
로 나타내는 구성 단위 (2-1) 인, [19] ∼ [21] 중 어느 한 항에 기재된 키트.
[23] 상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, [19] ∼ [22] 중 어느 한 항에 기재된 키트.
[24] 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 핵산 증폭을, 상기 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산에 의해 저해하는 효과의 증강제로서,
구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체를 포함하는, 증강제.
[25] 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가, 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기를 갖는, [24] 에 기재된 증강제.
[26] 상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, [24] 또는 [25] 에 기재된 증강제.
[27] 상기 양쪽성 공중합체에 있어서, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
[화학식 9]
Figure pct00009
(식 중, R1 은, 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.)
로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1) 이고,
상기 아니온성 구성 단위 (2) 의 적어도 일부가 일반식 (II-a)
[화학식 10]
Figure pct00010
(식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 이다.)
로 나타내는 구성 단위 (2-1) 인, [24] ∼ [26] 중 어느 한 항에 기재된 증강제.
[28] 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭 저해 효과를 증강하는 핵산 증폭 저해 증강제를 제조하기 위한 양쪽성 공중합체의 사용으로서,
상기 양쪽성 공중합체는, 구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체의 사용.
[29] 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가, 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기를 갖는, [28] 에 기재된 사용.
[30] 상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, [28] 또는 [29] 에 기재된 사용.
[31] 상기 양쪽성 공중합체에 있어서, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
[화학식 11]
Figure pct00011
(식 중, R1 은, 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.)
로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1) 이고,
상기 아니온성 구성 단위 (2) 의 적어도 일부가 일반식 (II-a)
[화학식 12]
Figure pct00012
(식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 이다.)
로 나타내는 구성 단위 (2-1) 인, [28] ∼ [30] 중 어느 한 항에 기재된 사용.
[32] 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭 저해 효과를 증강하기 위한 양쪽성 공중합체의 사용으로서,
상기 양쪽성 공중합체는, 구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체의 사용.
[33] 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가, 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기를 갖는, [32] 에 기재된 사용.
[34] 상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, [32] 또는 [33] 에 기재된 사용.
[35] 상기 양쪽성 공중합체에 있어서, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
[화학식 13]
Figure pct00013
(식 중, R1 은, 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.)
로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1) 이고,
상기 아니온성 구성 단위 (2) 의 적어도 일부가 일반식 (II-a)
[화학식 14]
Figure pct00014
(식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 이다.)
로 나타내는 구성 단위 (2-1) 인, [32] ∼ [34] 중 어느 한 항에 기재된 사용.
상기 양쪽성 공중합체는, 그 자체로는 핵산 증폭 반응을 저해하지 않지만, 클램프 핵산에 의한 그것에 상보적인 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 효과를 선택적으로 증강할 수 있다. 이로써, 본 발명의 일 실시형태에 의하면, 시료 중에 있어서, 클램프 핵산에 상보적인 표준 염기 서열을 갖는 핵산의 비율에 대해, 표준 염기 서열에 대한 변이를 갖는 핵산의 비율이 매우 낮은 경우에도 (예를 들면, 0.1 ％ 이하), 클램프 핵산에 의해 표준 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭이 선택적으로 저해되는 한편, 표준 염기 서열에 대한 변이를 갖는 핵산이 통상과 같이 증폭되어, 변이를 갖는 핵산의 검출이 매우 고감도로 간이한 방법에 의해 가능하게 된다.
도 1 의 a 는, 시험 1 에 있어서, PCR 반응을 저해하지 않는 경우의 핵산 증폭 곡선의 일례로서, 실시예 2 의 폴리머 (디알릴메틸아민·말레산 1 : 1 의 공중합체) 를 사용한 경우의 핵산 증폭 곡선을 나타낸다. 도 1 의 b 는, 시험 1 에 있어서, PCR 반응을 저해하는 경우의 핵산 증폭 곡선의 일례로서, 비교예 7 의 폴리머 (디알릴디메틸암모늄클로라이드·아크릴아미드 8 : 1 의 공중합체) 를 사용한 경우의 핵산 증폭 곡선을 나타낸다.
도 2 는, 변이형 유전자의 증폭은 저해하지 않고, BNA 를 포함하는 클램프 핵산 (BNA clamp) 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 증강하는 경우의 핵산 증폭 곡선의 일례로서, BNA clamp 의 존재하 또는 비존재하에, 실시예 4 의 폴리머 (디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염·아크릴아미드·아크릴산 1 : 1 : 2 의 공중합체) 를 첨가 또는 첨가하지 않고, 야생형 유전자 또는 변이형 유전자를 주형으로 하여 리얼타임 PCR 반응을 실시했을 때의 핵산 증폭 곡선을 나타낸다.
도 3 은, BNA clamp 의 존재하, 폴리머를 첨가하지 않거나, 혹은 실시예 1, 2, 4 또는 6 의 폴리머 (디알릴아민염산염·말레산 1 : 1 의 공중합체, 디알릴메틸아민·말레산 1 : 1 의 공중합체, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염·아크릴아미드·아크릴산 1 : 1 : 2 의 공중합체 또는 디알릴아민염산염·아크릴아미드·아크릴산 1 : 1 : 2 의 공중합체) 를 첨가하고, 변이형의 함유율이 10 ％, 1 ％, 0.10 ％, 0.01 ％ 또는 0 ％ (WT) 인 KRAS 유전자를 주형으로 하여, 리얼타임 PCR 반응을 실시했을 때의 핵산 증폭 곡선을 나타낸다.
도 4 는, 시험 5 에서 사용한 KRAS WT/Mutant plasmid DNA 의 구조를 나타낸다.
도 5 는, BNA clamp 의 존재하, 폴리머를 첨가하지 않거나, 혹은 실시예 1, 2, 4 또는 6 의 폴리머 (디알릴아민염산염·말레산 1 : 1 의 공중합체, 디알릴메틸아민·말레산 1 : 1 의 공중합체, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염·아크릴아미드·아크릴산 1 : 1 : 2 의 공중합체 또는 디알릴아민염산염·아크릴아미드·아크릴산 1 : 1 : 2 의 공중합체) 를 첨가하고, 변이형의 함유율 0.01 ％ 이고 KRAS 유전자를 갖는 도 4 의 플라스미드 DNA 를 주형으로서 사용하여, 리얼타임 PCR 반응을 실시했을 때의 핵산 증폭 곡선을 나타낸다.
도 6 은, BNA clamp 의 존재하, 폴리머를 첨가하지 않거나, 혹은 실시예 1, 2, 4 또는 6 의 폴리머 (알릴아민염산염·말레산 1 : 1 의 공중합체, 디알릴메틸아민·말레산 1 : 1 의 공중합체, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염·아크릴아미드·아크릴산 1 : 1 : 2 의 공중합체 또는 디알릴아민염산염·아크릴아미드·아크릴산 1 : 1 : 2 의 공중합체) 를 첨가하고, 변이형의 함유율이 0.01 ％ 이고 KRAS 유전자를 갖는 도 4 의 플라스미드 DNA 를 주형으로서 사용하여, 리얼타임 PCR 반응을 실시하여 얻어진 PCR 산물을 시퀀스 결정하여 얻어진 결과를 나타낸다.
본 발명의 실시형태를 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시형태에 한정시켜 이해되어야 하는 것은 아니다.
본 발명은, 일 실시형태에 있어서, 클램프 핵산을 사용하는 핵산 증폭법에 있어서, 특정한 양쪽성 공중합체의 존재하에 핵산 증폭을 실시함으로써, 대상 염기 서열 중에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 다른 실시형태에 있어서, 클램프 핵산 및 특정한 양쪽성 공중합체의 존재하에 핵산 증폭을 실시함으로써, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 또 다른 실시형태에 있어서, 이들 방법을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 또 다른 실시형태에 있어서, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭 저해 효과의 증강제에 관한 것이다. 이하, 각 실시형태에 대해 상세하게 설명한다.
1. 대상 염기 서열 중에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하는 방법
본 발명의 일 실시형태는, 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은, 표준 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 클램프 핵산과, 특정한 양쪽성 공중합체를 준비하고, 이들을 이용하여 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시한다. 대상 염기 서열이 표준 염기 서열에 대하여 변이를 갖는 경우에는, 대상 염기 서열을 포함하는 영역이 표준 서열보다 우선적으로 핵산 증폭되어, 이로써, 변이의 존재를 검출하는 것이 가능해진다.
시료
본 발명의 방법에 제공되는 시료는, 실시형태에 따라서, 변이를 갖는 핵산 또는 증폭 저해 대상인 핵산을 포함할 수 있다고 상정되는 시료이며, 본 실시형태에 있어서는, 변이의 검출이 소망되는 핵산을 포함한다고 상정되는 시료이다. 시료는, 예를 들어 포유 동물, 전형적으로는 인간으로부터 채취된 검체로부터 조제된 시료이다. 예를 들면, 혈액, 흉수, 기관지 세정액, 골수액, 림프액 등의 액체 시료, 또는 림프절, 혈관, 골수, 뇌, 비장, 피부 등의 고형 시료로부터 조제된 시료를 들 수 있다. 본 발명의 방법은 매우 높은 감도로 핵산의 변이를 검출할 수 있기 때문에, 예를 들면 암 등의 병변 부위로부터 채취된 검체로부터의 시료뿐만 아니라, 혈액 등의 변이형 유전자가 미량밖에 포함되지 않은 검체로부터의 시료를 이용할 수 있다.
대상 염기 서열
본원 명세서에 있어서, 「대상 염기 서열」이란, 본 발명의 실시형태에 의한 방법에 따라서, 변이 검출 또는 증폭 저해의 대상이 되는 염기 서열을 의미한다. 또한, 「시료 중의 핵산」은, 변이 검출 또는 증폭 저해의 대상이 되는 염기 서열을 포함할 수 있는 핵산이다. 단, 「대상 염기 서열」은, 실제로 변이를 갖는 것, 또는 실제로 증폭 저해되는 염기 서열을 포함하는 것까지는 의미하지 않으며, 「시료 중의 핵산」은, 실제로 변이 검출 또는 증폭 저해의 대상이 되는 염기 서열을 포함하는 것까지는 의미하지 않는다.
본 실시형태에 의한 방법에 있어서는, 「대상 염기 서열」은, 변이의 유무를 검출하는 대상이 되는 염기 서열이고, 「시료 중의 핵산」은, 변이의 유무를 검출하는 대상이 되는 염기 서열을 포함하는 핵산이다. 또한, 「대상 염기 서열을 포함하는 영역」은, 본 발명의 방법에 의해 증폭 대상이 되는 영역이다.
시료 중의 핵산
핵산은, DNA 여도 되고 RNA 여도 되며, 게놈 DNA, cDNA, 플라스미드 DNA, 무세포 DNA, 순환 DNA, RNA, miRNA, mRNA 등의 천연형 혹은 비천연형의 모든 핵산을 포함할 수 있다. 포유 동물, 전형적으로는 인간으로부터 채취된 검체로부터의 시료를 사용하는 경우에는, 변이 검출의 대상이 되는 핵산은, 많은 경우 DNA 이고, 전형적으로는 임상 상의 의의가 큰 게놈 DNA 이다. 또, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭의 저해 효과의 증강 효과가 커진다는 관점에서도, 시료 중의 핵산은 게놈 DNA 인 것이 바람직하다.
게놈 DNA 로는, 예를 들면, 그 변이 (선천적 또는 후천적인 변이) 가 특정 질환의 발증 및/또는 치료 감수성에 관련되는 게놈 DNA 를 들 수 있다. 이러한 질환은 다수 알려져 있으며, 그 대표적인 예가 각종 암이다. 또한, 그 변이가 암의 발증 및/또는 치료 감수성에 관련되는는 것이 알려져 있는 유전자로는, 예를 들면, ABL/BCR 융합 유전자 (만성 골수성 백혈병), HER2 유전자 (유방암), EGFR 유전자 (비소세포폐암), c-KIT 유전자 (소화관 간질 종양), KRAS 유전자 (대장암, 췌암), BRAF 유전자 (멜라노마, 대장암), PI3KCA 유전자 (폐암, 대장암), FLT3 유전자 (급성 골수성 백혈병), MYC 유전자 (여러가지 암), MYCN 유전자 (신경아세포종), MET 유전자 (폐암, 위암, 멜라노마), BCL2 유전자 (여포성 B 림프종), 및 EML4/ALK 융합 유전자 (폐암) 를 들 수 있다.
표준 염기 서열 및 변이
본원 명세서에 있어서, 「표준 염기 서열」이란, 「대상 염기 서열」의 변이를 검출하는 방법에 있어서, 「대상 염기 서열」이 변이를 갖고 있는지를 판단할 때의 기준이 되는 염기 서열을 의미하고, 「변이」는, 「대상 염기 서열」이 「표준 염기 서열」에 대하여 치환, 삽입, 결실, 역위, 중복, 전좌 또는 이들의 2 개 이상의 조합에 의해 어떠한 염기 서열의 상이를 가지고 있는 상태를 의미한다. 본원 명세서에 있어서, 이와 같은 「변이」는, 20 ％ 이하의 염기 서열의 상이, 10 ％ 이하의 염기 서열의 상이, 5 ％ 이하의 염기 서열의 상이, 또는, 1 ％ 이하의 염기 서열의 상이어도 된다.
「표준 염기 서열」은, 검사 목적에 따라서 다양한 염기 서열을 선택할 수 있지만, 전형적으로는, 야생형의 핵산에서 유래하는 염기 서열이고, 바람직하게는 특정 질환의 발증 및/또는 치료 감수성에 관련되는 것이 알려져 있는 야생형 유전자에서 유래하는 염기 서열이다. 따라서, 「변이형 핵산」은, 전형적으로는, 야생형의 핵산에서 유래하는 염기 서열에 대해 치환, 삽입, 결실, 역위, 중복, 전좌 또는 이들의 2 개 이상의 조합에 의해 어떠한 염기 서열의 상이가 있는 핵산이며, 바람직하게는, 특정 질환의 발증 및/또는 치료 감수성에 관련되는 것이 알려져 있는 야생형 유전자에 대하여 이러한 염기 서열의 상이가 있는 핵산이다. 예를 들어, KRAS 유전자의 제 2 엑손의 12 번째 코돈 또는 13 번째 코돈의 변이는, 분자 표적약 세툭시맙의 주효율과 관련되는 것이 알려져 있다. 또한, BRAF 유전자에서는, 제 15 엑손의 600 번째 코돈의 변이는. 분자 표적약 세툭시맙 또는 파니투무맙의 주효율과 관련되는 것이 알려져 있다.
특정한 양쪽성 공중합체가 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭의 저해 효과를 특히 증대시키는 점에서, 상기 시료 중의 핵산에 포함되는, 변이를 포함하지 않는 대상 서열 (표준 염기 서열) 과, 상기 변이가 포함되는 대상 서열의 합계에 대해, 상기 변이가 포함되는 대상 염기 서열의 비율의 기대값은, 0.1 ％ 미만이어도 된다. 또한, 바람직한 실시형태에서는 0.05 ％ 이하여도 되고, 더욱 바람직한 실시형태에서는 0.01 ％ 이하여도 된다. 여기서, 변이가 포함되는 대상 염기 서열의 비율의 기대값은, 각 변이에 대하여 임상적으로 구해진다.
클램프 핵산
본원 명세서에 있어서, 「클램프 핵산」이란, 핵산 증폭을 저해하는 대상으로 한 「염기 서열」(실시형태에 따라서 「표준 염기 서열」인 경우도 「대상 염기 서열」인 경우도 있을 수 있다) 과 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 인공적인 핵산이다. 「클램프 핵산」은, 핵산 증폭을 저해하는 대상으로 한 「염기 서열」과 하이브리다이즈되어 핵산 증폭을 저해하지만, 그 염기 서열과 상보적이지 않은 염기 서열의 핵산은 강하게 하이브리다이즈되지 않아 핵산 증폭을 저해하지 않는다.
「대상 염기 서열」의 변이를 검출하는 방법에 있어서는, 「클램프 핵산」에 의해 핵산 증폭을 저해하는 대상이 되는 「염기 서열」은 「표준 염기 서열」이고, 「클램프 핵산」은, 「표준 염기 서열」에 하이브리다이즈되어 그 핵산 증폭을 저해한다.
비천연형 뉴클레오티드로는, 예를 들어, Peptide Nucleic Acid (PNA), Bridged nucleic acid (BNA), 포스페이트기를 갖는 펩티드 핵산 (PHONA), 모르폴리노 핵산을 들 수 있다. 또한, 제 1 세대의 BNA 는, Locked nucleic acid (LNA) 라고도 불린다 (예를 들어, 비특허문헌 2, 3 및 특허문헌 1, 2 참조).
PNA 를 포함하는 클램프 핵산 (PNA clamp) 은, 핵산의 인산 결합을 대신하여 펩티드 결합으로 골격을 형성하고 있는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 완전 수식형 인공 핵산이다. 수식 뉴클레오티드는, 전형적으로는, 뉴클레오티드의 당-인산 골격을, N-(2-아미노에틸)글리신을 단위로 하는 골격으로 치환하고, 메틸렌카르보닐 결합으로 염기를 결합시킨 구조를 갖는다. PNA 에 관한 상세는, 비특허문헌 6 에 기재하는 바와 같다. PNA clamp 는, 상보 구조의 DNA 사슬과의 하이브리다이즈능이 천연 DNA 보다 강하고, 핵산 분해 효소에 의한 분해를 받지 않는 점에서 클램프 핵산으로서 바람직한 특성을 가지고 있다.
BNA 를 포함하는 클램프 핵산 (BNA clamp) 은, 리보스의 2' 위치의 산소 원자와 4' 위치의 탄소 원자를 가교한 구조를 갖는 1 이상의 비천연 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 인공 핵산이며, 제 1 세대의 BNA 는, Locked nucleic acid (LNA) 라고도 불린다. BNA clamp 는, 나선 구조가 고정화되어, 상보 사슬을 갖는 핵산에 하이브리다이즈되면 매우 안정적인 이중 가닥을 형성할 수 있다. 또, 수식된 뉴클레오티드의 수에 비례하여 상보 사슬을 갖는 핵산에 대한 결합이 강해지기 때문에, 핵산의 길이와 수식 뉴클레오티드의 수를 조정함으로써 적당한 하이브리다이즈능을 획득할 수 있어, 비교적 짧은 올리고뉴클레오티드 사슬로 클램프 효과를 발휘시키는 것이 가능하다.
BNA clamp 의 대표적인 예는, 이하의 구조를 갖는 수식 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다.
[화학식 15]
Figure pct00015
제 1 세대 BNA : 2',4'-BNA (LNA) (예를 들어, 특허문헌 10)
[화학식 16]
Figure pct00016
[화학식 17]
Figure pct00017
[화학식 18]
Figure pct00018
(식 중,
Base 는, 피리미딘 혹은 푸린 핵산 염기, 또는 수산기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 수산기, 탄소수 1 ∼ 5 의 알콕시기, 메르캅토기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 메르캅토기, 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬티오기, 아미노기, 핵산 합성의 보호기로 보호된 아미노기, 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬기로 치환된 아미노기, 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬기 및 할로겐 원자 (예를 들어 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 또는 요오드 원자) 로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기로 치환된 피리미딘 혹은 푸린 핵산 염기를 나타내고,
R2 는, 수소 원자, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 또는 분기 사슬형의 알킬기, 탄소수 2 ∼ 20 의 직사슬 또는 분기 사슬형의 알케닐기, 탄소수 3 ∼ 10 의 시클로알킬기, 탄소수 6 ∼ 14 의 아릴기, 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기가 탄소수 6 ∼ 14 의 아릴기로 치환되어 있는 아르알킬기, 아실기, 술포닐기, 또는 실릴기, 또는 표지 분자를 나타내고,
m 은, 0 ∼ 2 의 정수이고,
n 은, 1 ∼ 3 의 정수이다.)
식 (IV) 의 수식 뉴클레오티드는, 바람직하게는, Base 가 벤조일아미노푸린-9-일, 아데니닐, 2-이소부티릴아미노-6-하이드록시푸린-9-일, 구아니닐, 2-옥소-4-벤조일아미노-1,2-디하이드로피리미딘-1-일, 시토시닐, 2-옥소-5-메틸-4-벤조일아미노-1,2-디하이드로피리미딘-1-일, 5-메틸시토시닐, 우라시닐 및 티미닐기로 이루어지는 군에서 선택되고, R1 이 메틸기이고, m 이 0 이고, n 이 1 이다.
단, 본 발명에서 사용되는 BNA 는 상기에 한정되는 것은 아니며, 다른 BNA (예를 들어, 5'-amino-2',4'-BNA, 2',4'-BNACOC, 2',4'-BNANC 등) 도 사용할 수 있다. 또한, BNA clamp 에서는, 수식 뉴클레오티드와 뉴클레오티드 사이, 또는 수식 뉴클레오티드 사이의 결합은 통상 인산디에스테르 결합이지만, 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다. BNA 의 상세에 대해서는 특허문헌 1 ∼ 10 에 기재되어 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는, 이들 문헌 등의 공지된 기술적 사항으로부터 어떠한 인공 핵산이 BNA clamp 에 해당하는지를 용이하게 이해할 수 있다.
클램프 핵산으로는, 비교적 적은 뉴클레오티드로 상보적인 서열의 핵산과 안정적인 이중 가닥을 형성하고, 당해 핵산의 핵산 증폭을 선택적으로 저해할 수 있는 (후술하는, 인터칼레이터법과 같은 야생형 유전자의 증폭 사이클수를 기준으로 한 변이 검출법을 사용한 경우에 있어서, ΔΔΔCt 값이 크다) 점에서, BNA clamp 가 바람직하고, 특히 식 (IV) 의 구조의 수식 뉴클레오티드를 포함하는 BNA clamp 가 바람직하다.
클램프 핵산의 길이 및 비천연형 뉴클레오티드의 수는, 핵산 증폭을 저해하는 대상이 되는 핵산에 대한 결합력을 결정하는 인자이다. 따라서, 이들 인자는, 핵산 증폭을 저해하는 대상이 되는 핵산 (변이를 검출하는 방법에서는, 표준 염기 서열을 갖는 핵산이다) 에 강력하게 결합하여, 당해 핵산의 증폭을 선택적으로 저해할 수 있도록 적절히 설정하는 것이 바람직하다. 이 점에서, 클램프 핵산의 길이는, 통상 5 ∼ 50 mer 이고, 바람직하게는 6 ∼ 30 mer 이고, 보다 바람직하게는 7 ∼ 25 mer 이고, 더욱 바람직하게는 8 ∼ 20 mer 이고, 특히 바람직하게는 9 ∼ 15 mer 이다.
또, 클램프 핵산에 있어서의 비천연형 핵산의 비율은, 동일한 점에서, 통상 10 ∼ 100 ％ 이고, 바람직하게는 30 ∼ 95 ％이고, 보다 바람직하게는 40 ∼ 90 ％ 이고, 더욱 바람직하게는 50 ∼ 85 ％ 이고, 특히 바람직하게는 60 ∼ 80 ％ 이다.
클램프 핵산의 합성은, 특허문헌 7 ∼ 10 등의 문헌에 기초하여 실시할 수 있다. 또한, 클램프 핵산의 합성을 수탁하는 업자에게 위탁해도 된다.
양쪽성 공중합체
본 발명의 방법에 있어서는, 상기 프라이머 세트를 사용하여, 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시할 때, 상기 블로커 핵산과 함께, 특정한 양쪽성 공중합체가 존재하는 상태에서 핵산 증폭 반응을 실시한다. 본 발명에서 사용되는 양쪽성 공중합체는, 블로커 핵산에 의한 선택적 핵산 증폭 저해 효과를 증강시키는 것으로, 구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체이다.
카티온성 구성 단위 (1)
본 발명에 있어서 사용되는 양쪽성 공중합체를 구성하는 카티온성 구성 단위 (1) 은, 그 구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성의 구성 단위이다.
카티온성 구성 단위 (1) 에는, 그 구조 중에 카티온성의 관능기로서 아미노기를 함유하는 구성 단위인 것 이외의 제한은 부과되지 않고, 따라서 구조 중에 아미노기를 함유하는 구성 단위라는 조건을 만족하는 한, 각종 구조의 구성 단위를 카티온성 구성 단위 (1) 로서 채용할 수 있다.
카티온성 구성 단위 (1) 중의 아미노기에도 특별히 제한은 없지만, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭의 저해 효과의 증강 효과가 크다는 점에서, 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기인 것이 바람직하고, 제 3 급 아미노기인 것이 특히 바람직하다.
카티온성 구성 단위 (1) 로서 특히 바람직한 구성 단위로서, 하기의 구성 단위 (1-1), 구성 단위 (1-2), 구성 단위 (1-3) 및 구성 단위 (1-4) 를 들 수 있다. 그 중에서도, 구성 단위 (1-1), 구성 단위 (1-3) 또는 구성 단위 (1-4) 가 카티온 구성 단위 (1) 로서 바람직하고, 구성 단위 (1-1) 이 카티온성 구성 단위 (1) 로서 특히 바람직하다.
양쪽성 공중합체는, 카티온성 구성 단위 (1) 1 종류만을 포함하고 있어도 되고, 2 종류 이상의 카티온성 구성 단위 (1) 을 포함하고 있어도 된다. 2 종류 이상의 카티온성 구성 단위 (1) 을 포함하는 경우의 당해 2 종류 이상의 카티온성 구성 단위 (1) 은, 함께 구성 단위 (1-1) 로 분류되는 구성 단위의 조합, 함께 구성 단위 (1-2) 로 분류되는 구성 단위의 조합, 함께 구성 단위 (1-3) 으로 분류되는 구성 단위의 조합, 또는 함께 구성 단위 (1-4) 로 분류되는 구성 단위의 조합이어도 되고, 구성 단위 (1-1) 에서 (1-4) 중 서로 상이한 것으로 분류되는 구성 단위끼리의 조합이어도 된다. 구성 단위 (1-1) 에서 (1-4) 중 어느 것에도 해당하지 않는 카티온성 구성 단위를 조합하여 사용해도 된다.
구성 단위 (1-1)
구성 단위 (1-1) 은, 하기 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위이다. 구성 단위 (1-1) 은, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭의 저해 효과의 증강 효과가 크다는 점에서, 카티온성 구성 단위 (1) 로서 특히 바람직한 구성 단위이다. 즉, 카티온성 구성 단위 (1) 의 전부 또는 일부로서 구성 단위 (1-1) 을 사용함으로써, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭의 저해 효과를 보다 증강시킬 수 있다.
[화학식 19]
Figure pct00019
식 중, R1 은 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다. R1 은, 수소 원자, 메틸기, 에틸기 또는 벤질기인 것이 바람직하고, 수소 원자 또는 메틸기인 것이 특히 바람직하다.
구성 단위 (1-1) 은, 상기의 구조식 (1-a), 또는 (1-b) 로 나타내는 구조의 무기산염, 혹은 유기산염 등인 구조, 즉 산 부가염인 구조를 가지고 있어도 된다.
양쪽성 공중합체가 구성 단위 (1-1) 을 갖는 경우, 양쪽성 공중합체의 제조시에 있어서는, 제조 비용 등의 관점에서는, 부가염을 갖는 디알릴아민 모노머를 사용하는 것이 바람직하다. 중합체로부터 HCl 등의 부가염을 제거하는 프로세스는 번잡하여, 비용 증대의 원인이 되기도 하기 때문에, 그와 같은 프로세스를 필요로 하지 않고 제조 가능한, 부가염형의 구성 단위 (1-1) 을 사용하는 것은, 비용 등의 관점에서도 바람직한 실시형태이다.
입수의 용이함이나 반응의 제어성 등의 관점에서, 이 실시형태의 구성 단위 (1-1) 에 있어서의 무기산염, 또는 유기산염은, 염산염, 카르복실산염, 술폰산염, 또는 알킬술페이트염인 것이 바람직하고, 염산염인 것이 특히 바람직하다.
구성 단위 (1-2)
구성 단위 (1-2) 는, 하기 일반식 (I-c) 혹은 일반식 (I-d) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 20]
Figure pct00020
식 중, R2 및 R3 은 각각 독립적으로 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기이고, Xa- 는 카운터 이온을 나타내고, a 는 그 카운터 이온의 가수를 나타낸다.
R2 및 R3 은 각각 독립적으로 수소 원자, 메틸기, 에틸기 또는 벤질기인 것이 바람직하고, 수소 원자 또는 메틸기인 것이 특히 바람직하다.
카운터 이온 Xa- 에는 특별히 한정은 없지만, 입수의 용이함이나 반응의 제어성 등의 관점에서, 염소 이온, 카르복실산 이온, 술폰산 이온, 또는 알킬술페이트 이온인 것이 바람직하고, 염소 이온, 또는 에틸술페이트 이온인 것이 특히 바람직하다.
양쪽성 공중합체의 제조시에 있어서는, 제조 비용 등의 관점에서는, 카운터 이온을 갖는 디알릴아민 모노머를 사용하는 것이 바람직하다. 중합체로부터 카운터 이온을 제거하는 프로세스는 번잡하여, 비용 증대의 원인이 되기도 하는 점에서, 그와 같은 프로세스를 필요로 하지 않고 제조 가능한, 카운터 이온형의 구성 단위 (1-2) 를 갖는 양쪽성 공중합체를 사용하는 것은, 비용 등의 관점에서도 바람직한 실시형태이다.
구성 단위 (1-3)
구성 단위 (1-3) 은, 하기 일반식 (I-e) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 21]
Figure pct00021
식 중, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 12 의 알킬기, 탄소수 7 ∼ 12 의 아르알킬기, 또는 탄소수 5 ∼ 6 의 시클로알킬기를 나타낸다.
R4 및 R5 로서 바람직한 탄소수 1 ∼ 12 의 알킬기 또는 아르알킬기는, 직사슬형, 분지형 중 어느 것이어도 된다. 그 예로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, 헥실기, 옥틸기, 데실기, 도데실기, 벤질기 등을 들 수 있다. 또, R4 및 R5 로서 바람직한 탄소수 5 ∼ 6 의 시클로알킬기로는, 시클로펜틸기 및 시클로헥실기를 들 수 있지만, 이것들에 한정되지는 않는다.
R4 및 R5 은 각각 독립적으로 수소 원자, 메틸기, 에틸기 또는 벤질기인 것이 바람직하고, 수소 원자 또는 메틸기인 것이 특히 바람직하다.
구성 단위 (1-3) 이 일반식 (I-e) 로 나타내는 구조의 산 부가염인 경우의 부가염의 종류에는 특별히 제한은 없지만, 입수성이나 반응의 제어의 용이함 등의 관점에서, 예를 들어 염산염, 황산염, 인산염, 질산염, 아황산염, 아인산염, 아질산염, 브롬화수소산염, 아세트산염, 아미드황산염, 메탄술폰산염, 트리플루오로아세트산염, p-톨루엔술폰산염 등을 사용할 수 있다.
그 중에서도, 염산염, 황산염, 인산염, 및 아미드황산염이 바람직하고, 모노알릴아민으로부터 유도되는 구조의 염산염, 황산염, 인산염, 및 아미드황산염이 특히 바람직하다.
구성 단위 (1-4)
구성 단위 (1-4) 는, 하기 일반식 (I-f) 로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 22]
Figure pct00022
식 중 R6 은 수소 원자 또는 메틸기, R7 및 R8 은 각각 독립적으로 수소 원자, 또는 탄소수 1 ∼ 4 의 알킬기를 나타내고, n 은 2 ∼ 4 의 정수이다.
R6 은, 메틸기인 것이 바람직하고, n 은 2 ∼ 3 인 것이 바람직하고, R7 및 R8 은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸기인 것이 바람직하다.
구성 단위 (1-4) 가 일반식 (I-f) 로 나타내는 구조의 산 부가염인 경우의 부가염의 종류에는 특별히 제한은 없지만, 입수성이나 반응의 제어의 용이함 등의 관점에서, 예를 들어 염산염, 황산염, 인산염, 질산염, 아황산염, 아인산염, 아질산염, 브롬화수소산염, 아세트산염, 아미드황산염, 메탄술폰산염, 트리플루오로아세트산염, p-톨루엔술폰산염 등을 사용할 수 있다.
그 중에서도, 염산염, 황산염, 인산염 및 아미드황산염이 바람직하고, 모노알릴아민으로부터 유도되는 구조의 염산염, 황산염, 인산염 및 아미드황산염이 특히 바람직하다.
양쪽성 공중합체의 전체 구성 단위에서 차지하는 카티온성 구성 단위 (1) 의 비율은, 통상 10 ∼ 70 몰％ 이고, 바람직하게는 15 ∼ 60 몰％ 이고, 특히 바람직하게는 20 ∼ 55 몰％ 이다. 2 종류 이상의 카티온성 구성 단위 (1) 을 포함하는 경우의 상기 비율은, 당해 2 종류 이상의 카티온성 구성 단위 (1) 의 합계량에 기초하여 정의된다.
아니온성 구성 단위 (2)
본 발명에 있어서 사용되는 양쪽성 공중합체를 구성하는 아니온성 구성 단위 (2) 는, 그 구조 중에 아니온성의 관능기를 갖는 구성 단위이다.
아니온성 구성 단위 (2) 에는, 그 구조 중에 아니온성의 관능기를 포함하는 구성 단위인 것 이외의 제한은 부과되지 않고, 따라서 구조 중에 아니온성의 관능기를 포함하는 구성 단위라는 조건을 만족하는 한, 각종 구조의 구성 단위를 아니온성 구성 단위 (2) 로서 채용할 수 있다.
아니온성 구성 단위 (2) 로서 특히 바람직한 구성 단위로서, 하기의 구성 단위 (2-1), 구성 단위 (2-2), 구성 단위 (2-3) 및 구성 단위 (2-4) 를 들 수 있다. 그 중에서도 구성 단위 (2-1) 이, 아니온성 구성 단위 (2) 로서 특히 바람직하다.
특정의 양쪽성 공중합체는, 아니온성 구성 단위 (2) 1 종류만을 포유하고 있어도 되고, 2 종류 이상의 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하고 있어도 된다. 2 종류 이상의 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하는 경우의 당해 2 종류 이상의 아니온성 구성 단위 (2) 는, 함께 구성 단위 (2-1) 로 분류되는 구성 단위의 조합, 함께 구성 단위 (2-2) 로 분류되는 구성 단위의 조합, 함께 구성 단위 (2-3) 으로 분류되는 구성 단위의 조합, 또는 함께 구성 단위 (2-4) 로 분류되는 구성 단위의 조합이어도 되고, 구성 단위 (2-1) 에서 (2-4) 중 서로 상이한 것으로 분류되는 구성 단위끼리의 조합이어도 된다. 구성 단위 (2-1) 에서 (2-4) 중 어느 것에도 해당하지 않는 아니온성 구성 단위를 조합하여 사용해도 된다.
구성 단위 (2-1)
구성 단위 (2-1) 은, 하기 일반식 (II-a) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위이다.
아니온성 구성 단위 (2) 의 전부 또는 일부로서 구성 단위 (2-1) 을 사용함으로써, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭의 저해 효과를 보다 증강시킬 수 있다.
[화학식 23]
Figure pct00023
식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 를 나타낸다.
R9 는 수소인 것이 바람직하고, Y 는 수소 또는 Na 인 것이 바람직하다. 구성 단위 (2-1) 은, 말레산으로부터 유도되는 것인 것이 특히 바람직하다.
구성 단위 (2-2)
구성 단위 (2-2) 는, 하기 일반식 (II-b) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 24]
Figure pct00024
식 중 Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 를 나타낸다.
Y 는 수소 또는 Na 인 것이 바람직하다.
구성 단위 (2-3)
구성 단위 (2-3) 은, 하기 일반식 (II-c) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 25]
Figure pct00025
식 중 Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, 또는 1/3Fe 이다.
Y 는 수소 또는 Na 인 것이 바람직하다.
구성 단위 (2-4)
구성 단위 (2-4) 는, 하기 일반식 (II-d) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위이다.
[화학식 26]
Figure pct00026
식 중 R10 은, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 이다. R10 은 수소인 것이 바람직하고, Y 는 수소 또는 Na 인 것이 바람직하다.
구성 단위 (2-4) 는, (메트)아크릴산으로부터 유도되는 것인 것이 바람직하고, 아크릴산으로부터 유도되는 것인 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용하는 양쪽성 공중합체는, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하기 때문에, 카티온성 및 아니온성을 갖는 양쪽성 공중합체가 된다.
상기 특정한 구조를 갖는 카티온성 구성 단위 (1), 및 아니온성 구성 단위 (2) 를 포함하고, 카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2) 의 몰비가 상기 특정한 범위 내에 있는 양쪽성 공중합체를 사용함으로써, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭의 저해 효과를 증강시키는 등의 본 발명의 현저한 효과가 실현되는 메커니즘은 반드시 분명하지는 않지만, 특정한 구조를 갖는 카티온성 구성 단위 (1) 은, 그 강력한 포지티브 차지에 의해, 클램프 핵산과 DNA 의 결합을 안정화시키지만, 그 반면, 지나치게 강력한 포지티브 차지는, DNA 의 이중 가닥 형성이나 단일 가닥으로의 변성을 저해하는 경우가 있다. 이와 같은 특정한 구조를 갖는 카티온성 구성 단위 (1) 에 대하여, 아니온 차지를 구비하는 구성 단위 (2) 가 특정한 몰비로 존재함으로써, 카티온성 구성 단위 (1) 이 구비하는 포지티브 차지를 적당히 조정하여, DNA 의 이중 가닥 형성이나 단일 가닥으로의 변성을 저해하는 것을 억제하고, 클램프 핵산과 DNA 의 결합을 안정화시키는 기능을 발현시키는 것으로 추정된다.
상기 서술한 바와 같이, 양쪽성 공중합체에 있어서, 카티온성 구성 단위 (1) 이 구성 단위 (1-1) 인 것이 바람직하고, 아니온성 구성 단위 (2) 가 구성 단위 (2-1) 인 것이 바람직하기 때문에, 카티온성 구성 단위 (1) 로서 구성 단위 (1-1) 을 갖고, 아니온성 구성 단위 (2) 로서 구성 단위 (2-1) 을 갖는 양쪽성 공중합체를, 시료 중에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 구비하는 대상 염기 서열의 함유율이 낮은 경우라도, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭의 저해 효과를 충분히 증강 가능한 점에서 특히 바람직하게 사용할 수 있다.
그 이외의 구성 단위 (3)
양쪽성 공중합체는, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 에 추가하여, 그 이외의 구성 단위를 가지고 있어도 된다.
그 이외의 구성 단위로는, 후술하는 논이온성 구성 단위 (3-1) 이나, 카티온성 구성 단위 (1) 에는 해당하지 않는 구조를 갖는, 즉 아미노기를 갖지 않는, 카티온성의 구성 단위 (3-2) 를 들 수 있다.
카티온성 구성 단위 (1) 과 아니온성 구성 단위 (2) 의 거리를 조정한다는 관점에서, 양쪽성 공중합체는 논이온성 구성 단위 (3-1) 을 또한 포함하는 것이 바람직하다.
논이온성 구성 단위 (3-1)
본 실시형태에 있어서의 논이온성 구성 단위 (3-1) 은, 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 와 공중합 가능한 비이온성의 단량체로부터 유도되는 구성 단위이면 되고, 특별히 그것 이외의 제한은 없지만, 메타크릴산에스테르계 단량체, 아크릴산에스테르계 단량체, 메타크릴아미드계 단량체, 아크릴아미드계 단량체, 이산화황 등으로부터 유도되는 구성 단위를 바람직하게 사용할 수 있다. 보다 구체적인 예로는, 메타크릴산메틸, 메타크릴산에틸, 메타크릴산부틸, 아크릴산메틸, 아크릴산에틸, 아크릴산부틸, 메타크릴아미드, N-메틸메타크릴아미드, 디메틸메타크릴아미드, N-(3-디메틸아미노프로필)메타크릴아미드, 아크릴아미드, 디메틸아크릴아미드, 하이드록시에틸아크릴아미드, 디메틸아미노프로필아크릴아미드, 디메틸아미노프로필아크릴아미드염화메틸4급염, 아크릴로일모르폴린, 이소프로필아크릴아미드, 4-t-부틸시클로헥실아크릴레이트, 또는 이산화황으로부터 유도되는 구성 단위를 들 수 있다. 아크릴아미드 또는 메타크릴아미드로부터 유도되는 구성 단위를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
논이온성 구성 단위 (3-1) 은, 통상, 단량체로서 비이온성의 단량체를 사용함으로써, 양쪽성 공중합체 중에 도입할 수 있다.
양쪽성 공중합체가 논이온성 구성 단위 (3-1) 을 갖는 경우의 논이온성 구성 단위 (3-1) 의 함유량에는 특별히 제한은 없고, 또 논이온성 구성 단위 (3-1) 의 종류에 따라서도 그 바람직한 양은 상이하지만, 아니온성 구성 단위 (2) 와의 몰비가, 논이온성 구성 단위 (3-1)/아니온성 구성 단위 (2) = 0.1/1 ∼ 1/1 인 것이 바람직하고, 0.2/1 ∼ 0.8/1 인 것이 보다 바람직하고, 0.3/1 ∼ 0.7/1 인 것이 더욱 바람직하고, 0.4/1 ∼ 0.6/1 인 것이 특히 바람직하다.
논이온성 구성 단위 (3-1) 이 메타크릴산에스테르계 단량체, 아크릴산에스테르계 단량체, 메타크릴아미드계 단량체, 또는 아크릴아미드계 단량체로부터 유도되는 경우에는, 상기 비율은 0.1/1 ∼ 1/1 인 것이 바람직하고, 0.2/1 ∼ 0.8/1 인 것이 보다 바람직하고, 0.3/1 ∼ 0.7/1 인 것이 더욱 바람직하고, 0.4/1 ∼ 0.6/1 인 것이 특히 바람직하다.
논이온성 구성 단위 (3-1) 이 이산화황으로부터 유도되는 경우에는, 상기 비율은 0.1/1 ∼ 1/1 인 것이 바람직하고, 0.2/1 ∼ 1/1 인 것이 특히 바람직하다.
양쪽성 공중합체는, 카티온성 구성 단위 (1) 과 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖는 것으로, 따라서 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 만으로 구성되어 있어도 되며, 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 에 추가하여, 그 이외의 구성 단위를 가지고 있어도 된다. 그 이외의 구성 단위로는, 후술하는 논이온성 구성 단위 (3-1) 이나, 상기 서술한 바와 같이 특정한 구조를 갖는 카티온성 구성 단위 (1) 에는 해당하지 않는 구조의 카티온성 구성 단위 (3-2) 를 들 수 있다.
카티온성 구성 단위 (1) 과 아니온성 구성 단위 (2) 의 합계가 양쪽성 공중합체의 전체 구성 단위에서 차지하는 비율에는 특별히 제한은 없지만, 통상 67 몰％ 이상이고, 바람직하게는 75 ∼ 100 몰％ 이고, 보다 바람직하게는 80 ∼ 100 몰％ 이고, 특히 바람직하게는 90 ∼ 100 몰％ 이다.
양쪽성 공중합체에 있어서의 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 는, 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있다.
양쪽성 공중합체에 있어서의 카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2) 의 몰비가 0.13 이상임으로써, 카티온성 구성 단위 (1) 이 구비하는 클램프 핵산과 DNA 의 결합을 안정화시키는 기능이 손상되지 않고, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭의 저해 효과를 증강시킬 수 있다.
양쪽성 공중합체에 있어서의 카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2) 의 몰비는, 0.20 이상인 것이 바람직하고, 0.25 이상인 것이 보다 바람직하고, 0.37 이상인 것이 더욱 바람직하고, 0.45 이상인 것이 특히 바람직하고, 0.50 이상인 것이 가장 바람직하다.
양쪽성 공중합체에 있어서의 카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2) 의 몰비가 1.62 이하임으로써, 카티온성 구성 단위 (1) 에 의한 DNA 의 이중 가닥 형성이나 단일 가닥으로의 변성 저해가 억제되어, 클램프 핵산과 DNA 의 결합을 안정화시키는 기능을 발현시킬 수 있다.
양쪽성 공중합체에 있어서의 카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2) 의 몰비는, 1.30 이하인 것이 바람직하고, 1.25 이하인 것이 보다 바람직하고, 1.13 이하인 것이 더욱 바람직하고, 1.05 이하인 것이 특히 바람직하고, 1.00 이하인 것이 가장 바람직하다.
양쪽성 공중합체에 있어서의 카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2) 의 몰비는, 0.25 ∼ 1.25 의 범위에 있는 것이 바람직하고, 0.50 ∼ 1.00 의 범위에 있는 것이 특히 바람직하다.
양쪽성 공중합체에 있어서의, 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 의 몰비는, 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 의 구조가 이미 알려진 경우, 양쪽성 공중합체를 이소프로필알코올 또는 아세톤 등의 유기 용매로 재침하고, 재침물에 대해, Perkin Elmer 2400II CHNS/O 전자동 원소 분석 장치 또는 동등한 성능의 장치를 사용하여, 상기 구성 단위의 구조에 따른 적절한 모드로 분석함으로써 특정할 수 있다. 또한, 측정은, 캐리어 가스로서 헬륨 가스를 사용하고, 주석 캡슐에 고체 시료를 칭량하여, 연소관 내에 낙하하고 순산소 가스 중에서 연소 온도 1800 ℃ 이상에서 시료를 연소시켜, 분리 칼럼 및 열전도 검출기에 의한 프론탈 크로마토그래피 방식으로 각 측정 성분을 검출하고, 교정 계수를 사용하여 각 원소의 함유율을 정량함으로써 실시할 수 있다. 또, 양쪽성 공중합체에 있어서의 카티온성 구성 단위 (1) 및 아니온성 구성 단위 (2) 의 구조를 알고 있지 않은 경우, 상기 원소 분석 장치에 의한 측정 전에, 1H-NMR 또는 13C-NMR 을 사용한 공지된 방법에 의해, 각각의 구성 단위의 구조를 특정한다. 또한, 양쪽성 공중합체의 제조 (공중합) 에 있어서 공급한 각 단량체의 양, 및 양쪽성 공중합체에 도입되지 않고 잔류한 각 단량체의 양으로부터 계산할 수도 있다. 또한, 양쪽성 공중합체에 있어서의 각 단량체로부터 유도되는 구성 단위의 비율 (몰비) 은, 각 구성 단위의 투입 조성 (몰비) 과 거의 일치하기 때문에, 본 명세서에서는 편의적으로 모노머의 배합비를 구성 단위의 비율 (몰비) 로서 취급하는 경우가 있다.
양쪽성 공중합체에 있어서의, 카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2) 의 몰비는, 양쪽성 공중합체의 제조 (공중합) 에 있어서 공급한 각 단량체, 특히 카티온성 구성 단위 (1) 을 유도하는 단량체 및 아니온성 구성 단위 (2) 를 유도하는 단량체의 종류 및 양, 제조 (공중합) 의 조건, 예를 들면 촉매의 종류나 양, 공중합 온도나 시간 등을 선택, 조정함으로써, 적절히 조정할 수 있다.
양쪽성 공중합체의 제조 방법
양쪽성 공중합체의 제조 방법에는 특별히 제한은 없고, 종래 당해 기술 분야에 있어서 공지된 방법으로 제조할 수 있지만, 예를 들어 카티온성 구성 단위 (1) 에 대응하는 구조의 카티온성 단량체, 및 아니온성 구성 단위 (2) 에 대응하는 구조의 아니온성 단량체, 그리고 원하는 바에 따라서 논이온성 구성 단위 (3) 에 대응하는 구조의 논이온성 단량체 등의 그 이외의 단량체를 공중합함으로써 제조할 수 있다.
카티온성 구성 단위 (1) 에 대응하는 구조의 카티온성 단량체, 아니온성 구성 단위 (2) 에 대응하는 구조의 아니온성 단량체 등을 공중합하는 경우의 용매는 특별히 한정되지 않고, 수계 용매여도 되고, 알코올, 에테르, 술폭사이드, 아미드 등의 유기계 용매여도 되지만, 수계 용매인 것이 바람직하다.
카티온성 구성 단위 (1) 에 대응하는 구조의 카티온성 단량체, 아니온성 구성 단위 (2) 에 대응하는 구조의 아니온성 단량체 등을 공중합하는 경우의 단량체 농도는 단량체의 종류에 따라, 또 공중합을 실시하는 용매의 종류에 따라 상이하지만, 수계 용매의 경우 통상 10 ∼ 75 질량％ 이다. 이 공중합 반응은, 통상, 라디칼 중합 반응이며, 라디칼 중합 촉매의 존재하에 실시된다. 라디칼 중합 촉매의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니고, 그 바람직한 예로서, t-부틸하이드로퍼옥사이드 등의 과산화물, 과황산암모늄, 과황산나트륨, 과황산칼륨 등의 과황산염, 아조비스계, 디아조계 등의 수용성 아조 화합물을 들 수 있다.
라디칼 중합 촉매의 첨가량은, 일반적으로는 전체 단량체에 대해 0.1 ∼ 20 몰％, 바람직하게는 1.0 ∼ 10 몰％ 이다. 중합 온도는 일반적으로는 0 ∼ 100 ℃, 바람직하게는 5 ∼ 80 ℃ 이고, 중합 시간은 일반적으로는 1 ∼ 150 시간, 바람직하게는 5 ∼ 100 시간이다. 중합 분위기는, 대기 중에서도 중합성에 큰 문제를 일으키지 않지만, 질소 등의 불활성 가스의 분위기에서 실시할 수도 있다.
핵산 증폭 반응
본 실시형태에 의한 방법에서는, 클램프 핵산과 양쪽성 공중합체를 사용하여, 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시한다.
핵산 증폭법으로는 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 리얼타임 PCR 법, 디지털 PCR 법, 전통적인 PCR 법, RT-PCR 법 등의 PCR 법, LAMP 법, ICAN 법, NASBA 법, LCR 법, SDA 법, TRC 법, TMA 법을 들 수 있다. 핵산 증폭법은, 수법의 범용성·간편성의 관점에서 PCR 법이 바람직하고, 핵산 증폭물의 정량이 용이한 점에서, 리얼타임 PCR 법이 보다 바람직하다.
핵산 증폭용 반응액의 조성은, 사용하는 핵산 증폭법에 따라 다소 상이하지만, 통상은, 상기 서술한 클램프 핵산 및 양쪽성 공중합체에 추가하여, 프라이머 세트와, 기질로서의 데옥시뉴클레오시드 삼인산 (예를 들면, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP : 이하 일괄하여 dNTP 라고 부른다) 과, 핵산 합성 효소 (예를 들면, DNA 폴리메라아제) 를 버퍼 중에 포함하고, 경우에 따라서는, 핵산 합성 효소의 보조 인자로서 마그네슘 이온 (예를 들면, 반응액 중 1 ∼ 6 mM 의 농도로 포함한다) 을 포함해도 된다.
또한, 리얼타임 PCR 법 등의 핵산 증폭과 증폭된 핵산의 검출을 동시에 실시하는 핵산 증폭법을 사용하는 경우에는, 인터칼레이터, 형광 표지 프로브, 사이클링 프로브 등의 적당한 검출용 시약도 핵산 증폭용 반응액 중에 포함한다.
프라이머 세트는, 대상 염기 서열을 포함하는 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭 가능하면 되고, 통상, 증폭 대상으로 하는 영역에 인접하는 소정의 영역에 하이브리다이즈되도록 설계되지만, 프라이머의 서열 중에 대상 염기 서열의 일부에 하이브리다이즈되는 서열을 포함하고 있어도 된다.
프라이머는, DNA, RNA 등의 핵산에 의해 구성할 수 있다. 프라이머의 농도는, 통상, 반응액 중 20 nM ∼ 2 μM 의 범위에서 적절한 농도를 선택하면 된다. 프라이머의 길이는, 통상 5 ∼ 40 mer 이고, 바람직하게는 12 ∼ 35 mer 이고, 보다 바람직하게는 14 ∼ 30 mer 이고, 더욱 바람직하게는 15 ∼ 25 mer 이다. 프라이머 사이의 거리, 즉 증폭 대상으로 하는 영역은 통상 50 ∼ 5000 염기이고, 바람직하게는 100 ∼ 2000 염기이다. 프라이머의 설계는 매뉴얼로 실시해도 되고, 적당한 프라이머 디자인용의 소프트웨어를 사용해도 된다. 이러한 소프트로는, 예를 들면, Primer3 소프트웨어 (http://frodo.wi.mit.edu) 등을 들 수 있다.
dNTP 의 농도는, 통상 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP 의 반응액 중의 각각의 농도가 100 ∼ 400 μM 의 범위가 되는 농도에서 선택하면 된다. 핵산 합성 효소로는, 예를 들면, DNA 폴리메라아제, RNA 폴리메라아제, 역전사 효소 등을 들 수 있고, 사용하는 핵산 증폭법에 따라서, 적합한 성질의 효소를 사용하면 된다. 예를 들면, PCR 법이면, TaqDNA 폴리메라아제, PfuDNA 폴리메라아제, 기타 바이오사이언스 관련의 각사에 의해 개발된 각종 내열성 DNA 폴리메라아제가 바람직하게 사용된다.
버퍼는, 사용하는 DNA 폴리메라아제의 최적 pH 및 최적 염 농도를 갖는 것을 선택하는 것이 바람직하다. 핵산 증폭법에 따라서는, 추가로 리보뉴클레아제 H (RNaseH) 나 역전사 효소 (RT) 등을 포함하고 있어도 된다. 또한, 각 핵산 증폭법에 대해서 다양한 키트가 시판되고 있으므로, 핵산 증폭용 반응액은, 그러한 시판 키트에 첨부된 것을 사용해도 된다.
핵산 증폭 반응의 주형이 되는 핵산, 즉 「시료 중의 핵산」의 반응액 중의 농도는, 통상 반응액 100 μl 당 0.3 ng ∼ 3 μg 으로 하면 되지만, 주형이 되는 핵산의 양이 지나치게 많으면 비특이적 증폭의 빈도가 증가하기 때문에, 반응액 100 μl 당 0.5 μg 이하로 억제하는 것이 바람직하다.
반응액 중의 클램프 핵산의 양으로는, 시료 중의 표준 염기 서열을 갖는 핵산 (예를 들어, 야생형 핵산) 의 양에 대한 변이를 갖는 것으로 상정되는 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 양에 따라서, 대상 염기 서열이 변이를 갖는 경우에, 표준 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭이 충분히 저해되고, 변이를 갖는 대상 염기 서열을 포함하는 핵산이 우선적으로 증폭되는 양을 선택하는 것이 바람직하다. 시료 중에서는 통상, 변이형 핵산에 대하여 야생형 핵산이 대다수이기 때문에, 10 nM ∼ 1 μM 으로 하는 것이 바람직하고, 20 nM ∼ 500 nM 이 보다 바람직하고, 50 nM ∼ 200 nM 이 특히 바람직하다.
반응액 중의 양쪽성 공중합체의 농도는, 핵산 증폭 반응에 악영향을 미치지 않고, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭 반응의 선택적 저해 효과를 증강할 수 있도록 적절한 농도를 선택하는 것이 바람직하다. 반응액 중의 양쪽성 공중합체의 농도는, 중합체의 종류에 따라서도 상이하지만, 통상 0.001 ∼ 0.500 질량％ 로 하면 되고, 바람직하게는 0.010 ∼ 0.300 질량％ 이고, 보다 바람직하게는 0.020 ∼ 0.150 질량％ 이고, 특히 바람직하게는 0.025 ∼ 0.100 질량％ 이다.
상기 서술한 클램프 핵산과 양쪽성 공중합체를 사용하여, 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하면, 클램프 핵산은 표준 염기 서열을 갖는 핵산에 강하게 결합하여, 증폭 반응 동안의 프라이머의 어닐링 및/또는 프라이머의 신장을 저해하고, 공존하는 양쪽성 공중합체는 이 저해 효과를 증강시킨다. 한편, 클램프 핵산의 결합력은 표준 염기 서열에 대하여 변이를 갖는 염기 서열에 대해서는 대폭 저하되기 때문에, 어닐링 및 프라이머의 신장은 거의 저해되지 않고 통상적인 핵산 증폭 반응을 일으킨다. 또한, 양쪽성 공중합체는, 그 자체로는 핵산 증폭 반응을 저해하지 않는다. 이 결과, 본 실시형태의 방법에 의하면, 시료 중의 핵산 중, 변이를 갖는 핵산이 미량 (예를 들면, 0.1 ％ 이하 또는 0.05 ％ 이하, 특히 0.02 ％ 이하인 경우) 이고, 표준 염기 서열을 갖는 핵산이 지배적인 경우라도, 표준 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭이 선택적으로 저해되고, 변이를 갖는 핵산이 우선적으로 증폭되기 때문에, 극히 미량으로 포함되는 변이를 갖는 핵산의 검출이 가능해진다.
본 실시형태의 방법에 있어서는, 상기 서술한 핵산 증폭 반응의 특성을 이용하여 변이의 존재를 검출한다. 즉, 표준 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭이 선택적으로 저해되는 한편, 대상 염기 서열이 표준 염기 서열에 대하여 변이를 갖는 경우에는, 대상 염기 서열을 포함하는 영역이 우선적으로 증폭되어, 그 결과, 변이의 유무에 의해, 핵산 증폭 반응의 진행 속도, 반응 산물의 양 등에 차이를 일으키기 때문에, 이것들을 변이의 검출에 이용한다.
본 실시형태에 있어서, 변이의 검출은, 증폭 반응의 최종 산물에 대하여 검출을 실시하는 방법과, 증폭 반응 중에 경시적으로 증폭을 확인하는 방법이 있고, 예를 들면, 얻어진 핵산 증폭 산물의 총량, 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수, 상기 핵산 증폭 산물 중의 상기 변이를 갖는 핵산의 양, 또는 상기 핵산 증폭 산물 중의 상기 변이를 갖는 핵산량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수에 기초하여, 변이를 검출할 수 있다. 특히, 실시의 간편함이나 적응 범위가 넓다는 점에서, 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수에 기초하여 변이를 검출하는 방법이 바람직하다.
또한, 다이렉트 시퀀스법 등에 의해 증폭 산물의 염기 서열을 확인함으로써, 정확하고 또한 고감도의 검출이 가능하다. 단, 후술하는 실시예에서 실증하는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하면, 시퀀스 결정에 상관없이, 정확하고 또한 고감도로 변이의 검출이 가능하다.
핵산 증폭 산물의 총량에 기초하여 변이를 검출하는 방법으로는, 예를 들어, 증폭 반응 후의 용액을 페놀·클로로포름 (1 : 1) 용액으로 제(除)단백 처리 후, 수층을 직접, 또는 에탄올 침전 후에, 적당한 정제 키트를 사용하여 정제하고, 정제 용액의 파장 260 nm 의 흡광도를, 흡광 광도계를 사용하여 측정하는 방법 ; 증폭 산물을 전기 영동에 의해 아가로오스겔, 또는 폴리아크릴아미드겔로 전개한 후, 적당한 프로브를 사용하여 서던 하이브리다이제이션법에 의해 검출하는 방법 ; 금 나노 입자를 사용한 크로마토 하이브리다이제이션법에 의해 검출하는 방법 ; 증폭시킨 핵산에 의한 용액의 탁도를 측정하는 방법 ; 증폭 프라이머의 5' 말단을 미리 형광 표지해 두고, 증폭 반응 후에 아가로오스겔, 또는 폴리아크릴아미드겔로 전기 영동 후, 이미징 플레이트에 형광 발광을 도입하고, 적당한 검출 장치를 사용하여 검출하는 방법 등을 들 수 있다.
핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수에 기초하여 변이를 검출하는 방법으로는, 인터칼레이터법, TaqManTM 프로브법, 사이클링 프로브법 등의 리얼타임 PCR 법을 들 수 있다. 또한, 상기 임계값은, 리얼타임 PCR 장치 (예를 들면, Step One Plus 리얼타임 PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific 사 제조)) 에 의해, 자동 검출하는 것이 가능하다.
인터칼레이터법은, 인터칼레이터성 형광 색소 (인터칼레이터라고 하는 경우도 있다) 를 사용하는 방법이다. 인터칼레이터는, 이중 가닥 핵산의 염기쌍 사이에 특이적으로 결합하여 형광을 발하는 시약으로, 여기광을 조사하면 형광을 발한다. 인터칼레이터에서 유래하는 형광 강도의 검출에 기초하여, 프라이머 신장 산물의 양을 알 수 있다. 본 실시형태에 있어서는, 이 형광 강도를 리얼타임으로 모니터링함으로써, 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수를 알 수 있다. 본 실시형태에 있어서는, 통상 이 분야에서 사용되는 임의의 인터칼레이터를 사용할 수 있고, 예를 들어, SYBRTM Green I (Molecular Probe 사), 에티듐브로마이드, 플루오렌 등을 들 수 있다.
TaqManTM 프로브법은, 일방의 말단 (통상, 5' 말단) 을 형광기 (리포터) 로, 타방의 말단 (통상, 3' 말단) 을 소광기로 표지한, 대상 핵산의 특정 영역에 하이브리다이즈되는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 리얼타임 PCR 법에 의해, 목적으로 하는 미량의 핵산을 고감도이면서 정량적으로 검출할 수 있는 방법이다. 그 프로브는, 통상적인 상태에서는 소광기에 의해 리포터의 형광이 저해되고 있다. 이 형광 프로브를 검출 영역에 완전히 하이브리다이즈시킨 상태에서, 그 외측으로부터 DNA 폴리메라아제를 사용하여 PCR 을 실시한다. DNA 폴리메라아제에 의한 신장 반응이 진행되면, 그 엑소뉴클레아제 활성에 의해 형광 프로브가 가수분해되고, 리포터 색소가 유리되어, 형광을 발한다. 본 실시형태에 있어서는, 이 형광 강도를 리얼타임으로 모니터링함으로써, 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수를 알 수 있다.
사이클링 프로브법은, RNA 와 DNA 로 이루어지는 키메라 프로브와 RNase H 의 조합에 의한 고감도의 검출 방법이다. 그 프로브는, RNA 부분을 사이에 두고 일방이 형광 물질 (리포터) 이고, 다른 일방이 형광을 소광하는 물질 (??처) 로 표지되어 있다. 이 프로브는, 인택트한 상태에서는 ??칭에 의해 형광을 발하지 않지만, 서열이 상보적인 증폭 산물과 하이브리드를 형성한 후에 RNase H 에 의해 RNA 부분이 절단되면, 강한 형광을 발하게 된다. 본 실시형태에 있어서는, 이 형광 강도를 측정함으로써 핵산 증폭 산물의 총량을 알 수 있어, 형광 강도를 리얼타임으로 모니터링함으로써, 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수를 알 수 있다.
이 방법은, 사이클링 프로브의 RNA 부근에 미스매치가 존재하면, RNase H 에 의한 절단이 일어나지 않기 때문에, 1 염기의 차이도 인식할 수 있는 매우 특이성이 높은 검출이 가능하다. 사이클링 프로브에 대해서도, 적당한 업자에게 설계·합성을 위탁하거나 하여 취득할 수 있다.
핵산 증폭 산물 중의 염기 변이를 갖는 핵산량에 기초하여 변이를 검출하는 방법으로는, 생어 시퀀싱법, 융해 곡선 분석법 등을 들 수 있다.
핵산 증폭 산물 중의 염기 변이를 갖는 핵산량이 임계값에 도달할 때까지의 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수에 기초하여 변이를 검출하는 방법으로는, 염기 변이를 갖는 핵산에 특이적으로 결합하는 프로브를 사용하여, 상기 리얼타임 PCR 법을 적용하는 것을 들 수 있다.
2. 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하기 위한 키트
본 발명은, 다른 실시형태에 있어서, 상기 서술한 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 본 실시형태에 의한 키트는,
표준 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 핵산을 포함하는, 클램프 핵산과,
구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체와,
경우에 따라, 대상 염기 서열을 포함하는 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭 가능한 프라이머 세트와,
경우에 따라, 핵산 증폭 반응을 실시하기 위한 그 밖의 시약을 포함한다.
클램프 핵산, 양쪽성 공중합체, 및 프라이머 세트의 상세는, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법에서 설명한 바와 같고, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다.
핵산 증폭 반응을 실시하기 위한 그 밖의 시약으로는, 뉴클레오시드 삼인산, 핵산 합성 효소, 및 증폭 반응용 완충액을 들 수 있다. 뉴클레오시드 삼인산은, 핵산 합성 효소에 따른 기질 (dNTP, rNTP 등) 을 포함할 수 있다. 핵산 합성 효소는, 키트가 대상으로 하는 핵산 증폭법에 따른 효소이며, DNA 폴리메라아제, RNA 폴리메라아제, 역전사 효소 등을 들 수 있다. 증폭 반응용의 완충액으로는, 예를 들면, 트리스 완충액, 인산 완충액, 베로날 완충액, 붕산 완충액, 굿 완충액 등, 통상의 핵산 증폭 반응이나 하이브리다이제이션 반응을 실시하는 경우에 사용되는 완충액을 들 수 있으며, 그 pH 도 특별히 한정되지 않지만, 통상 5 ∼ 9 의 범위가 바람직하다.
본 실시형태에 의한 키트는 또한, 상기 서술한 핵산 증폭 반응 산물을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리얼타임 PCR 을 위해서 사용되는, 인터칼레이터, 형광 표지 프로브, 사이클링 프로브 등을 들 수 있다.
또한, 안정화제, 방부제 등의, 핵산 증폭 반응 시약에서 일반적으로 사용되는 다른 성분도 포함할 수 있다.
또한, 프라이머 세트 및 핵산 증폭 반응을 실시하기 위한 그 밖의 시약은, 핵산 증폭 반응을 실시하기 위해 필요하지만, 키트 중에 포함되지 않는 경우도 있다. 또한, 핵산 증폭 반응 산물을 검출하기 위한 시약이나, 안정화제, 방부제 등의 다른 성분은 핵산 증폭 반응에 있어서 임의 성분으로, 키트 중에 포함되지 않는 경우도 있다.
3. 핵산 증폭 반응에 있어서, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 방법
본 발명은, 또 다른 실시형태에 있어서, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 방법을 제공한다. 이 방법에서는,
대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 핵산을 포함하는, 클램프 핵산과,
구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체를 사용하여 상기 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시한다.
이 실시형태에 있어서의 방법에서는, 「시료」는 증폭 저해 대상이 되는 핵산을 포함할 수 있다고 상정되는 시료이고, 「대상 염기 서열」은 증폭 저해의 대상이 되는 염기 서열이고, 「시료 중의 핵산」은 증폭 저해의 대상이 되는 염기 서열을 포함할 수 있는 핵산이다. 단, 이들 용어는, 「시료 중의 핵산」이, 실제로 증폭 저해의 대상이 되는 염기 서열을 포함하는 것까지 의미하지는 않는다.
또한, 이 실시형태에 있어서의 「클램프 핵산」은, 「대상 염기 서열」에 상보적인 염기 서열을 갖고, 이와 같은 「클램프 핵산」의 존재에 의해, 당해 「대상 염기 서열」을 갖는 핵산의 증폭이 저해된다.
본 실시형태에 있어서는, 핵산 증폭 반응에 있어서, 상기 특정한 양쪽성 공중합체가 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 클램프 핵산과 공존함으로써, 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 클램프 핵산에 의한 효과가 증강되어, 시료 중에 당해 대상 염기 서열을 갖는 핵산이 대량으로 존재하는 경우에도 당해 핵산의 증폭을 선택적으로 저해할 수 있다.
시료, 및 시료 중의 핵산의 그 밖의 점은, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법에서 서술한 바와 같으며, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다. 또한, 클램프 핵산 및 양쪽성 공중합체의 상세도, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법에서 서술한 바와 같고, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다. 또한, 핵산 증폭 반응의 실시 및 핵산 증폭 반응을 실시하기 위한 시약의 상세도, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법 및 키트에서 서술한 바와 같고, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법 및 키트와 동일하다. 다만, 본 실시형태의 방법에서는, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭 저해를 검출하는 것은 필수는 아니며, 이와 같은 검출을 위해서 필요한 공정 및 시약은, 필요에 따라 실시 혹은 사용한다.
4. 핵산 증폭 반응에 있어서, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하기 위한 키트
본 발명은 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 서술한, 핵산 증폭 반응에서 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 본 실시형태에 의한 키트는,
대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,
구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체와,
경우에 따라, 대상 염기 서열을 포함하는 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭 가능한 프라이머 세트와,
경우에 따라, 핵산 증폭 반응을 실시하기 위한 그 밖의 시약을 포함한다.
본 실시형태에 있어서의 「시료」, 「대상 염기 서열」, 「시료 중의 핵산」 및 「클램프 핵산」이라는 용어의 의의는, 핵산 증폭 반응에 있어서 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 방법에서 서술한 것과 동일하다.
또, 시료, 및 시료 중의 핵산의 그 밖의 점은, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법에서 서술한 바와 같으며, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다. 또한, 클램프 핵산 및 양쪽성 공중합체의 상세도, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법에서 서술한 바와 같고, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다. 또한, 핵산 증폭 반응의 실시 및 핵산 증폭 반응을 실시하기 위한 시약의 상세도, 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법 및 키트에서 서술한 바와 같고, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다.
5. 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭 저해를 증강하는 핵산 증폭 저해 증강제
본 발명은, 또 다른 실시형태에 있어서, 핵산 증폭 반응에 있어서, 클램프 핵산에 의한 그것에 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭 저해 효과를 증강하는 핵산 증폭 저해 증강제를 제공한다.
이 증강제는, 구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체를 포함한다.
이 증강제를 사용하여 실시하는 「핵산 증폭」은, 「상기 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산」을 사용하여 실시되는 것이고, 본 실시형태에 있어서의 「시료」, 「대상 염기 서열」, 「시료 중의 핵산」 및 「클램프 핵산」이라는 용어의 의의는, 핵산 증폭 반응에 있어서, 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 저해하는 방법에서 서술한 것과 동일하다.
또한, 본 실시형태에 의한 「클램프 핵산에 의해 저해하는 효과의 증강제」는, 상기 양쪽성 공중합체를 포함하는데, 이것도 대상 염기 서열 중의 변이를 검출하는 방법에서 서술한 바와 같으며, 바람직한 실시형태 및 구체예도 당해 방법과 동일하다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
1. 폴리머 첨가에 의한 PCR 반응에 대한 영향
본 발명의 방법에 사용 가능한 특정한 양쪽성 공중합체 (실시품) 또는 비교품의 폴리머 혹은 모노머를 PCR 반응액 중에 첨가하여, PCR 반응에 대한 영향을 확인하였다.
1-1. 사용한 폴리머 수용액
이하의 표에 나타내는 폴리머 또는 모노머를 물에 용해하여, pH 7.0, 10 질량％ 의 수용액을 조제하였다. 또한, 표 중, 제품명은 모두 닛토보 메디컬 주식회사의 제품명이고, 중합체 1 ∼ 18 의 중합 조건은 이하와 같다.
중합체 1 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 500 mL 의 4 구 플라스크에 66.78 질량％ 디알릴아민염산염 160.07 g (0.80 몰), 무수 말레산 78.45 g (0.80 몰), 증류수 91.86 g 을 투입하고, 내온을 50 ℃ 로 승온하였다. 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을, 당해 수용액 중의 과황산암모늄량이 모노머 전체량에 대해 0.5 질량％ 가 되는 양만큼 첨가하여 중합을 개시하였다. 4 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.5 질량％ 가 되는 양, 20, 26 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 1.0 질량％ 가 되는 양, 45, 51 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 1.5 질량％ 가 되는 양의 상기 과황산암모늄 수용액을 첨가하고, 68 시간 반응시켰다.
중합체 2 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 20 L 의 4 구 플라스크에 무수 말레산 1.86 kg (19.0 몰) 과 증류수 0.34 kg 을 투입하고, 디알릴메틸아민 2.11 kg (19.0 몰) 을 냉각하에 적하하였다. 그 후, 내온을 50 ℃ 로 승온하였다. 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.5 질량％ 가 되는 양만큼 첨가하여 중합을 개시시켰다. 3, 21, 25 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 1.0 질량％ 가 되는 양의 상기 과황산암모늄 수용액을 첨가하고, 추가로 하룻밤 반응시켰다.
중합체 3 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 3 L 의 4 구 플라스크에 증류수 842.93 g, 무수 말레산 488.34 g (4.98 몰) 을 투입하였다. 그 후, 냉각하면서 알릴아민 342.60 g (6.00 몰) 을 적하하고, 65 ℃ 로 승온하였다. 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 1 몰％ 가 되는 양만큼 첨가하여 중합을 개시시켰다. 3 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 1 몰％, 24, 28 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 2 몰％ 가 되는 양의 상기 과황산암모늄 수용액을 첨가하고 추가로 하룻밤 반응시켰다.
중합체 4 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염 (고형분 농도 51.2 질량％) 을 16.15 g (0.04 몰 상당), 아크릴아미드 (고형분 농도 97 질량％) 를 2.93 g (0.04 몰 상당), 아크릴산 (고형분 농도 99 질량％) 을 5.82 g (0.08 몰 상당), 증류수를 143.86 g 투입하고, 60 ℃ 로 승온하였다. 2 시간마다 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 각각 0.25, 0.5, 0.5, 0.75 몰％ 가 되는 양의, 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 첨가하고, 하룻밤 반응을 계속하였다.
중합체 5 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염 (고형분 농도 51.2 질량％) 을 20.17 g (0.05 몰 상당), 아크릴아미드 (고형분 농도 97 질량％) 를 3.66 g (0.05 몰 상당), 메타크릴산 (고형분 농도 99 질량％) 을 8.69 g (0.10 몰 상당), 증류수를 192.43 g 투입하고, 60 ℃ 로 승온하였다. 2 시간마다 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 각각 0.25, 0.5, 0.5, 0.75 몰％ 가 되는 양의, 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 첨가하고, 하룻밤 반응을 계속하였다.
중합체 6 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에, 디알릴아민염산염 (고형분 농도 65.40 질량％) 을 20.43 g (0.1 몰 상당), 증류수를 110.9 g 투입하고, 65 ℃ 로 승온하였다. 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 2.0 몰％ 가 되는 양의 28.5 질량％ 의 과황산암모늄을 첨가한 후, 30 분 경과하고 나서 아크릴아미드 (고형분 농도 97 질량％) 를 7.11 g (0.1 몰 상당), 아크릴산 (고형분 농도 99 질량％) 을 14.56 g (0.2 몰 상당), 증류수를 21.15 g 혼합한 용액을 3 시간에 걸쳐 적하하고, 하룻밤 반응을 계속하였다.
중합체 7 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에, 디알릴아민 (농도 100 질량％) 을 29.15 g (0.30 몰 상당), 푸마르산 (농도 100 질량％) 을 27.86 g (0.24 몰 상당), 증류수를 227.45 g 투입하고, 50 ℃ 로 승온하였다. 차아인산나트륨 (농도 100 질량％) 을 0.57 g (0.0054 몰 상당) 첨가하고, 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 10 질량％ 로 되는 양만큼 8 분할하여 첨가하고, 50 ℃ 에서 중합을 실시하였다.
중합체 8 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에 51.2 ％ N-디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염 16.15 g (0.04 몰), 97.0 ％ 아크릴아미드 5.86 g (0.08 몰), 99.0 ％ 아크릴산 5.82 g (0.08 몰), 증류수 169.36 g 을 투입하고, 내온을 60 ℃ 로 승온하였다. 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.25 몰％ 가 되는 양을 첨가하여 중합을 개시하였다. 2, 4 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.5 몰％ 가 되는 양, 6 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.75 몰％ 가 되는 양의 상기 과황산암모늄 수용액을 첨가하여 24 시간 반응시켰다.
중합체 9 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에 51.2 ％ N-디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염 14.13 g (0.035 몰), 97.0 ％ 아크릴아미드 2.56 g (0.035 몰), 99.0 ％ 아크릴산 10.19 g (0.140 몰), 증류수 171.23 g 을 투입하고, 내온을 60 ℃ 로 승온하였다. 28.5 질량％ 과황산암모늄 수용액을 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.25 몰％ 가 되는 양만큼 첨가하여 중합을 개시하였다. 2, 4 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.5 몰％ 가 되는 양, 6 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.75 몰％ 가 되는 양의 상기 과황산암모늄 수용액을 첨가하여 24 시간 반응시켰다.
중합체 10 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염 (고형분 농도 51.2 질량％) 을 18.17 g (0.05 몰 상당), 증류수를 74.86 g 투입하고, 60 ℃ 로 승온하였다. 1 시간마다 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 각각 0.25, 0.5, 0.5, 0.75 몰％ 가 되는 양만큼 첨가하고, 60 ℃ 에서 하룻밤 반응을 계속하였다.
중합체 11 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에, 증류수를 189.16 g (단량체 농도 10 질량％ 가 되는 양) 투입하고, 60 ℃ 로 승온하였다. 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 3.0 질량％ 가 되는 양만큼 첨가 후, 40 질량％ 의 아크릴산 수용액 63.06 g 을 3 시간에 걸쳐 적하하고, 60 ℃ 에서 하룻밤 반응을 계속하였다.
중합체 12 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 1 L 의 4 구 플라스크에 57.22 질량％ 의 알릴아민염산염 10.63 g (0.065 몰) 과 65.22 질량％ 의 디알릴아민염산염 253.02 g (1.235 몰) 과 증류수 31.35 g 을 투입하고, 60 ℃ 로 승온하였다. 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.25 질량％ 가 되는 양만큼 첨가하여 중합을 개시시켰다. 3, 5, 21 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.25 질량％ 가 되는 양, 23, 25, 27, 29 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.50 질량％ 가 되는 양의 상기 과황산암모늄 수용액을 첨가하고, 추가로 하룻밤 반응시켰다.
중합체 13 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에 65.0 ％ 디알릴디메틸암모늄클로라이드 124.37 g (0.50 몰), 아크릴아미드 4.44 g (0.06 몰), 차아인산나트륨 0.85 g, 증류수 84.39 g 을 투입하고, 내온을 50 ℃ 로 승온하였다. 28.5 질량％ 과황산암모늄 수용액을 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.2 질량％ 가 되는 양만큼 첨가하여 중합을 개시하였다. 4 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.3 질량％ 가 되는 양, 23 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 0.5 질량％ 가 되는 양, 28 시간 후에 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 1.0 질량％ 가 되는 양의 상기 과황산암모늄 수용액을 첨가하고 48 시간 반응시켰다.
중합체 14 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 1 L 의 4 구 플라스크에 58.01 질량％ 의 알릴아민염산염 209.67 g (1.3 몰) 과 63.61 질량％ 의 디메틸알릴아민염산염 248.51 g (1.3 몰) 을 투입하고, 60 ℃ 로 승온하였다. 개시제 V-50 (2,2'-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)이염산염) 을 모노머 전체량에 대하여 V-50 이 12 몰％ 가 되는 양만큼 3 분할하여 첨가하고, 72 시간 중합을 실시하였다. 그 후, 48 시간 60 ℃ 에서 가열 분해 처리하였다. 그 후, 30 ℃ 이하의 냉각하에서 농도 25 질량％ 의 수산화나트륨을 449.28 g (2.81 몰) 첨가하고, 40 ℃ 에서 24 시간 반응시켰다. 그 후, 이배퍼레이터에 의한 탈모노머 (50 ℃, 3 시간) 를 실시하였다. 탈모노머 후, 농도 15 ％ 로 조정하여 전기 투석에 의한 탈염 (약 3 시간, 전도도가 완전히 내려간 다음 1 시간 후에 종료) 을 실시하였다.
중합체 15 : 교반기, 온도계, 유리 마개를 구비한 100 ml 의 3 구 플라스크에 증류수 25.95 g 과 디알릴메틸아민염산염 수용액 0.088 몰과 아크릴아미드를 0.011 몰 투입하고, 55 ℃ 로 승온하였다. 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 4.0 몰％ 가 되는 양만큼 7 분할하여 첨가하고, 55 ℃ 에서 중합을 실시하였다.
중합체 16 : 교반기, 온도계, 유리 마개를 구비한 100 ml 의 3 구 플라스크에 증류수 24.71 g 과 디알릴메틸아민염산염 수용액 0.06 몰과 N-이소프로필아크릴아미드를 0.06 몰 투입하고, 55 ℃ 로 승온하였다. 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 3.25 몰％ 가 되는 양만큼 7 분할하여 첨가하고, 55 ℃ 에서 중합을 실시하였다.
중합체 17 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염 (고형분 농도 51.2 질량％) 을 32.30 g (0.08 몰 상당), 아크릴아미드 (고형분 농도 97 질량％) 를 2.93 g (0.04 몰 상당), 아크릴산 (고형분 농도 99 질량％) 을 2.91 g (0.04 몰 상당), 증류수를 184.49 g 투입하고, 60 ℃ 로 승온하였다. 2 시간마다 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 각각 0.25, 0.5, 0.5, 0.75 몰％ 가 되는 양의, 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 첨가하고, 하룻밤 반응을 계속하였다.
중합체 18 : 온도계, 교반기, 냉각관을 구비한 300 mL 의 4 구 플라스크에, 디메틸아미노프로필메타크릴아미드염산염 (고형분 농도 51.2 질량％) 을 32.30 g (0.08 몰 상당), 아크릴아미드 (고형분 농도 97 질량％) 를 2.93 g (0.04 몰 상당), 메타크릴산 (고형분 농도 99 질량％) 을 3.44 g (0.04 몰 상당), 증류수를 189.55 g 투입하고, 60 ℃ 로 승온하였다. 2 시간마다 모노머 전체량에 대하여 과황산암모늄이 각각 0.25, 0.5, 0.5, 0.75 몰％ 가 되는 양의, 28.5 질량％ 의 과황산암모늄 수용액을 첨가하고, 하룻밤 반응을 계속하였다.
[표 1-1]
Figure pct00027
[표 1-2]
Figure pct00028
1-2. PCR 반응
하기의 표에 나타내는 조성의 PCR 반응액을 조제하였다.
[표 2]
Figure pct00029
1-3. 프라이머 및 주형 DNA
PCR 반응에서 사용한 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머의 서열은 하기 표에 나타낸 바와 같다.
[표 3]
Figure pct00030
각 프라이머는 KRAS 유전자 (염기 서열은, 예를 들어, NCBI (DB 명) 로 확인할 수 있다) 를 타깃으로 하여, Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu 에서 입수) 을 사용하여 설계하였다.
주형 DNA 로서, 이하의 염기 서열 (증폭 대상 서열) 을 포함하는, HCC70 세포로부터 추출한 게놈을 사용하였다.
[화학식 27]
Figure pct00031
또한, HCC70 세포 게놈 중, 상기 염기 서열을 포함하고, 이것에 인접하는 염기 서열은 이하와 같다.
[화학식 28]
Figure pct00032
1-4. 리얼타임 PCR 시스템
Step One Plus 리얼타임 PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하였다.
1-5. PCR 반응
조제한 PCR 반응 용액 20 μL 를 리얼타임 PCR 시스템에 세팅하고, 하기 표에 기재된 스텝 (i) 을 실시한 후, 스텝 (ii) ∼ (iv) 를 40 사이클 반복하였다.
[표 4]
Figure pct00033
40 사이클 종료 후, 스텝 (v) ∼ (vii) 을 실시하고, 반응을 종료하였다. 사이클마다 반응액의 형광 강도를 측정함으로써, DNA 증폭량을 모니터하였다. 또한, 반응의 종료 후, 형광 강도가 Threshold Line 에 도달하고 있는지 여부로, PCR 반응의 저해의 유무를 판정하였다. Threshold Line 은, 상기 장치에 의해 자동 산출하였다. 일부, 실험에 의해 어쩔 수 없이 통상보다 낮게 설정되어 버리는 경우에는, 다른 실험과 동렬로 비교하기 위해, 수동으로 ΔRn 값 0.7 ∼ 1.2 의 사이로 설정하였다.
1-5. 결과
PCR 반응의 성부 (成否) 를 하기 표에 나타낸다.
[표 5-1]
Figure pct00034
[표 5-2]
Figure pct00035
또한, PCR 반응을 저해하지 않는 경우의 핵산 증폭 곡선의 예 (실시예 2 의 디알릴메틸아민·말레산 1 : 1 의 공중합체) 와 저해하는 경우의 핵산 증폭 곡선의 예 (비교예 7 의 디알릴디메틸암모늄클로라이드·아크릴아미드 8 : 1 의 공중합체) 를 각각 도 1 에 나타낸다.
상기한 바와 같이, 구조 중에 아민을 함유하는 카티온성 구성 단위와, 아니온성 구성 단위를 갖고, 카티온성 구성 단위/아니온성 구성 단위가 0.25 ∼ 1.25 의 범위에 있는 양쪽성 공중합체인, 실시예 1 ∼ 9 의 중합체를 첨가한 경우, 또는 비교예 13 또는 14 의 모노머를 첨가한 경우에는, PCR 반응을 저해하지 않았다.
2. BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과의 폴리머에 의한 증강
시험 1 에서 PCR 반응을 저해하지 않는 것을 확인한 실시예 1 ∼ 9 의 폴리머 그리고 비교예 13 및 14 의 모노머를, BNA clamp PCR 에 있어서의 야생형 KRAS 유전자의 증폭 저해 효과의 증강에 대해 평가하였다.
2-1. 사용한 폴리머 또는 모노머
실시예 1 ∼ 9 의 폴리머 그리고 비교예 13 및 14 의 모노머를 사용하였다. 각 폴리머 또는 모노머를 뉴클레아제 프리의 물에 용해하고, pH 7.0 으로, 농도가 10 ％ 인 폴리머 또는 모노머의 수용액을 조제하여 사용하였다.
얻어진 10 ％ 농도의 폴리머 수용액 또는 모노머 수용액은, 각각, 시험 1 의 결과로부터 PCR 반응을 저해하지 않는 범위의 농도로 희석하였다. 하기 표에 본 시험에서 사용한 각 폴리머 또는 모노머의 수용액의 농도 및 반응액 중의 폴리머 또는 모노머의 농도를 나타낸다.
[표 6]
Figure pct00036
2-2. 사용한 키트
변이형 KRAS 유전자를 검출하기 위한 키트인, BNA Clamp KRAS Enrichment Kit (리켄 제네시스사) 의 부속물을 사용하였다. 상세한 것은 이하에 기재하지만, Primer set 및 BNA clamp 는, 키트 부속물을 사용하였다. 또, real-time PCR 의 반응 조건은 키트 프로토콜에 준거하였다.
2-3. 프라이머, BNA clamp 및 주형 DNA
이하의 표에 나타내는 포워드 프라이머, 리버스 프라이머 및 BNA clamp 를 사용하였다.
[표 7]
Figure pct00037
또한, 표준 염기 서열을 갖는 주형 DNA 로서, 이하의 염기 서열 (증폭 대상 서열 ; 후술하는 서열 번호 10 의 염기 서열과 상이한 염기를 밑줄 굵은 글씨로 나타내었다) 을 포함하는, 야생형 KRAS 유전자를 갖는 HCC70 세포의 게놈을 사용하였다.
[화학식 29]
Figure pct00038
또한, HCC70 세포 게놈 중, 상기 염기 서열과 그것에 인접하는 염기 서열은 이하와 같다 (후술하는 서열 번호 11 의 염기 서열과 상이한 염기를 밑줄 굵은 글씨로 나타내었다).
[화학식 30]
Figure pct00039
한편, 표준 염기 서열에 대한 변이를 갖는 주형 DNA 로서, 이하의 염기 서열 (증폭 대상 서열 ; 상기 서술한 서열 번호 8 의 염기 서열과 상이한 염기를 밑줄 굵은 글씨로 나타내었다) 을 포함하는, 변이형 KRAS 유전자를 갖는 MDA-MB-231 세포의 게놈을 사용하였다.
[화학식 31]
Figure pct00040
또, MDA-MB-231 세포 게놈 중, 상기 염기 서열 및 그것에 인접하는 염기 서열은 이하와 같다 (전술한 서열 번호 9 의 염기 서열과 상이한 염기를 밑줄 굵은 글씨로 나타내었다).
[화학식 32]
Figure pct00041
2-4. BNA clamp PCR 반응액
하기의 표에 나타내는 조성의 반응액 1 ∼ 4 를 조제하였다. 반응액 1 또는 반응액 2 에 있어서, 폴리머 또는 모노머의 농도는 0.025 질량％ 였다. 반응액 1 또는 반응액 2 에 있어서, 폴리머 또는 모노머의 농도는, 상기 표 6 에 나타내는 바와 같았다.
[표 8]
Figure pct00042
[표 9]
Figure pct00043
[표 10]
Figure pct00044
[표 11]
Figure pct00045
2-5. 리얼타임 PCR 시스템
Step One Plus 리얼타임 PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하였다.
2-6. PCR 반응
조제한 각 반응 용액 20 μL 를 PCR 용 튜브에 칭량하여 넣고, PCR 용 튜브를 리얼타임 PCR 시스템에 세팅하여, 하기 표에 기재된 스텝 (i) 을 실시한 후, 스텝 (ii) ∼ (iv) 를 50 사이클 반복하였다. 50 사이클 종료 후, 스텝 (v) ∼ (vii) 을 실시하고, 반응을 종료하였다. 사이클마다 반응액의 형광 강도를 측정함으로써, DNA 증폭량을 모니터하여, 각 반응액의 증식 곡선을 얻었다.
[표 12]
Figure pct00046
2-7. 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 ΔCt (WT) 및 ΔCt (Mutant) 의 산출, 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 ΔΔCt 의 산출, 그리고 ΔΔΔCt 의 산출
반응액 1 (폴리머 첨가, BNA clamp 첨가), 반응액 2 (폴리머 첨가, BNA clamp 무첨가), 반응액 3 (폴리머 무첨가, BNA clamp 첨가), 및 반응액 4 (폴리머 무첨가, BNA clamp 무첨가) 를, 주형 DNA 로서, 야생형 KRAS 유전자 또는 변이형 KRAS 유전자를 사용하여, 상기 PCR 반응을 실시하여 증폭 곡선을 얻고, 각 조건의 증폭 곡선으로부터, 설정한 Threshold Line 으로부터 각각의 Ct 값을 얻었다 (대부분의 실험 구분에 있어서, Threshold Line 은, 장치에 의해 자동 산출하여였다. 일부, 실험에 의해 어쩔 수 없이 통상보다 낮게 설정되어 버리는 경우에는, 다른 실험과 동렬로 비교하기 위해, 수동으로 ΔRn 값을 0.7 ∼ 1.2 의 사이로 설정하였다).
이어서, 이하의 식에 의해, 폴리머 무첨가의 경우의 ΔCt (WT) 및 ΔCt (Mutant) 를 산출하였다.
[수학식 1]
Figure pct00047
[수학식 2]
Figure pct00048
또한, 인터칼레이터법에 있어서의 비특이적인 증폭이 없는 것의 확인을 위해, 이하의 식에 의해 폴리머 무첨가의 경우의 ΔΔCt 를 산출하였다.
[수학식 3]
Figure pct00049
폴리머 무첨가의 경우의 ΔΔCt ＞ 0 의 경우, 인터칼레이터법에 있어서의 비특이적인 증폭이 없는 것이 이해된다.
다음으로, 이하의 식에 의해, 폴리머 첨가의 경우의 ΔCt (WT) 및 ΔCt (Mutant) 를 산출하고, 또한, 인터칼레이터법에 있어서의 비특이적인 증폭이 없는 것의 확인을 위해, 폴리머 첨가의 경우의 ΔΔCt 를 산출하였다.
[수학식 4]
Figure pct00050
[수학식 5]
Figure pct00051
[수학식 6]
Figure pct00052
폴리머 첨가의 경우의 ΔΔCt ＞ 0 의 경우, 인터칼레이터법에 있어서의 비특이적인 증폭이 없는 것이 이해된다.
마지막으로, BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과의 폴리머 첨가에 의한 증강을 평가하기 위한 지표로서, 하기 식에 의해 ΔΔΔCt 를 산출하였다.
[수학식 7]
Figure pct00053
시험상 일어날 수 있는 결과의 변동을 고려해도, 인터칼레이터법과 같은 야생형 유전자의 증폭 사이클수를 기준으로 한 변이 검출법을 사용한 경우에 있어서, ΔΔΔCt ≥ 1.00 이면, BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 충분히 증강하였다고 평가할 수 있다. 또한, 인터칼레이터법과 같은 야생형 유전자의 증폭 사이클수를 기준으로 한 변이 검출법을 사용한 경우에 있어서, ΔΔΔCt ≥ 3.20 이면, BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 현저히 증강하였다고 평가할 수 있다. 또한, ΔΔΔCt = 3.20 이, 감도가 약 10 배 향상되는 기준이 된다.
2-8. 결과
시험 결과를 이하에 정리하여 나타낸다.
[표 13]
Figure pct00054
상기의 시험 결과로부터, 실시예 1 ∼ 9 의 폴리머를 첨가하면, 변이형 유전자의 증폭은 저해하지 않고, BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 증강하는 것이 분명해졌다. 또한, 실시예 1, 2, 4 ∼ 9 의 폴리머 (카티온성 구성 단위가 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기를 갖는 양쪽성 공중합체) 는, 실시예 3 의 폴리머 (카티온성 구성 단위가 제 1 급 아미노기를 갖는 양쪽성 공중합체) 보다, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭의 저해 효과의 증강 효과가 큰 것이 분명해졌다. 이와 같이 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 증강하는 일례의 그래프를 도 2 에 나타낸다.
3. 폴리머 첨가에 의한 BNA clamp PCR 의 고감도화
상기 시험에서 BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 증강하는 효과가 확인된 실시예 1, 2, 4 및 6 의 폴리머를 사용하여, BNA clamp PCR 의 고감도화를 시도하였다.
3-1. 사용 폴리머
실시예 1, 2, 4 및 6 의 폴리머를 사용하였다. 각 폴리머 용액의 농도 및 PCR 반응액 중에 있어서의 최종 농도를 이하의 표에 나타낸다.
[표 14]
Figure pct00055
3-2. 사용한 키트
시험 2 와 동일한 키트의 부속물을 사용하였다.
3-3. 주형 DNA
표준 염기 서열을 갖는 주형 DNA 로서, 서열 번호 8 의 염기 서열을 포함하는, 야생형 KRAS 유전자를 갖는 HCC70 세포의 게놈을 사용하였다. 또한, 표준 염기 서열에 대한 변이를 갖는 주형 DNA 로서, 서열 번호 10 의 염기 서열을 포함하는, 변이형 KRAS 유전자를 갖는 MDA-MB-231 세포의 게놈을 사용하였다.
본 시험에서는, 주형 DNA 전체의 양이 2.0 μL 중에 50 ng 이 되도록 하면서, 전체 주형 DNA 중의 변이형 유전자의 주형 DNA 의 질량％ 가 이하의 표가 되도록, 야생형 유전자의 주형 DNA 와 변이형 유전자의 주형 DNA 를 혼합하고, 얻어진 각 주형 DNA 혼합물과, 야생형 유전자의 주형 DNA 를 PCR 반응에 사용하였다.
[표 15]
Figure pct00056
3-4. 프라이머 및 BNA clamp
시험 2 와 동일한 프라이머 및 BNA clamp 를 사용하였다.
3-5. BNA clamp PCR 반응액
하기의 표에 나타내는 조성의 반응액 1 및 2 를 조제하였다. 또한, 반응액 1 에 있어서, 폴리머의 농도는, 상기 표 14 에 나타내는 바와 같았다.
[표 16]
Figure pct00057
[표 17]
Figure pct00058
3-6. 리얼타임 PCR 시스템 및 PCR 반응
시험 2 와 동일한 리얼타임 PCR 시스템을 사용하여, 시험 2 와 동일한 조건으로 PCR 반응을 실시하였다.
3-7. 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 δCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 의 결정, 및 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 δδCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 의 산출
반응액 1 (폴리머 첨가, BNA clamp 첨가) 및 반응액 2 (폴리머 무첨가, BNA clamp 첨가) 를, 주형 DNA 또는 각 주형 DNA 혼합물을 사용하여, 상기 PCR 반응에 제공하여 증폭 곡선을 얻고, 각 조건의 증폭 곡선으로부터 시험 2 와 동일하게 하여 Ct (Mutant 10 ％ ∼ 0 ％) 를 결정하고, 이하의 표에 나타내는 바와 같이 Ct (Mutant 0 ％, WT) 로부터 각 변이형 유전자 템플릿 농도의 Ct (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 를 빼서, 각 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 δCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 를 산출하였다.
[표 18]
Figure pct00059
[표 19]
Figure pct00060
마지막으로, 각각, 폴리머 첨가의 경우의 δCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 로부터 폴리머 무첨가의 경우의 δCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 를 빼서, δδCt (Mutant 10 ％ ∼ 0.01 ％) 를 산출하였다.
인터칼레이터법과 같은 야생형 유전자의 증폭 사이클수를 기준으로 한 변이 검출법을 사용한 경우에 있어서, δδCt ＞ 0 의 경우, 폴리머를 첨가함으로써, 변이형 유전자가 특이적으로 검출되어, 변이형 유전자의 증폭 곡선이 야생형 유전자의 증폭 곡선으로부터 구별되고 있는 것을 의미한다 (참고문헌 : 특허문헌 11).
3-8. 결과
시험 결과를 이하의 표 및 도 3 에 정리하여 나타낸다. 또한, Mutant 비율 0.01 ％ 의 경우의 폴리머 무첨가시 δCt 는, -0.68 이었다.
[표 20]
Figure pct00061
본 시험의 결과, 폴리머 무첨가의 경우에서는, Mutant 비율이 0.01 ％ 이고, δCt 가 0 미만이 되어, 변이형 유전자의 증폭 곡선을 야생형 유전자의 증폭 곡선으로부터 구별할 수 없지만, 실시예 1, 2, 4 또는 6 의 폴리머를 첨가한 경우에서는, 0.01 ％ 의 Mutant 비율에서도 변이형 유전자의 증폭 곡선을 야생형 유전자의 증폭 곡선으로부터 구별할 수 있음이 분명해졌다. 또한, 특히 실시예 2 의 폴리머 (카티온성 구성 단위가 상기 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b) 로 나타내는 구조를 갖는 구성 단위이고, 아니온성 구성 단위가 상기 일반식 (II-a) 로 나타내는 구성 단위인 양쪽성 공중합체) 를 첨가한 경우에는, Mutant 비율이 0.1 ％ 이하인 조건에 있어서, 클램프 핵산에 의한 핵산 증폭의 저해 효과의 증강 효과가 특히 커지는 것이 분명해졌다. 또한, 본 실험에 있어서는, BNA clamp 무첨가 반응액에 대해서 시험하고 있지 않지만, 시험 2 의 결과로부터, BNA clamp 무첨가 반응액에 있어서도 폴리머 첨가의 유무에 상관없이, 비특이적인 증폭이 없는 것은 분명하다.
4. KRAS 이외의 변이형 유전자에 대한 적응 가능성 1 (BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과의 폴리머에 의한 증강)
4-1. 사용한 폴리머
시험 2 에서 사용한 폴리머 중, 실시예 1, 2, 4, 6 및 7 의 폴리머를 사용하였다. 각각의 폴리머 용액 농도 및 PCR 반응액 중에 있어서의 폴리머 농도는, 하기 표와 같이 하였다.
[표 21]
Figure pct00062
4-2. 사용한 키트
변이형 BRAF 유전자를 검출하기 위한 키트인, BNA Clamp BRAF Enrichment Kit (리켄 제네시스사) 의 부속물을 사용하였다. 상세한 것은 이하에 기재하지만, Primer set 및 BNA clamp 는, 키트 부속물을 사용하였다. 또, real-time PCR 의 반응 조건은 키트 프로토콜에 준거하였다.
4-3. 주형 DNA
표준 염기 서열을 갖는 주형 DNA 로서, 이하의 염기 서열 (후술하는 서열 번호 13 의 염기 서열과 상이한 염기를 밑줄 굵은 글씨로 나타내었다) 을 포함하는, 야생형 BRAF 유전자를 갖는 HCC70 세포의 게놈을 사용하였다.
[화학식 33]
Figure pct00063
또한, 상기 서열은, 증폭 대상 서열 이외의 염기 서열을 포함한다고 이해되는 점에 유의해야 한다.
한편, 표준 염기 서열에 대한 변이를 갖는 주형 DNA 로서, 이하의 염기 서열 (전술한 서열 번호 12 의 염기 서열과 상이한 염기를 밑줄 굵은 글씨로 나타내었다) 을 포함하는, 변이형 BRAF 유전자를 갖는 DU4475 세포의 게놈을 사용하였다.
[화학식 34]
Figure pct00064
또한, 상기 서열은, 증폭 대상 서열 이외의 염기 서열을 포함한다고 이해되는 점에 유의해야 한다.
4-4. BNA clamp PCR 반응액
하기의 표에 나타내는 조성의 반응액 1 ∼ 4 를 조제하였다. 또한, 반응액 1 또는 반응액 2 에 있어서, 폴리머의 농도는, 상기 표 21 에 나타내는 바와 같았다.
[표 22]
Figure pct00065
[표 23]
Figure pct00066
[표 24]
Figure pct00067
[표 25]
Figure pct00068
4-5. 리얼타임 PCR 시스템 및 PCR 반응
시험 2 와 동일한 시스템을 사용하고, 시험 2 와 동일하게 하여 PCR 반응을 실시하였다.
4-6. 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 ΔCt (WT) 및 ΔCt (Mutant) 의 산출, 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 ΔΔCt 의 산출, 그리고 ΔΔΔCt 의 산출
시험 2 와 동일하게 실시하였다.
4-7. 결과
시험 결과를 이하에 정리하여 나타낸다.
[표 26]
Figure pct00069
상기와 같이, 어느 폴리머도 KRAS 유전자와 마찬가지로 BNA clamp 에 의한 야생형 유전자의 선택적 증폭 저해 효과를 증강하였다. 증폭 저해 효과는, 모두 10 배 감도 상승의 기준인 ΔΔΔCt = 3.2 보다 큰 것을 알 수 있었다.
5. plasmid DNA 를 사용한 BNA clamp PCR 의 고감도화 확인과 PCR 산물의 시퀀스 해석
5-1. 사용한 폴리머
시험 3 과 동일한 폴리머 (실시예 1, 2, 4 및 6 의 폴리머) 를 사용하였다. 각 폴리머 용액의 농도 및 PCR 반응액 중에 있어서의 농도를 이하의 표에 나타낸다.
[표 27]
Figure pct00070
5-2. 사용한 키트
시험 2 와 동일한 키트의 부속물을 사용하였다.
5-3. 주형 DNA
주형 DNA 는, 도 4 에 나타내는 KRAS WT/Mutant plasmid DNA 를 사용하였다. 주형 DNA 에 있어서의 Mutant DNA 의 함유율 (Mutant 비율) 은 0.01 ％ 로 하였다. 또한, 도 4 중, KRAS WT plasmid DNA 의 경우, 삽입 서열은, 이하의 서열 번호 14 에 나타내는 서열이고, KRAS Mutant plasmid DNA 의 경우, 이하의 서열 번호 15 에 나타내는 서열이었다. 또한, 어느 서열에 있어서도, 마지막의 6 염기 (AAGCTT) 가 Hind III 의 인식 서열이다.
[화학식 35]
Figure pct00071
[화학식 36]
Figure pct00072
5-4. 프라이머 및 BNA clamp
시험 2 와 동일한 프라이머 및 BNA clamp 를 사용하였다.
5-5. BNA clamp PCR 반응액
하기의 표에 나타내는 조성의 반응액 1 및 2 를 조제하였다.
[표 28]
Figure pct00073
[표 29]
Figure pct00074
5-6. 리얼타임 PCR 시스템 및 PCR 반응
시험 2 와 동일한 리얼타임 PCR 시스템을 사용하여, 시험 2 와 동일한 조건으로 PCR 반응을 실시하였다.
5-7. 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 δCt (WT) 및 δCt (Mutant) 의 결정, 및 폴리머 첨가 또는 무첨가의 경우의 δδCt 의 산출
시험 3 와 동일하게 실시하였다.
5-8. PCR 산물의 시퀀스 해석
PCR 반응에서 얻어진 PCR 산물을 Fasmac 사에 위탁하여, 다이렉트 시퀀스법으로 서열 해석을 실시하였다 (도 6).
5-9. 결과
5-9-1. BNA clamp PCR 의 고감도화 검토
시험 결과를 이하의 표 및 도 5 에 나타낸다.
[표 30]
Figure pct00075
본 시험의 결과, 폴리머 무첨가의 경우에서는, Mutant 비율 0.01 ％ 에서, 변이형 유전자의 검출은 곤란하지만, 실시예 1, 2, 4 또는 6 의 폴리머를 첨가한 경우에는, Mutant 비율 0.01 ％ 에서도 변이형 유전자를 확실하게 검출할 수 있었다.
5-9-1. PCR 산물의 시퀀스 해석
도 6 에 나타내는 바와 같이, Mutant 비율 0.01 ％ 에 있어서는, 폴리머가 무첨가인 경우에도 변이는 검출 가능하지만, 파선의 테두리로 둘러싼 염기의 피크로부터 이해되는 바와 같이, 전체적으로, 폴리머를 첨가했을 때의 PCR 산물의 쪽이 유의하게 변이 함유량이 많이 보여, 폴리머 무첨가보다 명백하게 고감도화를 달성하고 있는 것으로 이해된다.
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Claims (27)

  1. 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하는 방법으로서,
    상기 표준 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,
    구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체를 사용하여, 상기 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하고,
    상기 핵산 증폭 반응에 의해 얻어진 핵산 증폭 산물의 총량, 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수, 상기 핵산 증폭 산물 중의 상기 변이를 갖는 핵산의 양, 또는 상기 핵산 증폭 산물 중의 상기 변이를 갖는 핵산의 양이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수에 기초하여, 상기 변이의 존재를 판정하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가, 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기를 갖는, 검출 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, 검출 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양쪽성 공중합체에 있어서, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
    Figure pct00076

    (식 중, R1 은, 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.)
    로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1) 이고,
    상기 아니온성 구성 단위 (2) 의 적어도 일부가 일반식 (II-a)
    Figure pct00077

    (식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 이다.) 로 나타내는 구성 단위 (2-1) 인, 검출 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, 검출 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 증폭을 리얼타임 PCR 로 실시하는, 검출 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 샘플이 게놈 DNA 인, 검출 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로, 상기 표준 염기 서열을 갖는 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하고,
    상기 시료 중의 핵산을 주형으로 사용한 경우의 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수가, 상기 표준 염기 서열을 갖는 핵산을 주형으로 사용한 경우의 상기 핵산 증폭 산물의 총량이 임계값에 도달할 때까지의 상기 핵산 증폭 반응의 증폭 사이클수와 비교하여 적었던 경우에, 상기 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 상기 변이가 존재한다고 판정하는, 검출 방법.
  9. 시료 중의 핵산의 대상 염기 서열에 있어서의 표준 염기 서열에 대한 변이를 검출하기 위한 키트로서,
    상기 표준 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,
    구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체를 포함하는 키트.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가, 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기를 갖는, 키트.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, 키트.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양쪽성 공중합체에 있어서, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
    Figure pct00078

    (식 중, R1 은, 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.)
    로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1) 이고,
    상기 아니온성 구성 단위 (2) 의 적어도 일부가 일반식 (II-a)
    Figure pct00079

    (식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 이다.)
    로 나타내는 구성 단위 (2-1) 인, 키트.
  13. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, 키트.
  14. 핵산 증폭 반응에 있어서, 소정의 대상 염기 서열을 갖는 시료 중의 핵산의 증폭을 억제하는 방법으로서,
    상기 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 핵산을 포함하는, 클램프 핵산과,
    구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체를 사용하여, 상기 시료 중의 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 실시하는, 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가, 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기를 갖는, 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, 방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양쪽성 공중합체에 있어서, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
    Figure pct00080

    (식 중, R1 은, 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.)
    로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1) 이고,
    상기 아니온성 구성 단위 (2) 의 적어도 일부가 일반식 (II-a)
    Figure pct00081

    (식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 이다.)
    로 나타내는 구성 단위 (2-1) 인, 방법.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, 방법.
  19. 핵산 증폭 반응에 있어서, 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 증폭을 억제하기 위한 키트로서,
    상기 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산과,
    구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체를 포함하는, 키트.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가, 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기를 갖는, 키트.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
    상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, 키트.
  22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양쪽성 공중합체에 있어서, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
    Figure pct00082

    (식 중, R1 은, 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.)
    로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1) 이고,
    상기 아니온성 구성 단위 (2) 의 적어도 일부가 일반식 (II-a)
    Figure pct00083

    (식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 이다.)
    로 나타내는 구성 단위 (2-1) 인, 키트.
  23. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비천연형 뉴클레오티드가 BNA 인, 키트.
  24. 대상 염기 서열을 갖는 핵산의 핵산 증폭을, 상기 대상 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖고, 적어도 1 잔기의 비천연형 뉴클레오티드를 포함하는, 클램프 핵산에 의해 저해하는 효과의 증강제로서,
    구조 중에 아미노기를 함유하는 카티온성 구성 단위 (1) 과, 아니온성 구성 단위 (2) 를 갖고, 상기 아니온성 구성 단위 (2) 에 대한 카티온성 구성 단위 (1) 의 몰비 (카티온성 구성 단위 (1)/아니온성 구성 단위 (2)) 가 0.13 ∼ 1.62 의 범위에 있는, 양쪽성 공중합체를 포함하는, 증강제.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가, 제 2 급 아미노기 또는 제 3 급 아미노기를 갖는, 증강제.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,
    상기 양쪽성 공중합체가, 추가로 논이온성 구성 단위 (3) 을 포함하는, 증강제.
  27. 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양쪽성 공중합체에 있어서, 상기 카티온성 구성 단위 (1) 의 적어도 일부가 일반식 (I-a) 혹은 일반식 (I-b)
    Figure pct00084

    (식 중, R1 은, 수소 원자, 수산기를 가지고 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬기, 탄소수 5 ∼ 10 의 시클로알킬기, 또는 탄소수 7 ∼ 10 의 아르알킬기를 나타낸다.)
    로 나타내는 구조, 또는 그 산 부가염인 구조를 갖는 구성 단위 (1-1) 이고,
    상기 아니온성 구성 단위 (2) 의 적어도 일부가 일반식 (II-a)
    Figure pct00085

    (식 중 R9 는, 수소 또는 메틸기, Y 는 결합하는 카르복시기마다 각각 독립적으로 수소, Na, K, NH4, 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al 또는 1/3Fe 이다.)
    로 나타내는 구성 단위 (2-1) 인, 증강제.
KR1020247019353A 2021-12-10 2022-12-01 핵산의 대상 염기 서열 중에 있어서의 변이를 검출하기 위한 방법, 핵산의 증폭을 선택적으로 저해하는 방법, 및 이것들을 실시하기 위한 키트 KR20240099469A (ko)

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