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CN116888154A - Cea6结合分子及其用途 - Google Patents

Cea6结合分子及其用途 Download PDF

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CN116888154A
CN116888154A CN202180094077.8A CN202180094077A CN116888154A CN 116888154 A CN116888154 A CN 116888154A CN 202180094077 A CN202180094077 A CN 202180094077A CN 116888154 A CN116888154 A CN 116888154A
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CN
China
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sequence
cdr
seq
ser
gly
Prior art date
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Pending
Application number
CN202180094077.8A
Other languages
English (en)
Inventor
法扎德·海利扎德
马苏德·塔耶比
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boaades Biotech
Original Assignee
Boaades Biotech
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Publication date
Application filed by Boaades Biotech filed Critical Boaades Biotech
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Abstract

本文公开了癌胚抗原6(CEA6)特异性结合多肽。这些结合多肽可以掺入嵌合抗原受体(CAR)中。本文还公开了使用这些结合多肽和/或CAR治疗例如癌症的方法。

Description

CEA6结合分子及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月18日递交的第63/127885号美国临时专利申请和2021年10月8日递交的第63/262312号美国临时专利申请的优先权权益，其中每项在此均通过引用整体明确地并入本文中。
序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表作为名为BWGB005_SeqListing.TXT的文件提供，该文件于2021年12月16日创建并最后一次修改，大小为76,529字节。电子序列表中的信息在此通过引用整体并入本文中。
领域
本公开的方面通常涉及CEA6(CEACAM6)特异性结合多肽。这些结合多肽可以掺入嵌合抗原受体(CAR)构建体中，以在免疫细胞中表达。这些结合多肽和CAR可用于治疗癌症。
背景
嵌合抗原受体(CAR)T细胞和其他过继性细胞疗法已被证明对癌症的治疗有效。CAR由细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域组成，其能够基于细胞表面抗原表达直接杀伤癌细胞，同时对不表达靶抗原的正常细胞影响最小。细胞外抗原结合结构域通常由抗体或其结合片段或衍生物(如单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb))组成。目前需要在CAR中使用改进的细胞外抗原结合结构域来治疗各种癌症或其他疾病。
本公开概述
本文公开了能够结合癌胚抗原6(CEA6；癌胚抗原相关细胞粘附分子6；CEACAM6)的结合多肽。这些结合多肽可以掺入嵌合抗原受体(CAR)中，所述嵌合抗原受体可被细胞表达。在一些实施方案中，所述结合多肽是单结构域抗体(sdAb)。
在一些实施方案中，本文公开了包含免疫球蛋白重链可变结构域的CEA6结合多肽，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，所述CDR-H1包含与选自SEQ ID NO:1-43的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述CDR-H2包含与选自SEQ ID NO:44-86的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述CDR-H3包含与选自SEQ ID NO:87-129的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述CDR-H1包含与选自SEQ ID NO:1-43的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列，所述CDR-H2包含与选自SEQ ID NO:44-86的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列，并且所述CDR-H3包含与选自SEQ ID NO:87-129的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:130-172的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。
本文还公开了编码本文所公开的CEA6结合多肽中的任一种的核酸。
本文还公开了治疗有需要的对象的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述对象施用嵌合抗原受体细胞。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体细胞是本文所公开的嵌合抗原受体细胞中的任一种。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体细胞包含本文所公开的CEA6结合多肽中的任何一种或多种。
通过以下编号的可替代选择的方式描述了本文所提供的本发明的实施方案：
1.癌胚抗原6(CEA6)结合多肽，其包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3免疫球蛋白重链可变结构域，其中：
所述CDR-H1包含与选自SEQ ID NO:1-43的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列；
所述CDR-H2包含与选自SEQ ID NO:44-86的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列；并且
所述CDR-H3包含与选自SEQ ID NO:87-129的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。
2.如可替代选择1所述的CEA6结合多肽，其中：
1)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:1的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:44的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:87的序列；
2)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:2的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:45的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:88的序列；
3)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:3的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:46的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:89的序列；
4)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:4的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:47的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:90的序列；
5)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:5的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:48的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:91的序列；
6)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:6的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:49的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:92的序列；
7)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:7的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:50的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:93的序列；
8)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:8的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:51的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:94的序列；
9)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:9的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:52的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:95的序列；
10)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:10的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:53的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:96的序列；
11)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:11的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:54的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:97的序列；
12)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:12的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:55的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:98的序列；
13)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:13的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:56的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:99的序列；
14)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:14的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:57的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:100的序列；
15)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:15的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:58的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:101的序列；
16)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:16的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:59的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:102的序列；
17)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:17的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:60的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:103的序列；
18)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:18的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:61的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:104的序列；
19)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:19的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:62的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:105的序列；
20)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:20的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:63的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:106的序列；
21)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:21的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:64的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:107的序列；
22)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:22的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:65的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:108的序列；
23)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:23的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:66的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:109的序列；
24)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:24的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:67的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:110的序列；
25)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:25的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:68的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:111的序列；
26)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:26的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:69的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:112的序列；
27)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:27的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:70的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:113的序列；
28)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:28的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:71的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:114的序列；
29)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:29的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:72的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:115的序列；
30)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:30的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:73的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:116的序列；
31)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:31的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:74的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:117的序列；
32)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:32的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:75的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:118的序列；
33)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:33的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:76的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:119的序列；
34)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:34的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:77的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:120的序列；
35)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:35的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:78的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:121的序列；
36)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:36的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:79的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:122的序列；
37)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:37的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:80的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:123的序列；
38)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:38的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:81的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:124的序列；
39)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:39的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:82的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:125的序列；
40)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:40的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:83的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:126的序列；
41)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:41的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:84的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:127的序列；
42)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:42的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:85的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:128的序列；或者
43)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:43的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:86的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:129的序列。
3.如可替代选择1或2所述的CEA6结合多肽，其中所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:130-172的任意序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
4.如可替代选择1-3中任一项所述的CEA6结合多肽，其中所述CEA6结合多肽是人源化的。
5.如可替代选择1-4中任一项所述的CEA6结合多肽，其中所述CEA6结合多肽是单结构域抗体(sdAb)。
6.嵌合抗原受体(CAR)，其包含可替代选择1-5中任一项所述的CEA6结合多肽。
7.嵌合抗原受体(CAR)细胞，其包含可替代选择6所述的CAR。
8.如可替代选择7所述的CAR细胞，其中所述CAR细胞是CAR T细胞。
9.如可替代选择7或8所述的CAR细胞，其中所述CAR细胞包含至少两个结合多肽，并且所述CAR细胞是多价CAR细胞。
10.如可替代选择7-9中任一项所述的CAR细胞，其中所述CAR细胞来源于对象或细胞系。
11.如可替代选择10所述的CAR细胞，其中所述对象患有癌症。
12.如可替代选择11所述的CAR细胞，其中所述癌症是乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、脑癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、头颈癌、胆囊癌、血液恶性肿瘤或以上的任意组合。
13.编码多肽的核酸，所述多肽包含与可替代选择1-5中任一项所述的CEA6结合多肽或可替代选择6所述的CAR具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。
14.治疗有需要的对象的癌症的方法，其包括施用可替代选择7-12中任一项所述的CAR细胞。
15.如可替代选择14所述的方法，其中所述嵌合抗原受体细胞对于所述对象是自体同源的或同种异体的。
16.如可替代选择14或15所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
17.如可替代选择14-16中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
18.如可替代选择14-17中任一项所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、脑癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、头颈癌、胆囊癌、血液恶性肿瘤或以上的任意组合。
19.如可替代选择14-18中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体细胞经肠胃外施用。
附图简述
除了上述特征之外，从以下对附图和示例性实施方案的描述中，另外的特征和变化将易于显而易见。应理解的是，这些附图描绘了典型的实施方案，并且不旨在限制其范围。
图1描绘了本文所公开的重链可变结构域CDR的示例性比对。
图2A和图2B的条形图显示了针对MKN-45胃癌细胞的示例性抗CEA6 CAR T细胞系的细胞毒性测定结果，其中T细胞获自两名供体Z0016(图2A)或Y1287(图2B)。
图2C和图2D的条形图显示了针对BxPC-3胰腺癌细胞的示例性抗CEA6 CAR T细胞系的细胞毒性测定结果，其中T细胞获自两名供体Z0016(图2C)或Y1287(图2D)。
图2E和图2F的条形图显示了针对Capan-1胰腺癌细胞的示例性抗CEA6 CAR T细胞系的细胞毒性测定结果，其中T细胞获自两名供体Z0016(图2E)或Y1287(图2F)。
图3A显示的3幅线图显示了针对胃肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)和胰腺肿瘤的细胞系来源的异种移植(CDX)模型中的肿瘤的示例性抗CEA6 CAR T细胞系B4T2-001(‘001)的抗肿瘤效力。
图3B显示了胰腺肿瘤的胰腺原位模型的图像，并且还显示了详细说明针对胰腺原位和患者来源的结直肠癌异种移植模型中的肿瘤的示例性抗CEA6 CAR T细胞系B4T2-001(‘001)的效力的线图。
图4的线图显示了肿瘤再激发研究的结果，其显示了驱动次级完全应答的示例性抗CEA6 CAR T细胞系B4T2-001的免疫记忆。
本公开详述
本文公开了掺入嵌合抗原受体细胞中的结合多肽。在一些实施方案中，嵌合抗原受体细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。可以通过本领域常规已知的过程构建这些CAR-T。结合多肽提供针对其各自的肿瘤相关抗原的特异性，使得CAR-T细胞能够靶向表达所述肿瘤相关抗原的癌症。
在一些实施方案中，结合多肽是设置在嵌合抗原受体细胞(例如CAR-T细胞)表面上的单结构域抗体(sdAb)。sdAb可以为肿瘤相关抗原特异性的，或者对肿瘤相关抗原具有结合亲和力。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是癌胚抗原6(CEA6)。
本文还公开了通过施用包含本文所公开的一种或多种结合多肽的嵌合抗原受体细胞来治疗有需要的对象的癌症的方法。在一些实施方案中，癌症可以是乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、脑癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、头颈癌、胆囊癌、血液恶性肿瘤或以上的任意组合。在一些实施方案中，血液恶性肿瘤可以包括白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。CAR-T细胞可以来源于进行自体同源治疗的对象。可选地，CAR-T细胞可以来源于与同种异体治疗的对象相同的物种。
定义
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与所要求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。应理解，前述一般描述和以下详细描述仅是示例性的和解释性的，并且不是对所要求保护的任何主题的限制。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，并且不应解释为限制所述主题。
冠词“一个/种(a/an)”在本文中用于指冠词的一个/种或多于一个/种(例如，至少一个/种)语法对象。举例来说，“一个/种元素(an element)”意指一个/种元素或多于一个/种元素。
“约”意指与参考量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度相差多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度。
在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为意味着包含所述步骤或元素或者步骤或元素的组，但不排除任何其他步骤或元素或者步骤或元素的组。“由…组成(consistingof)”意指包括但不限于短语“由…组成”之后的任何内容。因此，短语“由…组成”表示所列元素是必需的或强制性的，并且不可能存在其他元素。“实质上由…组成(consistingessentially of)”意指包括在短语之后列出的任何元素，并且限于不干扰或有助于在公开中为所列的元素指定的活性或作用的其他元素。因此，短语“实质上由…组成”表示所列元素是必需的或强制性的，但其他元素是任选的，并且可能存在或也可能不存在，这取决于它们是否对所列元素的活性或作用产生重大影响。
如本文所用的，术语“个体”、“对象”和“患者”意指任何哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，哺乳动物是非人类。这些术语都不要求或限于以健康护理工作者(例如医生、注册护士、护士从业人员、医生助理、勤务员或临终关怀工作者)的监督(例如持续或间歇性)为特征的情况。
术语“施用”包括肠、口、鼻内、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌内、小动脉内、心室内、皮内、病灶内、颅内、鞘内或皮下施用，或者向对象植入缓释装置(例如微型渗透泵)。
如本文用的术语“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段，以及通过连接、剪切、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中的任一种产生的片段。核酸分子可以由单体组成，所述单体是天然存在的核苷酸(如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对映体形式)或两者的组合。可以通过磷酸二酯键或此类键合的类似物连接核酸单体。一种或多种核酸可以包含在核酸载体或核酸构建体(例如质粒、病毒、噬菌体、粘粒、福斯质粒(fosmid)、噬菌粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或人类人工染色体(HAC))中，所述核酸载体或核酸构建体可以被用于在各种生物系统中扩增和/或表达一种或多种核酸。通常，载体或构建体还将包含元件，其包括但不限于启动子、增强子、终止子、诱导子、核糖体结合位点、翻译起始位点、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、复制起点、克隆位点、多个克隆位点、限制酶位点、表位、报告基因、选择标志物、抗生素选择标志物、靶向序列、肽纯化标签或附加基因，或者以上的任意组合。
核酸或核酸分子可以包含编码不同肽、多肽或蛋白质的一条或多条序列。这些一条或多条序列可以相邻地连接在同一核酸或核酸分子中，或者在它们之间具有另外的核酸，例如接头、重复序列或限制酶位点，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长度，或者在由前述长度中的任意两个限定的范围内的任意长度的任何其他序列。如本文所用的核酸上的术语“下游”是指在先前序列的3’端之后的序列，如果核酸是双链的，则在包含编码序列的链(有义链)上。如本文所用的核酸上的术语“上游”是指在随后序列的5’端之前的序列，如果核酸是双链的，则在包含编码序列的链(有义链)上。如本文所用的核酸上的术语“分组的(grouped)”是指直接相邻出现或与在其间的另外核酸(例如接头、重复序列或限制酶位点，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长度，或者在由前述长度中的任意两个限定的范围内的限定长度的任何其他序列)一起出现，但通常不与在其间编码功能或催化多肽、蛋白质或蛋白质结构域的序列一起出现的两个或更多个序列。
如本文所用的关于核酸的术语“密码子优化的”是指基于物种特异性密码子使用偏差和靶细胞细胞质中每种氨酰基-tRNA的相对可用性，在不改变多肽序列的情况下取代核酸的密码子，以增强或最大化特定物种的宿主中的翻译。密码子优化和进行此类优化的技术是本领域已知的。本领域技术人员将理解，基因表达水平取决于许多因素，如启动子序列和调控元件。在这方面，可以设计许多合成基因来提高它们的蛋白质表达水平。
如本文所用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是指由肽键连接的氨基酸组成的大分子。肽、多肽和蛋白质的多种功能是本领域已知的，并且包括但不限于酶、结构、转运、防御、激素或信号传导。肽、多肽和蛋白质通常但并不总是通过使用核酸模板的核糖体复合物进行生物产生，尽管也可以进行化学合成。通过操纵核酸模板，可以进行肽、多肽和蛋白质突变，如多于一个肽、多肽或蛋白质的取代、缺失、截短、添加、重复或融合。多于一个肽、多肽或蛋白质的这些融合可以相邻地连接在同一分子中，或者与其间的另外氨基酸(例如连接子、重复序列、表位或标签，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长度，或者在由前述长度中的任意两个限定的范围内的任意长度的任何其他序列)一起连接。如本文所用的多肽上的术语“下游”是指在先前序列的C-末端之后的序列。如本文所用的多肽上的术语“上游”是指在随后序列的N-末端之前的序列。
在一些实施方案中，本文提出并在实例中使用的核酸或肽序列在各种生物系统中具有功能，所述生物系统包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴子、灵长类动物、猫、狗、兔、大肠杆菌(E.coli)、酵母和哺乳动物细胞。在其他实施方案中，与本文提出并在实例中使用的核酸或肽序列共有至少或低于0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，或者在任意两个前述同一性百分比限定的范围内的任意百分比的核酸或肽序列，也可以在对生物系统中的序列功能具有很少或没有影响的情况下使用。如本文所用的，术语“同一性”是指分别与在序列内具有特定变化(如取代、缺失、重复或插入)的模板核酸或肽序列具有相同的核苷酸或氨基酸总体顺序的核酸或肽序列。在一些实施方案中，共有低达0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的两条核酸序列可以通过包含在翻译期间编码同一氨基酸的不同密码子来编码同一多肽。
如本文所公开的，可以设想并且可以使用与本文所公开的任何序列具有％同源性的序列。术语“％同源性”是指当考虑到两个序列的三维结构时，它们之间的保守性程度。例如，两条蛋白质序列之间的同源性可能取决于结构基序(如β链、α螺旋和其他折叠)，以及它们在整个序列中的分布。同源性可以通过结构测定来确定，无论是凭经验还是通过计算机。在一些实施方案中，可以使用与本文所公开的任何序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性的任何序列。在一些实施方案中，可以使用可能影响或可能不影响总体％同源性的相对于本文所公开的任何序列具有至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个取代、缺失或添加的任何序列。
如本文所应用的，可以设想并且可以使用与本文所公开的任何序列具有某一％相似性的序列。在一些实施方案中，这些序列可以包括肽序列、核酸序列、CDR序列、可变区序列、或重链或轻链序列。如本领域关于肽序列所理解的，“相似性”是指基于氨基酸性质的氨基酸的比较，所述氨基酸性质包括但不限于大小、极性、电荷、pK、芳香性、氢键性质或官能团(例如羟基、硫醇、胺、羧基等)的存在。术语“％相似性”是指两条或更多条序列之间相同的单元(即氨基酸)相对于序列长度的百分比。当被比较的两条或更多条序列具有相同的长度时，％相似性将分别为该长度。当被比较的两条或更多条序列具有不同的长度时，可以引入缺失和/或插入以获得最佳比对。两个氨基酸的相似性可能决定某个取代是保守性的还是非保守性的。测定氨基酸取代的保守性的方法在本领域中通常是已知的，并且可以涉及取代矩阵。常用的取代矩阵包括BLOSUM45、BLOSUM62、BLOSUM80、PAM100、PAM120、PAM160、PAM200、PAM250，但是可以使用如技术人员认为合适的其他取代矩阵或方法。当考虑诸如相关序列(例如在同一物种或更广泛的范围内)的严格性、保守性和/或差异性以及所讨论序列的长度等方面时，某个取代矩阵可能优先于其他取代矩阵。如本文所用的，与另一序列具有某一％相似性的肽序列将具有高达该％的氨基酸，所述氨基酸是相同的或是由所使用的相似性确定方法所控制的可接受的取代。在一些实施方案中，可以使用与本文所公开的任何序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相似性的序列。在一些实施方案中，可以使用相对于本文所公开的任何序列具有至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个相似取代的任何序列。当应用于抗体序列时，这些相似的取代可以应用于抗原结合区(即CDR)或不结合抗原或仅次于抗原结合的区域(即框架区)。
本文中关于序列所使用的术语“共识序列”是指代表一组序列的每个位置处允许的氨基酸的所有不同组合的广义序列。共识序列可以提供对其中大部分或全部序列中的单元(例如氨基酸或核苷酸)是相同的相关序列的保守区以及在序列之间表现出差异的区域的深入了解。在抗体的情况下，CDR的共识序列可以指示对抗原结合重要或不必要的氨基酸。可以设想，共识序列可以用本文所提供的任何序列制备，并且来源于共识序列的所得各种序列可以被验证为与模板序列具有类似的效果。
如本文所用的，术语“抗体”表示本领域技术人员赋予它的含义，并且进一步地，它旨在包括具有适合并识别表位的特定形状的任何含有多肽链的分子结构，其中一种或多种非共价结合相互作用稳定分子结构和表位之间的复合物。
术语“抗体文库”是指展示用于筛选和/或组合成完整抗体的抗体和/或抗体片段的集合。抗体和/或抗体片段可以展示在核糖体上；在噬菌体上；或者在细胞表面上，特别是酵母细胞表面上。
本文中关于抗体或结合多肽所使用的术语“竞争”意指第一抗体或结合多肽或其抗原结合部分，以与第二抗体或结合多肽或其抗体结合部分的结合充分相似的方式结合表位，使得与在不存在第二抗体或结合多肽的情况下第一抗体或结合多肽的结合相比，在第二抗体或结合多肽存在的情况下，第一抗体或结合多肽与其同源表位的结合结果可检测地降低。其中在第一抗体或结合多肽存在的情况下，第二抗体或结合多肽与其表位的结合也可检测地降低的可替代方案可以是但不必是这种情况。不管发生此类竞争的机制如何(例如，空间位阻、构象变化或与共同表位或其部分的结合)，技术人员都将理解，基于本文所提供的教导，此类竞争性抗体或结合多肽被包括在内，并且可用于本文所公开的方法。
与表位“优先结合”或“特异性结合”(本文中可互换使用)的抗体或结合多肽是本领域充分理解的术语，并且确定此类特异性或优先结合的方法也是本领域熟知的。如果相比分子与可替代细胞或物质的反应或缔合，分子与特定细胞或物质更频繁地、和/或更快地、和/或以更长的持续时间、和/或以更大的亲和力反应或缔合，则称其表现出“特异性结合”或“优先结合”。如果相比抗体或结合多肽与其他物质的结合，抗体或结合多肽以更大的亲和力和/或亲合力、和/或更快地、和/或以更长的持续时间结合，则其与靶标“特异性结合”或“优先结合”。
适用于非人类(例如啮齿动物或灵长类动物)抗体的术语“人源化的”是包含来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的杂合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段。
如本文所用的术语“单结构域结合多肽”或“单结构域抗体”(sdAb)是指包含完整免疫球蛋白结构域或能够识别抗原的其他蛋白质折叠的单肽链(例如，不与具有二硫键的另一肽链结合)。单结构域结合多肽或sdAb可来源于典型的重或轻免疫球蛋白链，如来源于人类或来源于可替代来源，如单峰驼(例如VHH)和软骨鱼(例如VNAR)。在一些实施方案中，单结构域结合多肽或sdAb包含一个、两个或三个互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，单结构域结合多肽或sdAb包含CDR1、CDR2和CDR3中的一个、两个或三个。
如本文所用的术语“单链可变片段”(scFv)是包含免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白，其中VH和VL共价连接以形成VH:VL异二聚体。VH和VL直接连接或通过肽编码连接子连接，所述肽编码连接子将VH的N-末端与VL的C-末端连接，或者将VH的C-末端与VL的N-末端连接。连接子通常富含甘氨酸以获得柔性，以及丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性。尽管去除了恒定区并引入了连接子，但是scFv蛋白保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可以由包括VH和VL编码序列的核酸表达。在一些实施方案中，scFv的VH和VL各自包含一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，scFv的VH和VL各自包含CDR1、CDR2和CDR3中的一个、两个或三个。
在某些实施方案中，通过解决抗体或结合多肽的结构、和/或解决抗体-配体复合物的结构来完成CDR的明确描绘和包含抗体或结合多肽的结合位点的残基的鉴定。在某些实施方案中，这可以通过本领域技术人员已知的各种技术中的任一种来实现，如X射线晶体学。在某些实施方案中，可以采用各种分析方法来鉴定或粗略估计CDR区域。在某些实施方案中，可以采用各种分析方法来识别或粗略估计CDR区域。此类方法的实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、IMGT方法(Lefranc等人，2003)Dev Comp Immunol.27:55-77)、计算程序如Paratome(Kunik等人，2012,Nucl Acids Res.W521-4)、AbM定义和构象定义。
Kabat定义是对抗体中的残基进行编号的标准，并且通常用于鉴定CDR区域。参见例如，Johnson&Wu,2000,Nucleic Acids Res.,28:214-8。Chothia定义类似于Kabat定义，但Chothia定义考虑了某些结构环区域的位置。参见例如，Chothia等人，1986,J.Mol.Biol.,196:901-17；Chothia等人，1989,Nature,342:877-83。AbM定义使用了牛津分子集团(Oxford Molecular Group)产生的一套模拟抗体结构的集成计算机程序。参见Martin等人，1989,Proc Natl Acad Sci(USA),86:9268-9272；"AbM.TM.,A ComputerProgram for Modeling Variable Regions of Antibodies,"Oxford,UK；OxfordMolecular,Ltd。AbM定义使用知识数据库和从头算方法的组合，如PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3:194-198中由Samudrala等人，1999,"Ab InitioProtein Structure Prediction Using aCombined Hierarchical Approach"描述的那些，从一级序列中模拟抗体的三级结构。接触定义是基于对可用的复杂晶体结构的分析。参见例如，MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.,5:732-45。在另一种方法中，本文称为CDR的“构象定义”，CDR的位置可以被鉴定为对抗原结合做出焓贡献的残基。参见例如Makabe等人，2008,Journal of Biological Chemistry,283:1156-1166。还有其他CDR边界定义可能不严格遵循上述方法之一，但仍将与Kabat CDR的至少一部分重叠，尽管根据特定残基或残基组不会显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以被缩短或延长。如本文所用的，CDR可指通过本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。本文所用的方法可以利用根据这些方法中的任一种定义的CDR。对于含有多于一个CDR的任何给定实施方案，CDR可根据Kabat、Chothia、扩展的、IMGT、Paratome、AbM和/或构象定义中的任一种或前述任一种的组合来定义。
如本文所用的术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指在免疫细胞中对某种抗原(如肿瘤相关抗原)赋予人工特异性的工程化的生物受体。其中可以使用CAR的示例性免疫细胞是T细胞，但可以设想的是，CAR可以被工程化成任何易进行处理的细胞毒性免疫细胞，其包括但不限于T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、树突状细胞或巨噬细胞。在这个方面，任何关于CAR T细胞的公开也可以被应用于包含CAR的其他免疫细胞。在其核心处，CAR包含细胞外抗原识别结构域(例如肿瘤受体配体或抗体)、铰链、跨膜和细胞内信号传导结构域(内结构域)。这些CAR组分的不同组合可能导致对某些癌症抗原的不同特异性和效力。
如本文所用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”(并且如本领域所熟知的)意指用于获得对象病况的有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。有益的或期望的临床结果可以包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病况、减少疾病的程度、稳定(即不恶化)疾病状态、预防疾病的传播或扩散、延缓或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态、疾病复发的减少、以及缓解，无论是部分还是全部，并且无论是可检测的还是不可检测的。如本文所用的“治疗(Treating)”或“治疗(treatment)”也包括预防性治疗。治疗方法包括向对象施用治疗有效量的活性剂。施用步骤可以由单一施用组成，或者可以包括一系列施用。组合物以足以治疗对象的量和持续时间施用于对象。治疗期的长度取决于多种因素，如病况的严重程度、对象的年龄和遗传特征、活性剂的浓度、治疗中使用的组合物的活性、或以上的组合。还将理解，用于治疗或预防的试剂的有效剂量可以在特定治疗或预防方案的过程中增加或减少。剂量的变化可能通过本领域已知的标准诊断测定而导致并变得明显。在一些情况下，可能需要长期施用。
如本文所用的术语“有效量”或“有效剂量”是指产生可观察到的指定效果的所述组合物或化合物的量。本公开主题的活性组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便施用有效实现针对特定对象和/或应用的指定应答的活性组合物或化合物的量。所选择的剂量水平可以基于多种因素而变化，包括但不限于组合物的活性、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、正在治疗的病况的严重程度，以及正在治疗的对象的身体状况和既往医疗史。在一些实施方案中，施用最小剂量，并且在没有剂量限制性毒性的情况下将剂量增加至最小有效量。本文考虑了有效剂量的确定和调整，以及何时和如何进行此类调整的评估。
术语“施用”包括向对象口服施用、局部接触、作为栓剂施用、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鞘内、鼻内、真皮下(subdermal)或皮下(subcutaneous)施用，或者植入缓释装置(例如微型渗透泵)。通过任何途径施用，包括肠胃外和透粘膜(例如，颊、舌下、腭、牙龈、鼻、阴道、直肠或透皮)。肠胃外施用包括例如，静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其他递送模式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉输注、透皮贴剂等。“共施用”意指在施用本文所述的第二化合物同时、之前不久或之后不久施用本文中所述的第一化合物。
如本文所用的，术语“治疗性靶标”是指在调节其活性时(例如，通过调节表达、生物活性等)，能够提供对疾病表型的调节的基因或基因产物。如通篇使用的，“调节(modulation)”意指所示现象的增加或降低(例如，生物活性的调节是指生物活性的增加或生物活性的降低)。
如本文所用的，术语“护理标准”、“最佳实践”和“标准疗法”是指被医疗从业人员接受为某种疾病的合适、适当、有效和/或广泛使用的治疗的治疗。某种疾病的护理标准取决于许多不同的因素，包括治疗的生物学效应、体内的区域或位置、患者状况(例如年龄、体重、性别、遗传风险、其他残疾、次要病况)、毒性、代谢、生物累积性、治疗指数、剂量和本领域已知的其他因素。确定疾病的护理标准还取决于在监管机构标准化的临床试验中建立安全性和有效性，所述监管机构如美国食品和药物管理局(the US Food and DrugAdministration)、国际协调理事会(International Council for Harmonisation)、加拿大卫生部(Health Canada)、欧洲药品管理局(European Medicines Agency)、医疗用品管理局(Therapeutics Goods Administration)、中央药品标准控制组织(Central DrugsStandard Control Organization)、国家药品监督管理局(National Medical ProductsAdministration)、药品和医疗器械局(Pharmaceuticals and Medical Devices Agency)、食品和药物安全部(Ministry of Food and Drug Safety)和世界卫生组织(the WorldHealth Organization)。疾病的护理标准可以包括但不限于手术、放疗、化疗、靶向疗法或免疫疗法。
术语“％w/w”或“％wt/wt”意指根据成分或试剂的重量占组合物总重量之比乘以100表示的百分比。
抗原结合多肽
除非另有规定，否则本文所公开的互补决定区(CDR)遵循IMGT定义。然而，CDR，单独地或在可变结构域的上下文中，也可以通过Kabat、Chothia或本领域技术人员理解的其他定义来解释。
本文公开了癌胚抗原6(癌胚抗原相关细胞粘附分子6；CEA6；CEACAM6)结合多肽。在一些实施方案中，CEA6结合多肽包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的免疫球蛋白重链可变结构域。在一些实施方案中，CDR-H1包含与选自SEQ ID NO:1-43的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CDR-H2包含与选自SEQ ID NO:44-86的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CDR-H3包含与选自SEQ ID NO:87-129的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CDR-H1包含与选自SEQ ID NO:1-43的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列，CDR-H2包含与选自SEQ ID NO:44-86的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列，并且CDR-H3包含与选自SEQ ID NO:87-129的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。
在CEA6结合多肽的一些实施方案中：1)CDR-H1包含SEQ ID NO:1的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:44的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:87的序列；2)CDR-H1包含SEQ ID NO:2的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:45的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:88的序列；3)CDR-H1包含SEQ ID NO:3的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:46的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:89的序列；4)CDR-H1包含SEQ ID NO:4的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:47的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:90的序列；5)CDR-H1包含SEQ ID NO:5的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:48的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:91的序列；6)CDR-H1包含SEQ ID NO:6的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:49的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:92的序列；7)CDR-H1包含SEQ ID NO:7的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:50的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:93的序列；8)CDR-H1包含SEQ ID NO:8的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:51的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:94的序列；9)CDR-H1包含SEQ ID NO:9的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:52的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:95的序列；10)CDR-H1包含SEQ ID NO:10的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:53的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:96的序列；11)CDR-H1包含SEQ ID NO:11的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:54的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:7的序列；12)CDR-H1包含SEQ IDNO:12的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:55的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:98的序列；13)CDR-H1包含SEQ ID NO:13的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:56的序列，并且CDR-H3包含SEQID NO:99的序列；14)CDR-H1包含SEQ ID NO:14的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:57的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:100的序列；15)CDR-H1包含SEQ ID NO:15的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:58的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:101的序列；16)CDR-H1包含SEQ ID NO:16的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:59的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:102的序列；17)CDR-H1包含SEQ ID NO:17的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:60的序列，并且CDR-H3包含SEQID NO:103的序列；18)CDR-H1包含SEQ ID NO:18的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:61的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:104的序列；19)CDR-H1包含SEQ ID NO:19的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:62的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:105的序列；20)CDR-H1包含SEQ ID NO:20的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:63的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:106的序列；21)CDR-H1包含SEQ ID NO:21的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:64的序列，并且CDR-H3包含SEQID NO:107的序列；22)CDR-H1包含SEQ ID NO:22的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:65的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:108的序列；23)CDR-H1包含SEQ ID NO:23的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:66的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:109的序列；24)CDR-H1包含SEQ ID NO:24的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:67的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:110的序列；25)CDR-H1包含SEQ ID NO:25的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:68的序列，并且CDR-H3包含SEQID NO:111的序列；26)CDR-H1包含SEQ ID NO:26的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:69的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:112的序列；27)CDR-H1包含SEQ ID NO:27的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:70的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:113的序列；28)CDR-H1包含SEQ ID NO:28的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:71的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:114的序列；29)CDR-H1包含SEQ ID NO:29的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:72的序列，并且CDR-H3包含SEQID NO:115的序列；30)CDR-H1包含SEQ ID NO:30的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:73的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:116的序列；31)CDR-H1包含SEQ ID NO:31的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:74的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:117的序列；32)CDR-H1包含SEQ ID NO:32的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:75的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:118的序列；33)CDR-H1包含SEQ ID NO:33的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:76的序列，并且CDR-H3包含SEQID NO:119的序列；34)CDR-H1包含SEQ ID NO:34的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:77的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:120的序列；35)CDR-H1包含SEQ ID NO:35的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:78的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:121的序列；36)CDR-H1包含SEQ ID NO:36的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:79的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:122的序列；37)CDR-H1包含SEQ ID NO:37的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:80的序列，并且CDR-H3包含SEQID NO:123的序列；38)CDR-H1包含SEQ ID NO:38的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:81的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:124的序列；39)CDR-H1包含SEQ ID NO:39的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:82的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:125的序列；40)CDR-H1包含SEQ ID NO:40的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:83的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:126的序列；41)CDR-H1包含SEQ ID NO:41的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:84的序列，并且CDR-H3包含SEQID NO:127的序列；42)CDR-H1包含SEQ ID NO:42的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:85的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:128的序列；或者43)CDR-H1包含SEQ ID NO:43的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO:86的序列，并且CDR-H3包含SEQ ID NO:129的序列。
在一些实施方案中，CEA6结合多肽包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的免疫球蛋白重链可变结构域，其中这些CDR中的一个或多个通过共识序列来限定。本文所提供的共识序列来源于图1中描绘的CDR的比对。然而，可以设想的是，可以进行可替代比对(例如，使用全局或局部比对，或者利用不同的算法，如隐马尔可夫模型、种子引导树、Needleman-Wunsch算法或Smith-Waterman算法，或者其他已知方法)，并且因此，可以导出可替代的共识序列(包括利用本文所提供的序列子集进行的那些)。
在一些实施方案中，CDR-H1通过式X1X2X3X4X5X6X7X8来限定，其中X1是G；X2是F、R、S或Y；X3是I或T；X4是F、G、L、S或Y；X5是D、G、N或S；X6是D、F、I、L、N、S、T或Y；X7是D、N或Y；X8是D、F、H、L、P、T、V或Y。在一些实施方案中，CDR-H1包含与该共识序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，CDR-H1包含具有来自该共识序列的0、1、2、3、4、5或6个取代的序列。
在一些实施方案中，CDR-H2通过式X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10来限定，其中X1是无氨基酸，是S或T；X2是I；X3是N、S或T；X4是R、S、T或W；X5是D、F、I、L、S、T或Y；X6是A、D、G或S；X7是A、D、G或S；X8是I或S；X9是T；X10是无氨基酸，或是Y。在一些实施方案中，CDR-H2包含与该共识序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，CDR-H2包含具有来自该共识序列的0、1、2、3、4、5或6个取代的序列。
在一些实施方案中，CDR-H3通过式X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X1 9X20X21X22X23X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33来限定，其中X1是无氨基酸，或是A；X2是无氨基酸，是A或V；X3是无氨基酸，是A、G、M、Q、S、T或V；X4是无氨基酸，是A、D、E、G、I、M、N、R、S、V或Y；X5是无氨基酸，是A、E、K、M、R、S、T、V或W；X6是无氨基酸，是A、E、M、P、S或V；X7是无氨基酸，是A、F、I、M、P、W或Y；X8是无氨基酸，是D、I、K、L、S、T或V；X9是无氨基酸，是A、K、Q、T或V；X10是无氨基酸，是A、D、E或S；X11是无氨基酸，是A、I、L、R、V或Y；X12是无氨基酸，是A、E、G、L、P、S或T；X13是无氨基酸，是D、G、I、L、N、P、Q、S、T或V；X14是无氨基酸，是A、E、F、H、K、L、M、P、Q、R、T、V或Y；X15是无氨基酸，是A、D、H、I、L、M、P、Q、R、S、T或V；X16是无氨基酸，是A、D、E、H、L、S、T、V、W或Y；X17是无氨基酸，是E、F、G、H、L、M、N、Q、S、T或Y；X18是无氨基酸，是A、D、G、H、K、M、N、Q、R、S、V或Y；X19是无氨基酸，是F、H、Q或Y；X20是无氨基酸，是D、N、Q、S或Y；X21是无氨基酸，是A、G或Y；X22是无氨基酸，是W或Y；X23是无氨基酸，是A或R；X24是无氨基酸，是H或S；X25是无氨基酸，是D或G；X26是无氨基酸，是E或K；X27是无氨基酸，是I或T；X28是无氨基酸，是F或R；X29是无氨基酸，或是Y；X30是无氨基酸，或是Y；X31是无氨基酸，或是Y；X32是无氨基酸，是N或S；X33是无氨基酸，或是Y。
在一些实施方案中，CDR-H3包含与该共识序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，CDR-H3包含具有来自该共识序列的0、1、2、3、4、5或6个取代的序列。
在CEA6结合多肽的一些实施方案中，重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:130-172的任何序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CEA6结合多肽是人源化的。在一些实施方案中，CEA6结合多肽是单结构域抗体(sdAb)。
在一些实施方案中，CEA6结合多肽以小于1nM、2nM、5nM、10nM、15nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或1000nM的解离常数(KD)或由任意两个上述KD限定的范围内的任意KD与CEA6结合。
本文所公开的结合多肽可以从抗体文库中获得。在一些实施方案中，抗体文库是免疫抗体文库、幼稚抗体文库、合成抗体文库或半合成抗体文库。在一些实施方案中，抗体文库包含来源于人的抗体、或者在人中不具免疫原性的抗体、或两者。在一些实施方案中，抗体文库包含人源化的抗体，例如来自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、牛、马、绵羊、山羊、马、驴的人源化的抗体。在一些实施方案中，抗体文库包含单结构域抗体(sdAb)、纳米抗体、VHH片段、VNAR片段、单链可变片段(scFv)、骆驼抗体或软骨鱼类抗体，或者以上的任意组合。可以使用的一种示例性文库是完全人源化的合成sdAb文库，但是可以制备或可用的任何其他抗体文库都可以用于本文所公开的方法。在一些实施方案中，抗体文库包含sdAb。在一些实施方案中，抗体文库包含至少100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、500000或1000000个独特抗体，或者在由上述数量的抗体中的任意两个限定的范围内的任意数量的抗体。
可以通过计算或使用机器学习过程生成抗体文库。通过计算产生抗体文库的示例性方法包括在一个或多个互补决定区(CDR)(如CDR1、CDR2或CDR3或其任意组合)中用合成多样性修饰通用VHH框架。CDR的多样性是通过随机化编码具有简并密码子的抗体的序列文库来引入的。例如，可以采用NNK密码子文库，其中NNK密码子包含N(A/T/C/G的25％混合物)和K(T/G的50％混合物)。在一些实施方案中，NNK密码子文库用所有可能的氨基酸构建，或者排除了一些氨基酸(例如半胱氨酸)和终止密码子组合。可以用最少的实验代替其他简并密码子混合物的所述NNK密码子文库。在其他实施方案中，可以使用三聚体密码子混合物产生抗体文库，这改善了有义密码子的平衡表示，同时减少了终止密码子的机会，提高了抗体产生和测试的效率。在一些实施方案中，基于人工智能的预测可以用于使用可用的结合模型或结构数据来随机化抗体的特异性结合口袋。
在一些实施方案中，淘选抗体文库包括通过噬菌体展示、酵母展示、细菌展示、核糖体展示或mRNA展示或以上的任意组合来筛选候选结合多肽。在一些实施方案中，淘选抗体文库包括一轮或多轮选择，其中选择候选结合多肽对癌相关抗原(例如CEA6)或展示癌相关抗原的细胞或组织的特异性。在一些实施方案中，候选结合多肽是在包括但不限于肿瘤微环境样条件、免疫抑制条件、低或高pH、低或高氧浓度、低或高温度、低或高粘度或以上的任意组合的条件下选择的，或选择其针对一种或多种癌症相关抗原的修饰或衍生形式的特异性。在一些实施方案中，免疫抑制条件可包括存在肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、髓源性抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关中性粒细胞(TAN)、癌相关成纤维细胞(CAF)或其他免疫抑制细胞、或者存在腺苷、或者两者。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体细胞来自细胞系(例如Jurkat)。在一些实施方案中，嵌合抗原受体细胞来源于对象。在一些实施方案中，对象患有癌症。在一些实施方案中，对象患有癌症，并且该癌症表达本文所公开的癌症相关抗原(例如CEA6)中的任何一种或多种。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、脑癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、头颈癌、胆囊癌、血液恶性肿瘤或以上的任意组合。在一些实施方案中，血液恶性肿瘤可以包括白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，对象是哺乳动物，如人、猫、狗、小鼠、大鼠、仓鼠、啮齿动物、牛、猪、马、山羊、绵羊、驴或猴。在一些实施方案中，对象是人。
嵌合抗原受体(CAR)和细胞
本文还公开了包含本文所公开的CEA6结合多肽中的任一种或多种的嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，CAR包含至少两个结合多肽，并且CAR是多价CAR。在一些实施方案中，CAR包含两个结合多肽，并且CAR是二价CAR。在一些实施方案中，CAR包含三个结合多肽，并且CAR是三价CAR。
在一些实施方案中，CAR还包含一种或多种信号肽、具有不同长度和组成的连接子、铰链、跨膜结构域、共刺激结构域、信号传导结构域、细胞质结构域、功能信号、增殖信号、抗耗竭信号、抗抑制受体、肿瘤/癌症归巢蛋白或调节分子、或者以上的任意组合。在一些实施方案中，铰链包含CD3ζ、CD4、CD8或CD28铰链，或者具有不同长度的计算设计的合成铰链。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD3ζ、CD4、CD8或CD28跨膜结构域，或者计算设计的合成跨膜结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域包含CD8、CD28、ICOS、4-1BB、OX40(CD134)、CD27、CD40、CD40L、TLR或其他TNFR超家族成员或Ig超家族成员共刺激结构域，或者经由IL-2Rβ、IL-15R-α、MyD88或CD40或任何其他Toll样受体或IL-1受体信号传导通路成员的细胞质结构域的其他信号传导。
在一些实施方案中，通过从编码本文所公开的任一种结合多肽的核酸和编码不同CAR模块的相容核酸的混合物组装CAR表达构建体来构建本文所公开的CAR。在一些实施方案中，产生CAR的不同组合以用于CAR文库中用于筛选CAR效力(体外或体内)。在一些实施方案中，单独产生独特的CAR。在一些实施方案中，CAR对一种靶标是特异性的。在一些实施方案中，CAR对至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种靶标是特异性的。在一些实施方案中，CAR是双特异性或三特异性的。
为了构建本文所公开的CAR中的任一种，将编码通过淘选抗体文库鉴定的结合多肽的核酸组装成具有其他CAR模块的CAR表达构建体。在一些实施方案中，使用本领域已知的多片段组装反应组装CAR表达构建体。组装CAR表达构建体的一种示例性方法涉及使用IIS型限制酶来产生具有相容突出序列的核酸片段，并用连接酶连接核酸片段。当IIS型限制酶在其识别位点外切割时，可以同时制备多种相容的核酸片段。在其他实施方案中，可以通过重叠延伸PCR组装CAR表达构建体。可以设想可以采用从多于一种核酸片段组装核酸构建体的任何其他方法。在一些实施方案中，不同的CAR模块包含信号肽、连接子、铰链、跨膜结构域、共刺激结构域、激活结构域、信号传导结构域、细胞质结构域、功能信号、增殖信号、抗耗竭信号、抗抑制剂受体、癌症归巢蛋白或调节分子，或者以上的任意组合。一些示例性铰链包括CD8铰链、CD28铰链、IgG1铰链或IgG4铰链。一些示例性跨膜结构域包含CD3ζ跨膜结构域、CD8α跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD28跨膜结构域或ICOS跨膜结构域。一些示例性共刺激结构域包含CD8共刺激结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域、OX40(CD134)共刺激结构域、ICOS共刺激结构域、CD27共刺激结构域、CD40共刺激结构域、CD40L共刺激结构域、TLR共刺激结构域、MYD88-CD40共刺激结构域或KIR2DS2共刺激结构域。在一些实施方案中，不同的CAR模块来源于CD8、CD28、4-1BB、CD3ζ或以上的任意组合。CAR也可以用各种添加物进行修饰，包括但不限于细胞因子、趋化因子、细胞因子受体、趋化因子受体、抗原受体或配体、抗体或酶。
本文还公开了嵌合抗原受体(CAR)细胞，其包含本文所公开的CAR中的任一种。在一些实施方案中，CAR细胞是CAR-T细胞。在一些实施方案中，CAR细胞来源于对象或细胞系。在一些实施方案中，对象患有癌症。在一些实施方案中，对象患有癌症，并且该癌症表达本文所公开的癌症相关抗原(例如，CEA6)中的任一种或多种。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、脑癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、头颈癌、胆囊癌、血液恶性肿瘤或以上的任意组合。在一些实施方案中，血液恶性肿瘤可以包括白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
核酸
本文还公开了编码多肽的核酸。在一些实施方案中，多肽是结合多肽。在一些实施方案中，多肽是单结构域结合多肽。在一些实施方案中，多肽是本文所公开的结合多肽中的任一种。在一些实施方案中，多肽包含与本文所公开的CEA6结合多肽中的任一种或多种具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，多肽是本文所公开的CAR中的任一种。
编码结合多肽的任一种核酸都可以通过重组DNA技术、合成化学技术或以上的组合制备。例如，可使用本领域已知的标准分子技术将编码结合多肽的核酸序列克隆到表达载体中。可以从编码所期望的蛋白质序列的其他载体、从使用各自模板核酸的PCR产生的片段或通过组装编码所期望序列的合成寡核苷酸获得序列。在一些实施方案中，表达载体可以是CAR表达载体，其中将其提供给免疫细胞以便其表达CAR。在一些实施方案中，表达载体可以是适于大规模抗体或结合多肽生产的表达载体，可以从中分离肽产物以供进一步使用。
可以通过本领域已知的核酸或蛋白质测定确认结合多肽或CAR的表达。例如，可以通过常规杂交测定(例如Northern印迹分析)、扩增程序(例如RT-PCR)、SAGE(第5,695,937号美国专利)，以及基于阵列的技术(参见例如，第5,405,783号、第5,412,087号和第5,445,934号美国专利)，使用与编码结合多肽或CAR的多核苷酸的任何区域互补的探针，检测和/或定量结合多肽或CAR的转录mRNA的存在。也可以通过检查表达的肽确定结合多肽或CAR的表达。本领域中有多种技术可用于蛋白质分析。它们包括但不限于放射免疫测定、ELISA(酶联免疫放射测定)、“三明治”免疫测定、免疫放射测定、原位免疫测定(使用例如，胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀测定、免疫荧光测定和SDS-PAGE。
使用或治疗方法
本文还公开了治疗有需要的对象的癌症的方法。在一些实施方案中，方法包括向对象施用嵌合抗原受体细胞。在一些实施方案中，方法包括施用本文所公开的嵌合抗原受体细胞中的任一种。在一些实施方案中，嵌合抗原受体细胞表达和/或包含本文所公开的CEA6结合多肽中的任一种或多种。在一些实施方案中，嵌合抗原受体细胞是CAR-T细胞。在一些实施方案中，嵌合抗原受体细胞来源于对象，并且是对象自体同源的。在一些实施方案中，嵌合抗原受体细胞是对象同种异体的。在一些实施方案中，嵌合抗原受体细胞来自细胞系(例如Jurkat)。在一些实施方案中，对象是哺乳动物，诸如人、猫、狗、小鼠、大鼠、仓鼠、啮齿动物、牛、猪、马、山羊、绵羊、驴或猴。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象患有癌症，并且该癌症表达本文所公开的癌症相关抗原(例如，CEA6)中的任一种或多种。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、脑癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、头颈癌、胆囊癌、血液恶性肿瘤、或者以上的任意组合。在一些实施方案中，血液恶性肿瘤可以包括白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，嵌合抗原受体细胞经肠胃外施用。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体细胞每天施用一次、每天施用两次、每天施用三次或更多次。在一些实施方案中，嵌合抗原受体细胞每日、每天、每隔一天、每周五天、每周一次、每隔一周、每月两周、每月三周、每月一次、每月两次、每月三次或更多次施用。在一些实施方案中，施用免疫细胞至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、2年、3年或更长时间。
在一些实施方案中，对应于此类量的给定试剂的量根据以下因素而变化，如特定化合物、疾病的严重程度、需要治疗的对象或宿主的特性(例如体重)，但仍然根据围绕病例的特定情况以本领域已知的方式常规地确定，包括例如，施用的具体试剂、施用途径以及被治疗的对象或宿主。在一些情况下，所需剂量方便地以单一剂量或作为同时(或在短时间段内)或以适当间隔(例如作为每天两剂、三剂、四剂或更多剂亚剂量)施用的分剂量呈现。
施用的范围只是提示性的，因为关于个体治疗方案的变量数量很大，并且与这些推荐值的显著偏离并不罕见。此类剂量根据许多变量而改变，这些变量不限于所用化合物的活性、待治疗的疾病或病况、施用模式、单个对象的要求、待治疗疾病或病况的严重程度，以及从业者的判断。
在一些实施方案中，此类治疗方案的毒性和治疗效力通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，包括但不限于LD50(对50％的群体致命的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)的确定。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其表示为LD50和ED50之间的比率。优选表现出高治疗指数的化合物。从细胞培养测定和动物研究中获得的数据被用于配制用于人的一系列剂量。此类化合物的剂量优选在包括具有最小毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量在此范围内变化，取决于采用的剂量形式和利用的施用途径。
实施例
在以下实施例中进一步详细地公开了上述讨论的实施方案的一些方面，这些实施例并不以任何方式旨在限制本公开的范围。本领域技术人员将理解，许多其他实施方案也落入本发明的范围内，如上文和权利要求中所述。
实施例1.方法
质粒制备和质量检查(QC)
使用Maxi质粒纯化试剂盒(Zymo,D4203)进行CAR质粒制备。通过Nanodrop(260/280比率和260/230比率)和ToxinSensor显色LAL内毒素测定(Genescript,L00350)分析质粒浓度和质量。良好质量的质粒DNA将具有1.8-2.0的A260/A280比率、大于2.0的A260/A230比率和低于0.1EU/μg的内毒素。
质粒组装和QC
所有CAR均由Genewiz合成。将编码与CEA6结合的抗体的合成单结构域抗体基因克隆到pLenti载体中，并使用Sanger测序确认该构建体。CAR构建体含有信号肽(例如CD8信号肽)、铰链(例如CD8α茎)、跨膜结构域(例如CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域)，以及信号传导结构域(例如，4-1BB共刺激结构域或CD3ζ信号传导结构域)和抗CEA6-sdAb。
为了监测CAR表达水平，也可以对CAR质粒的表达盒进行工程化以表达荧光eGFP+T2A自切割肽序列。可选地，截短的CD19或截短的EGFR盒可用于通过抗体检测进行监测。可在GenBank上访问人类序列(例如CD8、4-1BB、CD3ζ)。
病毒产生和滴定
为了用抗CEA6 CAR构建体产生慢病毒，用CAR转基因编码pLenti转移质粒和一种或多种必要的包装质粒(即编码Gag、Pol、Rev、VSVG和任选的Tat)共转染人胚胎肾293T(HEK293T)细胞。在转染后48或72小时收集HEK293T培养物的上清液，离心，并用0.45μm过滤器过滤。
在用稀释的慢病毒集合物转导的Jurkat细胞中进行病毒滴定。48小时后，用生物素化的重组蛋白L和藻红蛋白(PE)缀合的链霉亲和素对转导的Jurkat细胞进行染色，并通过流式细胞术测量抗CEA6 CAR的丰度。
T细胞转导和扩增
通过用Lymphoprep试剂(StemCell Technologies)进行密度梯度离心，从健康人供体的外周血中分离人PBMC。将PBMC以1×106个细胞/mL重悬于具有10ng/mL IL-2(Novoprotein,GMP-CD66)和10ng/mL IL-7(Novoprotein,GMP-CD47)的X-VIVO 15无血清造血培养基(Lonza,04-418QCN)中。用50ng/mL抗CD3抗体(Novoprotein,GMP-A018)刺激PBMC24小时。然后，用抗CEA6 CAR慢病毒(以1-10的MOI)转导PBMC，并在合适的烧瓶中，于补充有10％胎牛血清的RPMI 1640基础培养基中扩增9-10天。在任何测定之前，将T细胞在37℃下静息24小时。在用抗CD3抗体初始刺激PBMC后12或14天，测量CAR表面水平、CD3和CD4/CD8比率(使用来自Biolegend的抗体，317344、301012和317412)。
T细胞冷冻保存和解冻
在CAR-T扩增14天后，离心抗CEA6 CAR-T细胞并丢弃上清液。以5×107个细胞/mL的活细胞密度将细胞沉淀重悬于冷冻的CryoStor CS10(StemCell Technologies,07930)中。将等分的细胞悬浮液分配到冷冻小瓶中。冷冻小瓶以1℃/分钟降低速度冷却。将冷冻的细胞转移到液氮中。
为了解冻，轻轻搅拌下将细胞在37℃水浴中快速解冻。将解冻的细胞转移到50mL锥形管中，并通过逐滴加入20mL新鲜生长培养基进行洗涤。将细胞离心并以1×106个细胞/mL的细胞密度重悬于X-VIVO 15培养基中。
细胞毒性测定
通过标准的基于荧光素酶的测定确定抗CEA6 CAR T细胞的细胞毒性。简言之，在X-VIVO 15培养基中，使用具有于每孔100μL总体积中的2×104个靶细胞的白壁96孔板，以所示的效应物：靶标比例，以一式三份将表达萤火虫萤光素酶的靶细胞与CAR-T细胞一起共培养。以相同的细胞密度接种仅作为对照的靶细胞。共培养48小时后，将100μL萤光素酶底物(ONE-Glo,Promega)直接加入每个孔中。用发光板读取仪检测发射的光。
在类似的基于荧光素酶的细胞毒性测定中，在细胞培养基(如RPMI)中制备经工程化以过表达荧光素酶的靶癌症细胞，并在100μL/孔的体积中以5×104个至5×106个细胞将其接种到96孔板上，并在37℃下孵育24小时。然后，以100μL/孔将CAR T细胞以不同效应物：靶标(E:T)比例(例如，5:1、1:1和1:5)接种在具有CAR T细胞的相应孔中。然后将共培养物在37℃下孵育24或48小时。随后，根据制造商的说明，使用板读取仪，用萤光素酶测定系统(Promega,E1501)处理细胞。使用BioTek Synergy H4杂合微孔板读取仪，在端点模式下读取发光10秒。使用洋地黄皂苷处理的细胞的荧光素酶活性作为最大细胞死亡，并且未处理的细胞作为自发细胞死亡，使用公式％特异性裂解＝100％×[(实验发光–自发细胞死亡发光)/(最大细胞死亡发光–自发细胞死亡发光)]，计算特异性裂解的百分比。
关于示例性荧光素酶细胞毒性测定的另外的信息可以发现于Matta等人，“Development and characterization of a novel luciferase based cytotoxicityassay”Scientific Reports(2018)8,199中，其在此通过引用整体明确地并入本文中。
IFN-γ评估
在6孔组织培养板中，以所示的效应物：靶细胞比率将1×106个/孔的抗CEA6 CART细胞用靶细胞刺激24小时。使用人IL-2ELISA试剂盒II(BD,550611)和人IFN-γELISA试剂盒II(BD,550612)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对干扰素-γ(IFN-γ)和IL-2分泌进行定量。
CD25/CD69测定
在6孔组织培养板中，以所示的效应物：靶细胞比率，将1×106个/孔的抗CEA6 CART细胞用靶细胞刺激24小时。用活/死可固定近红外死细胞染色试剂盒(LIVE/DEAD FixableNear-IR Dead Cell Stain Kit，ThermoFisher)以标记死细胞和抗CD3对细胞染色，并通过流式细胞术将CAR-T细胞鉴定为CD3+GFP+细胞。用Alexa Fluor 700抗人CD69抗体(Biolegend)和PE抗CD25抗体(Biolegend)对CAR-T细胞上的CD69和CD25染色。
对CAR T细胞文库测序
从抗CEA6 CAR-T文库筛选中收集细胞。使用血液/细胞基因组DNA微型试剂盒(Tiangen,DP304-03)提取基因组DNA(gDNA)。将75ng的gDNA用于PCT以扩增文库的CAR区域。用TA/Blunt-Zero克隆试剂盒(Vazyme,C601)对扩增的区域进行TA克隆并测序。
实施例2.示例性抗CEA6 CAR T细胞系针对癌症是有效的
从本文所公开的抗CEA6结合物制备几种抗CEA6 CAR T细胞系。在从两种供体分离的T细胞中表达构建体，表示为Z0016和Y1287。以1:5、1:1和5:1的效应物：靶标比率，按实施例1中所述进行细胞毒性测定。这些抗CEA6 CAR T细胞系显示出针对MKN-45胃癌细胞(图2A-B)、BxPC-3胰腺癌细胞(图2C-D)和Capan-1胰腺癌细胞(图2E-F)的细胞毒性效力。将未转染的T细胞(UNT)用作阴性对照。
在体内NSG小鼠模型中测试示例性的抗CEA6 CAR T细胞系B4T2-001。在细胞系来源的异种移植模型中，施用B4T2-001导致胃癌、非小细胞肺癌和胰腺肿瘤的异种移植物的大幅清除，而对照小鼠中的肿瘤生长出现进展(图3A)。在原位胰腺癌模型中，23天的B4T2-001处理导致胰腺肿瘤的强大清除(如通过荧光素酶发光检测的)，而对照小鼠没有表现出肿瘤大小的减小(图3B)。在患者来源的结直肠癌的异种移植(PDX)中，用B4T2-001处理的小鼠早在42天就表现出肿瘤清除。
进行使用抗CEA6 CAR T细胞系B4T2-001的肿瘤再激发研究，且结果如图4所示。在第0天向胰腺肿瘤模型施用初始CAR T细胞输注。虽然对照小鼠表现出不受限制的肿瘤生长，但施用B4T2-001的小鼠早在第19天就表现出无法检测到的肿瘤体积。在检测到B4T2-001 T细胞的存在约为每100μL血液100个细胞的第87天，将第二肿瘤移植到同一小鼠中。观察到抗CEA6 CAR T细胞的快速再扩增，并且在大约第107天达到峰值体积的再移植肿瘤在约第120天被完全清除。这表明B4T2-001在显著量的时间内保持持续性，并且能够驱动二次完全应答。
实施例3.用于治疗癌症的抗CEA6 CAR-T细胞
患者患有癌症，例如表达或过度表达CEA6的癌症(例如，使得CEA6可以被用作检测和靶向癌症的生物标志物)。在一些情况下，癌症是乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、脑癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、头颈癌、胆囊癌、血液恶性肿瘤或以上的任意组合。在一些情况下，血液系统恶性肿瘤可以包括白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
本文所公开的一种或多种CAR T细胞(其可包括抗CEA6CAR和/或抗CEA6结合物中的任一种或多种)经肠道、经口、鼻内、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、心室内、皮内、病灶内、颅内、鞘内或皮下施用于患者。
CAR T细胞以每剂量104、105、106、107、108或109个细胞，或者每剂量在由任意两个上述细胞限定的范围内的任意数量的细胞，或者由受过训练的医疗从业人员确定的有效和/或安全的任意数量的细胞的量，作为剂量施用。每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、24天、36天或48天、或数周、或者在由任意两个上述时间限定的范围内的任何时间，或者由受过训练的医疗从业人员确定的有效和/或安全的任何剂量时间施用剂量。
施用一剂或多剂CAR T细胞后，在患者中观察到癌症或其症状的改善。CAR T细胞的施用可与另一癌症疗法一起进行，包括但不限于免疫治疗、化疗、放射疗法、手术、光动力疗法或靶向疗法。
在至少一些先前描述的实施方案中，实施方案中所使用的一个或多个元素可以在另一实施方案中互换使用，除非此类替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他省略、添加和修改。所有此类的修改和改变旨在落入所附权利要求所限定的主题的范围内。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以视上下文和/或应用情况从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，本文可能明确地阐述各种单数/复数排列。
本领域技术人员将理解，一般而言，本文中所使用的术语，且特别是在所附权利要求中(例如，所附权利要求的主体)，通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括(including)”应被解释为“包括但不限于(including but not limited to)”，术语“具有(having)”应被理解为“至少具有”，术语“包括(includes)”应被解释为“包含但不限于(includes but is not limited to)”等)。本领域的技术人员还将理解，如果旨在特定数量的引入的权利要求陈述，则在权利要求中将明确地陈述此类意图，并且在没有此类陈述的情况下，不存在此类意图。例如，作为对理解的帮助，以下所附权利要求可以含有引入性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用，以引入权利要求陈述。然而，这些短语的使用不应被解释为暗示通过不定冠词“一个/种(a)”或“一个/种(an)”引入的权利要求陈述将含有此类引入的权利要求陈述的任何特定权利要求限制为仅含有一种此类陈述的实施方案，即使当同一权利要求包括引入性短语“一个或多个”或“至少一个”以及不定冠词如“一个/种(a)”或“一个/种(an)”(例如，“一个/种(a)”和/或“一个/种(an)”应解释为意指“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”)；用于引入权利要求陈述的定冠词的使用同样如此。另外，即使明确地陈述了特定数量的引入的权利要求陈述，本领域技术人员也会认识到，此类陈述应该被解释为意指至少所陈述的数量(例如，没有其他修饰语的“两个陈述物”的裸陈述意指至少两个陈述物，或者两个或更多个陈述物)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常，此类构造旨在为本领域技术人员将理解该惯例的含义(例如，“具有A、B和C中的至少一种的系统”将包括但不限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、A和B一起、A和C一起、B和C一起和/或A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常，此类构造旨在为本领域技术人员将理解该惯例的含义(例如，“具有A、B或C中的至少一种的系统”将包括但不限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、A和B一起、A和C一起、B和C一起和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员还将理解，实际上，任何呈现两个或更多个替代术语的转折词语和/或短语，无论是在说明书、权利要求书还是附图中，都应该被理解为考虑包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”、或“A和B”的可能性。
另外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此是根据马库什组的任何单个成员或成员的亚组来描述的。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，如就提供书面描述而言，本文所公开的所有范围也包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并使得相同的范围能够被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文所讨论的每个范围都可以容易地被分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，诸如“多达(up to)”、“至少(at least)”、“大于(greater than)”、“小于(less than)”等的所有语言都包括所陈述的数字，并且指的是随后可以分解成如上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组指的是具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组指的是具有1、2、3、4或5个物品的组，等等。
虽然本文公开了不同的方面和实施方案，但其他方面和实施方案对本领域技术人员来说是显而易见的。本文所公开的不同方面和实施方案仅用于说明目的，并非旨在限制，真正的范围和精神由以下权利要求指示。
本文引用的所有参考文献，包括但不限于已发表和未发表的申请、专利和文献参考文献，均通过引用整体并入本文中，并在此构成本说明书的一部分。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相矛盾的情况下，说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
序列表
CEA6序列
序列表
<110> 博奥阿迪斯生物科技公司(BioArdis, LLC)
<120> CEA6结合分子及其用途
<130> BWGB.005WO
<150> US 63/127885
<151> 2020-12-18
<150> US 63/262312
<151> 2021-10-08
<160> 172
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> Cap01+02-CEA6-Bio-R2-11 HCDR2
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<220>
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 57
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<223> Cap03+04-CEA6-R2-7 HCDR2
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<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-9 HCDR2
<400> 59
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1 5
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-10 HCDR2
<400> 60
Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-11/8 HCDR2
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<211> 8
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<220>
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<220>
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<211> 8
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<210> 91
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEA6-A08 HCDR3
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap01+02-CEA6-Bio-R2-11 HCDR3
<400> 97
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1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-2/5 HCDR3
<400> 99
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1 5 10 15
Tyr
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-4 HCDR3
<400> 100
Ala Ala Trp Pro Tyr Val Gln Asp Arg Ala Thr Leu Leu Ala His Asn
1 5 10 15
Tyr
<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-7 HCDR3
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Ala Ala Ile Glu Asp Val Leu Trp His Asn Tyr
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-9 HCDR3
<400> 102
Ala Ala Gln Asp Lys Val Arg Pro Thr Leu Lys Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 103
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-10 HCDR3
<400> 103
Ala Ala Gly Val Met Val Tyr Val Val Thr Asp His Gln Arg Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 104
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-11/8 HCDR3
<400> 104
Ala Val Val Val Ser Phe Ser Thr Glu Tyr Gly Ser Tyr Val Tyr Tyr
1 5 10 15
Gly Tyr Asp Tyr
20
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-13/6 HCDR3
<400> 105
Ala Val Thr Arg Thr Ala Ile Thr Leu Glu Gln Val Gln Gln Tyr Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 106
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-15 HCDR3
<400> 106
Ala Ala Lys Glu Trp Asp Lys Asp Ala Thr Thr Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-16 HCDR3
<400> 107
Ala Ala Thr Tyr Ser Pro Pro Ile Gln Met Met Ser His His Phe Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 108
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-19 HCDR3
<400> 108
Ala Ala Met Glu Lys Ser Lys Pro Ser Leu Asp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 109
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R3-12 HCDR3
<400> 109
Ala Val Arg Arg Trp Gly Gly Tyr Asp Ala Tyr Arg Ser Asp Glu Thr
1 5 10 15
Arg Tyr Tyr Tyr Ser Tyr
20
<210> 110
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R3-15 HCDR3
<400> 110
Ala Ala Ser Arg Ala Leu Val Ser Val Gln Gln His Glu Gly Phe Asn
1 5 10 15
Tyr
<210> 111
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R3-39/19 HCDR3
<400> 111
Ala Ala Ser Gly Ala Thr Val Asp Val Ala Asp Ala Ser Ser Tyr Asn
1 5 10 15
Tyr
<210> 112
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R3-1 HCDR3
<400> 112
Ala Ala Gly Ile Arg Met Ile Thr Ile Glu His Trp Asn Lys Tyr Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 113
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R3-11 HCDR3
<400> 113
Ala Ala Ser Ala Pro Gly Pro Ser Leu Thr Val Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 114
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap01+02-CEA6-Bio-R2-1 HCDR3
<400> 114
Ala Ala Asn Thr Gly His Ser Asp Phe Ser Tyr
1 5 10
<210> 115
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap01+02-CEA6-R3-32 HCDR3
<400> 115
Ala Ala Asn Thr Gly His Ser Ala Ser Ser His Asn Tyr
1 5 10
<210> 116
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-17/3 HCDR3
<400> 116
Ala Ala Ala Lys Thr Ala Leu Thr Trp Tyr Asn Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEA6-细胞-R3-65 HCDR3
<400> 117
Ala Ala Asn Thr Gly His Ser Asp Phe Ser Tyr
1 5 10
<210> 118
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEA6-细胞-R3-66 HCDR3
<400> 118
Ala Ala Asn Thr Gly His Ser Ala Ser Ser His Asn Tyr
1 5 10
<210> 119
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-10-41BB HCDR3
<400> 119
Ala Val Thr Arg Thr Ala Ile Thr Leu Glu Gln Val Gln Gln Tyr Ser
1 5 10 15
Tyr
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-2-41BB HCDR3
<400> 120
Ala Asn Thr Gly Phe Ser Ser Leu Ser Tyr
1 5 10
<210> 121
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-3-41BB HCDR3
<400> 121
Ala Val Leu Pro Phe Pro Trp Asn Met Gln Tyr Gly Tyr
1 5 10
<210> 122
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-3-BC141BB HCDR3
<400> 122
Ala Asn Thr Gly His Ser Asp Phe Ser Tyr
1 5 10
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-6-41BB HCDR3
<400> 123
Ala Ile Glu Asp Val Leu Trp His Asn Tyr
1 5 10
<210> 124
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-7-BC141BB HCDR3
<400> 124
Ala Asn Thr Gly His Ser Ala Ser Ser His Asn Tyr
1 5 10
<210> 125
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-8-41BB HCDR3
<400> 125
Ala Gly Val Met Val Tyr Val Val Thr Asp His Gln Arg Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 126
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-8-CP3-41BB HCDR3
<400> 126
Ala Ala Ser Thr Thr Phe Ser Ser His Asn Tyr
1 5 10
<210> 127
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-M-1 HCDR3
<400> 127
Ala Gly Ile Arg Met Ile Thr Ile Glu His Trp Asn Lys Tyr Ser Tyr
1 5 10 15
<210> 128
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-M-2 HCDR3
<400> 128
Ala Asn Thr Gly His Ser Asp Phe Ser Tyr
1 5 10
<210> 129
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-M-3 HCDR3
<400> 129
Ala Gly Ile Arg Met Ile Thr Ile Glu His Trp Asn Lys Tyr Ser Tyr
1 5 10 15
<210> 130
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEA6-H01 VH
<400> 130
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Tyr Ser Tyr Tyr
20 25 30
His Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Arg Pro Met Ile Thr His Ser Leu Met Tyr Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 131
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEA6-F02 VH
<400> 131
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Tyr Ser Phe Tyr
20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ile Arg Met Ile Thr Ile Glu His Trp Asn Lys Tyr Ser
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 132
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEA6-F06 VH
<400> 132
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Thr Ile Asn Ser Phe Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asn Thr Gly His Ser Asp Phe Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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1 5 10 15
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20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Lys Thr Ala Leu Thr Trp Tyr Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
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1 5 10 15
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20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
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50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
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1 5 10 15
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Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
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35 40 45
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65 70 75 80
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Tyr Ser Phe Asn
20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Phe Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
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20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
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50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
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50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Asp Phe Tyr
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Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
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Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<211> 121
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20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
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Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ser
<210> 153
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 153
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
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Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 154
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R3-39/19 VH
<400> 154
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Asn Phe Tyr
20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Gly Ala Thr Val Asp Val Ala Asp Ala Ser Ser Tyr Asn
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Cys
115 120
<210> 155
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 155
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Tyr Ser Phe Tyr
20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ile Arg Met Ile Thr Ile Glu His Trp Asn Lys Tyr Ser
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 156
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R3-11 VH
<400> 156
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Ser Phe Asn
20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Ala Pro Gly Pro Ser Leu Thr Val Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 157
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap01+02-CEA6-Bio-R2-1 VH
<400> 157
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Thr Ile Asn Ser Phe Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asn Thr Gly His Ser Asp Phe Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 158
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap01+02-CEA6-R3-32 VH
<400> 158
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Phe Asn
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Thr Ile Ser Trp Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asn Thr Gly His Ser Ala Ser Ser His Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 159
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cap03+04-CEA6-R2-17/3 VH
<400> 159
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Ser Phe Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Lys Thr Ala Leu Thr Trp Tyr Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 160
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEA6-细胞-R3-65 VH
<400> 160
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Thr Ile Asn Ser Phe Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asn Thr Gly His Ser Asp Phe Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 161
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEA6-细胞-R3-66 VH
<400> 161
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Phe Asn
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Thr Ile Ser Trp Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Asn Thr Gly His Ser Ala Ser Ser His Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 162
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-10-41BB VH
<400> 162
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Tyr Ser Phe Tyr
20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Thr Arg Thr Ala Ile Thr Leu Glu Gln Val Gln Gln Tyr Ser
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 163
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-2-41BB VH
<400> 163
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Ser Asp Ile Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ser Ile Asn Ser Tyr Ala Asp Ile Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Asn Thr Gly Phe Ser Ser Leu Ser Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 164
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-3-41BB VH
<400> 164
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp Asn Tyr
20 25 30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Asp Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Leu Pro Phe Pro Trp Asn Met Gln Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 165
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-3-BC141BB VH
<400> 165
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Thr Ile Asn Ser Phe Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Asn Thr Gly His Ser Asp Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 166
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-6-41BB VH
<400> 166
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
20 25 30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Glu Asp Val Leu Trp His Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 167
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-7-BC141BB VH
<400> 167
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Phe Asn
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Thr Ile Ser Trp Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Asn Thr Gly His Ser Ala Ser Ser His Asn Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 168
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-8-41BB VH
<400> 168
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Tyr Ser Phe Asn
20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Val Met Val Tyr Val Val Thr Asp His Gln Arg Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 169
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-8-CP3-41BB VH
<400> 169
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Gly Asn Asp Tyr
20 25 30
Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Thr Thr Phe Ser Ser His Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 170
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-M-1 VH
<400> 170
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Tyr Ser Phe Tyr
20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Ile Arg Met Ile Thr Ile Glu His Trp Asn Lys Tyr Ser Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 171
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-M-2 VH
<400> 171
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Tyr Ser Phe Tyr
20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Thr Gly His Ser Asp Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 172
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H002-M-3 VH
<400> 172
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Ser Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Thr Ile Asn Ser Phe Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp
50 55 60
Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gly Ile Arg Met Ile Thr Ile Glu His Trp Asn Lys Tyr
100 105 110
Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

Claims (19)

1.癌胚抗原6(CEA6)结合多肽，其包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的免疫球蛋白重链可变结构域，其中：
所述CDR-H1包含与选自SEQ ID NO:1-43的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列；
所述CDR-H2包含与选自SEQ ID NO:44-86的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列；并且
所述CDR-H3包含与选自SEQ ID NO:87-129的序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。
2.如权利要求1所述的CEA6结合多肽，其中：
1)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:1的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:44的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:87的序列；
2)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:2的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:45的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:88的序列；
3)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:3的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:46的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:89的序列；
4)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:4的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:47的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:90的序列；
5)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:5的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:48的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:91的序列；
6)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:6的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:49的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:92的序列；
7)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:7的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:50的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:93的序列；
8)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:8的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:51的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:94的序列；
9)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:9的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:52的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:95的序列；
10)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:10的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:53的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:96的序列；
11)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:11的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:54的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:97的序列；
12)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:12的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:55的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:98的序列；
13)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:13的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:56的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:99的序列；
14)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:14的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:57的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:100的序列；
15)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:15的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:58的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:101的序列；
16)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:16的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:59的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:102的序列；
17)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:17的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:60的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:103的序列；
18)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:18的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:61的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:104的序列；
19)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:19的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:62的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:105的序列；
20)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:20的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:63的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:106的序列；
21)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:21的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:64的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:107的序列；
22)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:22的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:65的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:108的序列；
23)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:23的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:66的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:109的序列；
24)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:24的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:67的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:110的序列；
25)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:25的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:68的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:111的序列；
26)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:26的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:69的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:112的序列；
27)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:27的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:70的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:113的序列；
28)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:28的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:71的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:114的序列；
29)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:29的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:72的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:115的序列；
30)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:30的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:73的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:116的序列；
31)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:31的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:74的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:117的序列；
32)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:32的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:75的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:118的序列；
33)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:33的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:76的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:119的序列；
34)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:34的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:77的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:120的序列；
35)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:35的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:78的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:121的序列；
36)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:36的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:79的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:122的序列；
37)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:37的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:80的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:123的序列；
38)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:38的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:81的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:124的序列；
39)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:39的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:82的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:125的序列；
40)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:40的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:83的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:126的序列；
41)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:41的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:84的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:127的序列；
42)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:42的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:85的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:128的序列；或者
43)所述CDR-H1包含SEQ ID NO:43的序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO:86的序列，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO:129的序列。
3.如权利要求1或2所述的CEA6结合多肽，其中所述重链可变结构域包含与选自SEQ IDNO:130-172的任意序列具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的CEA6结合多肽，其中所述CEA6结合多肽是人源化的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的CEA6结合多肽，其中所述CEA6结合多肽是单结构域抗体(sdAb)。
6.嵌合抗原受体(CAR)，其包含权利要求1-5中任一项所述的CEA6结合多肽。
7.嵌合抗原受体(CAR)细胞，其包含权利要求6所述的CAR。
8.如权利要求7所述的CAR细胞，其中所述CAR细胞是CAR T细胞。
9.如权利要求7或8所述的CAR细胞，其中所述CAR细胞包含至少两个结合多肽，并且所述CAR细胞是多价CAR细胞。
10.如权利要求7-9中任一项所述的CAR细胞，其中所述CAR细胞来源于对象或细胞系。
11.如权利要求10所述的CAR细胞，其中所述对象患有癌症。
12.如权利要求11所述的CAR细胞，其中所述癌症是乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、脑癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、头颈癌、胆囊癌、血液恶性肿瘤或以上的任意组合。
13.编码多肽的核酸，所述多肽包含与权利要求1-5中任一项所述的CEA6结合多肽或权利要求6所述的CAR具有至少90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。
14.治疗有需要的对象的癌症的方法，其包括施用权利要求7-12中任一项所述的CAR细胞。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述嵌合抗原受体细胞对于所述对象是自体同源的或同种异体的。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、脑癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、头颈癌、胆囊癌、血液恶性肿瘤或以上的任意组合。
19.如权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体细胞经肠胃外施用。
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