CN112980932B

CN112980932B - 一种检测基因突变的核苷酸及其组合物和方法

Info

Publication number: CN112980932B
Application number: CN201911302950.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡统聪; 钟淑瑶; 卢庆庆; 林钰琼
Original assignee: Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Current assignee: Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2039-12-17
Also published as: CN112980932A

Abstract

本发明公开了一种检测基因突变的核苷酸及其组合物和方法，涉及突变扩增技术领域，具体地，该核苷酸组合物包括第一和第二核酸分子，第一核酸分子被设计成与ARMS引物中的突变型AS引物竞争靶序列的序列，第二核酸分子与第一核酸分子互补，该核苷酸组合物能够降低基因突变检测过程中野生型DNA的干扰，降低扩增时的背景信号，显著提高检测的特异性和灵敏度。

Description

一种检测基因突变的核苷酸及其组合物和方法

技术领域

本发明涉及等位基因扩增技术领域，具体而言，涉及一种检测基因突变的核苷酸及其组合物和方法。

背景技术

EGFR基因的常见突变位点发生在18、19、20和21号外显子上，其中，19号外显子的非移码缺失突变约占45％，21号外显子的L858R点突变占40-45％，这两种突变为常见突变。此外，EGFR基因有药物敏感突变和耐药突变，药物敏感突变为突变后对某种靶向药物敏感；耐药突变为突变后对某种靶向药物耐药，如T790 M(2369C>T)突变，且该突变占50％左右的突变频率。

在接受1st line EGFR-TKI治疗后，有近50～60％的患者会继发获得性耐药T790M，目前三代TKI Osermertinib克服了T790M，但随之而来的是更为错综复杂的C797S(2389T>A、2390G>C)。

EGFR基因T790M和C797S的检测在临床上具有意义，随着三代TKI药物的应用，以及T790M和C797S突变患者临床应用的进一步探索，可能会列入EGFR靶向药伴随诊断的标准。

目前，用于检测靶向用药基因检测的技术主要为NGS和数字PCR技术。NGS检测技术成本较高，周期较长，且对于循环肿瘤DNA样本需要进行扩增富集后才能进行建库，扩增过程中也会引入碱基错配的情况；数字PCR虽然灵敏度较高，且无需标曲也能做到对样品的绝对定量，但数字PCR仪器需要使用对应的耗材，无法与现有荧光定量PCR平台进行匹配，增加了仪器采购的成本，增加了样品检测费用。

基因突变的检测技术还可采用ARMS技术(amplification refractory mutationsystem，突变扩增系统)，又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification，ASA)，是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。

ARMS的基本原理是，如果引物的3’端碱基与模板碱基不互补，利用Taq酶缺少3’～5’的外切酶校正活性，无法切除掉引物3’端错配的碱基，且碱基错配会导致引物无法正常延伸，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此，根据已知点突变设计PCR引物，其3’端碱基与突变的模板碱基互补，若PCR能够得到相应长度的PCR片段或者扩增曲线，则说明该样本中含有该突变的DNA序列，若无法得到相应长度的PCR片段或者扩增曲线，则说明该样本中未含有该突变序列，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。

然而，常规ARMS技术检测肿瘤DNA碱基突变，很大程度上是依赖碱基错配的类型，因为不同碱基错配类型的强度存在差异，即嘌呤与嘌呤为强错配、嘧啶与嘧啶为中错配，嘧啶与嘌呤，或嘌呤和嘌呤弱错配。碱基的突变类型与ARMS技术检测的灵敏度和准确性有关，若突变后的碱基与野生型碱基的互补链上的碱基错配类型为强错配，则检测灵敏度和准确性相对较高，若突变后的碱基与野生型碱基的互补链上的碱基错配类型为弱错配，则检测灵敏度低和特异性较低，其限制了ARMS技术在不同突变中的应用。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测基因突变的核苷酸及其组合物和方法。该核苷酸组合物能降低基因突变检测过程中野生型DNA的干扰，降低扩增时的背景信号，显著提高检测的特异性和灵敏度。

本发明是这样实现的：

本发明实施例提供一种核苷酸，其适用于与ARMS引物和第一核酸分子配合使用以检测基因突变；所述第一核酸分子被设计成与ARMS引物中的突变型AS引物竞争靶序列的序列，所述靶序列取自野生型目标基因序列上覆盖待测突变位点的区域，所述第一核酸分子与所述靶序列的互补区域覆盖所述待测突变位点，所述核苷酸包括第二核酸分子；所述第二核酸分子的全长或其部分与所述第一核酸分子的全长或其部分序列互补，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子的互补区域覆盖所述待测突变位点。

本发明实施例还提供了上述核苷酸在用于与ARMS引物和第一核酸分子配合使用以检测基因突变中的应用。

本发明实施例提供一种核苷酸组合物，其包括上述的核苷酸和所述第一核酸分子。

本发明实施例提供一种检测基因突变的试剂或试剂盒，其包括上述核苷酸或上述核苷酸组合物。

本发明实施例提供一种检测基因突变的方法，在检测目标基因突变的反应体系中加入上述核苷酸组合物。

本发明实施方案的有益效果：

本发明提供了一种核苷酸组合物，该核苷酸组合物包括第一和第二核酸分子，第一核酸分子被设计成与ARMS引物中的突变型AS引物竞争靶序列的序列，第二核酸分子与第一核酸分子互补，该核苷酸组合物能够降低基因突变检测过程中野生型DNA的干扰，降低扩增时的背景信号，显著提高检测的特异性和灵敏度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为试验例1中的试验组1的Ct值检测结果；

图2为试验例1中的试验组2的Ct值检测结果；

图3为试验例1中的试验组3的Ct值检测结果；

图4为试验例2中组1～组4的Ct值检测结果；

图5为试验例3中组1～组4的Ct值检测结果；

图6为试验例4中组1～组3的CT值检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供了一种核苷酸，其适用于与ARMS引物和第一核酸分子配合使用以检测基因突变；所述第一核酸分子被设计为与ARMS引物中的突变型AS引物竞争靶序列的序列，所述靶序列取自野生型目标基因序列上覆盖待测突变位点的区域，所述第一核酸分子与所述靶序列的互补区域覆盖所述待测突变位点，所述核苷酸包括第二核酸分子；所述第二核酸分子的全长或其部分与所述第一核酸分子的全长或其部分序列互补，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子的互补区域覆盖所述待测突变位点。

本说明书使用的“ARMS”为the amplification refractory mutation system，又称突变阻滞扩增系统。

ARMS引物中包括突变型等位基因特异性引物(Mutant allele specific Primer，简称突变型AS引物)，该引物3’端碱基与突变型模板上的突变碱基互补，而与野生型模板不互补，从而将野生型模板和突变型模板区分开。

上述“所述第一核酸分子被设计为与ARMS引物中的突变型AS引物竞争靶序列的序列”是指：突变型AS引物能与靶序列(含突变待测位点)互补配对，第一核酸分子也能与靶序列互补配对，两者为竞争关系，即在含有特异性引物与靶序列的混合体系中，加入第一核酸分子，会减少突变型AS引物与靶序列的结合率。

在第一核酸分子与第二核酸分子的混合体系中，当第一核酸分子与野生型目标基因接触时，第一核酸分子可以与第二核酸分子分离，分离后，第一核酸分子与野生型目标基因进行碱基互补配对，以抑制引物对野生型目标基因的扩增；当第一核酸分子与突变型目标基因接触时，第一核酸分子可以与第二核酸分子进行互补配对，能避免或降低第一核酸分子与突变型目标基因的结合，从而避免或减少假阳性结果的出现。

在可选实施方式中，第一核酸分子的全长与靶序列互补。

在可选实施方式中，所述第一核酸分子的Tm值＞所述第二核酸分子的Tm值＞所述突变型AS引物的Tm值。

在上述Tm值的设置条件下，第一核酸分子与野生型目标基因的结合倾向＞第一核酸分子与第二核酸分子的结合倾向＞第一核酸分子与突变型目标基因的结合倾向。即遇到野生型目标基因时，第一核酸分子优先与野生型目标基因进行碱基互补配对；当遇到突变型目标基因时，第一核酸分子优先与第二核酸分子进行互补配对，从而避免或显著降低第一核酸分子与突变型目标基因的结合。

在可选实施方式中，所述第一核酸分子的Tm值比所述第二核酸分子的Tm值高1～15℃。具体地，第一核酸分子的Tm值可以比所述第二核酸分子的Tm值高1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃。

在可选实施方式中，所述第一核酸分子的Tm值比所述第二核酸分子的Tm值高1～13℃。具体地，所述第一核酸分子的Tm值可以比所述第二核酸分子的Tm值高1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃或13℃。

在可选实施方式中，所述第二核酸分子的长度小于所述第一核酸分子的长度。

在可选实施方式中，所述第二核酸分子为13～25nt。

在可选实施方式中，所述第二核酸分子修饰有延伸阻断物；

在可选实施方式中，所述延伸阻断物修饰于所述第二核酸分子的3’端；

在可选实施方式中，所述延伸阻断物包括：胺(NH₂)、生物素、ddNTPs、PEG和PO₄中的一种或多种。

在可选实施方式中，所述第二核酸分子含有修饰基团，所述修饰基团为锁核酸、肽核酸和小沟结合物中的至少一种。而修饰基团能够提高核酸分子的Tm值，增强其与互补序列结合的稳定性，同时有利于缩短核酸分子的长度。需要说明的是，在其他实施方式中，第二核酸分子也可以省略修饰基团。

在可选实施方式中，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子的互补区域覆盖第一核酸分子序列的5’端的1～8碱基中的至少一个。

需要说明的是，“互补区域覆盖第一核酸分子序列的5’端的1～8碱基中的至少一个”是指第二核酸分子与第一核酸分子的互补区域更靠近第一核酸分子序列的5’端，在该条件下，第二核酸分子对第一核酸分子的封闭效果更好，并且阻碍等位基因特异性扩增引物与野生型序列的互补，提高检测结果的特异性。

在可选实施方式中，所述第一核酸分子与所述靶序列的互补区域包括有5’端互补区，所述5’端互补区覆盖所述第一核酸分子序列的5’端的1～8个碱基中的至少一个，所述待测突变位点位于所述5’端互补区。

上述“5’端互补区覆盖所述第一核酸分子序列的5’端的1～8个碱基中的至少一个”是指5’端互补区更靠近第一核酸分子序列的5’端，即第一核酸分子上对应上述待测突变位点的位置更靠近第一核酸分子序列的5’端。

在可选实施方式中，所述基因突变包括以下任一突变方式：一个或几个核苷酸的替换、一个或几个核苷酸的缺失和一个或几个核苷酸的插入。

在可选实施方式中，所述目标基因包括EGFR基因。

在可选实施方式中，所述待测突变位点为2369C>T或2390G>C。

在可选实施方式中，当待测突变位点为2369C>T时，所述第二核酸分子的序列如SEQ ID No.2、11或12所示。

在可选实施方式中，当待测突变位点为2390G>C时，所述第二核酸分子的序列如SEQ ID No.4所示。

在该应用中，核苷酸、第一核酸分子与ARMS引物如前述实施方式所述，在此不再赘述。

本发明实施例还提供了一种核苷酸组合物，其包括有前述实施方式所述的核苷酸和第一核酸分子，在此不再赘述。

在可选实施方式中，所述第一核酸分子与所述第一核酸分子分别以单链形式存在；或，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子相结合以双链形式存在。

在可选实施方式中，所述第一核酸分子修饰有延伸阻断物。

在可选实施方式中，所述延伸阻断物修饰于所述第一核酸分子的3’端。

在可选实施方式中，所述第一核酸分子连接有修饰基团，所述修饰基团为锁核酸、肽核酸和小沟结合物中的至少一种。

在可选实施方式中，所述第一核酸分子为15～35nt。

在可选实施方式中，当所述待测突变位点为2369C>T时，所述第一核酸分子的序列如SEQ ID No.1、13或14所示。

当所述待测突变位点为2390G>C时，所述第一核酸分子的序列如SEQ ID No.3所示。

在可选实施方式中，所述核苷酸组合物还包括用于检测所述目标基因的ARMS引物。

在可选实施方式中，所述ARMS引物包括：用于检测2369C>T突变的序列依次如SEQID No.5～6所示的第一ARMS引物对；和/或，用于检测2390G>C突变的序列依次如SEQ IDNo.7～8所示的第二ARMS引物对。

在可选实施方式中，所述核苷酸组合物还包括探针。

在可选实施方式中，所述探针为Taqman探针。

在可选实施方式中，所述探针包括：用于检测2369C>T突变且序列如SEQ ID No.9所示的第一探针，和/或，用于检测2390G>C突变的序列如SEQ ID No.10所示的第二探针。

本发明实施例还提供了一种检测基因突变的试剂或试剂盒，其包括前述实施方式所述的核苷酸或如前述实施方式所述的核苷酸组合物。

此外，本发明实施例还提供了一种检测基因突变的方法，其包括在检测目标基因突变的反应体系中加入如前述实施方式所述的核苷酸组合物。

在可选实施方式中，所述检测目标基因突变的反应体系为AMRS-PCR反应体系。

在可选实施方式中，在进行AMRS-PCR反应前，当所述核苷酸组合中的第一核酸分子以单链形式存在时，所述方法包括将第一核酸分子与第二核酸分子进行退火，而后加入至反应体系中。

在可选的实施方式中，所述第一核酸分子的浓度小于所述第二核酸分子的浓度。

在可选的实施方式中，第一核酸分子与第二核酸分子的摩尔比为1：(1.1～2.0)；优选为1：1.2。

在可选的实施方式中，上述退火为梯度退火，退火的反应条件如下：94～96℃，0.8～1.2min→84～86℃，0.8～1.2min→74～76℃，0.8～1.2min→64～66℃，0.8～1.2min→54～56℃，0.8～1.2min→44～46℃，0.8～1.2min→34～36℃，0.8～1.2min→24～26℃，0.8～1.2min→14～16℃，0.8～1.2min→3～5℃，∞。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种针对EGFR基因T790M突变(2369C>T)的核苷酸组合物，其包括第一核酸分子、第二核酸分子、ARMS引物以及探针，该核苷酸组合物的序列如表1所示。

表1核酸分子序列

备注：

1.V为简并碱基，可以替换为G、A或C，在本实施例中为A；

2.第一核酸分子的Tm值为83℃；第二核酸分子的Tm值为77.6℃；上游引物的Tm值为70℃；下游引物的Tm值为65℃；

3.第一核酸分子与第二核酸分子中加粗且下划线的碱基对应待测突变位点；

4.突变型AS引物为ARMS引物中的针对突变型等位基因特异性扩增引物。

实施例2

本实施例提供一种针对EGFR基因C797S突变(2390G>C)的核苷酸组合物，其包括第一核酸分子、第二核酸分子、ARMS引物以及探针，该核苷酸组合物的序列如表2所示。

表2核酸分子序列

备注：

突变型AS引物为ARMS引物中的突变型等位基因特异性扩增引物。

实施例3

本实施例提供的核苷酸组合物包括有实施例1和实施例2中的核苷酸组合物。

实施例4

本实施例提供一种检测基因突变的方法，其包括以下步骤：

1.预处理：

T790M基因突变的预处理

采用实施例1提供的核苷酸组合物中的针对第一核酸分子和第二核酸分子按照摩尔比为1:1.2进行混合，放入常规定性PCR仪器Biometra TRIO进行梯度退火热处理，反应条件如下：

95℃，1min→85℃，1min→75℃，1min→65℃，1min→55℃，1min→45℃，1min→35℃，1min→25℃，1min→15℃，1min→4℃，∞。

C797S基因突变的预处理

采用实施例2提供的核苷酸组合物中的针对第一核酸分子和第二核酸分子按照摩尔比为1:1.2进行混合，放入常规定性PCR仪器Biometra TRIO进行梯度退火热处理，退火热处理同上。

2.AMRS-PCR反应：

T790M基因突变的检测

将对应的AMRS引物对、待测样品以及上述预处理步骤得到的第一核酸分子和第二核酸分子的退火产物混合进行AMRS-PCR反应，反应的体系如表3所示，反应条件如表4所示。

C797S基因突变的检测

将对应的AMRS引物对、待测样品以及上述预处理步骤得到的第一核酸分子和第二核酸分子的退火产物混合进行AMRS-PCR反应，反应体系和反应条件同上(表3和表4)。

表3反应体系

表4反应条件

试验例1

验证实施例1提供的核苷酸组合物中第二核酸分子的Tm值对基因突变检测的影响。

试验过程

采用实施例1中提供核苷酸组合物，设置3组第二核酸分子具有不同Tm值的第二核酸分子以及1组无第二核酸分子的对照组。

试验组1的第二核酸分子的序列为：

5’-GGCATGAGCTGCGTGATGA-3’-NH₂-MGB(SEQ ID No.11)；

试验组2的第二核酸分子的序列为：

5’-GCATGAGCTGCGTGATGA-3’-NH₂-MGB(SEQ ID No.2)。

试验组3的第二核酸分子的序列为：

5’-CATGAGCTGCGTGATGA-3’-NH₂-MGB(SEQ ID No.12)。

将T790M突变细胞系与正常的野生型细胞系分别按照突变细胞系0.1％和0％的不同细胞个数比例进行混合，混合后提取DNA作为含0.1％突变比例或没有含突变的模板(待测样品)。

然后分别采用实施例4提供的检测方法，对T790M进行基因突变检测，然后计算野生型细胞系的DNA与0.1％-T790M细胞系的DNA的CT值和ΔCT值。

试验结果

表5检测结果

试验组1～3的结果请依次参照附图1～3，结合表5可知，扩增相同T790M突变比例(0.1％)的DNA模板，加入不同TM值的第二核酸分子后的扩增体系ΔCT值存在差异。

其中，TM值最高的试验组1对于突变型DNA的扩增干扰最少，但对野生型DNA的抑制效果也明显降低，ΔCT值＝9.1，相比对照组有改善的区分效果；

中等TM值的试验组2对于突变型的模板有一定的干扰，但对于野生型有较好的抑制效果，相较于其他两条第二核酸分子，ΔCT值最大，ΔCT值＝12.8，区分效果最好。

TM值最低的试验组3，对于突变型的模板有一定的干扰，但对于野生型的抑制效果最优，ΔCT值＝10.2，区分效果优良。

试验例2

验证实施例1提供的核苷酸组合物对T790M基因突变检测特异性的影响。

使用T790M突变细胞系与正常的野生型细胞系按照0.1％和0％的不同细胞个数比例进行混合，混合后提取DNA作为含0.1％突变比例或没有含突变的模板(待测样品)。

设置4组试验组，具体如下。需要说明的是，“第一核酸分子”简写为“单链Block”，第一核酸分子和第二核酸分子的结合形成的双链形式简写为“双链Block”，无第一核酸和第二核酸，简写为“无Block”。

组1：0％T790M，无Block；

组2：0.1％T790M，无Block；

组3：0.1％T790M，单链Block；

组4：0.1％T790M，双链block。

然后分别采用实施例4提供的检测方法，对T790M进行基因突变检测，然后分别计算4组待测样品的ΔCT值。

试验结果

表6试验结果

结果请参照附图4，结合表6可知，加入双链Block的特异性优于单链Blcok，并显著优于没有Block，即加入了第一核酸和/或第二核酸能显著提高T790M基因突变检测的特异性。

试验例3

验证实施例2提供的核苷酸组合物对C797S基因突变检测特异性的影响。

使用C797S突变细胞系与正常的野生型细胞系按照0.1％和0％的不同细胞个数比例进行混合，混合后提取DNA作为含0.1％突变比例或没有含突变的模板(待测样品)。

设置4组试验组，具体如下。需要说明的是，第一核酸分子简写为Block或单链Block，第一核酸分子和第二核酸分子的结合形成的双链形式简写为双链Block，无第一核酸和第二核酸，简写为“无Block”。

组1：0％C797S，无Block；

组2：0.1％C797S，无Block；

组3：0.1％C797S，双链Block；

组4：0.1％C797S，单链block。

然后分别采用实施例4提供的检测方法，对C797S进行基因突变检测，然后分别计算4组待测样品的ΔCT值。

试验结果

表7试验结果

结果请参照附图5，结合表7可知，加入双链Block的特异性优于单链Blcok，并显著优于没有Block，即加入了第一核酸和/或第二核酸能显著提高基因突变检测的特异性。

试验例4

采用实施例1提供的核苷酸组合物，设置3组第一核酸分子。

试验组1的第一核酸分子的序列为：

5’-TCATCACGCAGCTCATGCC-3’-NH₂-MGB(Tm值为83.0℃，实施例1中的第一核酸分子)；

试验组2的第一核酸分子的序列为：

5’-CAGCTCATCACGCAGCTCAT-3’-NH₂-MGB(Tm值为83.3℃，SEQ ID No.13)。

试验组3的第一核酸分子的序列为：

5’-CCGTGCAGCTCATCACGC-3’-NH₂-MGB(Tm值为82.9℃，SEQ ID No.14)。

需要说明的是，序列中加粗且下划线的碱基对应待测突变位点。

然后分别采用实施例4提供的检测方法，对T790M的野生型样本进行检测，然后分别计算3组野生型样品的CT值。实验结果如表8和图6所示。

表8试验结果

试验组	野生型CT值
		1	32.5
2	30.3
		3	26.8

由表8和图6可知，当第一核酸分子上对应待测突变位点的位置越靠近第一核酸分子序列的5’端，其对野生型的封闭效果更好；同时，在第二核酸分子不变的情况下，其与第一核酸分子互补区域相对于第一核酸分子的位置发生变化，因此，第二核酸与第一核酸分子互补区域靠近第一核酸分子5’端时，对于野生型的抑制越强，CT值越大。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东菲鹏生物有限公司

<120> 一种检测基因突变的核苷酸及其组合物和方法

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcatcacgca gctcatgcc 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcatgagctg cgtgatga 18

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggctgcctc ctggactatg tcc 23

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccaggaggca gccg 14

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cacctccacc gtgcavctca tctt 24

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgagcagct actgggagcc aat 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcagctcatg cccttcggca c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcgatctgca cacaccagtt g 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agctcatgcc cttcggctgc c 21

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tggactatgt ccgggaacac aaagacaa 28

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggcatgagct gcgtgatga 19

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

catgagctgc gtgatga 17

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cagctcatca cgcagctcat 20

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccgtgcagct catcacgc 18

Claims

1.一种检测基因突变的试剂或试剂盒，其特征在于，其包括核苷酸组合物；所述核苷酸组合物包括第二核酸分子和第一核酸分子；所述核苷酸组合物适用于与ARMS引物配合使用以检测基因突变；所述第一核酸分子被设计成与ARMS引物中的突变型AS引物竞争靶序列的序列，所述靶序列取自野生型目标基因序列上覆盖待测突变位点的区域，所述第一核酸分子与所述靶序列的互补区域覆盖所述待测突变位点；

所述第二核酸分子的全长或其部分与所述第一核酸分子的全长或其部分序列互补，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子的互补区域覆盖所述待测突变位点；

所述第一核酸分子的全长与所述靶序列互补；所述第一核酸分子与所述靶序列的互补区域包括有5’端互补区，所述5’端互补区覆盖所述第一核酸分子序列的5’端的1~8个碱基中的至少一个，所述待测突变位点位于所述5’端互补区；

所述第一核酸分子的Tm值＞所述第二核酸分子的Tm值＞所述突变型AS引物的Tm值；

所述核苷酸组合物还包括用于检测所述目标基因的ARMS引物；所述检测目标基因突变的反应体系为AMRS-PCR反应体系。

2.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第一核酸分子的Tm值比所述第二核酸分子的Tm值高1~15℃。

3.根据权利要求2所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第一核酸分子的Tm值比所述第二核酸分子的Tm值高1~13℃。

4.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第二核酸分子的长度小于所述第一核酸分子的长度。

5.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第二核酸分子为13～25nt。

6.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第二核酸分子修饰有延伸阻断物。

7.根据权利要求6所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述延伸阻断物修饰于所述第二核酸分子的3’端。

8.根据权利要求6所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述延伸阻断物选自：胺、生物素、ddNTPs、PEG和PO₄中的一种或多种。

9.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第二核酸分子还连接有修饰基团，所述修饰基团为锁核酸、肽核酸和小沟结合物中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子的互补区域覆盖第一核酸分子序列的5’端的1~8碱基中的至少一个。

11.根据权利要求1~10任一项所述的检测基因突变的试剂或试剂盒，其特征在于，所述基因突变包括以下任一突变方式：一个或几个核苷酸的替换、一个或几个核苷酸的缺失和一个或几个核苷酸的插入。

12.根据权利要求11所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述目标基因包括EGFR基因。

13.根据权利要求12所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述待测突变位点为EGFR基因2369C>T或EGFR基因2390G>C。

14.根据权利要求13所述的试剂或试剂盒，其特征在于，当待测突变位点为EGFR基因2369C>T时，所述第二核酸分子的序列如SEQ ID No.2、11或12所示。

15.根据权利要求13所述的试剂或试剂盒，其特征在于，当待测突变位点为EGFR基因2390G>C时，所述第二核酸分子的序列如SEQ ID No.4所示。

16.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第一核酸分子与所述第一核酸分子分别以单链形式存在；或，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子相结合以双链形式存在。

17.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第一核酸分子修饰有延伸阻断物。

18.根据权利要求17所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述延伸阻断物修饰于所述第一核酸分子的3’端。

19.根据权利要求17所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述延伸阻断物选自：胺、生物素、ddNTPs、PEG和PO₄中的一种或多种。

20.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第一核酸分子连接有修饰基团，所述修饰基团为锁核酸、肽核酸和小沟结合物中的至少一种。

21.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第一核酸分子为15～35nt。

22.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，当所述待测突变位点为EGFR基因2369C>T时，所述第一核酸分子的序列如SEQ ID No.1、13或14所示；

当所述待测突变位点为EGFR基因2390G>C时，所述第一核酸分子的序列如SEQ ID No.3所示。

23.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述ARMS引物包括：用于检测EGFR基因2369C>T突变的序列依次如SEQ ID No.5～6所示的第一ARMS引物对；和/或，用于检测EGFR基因2390G>C突变的序列依次如SEQ ID No.7~8所示的第二ARMS引物对。

24.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述核苷酸组合物还包括探针。

25.根据权利要求24所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述探针为Taqman探针。

26.根据权利要求24所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述探针包括：用于检测EGFR基因2369C>T突变且序列如SEQ ID No.9所示的第一探针，和/或，用于检测EGFR基因2390G>C突变的序列如SEQ ID No.10所示的第二探针。

27.根据权利要求1~10、12~26任一项所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述基因突变包括以下任一突变方式：一个或几个核苷酸的替换、一个或几个核苷酸的缺失和一个或几个核苷酸的插入。

28.根据权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，在进行AMRS-PCR反应前，当所述核苷酸组合中的第一核酸分子以单链形式存在时，所述方法包括将第一核酸分子与第二核酸分子进行退火，而后加入至反应体系中。

29.根据权利要求28所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第一核酸分子的浓度小于所述第二核酸分子的浓度。

30.根据权利要求29所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子的摩尔比为1：1.1~2.0。

31.核苷酸组合物与用于检测目标基因的ARMS引物的组合在制备用于检测基因突变的试剂或试剂盒中的应用；

所述核苷酸组合物包括第二核酸分子和第一核酸分子；所述核苷酸组合物适用于与ARMS引物配合使用以检测基因突变；所述第一核酸分子被设计成与ARMS引物中的突变型AS引物竞争靶序列的序列，所述靶序列取自野生型目标基因序列上覆盖待测突变位点的区域，所述第一核酸分子与所述靶序列的互补区域覆盖所述待测突变位点；

所述核苷酸组合物还包括用于检测所述目标基因的ARMS引物；所述检测目标基因突变的反应体系为AMRS-PCR反应体系；

用于检测所述目标基因的ARMS引物包括：用于检测EGFR基因2369C>T突变的序列依次如SEQ ID No.5～6所示的第一ARMS引物对；和/或，用于检测EGFR基因2390G>C突变的序列依次如SEQ ID No.7~8所示的第二ARMS引物对。

32.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述第一核酸分子的Tm值比所述第二核酸分子的Tm值高1~15℃。

33.根据权利要求32所述的应用，其特征在于，所述第一核酸分子的Tm值比所述第二核酸分子的Tm值高1~13℃。

34.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述第二核酸分子的长度小于所述第一核酸分子的长度。

35.根据权利要求34所述的应用，其特征在于，所述第二核酸分子为13～25nt。

36.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述第二核酸分子修饰有延伸阻断物。

37.根据权利要求36所述的应用，其特征在于，所述延伸阻断物修饰于所述第二核酸分子的3’端。

38.根据权利要求36所述的应用，其特征在于，所述延伸阻断物选自：胺、生物素、ddNTPs、PEG和PO₄中的一种或多种。

39.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述第二核酸分子还连接有修饰基团，所述修饰基团为锁核酸、肽核酸和小沟结合物中的至少一种。

40.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子的互补区域覆盖第一核酸分子序列的5’端的1~8碱基中的至少一个。

41.根据权利要求31~40任一项所述的应用，其特征在于，所述基因突变包括以下任一突变方式：一个或几个核苷酸的替换、一个或几个核苷酸的缺失和一个或几个核苷酸的插入。

42.根据权利要求41所述的应用，其特征在于，所述目标基因包括EGFR基因。

43.根据权利要求42所述的应用，其特征在于，所述待测突变位点为EGFR基因2369C>T或EGFR基因2390G>C。

44.根据权利要求43所述的应用，其特征在于，当待测突变位点为EGFR基因2369C>T时，所述第二核酸分子的序列如SEQ ID No.2、11或12所示。

45.根据权利要求43所述的应用，其特征在于，当待测突变位点为EGFR基因2390G>C时，所述第二核酸分子的序列如SEQ ID No.4所示。

46.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述第一核酸分子与所述第一核酸分子分别以单链形式存在；或，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子相结合以双链形式存在。

47.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述第一核酸分子修饰有延伸阻断物。

48.根据权利要求47所述的应用，其特征在于，所述延伸阻断物修饰于所述第一核酸分子的3’端。

49.根据权利要求47所述的应用，其特征在于，所述延伸阻断物选自：胺、生物素、ddNTPs、PEG和PO₄中的一种或多种。

50.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述第一核酸分子连接有修饰基团，所述修饰基团为锁核酸、肽核酸和小沟结合物中的至少一种。

51.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述第一核酸分子为15～35nt。

52.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，当所述待测突变位点为EGFR基因2369C>T时，所述第一核酸分子的序列如SEQ ID No.1、13或14所示；

53.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述核苷酸组合物还包括探针。

54.根据权利要求53所述的应用，其特征在于，所述探针为Taqman探针。

55.根据权利要求53所述的应用，其特征在于，所述探针包括：用于检测EGFR基因2369C>T突变且序列如SEQ ID No.9所示的第一探针，和/或，用于检测EGFR基因2390G>C突变的序列如SEQ ID No.10所示的第二探针。