Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

KR20230146100A - Bcma 키메릭 항원 수용체 - Google Patents

Bcma 키메릭 항원 수용체 Download PDF

Info

Publication number
KR20230146100A
KR20230146100A KR1020237033164A KR20237033164A KR20230146100A KR 20230146100 A KR20230146100 A KR 20230146100A KR 1020237033164 A KR1020237033164 A KR 1020237033164A KR 20237033164 A KR20237033164 A KR 20237033164A KR 20230146100 A KR20230146100 A KR 20230146100A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
car
vector
virus
Prior art date
Application number
KR1020237033164A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102731379B1 (ko
Inventor
리처드 모건
케빈 프리드먼
Original Assignee
2세븐티 바이오, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 2세븐티 바이오, 인코포레이티드 filed Critical 2세븐티 바이오, 인코포레이티드
Publication of KR20230146100A publication Critical patent/KR20230146100A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102731379B1 publication Critical patent/KR102731379B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)

Abstract

본 발명은 B 세포 관련 병태를 위한 입양 T 세포 요법을 위한 개선된 조성물을 제공한다.

Description

BCMA 키메릭 항원 수용체{BCMA CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS}
관련 출원의 상호참조
본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에 2015년 8월 3일자로 출원된 미국 가출원 62/200,505, 및 2014년 12월 12일자로 출원된 미국 가출원 62/091,419의 이익을 청구하고, 이들 각각은 이의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록이 종이 사본 대신에 텍스트 포맷으로 제공되며, 본 명세서에 참고로 포함된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 BLBD_043_02WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 27KB이며, 2015년 12월 4일자로 생성되었고, 본 명세서의 출원과 동시에, EFS-Web을 통해 전자 제출 중에 있다.
기술분야
본 발명은 B 세포 관련 병태를 치료하기 위한 개선된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 특별하게는, 본 발명은 뮤린(murine) 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 개선된 키메릭 항원 수용체(CAR), 이러한 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 면역 이펙터 세포, 및 B 세포 관련 병태를 효과적으로 치료하기 위한 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.
다수의 중요 질환이 B 림프구, 즉 B 세포를 수반한다. 이상 B 세포 생리학은 또한, 전신 홍반성 루프스(SLE)를 포함하지만 이에 제한되지 않은 자가면역 질환이 발병되게 할 수 있다. B 세포의 악성 변형은, 림프종, 예를 들어 다발성 골수종 및 비-호지킨 림프종(non-Hodgkins' lymphoma)을 포함하지만 이에 제한되지 않은 암에 이르게 한다.
비-호지킨 림프종(NHL) 및 다발성 골수종(MM)을 비롯한 B 세포 악성종양(B cell malignancy)을 갖는 환자의 대다수는 암 사망률의 중요 기여인자이다. 다양한 형태의 치료에 대한 B 세포 악성종양의 반응은 혼합되어 있다. 화학요법 및 방사선요법을 비롯한, B 세포 악성종양의 전통적인 치료 방법은 독성 부작용으로 인해 제한된 유용성을 갖는다. 항-CD19, 항-CD20, 항-CD22, 항-CD23, 항-CD52, 항-CD80, 및 항-HLA-DR 치료학정 항체로의 면역요법은 부분적으로, 불량한 약동학적 프로파일, 혈청 프로테아제 및 사구체에서의 여과에 의한 항체의 신속한 제거, 및 종양 부위로의 제한된 침투 및 암 세포 상의 표적 항원의 발현 수준으로 인해서, 제한된 성공을 제공하였다. 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 유전자 변형된 세포를 사용하고자 하는 시도 또한 제한된 성공으로 만족되었다. 또한, CAR에서 사용되는 주어진 항원 결합 도메인의 치료 효능은 예측이 불가능한데: 항원 결합 도메인이 너무 강하게 결합하면, CAR T 세포가 거대 사이토카인 방출을 유도하고, 이것은 "사이토카인 폭풍"으로 여겨지는 잠재적으로 치명적인 면역 반응을 유발하고, 항원 결합 도메인이 너무 약하게 결합하면, CAR T 세포는 암 세포를 클리어링하는 충분한 치료 효능을 나타내지 않는다.
본 발명은 일반적으로 T 세포 요법의 생성을 위한 개선된 벡터 및 이의 사용 방법을 제공한다.
다양한 실시형태에서, 인간 BCMA 폴리펩타이드의 하나 이상의 에피토프와 결합하는 뮤린 항-BCMA(B 세포 성숙화 항원(B cell maturation antigen)) 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 도메인; 막관통 도메인, 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인, 및 주요 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)가 제공된다.
특별한 실시형태에서, 인간 BCMA 폴리펩타이드와 결합하는 뮤린 항-BCMA 항체 또는 항원 결합 단편은 카멜(Camel) Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단쇄 Fv 항체("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 다이설파이드 안정화된 Fv 단백질("dsFv"), 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 실시형태에서, 인간 BCMA 폴리펩타이드와 결합하는 뮤린 항-BCMA 항체 또는 항원 결합 단편은 scFv이다.
일부 실시형태에서, 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함한다.
특별한 실시형태에서, 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함한다.
특정 실시형태에서, 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열을 포함한다.
특별한 실시형태에서, 가변 경쇄 서열은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 8에 서열 제시된 바와 같은 가변 중쇄를 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 가변 중쇄 서열은 서열번호 4 내지 6에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
추가 실시형태에서, 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154, 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α; CD4, CD45, PD1, 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된다.
특정 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래된다.
특별한 실시형태에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 공-자극 분자로부터 유래된다.
특별한 실시형태에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28, CD134, 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택된 공-자극 분자로부터 유래된다.
추가적인 실시형태에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28, CD134, 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택된 공-자극 분자로부터 유래된다.
추가적인 실시형태에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28로부터 유래된다.
특별한 실시형태에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD134로부터 유래된다.
다른 실시형태에서, 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래된다.
특정 실시형태에서, CAR은 힌지(hinge) 영역 폴리펩타이드를 포함한다.
추가 실시형태에서, 힌지 영역 폴리펩타이드는 CD8α의 힌지 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 스페이서 영역을 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 스페이서 영역 폴리펩타이드는 IgG1 또는 IgG4의 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함한다.
특별한 실시형태에서, CAR은 신호 펩타이드를 포함한다.
추가 실시형태에서, 신호 펩타이드는 IgG1 중쇄 신호 폴리펩타이드, 과립구-대식세포 집락 자극 인자 수용체 2(granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor 2: GM-CSFR2) 신호 펩타이드, 또는 CD8α 신호 폴리펩타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 서열번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
다양한 특별한 실시형태에서, CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 여기서 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10에 제시되어 있다.
다양한 특정 실시형태에서, 본 발명에서 고려되거나 또는 서열번호 10에 제시된 바와 같은 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 제공된다.
특정 실시형태에서, 벡터는 발현 벡터이다.
추가적인 실시형태에서, 벡터는 에피솜 벡터이다.
특별한 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
추가 실시형태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
다른 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일 실시형태에서, BCMA CAR을 암호화하는 벡터는 서열번호 36에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1); 인간 면역결핍 바이러스 2(HIV-2), 비스나-매디 바이러스(visna-maedi virus: VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)로 본질적으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특별한 실시형태에서, 벡터는 좌측(5') 레트로바이러스 LTR, 프사이(Ψ) 패키징 신호, 중앙 폴리퓨린 트랙/DNA 플랩(cPPT/FLAP), 레트로바이러스 외수송 요소; 본 명세서에서 고려되는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 및 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함한다.
다른 실시형태에서, CAR은 이종 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(hepatitis B virus posttranscriptional regulatory element: HPRE) 또는 우드척 전사후 조절 요소(woodchuck post-transcriptional regulatory element: WPRE)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 5' LTR의 프로모터는 이종 프로모터로 대체된다.
추가 실시형태에서, 이종 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 또는 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터이다.
특별한 실시형태에서, 5' LTR 또는 3' LTR은 렌티바이러스 LTR이다.
특별한 실시형태에서, 3' LTR은 하나 이상의 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 3' LTR은 하나 이상의 결실을 포함한다.
특정 실시형태에서, 3' LTR은 자가-불활성화(SIN) LTR이다.
일부 실시형태에서, 폴리아데닐화 서열은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 또는 신호 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열이다.
추가적인 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 최적화된 코작(Kozak) 서열을 포함한다.
추가 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 거대세포바이러스 전초기 유전자 프로모터(CMV), 연장 인자(elongation factor) 1 알파 프로모터(EF1-α), 포스포글리세레이트 카이나제-1 프로모터(PGK), 유비퀴틴-C 프로모터(UBQ-C), 거대세포바이러스 인핸서/치킨 베타-액틴 프로모터(CAG), 폴리오마 인핸서/헤르페스 단순 티미딘 카이나제 프로모터(MC1), 베타 액틴 프로모터(β-ACT), 유인원 바이러스 40 프로모터(SV40), 및 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 벡터를 포함하는 면역 이펙터 세포가 제공된다. 다양한 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 본 명세서에서 고려되는 벡터로 형질도입된다.
추가 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 T 림프구 및 자연 살해(NK) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 제28항 내지 제46항 중 어느 한 항의 벡터로 형질도입되고, PI3K 경로의 억제제의 존재하에서 활성화 및 자극되고, 이에 의해서 PI3K 경로의 억제제의 부재하에서 활성화 및 자극된 형질도입된 면역 이펙터 세포의 증식에 비해서, 형질도입된 면역 이펙터 세포의 증식을 유지시킨다.
특별한 실시형태에서, PI3K 경로의 억제제의 존재하에서 활성화 및 자극된 면역 이펙터 세포는 PI3K 경로의 억제제의 부재하에서 활성화 및 자극된 면역 이펙터 세포에 비해서 i) CD62L, CD127, CD197, 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커; 또는 ii) 마커 CD62L, CD127, CD197, 및 CD38 전부의 증가된 발현을 갖는다.
일 실시형태에서, PI3K 억제제는 ZSTK474이다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 면역 이펙터 세포 및 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 면역 이펙터 세포에 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 포함하는 면역 이펙터 세포를 생성하는 방법이 제공된다.
추가적인 실시형태에서, 방법은 면역 이펙터 세포를 자극하고, 세포를 CD3과 결합하는 항체 및 CD28에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 세포를 증식하도록 유도하고; 이에 의해서 면역 이펙터 세포의 집단을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
특별한 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 벡터를 도입하기 전에 자극되어, 증식하도록 유도된다.
특정 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 T 림프구를 포함한다.
특별한 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 NK 세포를 포함한다.
특별한 실시형태에서, 세포는 PI3K 경로의 억제제의 존재하에서 활성화 및 자극되고, 이에 의해서 PI3K 경로의 억제제의 부재하에서 활성화 및 자극된 면역 이펙터 세포의 증식에 비해서 형질도입된 면역 이펙터 세포의 증식을 유지시킨다.
일부 실시형태에서, PI3K 경로의 억제제의 존재하에서 활성화 및 자극된 면역 이펙터 세포는 PI3K 경로의 억제제의 부재하에서 활성화 및 자극된 면역 이펙터 세포에 비해서 i) CD62L, CD127, CD197, 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커; 또는 ii) 마커 CD62L, CD127, CD197, 및 CD38 전부의 증가된 발현을 갖는다.
일 실시형태에서, PI3K 억제제는 ZSTK474이다.
다양한 실시형태에서, 대상체에게 치료 유효량 본 명세서에서 고려되는 CMA CAR T 세포 및 임의로 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, B 세포 관련 병태의 치료가 필요한 대상체에서 B 세포 관련 병태를 치료하는 방법이 제공된다.
다른 실시형태에서, B 세포 관련 병태는 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 불확실한 악성 잠재성의 B 세포 증식, 림프종모양 육아종증, 이식-후 림프증식성장애, 면역조절 장애, 류마티스성 관절염, 중증 근무력증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 항-인지질 증후군, 샤가스병(Chagas' diease), 그레이브스병(Grave's diease), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 결절성 다발동맥염, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 심상성 천포창, 피부경화증, 다발성 경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 연관 혈관염, 굿파스쳐병(Goodpasture's diease), 가와사키병, 자가면역 용혈성 빈혈, 및 급속 진행성 사구체신염, 중쇄병, 원발성 또는 면역세포-연관 아밀로이드증, 또는 미확정 단클론성 감마병증(monoclonal gammopathy of undetermined significance)이다.
추가 실시형태에서, B 세포 관련 병태는 B 세포 악성종양이다.
특정 실시형태에서, B 세포 악성종양은 다발성 골수종(MM) 또는 비-호지킨 림프종(NHL)이다.
특정 실시형태에서, MM은 현성(overt) 다발성 골수종, 무증상(smoldering) 다발성 골수종, 형질 세포성 백혈병, 비-분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화성 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 및 골수외 형질세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, NHL은 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 만성 림프구성 백혈병/소 림프구성 림프종(CLL/SLL), 미만성 거대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 면역모구성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 및 외투 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특별한 실시형태에서, B 세포 관련 병태는 형질 세포 악성종양이다.
추가 실시형태에서, B 세포 관련 병태는 자가면역 질환이다.
추가적인 실시형태에서, 자가면역 질환은 전신 홍반성 루프스이다.
특정 실시형태에서, B 세포 관련 병태는 류마티스성 관절염이다.
특별한 실시형태에서, B 세포 관련 병태는 특발성 혈소판감소성 자반증, 또는 중증 근무력증, 또는 자가면역 용혈성 빈혈이다.
A. 개요
본 발명은 일반적으로 B 세포 관련 병태의 치료를 위한 개선된 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "B 세포 관련 병태"라는 용어는 부적절한 B 세포 활성을 수반하는 병태 및 B 세포 악성종양에 관한 것이다.
특별한 실시형태에서, 본 발명은 유전자 변형된 면역 이펙터 세포를 사용하는 B 세포 관련 병태의 개선된 입양 세포 요법(adoptive cell therapy)에 관한 것이다. 유전학적 접근법은 암 세포의 면역 인식 및 제거를 향상시키는 잠재적인 수단을 제공한다. 한 가지 유망한 전략은 세포독성을 암 세포로 재지시하는(redirect) 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 면역 이펙터 세포를 유전자 조작하는 것이다. 그러나, B 세포 장애를 치료하기 위한 기존의 입양 세포 면역요법은, 세포가 모든 또는 대부분의 B 세포 상에 발현된 항원을 표적화하기 때문에, 체액 면역(humoral immunity)을 손상시킬 심각한 위험성을 나타낸다. 따라서, 그러한 요법은 임상적으로 바람직하지 않으며, 따라서 관련 분야에서는 체액 면역이 부족한 B 세포 관련 병태에 보다 효율적인 요법이 여전히 필요하다.
본 명세서에 개시된 입양 세포 요법의 개선된 조성물 및 방법은, 쉽게 확장될 수 있고, 생체내에서 장기간 잔류성을 나타낼 수 있으며, B 세포 발현 B 세포 성숙화 항원(BCMA, 또한 CD269 또는 종양 괴사 인자 수용체 상과, 구성원 17; TNFRSF17로서 공지됨)을 표적화함으로써 체액 면역의 손상을 감소시킬 수 있는 유전자 변형된 면역 이펙터 세포를 제공한다.
BCMA는 종양 괴사 인자 수용체 상과의 구성원이다(예를 들어, 문헌[Thompson et al., J. Exp. Medicine, 192(1): 129-135, 2000], 및 [Mackay et al., Annu. Rev.Immunol, 21: 231-264, 2003] 참고). BCMA는 B-세포 활성화 인자(BAFF) 및 증식 유도성 리간드(APRIL)와 결합한다(예를 들어, 문헌[Mackay et al., 2003 and Kalled et al., Immunological Reviews, 204: 43-54, 2005] 참고). 비악성종양성 세포 중에서, BCMA는 형질 세포 및 성숙한 B-세포의 하위세트에서 주로 발현된다고 보고되어 있다(예를 들어, 문헌[Laabi et al., EMBO J., 77(1 ): 3897-3904, 1992; Laabi et al., 핵산 Res., 22(7): 1147-1154,, 1994]; [Kalled et al., 2005; O'Connor et al., J. Exp. Medicine, 199(1): 91-97, 2004]; 및 [Ng et al., J. Immunol., 73(2): 807-817, 2004] 참고). BCMA가 결핍된 마우스는 건강하고, 정상적인 수의 B 세포를 갖지만, 장기간 형질 세포의 생존이 손상된다(예를 들어, 문헌[O'Connor et al., 2004; Xu et al., Mol. Cell. Biol, 21(12): 4067-4074, 2001]; 및 [Schiemann et al., Science, 293(5537): 2 111-21 14, 2001] 참고). BCMA RNA는 보편적으로 다발성 골수종 세포 및 다른 림프종에서 검출되었으며, BCMA 단백질은 다수의 연구자들에 의해서 다발성 골수종 환자로부터의 형질 세포의 표면 상에서 검출되었다(예를 들어, 문헌[Novak et al., Blood, 103(2): 689-694, 2004]; [Neri et al., Clinical Cancer Research, 73(19): 5903-5909, 2007]; [Bellucci et al., Blood, 105(10): 3945-3950, 2005]; 및 [Moreaux et al., Blood, 703(8): 3148-3157, 2004] 참고)
다양한 실시형태에서, 뮤린 항-BCMA 항체 서열을 포함하는 CAR은 특정 인간 항체 서열을 포함하는 BCMA CAR에 비해서 매우 효능이 있으며; 확고한 생체내 확장을 겪고; BCMA를 발현하는 인간 B 세포를 인식하고; BCMA 발현 B 세포에 대해 세포독성 활성을 나타내고; 활성화된 T 세포에 의해서 방출된 사이토카인이 비감염성 발열을 자극하는 계에서의 갑작스러운 염증성 반응을 생성하는 잠재적으로 치명적인 병태인 사이토카인 폭풍을 유도하는 징후를 나타내지 않는다.
일 실시형태에서, 뮤린 항-BCMA 항체 또는 항원 결합 단편, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 면역 이펙터 세포가 제공된다. CAR을 발현하는 T 세포를 본 명세서에서 CAR T 세포 또는 CAR 변형된 T 세포라 칭한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 유전자 변형된 면역 이펙터 세포는 B 세포 관련 병태, 예를 들어 B 세포와 연관된 자가면역 질환 또는 B 세포 악성종양이 있는 환자에게 투여된다.
본 발명의 실시는, 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 관련 기술 분야의 기술 내에 있는 통상적인 화학, 생화학, 유기화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 유전학, 면역학, 및 세포 생물학의 방법을 사용할 것이며, 이들 중 다수는 하기에 예시를 목적으로 기술된다. 그러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001]); [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]; [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 2008년 7월 개정)]; [Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience]; [Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985)]; [Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992)]; [Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984)]; [Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]; [Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998)]; [Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991)]; [Annual Review of Immunology]; 뿐만 아니라 학술지, 예컨대 문헌[Advances in Immunology]의 논문을 참고하기 바란다.
B. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 조성물, 방법 및 물질의 바람직한 실시형태를 본 명세서에 기술한다. 본 발명의 목적을 위해서, 하기의 용어를 하기에 정의한다.
단수 표현은 본 명세서에서 단수 표현의 문법적 목적어의 하나 또는 하나 초과(즉 적어도 하나 또는 하나 이상)를 지칭한다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
양자택일(예를 들어 "또는")의 사용은 양자택일 중 하나, 둘 다, 또는 이의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해해야 한다.
"및/또는"이라는 용어는 양자택일 중 하나 또는 둘 모두를 의미하는 것으로 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약" 또는 "대략적으로"라는 용어는 참조 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 까지 변하는 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, "약" 또는 "대략적으로"라는 용어는 참조 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 관하여 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2%, 또는 ± 1%의 범위를 지칭한다.
본 명세서 전체를 통해서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다", "포함한다" 및 "포함하는"이란 단어는 진술된 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 군을 포함하나 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 군은 포함하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "로 이루어진"은 "로 이루어진"이란 어구에 앞의 것은 무엇이든 포함하며 이들로 제한됨을 의미한다. 따라서, "로 이루어진"이란 어구는 나열된 요소가 필요하거나 필수적이며 다른 요소는 존재할 수 없음을 가리킨다. "본질적으로 이루어진"은 이러한 어구 앞에 나열된 임의의 요소를 포함하며, 나열된 요소에 대해서 본 명세서에 명시된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 작용에 기여하지 않는 다른 요소로 제한됨을 의미한다. 따라서, "본질적으로 이루어진"이란 어구는 나열된 요소가 필요하거나 필수적이지만, 나열된 요소의 활성 또는 작용에 실질적으로 영향을 미치는 다른 요소들은 존재하지 않음을 가리킨다.
본 명세서 전체를 통해 "일 실시형태", "실시형태", "특별한 실시형태", "관련 실시형태", "특정 실시형태", "추가적인 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이의 조합에 대한 언급은, 실시형태와 관련하여 기술된 특별한 특징부, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체를 통해 다양한 부분에서 상기 어구들의 출현은 반드시 모두 동일한 실시형태를 언급하는 것은 아니다. 또한, 특별한 특징부, 구조 또는 특징을 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합할 수 있다. 또한, 하나의 실시형태에서 하나의 특징의 긍정적인 인용은 특정한 실시형태에서 특징부를 제외하는 근거로서 작용하는 것으로 이해된다.
C. 키메릭 항원 수용체
다양한 실시형태에서, 면역 이펙터 세포의 세포독성을 B 세포로 재지시하는 유전자 조작된 수용체가 제공된다. 이러한 유전자 조작된 수용체는 본 명세서에서 키메릭 항원 수용체(CAR)라 지칭된다. CAR은, 목적하는 항원(예를 들어 BCMA)에 대한 항체-기반 특이성을 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하여 특이적인 항-BCMA 세포 면역 활성을 나타내는 키메릭 단백질을 생성하는 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "키메릭"이라는 용어는 상이한 기원으로부터의 상이한 단백질 또는 DNA의 부분으로 구성됨을 기술한다.
본 명세서에서 고려되는 CAR은 BCMA에 결합하는 세포외 도메인(또한 결합 도메인 또는 항원-특이적인 결합 도메인이라 지칭됨), 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. CAR의 항-BCMA 항원 결합 도메인과 표적 세포의 표면 상의 BCMA와의 맞물림은 CAR의 클러스터를 생성시키며 CAR-함유 세포로 활성화 자극을 전달한다. CAR의 주 특징은 면역 이펙터 세포 특이성을 재지시하는 능력이며, 이에 의해 주 조직적합성(MHC) 독립적인 방식으로 증식, 사이토카인 생산, 식작용, 또는 표적 항원 발현 세포의 세포사를 매개할 수 있는 분자의 생산을 촉발하고, 단클론성 항체, 용해성 리간드 또는 세포 특이적인 공-수용체의 세포 특이적인 표적화 능력을 활용한다.
다양한 실시형태에서, CAR은 뮤린 항-BCMA-특이적인 결합 도메인을 포함하는 세포외 결합 도메인; 막관통 도메인; 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특별한 실시형태에서, CAR은 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 결합 도메인; 하나 이상의 힌지 도메인 또는 스페이서 도메인; 막관통 도메인; 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
1. 결합 도메인
특별한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 B 세포 상에서 발현된 인간 BCMA 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 결합 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "결합 도메인", "세포외 도메인", "세포외 결합 도메인", "항원-특이적인 결합 도메인", 및 "세포외 항원 특이적인 결합 도메인"이라는 용어는 상호 교환 가능하게 사용되며, CAR에 관심 표적 항원, 예를 들어 BCMA에 특이적으로 결합하는 능력을 제공한다. 결합 도메인은 천연, 합성, 반-합성, 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "특이적인 결합 친화성" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합된" 또는 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 표적화한다"라는 용어는 배경 결합보다 더 큰 결합 친화성으로의 BCMA에 대한 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편(또는 이를 포함하는 CAR)의 결합을 기술한다. 결합 도메인(또는 결합 도메인을 포함하는 CAR 또는 결합 도메인을 함유하는 융합 단백질)은 도메인이 예를 들어 약 105M-1 이상의 친화성 또는 Ka(즉 1/M의 단위를 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 결합 상수)로 BCMA에 결합하거나 또는 이것과 회합하는 경우 BCMA에 "특이적으로 결합한다". 특정 실시형태에서, 결합 도메인(또는 이의 융합 단백질)은 약 106M-1, 107M-1, 108M-1, 109M-1, 1010M-1, 1011M-1, 1012M-1, 또는 1013M-1 이상의 Ka로 표적에 결합한다. "고 친화성" 결합 도메인(또는 이의 단쇄 융합 단백질)은 적어도 107M-1, 적어도 108M-1, 적어도 109M-1, 적어도 1010M-1, 적어도 1011M-1, 적어도 1012M-1, 적어도 1013M-1, 또는 그 초과의 Ka를 갖는 결합 도메인을 지칭한다.
대안적으로, 친화성은 M의 단위(예를 들어 10-5M 내지 10-13M, 또는 그 미만)를 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)로서 정의될 수 있다. 본 개시 내용에 따른 결합 도메인 폴리펩타이드 및 CAR 단백질의 친화성은 통상적인 기술을 사용하여, 예를 들어 경쟁 ELISA(효소-연결된 면역흡수 검정법)에 의해서, 또는 결합 회합, 또는 표지된 리간드를 사용하거나 또는 표면-플라스몬 공명 장치, 예를 들어 비아코어(Biacore) T100(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 비아코어, 인코포레이티드(Biacore, Inc.)로부터 입수 가능함)을 사용하는 치환 검정법(displacement assay), 또는 광학 바이오센서 기술, 예를 들어 EPIC 시스템 또는 엔스파이어(EnSpire)(각각 코닝(Corning) 및 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)로부터 입수 가능함)에 의해 쉽게 측정될 수 있다(또한 예를 들어 문헌[Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660]; 및 미국 특허 5,283,173; 미국 특허 5,468,614 또는 등가물을 참고).
일 실시형태에서, 특이적인 결합의 친화성은 배경 결합보다 약 2배 더 크거나, 배경 결합보다 약 5배 더 크거나, 배경 결합보다 약 10배 더 크거나, 배경 결합보다 약 20배 더 크거나, 배경 결합보다 약 50배 더 크거나, 배경 결합보다 약 100배 더 크거나, 또는 배경 결합보다 약 1000배 더 크거나, 또는 그 초과이다.
특별한 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. "항체"는 항원의 에피토프, 예를 들어 항원 결정인자, 예를 들어 면역 세포에 의해 인식되는 것을 함유하는 펩타이드, 지질, 폴리사카라이드, 또는 핵산을 특이적으로 인식 및 결합하는 적어도 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드인 결합제를 지칭한다.
"항원(Ag)"은 동물에서 항체의 생산 또는 T 세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물, 또는 물질을 지칭하며, 동물에게 주사되거나 흡수되는 조성물(예컨대 암-특이적인 단백질을 포함하는 것)을 포함한다. 항원은 이종 항원, 예컨대 개시된 항원에 의해 유도되는 것을 비롯한 특이적인 체액 또는 세포 면역의 생산물과 반응한다. 특별한 실시형태에서, 표적 항원은 BCMA 폴리펩타이드의 에피토프이다.
"에피토프" 또는 "항원 결정인자"는 결합제가 결합하는 항원의 영역을 지칭한다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬되는 연속적인 아미노산 또는 불연속적인 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 연속적인 아미노산으로부터 형성되는 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면 3차 폴딩에 의해 형성되는 에피토프는 전형적으로 변성 용매 처리시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 입체구조(conformation)의 적어도 3개, 및 보다 대개는 적어도 5개, 약 9개, 또는 약 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
항체는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 카멜 Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단쇄 Fv 항체("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 다이설파이드 안정화된 Fv 단백질("dsFv"), 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디) 및 항원 결합을 담당하는 전장 항체의 부분을 포함한다. 이러한 용어는 또한 유전자 조작된 형태, 예컨대 키메릭 항체(예를 들어 인간화된 뮤린 항체), 이종접합 항체(예를 들어 이중특이적인 항체) 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 또한 문헌[Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)]; [Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997]을 참고하기 바란다.
통상의 기술자에 의해 이해되고 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 완전 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 가변 영역 및 제1, 제2 및 제3 불변 영역으로 이루어지는 반면, 각각의 경쇄는 가변 영역 및 불변 영역으로 이루어진다. 포유동물 중쇄는 α, δ, ε, γ 및 μ로서 분류된다. 포유동물 경쇄는 λ 또는 κ로서 분류된다. α, δ, ε, γ 및 μ 중쇄를 포함하는 면역글로불린은 면역글로불린 (Ig)A, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로서 분류된다. 완전 항체는 "Y" 형상을 형성한다. Y의 줄기는 함께 결합된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역(및 IgE 및 IgM의 경우, 제4 불변 영역)으로 이루어지며, 다이설파이드 결합(쇄-간)이 힌지에 형성된다. 중쇄 γ, α 및 δ는 3개의 직렬(한 줄로) Ig 도메인으로 구성된 불변 영역, 및 유연성을 부가하기 위한 힌지 영역을 가지며; 중쇄 μ 및 ε는 4개의 면역글로불린 도메인으로 구성된 불변 영역을 갖는다. 제2 및 제3 불변 영역을 각각 "CH2 도메인" 및 "CH3 도메인"이라 칭한다. Y의 각 아암(arm)은 단일 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역에 결합된 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 담당한다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역은 3개의 고가변 영역, 소위 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"에 의해 중단된 "프레임워크" 영역을 함유한다. CDR은 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 카바트(Kabat) 등(문헌[Wu, TT and Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970)]; 문헌[Borden, P. and Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987)])에 따른 서열에 의해; (본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991] 참고), 또는 코티아(Chothia) 등(문헌[Chothia, C. and Lesk, A.M., J Mol. Biol., 196(4): 901-917 (1987)], [Chothia, C. et al, Nature, 342: 877 - 883 (1989)])에 따른 구조에 의해 정의되거나 식별될 수 있다.
상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종, 예컨대 인간 내에서 비교적 보존된다. 항체의 프레임워크 영역, 즉 구성 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역은 CDR을 3차원 공간에 위치 및 정렬시키는 작용을 한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 각 쇄의 CDR은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라 지칭되며, N-말단으로부터 출발하여 연속해서 번호 매겨지고, 또한 전형적으로 특정 CDR이 위치된 쇄에 의해 식별된다. 따라서, 항체의 중쇄의 가변 도메인에 위치된 CDR은 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이라 지칭되는 반면, 항체의 경쇄의 가변 도메인에 위치된 CDR은 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이라 지칭된다. 상이한 특이성(즉 상이한 항원에 대한 상이한 조합 부위)을 갖는 항체는 상이한 CDR을 갖는다. 그것은 항체마다 다른 CDR이지만, CDR 내에 단지 제한된 수의 아미노산 위치만이 항원 결합에 직접적으로 관련된다. CDR 내의 이러한 위치를 특이성 결정 잔기(SDR)라 칭한다. 본 명세서에서 고려되는 인간화된 BCMA CAR을 구축하기에 적합한 경쇄 CDR의 예시적인 예는 서열번호 1 내지 3에 제시된 CDR 서열을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 고려되는 인간화된 BCMA CAR을 구축하기에 적합한 중쇄 CDR의 예시적인 예는 서열번호 4 내지 6에 제시된 CDR 서열을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
"VH" 또는 "VH"에 대한 언급은 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭하며, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab 또는 다른 항체 단편의 것을 포함한다. "VL" 또는 "VL"에 대한 언급은 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭하며, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체, Fv, scFv, dsFv, Fab 또는 다른 항체 단편의 것을 포함한다.
"단클론성 항체"는 B 림프구의 단일 클론에 의해 또는 단일 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자로 형질감염된 세포에 의해 생산된 항체이다. 단클론성 항체는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어 골수종 세포와 면역 비장 세포와의 융합으로부터 혼성 항체-형성 세포를 제조함으로써 생산된다. 단클론성 항체는 인간화된 단클론성 항체를 포함한다.
"키메릭 항체"는 하나의 종, 예컨대 인간으로부터의 프레임워크 잔기, 및 또 다른 종, 예컨대 마우스로부터의 CDR(일반적으로 항원 결합을 부여함)을 갖는다. 특히 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 키메릭 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 항원-특이적인 결합 도메인을 포함한다.
"인간화된" 항체는 인간 프레임워크 영역 및 비-인간(예를 들어, 마우스, 래트 또는 합성) 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린이다. CDR을 제공하는 비-인간 면역글로불린을 "공여체"라 칭하며, 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린을 "억셉터"라 칭한다.
특별한 실시형태에서, 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 카멜 Ig(a 카멜리드 항체(VHH)), Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단쇄 Fv 항체("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 다이설파이드 안정화된 Fv 단백질("dsFv"), 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "카멜 Ig" 또는 "카멜리드 VHH"는 중쇄 항체의 가장 작은 공지된 항원-결합 단위를 지칭한다(Koch-Nolte, et al, FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)). "중쇄 항체" 또는 "카멜리드 항체"는 2개의 VH 도메인을 함유하고 경쇄는 없는 항체를 지칭한다(Riechmann L. et al, J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999); WO94/04678; WO94/25591; 미국 특허 6,005,079).
"면역글로불린 신규 항원 수용체"의 "IgNAR"은 하나의 가변 신규 항원 수용체(VNAR) 도메인 및 5개의 불변 신규 항원 수용체(CNAR) 도메인의 동종이량체로 이루어진 상어 면역 레퍼토리로부터의 항체 부류를 지칭한다. IgNAR은 가장 작은 공지된 면역글로불린-계 단백질 스캐폴드 중 일부를 나타내고 매우 안정성이며 효율적인 결합 특징을 갖는다. 고유 안정성은 (i) 뮤린 항체에서 발견되는 통상적인 항체 VH 및 VL 도메인에 비해 상당한 수의 하전되고 친수성인 표면 노출된 잔기를 나타내는 근원적인 Ig 스캐폴드; 및 (ii) 고리-간 다이설파이드 다리 및 고리-내 수소 결합의 패턴을 비롯한 상보성 결정 영역(CDR) 고리에서 구조적 특징의 안정화 모두에 기여할 수 있다.
항체의 파파인 절단은 소위 "Fab" 단편이라 칭하는 2개의 동일한 항원-결합 단편(각각 단일 항원-결합 부위를 가짐), 및 잔류 "Fc" 단편(이의 명칭은 쉽게 결정화하는 이의 능력을 반영함)을 생산한다. 펩신 처리는 2개의 항원-조합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 일 실시형태에서, 2-쇄 Fv 종은 빈틈없이 비-공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단쇄 Fv(scFv) 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인을, 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서의 경우와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩타이드 링커에 의해 공유 결합시킬 수 있다. 이러한 구성에서, 각 가변 도메인의 3개의 고가변 영역(HVR)은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 6개의 HVR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)조차, 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화성이기는 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하며 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 또한 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇몇 잔기의 추가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본 명세서에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 표시이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 힌지 시스테인이 그들 사이에 있는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
"다이아바디"라는 용어는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하며, 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 간에 짝지움을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 짝을 이루게 하여 2개의 항원-결합 부위를 생성시킨다. 다이아바디는 2가이거나 이중특이적일 수 있다. 다이아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 [Hollinger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 충분히 기술되어 있다. 트라이아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기술되어 있다.
"단일 도메인 항체" 또는 "sdAb" 또는 "나노바디"는 항체 중쇄의 가변 영역(VH 도메인) 또는 항체 경쇄의 가변 영역(VL 도메인)으로 이루어진 항체 단편을 지칭한다(Holt, L., et al, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490).
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄 및 어느 한 배향으로(예를 들어 VL-VH 또는 VH-VL) 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하며, 이는 scFv가 항원 결합에 목적하는 구조를 형성할 수 있게 한다. scFv에 대한 고찰을 위해서, 예를 들어 문헌[Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315]을 참고하기 바란다.
바람직한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 뮤린 scFv인 항원-특이적인 결합 도메인을 포함한다. 단쇄 항체를 목적하는 표적에 특이적인 하이브리도마의 V 영역 유전자로부터 클로닝할 수 있다. 그러한 하이브리도마의 생산은 통상적이게 된다. 가변 영역 중쇄(VH) 및 가변 영역 경쇄(VL)를 클로닝하는 데 사용될 수 있는 기술은 예를 들어 문헌[Orlandi et al., PNAS, 1989; 86: 3833- 3837]에 기술되어 있다.
특별한 실시형태에서, 항원-특이적인 결합 도메인은 인간 BCMA 폴리펩타이드와 결합하는 뮤린 scFv이다. 본 명세서에서 고려되는 BCMA CAR을 구축하기에 적합한 가변 중쇄의 예시적인 예는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 고려되는 BCMA CAR을 구축하기에 적합한 가변 경쇄의 예시적인 예는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 제공된 BCMA-특이적인 결합 도메인은 또한 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. 그러한 CDR은 경쇄의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 및 중쇄의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로부터 선택된 비인간 CDR 또는 변경된 비인간 CDR일 수 있다. 특정 실시형태에서, BCMA-특이적인 결합 도메인은 (a) 경쇄 CDRL1, 경쇄 CDRL2 및 경쇄 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 중쇄 CDRH1, 중쇄 CDRH2 및 중쇄 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
2. 링커
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은, 예를 들어 분자의 적합한 이격 및 입체구조를 위해 첨가된, 다양한 도메인들 사이의 링커 잔기를 포함할 수 있다. 특별한 실시형태에서 링커는 가변 영역 연결 서열이다. "가변 영역 연결 서열"은, VH 및 VL 도메인을 연결하고, 생성되는 폴리펩타이드가 동일한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체로서 동일한 표적 분자에 대해 특이적인 결합 친화성을 유지하도록 2개의 하위-결합 도메인의 상호작용과 상용성인 스페이서 기능을 제공하는 아미노산 서열이다. 본 명세서에서 고려되는 CAR은 1, 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 초과의 링커를 포함할 수 있다. 특별한 실시형태에서, 링커의 길이는 약 1 내지 약 25 아미노산, 약 5 내지 약 20 아미노산, 또는 약 10 내지 약 20 아미노산, 또는 임의의 사이 길이의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 그 초과의 아미노산 길이이다.
링커의 예시적인 예는 글리신 중합체 (G)n; 글리신-세린 중합체(G1-5S1-5)n(여기서 n은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5의 정수임); 글리신-알라닌 중합체; 알라닌-세린 중합체; 및 관련 기술 분야에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 비교적 구조화되지 않으며, 따라서 본 명세서에 기술된 CAR과 같은 융합 단백질의 도메인들간의 중립 밧줄(neutral tether)로서 작용할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다 상당히 더 파이-프사이 공간에 접근하며 보다 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다(문헌[Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)] 참고). 통상의 기술자는 특별한 실시형태에서 CAR의 설계가 전부 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있어서, 링커가 가요성 링커뿐만 아니라 목적하는 CAR 구조를 제공하도록 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있음을 인식할 것이다.
다른 예시적인 링커는 하기 아미노산 서열을 포함하지만 이들에 제한되는 것은 아니다: GGG; DGGGS(서열번호 12); TGEKP(서열번호 13)(예를 들어, 문헌[Liu et al., PNAS 5525-5530(1997)] 참고); GGRR(서열번호 14)(상기 문헌[Pomerantz et al. 1995]);(GGGGS)n(여기서 = 1, 2, 3, 4 또는 5임)(서열번호 15)(Kim et al., PNAS 93, 1156-1160(1996.); EGKSSGSGSESKVD(서열번호 16)(Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 17)(Bird et al., 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS(서열번호 18); LRQRDGERP(서열번호 19); LRQKDGGGSERP(서열번호 20); LRQKd(GGGS)2 ERP(서열번호21). 대안적으로, 가요성 링커를 DNA-결합 부위 및 펩타이드 자체 둘 모두를 모델링할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 사용하여(Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994)) 또는 파지 디스플레이 방법에 의해 합리적으로 설계할 수 있다. 일 실시형태에서, 링커는 하기의 아미노산 서열을 포함한다: GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열번호 22)(Cooper et al., Blood, 101(4): 1637-1644(2003)).
3. 스페이서 도메인
특별한 실시형태에서, CAR의 결합 도메인에 이어서 하나 이상의 "스페이서 도메인"(항원 결합 도메인을 이펙터 세포 표면으로부터 멀리 이동시켜 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하는 영역을 지칭함)이 있다(Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419). 힌지 도메인은 천연, 합성, 반-합성, 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, 스페이서 도메인은 하나 이상의 중쇄 불변 영역, 예를 들어 CH2 및 CH3을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 면역글로불린의 일부이다. 스페이서 도메인은 천연 발생 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 스페이서 도메인은 IgG1 또는 IgG4의 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
4. 힌지 도메인
CAR의 결합 도메인에 이어서 일반적으로 하나 이상의 "힌지 도메인"(항원 결합 도메인을 이펙터 세포 표면으로부터 멀리 위치시켜 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하는 역할을 함)이 있다. CAR은 일반적으로 결합 도메인과 막관통 도메인(TM) 사이에 하나 이상의 힌지 도메인을 포함한다. 힌지 도메인은 천연, 합성, 반-합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 힌지 도메인은 천연 발생 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
"변경된 힌지 영역"은 (a) 30% 이하의 아미노산 변화(예를 들어 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하의 아미노산 치환 또는 결실)를 갖는 천연 발생 힌지 영역, (b) 30% 이하의 아미노산 변화(예를 들어 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하의 아미노산 치환 또는 결실)를 갖는, 적어도 10개의 아미노산(예를 들어 적어도 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산) 길이인 천연 발생 힌지 영역의 일부, 또는 (c) 코어 힌지 영역(4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 또는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 길이일 수 있음)을 포함하는 천연 힌지 발생 영역의 일부를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 천연 발생 면역글로불린 힌지 영역 중 하나 이상의 시스테인 잔기를 하나 이상의 다른 아미노산 잔기(예를 들어 하나 이상의 세린 잔기)에 의해 치환시킬 수 있다. 변경된 면역글로불린 힌지 영역은 대안적으로는 또는 추가로 또 다른 아미노산 잔기(예를 들어 세린 잔기)에 의해 치환된 야생형 면역글로불린 힌지 영역의 프롤린 잔기를 가질 수 있다.
본 명세서에 기술된 CAR에 사용하기에 적합한 다른 예시적인 힌지 도메인은 1형 막 단백질의 세포외 영역으로부터 유래된 힌지 영역, 예를 들어 CD8α, CD4, CD28 및 CD7을 포함하며, 이들은 이러한 분자로부터의 야생형 힌지 영역이거나 변경될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 영역을 포함한다.
5. 막관통(TM) 도메인
"막관통 도메인"은, 세포외 결합 부분과 세포내 신호전달 도메인을 융합하며 CAR을 면역 이펙터 세포의 혈장 막에 고정시키는 CAR의 부분이다. TM 도메인은 천연, 합성, 반-합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. TM 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154, 및 PD1로부터 유래될 수 있다(즉 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다). 특별한 실시형태에서, TM 도메인은 합성적이며 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 우세하게 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 CD8α로부터 유래된 TM 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 CD8α로부터 유래된 TM 도메인과, CAR의 TM 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커를 포함한다. 글리신-세린계 링커가 특히 적합한 링커를 제공한다.
6. 세포내 신호전달 도메인
특별한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. "세포내 신호전달 도메인"은 인간 BCMA 폴리펩타이드에 대한 유효한 BCMA CAR은 결합의 메세지를 면역 이펙터 세포의 내부로 전달하여 이펙터 세포 기능, 예를 들어 CAR-결합된 표적 세포로의 세포독성 인자의 방출 또는 세포외 CAR 도메인에 대한 항원 결합으로 유도된 다른 세포 반응을 비롯한, 활성화, 사이토카인 생산, 증식 및 세포독성 활성화를 유도하는데 관여하는 CAR의 부분을 지칭한다.
"이펙터 기능"이라는 용어는 면역 이펙터 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. T 세포의 이펙터 기능은 예를 들어, 사이토카인의 분비를 비롯한 세포용해 활성이거나 또는 활성을 도울 수 있다. 따라서, "세포내 신호전달 도메인"이라는 용어는 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 전문화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질 부분을 지칭한다. 대개는 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 다수의 경우에 전체 도메인을 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 경우, 그러한 절단된 부분을, 그것이 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 전체 도메인 대신에 사용할 수 있다. 세포내 신호전달 도메인이라는 용어는 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함함을 의미한다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하며 2차적인 또는 공-자극 신호가 또한 필요한 것으로 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 2개의 구별되는 부류의 세포내 신호전달 도메인, 즉 TCR(예를 들어 TCR/CD3 복합체)을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 주요 신호전달 도메인 및 항원-독립적인 방식으로 2차적인 또는 공-자극 신호를 제공하는 작용을 하는 공-자극 신호전달 도메인에 의해 매개된다고 할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 하나 이상의 "공-자극 신호전달 도메인" 및 "주요 신호전달 도메인"을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
주요 신호전달 도메인은 TCR 복합체의 1차 활성화를 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 주요 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-계 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특히 유용한 주요 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예시적인 예는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 주요 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 주요 신호전달 및 공-자극 신호전달 도메인을 임의의 순서로 직렬로 막관통 도메인의 카복실 말단에 연결시킬 수 있다.
본 명세서에서 고려되는 CAR은 CAR 수용체를 발현하는 T 세포의 효능 및 확장을 향상시키기 위해 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "공-자극 신호전달 도메인" 또는 "공-자극 도메인"이라는 용어는 공-자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 지칭한다. 공-자극 분자는 항원에 결합 시 T 림프구의 효율적인 활성화 및 기능에 필요한 제2 신호를 제공하는 항원 수용체 또는 Fc 수용체 이외의 세포 표면 분자이다. 그러한 공-자극 분자의 예시적인 예는 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, 및 ZAP70을 포함한다. 일 실시형태에서, CAR은 CD28, CD137 및 CD134, 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, CAR은 CD28 및 CD137 공-자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
추가의 또 다른 실시형태에서, CAR은 CD28 및 CD134 공-자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 CD137 및 CD134 공-자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특별한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR은 B 세포 상에서 발현된 BCMA 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드와 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154, 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된 막관통 도메인; 및 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 공-자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터의 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드와 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3, IgG4 힌지/CH2/CH3, 및 CD8α 힌지로 이루어진 군으로부터 선택된 힌지 도메인; T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154, 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된 막관통 도메인; CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 공-자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터의 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드와 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3, IgG4 힌지/CH2/CH3, 및 CD8α 힌지로 이루어진 군으로부터 선택된 힌지 도메인; T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154, 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된 막관통 도메인; TM 도메인을 CAR의 세포내 신호전달 도메인에 연결하는 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커; 및 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 공-자극 분자로부터의 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터의 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특별한 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드와 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; IgG1 힌지/CH2/CH3 폴리펩타이드 및 CD8α 폴리펩타이드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10개의 아미노산의 폴리펩타이드 링커를 포함하는 CD8α 막관통 도메인; CD137 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특별한 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드와 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; CD8α 폴리펩타이드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10개의 아미노산의 폴리펩타이드 링커를 포함하는 CD8α 막관통 도메인; CD134 세포내 공-자극신호전달 도메인; 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
특별한 실시형태에서, CAR은 BCMA 폴리펩타이드와 결합하는 뮤린 항-BCMA scFv; CD8α 폴리펩타이드를 포함하는 힌지 도메인; 약 3 내지 약 10개의 아미노산의 폴리펩타이드 링커를 포함하는 CD8α 막관통 도메인; CD28 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 CD3ζ 주요 신호전달 도메인을 포함한다.
더욱이, 본 명세서에서 고려되는 CAR의 설계는, 변형되지 않은 T 세포 또는 다른 CAR을 발현하도록 변형된 T 세포에 비해서 CAR을 발현하는 T 세포에서 개선된 확장, 장기간 잔류성, 및 허용되는 세포독성 특성을 가능하게 한다.
D. 폴리펩타이드
본 발명은 부분적으로 CAR 폴리펩타이드 및 이의 단편, 이를 포함하는 세포 및 조성물, 및 폴리펩타이드를 발현하는 벡터를 고려한다. 바람직한 실시형태에서, 서열번호 9에 제시된 바와 같은 하나 이상의 CAR을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
"폴리펩타이드", "폴리펩타이드 단편", "펩타이드" 및 "단백질"은 달리 명시되지 않는 한 상호 교환 가능하게, 통상적인 의미, 즉 아미노산의 서열로서 통상적인 의미에 따른다. 폴리펩타이드는 특정 길이로 제한되지 않고, 예를 들어 이것은 전장 단백질 서열 또는 전장 단백질의 단편을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드의 번역-후 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등뿐만 아니라 관련 기술 분야에 공지된 다른 변형(천연 및 비-천연 발생 모두)을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩타이드는 단백질의 전달을 번역과 동시에 또는 번역-후에 지시하는, 단백질의 N-말단 단부의 신호(또는 리더) 서열을 포함한다. 본 명세서에 개시된 CAR에 유용한 적합한 신호 서열의 예시적인 예는 IgG1 중쇄 신호 서열 및 CD8α 신호 서열을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 폴리펩타이드는 다양한 널리 공지된 재조합 및/또는 합성 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조될 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 폴리펩타이드는 본 개시내용의 CAR, 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 CAR의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 아미노산에 대한 부가, 및/또는 아미노산의 치환을 갖는 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "단리된 펩타이드" 또는 "단리된 폴리펩타이드" 등은 세포 환경으로부터, 그리고 세포의 다른 성분과의 회합으로부터의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자의 시험관내 단리 및/또는 정제를 지칭하고, 즉 이것은 생체내 물질과 상당히 회합되지는 않는다. 유사하게, "단리된 세포"는 생체내 조직 또는 기관으로부터 수득되었고 세포외 매트릭스가 실질적으로 없는 세포를 지칭한다.
폴리펩타이드는 "폴리펩타이드 변이체"를 포함한다. 폴리펩타이드 변이체는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 있어서 천연 발생 폴리펩타이드와 상이할 수 있다. 그러한 변이체는 천연 발생이거나, 또는 예를 들어 상기 폴리펩타이드 서열 중 하나 이상을 변형시킴으로써 합성적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 특별한 실시형태에서, 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 CAR 폴리펩타이드의 결합 도메인, 힌지, TM 도메인, 공-자극 신호전달 도메인 또는 주요 신호전달 도메인에 도입함으로써 CAR의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩타이드는 폴리펩타이드에 적어도 약 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 아미노산 일치성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
폴리펩타이드는 "폴리펩타이드 단편"을 포함한다. 폴리펩타이드 단편은 천연-발생 또는 재조합-생산된 폴리펩타이드의 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실 및/또는 내부 결실 또는 치환을 갖는, 단량체이거나 다량체일 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 단편은 적어도 5 내지 약 500개의 아미노산 길이의 아미노산 쇄를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단편은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450개의 아미노산 길이임을 인지할 것이다. 특히 유용한 폴리펩타이드 단편은 항체의 항원-결합 도메인 또는 단편을 비롯한 기능성 도메인을 포함한다. 뮤린 항-BCMA 항체의 경우에, 유용한 단편은 CDR 영역, 중쇄 또는 경쇄의 CDR3 영역; 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역; 2개의 CDR을 포함하는 항체 쇄 또는 가변 영역의 일부 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
폴리펩타이드는 또한 폴리펩타이드의 합성, 정제 또는 식별의 용이성을 위해서(예를 들어 폴리-His) 또는 폴리펩타이드의 고체 지지체에 대한 결합을 향상시키기 위해서 링커 또는 다른 서열에 인-프레임 융합되거나 또는 접합될 수 있다.
상기에서 주목되는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 아미노산 치환, 결실, 절단 및 삽입을 비롯한 다양한 방식으로 변경될 수 있다. 그러한 조작 방법은 일반적으로 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체는 DNA의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발(mutagenesis) 및 뉴클레오타이드 서열 변경을 위한 방법이 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492)], [Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382)], 미 국 특허 4,873,192, 문헌[Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)] 및 이들에 인용된 참고 문헌을 참고하기 바란다. 관심 단백질의 생물 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 관한 지침은 문헌[Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.]의 모델에서 찾아볼 수 있다.
특정 실시형태에서, 변이체는 보존적 치환을 함유할 것이다. "보존적 치환"은 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산에 대해 치환되는 것이어서, 펩타이드 화학 분야의 통상의 기술자는 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수치료 성질(hydropathic nature)이 실질적으로 변하지 않을 것이라고 예견할 것이다. 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 구조 중에서 행해질 수 있으며 바람직한 특징을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩타이드를 암호화하는 기능성 분자를 여전히 수득할 수 있다. 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경시켜 본 발명의 동등한, 또는 심지어 개선된 변이체 폴리펩타이드를 생성하고자 하는 경우, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 예를 들어 표 1에 따른 암호화 DNA 서열의 코돈 중 하나 이상을 변화시킬 수 있다.
생물 활성을 없애지 않으면서 치환, 삽입 또는 결실시킬 수 있는 아미노산 잔기를 결정하는 지침은 관련 기술 분야에 널리 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 드나스타(DNASTAR)(상표명) 소프트웨어를 사용하여 찾을 수 있다. 바람직하게, 본 명세서에 개시된 단백질 변이체에서의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전되거나 하전되지 않은 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 측쇄와 관련된 아미노산 과 중 하나의 치환을 포함한다. 천연 발생 아미노산은 일반적으로 4개의 과로 분류된다: 산성(아스파테이트, 글루타메이트), 염기성(라이신, 아르지닌, 히스티딘), 비-극성(알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 하전되지 않은 극성(글리신, 아스파라진, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로서 공동으로 분류된다. 펩타이드 또는 단백질에서, 아미노산의 적합한 보존적 치환은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 일반적으로, 생성된 분자의 생물 활성을 변경하지 않고 행해질 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 일반적으로 폴리펩타이드의 필수적이지 않은 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물 활성을 실질적으로 변경하지 않음을 인식한다(예를 들어 문헌[Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224] 참고). 예시적인 보존적 치환은 미국 가특허 출원 61/241,647에 기재되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
그러한 변화의 생성에서, 아미노산의 수치료 지수를 고려할 수 있다. 단백질에 대한 상호작용성 생물학적 기능의 부여에 있어서 아미노산 수치료 지수의 중요성은 관련 기술 분야에서 일반적으로 이해된다(본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Kyte and Doolittle, 1982]). 각각의 아미노산은 이의 소수성 및 전하 특징을 기준으로 수치료 지수가 할당되었다(Kyte and Doolittle, 1982). 이러한 값은 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스테인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라진(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)이다.
특정 아미노산을 유사한 수치료 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환시킬 수 있고, 여전히 유사한 생물 활성을 갖는 단백질이 생성될 수 있고, 즉 여전히 생물학적 기능이 동등한 단백질을 수득할 수 있음이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 그러한 변화의 생성에서, 수치료 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내의 경우가 특별하게 바람직하고, ±0.5 이내의 경우가 훨씬 더 특별하게 바람직하다. 유사한 아미노산의 치환이 친수성을 기준으로 유효하게 이루어질 수 있음이 또한 관련 기술 분야에서 이해된다.
미국 특허 4,554,101에 상술된 바와 같이, 하기의 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되어있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라진(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산을 유사한 친수성 값을 갖는 또 다른것으로 치환시킬 수 있고, 여전히 생물학적으로 동등한, 및 특히 면역학적으로 동등한 단백질을 수득할 수 있는 것으로 이해된다. 그러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 특별히 바람직하고, ±0.5 이내인 것이 보다 더 특별하게 바람직하다.
상기에 개략된 바와 같이, 아미노산 치환은 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들어 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초할 수 있다.
폴리펩타이드 변이체는 글리코실화된 형태, 다른 분자와의 집합적인 접합체, 및 관련되지 않은 화학적 모이어티(예를 들어 페길화된 분자)와의 공유 접합체를 추가로 포함한다. 공유 변이체는 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 아미노산 쇄 중에서 또는 N- 또는 C-말단 잔기에서 발견되는 기에 작용기를 연결함으로써 제조될 수 있다. 변이체는 또한 대립유전자 변이체, 종 변이체, 및 뮤테인을 포함한다. 단백질의 기능 활성에 영향을 미치지 않는 영역의 절단 또는 결실이 또한 변이체이다.
일 실시형태에서, 2개 이상의 폴리펩타이드의 발현을 원하는 경우, 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 본 명세서의 다른 곳에 논의된 바와 같은 IRES 서열에 의해 분리시킬 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 2개 이상의 폴리펩타이드를 하나 이상의 자가-절단 폴리펩타이드 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현시킬 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드 및 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 CAR이 제공된다. 융합 폴리펩타이드 및 융합 단백질은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 초과의 폴리펩타이드 분절을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 융합 폴리펩타이드는 전형적으로 C-말단이 N-말단에 연결되지만, 또한 그것은 C-말단이 C-말단에, N-말단이 N-말단에, 또는 N-말단이 C-말단에 연결될 수 있다. 융합 단백질의 폴리펩타이드는 임의의 순서 또는 명시된 순서로 존재할 수 있다. 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 또한 융합 폴리펩타이드의 목적하는 전사 활성이 보존되는 한, 보존적으로 변형된 변이체, 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체, 하위서열, 및 종간 상동체를 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드를 화학적 합성 방법에 의해서 또는 2개의 모이어티 간의 화학적 결합에 의해서 생산하거나 또는 일반적으로 다른 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 융합 폴리펩타이드를 포함하는 결찰된(ligated) DNA 서열을 본 명세서의 다른 곳에 논의된 바와 같은 적합한 전사 또는 번역 제어 요소에 작동 가능하게 연결시킨다.
일 실시형태에서, 융합 짝은 단백질이 네이티브 재조합 단백질보다 더 높은 수준으로 발현되는 것을 돕는 서열(발현 인핸서)을 포함한다. 다른 융합 짝은 단백질의 용해도를 증가시키거나 또는 단백질이 목적하는 세포내 구획에 표적화될 수 있게 하거나 또는 세포막을 통한 융합 단백질의 수송을 촉진하도록 선택될 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 본 명세서에 기술된 각각의 폴리펩타이드 도메인들 사이에 폴리펩타이드 절단 신호를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 부위를 임의의 링커 펩타이드 서열 내에 넣을 수 있다. 예시적인 폴리펩타이드 절단 신호는 폴리펩타이드 절단 인식 부위, 예를 들어 프로테아제 절단 부위, 뉴클레아제 절단 부위(예를 들어 드문 제한 효소 인식 부위, 자가-절단 리보자임 인식 부위), 및 자가-절단 바이러스 올리고펩타이드(문헌[deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26]을 참고)를 포함한다.
적합한 프로테아제 절단 부위 및 자가-절단 펩타이드는 통상의 기술자에게 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722]; [Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594] 참고). 예시적인 프로테아제 절단 부위는 포티바이러스 NIa 프로테아제(예를 들어 담배 식각 (tobacco etch) 바이러스 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1(P35) 프로테아제, 비요바 이러스(byovirus) NIa 프로테아제, 비요바이러스 RNA-2-암호화된 프로테아제, 앱토바이러스(aphthovirus) L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 피코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스(nepovirus) 24K 프로테아제, RTSV(벼 해충 구상 바이러스(rice tungro spherical virus)) 3C-형 프로테아제, PYVF(파스닙 황색 얼룩 바이러스) 3C-형 프로테아제, 헤파린, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로카이나제의 절단 부위를 포함하지만 이드로 제한되는 것은 아니다. 일 실시형태에서 TEV(담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단 부위, 예를 들어, EXXYXQ(G/S)(서열번호 23), 예를 들어, ENLYFQG(서열번호 24) 및 ENLYFQS(서열번호 25)(여기서 X는 임의의 아미노산을 나타냄)(Q와 G 또는 Q와 S 사이에 TEV에 의한 절단이 발생함)가 이의 높은 절단 엄격성으로 인해서 바람직하다.
특별한 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 포티바이러스 및 카디오바이러스 2A 펩타이드, FMDV(구제역 바이러스), 말 A형 비염 바이러스, 해충 고착(Thosea asigna) 바이러스 및 돼지 테스코바이러스로부터 수득된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 자가-절단 폴리펩타이드 부위는 2A 또는 2A-유사 부위, 서열 또는 도메인을 포함한다(Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041).
바람직한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 폴리펩타이드는 CAR 폴리펩타이드를 포함한다.
E. 폴리뉴클레오타이드
바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 서열번호 10이 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"이라는 용어는 메신저 RNA(mRNA), RNA, 게놈 RNA(gRNA), 플러스 가닥 RNA(RNA(+)), 마이너스 가닥 RNA(RNA(-)), 게놈 DNA(gDNA), 상보성 DNA(cDNA) 또는 재조합 DNA를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 및 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서(예를 들어 서열 목록을 참고)에 기술된 참조 서열 중 임의의 것에 대해 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 변이체를 포함하며, 전형적으로 여기서 변이체는 참조 서열의 적어도 하나의 생물 활성을 유지한다. 다양한 예시적인 실시형태에서, 본 발명은, 부분적으로, 발현 벡터, 바이러스 벡터, 및 전달 플라스미드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 포함하는 조성물 및 세포를 고려한다.
특별한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드의 적어도 약 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 1000, 1250, 1500, 1750, 또는 2000 또는 그 초과의 연속적인 아미노산 잔기뿐만 아니라 모든 중간 길이의 아미노산 잔기를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이와 관련하여 "중간 길이"는 인용된 값들 사이의 임의의 길이, 예를 들어 6, 7, 8, 9 등, 101, 102, 103 등; 151, 152, 153 등; 201, 202, 203 등을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오타이드 변이체" 및 "변이체" 등의 용어는 참조 폴리뉴클레오타이드 서열과 실질적인 서열 일치성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드 또는 본 명세서에서 이하에 정의되는 엄격한 조건하에서 참조 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 이들 용어는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 참조 폴리뉴클레오타이드에 비해 부가 또는 결실되었거나 또는 상이한 뉴클레오타이드로 대체된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 부가, 결실 및 치환을 포함한 특정 변경을 참조 폴리뉴클레오타이드에 대해 수행할 수 있으며, 이에 의해서 변경된 폴리뉴클레오타이드가 참조 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 기능 또는 활성을 유지함은 관련 기술 분야에서 충분히 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "서열 일치성" 또는 예를 들어 "에 50% 일치하는 서열"을 포함하는 인용은 서열이 비교창에 걸쳐 뉴클레오타이드 하나하나를 기준으로 또는 아미노산 하나하나를 기준으로 일치하는 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 일치성 백분율"을, 2개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교창에 걸쳐 비교하고, 일치하는 핵산 염기(예를 들어 A, T, C, G, I) 또는 일치하는 아미노산 잔기(예를 들어 Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 두 서열 모두에 존재하는 위치들의 수를 측정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교창 중의 전체 위치의 수(즉 창 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 일치성의 비율을 산출함으로써 계산할 수 있다. 본 명세서에 기술된 참조 서열 중 임의의 것에 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 포함하며, 전형적으로 여기서 폴리펩타이드 변이체는 참조 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물 활성을 유지한다.
2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 간의 서열 관계를 기술하는데 사용되는 용어는 "참조 서열", "비교창", "서열 일치성", "서열 일치성의 백분율" 및 "실질적인 일치성"을 포함한다. "참조 서열"은 적어도 12, 그러나 흔히는 15 내지 18 및 종종 적어도 25개의, 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기를 포함한 단량체 단위의 길이이다. 2개의 폴리뉴클레오타이드는 각각 (1) 두 폴리뉴클레오타이드 간에 유사한 서열(즉 완전한 폴리뉴클레오타이드 서열의 단지 일부), 및 (2) 두 폴리뉴클레오타이드 간에 상이한 서열을 포함할 수 있기 때문에, 두(또는 그 초과) 폴리뉴클레오타이드 간의 서열 비교를 전형적으로는 두 폴리뉴클레오타이드의 서열들을 "비교창"에 걸쳐 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 식별하고 비교함으로써 수행한다. "비교창"은 적어도 6개의 연속적인 위치, 대개는 약 50 내지 약 100개, 보다 대개는 약 100 내지 약 150개 위치의 개념상 분절을 지칭하며 여기서 두 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 하나의 서열을 동일한 수의 연속적인 위치의 참조 서열과 비교한다. 비교창은 두 서열의 최적의 정렬을 위해서 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비해 약 20% 이하의 부가 또는 결실(즉 갭)을 포함할 수 있다. 비교창의 정렬을 위한 서열의 최적의 정렬을, 컴퓨터화된 연산의 실행(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 릴리스 7.0(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0)(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 사이언스 드라이브 매디슨 575 소재)에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해서, 또는 선택된 다양한 방법 중 임의의 것에 의해 발생한 검사 및 최선의 정렬(즉 상기 비교창에 걸쳐 가장 높은 상동성 비율을 생성시키는)에 의해서 수행할 수 있다. 또한 예를 들어 문헌[Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389]에 개시된 바와 같은 프로그램들의 BLAST 부류를 참고할 수 있다. 서열 분석에 대한 상세한 논의는 문헌[Unit 19.3 of Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15]에서 찾아볼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 천연-발생 상태에서 인접한 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 일반적으로 단편에 인접된 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다. "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 또한, 자연에서 존재하지 않고 인공으로 제조된 상보성 DNA(cDNA), 재조합 DNA 또는 다른 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
폴리뉴클레오타이드의 배향을 기술하는 용어는 5'(일반적으로 유리 포스페이트기를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 단부) 및 3'(일반적으로 유리 하이드록실(OH)기를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 단부)를 포함하다. 폴리뉴클레오타이드 서열을 5'에서 3' 배향 또는 3'에서 5' 배향으로 어노테이션할 수 있다. DNA 및 mRNA의 경우, 5'에서 3' 가닥은 이의 서열이 프리메신저(premRNA)[RNA에서 우라실(U) 제외, DNA에서 티민(T) 대신]의 서열에 일치하기 때문에 "센스", "플러스", 또는 "암호화" 가닥으로 표시된다. DNA 및 mRNA의 경우, RNA 폴리머라제에 의해 전사되는 가닥인 상보성 3'에서 5' 가닥은 "템플레이트", "안티센스", "마이너스" 또는 "비-암호화" 가닥으로서 지정된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "역 배향"이라는 용어는 3'에서 5' 배향으로 작성된 5'에서 3' 서열 또는 5'에서 3' 배향으로 작성된 3'에서 5' 서열을 지칭한다.
"상보적인" 및 "상보성"이라는 용어는 염기-짝지움 규칙과 관련된 폴리뉴클레오타이드(즉 뉴클레오타이드의 서열)를 지칭한다. 예를 들어 DNA 서열 5' A G T C A T G 3'의 상보성 가닥은 3' T C A G T A C 5'이다. 나중의 서열은 종종 좌측에 5' 단부 및 우측에 3' 단부를 갖는 역 보체, 5' C A T G A C T 3'로서 작성된다. 역 보체와 동등한 서열을 회문성 서열이라고 한다. 상보성은 "부분적"일 수 있으며, 여기서 핵산 염기의 단지 일부만이 염기쌍 규칙에 따라 매칭된다. 또는, 핵산들 간에 "완전한" 또는 "전체" 상보성이 존재할 수 있다.
더욱이, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는, 유전자 코드 축퇴성의 결과로서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 단편을 암호화하는 다수의 뉴클레오타이드 서열이 존재함을 인식할 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드 중 일부는 임의의 네이티브 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 최소의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용의 차이로 인해 변하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 인간 및/또는 영장류 코돈 선택에 대해서 최적화된 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 의해 구체적으로 고려된다. 더욱이, 본 명세서에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자를 또한 사용할 수 있다. 대립유전자는 뉴클레오타이드의 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경되는 내인성 유전자이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "핵산 카세트"라는 용어는 RNA, 및 후속으로 단백질을 발현할 수 있는 벡터 내의 유전자 서열을 지칭한다. 핵산 카세트는 관심 유전자, 예를 들어 CAR을 함유한다. 핵산 카세트는 벡터 내에, 카세트 중의 핵산이 RNA로 전사될 수 있고, 필요한 경우, 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역되며, 형질전환된 세포에서 활성에 필요한 적절한 번역-후 변형을 겪고, 적절한 세포내 구획에의 표적화 또는 세포외 구획 내로의 분비에 의해 생물 활성에 적절한 구획으로 전좌될 수 있도록 위치적으로 및 서열에 의해 배향된다. 바람직하게, 카세트는 벡터에 바로 삽입되기에 적합한 3' 및 5' 단부를 가지며, 예를 들어 이것은 각 단부에 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 핵산 카세트는 B 세포 악성종양을 치료하는 데 사용되는 키메릭 항원 수용체의 서열을 함유한다. 카세트를 제거하여 단일 유닛으로서 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 삽입할 수 있다.
특별한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "관심 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 발현시키고자 하는 발현 벡터 내로 삽입된, 폴리펩타이드(즉 관심 폴리펩타이드)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 벡터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 관심 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 관심 폴리뉴클레오타이드는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 치료 효과를 제공하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 관심 폴리뉴클레오타이드, 및 그로부터 암호화된 폴리펩타이드는 야생형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 이의 기능상 변이체 및 단편 둘 모두를 포함한다. 특별한 실시형태에서, 기능상 변이체는 상응하는 야생형 참조 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열에 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 일치성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 기능상 변이체 또는 단편은 상응하는 야생형 폴리펩타이드의 생물 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%를 갖는다.
일 실시형태에서, 관심 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 암호화하지 않고 miRNA, siRNA, 또는 shRNA, 리보자임, 또는 다른 억제성 RNA를 전사하는 템플레이트로서 작용한다. 다양한 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 CAR을 암호화하는 관심 폴리뉴클레오타이드 및 siRNA, miRNA, shRNA 및 리보자임을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 억제성 핵산 서열을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 추가적인 관심 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "siRNA" 또는 "짧은 간섭 RNA"라는 용어는 동물에서 서열-특이적인 전사후 유전자 사일런싱, 번역 억제, 전사 억제 또는 후성적 RNAi의 과정을 매개하는 짧은 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다([Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33]; [Fire et al., 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951]; [Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13, 139-141]; 및 [Strauss, 1999, Science, 286, 886]). 특정 실시형태에서, siRNA는 동일한 수의 뉴클레오사이드를 갖는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하지만; 제1 및 제2 가닥은 제1 및 제2 가닥 상의 2개의 말단 뉴클레오사이드가 상보성 가닥 상의 잔기와 짝을 이루지 않도록 상쇄된다. 특정 예에서, 짝을 이루지 않은 2개의 뉴클레오사이드는 티미딘 잔기이다. siRNA는 siRNA 또는 이의 단편이 표적 유전자의 하향 조절을 매개할 수 있도록, 표적 유전자에 충분한 상동성을 갖는 영역을 포함하고 뉴클레오타이드에 관하여 충분한 길이를 가져야 한다. 따라서, siRNA는 표적 RNA에 적어도 부분적으로 상보성인 영역을 포함한다. siRNA와 표적 간에 완벽한 상보성이 존재할 필요는 없지만, siRNA 또는 이의 절단 생산물이 서열 특이성 사일런싱을, 예를 들어 표적 RNA의 RNAi 절단에 의해 지시할 수 있기에 충분한 상응성이 존재해야 한다. 표적 가닥과의 상보성, 또는 가닥과의 상동성 정도가 안티센스 가닥에서 가장 중요하다. 특히 안티센스 가닥에서 완벽한 상보성이 종종 요구되지만, 일부 실시형태는 표적 RNA에 관하여 하나 이상, 바람직하게는 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 또는 더 적은 미스매치(mismatch)를 포함한다. 미스매치는 말단 영역에서 가장 허용되며, 존재하는 경우 바람직하게는 말단 영역 또는 영역들, 예를 들어 5' 및/또는 3' 말단의 6, 5, 4 또는 3개 뉴클레오타이드 내에서 허용된다. 센스 가닥은 단지 안티센스 가닥과, 분자의 전체 이중-가닥 특징을 유지시키기에 충분한 상보성 만이 필요하다.
또한, siRNA는 변형되거나 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함할 수 있다. siRNA의 단일 가닥 영역은 변형되거나 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함할 수 있고, 예를 들어 헤어핀 구조의 짝없는 영역 또는 영역들, 예를 들어 2개의 상보성 영역들을 결합시키는 영역이 변형 또는 뉴클레오사이드 유사체를 가질 수 있다. siRNA의 하나 이상의 3'- 또는 5'-말단을, 예를 들어 엑소뉴클레아제에 대해 안정화시키는, 또는 안티센스 siRNA제가 RISC 내로 진입하는 것을 촉진시키는 변형이 또한 유용하다. 변형은 C3(또는 C6, C7, C12) 아미노 링커, 티올 링커, 카복실 링커, 비-뉴클레오타이드 스페이서(C3, C6, C9, C12, 무염기성, 트라이에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜), 포스포른아미다이트이고 또 다른 DMT-보호된 하이드록실기를 갖는 특수 비오틴 또는 플루오레세인 시약을 포함하여, RNA 합성 동안 다수의 커플링을 허용할 수 있다. siRNA의 각 가닥은 30, 25, 24, 23, 22, 21 또는 20개의 뉴클레오타이드 이하의 길이일 수 있다. 가닥은 바람직하게는 적어도 19개의 뉴클레오타이드 길이이다. 예를 들어, 각각의 가닥은 21 내지 25 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 바람직한 siRNA는 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역, 및 2 내지 3개의 뉴클레오타이드의 하나 이상의 오버행(overhang), 바람직하게는 2 내지 3개의 뉴클레오타이드의 하나 또는 2개의 3' 오버행을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "miRNA" 또는 "마이크로RNA"라는 용어는 전형적으로, 프리-miRNA로서 공지된 약 70개의 뉴클레오타이드 폴드백(foldback) RNA 전구체 구조로부터 절제된, 20 내지 22 뉴클레오타이드의 작은 비-암호화 RNA를 지칭한다. miRNA는 이의 표적들을 miRNA와 표적 간의 상보성 정도에 따라 2가지 방식 중 하나로 음으로 조절한다. 먼저, 단백질-암호화 mRNA 서열에 완벽한 또는 거의 완벽한 상보성으로 결합하는 miRNA는 RNA-매개된 간섭(RNAi) 경로를 유도한다. mRNA 표적의 3' 번역되지 않은 영역(UTR) 내 불완전한 상보성 부위에 결합함으로써 조절 효과를 발휘하는 miRNA는 표적-유전자 발현을 전사-후에, 명백하게 번역 수준에서, RNAi 경로에 사용되는 것과 유사하거나 또는 어쩌면 동일한 RISC 복합체를 통해 억제한다. 번역 제어와 일관되게, 이러한 기전을 사용하는 miRNA는 이의 표적 유전자의 단백질 수준을 감소시키지만, 유전자의 mRNA 수준은 단지 최소로 영향을 받는다. miRNA는 천연 miRNA뿐만 아니라 임의의 mRNA 서열을 특이적으로 표적화할 수 있는 인공적으로 설계된 miRNA 모두를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 통상의 기술자는 인간 miRNA(예를 들어 miR-30 또는 miR-21) 주 전사물로서 발현된 짧은 헤어핀 RNA 구축물을 설계할 수 있다. 이러한 설계는 헤어핀 구축물에 드로샤(Drosha) 가공 부위를 더하며 이는 녹다운 효율을 크게 증가시키는 것으로 나타났다(Pusch et al., 2004). 헤어핀 줄기는 22-nt의 dsRNA(예를 들어 안티센스는 목적하는 표적에 완벽한 상보성을 가짐) 및 인간 miR로부터의 15 내지 19-nt 고리로 이루어진다. miR 고리 및 miR30 인접 서열을 헤어핀의 어느 한쪽 또는 양쪽 모두에 가하여, 마이크로RNA가 없는 통상적인 shRNA 설계에 비해서 발현된 헤어핀의 드로샤 및 다이서(Dicer) 가공을 10배 넘게 증가시킨다. 증가된 드로샤 및 다이서 가공은 보다 큰 siRNA/miRNA 생성 및 발현된 헤어핀에 대한 보다 큰 효능으로 번역된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "shRNA" 또는 "짧은 헤어핀 RNA"라는 용어는 단일의 자기-상보성 RNA 가닥에 의해 형성되는 이중-가닥 구조를 지칭한다. 표적 유전자의 암호화 또는 비-암호화 서열 중 어느 하나의 일부에 일치하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 shRNA 구축물이 억제에 바람직하다. 표적 서열에 비해 삽입, 결실 및 단일 점 돌연변이를 갖는 RNA 서열이 또한 억제에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 표적 유전자의 일부와 억제성 RNA 간에 90% 초과의 서열 일치성, 또는 심지어 100% 서열 일치성이 바람직하다. 특정 바람직한 실시형태에서, shRNA의 듀플렉스-형성 부분의 길이는 적어도 20, 21 또는 22개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어 다이서-의존성 절단에 의해 생성된 RNA 생산물에 상응하는 크기이다. 특정 실시형태에서, shRNA 구축물은 적어도 25, 50, 100, 200, 300 또는 400개의 염기 길이이다. 특정 실시형태에서, shRNA 구축물은 400 내지 800개의 염기 길이이다. shRNA 구축물은 고리 서열 및 고리 크기의 변화에 매우 허용성이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "리보자임"이라는 용어는 표적 mRNA의 부위-특이적인 절단이 가능한 촉매 활성 RNA 분자를 지칭한다. 다수의 하위유형, 예를 들어 해머헤드 및 헤어핀 리보자임이 기술되어 있다. 리보자임 촉매 활성 및 안정성을, 비촉매 염기에서 데옥시리보뉴클레오타이드를 리보뉴클레오타이드 대신 치환시킴으로써 개선시킬 수 있다. 부위-특이적인 인식 서열에서 mRNA를 절단하는 리보자임을 사용하여 특정한 mRNA를 파괴할 수 있지만, 해머헤드 리보자임의 사용이 바람직하다. 해머헤드 리보자임은 mRNA를, 표적 mRNA와 상보성 염기쌍을 형성하는 영역들과의 인접에 의해 지시된 위치에서 절단한다. 유일한 요건은 표적 mRNA가 하기 2개 염기의 서열: 5'-UG-3'을 갖는 것이다. 해머헤드 리보자임의 구축 및 생산은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다.
siRNA, miRNA, shRNA, 또는 리보자임을 포함하는 관심 폴리뉴클레오타이드의 바람직한 전달 방법은 본 명세서에서 다른 곳에 기술된 바와 같은, 하나 이상의 조절 서열, 예를 들어 강한 구성적(constitutive) pol III, 예를 들어 인간 U6 snRNA 프로모터, 마우스 U6 snRNA 프로모터, 인간 및 마우스 H1 RNA 프로모터 및 인간 tRNA-val 프로모터, 또는 강한 구성 pol II 프로모터를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 암호화 서열 자체의 길이와 상관없이, 본 명세서에 다른 곳에 개시되거나 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은, 다른 DNA 서열, 예를 들어 프로모터 및/또는 인핸서, 번역되지 않은 영역(UTR), 신호 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 리콤비나제 인식 부위(예를 들어 LoxP, FRT, 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 신호, 및 자가-절단 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 에피토프 태그와 결합될 수 있으며, 따라서 이들의 전체 길이는 상당히 다양할 수 있다. 따라서, 거의 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이 사용될 수 있으며, 이때 전체 길이는 바람직하게는 제조의 용이성 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 용도에 의해 제한되는 것으로 생각된다.
폴리뉴클레오타이드를 관련 기술 분야에 공지되고 입수 가능한 충분히 확립된 다양한 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조, 조작 및/또는 발현시킬 수 있다. 목적하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해서, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 적합한 벡터에 삽입할 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 자율 복제 서열, 및 전이 요소이다. 추가의 예시적인 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예를 들어 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC), 또는 P1-유래된 인공 염색체(PAC), 박테리오파지, 예를 들어 람다 파지 또는 M13 파지, 및 동물 바이러스를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 벡터로서 유용한 동물 바이러스의 카테코리의 예는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어 헤르페스 단순 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 파필로마바이러스, 및 파포바바이러스(예를 들어 SV40)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 발현 벡터의 예는 포유동물 세포에서의 발현을 위한 pClneo 벡터(프로메가(Promega)); 포유 동물에서 렌티바이러스-매개된 유전자 전달 및 발현을 위한 pLenti4/V5-DEST(상표명), pLenti6/V5-DEST(상표명), 및 p렌티6.2/V5-GW/락Z(pLenti6.2/V5-GW/lacZ)(인비트로젠(Invitrogen))이다. 특별한 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메릭 단백질의 암호화 서열을, 포유동물 세포에서 키메릭 단백질의 발현을 위해 그러한 발현 벡터에 결찰시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 암호화하는 벡터는 서열번호 36에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특별한 실시형태에서, 벡터는 에피솜 벡터 또는 염색체외에서 유지되는 벡터이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "에피솜"이라는 용어는 숙주의 염색체 DNA 내로의 통합 없이 그리고 분열하는 숙주 세포로부터의 점진적인 손실 없이 복제할 수 있는 벡터를 지칭하며, 이는 또한 상기 벡터가 염색체외에서 또는 에피솜에서 복제함을 의미한다. 벡터를, DNA 복제 기원을 암호화하는 서열 또는 림프친화성(lymphotrophic) 헤르페스 바이러스 또는 감마 헤르페스바이러스, 아데노바이러스, SV40, 소 유두종 바이러스, 또는 효모로부터의 "ori", 구체적으로 EBV의 oriP에 상응하는 림프친화성 헤르페스 바이러스 또는 감마 헤르페스바이러스의 복제 기원을 갖도록 조작한다. 특별한 양상에서, 림프친화성 헤르페스 바이러스는 엡스타인 바 바이러스(EBV), 카포시 육종 헤르페스 바이러스(KSHV), 헤르페스 바이러스 다람쥐원숭이(HS), 또는 마렉병 바이러스(MDV)일 수 있다. 엡스타인 바바이러스(EBV) 및 카포시 육종 헤르페스 바이러스(KSHV)가 또한 감마 헤르페스바이러스의 예이다. 전형적으로, 숙주 세포는 복제를 활성화하는 바이러스 복제 트랜스활성제 단백질을 포함한다.
발현 벡터 중에 존재하는 "제어 요소" 또는 "조절 서열"은 벡터의 번역되지 않은 영역 - 복제 기원, 선택 카세트, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(샤인 달가르노 서열 또는 코작 서열) 인트론, 폴리아데닐화 서열, 5' 및 3' 번역되지 않은 영역(이들은 숙주 세포 단백질과 상호작용하여 전사 및 번역을 수행함)이다. 그러한 요소는 이의 강도 및 특이성이 다양할 수 있다. 사용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라서, 편재하는 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함한 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다.
특별한 실시형태에서, 발현 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 본 발명의 실시에 사용하기 위한 벡터는 외인성, 내인성 또는 이종 제어 서열, 예를 들어 프로모터 및/또는 인핸서를 포함할 것이다. "내인성" 제어 서열은 게놈 중 주어진 유전자와 자연적으로 결합되는 것이다. "외인성" 제어 서열은 유전자의 전사가 결합된 인핸서/프로모터에 의해 지시되도록 유전자 조작(즉 분자 생물학적 기술)에 의해 유전자에 나란히 놓인 것이다. "이종" 제어 서열은 유전자 조작되는 세포와 상이한 종으로부터의 외인성 서열이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "프로모터"라는 용어는 RNA 폴리머라제가 결합하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 지칭한다. RNA 폴리머라제는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 개시시키고 전사한다. 특별한 실시형태에서, 포유동물 세포에서 작동성인 프로모터는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개의 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역 및/또는 전사의 출발로부터 70 내지 80개의 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열, CNCAAT 영역(여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드일 수 있음)을 포함한다.
"인핸서"라는 용어는 향상된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하고 일부의 경우에 또 다른 조절 서열에 비해 배향 독립적으로 기능할 수 있는 DNA의 분절을 지칭한다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협동적으로 또는 부가적으로 기능할 수 있다. "프로모터/인핸서"라는 용어는 프로모터와 인핸서 기능을 모두 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 분절을 지칭한다.
"작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 기술된 성분이 이들을 이들이 의도하는 방식으로 기능하게 하는 관계에 있는 병렬 배치를 지칭한다. 일 실시형태에서, 이러한 용어는 핵산 발현 제어 서열(예를 들어 프로모터, 및/또는 인핸서)과 제2 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 관심 폴리뉴클레오타이드 간의 기능성 결합을 지칭하며, 여기서 발현 제어 서열은 핵산의 전사를 제2 서열에 상응하게 지시한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "구성적 발현 제어 서열"이라는 용어는 작동 가능하게 연결된 서열의 전사를 연속적으로 또는 연속해서 허용하는 프로모터, 인핸서, 또는 프로모터/인핸서를 지칭한다. 구성적 발현 제어 서열은 각각, 광범위하게 다양한 세포 및 조직 유형에서 발현을 허용하는 "편재하는" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서, 또는 제한된 다양한 세포 및 조직 유형에서 발현을 허용하는 "세포 특이적인", "세포 유형 특이적인", "세포 계통 특이적인" 또는 "조직 특이적인" 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서일 수 있다.
본 발명의 특별한 실시형태에서 사용하기에 적합한 예시적인 편재하는 발현 제어 서열은 거대세포바이러스(CMV) 전초기 프로모터, 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어 초기 또는 말기), 몰로니 뮤린 백혈 병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR, 헤르페스 단순 바이러스(HSV)(티미딘 카이나제) 프로모터, H5, P7.5, 및 우두 바이러스로부터 P11 프로모터, 연장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 초기 성장 반응 1((EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), 진 핵생물 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열 충격 70kDa 단백질 5(HSPA5), 열 충격 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1), 열 충격 단백질 70kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 유전자좌(Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세레이트 카이나제-1(PGK) 프로모터, 거대세포바이러스 인핸서/치킨 β-액틴(CAG) 프로모터, β-액틴 프로모터 및 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터(Challita et al., J Virol. 69(2):748-55 (1995))를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 MND 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 인간 EF1a 유전자의 제1 인트론을 포함하는 EF1a 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 인간 EF1a 유전자의 제1 인트론이 없는 EF1a 프로모터를 포함한다.
특별한 실시형태에서, T 세포 특이적인 프로모터로부터의 CAR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 것이 바람직할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "조건적 발현"은 유도성 발현; 억제성 발현; 특별한 생리학적, 생물학적 또는 질환 상태 등을 갖는 세포 또는 조직에서의 발현을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 유형의 조건적 발현을 지칭할 수 있다. 이러한 정의는 세포 유형 또는 조직 특이적인 발현을 제외하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 특정 실시형태는 관심 폴리뉴클레오타이드의 조건적 발현을 제공하고, 예를 들어 세포, 조직, 유기체 등에, 폴리뉴클레오타이드가 발현되게 하거나 또는 관심 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리뉴클레오타이드의 발현의 증가 또는 감소를 야기하는 처리 또는 조건을 가함으로써 발현을 조절한다.
유도성 프로모터/시스템의 예시적인 예는 스테로이드-유도성 프로모터, 예를 들어 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체를 암호화하는 유전자에 대한 프로모터(상응하는 호르몬에 의한 처리에 의해 유도 가능함), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속에 의한 처리에 의해 유도 가능함), MX-1 프로모터(인터페론에 의해 유도 가능함), "젠스위치(GeneSwitch)" 미페프리스톤-조절성 시스템(Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), 큐메이트 유도성 유전자 변환(WO 2002/088346), 테트라사이클린-의존성 조절 시스템 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
조건적 발현을 또한 부위 특이적인 DNA 리콤비나제를 사용하여 성취할 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에 따라 벡터는 부위 특이적인 리콤비나제에 의해 매개되는 재조합을 위한 적어도 하나(전형적으로 2개)의 부위(들)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "리콤비나제" 또는 "부위 특이적인 리콤비나제"라는 용어는 하나 이상의 재조합 부위(예를 들어 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 30, 50개 등)를 수반하는 재조합 반응에 관련된 삭제성 또는 통합성 단백질, 효소, 보조-인자 또는 관련 단백질을 포함하며, 이들은 야생형 단백질(문헌[Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)] 참고), 또는 이의 돌연변이체, 유도체 (예를 들어 상기 재조합 단백질 서열 또는 이의 단편을 함유하는 융합 단백질), 단편 및 변이체일 수 있다. 본 발명의 특별한 실시형태에 사용하기에 적합한 리콤비나제의 예시적인 예는 Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, φC31, Cin, Tn3 리졸베이스, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1, 및 ParA를 포하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
벡터는 광범위하게 다양한 부위 특이적인 리콤비나제 중 임의의 것에 대한 하나 이상의 재조합 부위를 포함할 수 있다. 부위 특이적인 리콤비나제에 대한 표적 부위는 또한 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터의 통합에 필요한 임의의 부위(들)에 대한 것임을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "재조합 서열", "재조합 부위" 또는 "부위 특이적인 재조합 부위"라는 용어는 리콤비나제가 인식하고 결합하는 특정 핵산 서열을 지칭한다.
예를 들어, Cre 리콤비나제에 대한 하나의 재조합 부위는 loxP이며, 이는 8 염기쌍 코어 서열에 인접한 2개의 13 염기쌍 역전된 반복부(리콤비나제 결합 부위로서 작용함)를 포함하는 34 염기쌍 서열이다(문헌[Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)]의 도 1을 참고). 다른 예시적인 loxP 부위는 lox511(Hoess et al., 1996; Bethke and Sauer, 1997), lox5171(Lee and Saito, 1998), lox2272(Lee and Saito, 1998), m2(Langer et al., 2002), lox71(Albert et al., 1995), 및 lox66(Albert et al., 1995)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
FLP 리콤비나제에 적합한 인식 부위는 FRT(McLeod, et al., 1996), F1, F2, F3(Schlake and Bode, 1994), F4, F5(Schlake and Bode, 1994), FRT(LE)(Senecoff et al., 1988), FRT(RE)(Senecoff et al., 1988)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
인식 서열의 다른 예는 attB, attP, attL 및 attR 서열이며, 이들은 리콤비나제 효소 λ 인테그라제, 예를 들어 파이-c31에 의해 인식된다. φC31 SSR은 이종형 부위 attB(34 bp 길이)와 attP(39 bp 길이) 사이에서만 재조합을 매개한다(Groth et al., 2000). 각각 세균 및 파지 게놈 상의 파지 인테그라제에 대한 부착 부위들을 명명하는 attB 및 attP는 모두 φC31 동종이량체에 의해서 결합되는 듯한 불완전한 역전된 반복부를 함유한다(Groth et al., 2000). 생산물 부위, attL 및 attR은 추가의 φC31-매개된 재조합에 대해 유효하게 불활성이며(Belteki et al., 2003), 이는 반응을 비가역적으로 만든다. 삽입을 촉매화하기 위해서, attB-함유 DNA를 게놈 attP 부위에 삽입하는 것이 attP 부위를 게놈 attB 부위에 삽입하는 것보다 더 쉬운 것으로 밝혀졌다(Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). 따라서, 전형적인 전략은 동종 재조합에 의해 attP-함유 "도킹 부위"를 한정된 유전자 자리(locus)로 위치시키고, 이어서 이것은 삽입을 위해 attB-함유 유입 서열과 짝을 이룬다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "내부 리보솜 진입 부위" 또는 "IRES"는 내부 리보솜의 시스트론(단백질 암호화 영역)의 개시 코돈, 예를 들어 ATG 내로의 직접적인 진입을 촉진하고, 이에 의해 유전자의 캡-독립적인 번역을 유도하는 요소이다. 예를 들어 문헌[Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83)] 및 문헌[Jackson and Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000]을 참고하기 바란다. 특별한 실시형태에서, 본 발명에 의해 고려되는 벡터는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특별한 실시형태에서, 복수의 폴리펩타이드 각각의 효율적인 번역을 달성하기 위해서, 폴리뉴클레오타이드 서열을 하나 이상의 IRES 서열 또는 자기-절단성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 분리시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "코작 서열"이라는 용어는 mRNA의 리보솜의 작은 소단위에 대한 초기 결합을 크게 촉진하고 번역을 증가시키는 짧은 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 공통(consensus) 코작 서열은 (GCC)RCCATGG이고, 여기서 R은 퓨린(A 또는 G)이다(Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92, 및 Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48). 특별한 실시형태에서, 본 발명에 의해 고려되는 벡터는 공통 코작 서열을 갖고 목적하는 폴리펩타이드, 예를 들어 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 세포는 직접적인 독성 및/또는 조절되지 않는 증식의 위험성을 감소시키기 위한 유도성 자살 유전자를 비롯한, 자살 유전자를 사용한다. 특정한 양상에서, 자살 유전자는 폴리뉴클레오타이드 또는 세포를 갖는 숙주에 대해 면역원성이 아니다. 사용될 수 있는 자살 유전자의 몇몇 예는 카스파제-9 또는 카스파제-8 또는 시토신 데아미나제이다. 카스파제-9를 이량체화의 특이적인 화학적 유도인자(CID)를 사용하여 활성화시킬 수 있다.
특정 실시형태에서, 벡터는 본 발명의 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포가 생체내에서 음성 선택에 민감해지게 하는 유전자 분절을 포함한다. "음성 선택"은 주입된 세포가 개체의 생체내 조건의 변화의 결과로서 제거될 수 있음을 의미한다. 음성 선택성 표현형은 투여된 작용제, 예를 들어 화합물에 민감성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 생성될 수 있다. 음성 선택성 유전자는 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 특히 하기를 포함한다: 강시클로비어 민감성을 부여하는 헤르페스 단순 바이러스 I형 티미딘 카이나제(HSV-I TK) 유전자(Wigler et al., Cell 11:223, 1977); 세포성 하이포잔틴 포스프리보실트랜스퍼라제(HPRT) 유전자, 세포성 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(APRT) 유전자, 및 세균성 시토신 데아미나제(Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).
일부 실시형태에서, 유전자 변형된 면역 이펙터 세포, 예컨대 T 세포는 시험관내에서 음성 선택성 표현형의 세포를 선택할 수 있게 하는 양성 마커를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 양성 선택성 마커는, 숙주 세포 내에 도입시 유전자를 운반하는 세포의 양성 선택을 허용하는 우성 표현형을 발현하는 유전자일 수 있다. 이러한 유형의 유전자는 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 특히 하이그로마이신 B에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신-B 포스포트랜스퍼라제 유전자(hph), 항생제 G418에 대한 내성을 암호화하는 Tn5로부터의 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자(neo 또는 aph), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자, 아데노신 데아미나제 유전자(ADA), 및 다중-약물 내성(MDR) 유전자를 포함한다.
바람직하게, 양성 선택성 마커 및 음성 선택성 요소는 음성 선택성 요소의 상실이 또한 반드시 양성 선택성 마커의 상실에 의해 동반되도록 연결된다. 보다 더 바람직하게, 양성 및 음성 선택성 마커는 하나의 상실이 필수적으로 다른 것의 상실을 유도하도록 융합된다. 발현 생산물로서 상술한 목적하는 양성 및 음성 선택성 특징을 모두 부여하는 폴리펩타이드를 제공하는 융합된 폴리뉴클레오타이드의 일례는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 티미딘 카이나제 융합 유전자(HyTK)이다. 이러한 유전자의 발현은 시험관내에서 양성 선택을 위한 하이그로마이신 B 내성, 및 생체내에서 음성 선택을 위한 강시클로비어 민감성을 부여하는 폴리펩타이드를 제공한다. 문헌[Lupton S. D., et al, Mol. and Cell. Biology 1 1:3374- 3378, 1991]을 참조하기 바란다. 또한, 바람직한 실시형태에서, 키메릭 수용체를 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 융합된 유전자, 특히 시험관내에서 양성 선택을 위한 하이그로마이신 B 내성, 및 생체내에서 음성 선택을 위한 강시클로비어 민감성을 부여하는 것들을 함유하는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 상기 문헌[Lupton, S.D. et al.(1991)]에 기재된 HyTK 레트로바이러스 벡터 중에 있다. 또한 우성 양성 선택성 마커와 음성 선택성 마커와의 융합으로부터 유도된 이기능성 선택성 융합 유전자의 용도를 기재하는, 에스 디 럽톤(S.D. Lupton)의 PCT US91/08442 및 PCT/US94/05601의 공보를 참고하기 바란다.
바람직한 양성 선택성 마커는 hph, nco 및 gpt로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자들로부터 유래되며, 바람직한 음성 선택성 마커는 시토신 데아미나제, HSV-I TK, VZV TK, HPRT, APRT 및 gpt로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자로부터 유래된다. 특히 바람직한 마커는 양성 선택성 마커가 hph 또는 neo로 부터 유래되고 음성 선택성 마커는 시토신 데아미나제 또는 TK 유전자 또는 선택성 마커로부터 유래되는 이기능성 선택성 융합 유전자이다. 유도성 자살 유전자
F. 바이러스 벡터
특별한 실시형태에서, 세포(예를 들어 면역 이펙터 세포)를 CAR을 암호화하는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터로 형질도입시킨다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포를, CD3ζ, CD28, 4-1BB, Ox40, 또는 이들 의 임의의 조합의 세포내 신호전달 도메인과 함께, BCMA 폴리펩타이드와 결합하는 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CAR을 암호화하는 벡터로 형질도입시킨다. 따라서, 이들 형질도입된 세포는 CAR-매개된 세포독성 반응을 이끌어낼 수 있다.
레트로바이러스는 유전자 전달을 위한 통상적인 도구이다(Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). 특별한 실시형태에서, 레트로바이러스를 사용하여 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 전달한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "레트로바이러스"라는 용어는 게놈 RNA를 선형 이중-가닥 DNA 사본으로 역전사하고 후속으로 이의 게놈 DNA를 숙주 게놈 내로 공유적으로 통합시키는 RNA 바이러스를 지칭한다. 일단 바이러스가 숙주 게놈 내에 통합되면, 이를 "프로바이러스"라 칭한다. 프로바이러스는 RNA 폴리머라제 II에 대한 템플레이트로서 작용하며 새로운 바이러스 입자를 생산하는데 필요한 구조 단백질 및 효소를 암호화하는 RNA 분자의 발현을 지시한다.
특별한 실시형태에 사용하기에 적합한 예시적인 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M- MuLV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(MoMSV), 하비 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유방종양 바이러스(MuMTV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스, 프리엔드 쥐 백혈병 바이러스, 뮤린 줄기세포 바이러스(MSCV) 및 라우스 육종 바이러스(RSV)) 및 렌티바이러스를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "렌티바이러스"라는 용어는 복합 레트로바이러스의 군(또는 속)을 지칭한다. 예시적인 렌티바이러스는 HIV(인간 면역결핍 바이러스; HIV 1형 및 HIV 2형 포함); 비스나-매디 바이러스(VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 일 실시형태에서, HIV계 벡터 주쇄(즉 HIV 시스-작용 서열 요소)가 바람직하다. 특별한 실시형태에서, 렌티바이러스를 사용하여 CAR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 전달한다.
레트로바이러스 벡터 및 보다 특별하게는 렌티바이러스 벡터를 본 발명의 특정한 실시형태의 실시에 사용할 수 있다. 상응하게, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "레트로바이러스" 또는 "레트로바이러스 벡터"라는 용어는 각각 "렌티바이러스" 및 "렌티바이러스 벡터"를 포함함을 의미한다.
"벡터"는 본 명세서에서 또 다른 핵산 분자를 전달하거나 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는데 사용된다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결된다, 예를 들어 상기 분자 내로 삽입된다. 벡터는 세포에서 자율적인 복제를 지시하는 서열을 포함하거나, 또는 숙주 세포 DNA내로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는 예를 들어 플라스미드(예를 들어 DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포손, 코스미드, 세균 인공 염색체, 및 바이러스 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 예를 들어 복제 결함 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명한 바와 같이, "바이러스 벡터"라는 용어는 전형적으로 핵산 분자(예를 들어 전달 플라스미드)의 세포 게놈 내로의 전달 또는 통합을 촉진하는 바이러스-유래된 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자, 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자를 지칭하는데 광범위하게 사용된다. 바이러스 입자는 전형적으로 다양한 바이러스 성분 및 때때로 또한 핵산(들) 이외의 숙주 세포 성분을 포함할 것이다.
바이러스 벡터라는 용어는 핵산을 세포 내로 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자 또는 상기 전달된 핵산 자체를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드는 주로 바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 기능성 유전 요소를 함유한다. "레트로바이러스 벡터"라는 용어는 주로 레트로바이러스로부터 유래된 구조적 및 기능성 유전 요소를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 또는 이의 부분들을 지칭한다. "렌티바이러스 벡터"라는 용어는 주로 렌티바이러스로부터 유래된 LTR을 포함한 구조적 및 기능성 유전 요소를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드, 또는 이의 부분들을 지칭한다. "혼성 벡터"라는 용어는 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 서열 및 비-렌티바이러스 바이러스 서열을 모두 함유하는 벡터, LTR 또는 다른 핵산을 지칭한다. 일 실시형태에서, 혼성 벡터는 역전사, 복제, 통합 및/또는 패키징을 위한 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 서열을 포함하는 벡터 또는 전달 플라스미드를 지칭한다.
특별한 실시형태에서, "렌티바이러스 벡터", "렌티바이러스 발현 벡터"라는 용어는 렌티바이러스 전달 플라스미드 및/또는 감염성 렌티바이러스 입자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 클로닝 부위, 프로모터, 조절 요소, 이종 핵산 등을 지칭하는 경우, 이들 요소의 서열은 RNA 형태로 본 발명의 렌티바이러스 입자 중에 존재하고 본 발명의 DNA 플라스미드 중에 DNA 형태로 존재하는 것으로 생각된다.
프로바이러스의 각 단부에 "긴 말단 반복부" 또는 "LTR"이라 칭하는 구조가 존재한다. "긴 말단 반복부(LTR)"라는 용어는 레트로바이러스 DNA의 단부에 위치하는 염기쌍의 도메인을 지칭하며, 이의 천연 서열과 관련하여 직접적인 반복부이고 U3, R 및 U5 영역을 함유한다. LTR은 일반적으로 레트로바이러스 유전자의 발현(예를 들어 유전자 전사물의 촉진, 개시 및 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제에 근본적인 기능을 제공한다. LTR은 전사 제어 요소, 폴리아데닐화 신호 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합에 필요한 서열을 포함한 다수의 조절 신호를 함유한다. 바이러스 LTR은 U3, R 및 U5라 칭하는 3개의 영역으로 분류된다. U3 영역은 인헨서 및 프로모터 요소를 함유한다. U5 영역은 프라이머 결합 부위와 R 영역 사이의 서열이고 폴리아데닐화 서열을 함유한다. R(반복) 영역은 U3 및 U5 영역에 인접해 있다. LTR은 U3, R 및 U5 영역으로 구성되며 바이러스 게놈의 5' 및 3' 단부 모두에 존재한다. 5' LTR에 인접하여 게놈의 역전사(tRNA 프라이머 결합 부위) 및 입자 내로의 바이러스 RNA의 효율적인 패키징(프사이 부위)에 필요한 서열들이 존재한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "패키징 신호" 또는 "패키징 서열"이라는 용어는 바이러스 RNA의 바이러스 캡시드 또는 입자 내로의 삽입에 필요한 레트로바이러스 게놈 내에 위치한 서열을 지칭한다. 예를 들어 문헌[Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109]을 참고하기 바란다. 다수의 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 캡슐화에 필요한 최소 패키징 신호(또한 프사이[ψ] 서열이라 칭한다)를 사용한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "패키징 서열", "패키징 신호", "프사이" 및 기호 "ψ"는 바이러스 입자 형성 중에 레트로바이러스 RNA 가닥의 캡슐화에 필요한 비-암호화 서열에 관하여 사용된다.
다양한 실시형태에서, 벡터는 변형된 5' LTR 및/또는 3' LTR을 포함한다. LTR 중 하나 또는 둘 모두는 하나 이상의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하지만 이들로 제한되지 않은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 3' LTR의 변형은 종종 바이러스를 복제-결함으로 만듦으로써 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 시스템의 안전성을 개선시키기 위해 이루어진다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "복제-결함"이라는 용어는 감염성 비리온이 생성되지 않도록 (예를 들어 복제-결함 렌티바이러스 자손) 완전한, 유효한 복제가 가능하지 않은 바이러스를 지칭한다. "복제-가능(replication-competent)"이라는 용어는 바이러스의 바이러스 복제가 감염성 비리온을 생성시킬 수 있도록(예를 들어 복제-가능 렌티바이러스 자손) 복제가 가능한 야생형 바이러스 또는 돌연변이 바이러스를 지칭한다.
"자가-불활성화"(SIN) 벡터는 우측(3') LTR 인헨서-프로모터 영역(U3 영역으로서 공지됨)이 첫번째 바이러스 복제 라운드를 벗어난 바이러스 전사를 방지하도록 변형된(예를 들어 결실 또는 치환에 의해) 복제-결함 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다. 이는 우측(3') LTR U3 영역이 바이러스 복제 동안 좌측(5') LTR U3 영역에 대한 주형으로서 사용되고 따라서 바이러스 전사가 상기 U3 인헨서-프로모터 없이 이루어질 수 없기 때문이다. 본 발명의 추가의 실시형태에서, 3' LTR은 상기 U5 영역이 예를 들어 이상적인 폴리(A) 서열로 치환되도록 변형된다. LTR에 대한 변형, 예를 들어 3' LTR, 5' LTR 또는 3' 및 5' LTR 모두에 대한 변형이 또한 본 발명에 포함됨에 유의해야 한다.
추가적인 안전성 향상은 5' LTR의 U3 영역을 이종 프로모터로 치환시켜 바이러스 입자의 생성 동안 바이러스 게놈의 전사를 구동함으로써 제공된다. 사용될 수 있는 이종 프로모터의 예는 예를 들어 바이러스 유인원 바이러스 40(SV40)(예를 들어 초기 또는 말기), 거대세포바이러스(CMV)(예를 들어 전초기), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 및 헤르페스 단순 바이러스(HSV)(티미딘 카이나제) 프로모터를 포함한다. 전형적인 프로모터는 Tat-독립적인 방식으로 높은 수준의 전사를 구동할 수 있다. 이러한 치환은 바이러스 생성 시스템에서 완전한 U3 서열이 존재하지 않기 때문에 복제-가능 바이러스를 생성시키는 재조합 가능성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 이종 프로모터는 바이러스 게놈이 전사되는 방식을 조절함에 있어서 추가적인 이점을 갖는다. 예를 들어, 이종 프로모터는 유도성일 수 있으며, 따라서 바이러스 게놈의 일부 또는 전부의 전사는 오직 유도 인자가 존재하는 경우에만 발생할 것이다. 유도 인자는 하나 이상의 화학 화합물 또는 생리학적 조건, 예를 들어 숙주 세포가 배양되는 온도 또는 pH를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 TAR 요소를 포함한다. "TAR"이라는 용어는 렌티바이러스(예를 들어 HIV) LTR의 R 영역 중에 위치한 "트랜스-활성화 반응" 유전 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 렌티바이러스 트랜스-활성제(tat) 유전 요소와 상호작용하여 바이러스 복제를 향상시킨다. 그러나, 요소는 5' LTR의 U3 영역이 이종 프로모터에 의해 치환되는 실시형태에는 필요하지 않다.
"R 영역"은, 캡핑 군의 출발(즉 전사의 출발)시 시작하고 폴리 A 트랙의 출발 직전에 종료되는 레트로바이러스 LTR내의 영역을 지칭한다. R 영역은 또한 U3 및 U5 영역에 의해 인접되는 것으로서 정의된다. R 영역은 역전사 중에 게놈의 한쪽 단부에서 다른 쪽으로 발생기 DNA의 전달을 허용하는데 한 역할을 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "FLAP 요소"라는 용어는 레트로바이러스, 예를 들어 HIV-1 또는 HIV-2의 중앙 폴리퓨린 트랙 및 중앙 종결 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 서열을 갖는 핵산을 지칭한다. 적합한 FLAP 요소는 미국 특허 6,682,907 및 문헌[Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173]에 기재되어 있다. HIV-1 역 전사 중에, 중앙 폴리퓨린 트랙(cPPT)에서의 플러스-가닥 DNA의 중앙 개시 및 중앙 종결 서열(CTS)에서의 중앙 종결은 3-가닥 DNA 구조: HIV-1 중앙 DNA 플랩의 형성을 유도한다. 임의의 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, DNA 플랩은 렌티바이러스 게놈 핵 내수송(import)의 시스-활성 결정인자로서 작용하고/하거나 상기 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있다. 특별한 실시형태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 주쇄는 벡터 중의 관심 이종 유전자의 상류 또는 하류에 하나 이상의 FLAP 요소를 포함한다. 예를 들어, 특별한 실시형태에서, 전달 플라스미드는 FLAP 요소를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 HIV-1로부터 단리된 FLAP 요소를 포함한다.
일 실시형태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 전달 벡터는 하나 이상의 외수송 요소를 포함한다. "외수송 요소"라는 용어는 세포의 핵에서 세포질로의 RNA 전사물의 수송을 조절하는 시스-작용 전사-후 조절 요소를 지칭한다. RNA 외수송 요소의 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) rev 반응 요소(RRE)(예를 들어 문헌[Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053]; 및 문헌[Cullen et al., 1991. Cell 58: 423]을 참고), 및 B형 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(HPRE)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 일반적으로, RNA 외수송 요소는 유전자의 3' UTR 내에 위치하며 하나 또는 다수의 복사체로서 삽입될 수 있다.
특별한 실시형태에서, 바이러스 벡터 중 이종 서열의 발현은 전사후 조절 요소, 효율적인 폴리아데닐화 부위, 및 임의로 전사 종결 신호의 벡터내로의 통합에 의해 증가된다. 다양한 전사후 조절 요소, 예를 들어 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886); B형 간염 바이러스 중에 존재하는 전사후 조절 요소(HPRE)(Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864); 등(Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766)이 단백질에서 이종 핵산의 발현을 증가시킬 수 있다. 특별한 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE 또는 HPRE를 포함한다.
특별한 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 전사후 조절 요소(PTE), 예컨대 WPRE 또는 HPRE가 없거나 또는 포함하지 않는데, 그 이유는 일부 예에서 이들 요소가 세포 형질전환의 위험성을 증가시키고/증가시키거나 mRNA 전사물의 양 또는 mRNA 안정성을 실질적으로 또는 유의하게 증가시키지 않기 때문이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 PTE가 없거나 또는 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 가중된 안전성 수단으로서 WPRE 또는 HPRE가 없거나 또는 이들을 포함하지 않는다.
이종 핵산 전사물의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 요소는 이종 유전자 발현을 증가시킨다. 전사 종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호의 하류에서 발견된다. 특별한 실시형태에서, 벡터는 발현시키려는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 폴리아데닐화 서열 3'을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "폴리A 부위" 또는 "폴리A 서열"이라는 용어는 RNA 폴리머라제 II에 의한 발생기 RNA 전사물의 종결 및 폴리아데닐화 모두를 지시하는 DNA 서열을 나타낸다. 폴리아데닐화 서열은 암호화 서열의 3' 단부에 폴리A 꼬리를 부가함으로써 mRNA 안정성을 촉진시킬 수 있고, 따라서 증가된 번역 효율에 기여할 수 있다. 재조합 전사물의 효율적인 폴리아데닐화는, 폴리 A 꼬리가 없는 전사물은 불안정하고 급속히 분해되므로, 바람직할 수 있다. 본 발명의 벡터에 사용될 수 있는 폴리 A 신호의 예시적인 예는 이상적인 폴리A 서열 (예를 들어 AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), 소 성장 호르몬 폴리A 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 폴리A 서열(rβ gpA), 또는 관련 기술 분야에 공지된 또 다른 적합한 이종 또는 내인성 폴리A 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터는 하나 이상의 격리제(insulator) 요소를 추가로 포함한다. 격리제 요소는 렌티바이러스-발현된 서열, 예를 들어 치료학적 폴리펩타이드를 통합 부위 효과(이는 게놈 DNA 중에 존재하는 시스-작용 요소들에 의해 매개되고 전달된 서열의 조절해제된 발현을 유도할 수 있음)(즉, 위치 효과; 예를 들어 문헌[Burgess-Beusse et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99:16433]; 및 [Zhan et al., 2001, Hum. Genet., 109:471] 참고)로부터 보호하는 데 기여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 전달 벡터는 하나 이상의 격리제 요소 3' LTR을 포함하며, 프로바이러스의 숙주 게놈 내로의 통합시 프로바이러스는 5' LTR 또는 3' LTR 모두에, 3' LTR의 복제에 의해 하나 이상의 격리제를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 격리제는 치킨 β-글로빈 격리제를 포함한다(문헌[Chung et al., 1993. Cell 74:505]; 문헌[Chung et al., 1997. PNAS 94:575]; 및 [Bell et al., 1999. Cell 98:387](이들은 본 명세서에 참고로 포함됨)을 참고). 격리제 요소의 예는 β-글로빈 유전자 자리로부터의 격리제, 예를 들어 치킨 HS4를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 특정 구체적인 실시형태에 따르면, 바이러스 벡터 주쇄 서열의 대부분 또는 전부는 렌티바이러스, 예를 들어 HIV-1으로부터 유래된다. 그러나, 레트로바이러스 및/또는 렌티바이러스 서열의 다수의 상이한 공급원들이 사용될 수 있거나, 또는 렌티바이러스 서열 중 일부에서 조합된 다수의 치환 및 변경이 본 명세서에 기술된 기능들을 수행하는 전달 벡터의 능력을 손상시키지 않으면서 수용될 수 있음을 알아야 한다. 더욱이, 다양한 렌티바이러스 벡터들이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 문헌[Naldini et al., (1996a, 1996b, and 1998)]; [Zufferey et al., (1997)]; [Dull et al., 1998], 미국 특허 6,013,516; 및 미국 특허 5,994,136(이들 중 다수는 본 발명의 바이러스 벡터 또는 전달 플라스미드의 생성에 적합할 수 있음)을 참고하기 바란다.
다양한 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 벡터는 하나 이상의 LTR을 가질 수 있으며, 여기서 LTR은 하나 이상의 변형, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 벡터는 형질도입 효율(예를 들어 cPPT/FLAP), 바이러스 패키징(예를 들어 프사이(ψ) 패키징 신호, RRE)을 증가시키기 위한 하나 이상의 보조 요소, 및/또는 치료학적 유전자 발현을 증가시키는 다른 요소(예를 들어 폴리(A) 서열)를 추가로 포함할 수 있으며 WPRE 또는 HPRE를 임의로 포함할 수 있다.
특별한 실시형태에서, 본 발명의 전달 벡터는 좌측(5') 레트로바이러스 LTR; 중앙 폴리퓨린 트랙/DNA 플랩(cPPT/FLAP); 레트로바이러스 외수송 요소; 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 및 우측(3') 레트로바이러스 LTR; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함한다.
특별한 실시형태에서, 본 발명의 전달 벡터는 좌측(5') 레트로바이러스 LTR; 레트로바이러스 외수송 요소; 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 우측(3') 레트로바이러스 LTR; 및 폴리(A) 서열; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함한다. 또 다른 특별한 실시형태에서, 본 발명은 좌측(5') LTR; cPPT/FLAP; RRE; 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 우측(3') LTR; 및 폴리아데닐화 서열; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 좌측(5') HIV-1 LTR; 프사이(ψ) 패키징 신호; cPPT/FLAP; RRE; 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 우측(3') 자가-불활성화(SIN) HIV-1 LTR; 및 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 LTR; 중앙 폴리퓨린 트랙/DNA 플랩(cPPT/FLAP); 레트로바이러스 외수송 요소; 및 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함하는 벡터를 제공한다.
특별한 실시형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 LTR; cPPT/FLAP; RRE; 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 및 폴리아데닐화 서열; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 포함하는 벡터를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 적어도 하나의 SIN HIV-1 LTR; 프사이(ψ) 패키징 신호; cPPT/FLAP; RRE; 본 명세서에서 고려되는 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된, T 세포에서 활성인 프로모터; 및 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열; 및 임의로 WPRE 또는 HPRE를 제공한다.
다양한 실시형태에서, 벡터는 통합 바이러스 벡터이다.
다양한 다른 실시형태에서, 벡터는 에피솜 또는 비-통합 바이러스 벡터이다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 벡터는 비-통합 또는 통합 결함 레트로바이러스를 포함한다. 일 실시형태에서, "통합 결함" 레트로바이러스 또는 렌티바이러스는 숙주 세포의 게놈 내로 바이러스 게놈을 통합시키는 능력이 없는 인테그라제를 갖는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 지칭한다. 다양한 실시형태에서, 인테그라제 단백질은 이의 인테그라제 활성을 특이적으로 감소시키도록 돌연변이화된다. 통합-부전(incompetent) 렌티바이러스 벡터는 인테그라제 단백질을 암호화하는 pol 유전자를 변형시켜서, 통합성 결함 인테그라제를 암호화하는 돌연변이화된 pol 유전자를 유발함으로써 수득된다. 그러한 통합-부전 바이러스 벡터는 전문이 참고로 포함된 특허 출원 WO 2006/010834에 기술되어 있다.
인테그라제 활성을 감소시키기에 적합한 HIV-1 pol 유전자에서의 예시적인 돌연변이는 H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199c, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A 및 K264H를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
인테그라제 활성을 감소시키기에 적합한 HIV-1 pol 유전자에서의 예시적인 돌연변이는 D64E, D64V, E92K, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, W235F, 및 W235E를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
특별한 실시형태에서, 인테그라제는 아미노산, D64, D116 또는 E152 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함한다. 일 실시형태에서, 인테그라제는 아미노산, D64, D116 및 E152 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함한다. 특별한 실시형태에서, 결함 HIV-1 인테그라제는 D64V 돌연변이를 포함한다.
"숙주 세포"는 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 생체내, 생체외, 또는 시험관내에서 전기천공되거나, 형질감염되거나, 감염되거나 또는 형질도입된 세포를 포함한다. 숙주 세포는 패키징 세포, 생산자 세포, 및 바이러스 벡터로 감염된 세포를 포함할 수 있다. 특별한 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 벡터로 감염된 숙주 세포를 치료가 필요한 대상체에게 투여한다. 특정 실시형태에서, "표적 세포"라는 용어는 숙주 세포와 상호 교환 가능하게 사용되며, 목적하는 세포 유형의 형질감염되거나, 감염되거나 또는 형질도입된 세포를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 표적 세포는 T 세포이다.
대규모 바이러스 입자 생산은 종종 타당한 바이러스 역가를 성취하기 위해 필요하다. 바이러스 입자는 전달 벡터를 바이러스 구조 및/또는 보조 유전자, 예를 들어 gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx, 또는 nef 유전자 또는 다른 레트로바이러스 유전자를 포함하는 패키징 세포계에 형질감염시킴으로써 생산된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "패키징 벡터"라는 용어는, 패키징 신호가 없고 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 바이러스 구조 및/또는 보조 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 또는 바이러스 벡터를 지칭한다. 전형적으로, 패키징 벡터는 패키징 세포 중에 포함되며 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 세포 내로 도입된다. 형질감염, 형질도입 또는 감염 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명의 레트로바이러스/렌티바이러스 전달 벡터를 형질감염, 형질도입 또는 감염을 통해 패키징 세포계 내로 도입시켜 생산자 세포 또는 세포계를 생성시킬 수 있다. 본 발명의 패키징 벡터를 예를 들어 칼슘 포스페이트 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공을 포함한 표준 방법에 의해 인간 세포 또는 세포계에 도입시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 패키징 벡터를 우성 선택성 마커, 예를 들어 네오마이신, 하이그로마이신, 퓨로마이신, 블라스토시딘, 제오신, 티미딘 카이나제, DHFR, Gln 신시타제 또는 ADA와 함께 세포에 도입시킨 다음, 적절한 약물의 존재하에서 선택하고 클론을 단리한다. 선택성 마커 유전자를 패키징 벡터에 의해, 예를 들어 IRES 또는 자기 절단 바이러스 펩타이드에 의해 유전자 암호화에 물리적으로 연결시킬 수 있다.
바이러스 외막 단백질(env)은 세포계로부터 생성된 재조합 레트로바이러스에 의해 최종적으로 감염 및 형질전환될 수 있는 숙주 세포의 범위를 결정한다. 렌티바이러스, 예를 들어 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV 및 EIV의 경우에, env 단백질은 gp41 및 gp120을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 패키징 세포에 의해 발현된 바이러스 env 단백질은 앞서 기재된 바와 같이, 바이러스 gag 및 pol 유전자로부터의 별도의 벡터 상에서 암호화된다.
본 발명에 사용될 수 있는 레트로바이러스-유래된 env 유전자의 예시적인 예는 MLV 외막, 10A1 외막, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, 에볼라, 센다이, FPV(조류 역병 바이러스), 및 인플루엔자 바이러스 외막을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 유사하게, RNA 바이러스(예를 들어 피코르나비리다에, 칼시비리다에, 아스트로비리다에, 토가비리다에, 플라비비리다에, 코로나비리다에, 파라믹소비리다에, 라브도비리다에, 필로비리다에, 오쏘믹소비리다에, 분야비리다에, 아레나비리다에, 레오비리다에, 비르나비리다에, 레트로비리다에의 RNA 바이러스 과)뿐만 아니라 DNA 바이러스(헤파드나비리다에, 시르코비리다에, 파르보비리다에, 파포바비리다에, 아데노비리다에, 헤르페스 비리다에, 폭시리다에, 및 이리도비리다에 과)로부터의 외막을 암호화하는 유전자가 사용될 수 있다. 대표적인 예는 FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, 광견병, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10, 및 EIAV를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 바이러스를 의사분류(pseudotyping)하기 위한 외막 단백질은 하기의 바이러스 중 임의의 것을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다: 인플루엔자 A, 예컨대 H1N1, H1N2, H3N2 및 H5N1(조류독감), 인플루 엔자 B, 인플루엔자 C 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 로타바이러스, 노로 바이러스 군의 임의의 바이러스, 장 아데노바이러스, 파르보바이러스, 뎅기열 바이러스, 원숭이 두창, 모노네가바이러스, 리사바이러스, 예를 들어 광견병 바이러스, 라고스 박쥐 바이러스, 모콜라 바이러스, 듀벤헤이즈 바이러스, 유럽 박쥐 바이러스 1 & 2 및 호주 박쥐 바이러스, 에페메로바이러스, 수포성 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 헤르페스바이러스, 예를 들어 헤르페스 단순 바이러스 1형 및 2형, 수두 대상포진, 거대세포바이러스, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 인간 헤르페스바이러스(HHV), 인간 헤르페스바이러스 6형 및 8형, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 유두종 바이러스, 뮤린 감마헤르페스바이러스, 아레나바이러스, 예를 들어 아르헨티나 출혈열 바이러스, 볼리비아 출혈열 바이러스, 사비아-관련 출혈 열 바이러스, 베네수엘라 출혈열 바이러스, 라싸열 바이러스, 마추포바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV), 분야비리다에, 예를 들어 크리미안-콩고 출혈열 바이러스, 한타바이러스, 신장 증후군 유발 바이러스에 의한 출혈열, 리프트밸리열 바이러스, 에볼라 출혈열 및 마르부르크 출혈열을 포함한 필로비리다에(필로바이러스), 카이사누르 포레스트병 바이러스를 포함한 플라비비리다에, Omsk 출혈열 바이러스, 진드기-매개 뇌염 유발 바이러스 및 파라믹소비리다에, 예를 들어 헨드라 바이러스 및 니파 바이러스, 대두창 및 소두창(천연두), 알파 바이러스, 예를 들어 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, SARS-관련 코로나바이러스(SARS-CoV), 서나일 바이러스(West Nile virus), 임의의 뇌염 유발 바이러스.
일 실시형태에서, 본 발명은 VSV-G 당단백질에 의해 의사분류된 재조합 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스를 생산하는 패키징 세포를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 "의사형(pseudotype)" 또는 "의사분류"라는 용어는 바람직한 특성을 갖는 또 다른 바이러스의 외막 단백질로 치환된 바이러스 외막 단백질을 갖는 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, HIV는, HIV 외막 단백질(env 유전자에 의해 암호화됨)이 통상적으로 바이러스를 CD4+ 제시 세포에 표적화하기 때문에, HIV가 광범위한 세포를 감염시키게 하는 수포성 구내염바이러스 G-단백질(VSV-G) 외막 단백질로 의사분류될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 렌티바이러스 외막 단백질은 VSV-G로 의사분류된다. 일 실시형태에서, 본 발명은 VSV-G 외막 당단백질로 의사분류된 재조합 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스를 생산하는 패키징 세포를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "패키징 세포계"라는 용어는, 패키징 신호를 함유하지 않지만 바이러스 입자의 정확한 패키징에 필요한 바이러스 구조 단백질 및 복제 효소(예를 들어 gag, pol 및 env)를 안정하게 또는 일시적으로 발현시키는 세포계와 관련하여 사용된다. 임의의 적합한 세포계를 사용하여 본 발명의 패키징 세포를 제조할 수 있다. 일반적으로, 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 실시형태에서, 패키징 세포계의 생산에 사용되는 세포는 인간 세포이다. 사용될 수 있는 적합한 세포계는 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10T1/2 세포, FLY 세포, 프사이-2 세포, BOSC 23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC 1 세포, BSC 40 세포, BMT 10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRC5 세포, A549 세포, HT1080 세포, 293 세포, 293T 세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포, 및 211A 세포이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 패키징 세포는 293 세포, 293T 세포 또는 A549 세포이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 세포는 A549 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생산자 세포계"라는 용어는 재조합 레트로바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포계를 지칭하며, 패키징 세포계 및 패키징 신호를 포함하는 전달 벡터 구축물을 포함한다. 감염성 바이러스 입자 및 바이러스 모액의 제조를 통상적인 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 바이러스 모액의 제조 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633], 및 [N. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113]에 예시된다. 감염성 바이러스 입자를 통상적인 기술을 사용하여 패키징 세포로부터 수집할 수 있다. 예를 들어, 감염성 입자를 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이 세포 용해, 또는 세포 배양물의 상등액의 수집에 의해 수집할 수 있다. 임의로, 수집된 바이러스 입자를 경우에 따라 정제할 수 있다. 적합한 정제 기술은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
형질감염에 의해서라기보다는 바이러스 감염에 의해서 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 유전자(들) 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 전달하는 것을 "형질도입"이라 칭한다. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터를 감염 및 프로바이러스 통합을 통해 세포 내에 형질도입시킨다. 특정 실시형태에서, 표적 세포, 예를 들어 T 세포는, 이것이 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하는 감염에 의해 세포로 전달된 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경우, "형질도입된다". 특별한 실시형태에서, 형질도입된 세포는 이의 세포 게놈 중에 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 의해 전달된 하나 이상의 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특별한 실시형태에서, 하나 이상의 폴리펩타이드를 발현하는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 숙주 세포를, B 세포 악성종양의 치료 및/또는 예방을 위해 대상체에게 투여한다. 본 발명의 특정 실시형태에 따라 사용될 수 있는 유전자 요법에서의 바이러스 벡터의 용도와 관련된 다른 방법은 예를 들어 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다: [Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S]; [Ferry, N. and Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81]; [Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86]; [Thule, P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52]; [Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58]; [Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101]; [Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172]; [Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49]; 및 [Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8].
G. 유전자 변형된 세포
본 발명은 특별한 실시형태에서, B 세포 관련 병태의 치료에 사용하기 위한, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 세포를 고려한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유전자 조작된" 또는 "유전자 변형된"이라는 용어는 여분의 유전 물질을 DNA 또는 RNA의 형태로 세포 중의 전체 유전 물질에 부가함을 지칭한다. "유전자 변형된 세포", "변형된 세포" 및 "재지시된 세포"란 용어들은 상호 교환 가능하게 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유전자 요법"이라는 용어는 여분의 유전 물질을 DNA 또는 RNA의 형태로, 유전자의 발현을 복원, 보정 또는 변형시키거나 또는 치료학적 폴리펩타이드, 예를 들어 CAR을 발현시키기 위해 세포 중의 전체 유전 물질에 도입시킴을 지칭한다.
특별한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을, 관심 표적 항원, 예를 들어 BCMA 폴리펩타이드에 대한 이의 특이성을 재지시하기 위해서 면역 이펙터 세포에 도입시키고 발현시킨다. "면역 이펙터 세포"는 하나 이상의 이펙터 기능(예를 들어 세포독성 세포 살해 활성, 사이토카인의 분비, ADCC 및/또는 CDC의 유도)을 갖는 면역계의 임의의 세포이다.
본 발명의 면역 이펙터 세포는 자가유래성/자가성("자가") 또는 비-자가유래성("비-자가", 예를 들어 동종이계, 동계 또는 이종)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "자가유래성"은 동일한 대상체로부터의 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "동종이계"는 비교 세포와 유전학적으로 상이한 동일한 종의 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "동계"는 비교 세포와 유전학적으로 일치하는 상이한 대상체의 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "이종"은 비교 세포와 상이한 종의 세포를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 세포는 동종이계이다.
본 명세서에서 고려되는 CAR과 함께 사용되는 예시적인 면역 이펙터 세포는 T 림프구를 포함한다. "T 세포" 또는 "T 림프구"라는 용어는 관련 기술 분야에 인지되어 있으며 흉선세포, 미성숙 T 림프구, 성숙한 T 림프구, 휴지 T 림프구, 또는 활성화된 T 림프구를 포함함을 의미한다. T 세포는 T 헬퍼(Th) 세포, 예를 들어 T 헬퍼 1(Th1) 또는 T 헬퍼 2(Th2) 세포일 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포(HTL; CD4+ T 세포) CD4+ T 세포, 세포독성 T 세포(CTL; CD8+ T 세포), CD4+CD8+ T 세포, CD4-CD8- T 세포, 또는 T 세포들의 임의의 다른 하위세트일 수 있다. 특별한 실시형태에 사용하기에 적합한 T 세포의 다른 예시적인 집단은 나이브(naive) T 세포 및 기억 T 세포를 포함한다.
통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 다른 세포를 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR을 갖는 면역 이펙터 세포로서 사용할 수 있다. 특히, 면역 이펙터 세포는 NK 세포, NKT 세포, 호중구, 및 대식세포를 또한 포함한다. 면역 이펙터 세포는 이펙터 세포의 전구세포를 또한 포함하며, 여기서 그러한 전구체 세포는 생체내 또는 시험관내에서 면역 이펙터 세포로 분화되도록 유도될 수 있다. 따라서, 특별한 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 면역 이펙터 세포의 전구체, 예를 들어 대상체에 투여시 성숙한 면역 이펙터 세포로 분화하거나 또는 시험관내에서 성숙한 면역 이펙터 세포로 분화하도록 유도될 수 있는 제대혈, 골수 또는 동원된 말초 혈액으로부터 유래된 세포의 CD34+ 집단 내에 함유된 조혈모세포(HSC)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, BCMA-특이적인 CAR을 함유하도록 유전자 조작된 면역 이펙터 세포를 "BCMA-특이적인 재지시된 면역 이펙터 세포"라 칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "CD34+ 세포"라는 용어는 표면 상에 CD34 단백질을 발현하는 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "CD34"는 종종 세포-세포 부착 인자로서 작용하고 림프절 내로의 T 세포 진입에 관련된 세포 표면 당단백질(예를 들어 시알로뮤신 단백질)을 지칭한다. CD34+ 세포 집단은 조혈모세포(HSC)를 함유하며, 세포는 환자에게 투여시 분화하고 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 호중구 및 단핵구/대식 세포 계통의 세포를 포함한 모든 조혈 계통에 기여한다.
본 발명은 본 명세서에서 고려되는 CAR을 발현하는 면역 이펙터 세포의 제조 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 방법은 면역 이펙터 세포가 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CAR을 발현하도록 개체로부터 단리된 면역 이펙터 세포를 형질감염시키거나 형질도입시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 이펙터 세포를 개체로부터 단리하고 시험관내에서 추가의 조작 없이 유전자 변형시킨다. 이어서 그러한 세포를 직접 개체에게 다시-투여할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 면역 이펙터 세포를, CAR을 발현하도록 유전자 변형시키기 전에 먼저 활성화시키고 시험관내에서 증식하도록 자극한다. 이와 관련하여, 면역 이펙터 세포를 유전자 변형(즉 본 명세서에서 고려되는 CAR을 발현하도록 형질도입 또는 형질감염)시키기 전 및/또는 후에 배양할 수 있다.
특별한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역 이펙터 세포의 시험관내 조작 또는 유전자 변형 전에, 세포의 공급원을 대상체로부터 수득한다. 특별한 실시형태에서, CAR-변형된 면역 이펙터 세포는 T 세포를 포함한다. T 세포를 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선조직, 감염 부위를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다수의 공급원으로부터의 조직, 복수, 흉수, 비장 조직 및 종양으로부터 수득할 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포를 통상의 기술자에게 공지된 임의의 수의 기술, 예를 들어 침강, 예를 들어 FICOLL(상표명) 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득할 수 있다. 일 실시형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포를 분리반출법에 의해 수득한다. 성분채집 생성물은 전형적으로 T 세포를 포함한 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 함유한다. 일 실시형태에서, 분리반출법에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고 세포를 후속의 가공을 위해 적합한 완충제 또는 배지 중에 배치할 수 있다. 세포를 PBS로, 또는 칼슘, 마그네슘 및 전부는 아니지만 대부분의 다른 2가 양이온이 없는 또 다른 적합한 용액으로 세척할 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 세척 단계는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법, 예를 들어 반자동 병류식 원심분리기를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어 코브(Cobe) 2991 세포 가공기, 박스터 사이토메이트(Baxter CytoMate) 등. 세척 후에, 세포를 다양한 생체적합성 완충제 또는 완충제가 존재하거나 존재하지 않는 다른 염수 용액에 재현탁할 수 있다. 특정 실시형태에서, 성분채집 샘플의 바람직하지 않은 성분을 배양 배지에 직접 재현탁된 세포에서 제거할 수 있다.
특정 실시형태에서, T 세포를, 적혈구를 용해시키고 단핵세포를 고갈시킴으로써, 예를 들어 PERCOLL(상표명) 구배를 통한 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리한다. 하기 마커: CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA, 및 CD45RO 중 하나 이상을 발현하는 T 세포의 특정 하위집단을 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리할 수 있다. 일 실시형태에서, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA 및 CD45RO를 발현하는 T 세포의 특정 하위집단을 양성 또는 음성 선택 기술에 의해서 추가로 단리한다. 예를 들어, 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축을 음성적으로 선택된 세포에 대해서 독특한 표면 마커로 안내되는 항체의 조합에 의해 달성할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 한 가지 방법은 음성적으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커로 안내되는 단클론성 항체의 칵테일을 사용하는 유세포 분석기 또는 음성 자기 면역부착을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축시키기 위해서, 단클론성 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 유세포 분석기 및 세포 분류를 또한 사용하여 본 발명에 사용하기 위한 관심 세포 집단을 단리할 수 있다.
PBMC를 본 명세서에서 고려되는 방법을 사용하여 CAR을 발현하도록 직접 유전자 변형시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, PBMC의 단리 후에, T 림프구를 추가로 단리하고, 특정 실시형태에서, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구를 모두, 유전자 변형 및/또는 확장 전 또는 후에 나이브, 기억 및 이펙터 T 세포 하위집단으로 분류할 수 있다.
CD8+ 세포를 표준 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 일부 실시형태에서, CD8+ 세포를, CD8+ 세포의 각각의 유형과 관련된 세포 표면 항원을 식별함으로써 나이브, 중앙 기억, 및 이펙터 세포로 추가로 분류할 수 있다.
특정 실시형태에서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 및 CD45RA를 비롯한 나이브 T 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 한다.
특별한 실시형태에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 하위세트 둘 모두에 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체로 염색 후 CD62L-CD8+ 및 CD62L+CD8+ 분획으로 분류된다. 일부 실시형태에서, 중앙 기억 T 세포의 표현형 마커의 발현은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 및 CD127을 포함하며 그랜자임 B에 대해서 음성이다. 일부 실시형태에서, 중앙 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다.
일부 실시형태에서, 이펙터 T 세포는 CD62L, CCR7, CD28 및 CD127에 대해서 음성이고, 그랜자임 B 및 퍼포린에 대해서 양성이다.
특정 실시형태에서, CD4+ T 세포를 하위집단으로 추가 분류한다. 예를 들어, CD4+ T 헬퍼 세포를 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 식별함으로써 나이브, 중앙 기억 및 이펙터 세포로 분류할수 있다. CD4+ 림프구를 표준 방법에 의해 수득할 수 있다. 일부 실시형태에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ CD4+ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 중앙 기억 CD4+ 세포는 CD62L 양성 및 CD45RO 양성이다. 일부 실시형태에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L 및 CD45RO 음성이다.
면역 이펙터 세포, 예컨대 T 세포를 공지된 방법을 사용하여 단리한 후에 유전자 변형시키거나, 또는 면역 이펙터 세포를 유전자 변형시키기 전에 시험관내에서 활성화 및 확장시킬 수 있다(또는 전구세포의 경우 분화시킬 수 있다). 특별한 실시형태에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포를 본 명세서에서 고려되는 키메릭 항원 수용체로 유전자 변형시키고(예를 들어 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시키고) 이어서 시험관내에서 활성화 및 확장시킨다. 다양한 실시형태에서, T 세포를 예를 들어 미국 특허 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공보 20060121005에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여, CAR을 발현하도록 유전자 변형시키기 전 또는 후에 활성화 및 확장시킬 수 있다.
일반적으로, T 세포를 CD3 TCR 복합체 결합된 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면상의 공-자극 분자를 자극하는 리간드를 세포에 부착된 표면과 접촉시킴으로써 확장시킨다. T 세포 집단을 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면상에 고정화된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어(ionophore)와 함께 단백질 키나제 C 활성제(예를 들어 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극할 수 있다. T 세포 표면 상의 보조 분자의 공-자극이 또한 고려된다.
특별한 실시형태에서, PBMC 또는 단리된 T 세포를, 적절한 사이토카인, 예를 들어 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15가 있는 배양 배지에서 비드 또는 다른 표면에 일반적으로 부착된 자극제 및 공자극제, 예를 들어 항-CD3 및 항-CD28 항체와 접촉시킨다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(디아시온(Diacione), 프랑스 브장송 소재)을 포함하며 관련 기술 분야에 통상적으로 공지된 다른 방법에서와 같이 사용할 수 있다(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999). 동일한 비드에 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체는 "대용(surrogate)" 항원 제시 세포(APC)로서 작용한다. 다른 실시형태에서, T 세포를 US6040177; US5827642; 및 WO2012129514에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 배양보조 세포 및 적합한 항체 및 사이토카인과 함께 증식을 위해 활성화시키고 자극할 수 있다.
다른 실시형태에서, 인공 APC(aAPC)를, K562, U937, 721.221, T2 및 C1R 세포를 다양한 공-자극 분자 및 사이토카인의 안정한 발현 및 분비를 지시하도록 조작함으로써 제조하였다. 특별한 실시형태에서 K32 또는 U32 aAPC를 사용하여 AAPC 세포 표면 상의 하나 이상의 항체-계 자극 분자의 디스플레이를 지시한다. aAPC 상의 유전자의 다양한 조합들의 발현은, aAPC가 특정한 성장 요건 및 별개의 기능을 갖는 T-세포 부분집합의 최적의 증식에 맞출 수 있도록 인간 T-세포 활성화 요건의 정확한 측정을 가능하게 한다. aAPC는 기능성 인간 CD8 T 세포의 생체외 성장 및 장기간 확장을, 천연 APC의 사용과 대조적으로, 외인성 사이토카인을 첨가할 필요 없이 지지한다. T 세포의 집단을 CD137L(4-1BBL), CD134L(OX40L) 및/또는 CD80 또는 CD86을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 공자극 분자를 발현하는 aAPC에 의해 확장시킬 수 있다. 최종적으로, aAPC는 유전자 변형된 T 세포를 확장시키고 CD8 T 세포 상에서 CD28 발현을 유지시키기에 효율적인 플랫폼을 제공한다. WO03/057171 및 US2003/0147869에 제공된 aAPC는 내용 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
일 실시형태에서, CD34+ 세포를 본 발명에 따라 핵산 구축물로 형질도입시킨다. 특정 실시형태에서, 형질도입된 CD34+ 세포는 대상체 내로의 투여에 이어서 생체내에서 성숙한 면역 이펙터 세포로 분화하며, 일반적으로 대상체로부터 세포가 최초로 단리되었다. 또 다른 실시형태에서, CD34+ 세포를 본 명세서에 기술된 바와 같은 CAR에 노출 전 또는 CAR로 유전자 변형 후에, 상기에 기술된 방법(Asheuer et al., 2004; Imren, et al., 2004)에 따라 하기의 사이토카인 중 하나 이상으로 자극할 수 있다: Flt-3 리간드(FLT3), 줄기세포 인자(SCF), 거핵세포(megakaryocyte) 성장 및 분화 인자(TPO), IL-3 및 IL-6.
본 발명은 암의 치료를 위한 변형된 면역 이펙터 세포의 집단을 제공하며, 변형된 면역 이펙터 세포는 본 명세서에 개시된 바와 같은 CAR을 포함한다. 예를 들어, 변형된 면역 이펙터 세포의 집단을 본 명세서에 기술된 B 세포 악성종양이 있는 것으로 진단된 환자(자가유래성 공여체)로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 제조한다. PBMC는 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+일 수 있는 T 림프구의 이질 집단을 형성한다.
PBMC는 또한 NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 다른 세포독성 림프구를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 고려 되는 CAR의 암호화 서열을 운반하는 발현 벡터를 인간 공여체 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포의 집단 내로 도입시킬 수 있다. 발현 벡터를 운반하는 성공적으로 형질도입된 T 세포를 유세포 분석기를 사용하여 분류하여 CD3 양성 T 세포를 단리하고 이어서 추가로 증식시켜, 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체 및 IL-2를 사용하거나 또는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여, 세포 활성화 외에 이러한 CAR 단백질 발현 T 세포의 수를 증가시킬 수 있다. 인간 대상체에 사용하기 위한 저장 및/또는 제조를 위해 상기 CAR 단백질 T 세포를 발현하는 T 세포의 저온보존에 대한 표준 절차를 사용한다. 일 실시형태에서, T 세포의 시험관내 형질도입, 배양 및/또는 확장을 비-인간 동물 유래된 생산물, 예를 들어 송아지 태아 혈청 및 소 태아 혈청의 부재하에서 수행한다. PBMC의 이질 집단을 유전자 변형시키기 때문에, 생성되는 형질도입된 세포는 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 BCMA 표적화 CAR을 포함하는 변형된 세포의 이질 집단이다.
추가 실시형태에서, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과의 상이한 발현 벡터의 혼합물을 면역 이펙터 세포의 공여체 집단의 유전자 변형에 사용할 수 있으며, 여기서 각각의 벡터는 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 상이한 키메릭 항원 수용체 단백질을 암호화한다. 생성되는 변형된 면역 이펙터 세포는 변형된 세포의 혼합된 집단을 형성하며, 변형된 세포의 일부는 하나 초과의 상이한 CAR 단백질을 발현한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 BCMA 단백질을 표적화하는 유전자 변형된 뮤린, 인간 또는 인간화된 CAR 단백질 발현 면역 이펙터 세포의 분류 방법을 제공하며, 방법은 면역 이펙터 세포를 세포가 해동시 생육 가능하게 남아있도록 저온보존하는 단계를 포함한다. CAR 단백질을 발현하는 면역 이펙터 세포의 분획을 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해 저온보존하여 B 세포 관련된 병태에 걸린 환자의 차후 치료를 위해 상기와 같은 세포의 영구적인 공급원을 제공할 수 있다. 필요한 경우, 저온보존된 형질전환된 면역 이펙터 세포를 보다 많은 상기와 같은 세포를 위해 해동시키고, 증식시키고, 확장시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "저온보존"은 세포를 영하 온도, 예를 들어 (전형적으로) 77K 또는 -196℃(액체 질소의 비등점)로 냉각시킴으로써 보존함을 지칭한다. 저온보호제는 종종, 보존하려는 세포를 저온에서의 동결 또는 실온으로의 가온으로 인한 손상으로부터 방지하기 위해 영하의 온도에서 사용된다. 저온보존제 및 최적의 냉각속도는 세포 손상을 보호할 수 있다. 사용될 수 있는 저온보호제는 다이메틸 설폭사이드(DMSO)(Lovelock and Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), 글리세롤, 폴리비닐피롤리딘(Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576), 및 폴리에틸렌 글리콜 (Sloviter and Ravdin, Nature, 1962; 196: 48)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 바람직한 냉각 속도는 1 내지 3℃/분이다. 적어도 2시간 후에, T 세포는 -80℃의 온도에 도달하며, 이를 예를 들어 장기간 저온 보관 용기에서의 영구 보관을 위해 액체 질소(-196℃)에 직접 넣을 수 있다.
H. T 세포 제조 방법
본 명세서에서 고려되는 방법에 의해서 제조된 T 세포는 개선된 입양 면역요법 조성물을 제공한다. 임의의 특정 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 본 명세서에서 고려되는 방법에 의해서 제조된 T 세포 조성물은 증가된 생존율, 분화의 상대적인 부재하에서의 확장, 및 생체내 잔류성을 비롯한 우수한 특성을 갖는다. 일 실시형태에서, T 세포의 제조 방법은 세포를 PI3K 세포 신호전달 경로를 조절하는 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, T 세포의 제조 방법은 세포를 PI3K/Akt/mTOR 세포 신호전달 경로를 조절하는 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, T 세포를 임의의 공급원으로부터 수득하고, 제조 공정 동안 활성화 및/또는 확장 단계 동안 작용제와 접촉시킬 수 있다. 생성된 T 세포 조성물은 하기 바이오마커: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197, 및 CD38 중 하나 이상을 증식 및 발현하는 능력을 갖는 발달상 효력이 있는 T 세포가 풍부하다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 PI3K 억제제로 처리된 T 세포를 포함하는 세포의 집단은 하기 바이오마커: CD62L, CD127, CD197, 및 CD38 중 하나 이상, 또는 전부를 공-발현하는 CD8+ T 세포의 집단이 풍부하다.
일 실시형태에서, 유지되는 증식 수준 및 감소된 분화를 포함하는 변형된 T 세포를 제조한다. 특별한 실시형태에서, T 세포를 하나 이상의 자극 신호 및 PI3K 세포 신호전달 경로의 억제제인 작용제의 존재하에서 활성화되고 증식하도록 자극함으로써 T 세포를 제조한다.
이어서, T 세포를 항-BCMA CAR을 발현하도록 변형시킬 수 있다. 일 실시형태에서, T 세포를 본 명세서에서 고려되는 항-BCMA CAR를 포함하는 바이러스 벡터로 형질주입시킴으로써 변형시킨다. 특정 실시형태에서, PI3K 세포 신호전달 경로의 억제제의 존재하에서 자극 및 활성화시키기 전에 T 세포를 변형시킨다. 또 다른 실시형태에서, PI3K 세포 신호전달 경로의 억제제의 존재하에서 자극 및 활성화시킨 후에 T 세포를 변형시킨다. 특별한 실시형태에서, PI3K 세포 신호전달 경로의 억제제의 존재하에서 12시간, 24시간, 36시간, 또는 48시간 자극 및 활성화시키는 동안 T 세포를 변형시킨다.
T 세포를 활성화시킨 후에, 세포를 배양하여 증식시킨다. T 세포를 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일, 적어도 2주일, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 또는 그 초과 동안 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 또는 그 초과의 확장 라운드 동안 배양할 수 있다.
다양한 실시형태에서, PI3K 경로의 하나 이상의 억제제의 존재하에서 T 세포 조성물을 제조한다. 억제제는 그 경로에서 하나 이상의 활성 또는 단일 활성을 표적화할 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, T 세포를 제조 공정의 자극, 활성화 및/또는 확장 단계 동안 PI3K 경로의 하나 이상의 억제제로 치료 또는 접촉시키는 것이 젊은 T 세포를 우선적으로 증가시켜서 우수한 치료 T 세포 조성물을 생산한다고 고려된다.
특별한 실시형태에서, 조작된 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포의 증식을 증가시키는 방법이 제공된다. 그러한 방법은 예를 들어, 대상체로부터 T 세포의 공급원을 수확하는 단계, PI3K 경로의 하나 이상의 억제제의 존재하에서 T 세포를 자극 및 활성화시키는 단계, 항-BCMA CAR, 예를 들어, 항-BCMA02 CAR을 발현하도록 T 세포를 개질시키는 단계 및 T 세포를 배양액 중에서 확장시키는 단계를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, T 세포의 집단의 생산 방법은 하기 바이오마커: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197, 및 CD38 중 하나 이상의 발현이 풍부하다. 일 실시형태에서, 젊은 T 세포는 하기 생물학적 마커: CD62L, CD127, CD197, 및 CD38 중 하나 이상 또는 전부를 포함한다. 일 실시형태에서, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3, 및 LAG3을 발현하지 않는 젊은 T 세포가 제공된다. 본 명세서 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 젊은 T 세포 바이오마커의 발현 수준은 보다 더 분화된 T 세포 또는 면역 이펙터 세포 집단에서 그러한 마커의 발현 수준에 비례한다.
일 실시형태에서, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 본 명세서에서 고려되는 T 세포 제조 방법에서 T 세포의 공급원으로서 사용된다. PBMC는 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+일 수 있고, 다른 단핵 세포, 예컨대 단핵구, B 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함할 수 있는 T 림프구의 이질 집단을 형성한다. 조작된 TCR 또는 본 명세서에서 고려되는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 인간 공여체 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포의 집단에 도입할 수 있다. 발현 벡터를 운반할 수 있는 성공적으로 형질도입된 T 세포를 유세포 분석기를 사용하여 분류하여 CD3 양성 T 세포를 단리하고, 이어서 추가로 증식시켜서 항-CD3 항체 및 또는 항-CD28 항체 및 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15 또는 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 다른 방법을 사용하는 세포 활성화에 더하여 변형된 T 세포의 수를 증가시킬 수 있다.
본 명세서에서 고려되는 제조 방법은 인간 대상체에서 사용하기 위해서 저장 및/또는 제조 동안 변형된 T 세포의 저온보존을 추가로 포함할 수 있다. T 세포는 세포가 해동시 생육 가능하게 유지되도록 저온보존된다. 필요할 경우, 저온보존된 형질전환된 면역 이펙터 세포를 보다 그러한 세포를 위해서 해동, 성장 및 확장시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "저온보존"은 영하의 온도, 예컨대(전형적으로는) 77 K 또는 -196℃(액체 질소의 비등점)로 냉각시킴으로써 세포를 보존하는 것을 지칭한다. 저온보호제는 종종 보존될 세포를 저온에서의 동결 또는 실온으로의 가온으로 인한 손상으로부터 보호하도록 영하의 온도에서 사용된다. 저온보존제 및 최적의 냉각 속도는 세포 상해를 보호할 수 있다. 사용될 수 있는 냉동보호제는 다이메틸 설폭사이드(DMSO)(Lovelock and Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), 글리세롤, 폴리비닐피롤리딘(Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576), 및 폴리에틸렌 글리콜(Sloviter and Ravdin, Nature, 1962; 196: 48)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 바람직한 냉각 속도는 1° 내지 3℃/분이다. 적어도 2시간 후에, T 세포는 -80℃의 온도에 도달하며, 이를 예를 들어 장기간 저온 보관 용기에서의 영구 보관을 위해 액체 질소(-196℃)에 직접 넣을 수 있다.
1. T 세포
본 발명은 개선된 CAR T 세포 조성물의 제조를 고려한다. CAR T 세포 생산을 위해서 사용되는 T 세포는 자가유래성(autologous)/자가성(autogeneic)("자가") 또는 비-자가유래성("비-자가" 예를 들어, 동종이계, 동계 또는 이종)일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, T 세포는 포유동물 대상체로부터 수득된다. 보다 바람직한 실시형태에서, T 세포는 영장류 대상체로부터 수득된다. 가장 바람직한 실시형태에서, T 세포는 인간 대상체로부터 수득된다.
T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉수, 비장 조직, 및 종양을 포함하지만 이들로 제한되지 않은 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 수의 기술, 예컨대 침강, 예를 들어 FICOLL(상표명) 분리법을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 일 실시형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출법에 의해서 수득된다. 분리반출법 생산물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구를 비롯한 림프구를 함유한다. 일 실시형태에서, 분리반출법에 의해서 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 후속 가공을 위해서 적절한 완충제 또는 배지 중에 세포를 배치할 수 있다. 세포를 PBS로 또는 칼슘, 마그네슘 및 전부는 아니지만 대부분의 다른 2가 양이온이 없는 또 다른 적합한 용액으로 세척할 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 인지될 바와 같이, 세척 단계는 관련 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대 반자동화 병류식 원심분리를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 코브 2991 세포 가공기, 박스터 사이토메이트 등. 세척 후에, 세포를 다양한 생체적합성 완충제 또는 완충제가 존재하거나 존재하지 않는 다른 염수 용액 중에서 재현탁할 수 있다. 특정 실시형태에서, 분리반출법 샘플의 바람직하지 않은 성분을 배양 배지에 직접 재현탁된 세포에서 제거할 수 있다.
특별한 실시형태에서, T 세포를 포함하는 세포의 집단, 예를 들어 PBMC가 본 명세서에서 고려되는 제조 방법에서 사용된다. 다른 실시형태에서, T 세포의 단리 또는 정제된 집단이 본 명세서에서 고려되는 제조 방법에서 사용된다. 세포는 적혈구 세포를 용해시키고, 단핵구를 고갈시킴으로써, 예를 들어 PERCOLL(상표명) 구배를 통한 원심분리에 의해서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, PBMC의 단리 후에, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구 둘 모두는 활성화, 확장 및/또는 유전자적 변형 전에 또는 후에 나이브, 기억 및 이펙터 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.
하기 마커: D3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62, CD127, 및 HLA-DR 중 하나 이상을 발현하는, T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해서 추가로 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, i) CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; 또는 ii) CD38 또는 CD62L, CD127, CD197, 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상을 발현하는, T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해서 추가로 단리된다. 다양한 실시형태에서, 제조된 T 세포 조성물은 하기 마커: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3, 및 LAG3 중 하나 이상을 발현하지 않거나 또는 실질적으로 발현하지 않는다.
일 실시형태에서, CD62L, CD127, CD197, 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 억제제 없이 활성화 및 확장된 T 세포의 집단에 비해서 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배, 또는 그 초과가 증가된다.
일 실시형태에서, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3, 및 LAG3으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 억제제와 함께 활성화 및 확장된 T 세포의 집단에 비해서 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배, 또는 그 초과가 감소된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 제조 방법은 나이브 또는 발달상 효력이 있는 T 세포의 하나 이상의 마커를 포함하는 CAR T 세포의 수를 증가시킨다. 임의의 특정 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 본 발명자들은 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 하나 이상의 PI3K 억제제로 처리하는 것이 발달상 효력이 있는 T 세포의 확장 증가를 유발하고, 기존의 CAR T 세포 요법에 비해서 효능이 있는 입양 CAR T 세포 면역요법을 제공한다고 생각한다.
본 명세서에서 고려되는 방법을 사용하에 제조된 T 세포에서 증가된 나이브 또는 발달상 효력이 있는 T 세포의 마커의 예시적인 예는 CD62L, CD127, CD197 및 CD38을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 특별한 실시형태에서, 나이브 T 세포는 하기 마커: CD57, CD244, CD160, PD-1, BTLA, CD45RA, CTLA4, TIM3 및 LAG3 중 하나 이상을 발현하지 않거나 또는 실질적으로 발현하지 않는다.
T 세포와 관련하여, 본 명세서에서 고려되는 다양한 확장 방법으로부터 유발된 T 세포 집단은 사용된 조건에 따라서 다양한 특정 표현형 특성을 가질 수 있다. 다양한 실시형태에서, 확장된 T 세포 집단은 하기 표현형 마커: CD62L, CD127, CD197, CD38, 및 HLA-DR 중 하나 이상을 포함한다.
일 실시형태에서, 그러한 표현형 마커는 CD62L, CD127, CD197, 및 CD38 중 하나 이상 또는 전부의 향상된 발현을 포함한다. 특별한 실시형태에서, CD62L, CD127, CD197, 및 CD38을 비롯한 나이브 T 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 하는 CD8+ T 림프구를 확장시킨다.
특별한 실시형태에서, CD45RO, CD62L, CD127, CD197, 및 CD38을 비롯한 중앙 기억 T 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 하고, 그란자임 B에 대해서 음성인 T 세포를 확장시킨다. 일부 실시형태에서, 중앙 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다.
특정 실시형태에서, CD62L을 비롯한 나이브 CD4+ 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 하고, CD45RA 및/또는 CD45RO의 발현에 대해서 음성인 CD4+ T 림프구를 확장시킨다. 일부 실시형태에서, CD62L을 비롯하여 중앙 기억 CD4+ 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 하고, CD45RO 양성인 CD4+ 세포. 일부 실시형태에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L 양성이고, CD45RO 음성이다.
특정 실시형태에서, 항-BCMA CAR을 발현하도록 유전자 변형시키기 전에, T 세포를 개체로부터 단리하고, 활성화 및 자극하여 시험관내에서 증식시킨다. 이와 관련하여, 유전자 변형시키기(즉, 본 명세서에서 고려되는 항-BCMA CAR을 발현하도록 형질도입 또는 형질감염시킴) 전에 그리고/또는 후에 T 세포 배양할 수 있다.
2. 활성화 및 확장
충분한 치료 용량의 T 세포 조성물을 달성하기 위해서, T 세포를 종종 자극, 활성화 및/또는 확장의 하나 이상의 라운드에 적용한다. 예를 들어, 전문이 참고로 본 명세서에 포함된 미국 특허 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 및 6,867,041에 기술된 방법을 일반적으로 사용하여 T 세포를 활성화 및 확장시킬 수 있다. T 세포를 변형시키기 전에 그리고/또는 후에 항-BCMA CAR을 발현하도록 변형된 T 세포를 활성화 및 확장시킬 수 있다. 또한, 활성화 및/또는 확장 전에, 그 동안 및/또는 그 후에 T 세포를 PI3K 세포 신호전달 경로를 조절하는 하나 이상의 작용제와 접촉시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 방법에 의해서 제조된 T 세포를 활성화 및 확장의 1, 2, 3, 4, 또는 5, 또는 그 초과의 라운드에 적용하고, 이들 각각은 PI3K 세포 신호전달 경로를 조절하는 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 공자극 리간드가 T 세포 상에서 동족(cognate) 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 항원 존재 세포(예를 들어, aAPC, 덴드리틱 세포, B 세포 등) 상에 존재하여, 예를 들어 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해서 제공되는 주요 신호에 더하여, 목적하는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공한다. 적합한 공자극 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L 1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공자극 리간드(ICOS-L), 세포간 접착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, ILT3, ILT4, Toll 리간드 수용체와 결합하는 효능제 또는 항체, 및 B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
특별한 실시형태에서, 공자극 리간드는 CD27, CD28, 4- IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, 1COS, 림프구 기능-관련 항원- 1(LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, T 세포 상에 존재하는 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
적합한 공자극 리간드는 변형된 T 세포 상에서 발현된 조작된 TCR 또는 CAR과 결합하는 APC 또는 aAPC 상에서 발현되거나 가용성 형태로 제공될 수 있는 표적 항원을 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 T 세포의 제조 방법은 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 활성화하고, T 세포의 집단을 확장시키는 것을 포함한다. T 세포 활성화는 T 세포 TCR/CD3 복합체를 통해서 또는 CD2 표면 단백질의 자극을 통해서 주요 자극 신호를 제공하고, 보조 분자, 예를 들어 CD28을 통해서 2차 공자극 신호를 제공함으로써 달성될 수 있다.
TCR/CD3 복합체는 T 세포를 적합한 CD3 결합제, 예를 들어 CD3 리간드 또는 항-CD3 단클론성 항체와 접촉시킴으로써 자극될 수 있다. CD3 항체의 예시적인 예는 OKT3, G19-4, BC3 및 64.1을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
또 다른 실시형태에서, CD2 결합제를 사용하여 주요 자극 신호를 T 세포에 제공할 수 있다. CD2 결합제의 예시적인 예는 CD2 리간드 및 항-CD2 항체, 예를 들어, T11.1 또는 T11.2 항체와 조합된 T11.3 항체(Meuer, S. C. et al. (1984) Cell 36:897-906) 및 9-1 항체와 조합된 9.6 항체(이것은 TI 1.1과 동일한 에피토프를 인식함)(Yang, S. Y. et al.(1986) J. Immunol. 137:1097-1100)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 상기에 기술된 항체 중 임의의 것과 동일한 에피토프에 결합하는 다른 항체가 또한 사용될 수 있다. 본 명세서 다른 곳에 개시된 바와 같은 표준 기술을 사용하여 추가적인 항체, 또는 항체의 조합을 제조 및 식별할 수 있다.
TCR/CD3 복합체를 통해서 또는 CD2를 통해서 제공된 주요 자극 신호에 더하여, T 세포 반응의 유도가 2차 공자극 신호를 요구한다. 특별한 실시형태에서, CD28 결합제를 사용하여 공자극 신호를 제공할 수 있다. CD28 결합제의 예시적인 예는 천연 CD 28 리간드, 예를 들어, CD28에 대한 천연 리간드(예를 들어, 단백질의 B7과의 구성원, 예컨대 B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86); CD28 분자를 가교할 수 있는 항-CD28 단클론성 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 단클론성 항체 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8, 248.23.2, 및 EX5.3D10을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에서, 주요 자극 신호를 제공하는 분자, 예를 들어 TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통해서 자극을 제공하는 분자, 및 공자극 분자를 동일한 표면에 결합시킨다.
특정 실시형태에서, 자극 신호 및 공자극 신호를 제공하는 결합제를 세포의 표면 상에 국지화시킨다. 이는 세포를 세포 표면 상에서의 이의 발현에 적합한 형태로 결합제를 암호화하는 핵산으로 형질감염 또는 형질도입함으로써, 또는 대안적으로는 세포 표면에 결합제를 커플링시킴으로써 달성될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 주요 자극 신호를 제공하는 분자, 예를 들어 TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통해서 자극을 제공하는 분자, 및 공자극 분자를 항원 존재 세포 상에 디스플레이한다.
일 실시형태에서, 주요 자극 신호를 제공하는 분자, 예를 들어 TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통해서 자극을 제공하는 분자, 및 공자극 분자를 별개의 표면 상에 제공한다.
특정 실시형태에서, 자극 신호 및 공자극 신호를 제공하는 결합제 중 하나는 가용성(용액 중에 제공됨)이고, 나머지 결합제(들)를 하나 이상의 표면 상에 제공한다.
특별한 실시형태에서, 자극 신호 및 공자극 신호를 제공하는 결합제 둘 모두를 가용성 형태(용액 중에 제공됨)로 제공하다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 T 세포의 제조 방법은 T 세포를 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 활성화시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 고려되는 방법에 의해서 제조된 T 세포 조성물은 PI3K 세포 신호전달 경로를 억제하는 하나 이상의 작용제의 존재하에서 활성화 및/또는 확장된 T 세포를 포함한다. 항-BCMA CAR을 발현하도록 변형된 T 세포는 T 세포를 변형시키기 전에 그리고/또는 변형시킨 후에 활성화 및/또는 확장될 수 있다. 특별한 실시형태에서, T 세포의 집단을 활성화시키고, 항-BCMA CAR을 발현하도록 변형시키고, 이어서 확장을 위해서 배양한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 방법에 의해서 제조된 T 세포는 높은 증식 가능성 및 T 세포 분화의 검출 가능하지 않은 마커를 발현하지 않거나 또는 실질적으로 발현하지 않는 자가-재개 능력을 나타내는 증가된 수의 T 세포 발현 마커를 포함한다. 이러한 T 세포는 견고한 방식으로 반복적으로 활성화 및 확장될 수 있고, 이에 의해서 개선된 치료 T 세포 조성물을 제공할 수 있다.
일 실시형태에서, PI3K 세포 신호전달 경로를 억제하는 하나 이상의 작용제의 존재하에서 활성화 및 확장된 T 세포의 집단은 PI3K 억제제 없이 활성화 및 확장된 T 세포의 집단에 비해서 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 250배, 적어도 500배, 적어도 1000배, 또는 그 초과로 확장된다.
일 실시형태에서, PI3K 세포 신호전달 경로를 억제하는 하나 이상의 작용제의 존재하에서 활성화 및 확장된 젊은 T 세포의 마커의 발현을 특징으로 하는 T 세포의 집단은 PI3K 억제제 없이 활성화 및 확장된 T 세포의 집단에 비해서 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 250배, 적어도 500배, 적어도 1000배, 또는 그 초과로 확장된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 방법에 의해서 활성화된 T 세포의 확장은 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 수 시간(약 3시간) 내지 약 7일 내지 약 28일 또는 그 사이의 임의의 시간 단위의 정수 값 동안 배양하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, T 세포 조성물을 14일 동안 배양할 수 있다. 특별한 실시형태에서, T 세포를 약 21일 동안 배양한다. 또 다른 실시형태에서, T 세포 조성물을 약 2 내지 3일 동안 배양한다. 자극/활성화/확장의 수회 사이클이 또한 바람직할 수 있어서, T 세포의 배양 시간은 60일 이상일 수 있다.
특별한 실시형태에서, T 세포 배양에 적절한 조건은 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지(Minimal Essential Media) 또는 RPMI 배지 1640 또는, 엑스-비보(X-vivo) 15, (론자(Lonza))), 및 혈청(예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL- 10, IL- 12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 통상의 기술자에게 공지된 세포의 성장에 적합한 임의의 다른 첨가제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 증식 및 생존에 필요한 하나 이상의 인자를 포함한다.
세포 배양 배지의 추가로 예시적인 예는 RPMI 1640, 클릭스(Clicks), AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, 엑스-비보 1 5, 및 엑스-비보 20, 옵티마이저를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들은 아미노산, 소듐 피루베이트, 및 비타민이 첨가되어 있고, 무-혈청이거나 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 규정된 세트의 호르몬, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 사이토카인(들)의 양이 보충되어 있다.
T 세포 확정을 위한 다른 첨가제의 예시적인 예는 계면활성제, 피아스마네이트(piasmanate), pH 완충제, 예컨대 HEPES, 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다
항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양액에만 포함되고, 대상체에게 주입되려는 세포의 배양액에는 포함되지 않는다. 표적 세포를 성장을 지지하는 데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 대기(예를 들어, 공기 + 5% C02)하에서 유지시킨다.
특별한 실시형태에서, PBMC 또는 단리된 T 세포를 적절한 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15가 있는 배양 배지 중에서 일반적으로 비드 또는 다른 표면에 부착된 자극제 및 공자극제, 예컨대 항-CD3 및 항-CD28 항체와 접촉시킨다.
다른 실시형태에서, K562, U937, 721.221, T2, 및 C1R 세포를 다양한 공자극 분자 및 사이토카인의 안정한 발현 및 분비를 유도하도록 조작함으로써 인공 APC(aAPC)를 제조한다. 특별한 실시형태에서 K32 또는 U32 aAPC를 사용하여 AAPC 세포 표면 상에 하나 이상의 항체-계 자극 분자의 디스플레이를 유도한다. CD137L(4-1BBL), CD134L(OX40L), 및/또는 CD80 또는 CD86을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 공자극 분자를 발현하는 aAPC에 의해서 T 세포의 집단을 확장시킬 수 있다. 최종적으로, aAPC는 유전자 변형된 T 세포를 확장시키고, CD8 T 세포 상에서 CD28 발현을 유지시키는 효율적인 플랫폼을 제공한다. WO 03/057171 및 US2003/0147869에 제공된 aAPC가 전문이 참고로 포함된다.
3. 작용제
다양한 실시형태에서, T 세포를 세포에서 PI3K 경로를 조절하는 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는 미분화된 또는 발달상 효력이 있는 T 세포를 확장시키는 T 세포의 제조 방법이 제공된다. 다양한 실시형태에서, T 세포를 세포에서 PI3K/AKT/mTOR 경로를 조절하는 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는 미분화된 또는 발달상 효력이 있는 T 세포를 확장시키는 T 세포의 제조 방법이 제공된다. 세포를 활성화 및 확장 전에, 그 동안 및/또는 그 후에 접촉시킬 수 있다. T 세포 조성물은 그것이 분화를 실질적으로 증가시키지 않으면서 다수의 라운드의 확장을 겪을 수 있도록 충분한 T 세포 효력을 보유한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "조절하다", "조절자" 또는 "조절제" 또는 대등한 용어는 세포 신호전달 경로에서의 변화를 도출하는 작용제의 능력을 지칭한다. 조절자는 경로 성분의 양, 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있거나, 세포 신호전달 경로의 목적하는 효과 또는 산출을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 조절자는 억제제이다. 또 다른 실시형태에서, 조절자는 활성제이다.
"작용제"는 PI3K/AKT/mTOR 경로의 조절에서 사용되는 화합물, 소분자, 예를 들어 유기 소분자, 핵산, 폴리펩타이드, 또는 이의 단편, 동형체(isoform), 변이체, 유사체, 또는 유도체를 지칭한다.
"소분자"는 약 5 kD 미만, 약 4 kD 미만, 약 3 kD 미만, 약 2 kD 미만, 약 1 kD 미만, 또는 약 .5kD 미만의 분자량을 갖는 조성물을 지칭한다. 소분자는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 펩타이드 모방체(peptidomimetic), 펩토이드, 탄수화물, 지질, 이의 성분 또는 다른 유기 또는 무기 분자를 포함할 수 있다. 화학적 및/또는 생물학적 혼합물, 예컨대 진균, 박테리아 또는 조류(algal) 추출물의 라이브러리가 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 본 발명의 검정법 중 임의의 것을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법의 예는 문헌[Carell et al., 1994a; Carell et al., 1994b; Cho et al., 1993]; [DeWitt et al., 1993; Gallop et al., 1994; Zuckermann et al., 1994]에서 찾아볼 수 있다.
"유사체"는 화합물, 뉴클레오타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 본 발명의 목적하는 활성을 갖는 화합물과 유사하거나 동일한 활성을 갖지만 바람직한 실시형태의 서열 또는 구조와 유사하거나 동일한 서열 또는 구조를 반드시 포함할 필요는 없는 작은 유기 화합물, 뉴클레오타이드, 단백질, 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.
"유도체"는 아미노산 잔기 치환의 도입, 결실 또는 부가에 의해서 변경되거나, 또는 뉴클레오타이드 치환의 도입 또는 결실, 부가 또는 돌연변이에 의해서 변형된 모 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 화합물, 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 유도체 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드는 모 폴리펩타이드와 유사하거나 동일한 기능을 보유한다.
다양한 실시형태에서, PI3K 경로를 조절하는 작용제는 경로의 성분을 활성화한다. "활성제," 또는 "효능제"는 PI3K의 하나 이상의 활성을 억제하는 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 PI3K/AKT/mTOR 경로에서 분자의 하나 이상의 활성을 촉진, 증가 또는 유도하는 작용제를 지칭한다.
다양한 실시형태에서, PI3K 경로를 조절하는 작용제는 경로의 성분을 억제한다. "억제제" 또는 "길항제"는 PI3K를 포함하지만 이에 제한되지 않은 PI3K 경로에서 분자의 하나 이상의 활성을 억제, 감소 또는 감쇠시키는 작용제를 지칭한다. 일 실시형태에서, 억제제는 이중 분자 억제제이다. 특별한 실시형태에서, 억제제는 동일하거나 실질적으로 유사한 활성을 갖는 분자의 부류를 억제할 수 있거나(pan-억제제) 또는 분자의 활성을 특이적으로 억제할 수 있다(선택적인 또는 특이적인 억제제). 억제는 또한 비가역적 또는 가역적일 수 있다.
일 실시형태에서, 억제제는 적어도 1nM, 적어도 2nM, 적어도 5nM, 적어도 10nM, 적어도 50nM, 적어도 100nM, 적어도 200nM, 적어도 500nM, 적어도 1μM, 적어도 10μM, 적어도 50μM, 또는 적어도 100μM의 IC50을 갖는다. IC50 측정은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 종래의 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, IC50은 연구하에서 다양한 농도의 억제제의 존재하에서 주어진 효소의 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다. 이어서, 실험적으로 수득된 효소 활성 값을 사용된 억제제 농도에 대해서 플로팅한다. (어떤 억제제도 없는 활성에 비해서) 50% 효소 활성을 나타내는 억제제의 농도를 "IC50" 값으로서 취한다. 유사하게, 다른 억제 농도를 적절한 활성 측정을 통해서 규정할 수 있다.
다양한 실시형태에서, T 세포를 적어도 1nM, 적어도 2nM, 적어도 5nM, 적어도 10nM, 적어도 50nM, 적어도 100nM, 적어도 200nM, 적어도 500nM, 적어도 1μM, 적어도 10μM, 적어도 50μM, 적어도 100μM, 또는 적어도 1M의 농도에서 PI3K 경로의 하나 이상의 조절자와 접촉시키거나 또는 그것으로 처리하거나 또는 그것과 함께 배양한다.
특별한 실시형태에서, T 세포를 적어도 12시간, 18시간, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일, 적어도 2주일, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 또는 그 초과 동안 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 또는 그 초과의 라운드의 확장으로 PI3K 경로의 하나 이상의 조절자와 접촉시키거나 또는 그것으로 처리하거나 또는 그것과 함께 배양할 수 있다.
a. PI3K/Akt/mTOR 경로
라파마이신 경로의 포스파티딜-이노시톨-3 카이나제/Akt/포유동물 표적은 세포 증식, 분화, 대사 및 생존과 함께 성장 인자 신호전달을 통합하기 위한 도관(conduit)으로서 작용한다. PI3K은 고도로 보존된 세포내 지질 카이나제 과이다. 클래스 IA PI3K는 성장 인자 수용체 티로신 카이나제(RTK)에 의해서, 직접 또는 어댑터 분자의 인슐린 수용체 기질 과와의 상호 작용을 통해서 활성화된다. 이러한 활성화는 세린/트레오닌 카이나제 Akt의 조절인자인 포스파티딜-이노시톨-3,4,5-트라이포스페이트(PIP3)의 생산을 유발한다. mTOR은 각각 구별되는 활성을 부여하는 상이한 결합 짝을 특징으로 하는, 2개의 구별되는 복합체를 통해서 정규 PI3K 경로를 통해서 작용한다. mTORC1(PRAS40, 랩터(raptor), 및 mLST8/GbL과 복합되는 mTOR)은 PI3K/Akt 신호전달의 하류 이펙터로서 작용하여, 성장 인자 신호를 단백질 번역, 세포 성장, 증식 및 생존과 연결한다. mTORC2(릭터(rictor), mSIN1, 프로토(protor), 및 mLST8과 복합되는 mTOR)는 Akt의 상류 활성제로서 작용한다.
PI3K의 성장 인자 수용체-매개된 활성화 시, Akt는 이의 플렉스트린 상동성 도메인(pleckstrin homology domain)과 PIP3의 상호작용을 통해서 막으로 모집되고, 따라서 이의 활성화 고리를 노출시키고, 구성적으로 활성인 포스포이노시타이드-의존성 단백질 카이나제 1(PDK1)에 의해서 트레오닌 308(Thr308)에서 포스포릴화를 가능하게 한다. 최대 활성화를 위해서, Akt는 또한 이의 C-말단 소수성 모티프의 세린 473(Ser473)에서 mTORC2에 의해서 포스포릴화된다. DNA-PK 및 HSP가 또한 Akt 활성의 조절에서 중요한 것으로 밝혀져 있다. Akt는 TSC2의 억제적인 포스포릴화를 통해서 mTORC1을 활성화시키는데, 이것은 TSC1과 함께, mTORC1의 양성 조절인자인 Rheb GTPase를 억제함으로써 mTORC1을 음성적으로 조절한다. mTORC1은 2종의 널리-규정된 기질, 즉 p70S6K(이하에서 S6K1이라 칭함) 및 4E-BP1을 갖는데, 이들 둘 모두는 단백질 합성을 상당히 조절한다. 따라서, mTORC1은 성장 인자 신호전달을 단백질 번역 및 세포 증식과 연결하는 PI3K의 중요한 하류 이펙터이다.
b. PI3K 억제제
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "PI3K 억제제"라는 용어는 PI3K에 결합하여 PI3K의 적어도 하나의 활성을 억제하는 핵산, 펩타이드, 화합물 또는 유기 소분자를 지칭한다. PI3K 단백질은 3종의 부류, 즉 클래스 1 PI3K, 클래스 2 PI3K, 및 클래스 3 PI3K로 나뉠 수 있다. 클래스 1 PI3K는 4개의 p110 촉매작용 소단위(p110α, p110β, p110δ, 및 p110γ) 중 하나 그리고 조절 소단위의 2개의 과 중 하나로 이루어진 헤테로이량체로서 존재한다. 본 발명의 PI3K 억제제는 바람직하게는 클래스 1 PI3K 억제제를 표적화한다. 일 실시형태에서, PI3K 억제제는 클래스 1 PI3K 억제제의 하나 이상의 동형체에 대해서 특이성(즉, p110α, p110β, p110δ, 및 p110γ, 또는 p110α, p110β, p110δ, 및 p110γ 중 하나 이상에 대해서 특이적임)을 나타낼 것이다. 또 다른 양상에서, PI3K 억제제는 동형체 선택성을 나타내지 않을 것이어서, "pan-PI3K 억제제"로서 간주될 것이다. 일 실시형태에서, PI3K 억제제는 PI3K 촉매작용 도메인에 대해서 ATP와 결합을 위해서 경쟁할 것이다.
특정 실시형태에서, PI3K 억제제는 예를 들어, PI3K뿐만 아니라 PI3K-AKT-mTOR 경로에서 추가 단백질을 표적화할 수 있다. 특별한 실시형태에서, mTOR 및 PI3K 둘 모두를 표적화하는 PI3K 억제제를 mTOR 억제제 또는 PI3K 억제제라 칭할 수 있다. PI3K 만을 표적화하는 PI3K 억제제를 선택적인 PI3K 억제제라 칭할 수 있다. 일 실시형태에서, 선택적인 PI3K 억제제는 PI3K에 대한 50% 억제 농도가 mTOR 및/또는 경로의 다른 단백질에 대한 억제제의 IC50보다 적어도 10-배, 적어도 20-배, 적어도 30-배, 적어도 50-배, 적어도 100-배, 적어도 1000-배, 또는 그 초과만큼 더 낮은 작용제를 지칭하는 것으로 이해될 수 있다.
특별한 실시형태에서, 예시적인 PI3K 억제제는 약 200nM 이하, 바람직하게는 약 100nm 이하, 보다 더 바람직하게는 약 60nM 이하, 약 25nM, 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 100μM, 50μM, 25μM, 10μM, 1μM 이하의 IC50(활성의 50%를 억제하는 농도)으로 PI3K를 억제한다. 일 실시형태에서, PI3K 억제제는 약 2nM 내지 약 100nm, 보다 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 보다 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 15nM의 IC50으로 PI3K를 억제한다.
본 명세서에서 고려되는 T 세포 제조 방법에서 사용하기에 적합한 PI3K 억제제의 예시적인 예는 BKM120(클래스 1 PI3K 억제제, 노바티스(Novartis)), XL147(클래스 1 PI3K 억제제, 엑셀릭시스(Exelixis)), pan-PI3K 억제제, 글락소스미쓰클라인(GlaxoSmithKline)) 및 PX-866(클래스 1 PI3K 억제제; p110α, p110β, 및 p110γ 동형체, 온코티레온(Oncothyreon))을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
선택적인 PI3K 억제제의 다른 예시적인 예는 BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, ZSTK474 및 IPI-145를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
pan-PI3K 억제제의 추가로 예시적인 예는 BEZ235, LY294002, GSK1059615, TG100713 및 GDC-0941를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
c. AKT 억제제
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "AKT 억제제"라는 용어는 AKT의 적어도 하나의 활성을 억제하는 핵산, 펩타이드, 화합물 또는 유기 소분자를 지칭한다. AKT 억제제는 지질-기재 억제제(예를 들어 AKT가 혈장 막에 대해서 국지화되는 것을 예방하는 AKT의 플렉스트린 상동성 도메인을 표적화하는 억제제), ATP-경쟁성 억제제, 및 알로스터릭(allosteric) 억제제를 비롯한, 몇몇 부류로 분류될 수 있다. 일 실시형태에서, AKT 억제제는 AKT 촉매작용 부위에 결합함으로써 작용한다. 특별한 실시형태에서, Akt 억제제는 하류 AKT 표적, 예컨대 mTOR의 포스포릴화를 억제함으로써 작용한다. 또 다른 실시형태에서, AKT 활성은 예를 들어 AKT의 DNA-PK 활성화, AKT의 PDK-1 활성화, 및/또는 Akt의 mTORC2 활성화를 억제함으로써 Akt를 활성화하는 입력 신호를 억제함으로써 억제된다.
AKT 억제제는 3종의 AKT 동형체인 AKT1, AKT2, AKT3 전부를 표적화할 수 있거나, 동형체 선택적이어서, AKT 동형체 중 하나 또는 둘 만을 표적화할 수 있다. 일 실시형태에서, AKT 억제제는 AKT뿐만 아니라 PI3K-AKT-mTOR 경로 내의 추가 단백질을 표적화할 수 있다. AKT 만을 표적화하는 AKT 억제제를 선택적인 억제제라 칭할 수 있다. 일 실시형태에서, 선택적인 AKT 억제제는 AKT에 대한 50% 억제 농도가 경로 내의 다른 단백질에 대한 억제제의 IC50보다 적어도 10-배, 적어도 20-배, 적어도 30-배, 적어도 50-배, 적어도 100-배, 적어도 1000-배, 또는 그 초과만큼 더 낮은 작용제를 지칭한다고 이해될 수 있다.
특별한 실시형태에서, 예시적인 AKT 억제제는 약 200nM 이하, 바람직하게는 약 100nm 이하, 보다 더 바람직하게는 약 60nM 이하, 약 25nM, 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 100μM, 50μM, 25μM, 10μM, 1μM 이하의 IC50(활성의 50%를 억제하는 농도)으로 AKT를 억제한다. 일 실시형태에서, AKT는 약 2nM 내지 약 100nm, 보다 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 보다 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 15nM의 IC50으로 AKT를 억제한다.
아우리스타틴계 항체-약물 접합체와 조합하여 사용하기 위한 AKT 억제제의 예시적인 예는 예를 들어, 페리포신(케릭스(Keryx)), MK2206(머크(Merck)), VQD-002(비오퀘스트(VioQuest)), XL418(엑셀릭시스), GSK690693, GDC-0068, 및 PX316(프롤스 파마슈티컬즈(PROLX Pharmaceuticals))을 포함한다.
선택적인 Akt1 억제제의 예시적인 비제한적인 예는 A-674563이다.
선택적인 Akt2 억제제의 예시적인 비제한적인 예는 CCT128930이다.
특별한 실시형태에서, Akt 억제제 Akt의 DNA-PK 활성화, Akt의 PDK-1 활성화, Akt의 mTORC2 활성화, 또는 Akt의 HSP 활성화.
DNA-PK 억제제의 예시적인 예는 NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75 및 PP-121을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
d. mTOR 억제제
"mTOR 억제제" 또는 "mTOR을 억제하는 작용제"라는 용어는 이의 기질(예를 들어, p70S6 카이나제 1, 4E-BP1, AKT/PKB 및 eEF2) 중 적어도 하나에 대한 mTOR 단백질의 적어도 하나의 활성, 예컨대, 예를 들어, 세린/트레오닌 단백질 카이나제 활성을 억제하는 핵산, 펩타이드, 화합물, 또는 유기 소분자를 지칭한다. mTOR 억제제는 mTORC1, mTORC2 또는 mTORC1과 mTORC2 둘 모두에 직접 결합하여, 이들을 억제할 수 있다.
mTORC1 및/또는 mTORC2 활성의 억제는 PI3K/Akt/mTOR 경로의 신호 전달의 감소에 의해서 측정될 수 있다. 매우 다양한 판독치를 사용하여 그러한 신호전달 경로의 출력의 감소를 설정할 수 있다. 일부 비제한적인 예시적인 판독치는 (1) 5473 및 T308을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 잔기에서 Akt의 포스포릴화의 감소; (2) 예를 들어 Fox01/O3a T24/32, GSK3a/β; S21/9 및 TSC2 T1462를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 Akt 기질의 포스포릴화의 감소에 의해서 명백한 바와 같은 Akt의 활성화 감소; (3) 리보솜 S6 S240/244, 70S6K T389 및 4EBP1 T37/46을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 mTOR의 하류에서의 신호전달 분자의 포스포릴화의 감소; 및 (4) 암 세포의 증식 억제를 포함한다.
일 실시형태에서, mTOR 억제제는 활성 부위 억제제이다. 이것은 mTOR의 ATP 결합 부위(ATP 결합 포켓이라고도 칭함)에 결합하여, mTORC1 및 mTORC2 둘 모두의 촉매작용 활성을 억제하는 mTOR 억제제이다. 본 명세서에서 고려되는 T 세포 제조 방법에서 사용하기에 적합한 활성 부위 억제제의 한 부류는 PI3K 및 mTOR 둘 모두를 표적화하여, 이들을 직접 억제하는 이중 특이성 억제제이다. 이중 특이성 억제제는 mTOR 및 PI3K의 ATP 결합 부위 둘 모두에 결합한다. 그러한 억제제의 예시적인 예는 이미다조퀴나졸린, 보르트만닌, LY294002, PI-103(케이만 케미컬(Cayman Chemical)), SF1126(세마포어(Semafore)), BGT226(노바티스), XL765(엑셀릭시스) 및 NVP-BEZ235(노바티스)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다
본 명세서에서 고려되는 방법에서 사용하기에 적합한 mTOR 활성 부위 억제제의 또 다른 부류는 하나 이상의 타입 I 포스파티딜이노시톨 3-카이나제, 예를 들어, PI3 카이나제 α, β, γ, 또는 δ에 비해서 mTORC1 및 mTORC2를 선택적으로 억제한다. 이러한 활성 부위 억제제는 PI3K가 아닌 mTOR의 활성 부위에 결합한다. 그러한 억제제의 예시적인 예는 피라졸로피리미딘, 토린(Torin) 1(궤르틴(Guertin) 및 사바티니(Sabatini)), PP242(2-(4-아미노-1-아이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-1H-인돌-5-올), PP30, Ku-0063794, WAY-600(와이어쓰(Wyeth)), WAY-687(와이어쓰), WAY-354(와이어쓰), 및 AZD8055(Liu et al., Nature Review, 8, 627-644, 2009)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에서, 선택적인 mTOR 억제제는 mTORC1 및/또는 mTORC2에 대한 50% 억제 농도(IC50)가 1, 2, 3, 또는 그 초과의 타입 I PI3-카이나제 또는 타입 I PI3-카이나제 전부에 대한 억제제의 IC50보다 적어도 10-배, 적어도 20-배, 적어도 50-배, 적어도 100-배, 적어도 1000-배, 또는 그 초과만큼 더 낮은 작용제를 지칭한다.
본 발명에서 사용하기 위한 mTOR 억제제의 또 다른 부류를 본 명세서에서 "라파로그(rapalog)"라 칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "라파로그"라는 용어는 mTOR FRB 도메인(FKBP 라파마이신 결합 도메인)에 특이적으로 결합하고, 라파마이신과 구조적으로 관련되고, mTOR 억제 특성을 보유하는 화합물을 지칭한다. 라파로그라는 용어는 라파마이신을 제외한다. 라파로그는 라파마이신의 에스터, 에터, 옥심, 하이드라존 및 하이드록실아민, 뿐만 아니라 라파마이신 코어 구조 상의 작용기가 예를 들어 환원 또는 산화에 의해서 변형된 화합물을 포함한다. 그러한 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염이 또한 라파마이신 유도체인 것으로 고려된다. 본 명세서에서 고려되는 방법에서 사용하기에 적합한 라파로그의 예시적인 예는 템시롤리무스(CC1779), 에버롤리무스(RAD001), 데포롤리무스(AP23573), AZD8055(아스트라제네카(AstraZeneca)) 및 OSI-027(OSI)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에서, 작용제는 mTOR 억제제 라파마이신(시롤리무스)이다.
특별한 실시형태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 예시적인 mTOR 억제제는 약 200nM 이하, 바람직하게는 약 100nm 이하, 보다 더 바람직하게는 약 60nM 이하, 약 25nM, 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 100μM, 50μM, 25μM, 10μM, 1μM 이하의 IC50(활성의 50%를 억제하는 농도)으로 mTORC1, mTORC2 또는 mTORC1과 mTORC2 둘 모두를 억제한다. 일 양상에서, 본 발명에서 사용하기 위한 mTOR 억제제는 약 2nM 내지 약 100nM, 보다 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 보다 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 15nM의 IC50으로 mTORC1, mTORC2 또는 mTORC1과 mTORC2 둘 모두를 억제한다.
일 실시형태에서, 예시적인 mTOR 억제제는 약 200nM 이하, 바람직하게는 약 100nM 이하, 보다 더 바람직하게는 약 60nM 이하, 약 25nM, 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 100μM, 50μM, 25μM, 10μM, 1μM 이하의 IC50(활성의 50%를 억제하는 농도)으로 PI3K 및 mTORC1 또는 mTORC2 또는 mTORC1과 mTORC2 둘 모두 및 PI3K를 억제한다. 일 양상에서, 본 발명에서 사용하기 위한 mTOR 억제제는 약 2nM 내지 약 100nM, 보다 바람직하게는 약 2nM 내지 약 50nM, 보다 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 15nM의 IC50으로 PI3K 및 mTORC1 또는 mTORC2 또는 mTORC1과 mTORC2 둘 모두 및 PI3K를 억제한다.
본 명세서에서 고려되는 특별한 실시형태에서 사용하기에 적합한 mTOR 억제제의 추가로 예시적인 예는 AZD8055, INK128, 라파마이신, PF-04691502, 및 에버롤리무스를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
mTOR은 웨스턴 블롯팅에서 인광체(phosphor)-특이적인 항체에 의해서 측정되는 바와 같이 생리학적 기질 단백질인 p70 S6 리보솜 단백질 카이나제 I(p70S6K1) 및 eIF4E 결합 단백질 1(4EBP1)에 대해서 견고하고 특이적인 촉매작용 활성을 나타내는 것으로 밝혀져 있다.
일 실시형태에서, PI3K/AKT/mTOR 경로의 억제제는 BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK, 및 AT7867로 이루어진 군으로부터 선택된 s6 카이나제 억제제이다.
I. 조성물 및 제형
본 명세서에서 고려되는 조성물은 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 유전자 변형된 면역 이펙터 세포 등을 포함할 수 있다. 조성물은 약제학적 조성물을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. "약제학적 조성물"은 세포 또는 동물에게 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 방식과 함께 투여하기 위한 약제학적으로 허용 가능한 또는 생리학적으로 허용 가능한 용액 중에 제형화된 조성물을 지칭한다. 또한, 경우에 따라서, 본 발명의 조성물을 또한 다른 작용제, 예컨대 예를 들어 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 소분자, 화학요법제, 전구-약물, 약물, 항체 또는 다른 다양한 약제학적 활성제와 함께 투여할 수 있다고 이해될 것이다. 추가적인 작용제가 의도된 요법을 전달하는 조성물의 능력에 불리한 영향을 미치지 않는 한, 조성물에 또한 포함시킬 수 있는 다른 성분들에 대한 제한은 실질적으로 없다.
"약제학적으로 허용 가능한"이란 어구는 본 명세서에서 타당한 이익/위험 비에 적합한, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 건전한 의학적 판단의 범위내에서 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형을 지칭하는데 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 미국 식품 의약품 안전청에서 인간 또는 가축에 사용하기에 허용 가능한 것으로서 승인된 임의의 보조제, 담체, 부형제, 윤활제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 풍미 증진제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정제, 등장화제, 용매, 계면활성제 또는 유화제를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당, 예를 들어 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화 아연; 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 잇꽃유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예를 들어 글리세린, 소르톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스터, 예를 들어 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예를 들어 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; 알긴산; 무-발열원 수; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알콜; 포스페이트 완충 용액; 및 약제학적 제형에 사용되는 임의의 다른 상용성 물질을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
특별한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에서 고려되는 CAR-발현 면역 이펙터 세포의 양을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "양"이라는 용어는 임상 결과를 비롯하여 이롭거나 목적하는 예방학적 또는 치료학적 결과를 성취하기 위한 유전자 변형된 치료학적 세포, 예를 들어 T 세포의 "유효한 양" 또는 "유효량"을 지칭한다.
"예방 유효량"은 목적하는 예방학적 결과를 성취하기에 유효한 유전자 변형된 치료학적 세포의 양을 지칭한다. 전형적으로, 반드시는 아니지만, 예방학적 용량은 질환 전에 또는 질환의 초기 단계에 대상체에서 사용되므로, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적다.
유전자 변형된 치료학적 세포의 "치료 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 이끌어내는 줄기 및 전구세포의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 치료 유효량은 또한 바이러스 또는 형질도입된 치료학적 세포의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료학적으로 이로운 효과가 훨씬 큰 양이다. "치료 유효량"이라는 용어는 대상체(예를 들어 환자)를 "치료하기"에 유효한 양을 포함한다. 치료량이 지시되는 경우, 투여되는 본 발명 조성물의 정확한 양은 환자(대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 병태의 개별적인 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 102 내지 1010세포/㎏ 체중, 바람직하게는 105 내지 106세포/㎏ 체중 투여량(상기 범위내의 모든 정수 값 포함)으로 투여할 수 있다. 세포의 수는 조성물 중에 포함된 세포의 유형에서와 같이 조성물이 의도되는 최종 용도에 좌우될 것이다. 본 명세서에 제공되는 용도에 대해서, 세포는 일반적으로 리터 이하의 부피로 존재하며, 500㎖ 이하, 심지어 250㎖ 또는 100㎖ 이하일 수 있다. 따라서 목적하는 세포의 밀도는 전형적으로 106세포/㎖ 초과이고, 일반적으로 107세포/㎖ 초과, 일반적으로 108세포/㎖ 이상이다. 면역 세포의 임상적으로 적합한 수는 누적해서 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 또는 1012 세포 이상의 수회 주입으로 배분될 수 있다. 발명의 일부 양상에서, 특히 주입된 세포는 모두 특정한 표적 항원(예를 들어, κ 또는 λ 경쇄)으로 재지시될 것이므로, 106/킬로그램(106 내지 1011/환자) 범위의 보다 낮은 세포 수가 투여될 수 있다. CAR 발현 세포 조성물을 이들 범위 내의 투여량으로 수회 투여할 수 있다. 세포는 요법을 겪는 환자에게 동종이계, 동계, 이종 또는 자가유래성일 수 있다. 경우에 따라서, 치료는 또한 면역 반응의 유도를 향상시키기 위해서 본 명세서에 기재된 바와 같은 미토젠(예를 들어 PHA) 또는 림포카인, 사이토카인 및/또는 케모카인(예를 들어 IFNγ, IL-2, IL-12, TNF-알파, IL-18, 및 TNF-베타, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α 등)의 투여를 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포를 포함하는 조성물을 면역저하된(immunocompromised) 개체에서 발생하는 질환의 치료 및 예방에 사용할 수 있다. 특히, 본 명세서에서 고려되는 CAR-변형된 T 세포를 포함하는 조성물을 B 세포 악성종양의 치료에 사용한다. 본 발명의 CAR-변형된 T 세포를 단독으로 또는 담체, 희석제, 부형제, 및/또는 다른 성분들, 예를 들어 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 함께 약제학적 조성물로서 투여할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 약제학적 조성물은 유전자 변형된 T 세포의 양을 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함한다.
CAR-발현 면역 이펙터 세포 집단, 예를 들어 T 세포를 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 완충제, 예를 들어 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예를 들어 글리신; 산화방지제; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA 또는 글루타티온; 아주반트(예를 들어 수산화 알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 바람직하게는 비경구 투여, 예를 들어 혈관내(정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 근육내 투여를 위해 제형화한다.
액체 약제학적 조성물은 그것이 용액이든, 현탁액이든 또는 다른 유사한 형태이든 간에, 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어 주사용수, 염수 용액, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화 나트륨, 고정유, 예를 들어 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노 또는 다이글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항균제, 예를 들어 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 산화 방지제, 예를 들어 아스코르브산 또는 나트륨 비설파이트; 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들어 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조정제, 예를 들어 염화 나트륨 또는 덱스트로스. 비경구 제제를 앰풀, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 수회 투여용 바이알 중에 동봉할 수 있다. 주사성 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균성이다.
특별한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 조성물은 유효량의 CAR-발현 면역 이펙터 세포를 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 함께 포함한다. 따라서, CAR-발현 면역 이펙터 세포 조성물을 단독으로 또는 다른 공지된 암 치료, 예를 들어 방사선 요법, 화학요법, 이식, 면역요법, 호르몬요법, 광역동 요법 등과 함께 투여할 수 있다. 조성물을 또한 항생제와 함께 투여할 수 있다. 그러한 치료제는 관련 기술 분야에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 질환 상태, 예를 들어 특정 암에 대한 표준 치료로서 허용될 수 있다. 고려되는 예시적인 치료제는 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 소염제, 화학요법제, 방사선 요법제, 치료학적 항체, 또는 다른 활성 및 보조제를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CAR-발현 면역 이펙터 세포를 포함하는 조성물을 임의의 수의 화학요법제와 함께 투여할 수 있다. 화학요법제의 예시적인 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 사이클로포스파미드(사이톡산(CYTOXAN)(상표명)); 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 유레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포아미드, 트라이에틸렌티오포스파오라미드 및 트라이메틸올롤멜라민 레주메; 질소 머스터드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라머스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 펜에스테린, 프레드니머스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스터드; 니트로스우레아, 예를 들어 카머스틴, 클로로조토신, 포테머스틴, 로머스틴, 니머스틴, 라니머스틴; 항생제, 예를 들어 아클라시노마이신, 액티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사체, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸어, 시타라빈, 다이데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록슈리딘, 5-FU; 안드로젠, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레뷸린산; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK(등록상표); 라족산; 시조피란; 스피로제르마늄; 테누아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2"-트라이클로로트라이에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노머스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀(탁솔(TAXOL)(등록상표), 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재), 및 도세탁셀(탁소테레(TAXOTERE)(등록상표), 롱 푸랑 로리(Rhne-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니 소재); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 국소이성화효소 억제제 RFS 2000; 다이플루오로메틸로미틴(DMFO); 레티노산 유도체, 예를 들어 타르그레틴(등록상표)(벡사로텐), 판레틴(등록상표)(알리트레티노인); 온타크(ONTAK)(등록상표)(데닐류킨 디프티톡스); 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한 암에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예를 들어 항-에스트로젠, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제성 4(5)-아미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(파레스톤); 및 항-안드로젠, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 이러한 정의 내에 포함된다.
다양한 다른 치료제를 본 명세서에 기재된 조성물과 함께 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, CAR-발현 면역 이펙터 세포를 포함하는 조성물을 소염제와 함께 투여한다. 소염제 또는 약물은 스테로이드 및 글루코코르티코이드(베타메타손, 부데소니드, 덱사메타손, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손, 하이드로코르티손, 메틸 프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트라이암시놀론 포함), 비스테로이드성 소염 약물(NSAID), 예를 들어 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트, 설파살라진, 레플루노미드, 항-TNF 약물, 사이클로포스파미드 및 마이코페놀레이트를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
다른 예시적인 NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 나트륨, 콕스-2 억제제, 예를 들어 비옥스(VIOXX)(등록상표)(로페콕시브) 및 셀레브렉스(CELEBREX)(등록상표)(셀레콕시브), 및 시알릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 진통제는 아세트아미노펜, 옥시코돈, 프로폭시펜 하이드로클로라이드의 트라마돌로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 글루코코르티코이드는 코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 또는 프레드니손으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 생물학적 반응 변형제는 세포 표면 마커(예를 들어 CD4, CD5 등)에 대해서 지시되는 분자, 사이토카인 억제제, 예를 들어 TNF 길항제(예를 들어 에타너셉트(엔브렐(ENBREL)(등록상표)), 아달리뮤맙(휴미라(HUMIRA)(등록상표)) 및 인플릭시맙(레미케이드(REMICADE)(등록상표)), 케모카인 억제제 및 접착 분자 억제제를 포함한다. 생물학적 반응 변형제는 단클론성 항체뿐만 아니라 분자들의 재조합 형태를 포함한다. 예시적인 DMARD는 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 페니실아민, 레플루노미드, 설파 살라진, 하이드록시클로로퀸, 금(경구(오라노핀) 및 근육내) 및 미노사이클린을 포함한다.
본 명세서에서 고려되는 CAR 변형된 T 세포와의 조합에 적합한 치료학적 항체의 예시적인 예는 바비툭시맙, 베바시주맙(아바스틴), 비바투주맙, 블리나투모맙, 코나투뮤맙, 다라투뮤맙, 둘리고튜맙, 다세투주맙, 달로투주맙, 엘로투주맙(HuLuc63), 젬투주맙, 이브리투모맙, 인다툭시맙, 이노투주맙, 로르보투주 맙, 루카투뮤맙, 밀라투주맙, 목세튜모맙, 오카라투주맙, 오파투뮤맙, 리툭시맙, 실툭시맙, 테프로투뮤맙 및 유블리툭시맙을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물을 사이토카인과 함께 투여한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "사이토카인"은 또 다른 세포 상에서 세포간 매개체로서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반적인 용어를 의미한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 및 전통적인 폴리펩타이드 호르몬이다. 사이토카인 중에는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 황체 호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토젠; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 뮐러관 억제 물질; 마우스 고나도트로핀-관련 펩타이드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-베타; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자(TGF), 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리쓰로포이에틴(EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, 베타, 및 -감마; 집락 자극 인자(CSF), 예를 들어 대식세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터류킨(IL), 예를 들어 IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, IL-21, 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 다른 폴리펩타이드 인자, 예를 들어 LIF 및 키트 리간드(KL)가 포함된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 사이토카인이라는 용어는 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질, 및 네이티브 서열 사이토카인의 생물 활성 등가물을 포함한다.
특별한 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 PI3K 억제제의 존재하에서 배양되고, 하기 마커: CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62, CD127 및 HLA-DR 중 하나 이상을 발현하는 본 명세서에서 고려되는 CAR T 세포를 포함하고, 양성 또는 음성 선택 기술에 의해서 추가로 단리될 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; 및 CD38 또는 CD62L, CD127, CD197, 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상을 발현하는, T 세포의 특이적인 하위집단을 포함하고, 양성 또는 음성 선택 기술에 의해서 추가로 단리된다. 다양한 실시형태에서, 조성물은 하기 마커: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3, 및 LAG3 중 하나 이상을 발현하지 않거나 실질적으로 발현하지 않는다.
일 실시형태에서, CD62L, CD127, CD197, 및 CD38로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 억제제 없이 활성화 및 확장된 T 세포 집단에 비해서 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배, 또는 그 초과만큼 증가된다.
일 실시형태에서, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3, 및 LAG3으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상의 발현은 PI3K 억제제와 함께 활성화 및 확장된 T 세포 집단에 비해서 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 25배 또는 그 초과만큼 감소된다.
J. 치료 방법
본 명세서에서 고려되는 유전자 변형된 면역 이펙터 세포는, 면역조절 병태 및 혈액 악성종양을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 B 세포 관련 병태의 치료에 사용하기 위한 입양 면역요법의 개선된 방법을 제공한다.
특별한 실시형태에서, 주요 면역 이펙터 세포의 특이성은 주요 면역 이펙터 세포를 본 명세서에서 고려되는 CAR로 유전자 변형시킴으로써 B 세포에 대해 재지시된다. 다양한 실시형태에서, 바이러스 벡터를 사용하여 면역 이펙터 세포를 BCMA 폴리펩타이드에 결합하는 뮤린 항-BCMA 항원 결합 도메인; 힌지 도메인; 막관통(TM) 토메인, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커(TM 도메인을 CAR의 세포내 신호전달 도메인에 연결함); 및 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인; 및 주요 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 암호화하는 특정 폴리뉴클레오타이드로 유전자 변형시킨다.
일 실시형태에서, 본 발명은 T 세포를, BCMA 발현 B 세포를 표적화하는 CAR을 발현하도록 유전자 변형시킨 세포요법의 한 유형을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항-BCMA CAR T 세포를 IL-2 및 PI3K 억제제의 존재하에서 배양하여 CAR T 세포의 치료 특성 및 잔류성을 증가시킨다. 이어서, CAR T 세포를 CAR T 세포의 주입이 필요한 수용자에게 주입한다. 주입된 세포는 수용자에서 질환 유발 B 세포를 살해할 수 있다. 항체 요법과 달리, CAR T 세포는 생체내에서 복제되어 장기간 잔류성을 생성시켜 지속적인 암 요법으로 이어질 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 확고한 생체내 T 세포 확장을 겪을 수 있으며 연장된 시간 동안 지속될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 특정 기억 T 세포로 진화하여, 임의의 추가적인 종양 형성 또는 성장을 억제하도록 재활성화될 수 있다.
특별한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR을 포함하는 면역 이펙터 세포를 포함하는 조성물을 이상 B 세포 활성과 관련된 병태의 치료에 사용한다.
본 명세서에서 고려되는 CAR을 포함하는 면역 이펙터 세포를 사용하여 치료, 예방 또는 개선될 수 있는 병태의 예시적인 예는 전신 홍반성 루프스, 류마티스성 관절염, 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소성 자반증, 항-인지질 증후군, 샤가스병, 그레이브스병, 베게너 육아종증, 결절성 다발동맥염, 쇼그렌 증후군, 심상성 천포창, 피부경화증, 다발성 경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 연관 혈관염, 굿파스쳐병, 가와사키병, 및 급속 진행성 사구체신염을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
변형된 면역 이펙터 세포는 또한 형질 세포 장애, 예컨대 중쇄병, 원발성 또는 면역세포-연관 아밀로이드증, 및 미확정 단클론성 감마병증(MGUS)에서 응용을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "B 세포 악성종양"은 하기에 논의되는 바와 같은 B 세포(면역계 세포의 한 유형)에 형성되는 암의 한 유형을 지칭한다.
특별한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 CAR-변형된 T 세포를 포함하는 조성물을 혈액 악성종양, 예를 들어 비제한적으로 B 세포 악성종양, 예를 들어 다발성 골수종(MM) 또는 비-호지킨 림프종(NHL)의 치료에 사용한다.
다발성 골수종은 이러한 유형의 세포의 단일 클론의 신생물 형질전환을 특징으로 하는 성숙한 형질 세포 형태의 B 세포 악성종양이다. 이러한 형질 세포는 BM에서 증식하며 인접한 뼈를 침범하고 때때로 혈액을 침범할 수 있다. 다발성 골수종의 변이 형태는 현성 다발성 골수종, 무증상 다발성 골수종, 형질 세포성 백혈병, 비-분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화성 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 및 골수외 형질세포종을 포함한다.(예를 들어 문헌[Braunwald, et al. (eds), Harrison's Principles of Internal Medicine, 15th Edition (McGraw-Hill 2001)] 참고).
비-호지킨 림프종은 림프구(백혈구)의 암의 큰 군을 포함한다. 비-호지킨 림프종은 어느 연령에서도 발생할 수 있고 종종 정상보다 큰 림프절, 발열 및 체중 감소에 의해서 인지된다. 다수의 상이한 유형의 비-호지킨 림프종이 존재한다. 예를 들어, 비-호지킨 림프종을 공격성(빠르게-성장하는) 및 지연성(느리게-성장하는) 유형으로 분류할 수 있다. 비-호지킨 림프종은 B 세포 및 T-세포로부터 유래될 수 있지만, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "비-호지킨 림프종" 및 "B 세포 비-호지킨 림프종"이라는 용어는 상호 교환 가능하게 사용된다. B 세포 비-호지 킨 림프종(NHL)은 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병/소 림프구성 림프종(CLL/SLL), 미만성 대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 면역모구성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종 및 외투 세포 림프종을 포함한다. 골수 또는 줄기세포 이식 후 발생하는 림프종은 대개 B 세포 비-호지킨 림프종이다.
만성 림프구성 백혈병(CLL)은 B 림프구 또는 B 세포라 칭하는 미성숙 백혈구의 느린 증가를 야기하는 지연성(느리게-성장하는) 암이다. 암세포는 혈액 및 골수를 통해 확산되며, 림프절 또는 다른 기관, 예를 들어 간 및 비장을 또한 침범할 수 있다. CLL은 최종적으로 골수를 쇠약하게 한다. 때때로, 질환의 말기 단계에서, 질환을 소 림프구성 림프종이라 칭한다.
특별한 실시형태에서, 치료 유효량의, 본 명세서에서 고려되는 CAR-발현 면역 이펙터 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 CAR-발현 면역 이펙터 세포의 치료가 필요한 환자에게 단독으로 또는 하나 이상의 치료제와 조합하여 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 세포는 이상 B 세포 활성과 관련된 병태 또는 B 세포 악성종양의 발병 위험이 있는 환자의 치료에 사용된다. 따라서, 본 발명은 이상 B 세포 활성과 관련된 병태 또는 B 세포 악성종양의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에게 치료 유효량의, 본 명세서에서 고려되는 CAR-변형된 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 이상 B 세포 활성과 관련된 병태 또는 B 세포 악성종양의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "개체" 및 "대상체"라는 용어는 종종 상호 교환 가능하게 사용되며, 유전자 요법 벡터, 세포-계 요법, 및 본 명세서의 다른 곳에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 병태의 증상을 나타내는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 대상체는 유전자 요법 벡터, 세포-계 요법, 및 본 명세서의 다른 곳에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 조혈계의 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어 B 세포 악성종양의 증상을 나타내는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 대상체(에를 들어 환자)는 실험용 동물(예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 기니아 피그), 농장 동물, 및 가축 또는 애완동물(예를 들어 고양이 또는 개)을 포함한다. 비-인간 영장류 및 바람직하게는 인간 환자가 포함된다. 전형적인 대상체는 B 세포 악성종양을 갖거나, B 세포 악성종양을 갖는 것으로 진단되었거나, 또는 B 세포 악성종양의 위험이 있거나 이것을 갖는 인간 환자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "환자"라는 용어는 유전자 요법 벡터, 세포-계 요법, 및 본 명세서의 다른 곳에 개시된 방법으로 치료될 수 있는 특정 질환, 장애 또는 병태로 진단된 대상체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "치료" 또는 "치료하는"은 질환 또는 병적인 상태의 증상 또는 병리에 대한 임의의 이롭거나 바람직한 효과를 포함하며, 심지어 치료되는 질환 또는 병태의 하나 이상의 측정 가능한 마커의 최소의 감소를 포함할 수 있다. 치료는 질환 또는 병태의 증상의 감소 또는 개선, 또는 질환 또는 병태의 진행의 지연을 임의로 수반할 수 있다. "치료"는 질환 또는 병태, 또는 이의 관련 증상의 완전한 근절 또는 치유를 반드시 가리키는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "예방하다" 및 유사한 단어, 예를 들어 "예방된", "예방하는" 등은 질환 또는 병태의 발생 또는 재발 가능성의 예방, 억제 또는 감쇠를 위한 접근법을 나타낸다. 이것은 또한 질환 또는 병증의 개시 또는 재발의 지연 또는 질환 또는 병태의 증상의 발생 또는 재발의 지연을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "예방" 및 유사한 단어들은 또한 질환 또는 병태의 개시 또는 재발 전에 질환 또는 병태의 강도, 효과, 증상 및/또는 크기의 감소를 포함한다.
"향상시키다" 또는 "촉진하다" 또는 "증가시키다" 또는 "확장시키다"는 일반적으로 본 명세서에서 고려되는 조성물, 예를 들어 CAR을 암호화하는 유전자 변형된 T 세포 또는 벡터가 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 의해 야기된 반응에 비해 보다 큰 생리학적 반응(즉 하류 효과)을 생성시키거나, 유도하거나, 또는 야기하는 능력을 지칭한다. 측정 가능한 생리학적 반응은 관련 기술 분야 및 본 명세서의 기재의 이해로부터 자명한 다른 것 중에서 T 세포 확장, 활성화, 잔류성, 및/또는 암 세포 살해 능력의 증가를 포함할 수 있다. "증가된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 "통계학적으로 유의한" 양이며, 비히클 또는 대조군 조성물에 의해 생성된 반응의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 또는 그 초과의 배수(예를 들어, 500, 1000배)(이들 값 사이 및 1 초과의 모든 정수 및 소수점 포함, 예를 들어 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등)의 증가를 포함할 수 있다.
"감소시키다" 또는 "낮추다", "축소하다" 또는 "감쇠시키다" 또는 "내리다"는 일반적으로 본 명세서에서 고려되는 조성물이 비히클 또는 대조군 분자/조성물에 의해 야기된 반응에 비해 보다 작은 생리학적 반응(즉 하류 효과)을 생성시키거나, 유도하거나, 또는 야기하는 능력을 지칭한다. "감소된" 또는 "감쇠된" 양은 전형적으로 "통계학적으로 유의한" 양이며, 비히클, 대조군 조성물에 의해 생성된 반응(참조 반응) 또는 특정 세포 계통에서의 반응의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30배 또는 그 초과의 배수(예를 들어, 500, 1000배)(이들 값 사이 및 1 초과의 모든 정수 및 소수점 포함, 예를 들어 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등)의 감소를 포함할 수 있다.
"유지하다" 또는 "보존하다" 또는 "유지" 또는 "변화없이" 또는 "실질적인 변화 없이" 또는 "실질적인 감소 없이"는 일반적으로 비히클, 대조군 분자/조성물에 의해 야기되는 반응 또는 특정 세포 계통에서의 반응에 비해, 세포에서 보다 적은 생리학적 반응(즉 하류 효과)을 생성시키거나, 유도하거나 또는 야기하는 본 명세서에서 고려되는 조성물의 능력을 지칭한다. 대등한 반응은 상기 참조 반응과 유의하게 상이하지 않거나 측정 가능하게 상이하지 않은 것이다.
일 실시형태에서, B 세포 관련 병태의 치료가 필요한 대상체에서 B 세포 관련된 병태를 치료하는 방법은 유효량, 예를 들어 치료 유효량의, 본 명세서에서 고려되는 유전자 변형된 면역 이펙터 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 투여량 및 투여 빈도는 환자의 상태, 및 환자 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해서 결정될 것이지만, 적합한 투여량을 임상 시험에 의해 결정할 수도 있다.
일 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조성물 중의 T 세포의 양은 적어도 0.1 x 105 세포, 적어도 0.5 x 105 세포, 적어도 1 x 105 세포, 적어도 5 x 105 세포, 적어도 1 x 106 세포, 적어도 0.5 x 107 세포, 적어도 1 x 107 세포, 적어도 0.5 x 108 세포, 적어도 1 x 108 세포, 적어도 0.5 x 109 세포, 적어도 1 x 109 세포, 적어도 2 x 109 세포, 적어도 3 x 109 세포, 적어도 4 x 109 세포, 적어도 5 x 109 세포, 또는 적어도 1 x 1010 세포이다. 특별한 실시형태에서, 약 1 x 107 CAR T 세포 내지 약 1 x 109 CAR T 세포, 약 2 x 107 CAR T 세포 내지 약 0.9 x 109 CAR T 세포, 약 3 x 107 CAR T 세포 내지 약 0.8 x 109 CAR T 세포, 약 4 x 107 CAR T 세포 내지 약 0.7 x 109 CAR T 세포, 약 5 x 107 CAR T 세포 내지 약 0.6 x 109 CAR T 세포, 또는 약 5 x 107 CAR T 세포 내지 약 0.5 x 109 CAR T 세포를 대상체에게 투여한다.
일 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 조성물 중의 T 세포의 양은 적어도 0.1 x 104 세포/체중 kg, 적어도 0.5 x 104 세포/체중 kg, 적어도 1 x 104 세포/체중 kg, 적어도 5 x 104 세포/체중 kg, 적어도 1 x 105 세포/체중 kg, 적어도 0.5 x 106 세포/체중 kg, 적어도 1 x 106 세포/체중 kg, 적어도 0.5 x 107 세포/체중 kg, 적어도 1 x 107 세포/체중 kg, 적어도 0.5 x 108 세포/체중 kg, 적어도 1 x 108 세포/체중 kg, 적어도 2 x 108 세포/체중 kg, 적어도 3 x 108 세포/체중 kg, 적어도 4 x 108 세포/체중 kg, 적어도 5 x 108 세포/체중 kg, 또는 적어도 1 x 109 세포/체중 kg이다. 특별한 실시형태에서, 약 1 x 106 CAR T 세포/체중 kg 내지 약 1 x 108 CAR T 세포/체중 kg, 약 2 x 106 CAR T 세포/체중 kg 내지 약 0.9 x 108 CAR T 세포/체중 kg, 약 3 x 106 CAR T 세포/체중 kg 내지 약 0.8 x 108 CAR T 세포/체중 kg, 약 4 x 106 CAR T 세포/체중 kg 내지 약 0.7 x 108 CAR T 세포/체중 kg, 약 5 x 106 CAR T 세포/체중 kg 내지 약 0.6 x 108 CAR T 세포/체중 kg, 또는 약 5 x 106 CAR T 세포/체중 kg 내지 약 0.5 x 108 CAR T 세포/체중 kg을 대상체에게 투여한다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 목적하는 요법을 달성하기 위해서 본 발명의 조성물의 다회 투여가 요구될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 조성물은 1주일, 2주일, 3주일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 5년, 10년, 또는 그 초과의 범위에 걸쳐서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 또는 그 초과의 횟수로 투여될 수 있다.
특정 실시형태에서, 활성화된 면역 이펙터 세포를 대상체에게 투여하고 이어서 후속으로 혈액을 재채혈하고(또는 분리반출법을 수행하고), 본 발명에 따라서 이로부터 면역 이펙터 세포를 활성화시키고, 환자에게 활성화되고 확장된 면역 이펙터 세포를 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 과정을 몇 주마다 수회 수 행할 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역 이펙터 세포를 10cc 내지 400cc의 채혈된 혈액으로부터 활성화시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역 이펙터 세포를 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, 100cc, 150cc, 200cc, 250cc, 300cc, 350cc, 또는 400cc, 또는 그 초과의 채혈된 혈액으로부터 활성화시킨다. 이론에 얽매이고자 함은 것은 아니지만, 이러한 다중 채혈/수회 재주입 프로토콜의 사용은 면역 이펙터 세포의 특정 집단의 선택을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 고려되는 조성물의 투여를 임의의 편리한 방식으로, 예를 들어 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 주입 또는 이식에 의해서 수행할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 조성물을 비경구로 투여한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"이란 어구는 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 대개는 주사에 의한 투여 방식을 지칭하며, 혈관내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 관절낭내, 안와내, 종양내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지경, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 및 흉골 내 주사 및 주입을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 조성물을 대상체에게 직접 주사에 의해서 종양, 림프절 또는 감염 부위에 투여한다.
일 실시형태에서, B 세포 관련 병태에 대한 세포 면역 반응을 증가시키는 조성물의 투여가 필요한 대상체에게 유효량의, 대상체에서 B 세포 관련 병태에 대한 세포 면역 반응을 증가시키는 조성물을 투여한다. 면역 반응은 감염된 세포를 살해할 수 있는 세포독성 T 세포, 조절성 T 세포 및 헬퍼 T 세포 반응에 의해 매개되는 세포 면역 반응을 포함할 수 있다. B 세포를 활성화할 수 있고 따라서 항체 생산을 유도할 수 있는 헬퍼 T 세포에 의해 주로 매개되는 체액 면역 반응이 또한 유도될 수 있다. 다양한 기술들을 본 발명의 조성물에 의해 유도되는 면역 반응의 유형을 분석하기 위해 사용할 수 있으며, 이는 관련 기술 분야에, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y]에 널리 기술되어 있다.
T 세포-매개된 살해의 경우, CAR-리간드 결합은 T 세포로의 CAR 신호전달을 개시하여, T 세포가 다양한 기전에 의해 표적 세포 세포자멸을 유도할 수 있는 단백질을 생산하거나 방출하도록 유도하는 다양한 T 세포 신호전달 경로의 활성화를 생성시킨다. 이들 T 세포-매개된 기전은 (비제한적으로) 상기 T 세포로부터 표적 세포 내로의 세포내 세포독성 과립의 전달, 표적 세포 살해를 직접적으로(또는 간접적으로 다른 킬러 이펙터 세포의 모집을 통해) 유도할 수 있는 염증전 사이토카인의 T 세포 분비, 및 표적 세포 상의 동족 사멸 수용체 (예를 들어 Fas)에 대한 결합에 따른 표적 세포 세포자멸을 유도하는 T 세포 표면 상의 사멸 수용체 리간드(예를 들어 FasL)의 상향 조절을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 BCMA-발현 B 세포 관련된 병태로 진단된 대상체로부터 면역 이펙터 세포를 제거하고, 상기 면역 이펙터 세포를 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 유전자 변형시켜서, 변형된 면역 이펙터 세포의 집단을 생산하고, 변형된 면역 이펙터 세포의 집단을 동일한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, B 세포 관련된 병태로 진단된 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 면역 이펙터 세포는 T 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 또한 대상체에게 CAR 분자를 암호화하는 핵산 구축물을 발현하는 면역 이펙터 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 표적 세포 집단에 대한 면역 이펙터 세포 매개된 면역 조절자 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 세포 조성물의 투여 방법은 대상체에서 본 발명의 CAR을 직접 발현하는 생체외 유전자 변형된 면역 이펙터 세포의 재도입 또는 대상체내로 도입시 CAR을 발현하는 성숙한 면역 이펙터 세포로 분화하는 면역 이펙터 세포의 유전자 변형된 전구체의 재도입을 생성시키기에 유효한 임의의 방법을 포함한다. 한 가지 방법은 생체외에서 말초 혈액 T 세포를 본 발명에 따라서 핵산 구축물로 형질도입시키고 형질도입된 세포를 대상체에게 되돌려보내는 단계를 포함한다.
본 명세서에 포함된 모든 공보, 특허 출원 및 허여된 특허는 각각의 개별적인 공보, 특허 출원 또는 허여된 특허가 참고로 구체적이고 개별적으로 포함된 것을 나타내는 바와 같이 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 B 세포 관련 병태를 치료하기 위한 개선된 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 개선된 키메릭 항원 수용체(CAR), 이러한 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 면역 이펙터 세포, 및 B 세포 관련 병태를 효과적으로 치료하기 위한 이러한 조성물의 용도를 제공한다.
도 1은 뮤린 B 세포 성숙화 항원(muBCMA) CAR 구축물의 도해를 나타낸 도면.
도 2a는 세포를 BCMA를 발현하는 K562 세포와 24시간 동안 공-배양한 후 항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포, 및 CAR19Δ T 세포로부터 방출되는 IFNg의 양을 나타낸 도면.
도 2b는 BCMA를 발현하는 K562 세포와 비교한, 세포를 BCMA를 발현하지 않는 K562 세포와 24시간 동안 공-배양한 후 항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포, 및 CAR19Δ T 세포로부터 방출되는 IFNg의 양을 나타낸 도면.
도 3은 검정 전 10일 동안 자극된 형질도입되지 않은 대조군 T 세포, 항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포, 및 CAR19Δ T 세포로부터의 성장 배지 중에서의 염증성 사이토카인의 양을 나타낸 도면.
도 4는 항원 자극의 부재하에서 항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포, 및 CAR19Δ T 세포에 의해서 생산된 염증성 사이토카인의 양을 나타낸 도면.
도 5는 항-BCMA CAR T 세포를 제조한 후에 활성화의 표현형 마커의 발현을 나타낸 도면. HLA-DR 및 CD25 발현을 항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CAR T 세포, 및 CAR19Δ T 세포에서 측정하였다.
도 6은 항원 자극의 부재하에서, 항-BCMA10 CAR T 세포 및 항-BCMA02 CAR T 세포에서 세포자멸(apoptosis)에서 필수적인 단계이고, AICD에 중요한 활성화된 카스파제-3의 수준을 나타내는 도면.
도 7은 소 태아 혈청(FBS), 인간 AB 혈청(HABS), 또는 100ng/ml 가용성 BCMA를 함유한 배지 중에서 항-BCMA02 및 항-BCMA10 CAR T 세포에서의 염증성 사이토카인 방출의 양을 나타낸 도면.
도 8a는 약 100㎣의 실험용 피하 인간 다발성 골수종(RPMI-8226) 종양을 갖는 NOD scid 감마(NSG) 마우스에서의 종양 부피를 나타낸 도면. 마우스를 비히클, 107 항-BCMA02 CAR T 세포, 107 항-BCMA10 CAR T 세포, 또는 보르테조밉(벨케이드)으로 치료하였다.
도 8b는 약 100㎣의 실험용 피하 인간 다발성 골수종(RPMI-8226) 종양을 갖는 NOD scid 감마(NSG) 마우스에서의 종양 부피를 나타낸 도면. 마우스를 비히클, 107 항-BCMA02 CAR T 세포, 107 항-BCMA10 CAR T 세포, 또는 보르테조밉(벨케이드)으로 치료하였다.
도 9는 림프종 및 백혈병 세포계 상에서의 BCMA 발현의 수준(원) 및 각각의 세포계에 대한 항-BCMA CAR T 세포의 활성의 수준(IFNγ 방출, 사각형)을 나타낸 도면. BCMA-음성(BCMA-) 종양 세포계: 골수성 백혈병(K562), 급성 림프구성 백혈병(NALM-6 및 NALM-16); 외투 세포 림프종(REC-1); 또는 호지킨 림프종(HDLM-2)은 IFNγ 방출을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않았다. BCMA-양성(BCMA+) 종양 세포계: B 세포 만성 림프모구성 백혈병(MEC-1), 외투 세포 림프종(JeKo-1), 호지킨 림프종(RPMI-6666), 버킷 림프종(다우디(Daudi) 세포 및 라모스(Ramos) 세포), 및 다발성 골수종(RPMI-8226)은 상당한 IFNγ 방출을 나타내었다.
도 10a는 CAR T 세포가 종양 유도 8일 후에 마우스에 투여되는 경우 NSG 마우스 모델에서 BCMA 발현 버킷 림프종 세포(다우디 세포)에 대한 비히클, 항-CD19Δ CAR T 세포, 항-CD19 CAR T 세포, 및 항-BCMA CAR T 세포의 생체내 활성을 나타내는 도면.
도 10b는 CAR T 세포가 종양 유도 18일 후에 마우스에 투여되는 경우 NSG 마우스 모델에서 BCMA 발현 버킷 림프종 세포(다우디 세포)에 대한 비히클, 항-CD19Δ CAR T 세포, 항-CD19 CAR T 세포, 및 항-BCMA CAR T 세포의 생체내 활성을 나타내는 도면.
도 11은 50% 감소의 항-BCMA CAR 발현으로 달성되는 항-BCMA CAR T 세포의 강력한 시험관내 활성을 나타내는 도면. (a) T 세포 집단을 항-BCMA CAR 분자를 암호화하는 렌티바이러스 4x108 내지 5x107 형질도입 단위로 형질도입하였다(MOI 5 내지 40). 생성된 T 세포 집단을 26 ± 4% 항-BCMA CAR-양성 T 세포를 함유하도록 정규화하였다. (b) 정규화된 항-BCMA CAR T 세포의 MFI는 유세포 분석기에 의해서 검정되는 경우 885 내지 1875 범위였다. (c) K562 세포 및 K562-BCMA 세포를 대등한 세포용해 활성을 나타내는 20:1 또는 10:1의 이펙터(E; T 세포) 대 표적(T; K562와 K562 BCMA 세포의 1:1 혼합물)에서 정규화된 항-BCMA CAR T 세포와 함께 공-배양하였다.
도 12는 항-BCMA CAR T 세포의 제조 공정의 신뢰성을 나타내는 도면. (A) 11명의 개체의 공여체의 PBMC로부터 제조된 항-BCMA CAR T 세포 생산물은 형질도입되지 않은 공여체 T 세포의 매칭된 배양액과 비교하여 대등한 확장 수준을 보여준다. (B) 11명의 공여체로부터 제조된 항-BCMA CAR T 세포는 대등한 렌티바이러스 형질도입 효율(VCN)을 나타내었다. (C) 항-BCMA CAR 양성 T 세포의 빈도를 유세포 분석기에 의해서 측정하였고, BCMA 발현은 모든 공여체 전체에서 대등한 것으로 밝혀졌다. (D) 11명의 공여체로부터 제조된 항-BCMA CAR T 세포 생산물은 BCMA-발현 K562 세포에 노출되는 경우 치료 관련 수준의 IFNγ 방출을 나타내었다.
도 13은 10일 동안 IL-2의 존재하에서 또는 IL-2 및 ZSTK474의 존재하에서 배양된 CD62L 양성 항-BCMA02 T 세포에서의 CD127, CD197 및 CD38의 공-발현에 대한 벤 다이어그램(Venn diagram)을 나타낸 도면. ZSTK474-처리된 항-BCMA02 CAR T 세포는 IL-2 단독과 함께 배양된 항-BCMA CAR T 세포와 비교할 때 CD127, CD197 및 CD38을 공-발현하는 세포의 백분율 증가를 나타내었다.
도 14는 IL-2 단독으로 처리된 배양액과 비교할 때 IL-2 및 ZSTK474로 처리된 배양액(n=7)에서 CD8 발현 항-BCMA02 CAR T 세포의 백분율 증가를 나타내는 도면. CD8 발현은 형광-표지된 항-CD8 항체 및 유세포 분석기를 사용하여 측정되었다.
도 15는 IL-2 단독 또는 IL-2 및 ZSTK474와 함께 배양한 후 14명의 공여체로부터의 항-BCMA02 CAR T 세포에 의해서 방출된 IFN-γ의 양을 나타낸 도면. 배양 기간 완료 후에, 동등한 수의 항-BCMA02 CAR T 세포를 배지 단독 중에서 24시간 동안 재배양하였다. 24시간 동안 방출된 IFN-γ의 양을 ELISA에 의해서 정량분석하였다. ZSTK474 중에서의 배양은 IL-2 단독과 함께 배양된 항-BCMA02 CAR T 세포와 비교할 때 항-BCMA02 CAR T 세포 긴장성 사이토카인 방출을 유의하게 증가시키지 않았다.
도 16은 공격적인 다우디 종양 모델에서 IL-2로 처리되거나, 또는 IL-2와 ZSTK474로 처리된 항-BCMA02 CAR T 세포의 항-종양 활성, 또는 IL-2와 ZSTK474로 처리된 절단된 신호전달 결핍 항-BCMA02(tBCMA02) CAR T 세포의 항-종양 활성을 나타내는 도면. 완전한 종양 감소는 IL-2 및 ZSTK474로 처리된 항-BCMA02 CAR T 세포를 투여한 마우스의 50%에서 관찰되었다.
도 17은 다발성 골수종 종양(RPMI-8226) 모델에서 IL-2로 처리되거나, 또는 IL-2와 ZSTK474로 처리된 항-BCMA02 CAR T 세포의 항-종양 활성을 나타내는 도면. IL-2-배양된 항-BCMA02 CAR T 세포 또는 IL-2와 ZSTK474-배양된 항-BCMA02 CAR T 세포로 치료된 동물은 종양 생성이 완전히 예방되었다.
서열 식별자의 간단한 설명
서열번호 1 내지 3은 본 명세서에서 고려되는 BCMA CAR에 대한 예시적인 경쇄 CDR 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 4 내지 6은 본 명세서에서 고려되는 BCMA CAR에 대한 예시적인 중쇄 CDR 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 7은 본 명세서에서 고려되는 BCMA CAR에 대한 예시적인 경쇄 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 8은 본 명세서에서 고려되는 BCMA CAR에 대한 예시적인 중쇄 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 9는 본 명세서에서 고려되는 예시적인 BCMA CAR의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 10은 본 명세서에서 고려되는 예시적인 BCMA CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
서열번호 11은 인간 BCMA의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 12 내지 22는 다양한 링커의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 23 내지 35는 프로테아제 절단 부위 및 자가-절단 폴리펩타이드 절단 부위의 아미노산 서열을 제시한다.
서열번호 36은 BCMA CAR을 암호화하는 벡터의 폴리뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
상기 발명을 이해의 명확성을 위해서 설명 및 실시예에 의해서 일부 상세히 개시하였지만, 몇몇 변화 및 변형을 첨부되는 특허청구범위의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고 본 발명에 대해 수행할 수 있음은 본 발명의 교시에 비추어 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 쉽게 자명할 것이다. 하기의 실시예는 단지 예시로서 제공되며 제한으로서 제공되는 것은 아니다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 필수적으로 유사한 결과를 생성시키도록 변화 또는 변형시킬 수 있는 다양한 중요하지 않은 매개변수를 쉽게 알 것이다.
실시예 1
BCMA CAR의 구축
뮤린 항-BCMA scFv 항체를 함유하는 CAR을, 항-BCMA scFv에 작동 가능하게 연결된 MND 프로모터, CD8α로부터의 힌지 및 막관통 도메인 및 CD137 공-자극 도메인에 이어서 CD3ζ 쇄의 세포내 신호전달 도메인을 함유하도록 설계하였다. 예를 들어, 도 1을 참고하기 바란다. 도 1에 도시된 BCMA CAR은 면역 이펙터 세포 상에서의 표면 발현을 위한 CD8α 신호 펩타이드(SP) 서열을 포함한다. 예시적인 BCMA CAR의 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10에 제시되어 있고; BCM CAR의 예시적인 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9에 제시되어 있고; 예시적인 CAR 구축물의 벡터 맵은 도 1에 도시되어 있다. 표 3은 BCMA CAR 렌티바이러스 벡터의 다양한 뉴클레오타이드 분절에 대한 아이덴터티, 젠뱅크 참조, 공급원 명칭 및 인용을 나타낸다.
실시예 2
뮤린 BCMA CAR의 평가
서론
키메릭 항원 수용체(CAR)로 유전자 조작된 T 세포의 입양 전달이 암을 치료하기 위한 유망한 접근법으로서 출현하였다. CAR은 막관통 영역을 통해서 T 세포 신호전달 도메인에 융합된 항원 반응성 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 인공 분자이다. 본 실시예에서, B 세포 성숙화 항원(BCMA)에 대해서 특이적인 CAR을 평가하였다. BCMA은 다발성 골수종, 형질세포종, 및 일부 림프종 상에서는 발현되지만, 정상 발현은 형질 세포에 제한된다(Avery et al., 2003; Carpenito et al., 2009; Chiu et al., 2007).
항-BCMA02 CAR을 마우스 항-BCMA 항체(C11D5.3)로부터의 서열을 사용하여 구축하였다. 항-BCMA10 CAR을 변형된 서열을 사용하여 구축하였고, 이것은 항-BCMA02 CAR의 "인간화된" 버전이다. 일련의 시험관내 검정법에서, 항-BCMA02 CAR T 세포 및 항-BCMA10 CAR T 세포 둘 모두는 종양 특이성, 높은 CAR 발현을 나타내었고, 항원 발현 표적에 대해서 강력한 반응성을 유발하였다. 항-BCMA02 CAR T 세포 및 항-BCMA10 CAR T 세포는 BCMA-발현 종양 세포계에 대해서 대등한 반응성을 갖는 것으로 나타났다. 항-BCMA02 CAR T 세포 및 항-BCMA10 CAR T 세포 둘 모두가 마우스 종양 모델에서 감소를 유발할 수 있지만, 항-BCMA10 CAR T 세포는 항원-독립적인 염증성 사이토카인 분비를 나타내었고, 따라서 임상적인 독성과 관련된 높은 사이토카인 수준을 유발할 가능성을 갖는다.
결과
긴장성 염증성 사이토카인은 세포자멸과 관련된 항-BCMA10 T 세포로부터 방출된다
BCMA 단백질은 다발성 골수종(Sanchez et al., 2012)을 갖는 환자의 혈청 중에서 검출 가능하다. 다발성 골수종 환자에서 평균 혈청 BCMA는 10ng/mL였지만, 최대 100ng/mL의 수준이 최대값이었다. 항-BCMA CAR T 세포 후보물질에 대한 생리학적 가용성 BCMA 수준의 영향을 평가하였다.
항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포, 및 CAR19Δ T 세포로부터의 IFNγ 방출을 가용성 BCMA와 함께 24시간 동안 배양한 후에 관찰하였다(도 2a). 항-BCMA02 CAR T 세포는 최대 1ug/mL BCMA와 함께 24시간 동안 배양된 후에 최소 사이토카인 방출로 반응하였다. 이에 반해서, 항-BCMA10 CAR T 세포는 배양물에 첨가된 가용성 BCMA의 농도에 비례하게 IFNγ의 수준을 증가시키도록 반응하였다. 다발성 골수종 환자에서 보고된 최대 수준인 100ng/mL BCMA에서, 항-BCMA10 CAR T 세포는 82.1ng/ml의 IFNγ를 분비하였고, 이에 비해서 항-BCMA02 CAR T 세포는 28.8ng/ml의 IFNγ를 분비하였다. IFNγ는 항-BCMA10 CAR T 세포 + BCMA 항원이 없는 대조군 세포계와 함께 수회 공-배양하는 실험에서도 검출되었다(도 2b, K562 공-배양). 이러한 데이터는 항-BCMA10 CAR T 세포가 가용성 BCMA에 의한 자극에 대해서 증가된 감도를 가져서, T 세포에서 항원-독립적인 사이토카인 반응에 대한 가능성을 가짐을 제안하였다.
항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포(배양 개시로부터 10일), 및 CAR19Δ T 세포로부터의 긴장성 사이토카인 분비 가능성을 관찰하였다. CAR T 세포를 제조한 후, 항-BCMA02 CAR T 세포, 항-BCMA10 CART 세포, 및 CAR19Δ T 세포 배양물로부터의 성장 배지를 염증성 사이토카인의 존재에 대해서 분석하였다. 항원 자극의 부재에도 불구하고, 항-BCMA10 CAR T 세포 배양물은 10ng/mL를 초과하는 IFNγ를 함유하였고, 이에 비해서 항-BCMA02 CAR T 세포 배양물 중에는 1ng/mL 미만의 IFNγ가 함유되었다(도 3). 항-BCMA10 CAR T 세포 배양물은 또한 유의하게(p<0.001) 더 많은 TNFα를 함유하였다. 항원 자극 없이 항-BCMA10 CAR T 세포에 의해서 생산된 사이토카인의 양을 추가로 정량분석하기 위해서, 24시간의 배양 동안 5 x 104 CAR T 세포로부터 사이토카인 방출을 측정하였다. 항-BCMA10 CAR T 세포는 항-BCMA02 CAR T 세포에 비해서 유의하게 더 많은 양의 염증성 사이토카인 MIP1α, IFNγ, GMCSF, MIP1β, IL-8, 및 TNFα를 생산하였다(도 4, p<0.0001). MIP1α 및 IFNγ 농도가 관찰된 모든 사이토카인 중에서 가장 높았다. 항-BCMA10 CAR T 세포는 4.7ng MIP1α/5 x 104 세포/24시간, 3.0ng IFNγ/5 x 104 세포/24시간 및 약 1ng/5 x 104 세포/24시간 이하의 다른 사이토카인을 생산하였다. 항-염증성 사이토카인인 IL-10, IL-2, 및 IL-4에서는 유의한 차이가 검출되지 않았다.
항-BCMA10 CAR T 세포를 제조한 후에 T 세포 활성화의 표현형 마커의 발현을 측정하여 긴장성 염증성 사이토카인 분비가 항-BCMA10 CAR T 세포에서 활동항진(hyperactive) 상태를 나타내는지를 관찰하였다. HLA-DR 및 CD25는 일반적으로 T 세포 활성화 12 내지 24시간 후에 최대 발현을 나타내고, 이어서 시간에 따라서 감소하는 표면 마커이다. 3명의 정상 공여체로부터 제조된 CAR T 세포는 항-BCMA02 CAR T 세포의 평균 40±2%가 HLA-DR을 발현하였음을 보여주었다. 이들 세포에서의 HLA-DR의 발현은 형질도입되지 않은 (43±2.3%) T 세포 및 CAR19Δ(32±2.2%) 대조군 T 세포에 대등하였다. 이에 반해서, 88±1.2%의 항-BCMA10 CAR T 세포가 HLA-DR을 발현하였다(도 5). 또 다른 활성화 마커 CD25의 발현 또한 항-BCMA02 CAR T 세포와 비교할 때 항-BCMA10 CAR T 세포 상에서 더 높았다(53±0.9% 대 35±2.4%). 따라서, 항-BCMA10 CAR T 세포는 첨가된 항원의 부재하에서 활성화된 T 세포의 표현형 특징을 나타내었다.
T 세포에서의 활동항진은 종종 세포자멸에 의해서 활성화-유도된 세포 사멸(AICD)과 연관된다. 활성화된 카스파제-3의 수준을 측정하여 항-BCMA10 CAR T 세포의 활동항진이 항-BCMA02 CAR T 세포와 비교하여 더 높은 세포자멸 수준을 유발할 수 있는지를 관찰하였다. 2명의 공여체로부터의 항-BCMA10 CAR T 세포의 48%가 활성 카스파제-3을 가졌고, 이에 비해서 항-BCMA02 CAR T 세포의 16%가 그러하였다(도 6). 따라서, 첨가된 BCMA 항원의 부재하에서, 항-BCMA10 CAR T 세포는 항-BCMA02 CAR T 세포에 비해서 증가된 활성화 및 염증성 사이토카인 분비와 연관된 세포자멸성 세포의 더 높은 빈도를 함유한다.
CAR T 세포가 낮은 BCMA 수준에 대해서 선택적으로 반응할 수 있는지 또는 T 세포 성장을 위해서 사용되는 인간 혈청에서 관련이 없는 항원에 대해서 교차 반응성일 수 있는지에 대해서 항-BCMA02 CAR T 세포 및 항-BCMA10 CAR T 세포를 평가하였다. T 항-BCMA02 CAR T 세포 및 항-BCMA10 CAR T 세포를 2일 동안 인간 혈청이 없는 배지 중에서 유지시키고, 이어서 100ng/mL의 가용성 BCMA의 존재하에서 또는 그것의 부재하에서 소 태아 혈청(FBS), 인간 혈청(HABS), 또는 HABS를 함유하는 배지로 교체하였다(도 7). ELISA에 의해서 24시간 후에 IFNγ 방출을 검정하였다. 항-BCMA02 CAR T 세포 및 항-BCMA10 CAR T 세포 둘 모두는 가용성 BCMA에 대해서 반응하였다. 그러나, 항-BCMA10 CAR T 세포는 항-BCMA02 CAR T 세포보다 10-배 더 많은 IFNγ를 분비하였다. BCMA의 부재하에서는, 소 태아 혈청(FBS)(p=0.0002) 또는 인간 AB 혈청(HABS)(p=0.0007) 중에서의 배양에 관계없이 항-BCMA10 CAR T 세포 만이 IFNγ를 방출하였다. 이러한 데이터는 염증성 사이토카인 분비가 항-BCMA10 CAR T 세포에 대해서 내재성임을 제안하였다.
다발성 골수종의 마우스 모델에서 항-BCMA10 CAR T 세포의 더 낮은 항-종양 기능
활동항진성 및 증가된 세포자멸은 환자에서 그리고 궁극적으로 임상적인 효능에서 CAR T 세포 잔류성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 항-BCMA02 CAR T 세포 및 항-BCMA10 CAR T 세포의 항-종양 기능을 마우스 종양 모델에서 관찰하였다. 약 100㎣ 의 실험용 피하 인간 다발성 골수종(RPMI-8226) 종양을 갖는 NOD scid 감마(NSG) 마우스를 107 항-BCMA02 CAR T 세포, 107 항-BCMA10 CAR T 세포, 또는 보르테조밉(벨케이드)으로 치료하였다. RPMI-8226 성장을 캘리퍼로 모니터링하였다. 2개의 독립적인 실험(도 8a 및 8b)에서, 보르테조밉 대조군 종양 성장을 비히클 대조군 동물과 비교하였다. 항-BCMA02 CAR T 세포가 입양 전달된 동물은 신속하고 지속적인 종양 클리어런스를 나타내었다(삽입된 그래프는 초기 종양 감소를 확대함). 항-BCMA10 CAR T 세포의 입양 전달 또한 종양 감소를 유발하였지만, 항-BCMA02 CAR T 세포와 비교하여 두 실험 모두에서 지연되었다.
결론
항-BCMA02 CAR T 세포 및 항-BCMA10 CAR T 세포는 시험관내 검정법에서 대등한 항종양 기능을 나타내었지만, 항-BCMA10 CAR T 세포는 환자 치료에서 안전성 및 효능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 특징을 가졌다. 항-BCMA10 CAR T 세포는 BCMA 단백질의 생리학적 수준에 노출된 후에 염증성 사이토카인 분비에 대해서 강하게 반응하였다. 사이토카인 폭풍 또는 사이토카인 방출 증후군은 CAR T 세포 요법과 연관된 공지된 임상적인 독성이다. BCMA에 대한 사이토카인 방출에 대한 문제가 항-BCMA10 CAR T 세포의 긴장성 활성의 관찰 후에 악화되었다. 항원-자극의 부재하에서도, 항-BCMA10 CAR T 세포는 높은 수준의 염증성 사이토카인을 방출하였다. 지속적인 사이토카인 분비는 항-종양 기능에 부정적으로 영향을 미칠 뿐만 아니라 실질적인 임상 독성을 유발할 가능성을 갖는다. 결국, 본 발명자들은 다발성 골수종의 마우스 모델에서 항-BCMA02 CAR T 세포 배양물에 비해서 항-BCMA10 CAR T 세포에서 더 높은 조성의 세포자멸성 세포 및 더 낮은 항-종양 기능을 발견하였다.
참고 문헌
Avery et al., (2003). BAFF selectively enhances the survival of plasmablasts generated from human memory B cells. J Clin Invest, 112(2), 286-297.
Carpenito et al., (2009). Control of large, established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains. Proc Natl Acad Sci U S A, 106(9), 3360-3365.
Chiu et al., (2007). Hodgkin lymphoma cells express TACI and BCMA receptors and generate survival and proliferation signals in response to BAFF and APRIL. Blood, 109(2), 729-739.
Sanchezet al. (2012). Serum B-cell maturation antigen is elevated in multiple myeloma and correlates with disease status and survival. Br J Haematol, 158(6), 727-738.
실시예 3
림프종 상에서의 최소 BCMA 발현이 항-BCMA CAR T 세포를 활성화한다.
발현이 항-BCMA02 CAR T 세포를 활성화시키기에 충분한지를 결정하기 위해서 림프종 및 백혈병 세포계(다우디 및 라지(Raji)) 상에서의 BCMA 발현의 수준을 측정하였다.
림프종, 백혈병, 및 다발성 골수종 세포 상에서의 BCMA 발현을 유세포 분석기를 사용하여 정량분석하였다. 이러한 검정법에서, 알고 있는 수의 결합된 항체(항체 결합 능력, ABC)에 대한 BCMA 발현의 형광 강도의 상관관계에 의해서 세포 상에서의 상대적인 BCMA 발현을 평가하였다. 림프종 세포계 중의 BCMA 발현 수준을 항-BCMA02 CAR T 세포를 활성화시킨다고 공지된 다발성 골수종 세포계(RPMI-8226) 중에서의 BCMA 발현 수준과 비교하였다. 12590±1275 BCMA02 분자가 RPMI-8226 세포의 표면 상에서 발현되었다. 그에 대조적으로, 다우디 세포는 1173±234 BCMA02 분자를 발현하였고, JeKo-1 세포(외투 세포 림프종 세포계)는 222±138 BCMA02 분자 만을 발현하였다(도 9, 원).
또 다른 실험 세트에서, 림프종 및 백혈병 세포계 상에서 관찰된 낮은 수준의 BCMA에 대한 항-BCMA02 CAR T 세포의 활성을 시험하였다(도 9, 사각형). 표준 방법을 사용하여 항-BCMA02 CAR T 세포를 생성하였고, BCMA-양성 및 BCMA-음성 종양 세포계와 함께 공-배양한 후에 IFNγ ELISA에 의해서 활성을 평가하였다. 항-BCMA02 CAR T 세포의 반응성은 공-배양 후 다양한 종양 세포계의 표면 상에서 BCMA mRNA 발현(역치 초과)의 상대적인 양 및/또는 BCMA 수용체의 밀도와 상관관계가 있었다(도 9). BCMA CAR T 세포를 BCMA-음성(BCMA-) 종양 세포계: 골수성 백혈병(K562), 급성 림프구성 백혈병(NALM-6 및 NALM-16); 외투 세포 림프종(REC-1); 또는 호지킨 림프종(HDLM-2)과 함께 공-배양하는 경우 존재하더라도 약간의 IFNγ가 방출된다. 이와 대조적으로, BCMA02 CAR T 세포를 BCMA-양성(BCMA+) 종양 세포계: B 세포 만성 림프모구성 백혈병(MEC-1), 외투 세포 림프종(JeKo-1), 호지킨 림프종(RPMI-6666), 버킷 림프종(다우디 세포 및 라모스 세포), 및 다발성 골수종(RPMI-8226)과 함께 공-배양하는 경우 상당한 양의 IFNγ가 방출되었다.
BCMA 발현 버킷 림프종 세포(다우디 세포)에 대한 항-BCMA02 CAR T 세포의 반응성을 생체내 동물 연구로 확장시켰다. 다우디 세포는 또한 CD19를 발현한다. 항-BCMA02 CAR T 세포의 생체내 활성을 항-CD19 CAR T 세포의 생체내 활성과 비교하였다. NOD scid 감마(NSG) 마우스에 2 x 106 다우디 세포를 IV 주사하고, CAR T 세포로 치료하기 전에 큰 순환성 종양 부하량이 축적되게 하였다. 종양 유도 후 8일 및 18일에 CAR T 세포를 투여하였다(각각 도 10a 및 도 10b). 비히클 및 음성 대조군(항-CD19Δ CAR T 세포)은 생물발광의 대수기(log-phase) 증가에 의해서 나타내어지는 바와 같이 종양 성장 예방에 실패하였고, 이는 체중 감소 및 죽음을 유발하였다(도 10a, 가장 좌측의 2개의 마우스 패널). 항-CD19 및 항-BCMA02 CAR T 세포는 종양 성장을 예방하였고, 이는 체중 유지 및 생존을 유발하였다. 항-CD19 및 항-BCMA02 CAR T 세포는 8일에 투여되는 경우 동일하게 효과적이었다(도 10a, 가장 우측의 2개의 마우스 패널). 항-BCMA02 CAR T 세포는 또한 종양 유도 후 18일에 투여되는 경우 종양 부하량을 감소시키는 데 효과적이었다. 도 10b, 가장 우측 패널.
실시예 4
항-BCMA CAR T 세포의 강력한 시험관내 활성
항-BCMA02 CAR T 세포의 강력한 시험관내 활성은 50% 감소의 항-BCMA02 CAR 발현으로 달성되었다. T 세포 집단에 항-BCM02 CAR 분자를 암호화하는 렌티바이러스 4x108 내지 5x107 형질도입 단위를 형질도입하였다. 생성된 T 세포 집단은 감소된 항-BCMA02CAR T 세포 빈도(% 양성으로서 검정됨) 및 항-BCMA02CAR 분자의 감소된 발현(평균 형광 강도: MFI로서 검정됨)을 나타내었다.
항-BCMA02 활성에 대한 감소된 CAR 분자 발현의 영향을 측정하였다. 26 ± 4% BCMA-반응성 T 세포를 함유하도록 항-BCMA CAR-양성 T 세포의 빈도를 형질도입되지 않은 T 세포로 정규화하였다(도 11a). 정규화된 항-BCMA02 CAR T 세포의 MFI는 885 내지 1875 범위였다(도 11b). K562는 BCMA를 발현하지 않는 CML 세포계이다. K562 세포를 BCMA를 발현하도록 조작하고, 시험관내 세포용해 검정법에서 사용하여 다양한 BCMA CAR 발현으로 항-BCMA02 CAR T 세포의 활성을 평가하였다(도 11c). K562 세포를 세포 트레이스 바이올렛(cell trace violet)으로 표지하였고, BCMA를 안정하게 발현하는 K562 세포(K562-BCMA)를 CFSE로 표지하였다. T 세포, K562 세포, 및 K562-BCMA 세포를 수확하고, 세척하고, 외인성 사이토카인이 없는 배지 중에 재현탁하였다. 세포를 4시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 20:1 또는 10:1의 이펙터(E; T 세포) 대 표적(T; K562 및 K562 BCMA 세포의 1:1 혼합) 비율에서 배양하였다. 이어서, 세포를 살아있는 것/죽은 것으로 염색하였고, FACS에 의해서 분석하였다. T 세포가 없는 조건에 대해서 정규화된 K562:K562-BCMA 세포의 비의 차이에 의해서 세포독성을 측정하였다.
실시예 5
항-BCMA CAR T 세포 제조 공정
독특한 항-BCMA02 CAR T 세포 생산물을 각각의 환자 치료를 위해서 제조하였다. 11명의 개체의 정상 공여체 PBMC로부터 항-BCMA02 CAR T 세포를 생성함으로써 항-BCMA02 CAR T 세포 생산물에 대한 제조 공정의 신뢰성을 평가하였다. 각각의 공여체로부터의 항-BCMA02 CAR T 세포 확장을 평행하게 수행된 매칭된 형질도입되지 않은 배양물과 비교하였다(도 12a).
배양 기간 마지막에(10일), qPCR 및 렌티바이러스-특이적인 프라이머 세트를 갖는 통합된 렌티바이러스의 수(벡터 복사체 수, VCN)를 정량분석함으로써 T 세포 형질도입 효율을 평가하였다. 11명의 공여체로부터의 항-BCMA02 CAR T 세포 배양물은 대등한 렌티바이러스 형질도입 효율을 나타내었다(도 12b). 유세포 분석기에 의해서 항-BCMA02 CAR 양성 T 세포의 빈도를 측정하였고, BCMA 발현은 모든 공여체 전체에서 대등한 것을 발견하였다(도 12c).
BCMA를 발현하도록 조작된 K562 세포와 함께 공-배양한 후 IFNγ-방출에 의해서 각각의 항-BCMA02 CAR T 세포 생산물의 활성을 평가하였다. 모든 항-BCMA CAR02 T 세포 생산물은 BCMA-발현 K562 세포에 노출되는 경우 치료 관련 수준의 IFNγ 방출을 나타내었다(도 12d).
실시예 6
IL-2로 처리되거나 또는 IL-2와 ZSTK474로 처리된 CAR T 세포 상에서의 CD62L, CD127, CD197, 및 CD38 발현
IL-2 및 ZSTK474와 함께 배양된 CAR T 세포는 IL-2 단독과 함께 배양된 CAR T 세포에 비해서 증가된 CD62L 발현을 나타낸다. 멀티파라미터 질량 세포분석기(CyTOF)를 사용하여 IL-2 및 ZSTK474와 함께 배양된 항-BCMA02 CAR T 세포 상에서의 29개의 추가적인 세포 표면 마커의 발현 분석을 수행하였고, IL-2 단독 중에서 배양된 CAR T 세포와 비교하였다. 3종의 추가 마커(CD127, CD197, 및 CD38)는 IL-2 단독으로 처리된 CAR T 세포에 비해서 IL-2 + ZSTK474 처리된 CAR T 세포에서 증가된 발현을 나타내었다. 따라서, CD62L, CD127, CD197, 및 CD38의 공-발현은 ZSTK474-배양된 CAR T 세포를 추가로 계층화하였다. IL-2를 함유하는 배지 중에서 배양한 후, 항-BCMA02 CAR T의 7.44%가 CD127, CD197 및 CD38을 공-발현하였고, 이에 비해서 IL-2 및 ZSTK474와 함께 배양된 항-BCMA02 CAR T 세포의 24.5%가 그러하였다. 도 13의 벤 다이어그램은 CD62L 양성 항-BCMA02 T 세포 중에서의 CD127, CD197 및 CD38의 공-발현을 도시한다.
실시예 7
ZSTK474 처리는 CD8 T 세포의 빈도를 증가시킨다.
CD8 발현을 IL-2 단독으로 처리된 항-BCMA02 CAR T 세포 또는 IL-2와 ZSTK474로 처리된 항-BCMA02 CAR T 세포에서 정량분석하였다. 형광-표지된 항-CD8 항체 및 유세포 분석기를 사용하여 CD8 발현을 측정하였다. IL-2 및 ZSTK474와 함께 배양된 7명의 정상 공여체로부터의 항-BCMA02 CAR T 세포는 IL-2 단독과 함께 배양된 항-BCMA02 CAR T 세포에 비해서 상당히 더 높은 CD8 발현을 가졌다. 도 14.
실시예 8
ZSTK474 처리된 항-BCMA CAR T 세포 중에서의 항원-독립적인 활성의 부재
항원의 부재하에서 CAR T 세포의 긴장성 활성은 감소된 생물 활성과 연관되었다. IL-2 및 ZSTK474의 존재하에서 배양한 후 항원의 부재하에서 인터페론-γ(IFN-γ) 방출을 정량분석하고 IL-2 단독을 갖는 표준 배양 조건과 비교함으로써 항-BCMA02 CAR T 세포의 긴장성 활성을 평가하였다. 대규모 임상 제조 공정으로 직접 규모 확대 가능한 시스템을 사용하여 항-BCMA CAR T 세포 배양물을 제조하였다. 간략하면, IL-2(셀제닉스(CellGenix)), 및 CD3 및 CD28에 대해서 특이적인 항체(밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec))를 함유하는 배지 중에서 정지 플라스크에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 배양하였다. 항-BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스 2x108 형질도입 단위를 배양 시작 1일 후에 첨가하였다.
IL-2 및 총 10일의 배양을 위해서 최적화된 양의 ZSTK474를 함유하는 새로운 배지를 첨가함으로써 항-BCMA02 CAR T 세포를 대수기로 유지시켰다. 제조 마지막에, 동일한 수의 항-BCMA02 CAR T 세포를 배지 단독 중에서 24시간 동안 재배양하였다. 24시간 동안 방출된 IFN-γ의 양을 ELISA에 의해서 정량분석하였다. 이러한 검정법에서, 200pg/mL 미만의 IFN-γ 수준은 긴장성 활성이 없음을 나타낸다. 도 15는 14명의 공여체로부터의 항-BCMA02 CAR T 세포에 의해서 방출된 IFN-γ의 양이 CAR T 세포가 ZSTK474와 함께 배양되든지 그렇지 않든지에 관계없이 긴장성 활성 부재와 일치한다는 것을 보여준다.
실시예 9
ZSTK474 처리된 항-BCMA02 CAR T 세포는 림프종 종양 모델에서 치료 활성을 나타낸다.
다우디 종양을 사용하여 IL-2와 함께 배양되거나 또는 IL-2 및 ZSTK474와 함께 배양된 항-BCMA02 CAR T 세포의 항-종양 활성을 조사하였다. 다우디 세포는 낮은 수준의 BCMA 단백질을 발현하고, 공격적이고, 치료가 어려운 림프종 종양 모델을 제공한다.
2 x 106 다우디 종양 세포를 파이어플라이(firefly) 루시퍼라제 유전자로 표지하고, 정맥내 주사에 의해서 NOD scid IL-2 수용체 감마 쇄 넉아웃 마우스(NSG)에 주사하였다. 종양이 형성되도록 한 후, 1x107 CAR T 세포를 종양 보유 마우스에 주사하였다. 마우스에 i) IL-2 또는 IL-2 및 ZSTK474로 10일 동안 처리된 항-BCMA02 CAR T 세포; 또는 ii) IL-2 및 ZSTK474로 10일 동안 처리된 절단된 신호전달 결핍 항-BCMA02(tBCMA02) CAR T 세포를 주사하였다. 제노겐-IVIS 영상화 시스템(IVIS)을 사용하여 생물발광에 의해서 종양 성장을 모니터링하였다.
IL-2 및 ZSTK474로 처리된 항-BCMA02 CAR T 세포가 투여된 마우스의 50%에서 완전한 종양 감소가 관찰되었다. 도 16.
실시예 10
ZSTK474 처리된 CAR T 세포는 인간 골수종의 마우스 모델에서 치료 활성을 나타낸다.
100㎣의 피하 다발성 골수종 종양(RPMI-8226)을 갖는 동물에 동등한 CAR T 세포 용량(1x106 항-BCMA02 CAR-양성 T 세포) 또는 매칭된 T 세포 공여체로부터의 변형되지 않은 T 세포(형질도입되지 않음)를 주입하였다. 항-BCMA CAR T 세포는 실시예 8에 기술된 바와 같이 IL-2로 처리되거나 또는 IL-2 및 ZSTK474로 처리되었다.
IL-2-배양된 항-BCMA02 CAR T 세포로 치료된 동물 또는 IL-2 및 ZSTK474-배양된 항-BCMA02 CAR T 세포로 치료된 동물은 종양 생성이 완전히 예방되었다. 도 17. 이에 반해서, 형질도입되지 않거나 또는 비히클로 치료된 동물은 종양 성장을 제어할 수 없었다. 도 17.
일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시된 구체적인 실시형태로 제한하는 것으로 이해되어서는 안되지만, 그러한 청구범위에 부여된 등가물의 완전한 범주와 함께 모든 가능한 실시형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해서 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> bluebird bio, Inc. <120> BCMA CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS <130> IPA170682-US-D1 <150> US 62/091,419 <151> 2014-12-12 <150> US 62/200,505 <151> 2015-08-03 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 2 Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 3 Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Asp Tyr Ser Ile Asn 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly 1 5 10 15 Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu 20 25 30 Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg 85 90 95 Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 493 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-BCMA02 CAR <400> 9 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu 20 25 30 Ala Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu 35 40 45 Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln 65 70 75 80 Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly 130 135 140 Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu 145 150 155 160 Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly 165 170 175 Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly 180 185 190 Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro 195 200 205 Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr 210 215 220 Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp 225 230 235 240 Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Thr 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln 275 280 285 Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala 290 295 300 Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala 305 310 315 320 Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr 325 330 335 Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln 340 345 350 Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser 355 360 365 Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys 370 375 380 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln 385 390 395 400 Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 405 410 415 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg 420 425 430 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 435 440 445 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 450 455 460 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 465 470 475 480 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 490 <210> 10 <211> 1485 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-BCMA02 CAR <400> 10 atggcactcc ccgtcaccgc ccttctcttg cccctcgccc tgctgctgca tgctgccagg 60 cccgacattg tgctcactca gtcacctccc agcctggcca tgagcctggg aaaaagggcc 120 accatctcct gtagagccag tgagtccgtc acaatcttgg ggagccatct tattcactgg 180 tatcagcaga agcccgggca gcctccaacc cttcttattc agctcgcgtc aaacgtccag 240 acgggtgtac ctgccagatt ttctggtagc gggtcccgca ctgattttac actgaccata 300 gatccagtgg aagaagacga tgtggccgtg tattattgtc tgcagagcag aacgattcct 360 cgcacatttg gtgggggtac taagctggag attaagggaa gcacgtccgg ctcagggaag 420 ccgggctccg gcgagggaag cacgaagggg caaattcagc tggtccagag cggacctgag 480 ctgaaaaaac ccggcgagac tgttaagatc agttgtaaag catctggcta taccttcacc 540 gactacagca taaattgggt gaaacgggcc cctggaaagg gcctcaaatg gatgggttgg 600 atcaataccg aaactaggga gcctgcttat gcatatgact tccgcgggag attcgccttt 660 tcactcgaga catctgcctc tactgcttac ctccaaataa acaacctcaa gtatgaagat 720 acagccactt acttttgcgc cctcgactat agttacgcca tggactactg gggacaggga 780 acctccgtta ccgtcagttc cgcggccgca accacaacac ctgctccaag gccccccaca 840 cccgctccaa ctatagccag ccaaccattg agcctcagac ctgaagcttg caggcccgca 900 gcaggaggcg ccgtccatac gcgaggcctg gacttcgcgt gtgatattta tatttgggcc 960 cctttggccg gaacatgtgg ggtgttgctt ctctcccttg tgatcactct gtattgtaag 1020 cgcgggagaa agaagctcct gtacatcttc aagcagcctt ttatgcgacc tgtgcaaacc 1080 actcaggaag aagatgggtg ttcatgccgc ttccccgagg aggaagaagg agggtgtgaa 1140 ctgagggtga aattttctag aagcgccgat gctcccgcat atcagcaggg tcagaatcag 1200 ctctacaatg aattgaatct cggcaggcga gaagagtacg atgttctgga caagagacgg 1260 ggcagggatc ccgagatggg gggaaagccc cggagaaaaa atcctcagga ggggttgtac 1320 aatgagctgc agaaggacaa gatggctgaa gcctatagcg agatcggaat gaaaggcgaa 1380 agacgcagag gcaaggggca tgacggtctg taccagggtc tctctacagc caccaaggac 1440 acttatgatg cgttgcatat gcaagccttg ccaccccgct aatga 1485 <210> 11 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 30 Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser 35 40 45 Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu 50 55 60 Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile 65 70 75 80 Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu 85 90 95 Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu 100 105 110 Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys 115 120 125 Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe 130 135 140 Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys 145 150 155 160 Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu 165 170 175 Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg 180 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible peptide linker <400> 12 Asp Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible peptide linker <400> 13 Thr Gly Glu Lys Pro 1 5 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible peptide linker <400> 14 Gly Gly Arg Arg 1 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible peptide linker <400> 15 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible peptide linker <400> 16 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp 1 5 10 <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible peptide linker <400> 17 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible peptide linker <400> 18 Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible peptide linker <400> 19 Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro 1 5 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible peptide linker <400> 20 Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro 1 5 10 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible peptide linker <400> 21 Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro 1 5 10 15 <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible peptide linker <400> 22 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> Xaa = Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is Gly or Ser <400> 23 Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 24 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 25 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser 1 5 <210> 26 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 26 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 27 Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 28 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 28 Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 1 5 10 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 29 Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 1 5 10 15 Pro <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 30 Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 31 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 31 Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 32 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 32 Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro 1 5 10 15 Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys 20 25 30 Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr 35 40 <210> 33 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 33 Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 34 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 34 Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val 1 5 10 15 Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly 20 25 30 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 35 40 <210> 35 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 35 Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu 1 5 10 15 Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 20 25 30 Pro <210> 36 <211> 7350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-BCMA02 CAR vector <400> 36 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatcatat gccagcctat ggtgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240 tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300 tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360 tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480 caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca 600 gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat 660 tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 720 caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 780 cagagctcgt ttagtgaacc gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 840 ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgctcaaag 900 tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 960 cagtgtggaa aatctctagc agtggcgccc gaacagggac ttgaaagcga aagtaaagcc 1020 agaggagatc tctcgacgca ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg 1080 gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagtagg 1140 gtgcgagagc gtcggtatta agcgggggag aattagataa atgggaaaaa attcggttaa 1200 ggccaggggg aaagaaacaa tataaactaa aacatatagt tagggcaagc agggagctag 1260 aacgattcgc agttaatcct ggccttttag agacatcaga aggctgtaga caaatactgg 1320 gacagctaca accatccctt cagacaggat cagaagaact tagatcatta tataatacaa 1380 tagcagtcct ctattgtgtg catcaaagga tagatgtaaa agacaccaag gaagccttag 1440 ataagataga ggaagagcaa aacaaaagta agaaaaaggc acagcaagca gcagctgaca 1500 caggaaacaa cagccaggtc agccaaaatt accctatagt gcagaacctc caggggcaaa 1560 tggtacatca ggccatatca cctagaactt taaattaaga cagcagtaca aatggcagta 1620 ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 1680 gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 1740 caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggaaagg accagcaaag 1800 ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata atagtgacat aaaagtagtg 1860 ccaagaagaa aagcaaagat catcagggat tatggaaaac agatggcagg tgatgattgt 1920 gtggcaagta gacaggatga ggattaacac atggaaaaga ttagtaaaac accatagctc 1980 tagagcgatc ccgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga 2040 attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa 2100 gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt 2160 cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag 2220 acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca 2280 acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc 2340 tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact 2400 catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat 2460 ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttggt 2520 aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc 2580 accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat 2640 agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatccat 2700 ctcgacggaa tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc taggatcaag gttaggaaca 2760 gagagacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct 2820 cagggccaag aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 2880 gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc 2940 agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg 3000 ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc 3060 gagctcaata aaagagccca caacccctca ctcggcgcga ttcacctgac gcgtctacgc 3120 caccatggca ctccccgtca ccgcccttct cttgcccctc gccctgctgc tgcatgctgc 3180 caggcccgac attgtgctca ctcagtcacc tcccagcctg gccatgagcc tgggaaaaag 3240 ggccaccatc tcctgtagag ccagtgagtc cgtcacaatc ttggggagcc atcttattca 3300 ctggtatcag cagaagcccg ggcagcctcc aacccttctt attcagctcg cgtcaaacgt 3360 ccagacgggt gtacctgcca gattttctgg tagcgggtcc cgcactgatt ttacactgac 3420 catagatcca gtggaagaag acgatgtggc cgtgtattat tgtctgcaga gcagaacgat 3480 tcctcgcaca tttggtgggg gtactaagct ggagattaag ggaagcacgt ccggctcagg 3540 gaagccgggc tccggcgagg gaagcacgaa ggggcaaatt cagctggtcc agagcggacc 3600 tgagctgaaa aaacccggcg agactgttaa gatcagttgt aaagcatctg gctatacctt 3660 caccgactac agcataaatt gggtgaaacg ggcccctgga aagggcctca aatggatggg 3720 ttggatcaat accgaaacta gggagcctgc ttatgcatat gacttccgcg ggagattcgc 3780 cttttcactc gagacatctg cctctactgc ttacctccaa ataaacaacc tcaagtatga 3840 agatacagcc acttactttt gcgccctcga ctatagttac gccatggact actggggaca 3900 gggaacctcc gttaccgtca gttccgcggc cgcaaccaca acacctgctc caaggccccc 3960 cacacccgct ccaactatag ccagccaacc attgagcctc agacctgaag cttgcaggcc 4020 cgcagcagga ggcgccgtcc atacgcgagg cctggacttc gcgtgtgata tttatatttg 4080 ggcccctttg gccggaacat gtggggtgtt gcttctctcc cttgtgatca ctctgtattg 4140 taagcgcggg agaaagaagc tcctgtacat cttcaagcag ccttttatgc gacctgtgca 4200 aaccactcag gaagaagatg ggtgttcatg ccgcttcccc gaggaggaag aaggagggtg 4260 tgaactgagg gtgaaatttt ctagaagcgc cgatgctccc gcatatcagc agggtcagaa 4320 tcagctctac aatgaattga atctcggcag gcgagaagag tacgatgttc tggacaagag 4380 acggggcagg gatcccgaga tggggggaaa gccccggaga aaaaatcctc aggaggggtt 4440 gtacaatgag ctgcagaagg acaagatggc tgaagcctat agcgagatcg gaatgaaagg 4500 cgaaagacgc agaggcaagg ggcatgacgg tctgtaccag ggtctctcta cagccaccaa 4560 ggacacttat gatgcgttgc atatgcaagc cttgccaccc cgctaatgac aggtaccttt 4620 aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 4680 actggaaggg ctaattcact cccaaagaag acaagatctg ctttttgcct gtactgggtc 4740 tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 4800 taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaatgtgtg tgttggtttt ttgtgtgtcg 4860 aaattctagc gattctagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 4920 ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 4980 tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 5040 gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 5100 gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 5160 gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 5220 taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 5280 cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 5340 ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 5400 aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 5460 tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 5520 gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 5580 cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 5640 ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 5700 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 5760 gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 5820 cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 5880 tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 5940 ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 6000 aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 6060 atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 6120 ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 6180 tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 6240 agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 6300 taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 6360 tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 6420 cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 6480 ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 6540 tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 6600 tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 6660 cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 6720 tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 6780 gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 6840 tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 6900 atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 6960 tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 7020 cacatttccc cgaaaagtgc cacctgggac tagctttttg caaaagccta ggcctccaaa 7080 aaagcctcct cactacttct ggaatagctc agaggccgag gcggcctcgg cctctgcata 7140 aataaaaaaa attagtcagc catggggcgg agaatgggcg gaactgggcg gagttagggg 7200 cgggatgggc ggagttaggg gcgggactat ggttgctgac taattgagat gagcttgcat 7260 gccgacattg attattgact agtccctaag aaaccattct tatcatgaca ttaacctata 7320 aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 7350

Claims (65)

  1. 인간 BCMA(B 세포 성숙화 항원(B cell maturation antigen)) 폴리펩타이드의 하나 이상의 에피토프와 결합하는 뮤린(murine) 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 세포외 도메인; 막관통 도메인, 하나 이상의 세포내 공-자극 신호전달 도메인, 및 주요 신호전달 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 BCMA 폴리펩타이드와 결합하는 상기 뮤린 항-BCMA 항체 또는 항원 결합 단편은 카멜(Camel) Ig, Ig NAR, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, F(ab)'3 단편, Fv, 단쇄 Fv 항체("scFv"), 비스-scFv, (scFv)2, 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 다이설파이드 안정화된 Fv 단백질("dsFv"), 및 단일-도메인 항체(sdAb, 나노바디)로 이루어진 군으로부터 선택되는, CAR.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인간 BCMA 폴리펩타이드와 결합하는 상기 뮤린 항-BCMA 항체 또는 항원 결합 단편은 scFv인, CAR.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함하는, CAR.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 하나 이상의 CDR을 포함하는, CAR.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 서열을 포함하는, CAR.
  7. 제6항에 있어서, 상기 가변 경쇄 서열은 서열번호 1 내지 3에 제시된 CDR 서열을 포함하는, CAR.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뮤린 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 8에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 서열을 포함하는, CAR.
  9. 제8항에 있어서, 상기 가변 중쇄 서열은 서열번호 4 내지 6에 제시된 CDR 서열을 포함하는, CAR.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154, 및 PD1로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 유래되는, CAR.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α; CD4, CD45, PD1, 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드로부터 유래되는, CAR.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α로부터 유래되는, CAR.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM, 및 ZAP70으로 이루어진 군으로부터 선택된 공-자극 분자로부터 유래되는, CAR.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28, CD134, 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택된 공-자극 분자로부터 유래되는, CAR.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28, CD134, 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택된 공-자극 분자로부터 유래되는, CAR.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD28로부터 유래되는, CAR.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD134로부터 유래되는, CAR.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 공-자극 신호전달 도메인은 CD137로부터 유래되는, CAR.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지(hinge) 영역 폴리펩타이드를 더 포함하는, CAR.
  20. 제19항에 있어서, 상기 힌지 영역 폴리펩타이드는 CD8α의 힌지 영역을 포함하는, CAR.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 영역을 더 포함하는, CAR.
  22. 제21항에 있어서, 상기 스페이서 영역 폴리펩타이드는 IgG1 또는 IgG4의 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는, CAR.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩타이드를 더 포함하는, CAR.
  24. 제23항에 있어서, 상기 신호 펩타이드는 IgG1 중쇄 신호 폴리펩타이드, 과립구-대식세포 집락 자극 인자 수용체 2(granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor 2: GM-CSFR2) 신호 폴리펩타이드, 또는 CD8α 신호 폴리펩타이드를 포함하는, CAR.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, CAR.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  27. CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10에 제시된, CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  28. 제26항 또는 제27항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터인, 벡터.
  30. 제28항에 있어서, 상기 벡터는 에피솜 벡터인, 벡터.
  31. 제28항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
  32. 제28항에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 벡터.
  33. 제28항에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  34. 제28항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1); 인간 면역결핍 바이러스 2(HIV-2), 비스나-매디 바이러스(visna-maedi virus: VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역 결핍 바이러스(BIV); 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)로 본질적으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  35. 제28항 내지 34항 중 어느 한 항에 있어서, 좌측(5') 레트로바이러스 LTR, 프사이(Ψ) 패키징 신호, 중앙 폴리퓨린 트랙/DNA 플랩(cPPT/FLAP), 레트로바이러스 외수송 요소; 제26항 또는 제27항의 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 및 우측(3') 레트로바이러스 LTR을 포함하는, 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 이종 폴리아데닐화 서열을 더 포함하는, 벡터.
  37. 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(hepatitis B virus posttranscriptional regulatory element: HPRE) 또는 우드척 전사후 조절 요소(woodchuck post-transcriptional regulatory element: WPRE)를 더 포함하는, 벡터.
  38. 제35항 내지 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' LTR의 상기 프로모터는 이종 프로모터로 대체된, 벡터.
  39. 제38항에 있어서, 상기 이종 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 또는 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터인, 벡터.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' LTR 또는 상기 3' LTR은 렌티바이러스 LTR인, 벡터.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR은 하나 이상의 변형을 포함하는, 벡터.
  42. 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR은 하나 이상의 결실을 포함하는, 벡터.
  43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' LTR은 자가-불활성화(SIN) LTR인, 벡터.
  44. 제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 서열은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 또는 신호 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열인, 벡터.
  45. 제28항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제26항 또는 제27항의 폴리뉴클레오타이드는 최적화된 코작(Kozak) 서열을 포함하는, 벡터.
  46. 제35항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제26항 또는 제27항의 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 상기 프로모터는 거대세포바이러스 전초기 유전자 프로모터(CMV), 연장 인자(elongation factor) 1 알파 프로모터(EF1-α), 포스포글리세레이트 카이나제-1 프로모터(PGK), 유비퀴틴-C 프로모터(UBQ-C), 거대세포바이러스 인핸서/치킨 베타-액틴 프로모터(CAG), 폴리오마 인핸서/헤르페스 단순 티미딘 카이나제 프로모터(MC1), 베타 액틴 프로모터(β-ACT), 유인원 바이러스 40 프로모터(SV40), 및 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  47. 제28항 내지 제46항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 면역 이펙터 세포.
  48. 제47항에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 T 림프구 및 자연 살해(NK) 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 이펙터 세포.
  49. 제47항 또는 제48항의 면역 이펙터 세포 및 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
  50. 면역 이펙터 세포에 제28항 내지 제46항 중 어느 한 항의 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 포함하는 면역 이펙터 세포의 생성 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포를 자극하고, 상기 세포를 CD3과 결합하는 항체 및 CD28에 결합하는 항체와 접촉시킴으로써 상기 세포를 증식하도록 유도하고; 이에 의해서 면역 이펙터 세포의 집단을 생성하는 단계를 더 포함하는, CAR을 포함하는 면역 이펙터 세포의 생성 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 벡터를 도입하기 전에 상기 면역 이펙터 세포를 자극하여, 증식하도록 유도하는, CAR을 포함하는 면역 이펙터 세포의 생성 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 T 림프구를 포함하는, CAR을 포함하는 면역 이펙터 세포의 생성 방법.
  54. 제51항에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 NK 세포를 포함하는, CAR을 포함하는 면역 이펙터 세포의 생성 방법.
  55. B 세포 관련 병태의 치료가 필요한 대상체에서 B 세포 관련 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 치료 유효량의 제49항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, B 세포 관련 병태를 치료하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 B 세포 관련 병태는 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 불확실한 악성 잠재성의 B 세포 증식, 림프종모양 육아종증, 이식-후 림프증식성 장애, 면역조절 장애, 류마티스성 관절염, 중증 근무력증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 항-인지질 증후군, 샤가스병(Chagas' diease), 그레이브스병(Grave's diease), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 결절성 다발동맥염, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 심상성 천포창, 피부경화증, 다발성 경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 연관 혈관염, 굿파스쳐병(Goodpasture's diease), 가와사키병, 자가면역 용혈성 빈혈, 및 급속 진행성 사구체신염, 중쇄병, 원발성 또는 면역세포-연관 아밀로이드증, 또는 미확정 단클론성 감마병증(monoclonal gammopathy of undetermined significance)인, B 세포 관련 병태를 치료하는 방법.
  57. 제55항에 있어서, 상기 B 세포 관련 병태는 B 세포 악성종양인, B 세포 관련 병태를 치료하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 B 세포 악성종양은 다발성 골수종(MM) 또는 비-호지킨 림프종(NHL)인, B 세포 관련 병태를 치료하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 MM은 현성(overt) 다발성 골수종, 무증상(smoldering) 다발성 골수종, 형질 세포성 백혈병, 비-분비성 골수종, IgD 골수종, 골경화성 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 및 골수외 형질세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, B 세포 관련 병태를 치료하는 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 NHL은 버킷 림프종(Burkitt lymphoma), 만성 림프구성 백혈병/소 림프구성 림프종(CLL/SLL), 미만성 거대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 면역모구성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 및 외투 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, B 세포 관련 병태를 치료하는 방법.
  61. 제55항에 있어서, 상기 B 세포 관련 병태는 형질 세포 악성종양인, B 세포 관련 병태를 치료하는 방법.
  62. 제55항에 있어서, 상기 B 세포 관련 병태는 자가면역 질환인, B 세포 관련 병태를 치료하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 전신 홍반성 루프스인, B 세포 관련 병태를 치료하는 방법.
  64. 제55항에 있어서, 상기 B 세포 관련 병태는 류마티스성 관절염인, B 세포 관련 병태를 치료하는 방법.
  65. 제55항에 있어서, 상기 B 세포 관련 병태는 특발성 혈소판감소성 자반증, 또는 중증 근무력증, 또는 자가면역 용혈성 빈혈인, B 세포 관련 병태를 치료하는 방법.
KR1020237033164A 2014-12-12 2015-12-07 Bcma 키메릭 항원 수용체 KR102731379B1 (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462091419P 2014-12-12 2014-12-12
US62/091,419 2014-12-12
US201562200505P 2015-08-03 2015-08-03
US62/200,505 2015-08-03
KR1020177019116A KR102584938B1 (ko) 2014-12-12 2015-12-07 Bcma 키메릭 항원 수용체
PCT/US2015/064269 WO2016094304A2 (en) 2014-12-12 2015-12-07 Bcma chimeric antigen receptors

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177019116A Division KR102584938B1 (ko) 2014-12-12 2015-12-07 Bcma 키메릭 항원 수용체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20230146100A true KR20230146100A (ko) 2023-10-18
KR102731379B1 KR102731379B1 (ko) 2024-11-19

Family

ID=

Also Published As

Publication number Publication date
BR112017012502B1 (pt) 2020-09-15
RS59537B1 (sr) 2019-12-31
US20190388526A1 (en) 2019-12-26
US20190388527A1 (en) 2019-12-26
CY1122528T1 (el) 2021-01-27
DK3628687T3 (da) 2021-10-18
SG10202013144UA (en) 2021-02-25
US20180085444A1 (en) 2018-03-29
US11633463B2 (en) 2023-04-25
EP3971210A1 (en) 2022-03-23
IL252783B (en) 2021-04-29
CN107207598A (zh) 2017-09-26
US20210077604A1 (en) 2021-03-18
CN112358551B (zh) 2024-02-02
PT3230321T (pt) 2019-10-30
MX2021007011A (es) 2021-10-22
WO2016094304A3 (en) 2016-10-13
CN112358551A (zh) 2021-02-12
US11020466B2 (en) 2021-06-01
US20190388528A1 (en) 2019-12-26
US20190388525A1 (en) 2019-12-26
JP2017538710A (ja) 2017-12-28
US10624960B2 (en) 2020-04-21
HUE056074T2 (hu) 2022-01-28
US20210038705A1 (en) 2021-02-11
MX2017007575A (es) 2018-03-01
ES2895640T3 (es) 2022-02-22
EA201791310A1 (ru) 2017-11-30
CL2017001515A1 (es) 2018-01-12
HUE046815T2 (hu) 2020-03-30
BR112017012502A2 (pt) 2017-12-26
US10646558B2 (en) 2020-05-12
ECSP17044494A (es) 2017-10-31
RS62527B1 (sr) 2021-11-30
WO2016094304A2 (en) 2016-06-16
AU2015360845B2 (en) 2020-11-26
IL281484B (en) 2022-04-01
SG11201704727WA (en) 2017-07-28
JP7065136B2 (ja) 2022-05-11
NZ770737A (en) 2024-07-05
EP3640262A1 (en) 2020-04-22
JP2020092707A (ja) 2020-06-18
PL3230321T3 (pl) 2020-03-31
US10639359B2 (en) 2020-05-05
SI3628687T1 (sl) 2021-12-31
AU2021201147A1 (en) 2021-03-11
CA2970466A1 (en) 2016-06-16
HRP20191873T1 (hr) 2020-01-24
EP3628687A1 (en) 2020-04-01
EP3230321B1 (en) 2019-08-28
US20200330572A1 (en) 2020-10-22
EP3230321A2 (en) 2017-10-18
HK1245801B (zh) 2020-05-15
CN107207598B (zh) 2020-12-08
IL252783A0 (en) 2017-08-31
CL2018001556A1 (es) 2018-07-20
ES2750725T3 (es) 2020-03-26
CO2017006808A2 (es) 2018-01-05
EP3230321A4 (en) 2018-07-25
US20210052711A1 (en) 2021-02-25
ZA201704059B (en) 2021-08-25
DK3230321T3 (da) 2019-10-28
JP2023178438A (ja) 2023-12-14
JP6671370B2 (ja) 2020-03-25
US20210077603A1 (en) 2021-03-18
PT3628687T (pt) 2021-10-20
KR102584938B1 (ko) 2023-10-05
LT3230321T (lt) 2019-12-10
JP7375098B2 (ja) 2023-11-07
LT3628687T (lt) 2021-11-10
SI3230321T1 (sl) 2019-12-31
EA036379B1 (ru) 2020-11-02
KR20170090501A (ko) 2017-08-07
US12029784B2 (en) 2024-07-09
EP3628687B1 (en) 2021-07-28
US10383929B2 (en) 2019-08-20
CY1124886T1 (el) 2022-11-25
IL281484A (en) 2021-04-29
US10639358B2 (en) 2020-05-05
US11351236B2 (en) 2022-06-07
PL3628687T3 (pl) 2022-03-21
US11382965B2 (en) 2022-07-12
HRP20211648T1 (hr) 2022-02-04
AU2021201147B2 (en) 2024-08-22
JP2022090086A (ja) 2022-06-16
AU2015360845A1 (en) 2017-07-13
NZ733025A (en) 2022-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021201147B2 (en) BCMA chimeric antigen receptors
KR20220110208A (ko) 항-ｂｃｍａ 키메라 항원 수용체의 용도
AU2019261783B2 (en) MND promoter chimeric antigen receptors
JP6706244B2 (ja) Ｂｃｍａキメラ抗原受容体
KR20210045985A (ko) 항-bcma 키메라 항원 수용체의 용도
KR102731379B1 (ko) Bcma 키메릭 항원 수용체
KR20230113755A (ko) 선행 항암 알킬화제 요법을 받은 환자에서의 car t 세포 요법
KR20230117383A (ko) 염증-관련 가용성 인자의 억제제와 조합된 키메라 항원수용체 (car) t-세포 요법의 용도
KR20230171994A (ko) 선행 줄기 세포 이식을 받은 환자에서의 t 세포 요법
CN116802743A (zh) 曾经历先前抗癌烷化剂疗法的患者中的car t细胞疗法
RU2799573C2 (ru) Химерные антигенные рецепторы с mnd-промотором
JP2024161391A (ja) 抗ｂｃｍａキメラ抗原受容体の使用
EA045264B1 (ru) Способ лечения гемобластоза с помощью иммунных эффекторных клеток, содержащих химерные антигенные рецепторы к bcma

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right