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KR20230126713A - Cea6 결합 분자 및 이의 사용 - Google Patents

Cea6 결합 분자 및 이의 사용 Download PDF

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KR20230126713A
KR20230126713A KR1020237024174A KR20237024174A KR20230126713A KR 20230126713 A KR20230126713 A KR 20230126713A KR 1020237024174 A KR1020237024174 A KR 1020237024174A KR 20237024174 A KR20237024174 A KR 20237024174A KR 20230126713 A KR20230126713 A KR 20230126713A
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KR
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seq
ser
gly
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Application number
KR1020237024174A
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English (en)
Inventor
파르자드 하에리자데
마수드 타예비
Original Assignee
바이오아르디스 엘엘씨
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Filing date
Publication date
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Abstract

종양태아성 항원 6(CEA6)-특이적 결합 폴리펩타이드가 본 명세서에 개시된다. 이들 결합 폴리펩타이드는 키메라 항원 수용체(CAR)에 포함될 수 있다. 또한 예를 들어 암의 치료를 위해 이들 결합 폴리펩타이드 및/또는 CAR을 사용하는 방법이 본 명세서에 개시된다.

Description

CEA6 결합 분자 및 이의 사용
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 18일자로 출원된 미국 가출원 제63/127885호 및 2021년 10월 8일자로 출원된 미국 가출원 제63/262312호의 우선권을 주장하는 것으로, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2021년 12월 16일자로 생성되어 마지막으로 수정된 76,529바이트 크기의 BWGB005_SeqListing.TXT라는 이름의 파일로 제공된다. 전자 서열 목록의 정보는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
분야
본 개시내용의 양상들은 일반적으로 CEA6(CEACAM6)-특이적 결합 폴리펩타이드에 관한 것이다. 이들 결합 폴리펩타이드는 면역 세포에서 발현되도록 키메라 항원 수용체(CAR) 작제물에 포함될 수 있다. 이들 결합 폴리펩타이드 및 CAR은 암의 치료에 사용될 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 및 기타 입양세포요법(adoptive cell therapy)은 암의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. CAR은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호 도메인으로 구성되며, 표적 항원을 발현하지 않는 정상 세포에 최소한으로 영향을 미치면서 세포 표면 항원 발현을 기반으로 암세포의 직접 살해를 가능하게 한다. 세포외 항원 결합 도메인은 종종 항체 또는 이의 결합 단편 또는 유도체, 예를 들어 단일 사슬 가변 단편(scFv) 또는 단일 도메인 항체(sdAb)로 구성된다. 현재 다양한 암 또는 기타 질환의 치료를 위한 CAR에 사용하기 위한 개선된 세포외 항원 결합 도메인이 필요하다.
종양태아성 항원 6(carcinoembryonic antigen 6)(CEA6; 종양태아성 항원-관련 세포접착분자 6(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6); CEACAM6)에 결합할 수 있는 결합 폴리펩타이드가 본 명세서에 개시된다. 이들 결합 폴리펩타이드는 세포에 의해 발현될 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR)에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 폴리펩타이드는 단일 도메인 항체(sdAb)이다.
일부 실시형태에서 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CEA6 결합 폴리펩타이드가 본 명세서에 개시된다. 일부 실시형태에서, CDR-H1은 서열번호 1 내지 43에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H2는 서열번호 44 내지 86에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열번호 87 내지 129에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H1은 서열번호 1 내지 43에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 44 내지 86에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 87 내지 129에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 서열번호 130 내지 172에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또한 본 명세서에 개시된 CEA6 결합 폴리펩타이드들 중 임의의 하나를 암호화하는 핵산이 본 명세서에 개시된다.
또한 치료를 필요로 하는 대상의 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상에게 키메라 항원 수용체 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 세포는 본 명세서에 개시된 키메라 항원 수용체 세포들 중 임의의 하나이다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 세포는 본 명세서에 개시된 CEA6 결합 폴리펩타이드들 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 본 발명의 실시형태들은 다음의 번호가 매겨진 대안들을 통해 기술된다:
1. CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 종양태아성 항원 6(CEA6) 결합 폴리펩타이드로서,
CDR-H1은 서열번호 1 내지 43에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고,
CDR-H2는 서열번호 44 내지 86에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고,
CDR-H3은 서열번호 87 내지 129에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, CEA6 결합 폴리펩타이드.
2. 대안 1에 있어서,
1) CDR-H1은 서열번호 1의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 44의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 87의 서열을 포함하는;
2) CDR-H1은 서열번호 2의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 45의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 88의 서열을 포함하는;
3) CDR-H1은 서열번호 3의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 46의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 89의 서열을 포함하는;
4) CDR-H1은 서열번호 4의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 47의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 90의 서열을 포함하는;
5) CDR-H1은 서열번호 5의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 48의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 91의 서열을 포함하는;
6) CDR-H1은 서열번호 6의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 49의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 92의 서열을 포함하는;
7) CDR-H1은 서열번호 7의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 50의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 93의 서열을 포함하는;
8) CDR-H1은 서열번호 8의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 51의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 94의 서열을 포함하는;
9) CDR-H1은 서열번호 9의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 52의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 95의 서열을 포함하는;
10) CDR-H1은 서열번호 10의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 53의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 96의 서열을 포함하는;
11) CDR-H1은 서열번호 11의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 54의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 97의 서열을 포함하는;
12) CDR-H1은 서열번호 12의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 55의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 98의 서열을 포함하는;
13) CDR-H1은 서열번호 13의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 56의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 99의 서열을 포함하는;
14) CDR-H1은 서열번호 14의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 57의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 100의 서열을 포함하는;
15) CDR-H1은 서열번호 15의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 58의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 101의 서열을 포함하는;
16) CDR-H1은 서열번호 16의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 59의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 102의 서열을 포함하는;
17) CDR-H1은 서열번호 17의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 60의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 103의 서열을 포함하는;
18) CDR-H1은 서열번호 18의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 61의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 104의 서열을 포함하는;
19) CDR-H1은 서열번호 19의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 62의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 105의 서열을 포함하는;
20) CDR-H1은 서열번호 20의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 63의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 106의 서열을 포함하는;
21) CDR-H1은 서열번호 21의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 64의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 107의 서열을 포함하는;
22) CDR-H1은 서열번호 22의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 65의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 108의 서열을 포함하는;
23) CDR-H1은 서열번호 23의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 66의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 109의 서열을 포함하는;
24) CDR-H1은 서열번호 24의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 67의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 110의 서열을 포함하는;
25) CDR-H1은 서열번호 25의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 68의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 111의 서열을 포함하는;
26) CDR-H1은 서열번호 26의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 69의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 112의 서열을 포함하는;
27) CDR-H1은 서열번호 27의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 70의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 113의 서열을 포함하는;
28) CDR-H1은 서열번호 28의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 71의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 114의 서열을 포함하는;
29) CDR-H1은 서열번호 29의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 72의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 115의 서열을 포함하는;
30) CDR-H1은 서열번호 30의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 73의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 116의 서열을 포함하는;
31) CDR-H1은 서열번호 31의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 74의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 117의 서열을 포함하는;
32) CDR-H1은 서열번호 32의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 75의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 118의 서열을 포함하는;
33) CDR-H1은 서열번호 33의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 76의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 119의 서열을 포함하는;
34) CDR-H1은 서열번호 34의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 77의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 120의 서열을 포함하는;
35) CDR-H1은 서열번호 35의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 78의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 121의 서열을 포함하는;
36) CDR-H1은 서열번호 36의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 79의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 122의 서열을 포함하는;
37) CDR-H1은 서열번호 37의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 80의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 123의 서열을 포함하는;
38) CDR-H1은 서열번호 38의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 81의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 124의 서열을 포함하는;
39) CDR-H1은 서열번호 39의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 82의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 125의 서열을 포함하는;
40) CDR-H1은 서열번호 40의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 83의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 126의 서열을 포함하는;
41) CDR-H1은 서열번호 41의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 84의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 127의 서열을 포함하는;
42) CDR-H1은 서열번호 42의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 85의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 128의 서열을 포함하는; 또는
43) CDR-H1은 서열번호 43의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 86의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 129의 서열을 포함하는; CEA6 결합 폴리펩타이드.
3. 대안 1 또는 대안 2에 있어서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 130 내지 172에서 선택된 임의의 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CEA6 결합 폴리펩타이드.
4. 대안 1 내지 대안 3 중 어느 하나에 있어서, CEA6 결합 폴리펩타이드는 인간화된, CEA6 결합 폴리펩타이드.
5. 대안 1 내지 대안 4 중 어느 하나에 있어서, CEA6 결합 폴리펩타이드는 단일 도메인 항체(sdAb)인, CEA6 결합 폴리펩타이드.
6. 대안 1 내지 대안 5 중 어느 하나의 CEA6 결합 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
7. 대안 6의 CAR을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 세포.
8. 대안 7에 있어서, CAR 세포는 CAR T 세포인, CAR 세포.
9. 대안 7 또는 대안 8에 있어서, CAR 세포는 적어도 2종의 결합 폴리펩타이드를 포함하고 CAR 세포는 다가 CAR 세포인, CAR 세포.
10. 대안 7 내지 대안 9 중 어느 하나에 있어서, CAR 세포는 대상으로부터 또는 세포주로부터 유래된, CAR 세포.
11. 대안 10에 있어서, 대상은 암이 있는, CAR 세포.
12. 대안 11에 있어서, 암은 유방암, 대장암, 신장암, 간암, 폐암, 뇌암, 췌장암, 방광암, 고환암, 전립선암, 위암, 난소암, 두경부암, 담낭암, 혈액암 또는 이들의 임의의 조합인, CAR 세포.
13. 대안 1 내지 대안 5 중 어느 하나의 CEA6 결합 폴리펩타이드 또는 대안 6의 CAR에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
14. 대안 7 내지 대안 12 중 어느 하나의 CAR 세포를 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 대상의 암을 치료하는 방법.
15. 대안 14에 있어서, 키메라 항원 수용체 세포는 대상에 자가조직적이거나 동종이계적인, 암을 치료하는 방법.
16. 대안 14 또는 대안 15에 있어서, 대상은 포유동물인, 암을 치료하는 방법.
17. 대안 14 내지 대안 16 중 어느 하나에 있어서, 대상은 인간인, 암을 치료하는 방법.
18. 대안 14 내지 대안 17 중 어느 하나에 있어서, 암은 유방암, 대장암, 신장암, 간암, 폐암, 뇌암, 췌장암, 방광암, 고환암, 전립선암, 위암, 난소암, 두경부암, 담낭암, 혈액암 또는 이들의 임의의 조합인, 암을 치료하는 방법.
19. 대안 14 내지 대안 18 중 어느 하나에 있어서, 키메라 항원 수용체 세포는 비경구적으로 투여되는, 암을 치료하는 방법.
위에 기술된 특징들에 더해, 추가적인 특징들 및 변형들이 다음의 도면 및 예시적인 실시형태들의 설명으로부터 쉽게 명확해질 것이다. 이들 도면은 전형적인 실시형태를 나타내며 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
도 1은 본 명세서에 개시된 중쇄 가변 도메인 CDR들에 대한 예시적인 정렬을 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 MKN-45 위암 세포에 대한 예시적인 항-CEA6 CAR T-세포주의 세포독성 분석 결과를 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 T-세포는 Z0016(도 2a) 또는 Y1287(도 2b)의 두 공여자로부터 얻었다.
도 2c 및 도 2d는 BxPC-3 췌장암 세포에 대한 예시적인 항-CEA6 CAR T-세포주의 세포독성 분석 결과를 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 T-세포는 Z0016(도 2c) 또는 Y1287(도 2d)의 두 공여자로부터 얻었다.
도 2e 및 도 2f는 Capan-1 췌장암 세포에 대한 예시적인 항-CEA6 CAR T-세포주의 세포독성 분석 결과를 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 T-세포는 Z0016(도 2e) 또는 Y1287(도 2f)의 두 공여자로부터 얻었다.
도 3a는 위 종양, 비-소세포 폐암(NSCLC) 및 췌장 종양의 세포주-유래 이종이식(CDX) 모델에서 종양에 대한 예시적인 항-CEA6 CAR T-세포주 B4T2-001('001)의 항-종양 효능을 나타내는 3개의 선 그래프를 나타낸다.
도 3b는 췌장 종양의 췌장 정위(orthotopic) 모델 이미지를 나타내며 또한 췌장 정위 및 환자-유래 대장암 이종이식 모델에서 종양에 대한 예시적인 항-CEA6 CAR T-세포주 B4T2-001('001)의 효능을 상세히 설명하는 선 그래프를 나타낸다.
도 4는 2차 완전 반응을 유도하는 예시적인 항-CEA6 CAR T-세포주 B4T2-001의 면역학적 기억을 나타내는 종양 재공격 연구의 결과를 나타내는 선 그래프이다.
키메라 항원 수용체 세포에 포함되는 결합 폴리펩타이드가 본 명세서에 개시된다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 세포는 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포)이다. 이들 CAR-T는 이 분야에 통상적으로 알려진 공정들을 통해 구축될 수 있다. 결합 폴리펩타이드는 각각의 종양-관련 항원들에 대한 특이성을 제공하여 CAR-T 세포에 의한 상기 종양-관련 항원을 발현하는 암의 표적화를 가능하게 한다.
일부 실시형태에서, 결합 폴리펩타이드는 키메라 항원 수용체 세포(예를 들어, CAR-T 세포)의 표면 상에 배치된 단일 도메인 항체(sdAbs)이다. sdAbs는 종양-관련 항원에 대해 특이적이거나 이 항원에 대한 결합 친화성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양-관련 항원은 종양태아성 항원 6(CEA6)이다.
또한 본 명세서에 개시된 하나 이상의 결합 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체 세포를 투여하여 치료를 필요로 하는 대상의 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시형태에서, 암은 유방암, 대장암, 신장암, 간암, 폐암, 뇌암, 췌장암, 방광암, 고환암, 전립선암, 위암, 난소암, 두경부암, 담낭암, 혈액암 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 혈액암은 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 털세포 백혈병, 림프종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종 또는 다발성 골수종을 포함할 수 있다. CAR-T 세포는 자가 치료를 위해 대상으로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, CAR-T 세포는 동종이계 치료를 위해 대상과 같은 종으로부터 유래될 수 있다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 청구된 주제가 속하는 기술 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명을 위한 것이며 임의의 청구된 주제를 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다.
본 명세서에 사용된 부분 머릿말은 구성적 목적 만을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에 사용된 단수적 표현은 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(예를 들어, 적어도 하나)를 의미한다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
"약"은 참조 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이에 대한 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%만큼의 변하는 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이를 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 "포함하는"은 언급된 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 군을 포함하는 것을 암시하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 군을 배제하는 것을 암시하지는 않는 것으로 이해될 것이다. "이루어지는"은 문구 "이루어지는"의 앞에 오는 모든 것을 포함하고 이 것으로 제한되는 것을 의미한다. 따라서 문구 "이루어지는"은 나열된 요소가 필수적이거나 의무적이고, 다른 요소들은 존재할 수 없음을 나타낸다. "본질적으로 이루어지는"은 문구 앞에 나열된 임의의 요소들을 포함하는 것을 의미하며 나열된 요소들에 대한 개시내용에 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다. 따라서 문구 "본질적으로 이루어지는"은 나열된 요소가 필수적이거나 의무적이지만, 다른 요소들은 선택적이며 나열된 요소들의 활성 또는 작용에 실질적으로 영향을 미치는지에 따라 존재할 수도 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 "개체(들)", "대상(들)" 및 "환자(들)"은 임의의 포유동물을 의미한다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 비-인간이다. 어떠한 용어도 의료계 종사자(예를 들어, 의사, 공인 간호사, 전담 간호사, 의사 보조원, 잡역 또는 호스피스 종사자)의 감독(예를 들어, 지속적 또는 간헐적)이 특징인 상황을 필요로 하거나 이에 제한되지 않는다.
용어 "투여"는 대상에 대한 경장(enteral), 경구, 비강내, 비경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 세동맥내, 심실내(뇌실내), 피내, 병변내, 두개내, 척수강내 또는 피하 투여 또는 서방형 장치, 예를 들어 미니-삼투압 펌프의 이식을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 올리고뉴클레오타이드, 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 생성되는 단편 및 결찰, 절단, 엔도뉴클레아제의 작용 및 엑소뉴클레아제의 작용 중 임의의 것에 의해 생성되는 단편을 의미한다. 핵산 분자는 자연-발생 뉴클레오타이드(예를 들어, DNA 및 RNA) 또는 자연-발생 뉴클레오타이드의 유사체(예를 들어, 자연-발생 뉴클레오타이드의 거울상 이성질체 형태)인 단량체들 또는 이 둘의 조합으로 구성될 수 있다. 핵산 단량체들은 인산이에스터 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 핵산 또는 핵산들은 다양한 생물학적 시스템에서 핵산 또는 핵산들의 증폭 및/또는 발현을 위해 사용될 수 있는 핵산 벡터 또는 핵산 작제물(예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 포스미드, 파지미드, 세균성 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 또는 인간 인공 염색체(HAC))에 포함될 수 있다. 전형적으로, 벡터 또는 작제물은 프로모터, 인핸서, 터미네이터, 인듀서, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위, 시작 코돈, 정지 코돈, 폴리아데닐화 신호, 복제 기원점, 클로닝 부위, 다중 클로닝 부위, 제한 효소 부위, 에피토프, 리포터 유전자, 선별 마커, 항생제 선별 마커, 표적화 서열, 펩타이드 정제 태그 또는 부속 유전자 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이로 제한되지 않는 요소들도 함유할 것이다.
핵산 또는 핵산 분자는 서로 다른 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 이들 하나 이상의 서열은 같은 핵산 또는 핵산 분자 안에 인접하게 연결되거나 그 사이의 추가 핵산, 예를 들어 링커, 반복체 또는 제한 효소 부위, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200 또는 300개의 염기 길이이거나 전술한 길이들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 임의의 길이의 임의의 다른 서열로 연결될 수 있다. 본 명세서에 사용된 것으로서 핵산 상의 용어 "다운스트림"은 핵산이 이중 가닥인 경우 암호화 서열을 함유하는 가닥(센스 가닥) 상에서 이전 서열의 3'-말단 뒤에 있는 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 것으로서 핵산 상의 용어 "업스트림"은 핵산이 이중 가닥인 경우 암호화 서열을 함유하는 가닥(센스 가닥) 상에서 후속 서열의 5'-말단 앞에 있는 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 것으로서 핵산 상의 용어 "집단화된"(grouped)은 직접적으로 또는 그 사이의 추가 핵산, 예를 들어 링커, 반복체 또는 제한 효소 부위, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200 또는 300개의 염기 길이이거나 전술한 길이들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 임의의 길이의 임의의 다른 서열과 함께, 그러나 일반적으로는 기능적 또는 촉매적 폴리펩타이드, 단백질 또는 단백질 도메인을 암호화하는 사이 서열과 함께 하지는 않는, 근접하게 존재하는 둘 이상의 서열을 의미한다.
본 명세서에 사용된 것으로서 핵산에 관한 용어 "코돈 최적화된"은 종-특이적 코돈 사용빈도 편향 및 표적 세포 세포질에서의 각 아미노아실-tRNA의 상대적 가용성을 기반으로 폴리펩타이드 서열의 변화없이 특정 종의 숙주에서 번역을 향상 또는 최적화하기 위한 핵산 코돈의 치환을 의미한다. 코돈 최적화 및 이러한 최적화를 수행하는 기술들은 이 분야에 알려져 있다. 이 분야의 기술자들은 유전자 발현 수준이 프로모터 서열 및 조절 요소와 같은 많은 인자들에 의존함을 이해할 것이다. 이러한 양상에서, 많은 합성 유전자들을 이들의 단백질 발현 수준이 증가하도록 설계할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 펩타이드 결합으로 연결된 아미노산들로 구성된 거대분자를 의미한다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질의 수많은 기능들이 이 분야에 알려져 있으며, 효소, 구조, 수송, 방어, 호르몬 또는 신호전달이 포함되지만 이로 제한되지는 않는다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 항상은 아니지만 종종 핵산 주형을 사용하여 리보솜 복합체에 의해 생물학적으로 생산되지만, 화학적 합성도 이용할 수 있다. 핵산 주형을 조작하여, 치환, 결실, 절단, 부가, 중복화 또는 하나 초과의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 융합과 같은 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질 돌연변이를 수행할 수 있다. 이들 하나 초과의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 융합은 같은 분자 안에 인접하게 연결되거나 그 사이의 추가 아미노산, 예를 들어 링커, 반복체, 에피토프 또는 태그, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200 또는 300개의 베이스 길이이거나 전술한 길이들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 임의의 길이의 임의의 다른 서열로 연결될 수 있다. 본 명세서에 사용된 것으로서 폴리펩타이드 상의 용어 "다운스트림"은 이전 서열의 C-말단 뒤에 있는 서열을 의미한다. 본 명세서에 사용된 것으로서 폴리펩타이드 상의 용어 "업스트림"은 후속 서열의 N-말단 앞에 있는 서열을 의미한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제시되고 실시예에서 사용된 핵산 또는 펩타이드 서열은 인간, 생쥐, 쥐, 원숭이, 영장류, 고양이, 개, 토끼, 대장균, 효모 및 포유동물 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 생물학적 시스템에서 기능적이다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제시되고 실시예에서 사용된 핵산 또는 펩타이드 서열과 적어도 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 또는 이들 미만의 동일성 또는 전술한 백분율들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 임의의 백분율의 동일성을 공유하는 핵산 또는 펩타이드 서열 또한 생물학적 시스템에서 서열들의 기능에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않고 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "동일성"은 치환, 결실, 반복 또는 서열 내의 삽입과 같은 특정 변화를 가지며 주형 핵산 또는 펩타이드 서열과 각각 같은 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 전체적인 순서를 갖는 핵산 또는 펩타이드 서열을 의미한다. 일부 실시형태에서, 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%만큼 낮은 동일성을 공유하는 2개의 핵산 서열이 번역 중 같은 아미노산을 암호화하는 서로 다른 코돈을 포함함으로써 같은 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
본 명세서에 개시된 것으로서, 본 명세서에 개시된 서열 중 임의의 것에 대해 % 상동성을 갖는 서열이 구상되고 사용될 수 있다. 용어 "% 상동성"은 3-차원 구조를 고려할 때 두 서열들 사이의 보존 정도를 의미한다. 예를 들어, 두 단백질 서열들 사이의 상동성은 베타 가닥, 알파 나선 및 기타 접힘과 같은 구조적 모티프뿐만 아니라 서열 전체의 분포에 따를 수 있다. 상동성은 실증적 또는 인실리코(in silico) 구조적 결정을 통해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 서열들 중 임의의 것에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 임의의 서열이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전체적인 % 상동성에 영향을 미칠 수 있거나 미치지 않을 수 있는, 본 명세서에 개시된 서열들 중 임의의 것에 비교하여 적어도 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 임의의 서열이 사용될 수 있다.
본 명세서에 적용된 것으로서, 본 명세서에 개시된 서열 중 임의의 것에 대해 특정 % 유사성을 갖는 서열이 구상되고 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 서열에는 펩타이드 서열, 핵산 서열, CDR 서열, 가변 영역 서열 또는 중쇄 또는 경쇄 서열이 포함될 수 있다. 펩타이드 서열과 관련하여 이 분야에서 이해되는 바와 같이, "유사성"은 크기, 극성, 전하, pK, 방향족성, 수소 결합 특성 또는 작용기(예를 들어, 하이드록실, 티올, 아민, 카복실 등)의 존재를 포함하지만 이로 제한되지 않는 특성을 기반으로 한 아미노산의 비교를 의미한다. 용어 "% 유사성"은 서열의 길이에 대해 둘 이상의 서열들 사이의 같은 단위(즉, 아미노산)의 백분율을 의미한다. 비교하는 둘 이상의 서열들이 같은 길이인 경우, % 유사성은 각각의 그 길이일 것이다. 비교하는 둘 이상의 서열들이 다른 길이인 경우, 결실 및/또는 삽입이 최상의 정렬을 얻기 위해 도입될 수 있다. 두 아미노산의 유사성은 특정 치환이 보존적인지 비-보존적인지를 나타낼 수 있다. 아미노산 치환의 보존성을 결정하는 방법은 이 분야에 일반적으로 알려져 있으며 치환 매트릭스를 포함할 수 있다. 일반적으로 사용되는 치환 매트릭스에는 BLOSUM45, BLOSUM62, BLOSUM80, PAM100, PAM120, PAM160, PAM200, PAM250이 포함되지만, 기술자에 의해 적절한 것으로 간주되는 것으로서 다른 치환 매트릭스 또는 접근방식이 사용될 수 있다. 관련 서열(예를 들어, 같은 종 또는 더 넓은 범위 내)의 엄격성, 보존 및/또는 분화 및 문제 서열의 길이와 같은 양상을 고려할 때 특정 치환 매트릭스가 다른 것들보다 우선될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 다른 서열에 특정 % 유사성을 갖는 펩타이드 서열은 사용된 유사성 결정 방법에 의해 좌우되는 같거나 허용가능한 치환인 아미노산의 그 %까지 가질 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 서열들 중 임의의 것에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 유사성을 갖는 서열이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 서열들 중 임의의 것에 비교하여 적어도 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 유사한 치환을 갖는 임의의 서열이 사용될 수 있다. 항체 서열에 적용되는 것으로서, 이들 유사한 치환은 항원-결합 영역(즉, CDR) 또는 항원에 결합하지 않거나 항원 결합에 대해 단지 2차적인 영역(즉, 프레임워크 영역)에 적용될 수 있다.
서열과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "공통 서열"(consensus sequence)은 서열 군의 각 위치에서 허용되는 아미노산의 모든 서로 다른 조합들을 나타내는 일반화된 서열을 의미한다. 공통 서열은 단위(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오타이드)가 대부분의 또는 모든 서열에서 같은 관련된 서열들의 보존 영역 및 서열들 사이의 분화를 나타내는 영역에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 항체의 경우에서, CDR의 공통 서열은 항원 결합을 위해 중요하거나 없어도 되는 아미노산을 나타낼 수 있다. 공통 서열은 본 명세서에 제공된 서열들 중 임의의 것으로 준비될 수 있으며, 그 결과로 인한 공통 서열로부터 유래된 다양한 서열들이 주형 서열과 유사한 효과를 갖는 것으로 확인될 수 있음이 고려된다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 이 분야의 기술자에 의해 부여되는 의미를 나타내며, 추가로 에피토프에 알맞고 에피토프를 인식하는 특정 형태를 갖는 임의의 폴리펩타이드 사슬-함유 분자 구조를 포함하는 것으로 의도되고, 여기서 하나 이상의 비-공유 결합 상호작용은 분자 구조와 에피토프 사이의 복합체를 안정화시킨다.
용어 "항체 라이브러리"는 완전한 항체로의 스크리닝 및/또는 조합을 위해 디스플레이된 항체들 및/또는 항체 단편들의 수집물을 의미한다. 항체 및/또는 항체 단편은 리보솜 상에; 파지 상에; 또는 세포 표면 상에, 특히 효모 세포 표면 상에 디스플레이될 수 있다.
항체 또는 결합 폴리펩타이드와 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "경쟁"은, 제1의 항체 또는 결합 폴리펩타이드와 이의 관련 에피토프의 결합의 결과가 제2의 항체 또는 결합 폴리펩타이드의 부재 하에서의 제1의 항체 또는 결합 폴리펩타이드의 결합과 비교하여 제2의 항체 또는 결합 폴리펩타이드의 존재 하에서 검출가능하게 감소될 정도로, 제1의 항체 또는 결합 펩타이드 또는 이의 항원-결합 부분이 제2의 항체 또는 결합 펩타이드 또는 이의 항원-결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합함을 의미한다. 제2의 항체 또는 결합 폴리펩타이드가 이의 에피토프에 결합하는 것이 제1의 항체 또는 결합 폴리펩타이드의 존재 하에서 검출가능하게 감소하는 대안적인 것도 가능하지만 그럴 필요는 없다. 이러한 경쟁이 발생하는 메커니즘(예를 들어, 입체 장애, 구조적 변화 또는 공통 에피토프 또는 이의 일부에 대한 결합)에 상관없이, 숙련된 기술자는 본 명세서에 제공된 교시를 기초로 이러한 경쟁하는 항체 또는 결합 폴리펩타이드가 포함될 수 있고 본 명세서에 개시된 방법에 유용할 수 있음을 인식할 것이다.
에피토프에 "우선적으로 결합"하거나 "특이적으로 결합"(본 명세서에서 호환가능하게 사용됨)하는 항체 또는 결합 폴리펩타이드는 이 분야에서 잘 이해되는 용어이며, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 결정하는 방법 또한 이 분야에 잘 알려져 있다. 분자가 대안적인 세포 또는 물질보다 특정 세포 또는 물질과 더 자주 및/또는 더 빠르게 및/또는 더 큰 지속 기간으로 및/또는 더 큰 친화성으로 반응하거나 관여하는 경우 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타낸다고 한다. 항체 또는 결합 폴리펩타이드가 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화성 및/또는 결합활성으로 및/또는 더 쉽게 및/또는 더 큰 지속 기간으로 결합하는 경우 이 항체 또는 결합 폴리펩타이드는 표적에 대해 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"한다.
비-인간(예를 들어, 설치류 또는 영장류) 항체에 적용하는 용어 "인간화"는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소한의 서열을 함유하는 하이브리드 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편이다.
본 명세서에 사용된 용어 "단일 도메인 결합 폴리펩타이드" 또는 "단일 도메인 항체"(sdAb)는 항원을 인식할 수 있는 온전한 면역글로불린 도메인 또는 다른 단백질 접힘부를 포함하는 단일 펩타이드 가닥(예를 들어, 이황화 결합으로 다른 펩타이드 가닥에 결합되지 않은 것)을 의미한다. 단일 도메인 결합 폴리펩타이드 또는 sdAb는 예를 들어 인간으로부터의 또는 대안적인 공급원, 예를 들어 단봉낙타(예를 들어, VHH) 및 연골어류(예를 들어, VNAR)로부터의 전형적인 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 사슬에서 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 결합 폴리펩타이드 또는 sdAb는 하나, 둘 또는 셋의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 도메인 결합 폴리펩타이드 또는 sdAb는 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나, 둘 또는 셋을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "단일-사슬 가변 단편"(scFv)은 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, VH와 VL이 공유결합으로 연결되어 VH:VL 헤테로다이머를 형성하는 융합 단백질이다. VH와 VL은 VL의 C-말단과 VH의 N-말단이 연결되거나 VL의 N-말단과 VH의 C-말단이 연결되도록 직접적으로 연결되거나 펩타이드-암호화 링커에 의해 연결된다. 링커는 일반적으로 유연성을 위한 글라이신뿐만 아니라 용해성을 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하다. 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, scFv 단백질은 본래 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 단일 사슬 Fv 폴리펩타이드 항체는 VH- 및 VL-암호화 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, scFv의 VH 및 VL은 각각 하나, 둘 또는 셋의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, scFv의 VH 및 VL은 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나, 둘 또는 셋을 포함한다.
특정 실시형태에서, CDR의 최종적인 윤곽 및 항체 또는 결합 폴리펩타이드의 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인은 항체 또는 결합 폴리펩타이드의 구조를 해결하고/해결하거나 항체-리간드 복합체의 구조를 해결하여 달성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이는 X-선 결정학과 같은 이 분야의 기술자에게 알려진 다양한 기술들 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 다양한 분석 방법이 CDR 영역을 확인하거나 어림잡는데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 다양한 분석 방법이 CDR 영역을 확인하거나 어림잡는데 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예시에 카밧(Kabat) 정의, 코티아(Chothia) 정의, IMGT 접근방식(Lefranc et al., 2003, Dev Comp Immunol. 27:55-77), 파라톰(Paratome)(Kunik et al., 2012, Nucl Acids Res. W521-4)과 같은 컴퓨터 프로그램, AbM 정의 및 입체구조적 정의가 포함되지만 이로 제한되지는 않는다.
카밧 정의는 항체의 잔기 번호 매기기를 위한 표준이며 CDR 영역을 확인하는데 전형적으로 사용된다. 예를 들어, 문헌[Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8]를 참고할 수 있다. 코티아 정의는 카밧 정의와 유사하지만, 코티아 정의는 특정 구조적 고리 영역의 위치를 고려한다. 예를 들어, 문헌[Chothia et al., 1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17] 및 [Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-83]를 참고할 수 있다. AbM 정의는 항체 구조를 모델링하는 Oxford Molecular Group에 의해 생산된 통합된 컴퓨터 프로그램 세트를 사용한다. 예를 들어, 문헌[Martin et al., 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272] 및 ["AbM.TM., A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd]를 참고할 수 있다. AbM 정의는 지식 데이터베이스와 문헌[Samudrala et al., 1999, "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198]에 기술된 바와 같은 순이론적 방법(ab initio method)의 조합을 사용하여 1차 서열로부터 항체의 3차 구조를 모델링한다. 접촉 정의는 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 예를 들어, 문헌[MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45]를 참고할 수 있다. 본 명세서에서 CDR의 "입체구조적 정의"로 언급되는 또 다른 접근방식에서, CDR의 위치는 항원 결합에 대한 엔탈피 기여(enthalpic contribution)를 만드는 잔기로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166]을 참고할 수 있다. 또 다른 CDR 경계 정의는 위의 접근방식 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고 카밧 CDR의 적어도 일부와 중복될 것이며, 특정 잔기 또는 잔기 군이 항원 결합에 유의적인 영향을 주지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 단축되거나 연장될 수 있다. 본 명세서에 사용된 CDR은 접근방식들의 조합을 포함하는 이 분야에 알려진 임의의 접근방식으로 정의되는 CDR을 의미할 수 있다. 본 명세서에 사용된 방법은 이들 접근방식 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다. 하나 초과의 CDR을 함유하는 임의의 주어진 실시형태의 경우, CDR은 카밧, 코티아, 확장, IMGT, 파라톰, AbM 및/또는 입체구조적 정의 중 임의의 것 또는 전술한 것들 중 임의의 조합에 따라 정의될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체(CAR)"는 종양-관련 항원과 같은 특정 항원에 대해 면역 세포에 인공적인 특이성을 부여하는 조작된 생물학적 수용체를 의미한다. CAR이 사용될 수 있는 예시적인 면역 세포는 T 세포이지만, CAR이 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 수지상 세포 또는 대식세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 순응성 세포독성 면역 세포에 조작될 수 있음이 고려된다. 본 양상에서, CAR T 세포에 관계된 임의의 개시내용은 CAR을 포함하는 다른 면역 세포에도 적용될 수 있다. 이들의 핵심에서, CAR은 세포외 항원-인식 도메인(예를 들어, 종양 수용체 리간드 또는 항체), 힌지, 막관통 및 세포내 신호전달 도메인(엔도도메인: endodomain)을 포함한다. 이들 CAR 구성요소들의 서로 다른 조합은 특정 암 항원에 대해 서로 다른 특이성 및 효능을 초래할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료"(및 이 분야에서 잘 이해되는 것)는 임상적 결과를 포함하여 대상의 상태에서 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근방식을 의미한다. 유익하거나 원하는 임상적 결과는, 부분적이든 전체적이든 그리고 검출가능하든 검출불가능하든, 하나 이상의 증상 또는 상태의 경감 또는 개선, 질환 정도의 감소, 질환 상태를 안정화하는 것(즉, 악화시키지 않는 것), 질환의 전염 또는 확산의 예방, 질환 경과의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 완화, 질환 재발의 감소 및 차도를 포함할 수 있지만 이로 제한되지는 않는다. 본 명세서에 사용된 "치료하는" 또는 "치료"는 또한 예방적 치료를 포함한다. 치료 방법은 치료적 유효량의 활성제를 대상에 투여하는 단계를 포함한다. 투여하는 단계는 단일 투여로 이루어질 수 있거나 일련의 투여를 포함할 수 있다. 조성물을 대상을 치료하기에 충분한 양으로 및 기간 동안 대상에 투여한다. 치료 기간의 길이는 상태의 중증도, 대상의 연령 및 유전적 프로필, 활성제의 농도, 치료에 사용되는 조성물의 활성 또는 이들의 조합과 같은 다양한 요인에 달려있다. 치료 또는 예방을 위해 사용되는 약제의 유효 투여량은 특정 치료 또는 예방 요법의 과정에 걸쳐 증가 또는 감소할 수 있음이 이해될 것이다. 투여량의 변화는 이 분야에 알려진 표준 진단 분석법을 통해 이루어질 수 있고 명확해질 수 있다. 일부의 경우, 만성적 투여가 필요할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "유효량" 또는 "유효 투여량"은 관찰가능한 지정된 효과를 초래하는 언급된 조성물 또는 화합물의 양을 의미한다. 현재 개시된 주제의 활성 조성물 중 활성 성분의 실제 투여 수준은 특정 대상 및/또는 적용에 대한 지정된 반응을 달성하는데 효과적인 양의 활성 조성물 또는 화합물을 투여하기 위해 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 조성물의 활성, 제형, 투여 경로, 다른 약물 또는 치료와의 조합, 치료되는 상태의 중증도 및 치료되는 대상의 신체 상태 및 이전 병력을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 요인들을 기반으로 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 최소 용량을 투여하고, 용량-제한 독성이 없으면 최소 유효량까지 투여량을 점차 증가시킨다. 유효 투여량의 결정 및 조정, 뿐만 아니라 이러한 조정을 언제 그리고 어떻게 하는지에 대한 평가가 여기에서 고려된다.
용어 "투여"는 대상에 대한 경구 투여, 국소 접촉, 좌약으로서의 투여, 비경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 병변내, 척수강내, 비강내, 진피하 또는 피하 투여 또는 서방형 장치, 예를 들어 미니-삼투압 펌프의 이식을 포함한다. 투여는 비경구 및 점막경유(예를 들어, 협, 설하, 구개, 잇몸, 코, 질, 직장 또는 경피)를 포함하는 임의의 경로를 통해 이루어진다. 비경구 투여는 예를 들어 정맥내, 근육내, 세동맥내, 피내, 피하, 복강내, 심실내(뇌실내) 및 두개내를 포함한다. 다른 전달 방식은 리포솜 제형의 사용, 정맥내 주입, 경피 패치 등을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. "공동-투여"는 본 명세서에 기술된 제1화합물을 본 명세서에 기술된 제2의 화합물의 투여와 동시에, 직전에 또는 직후에 투여함을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료 표적"은 활성 조절(예를 들어, 발현, 생물학적 활성 등의 조절에 의함) 시 질환 표현형의 조절을 제공할 수 있는 유전자 또는 유전자 산물을 의미한다. 전체적으로 사용된 "조절"은 지시된 현상의 증가 또는 감소를 의미한다(예를 들어, 생물학적 활성의 조절은 생물학적 활성의 증가 또는 생물학적 활성의 감소를 의미함).
본 명세서에 사용된 용어 "치료 표준", "모범 사례" 및 "표준 요법"은 특정 질환을 위해 적절하게, 알맞게, 효과적으로 및/또는 폭넓게 사용되는 치료가 된다고 의사에 의해 인정되는 치료를 의미한다. 특정 질환의 치료 표준은 치료의 생물학적 효과, 신체 내 영역 또는 위치, 환자의 상태(예를 들어, 연령, 체중, 성별, 유전적 위험, 기타 장애, 이차적 상태), 독성, 대사, 생물축적, 치료 지수, 투여량 및 이 분야에 알려진 기타 요인들을 포함하는 많은 서로 다른 인자들에 달려있다. 또한 질환에 대한 치료 표준을 결정하는 것은 미국 식품 의약품, 국제 의약품 규제 조화 위원회, 캐나다 보건부, 유럽 의약품청, 호주 식품 의약품청, 인도 의약 표준 관리기구, 중국 국가 약품 감독 관리국, 일본 후생성, 식품 의약품 안전처 및 세계 보건 기구와 같은 규제 기관에 의해 표준화된 임상 시험에서 안전성 및 효능을 확립하는 것에 달려있다. 질환에 대한 치료 표준은 수술, 방사선, 화학요법, 표적 요법 또는 면역 요법을 포함할 수 있지만 이로 제한되지는 않는다.
용어 "% w/w" 또는 "% wt/wt"는 조성물의 총 중량에 대한 성분 또는 약제의 중량에 100을 곱한 것으로 표현되는 백분율을 의미한다.
항원 결합 폴리펩타이드
달리 명시되지 않은 한, 본 명세서에 개시된 상보성 결정 영역(CDR)은 IMGT 정의를 따른다. 그러나, CDR은 개별적으로 또는 가변 도메인의 맥락에서 카밧, 코티아 또는 이 분야의 기술자에 의해 이해되는 다른 정의에 의해 해석될 수도 있다.
종양태아성 항원 6(종양태아성 항원-관련 세포접착분자 6; CEA6; CEACAM6) 결합 폴리펩타이드가 본 명세서에 개시된다. 일부 실시형태에서, CEA6 결합 폴리펩타이드는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H1은 서열번호 1 내지 43에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H2는 서열번호 44 내지 86에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열번호 87 내지 129에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H1은 서열번호 1 내지 43에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 44 내지 86에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 87 내지 129에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
CEA6 결합 폴리펩타이드의 일부 실시형태에서: 1) CDR-H1은 서열번호 1의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 44의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 87의 서열을 포함하거나; 2) CDR-H1은 서열번호 2의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 45의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 88의 서열을 포함하거나; 3) CDR-H1은 서열번호 3의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 46의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 89의 서열을 포함하거나; 4) CDR-H1은 서열번호 4의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 47의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 90의 서열을 포함하거나; 5) CDR-H1은 서열번호 5의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 48의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 91의 서열을 포함하거나; 6) CDR-H1은 서열번호 6의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 49의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 92의 서열을 포함하거나; 7) CDR-H1은 서열번호 7의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 50의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 93의 서열을 포함하거나; 8) CDR-H1은 서열번호 8의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 51의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 94의 서열을 포함하거나; 9) CDR-H1은 서열번호 9의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 52의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 95의 서열을 포함하거나; 10) CDR-H1은 서열번호 10의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 53의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 96의 서열을 포함하거나; 11) CDR-H1은 서열번호 11의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 54의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 97의 서열을 포함하거나; 12) CDR-H1은 서열번호 12의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 55의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 98의 서열을 포함하거나; 13) CDR-H1은 서열번호 13의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 56의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 99의 서열을 포함하거나; 14) CDR-H1은 서열번호 14의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 57의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 100의 서열을 포함하거나; 15) CDR-H1은 서열번호 15의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 58의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 101의 서열을 포함하거나; 16) CDR-H1은 서열번호 16의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 59의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 102의 서열을 포함하거나; 17) CDR-H1은 서열번호 17의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 60의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 103의 서열을 포함하거나; 18) CDR-H1은 서열번호 18의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 61의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 104의 서열을 포함하거나; 19) CDR-H1은 서열번호 19의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 62의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 105의 서열을 포함하거나; 20) CDR-H1은 서열번호 20의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 63의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 106의 서열을 포함하거나; 21) CDR-H1은 서열번호 21의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 64의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 107의 서열을 포함하거나; 22) CDR-H1은 서열번호 22의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 65의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 108의 서열을 포함하거나; 23) CDR-H1은 서열번호 23의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 66의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 109의 서열을 포함하거나; 24) CDR-H1은 서열번호 24의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 67의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 110의 서열을 포함하거나; 25) CDR-H1은 서열번호 25의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 68의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 111의 서열을 포함하거나; 26) CDR-H1은 서열번호 26의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 69의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 112의 서열을 포함하거나; 27) CDR-H1은 서열번호 27의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 70의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 113의 서열을 포함하거나; 28) CDR-H1은 서열번호 28의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 71의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 114의 서열을 포함하거나; 29) CDR-H1은 서열번호 29의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 72의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 115의 서열을 포함하거나; 30) CDR-H1은 서열번호 30의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 73의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 116의 서열을 포함하거나; 31) CDR-H1은 서열번호 31의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 74의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 117의 서열을 포함하거나; 32) CDR-H1은 서열번호 32의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 75의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 118의 서열을 포함하거나; 33) CDR-H1은 서열번호 33의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 76의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 119의 서열을 포함하거나; 34) CDR-H1은 서열번호 34의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 77의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 120의 서열을 포함하거나; 35) CDR-H1은 서열번호 35의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 78의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 121의 서열을 포함하거나; 36) CDR-H1은 서열번호 36의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 79의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 122의 서열을 포함하거나; 37) CDR-H1은 서열번호 37의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 80의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 123의 서열을 포함하거나; 38) CDR-H1은 서열번호 38의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 81의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 124의 서열을 포함하거나; 39) CDR-H1은 서열번호 39의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 82의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 125의 서열을 포함하거나; 40) CDR-H1은 서열번호 40의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 83의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 126의 서열을 포함하거나; 41) CDR-H1은 서열번호 41의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 84의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 127의 서열을 포함하거나; 42) CDR-H1은 서열번호 42의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 85의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 128의 서열을 포함하거나; 43) CDR-H1은 서열번호 43의 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호 86의 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호 129의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CEA6 결합 폴리펩타이드는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 이들 CDR 중 하나 이상이 공통 서열에 의해 정의된다. 본 명세서에 제공된 공통 서열은 도 1에 도시된 CDR의 정렬에서 유래되었다. 그러나, 대안적인 정렬이 행해질 수 있고(예를 들어, 전체적 또는 부분적 정렬을 사용하거나 다른 알고리즘, 예를 들어, 은닉 마르코프 모델(Hidden Markov Models), 시디드 가이드 트리(seeded guide trees), 니들만-브니쉬 알고리즘(Needleman-Wunsch algorithm) 또는 스미스-워터맨 알고리즘(Smith-Waterman algorithm)을 사용하거나 다른 알려진 방법을 사용함) 따라서 대안적인 공통 서열(본 명세서에 제공된 서열의 부분 집합으로 수행된 것을 포함)이 파생될 수 있음이 고려된다.
일부 실시형태에서, CDR-H1은 화학식 X1X2X3X4X5X6X7X8로 정의되며, 여기서 X1은 G이고; X2는 F, R, S 또는 Y이고; X3은 I 또는 T이고; X4는 F, G, L, S 또는 Y이고; X5는 D, G, N 또는 S이고; X6은 D, F, I, L, N, S, T 또는 Y이고; X7은 D, N 또는 Y이고; X8은 D, F, H, L, P, T, V 또는 Y이다. 일부 실시형태에서, CDR-H1은 이 공통 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H1은 이 공통 서열에서 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 치환을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CDR-H2는 화학식 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10으로 정의되며, 여기서 X1은 아미노산이 없거나, S 또는 T이고; X2는 I이고; X3은 N, S 또는 T이고; X4는 R, S, T 또는 W이고; X5는 D, F, I, L, S, T 또는 Y이고; X6은 A, D, G 또는 S이고; X7은 A, D, G 또는 S이고; X8은 I 또는 S이고; X9는 T이고; X10은 아미노산이 없거나 Y이다. 일부 실시형태에서, CDR-H2는 이 공통 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H2는 이 공통 서열에서 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 치환을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CDR-H3은 화학식 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33으로 정의되며, 여기서 X1은 아미노산이 없거나 A이고; X2는 아미노산이 없거나 A 또는 V이고; X3은 아미노산이 없거나, A, G, M, Q, S, T 또는 V이고; X4는 아미노산이 없거나, A, D, E, G, I, M, N, R, S, V 또는 Y이고; X5는 아미노산이 없거나, A, E, K, M, R, S, T, V 또는 W이고; X6은 아미노산이 없거나, A, E, M, P, S 또는 V이고; X7은 아미노산이 없거나, A, F, I, M, P, W 또는 Y이고; X8은 아미노산이 없거나, D, I, K, L, S, T 또는 V이고; X9는 아미노산이 없거나, A, K, Q, T 또는 V이고; X10은 아미노산이 없거나, A, D, E 또는 S이고; X11은 아미노산이 없거나, A, I, L, R, V 또는 Y이고; X12는 아미노산이 없거나, A, E, G, L, P, S 또는 T이고; X13은 아미노산이 없거나, D, G, I, L, N, P, Q, S, T 또는 V이고; X14는 아미노산이 없거나, A, E, F, H, K, L, M, P, Q, R, T, V 또는 Y이고; X15는 아미노산이 없거나, A, D, H, I, L, M, P, Q, R, S, T 또는 V이고; X16은 아미노산이 없거나, A, D, E, H, L, S, T, V, W 또는 Y이고; X17은 아미노산이 없거나, E, F, G, H, L, M, N, Q, S, T 또는 Y이고; X18은 아미노산이 없거나, A, D, G, H, K, M, N, Q, R, S, V 또는 Y이고; X19는 아미노산이 없거나, F, H, Q 또는 Y이고; X20은 아미노산이 없거나, D, N, Q, S 또는 Y이고; X21은 아미노산이 없거나, A, G 또는 Y이고; X22는 아미노산이 없거나, W 또는 Y이고; X23은 아미노산이 없거나, A 또는 R이고; X24는 아미노산이 없거나, H 또는 S이고; X25는 아미노산이 없거나, D 또는 G이고; X26은 아미노산이 없거나, E 또는 K이고; X27은 아미노산이 없거나, I 또는 T이고; X28은 아미노산이 없거나, F 또는 R이고; X29는 아미노산이 없거나 Y이고; X30은 아미노산이 없거나 Y이고; X31은 아미노산이 없거나 Y이고; X32는 아미노산이 없거나, N 또는 S이고; X33은 아미노산이 없거나 Y이다.
일부 실시형태에서, CDR-H3은 이 공통 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 이 공통 서열에서 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 치환을 갖는 서열을 포함한다.
CEA6 결합 폴리펩타이드의 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 130 내지 172에서 선택된 임의의 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CEA6 결합 폴리펩타이드는 인간화된 것이다. 일부 실시형태에서, CEA6 결합 폴리펩타이드는 단일 도메인 항체(sdAb)이다.
일부 실시형태에서, CEA6 결합 폴리펩타이드는 1nM, 2nM, 5nM, 10nM, 15nM, 20nM, 30nM, 40nM, 50nM, 60nM, 70nM, 80nM, 90nM, 100nM, 200nM, 300nM, 400nM, 500nM, 600nM, 700nM, 800nM, 900nM 또는 1000nM 미만의 해리 상수(KD) 또는 전술한 KD 중 임의의 두 개에 의해 정의되는 범위 내의 임의의 KD로 CEA6에 결합한다.
본 명세서에 개시된 결합 폴리펩타이드는 항체 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 라이브러리는 면역 항체 라이브러리, 나이브() 항체 라이브러리, 합성 항체 라이브러리 또는 반-합성 항체 라이브러리이다. 일부 실시형태에서, 항체 라이브러리는 인간에서 유래된 항체 또는 인간에서 면역원성이 아닌 항체를 포함하거나 이들 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 라이브러리는 예를 들어 생쥐, 쥐, 기니피그, 토끼, 고양이, 개, 소, 말, 양, 염소, 말, 당나귀로부터 인간화된 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 라이브러리는 단일 도메인 항체(sdAb), 나노바디, VHH 단편, VNAR 단편, 단일-사슬 가변 단편(scFv), 낙타과 항체 또는 연골어류 항체 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 사용될 수 있는 하나의 예시적인 라이브러리는 완전 인간화, 합성, sdAb 라이브러리이지만, 제작될 수 있거나 이용가능한 임의의 다른 항체 라이브러리를 본 명세서에 개시된 방법을 위해 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 라이브러리는 sdAb를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 라이브러리는 적어도 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 500000 또는 1000000개의 고유 항체 또는 전술한 항체 수 중 임의의 두 개에 의해 정의되는 범위 내의 임의의 수의 항체를 포함한다.
항체 라이브러리는 전산적으로 또는 기계 학습 과정을 사용하여 생성될 수 있다. 항체 라이브러리를 전산적으로 생성하는 예시적인 방법에는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)에서 합성적 다양성을 갖도록 범용 VHH 프레임워크를 변형하는 것이 포함된다. CDR의 다양성은 축퇴 코돈(degenerate codon)으로 항체를 암호화하는 서열의 라이브러리를 무작위화함으로써 도입된다. 예를 들어, NNK 코돈 라이브러리를 사용할 수 있으며, 여기서 NNK 코돈은 N(A/T/C/G의 25% 혼합) 및 K(T/G의 50% 혼합)를 포함한다. 일부 실시형태에서, NNK 코돈 라이브러리는 모든 가능한 아미노산으로 또는 일부 아미노산(예를 들어, 시스테인) 및 정지 코돈 조합이 제외된 상태로 구축된다. 기타 축퇴 코돈 혼합이 최소한의 실험으로 상기 NNK 코돈 라이브러리를 대체할 수 있다. 다른 실시형태에서, 항체 라이브러리는 삼량체 코돈 혼합을 사용하여 생성할 수 있으며, 이는 정지 코돈의 기회를 줄이면서 센스 코돈의 균형잡힌 표현을 개선하고, 항체 생성 및 시험의 효율을 개선한다. 일부 실시형태에서, 이용가능한 결합 모델 또는 구조 데이터를 사용하여 항체의 특이적 결합 포켓을 무작위화하기 위해 인공 지능-기반 예측을 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 라이브러리를 선별(panning)하는 것에는 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 세균 디스플레이, 리보솜 디스플레이 또는 mRNA 디스플레이 또는 이들의 임의의 조합에 의한 후보 결합 폴리펩타이드의 스크리닝이 포함된다. 일부 실시형태에서, 항체 라이브러리 선별은 1회 이상의 선별을 포함하며, 여기서 후보 결합 폴리펩타이드는 암-관련 항원(예를 들어, CEA6) 또는 암-관련 항원을 표시하는 세포 또는 조직에 대한 특이성을 위해 선별된다. 일부 실시형태에서, 후보 결합 폴리펩타이드는 종양 미세환경-유사 조건, 면역억제 조건, 낮거나 높은 pH, 낮거나 높은 산소 농도, 낮거나 높은 온도, 낮거나 높은 점도 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이로 제한되지 않는 조건 하에서, 또는 하나 이상의 암-관련 항원의 변형된 형태 또는 유도체 형태에 대한 특이성을 위해 선별된다. 일부 실시형태에서, 면역억제 조건에는 종양-관련 대식세포(TAM), 골수-유래 억제 세포(MDSC), 종양-관련 호중구(TAN), 암-관련 섬유아세포(CAF) 또는 기타 면역억제 세포의 존재 또는 아데노신의 존재 또는 이 둘 모두가 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 세포는 세포주(예를 들어, Jurkat)로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 세포는 대상으로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 대상은 암을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상은 암을 앓고 있고, 이 암은 본 명세서에 개시된 암-관련 항원(예를 들어, CEA6) 중 임의의 하나 이상을 발현한다. 일부 실시형태에서, 암은 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 뇌암, 췌장암, 방광암, 고환암, 전립선암, 위암, 난소암, 두경부암, 담낭암, 혈액암 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 혈액암은 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 털세포 백혈병, 림프종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종 또는 다발성 골수종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상은 포유동물, 예를 들어 인간, 고양이, 개, 생쥐, 쥐, 햄스터, 설치류, 소, 돼지, 말, 염소, 양, 당나귀 또는 원숭이이다. 일부 실시형태에서, 대상은 인간이다.
키메라 항원 수용체(CAR) 및 세포
본 명세서에 개시된 CEA6 결합 폴리펩타이드 중 임의의 하나 이상을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 또한 본 명세서에 개시된다.
일부 실시형태에서, CAR은 적어도 2개의 결합 폴리펩타이드를 포함하고 CAR은 다가(multivalent) CAR이다. 일부 실시형태에서, CAR은 2개의 결합 폴리펩타이드를 포함하고 CAR은 이가(bivalent) CAR이다. 일부 실시형태에서, CAR은 3개의 결합 폴리펩타이드를 포함하고 CAR은 삼가(trivalent) CAR이다.
일부 실시형태에서, CAR은 하나 이상의 신호 펩타이드, 다양한 길이 및 조성을 갖는 링커, 힌지, 막관통 도메인, 공동자극 도메인, 신호전달 도메인, 세포질 도메인, 기능성 신호, 증식 신호, 항-고갈 신호, 항-억제 수용체, 종양/암 귀소 단백질 또는 조절 분자 또는 이들의 임의의 조합을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 힌지에는 CD3ζ, CD4, CD8 또는 CD28 힌지 또는 다양한 길이를 갖는 전산적으로 설계된 합성 힌지가 포함된다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인에는 CD3ζ, CD4, CD8 또는 CD28 막관통 도메인 또는 전산적으로 설계된 합성 막관통 도메인이 포함된다. 일부 실시형태에서, 공동자극 도메인에는 CD8, CD28, ICOS, 4-1BB, OX40(CD134), CD27, CD40, CD40L, TLR 또는 기타 TNFR 수퍼패밀리 구성원 또는 Ig 수퍼패밀리 구성원 공동자극 도메인 또는 IL-2Rβ, IL-15R-α, MyD88 또는 CD40의 세포질 도메인 또는 임의의 다른 Toll-유사 수용체 또는 IL-1 수용체 신호전달 경로 구성원을 통한 기타 신호전달이 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CAR은 본 명세서에 개시된 결합 폴리펩타이드들 중 임의의 하나를 암호화하는 핵산 및 서로 다른 CAR 모듈을 암호화하는 적합한 핵산들의 혼합으로부터 CAR 발현 작제물을 조립함으로써 구축된다. 일부 실시형태에서, 서로 다른 CAR의 조합은 CAR 효능 스크리닝(시험관 내 또는 생체 내)을 위한 CAR 라이브러리에서 사용하기 위해 생산된다. 일부 실시형태에서, 고유 CAR은 별도로 생산된다. 일부 실시형태에서, CAR은 하나의 표적에 대해 특이적이다. 일부 실시형태에서, CAR은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 표적에 대해 특이적이다. 일부 실시형태에서, CAR은 이중-특이적 또는 삼중-특이적이다.
본 명세서에 개시된 CAR 중 임의의 하나를 구축하기 위해, 항체 라이브러리의 선별에 의해 식별된 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 다른 CAR 모듈이 있는 CAR 발현 작제물로 조립한다. 일부 실시형태에서, CAR 발현 작제물은 이 분야에 알려진 다중-단편 조립 반응을 사용하여 조립한다. CAR 발현 작제물을 조립하는 하나의 예시적인 방법은 IIS 유형 제한 효소를 사용하여 적합한 돌출 서열을 갖는 핵산 단편을 생성하는 단계 및 리가제로 핵산 단편을 결찰하는 단계를 포함한다. IIS 유형 제한 효소는 이들의 인식 부위 바깥부분을 자르기 때문에, 여러 적합한 핵산 단편이 동시에 제작될 수 있다. 다른 실시형태에서, CAR 발현 작제물은 중복 연장 PCR에 의해 조립될 수 있다. 하나 초과의 핵산 단편으로부터 핵산 작제물을 조립하는 임의의 다른 방법을 사용할 수 있음이 고려된다. 일부 실시형태에서, 서로 다른 CAR 모듈은 신호 펩타이드, 링커, 힌지, 막관통 도메인, 공동자극 도메인, 활성화 도메인, 신호전달 도메인, 세포질 도메인, 기능성 신호, 증식 신호, 항-고갈 신호, 항-억제 신호, 암 귀소 단백질 또는 조절 분자 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 예시적인 힌지에는 CD8 힌지, CD28 힌지, IgG1 힌지 또는 IgG4 힌지가 포함된다. 일부 예시적인 막관통 도메인에는 CD3ζ 막관통 도메인, CD8α 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인 또는 ICOS 막관통 도메인이 포함된다. 일부 예시적인 공동자극 도메인에는 CD8 공동자극 도메인, CD28 공동자극 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인, OX40(CD134) 공동자극 도메인, ICOS 공동자극 도메인, CD27 공동자극 도메인, CD40 공동자극 도메인, CD40L 공동자극 도메인, TLR 공동자극 도메인, MYD88-CD40 공동자극 도메인 또는 KIR2DS2 공동자극 도메인이 포함된다. 일부 실시형태에서, 서로 다른 CAR 모듈은 CD8, CD28, 4-1BB, CD3ζ 또는 이들의 임의의 조합에서 유래된다. CAR은 사이토카인, 케모카인, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 항원 수용체 또는 리간드, 항체 또는 효소를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 부가로 변형될 수도 있다.
본 명세서에 개시된 CAR 중 임의의 하나를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 세포 또한 본 명세서에 개시된다. 일부 실시형태에서, CAR 세포는 CAR-T 세포이다. 일부 실시형태에서, CAR 세포는 대상으로부터 유래하거나 세포주로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 대상은 암을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상은 암을 앓고 있고, 이 암은 본 명세서에 개시된 암-관련 항원(예를 들어, CEA6) 중 임의의 하나 이상을 발현한다. 일부 실시형태에서, 암은 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 뇌암, 췌장암, 방광암, 고환암, 전립선암, 위암, 난소암, 두경부암, 담낭암, 혈액암 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 혈액암은 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 털세포 백혈병, 림프종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종 또는 다발성 골수종을 포함할 수 있다.
핵산
폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또한 본 명세서에 개시된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 결합 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 단일 도메인 결합 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 개시된 결합 폴리펩타이드들 중 임의의 하나이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 개시된 CEA6 결합 폴리펩타이드들 중 임의의 하나 이상에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 본 명세서에 개시된 CAR 중 임의의 하나이다.
결합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산들 중 임의의 하나는 재조합 DNA 기술, 합성 화학 기술 또는 이들의 조합을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, 결합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 서열은 이 분야에 알려진 표준 분자 기술을 사용하여 발현 벡터에 클론화될 수 있다. 서열은 원하는 단백질 서열을 암호화하는 다른 벡터로부터, 각각의 주형 핵산을 사용한 PCR-생성 단편으로부터, 또는 원하는 서열을 암호화하는 합성 올리고뉴클레오타이드의 조립을 통해 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 CAR을 발현하도록 면역 세포에 제공되는 CAR 발현 벡터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 펩타이드 생산물을 추가 사용을 위해 분리할 수 있는 대규모 항체 또는 결합 폴리펩타이드 생산에 적합한 발현 벡터일 수 있다.
결합 폴리펩타이드 또는 CAR의 발현은 이 분야에 알려진 핵산 또는 단백질 분석법으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 결합 폴리펩타이드 또는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 임의의 영역에 상보적인 탐침을 사용한, 통상적인 혼성화 분석법(예를 들어, 노던 블롯 분석), 증폭 절차(예를 들어, RT-PCR), SAGE(미국특허 제5,695,937호) 및 어레이 기반 기술(예를 들어, 미국특허 제5,405,783호, 제5,412,087호 및 제5,445,934호 참조)로 결합 폴리펩타이드 또는 CAR의 전사된 mRNA의 존재를 검출 및/또는 정량화할 수 있다. 결합 폴리펩타이드 또는 CAR의 발현은 발현된 펩타이드를 시험하는 것을 통해서도 결정될 수 있다. 단백질 분석을 위해 다양한 기술들이 이 분야에서 이용가능하다. 여기에는 방사면역분석법, ELISA(enzyme linked immunoradiometric assays: 효소 결합 면역방사측정법), "샌드위치" 면역분석법, 면역방사측정법, 인시츄 면역분석법(예를 들어, 콜로이드성 골드, 효소 또는 방사성동위원소 표지를 사용함), 웨스턴 블롯 분석법, 면역침전 분석법, 면역형광 분석법 및 SDS-PAGE가 포함되지만 이로 제한되지는 않는다.
사용 또는 치료 방법
치료를 필요로 하는 대상의 암을 치료하는 방법 또한 본 명세서에 개시된다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상에게 키메라 항원 수용체 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 개시된 키메라 항원 수용체 세포들 중 임의의 하나를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 세포는 본 명세서에 개시된 CEA6 결합 폴리펩타이드들 중 임의의 하나 이상을 발현하고/발현하거나 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 세포는 CAR-T 세포이다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 세포는 대상으로부터 유래하고 대상에 대해 자가조직적이다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 세포는 대상에 대해 동종이계적이다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 세포는 세포주(예를 들어, Jurkat)로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 대상은 포유동물, 예를 들어 인간, 고양이, 개, 생쥐, 쥐, 햄스터, 설치류, 소, 돼지, 말, 염소, 양, 당나귀 또는 원숭이이다. 일부 실시형태에서, 대상은 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상은 암을 앓고 있고, 이 암은 본 명세서에 개시된 암-관련 항원(예를 들어, CEA6) 중 임의의 하나 이상을 발현한다. 일부 실시형태에서, 암은 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 뇌암, 췌장암, 방광암, 고환암, 전립선암, 위암, 난소암, 두경부암, 담낭암, 혈액암 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 혈액암은 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 털세포 백혈병, 림프종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종 또는 다발성 골수종을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 세포는 비경구적으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 세포는 하루에 1회, 하루에 2회, 하루에 3회 또는 그 이상 투여된다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 세포는 일단위로, 매일, 격일, 1주에 5일, 1주에 1회, 격주, 1달에 2주, 1달에 3주, 1달에 1회, 1달에 2회, 1달에 3회 또는 그 이상 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 적어도 1달, 2달, 3달, 4달, 5달, 6달, 7달, 8달, 9달, 10달, 11달, 12달, 18달, 2년, 3년 또는 그 이상 동안 투여된다.
일부 실시형태에서, 그러한 양에 상응하는 주어진 약제의 양은 특정 화합물, 질환의 중증도, 치료를 필요로 하는 대상 또는 숙주의 정체(예를 들어, 체중)와 같은 요인들에 따라 다르지만, 그럼에도 불구하고 예를 들어 투여되는 특정 약제, 투여 경로 및 치료받는 대상 또는 숙주를 포함하는 경우를 둘러싼 특정 상황에 따라 이 분야에 알려진 방식을 통해 통상적으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 원하는 용량은 단일 용량으로 또는 동시에(또는 짧은 기간에 걸쳐) 또는 적절한 간격으로 투여되는 분할 용량으로, 예를 들어 하루에 2, 3, 4 또는 그 이상의 하위-용량으로, 편의적으로 제공된다.
개별 치료 요법에 관한 변수가 많고, 이러한 권장된 값으로부터 상당한 일탈이 드물지 않기 때문에, 투여를 위한 범위는 암시적일 뿐이다. 이러한 투여량은 사용된 화합물의 활성, 치료하는 질환 또는 상태, 투여 방식, 개별 대상의 요구사항, 치료하는 질환 또는 상태의 중증도 및 의사의 판단으로 제한되지 않는 여러 변수에 따라 변경된다.
일부 실시형태에서, 이러한 치료 요법의 독성 및 치료 효능은 LD50(개체군의 50%가 사망하는 양) 및 ED50(개체군의 50%에서 치료적으로 효과적인 양)의 결정을 포함하지만 이로 제한되지 않는 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약학적 절차에 따라 결정된다. 독성과 치료 효과 사이의 투여량 비율은 치료 지수이며 LD50과 ED50 사이의 비율로 표시된다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 세포 배양 분석 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량의 범위를 공식화하는데 사용된다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 최소이고 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 다양하다.
실시예
위에서 논의된 실시형태들의 일부 양상이 다음의 실시예에서 더 상세하게 개시되며, 이는 어떤 경우든 본 개시내용의 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 이 분야의 기술자들은, 본 명세서 및 청구범위에 기술된 바와 같이, 많은 다른 실시형태들 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다는 것을 이해할 것이다.
실시예 1. 방법론
플라스미드 준비 및 품질 확인(QC)
CAR 플라스미드 준비를 위해 Maxi Plasmid Purification 키트(Zymo, D4203)를 사용하였다. 플라스미드 농도 및 품질은 Nanodrop(260/280 비율 및 260/230 비율) 및 ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay(Genescript, L00350)로 분석하였다. 좋은 품질의 플라스미드 DNA는 1.8 내지 2.0의 A260/A280 비율 및 2.0 초과의 A260/A230 비율 및 0.1EU/㎍ 미만의 엔도톡신을 가질 것이다.
플라스미드 조립 및 QC
Genewiz를 통해 모든 CAR을 합성하였다. CEA6에 결합하는 항체를 암호화하는 합성 단일 도메인 항체 유전자를 pLenti 벡터에 클로닝하고 생어(Sanger) 염기서열 분석을 사용하여 작제물을 확인하였다. CAR 작제물은 신호 펩타이드(예를 들어, CD8 신호 펩타이드), 힌지(예를 들어, CD8α 줄기), 막관통 도메인(예를 들어, CD8 막관통 도메인 또는 CD28 막관통 도메인) 및 신호전달 도메인(예를 들어, 4-1BB 공동자극 도메인 또는 CD3ζ 신호전달 도메인) 및 항-CEA6 sdAb를 함유한다.
CAR 발현 수준을 모니터하기 위해, CAR 플라스미드의 발현 카세트를 형광 eGFP+T2A 자가-절단 펩타이드 서열을 발현하도록 조작할 수도 있다. 대안적으로, 절단된 CD19 또는 절단된 EGFR 카세트를 항체 검출을 통한 모니터를 위해 사용할 수 있다. 인간 서열들(예를 들어, CD8, 4-1BB, CD3ζ)은 GenBank에서 이용할 수 있다.
바이러스 생산 및 적정
항-CEA6 CAR 작제물을 갖는 렌티바이러스를 생산하기 위해, 인간 배아 신장 293T(HEK293T) 세포를 CAR 전이유전자-암호화 pLenti 전이 플라스미드 및 하나 이상의 필요한 패키징 플라스미드(즉, Gag, Pol, Rev, VSVG 및 선택적으로 Tat를 암호화함)로 공동-형질주입하였다. 형질주입 48시간 또는 72시간 후에 HEK293T 배양물의 상등액을 수집하고, 원심분리하고, 0.45㎛ 필터로 여과하였다.
바이러스 적정은 희석된 렌티바이러스 수집물로 형질도입된 Jurkat 세포에서 수행하였다. 48시간 후, 형질도입된 Jurkat 세포를 비오틴화 재조합 단백질 L 및 피코에리트린(PE)-접합 스트렙타비딘으로 염색하고, 유세포 분석으로 항-CEA6 CAR 풍부도를 측정하였다.
T 세포 형질도입 및 확장
Lymphoprep 시약(StemCell Technologies)을 사용한 밀도 구배 원심분리를 사용하여 건강한 인간 공여자의 말초 혈액으로부터 인간 PBMC를 분리하였다. PBMC를 10ng/㎖ IL-2(Novoprotein, GMP-CD66) 및 10ng/㎖ IL-7(Novoprotein, GMP-CD47) 함유 X-VIVO 15 무혈청 조혈 배지(Lonza, 04-418QCN)에 1×106 세포/㎖로 재현탁하였다. PBMC를 24시간 동안 50ng/㎖ 항-CD3 항체(Novoprotein, GMP-A018)로 자극하였다. 이후, PBMC를 항-CEA6 CAR 렌티바이러스(1 내지 10 MOI)로 형질도입하고 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 기본 배지에서 9 내지 10일 동안 적절한 플라스크에서 확장시켰다. T 세포는 임의의 분석 전 37℃에서 24시간 동안 휴지시켰다. 항-CD3 항체를 사용한 PBMC의 초기 자극 12일 또는 14일 후 CAR 표면 수준, CD3 및 CD4/CD8 비율(Biolegend의 항체 사용, 317344, 301012 및 317412)을 측정하였다.
T 세포 동결보존 및 해동
CAR-T 확장 14일 후, 항-CEA6 CAR-T 세포를 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 세포 펠릿을 5×107 세포/㎖의 생존 세포 밀도로 냉각한 CryoStor CS10(StemCell Technologies, 07930)에 재현탁하였다. 세포 현탁액 분취물을 극저온 바이알에 나누어 담았다. 극저온 바이알을 1℃/분 감소로 냉각하였다. 동결된 세포를 액체 질소로 옮겼다.
해동을 위해, 세포를 부드럽게 교반하면서 37℃ 수조에서 빠르게 해동한다. 해동된 세포를 50㎖ 코니칼 튜브로 옮기고 20㎖의 새로운 성장 배지를 한 방울씩 첨가하여 세척하였다. 세포를 원심분리하고 1×106 세포/㎖의 세포 밀도로 X-VIVO 15 배지에 재현탁하였다.
세포독성 분석
항-CEA6 CAR T-세포의 세포독성은 표준 루시퍼라제-기반 분석법으로 결정하였다. 간략하게, 반딧불 루시퍼라제를 발현하는 표적 세포를 X-VIVO 15 배지에서 웰당 총 100㎕의 부피에 2×104 표적 세포로 백색벽 96-웰 플레이트를 사용하여 표시된 효과기:표적 비율로 3반복으로 CAR-T 세포와 함께 공동배양하였다. 대조군으로서 표적 세포 단독을 같은 세포 밀도로 플레이팅하였다. 공동-배양 48시간 후, 100㎕의 루시퍼라제 기질(ONE-Glo, Promega)을 각 웰에 직접 첨가하였다. 방출된 빛을 발광 플레이트 리더기로 검출하였다.
유사한 루시퍼라제 기반 세포독성 분석에서, 루시퍼라제를 과발현하도록 조작한 표적 암 세포를 세포 배양 배지(예를 들어, RPMI)에 준비하고 100㎕/웰의 부피에 5×104 내지 5×106 세포로 96 웰 플레이트에 접종하고, 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이후 CAR T-세포를 100㎕/웰에 다양한 효과기:표적(E:T) 비율(예를 들어, 5:1, 1:1 및 1:5)로 CAR T-세포와 함께 해당 웰에 접종하였다. 이후 공동-배양물을 24 또는 48시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이어서, 세포를 플레이트 리더기를 사용하여 제조사의 지시에 따라 Luciferase Assay System(Promega, E1501)으로 처리하였다. 발광은 10초 동안 BioTek Synergy H4 하이브리드 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 종점 모드에서 판독하였다. 다음의 계산식을 사용하여, 최대 세포 사멸로서 디기토닌(digitonin)-처리 세포의 루시퍼라제 활성을 사용하고 자연 세포 사멸로서 비처리 세포의 루시퍼라제 활성을 사용하여 특이적 용해의 백분율을 계산하였다: 특이적 용해% = 100% × [(실험적 발광 - 자연적 세포 사멸 발광)/(최대 세포 사멸 발광 - 자연적 세포 사멸 발광)].
예시적인 루시퍼라제 세포독성 분석 관련 추가 정보는 문헌[Matta H et al. "Development and characterization of a novel luciferase based cytotoxicity assay" Scientific Reports (2018) 8,199, 이의 전체가 참조로 본 명세서에 명시적으로 원용됨]에서 찾을 수 있다.
IFN-γ 평가
웰당 1×106개의 항-CEA6 CAR T-세포를 24시간 동안 6-웰 조직 배양 플레이트에서 표시된 효과기:표적 세포 비율로 표적 세포로 자극하였다. 인터페론 감마(IFN-γ) 및 IL-2의 분비를 인간 IL-2 ELISA Kit II(BD, 550611) 및 인간 IFN-γ ELISA Kit II(BD, 550612)를 사용한 효소-결합 면역흡착제 분석법(ELISA)을 통해 정량하였다.
CD25/CD69 분석
웰당 1×106개의 항-CEA6 CAR T-세포를 24시간 동안 6-웰 조직 배양 플레이트에서 표시된 효과기:표적 세포 비율로 표적 세포로 자극하였다. 세포를 죽은 세포 표지를 위한 LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit(ThermoFisher)로 그리고 항-CD3으로 염색하였고, 유세포 분석으로 CAR-T 세포를 CD3+ GFP+ 세포로서 식별하였다. CAR-T 세포 상의 CD69 및 CD25는 Alexa Fluor 700 항-인간 CD69 항체(Biolegend) 및 PE 항-CD25 항체(Biolegend)로 염색하였다.
CAR T 세포 라이브러리의 시퀀싱
항-CEA6 CAR-T 라이브러리 스크린으로부터 세포를 수집하였다. Blood/Cell Genome DNA Mini 키트(Tiangen, DP304-03)를 사용하여 게놈 DNA(gDNA)를 추출하였다. 75ng의 gDNA를 라이브러리의 CAR 영역을 증폭하기 위한 PCT를 위해 사용하였다. 증폭된 영역을 TA/Blunt-Zero Cloning 키트(Vazyme, C601)로 TA 클로닝하고 시퀀싱하였다.
실시예 2. 예시적인 항-CEA6 CAR T-세포주는 암에 대해 효과적임
본 명세서에 개시된 항-CEA6 결합체들로부터 몇몇 항-CEA6 CAR T-세포주를 준비하였다. 작제물을 두 명의 기증자 Z0016 및 Y1287로부터 분리한 T-세포에서 발현시켰다. 세포독성 분석은 1:5, 1:1 및 5:1의 효과기:표적 비율로 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 이들 항-CEA6 CAR T-세포주는 MKN-45 위암 세포(도 2a 내지 도 2b), BxPC-3 췌장암 세포(도 2c 내지 도 2d) 및 Capan-1 췌장암 세포(도 2e 내지 도 2f)에 대해 세포독성 효능을 나타냈다. 형질주입하지 않은 T-세포(UNT)는 음성 대조군으로 사용하였다.
예시적인 항-CEA6 CAR T-세포주 B4T2-001을 생체내 NSG 생쥐 모델에서 시험하였다. 세포주-유래 이종이식 모델에서, 대조군 생쥐에서의 종양 성장은 진행된 반면, B4T2-001의 투여는 위암, 비-소세포 폐암 및 췌장 종양에 대한 이종이식의 극적인 제거 효과를 나타냈다(도 3a). 정위성(orthotopic) 췌장암 모델에서, 대조군 생쥐는 종양 크기 감소를 나타내지 않은 반면, B4T2-001 처리 23일에 췌장 종양의 높은 제거 효과(루시퍼라제 발광 검출에 의함)가 나타났다(도 3b). 대장암의 환자-유래 이종이식(PDX)에서, B4T2-001으로 처리한 생쥐는 빠른 경우 42일에 종양의 제거를 나타냈다.
항-CEA6 CAR T-세포주 B4T2-001을 사용한 종양 재-도전 연구를 수행하였고 이의 결과를 도 4에 나타내었다. 초기 CAR T-세포 주입제를 0일째에 췌장 종양 모델에 투여하였다. 대조군 생쥐는 억제되지 않은 종양 성장을 나타낸 반면, B4T2-001을 투여한 생쥐는 빠른 경우 19일째에 검출가능한 종양 부피를 나타내지 않았다. 87일째에, B4T2-001 T-세포의 존재가 대략적으로 100㎕의 혈액 당 100개의 세포로 검출되었고, 2차 종양을 같은 생쥐에 이식하였다. 항-CEA6 CAR T-세포의 빠른 재-확장이 관찰되었고, 대략적으로 107일째에 최대 부피에 도달했던 재-이식 종양은 약 120일째에 완전히 제거되었다. 이는 B4T2-001이 상당한 정도의 시간 동안 지속되며 2차 완전 반응을 유도할 수 있음을 보여준다.
실시예 3. 암의 치료를 위한 항-CEA6 CAR-T 세포
환자는 암, 예를 들어 CEA6를 발현 또는 과발현하는(예를 들어, CEA6가 암을 검출 및 표적화하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있도록) 암을 앓고 있다. 일부의 경우, 암은 유방암, 대장암, 신장암, 간암, 폐암, 뇌암, 췌장암, 방광암, 고환암, 전립선암, 위암, 난소암, 두경부암, 담낭암, 혈액암 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부의 경우, 혈액암은 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 털세포 백혈병, 림프종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종 또는 다발성 골수종을 포함할 수 있다.
임의의 하나 이상의 항-CEA6 CAR 및/또는 항-CEA6 결합체를 포함할 수 있는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 CAR T-세포를 경장으로, 경구로, 비강내로, 비경구로, 정맥내로, 복강내로, 근육내로, 동맥내로, 심실내(뇌실내)로, 피내로, 병변내로, 두개내로, 척수강내로 또는 피하로 환자에 투여한다.
CAR T-세포를 용량 당 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개 세포의 양으로 또는 용량 당 전술한 세포들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 임의의 수의 세포의 양으로 또는 훈련된 의사에 의해 효과적이고/효과적이거나 안전한 것으로 결정된 임의의 수의 세포의 양으로 투여한다. 용량을 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 36 또는 48일마다 또는 매주 또는 전술한 시간들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위 내의 임의의 시간에 또는 훈련된 의사에 의해 효과적이고/효과적이거나 안전한 것으로 결정된 임의의 투여 시기에 투여한다.
하나 이상의 CAR T-세포의 투여 후 환자에서 암 또는 이의 증상의 개선을 관찰한다. CAR T-세포의 투여는 면역 요법, 화학 요법, 방사선 요법, 수술, 광역학 요법 또는 표적 요법을 포함하지만 이로 제한되지 않는 암에 대한 다른 요법과 함께 수행될 수 있다.
앞서 기술된 실시형태의 적어도 일부에서, 기술적으로 실현가능하지 않은 경우가 아니라면 실시형태에 사용된 하나 이상의 요소가 다른 실시형태에서 호환가능하게 사용될 수 있다. 이 분야의 기술자들은 청구된 주제의 범위를 벗어나지 않고 위에 기술된 방법 및 구조에 다양한 다른 생략, 부가 및 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 모든 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 주제의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 실질적으로 임의의 복수 및/또는 단수적 용어의 사용과 관련하여, 이 분야의 기술자는 문맥 및/또는 적용에 적절하도록 복수에서 단수로 및/또는 단수에서 복수로 번역할 수 있다. 다양한 단수/복수 순열이 명확성의 목적을 위해 본 명세서에서 명시적으로 설명될 수 있다.
일반적으로, 본 명세서 및 특히 첨부된 청구범위(예를 들어, 첨부된 청구범위의 본문)에 사용된 용어들은 일반적으로 "개방" 용어로서 의도(예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이로 제한되지 않는"으로 해석하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석하고, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이로 제한되지 않는"으로 해석하는 등)된다는 것을 이 분야의 기술자는 이해할 것이다. 또한 도입된 청구항 기재의 특정 수가 의도된 경우, 이러한 의도는 청구항에 명시적으로 기재될 것이며, 이러한 기재가 없는 경우 이러한 의도가 존재하지 않다는 것을 이 분야의 기술자는 이해할 것이다. 예를 들어, 이해를 돕기 위한 것으로서, 다음의 첨부된 청구항들은 청구항 기재를 도입하기 위한 도입 문구 "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 사용을 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 문구의 사용은, 같은 청구항이 "하나 이상" 또는 "적어도 하나"의 도입 문구 및 단수적 표현을 포함하는 경우라도, 단수적 표현에 의한 청구항 기재의 도입이 이렇게 도입된 청구항 기재를 포함하는 임의의 특정 청구항을 단 하나의 이러한 기재를 포함하는 실시형태로 제한함을 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다(예를 들어, 단수적 표현이 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"으로 해석되어야 함). 추가로, 도입된 청구항 기재의 특정 수가 명시적으로 기재된 경우라도, 이 분야의 기술자는 이러한 기재가 기재된 수 이상의 의미(예를 들어, 다른 수식어가 없는 "두 기재"의 단순 기재는 적어도 두 기재 또는 둘 이상의 기재를 의미함)로 해석되어야 함을 인식할 것이다. 또한, "A, B 및 C 중 적어도 하나"와 유사한 규칙이 사용된 경우, 일반적으로 이러한 구조는 이 분야의 기술자가 규칙(예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 만을 갖는 시스템, B 만을 갖는 시스템, C 만을 갖는 시스템, A와 B를 함께 갖는 시스템, A와 C를 함께 갖는 시스템, B와 C를 함께 갖는 시스템 및/또는 A, B 및 C를 함께 갖는 시스템 등을 포함하지만 이로 제한되지 않을 것임)을 이해할 것이라는 의미에서 의도된다. "A, B 또는 C 중 적어도 하나"와 유사한 규칙이 사용된 경우, 일반적으로 이러한 구조는 이 분야의 기술자가 규칙(예를 들어, "A, B 또는 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 만을 갖는 시스템, B 만을 갖는 시스템, C 만을 갖는 시스템, A와 B를 함께 갖는 시스템, A와 C를 함께 갖는 시스템, B와 C를 함께 갖는 시스템 및/또는 A, B 및 C를 함께 갖는 시스템 등을 포함하지만 이로 제한되지 않을 것임)을 이해할 것이라는 의미에서 의도된다. 또한, 이 분야의 기술자는, 설명, 청구범위 또는 도면에 있든지 상관없이, 둘 이상의 대안적 용어를 제시하는 사실상 임의의 분리적 단어 및/또는 문구가 용어들 중 하나, 용어들 중 어느 하나 또는 용어들 모두를 포함하는 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 함을 이해할 것이다. 예를 들어, 문구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
추가로, 개시내용의 특징 및 양상이 마쿠쉬 군의 측면에서 기술되는 경우, 이 분야의 기술자는 개시내용이 마쿠쉬 군의 임의의 개별 구성원 또는 마쿠쉬 군의 구성원들의 하위군의 측면에서도 기술된다는 것을 인식할 것이다.
이 분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 그리고 모든 목적을 위해, 예를 들어, 서면 설명을 제공하는 측면에서, 본 명세서에 개시된 모든 범위들은 임의의 그리고 모든 가능한 하위-범위들 및 이들 하위-범위의 조합 또한 포함한다. 임의의 나열된 범위는 적어도 동등한 절반들, 3등분들, 4등분들, 5등분들, 10등분들 등으로 나뉘는 범위를 충분히 설명하는 것으로서 그리고 이것이 가능한 것으로서 쉽게 인식될 수 있다. 비-제한적 예시로서, 본 명세서에 논의된 각 범위는 하위 1/3, 중간 1/3 및 상위 1/3 등으로 쉽게 나뉠 수 있다. 또한 이 분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, "최대", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 언어는 기재된 수를 포함하며 이어서 위에서 논의된 바와 같은 하위-범위들로 나뉠 수 있는 범위를 의미한다. 마지막으로, 이 분야의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각 개별적 구성원을 포함한다. 그러므로, 예를 들어, 1 내지 3개의 물품을 갖는 군은 1, 2 또는 3개의 물품을 갖는 군을 의미한다. 유사하게, 1 내지 5개의 물품을 갖는 군은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 물품을 갖는 군 등을 의미한다.
다양한 양상 및 실시형태들이 본 명세서에 개시되었지만, 다른 양상 및 실시형태가 이 분야의 기술자에게 명확할 것이다. 본 명세서에 개시된 다양한 양상 및 실시형태는 예시를 위한 것이며 제한하려는 의도가 아니고, 다음의 청구범위에 의해 표시되는 진정한 범위 및 사상과 함께 한다.
공개 및 비공개 출원, 특허 및 문헌 참고를 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌들은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되며 이에 따라 본 명세서의 일부가 된다. 참조에 의해 원용된 공개 및 특허 또는 특허 출원이 명세서에 포함된 개시내용과 모순되는 경우, 명세서가 임의의 이러한 모순적 실체를 대체하고/대체하거나 우선된다.
SEQUENCE LISTING <110> BioArdis, LLC <120> CEA6 BINDING MOLECULES AND USES THEREOF <130> BWGB.005WO <140> PCT/US2021/063812 <141> 2021-12-16 <150> US 63/127885 <151> 2020-12-18 <150> US 63/262312 <151> 2021-10-08 <160> 172 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA6-H01 HCDR1 <400> 1 Gly Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr His 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA6-F02 HCDR1 <400> 2 Gly Phe Ile Tyr Ser Phe Tyr Phe 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA6-F06 HCDR1 <400> 3 Gly Ser Ile Ser Gly Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA6-H06 HCDR1 <400> 4 Gly Ser Ile Ser Ser Phe Tyr Val 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA6-B07 HCDR1 <400> 5 Gly Ser Ile Tyr Ser Phe Asp Phe 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA6-A08 HCDR1 <400> 6 Gly Tyr Ile Leu Ser Phe Asn Phe 1 5 <210> 7 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Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ser Ile Asn Ser Tyr Ala Asp Ile Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp 50 55 60 Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Asn Thr Gly Phe Ser Ser Leu Ser Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 164 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H002-3-41BB VH <400> 164 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp Asn Tyr 20 25 30 Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Ser Asp Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Leu Pro Phe Pro Trp Asn Met Gln Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 165 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H002-3-BC141BB VH <400> 165 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Gly Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Thr Ile Asn Ser Phe Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp 50 55 60 Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Asn Thr Gly His Ser Asp Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 166 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H002-6-41BB VH <400> 166 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn 20 25 30 Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Glu Asp Val Leu Trp His Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 167 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H002-7-BC141BB VH <400> 167 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Phe Asn 20 25 30 Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Thr Ile Ser Trp Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp 50 55 60 Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Asn Thr Gly His Ser Ala Ser Ser His Asn Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 168 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H002-8-41BB VH <400> 168 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Tyr Ser Phe Asn 20 25 30 Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Val Met Val Tyr Val Val Thr Asp His Gln Arg Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 169 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H002-8-CP3-41BB VH <400> 169 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Gly Asn Asp Tyr 20 25 30 Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr 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<220> <223> H002-M-2 VH <400> 171 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Tyr Ser Phe Tyr 20 25 30 Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Thr Gly His Ser Asp Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 172 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H002-M-3 VH <400> 172 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Gly Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Thr Ile Asn Ser Phe Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp 50 55 60 Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gly Ile Arg Met Ile Thr Ile Glu His Trp Asn Lys Tyr 100 105 110 Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

Claims (19)

  1. CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 종양태아성 항원 6(CEA6) 결합 폴리펩타이드로서,
    상기 CDR-H1은 서열번호 1 내지 43에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고,
    상기 CDR-H2는 서열번호 44 내지 86에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고,
    상기 CDR-H3은 서열번호 87 내지 129에서 선택된 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, CEA6 결합 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    1) 상기 CDR-H1은 서열번호 1의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 44의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 87의 서열을 포함하는;
    2) 상기 CDR-H1은 서열번호 2의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 45의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 88의 서열을 포함하는;
    3) 상기 CDR-H1은 서열번호 3의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 46의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 89의 서열을 포함하는;
    4) 상기 CDR-H1은 서열번호 4의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 47의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 90의 서열을 포함하는;
    5) 상기 CDR-H1은 서열번호 5의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 48의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 91의 서열을 포함하는;
    6) 상기 CDR-H1은 서열번호 6의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 49의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 92의 서열을 포함하는;
    7) 상기 CDR-H1은 서열번호 7의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 50의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 93의 서열을 포함하는;
    8) 상기 CDR-H1은 서열번호 8의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 51의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 94의 서열을 포함하는;
    9) 상기 CDR-H1은 서열번호 9의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 52의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 95의 서열을 포함하는;
    10) 상기 CDR-H1은 서열번호 10의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 53의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 96의 서열을 포함하는;
    11) 상기 CDR-H1은 서열번호 11의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 54의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 97의 서열을 포함하는;
    12) 상기 CDR-H1은 서열번호 12의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 55의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 98의 서열을 포함하는;
    13) 상기 CDR-H1은 서열번호 13의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 56의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 99의 서열을 포함하는;
    14) 상기 CDR-H1은 서열번호 14의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 57의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 100의 서열을 포함하는;
    15) 상기 CDR-H1은 서열번호 15의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 58의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 101의 서열을 포함하는;
    16) 상기 CDR-H1은 서열번호 16의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 59의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 102의 서열을 포함하는;
    17) 상기 CDR-H1은 서열번호 17의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 60의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 103의 서열을 포함하는;
    18) 상기 CDR-H1은 서열번호 18의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 61의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 104의 서열을 포함하는;
    19) 상기 CDR-H1은 서열번호 19의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 62의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 105의 서열을 포함하는;
    20) 상기 CDR-H1은 서열번호 20의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 63의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 106의 서열을 포함하는;
    21) 상기 CDR-H1은 서열번호 21의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 64의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 107의 서열을 포함하는;
    22) 상기 CDR-H1은 서열번호 22의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 65의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 108의 서열을 포함하는;
    23) 상기 CDR-H1은 서열번호 23의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 66의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 109의 서열을 포함하는;
    24) 상기 CDR-H1은 서열번호 24의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 67의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 110의 서열을 포함하는;
    25) 상기 CDR-H1은 서열번호 25의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 68의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 111의 서열을 포함하는;
    26) 상기 CDR-H1은 서열번호 26의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 69의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 112의 서열을 포함하는;
    27) 상기 CDR-H1은 서열번호 27의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 70의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 113의 서열을 포함하는;
    28) 상기 CDR-H1은 서열번호 28의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 71의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 114의 서열을 포함하는;
    29) 상기 CDR-H1은 서열번호 29의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 72의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 115의 서열을 포함하는;
    30) 상기 CDR-H1은 서열번호 30의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 73의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 116의 서열을 포함하는;
    31) 상기 CDR-H1은 서열번호 31의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 74의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 117의 서열을 포함하는;
    32) 상기 CDR-H1은 서열번호 32의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 75의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 118의 서열을 포함하는;
    33) 상기 CDR-H1은 서열번호 33의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 76의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 119의 서열을 포함하는;
    34) 상기 CDR-H1은 서열번호 34의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 77의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 120의 서열을 포함하는;
    35) 상기 CDR-H1은 서열번호 35의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 78의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 121의 서열을 포함하는;
    36) 상기 CDR-H1은 서열번호 36의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 79의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 122의 서열을 포함하는;
    37) 상기 CDR-H1은 서열번호 37의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 80의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 123의 서열을 포함하는;
    38) 상기 CDR-H1은 서열번호 38의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 81의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 124의 서열을 포함하는;
    39) 상기 CDR-H1은 서열번호 39의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 82의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 125의 서열을 포함하는;
    40) 상기 CDR-H1은 서열번호 40의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 83의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 126의 서열을 포함하는;
    41) 상기 CDR-H1은 서열번호 41의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 84의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 127의 서열을 포함하는;
    42) 상기 CDR-H1은 서열번호 42의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 85의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 128의 서열을 포함하는; 또는
    43) 상기 CDR-H1은 서열번호 43의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H2는 서열번호 86의 서열을 포함하고, 상기 CDR-H3은 서열번호 129의 서열을 포함하는; CEA6 결합 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 130 내지 172에서 선택된 임의의 서열에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CEA6 결합 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CEA6 결합 폴리펩타이드는 인간화된, CEA6 결합 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CEA6 결합 폴리펩타이드는 단일 도메인 항체(sdAb)인, CEA6 결합 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 CEA6 결합 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
  7. 제6항의 CAR을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 CAR 세포는 CAR T 세포인, CAR 세포.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 CAR 세포는 적어도 2종의 결합 폴리펩타이드를 포함하고 상기 CAR 세포는 다가 CAR 세포인, CAR 세포.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR 세포는 대상으로부터 또는 세포주로부터 유래된, CAR 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 대상은 암이 있는, CAR 세포.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 신장암, 간암, 폐암, 뇌암, 췌장암, 방광암, 고환암, 전립선암, 위암, 난소암, 두경부암, 담낭암, 혈액암 또는 이들의 임의의 조합인, CAR 세포.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 CEA6 결합 폴리펩타이드 또는 제6항의 CAR에 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
  14. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항의 CAR 세포를 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 대상의 암을 치료하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체 세포는 상기 대상에 자가조직적이거나 동종이계적인, 암을 치료하는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 대상은 포유동물인, 암을 치료하는 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상은 인간인, 암을 치료하는 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 신장암, 간암, 폐암, 뇌암, 췌장암, 방광암, 고환암, 전립선암, 위암, 난소암, 두경부암, 담낭암, 혈액암 또는 이들의 임의의 조합인, 암을 치료하는 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체 세포는 비경구적으로 투여되는, 암을 치료하는 방법.
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