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KR20230104203A - 치료용 방사성표지된 나노입자 및 이의 사용 방법 - Google Patents

치료용 방사성표지된 나노입자 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20230104203A
KR20230104203A KR1020237018427A KR20237018427A KR20230104203A KR 20230104203 A KR20230104203 A KR 20230104203A KR 1020237018427 A KR1020237018427 A KR 1020237018427A KR 20237018427 A KR20237018427 A KR 20237018427A KR 20230104203 A KR20230104203 A KR 20230104203A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
therapeutic
subject
nanoparticles
nanoparticle
cancer
Prior art date
Application number
KR1020237018427A
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English (en)
Inventor
마리안 르 퍼
병희 유
즈드라브카 메다로바
세르게이 슈바에브
피터 카라반
Original Assignee
더 제너럴 하스피탈 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 filed Critical 더 제너럴 하스피탈 코포레이션
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Abstract

방사성표지, 치료용 나노입자 및 방사성표지에 공유결합적으로 연결된 킬레이트제, 및 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결된 핵산 분자를 포함하는 치료용 나노입자가 본원에 제공된다. 치료용 나노입자는 약 10 나노미터 (nm) 내지 약 30 nm의 직경을 갖고, 치료용 나노입자는 자성이다. 또한, 이들 치료용 나노입자를 함유하는 제약 조성물이 제공된다. 또한, 암을 갖는 대상체에서 암 세포 침윤 또는 전이를 감소시키는 방법 및 대상체에게 이들 치료용 나노입자의 투여를 필요로 하는 대상체의 림프절에서 전이성 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 대상체에서 전이성 암 조직을 검출, 진단 및/또는 모니터링하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 이들 치료용 나노입자를 제조하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

치료용 방사성표지된 나노입자 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 11월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 63/109,298의 이익을 주장한다. 전술한 내용 전체는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방 정부 지원 연구 또는 개발
본 발명은 미국 국립보건원의 국립암연구소에서 수여한 승인 번호 CA16346101 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
기술분야
본 개시내용은 중합체 코팅 및 공유결합적으로 연결된 억제성 핵산을 포함하는 치료용 방사성표지된 나노입자, 이들 치료용 나노입자를 함유하는 조성물, 이들 치료용 나노입자를 사용하는 방법, 및 이들 치료용 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
원발성 종양 세포를 향해 표적화된 통상적인 요법은 종종 전이성 세포에 영향을 미치지 않으며 실제로 전이를 촉진할 수 있다. 이는 동일한 기원의 장기의 편재화된 암을 갖는 환자의 양호한 예후에도 불구하고 전이성 질환으로 진단된 환자의 불량한 결과를 설명한다 (Steeg P.S. Nat. Rev. Cancer. 2016; 16:201-218). 이들 이유로, 전이성 종양 세포의 독특한 특성에 특이적인 요법이 필요하다. 이들 세포는 원발성 종양 덩어리에서 벗어나 순환을 통해 이동하고 전이 프로세스에서 새로운 중요한 장기를 콜로니화하는 능력을 갖는다. 중요하게는, 이들 세포는 종양 덩어리에 있는 대부분의 세포와 유전적으로 및 표현형적으로 구별되어, 각각의 원발성 종양으로부터 유전자 발현 프로파일이 분기된 전이성 병변을 생성한다.
요약
본 개시내용의 특정 측면은 방사성표지; 치료용 나노입자 및 방사성표지에 공유결합적으로 연결된 킬레이트제; 및 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결된 핵산 분자를 포함하는 치료용 나노입자에 관한 것이며, 여기서 치료용 나노입자는 약 10 나노미터 (nm) 내지 약 30 nm의 직경을 갖고, 여기서 치료용 나노입자는 자성이다.
일부 실시양태에서, 킬레이트제는 이차 아민을 포함하는 화학적 모이어티를 통해 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 킬레이트제는 1,4,7-트리아자시클로노난,1-글루타르산-4,7-아세트산 (NODAGA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 킬레이트제는 DOTA, DOTA-GA, p-SCN-Bn-DOTA, CB-TE2A, CB-TE1A1P, AAZTA, MeCOSar, p-SCN-Bn-NOTA, NOTA, HBED-CC, THP, MAS3, DFO 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 구리-64 (Cu-64)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 구리-67 (Cu-67), 이트륨-90 (Y-90), 테르븀-161 (Tb-161), 루테튬-177 (Lu-177), 비스무트-231 (Bi-213), 납-212 (Pb-212), 악티늄-225 (Ac-225), 지르코늄-89 (Zr) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 잠금 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 안타고미르(antagomir)이다. 일부 실시양태에서, 안타고미르는 마이크로RNA-10b (miR-10b)를 억제한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 디술피드 결합을 포함하는 화학적 모이어티를 통해 나노입자에 공유결합적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 산화철 코어를 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 중합체 코팅을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체 코팅은 덱스트란을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 치료용 나노입자를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 주사제, 정제, 동결건조 분말, 현탁액 또는 이들의 임의의 조합인 투여 형태로 제형화된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 치료용 나노입자를 암을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체에서 암 세포 침윤 또는 전이를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 치료용 나노입자는 대상체에서 암 세포 침윤 또는 전이를 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 약 0.014 mg/kg 미만인 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 암 세포 전이는 대상체에서 원발성 종양으로부터 림프절로의 전이이거나, 대상체에서 림프절로부터 이차 조직으로의 전이이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 유방암 세포, 결장암 세포, 신장암 세포, 폐암 세포, 피부암 세포, 난소암 세포, 췌장암 세포, 전립선암 세포, 직장암 세포, 위암 세포, 갑상선암 세포 및 자궁암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서 암 세포의 위치 또는 수 또는 대상체에서 치료용 나노입자의 위치를 결정하기 위해 대상체의 조직을 영상화하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 치료용 나노입자를 전이성 암을 갖는 대상체의 림프절에 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 림프절에서 전이성 암을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 치료용 나노입자는 대상체의 림프절에서 전이성 암을 치료하기에 충분한 양으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 전이성 암은 원발성 유방암으로부터 기인한다. 일부 실시양태에서, 투여는 대상체의 림프절에서 전이성 종양 크기의 감소 또는 안정화 또는 전이성 종양 성장 속도의 감소를 발생시킨다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상체에서 전이성 암 조직을 검출, 진단 및/또는 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 방법은 본원에 개시된 임의의 치료용 나노입자를 전이성 암 조직을 갖는 대상체에게 투여하는 단계; 및 치료용 나노입자를 영상화하는 단계를 포함하며, 여기서 치료용 나노입자는 대상체에서 치료용 나노입자를 영상화하기에 충분한 양으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 영상화는 자기 공명 영상화 (MRI), 양전자 방출 단층촬영 (PET), 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT), 컴퓨터 단층촬영 (CT) 또는 이들의 임의의 조합에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 대상체에게 2개 이상의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 적어도 주 1회 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 정맥내, 피하, 동맥내, 근육내 또는 복강내 투여에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 화학요법제를 추가로 투여받는다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 치료용 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것이며, 방법은 하기를 포함한다: 자성 나노입자를 제조하는 단계; 핵산 분자를 자성 나노입자에 공유결합적으로 연결하는 단계; 자성 나노입자당 약 40 킬레이트제 당량의 비율로 자성 나노입자를 킬레이트제와 반응시킴으로써 킬레이트제를 자성 나노입자에 공유결합적으로 연결하는 단계; 자성 나노입자에 64CuCl2 용액을 첨가하는 단계; 및 64CuCl2 용액 및 자성 나노입자의 혼합물을 정제하여 치료용 나노입자를 생성하는 단계.
일부 실시양태에서, 킬레이트제를 자성 나노입자에 공유결합적으로 연결하는 단계는 약 0℃ 내지 약 8℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법은 64CuCl2 용액 및 자성 나노입자의 혼합물을 약 40℃ 내지 약 65℃의 온도에서 가열하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 약 10분 내지 약 30분 동안 가열된다.
용어 "자성"은 자기장에 반응하는 조성물을 설명하는데 사용된다. 자성 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 나노입자 조성물)의 비제한적인 예는 상자성, 초상자성, 강자성 또는 반자성인 물질을 함유할 수 있다. 자성 조성물의 비제한적인 예는 마그네타이트; 페라이트 (예를 들어, 망가니즈, 코발트 및 니켈의 페라이트); Fe(II) 산화물; 및 헤마타이트, 및 이들의 금속 합금의 군으로부터 선택된 금속 산화물을 함유한다. 추가 자성 물질은 본원에 기재되어 있으며 관련 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "반자성"은 1 이하이고 자기장에 의해 반발되는 상대적 자성 투과성을 갖는 조성물을 설명하는데 사용된다.
용어 "상자성"은 외부적으로 적용된 자기장의 존재 하에서만 자성 모멘트를 발생시키는 조성물을 설명하는데 사용된다.
용어 "강자성" 또는 "강자성"은 자기장에 매우 민감하고 외부적으로 적용된 자기장이 제거된 후에 자성 특성 (자성 모멘트)을 유지할 수 있는 조성물을 설명하는데 사용된다.
용어 "나노입자"는 약 2 nm 내지 약 200 nm (예를 들어, 10 nm 내지 200 nm, 2 nm 내지 100 nm, 2 nm 내지 40 nm, 2 nm 내지 30 nm, 2 nm 내지 20 nm, 2 nm 내지 15 nm, 100 nm 내지 200 nm, 및 150 nm 내지 200 nm)의 직경을 갖는 물체를 의미한다. 나노입자의 비제한적인 예는 본원에 기재된 나노입자를 포함한다.
용어 "자성 나노입자"는 자성 (본원에 정의된 바와 같음)인 나노입자 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 나노입자)를 의미한다. 자성 나노입자의 비제한적인 예는 본원에 기재되어 있다. 추가적인 자성 나노입자는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "핵산"은 임의의 단일- 또는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 또는 RNA, cDNA, 반합성 또는 합성 기원)를 의미한다. 용어 핵산은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 염기에서의 변형 및/또는 당에서의 변형을 함유함) 및/또는 2개의 뉴클레오티드를 연결하는 포스포디에스테르 결합에서의 변형을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 적어도 하나의 잠금 뉴클레오티드 (LNA)를 함유할 수 있다. 핵산의 비제한적인 예는 본원에 기재되어 있다. 핵산의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "변형된 뉴클레오티드"는 이의 염기에서의 적어도 하나의 변형 및/또는 이의 당 (리보스 또는 데옥시리보스)에서의 적어도 하나의 변형을 함유하는 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드를 의미한다. 변형된 뉴클레오티드는 또한 핵산 서열에서 2개의 인접한 뉴클레오티드 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 원자에서의 변형을 함유할 수 있다.
용어 "중합체 코팅"은 3차원 물체 (예를 들어, 자성 물질, 예컨대 금속 산화물을 함유하는 3차원 물체)의 표면에 적용된 적어도 하나의 중합체 (예를 들어, 덱스트란)의 적어도 하나의 분자층 (예를 들어, 균질 또는 비균질)을 의미한다. 중합체 코팅을 생성하기 위해 사용될 수 있는 중합체의 비제한적인 예는 본원에 기재되어 있다. 중합체 코팅을 생성하기 위해 사용될 수 있는 중합체의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 물체 (예를 들어, 자성 물질을 함유하는 3차원 물체)에 중합체 코팅을 적용하는 방법은 본원에 기재되어 있으며 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다.
어구 "암 세포 침윤"은 대상체에서 암 세포의 비암성 조직으로의 이동을 의미한다. 암 세포 침윤의 비제한적인 예는 암 세포의 림프절, 림프, 맥관계 (예를 들어, 혈관의 외막, 중막 또는 내막), 또는 상피 또는 내피 조직으로의 이동을 포함한다. 암 세포 침윤을 검출 및 결정하기 위한 예시적인 방법은 본원에 기재되어 있다. 암 세포 침윤을 검출 및 결정하기 위한 추가적인 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "전이"는 원발성 종양에 존재하는 암 세포의 대상체에서의 인접하지 않은 이차 조직으로의 이동을 의미한다. 전이의 비제한적인 예는 원발성 종양으로부터 림프절 (예를 들어, 국소 림프절), 뼈 조직, 폐 조직, 간 조직 및/또는 뇌 조직으로의 전이를 포함한다. 용어 전이는 또한 림프절에서 발견되는 전이성 암 세포의 이차 조직 (예를 들어, 뼈 조직, 간 조직 또는 뇌 조직)으로의 이동을 포함한다. 일부 비제한적인 실시양태에서, 원발성 종양에 존재하는 암 세포는 유방암 세포, 결장암 세포, 신장암 세포, 폐암 세포, 피부암 세포, 난소암 세포, 췌장암 세포, 전립선암 세포, 직장암 세포, 위암 세포, 갑상선암 세포 또는 자궁암 세포이다. 전이의 추가적인 측면 및 예는 관련 기술분야에 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있다.
용어 "원발성 종양"은 종양 진행이 시작되고 진행되어 암성 덩어리를 생성하는 해부학적 부위에 존재하는 종양을 의미한다. 일부 실시양태에서, 의사는 대상체에서 원발성 종양의 부위를 명확하게 식별하지 못할 수 있다.
용어 "전이성 종양"은 대상체의 원발성 종양으로부터 전이된 종양 세포로부터 기원된 대상체의 종양을 의미한다. 일부 실시양태에서, 의사는 대상체에서 원발성 종양의 부위를 명확하게 식별하지 못할 수 있다.
용어 "림프절"은 림프관에 의해 림프계에 연결된 B-림프구, T-림프구 및 대식세포를 포함한 다양한 세포를 함유하는 면역계의 작은 구형 또는 타원형 장기를 의미한다. 겨드랑이 림프절 (예를 들어, 측면 샘, 전방 또는 가슴 샘, 후방 또는 견갑하 샘, 중앙 또는 중간 샘, 또는 내측 또는 쇄골하 샘), 전초 림프절, 턱밑 림프절, 전방 경부 림프절, 후방 경부 림프절, 쇄골상 림프절, 턱끝밑 림프절, 대퇴부 림프절, 장간막 림프절, 종격 림프절, 서혜부 림프절, 세분절 림프절, 분절 림프절, 엽성 림프절, 엽간 림프절, 폐문 림프절, 활차상 샘, 삼각흉 샘, 표재 서혜부 림프절, 심부 서혜부 림프절, 상완 림프절 및 오금 림프절을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 림프절이 포유동물에 존재한다.
용어 "영상화"는 생물물리학적 기술 (예를 들어, 전자기 에너지 흡수 및/또는 방출)을 사용한 대상체의 적어도 하나의 조직의 시각화를 의미한다. 영상화의 비제한적인 실시양태는 자기 공명 영상화 (MRI), X선 컴퓨터 단층촬영 및 광학 영상화를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "대상체" 또는 "환자"는 예를 들어 실험적, 진단적, 예방적 및/또는 치료적 목적을 위해 본 개시내용의 조성물 또는 방법이 투여될 수 있는 임의의 포유동물 (예를 들어, 인간 또는 수의학 대상체, 예를 들어 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양, 마우스, 래트 또는 토끼)을 지칭한다. 대상체는 치료를 추구하거나 필요로 하거나, 치료를 필요로 할 수 있거나, 치료를 받고 있거나, 치료를 받을 예정이거나, 특정 질환 또는 병태에 대해 훈련된 전문가의 치료를 받고 있다.
명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나"는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 그러므로, 예를 들어 "나노입자"에 대한 언급은 나노입자의 혼합물을 포함하고, "나노입자"에 대한 언급은 2개 이상의 이러한 나노입자의 혼합물 등을 포함한다.
범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값 및/또는 "약" 또 다른 특정 값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현되는 경우, 또 다른 실시양태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 선행사 "약"을 사용하여 값이 근사치로 표현될 때, 특정 값이 또 다른 실시양태를 형성한다는 것이 이해될 것이다. 각각의 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여 그리고 다른 종점과는 독립적으로 유의하다는 것이 추가로 이해될 것이다.
용어 "화학요법제"는 암 세포 성장 속도를 감소시키거나 대상체 (예를 들어, 인간)에서 암 세포의 사멸 (예를 들어, 괴사 또는 아폽토시스)을 유도 또는 매개하기 위해 사용될 수 있는 분자를 의미한다. 비제한적인 예에서, 화학요법제는 소분자, 단백질 (예를 들어, 항체, 항체의 항원-결합 단편, 또는 이의 유도체 또는 접합체), 핵산 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 화학요법제의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 시클로포스파미드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 발루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포시드, 테니포시드, 타플루포시드, 아자시티딘, 악사티오프린, 카페시타빈, 시타라빈, 독시플루리딘, 플루오로우라실, 젬시타빈, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 티오구아닌, 블레오마이신, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 올트랜스 레티노산, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈 및 베바시주맙 (또는 이의 항원-결합 단편). 화학요법제의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
하기 개시된 실시양태는 중합체 코팅 및 공유결합적으로 연결된 억제성 핵산을 포함하는 치료용 방사성표지된 나노입자, 이들 치료용 나노입자를 함유하는 조성물, 이들 치료용 나노입자를 사용하는 방법, 및 이들 치료용 나노입자를 제조하는 방법을 포함한다. 본원에 기재된 치료용 나노입자, 조성물 및 방법의 일부 실시양태는 하기 장점 중 하나 이상을 제공할 수 있다.
첫째, 본 개시내용의 특정 실시양태는 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 (예를 들어, 암)의 치료, 예방, 진단 및/또는 영상화를 위해 임의의 나노입자 조성물을 사용하는 방법을 포함한다. 현재 치료 및/또는 진단 목적을 위해 전이성 조직에 유의하게 축적될 수 있는 개선된 치료제가 필요하다. 본 개시내용의 치료용 나노입자, 조성물 및 방법은 이러한 필요성을 다룬다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료용 나노입자는 전이성 조직에 축적될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 치료용 나노입자의 영상화 (예를 들어, 양전자 방출 단층촬영 (PET)을 통해)를 가능하게 하는 방사성표지를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 전이의 완전하고 지속적인 퇴행을 야기할 수 있는 억제성 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 치료용 나노입자는 전이성 조직을 효과적으로 표적화할 수 있다.
둘째, 본원에 기재된 일부 실시양태는 피코몰 이하 범위에 접근하는 민감도로 방사성표지된 약물의 농도를 결정하기에 충분한 민감도 (예를 들어, 영상화 기술로서 PET 사용)를 제공할 수 있다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 유리하게는 1 마이크로그램만큼 작은 용량을 투여하는 동안 검출 및/또는 영상화될 수 있다. 이러한 특징은 약물 개발의 초기 단계에서 유의한 장점을 갖는다. 이러한 저용량은 유해한 부작용을 유도하지 않기 때문에, 초기 인간 연구에 대한 미국 식품의약국의 승인은 치료제에 필요한 것보다 더 제한된 전임상 안전성 및 독성학 서류로 더 빨리 수득될 수 있다.
셋째, 본원에 기재된 일부 실시양태는 암 환자에서 치료용 나노입자의 생체분포를 명확히 할 수 있다. 암 치료제 개발의 직면한 주요 과제 중 하나는 표적 장기에 효과적으로 전달하는 것이다. 전이로의 약물 전달의 경우, 복잡한 인자는 동물 모델과 비교하여 병변의 더 큰 크기, 인간 질환의 이질성, 및 종간 혈역학적 변동성으로 인한 약물의 약동학의 차이를 포함한다. 이들 차이에 기초하여, 전임상 생체분포 및 효능 데이터로부터 치료제의 성공적인 임상 구현의 증거를 직접적으로 외삽하는 것은 불가능하다. 치료적 거대용량에 대한 치료적 미세용량의 필적하는 생체분포에 기초하여 (예를 들어, 도 11A-11D 참조), 본원에 기재된 특정 실시양태는 약 0.014 mg/kg 초과의 용량을 투여할 필요 없이 치료용 나노입자의 약동학적 거동을 밝힐 수 있고, 요법 동안 투여를 확립하는데 도움이 될 수 있고, 환자의 전이가 치료용 나노입자를 축적하는 것에 기초하여 치료할 환자를 선택하는 것을 가능하게 할 수 있다.
본 개시내용에서 범위의 관점에서 값이 기술되는 경우, 종점이 포함된다. 또한, 설명은 이러한 범위 내의 모든 가능한 하위 범위, 뿐만 아니라 특정 수치 값 또는 특정 하위 범위가 명시적으로 언급되는지 여부에 관계없이 이러한 범위 내에 속하는 특정 수치 값의 개시를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용의 특색의 다양한 실시양태가 본원에 기재되어 있다. 그러나, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공되며, 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 관련 기술분야의 통상의 기술자에 따라 수많은 변이, 변화 및 치환이 발생할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 기재된 특정 실시양태에 대한 다양한 대안은 또한 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 재료는 본원에 기재되어 있으며; 관련 기술분야에 공지된 기타 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목, 및 기타 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 충돌하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부사항은 첨부된 도면 및 하기 설명에 제시되어 있다. 본 발명의 다른 특색 및 장점은 하기 상세한 설명, 도면 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1A는 miRNA-10b를 표적화하는 안티센스 LNA 올리고뉴클레오티드 및 덱스트란-코팅을 갖는 예시적인 치료용 자성 나노입자 (MN-항-miR10b)를 보여주는 다이어그램이다. 도 1B는 MN-항-miR10b 또는 항-miR10b 핵산이 아닌 스크램블된 핵산을 함유하는 상응하는 자성 나노입자 (MN-scr-miR)와의 48시간 인큐베이션 후 인간 전이성 유방암 세포에서 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 결정된 miR-10b 발현 수준을 보여주는 그래프이다. 표시된 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시된다 (n = 3; **, p < 0.01).
도 2A는 포스페이트 버퍼 염수 (PBS) (음성 대조군), 저용량의 독소루비신 단독 (dox), 항-miR10b 핵산이 아닌 스크램블된 핵산을 함유하는 자성 나노입자 (MN-scr-miR), 스크램블된 핵산 및 저용량의 독소루비신을 함유하는 자성 나노입자 (MN-scr-miR + dox), MN-항-miR10b, 및 MN-항-miR10b 및 저용량 독소루비신 (MN-항-miR10b + dox)으로 처리한 후 48시간에 인간 전이성 유방암 세포의 세포 형태학을 보여주는 6개의 현미경사진 세트이다. 도 2B는 전술된 조건 각각에 대한 아폽토시스 세포의 퍼센트를 보여주는 그래프이다. 도 2C는 전술된 조건 각각에 대한 세포 증식의 퍼센트를 보여주는 그래프이다. 도 2D는 전술된 조건 각각에 대해 사전-G1 아폽토시스 및 G2/M 정지된 세포 집단을 보여주는 인간 전이성 유방암 세포의 유동 세포계측법 데이터의 6개의 그래프 세트이다. (데이터는 평균 ± 표준 편차를 나타냄; 양측 t-검정; n = 3).
도 3A는 miR-10b 녹아웃을 확인하는 겔 전기영동의 영상이다. 도 3B는 녹아웃 벡터 세트 (TALENs L+R)를 사용한 형질감염 후 24시간 및 72시간에 찍은 종양 세포의 6개의 현미경사진 세트이다.
도 4A는 MN-항-miR10b의 축적을 보여주는 전이를 갖는 절제된 장기의 생물발광 영상화 (BLI)를 사용하여 생성된 7개의 거시적 영상 세트 및 근적외선 형광 (NIRF) 영상화를 사용하여 생성된 7개의 거시적 영상 세트이다. 도 4B는 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색된 절제된 장기의 7개의 현미경사진 세트 및 Cy5.5로 형광으로 염색된 절제된 장기의 7개의 현미경사진 세트이다. 도 4C는 왼쪽에서 생체내 뇌 전이로의 MN-항-miR10b 전달의 BLI 및 NIRF 영상을 보여주고; 오른쪽에서 3개의 형광 현미경검사법 현미경사진은 루시퍼라제-발현 종양 세포에서 MN-항-miR10b의 축적 (MN 상의 Cy5.5)을 보여준다.
도 5A는 PBS (음성 대조군), 항-miR10b 핵산이 아닌 스크램블된 핵산을 함유하는 자성 나노입자 (MN-scr-miR), 스크램블된 핵산 및 저용량의 독소루비신을 함유하는 자성 나노입자 (MN-scr-miR + dox), MN-항-miR10b, 및 MN-항-miR10b 및 저용량 독소루비신 (MN-항-miR10b + dox)으로 처리된 동물에서 전이성 부담의 생물발광 영상 세트이다. 도 5B는 단지 4회 매주 처리 후 실험 동물의 림프절에서 전이성 부담의 완전한 퇴행을 나타내는 모든 처리 그룹으로부터의 전이성 부담의 정량적 분석을 보여주는 그래프이다. 백그라운드 카운트는 종양을 보유하지 않는 동물로부터 파생된다. 도 5C는 MN-항-miR10b + dox로 처리된 마우스에서 검출가능한 림프절 또는 폐 전이의 부재를 보여주는 생체외 장기의 생물발광 영상 및 사진 세트이다. 대조군 처리는 PBS, MN-scr-miR, MN-scr-miR + dox, 및 MN-항-miR10b를 포함하였다. 도 5D는 연구의 시간 경과 전체에 걸친 마우스의 체중을 보여주는 그래프이다. 도 5E는 PBS, MN-scr-miR, MN-scr-miR + dox, MN-항-miR10b, 및 MN-항-miR10b + dox로 처리된 마우스의 생존 확률을 보여주는 그래프이다. (데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타냄; 대상체내 ANOVA: p < 0.05. PBS, n = 2; MN-scr-miR, n = 6; MN-scrmiR+dox, n = 10; MN-항-miR10b, n = 7; MN-항-miR10b+dox, n = 10).
도 6A는 전이성 부담을 보여주는 마우스의 생물발광 영상 세트이다. 도 6B는 모든 처리 그룹에서 상대적 전이성 부담의 정량적 분석을 보여주는 그래프이다. 도 6C는 PBS, HD Dox, MN-scr-miR + dox, 및 MN-항-miR10b + dox로 처리된 마우스의 생존율을 보여주는 그래프이다. 도 6D는 MN-항-miR10b로 처리된 동물에서 폐 전이의 증거를 나타내지 않는 부검 후 폐의 3개의 영상 세트이다.
도 7은 nat/64Cu-MN-항-miR10b의 제조를 도시하는 개략도이다: 단계 1. NODAGA-MN을 형성하기 위한 MN-NH2 및 NODAGA-NHS 사이의 커플링 반응. 단계 2. 이종이관능성 링커인 SPDP를 사용한 관능화. 단계 3. NODAGA-MN-항-miR10b를 형성하기 위한 디술피드 연결을 통한 항-miR10b 안타고미르에 대한 접합. 단계 4. nat/64Cu-MN-항-miR10b를 유발하기 위한 natCuCl2 또는 64CuCl2와의 복합체화 반응.
도 8A는 iTLC에 의해 확인된 방사화학적 순도를 보여주는 그래프이다; (상단) 비표지된 Cu-64, (가운데) 64Cu-MN-항-miR10b 및 비표지된 Cu-64의 분리, 및 (하단) PD-10 정제 후 64Cu-MN-항-miR10b. 도 8B는 크기 배제 크로마토그래피를 사용한 64Cu-MN-항-miR10b의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 추적 (상단) 및 254 nm에서의 UV 추적 (하단)을 보여준다. 도 8C는 Cu-MN-항-miR10b 및 natCu-MN-항-miR10b의 2개의 투과 전자 현미경검사법 (TEM) 영상 세트이다. 도 8D는 TEM 및 동적 광 산란 (DLS)에 의해 특징화된 바와 같은 나노입자 크기를 보여주는 그래프이다. 도 8E는 유방 선암종 세포에 의한 시험관내 세포 흡수를 보여주는 그래프이다. 도 8F는 qRT-PCR에 의해 결정된 miR-10b 상대적 발현 수준을 보여주는 그래프이며, 이는 표적 결착 (miR-10b의 억제)을 입증한다. natCu는 natCu-MN-항-miR10b의 제조에 이용되었다 (t-검정, n = 3, **P < 0.01).
도 9는 MN-항-miR10b 나노입자의 방사성표지를 위한 개략적 예시적인 합성 경로이다.
도 10은 본 개시내용의 자성 방사성표지된 나노입자를 제조하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 킬레이트제 세트이다.
도 11A는 64Cu-MN-항-miR10b (%ID/g)의 미세용량의 투여 후 24 및 48시간에 측정된 생체외 생체분포를 보여주는 그래프이다. 도 11B는 64Cu-MN-항-miR10b의 치료용 담체-첨가된 거대용량의 투여 후 24 및 48시간에 측정된 생체외 생체분포를 보여주는 그래프이다 (%ID/g). 삽도는 간 및 비장에서의 %ID/g 값을 보여준다. #은 BLI에 의해 검출된 바와 같은 전이를 갖는 장기를 나타낸다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 도 11C 및 11D는 주사 후 24시간 (도 11C) 및 48시간 (도 11D)에 미세용량의 투여 후 수득된 비전이성 장기에서의 %ID/g 및 거대용량의 투여 후 수득된 %ID/g 사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다 (도 11C 및 11D 피어슨 곱적률 상관관계, 파선은 일치선에 상응함).
도 12A, 12B 및 12C는 64Cu-MN-항-miR10b의 미세용량을 투여받은 마우스 (n = 3)로부터의 심장 (도 12A), 신장 (도 12B) 및 간 (도 12C)에서 주사 후 5분 내지 48시간에 양전자 방출 단층촬영 (PET) 영상으로부터 수득된 시간-활성 곡선을 보여주는 그래프이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 13A는 주사 후 24시간에 측정된 미세용량 및 표준 치료 용량 (거대용량)으로 주사된 64Cu-MN-항-miR10b의 생체분포를 보여주는 그래프이다. 도 13B는 주사 후 48시간에 측정된 미세용량 및 표준 치료 용량 (거대용량)으로 주사된 64Cu-MN-항-miR10b의 생체분포를 보여주는 그래프이다. #은 BLI에 의해 검출된 바와 같은 전이를 갖는 장기를 나타낸다. 결과는 %ID/g로 표현된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. (t-검정, *P < 0.05, **P < 0.01).
도 14A는 64Cu-MN-항-miR10b의 미세용량 또는 거대용량의 주사 후 24시간에 전이성 유방 선암종을 보유하는 마우스의 생체내 PET-MRI 최대 강도 투사 (MIP) 영상 세트이다. 노란색 화살표는 뼈 또는 림프절 (LN) 전이를 가리킨다. 도 14B는 주사 후 24시간에 생체내 PET 영상으로부터 수득된 전이성 (Mets+) 및 비전이성 (Mets-) 장기에서 64Cu-MN-항-miR10b 축적의 정량화를 보여주는 그래프이다 (%ID/cc). 비전이성 장기와 비교하여 전이성 장기에서의 높은 신호 강도는 전이에 의한 치료제의 흡수를 확인한다. 열린 원은 미세용량을 주사받은 마우스를 나타내고, 닫힌 원은 거대용량을 주사받은 마우스를 나타낸다. 도 14C는 뼈 및 림프절 전이의 생체외 PET-MRI 영상 세트이다. 왼쪽부터: 전이성 병변의 생체내 BLI, 생체외 PET 및 생체외 백색광 사진. 도 14D는 미세용량 주사 후 48시간에 및 거대용량 주사 후 24시간에 PET에 의해 시각화된 바와 같은 64Cu-MN-항-miR10b의 생체분포의 생체외 영상 세트이다.
도 15는 전이성 (Mets+) 및 비전이성 뼈 (Mets-)에서 64Cu-MN-항-miR10b의 미세용량의 주사 후 5분 내지 48시간에 PET 영상화로부터 수득된 시간-활성 곡선을 보여주는 그래프이다 (n = 3).
상세한 설명
본원에 기재된 치료용 나노입자는 포유동물에서 암 전이를 검출하고 포유동물에서 암 세포 침윤 및 암 전이를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이들 활성을 갖는 치료용 나노입자, 뿐만 아니라 대상체에서 암 세포 침윤 또는 전이를 감소시키는 방법, 대상체의 림프절에서 전이성 암을 치료하는 방법, 및 이들 치료용 나노입자를 투여함으로써 대상체에서 전이성 암 조직을 검출, 진단 및/또는 모니터링하는 방법이 본원에 제공된다. 본 개시내용의 치료용 나노입자를 제조하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
조성물
치료용 나노입자 및 방사성표지에 공유결합적으로 연결된 킬레이트제, 및 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결된 핵산 분자를 포함하는 치료용 나노입자가 본원에 제공된다.
킬레이트제
본원에 기재된 치료용 나노입자는 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결된 적어도 하나의 킬레이트제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 킬레이트제는 방사성표지와 안정한 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 킬레이트제는 방사성표지에 결합한다.
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 각각의 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결된 약 1개 킬레이트제 내지 약 15개 킬레이트제 (예를 들어, 약 1개 킬레이트제 내지 약 11개 킬레이트제, 약 1개 킬레이트제 내지 약 12개 킬레이트제, 약 1개 킬레이트제 내지 약 13개 킬레이트제, 약 1개 킬레이트제 내지 약 14개 킬레이트제, 약 1개 킬레이트제 내지 약 15개 킬레이트제, 약 11개 킬레이트제 내지 약 12개 킬레이트제, 약 11개 킬레이트제 내지 약 13개 킬레이트제, 약 11개 킬레이트제 내지 약 14개 킬레이트제, 또는 약 11개 킬레이트제 내지 약 15개 킬레이트제)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 각각의 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결된 약 13개 킬레이트제를 포함할 수 있다.
치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결될 수 있는 다양한 상이한 킬레이트제는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 킬레이트제의 비제한적인 예는 1,4,7-트리아자시클로노난,1-글루타르산-4,7-아세트산 (NODAGA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라일)테트라아세트산 (DOTA), 10-(2,6-디옥소테트라히드로-2H-피란-3-일)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리일)트리아세트산 (DOTA-GA), 2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-6-[(4-이소티오시아나토페닐)메틸]-1,4,7,10-테트라자시클로도데크-1-일]아세트산 (p-SCN-Bn)-DOTA, 2,2'-(1,4,8,11-테트라아자바이시클로[6.6.2]헥사데칸-4,11-디일)디아세트산 (CB-TE2A), CB-TE1A1P, 1,4-비스(카르복시메틸)-6-[비스(카르복시메틸)]아미노-6-메틸퍼히드로-1,4-디아제핀 (AAZTA), 5-(8-메틸-3,6,10,13,16,19-헥사아자-바이시클로[6.6.6]이코산-1-일아미노)-5-옥소펜탄산 (MeCOSar), 2-S-(4-이소티오시아나토벤질)-1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산 (p-SCN-Bn)-NOTA, 1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산 (NOTA), N,N'-비스-[2-히드록시-5-(카르복시에틸)벤질]에틸렌디아민-N,N'-디아세트산) (HBED-CC), 트리스(히드록시피리디논) (THP), MAS3, 및 데스페록사민 (DFO)을 포함한다.
추가적인 킬레이트제는 또한 문헌 [Price and Ovig (Chem. Soc. Rev., 2014, 43, 260-290)], [Boros and Packard (Chem. Rev.　2019, 119, 2, 870-901)], [Barndt et al. (J. Nucl. Med., 2018, 59, 1500-1506)], 및 [Sneddon and Cornelissen (Curr. Opin. Chem. Biol., 2021, 63, 152-162)] (이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 킬레이트제는 일차 아민, 이차 아민, 아미드, 티오에스테르 또는 디술피드 결합을 함유하는 화학적 모이어티를 통해 치료용 나노입자에 부착된다. 킬레이트제를 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결하기 위해 사용될 수 있는 추가적인 화학적 모이어티는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
킬레이트제를 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결하기 위해 다양한 상이한 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형광단은 활성 에스테르, 카르복실레이트, 이소티오시아네이트 또는 히드라진 (예를 들어, 킬레이트제에 존재하거나 치료용 나노입자 상에 존재함)과 아민 기 (킬레이트제에 존재하거나 치료용 나노입자 상에 존재함)의 반응을 통해; 카르보디이미드의 존재 하에 카르복실 기 (예를 들어, 킬레이트제에 존재하거나 치료용 나노입자 상에 존재함)의 반응을 통해; 말레이미드의 존재 하에 티올 (예를 들어, 킬레이트제에 존재하거나 치료용 나노입자 상에 존재함)의 반응을 통해; 말레이미드 또는 아세틸 브로마이드의 존재 하에 티올 (예를 들어, 킬레이트제에 존재하거나 치료용 나노입자 상에 존재함)의 반응을 통해; 또는 글루타르알데히드의 존재 하에 아지드 (예를 들어, 킬레이트제에 존재하거나 치료용 나노입자 상에 존재함)의 반응을 통해 치료용 나노입자에 부착된다. 킬레이트제를 치료용 나노입자에 부착하기 위한 추가적인 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 킬레이트제를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 치료용 나노입자와 직접적으로 회합된 (예를 들어, 공유결합적으로 연결된) 방사성표지를 포함할 수 있다.
방사성표지
본원에 기재된 치료용 나노입자는 방사성표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 나노입자와 회합될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방사성표지는 링커를 통해 치료용 나노입자에 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 치료용 나노입자에 직접적으로 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 치료용 나노입자 또는 치료용 나노입자를 둘러싸는 조성물 또는 모이어티 (예를 들어, 반 데르 발스 힘을 통해)와 회합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 킬레이트제가 없는 치료용 나노입자 (예를 들어, 여기서 치료용 나노입자는 킬레이트제-비함유임)와 회합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 킬레이트제를 갖는 치료용 나노입자와 회합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 킬레이트제와 안정한 복합체를 형성한다.
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 치료용 나노입자당 약 1개 방사성표지 원자 내지 약 15개 방사성표지 원자 (예를 들어, 약 1개 방사성표지 원자 내지 약 11개 방사성표지 원자, 약 1개 방사성표지 원자 내지 약 12개 방사성표지 원자, 약 1개 방사성표지 원자 내지 약 13개 방사성표지 원자, 약 1개 방사성표지 원자 내지 약 14개 방사성표지 원자, 약 1개 방사성표지 원자 내지 약 15개 방사성표지 원자, 약 13개 방사성표지 원자 내지 약 14개 방사성표지 원자, 약 13개 방사성표지 원자 내지 약 15개 방사성표지 원자)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 각각의 나노입자와 회합된 (예를 들어, 킬레이트제를 통해) 약 14개 방사성표지 원자를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 방사성표지는 약 550 킬로전자 볼트 (keV) 내지 약 3500 keV (예를 들어, 약 550 keV 내지 약 580 keV, 약 550 keV 내지 약 640 keV, 약 550 keV 내지 약 660 keV, 약 550 keV 내지 약 770 keV, 약 550 keV 내지 약 910 keV, 약 579 keV 내지 약 1200 keV, 약 579 keV 내지 약 1900 keV, 약 579 keV 내지 약 3500 keV) 범위의 방출 에너지 (예를 들어, β+ 에너지)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 약 656 keV의 방출 에너지를 갖는다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 플루오린-18 (F-18)의 방출 에너지에 필적하는 (예를 들어, ± 25 keV) 방출 에너지를 갖는다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 약 656 keV의 방출 에너지를 갖는다.
일부 실시양태에서, 방사성표지는 거대분자 및/또는 혈액-풀 작용제의 느린 약동학의 적절한 평가를 가능하게 하는 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 약 10분 내지 약 80시간 (예를 들어, 약 10분 내지 약 13시간, 약 70분 내지 약 13시간, 약 110분 내지 약 13시간, 약 13시간 내지 약 26시간, 약 13시간 내지 약 80시간) 범위의 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 약 12.7시간의 반감기를 갖는다.
치료용 나노입자에 회합 (예를 들어, 공유결합적으로 연결 또는 비공유결합적으로 연결)될 수 있는 다양한 상이한 방사성표지는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 킬레이트제의 비제한적인 예는 구리-64 (Cu-64), F-18, 스칸듐-44 (Sc-44), 코발트-55 (Co-55), 니오븀-90 (Nb-90), 레늄-188 (Re-188), 탈륨-201 (Tl-201), 구리-67 (Cu-67), 이트륨-90 (Y-90), 테르븀-161 (Tb-161), 루테튬-177 (Lu-177), 비스무트-213 (Bi-213), 납-212 (Pb-212), 악티늄-225 (Ac-225) 및 지르코늄-89 (Zr)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방사성표지는 Cu-64이다.
핵산
본원에 제공된 치료용 나노입자는 전구체 마이크로RNA-10b (miR-10b)의 서열 내에 적어도 10개 (예를 들어, 적어도 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개)의 연속 뉴클레오티드를 함유하는 나노입자에 공유결합적으로 연결된 적어도 하나의 핵산 분자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 전구체 miR-10b의 서열을 함유한다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 전구체 miR-10b의 서열 내에 적어도 10개 (예를 들어, 적어도 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개)의 연속 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자 내의 핵산 분자는 miR-21, miR-15, miR-16, miR-17, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-92, miR-106, miR-191, miR-125b, miR-155, miR-569, miR-196b 또는 이들의 임의의 조합의 서열 또는 서열들을 함유한다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자에 함유된 핵산은 성숙한 인간 miR-21, miR-15, miR-16, miR-17, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-92, miR-106, miR-191, miR-125b, miR-155, miR-569, miR-196b 또는 이들의 임의의 조합에 상보적인 서열 내에 적어도 10개 (예를 들어, 적어도 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개)의 연속 뉴클레오티드의 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 성숙한 인간 miR-21, miR-15, miR-16, miR-17, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-92, miR-106, miR-191, miR-125b, miR-155, miR-569, miR-196b 또는 이들의 임의의 조합의 서열 내에 적어도 10개 (예를 들어, 적어도 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개)의 연속 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 함유할 수 있다.
부착된 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 전구체 miR-10b의 서열의 일부를 함유하고, 23개 뉴클레오티드 내지 50개 뉴클레오티드 (예를 들어, 23-30개 뉴클레오티드, 30-40개 뉴클레오티드, 및 40-50개 뉴클레오티드)의 총 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산은 전구체 miR-10b의 서열의 적어도 일부에 상보적인 서열을 함유하고, 22개 뉴클레오티드 내지 50개 뉴클레오티드 (예를 들어, 22-30개 뉴클레오티드, 30-40개 뉴클레오티드, 및 40-50개 뉴클레오티드)의 총 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 핵산은 안티센스 RNA (예를 들어, 안타고미르)일 수 있다.
안티센스 핵산 분자는 본원에 기재된 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 성숙한 인간 miR-10b의 서열에 상보적인 서열의 적어도 일부 (예를 들어, 적어도 10개 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 성숙한 인간 miR-10b의 마이너 형태의 서열에 상보적인 서열의 적어도 일부 (예를 들어, 적어도 10개 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 하향-조절을 위해 인간 miR-10b를 표적화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 임의의 다수의 적절한 안티센스 분자 (예를 들어, 성숙한 인간 miR-10b를 표적화하는 안티센스 분자)를 포함할 수 있다. 예를 들어, miR-10b를 표적화하는 안티센스 핵산은 관련 기술분야에 공지된 miR-10b에 대한 서열에 존재하는 적어도 10개 (예를 들어, 적어도 15 또는 20개)의 연속 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 함유할 수 있다.
안티센스 핵산은 관련 기술분야에 공지된 절차를 사용하여 화학적 합성 및 효소적 라이게이션 반응을 사용하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)은 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 안티센스 및 센스 핵산 사이에 형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키도록 설계된 자연 발생 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 변형된 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있으며, 예를 들어 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘-치환된 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 대안적으로, 안티센스 핵산은 안티센스 배향으로 핵산이 서브클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생산될 수 있다 (즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 관심 표적 핵산에 대해 안티센스 배향일 것임). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 안티센스 핵산 분자는 통상적인 뉴클레오티드 상보성에 의해 표적 핵산에 혼성화하고 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있다.
안티센스 핵산 분자는 α-아노머 핵산 분자일 수 있다. α-아노머 핵산 분자는 일반적인 β-유닛과 대조적으로 가닥이 서로 평행하게 실행되는 상보적 RNA와 특이적 이중-가닥 하이브리드를 형성한다 (Gaultier et al., Nucleic Acids Res. 15:6625-6641, 1987). 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-O-메틸리보뉴클레오티드 (Inoue et al., Nucleic Acids Res., 15:6131-6148, 1987) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체 (Inoue et al., FEBS Lett. 215:327-330, 1987)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 (변형된 염기 또는 당을 함유하는 뉴클레오티드)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 포스페이트 (포스포디에스테르) 백본에 적어도 하나의 변형을 함유할 수 있다. 이들 변형의 도입은 안정성을 증가시키거나 핵산 분자의 혼성화 또는 용해도를 개선할 수 있다.
본원에 기재된 분자는 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 5개)의 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 변형된 염기 또는 변형된 당을 함유할 수 있다. 변형된 염기의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자크산틴, 7-데아자구아닌, N4, N4-에타노시토신, N6, N6-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-(C3-C6)-알키닐-시토신, 슈도이소시토신, 2-히드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소시토신, 이소구아닌, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 히포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린.
변형된 염기의 추가적인 비제한적인 예는 미국 특허 번호 5,432,272 및 3,687,808 (본원에 참조로 포함됨), 문헌 [Freier et al., Nucleic Acids Res. 25:4429-4443, 1997]; [Sanghvi, Antisense Research and Application, Chapter 15, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu, CRC Press, 1993]; [Englisch, et al., Angewandte Chemie 30:613-722, 1991], [Kroschwitz, Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, John Wiley & Sons, pp. 858-859, 1990]; 및 [Cook, Anti-Cancer Drug Design 6:585-607, 1991]에 기재된 이러한 핵염기를 포함한다. 변형된 염기의 추가적인 비제한적인 예는 범용 염기 (예를 들어, 3-니트로피롤 및 5-니트로인돌)를 포함한다. 다른 변형된 염기는 피렌 및 피리딜옥사졸 유도체, 피레닐, 피레닐메틸글리세롤 유도체 등을 포함한다. 다른 바람직한 범용 염기는 관련 기술분야에 공지된 범용 염기를 포함한 피롤, 디아졸 또는 트리아졸 유도체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 이의 당 모이어티에 변형을 함유할 수 있다. 변형된 당을 함유하는 변형된 뉴클레오티드의 비제한적인 예는 잠금 뉴클레오티드 (LNA)이다. LNA 단량체는 WO 99/14226 및 미국 특허 출원 공개 번호 20110076675, 20100286044, 20100279895, 20100267018, 20100261175, 20100035968, 20090286753, 20090023594, 20080096191, 20030092905, 20020128381 및 20020115080 (본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. LNA의 추가적인 비제한적인 예는 미국 특허 번호 6,043,060, 미국 특허 번호 6,268,490, WO 01/07455, WO 01/00641, WO 98/39352, WO 00/56746, WO 00/56748, 및 WO 00/66604 (본원에 참조로 포함됨), 뿐만 아니라 문헌 [Morita et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12(1):73-76, 2002]; [Hakansson et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 11(7):935-938, 2001]; [Koshkin et al., J. Org. Chem. 66(25):8504-8512, 2001]; [Kvaerno et al., J. Org. Chem. 66(16):5498-5503, 2001]; [Hakansson et al., J. Org. Chem. 65(17):5161-5166, 2000]; [Kvaerno et al., J. Org. Chem. 65(17):5167-5176, 2000]; [Pfundheller et al., Nucleosides Nucleotides 18(9):2017-2030, 1999]; 및 [Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 8(16):2219-2222, 1998]에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 WO 03/020739에 기재된 것과 같은 옥시-LNA 단량체이다.
변형된 뉴클레오티드는 또한 안타고미르 (2'-O-메틸-변형된, 콜레스테롤-접합된 단일 가닥 RNA 유사체); ALN (α-L-LNA); ADA (2'-N-아다만틸메틸카르보닐-2'-아미노-LNA); PYR (2'-N-피레닐-1-메틸-2'-아미노-LNA); OX (옥세탄-LNA); ENA (2'-O, 4"-C-에틸렌 가교된 핵산); AENA (2'-데옥시-2'-N, 4'-C-에틸렌-LNA); CLNA (2',4'-카르보시클릭-LNA); 및 CENA (2',4'-카르보시클릭-ENA); HM-변형된 DNA (4'-C-히드록시메틸-DNA); 2'-치환된 RNA (2'-O-메틸, 2'-플루오로, 2'-아미노에톡시메틸, 2'-아미노프로폭시메틸, 2'-아미노에틸, 2'-구아니디노에틸, 2'-시아노에틸, 2'-아미노프로필을 갖음); 및 리보스 당 고리의 라디칼 변형을 갖는 RNA, 예컨대 비잠금 핵산 (UNA), 알트리톨 핵산 (ANA) 및 헥시톨 핵산 (HNA)을 포함할 수 있다 (문헌 [Bramsen et al., Nucleic Acids Res. 37:2867-81, 2009] 참조).
본원에 기재된 분자는 또한 포스포디에스테르 백본에 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 분자 내의 임의의 2개의 연속 (인접한) 뉴클레오티드 사이의 적어도 하나의 연결은 하기의 군으로부터 선택된 2 내지 4개의 그룹/원자를 함유하는 모이어티에 의해 연결될 수 있다: -CH2-, -O-, -S-, -NRH-, >C=O, >C=NRH, >C=S, -Si(R")2-, -SO-, -S(O)2-, -P(O)2-, -PO(BH3)-, -P(O,S)-, -P(S)2-, -PO(R")-, -PO(OCH3)-, 및 -PO(NHRH)-, 여기서 RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되고, R"는 C1-6-알킬 및 페닐로부터 선택된다. 이러한 연결의 예시적인 예는 -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CO-CH2-, -CH2-CHOH-CH2-, -O-CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -O-CH2-CH= (다음 단량체에 대한 연결로서 사용되는 경우 R5 포함), -CH2-CH2-O-, -NRH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NRH-, -CH2-NRH-CH2-, -O-CH2-CH2-NRH-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -NRH-CS-NRH-, -NRH-C(=NRH)-NRH-, -NRH-CO-CH2-NRH-, -O-CO-O-, -O-CO-CH2-O-, -O-CH2-CO-O-, -CH2-CO-NRH-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CH=N-O-, -CH2-NRH-O-, -CH2-O-N= (다음 단량체에 대한 연결로서 사용되는 경우 R5 포함), -CH2-O-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-O-, -CH2-NRH-CO-, -O-NRH-CH2-, -O-NRH-, -O-CH2-S-, -S-CH2-O-, -CH2-CH2-S-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH= (다음 단량체에 대한 연결로서 사용되는 경우 R5 포함), -S-CH2-CH2-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-S-CH2-, -CH2-SO-CH2-, -CH2-SO2-CH2-, -O-SO-O-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-CH2-, -O-S(O)2-NRH-, -NRH-S(O)2-CH2-, -O-S(O)2-CH2-, -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)2-S-, -S-P(O)2-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)2-S-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(OCH3)-O-, -O-PO-(OCH2CH3)-O-, -O-PO(OCH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRN)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)2-O-, -CH2-P(O)2-O-, -O-P(O)2-CH2-, 및 -O-Si(R")2-O-; 이들 중 -CH2-CO-NRH-, -CH2-NRH-O-, -S-CH2-O-, -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(CH3)-O-, 및 -O-PO(NHRN)-O-이며, 여기서 RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되고, R"는 C1-6-알킬 및 페닐로부터 선택된다. 추가적인 예시적인 예는 문헌 [Mesmaeker et. al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5:343-355, 1995]; 및 [Freier et al., Nucleic Acids Research 25:4429-43, 1997]에 제공된다. 뉴클레오시드간 연결의 왼쪽 측면은 3'-위치에서 치환기 P*로서 5원 고리에 결합된 반면, 오른쪽 측면은 선행 단량체의 5'-위치에 결합된다.
일부 실시양태에서, 핵산의 데옥시리보스 포스페이트 백본은 펩티드 핵산을 생성하도록 변형될 수 있다 (문헌 [Hyrup et al., Bioorganic & Medicinal Chem. 4(1): 5-23, 1996] 참조). 펩티드 핵산 (PNA)은 핵산 모방체, 예를 들어 DNA 모방체이며, 여기서 데옥시리보스 포스페이트 백본은 슈도펩티드 백본에 의해 대체되고 오직 4개의 천연 핵염기만이 유지된다. PNA의 중성 백본은 낮은 이온 강도의 조건 하에 DNA 및 RNA에 대한 특이적 혼성화를 허용한다. PNA 올리고머의 합성은 예를 들어 문헌 [Hyrup et al., 1996, supra]; [Perry-O'Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:14670-675, 1996]에 기재된 바와 같이 표준 고체상 펩티드 합성 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다.
PNA는 PNA에 친유성 또는 다른 헬퍼 그룹을 부착함으로써, PNA-DNA 키메라의 형성에 의해, 또는 리포좀 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 전달 기술의 사용에 의해 예를 들어 안정성 또는 세포 흡수를 향상시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, PNA 및 DNA의 유리한 특성을 조합할 수 있는 PNA-DNA 키메라가 생성될 수 있다. 이러한 키메라는 DNA 인식 효소, 예를 들어 RNAse H가 DNA 부분과 상호작용하도록 허용하는 반면, PNA 부분은 높은 결합 친화성 및 특이성을 제공할 것이다. PNA-DNA 키메라는 염기 스태킹, 핵염기 사이의 결합 수 및 배향의 관점에서 선택된 적절한 길이의 링커를 사용하여 연결될 수 있다 (Hyrup, 1996, supra). PNA-DNA 키메라의 합성은 문헌 [Hyrup, 1996, supra] 및 [Finn et al., Nucleic Acids Res. 24:3357-63, 1996]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, DNA 쇄는 표준 포스포르아미다이트 커플링 화학 및 변형된 뉴클레오시드 유사체를 사용하여 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 화합물, 예컨대 5'-(4-메톡시트리틸)아미노-5'-데옥시-티미딘 포스포르아미다이트는 PNA 및 DNA의 5' 말단 사이의 연결로서 사용될 수 있다 (Mag et al., Nucleic Acids Res., 17:5973-88, 1989). 그 후, PNA 단량체는 5' PNA 세그먼트 및 3' DNA 세그먼트를 갖는 키메라 분자를 생성하기 위해 단계적 방식으로 커플링된다 (Finn et al., Nucleic Acids Res. 24:3357-63, 1996). 대안적으로, 5' DNA 세그먼트 및 3' PNA 세그먼트를 갖는 키메라 분자가 합성될 수 있다 (Peterser et al., Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124, 1975).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 핵산은 관련 기술분야에 공지된 임의의 유형의 변형에 의해 (핵산이 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결되는 방식에 따라) 3' 또는 5' 말단에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단은 보호기로 캡핑되거나 가요성 연결기에 부착되거나 반응성 기에 부착되어 기질 표면에 부착하는 것을 도울 수 있다 (중합체 코팅). 3' 또는 5' 차단기의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 2-아미노-2-옥시에틸, 2-아미노벤조일, 4-아미노벤조일, 아세틸, 아세틸옥시, (아세틸아미노)메틸, 3-(9-아크리디닐), 트리시클로[3.3.1.1(3,7)]데크-1-일옥시, 2-아미노에틸, 프로페닐, (9-안트라세닐메톡시)카르보닐, (1,1-디메틸프로폭시)카르보닐, (1,1-디메틸프로폭시)카르보닐, [1-메틸-1-[4-(페닐아조)페닐]에톡시]카르보닐, 브로모아세틸, (벤조일아미노)메틸, (2-브로모에톡시)카르보닐, (디페닐메톡시)카르보닐, 1-메틸-3-옥소-3-페닐-1-프로페닐, (3-브로모-2-니트로페닐)티오, (1,1-디메틸에톡시)카르보닐, [[(1,1-디메틸에톡시)카르보닐] 아미노]에틸, 2-(페닐메톡시)페녹시, (1=[1,1'-바이페닐]-4-일-1-메틸에톡시) 카르보닐, 브로모, (4-브로모페닐)술포닐, 1H-벤조트리아졸-1-일, [(페닐메틸) 티오]카르보닐, [(페닐메틸)티오]메틸, 2-메틸프로필, 1,1-디메틸에틸, 벤조일, 디페닐메틸, 페닐메틸, 카르복시아세틸, 아미노카르보닐, 클로로디플루오로아세틸, 트리플루오로메틸, 시클로헥실카르보닐, 시클로헵틸, 시클로헥실, 시클로헥실아세틸, 클로로, 카르복시메틸, 시클로펜틸카르보닐, 시클로펜틸, 시클로프로필메틸, 에톡시카르보닐, 에틸, 플루오로, 포르밀, 1-옥소헥실, 아이오도, 메틸, 2-메톡시-2-옥소에틸, 니트로, 아지도, 페닐, 2-카르복시벤조일, 4-피리디닐메틸, 2-피페리디닐, 프로필, 1-메틸에틸, 술포 및 에테닐. 5' 및 3' 차단기의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 5' 또는 3' 차단기는 분자의 뉴클레아제 분해를 방지한다.
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자 내의 핵산 분자는 작은 간섭 RNA (siRNA)일 수 있다. RNAi는 RNA가 숙주 세포에서 분해되는 프로세스이다. RNA의 발현을 감소시키기 위해, 표적 RNA (예를 들어, 성숙한 인간 miR-10b)의 일부에 상응하는 서열을 함유하는 이중-가닥 RNA (dsRNA)가 세포에 도입된다. dsRNA는 짧은 간섭 RNA (또는 siRNA)라고 불리는 21-23개 뉴클레오티드-길이 듀플렉스로 소화되며, 이는 뉴클레아제 복합체에 결합하여 RNA-유도된 침묵 복합체 (또는 RISC)로서 공지된 것을 형성한다. RISC는 siRNA 가닥 중 하나 및 내인성 RNA 사이의 염기 쌍형성 상호작용에 의해 내인성 표적 RNA를 표적화한다. 그 후, siRNA의 3' 말단으로부터 약 12개 뉴클레오티드의 내인성 RNA를 절단한다 (문헌 [Sharp et al., Genes Dev. 15:485-490, 2001], 및 [Hammond et al., Nature Rev. Gen. 2:110-119, 2001] 참조).
siRNA를 생성하기 위해 표준 분자 생물학 기술을 사용할 수 있다. 짧은 간섭 RNA는 예를 들어 주형 DNA, 예컨대 플라스미드로부터 RNA를 발현함으로써 화학적으로 합성되거나, 재조합적으로 생산되거나, 상업적 공급업체, 예컨대 다마콘(Dharmacon)으로부터 수득될 수 있다. RNAi를 매개하는데 사용되는 RNA는 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 변형된 뉴클레오티드), 예컨대 포스포로티오에이트 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 성숙한 인간 miR-10b의 수준을 감소시키는데 사용되는 siRNA 분자는 다수의 방식으로 다양할 수 있다. 예를 들어, 이들은 3' 히드록실 기 및 21, 22 또는 23개 연속 뉴클레오티드의 가닥을 포함할 수 있다. 이들은 평활 말단을 가질 수 있거나, 3' 말단, 5' 말단 또는 양쪽 말단에서 오버행 말단을 포함할 수 있다. 예를 들어, RNA 분자의 적어도 하나의 가닥은 약 1 내지 약 6개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 1-5, 1-3, 2-4 또는 3-5개의 뉴클레오티드 (피리미딘 또는 퓨린 뉴클레오티드) 길이의 3' 오버행을 가질 수 있다. 가닥 둘 모두가 오버행을 포함하는 경우, 오버행의 길이는 각각의 가닥에 대해 동일하거나 상이할 수 있다.
RNA 듀플렉스의 안정성을 추가로 향상시키기 위해, 3' 오버행은 분해에 대해 안정화될 수 있다 (예를 들어 퓨린 뉴클레오티드, 예컨대 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 피리미딘 뉴클레오티드를 변형된 뉴클레오티드로 대체함으로써 (예를 들어, 2'-데옥시티미딘에 의한 우리딘 2-뉴클레오티드 3' 오버행의 치환은 용인되며 RNAi의 효율에 영향을 미치지 않는다). 관심 표적과 충분한 상동성을 갖는 임의의 siRNA가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 siRNA의 길이에는 상한이 없다 (예를 들어, siRNA는 약 21-50, 50-100, 100-250, 250-500, 또는 500-1000개 염기 쌍의 범위일 수 있음).
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자 내의 핵산 분자는 miRNA 모방체일 수 있다. miRNA 모방체의 비제한적인 예는 let7, miR-34a, miR-200c, miR-221/222, miR-126, miR-29 또는 이들의 임의의 조합의 miRNA 모방체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자 내의 핵산 분자는 면역자극성 핵산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역자극성 핵산은 면역자극성 RNA 및 면역자극성 DNA 또는 이들의 조합이다.
본원에 기재된 핵산은 핵산을 합성하기 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 합성될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Usman et al., J. Am. Chem. Soc. 109:7845, 1987]; [Scaringe et al., Nucleic Acid Res. 18:5433, 1990]; [Wincott et al., Methods Mol. Biol. 74:59, 1997]; 및 [Milligan, Nucleic Acid Res. 21:8783, 1987] 참조). 이들은 전형적으로 공통 핵산 보호기 및 커플링 기를 사용한다. 합성은 이러한 목적을 위해 설계된 상업적 장비, 예를 들어 제조업체에 의해 공급된 프로토콜을 사용하여 394 어플라이드 바이오시스템스, 인크.(394 Applied Biosystems, Inc.) 합성기에서 수행될 수 있다. 본원에 기재된 분자를 합성하기 위한 추가적인 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 대안적으로, 핵산은 올리고뉴클레오티드를 합성하는 상업적 공급업체로부터 특별히 주문될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 이의 5' 말단에서 치료용 나노입자에 부착된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 이의 3' 말단에서 치료용 나노입자에 부착된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 핵산에 존재하는 염기를 통해 치료용 나노입자에 부착된다.
일부 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 핵산)은 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합을 함유하는 화학적 모이어티를 통해 치료용 나노입자 (예를 들어, 치료용 나노입자의 중합체 코팅)에 부착된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 아미드 결합을 함유하는 화학적 모이어티를 통해 치료용 나노입자에 부착된다. 핵산을 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결하기 위해 사용될 수 있는 추가적인 화학적 모이어티는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
핵산을 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결하기 위해 다양한 상이한 방법이 사용될 수 있다. 핵산을 자성 입자에 연결하기 위해 사용될 수 있는 방법의 비제한적인 예는 EP 0937097; US RE41005; 문헌 [Lund et al., Nucleic Acid Res. 16:10861, 1998]; [Todt et al., Methods Mol. Biol. 529:81-100, 2009]; [Brody et al., J. Biotechnol. 74:5-13, 2000]; [Ghosh et al., Nucleic Acids Res. 15:5353-5372, 1987]; 미국 특허 번호 5,900,481; 미국 특허 번호 7,569,341; 미국 특허 번호 6,995,248; 미국 특허 번호 6,818,394; 미국 특허 번호 6,811,980; 미국 특허 번호 5,900,481; 및 미국 특허 번호 4,818,681 (이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 카르보디이미드는 치료용 나노입자에 대한 핵산의 말단-부착을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 치료용 나노입자의 표면 상에 존재하는 활성화된 모이어티와 이의 염기 중 하나의 반응 (예를 들어, 치료용 나노입자의 표면 상의 친핵성 모이어티와 친전자성 염기의 반응, 또는 치료용 나노입자의 표면 상의 친전자성 잔기와 친핵성 염기의 반응)을 통해 치료용 나노입자에 부착된다. 일부 실시양태에서, 5'-NH2 변형된 핵산은 CNBr-활성화된 히드록실 기를 함유하는 치료용 나노입자에 부착된다 (예를 들어 문헌 [Lund et al., supra] 참조). 아미노-변형된 핵산을 치료용 나노입자에 부착하기 위한 추가적인 방법은 하기 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 5'-포스페이트 핵산은 카르보디이미드의 존재 하에 히드록실 기를 함유하는 치료용 나노입자에 부착된다 (예를 들어 문헌 [Lund et al., supra] 참조). 핵산을 치료용 나노입자에 부착하는 다른 방법은 치료용 나노입자 상의 NH2 기에 대한 5'-포스페이트 핵산의 카르보디이미드-매개된 부착, 및 카르복실 기를 갖는 치료용 나노입자에 대한 5'-NH2 핵산의 카르보디이미드-매개된 부착을 포함한다 (예를 들어 문헌 [Lund et al., supra] 참조).
예시적인 방법에서, 반응성 아민 또는 반응성 티올 기를 함유하는 핵산이 생산될 수 있다. 핵산 내의 아민 또는 티올은 또 다른 반응성 기에 연결될 수 있다. 이 반응을 수행하기 위한 두 가지 일반적인 전략은 핵산을 유사한 반응성 모이어티 (아민에서 아민으로 또는 티올에서 티올로)에 연결하거나 (이는 동종이관능성 연결이라고 불림), 또는 핵산을 반대 기에 연결하는 것이다 (아민에서 티올로 또는 티올에서 아민으로) (이종이관능성 연결로서 공지됨). 기술 둘 모두는 핵산을 치료용 나노입자에 부착하는데 사용될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Misra et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18:5217-5221, 2008]; [Mirsa et al., Anal. Biochem. 369:248-255, 2007]; [Mirsa et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:3749-3753, 2007]; 및 [Choithani et al., Methods Mol Biol. 381:133-163, 2007] 참조).
특히 아민 기에 대한 전통적인 부착 기술은 동종이관능성 연결에 의존해 왔다. 가장 일반적인 기술 중 하나는 비스알데히드, 예컨대 글루타르알데히드의 사용이었다. 합성 핵산 프로브 (SNAP) 기술로서 신젠(Syngene) (미국 메릴랜드주 프레더릭)에 의해 상업화된 디숙신이미딜 수베레이트 (DSS), 또는 시약 p-페닐렌 디이소티오시아네이트는 또한 핵산 및 치료용 나노입자 사이의 공유결합적 연결을 생성하기 위해 사용될 수 있다. N,N'-o-페닐렌디말레이미드는 티올 기를 가교하는데 사용될 수 있다. 모든 동종이관능성 가교제와 함께, 핵산은 초기에 활성화된 후, 치료용 나노입자에 첨가된다 (예를 들어 문헌 [Swami et al., Int. J. Pharm. 374:125-138, 2009], [Todt et al., Methods Mol. Biol. 529:81-100, 2009]; 및 [Limanskii, Biofizika 51:225-235, 2006] 참조).
이종이관능성 링커는 또한 핵산을 치료용 나노입자에 부착하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP)는 초기에 일차 아민에 연결되어 디티올-변형된 화합물을 생성한다. 그 후, 이는 티올과 반응하여 피리딜티올을 들어오는 티올로 교환할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Nostrum et al., J. Control Release 15;153(1):93-102, 2011], 및 [Berthold et al., Bioconjug. Chem. 21:1933-1938, 2010] 참조).
티올 사용에 대한 대안적인 접근법은 티올-교환 반응이었다. 티올화된 핵산이 디술피드 치료용 나노입자에 도입되면, 디술피드 결합에 의해 핵산이 치료용 나노입자에 공유결합적으로 결합되도록 유발하는 디술피드-교환 반응이 일어날 수 있다. 다수의 잠재적 가교 화학이 아민 및 티올의 이종이관능성 가교에 이용가능하다. 일반적으로, 이들 절차는 티올화된 뉴클레오티드와 함께 사용되었다. 전형적으로 사용되는 시약은 NHS (N-히드록시숙신이미드 에스테르), MBS (m-말레이미도벤조일-N-숙신이미드 에스테르), 및 SPDP (피리딜디술피드-기반 시스템)이다. 일반적으로 사용되는 이종이관능성 링커는 아민화된 핵산에 의존한다. 핵산을 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결하기 위한 추가적인 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
나노입자
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 약 2 nm 내지 약 200 nm (예를 들어, 약 10 nm 내지 약 30 nm, 약 5 nm 내지 약 25 nm, 약 10 nm 내지 약 25 nm, 약 15 nm 내지 약 25 nm, 약 20 nm 내지 약 25 nm, 약 25 nm 내지 약 50 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 70 nm 내지 약 200 nm, 약 80 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 200 nm, 약 140 nm 내지 약 200 nm, 및 약 150 nm 내지 약 200 nm)의 직경을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 방사성표지를 포함하지 않는 나노입자의 직경보다 약 18% 내지 약 28% (예를 들어, 약 18% 내지 약 23%, 약 20% 내지 약 23%, 약 23% 내지 약 25%, 약 23% 내지 약 28%) 더 큰 직경을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 방사성표지를 포함하지 않는 나노입자의 직경보다 약 23% 더 큰 직경을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 방사성표지를 포함하지 않는 전이성-표적화 나노입자와 유사한 비율로 대상체의 전이성 조직에 축적될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 방사성표지를 포함하지 않는 전이성-표적화 나노입자와 비교하여 대상체의 전이성 조직에서 거의 동일한 축적을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료용 나노입자는 구형 또는 타원형일 수 있거나, 무정형 형상을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료용 나노입자는 약 2 nm 내지 약 200 nm (예를 들어, 약 10 nm 내지 약 200 nm, 약 2 nm 내지 약 30 nm, 약 5 nm 내지 약 25 nm, 약 10 nm 내지 약 25 nm, 약 15 nm 내지 약 25 nm, 약 20 nm 내지 약 25 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 70 nm 내지 약 200 nm, 약 80 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 200 nm, 약 140 nm 내지 약 200 nm, 및 약 150 nm 내지 약 200 nm)의 직경 (치료용 나노입자의 외부 표면 상의 임의의 2개의 포인트 사이)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 2 nm 내지 약 30 nm의 직경을 갖는 치료용 나노입자는 대상체의 림프절에 편재화된다. 일부 실시양태에서, 약 40 nm 내지 약 200 nm의 직경을 갖는 치료용 나노입자는 간에 편재화된다.
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 자성일 수 있다 (예를 들어, 자성 물질의 코어를 포함함). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 치료용 나노입자는 자성 물질 (예를 들어, 치료용 자성 나노입자)의 코어를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 산화철 코어를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자성 물질 또는 입자는 자기장에 반응하는 반자성, 상자성, 초상자성 또는 강자성 물질을 함유할 수 있다. 치료용 자성 나노입자의 비제한적인 예는 마그네타이트; 페라이트 (예를 들어, 망가니즈, 코발트 및 니켈의 페라이트); Fe(II) 산화물, 및 헤마타이트, 및 이의 금속 합금의 군으로부터 선택된 금속 산화물을 함유하는 자성 물질의 코어를 함유한다. 자성 물질의 코어는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 금속 염을 금속 산화물로 전환함으로써 형성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kieslich et al., Inorg. Chem. 2011]). 일부 실시양태에서, 나노입자는 시클로덱스트린 금 또는 양자점을 함유한다. 치료용 자성 나노입자를 생성하기 위해 사용될 수 있는 방법의 비제한적인 예는 문헌 [Medarova et al., Methods Mol. Biol. 555:1-13, 2009]; 및 [Medarova et al., Nature Protocols 1:429-431, 2006]에 기재되어 있다. 추가적인 자성 물질 및 자성 물질을 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 치료용 자성 나노입자의 위치 또는 편재화는 대상체에서 영상화될 수 있다 (예를 들어, 하나 이상의 용량의 치료용 자성 나노입자의 투여 후 대상체에서 영상화됨).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료용 나노입자는 자성 물질을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 부분적으로 중합체 (예를 들어, 폴리(락트산-코-글리콜산))를 함유하는 코어를 함유할 수 있다. 숙련된 실무자는 검 (예를 들어, 아카시아, 구아), 키토산, 젤라틴, 알긴산나트륨 및 알부민을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 수의 관련 기술분야에 공지된 물질이 나노입자를 제조하는데 사용될 수 있음을 인식할 수 있다. 본원에 기재된 치료용 나노입자를 생성하기 위해 사용될 수 있는 추가적인 중합체는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 치료용 나노입자를 생성하기 위해 사용될 수 있는 중합체는 셀룰로오스, 폴리(2-히드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(비닐 알콜), 폴리(아크릴산), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(메타크릴산), 폴리락티드 (PLA), 폴리글리콜리드 (PGA), 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA), 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리시아노아크릴레이트 및 폴리카프로락톤을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
숙련된 실무자는 나노입자의 조성물에 사용되는 물질, 제조 방법, 코팅, 및 나노입자의 크기를 제어하는 방법이 실질적으로 다양할 수 있음을 인식할 것이다. 그러나, 이들 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 핵심 문제는 나노입자의 생분해성, 독성 프로파일 및 약동학/약력학을 포함한다. 나노입자의 조성물 및/또는 크기는 이들의 생물학적 운명의 핵심 결정요인이다. 예를 들어, 더 큰 나노입자는 전형적으로 간에 의해 흡수되고 분해되는 반면, 더 작은 나노입자 (직경 <30 nm)는 전형적으로 장기간 동안 (때때로 인간에서 24시간 혈액 반감기에 걸쳐) 순환하고 림프절 및 종양과 같은 과투과성 맥관계를 갖는 장기의 간질에 축적된다.
중합체 코팅
본원에 기재된 치료용 나노입자는 코어 자성 물질 (예를 들어, 자성 물질의 표면) 위에 중합체 코팅을 함유한다. 중합체 물질은 하나 이상의 생물학적 작용제 (예를 들어, 예컨대 본원에 기재된 임의의 핵산)를 부착 또는 커플링하기에 적합할 수 있다. 하나 이상의 생물학적 작용제 (예를 들어, 핵산, 형광단 또는 표적화 펩티드)는 화학적 커플링 (공유결합적 결합)에 의해 중합체 코팅에 고정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 자성 물질의 코어를 물에서 상대적으로 안정한 중합체로 코팅하는 것을 포함하는 방법에 의해 형성된다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 자성 물질을 중합체로 코팅하거나 자성 물질을 환원기를 갖는 열가소성 중합체 수지에 흡수시키는 것을 포함하는 방법에 의해 형성된다. 코팅은 또한 미국 특허 번호 5,834,121, 5,395,688, 5,356,713, 5,318,797, 5,283,079, 5,232,789, 5,091,206, 4,965,007, 4,774,265, 4,770,183, 4,654,267, 4,554,088, 4,490,436, 4,336,173, 및 4,421,660; 및 WO 10/111066 (이들 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법을 사용하여 자성 물질에 적용될 수 있다.
산화철 나노입자의 합성 방법은 예를 들어 물리적 및 화학적 방법을 포함한다. 예를 들어, 산화철은 수용액에서 Fe2+ 및 Fe3+ 염의 공동-침전에 의해 제조될 수 있다. 생성된 코어는 마그네타이트 (Fe3O4), 마그헤마이트 (γ-Fe2O3) 또는 이 둘의 혼합물로 이루어진다. 음이온성 염 함량 (클로라이드, 니트레이트, 술페이트 등), Fe2+ 및 Fe3+ 비율, 수용액의 pH 및 이온 강도는 모두 크기를 제어하는 역할을 한다. 불활성 기체, 예컨대 질소 또는 아르곤 하에 무산소 환경에서 반응을 수행함으로써 합성된 나노입자의 산화를 방지하고 자성 특성을 보호하는 것이 중요하다. 코팅 물질은 산화철 나노입자의 마이크로입자로의 응집을 방지하기 위해 공동-침전 프로세스 동안 첨가될 수 있다. 숙련된 실무자는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수의 표면 코팅 물질이 산화철 나노입자를 안정화시키기 위해 사용될 수 있으며, 그 중에는 합성 및 천연 중합체, 예컨대, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 지방산, 폴리펩티드, 키토산, 젤라틴이 있음을 인식할 것이다.
예를 들어, 미국 특허 번호 4,421,660은 무기 물질의 중합체 코팅된 입자가 통상적으로 (1) 무기 고체를 산, 산 및 염기의 조합, 알콜 또는 중합체 용액으로 처리하는 단계; (2) 처리된 무기 고체의 수성 분산액에 부가 중합성 단량체를 분산시키는 단계 및 (3) 생성된 분산액을 유화 중합 조건에 적용시키는 단계에 의해 제조된다는 것에 주목한다. (컬럼 1, 라인 21-27) 미국 특허 번호 4,421,660은 또한 무기 나노입자를 중합체로 코팅하는 방법을 개시하고 있으며, 이는 (1) 소수성 유화 중합성 단량체를 무기 고체의 별개의 입자의 수성 콜로이드성 분산액에서 유화시키는 단계 및 (2) 소수성 단량체의 수불용성 중합체의 매트릭스에 분산된 무기 고체 입자의 안정한 유체 수성 콜로이드성 분산액을 형성하기 위한 유화 중합 조건에 생성된 에멀젼을 적용하는 단계를 포함한다 (컬럼 1, 라인 42-50).
대안적으로, 크기의 시작 요구사항을 충족하는 중합체-코팅된 자성 물질은 상업적으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 초소형 초상자성 산화철 나노입자는 NC100150 주사 (나이코메드 아머샴(Nycomed Amersham), 아머샴 헬스(Amersham Health)) 및 페루목시톨(Ferumoxytol) (AMAG 파마슈티칼스, 인크.(AMAG Pharmaceuticals, Inc.))을 포함한다.
자성 물질의 코어를 코팅하는데 사용될 수 있는 적합한 중합체는 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리에테르우레탄, 폴리술폰, 플루오린화된 또는 염소화된 중합체, 예컨대 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트 및 폴리에스테르를 제한 없이 포함한다. 자성 물질의 코어를 코팅하는데 사용될 수 있는 중합체의 추가 예는 폴리올레핀, 예컨대 폴리부타디엔, 폴리디클로로부타디엔, 폴리이소프렌, 폴리클로로프렌, 폴리비닐리덴 할라이드, 폴리비닐리덴 카르보네이트 및 폴리플루오린화된 에틸렌을 포함한다. 스티렌/부타디엔, 알파-메틸 스티렌/디메틸 실록산 또는 다른 폴리실록산을 포함하는 다수의 공중합체는 또한 자성 물질의 코어를 코팅하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 폴리디메틸 실록산, 폴리페닐메틸 실록산 및 폴리트리플루오로프로필메틸 실록산). 자성 물질의 코어를 코팅하는데 사용될 수 있는 추가적인 중합체는 폴리아크릴로니트릴 또는 아크릴로니트릴-함유 중합체, 예컨대 폴리 알파-아크릴로니트릴 공중합체, 알키드 또는 테르페노이드 수지, 및 폴리알킬렌 폴리술포네이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체 코팅은 덱스트란이다.
제약 조성물
또한, 본원에 기재된 바와 같은 치료용 나노입자를 함유하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 임의의 유형의 치료용 나노입자 중 2개 이상 (예를 들어, 2, 3 또는 4개)은 임의의 조합으로 제약 조성물에 존재할 수 있다. 제약 조성물은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방식으로 제형화될 수 있다.
제약 조성물은 의도된 투여 경로 (예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하 또는 복강내)와 호환가능하도록 제형화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 제약상 허용되는 희석제 (예를 들어, 멸균 희석제)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 희석제는 멸균수, 멸균 염수, 고정된 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매, 항박테리아제 또는 항진균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등, 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨, 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산, 버퍼, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 등장화제, 예컨대 당 (예를 들어, 덱스트로스), 폴리알콜 (예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨), 또는 염 (예를 들어, 염화나트륨), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 리포좀 현탁액은 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 번호 4,522,811 참조). 조성물의 제제는 제형화되고 앰플, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 봉입될 수 있다. 필요한 경우 (예를 들어 주사가능한 제형에서와 같이), 적절한 유동성은 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴 또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 치료용 나노입자의 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제 (예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)를 포함함으로써 연장될 수 있다. 대안적으로, 제어 방출은 생분해성, 생체적합성 중합체 (예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산; 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼, 인크.(Nova Pharmaceutical, Inc.))를 포함할 수 있는 이식체 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템에 의해 달성될 수 있다.
본원에 기재된 하나 이상의 임의의 치료용 나노입자를 함유하는 조성물은 투여 단위 형태 (즉, 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유하는 물리적으로 별개의 단위)로 비경구 (예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하 또는 복강내) 투여용으로 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 임의의 치료용 나노입자를 함유하는 조성물은 주사제, 정제, 동결건조 분말, 현탁액 또는 이들의 임의의 조합인 투여 형태로 제형화될 수 있다.
조성물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물 (예를 들어, 원숭이)에서 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, LD50 (집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정할 수 있다: 치료 지수는 LD50:ED50의 비율이다. 높은 치료 지수를 나타내는 작용제가 바람직하다. 작용제가 바람직하지 않은 부작용을 나타내는 경우, 잠재적 손상을 최소화하기 위해 (즉, 원치않는 부작용을 감소시키기 위해) 주의를 기울여야 한다. 독성 및 치료 효능은 다른 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 대상체 (예를 들어, 인간)에서 사용하기 위한 임의의 주어진 작용제의 적절한 투여량을 제형화하는데 사용될 수 있다. 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)의 치료용 나노입자 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 치료용 나노입자)의 치료 유효량은 대상체 (예를 들어, 인간)에서 암 (예를 들어, 유방암)을 갖는 대상체에서 암 세포 침윤 또는 전이를 감소시키거나, 대상체의 림프절에서 전이성 암을 치료하거나, 대상체의 림프절에서 전이성 종양 크기를 감소 또는 안정화시키거나, 대상체의 림프절에서 전이성 종양 성장 속도를 감소시키거나, 대상체 (예를 들어, 인간)에서 대상체의 림프절에서 전이성 암의 하나 이상의 증상의 중증도, 빈도 및/또는 지속시간을 감소시키거나, 또는 대상체의 림프절에서 전이성 암의 증상의 수를 감소시키는 양일 것이다 (예를 들어 동일한 질환을 갖고 있지만 치료 또는 상이한 치료를 받지 않은 대조군 대상체, 또는 치료 전의 동일한 대상체와 비교하여).
본원에 기재된 임의의 치료용 나노입자의 유효성 및 투여는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 건강 관리 전문가에 의해, 뿐만 아니라 대상체 (예를 들어, 인간)의 림프절에서 전이성 암의 하나 이상의 증상의 관찰에 의해 결정될 수 있다. 특정 인자는 대상체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있다 (예를 들어, 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 다른 질환의 존재).
예시적인 용량은 대상체의 체중 킬로그램당 본원에 기재된 임의의 치료용 나노입자의 밀리그램 또는 마이크로그램 양을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 약 0.020 mg/kg 미만 (예를 들어, 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.005 mg/kg, 약 0.005 내지 약 0.010 mg/kg, 약 0.010 mg/kg 내지 약 0.015 mg/kg, 약 0.011 mg/kg 내지 약 0.015 mg/kg, 약 0.012 mg/kg 내지 약 0.015 mg/kg, 약 0.013 mg/kg 내지 약 0.015 mg/kg, 약 0.012 mg/kg 내지 약 0.016 mg/kg, 약 0.013 mg/kg 내지 약 0.017 mg/kg, 약 0.013 mg/kg 내지 약 0.018 mg/kg, 또는 약 0.015 mg/kg 내지 약 0.020 mg/kg)인 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 약 0.014 mg/kg 미만인 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 대상체에서 전이성 암 조직을 영상화, 검출, 진단 및/또는 모니터링하기 위해 약 0.014 mg/kg 미만인 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg (예를 들어, 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 1 내지 약 7 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 7 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 9 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 6 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 7 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 9 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 6 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 7 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 9 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 6 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 7 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 9 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 6 mg/kg 내지 약 7 mg/kg, 약 6 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 6 mg/kg 내지 약 9 mg/kg, 약 6 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 7 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 7 mg/kg 내지 약 9 mg/kg, 또는 약 7 mg/kg 내지 약 10 mg/kg) 범위의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 약 5 mg/kg 내지 약 7 mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 대상체에서 전이성 암을 치료하고/거나 세포 침윤 또는 전이를 감소시키기 위해 약 5 mg/kg 내지 약 7 mg/kg 미만인 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다.
이들 용량은 특정 범위를 포함하지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 치료용 나노입자를 포함하는 치료제가 이들의 효력이 다양하고 유효량이 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 전형적으로, 처음에는 상대적으로 낮은 용량을 투여하고, 담당 건강 관리 전문가 (치료적 적용의 경우) 또는 연구원 (여전히 개발 단계에서 작업 중인 경우)은 적절한 반응이 수득될 때까지 용량을 후속적으로 및 점진적으로 증가시킬 수 있다. 또한, 임의의 특정 대상체에 대한 특정 용량 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도, 및 생체내 치료용 나노입자의 반감기를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것으로 이해된다.
제약 조성물은 투여 지침서와 함께 키트, 컨테이너, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
치료 방법
본원에 기재된 치료용 나노입자는 암 세포 침윤을 감소시키고 암 세포 전이를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견을 고려하여, 대상체에서 암 세포 침윤 또는 전이를 감소시키는 방법, 대상체의 림프절에서 전이성 암을 치료하는 방법, 및 대상체의 림프절에 존재하는 세포에 핵산을 전달하는 방법이 본원에 제공된다. 이들 방법의 특정 실시양태 및 다양한 측면은 하기 기재되어 있다.
전이성 암을 치료하는 방법
전이성 암은 대상체의 상이한 조직으로 이동한 원발성 종양으로부터의 암 세포로부터 기원하는 암이다. 일부 실시양태에서, 원발성 종양으로부터의 암 세포는 대상체의 혈류 또는 림프계를 통해 이동함으로써 대상체의 상이한 조직으로 이동할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전이성 암은 대상체의 림프절에 존재하는 전이성 암이다.
대상체가 경험하는 전이성 암의 증상은 전이성 종양 형성의 부위에 따라 다르다. 대상체의 뇌에서 전이성 암의 비제한적 증상은 두통, 어지러움 및 시야 흐림을 포함한다. 대상체의 간에서 전이성 암의 비제한적 증상은 체중 감소, 열, 오심, 식욕 부진, 복통, 복부 체액 (복수), 황달 및 다리 부종을 포함한다. 대상체의 뼈에서 전이성 암의 비제한적 증상은 경미한 상해 또는 상해가 없는 후의 통증 및 뼈 파손을 포함한다. 대상체의 폐에서 전이성 암의 비제한적 증상은 비-습성 기침, 혈성 가래를 생성하는 기침, 흉통 및 숨가쁨을 포함한다.
전이성 암은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 건강 관리 전문가 (예를 들어, 의사, 의사 보조원, 간호사 또는 실험실 기술자)에 의해 대상체에서 진단될 수 있다. 예를 들어, 전이성 암은 부분적으로 대상체에서 전이성 암의 적어도 하나의 증상 (예를 들어, 상기 나열된 임의의 증상)의 관찰 또는 검출에 의해 대상체에서 진단될 수 있다. 전이성 암은 또한 다양한 영상화 기술을 사용하여 대상체에서 진단될 수 있다 (예를 들어, 대상체에서 전이성 암의 하나 이상의 증상의 관찰과 조합하여 또는 단독으로). 예를 들어, 전이성 암 (예를 들어, 림프절 내의 전이성 암)의 존재는 컴퓨터 단층촬영, 자기 공명 영상화, 양전자 방출 단층촬영 및 X선을 사용하여 대상체에서 검출될 수 있다. 전이성 암 (예를 들어, 림프절 내의 전이성 암)은 또한 대상체로부터의 조직의 생검 (예를 들어, 대상체로부터의 림프절의 생검)을 수행함으로써 진단될 수 있다.
전이성 종양은 뇌, 폐, 간, 뼈, 복막, 부신, 피부 및 근육을 포함하나 이에 제한되지는 않는 대상체의 다양한 상이한 조직에서 형성될 수 있다. 원발성 종양은 유방암, 결장암, 신장암, 폐암, 피부암, 난소암, 췌장암, 직장암, 위암, 갑상선암 또는 자궁암을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 암 유형일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 하나 이상의 치료용 나노입자는 전이성 암을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 하나 이상의 치료용 나노입자는 건강 관리 시설 (예를 들어, 병원 또는 클리닉) 또는 보조 치료 시설에서 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이전에 암 (예를 들어, 원발성 암)을 갖는 것으로 진단되었다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이전에 전이성 암 (예를 들어, 림프절 내의 전이성 암)을 갖는 것으로 진단되었다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이미 원발성 암에 대한 치료적 치료를 받았다. 일부 실시양태에서, 대상체의 원발성 종양은 본원에 기재된 치료용 나노입자 중 하나로 치료하기 전에 외과적으로 제거되었다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 림프절은 본원에 기재된 치료용 나노입자 중 하나로 치료하기 전에 대상체로부터 제거되었다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암 관해 기간에 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 치료용 나노입자의 투여는 림프절에 존재하는 전이성 종양의 크기의 감소 (예를 들어, 유의한 또는 관찰가능한 감소), 림프절에 존재하는 전이성 종양의 크기의 안정화 (예를 들어, 크기의 유의한 또는 관찰가능한 변화 없음), 또는 대상체의 림프절에 존재하는 전이성 종양의 성장 속도의 감소 (예를 들어, 검출가능한 또는 관찰가능한 감소)를 발생시킨다. 건강 관리 전문가는 컴퓨터 단층촬영, 자기 공명 영상화, 양전자 방출 단층촬영 및 X선을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 상이한 영상화 기술을 사용하여 대상체의 림프절에 존재하는 전이성 종양의 크기 및/또는 크기 변화를 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 대상체의 림프절에 존재하는 전이성 종양의 크기는 요법에 대한 반응으로 대상체에서 전이성 종양의 크기가 감소 또는 안정화되었는지 여부를 결정하기 위해 요법 전 및 후에 결정될 수 있다. 대상체의 림프절에서 전이성 종양의 성장 속도는 또 다른 대상체 또는 치료를 받지 않거나 상이한 치료를 받고 있는 대상체 집단에서 전이성 종양의 성장 속도와 비교될 수 있다. 대상체의 림프절에서 전이성 종양의 성장 속도의 감소는 또한 치료적 치료 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 치료용 나노입자를 사용한 치료) 전 및 후 모두에서 림프절에서 전이성 종양의 성장 속도를 비교함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전이성 종양 (예를 들어, 림프절에서 전이성 종양)의 시각화는 전이성 종양에서 암 세포에 특이적으로 결합하는 표지된 프로브 또는 분자 (예를 들어, 원발성 암 세포의 표면 상에 존재하는 에피토프에 선택적으로 결합하는 표지된 항체)를 이용하는 영상화 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 치료용 나노입자를 대상체에게 투여하는 것은 적어도 하나의 전이성 종양을 이미 갖고 있는 대상체 (예를 들어, 림프절에 전이성 종양을 이미 갖고 있는 대상체)에서 추가적인 전이성 종양을 발병할 위험의 감소를 발생시킨다 (예를 들어, 유사한 전이성 종양을 이미 갖고 있지만 치료를 받지 않거나 대안적 치료를 받고 있는 대상체에서 추가적인 전이성 종양의 발달 속도와 비교하여). 적어도 하나의 전이성 종양을 이미 갖고 있는 대상체에서 추가적인 전이성 종양을 발병할 위험의 감소는 또한 요법을 받지 않거나 대안적 형태의 암 요법을 받는 대상체 집단에서 추가적인 전이성 종양을 발병할 위험과 비교될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료용 나노입자를 대상체에게 투여하는 것은 원발성 암 (예를 들어, 원발성 유방암)을 갖는 (예를 들어, 갖는 것으로 진단된) 대상체에서 전이성 암 (예를 들어, 림프절 내의 전이성 암)을 발병할 위험을 감소시킨다 (예를 들어, 유사한 원발성 암을 갖지만 치료를 받지 않거나 대안적 치료를 받고 있는 대상체에서 전이성 암의 발달 속도와 비교하여). 원발성 암을 갖는 대상체에서 전이성 종양을 발병할 위험의 감소는 또한 요법을 받지 않거나 대안적 형태의 암 요법을 받는 대상체 집단에서 전이성 암 형성률과 비교될 수 있다.
건강 관리 전문가는 또한 대상체에서 전이성 암의 증상의 수의 감소를 관찰함으로써 또는 대상체에서 전이성 암의 하나 이상의 증상의 중증도, 빈도 및/또는 지속시간의 감소를 관찰함으로써 전이성 암 (예를 들어, 대상체의 림프절에서 전이성 암)의 치료적 치료의 유효성을 평가할 수 있다. 전이성 암의 다양한 증상은 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원에 기재되어 있다. 림프절 내의 전이성 암의 증상의 비제한적인 예는 림프절의 통증, 림프절의 부종, 식욕 부진 및 체중 감소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 투여는 대상체에서 원발성 암 또는 전이성 암의 생존 기회의 증가 (예를 들어, 유의한 증가)를 발생시킬 수 있다 (예를 들어, 유사한 원발성 암 또는 유사한 전이성 암을 갖지만 상이한 치료적 치료를 받고 있거나 치료적 치료를 받지 않는 대상체 집단과 비교하여). 일부 실시양태에서, 투여는 원발성 암 또는 전이성 암을 갖는 대상체에 대한 개선된 예후를 발생시킬 수 있다 (예를 들어, 유사한 원발성 암 또는 유사한 전이성 암을 갖지만 상이한 치료적 치료를 받고 있거나 치료적 치료를 받지 않는 대상체 집단과 비교하여).
암 세포 침윤 또는 전이를 감소시키는 방법
또한, 대상체에서 암 세포 침윤 또는 전이를 감소시키기에 충분한 양으로 본원에 기재된 적어도 하나의 치료용 나노입자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암 세포 침윤 또는 전이를 감소시키는 방법 (예를 들어, 유의한 또는 관찰가능한 감소)이 제공된다.
이들 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포 전이는 대상체에서 원발성 종양 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 원발성 종양)으로부터 이차 조직 (예를 들어, 림프절)으로의 전이이다. 이들 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포 전이는 대상체에서 림프절로부터 이차 조직 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 이차 조직)으로의 전이이다.
일부 실시양태에서, 암 세포 침윤은 암 세포의 원발성 종양에 대해 근위에 있는 조직으로의 이동이다. 일부 실시양태에서, 암 세포 침윤은 원발성 종양으로부터의 암 세포의 림프계로의 이동이다. 일부 실시양태에서, 암 세포 침윤은 림프절에 존재하는 전이성 암 세포의 림프계로의 이동 또는 이차 조직에 존재하는 전이성 암 세포의 대상체의 인접한 조직으로의 이동이다.
대상체에서 암 세포 침윤은 본원에 기재된 임의의 영상화 기술을 사용하여 시각화에 의해 평가 또는 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 암 또는 전이성 암을 갖는 대상체의 하나 이상의 조직은 2개 이상의 시점 (예를 들어, 암 진단 직후의 시점 및 이후 시점)에서 시각화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 암 세포 침윤의 감소는 대상체에서 특정 조직을 통한 원발성 종양의 확산의 감소를 관찰함으로써 검출될 수 있다 (원발성 종양의 확산이 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 기재된 영상화 기술을 통해 평가될 때). 일부 실시양태에서, 암 세포 침윤의 감소는 대상체의 혈액 또는 림프에서 순환하는 원발성 암 세포 또는 순환하는 전이성 암 세포의 수의 감소에 의해 검출될 수 있다.
암 세포 전이는 본원에 기재되거나 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 암 세포 전이의 성공적인 감소는 적어도 하나의 전이성 종양을 이미 갖고 있는 대상체 (예를 들어, 림프절에 전이성 종양을 이미 갖고 있는 대상체)에서 추가적인 전이성 종양의 발달 속도의 감소로서 관찰될 수 있다 (예를 들어, 유사한 전이성 종양을 이미 갖고 있지만 치료를 받지 않거나 대안적 치료를 받고 있는 대상체 또는 대상체 집단에서 추가적인 전이성 종양의 발달 속도와 비교하여). 암 세포 전이의 성공적인 감소는 또한 원발성 암 (예를 들어, 원발성 유방암)을 갖는 (예를 들어, 갖는 것으로 진단된) 대상체에서 적어도 하나의 전이성 암 (예를 들어, 림프절 내의 전이성 암)을 발병할 위험의 감소로서 관찰될 수 있다 (예를 들어, 유사한 원발성 암을 갖지만 치료를 받지 않거나 대안적 치료를 받고 있는 대상체 또는 대상체 집단에서 전이성 암을 발병할 위험과 비교하여).
전이성 암 조직을 검출, 진단 및/또는 모니터링하는 방법
또한, 본원에 개시된 임의의 치료용 나노입자를 전이성 암 조직을 갖는 대상체에게 투여하는 단계 및 치료용 나노입자를 영상화하는 단계를 포함하는, 대상체에서 전이성 암 조직을 검출, 진단 및/또는 모니터링하는 방법이 본원에 제공된다.
이들 방법의 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 대상체에서 치료용 나노입자를 영상화하기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 전이성 암 조직을 검출, 진단 및/또는 모니터링하기에 충분한 치료용 나노입자의 양은 약 0.020 mg/kg 미만 (예를 들어, 약 0.001 mg/kg 내지 약 0.005 mg/kg, 약 0.005 내지 약 0.010 mg/kg, 약 0.010 mg/kg 내지 약 0.015 mg/kg, 약 0.011 mg/kg 내지 약 0.015 mg/kg, 약 0.012 mg/kg 내지 약 0.015 mg/kg, 약 0.013 mg/kg 내지 약 0.015 mg/kg, 약 0.012 mg/kg 내지 약 0.016 mg/kg, 약 0.013 mg/kg 내지 약 0.017 mg/kg, 약 0.013 mg/kg 내지 약 0.018 mg/kg, 또는 약 0.015 mg/kg 내지 약 0.020 mg/kg)이다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 전이성 암 조직을 검출, 진단 및/또는 모니터링하기에 충분한 치료용 나노입자의 양은 약 0.001 mg/kg 미만이다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 전이성 암 조직을 검출, 진단 및/또는 모니터링하기에 충분한 치료용 나노입자의 양은 약 0.014 mg/kg 미만이다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 전이성 암 조직을 검출, 진단 및/또는 모니터링하기에 충분한 치료용 나노입자의 양은 대상체에서 약물 부작용을 유도하지 않는다.
일부 실시양태에서, 영상화는 자기 공명 영상화 (MRI), 양전자 방출 단층촬영 (PET), 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT), 컴퓨터 단층촬영 (CT) 또는 이들의 임의의 조합에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 영상화는 PET-MRI에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 치료용 나노입자는 전이성 암 조직에 축적될 수 있으며, 그러므로 (예를 들어, PET 또는 PET-MRI를 통해) 영상화될 때 전이성 조직을 강조하는데 효과적일 수 있다.
투약, 투여 및 조성물
본원에 기재된 임의의 방법에서, 치료용 나노입자는 건강 관리 전문가 (예를 들어, 의사, 의사의 보조원, 간호사, 또는 실험실 또는 클리닉 작업자), 대상체 (즉, 자가-투여), 또는 대상체의 친구 또는 가족 구성원에 의해 투여될 수 있다. 투여는 임상 환경 (예를 들어, 클리닉 또는 병원에서), 생활 보조 시설 또는 약국에서 수행될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 치료용 나노입자는 암 (예를 들어, 원발성 암 또는 전이성 암)을 갖는 것으로 진단된 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 유방암 (예를 들어, 전이성 유방암)으로 진단되었다. 일부 비제한적인 실시양태에서, 대상체는 남성 또는 여성, 성인, 청소년 또는 어린이이다. 대상체는 암 또는 전이성 암 (예를 들어, 림프절 내의 전이성 암)의 하나 이상의 증상을 경험하였을 수 있다. 대상체는 또한 중증 또는 진행된 단계의 암 (예를 들어, 원발성 또는 전이성 암)을 갖는 것으로 진단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 적어도 하나의 림프절에 존재하는 전이성 종양을 갖는 것으로 식별되었을 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 림프절제술 및/또는 유방절제술을 이미 거쳤을 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 본원에 기재된 임의의 자성 입자 또는 제약 조성물 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)를 함유하는 조성물의 적어도 하나 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30개)의 용량을 투여받는다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 적어도 하나의 자성 입자 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 자성 입자 또는 제약 조성물)은 대상체에게 정맥내로, 동맥내로, 피하로, 복강내로 또는 근육내로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 자성 입자 또는 제약 조성물은 대상체의 림프절로 직접적으로 투여 (주사)된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 적어도 하나의 치료용 나노입자 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 치료용 나노입자 또는 제약 조성물) 및 적어도 하나의 추가적인 치료제를 투여받는다. 적어도 하나의 추가적인 치료제는 화학요법제 (예를 들어, 시클로포스파미드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 발루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포시드, 테니포시드, 타플루포시드, 아자시티딘, 아자티오프린, 카페시타빈, 시타라빈, 독시플루리딘, 플루오로우라실, 젬시타빈, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 티오구아닌, 블레오마이신, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 보르테조밉, 카르필조밉, 살리노스포라미드 A, 올트랜스 레티노산, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈) 및/또는 진통제 (예를 들어, 아세트아미노펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 멜록시캄, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 페닐부타존, 피록시캄, 술린닥, 톨메틴, 셀레콕시브, 부프레노르핀, 부토르파놀, 코데인, 히드로코돈, 히드로모르폰, 레보르파놀, 메페리딘, 메타돈, 모르핀, 날부핀, 옥시코돈, 옥시모르폰, 펜타조신, 프로폭시펜 및 트라마돌)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가적인 치료제 및 적어도 하나의 치료용 나노입자 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 치료용 나노입자)는 동일한 조성물 (예를 들어, 동일한 제약 조성물)로 투여된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가적인 치료제 및 적어도 하나의 치료용 나노입자는 상이한 투여 경로를 사용하여 대상체에게 투여된다 (예를 들어, 경구 투여에 의해 전달되는 적어도 하나의 추가적인 치료제 및 정맥내 투여에 의해 전달되는 적어도 하나의 치료용 나노입자).
본원에 기재된 임의의 방법에서, 적어도 하나의 치료용 나노입자 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 치료용 나노입자 또는 제약 조성물) 및 임의로 적어도 하나의 추가적인 치료제는 적어도 주 1회 (예를 들어, 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회, 1일 1회, 1일 2회 또는 1일 3회) 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 상이한 치료용 나노입자는 동일한 조성물 (예를 들어, 액체 조성물)로 투여된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 치료용 나노입자 및 적어도 하나의 추가적인 치료제는 동일한 조성물 (예를 들어, 액체 조성물)로 투여된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 치료용 나노입자 및 적어도 하나의 추가적인 치료제는 2개의 상이한 조성물 (예를 들어, 적어도 하나의 치료용 나노입자를 함유하는 액체 조성물 및 적어도 하나의 추가적인 치료제를 함유하는 고체 경구 조성물)로 투여된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 환제, 정제 또는 캡슐로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 지속-방출 경구 제형으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가적인 치료제는 적어도 하나의 치료용 나노입자 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 치료용 나노입자 또는 제약 조성물)을 투여하기 전에 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가적인 치료제는 적어도 하나의 치료용 나노입자 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 자성 입자 또는 제약 조성물)을 투여한 후 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가적인 치료제 및 적어도 하나의 치료용 나노입자 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 치료용 나노입자 또는 제약 조성물)은 대상체에서 하나 이상의 추가적인 치료제 및 적어도 하나의 치료용 나노입자 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 치료용 나노입자)의 생체활성 기간에 중첩이 있도록 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 연장된 기간 (예를 들어, 적어도 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년 또는 10년의 기간)에 걸쳐 적어도 하나의 치료용 나노입자 또는 제약 조성물 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 치료용 나노입자 또는 제약 조성물)을 투여받을 수 있다. 숙련된 의료 전문가는 치료의 유효성을 진단하거나 추적하기 위해 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 (예를 들어, 상기 방법 및 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여) 치료 기간의 길이를 결정할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 숙련된 의료 전문가는 또한 대상체에게 투여되는 치료용 나노입자 (및/또는 하나 이상의 추가적인 치료제)의 정체 및 수를 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)시킬 수 있고, 또한 치료 유효성의 평가 (예를 들어, 본원에 기재되고 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여)에 기초하여 대상체에 대한 적어도 하나의 치료용 나노입자 (및/또는 하나 이상의 추가적인 치료제)의 투여량 또는 투여 빈도를 조정 (예를 들어, 증가 또는 감소)할 수 있다. 숙련된 의료 전문가는 언제 치료를 중단할지 추가로 결정할 수 있다 (예를 들어, 대상체의 증상이 유의하게 감소되는 경우).
치료용 나노입자를 제조하는 방법
또한, 하기를 포함하는, 본 개시내용의 임의의 치료용 나노입자를 제조하는 방법이 본원에 제공된다: 자성 나노입자를 제조하는 단계 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 방법 중 임의의 하나를 통해), 핵산 분자를 자성 나노입자에 공유결합적으로 연결하는 단계; 약 40:1 당량 (eq.)의 비율 (즉, 40 당량의 킬레이트제 대 1 당량의 자성 나노입자)로 자성 나노입자를 킬레이트제와 반응시킴으로써 킬레이트제를 자성 나노입자 (MN)에 공유결합적으로 연결하는 단계, 자성 나노입자에 64CuCl2 용액을 첨가하는 단계, 및 64CuCl2 용액 및 자성 나노입자의 혼합물을 정제하여 치료용 나노입자를 생성하는 단계.
일부 실시양태에서, 방법은 약 5:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 60:1 킬레이트제 당량:MN (예를 들어, 약 5:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 10:1 킬레이트제 당량:MN, 약 5:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 12:1 킬레이트제 당량:MN, 약 5:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 15:1 킬레이트제 당량:MN, 약 5:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 20:1 킬레이트제 당량:MN, 약 5:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 25:1 킬레이트제 당량:MN, 약 5:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 30:1 킬레이트제 당량:MN, 약 5:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 35:1 킬레이트제 당량:MN, 약 5:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 40:1 킬레이트제 당량:MN, 약 5:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 45:1 킬레이트제 당량:MN, 약 5:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 50:1 킬레이트제 당량:MN, 약 5:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 55:1 킬레이트제 당량:MN, 또는 약 5:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 60:1 킬레이트제 당량:MN, 약 10:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 12:1 킬레이트제 당량:MN, 약 10:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 15:1 킬레이트제 당량:MN, 약 10:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 20:1 킬레이트제 당량:MN, 약 10:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 25:1 킬레이트제 당량:MN, 약 10:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 30:1 킬레이트제 당량:MN, 약 10:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 35:1 킬레이트제 당량:MN, 약 10:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 40:1 킬레이트제 당량:MN, 약 10:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 45:1 킬레이트제 당량:MN, 약 10:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 50:1 킬레이트제 당량:MN, 약 10:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 55:1 킬레이트제 당량:MN, 또는 약 10:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 60:1 킬레이트제 당량:MN, 약 15:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 20:1 킬레이트제 당량:MN, 약 15:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 25:1 킬레이트제 당량:MN, 약 15:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 30:1 킬레이트제 당량:MN, 약 15:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 35:1 킬레이트제 당량:MN, 약 15:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 40:1 킬레이트제 당량:MN, 약 15:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 45:1 킬레이트제 당량:MN, 약 15:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 50:1 킬레이트제 당량:MN, 약 15:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 55:1 킬레이트제 당량:MN, 또는 약 15:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 60:1 킬레이트제 당량:MN, 약 20:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 45:1 킬레이트제 당량:MN, 약 25:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 45:1 킬레이트제 당량:MN, 약 30:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 45:1 킬레이트제 당량:MN, 약 35:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 45:1 킬레이트제 당량:MN, 약 40:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 45:1 킬레이트제 당량:MN, 약 35:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 50:1 킬레이트제 당량:MN, 약 38:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 40:1 킬레이트제 당량:MN, 약 38:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 42:1 킬레이트제 당량:MN, 약 38:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 45:1 킬레이트제 당량:MN, 약 40:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 50:1 킬레이트제 당량:MN, 약 40:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 55:1 킬레이트제 당량:MN, 또는 약 40:1 킬레이트제 당량:MN 내지 약 60:1 킬레이트제 당량:MN) 범위의 비율로 자성 나노입자를 킬레이트제와 반응시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 킬레이트제를 자성 나노입자에 공유결합적으로 연결하는 단계는 약 0℃ 내지 약 8℃ (예를 들어, 약 0℃ 내지 약 4℃, 약 1℃ 내지 약 4℃, 약 2℃ 내지 약 4℃, 약 3℃ 내지 약 4℃, 약 2℃ 내지 약 6℃, 약 3℃ 내지 약 7℃, 약 4℃ 내지 약 5℃, 약 4℃ 내지 약 6℃, 약 4℃ 내지 약 7℃, 또는 약 4℃ 내지 약 8℃)의 온도에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 킬레이트제를 자성 나노입자에 공유결합적으로 연결하는 단계는 약 4℃의 온도에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 이들 방법은 64CuCl2 용액 및 자성 나노입자의 혼합물을 약 40℃ 내지 약 65℃ (예를 들어, 약 40℃ 내지 약 65℃, 약 45℃ 내지 약 65℃, 약 50℃ 내지 약 65℃, 약 55℃ 내지 약 65℃, 약 56℃ 내지 약 65℃, 약 57℃ 내지 약 65℃, 약 58℃ 내지 약 65℃, 약 59℃ 내지 약 65℃, 약 58℃ 내지 약 62℃, 약 59℃ 내지 약 61℃, 약 58℃ 내지 약 63℃, 약 59℃ 내지 약 63℃, 약 59℃ 내지 약 60℃, 약 60℃ 내지 약 61℃, 또는 약 60℃ 내지 약 62℃)의 온도에서 가열하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 방법은 64CuCl2 용액 및 자성 나노입자의 혼합물을 약 60℃의 온도에서 가열하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 이들 방법은 64CuCl2 용액 및 자성 나노입자의 혼합물을 약 10분 내지 약 30분 (예를 들어, 약 10분 내지 약 20분, 약 11분 내지 약 21분, 약 12분 내지 약 22분, 약 13분 내지 약 23분, 약 14분 내지 약 24분, 약 15분 내지 약 25분, 약 16분 내지 약 26분, 약 13분 내지 약 20분, 약 15분 내지 약 20분, 약 15분 내지 약 22분, 약 18분 내지 약 20분, 약 18분 내지 약 22분, 약 19분 내지 약 21분, 약 19분 내지 약 23분, 약 20분 내지 약 25분, 또는 약 20분 내지 약 30분) 동안 가열하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 방법은 64CuCl2 용액 및 자성 나노입자의 혼합물을 약 20분 동안 가열하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 이들 방법은 치료용 나노입자를 약 65℃를 초과하는 온도에 적용하지 않는다. 일부 실시양태에서, 이들 방법은 치료용 나노입자를 약 60℃를 초과하는 온도에 적용하지 않는다. 일부 실시양태에서, 킬레이트제를 사용하여 방사성표지를 치료용 나노입자와 회합시키는 것을 포함하는 본원에 개시된 방법은 유리하게는 핵산 분자를 잠재적으로 손상시킬 수 있는 임의의 가혹한 조건 (예를 들어, 약 20분 이상 동안 약 60℃를 초과하는 온도)을 회피한다.
실시예
본 개시내용의 특정 실시양태는 청구범위에 기재된 임의의 실시양태의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.
실시예 1. MN-항-miR10b의 시험관내 연구
20 내지 35 nm 덱스트란-코팅된 치료용 자성 나노입자는 인간 miRNA-10b를 표적화하는 안티센스 잠금 핵산 (LNA) 올리고뉴클레오티드로 관능화되었다. 생성된 치료용 자성 나노입자 (MN)는 이하 "MN-항-miR-10b"로 지칭된다. 이들 치료용 자성 나노입자를 테스트하는 시험관내 세포 연구를 하기 기재된 바와 같이 수행하였다.
21.6 ± 0.5-nm 덱스트란 코팅된 자성 나노입자를 miRNA-10b를 표적화하는 8 ± 0.7 LNA 안타고미르에 접합시켰다 (엑시콘(Exiqon), 미국 매사추세츠주 워번) (도 1A). MN-항-miR10b 치료제는 인간 림프절 전이성 MDA-MB-231-luc-D3H2LN 세포주 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 매사추세츠주 홉킨턴)에서 기능적이었다. 효능의 피크는 MN-항-miR10b (0.7 nmoles ASO/ml)와 함께 48시간 인큐베이션 후에 달성되었으며, 이 시점에서 무관한 올리고뉴클레오티드 (엑시콘, 미국 매사추세츠주 워번)로 관능화된 비활성 치료용 MN-scr-miR과 비교하여 표적 miRNA-10b의 유의한 86.3 ± 5.8% 억제가 있었다 (도 1B). 이들 결과는 전달 방법 및 치료 설계가 종양 세포에서 miRNA-10b를 매우 효율적으로 억제하는데 사용될 수 있음을 나타내었다. 이 방법론의 치료적 잠재성을 평가하기 위해, 종양 세포 아폽토시스, 증식, 침윤 및 이동에 대한 miR-10b 억제의 효과를 조사하였다.
치료제에 의한 miR-10b 억제는 유의한 아폽토시스 유도, 증식 억제, 및 침윤 및 이동의 감소를 유발하는 것으로 밝혀졌다 (도 2). 또한, 저용량의 세포독성 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신)의 공동투여에 의해 치료제의 유효성이 증폭되어 종양 성장의 억제 뿐만 아니라 퇴행 및 가능하게는 전이 제거를 유발할 수 있다는 가설을 세웠다. 치료제 (0.5 μM) 및 저용량의 독소루비신 (0.05 μM, <IC10)을 사용한 조합 치료 후, 종양 세포가 방추-유사 형상을 획득하고 분리되고 사멸하는 것이 관찰되었다 (도 2A). 이는 유의한 아폽토시스 유도 (도 2B) 및 증식 감소 (도 2C)에 상응하였다. 세포 주기에 대한 조합 치료의 효과의 분석은 독소루비신 및 치료제 사이에서 관찰된 시너지의 기초가 되는 잠재적 메커니즘을 밝혀내었다. 즉, 독소루비신은 단독으로 또는 치료제와 조합하여 배수성 및 G2/M 정지를 유도하였다 (도 2D). 이는 기재된 시나리오에서 독소루비신이 종양 세포에서 세포 주기를 억제하고 세포 분열 속도를 감소시킴으로써 MN-항-miR10b 치료제의 프로-아폽토시스 효과를 증폭시켰으며, 아마도 치료제의 더 높은 국소 농도를 보장함으로써 가능하다는 것을 나타내었다. 이 가설에 따라, 저용량 독소루비신 및 MN-항-miR10b가 조합되었을 때, 사전-G1 아폽토시스 및 G2/M 정지된 세포 집단 둘 모두의 증가가 있었다 (도 2D). 이들 연구는 기재된 치료제를 사용하여 저용량 세포증식억제제, 예컨대 독소루비신 및 miR-10b 억제를 조합함으로써 이의 종점에서 종양 세포 사멸 및 침윤성 특성의 손실로 나타나는 종양 세포 표현형에 대한 중대한 효과를 매개할 수 있음을 나타내었다. 이들 결과는 또한 miR-10b가 온코미르 중독의 배후 메커니즘과 유사한 종양 세포 생존에 필수적인 메타스타미르임을 시사하였다. 이 가설에 대한 추가 증거는 MDA-MB-231-luc-D3H2LN 세포주로부터 유래된 miR-10b 녹아웃 서브라인을 생성하려고 시도한 실험으로부터 나왔다 (도 3A). 녹아웃 벡터 세트 (TALENs L+R)를 사용한 형질감염의 24시간 이내에, 세포는 방추-형상 입체형태를 획득하고 분리되기 시작한 것으로 관찰되었다. 형질감염 72시간까지, 생존가능한 세포가 없었다 (도 3B). 이러한 후자의 결과는 독소루비신의 부재 하에서도 더 높은 용량의 MN-항-miR10b 치료제 단독으로 치료함으로써 강력한 치료 효과를 가능하게 달성할 수 있음을 시사하였다.
실시예 2. MN-항-miR10b 치료제는 생체내에서 원격 전이성 종양 세포에 전달될 수 있다
치료용 나노입자 및 저용량 화학요법제를 사용하여 miR-10b를 표적화하는 것이 치료 시나리오에 중대한 영향을 미칠 수 있다는 것을 시험관내에서 확립한 후, 관찰된 치료 효과가 생체내에서 달성될 수 있는지 여부가 결정되었다. 제1 단계는 치료제가 표적 전이성 장기에 전달될 수 있는지 여부를 평가하는 것이었다.
형광으로 표지된 치료제 (MN 상에 Cy5.5로 표지됨)를 뮤린 유방 선암종 4T1-luc2 세포주를 정위적으로 이식받은 balb/c 마우스에 주사하였다. 이 모델에서, 정위적으로 이식된 종양은 종양 접종 후 3주까지 편재화된 질환으로부터 림프절, 폐 및 뼈 전이로 진행한다. 치료제의 정맥내 주사 후 24시간에 수행된 생체외 근적외선 (NIRF) 광학 영상화는 림프절, 폐 및 뼈에서 전이성 병변에 의한 흡수를 밝혀내었다 (도 4A). 형광 현미경검사법은 이들 장기에서 전이성 종양 세포에 의한 광범위한 흡수를 확인하였고 (도 4B), 이는 치료제가 설계된 바와 같이 원격 장기에 파종된 암을 표적화할 수 있다는 본 발명자들의 가설을 뒷받침한다.
세망내피계의 장기에서 MN-항-miR10b의 낮은 수준의 축적이 예상되었다. 그곳에서 이는 세포에 의해 흡수되어 빠르게 분해되었다. 산화철 코어로부터의 철은 내인성 철 풀로 들어간 반면, 나노입자 코팅으로부터의 덱스트란은 신장을 통해 청소되었다. 확립된 뇌 전이를 갖는 동물에서 생체내 영상화 (도 4C)를 수행하고, 전이성 병변에 의한 흡수를 입증하였다. 이는 이 모델에서 혈액-뇌 장벽의 파괴 정도가 치료제 전달을 허용하기에 충분하다는 것을 시사하였다.
실시예 3. MN-항-miR10b를 사용한 요법은 림프절 전이의 퇴행을 촉발할 수 있다
본 발명자들의 치료적 접근법의 임상적 번역에 대한 전망과 함께, 저용량 독소루비신 (4 mg/kg 매주 i.p.) 및 MN-항-miR10b 치료제 (15 mg/kg Fe, 10 mg/kg ASO 매주 i.v.)를 림프절 전이성 유방암 퇴행의 목표와 조합하였다. 구체적으로, 종양 접종 후 4-5주에, 정위 MDA-MB-231-luc-D3H2LN 종양을 보유하는 마우스는 림프절 전이의 확인 후 외과적으로 제거된 원발성 종양을 가졌다. 이는 임상 시나리오를 더 잘 시뮬레이션하기 위해 수행되었으며, 현재 치료 표준은 림프절 전이성 유방암을 갖는 환자에서 원발성 종양의 외과적 제거를 수반하기 때문이다.
치료를 종양 제거 주에 개시하였다. 4주의 요법 후 MN-항-miR10b 및 저용량 독소루비신으로 치료된 실험 마우스에서 림프절 전이의 완전한 퇴행이 있었다 (도 5A 및 5B). 대조적으로, 대조군에서 전이성 진행이 있었다. 실험 마우스에서, 4주차에 완전한 전이성 퇴행이 관찰되면 치료를 중단하였다. 여전히, 연구의 종점까지 재발은 관찰되지 않았다 (도 5A 및 5B).
생체외 분석은 PBS 또는 독소루비신과 함께 또는 없이 비활성 치료제로 치료된 대조군 동물에서 림프절 전이 및 폐로의 전이성 파종의 존재를 밝혀내었다 (도 5C). MN-항-miR10b 단독으로 처리된 마우스에서, 폐가 아닌 림프절로의 전이의 증거가 있었다. 대조적으로, MN-항-miR10b 및 독소루비신으로 처리된 마우스에서 육안적 림프절 또는 폐 전이가 검출될 수 없었다 (도 5C).
MN-항-miR10b 및 저용량 독소루비신을 사용한 요법의 효과는 또한 체중 (도 5D) 및 생존 (도 5E)의 유의한 개선으로 번역되었다. 대조군과 달리, 요법 시작 후 14주차까지, 실험 동물 (MN-항-miR10b/독소루비신) 중 어느 것도 암에 걸리지 않았다. 또한, 독소루비신 및 MN-항-miR10b를 사용한 조합 요법은 치료제를 사용한 단독요법보다 우수하였다 (도 5A, 5B, 5C 및 5E).
요법 15주차까지, 간단한 해부학적 관찰에 의해 실험 동물 및 대조군 동물 사이의 차이가 명백하였다. MN-scr-miR 및 독소루비신으로 처리된 대조군 동물은 육안적 림프절병증 및 악액질을 나타내었다. MN-항-miR10b 및 독소루비신으로 처리된 실험 동물은 건강한 것으로 보였다. 장기간 관찰은 전이성 질환의 관해가 영구적이고 처리가 동물의 자연적인 생명을 위한 효과적인 치유를 발생시켰음을 나타내었다. 효능이 입증되었으므로 전신 독성의 중요한 문제를 해결할 필요가 있었다. 신장, 간 독성 등의 지표를 포함하는 혈액 화학 마커 패널을 분석하였으며, 치료제의 구성성분에 할당될 수 있는 유의한 효과는 발견되지 않았다. 주요 장기의 조직병리학은 육안적 조직 이상의 부재를 입증하였다.
실시예 4 - MN-항-miR10b를 사용한 요법은 원격 전이의 퇴행을 촉발할 수 있다
원격 전이와 특정 관련성으로, 저용량 독소루비신 (2 mg/kg 매주 i.p.) 및 MN-항-miR10b 치료제 (15 mg/kg Fe, 10 mg/kg ASO 매주 i.v.)를 정위 4T1-luc2 유방 종양을 보유하는 면역적격 마우스 (Balb/c)에서 조합하였다. PBS로 처리된 대조군 마우스에서, 전이는 빠르게 진행되었고 (도 6A 및 6B), 5주차까지 100% 동물 사망률을 발생시켰다 (도 6C). MN-scr-miR+dox로 처리된 마우스에서, 전이는 PBS 대조군에서보다 더 천천히 성장하였다 (도 6A 및 6B). 7주차까지 80% 암 사망률이 있었다 (도 6A 및 6B). 대조적으로, MN-항-miR10b+dox로 처리된 마우스에서, 6주차까지 분명한 원격 전이의 퇴행이 관찰되었으며 (도 6A 및 6B), 이 시점에서 치료를 중단하였다 (도 6A의 적색 화살표). 동물은 실험 과정 동안 전이가 없는 상태를 유지하였다. 퇴행은 동물의 65%에서 성취된 반면, 동물의 35%는 이 그룹에서 miR-10b의 비효율적인 억제로 인해 진행되었다 (도 6C). 부검 후 폐의 거시적 관찰은 MN-항-miR10b+dox로 처리된 응답자에서 전이성 병변의 부재를 확인하였다 (도 6D).
실시예 5. nat/64Cu-MN-항-miR10b의 합성 및 특징화
Cu-64 (64Cu)로 방사성표지된 항-miR10b 및 초소형 산화철 자성 나노입자 (MN) (이하 "64Cu-MN-항-miR10b"로 지칭됨)의 합성은 이전에 합성이 보고된 20-nm 아민화된 덱스트란-코팅된 산화철 나노입자인 MN의 변형으로 시작하였다 (Yoo et al., 2014). 나노입자는 종양 및 전이성 병변의 간질로의 작용제의 혈관외유출을 향상시키기 위해 최적화되었다 (Yoo et al., 2017a). MN 나노입자는 아미노 기 및 NODAGA의 활성화된 에스테르 모이어티 사이의 커플링 반응에 의해 킬레이트화 리간드인 NODAGA로 관능화되었다 (도 7). NODAGA 킬레이트제는 고도로 안정한 64Cu 복합체를 빠르게 형성하는 능력을 가졌으며, 이는 방사성금속의 생체내 해리 및 이의 후속 체내 체류를 방지하는데 필수적이다. 나노입자당 NODAGA 킬레이트제의 수는 13 ± 2로 정량화되었다. Cu/나노입자의 비율은 natCuCl2를 사용하여 복합체 형성 후 ICP-MS에 의해 14 ± 1로 결정되었다. 생체내 연구 전에, 나노입자를 SPDP로 처리하고, 디술피드 연결을 통해 항-miR-10b 안타고미르로 관능화하였다. 나노입자당 안타고미르의 수는 이전에 기재된 절차에 따라 7.4 ± 0.2로서 특징화되었다 (Yoo et al., 2014; Yoo et al., 2015). 이들 치료용 자성 방사성표지된 나노입자를 하기 기재된 바와 같이 생성하고 특징화하였다. 모든 반응물질 및 시약은 상업용 등급이었고, 추가 정제 없이 사용되었다. 모든 용액을 MilliQ 물로부터 제조하였다. 방사성표지를 위해 사용된 금속-비함유 버퍼 용액을 Chelex 100 수지 (100-200 메쉬, 바이오래드(BioRad))를 사용하여 제조하였다.
64Cu-MN-항-miR10b의 생체내 생체분포의 평가는 효율적인 표지 및 정제 방법의 개발을 필요로 한다. MN-항-miR10b의 방사성표지는 pH 6.8, 60℃에서 20분 동안 아세테이트 버퍼에서 달성되었다. 이들 조건은 나노담체의 무결성을 유지하면서 NODAGA 킬레이트제의 표지에 유리하다. PD-10 컬럼에서 정제 후, 7.1 mCi/mg 철의 비활성으로 방사화학적 순도 >99% (도 8A)를 갖는 64Cu-MN-항-miR10b를 수득하였다. 크기-배제 크로마토그래피에 의해 방사화학적 정체를 확인하였다 (도 8B). 또한, natCu-MN-항-miR10b를 합성하여 나노입자 크기 및 표적 결착에 대한 Cu-NODAGA 킬레이트의 존재의 효과를 평가하였다. 코어 내의 산화철 결정의 크기는 natCu-MN-항-miR10b의 경우 4.71 ± 0.24 nm 및 MN의 경우 4.69 ± 0.23 nm로서 측정되었다. 표면 변형은 투과 전자 현미경검사법 (TEM, 도 8C)에 의해 나타낸 바와 같이 산화철 코어의 크기 및 결정 구조의 어떠한 유의한 변화도 야기하지 않았다. 덱스트란 코팅된 관능화된 나노입자, natCu-MN-항-miR10b의 유체역학적 직경은 27.1 ± 0.9 nm로 결정되었으며, 이는 부모 MN보다 5.1 nm 더 크다. Cu-NODAGA 및 항-miR10b 안타고미르의 도입은 유체역학적 직경의 23% 증가를 발생시켰다 (도 8D).
세포당 원소 철로서 표현된 세포 흡수는 MN-항-miR10b의 경우 세포당 9.33 ± 2.42 pg Fe 및 natCu-MN-항-miR10b의 경우 세포당 11.34 ± 3.62 pg Fe였으며, 이는 유의하게 상이하지 않았다 (도 8E). 최종적으로, RNA-풍부한 세포 추출물을 분석하여 qRT-PCR에 의해 miR10b의 억제를 비교하였다. 안타고미르가 없는 부모 MN으로 처리 후 miR10b의 발현 수준과 비교하여, miR10b 발현은 MN-항-miR10b 또는 natCu-MN-항-miR10b로 처리 후 완전히 억제되었다 (도 8F).
NODAGA-MN-항-miR10b의 합성
nat/64Cu-MN-항-miR10b의 합성을 위한 단계는 도 7에 요약되어 있다. 이전에 기재된 바와 같이 에피클로로히드린 및 수산화암모늄으로 변형을 통해 덱스트란-코팅된 산화철 나노입자로부터 아민-유도체화된 산화철 나노입자 (MN)를 제조하였다 (Yoo et al., 2014). 100 μl PBS 버퍼 (100 mM, pH 7.4) 중 2.54 mg의 NODAGA-NHS 에스테르 (3.47 μmol, MN에 대한 40 당량)와 1 ml의 MN (87 μM, 10 mg Fe/ml, 54 NH2/MN)을 반응시킴으로써 나노입자를 NODAGA-NHS (케마테크(Chematech), 프랑스)와 접합시켰다. 반응을 밤새 4℃에서 수행한 후, 생성된 NODAGA-접합된 나노입자 (NODAGA-MN)를 뉴클레아제-비함유 PBS 버퍼를 용리액으로서 사용하여 크기 배제 컬럼 (PD-10, 지이 헬스케어(GE Healthcare))으로 정제하였다. NODAGA-MN을 4시간 동안 4℃에서 과량의 SPDP (250 당량)로 처리하여 NODAGA-MN-SPDP를 형성하였으며, 이를 다시 뉴클레아제-비함유 PBS 버퍼를 용리액으로서 사용하여 크기 배제 컬럼으로 정제하였다. LNA 안타고미르, 항-miR10b는 GLP 프로토콜에 따라 바이오스프링(Biospring) (독일 프랑크푸르트)에 의해 합성 및 제공된다. 항-miR10b LNA 안타고미르를 5'-티올-변형제 C6 디술피드 (5'-티오MC6)로 변형시켰으며, 이를 MN에 대한 접합을 위해 이용하였다. 올리고뉴클레오티드 상의 디술피드를 3% 트리스 (2-카르복시에틸) 포스핀 히드로클로라이드 (TCEP, 써모 사이언티픽 캄파니(Thermo Scientific Co.))에 의해 활성화시킨 후, MN에 대한 접합 전에 암모늄 아세테이트/에탄올 침전 처리로 정제하였다. TCEP 활성화 및 정제 후, 올리고를 뉴클레아제-비함유 물에 용해시키고, NODAGA-MN-SPDP와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 최종 생성물인 NODAGA-MN-항-miR10b를 동물 연구 전에 신선하게 제조하였다.
비방사성 natCu-MN-항-miR10b의 제조
4T1 세포에서 miR-10b의 억제 효과를 평가하기 위해 비방사성 natCu-MN-항-miR10b를 제조하였다. NODAGA-MN-항-miR10b의 0.6 mg Fe를 아세테이트 버퍼 (500 μL, pH 6.8, 0.1 M)에 분산시킨 후, CuCl2 (0.7 mg, NODAGA에 대해 50 당량 Cu2+)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 20분 동안 교반하고, EDTA (100 μL, 100 mM, pH 7.4)를 혼합물에 첨가하여 임의의 비표지된 유리 Cu2+ 이온을 제거한 후, 뉴클레아제-비함유 PBS 버퍼를 용리액으로서 사용하여 크기 배제 컬럼 (PD-10, 지이 헬스케어)으로 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획물을 조합하고, natCu-MN-항-miR10b의 농도를 ICP-MS에 의해 결정하였다.
방사성표지된 MN-항-miR10b (64Cu-MN-항-miR10b)의 제조
일반적으로 사용되는 절차에 따라 방사성표지를 수행하였다 (Desogere et al., 2017). 간략하게, PBS 중 200 μg (Fe로서)의 NODAGA-MN-항-miR10b를 아세트산나트륨 버퍼 (0.1 M, pH 6.8, 500 μL) 중 64CuCl2 용액 (4 mCi, 148 MBq, 미국 위스콘신주 매디슨의 위스콘신 대학교)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 20분 동안 가열한 후, 뉴클레아제-비함유 PBS 버퍼를 용리액으로서 사용하여 크기 배제 컬럼 (PD-10 컬럼)으로 정제하고, 각각의 500 μL의 용리액을 분획물로서 수집하였다. 각각의 분획물의 방사화학적 순도를 방사성-TLC 영상화 스캐너 (AR-2000, 에커트 앤드 치글러(Eckert & Ziegler), 독일 베를린)를 사용하여 용리액으로서 EDTA 용액 (50 mM, pH 5)으로 iTLC (애질런트(Agilent), iTLC-SG, 미국 캘리포니아주 산타클라라)에 의해 제어하였다. 방사화학적 순도 > 99%를 갖는 분획물을 조합하고 생체내 동물 연구를 위해 사용하였다. 64Cu-MN-항-miR10b의 최종 용액의 방사화학적 정체는 크기 배제 컬럼 (TSK 겔 QC-PAK-300, 등용매, 100% 인산나트륨 0.1 M pH 7.4, 20분)을 갖는 분석적 HPLC (애질런트 1100 HPLC 시스템, 미국 캘리포니아주 산타클라라) 및 규소 PIN 포토다이오드 및 254 nm에서 UV 검출을 갖는 캐롤/램지(Carroll/Ramsey) 방사능 검출기에 의해 확인하였다.
MN-항-miR10b 및 natCu-MN-항-miR10b의 특징화
유도 결합 플라즈마 질량 분광법 (ICP-MS) 분석 (애질런트 8800-QQQ 시스템, 미국 캘리포니아주 산타클라라)을 수행하여 구리 및 철의 농도를 결정하였다. 모든 샘플을 중량 기준으로 제조하였다. 인증된 구리 및 철 표준 (1000 mg/L)을 희석함으로써 교정 표준을 제조하였다. 0.1 내지 400 ppb 범위의 5개의 표준 용액으로부터 교정 곡선을 수득하였다. 샘플의 적절한 도입을 보장하기 위해 루테튬 (1 ppm)을 외부 표준으로서 사용하였다. 유체역학적 직경 및 제타-전위를 동적 광 산란 분광기 (제타사이저 나노(Zetasizer Nano), 영국 맬번)에 의해 측정하고, 산화철 코어의 크기를 투과 전자 현미경검사법 (JEM 2100 TEM, Jeol, 일본 도쿄)에 의해 결정하였다. MN당 NODAGA의 수를 정량화하기 위해, NODAGA와의 접합 후 MN당 아민의 수에서 MN당 아민의 수를 뺀다. MN당 아민의 수를 1:1 비율로 아민 기에 접합된 SPDP로부터 방출된 피리딘-2-티온 (343nm, 8080 M-1cm-1)에 의해 정량화하였다 (써모피셔(ThermoFisher), 미국 매사추세츠주 월섬). 최종적으로, MN당 올리고뉴클레오티드의 수를 상이한 농도의 다중 표준을 사용하여 분광광도법에 의해 결정하였다. 간략하게, MN-항-miR10b 및 natCu-MN-항-miR10b를 자성 컬럼 (MACS 컬럼, 밀테니(Miltenyi), 미국 매사추세츠주 케임브리지)을 사용하여 정제하여 결합되지 않은 항-miR10b 올리고를 제거하였다. 분광광도법 (스펙트라맥스(Spectramax) M2 마이크로플레이트 판독기, 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 서니베일)에 의해 정제된 나노입자를 검정하여 철 농도 (410 nm) 및 올리고 농도 (260 nm)를 결정하였다.
방사성표지된 89Zr-MN-항-miR10b의 제조 및 특징화
89Zr-MN-항-miR10b의 합성을 위한 단계는 도 9에 요약되어 있다. 데페록사민 (DFO)의 이소티오시아네이트 유도체 (DFO-Bz-NCS, 매크로시클릭스(Macrocyclics), 미국 텍사스주 플레이노)를 MN 상의 아민 기에 접합시켜 티오우레아 결합을 형성하였다 (12, 13). MN-항-miR10b (5 mg/mL)를 0.1 M NaHCO3 (0.9% NaCl 함유, pH 8.9)에 분산시키고, 5배 몰 과량의 DFO-Bz-NCS (DFO-NCS, DMSO 중 1 mg/mL)와 반응시켰다. 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 로커(rocker)에 놓고, 1 M 트리스를 첨가하여 접합 반응을 종결시켰다 (트리스의 최종 농도:15 mM). 89Zr-MN-항-miR10b의 특징화는 상기 요약된 MN-항-miR10b 및 natCu-MN-항-miR10b의 특징화와 동일한 단계를 따랐다. 예를 들어, MN당 DFO의 수를 정량화하기 위해, DFO와의 접합 후 MN당 아민의 수에서 MN당 아민의 수를 뺐다. 도 10은 본원에 기재된 치료용 자성 방사성표지된 나노입자의 합성에 적합할 수 있는 추가의 예시적인 킬레이트제를 보여준다.
세포 흡수
natCu-MN-항-miR10b의 세포 흡수를 MN-항-miR10b 및 부모 MN과 비교하였다. 4T1-luc 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하고, 24시간 동안 37℃에서 natCu-MN-항-miR10b, MN-항-miR10b 및 MN과 함께 인큐베이션하였다. DPBS로 세척한 후, 세포를 용해시키고 (세포 용해 버퍼, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스), ICP-MS에 의해 분석하여 철의 농도를 결정하였다. 단백질 농도를 BCA 검정 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)에 의해 결정하였다. 나노입자의 세포 흡수를 총 단백질에 의해 정규화하였다.
실시간 정량적 역전사-PCR
비표지된 MN-항-miR10b와 비교하여 natCu-MN-항-miR10b에 의한 표적 결착을 평가하기 위해, 4T1-luc 세포를 natCu-MN-항-miR10b, MN-항-miR10b 및 MN과 함께 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 용해물로부터, 제조업체의 프로토콜 (퀴아젠 인크.(Qiagen Inc.), 독일 힐덴)에 따라 miRNeasy 미니 키트를 사용하여 마이크로RNA-풍부한 분획물을 수확하였다. miR-10b의 상대적 발현을 실시간 정량적 역전사-PCR (qRT-PCR; 태크맨(Taqman) 프로토콜)에 의해 결정하고, 내부 하우스키핑 유전자인 SNORD44로 정규화하였다. ABI 프리즘 7700 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템스, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)을 사용하여 태크맨 분석을 수행하였다. 프라이머 (Hs-miR-10b-3 miScript 프라이머, Hs-SNORD44-11 miScript 프라이머) 및 검정 키트 (miScript PCR 스타터 키트, 퀴아젠, 독일 힐덴).
실시예 6. 64Cu-MN-항-miR10b의 생체분포
다음으로, 64Cu-MN-항-miR10b의 생체분포를 루시퍼라제-발현 전이성 유방 선암종 (4T1-luc2)을 보유하는 총 13마리의 마우스에서 PET-MRI 및 생체외 감마 계수에 의해 평가하였다. 4T1-luc2 세포는 루시퍼라제를 발현하고, 비침윤성 생물발광 영상화 (BLI)에 의해 검출될 수 있다. 64Cu-MN-항-miR10b의 2개의 상이한 농도를 조사하였다: 1) 64Cu-MN-항-miR10b의 추적자 수준 용량 (미세용량으로 지칭됨) (1 mg Fe/kg, n = 6), 및 2) MN-항-miR10b와 함께 공동-주사된 64Cu-MN-항-miR10b에 상응하는 치료 용량 (거대용량으로 지칭됨) (15 mg Fe/kg, n = 7). 마우스를 상이한 시점에서 PET-MRI에 의해 스캔하였다. 생체내 영상화 후, 생체외 생체분포 평가를 위해 p.i. 24시간 (미세용량 그룹에서 n = 3 및 거대용량 그룹에서 n = 4) 및 p.i. 48시간 (각 그룹에서 n = 3)에 마우스를 희생시켰다 (도 11A-11D). PET 영상으로부터 수득된 간, 신장 및 심장에 대한 시간-활성 곡선 (도 12A-12C)은 대부분의 주사된 용량이 간에 의해 빠르게 흡수됨을 나타낸다. 이는 이전에 보고된 연구와 일치한다 (Briley-Saebo et al., 2004; Estevanato et al., 2012; Schlachter et al., 2011).
이는 또한 주사된 용량의 대부분이 간 및 비장에 존재하고 간에서 %ID/g 값이 61.2 ± 6.5 (24시간, 미세용량), 53.4 ± 7.1 (24시간, 거대용량), 54.3 ± 5.5 (48시간, 미세용량) 및 32.1 ± 13.0 (48시간, 거대용량)임을 나타내는 생체외 생체분포 분석에 의해 뒷받침된다 (도 11A 및 11B, 삽도 참조). 다른 모든 수확된 장기 및 조직에서 4보다 낮은 %ID/g 값이 측정되었다. 64Cu-MN-항-miR10b는 전이성 병변에 축적되기 때문에, 전이를 보유하는 장기, 예컨대 림프절, 뇌, 뼈 및 폐에서 더 높은 %ID/g 값이 관찰되었다 (도 11A, 11B, 13A 및 13B, #은 전이성 병변을 갖는 장기를 나타냄). 더욱이, 림프절 전이는 미세용량 그룹과 비교하여 수득된 더 높은 %ID/g 값을 설명하는 거대용량 그룹에서 더 컸다. 주사 후 24시간 및 48시간에 미세용량 및 거대용량 사이에 필적하는 생체분포가 관찰되었다 (도 11A, 11B, 13A 및 13B, 림프절, 뇌, 폐 및 뼈에서 전이성 병변의 존재에 주목). 이는 또한 비전이성 장기에서 p.i. 24시간 및 48시간에 미세용량의 투여 후 수득된 %ID/g 및 거대용량의 투여 후 수득된 %ID/g 사이에 관찰된 1에 가까운 기울기와의 강한 상관관계에 의해 반영되며, 피어슨 계수는 각각 0.91 (p < 0.0001, 기울기 = 1.38) 및 0.78 (p = 0.004, 기울기 = 1.05)이다 (도 11C 및 11D).
동물 모델 및 64Cu-MN-항-miR10b의 투여
8주령 암컷 Balb/c 마우스 (더 잭슨 래보러토리(The Jackson Laboratory); 미국 메인주 바 하버)를 4T1-Red-Fluc 세포주 (0.5 x 106개 세포)로 상단 오른쪽 세 번째 유방 지방 패드 아래에 정위적으로 이식하였다. 세포는 루시퍼라제를 발현하고, 종양 부담의 상응하는 분석을 위해 비침윤성 생물발광 영상화 (BLI)에 의해 검출될 수 있다. 주 2회 전이 형성의 추적을 유지하기 위해 모든 동물을 BLI에 의해 스캔하였다. 세포 접종 후 2주에, 마우스는 64Cu-MN-항-miR10b를 정맥내로 주사받았다. 미세투여 연구를 위해, 상기 기재된 바와 같이 제조된 64Cu-MN-항-miR10b를 마우스당 Fe로서 20 μg, 118-190 μCi의 용량으로 주사하였다 (n = 6). 담체-첨가된 거대투여 연구를 위해, 64Cu-MN-항-miR10b를 NODAGA-MN-항-miR10b와 혼합하고, 마우스당 Fe로서 300 μg, 127-135 μCi의 용량으로 주사하였다 (n = 7). 주사된 용량의 분취액을 %ID/g 계산에 대해 분석하였다. PET-MR 영상화 후, 생체외 생체분포 분석을 위해 주사 후 24시간 (미세용량 그룹에서 n = 3 및 거대용량 그룹에서 n = 4) 및 주사 후 48시간 (각 그룹에서 n = 3)에 마우스를 희생시켰다.
생물발광 광학 영상화 (BLI)
BLI를 사용하여 전이를 식별하였다. IVIS 스펙트럼 영상화 시스템 (퍼킨 엘머, 미국 매사추세츠주 홉킨턴)을 사용하여 영상화를 수행하였다. 마취된 마우스는 영상 획득 전 12분에 DPBS (200 mL의 15 mg/mL; 퍼킨 엘머, 미국 매사추세츠주 홉킨턴) 중 D-루시페린 칼륨 염을 복강내로 주사받았다. 동일한 영상화 획득 설정 (시간, ~ 0.5-60초; F-스톱, 2; 비닝, 중간) 및 동일한 ROI를 사용하여 전신에 걸친 총 휘도 (광자/sec/cm2/sr)를 수득하였다. BLI를 약 6 내지 15분 동안 수행하여 최대 휘도를 수득하였다. 리빙 이미지(Living Image) 소프트웨어 (ver 4.5, IVIS 스펙트럼, 퍼킨 엘머, 미국 매사추세츠주 홉킨턴)를 사용하여 모든 영상을 프로세싱하였다. 생물발광 판독값으로부터의 총 휘도를 신호 정량화에 사용하였다.
PET-MR 영상화
마우스를 PET 인서트 (브루커(Bruker), 미국 매사추세츠주 빌레리카)가 장착된 4.7 테슬라 MRI 스캐너에서 영상화하였다. 마우스를 의료 공기 중의 1-2% 이소플루란으로 마취시켰다. 에어 히터 시스템을 사용하여 마우스를 따뜻하게 유지하고, 영상화 세션 동안 생리학적 모니터링 시스템 (SA 인스트루먼츠 인크.(SA Instruments Inc.), 미국 뉴욕주 스토니 브룩)에 의해 체온 및 호흡수를 모니터링하였다. 미세투여 연구를 위해, 동적 PET 획득을 64Cu-MN-항-miR10b의 주사 후 1시간 동안 연속적으로 수행하였다. 그 후, 마우스를 케이지으로 돌려보내고, 각각 30분, 30분, 60분 및 60분의 기간 동안 주사 후 2시간, 4시간, 24시간 및 48시간에 다시 영상화하였다. 거대투여 연구를 위해, 64Cu-MN-항-miR10b의 주사 후 24시간에 60분 동안 마우스를 스캔하였다. 생체외 영상화를 위해, 장기를 플라스틱 홀더에 놓고, 15분 동안 스캔하였다.
해부학적 MR 영상을 하기 파라미터로 T1-가중 3D FLASH (고속 저각 영상 획득) 서열을 포함한 PET 획득과 동시에 수득하였다: 에코 시간 (TE) = 3 ms, 반복 시간 (TR) = 20 ms, 영상화 해상도 = 0.25 x 0.25 x 0.5 mm3/복셀, 및 플립 각도 = 12도.
PET-MR 영상화 데이터를 분석하여 64Cu-MN-항-miR10b의 생체분포 및 청소를 추정하였다. 관심 영역 (ROI)은 아미드 소프트웨어 패키지를 사용하여 심장, 간 및 신장을 포함한 주요 장기에 대한 MR 영상에 그려졌으며 (Loening and Gambhir, 2003), 각각의 PET 프레임에 대한 방사능을 정량화하는데 사용되었다. 전이 및 전이가 없는 상응하는 조직에서 64Cu-MN-항-miR10b의 흡수를 BLI 및 비전이성 반대측 대응물에 의해 식별된 전이성 뼈 및 림프절에 걸쳐 ROI를 사용하여 정량화하였다. 결과는 조직의 입방 센티미터당 주사된 용량의 백분율로서 표현되었다 (%ID/cc).
생체외 생체분포
주사 후 24시간 및 48시간에 동물을 희생시켰다. 하기 장기 및 조직을 수집하였다: 림프절, 혈액, 소변, 신장, 간, 비장, 췌장, 심장, 폐, 뇌, 대퇴골, 방광 및 근육. 절제 및 생체외 스캔 후, 장기를 칭량하고, 붕괴에 대한 보정으로 감마 계수기 (위자드(Wizard), 퍼킨 엘머)를 사용하여 각 장기의 계수를 측정하였다.
통계적 분석
데이터는 평균 ± s.d로서 표현되었다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 양측 t-검정을 사용하여 통계적 비교를 수행하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 7. 종양 및 전이에서의 64Cu-MN-항-miR10b 축적의 PET-MRI
정위 종양 세포 이식 후 2주에, BLI에 의해 전이가 확인되면, 마우스는 64Cu-MN-항-miR10b를 정맥내로 주사받았다. 전이성 장기를 생체내 및 생체외 BLI에 의해 식별하였다. 전이에 의한 64Cu-MN-항-miR10b의 흡수는 담체-첨가되지 않은 미세용량 (마우스당 Fe로서 20 μg, 118-190 μCi, n = 6) 또는 상기 명시된 바와 같은 담체-첨가된 거대용량 (마우스당 Fe로서 300 μg, 127-135 μCi, n = 7)의 주사 후 PET-MRI에 의해 평가하였다. 생체내 PET-MR 영상화 후, 생체외 PET-MR 영상화를 위해 p.i. 24시간 및 48시간에 마우스를 희생시켰다.
생체분포 연구의 결과와 일치하게, 간 및 비장은 간 청소를 나타내는 매우 높은 PET 신호를 나타내었다. 신장 청소는 신장 및 소변에서 높은 PET 신호에 의해 나타난 바와 같이 다른 주요 청소 경로였다 (도 11A 및 11B). 뼈 및 림프절 전이성 병변은 생체내 PET-MRI에 의해 식별될 수 있었는데, 이는 부분적으로 간 및 비장으로부터의 공간적 분리 때문이다 (도 14A). 64Cu-MN-항-miR10b의 미세용량의 주사 후 전이성 및 비전이성 뼈로부터의 시간-활성 곡선은 전이에 의한 더 높은 흡수를 나타내었다 (도 15). 64Cu-MN-항-miR10b의 미세용량 또는 거대용량의 주사 후 24시간에, BLI에 의해 식별된 전이성 림프절 및 뼈는 전이가 없는 상응하는 장기보다 유의하게 더 높은 %ID/cc를 나타내었다 (도 14B).
64Cu-MN-항-miR10b의 미세용량의 주사 후 뼈 전이성 병변의 BLI 영상은 도 14C에 표시되어 있다. 전이성 병변에 의한 64Cu-MN-항-miR10b의 흡수를 생체외 PET-MRI에 의해 추가로 확인하였다 (도 14C). 전이성 뼈 및 림프절을 생체내 BLI에 의해 식별할 수 있었다. 이들 전이성 병변은 비전이성 대응물보다 더 높은 생체외 PET 신호를 나타내었다.
생체외 생체분포 및 생체내 PET-MRI와 일치하여, 생체외 영상화는 절제된 간 및 비장과 연관된 활성이 거대투여 및 미세투여 연구 둘 모두에서 가장 높음을 보여주었다. 종양 세포에 의해 콜로니화된 장기, 예컨대 림프절, 뼈 및 폐에서도 높은 활성이 관찰되었다 (도 14D).
종합하면, 이들 관찰은 MN-항-miR10b 및 다른 유사한 나노치료제의 방사성표지 및 영상화를 위한 방법론을 지원한다. 이들 발견은 관련 치료제의 번역 경로에 대한 중요한 단계로서 전이성 병변에서 치료적 축적의 임상 PET-MRI의 실행가능성을 지적한다.
논의
마이크로RNA-10b는 이전에 전이성 종양 세포의 생존력의 마스터 조절인자로서 식별되었으며, 전이성 암의 치료를 위해 치료용 miR-10b 억제제, MN-항-miR10b를 설계하였다 (Ma et al., 2007; Yigit et al., 2013; Yoo et al., 2015). MN-항-miR10b는 전신 독성의 증거 없이 유방암 모델에서 국소 림프절 및 원격 전이의 완전하고 지속적인 퇴행을 야기한다는 것이 입증되었다 (Yoo et al., 2015; Yoo et al., 2017b).
이 연구에서, 진행성 전이성 암을 갖는 환자에서 MN-항-miR10b의 적용을 위한 길을 열 수 있는 핵심 번역 실험을 수행하였다. MN-항-miR10b 치료제의 방사성-표지된 유도체인 64Cu-MN-항-miR10b가 개발되었다. 방사성표지 치료제는 종양 세포에서 miR10b의 완전한 억제에 기초하여 이의 물리화학적 특성에 영향을 미치지 않고 시험관내 세포 흡수에 영향을 미치지 않으며 이의 표적의 효과적인 결착을 보존한다는 것이 입증되었다. 그 후, 미세투여 PET-MRI가 64Cu-MN-항-miR10b의 흡수에 기초하여 치료 용량의 작용제의 생체분포를 적절하게 반영하고 전이성 조직을 강조하는데 효과적이라는 것이 밝혀졌다.
본원에 기재된 도구 및 방법은 임상 전이로의 치료제의 전달의 입증을 가능하게 할 것이며, 암 환자에서 작용제의 생체분포를 명확하게 하는 것을 가능하게 할 것이다. 실제로, 유사한 치료제 개발의 직면한 주요 과제 중 하나는 표적 장기에 효과적으로 전달하는 것이다. 전이로의 약물 전달의 경우, 복잡한 인자는 동물 모델과 비교하여 병변의 더 큰 크기, 인간 질환의 이질성, 및 종간 혈역학적 변동성으로 인한 약물의 약동학의 차이를 포함한다. 이들 차이에 기초하여, 전임상 생체분포 및 효능 데이터로부터 치료제의 성공적인 임상 구현의 증거를 직접적으로 외삽하는 것은 불가능하다.
이러한 이유로, 탐색적 연구용 신약 적용 프로토콜에 따라 환자에서 미세투여 PET 연구를 수행하는 능력은 임상 승인 경로에서 중요한 단계를 나타낸다. PET 기술은 피코몰 이하 범위에 접근하는 민감도로 방사성표지된 약물의 농도를 결정하기에 충분한 민감도를 갖기 때문에, 방사성표지된 약물의 마이크로그램만큼 작은 용량이 인간에서 제안된 PET 연구를 수행하기에 일반적으로 충분하다. 이러한 특징은 약물 개발의 초기 단계에서 유의한 장점을 갖는다. 방사성표지된 약물의 낮은 질량은 약물 효과를 유도하지 않기 때문에, 초기 인간 연구에 대한 미국 식품의약국의 승인은 치료제에 필요한 것보다 더 제한된 전임상 안전성 및 독성학 서류로 더 빨리 수득될 수 있다.
본 연구에서, 미세용량 및 치료 용량 사이에 동일한 거동이 놀랍게도 관찰되었다는 사실은 환자에서 미세투여 연구를 진행하는 것이 합리적이라는 것을 나타낸다. 이러한 탐색적 영상화 연구의 영향은 세 가지일 것이다. 첫째, 마우스에서 매우 효과적인 MN-항-miR10b가 인간 전이에서도 축적될 수 있음을 확립할 것이다. 이는 약물 전달이 실제로 실행가능하다는 것을 보여주기 때문에 치료제의 임상 개발 위험을 크게 줄인다. 나노치료제는 불량한 전달 및 인간 종양이 상이한 표면-대-부피 비율을 갖는 마우스보다 더 크다는 사실 때문에 실패하였다. 둘째, 제안된 연구는 요법 동안 투여 확립을 가능하게 할 수 있는 MN-항-miR10b의 약동학적 거동을 밝힐 수 있다. 셋째, MN-항-miR10b가 임상 시험에 도달하면, 방사성표지된 약물을 사용하여 환자의 전이가 치료제를 축적하는 것에 기초하여 치료할 환자를 선택할 수 있다.
64Cu-MN-항-miR10b의 성공적인 합성 및 테스트는 또한 본원에 예시된 바와 같은 산화철 전달 플랫폼 뿐만 아니라 다중모드 요법을 전달할 가능성을 제시하는 다른 나노입자에 기반한 유사한 나노치료제의 테스트에 대한 선례를 설정하기 때문에 유의하다. 예를 들어, 구리-기반 나노의학, 예컨대 구리 시스테아민은 RNA-기반 표적화된 요법을 구리-시스테아민 기반 X선 유도된 광역학 요법과 조합하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 암에서 유망한 것으로 나타났다 (Li et al., 2010; Ma et al., 2014; Shrestha et al., 2019).
RNA-기반 치료제와 특정 관련성으로, 이들 작용제의 대다수는 전달 비히클에 의존하며, 이는 많은 경우에 지질 나노입자 (예를 들어, 앨나일람(Alnylam)의 온파트로(Onpattro), 메디뮨(MedImmune)의 MEDI1191 및 아스트라제네카(AstraZeneca)의 AZD8601) 또는 GalNAc (예를 들어, 앨나일람의 지블라리(Givlaari), 노바티스(Novartis)의 인클리시란(Inclisiran) 등)를 포함한다. 이들 경우 중 일부에서, 성공적인 전달을 입증함으로써 임상 개발의 위험을 제거할 뿐만 아니라 용량 함수, 스케쥴 또는 약물 설계로서 표적 결착에 대한 추가 통찰력을 얻기 위해 전체 임상 시험 경로에서 관련 방사성표지 및 영상화 프로토콜을 사용하는 것이 가능할 수 있다.
임상 미세용량 영상화 연구의 가치는 완전한 임상 시험을 수행하기 위한 연관 비용 없이 약물 개발 경로에 대한 가장 중요한 질문 중 하나 (표적 장기 부위로의 전달 문제)에 답하는데 있을 수 있다. 전반적으로 본원에 기재된 데이터는 NODAGA 및 방사성 64Cu를 도입함으로써 방사성표지된 MN-항-miR10b 치료제의 성공적인 개발을 보여준다. 64Cu-MN-항-miR10b의 생체분포는 모든 장기에서 치료적 거대용량에 필적하는 생체분포를 보여주는 미세용량의 주사 후 조사되었다. 본원에 기재된 방사성표지 및 영상화 프로토콜은 작용제의 약동학적 거동을 밝히고, 향후 임상 시험의 위험을 제거하고, 환자의 전이가 치료제를 축적하는 것에 기초하여 치료할 환자의 선택을 보조함으로써 유사한 나노치료제의 임상 개발을 발전시킬 수 있다.
기타 실시양태
본 발명이 상세한 설명과 관련하여 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구항의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하지 않고 예시하기 위한 것임을 이해해야 한다. 다른 측면, 장점 및 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있다.

Claims (35)

  1. 하기를 포함하는 치료용 나노입자로서:
    방사성표지;
    치료용 나노입자 및 방사성표지에 공유결합적으로 연결된 킬레이트제; 및
    치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결된 핵산 분자,
    여기서 치료용 나노입자는 약 10 나노미터 (nm) 내지 약 30 nm의 직경을 갖고,
    여기서 치료용 나노입자는 자성인
    치료용 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 킬레이트제가 이차 아민을 포함하는 화학적 모이어티를 통해 치료용 나노입자에 공유결합적으로 연결된 것인 치료용 나노입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 킬레이트제가 1,4,7-트리아자시클로노난,1-글루타르산-4,7-아세트산 (NODAGA)을 포함하는 것인 치료용 나노입자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트제가 DOTA, DOTA-GA, p-SCN-Bn-DOTA, CB-TE2A, CB-TE1A1P, AAZTA, MeCOSar, p-SCN-Bn-NOTA, NOTA, HBED-CC, THP, MAS3, DFO 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 치료용 나노입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성표지가 구리-64 (Cu-64)를 포함하는 것인 치료용 나노입자.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성표지가 구리-67 (Cu-67), 이트륨-90 (Y-90), 테르븀-161 (Tb-161), 루테튬-177 (Lu-177), 비스무트-231 (Bi-213), 납-212 (Pb-212), 악티늄-225 (Ac-225), 지르코늄-89 (Zr) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 치료용 나노입자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 치료용 나노입자.
  8. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 잠금 뉴클레오티드인 치료용 나노입자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 안타고미르(antagomir)인 치료용 나노입자.
  10. 제9항에 있어서, 안타고미르가 마이크로RNA-10b (miR-10b)를 억제하는 것인 치료용 나노입자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 디술피드 결합을 포함하는 화학적 모이어티를 통해 나노입자에 공유결합적으로 연결된 것인 치료용 나노입자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 산화철 코어를 포함하는 치료용 나노입자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 중합체 코팅을 추가로 포함하는 것인 치료용 나노입자.
  14. 제13항에 있어서, 중합체 코팅이 덱스트란을 포함하는 것인 치료용 나노입자.
  15. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 치료용 나노입자를 포함하는 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 주사제, 정제, 동결건조 분말, 현탁액 또는 이들의 임의의 조합인 투여 형태로 제형화된 제약 조성물.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 치료용 나노입자를 암을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체에서 암 세포 침윤 또는 전이를 감소시키는 방법으로서, 여기서 치료용 나노입자는 대상체에서 암 세포 침윤 또는 전이를 감소시키기에 충분한 양으로 투여되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 치료용 나노입자가 약 0.014 mg/kg 미만인 용량으로 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 암 세포 전이가 대상체에서 원발성 종양으로부터 림프절로의 전이이거나, 대상체에서 림프절로부터 이차 조직으로의 전이인 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포가 유방암 세포, 결장암 세포, 신장암 세포, 폐암 세포, 피부암 세포, 난소암 세포, 췌장암 세포, 전립선암 세포, 직장암 세포, 위암 세포, 갑상선암 세포 및 자궁암 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 암 세포의 위치 또는 수 또는 대상체에서 치료용 나노입자의 위치를 결정하기 위해 대상체의 조직을 영상화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  23. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 치료용 나노입자를 전이성 암을 갖는 대상체의 림프절에 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 림프절에서 전이성 암을 치료하는 방법으로서, 여기서 치료용 나노입자는 대상체의 림프절에서 전이성 암을 치료하기에 충분한 양으로 투여되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 전이성 암이 원발성 유방암으로부터 기인하는 것인 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 투여가 대상체의 림프절에서 전이성 종양 크기의 감소 또는 안정화 또는 전이성 종양 성장 속도의 감소를 발생시키는 것인 방법.
  26. 하기를 포함하는, 대상체에서 전이성 암 조직을 검출, 진단 및/또는 모니터링하는 방법으로서:
    제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 치료용 나노입자를 전이성 암 조직을 갖는 대상체에게 투여하는 단계; 및
    치료용 나노입자를 영상화하는 단계,
    여기서 치료용 나노입자는 대상체에서 치료용 나노입자를 영상화하기에 충분한 양으로 투여되는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 영상화가 자기 공명 영상화 (MRI), 양전자 방출 단층촬영 (PET), 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT), 컴퓨터 단층촬영 (CT) 또는 이들의 임의의 조합에 의해 수행되는 것인 방법.
  28. 제18항, 제23항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 치료용 나노입자가 대상체에게 2개 이상의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 치료용 나노입자가 적어도 주 1회 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  30. 제18항, 제23항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 치료용 나노입자가 정맥내, 피하, 동맥내, 근육내 또는 복강내 투여에 의해 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  31. 제18항, 제23항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 화학요법제를 추가로 투여받는 것인 방법.
  32. 하기를 포함하는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 치료용 나노입자를 제조하는 방법:
    자성 나노입자를 제조하는 단계;
    핵산 분자를 자성 나노입자에 공유결합적으로 연결하는 단계;
    자성 나노입자당 약 40 킬레이트제 당량의 비율로 자성 나노입자를 킬레이트제와 반응시킴으로써 킬레이트제를 자성 나노입자에 공유결합적으로 연결하는 단계;
    자성 나노입자에 64CuCl2 용액을 첨가하는 단계; 및
    64CuCl2 용액 및 자성 나노입자의 혼합물을 정제하여 치료용 나노입자를 생성하는 단계.
  33. 제32항에 있어서, 킬레이트제를 자성 나노입자에 공유결합적으로 연결하는 단계가 약 0℃ 내지 약 8℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 64CuCl2 용액 및 자성 나노입자의 혼합물을 약 40℃ 내지 약 65℃의 온도에서 가열하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 혼합물이 약 10분 내지 약 30분 동안 가열되는 것인 방법.
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