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CN107614685A - Rna纳米颗粒及其使用方法 - Google Patents

Rna纳米颗粒及其使用方法 Download PDF

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CN107614685A CN201680022537.5A CN201680022537A CN107614685A CN 107614685 A CN107614685 A CN 107614685A CN 201680022537 A CN201680022537 A CN 201680022537A CN 107614685 A CN107614685 A CN 107614685A
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Abstract

本发明公开的主题涉及人造RNA纳米结构及其使用方法。具体地，本发明公开的主题涉及RNA纳米颗粒和RNA树枝状聚合物，以及使用RNA纳米结构和RNA树枝状聚合物的疾病诊断和治疗方法。

Description

RNA纳米颗粒及其使用方法
相关申请
本申请要求2015年4月17日提交的美国临时专利申请号62/149,117和2015年4月20日提交的美国临时专利申请号62/150,233的权益，其全部公开内容通过引证整体并入本文。
政府利益
本发明是在由国立卫生研究院授予的U01CA151648，R01EB019036和R01EB003730的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
本发明公开的主题涉及人造RNA纳米结构及其使用方法。具体地，本发明公开的主题涉及RNA纳米颗粒和RNA树枝状聚合物(dendrimers)，以及使用RNA纳米结构和RNA树枝状聚合物进行疾病诊断和治疗的方法。
背景技术
癌症是具有不可控制的细胞生长，侵袭和破坏附近组织和转移的广泛类型的疾病[1，2]。癌症已成为世界上人类死亡的主要原因之一，2008年约760万人死亡[3]。癌症的对患者和社会造成极高的经济负担。根据美国国立卫生研究院(NIH)的估计，2008年癌症的治疗的年度总成本为201.5亿美元[4]。因此，迫切需要一种有效、高效和安全的癌症治疗方法。
发明内容
本发明公开的主题满足部分或全部上述需要，这对于本领域的普通技术人员经过对本文件中提供的信息的研究之后将变得更明确。
本发明内容描述了本发明公开的主题的若干实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变化和排列。本发明内容仅仅是众多和变化的实施方式的示例。提及给定实施方式的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方式通常可以具有或不具有所提及的特征；同样，那些特征可以应用于本发明公开的主题的其它实施方式，无论是否在本发明内容中列出。本发明内容没有列出或暗示这些特征的所有可能的组合。
在一些实施方案中，本发明公开的主题涉及人造RNA纳米结构分子。所述分子包含：包含多个分支的RNA连接基序和至少一个成像模块，其中所述RNA连接基序的分支包含至少一个RNA寡核苷酸。成像模块的非限制性实例包括荧光染料、放射性核素和/或造影剂。荧光染料的非限制性实例包括Alexa染料、Cy染料或近红外染料。荧光染料的另外的非限制性实例包括Alexa染料、Cy染料、近红外(Near IR或NIR)染料，包括但不限于IRdye800、Alexa647、Cy5、Cy5.5、Alexa680、Iowa Black RQ、QSY21、IRDyeQC、BBQ650、BHQ-3、吲哚菁绿(ICG)。在一些实施方案中，成像模块包括报告成像模块。在一些实施方案中，成像模块包括参考成像模块。在一些实施方案中，参考成像模块包括参考染料和淬灭剂。在一些实施方案中，RNA分子还包含与RNA连接基序偶联的至少一个癌靶向模块。在一些实施方案中，所述分子还包括与RNA连接基序偶联的至少一个治疗模块。在一些实施方案中，成像模块偶联至RNA连接基序的至少一个分支。在一些实施方案中，成像模块偶联至RNA连接基序的任何分支。在一些实施方案中，成像模块偶联至癌靶向模块。在一些实施方案中，成像模块偶联至治疗模块。在一些实施方案中，多个分支包括三个分支、四个分支、五个分支、六个分支、七个分支、八个或更多个分支。在一个实施方案中，包含RNA连接基序的多个分支包括三分支RNA连接基序。在一个实施方案中，包含RNA连接基序的多个分支包含四分支RNA连接基序。
在本发明公开的主题的一些实施方案中，RNA纳米结构包括放射性核素。在一些实施方案中，术语“放射性核素“包括放射性标记肽和具有各种同位素的蛋白质。放射性同位素的非限制性实例包括177Lu、111In、64Cu、99mTc、203Pb、188Re、212Pb/212Bi。在一些实施方案中，放射性核素偶联至RNA连接基序的多于一个分支。在一些实施方案中，放射性核素通过螯合剂螯合。在一些实施方案中，螯合剂缀合至RNA连接基序的至少一个分支。螯合剂的非限制性实例是EDTA、DOTA、NOTA。在一些实施方案中，RNA分子包括造影剂。在一些实施方案中，造影剂是MRI造影剂。在一些实施方案中，MRI造影剂是胃肠MRI、静脉内MRI、血管内(血池)MRI肿瘤特异性MRI、肝胆MRI和网状内皮MRI。MRI造影剂的一个非限制性实例是钆造影剂。
在一些实施方案中，纳米结构在RNA寡核苷酸的2′位置包含至少一个化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰包括2’氟、2’胺基和2’O-甲基。
在本发明公开的主题的一些实施方案中，三分支RNA连接基序的分支是a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)或c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一个实施方案中，三分支RNA连接基序包含a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ IDNO：2)和c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1与核苷酸序列5′-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3′具有至少90％的同一性。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1包含核苷酸序列5′-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3′。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2与核苷酸序列5′-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3′具有至少90％的同一性。在一个实施方案中，SEQ ID NO：2包含核苷酸序列5′-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3′。在一些实施方案中，SEQID NO：3与核苷酸序列5′-GGA UCA AUC AUG GCAA-3′具有至少90％的同一性。在一个实施方案中，SEQ ID NO：3包含核苷酸序列5′-GGA UCA AUC AUG GCA A-3′。
在本发明公开的主题的一些实施方案中，RNA纳米结构包括癌靶向模块。在一些实施方案中，本发明公开的主题提供人造RNA纳米结构分子中的靶向模块包括结合至少一种癌细胞表面标记物的配体。在一些实施方案中，癌靶向模块是结肠癌靶向模块。叶酸的非限制性实例包括5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、氧化型叶酸(folic acid)和其它叶酸化合物。在一些实施方案中，治疗模块包含siRNA、miRNA、抗mRNA、核酶RNA或反义RNA。在一些实施方案中，治疗模块包括化疗药物、核糖开关或内体破坏剂。在一些实施方案中，治疗模块是siRNA序列。在一个实施方案中，siRNA直接结合存活蛋白。在一些实施方案中，siRNA直接结合PI3K、Akt或mTOR。在一些实施方案中，治疗模块是微RNA序列。在一些实施方案中，治疗模块是针对包含miR-9、miR-10b、miR-21或miR-26的miRNA的抗miRNA分子。在一些实施方案中，治疗模块是用于包含let-7a、miR-10b、miR-25、miR-34a、miR-124、miR-145或miR-181b的miRNA的miRNA分子。在一些实施方案中，治疗模块是细胞毒性药物。在一些实施方案中，细胞毒性药物包括多柔比星、紫杉醇、紫杉醇衍生物和类似物、细胞松弛素D、雷帕霉素、雷帕霉素衍生物和类似物、喜树碱、地塞米松、和5-氟尿嘧啶、喹唑啉酮衍生物、金属银、曲尼司特、依维莫司和/或相关化合物。
在另一方面，本发明公开的主题提供了人造RNA纳米结构分子，其包括包含多个分支的RNA连接基序和与RNA连接基序偶联的基于辐射的治疗模块，并且RNA连接基序的分支至少包括一个RNA寡核苷酸。在一些实施方案中，所述分子还包括偶联到RNA连接基序的靶向模块。在一些实施方案中，所述分子还包括与RNA连接基序偶联的成像模块。在一些实施方案中，纳米结构在RNA寡核苷酸的2′位置包含至少一个化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰包括2′氟、2′胺基和2′O-甲基。在一些实施方案中，多个分支包括三个分支、四个分支、五个分支、六个分支、七个分支、八个或更多个分支。在一些实施方案中，包含RNA连接基序的多个分支包括三分支RNA连接基序。在一些实施方案中，包含RNA连接基序的多个分支包含四分支RNA连接基序。在一些实施方案中，三分支RNA连接基序的分支包括a3WJ RN模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)或c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，三分支RNA连接基序包含a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)和c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1与核苷酸序列5′-UUGCCA UGU GUA UGU GGG-3′具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1包含核苷酸序列5′-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3′。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2与核苷酸序列5′-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3′具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，SEQ IDNO：2包含核苷酸序列5′-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3′。在一些实施方案中，SEQ ID NO：3与核苷酸序列5′-GGA UCA AUC AUG GCAA-3′具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO：3包含核苷酸序列5′-GGA UCA AUC AUG GCA A-3′。在一些实施方案中，癌靶向模块是癌细胞特异性配体。在一些实施方案中，癌靶向模块是叶酸。在一些实施方案中，癌靶向模块是RNA适体。在一些实施方案中，基于辐射的治疗模块包括同位素。同位素的非限制性实例包括177Lu、111In、64Cu、99mTc、203Pb、188Re、212Pb、212Bi、I-125或Cs-131。
此外，在本主题的另一方面，提供了RNA树枝状聚合物分子。所述分子包括(a)中心核多分支RNA连接基序，其中所述中心核基序包括多个分支，并且其中分支包含至少一个RNA寡核苷酸；和(b)包含至少一个重复多分支RNA连接基序单元的外表面多分支RNA连接基序，其中所述重复单元包含多个分支，并且其中分支包含至少一个RNA寡核苷酸。在一些实施方案中，树枝状聚合物还包括至少一个成像模块。在一些实施方案中，树枝状聚合物包括至少一个靶向模块。在一些实施方案中，树枝状聚合物还包括至少一个治疗模块。在一些实施方案中，多个分支包括中心核多分支RNA连接基序包括三分支RNA连接基序、四分支RNA连接基序、五分支RNA连接基序、六分支RNA连接基序、七分支RNA连接基序、八个或更多个分支的RNA连接基序。在一些实施方案中，包含重复多分支RNA连接基序单元的多个分支包括三分支RNA连接基序、四分支RNA连接基序、五分支RNA连接基序、六分支RNA连接基序、七分支的RNA连接基序、八个或更多个分支的RNA连接基序。在一些实施方案中，三分支RNA连接基序的分支包含a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)或c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一个实施方案中，三分支RNA连接基序包含a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)和c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，SEQID NO：1与核苷酸序列5′-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3′具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2与核苷酸序列5′-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3′具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO：3与核苷酸序列5′-GGA UCA AUC AUG GCAA-3′具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，中心核多分支RNA连接基序是多角形结构，其在每个角包含三分支RNA连接基序。在一些实施方案中，成像模块包括荧光染料、放射性核素或造影剂。在一些实施方案中，荧光染料是Alexa染料、Cy染料或近IR染料。荧光染料的非限制性实例包括IRdye800、Alexa647、Cy5、Cy5.5、Alexa680、Iowa Black RQ、QSY21、IRDyeQC、BBQ650、BHQ-3、吲哚菁绿(ICG)。在一些实施方案中，成像模块包括报告成像模块。在一些实施方案中，成像模块包括参考成像模块。在一些实施方案中，参考成像模块包括参考染料和淬灭剂。在一些实施方案中，成像模块包括至少一种荧光染料。在一些实施方案中，成像模块包括放射性核素和/或造影剂。造影剂的非限制性实例是MRI造影剂。在一个实施方案中，成像模块包括至少一种钆造影剂。在一些实施方案中，靶向模块包括癌靶向模块。在一些实施方案中，癌靶向模块是结合至少一种癌细胞表面标记物的配体。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物含有包含化学配体和/或RNA适体的靶向模块。配体的非限制性实例包括叶酸。在一些实施方案中，细胞表面标记物包括叶酸受体。在一些实施方案中，配体结合上皮细胞粘附分子(EpCAM)。在一些实施方案中，细胞表面标记物包含上皮细胞粘附分子(EpCAM)。在一些实施方案中，癌靶向模块包含适体。适体的非限制性实例是EpCAM RNA适体。在一些实施方案中，癌靶向模块是叶酸。叶酸的非限制性实例包括氧化型叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸或其组合。在一些实施方案中，治疗模块包含siRNA、miRNA、抗mRNA、核酶RNA或反义RNA。在一些实施方案中，治疗模块包括化疗药物、核糖开关或内体破坏剂。在一些实施方案中，治疗模块是细胞毒性药物。细胞毒性药物的非限制性实例包括多柔比星、紫杉醇、紫杉醇衍生物和类似物、细胞松弛素D、雷帕霉素、雷帕霉素衍生物和类似物、喜树碱、地塞米松和5-氟尿嘧啶、喹唑啉酮衍生物、金属银、曲尼司特、依维莫司和相关化合物，或抑制细胞增殖和/或迁移和/或炎症过程的其它试剂。在一些实施方案中，多支链的多个支链与SEQ ID NO：1-20中至少一个的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
在本发明公开主题的另一方面是包含治疗有效量的如上文和本文公开的RNA纳米结构分子和RNA树枝状聚合物的组合物。在一些实施方案中，该组合物还包括药学上可接受的载体。
在本发明公开主题的另一方面是药物递送系统，所述系统包含治疗有效量的如上文和本文所公开的RNA纳米结构和RNA树枝状聚合物分子。在一些实施方案中，药物递送系统进一步包括药学上可接受的载体。
此外，在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了将治疗剂图像引导药物递送至需要其的受试者的方法。所述方法包括施用如上文和本文所公开的治疗有效量的RNA纳米结构分子和RNA树枝状聚合物，并将成像检测装置应用于受试者。在一些实施方案中，成像检测装置是MRI成像系统。在一些实施方案中，成像检测装置是NIRF成像系统。在一些实施方案中，成像检测装置是CT/PET/SPECT成像系统。
在本主题的一些实施方案中，是诊断和/或治疗患有或处于患有疾病的风险的受试者中疾病的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含本文公开的RNA纳米结构和/或RNA树枝状聚合物的组合物。在一些实施方案中，该组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物或非哺乳脊椎动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，疾病包括但不限于卵巢癌、脑癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌。
附图说明
本公开主题的特征在所附权利要求中具体阐述。将通过参考以下详细描述来获得对本公开主题的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述其中使用主题的原理的说明性实施例及其附图。附图最初以彩色出版，通过引证整体并入本文(Li H，et al.，NucleicAcid Ther.2015Aug；25(4)：188-97；Sharma A.，et al.，Nanomedicine.2016Apr；12(3)：835-44.doi：10.1016/j.nano.2015.11.008)。本申请的黑白图纸对应于公布的颜色。
图1显示RNA 3WJ纳米颗粒的结构、装配和表征。A.pRNA 3WJ的二级结构。B.在放大视图中显示RNA 3WJ-pRNA纳米颗粒的八个代表性图像，并且图像显示RNA纳米颗粒的三分支形状。通过Veeco MultiMode AFM NanoScope IV系统在APS改性的云母表面上获得RNA纳米颗粒的AFM图像。(比例尺：10nm)。C.12％天然PAGE显示了通过溴化乙锭(上)和SYBRGreen II(下)染色的RNA 3WJ纳米颗粒的逐步装配。泳道：1：3WJa(SEQ ID NO：1)；2：3WJb(SEQ ID NO：2)；3：3WJc(SEQ ID NO：3)；4：3WJa+3WJb(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2)；5：3WJa+3WJc(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3)；6：3WJb+3WJc(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3)；7：3WJa+3WJb+3WJc(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3)。D.通过使用TGGE系统揭示装配的RNA 3WJ纳米颗粒的热力学稳定性。温度梯度设定为36～80℃，方向设定为垂直于电场。左侧两个泳道是3WJ片段，以及3WJ复合体在第三泳道开始。
图2显示了RNA 3WJ纳米颗粒的靶向、摄取和细胞毒性。A.显示通过细胞核(蓝色)、肌动蛋白(绿色)和Alexa647标记的RNA纳米颗粒(红色)信号的共定位的叶酸-3WJ RNA纳米颗粒和仅3WJ RNA纳米颗粒对结肠癌HT29细胞的摄取比较的共焦图像。B.流式细胞术分析，显示叶酸标记的3WJ 2′F RNA纳米颗粒与叶酸受体过表达的KB细胞的结合。黑色曲线：仅细胞对照；蓝色曲线：无叶酸的3WJ RNA纳米颗粒；红色曲线：具有叶酸的3WJ RNA纳米颗粒。C.叶酸-3WJ RNA纳米颗粒对HT29细胞活力的影响。将细胞用三种不同浓度(100nM、200nM和400nM)的叶酸-3WJ RNA纳米颗粒温育。D.将叶酸-3WJ-Alexa647静脉内注射到具有HT29皮下异种移植物的裸鼠中。通过IVIS谱站评估荧光标记的叶酸-3WJ纳米颗粒在肿瘤、肝和肺中的累积。
图3显示了用于尿素、血清和照射的RNA 3WJ纳米颗粒的稳定性测定。A.12％的天然PAGE证实了RNA 3WJ纳米颗粒对2M-8M尿素变性的稳定性。凝胶用溴化乙锭染色。泳道：1：3WJa(SEQ ID NO：1)；2：3WJb(SEQ ID NO：2)；3：3WJc(SEQ ID NO：3)；4：3WJa+3WJb(SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2)；5：3WJa+3WJc(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3)；6：3WJb+3WJc(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3)；7：3WJa+3WJb+3WJc(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3)。B.在2′F修饰和未修饰的RNA 3WJ纳米颗粒之间比较血清中的纳米颗粒稳定性长达36小时。黑色方块：RNA纳米颗粒；红球：2′F RNA纳米颗粒。C.RNA 3WJ纳米颗粒耐辐射。在用Cs-131照射7天或用I-125照射18天后，通过12％天然PAGE用TBM运行缓冲液检查2’F-修饰的RNA 3WJ纳米颗粒。通过Cs-131和I-125给予30Gy的剂量。在7天或18天照射后未检测到明显的变化。泳道：1：不照射的RNA纳米颗粒；2：用Cs-131照射7天(30Gy)后的RNA纳米颗粒；3：用I-125照射18天(30Gy)后的RNA纳米颗粒。D.质粒DNA被辐射损伤。在用Cs-131照射7天(30Gy)或用I-125照射18天(30Gy)后，通过0.7％琼脂糖凝胶用TAE运行缓冲液检查质粒DNA。在7天和18天照射后质粒DNA都被损伤。泳道：1和3：未照射的质粒DNA；2：用Cs-131照射7天(30Gy)后的质粒DNA；4：用I-125照射18天(30Gy)后的质粒DNA。
图4包括(A)常规分子信标和(B)基于RNA纳米技术的3WJ-信标的比较的图。
图5包括构建基于pRNA-3WJ的RNA树枝状聚合物(G0-G3)，用于包含用于MRI成像的多种钆造影剂和用于PET/SPECT成像的放射性核素。
图6包括(A)phi29DNA包装马达。(B)衍生自(D)14中的晶体的pRNA六聚体。(C)六聚体pRNA纳米颗粒。(D)pRNA-3WJ晶体和X射线衍射图14。(E)pRNA单体。框：3WJ结构域。(F)3WJ结构域9，其由三个片段a3wJ、b3wJ和c3wJ组成。H1-3：螺旋片段。
图7包括pRNA-3WJ纳米颗粒的竞争和解离测定[G9](A)温度效应：将固定浓度的Cy3-pRNA-3WJ核[ab*c]3WJ与不同浓度的未标记的b3WJ在37℃下温育。(B)尿素变性作用：在0-6M尿素存在下，在25℃下，将固定浓度的Cy3-[ab*c]3WJ与未标记的b3WJ以1∶1的比率温育。(C)系列稀释测定：[32P]pRNA-3WJ复合物甚至在160pM下保持完整。(D)在2′-F修饰后，RNA纳米颗粒化学稳定[G13]。
图8显示，与11种不同的RNA 3WJ核基序相比，3WJ-pRNA基序显示具有最陡斜率的最高Tm[G9]。
图9显示了用于构建具有各种形状和大小的多价RNA纳米颗粒的RNA纳米技术方法。
图10包括(A-B)结膜下注射后的pRNA纳米颗粒向角膜和视网膜的眼递送[G18]：(A)全身(B)视网膜的共聚焦图像显示4小时后的RNA积累。
图11包括(A-B)在全身注射时，pRNA-3WJ纳米颗粒特异性位于表达癌症受体的癌症异种移植物，并且在体内任何重要器官中未检测到[G9-11]。
图12包括“参考”染料IRdye800、淬灭剂衣阿华黑和“报道”染料Alexa647与用于荧光成像的pRNA-3WJ支架的缀合。或者，放射性核素作为用于同时PET/SPECT和荧光成像的“参考”模块将被并入。
图13显示“报告”染料Alexa647和“参照”染料IRdye800的发射光谱，显示没有光谱重叠。
图14显示了用放射性核素(177Lu或111In)或造影剂Gd3+标记DOTA缀合的RNA纳米颗粒的逐步制备方案。对于64Cu，将使用NOTASCN。然后将放射性标记的链与其它3WJ组分链混合以装配3WJ纳米颗粒。
图15示出显示pRNA-3WJ-FA纳米颗粒强烈结合并进入HT29结肠癌细胞的共聚焦图像。放大倍数：180×。
图16显示共聚焦图像，显示Cy5标记的pRNA-3WJ-EpCAM适体构建体强烈结合并进入HT29结肠癌细胞。适体选自我们基于RNA纳米技术的新的2′-F 3WJ文库。
图17显示了在同一基因上包含靶向不同基因座的不同siRNA的四价pRNA-X纳米颗粒的增强的基因沉默效应10。RLU：相对荧光素酶单位。
图18(A)显示miR-21-荧光素酶报道系统的构建。(B)pRNA-3WJ-FA-抗miR21纳米颗粒的示意图(图18A公开了SEQ ID NO：21)。(C)温育后，与对照(无FA或抗miR21)相比，观察到KB细胞中特异性敲低miR-21。
图19显示使用“点击化学”方法和酸不稳定键将紫杉醇与pRNA-3WJ缀合。
图20显示了表明由CPT-RNA链诱导的细胞凋亡的半胱天冬酶3测定的初步数据。插图：携带喜树碱(CPT)的pRNA-3WJ构建体的设计。
图21显示了pRNA-3WJ-信标的工作原理。一旦被内化到细胞中并从内体释放，RNA-3WJ-信标被RISC处理，并且siRNA组分将从3WJ复合体释放并远离淬灭剂，从而恢复′报告′染料Alexa647的荧光，用于实时成像。
图22显示(A)全身和(B)内脏器官图像，显示在全身注射后，pRNA-3WJ-FA纳米颗粒特异性靶向叶酸受体+HT29结肠癌皮下异种移植物，8小时后未在体内任何重要器官中检测到。(C)固定的冷冻肿瘤异种移植物切片确认pRNA纳米颗粒在体内结合和积累的共聚焦成像。对照：PBS。
图23显示MDA-MB-435乳腺癌皮下异种移植物携带小鼠的微SPECT/CT成像。(A)将全身SPECT图像与常规显微CT图像融合以验证放射性标记的111InDOTA(GSG)-KCCYSL肽的增加摄取的区域。(B)跨轴SPECT/CT图像聚焦于异种移植物中的肿瘤摄取。
图24显示了通过pRNA-3WJ-叶酸纳米颗粒的转移性肝癌的靶向。(A)确认肝转移的生物发光图像。如宏观(B)和组织学(C)测定所示，pRNA-3WJFA-Alexa647纳米颗粒特异性靶向HT29肝转移细胞，但不是全身注射后的正常肝实质细胞。对照：PBS处理的小鼠。绿色：癌细胞；蓝色：用于核的DAPI；品红：Alexa647RNA；白色箭头：叶酸-pRNA-Alexa647积累和结合；黄色箭头：正常肝实质。
图25显示pRNA纳米颗粒不诱导干扰素反应12，如通过(A)KB细胞的IFN测定；(B)人血液单核细胞的TLR-3、7和9基因；(C)HEK-Blue-hTLR3报道细胞的TLR-3途径。
图26示出(A-B)主要由RNA通过分支延伸组成的RNA树枝状聚合物的示意图和AFM图像。(C)使用pRNA-3WJ作为含有DOTA螯合的Gd3+、放射性核素和/或叶酸的支架的Generation-3RNA树枝状聚合物的2D结构。
图27示出肝转移的体内评价。(A)将HT29-Luc细胞注射到脾脏中以诱导肝转移。具有Luc表达的肝转移的小鼠的代表性生物发光图像(B)，在肯塔基大学小动物Clinscan MRI扫描仪上获取的T2加权图像描述多个肝转移(箭头)。
图28显示(A-B)2D序列；在15％天然PAGE中的装配，在8M尿素15％PAGE中的稳定性；和pRNA-3WJ(A)和pRNA-3WJrev(B)支架的热力学性质。(图28公开了SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6)。
图29显示了用作RNA树枝状聚合物构建的构件的三个模块的逐步装配。模块-1装配三个链：3WJ-a、3WJ-b和3WJ-c。模块-2从三个单元装配：具有a_rev的pRNA-3WJ、具有b_rev的pRNA-3WJ和具有c_rev粘性末端的pRNA-3WJ。模块-3从三个单元装配：具有a_rev的pRNA-3WJ、具有b_rev的pRNA-3WJ和具有三个c_rev粘性末端的pRNA-3WJ。右图：模块化构件的AFM图像。对于模块-1，AFM图像是对于3WJ，在三个分支处具有三个pRNA亚基。
图30显示多功能RNA树枝状聚合物的构建。用于靶向(化学配体或RNA适体)、成像(荧光团或放射性标记)和治疗性(siRNA、miRNA、抗miRNA、化疗药物、核酶、核糖开关、内体破坏剂)单元的各种部分的模块-3的功能化。
图31显示来自组成链的G-1至G-4 RNA树枝状聚合物的装配。G-0装配三个链：3WJ-a、3WJ-b和3WJ-c，如图2A模块1所示。(A)G-1从具有互补接头(黑色)和3WJ链(红色)的A、B、C、D和E五个链装配。(B)G-2从具有四个3WJ-b粘性末端的G-1和3WJ-a和3WJ-c链装配。(C)G-3从具有8个3WJ-b_rev粘性末端的G-2和3WJ-a_rev和3WJ-c_rev链装配。(D)G-4从具有8个3WJ-b_rev粘性末端的G-2和具有3WJ-a_rev和3WJ-c_rev链的二聚体模块装配。定义特性请参考表4。
图32显示G-0至G-4 RNA树枝状聚合物的(A)2D结构(左)、AFM图像(中)和3D模型(右)(使用Pymol和Swiss PDB观察器)。(B)2％琼脂糖凝胶，显示G-0至G-4 RNA树枝状聚合物的装配。(C)在2％琼脂糖凝胶中测定并通过ImageJ定量的G-4 RNA树枝状聚合物的血清稳定性测定。
图33显示(A)具有KB细胞的不同浓度(1nM、3nM和6nM)的G-4 RNA树枝状聚合物的流式细胞术数据。仅细胞(黑色)，无叶酸的G-4树枝状聚合物(红色)；和具有16个叶酸的G-4(蓝色)。右：结合结果的总结。(B)用KB细胞温育的G-4 RNA树枝状聚合物的共焦显微镜图像，通过DAPI的核染色(蓝色)，通过鬼笔环肽Alexa488(绿色)，Cy5标记的叶酸-G4树枝状聚合物(红色)和三个板的覆盖的细胞膜染色。底部：以红色框住的覆盖的图像切片的放大图。
具体实施方式
在本文档中阐述了本发明公开的主题的一个或多个实施方案的细节。本发明公开的主题满足一些或所有上述需要，这对于本领域的普通技术人员经过对本文档中提供的信息的研究之后将变得清晰明了。本文件中提供的信息，特别是所描述的示例性实施方案的具体细节，主要是为了清楚理解而提供，并且不应从中理解不必要的限制。
在某些情况下，本文公开的核苷酸和多肽包括在公众可获得的数据库中，例如和SWISSPROT。包括在这些公开可用的数据库中的这些核苷酸和多肽相关的序列和其他信息的信息明确地通过引证并入本文。除非另有说明或显而易见，否则对这种公开可用的数据库的引证是指在本申请的提交日期的数据库的最新版本。
虽然本文使用的术语被认为是本领域普通技术人员所理解的，但是阐述定义以便于解释本发明公开的主题。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所描述的方法，装置和材料类似或等同的任何方法，装置和材料可以用于本发明公开的主题的实践或测试，现在描述代表性的方法，装置和材料。
根据长期专利法惯例，当在本申请(包括权利要求)中使用时，术语“一个”、“一种”和“该”是指“一个或多个”。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞，等等。
除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表示成分、性质例如反应条件等的量的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则本说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据本发明所公开的主题所获得的期望性质而变化。
如本文所使用的，术语“约”当指质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量时，意味着包括在一些实施方案中从特定值±20％的变化，在一些实施方案中±10％，在一些实施方案中为±5％，在一些实施方案中为±1％，在一些实施方案中为±0.5％，和在一些实施方案中为±0.1％，因为这些变化适于执行所公开的方法。
如本文所使用的，范围可以表示为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。还应理解，存在本文公开的多个值，并且除了值本身之外，每个值还在本文中被公开为“约”该特定值。例如，如果公开值“10”，则还公开“约10”。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
除非另有说明，否则本文所用的任何保护基、氨基酸和其它化合物的缩写符合其通用用法、公认的缩写或IUPAC-IUBC生物化学委员会(参见Biochem.(1972)11(9)：1726-1732)。
本发明公开的主题包括人造RNA纳米结构和RNA树枝状聚合物及其使用方法。
RNA纳米技术是一个独特的领域[G8，G24]，不同于经典的RNA结构和折叠研究[G25-31]。在1998年，首次证明了通过自下而上自装配构建RNA纳米颗粒的可行性。使用来自pRNA的重构工程RNA片段装配RNA二聚体、三聚体和六聚体纳米颗粒，所述pRNA是携带phi29DNA包装马达的病毒组分(图6A-C[G32])。该发现(发表在Molecular Cell，并且在Cell中描述(G32-33))是RNA纳米技术的概念证明。一般来说，RNA在几个方面是独一无二的：(1)RNA包含多种基序，如螺旋、环、茎、发夹和伪节点，以指定丰富的3D架构；(2)RNA具有规范的、非规范的碱基配对(G34-38)，以及用于分子内或分子间相互作用的碱基堆积能力(G39-40)；(3)RNA在热力学上比DNA更稳定[G9，G10，G39，G40]；(4)RNA在转录、终止、剪接和自我加工中产生能够在体外和体内自装配成纳米颗粒的RNA片段的独特特征[G32，G41-45]；和(5)RNA展示功能实体，例如siRNA[G46，G47]、核酶[G48，G49]、核糖开关[G50-51]和miRNA[G52-53]。如本文所公开的，由于发现其高热力学稳定性，有利的和独特的体内属性(US2014/0179758，通过引证整体并入本文)，RNA纳米技术是重要的领域。在本公开的一些实施方案中，如US2014/0179758中公开的，RNA分子形成二聚体、三聚体、六聚体和图案化的超结构。
在自然界中，一些RNA分子形成具有不同功能的独特多聚体。在一个实施方案中，噬菌体phi29 pRNA通过右-和左-互锁环[G20，G32，G54，G55]之间的手牵手相互作用形成二聚体和六聚体(图6A-C)。最近发现了超稳定的pRNA 3-向结(3WJ)基序的异常性质(图6E-F)(Nature Nanotechnology，2011；Nano Today，2012)[G9-10]。3WJ从三种RNA寡核苷酸装配，在不存在金属盐的情况下具有非常高的亲和力；耐8M尿素变性；显示热力学稳定性能；并且不在超低浓度下解离(图7)[G9-12]。不受理论的束缚，具有接近90°的斜率的熔融曲线表示极低的自由能(ΔG)和三组分链的协同装配(图8)。2′-氟(2′-F)修饰[G9，G13，G56-58]导致RNA纳米颗粒对RNA酶降解具有抗性，同时保留可靠的折叠和生物活性[G9，G10，G13](图7D)。使用pRNA-3WJ作为支架构建了RNA纳米颗粒的多种变体，并证明了每个功能模块在体外和动物试验中保留了它们对于特异性细胞结合和进入、基因沉默和催化功能的折叠和独立功能[G9-12](图9-11)。pRNA-3WJ纳米颗粒展示有利的生物分布和药代动力学概况，并避免小鼠中的干扰素反应和细胞因子产生[G12](图25)。与2′-F裸siRNA的0.25-0.75小时相比，我们的2′-F功能性RNA的体内半衰期为6-12小时。最近获得了pRNA-3WJ核的晶体结构[G14]，这将促进多功能RNA纳米颗粒的设计。
RNA纳米颗粒可以制备成具有DNA的简单特征水平，同时具有模拟一些蛋白质的通用三级结构和催化功能[G8，G49，G61-66]。RNA纳米技术是指主要由通过自下而上自装配的RNA组成的RNA结构的设计、制造和应用(图9)，与其它广泛研究的将功能性RNA模块缀合到聚合物、脂质、树枝状聚合物、金或其它基于纳米材料的纳米颗粒的药物递送系统相反。在本发明公开的主题中产生的RNA纳米颗粒的性质包括：(1)身体本身处理RNA颗粒，避免巨噬细胞的吞噬并最小化正常器官中的积累；(2)RNA的聚阴离子性质可避免非特异性细胞进入，因为其不利于其穿过带负电的细胞膜[G67-70]；(3)RNA是聚合物(多核酸)。RNA纳米颗粒具有确定的大小、结构和化学计量(图9)。因此可以避免来自不均匀颗粒的不可预测的副作用(图9)[G8-10，G20，G24]；(4)设计了尺寸为10-60nm并且足以容纳siRNA、核酶、miRNA和适体的RNA纳米颗粒(图9)。纳米颗粒足够大以避免肾排泄(如裸siRNA的情况)，但足够小以通过受体介导的胞吞作用进入细胞[71]并避免肝库普弗细胞和肺巨噬细胞的包埋[G3，G8]；(5)我们的DNA纳米颗粒设计的分支棘轮形状(图9)促进肿瘤穿透和EPR(增强的渗透性和保留)效果[G3，G8]；(6)在无细胞系统中经济大规模生产是可能的；(7)RNA是高度可溶的，不易于聚集，并且不需要连接到PEG或血清白蛋白[G8，G24]，通常用于宽范围的纳米颗粒；(8)RNA纳米颗粒的多价性质允许靶向、成像和治疗模块的整合，以实现协同效应，而不使用任何交联方法(图9)[G8，G9]，模块化设计允许工程化RNA片段的自装配[G8，G24]；(9)已经证明2′-F化学修饰的RNA对核糖核酸酶降解具有抗性，同时保留可靠的折叠和生物学功能[G9，G10，G13]；(10)pRNA-3WJ纳米颗粒是热力学稳定的，因此在超低浓度下将在体内保持完整(图7-8)[G9，G10]；(11)基于pRNA-3WJ的纳米颗粒在体内具有有利的药代动力学和药效学分布；是无毒的，并且不在小鼠中诱导干扰素(图25)或细胞因子产生[G9，G10，G12]；(12)将稳定的RNA纳米颗粒全身注射到小鼠中已经显示RNA纳米颗粒强烈且特异性结合癌症，在生命器官或组织中几乎没有积累[G9，G10，G12](图11)。(13)RNA纳米颗粒不诱导宿主-抗体反应，这将允许癌症的重复治疗。这特别适用于响应于基于蛋白质的试剂而产生中和抗体的患者；(14)RNA是化学试剂。因此，预期与基于蛋白质的临床试剂相比，调节过程更有利[G8，G24]。
在一些实施方案中，本发明公开的主题涉及人造RNA纳米结构分子。该分子包括RNA连接基序和至少一个成像模块。RNA连接基序包括多个分支，并且RNA连接基序的分支包含至少一个RNA寡核苷酸。在一些实施方案中，多个分支包括三个分支、四个分支、五个分支、六个分支、七个分支、八个或更多个分支(US2014/0179758，通过引证整体并入本文)。
成像模块的非限制性实例包括荧光染料、放射性核素和/或造影剂。荧光染料的非限制性实例包括Alexa染料、Cy染料或近红外染料。荧光染料的另外的非限制性实例包括Alexa染料、Cy染料、近红外(近IR或NIR)染料，包括但不限于IRdye800、Alexa647、Cy5、Cy5.5、Alexa680、Iowa Black RQ、QSY21、IRDyeQC、BBQ650、BHQ-3、吲哚菁绿(ICG)。在一些实施方案中，成像模块包括报告成像模块。在一些实施方案中，成像模块包括参考成像模块。在一些实施方案中，参考成像模块包括参考染料和淬灭剂。在一些实施方案中，RNA分子还包括偶联到RNA接合基序的至少一个癌靶向模块。在一些实施方案中，所述分子还包括偶联到RNA连接基序的至少一个治疗模块。在一些实施方案中，成像模块偶联至RNA连接基序的至少一个分支。在一些实施方案中，成像模块偶联至RNA连接基序的任何分支。在一些实施方案中，成像模块偶联至癌靶向模块。在一些实施方案中，成像模块偶联至治疗模块。在一个实施方案中，包含RNA连接基序的多个分支包括三分支RNA连接基序。在一个实施方案中，包含RNA连接基序的多个分支包含四分支RNA连接基序。
此外，如本文所使用的，如本文所使用的术语“偶联”是指两个分子连接在一起。非限制性实例包括RNA纳米颗粒、配体部分例如叶酸或标记部分或治疗剂之间的共价连接，或通过掺入抗核酸酶的核苷酸(WO/2002/016596；美国专利号7,655,787；WO/2005/003293；WO/2007/016507，其明确地通过引证并入本文)。
NIR染料或荧光团是特别有吸引力，因为它们可以深入到组织中，更重要的是，大大减少了来自组织的自发荧光。不受理论束缚，将利用pRNA-3WJ基序开发稳健的RNA纳米技术，用于通过NIRF和PET/SPECT成像非侵入性地监测治疗剂的体内递送。在一些实施方案中，RNA纳米结构分子用于体内成像。
在本公开主题的一些实施方案中，RNA纳米结构包括放射性核素。在一些实施方案中，术语“放射性核素”包括放射性标记肽和具有各种同位素的蛋白质。放射性同位素的非限制性实例包括177Lu、111In、64Cu、99mTc、203Pb、188Re、212Pb/212Bi。在一些实施方案中，放射性核素偶联至RNA连接基序的多于一个分支。在一些实施方案中，放射性核素通过螯合剂螯合。在一些实施方案中，螯合剂缀合至RNA连接基序的至少一个分支。螯合剂的非限制性实例是EDTA、DOTA、NOTA。
在一些实施方案中，RNA分子包括造影剂。本文使用的术语“造影剂”是指用于改善图像中内部身体结构的可见性的化合物，包括但不限于X射线图像或扫描图像(例如，CAT(计算机化轴向断层摄影)扫描、MRI(磁共振成像)扫描)。术语造影剂在本文中也称为放射性造影剂。造影剂用于各种诊断(例如心导管插入术)和治疗(例如血管分流置入)程序中。磁共振成像(MRI)是一种强大的非侵入性技术，提供组织的高质量三维图像，包括关于解剖、功能和体内组织代谢的信息。钆是常见的T1加权MRI造影剂。在一些实施方案中，造影剂是MRI造影剂。在一些实施方案中，MRI造影剂是胃肠MRI、静脉内MRI、血管内(血池)MRI肿瘤特异性MRI、肝胆MRI和网状内皮MRI。MRI造影剂的一个非限制性实例是钆造影剂。
生物大分子作为天然构件对于活生物体的功能至关重要。RNA是除了DNA、蛋白质、脂质和碳水化合物之外的五个最重要的生物大分子之一。类似于DNA的一些方面在于，RNA由四个核苷酸组成，包括腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟苷(G)和尿苷(U)，其同质性是特别的。RNA是核苷酸的均聚物，但也是A、U、G和C的杂聚物。每个核苷酸含有核糖、核碱基和磷酸基团。核苷酸通过相邻核糖单元之间的3′→5′磷酸二酯键共价连接在一起，为糖-磷酸主链提供了定义RNA作为多核酸的方向性。主链中的磷酸部分带负电荷，使得RNA在生理pH下为聚阴离子大分子。RNA分子通常是单链的；然而，沃森克里克(规范)碱基对相互作用(A：U和G：C)、摇摆碱基配对(例如G：U)[G.Varani，W.H.McClain，EMBO Rep.，1(2000)，pp.18-23]或其他非规范碱基配对，例如与糖苷键相对于氢键(顺式或反式)的取向的边缘-边缘相互作用的十二个基本几何家族(Watson-Crick，Hoogsteen/CH或糖边缘)[U.Nagaswamy，et.，al.，Nucleic Acids Res.，30(2002)，pp.395-397]，一起产生展示环、发夹、凸起、茎、假结、连接等的各种结构构象，其是引导和驱动RNA分子装配成所需结构的必要元件[Y.Xin，et al.，RNA，14(2008)，pp.2465-2477；Y.Xin，et al.，RNA，14(2008)，pp.2465-2477；C.Laing，etal.，PLoS ONE，8(2013)，p.e71947；and C.Laing，et al.，Nucleic Acids Res.，40(2012)，pp.487-498]。
定义和区分它与DNA的RNA的特征是主链的每个核糖上的2′-羟基。2′-OH基团为RNA提供了特殊性质，其可以是优点或缺点。从结构观点来看，这种额外羟基的优点是它将核糖锁定为3′-内座椅构象(内切椅式构象，endo chair conformation)。因此，结构上有利的是RNA双螺旋采用比通常存在于DNA双螺旋中的B形式短和宽约～20％的A形式。此外，RNA中的2′-OH基团是化学活性的，并且能够在SN2反应中引发对相邻3′-磷酸二酯键的亲核攻击。这切割RNA糖-磷酸骨架和这种化学机制奠定了核酶中观察到的催化自裂的基础。缺点是2′-OH基团使得RNA易于被核酸酶消化，因为许多RNA酶识别包括2′-OH基团的RNA的结构作为特异性结合位点。然而，通过应用2′-OH基团的化学修饰已经克服了这种酶不稳定性。例如，用氟(2′-F)、O-甲基(2′-O-Me)或胺基(2′-NH2)取代2′羟基通过防止RNA酶引起的降解明显增加了体内RNA的稳定性。最近的研究还表明，siRNA在血清中的稳定性也高度依赖于特定的RNA序列，并且短和长RNA两者的降解双重主要发生在UA/UA或CA/UG位点[G112][Hui Li et al.，Nanotoday，volume 10，Issue 5，October 2015，pp631-655，hereinincorporated by reference in its entirety]。
在一些实施方案中，纳米结构在RNA寡核苷酸的2′位置包含至少一个化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰包括2′氟、2′胺基和2′O-甲基。
在本公开主题的一些实施方案中，三分支RNA连接基序的分支是a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)或c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一个实施方案中，三分支RNA连接基序包含a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)和c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1与核苷酸序列5′-UUGCCA UGU GUA UGU GGG-3′具有至少90％的同一性。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1包含核苷酸序列5′-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3′。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2与核苷酸序列5′-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3′具有至少90％的同一性。在一个实施方案中，SEQ IDNO：2包含核苷酸序列5′-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3′。在一些实施方案中，SEQ ID NO：3与核苷酸序列5′-GGA UCA AUC AUG GCA A-3′具有至少90％的同一性。在一个实施方案中，SEQ ID NO：3包含核苷酸序列5′-GGA UCA AUC AUG GCAA-3′。在一些实施方案中，成像模块附接到上面公开的a、b和c模块中的任何一个。在一些实施方案中，靶向模块附接到上文公开的a、b和c模块中的任一个。在一些实施方案中，治疗模块是上面公开的a、b和c模块中的任何一个。
在本公开主题的一些实施方案中，RNA纳米结构包括癌靶向模块。在一些实施方案中，本发明公开的主题提供人造RNA纳米结构分子中的靶向模块包括结合至少一种癌细胞表面标记物的配体。在一些实施方案中，癌靶向模块是结肠癌靶向模块。
如本文所用，细胞表面标记物包括可在细胞表面内或表面上检测的任何细胞组分，或结合或聚集到细胞表面的大分子。因此，细胞表面标记物不限于物理地在细胞表面上的标记物。例如，细胞表面标记可以包括但不限于表面抗原、跨膜受体或共受体，结合到表面的大分子，例如结合或聚集的蛋白质或碳水化合物，内部细胞成分等。表面标记物的非限制性实例包括叶酸受体、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFR、转铁蛋白受体和RGD。在一些实施方案中，配体包括适体。在一些实施方案中，适体与EpCAM、EGFR(EGFR蛋白[Homosapiens]GenBank：AAI18666.1)、PDGFR(血小板衍生生长因子受体β前体[Homo sapiens]NCBI参考序列：NP_002600.1)或叶酸受体(叶酸受体[Homo sapiens]GenBank：AAB05827.1)。在一些实施方案中，靶向模块是叶酸。
本文所用的术语“叶酸”可以包括明确定义的B-维生素化合物类，包括但不限于5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、氧化型叶酸和其它叶酸化合物。如本文所公开的，靶向递送系统需要在癌细胞中特异性发现的配体-受体对。包括但不限于胃、卵巢、肺、乳腺、肾、子宫内膜、结肠和造血细胞的许多癌细胞与正常细胞过度表达的叶酸受体(FR)相比，高摄取叶酸，因为叶酸是DNA复制和高度增殖细胞中甲基化的必需成分。叶酸的合成氧化形式氧化型叶酸(FA)已广泛用作各种癌靶向材料中的配体缀合物。
在一些实施方案中，治疗模块包含siRNA、miRNA、抗mRNA、核酶RNA或反义RNA。在一些实施方案中，在一些实施方案中，治疗模块包含化疗药物、核糖开关或内体破坏剂。在一些实施方案中，治疗模块是siRNA序列。siRNA的非限制性实例是siRNA，其针对存活蛋白、Bcl-2、XIAP、BCL-XL或BRCAA1。在一些实施方案中，siRNA直接结合PI3K、Akt或mTOR。在一些实施方案中，治疗模块是微RNA序列。
术语“小干扰RNA”、“短干扰RNA”、“小发夹RNA”、“siRNA”和shRNA可互换使用，是指能够介导RNA干扰(RNAi)或基因沉默的任何核酸分子。参见例如，Bass，Nature 411：428-429，2001；Elbashir等，Nature 411：494-498，2001a；和PCT国际公开号WO 00/44895、WO01/36646、WO 99/32619、WO 00/01846、WO 01/29058、WO 99/07409和WO 00/44914。在一个实施方案中，siRNA包含含有互补的有义和反义区的双链多核苷酸分子，其中反义区包含与靶核酸分子(例如，编码存活蛋白的核酸分子)的区域互补的序列。在另一个实施方案中，siRNA包含具有自身互补的有义和反义区的单链多核苷酸，其中反义区包含与靶核酸分子的区域互补的序列。在另一个实施方案中，siRNA包含具有一个或多个环结构的单链多核苷酸和包含自互补和反义区的茎，其中所述反义区包含与靶核酸分子的区域互补的序列，并且其中所述多核苷酸可以在体内或体外加工以产生能够介导RNAi的活性siRNA。如本文所使用的，siRNA分子不需要限于仅含有RNA的那些分子，而是还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
在一些实施方案中，本发明公开的主题利用短的双链RNA分子引起细胞基因下调的能力，称为RNA干扰的过程。如本文所用，“RNA干扰”(RNAi)是指由小干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。参见Fire等人，Nature 391：806-811，1998和美国专利号6,506,559，其各自通过引证整体并入本文。转录后基因沉默的过程被认为是进化上保守的细胞防御机制，其已经进化以防止外源基因的表达(Fire，Trends Genet 15：358-363，1999)。
本文公开了包括存活蛋白特异性的siRNA、Bcl-2、XIAP和BCL-XLsiRNA序列的非限制性实例。存活蛋白特异性siRNA包括有义序列：5′GGACCACCGCAUCUCUACAdTdT 3′(SEQ IDNO：21)和反义序列：5′dTdTCCUGGUGGCGUAGAGAUGU 3′(SEQ ID NO：22)(参见例如CancerGene Ther.2004 Mar；11(3)：186-93.Knockdown of survivin expression by smallinterfering RNA reduces the clonogenic survival of human sarcoma cell linesindependently of p53.)；Bcl-2 siRNA包括有义序列：5′-AAGCUGuCACAGAGGGGCUAC-3′(SEQ ID NO：23)和反义序列：5′-GUAGCCCCUCUGUGACAGCUU-3(SEQ ID NO：24)(参见例如Nucleic Acids Res.2012 Jul；40(13)：6319-37.doi：10.1093/nar/gks294.Epub 2012Mar 30.Delivery of chemo-sensitizing siRNAs to HER2+-breast cancer cellsusing RNA aptamers.)；XIAP siRNA包括有义序列：5′-CCAUGUGCUAUACAGUCAUUACUUU-3(SEQ ID NO：25)和反义序列：5′-AAAGUAAUGACUGUAUAGCACAUGG-3(SEQ ID NO：26)(参见例如Mol Cancer.2006 Sep 5；5：34.Specific down-regulation of XIAP with RNAinterference enhances the sensitivity of canine tumor cell-lines to TRAIL anddoxorubicin)；以及BCL-XL siRNA包括有义序列：5′-UUGGACAAUGGACUGGUUGA-3(SEQ IDNO：27)，反义序列：5′-UCAACCAGUCCAUUGUCCAA-3(SEQ ID NO：28)(参见例如Acta BiochimBi6phys Sin(Shanghai).2005Aug；37(8)：555-60.Silencing of Bcl-XL expression inhuman MGC-803 gastric cancer cells by siRNA.)。此外，在一个实施方案中，siRNA是BRCAA1 siRNA。非限制性实例是siRNA序列5′-CCACAUAAAGGGCCCACUA-3′(SEQ ID NO：29)。另一个非限制性实例是siRNA序列5′-UAGUGGGCCCUUUAUGUGG-3′(SEQ ID NO：30)。
在一些实施方案中，生物活性剂是微RNA序列。本文使用的术语“微RNA(miRNA)”是长度为至少约6个核苷酸的单链或双链非编码RNA，其可通过降解其靶mRNA或抑制其翻译来调节在转录后水平的基因表达(1，2)。MiRNA在调节细胞周期、增殖、分化、代谢和凋亡中起重要作用(1)。微RNA和各个微RNA结合序列的纲要可在miRNA登记处获得(参见例如Griffiths-Jones et al.(2006)Nucl.Acids Res.34：D140-D144；US20140045709，hereinincorporate by reference in their entireties.)。在具体实施方案中，本测定中使用的微RNA和微RNA结合序列与疾病或病症相关，其中微RNA的拮抗剂或激动剂可用于预防或治疗疾病或病症。
在一些实施方案中，本公开提供了miRNA(例如，抗miR-21)的抑制剂。本文还公开了包含此类抑制剂的组合物和使用此类抑制剂抑制miR-21的方法。任何miRNA抑制剂可以单独使用，或与本领域已知的其它miRNA抑制剂一起使用。在一些实施方案中，miRNA抑制剂包含反义分子。在一些实施方案中，反义分子可以是单链或双链序列。反义分子的实例包括但不限于siRNA、三螺旋形成剂、核酶、RNAi、合成肽核酸(PNA)、抗原(agRNA)、LNA/DNA共聚物、小分子化学化合物和反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，微RNA序列的长度为至少6个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA分子或其等价物或其模拟物的长度为约6至约30个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA长度为约12至约30个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA长度为约15至约28个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA长度为约19至约25个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA分子具有至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、约30个核苷酸或更多的长度。在一些实施方案中，miRNA分子的拮抗剂长度为约6至约30个核苷酸，长度为约10至约30个核苷酸，长度为约12至约28个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA分子的拮抗剂具有至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、约30个核苷酸或更多的长度。
在一些实施方案中，miRNA干扰致癌miRNA以复原癌生长。RNA纳米结构分子含有沉默致癌miRNA(包括但不限于miR-9、miR-10b、miR-21、miR-17和miR-26)的抗-miRNA。在一些实施方案中，miRNA拯救下调的癌抑制miRNA，其中RNA纳米结构引入癌抑制miRNA，包括但不限于let-7a、miR-10b、miR-25、miR-34a、miR-124、miR-145和miR-181b。其它实例公开于US20140045709中，其通过引证以其整体并入本文。
在一些实施方案中，治疗模块是细胞毒性药物。本文使用的术语“细胞毒性药物”是指具有抑制过度增殖细胞的生长或增殖(例如细胞生长抑制剂)或诱导杀死过度增殖细胞的性质的试剂。非限制性实例包括多柔比星、紫杉醇、紫杉醇衍生物和类似物、细胞松弛素D、雷帕霉素、雷帕霉素衍生物和类似物、喜树碱、地塞米松和5-氟尿嘧啶、喹唑啉酮衍生物、金属银、曲尼司特、依维莫司和相关化合物，或抑制细胞增殖和/或迁移和/或炎症过程的其它试剂。
在另一方面，本发明公开的主题提供了人造RNA纳米结构分子，其包括包含多个分支的RNA连接基序和与RNA连接基序偶联的基于辐射的治疗模块，并且所述RNA连接基序的分支包括至少一个RNA寡核苷酸。在一些实施方案中，所述分子还包括偶联到RNA连接基序的癌症靶向模块。在一些实施方案中，所述分子还包括与RNA连接基序偶联的成像模块。在一些实施方案中，纳米结构在RNA寡核苷酸的2′位置包含至少一个化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰包括2′氟、2′胺基和2′O-甲基。在一些实施方案中，多个分支包括三个分支、四个分支、五个分支、六个分支、七个分支、八个或更多个分支。在一些实施方案中，包含RNA连接基序的多个分支包括三分支RNA连接基序。在一些实施方案中，包含RNA连接基序的多个分支包含四分支RNA连接基序。在一些实施方案中，三分支RNA连接基序的分支包括a3WJRNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)或c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，三分支RNA连接基序包含a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)和c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1与核苷酸序列5′-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3′具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，SEQ IDNO：1包含核苷酸序列5′-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3′。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2与核苷酸序列5′-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3′具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2包含核苷酸序列5′-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3′。在一些实施方案中，SEQ ID NO：3与核苷酸序列5′-GGA UCA AUC AUG GCAA-3′具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO：3包含核苷酸序列5′-GGA UCA AUC AUG GCA A-3′。在一些实施方案中，癌靶向模块是癌细胞特异性配体。在一些实施方案中，癌靶向模块是叶酸。在一些实施方案中，癌靶向模块是RNA适体。在一些实施方案中，基于辐射的治疗模块包括同位素。同位素的非限制性实例包括177Lu、111In、64Cu、99mTc、203Pb、188Re、212Pb、212Bi、I-125或Cs-131。在一些实施方案中，衍生自pRNA 3WJ的RNA纳米颗粒在照射下在约1Gy、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy、40Gy、45Gy、50Gy、55Gy、60Gy、65Gy、70Gy、75Gy、80Gy、85Gy、至约90Gy的临床相关剂量是基本上稳定的。
癌症是具有不可控制的细胞生长、侵袭和破坏附近组织和转移的广泛类型的疾病。迫切需要一种有效、高效和安全的癌症治疗。放射治疗是抗癌治疗的主要方式，其利用由线性加速器(外部束治疗)或放射性同位素(近距离放射治疗和核医学)产生的电离辐射杀死癌细胞，抑制肿瘤生长并防止肿瘤复发[5]。然而，辐射不仅杀死癌细胞，而且损害健康细胞。与当前放射治疗相关的副作用明显限制了传递给患者的剂量[6，7]。放射治疗的目标是向靶标递送高剂量的辐射以杀死癌细胞，同时保护周围的健康组织。但是，这不容易实现使用当前技术。包括CT和MRI的医学成像用于在治疗之前/期间以及甚至之后准确地识别和定位或跟踪肿瘤。由于这种成像仅能识别瘫痪病变，因此很难找到和定位所有癌细胞，特别是微观疾病。除此之外，在剂量递送期间避免正常的组织损伤也是非常困难的。外部光束治疗使用在到达靶之前可能必须通过正常组织的电离粒子。近距离放射治疗以机械方式处理放射源，并且在定位放射源方面具有明显的不确定性。虽然某些电离放射性药物(例如用于核医学的I-131和Y-90)可靶向某些器官和肿瘤，但由药物的代谢和排泄引起的生物分布的变化和定位误差在靶向肿瘤和剂量测定中产生不确定性和限制，从而增加对正常组织的损伤[8]。
基于RNA纳米颗粒的纳米载体平台可克服常规放射治疗和诊断的上述限制，并为特异性递送辐射到癌症开辟新的机会，而不损害健康的器官和组织，降低毒性和副作用，提高治疗效果，并且在临床癌症治疗和诊断中表现出巨大的潜力。
最近，已经发现纳米颗粒能够精确靶向癌细胞，因此可以用于癌靶向和治疗[9-14]。纳米颗粒的尺寸通常在几百纳米内，并且可与大的生物分子例如酶、受体和抗体相比。由于小尺寸，纳米颗粒可以与细胞表面上和细胞内的生物分子相互作用，参与分子、生物化学和生物过程，因此可以用作医学成像和靶向癌症治疗的试剂。最常见的研究良好的纳米颗粒包括量子点、碳纳米管、顺磁性纳米颗粒、脂质体、金纳米颗粒和许多其他纳米颗粒。然而，存在这些纳米颗粒的生物相容性的担忧，特别是当它们暴露于辐射和它们逃离网状内皮系统的能力时，这可能导致短期和长期毒性[16，17]。
纳米技术的新发现导致了新型RNA纳米颗粒的发展，所述RNA纳米颗粒主要由能够强烈结合肿瘤而不在其他重要器官或组织中积累的RNA组成[18-20]。自1998年首次证明概念以来[21]，RNA纳米技术已经成为一个流行和快速增长的领域，其为纳米技术、分子生物学、医学和生物医学工程的接口。RNA纳米技术在医学和特征上具有重要的翻译潜力，可以制备RNA纳米颗粒所需的药剂和放射性同位素载体。首先，可以以高再现性用已知的化学计量产生RNA纳米颗粒[21，26，27]。RNA的简单性(仅由四个核酸碱基组成)允许通过自下而上自装配可预测和可寻址地形成具有不同功能基团的各种纳米结构。其次，RNA纳米颗粒可以通过靶向细胞表面受体通过使用功能像蛋白质或化学配体的RNA适体靶向特定细胞组[18，28，29]。这些结构不诱导抗体产生，允许重复递送和治疗[28]。第三，已经产生的RNA纳米颗粒具有10-50nm的尺寸范围，其是完美尺寸，不仅通过避免快速肾排泄而保留在体内而且通过细胞表面受体介导的内吞作用还通过癌肿瘤中的泄漏血管以及细胞膜[18-20]。
为了具有临床应用，RNA纳米颗粒和那些性质必须在临床条件下保持稳定和不变。噬菌体phi29包装RNA(pRNA)代表了用于RNA纳米颗粒自下而上装配的有吸引力的平台[18-20，通过引证将其整体并入本文]。pRNA的分子结构包含螺旋结构域、包含右手环和左手环的中心结构域以及三向结(3WJ)核[30]。最近的研究表明pRNA 3WJ具有热力学稳定性，并且基于pRNA 3WJ核构建的RNA纳米颗粒也是热力学和化学稳定的[27]。此外，受体结合配体、适体、短干扰RNA和核酶可以并入pRNA 3WJ纳米颗粒中并保持其正确的折叠和功能。pRNA纳米颗粒还显示了在体内靶向递送中的有利的药代动力学分布(与0.25-0.75小时的2′FsiRNA对应物相比，半衰期为5-10小时)。为了用作放射性同位素载体，将在临床相关剂量的照射下进一步测试RNA纳米颗粒的稳定性。
在一些实施方案中，所述分子在辐射处理下基本上稳定。如本文所用，术语“基本上稳定”可以指物理和/或化学稳定性。如本领域普通技术人员将认识到的，术语“基本上稳定”可以指相对于初始组合物(即，当最初制备组合物的特定批次时)在某些条件下组合物的稳定性。在这点上，如本领域普通技术人员将认识到的，可以确定组合物的具体实施方案的稳定性的一种方式如下：制备一批该组合物的实施方案，进行组合物样品(对照样品)的初始评估，使组合物的样品经受感兴趣的条件(例如，在特定温度下储存特定时间段)(测试样品)，对测试样品进行评估，以及将对照样品的评价与测试样品的评价进行比较。可以进行计算以确定测试样品中存在的量是否为存在于对照样品中的量的100％±20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0.1％。
在一个实施方案中，本公开提出了使用3WJ RNA纳米颗粒携带放射性同位素。在一个实施方案中，本公开提出使用四向结(4WJ)RNA纳米颗粒携带放射性同位素。放射性同位素的非限制性实例是I-125或Cs-131。使用这样的RNA纳米颗粒，癌细胞可以通过I-125或Cs-131被靶向并处理[31]。在核医学中，几种放射性同位素，例如I-131/P-32和Y-90已经用于靶向放射性核素治疗，但是这些同位素仅应用于非常有限类型的癌症[32-36]。此外，用于核医学治疗的大多数同位素是β发射体，并且不适合成像。如果没有准确的成像，精确的剂量估计几乎是不可能的。另一方面，I-125和Cs-131已广泛用于永久性植入近距离放射治疗，并成功治疗各种类型的癌症。使用I-125或Cs-131与3WJ RNA纳米颗粒的想法是为了增加肿瘤靶向的准确性，并增强治疗广泛范围的肿瘤和节省正常组织的有效性。此外，I-125和Cs-131发射光子，这将有助于在核内成像和研究这些同位素的生物分布以用于估计患者特异性剂量。在本研究中研究了在体内癌靶向和治疗中必需的pRNA 3WJ纳米颗粒的稳定性。
这项研究进一步调查从phi29DNA包装电机的pRNA三向结(3WJ)衍生的化学修饰的RNA纳米颗粒是否耐强力的I-125和Cs-131辐射，这是利用这些RNA纳米颗粒作为靶向放射治疗的载体所需的必要条件。构建并表征pRNA 3WJ纳米颗粒，并检查这些纳米颗粒在具有临床相关剂量的I-125和Cs-131照射下的稳定性。源衍生自pRNA 3WJ的RNA纳米颗粒特异性地靶向肿瘤，并且它们在I-125和Cs-131的照射下，在约1Gy至约90Gy的临床相关剂量下，在长达20天的相当长的时间内稳定，而对照质粒DNA在20Gy或更高时被损伤。
预期用于放射治疗和诊断的基于RNA纳米颗粒的纳米载体平台在若干方面将优于当前辐射系统或其它策略：(1)RNA纳米颗粒具有确定的大小、结构和化学计量；因此可以避免由不均匀颗粒引起的不可预测的副作用；(2)RNA纳米颗粒的纳米尺寸将促进组织穿透和靶向肿瘤；(3)RNA纳米颗粒易于通过自装配构建、高度可溶且不易聚集；(4)RNA纳米颗粒是热力学稳定的，因此整个构建体将在体内超低浓度下保持完整；(5)RNA纳米颗粒的多价性质允许靶向模块、成像模块和治疗模块容易地整合成单一形式；(6)RNA纳米颗粒即使在高剂量下也显示低或无免疫原性和/或毒性。3WJ-pRNA支架在体内显示有利的药代动力学和药效学分布(与0.25-0.75小时的最稳定的2′F修饰的siRNA对应物相比，半衰期为5-10小时)；无毒；并且不诱导干扰素或细胞因子；(7)全身注射热力学和化学稳定的RNA纳米颗粒到小鼠的尾静脉中显示RNA纳米颗粒保持完整。它们强烈且特异性结合癌症，而不进入肝、肺或任何其他重要器官或组织。这对于靶向由于穿过脉管系统的渗透问题和针对间隙压力的分散而先前不可接近的实体肿瘤是特别有利的；(8)衍生自pRNA 3WJ的RNA纳米颗粒在I-125和Cs-131的照射下，在长达20天的相当长的时间内在范围从1Gy至90Gy的临床相关剂量下是稳定的。
此外，在本主题的另一方面，提供了RNA树枝状聚合物分子。所述分子包括(a)中心核多分支RNA连接基序，其中所述中心核基序包括多个分支，并且其中分支包含至少一个RNA寡核苷酸；和(b)包含至少一个重复多分支RNA连接基序单元的外表面多分支RNA连接基序，其中所述重复单元包含多个分支，并且其中分支包含至少一个RNA寡核苷酸。在一些实施方案中，树枝状聚合物还包括至少一个成像模块。在一些实施方案中，树枝状聚合物包括至少一个靶向模块。在一些实施方案中，树枝状聚合物还包括至少一个治疗模块。在一些实施方案中，多个分支包括中心核多分支RNA连接基序，包括三分支RNA连接基序、四分支RNA连接基序、五分支RNA连接基序、六分支RNA连接基序、七分支RNA连接基序、八个或更多个分支的RNA连接基序。在一些实施方案中，包含重复多分支RNA连接基序单元的多个分支包括三分支RNA连接基序、四分支RNA连接基序、五分支RNA连接基序、六分支RNA连接基序、七分支RNA连接基序、八个或更多个分支的RNA连接基序。在一些实施方案中，三分支RNA连接基序的分支包含a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)或c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一个实施方案中，三分支RNA连接基序包含a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)和c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，SEQID NO：1与核苷酸序列5′-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3′具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2与核苷酸序列5′-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3′具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，SEQ ID NO：3与核苷酸序列5′-GGA UCA AUC AUG GCA A-3′具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，中心核多分支RNA连接基序是多角形结构，其在每个角包含三分支RNA连接基序。在一些实施方案中，成像模块包括荧光染料、放射性核素或造影剂。在一些实施方案中，荧光染料是Alexa染料、Cy染料或近IR染料。荧光染料的非限制性包括IRdye800、Alexa647、Cy5、Cy5.5、Alexa680、Iowa Black RQ、QSY21、IRDyeQC、BBQ650、BHQ-3、吲哚菁绿(ICG)。在一些实施方案中，成像模块包括报告成像模块。在一些实施方案中，成像模块包括参考成像模块。在一些实施方案中，参考成像模块包括参考染料和淬灭剂。在一些实施方案中，成像模块包含至少一种荧光染料。在一些实施方案中，成像模块包括放射性核素和/或造影剂。造影剂的非限制性实例是MRI造影剂。在一个实施方案中，成像模块包括至少一种钆造影剂。在一些实施方案中，靶向模块包括癌靶向模块。在一些实施方案中，癌靶向模块是结合至少一种癌细胞表面标记物的配体。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物含有包含化学配体和/或RNA适体的靶向模块。配体的非限制性实例包括叶酸。在一些实施方案中，细胞表面标记包括叶酸受体。在一些实施方案中，配体结合上皮细胞粘附分子(EpCAM)。在一些实施方案中，细胞表面标记物包含上皮细胞粘附分子(EpCAM)。在一些实施方案中，癌靶向模块包含适体。适体的非限制性实例是EpCAMRNA适体。在一些实施方案中，癌靶向模块是叶酸。叶酸的非限制性实例包括氧化型叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸或其组合。在一些实施方案中，治疗模块包含siRNA、miRNA、抗mRNA、核酶RNA或反义RNA。在一些实施方案中，治疗模块包括化疗药物、核糖开关或内体破坏剂。在一些实施方案中，治疗模块是细胞毒性药物。细胞毒素药物的非限制性实例包括多柔比星、紫杉醇、紫杉醇衍生物和类似物、细胞松弛素D、雷帕霉素、雷帕霉素衍生物和类似物、喜树碱、地塞米松和5-氟尿嘧啶、喹唑啉酮衍生物、金属银、曲尼司特、依维莫司和相关化合物，或抑制细胞增殖和/或迁移和/或炎症过程的其它试剂。在一些实施方案中，多分支RNA连接基序的多个分支与SEQ ID NO：1-20中至少一个的核苷酸序列具有至少90％的同一性。
近年来，称作树枝状聚合物的广泛支化的3D结构[D1-3]已经成为构建多功能大分子纳米材料作为诊断和治疗剂的有吸引力的平台[D4-8]。这主要是因为树枝状聚合物的多价性质、纳米尺寸、高度支化和含空隙空间的框架，其提供所需功能的高负载能力。有吸引力和有趣的树枝状聚合物在四十年前被概念化[G1]；然而，需要改进以实现其在临床环境中的商业可用性。例如，产生影响产物产率和纯度的无缺陷树枝状聚合物所必需的多步合成反应。并入不同的功能模块以产生多功能框架通常需要影响合成产率、水溶性和甚至功能性的一系列保护-脱保护步骤。传统的小分子构件，例如高分子量载体聚(酰氨基胺)(PAMAM)和聚(丙烯亚胺)(PPI)树枝状聚合物几乎小于10nm，在连续世代内具有埃级水平尺寸差异，使得希望寻找替代构件以增强其尺寸以避免用于体内应用的快速肾清除。
较大的构件例如核酸可以克服尺寸限制。核酸的自装配性质可优于复杂的合成途径以在受控制下产生精确装配的树枝状聚合物。已经提出DNA可以用作构件[D3]，并且已经报道了通过酶连接构建DNA树枝状聚合物[D9]以及最近通过使用粘性末端区段的杂交[D6，D10-13]。RNA树枝状聚合物迄今尚未实现，因为预测涉及规范和非规范碱基配对/碱基堆积和三级相互作用的分子内和分子间RNA折叠中的挑战[D14，D15]以及关于RNA的化学稳定性的担忧[D16-18]。
RNA纳米技术的最新进展已经使得能够构建多种具有精确控制大小、形状和化学计量的RNA纳米结构。几种结构RNA基序已被用作支架以构建多种2D和3D结构，包括分支RNA纳米颗粒[D22-24]、包装RNA(pRNA)六聚体[D24，D25]、纳米环[D26，D27]、三角形[D28，D29]、正方形[D30-32]、五边形[D33]；立方体[D34]和折纸结构[D35]。最近我们发现了来自phi29噬菌体DNA包装马达[D22]的pRNA的稳健的3WJ(三向结)基序[D36]，其可以作为制备RNA纳米颗粒的支架。pRNA-3WJ从三个RNA寡核苷酸装配、是异常热力学稳定的(Tm为59℃；ΔG°37℃为-28千卡/mol)，即使在8M尿素存在下也耐变性，并在体内超低浓度下保持完整[D22，23，37]。我们已经使用靶向、成像和治疗模块功能化pRNA-3WJ，并且所得的RNA纳米颗粒已经用于癌症靶向[D22-24，D38-40]和治疗[D41，D42]以及用于电阻性生物学应用。最近，我们解决了pRNA-3WJ支架的晶体结构[D44]，这有助于多功能RNA纳米颗粒的设计。RNA也已经被报道为耐沸的阴离子聚合物材料，以构建具有限定形状和化学计量的坚固结构[D28，D45]。
如本文所公开的，本发明公开的主题提供了利用高度稳定的pRNA-3WJ基序作为核支架的RNA树枝状聚合物的构建。通过转录或使用亚磷酰胺化学化学地合成每个链，然后顺序自装配以构建3D球状代0-4(G-0-G-4)RNA树枝状聚合物。RNA树枝状聚合物的装配采用模块化设计原理并且是高度可控的。在装配过程之前，可以在组分链的内部以及外围末端相对容易地引入官能团，从而产生具有高产率和纯度的均匀(单分散)RNA树枝状聚合物。
如本文所公开，RNA树枝状聚合物具有以下特征：(1)单分散；(2)聚阴离子性质；(3)具有定义的3D结构(G0-G3)的可调形状；(4)可调纳米尺寸(5-100nm)(G0-G3)；(5)多价性质，其允许多个治疗有效负载和检测模块的缀合，没有任何交联；(6)大量易于获得的末端官能团；(7)模块化设计，允许工程化的RNA片段的自装配；(8)生物相容的；(9)热力学稳定；因此，整个构建体将在体内的超低浓度下保持完整；(10)在2′-F修饰后化学稳定，因此耐RNA酶降解，同时保持正确的折叠和生物功能；(11)使用化学修饰的RNA的更长的血浆半衰期；(12)用于产生均匀的RNA纳米颗粒的可再现的制造框架，其避免免疫应答和非特异性副作用；(13)在无细胞系统中可以进行经济的工业规模生产；(14)高度可溶且不易聚集。它们不需要任何额外的步骤，例如与PEG或血清白蛋白的连接；(15)即使在高剂量下也显示低的或无免疫原性和/或毒性；(16)在小鼠中显示体内有利的药代动力学和药效学分布(与2′F siRNA对应物的0.25-0.75小时相比，半衰期为5-10小时)；(17)将热力学和化学稳定的RNA纳米颗粒全身注射到小鼠中显示RNA纳米颗粒强烈地且特异性地结合癌症，而不在肝、肺或任何其他重要器官或组织中积累；(18)抗体产生的最小诱导将允许癌症的重复治疗。这特别适用于在重复施用后产生基于蛋白质的试剂的中和抗体的患者。
如本文所公开的，RNA作为用于制备G0、G1、G2和G3树枝状聚合物的构建材料。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物携带细胞毒性药物(亲水性和疏水性)以受控和持续的方式杀死肿瘤。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物含有涉及疾病进展的敲低基因的siRNA。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物携带抗miRNA以敲低致癌基因。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物携带miRNA以增加内源性肿瘤抑制miRNA。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物含有用于结合细胞表面受体的适体或化学配体。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物携带适体或化学配体，用于通过内吞作用将RNA树枝状聚合物内化成靶细胞。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物含有用于裂解靶底物的核酶。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物携带用于响应刺激调节细胞通路的核糖开关。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物携带多种MRI造影剂。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物含有多种CT造影剂、多种PET示踪剂、多种NIR显像剂。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物含有用于疾病检测的放射性同位素。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物携带正电性质子海绵试剂例如咪唑或胺用于内体逃逸，和用于治疗癌症和其它疾病包括疾病诊断(包括但不限于癌症、免疫力、呼吸道、中枢神经系统、炎症和感染性疾病)的其它疾病的负电性治疗性RNA如siRNA、miRNA、核糖开关和核酶。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物用于透皮药物递送、口服药物递送、眼部药物递送、肺部药物递送、组织工程和器官支架。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物用于疾病治疗，包括但不限于癌症、免疫力、呼吸道、中枢神经系统、炎症和感染性疾病。在一些实施方案中，RNA树枝状聚合物用于疾病诊断，包括但不限于癌症、免疫力、呼吸道、中枢神经系统、炎症和感染性疾病。
在本发明公开主题的另一方面，是包含治疗有效量的如上文和本文公开的RNA纳米结构分子和RNA树枝状聚合物的组合物。在一些实施方案中，该组合物还包括药学上可接受的载体。
在本发明公开主题的另一方面是药物递送系统，所述系统包含治疗有效量的如上文和本文所公开的RNA纳米结构和RNA树枝状聚合物分子。在一些实施方案中，药物递送系统还包括药学上可接受的载体。
此外，在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了治疗剂的图像引导药物递送至需要其的受试者的方法。所述方法包括施用如上文和本文所公开的治疗有效量的RNA纳米结构分子和RNA树枝状聚合物，并将成像检测装置应用于受试者。在一些实施方案中，成像检测装置是MRI成像系统。在一些实施方案中，成像检测装置是NIRF成像系统。在一些实施例中，成像检测装置是CT/PET/SPECT成像系统。
用于实时监测的图像引导的药物递送系统的开发以及验证递送和响应的效果对于研究和临床应用非常重要[G1]。在过去的十年中，不同材料和物理化学性质的多功能纳米颗粒已经被追求作为成像和治疗平台；然而，定量评价治疗有效负荷向肿瘤和转移性癌细胞的递送的有效策略是具有挑战性的，因为特异性癌靶向、重要器官例如肝和肺中的非特异性累积的低效率、颗粒异质性、由于稀释全身注射后的解离、和不利的药代动力学和药效学分布[G1-7]。目标是采用创新的RNA纳米技术方法(The Emerging Field of RNANanotechnology，Nature Nanotechnology 2010，5：833)[G8]构建超稳定多功能RNA信标和RNA树枝状聚合物，用于定量评估肿瘤和转移癌靶向治疗递送、分布、摄取和反应。如在最近的出版物[G9-23]中报道的，RNA构建体是无毒的、非免疫原性的并且能够穿透异源生物屏障以向小鼠中的实体瘤和转移细胞递送高剂量的治疗剂，而在正常器官和组织中几乎没有积累[G9-23]。这提供了在体内癌症治疗的非侵入性图像递送的理想系统。
本发明公开的主题将使用实时地提供在各种空间和时间分辨率下药物输送过程的解剖学和定量功能测量的多模态成像技术(NIRF、PET/SPECT和/或MRI)。这种方法是基于以下考虑：这三种模式中的每一种具有优点，并且综合方法将导致协同的成像益处。例如，使用在RNA树枝状聚合物和RNA信标中包含的造影剂的MRI(图4-5)提供了高空间分辨率，并且可以提供比PET或NIRF更好的颗粒分布模式的描述。由于使用放射性示踪剂，PET提供了更好的信噪比。另一方面，NIRF可以在体内通过IVIS系统和在体外通过荧光显微镜可视化，发挥桥接体内和组织学观察的独特作用。
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了用于检测、测定和/或定位感兴趣的生物物质的试剂盒。试剂盒包括本文公开的RNA纳米结构和/或RNA树枝状聚合物分子。在一些实施方案中，试剂盒还包括合适的检测手段。在一些实施方案中，试剂盒包括本文公开的RNA-3WJ-信标。合适的检测手段的非限制性实例包括MRI、核成像(例如PET或SPECT)、光学成像、声致发光成像或光声成像(超声)。本领域技术人员将理解，本公开的特定成像模块应当与所使用的特定成像模式兼容。
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了诊断和/或治疗患有或处于患有所述疾病风险中的患者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如上文和本文所公开的RNA纳米结构分子和RNA树枝状聚合物的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物或非哺乳脊椎动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是结肠癌。疾病的非限制性实例包括癌症、免疫力、呼吸道、中枢神经系统、炎症和感染性疾病。癌症的非限制性实例包括但不限于卵巢癌、脑癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌。
本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指与本公开的异二聚体探针一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体，并且其由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物、更特别地用于人类。这样的药物载体可以是液体例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物载体可以是盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。当给予患者时，异二聚体探针和药学上可接受的载体可以是无菌的。当静脉内施用异二聚体探针时，水是有用的载体。盐溶液和葡聚糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，本发明的组合物还可以含有小量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。本发明的组合物可有利地采取溶液、乳液、持续释放制剂或适合使用的任何其它形式。
本文所用的术语“治疗有效量”是指对已经患有疾病、病症或障碍的患者施用的组合物的量，其足以治愈或至少部分阻止或在一定程度上缓解一种或多种被治疗的疾病、紊乱或病症的症状。这些组合物的有效性取决于包括但不限于疾病、紊乱或病症的严重性和病程、先前的治疗、患者的健康状况和对药物的反应以及治疗医师的判断的条件。仅作为实例，治疗有效量可通过常规实验确定，包括但不限于剂量递增临床试验。
任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的紊乱和紊乱的严重程度；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；所使用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所使用的具体化合物组合或同时使用的药物以及医学领域中熟知的类似因素。例如，本领域技术人员熟知以低于实现所需治疗效果所需的水平开始化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需的效果。如果需要，为了给药的目的，有效日剂量可以分成多个剂量。因此，单剂量组合物可含有这样的量或其约数(因数，submultiple)以构成每日剂量。在任何禁忌症的情况下，剂量可以由个体医生调整。剂量可以变化，并且可以每天一次或多次剂量施用，施用一天或几天。可以在文献中找到针对给定类别的药物产品的适当剂量的指导。在另外的各个方面，制剂可以以“预防有效量”施用；即有效预防疾病或病症的量。
根据本公开的方法向受试者施用有效量的组合物的合适方法包括但不限于全身施用、肠胃外施用(包括血管内、肌内、动脉内施用)、口服递送、口腔递送、皮下施用、吸入、气管内安装、手术植入、透皮递送、局部注射和超速注射/轰击。在适用的情况下，连续输注可增强靶位点处的药物积累(参见例如美国专利号6,180,082)。
如本文所用，术语“受试者”是指药物组合物的给药靶标。本文公开的方法的主题可以是脊椎动物，例如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。因此，本文公开的方法的主题可以是人或非人。因此，根据本发明公开的主题提供兽医治疗用途。因此，本发明公开的主题提供对哺乳动物如人和非人灵长类动物以及由于濒危而重要的哺乳动物如西伯利亚虎的施用；具有经济重要性，例如在农场饲养以供人类消费的动物；和/或对人类具有社会重要性的动物，例如保持为宠物或动物园中的动物。这样的动物的实例包括但不限于：食肉动物如猫和狗；猪类，包括乳猪(pig)、阉猪(hog)和野公猪(boar)；反刍动物和/或有蹄动物如牛(cattle)、公牛(oxem)、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼；兔，豚鼠和啮齿动物。还提供了鸟类的治疗，包括治疗那些种类的濒危和/或保存在动物园中的鸟类以及家禽，更特别是驯养的家禽，即家禽，例如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等，因为它们对人类也具有经济重要性。因此，还提供了家畜的治疗，包括但不限于驯养的猪、反刍动物、有蹄类动物、马(包括赛马)、家禽等。该术语不表示特定的年龄或性别。
通过以下具体但非限制性的实施例进一步说明本发明公开的主题。以下实施例可以包括代表在与本发明相关的开发和实验过程中的各个时间收集的数据的数据汇编。
实施例1
特异性靶向肿瘤的放射试剂对于治疗癌症具有高需求。RNA纳米技术领域可为靶向放射治疗提供新的机会。我们最近发现，衍生自phi29 DNA包装马达的pRNA三向结(3WJ)的化学修饰的RNA纳米颗粒对有力的I-125和Cs-131辐射耐受，这是使用这些RNA纳米颗粒作为用于靶向放射治疗的载体的必需的必要条件。具体地，衍生自pRNA 3WJ的RNA纳米颗粒靶向体内的肿瘤并且它们在I-125和Cs-131的照射下，在范围为1Gy至90Gy的临床相关剂量下，在长达20天的相当长的时间内稳定。这些研究证明RNA纳米颗粒可以用作用于放射治疗和诊断的载体。
材料和方法
寡核苷酸和RNA 3WJ纳米颗粒的装配
在本研究中用于构建RNA 3WJ纳米颗粒的RNA寡核苷酸从TriLinkBioTechnologies(San Diego，CA)订购。通过将在TMS(50mM TRIS pH＝8.0，100mM NaCl，10mM MgCl2)缓冲液中的等摩尔浓度的相应链(3WJa：UUGCCAUGUGUAUGUGGG(SEQ ID NO：1)、3WJb：CCCACAUACUUUGUUGAUCC(SEQ ID NO：2)和3WJc：GGAUCAAUCAUGGCAA(SEQ ID NO：3))混合进行RNA 3WJ纳米颗粒的装配。根据公开的程序[27]，在具有运行缓冲液(89mM Tris，200mM硼酸和5mM MgCl2)的12％天然PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)上证实3WJ形成。凝胶用溴化乙锭(EB)或SYBR Green II染色，并通过Typhoon FLA 7000(GE Healthcare)成像。将装配的RNA 3WJ纳米颗粒储存在-20℃冰箱中，然后进一步表征。
原子力显微镜(AFM)成像
原子力显微镜(AFM)用于研究包含三个单体pRNA的3WJ-pRNA纳米颗粒的形状和大小[27]。根据先前报道的方法[27]，通过使用特别改性的云母表面(APS云母)[37]用以敲击模式操作的Veeco MultiMode AFM NanoScope IV系统(Veeco/Digital Instruments，Santa Barbara，CA)对纳米颗粒成像来获得AFM图像。
温度梯度凝胶电泳(TGGE)
使用TGGE系统(Biometra GmbH，德国)研究2′F U/C修饰的RNA3WJ纳米颗粒的热力学稳定性。在本研究中用于构建RNA 3WJ纳米颗粒的2′F U/C修饰的RNA寡核苷酸从TriLinkBioTechnologies(San Diego，CA)订购。3WJb链是在装配前标记的5′-末端γ-32PATP(Perkin-Elmer，MA)。通过在TMS缓冲液中混合10uM总RNA链，加热至80℃并在1小时内将其冷却至4℃，实现RNA 3WJ纳米颗粒的装配。将RNA纳米颗粒经受15％天然PAGE(每孔2.5uLRNA)，并使其在恒定100V在环境温度下运行10分钟。在RNA进入凝胶基质后，将凝胶转移到TGGE装置中，并且将垂直于电流的线性温度梯度设置为从36°至80℃。凝胶在100V下运行1小时，然后在真空下干燥并使用具有Typhoon FLA 7000(GE Healthcare)的荧光储存屏幕成像。
用RNA纳米颗粒温育的HT29结肠癌细胞的共聚焦显微镜
结肠癌HT29细胞在24孔板中用无叶酸的培养基接种在盖玻片(FisherScientific)上，并在37℃下在含有5％CO2的湿润空气中培养过夜。用无叶酸的培养基洗涤细胞两次以除去死细胞。将Alexa-647标记的叶酸-3WJ和无叶酸的3WJ 2′F RNA纳米颗粒在无叶酸的培养基中稀释，并用细胞在37℃温育2小时。在用PBS洗涤后，用4％多聚甲醛固定细胞，用AlexaPhalloidin(Life technologies Corporation，Carlsbad，CA，USA)对肌动蛋白染色和用具有DAPI的Gold Antifade Reagent(Lifetechnologies)对细胞核染色。在Olympus FV1000共聚焦显微镜(Olympus Corporation，Tokyo，Japan)上获取图像。
RNA纳米颗粒的细胞结合的流式细胞术分析
KB细胞在无叶酸的RPM1-1640培养基(Gibco)中培养，然后用胰蛋白酶消化并用无叶酸的培养基冲洗。将3nMAlexa647标记的3WJ-叶酸和3WJ 2′F RNA用2×105KB细胞在37℃温育1小时。用PBS洗涤两次后，将细胞重悬于200μL PBS缓冲液中用于流式细胞术分析。通过每个样品计数20000个事件，用FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences)测定荧光强度。
细胞毒性测定
根据制造商的说明书，用MTT测定试剂盒(Promega，Madison，WI)评价RNA纳米颗粒的细胞毒性。简言之，将HT29细胞接种在96孔板中，并在37℃下在含有5％CO2的潮湿空气中培养过夜。将叶酸-3WJ 2′F RNA纳米颗粒在指定浓度下悬浮在具有10％FBS培养基的新鲜McCoy′s 5A中，并加入到细胞中，在37℃温育24小时。然后，向每个孔中加入15ul染料溶液，并在37℃下温育4小时；向每个孔中加入100ul增溶/终止溶液，并在室温下温育2小时以显色。使用酶标仪(Synergy 4，Bio Tek Instruments，Inc，USA)记录570nm处的吸光度。相对于仅对照的细胞的吸光度(仅对照细胞的存活力＝100％)计算细胞存活力。
动物试验：RNA 3WJ纳米颗粒的体内靶向
为了评价RNA 3WJ纳米颗粒的癌靶向性，进行动物试验。涉及动物的所有实验由肯塔基大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。从Taconic(Hudson，NY)获得雄性无胸腺裸露nu/nu(6-8周龄)小鼠并置于具有控制温度(27℃)、湿度和12小时光/暗循环的环境中的清洁、无病原体的室中。小鼠自由进食标准食物和自来水，并使其适应一周。皮下注射HT29结肠癌肿瘤细胞(在100μl 1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5×106个细胞)。在肿瘤细胞注射后3周静脉内施用RNA纳米颗粒。从TriLink BioTechnologies，Inc(San Diego，CA)定制用于装配RNA 3WJ纳米颗粒的叶酸和Alexa647标记的2′F U/C修饰的RNA寡聚物链。在注射叶酸-pRNA 3WJ纳米颗粒之前，将小鼠喂食无叶酸饮食(Harlan Laboratories；Indianapolis，IN)总共2周。对于静脉内注射，使用异氟烷气体(氧气中2％，0.6L/min流速)麻醉小鼠，并用处于300μl PBS中的100μg(4mg/kg)2′F U/C修饰的叶酸-Alexa647标记的pRNA 3WJ纳米颗粒注射。在注射后15分钟、1小时、2小时和3小时，在IVIS Spectrum站(CaliperLife Sciences；Hopkinton，MA)上进行全身成像(Alexa Fluor 647，Ex＝640nm，Em＝680nm)。获得的复合图像由具有反映荧光活性的图像重叠的黑色和白色数字照片组成。使用Living Image 3.1(Caliper Life Sciences；Hopkinton，MA)软件创建以光子/秒/cm2/球面度(p/s/cm2/sr)测量的密度图，并且表示为以最大斑点为中心的颜色梯度。在注射后3小时和15分钟进行CO2窒息。在CO2窒息后，切割小鼠的肿瘤。
组织样品的共聚焦显微镜
对于体内样品，将收集的组织在4℃下在含有10％蔗糖(Sigma-Aldrich；St.Louis，MO)的4％多聚甲醛(Polysciences；18814)中固定12小时，并在干冰上嵌入O.C.T.化合物(Tissue-Tek；Andwin Scientific，Schaumburg，IL)用于冷冻切片(10μm切片厚度)。切片的组织在黑暗中干燥过夜，在室温PBS中洗涤，通过具有DAPI的Gold Antifade Reagent(Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA)染色并安装过夜。使用Olympus FV1000共聚焦显微镜(Olympus Corporation，Tokyo，Japan)获得图像。
尿素稳定性测定
尿素是变性剂，其广泛用于生物化学中以使RNA或蛋白质变性。进行尿素稳定性测定以测定在尿素存在下RNA 3WJ纳米颗粒的稳定性。通过将装配的RNA 3WJ纳米颗粒与不同浓度的尿素(2M、4M、6M和8M)混合来测试尿素稳定性。在12％天然PAGE上测定样品，用EB染色，并通过Typhoon FLA 7000(GE Healthcare)成像。
胎牛血清(FBS)降解测定
纳米颗粒在体内的稳定性对于其体内应用是关键的，因为许多酶可以迅速降解纳米颗粒并阻碍它们的应用。在血液中，RNA的不稳定性主要是核糖核酸酶(RNA酶)酶促降解的结果。RNA酶可以分为两大类：内切核糖核酸酶和外切核糖核酸酶。内切核糖核酸酶切割RNA主链内的磷酸二酯键，而外切核糖核酸酶在RNA链的5′端或3′端切割磷酸二酯键。RNA确实对RNA酶的降解非常敏感，这赋予非常短的半衰期，因此，对于大多数RNA分子来说，其药物代谢动力学特征差。这限制了RNA分子作为治疗剂在体内的使用。然而，RNA的化学修饰可以克服这个缺点。例如，2′羟基被2′氟(2′F)原子取代通过防止RNA酶降解显著提高了体内RNA的稳定性[48-51]。为了测试用FBS处理的RNA 3WJ纳米颗粒的稳定性，将装配的RNA 3WJ纳米颗粒用在1640细胞培养基中的10％FBS在37℃水浴中温育不同的时间达36小时。然后在12％天然PAGE上测定样品，用EB染色，并通过Typhoon FLA 7000(GE Healthcare)成像。ImageJ软件用于整合凝胶中装配的RNA 3WJ纳米颗粒的强度。将每个时间点的积分面积与0分钟时间点的积分面积进行比较，以构建RNA和2′F RNA纳米颗粒之间的血清降解比较。Origin 8.6软件用于生成绘图。
用I-125和Cs-131辐照RNA 3WJ纳米颗粒
在本研究中使用两个近距离放射治疗源。I-125是通常用于治疗前列腺癌和各部位的肿瘤的同位素。它用具有平均能量为28KeV的宽光谱的电子捕获发射光子衰变为Te-125；半衰期为59.4天。用于前列腺植入物的本研究中使用的I-125近程放射治疗源由IsoAid(Port Richey，FL)制造为具有4.5mm物理长度和0.8mm外径的圆柱形；将I-125材料涂覆到用薄钛屏蔽包封的银棒上[38]。
同位素Cs-131对于近距离放射治疗相对较新，但已经用于治疗各种类型的癌症，例如前列腺、乳腺和眼睛以及最近的妇科恶性肿瘤[39-44]。它在许多方面类似于I-125。它在电子捕获中也衰减和发射平均能量为30KeV的光子，但Cs-131的半衰期只有9.7天[45]。Cs-131源由IsoRay Medical，Inc.，Richland，WA提供，为长4.5mm，直径0.8mm的小圆柱体。
将I-125或Cs-131放射源浸入包含在小瓶中的样品液体(1cc)中。对不同的时间段和剂量进行2′F U/C修饰的RNA样品的照射。目的是区分辐射对DNA和RNA结构的影响。未照射的样品保持在相同的缓冲液和温度下并用作对照。在照射后，通过12％天然PAGE用TBM运行缓冲液或0.7％琼脂糖凝胶用TAE运行缓冲液分别测定RNA 3WJ纳米颗粒和质粒对照的完整性。
结果
RNA 3WJ纳米颗粒通过一锅自装配形成
RNA 3WJ由三个片段组成：3WJa、3WJb和3WJc。通过以1∶1∶1摩尔比混合三种化学合成的寡核苷酸3WJa、3WJb和3WJc形成RNA纳米颗粒(图1)。通过简单混合将三个片段非常有效地装配成纳米颗粒(图1C，泳道7)，这表明pRNA 3WJ的热力学稳定性。值得注意的是，使用3WJa、3WJb和3WJc的1∶1∶1比率，几乎超过90％或接近100％的三个RNA片段有效地装配到3WJ复合物中。有效自装配的特征[27]表明pRNA 3WJ纳米颗粒可以非常简单和容易地制造，这对于治疗学开发和临床翻译有利。AFM成像还证实了含有三种单体pRNA的3WJ-pRNA纳米颗粒的形成，并揭示了尺寸为10-15nm的纳米颗粒的三角形支化结构(图1B)。
化学修饰的RNA 3WJ纳米颗粒是化学和热力学稳定的
此外，我们通过温度梯度电泳凝胶(TGGE)测量了RNA 3WJ纳米颗粒的热力学稳定性(图1D)。该技术允许通过在PAGE上随着温度升高通过降低纳米颗粒的分数来确定核酸的熔融温度[46，47](图1D)。2′F改性的3WJ纳米颗粒在高达66.8±2℃的温度下保持稳定，其高于正常人体的温度。
RNA 3WJ纳米颗粒与2M、4M、6M和8M尿素混合并装载到TBM凝胶中(图3A)。在8M尿素的存在下，装配的RNA 3WJ纳米颗粒仍显示很少的解离，这与先前公开的结果一致[27]。
用高达36小时的血清处理测试RNA 3WJ纳米颗粒的稳定性(图3B)。Pieken等人[48]，Kawasaki等人[49]，Sabahi A等人[50]和Liu等人[51]的先前公开的的报告已经证明2′F-修饰的RNA具有增加的核糖核酸酶抗性以及增强的热力学稳定性。我们对于RNA 3WJ纳米颗粒的结果显示出类似的结果。具体地，未修饰的RNA 3WJ纳米颗粒在血清中降解，这通过在血清处理后未修饰的RNA 3WJ纳米颗粒的消失显示，这表明大多数未修饰的RNA被降解。然而，2′F-修饰的RNA 3WJ纳米颗粒抗血清诱导的降解。与未修饰的RNA纳米颗粒相比，超过90％的2′F-修饰的RNA 3WJ纳米颗粒在36小时血清处理后保持完整，这与公开的报告[27]一致。
叶酸缀合的RNA纳米颗粒在体外特异性结合癌细胞
在一个实施方案中，通过共聚焦显微镜测试与叶酸缀合的2′F修饰的3WJ RNA纳米颗粒的特异性结合和进入结肠癌HT29细胞。在叶酸缀合的3WJ RNA纳米颗粒中，3WJb链用叶酸标记以及3WJc链用Alexa647标记。使用不含叶酸的3WJ RNA纳米颗粒作为阴性对照。共聚焦成像表明叶酸缀合的3WJ纳米颗粒的强结合和进入结肠癌HT29细胞，如核(蓝色)、肌动蛋白(绿色)和Alexa647标记的RNA纳米颗粒(红色)信号的共定位证明(图2A)。流式细胞术分析表明叶酸标记的3WJ 2′F RNA纳米颗粒也可以结合叶酸受体过表达的KB细胞(图2B)。
RNA 3WJ纳米颗粒具有在细胞测定中揭示的低细胞毒性
使用评估细胞增殖的标准比色MTT测定来评估叶酸-3WJ 2′F RNA纳米颗粒对结肠癌HT29细胞的细胞毒性。我们发现叶酸3WJ 2′F RNA纳米颗粒不诱导结肠癌HT29细胞的可测量的细胞存活力损失，即使在0.4μM的高浓度下(图2C)，这表明RNA纳米颗粒是生物相容并且无毒的。
RNA 3WJ纳米颗粒通过全身注射靶向异种移植癌
全身注射RNA 3WJ纳米颗粒用于确认这些纳米颗粒的化学和热动力学稳定性和癌靶向。此外，作为评估对于体内癌症靶向RNA纳米颗粒携带放射性同位素的可行性初步研究，我们在试验性实验中使用荧光染料代替放射性同位素。RNA纳米颗粒构建为具有一个携带叶酸作为癌靶向配体的RNA片段和另一个携带Alexa647荧光探针的RNA片段，而不是放射性同位素。将3WJ RNA纳米颗粒通过尾静脉全身注射到小鼠中。治疗小鼠的全身成像显示特异性位于癌异种移植物的荧光信号，其表达叶酸受体。在小鼠身体的健康组织或正常器官中未检测到荧光信号(图2D)，这表明在全身递送后，颗粒未积累或被捕获在肝、肺或其他有机体中。进一步的共聚焦显微镜分析(图2E)也证实Alexa647标记的RNA纳米颗粒可以进入肿瘤并结合癌细胞。
RNA 3WJ纳米颗粒在I-125和Cs-131的照射下是稳定的
2′-F修饰的RNA 3WJ纳米颗粒在临床相关剂量的照射下的稳定性对于靶向放射治疗的发展是至关重要的。用I-125和Cs-131辐照进行稳定性试验。包括DNA质粒作为对照。我们使用的质粒DNA是环形式的。在随机位点切割环状质粒将导致迁移到凝胶中不同位置的线性DNA。DNA的多重切割将导致在凝胶中形成涂片的随机大小，并且具有低浓度的许多单个条带是不可见的，因为每个DNA将具有几千个随机切割位点。用I-125的试验首先对RNA和DNA样品的低剂量1Gy进行，但没有观察到变化。当剂量增加到30Gy时，典型的治疗剂量，RNA3WJ纳米颗粒仍保持不变(图3C)，而DNA涂片形成，如图3D所示，这提供了通过辐射切割质粒DNA的证据。泳道1中的上条带和下条带分别代表线性和超螺旋质粒DNA。这些结果总结在表1中。
表1. I-125照射的结果。Y＝是，N＝否。
使用7Gy、20Gy、30Gy和90Gy的Cs-131进行四次测试，并且照射持续达20天(长于2天，半衰期为9.7天)。对于7Gy，DNA和RNA结构是完整的，但是对于20Gy或更高，DNA被破坏，而RNA 3WJ纳米颗粒保持完整。结果总结在表2中，30Gy的结果显示在图3D中。
表2. Cs-131照射的结果。Y＝是，N＝否。
结果表明，RNA 3WJ纳米颗粒在I-125和Cs-131辐射下稳定，剂量范围为1Gy-90Gy。然而，DNA质粒被以20Gy或更高的剂量损伤，规定了用于癌症治疗、而RNA 3WJ纳米颗粒保持完整的治疗剂量。该结果表明RNA 3WJ纳米颗粒可能够携带治疗剂量的I-125和Cs-131用于癌症治疗。
讨论
RNA纳米技术是一个在科学界越来越受欢迎的领域[13，21，52-56]。基于RNA 3WJ的纳米颗粒已经被成功制造(图1)，并且享有特定递送和更长的保留时间的靶向药物递送系统的优点，这减少了所需的剂量和副作用。可以通过EPR(增强的渗透性和保留)效应或通过与配体例如适体、叶酸和RGD缀合的活性靶向来实现特异性递送。全身注射热力学和化学稳定的RNA纳米颗粒到小鼠中揭示了RNA纳米颗粒强烈和特异性结合至癌症，而不积累在肝、肺或任何其他重要器官或组织(图2D和2E)。
在高浓度变性剂存在下RNA 3WJ纳米颗粒的高稳定性(图3A)对于体内应用是显著优点，包括放射治疗，因为在体内保持完整并且耐受各种变性因子对于在注射入身体后实现纳米颗粒的指定功能至关重要。此外，3WJ RNA纳米颗粒的确定的熔融温度(图1D)大约是正常人体温度(37℃)的两倍，这也表明RNA 3WJ纳米颗粒的这种物理性质有利于体内应用，包括放射治疗，因为这些RNA纳米颗粒不应在正常人体温度范围内分离。此外，抗血清诱导的降解的性质(图3B)表明这些2′F修饰的RNA纳米颗粒也将在人体内完整保存，并且再次作为用于体内癌症治疗的靶向递送系统应该是有利。
放射治疗的原理是使用辐射来破坏癌细胞中的DNA螺旋结构。然而，RNA具有相似的结构。为了能够携带放射性同位素，RNA结构应当在使用辐射时保持完整。研究表明，与DNA不同，RNA纳米颗粒对I-125或Cs-131的辐射具有抗性，并且在治疗剂量的照射下保持稳定(图3C和3D，表I和II)。这表明RNA纳米颗粒可携带放射性同位素杀死癌细胞，同时保持完整。RNA纳米颗粒在长时间照射下的稳定性很重要，因为放射性同位素与RNA的化学缀合可能是耗时的过程，这取决于缀合反应的速率和效率。在未来的实验中，我们还将研究RNA纳米颗粒在肿瘤组织内的稳定性，并尝试开发控制RNA纳米颗粒降解以及肿瘤内放射性同位素释放的方法。此外，I-125和Cs-131是γ发射体，并且γ发射的存在有助于成像和研究放射性药物的生物分布以估计患者特异性剂量分布[57]。这是γ发射体具有优于纯β发射体如Y-90的优点。在不存在γ发射的情况下，替代同位素如In-111必须用于纯α或β发射体例如Y-90的内部剂量测定。与也发射光子的I-131相比，I-125和Cs-131具有低得多的能量并且易于辐射防护。虽然I-125或Cs-131的图像质量将受到光子的低能量的影响，但是使用Gamma相机获得了良好质量的I-125图像[58，59]。因此，携带I-125或Cs-131的RNA纳米颗粒具有用于精确靶向放射治疗的潜力。如本文所公开的，在一些实施方案中，β发射体包括但不限于锶-90、氚、碳-14、磷-32、镍-63。在一些实施方案中，γ-发射同位素包括但不限于铯-137、碘-131、镧-140、钴-60、铱-192。
然而，应当注意，在本研究中使用的密封的I-125和Cs-131源不由RNA纳米颗粒携带。为了由RNA纳米颗粒携带，应使用未密封的I-125或Cs-131标记RNA纳米颗粒。I-125或Cs-131标记的RNA纳米颗粒将被注射到患者体内以靶向肿瘤，并且因此来自I-125或Cs-131的辐射可以杀死由纳米颗粒引导的癌细胞。I-125/Cs-131标记的RNA颗粒将保留在肿瘤细胞内以沉积由I-125/Cs-131产生的几乎所有剂量。考虑到与约60天/10天的I-125/Cs-131的半衰期相比人类的血液循环时间约为1分钟，循环期间损失的剂量可忽略不计。I-125/Cs-131标记的RNA颗粒的详细讨论将在我们的未来研究中解决。基于由Abdelmawla等人发表的pRNA纳米颗粒的生物分布研究[28]，我们预期用放射性同位素标记的3WJ纳米颗粒也将具有有利的生物分布特征，具有与先前报道的pRNA纳米颗粒相似的肿瘤靶向效率。在将来的实验中，我们将放射性标记3WJ RNA纳米颗粒，并使用放射性信号量化在个别器官和肿瘤中递送的剂量。我们还将比较递送的剂量与由近距离放射治疗植入的源提供的剂量。
结论
衍生自phi29DNA包装的pRNA三向结(3WJ)的化学修饰的RNA纳米颗粒对I-125或Cs-131的辐射具有抗性，并且在治疗剂量的照射下在长达20天的相当长的时间内保持稳定。因此，RNA 3WJ纳米颗粒具有携带I-125或Cs-131用于靶向放射治疗的潜力。
实施例2
本研究将利用pRNA-3WJ作为构建RNA-3WJ信标的平台和利用RNA树枝状聚合物作为具有多模态成像剂、癌靶向配体和治疗性siRNA/miRNA的多功能系统，所有都在一个纳米构造中，其将允许治疗剂的递送在体内以各种空间和时间分辨率可视化。实施例2着重于具有(1)成像模块的多功能pRNA-3WJ纳米颗粒的构建：NIR荧光团，例如用于体内荧光成像的Alexa647和IRdye800；放射性核素，例如用于PET/SPECT成像的177Lu、111In或64Cu；和造影剂，例如用于MRI的钆(Gd3+)；(2)靶向模块：例如用于结合癌症特异性细胞表面受体的RNA适体或化学配体，导致RNA纳米颗粒内化到癌细胞中；和(3)治疗模块：下调致癌基因的siRNA或抗-miRNA。
构建含有多模式成像剂的多功能RNA纳米颗粒，使用pRNA-3WJ平台靶向适体和治疗模块
使用pRNA-3WJ基序作为支架构建多功能RNA纳米颗粒以具有：(1)成像模块：用于体内荧光成像的NIR荧光团；用于PET/SPECT成像的放射性核素；和用于MRI的钆造影剂；(2)靶向模块：RNA适体或化学配体，用于结合癌症特异性细胞表面受体，导致RNA纳米颗粒内化到癌细胞中；和(3)治疗模块：siRNA和抗miRNA以下调致癌基因。
1.1成像模块与RNA构建体的结合
1.1.1 NIR荧光团：对于体内成像，NIR染料是特别有吸引力的，因为它们可以深入到组织中，更重要的是，组织的自体荧光大大减少。不受理论束缚，将利用pRNA-3WJ基序开发强健的RNA纳米技术，用于通过NIRF和PET/SPECT成像(图12)非侵入性地监测治疗剂的体内递送。RNA-3WJ-信标含有通过紧密接近的淬灭剂变暗的“报告”荧光团，并且仅在细胞中通过Dicer切割掺入的siRNA/抗miRNA时引发荧光信号(参见2.1节，本文实施例3中所描述的)。RNA-3WJ-信标还包含“参考”探针(NIR染料或放射性标记)，其在所有时间保持活性，并允许在细胞中跟踪整个RNA-3WJ-信标构建体(图12)。
pRNA-3WJ基序利用由三个单独片段组成的模块设计(图6F，12)。片段之一(c3WJ)将用“参考”染料IRdye800进行末端标记，而另一个片段(b3WJ)将用淬灭剂Iowa Black针对“报告”染料Alexa647进行末端标记。“报告”染料将在治疗性RNA片段(siRNA/miRNA)上末端标记。所有这些2′-F修饰的RNA片段将被定制设计并从IDT，TriLinkor或IBA购买，如我们的出版物[G9-11，其通过引证并入本文]中所述。当以化学计量比混合化学合成的单根链时，RNA片段将以高效率装配成超稳定的3WJ纳米颗粒，如我们的出版物[G9-11]中所示。
重要的是要注意，本文使用的NIR荧光团和淬灭剂高度可溶于生理缓冲液，显示出对细胞组分的非常低的非特异性结合，并具有高信噪比[G72]。在我们的RNA-信标构建体中，‘参考’和‘报告’染料的荧光光谱被设计为使得没有通过FRET的潜在光谱重叠或淬灭(图13)。作为替代，将研究其他可用的淬灭剂/发射体对(表3)。
表3：用于设计RNA分子信标的发射体-淬灭剂对(作为替代)
1.1.2放射性核素：具有各种同位素(177Lu、111In、64Cu、99mTc、203Pb、188Re、212Pb/212Bi)的放射性标记肽和蛋白质已经被开发为肿瘤特异性诊断和治疗剂[G73-77]。类似的方法将应用于本研究中使用的标记RNA构建体。
放射性核素选择：177Lu、111In或64Cu(作为替代)将用于标记RNA纳米颗粒。这些高比活性的放射性核素可商购。金属以其游离形式具有高毒性，因此必须螯合以使其毒性最小化。我们将使用DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N′，N″′-四乙酸)或NOTA(1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-1，4，7-三乙酸)作为用于我们的放射性核素的螯合剂。
镥-177(t1/2＝6.71天，β0.497MeV，γavg175keV)是用于靶向放射性核素治疗的有吸引力的放射性同位素，通过SPECT成像。DOTA大环螯合剂可以在37℃至75℃稳定地配位镥-177[G73]。
铟-111(t1/2＝2.8天，EC 100％，γ171keV，γ245keV)是常规用于诊断性SPECT核医学成像的γ发射体。DOTA大环螯合剂可以在37℃至75℃稳定配位111In[G78]。
铜-64(t1/2＝12.7小时，17.4％β+，41％EC，40％β-，Eavg278keV)是正电子和β-发射体。NOTA大环螯合剂可以有效和稳定地从25℃至50℃配位64Cu76，79。12.7小时半衰期足够长，以放射性标记RNA纳米颗粒，并使用PET进行生物分布和成像研究。
DOTA或NOTA与胺改性的纳米颗粒的缀合：pRNA-3WJ的片段(c3WJ)之一将被2′-F修饰并用胺基(NH2)(从Trilink定制)进行末端标记。c3WJ-NH2RNA将与50当量过量的DOTA-NHS(对于177Lu、111In)或NOTA-SCN(对于64Cu)(Macrocyclics Inc.)反应(图14)。DOTA-NHS螯合剂将在乙腈碳酸盐缓冲液(pH10)中与RNA缀合；NOTA-SCN将在碳酸氢钠缓冲液(pH8)中与RNA缀合。通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)监测反应。使用在无菌水中预平衡的7kDa重量截留旋转柱，从溶液中除去未反应的DOTA-NHS和NOTA-SCN。螯合剂改性的纳米颗粒将在-80℃被冻干并储存。
放射性标记DOTA和NOTA缀合的RNA：将螯合剂缀合的RNA片段在浓度范围为0.1-1nM(20-200微克)的乙酸盐缓冲液(pH7)中放射性标记，以最大化放射性标记效率[G80]。DOTA缀合的纳米颗粒将用40MBq的177LuCl3或111InCl3(＞50mCi/μg；MallinckrodtPharmaceuticals)在60℃下放射性标记40分钟[G78]。NOTA缀合的纳米颗粒将用75MBq的64CuCl2(＞100mCi/μg；Essential Isotopes Inc.)在50℃下放射性标记30分钟[G76，G80]。基于公开的研究[G76，G78，G79]，希望实现＞95％的放射性标记效率。使用在缓冲盐水中预平衡的7kDa截留旋转柱除去任何游离的放射性核素。然后，将放射性标记的链与其他3WJ组分链混合以装配3WJ纳米颗粒(图12、图14)。
1.1.3钆造影剂：钆是一种常见的T1加权MRI造影剂。使用标准NHS化学的类似方法将用于使用DOTA-NHS将Gd3+偶联到RNA(图14)。GdCl3和RNA-DOTA溶液将缓慢混合以避免任何沉淀。将溶液在75℃下保持1小时，这将导致～100％的掺入收率81。螯合的RNA链将通过尺寸排阻色谱法纯化，然后与其他3WJ组分链混合以装配3WJ纳米颗粒(图12、图14))(参见实施例4中描述的用于用钆构建RNA树枝状聚合物的3.1节)。
不受理论的约束，整个合成保持没有任何金属污染，因为DOTA是几乎所有金属阳离子的强螯合剂。如果发生金属阳离子如Zn2+、Cu2+和Fe2+的污染，则由于动力学和热力学问题，难以结合Gd3+。
1.2构建含有靶向配体的RNA纳米颗粒
结肠癌将用作模型系统，以在体外和在我们建立的皮下、原位和转移小鼠模型中评估我们的多功能RNA构建体(参见实施例3中描述的2.2节)。
1.2.1叶酸配体：许多癌细胞(特别是来自上皮来源的)在表面上过表达叶酸受体(FR)，包括结肠癌在内的1000倍。叶酸受体密度随着癌症的阶段或恶化级别而增加82。我们证明Alexa647-FA-pRNA-3WJ构建体在体外有效且特异性结合并内化到FR+HT29和KM20结肠癌细胞(图15)。更重要的是，RNA构建体特异性地和剂量依赖性地靶向小鼠中的FR+HT29结肠癌皮下异种移植物，而在正常器官和组织中几乎没有积累的(图22)。然而，预期靶向叶酸受体仅在所有结肠癌的～三分之一中成功。
1.2.2 2′-F EpCAM RNA适体：作为叶酸的替代物，我们鉴定了EpCAM(上皮细胞粘附分子[Homo sapiens]GenBank：AAH14785.1)，其在原发性和转移性结肠癌(包括干细胞)中过表达[G85-87]。我们已经开发了基于RNA纳米技术的新型2′-F 3WJ文库系统，使用SELEX选择2′-FRNA适体[G88-89]。我们使用该文库并成功地分离了对结肠癌EpCAM受体具有非常强的结合亲和力的RNA适体(图16)。
1.3设计含有治疗模块siRNA/抗miRNA的RNA构建体
对于我们的图像引导药物传递系统的概念验证，我们将结合siRNA靶向荧光素酶，并评估表达荧光素酶的HT29或KM20结肠癌细胞中的效果。为了增强癌细胞的凋亡，几个小组已经尝试将siRNA重复转染到细胞中[90]。然而，重复施用或高剂量的siRNA可导致高细胞毒性。我们已经使用pRNA-X基序作为支架，以缀合多个荧光素酶iRNA副本，靶向一个基因中的相同基因座或不同基因座。通过增加复合物中siRNA的数目逐渐增强基因敲低效果[G10](图17)。此外，1nM的具有四个siRNA模块的pRNA-X纳米颗粒可以实现与100nM未配制的siRNA相同的沉默效应[G10]。
备选方案1：siRNA靶：作为治疗性siRNA，我们将通过使用siRNA抑制抗凋亡蛋白存活蛋白来诱导结肠癌细胞的凋亡，如我们先前的出版物中所述[G9，G10，g22]。siRNA针对PI3K(普遍存在的脂质激酶)，其下游效应蛋白(Akt和mTOR)可以有效抑制CRC细胞生存力[G91-93，herein incorporated by reference in their entirety]。这些siRNA将用作存活蛋白的替代物。
备选方案2：抗miRNA靶：微RNA是显示两类功能的小非编码RNA(19-25nt)，作为致癌基因或肿瘤抑制剂[G94-95]。显示pRNA-3WJ基序是抑制剂miRNA的有效载体，以通过靶向柯萨奇病毒基因组的3′-UTR沉默病毒基因[G96-97]。遵循类似的递送原则，我们将递送抗miRNA以通过下调致癌miR-21来杀死肿瘤。MiR-21通过PI3K/Akt信号通路调节生物学行为[G98]，并下调miR-21将作为我们的siRNA策略的替代物。我们已经构建了miR-21荧光素酶报告系统，并发现pRNA-3WJ-叶酸-抗miR-21纳米颗粒可以有效地敲低温育后(与转染相反)在KB细胞中的miR-21表达(图18)(Dan Shu，et al.，Systemic Delivery of Anti-miRNAfor Suppression of Triple Negative Breast Cancer Utilizing RNANanotechnology，ACS NANO，(2015)Vol.9，No.10，pp9731-9740，通过参考将其整体并入本文)。
备选方案3：细胞毒性药物：我们已经使用‘点击化学’方法和酸不稳定键将紫杉醇(PTX)和喜树碱(CPT)缀合到pRNA-3WJ支架(图19)[US 20130116419；Kolb，Hartmuth C.，M.G.Finn，and K.Barry Sharpless.″Click chemistry：diverse chemical functionfrom a few good reactions.″Angewandte Chemie International Edition 40.11(2001)：2004-2021，通过引证将其全部并入本文]。RNA-药物-叶酸复合物可以有效诱导KB细胞中的细胞凋亡(图20)。
1.4：表征RNA纳米颗粒的生物化学和生物物理性质
具有不同功能模块的pRNA-3WJ支架保留其所有并入模块的折叠和独立功能9，10。然而，我们将使用成熟的方法来表征1.1-1.3节RNA构建体的生物化学和生物物理性质：(1)使用天然凝胶测定RNA纳米颗粒折叠和装配[G9，G10]；(2)通过使用SYBR Green、温度梯度凝胶或UV吸光度的定量PCR评估Tm[G9，G10]；(3)使用放射性标记的/荧光标记的RNA[G9]或SPR通过竞争测定评估KD；(4)通过用RNA酶或10％FBS温育RNA来评价化学稳定性(在2′-F修饰后)[G9，G13]；(5)检测变性凝胶中2-8M尿素对变性的抗性[G9，G10]；(6)AFM成像的结构表征[G9-11]；通过“m-折叠”算法的二次结构预测[G99]；(7)放射化学稳定性测定。简言之，将RNA纳米颗粒最初在PBS(pH7.4)、含有1mM EDTA的PBS和血清中于37℃检查。放射性标记的纳米颗粒溶液的样品将在24小时期间的各个时间点除去，并通过HPLC检查用于证明通过竞争性金属螯合剂EDTA的放射性金属的降解或反式螯合。
实施例3
在结肠癌模型系统中通过NIRF和PET/SPECT成像评估pRNA-3WJ-信标构建体
这项研究着重于构建包含目标配体、治疗性siRNA/抗miRNA和成像剂的RNA-3WJ-信标以在结肠癌小鼠模型中通过NIRF和PET/SPECT非侵入性跟踪递送和图像治疗反应。将进行肿瘤的详细组织学测定以验证体内非侵入性成像评估。将构建RNA-3WJ-信标，将pRNA-3WJ递送平台的强大特征与分子信标和治疗性siRNA/抗miRNA以及癌靶向配体的功能组分组合，所有均在一个纳米构建体中(图4)。在靶识别后，RNA-3WJ-信标将产生‘报告’成像信号，其与‘参考’成像模块组合将使得我们能够跟踪RNA治疗剂在体内的分布和转运。我们已经成功地生成原位和转移性结肠癌小鼠模型以评估体内RNA构建体。
在体内检测内源基因表达和沉默，包括探针设计、体内递送、特异性靶向和探针灵敏度方面存在重大挑战。已经报道了通过竞争性杂交方法在体外使细胞内RNA表达成像的分子信标[G100-108]，但是它们在具有确定的分子信标靶标条件的溶液中进行。虽然这些研究表明检测mRNA和监测细胞中RNA运输的可行性，但是通过显微注射或通过脂质体递送递送分子信标的程序使得难以将这种有希望的技术应用于广泛的研究领域或常规临床程序中。挑战包括：(1)RNA或DNA在体内的核酸酶降解；(2)低信噪比；(3)由于空间位阻所导致的低效竞争性杂交；和(4)缺乏细胞特异性；和(5)由于肝和肺中的非特异性积累而导致的低效递送。为了克服这些问题，我们已经开发了一种创新的RNA-3WJ-信标平台(图4B)，其将分子信标的功能结合到稳健的pRNA-3WJ递送系统中，其显示高度有效的癌靶向能力，在正常器官例如肝、肺和肾中几乎不积累。在靶标识别后，RNA-3WJ-信标将产生‘报告’成像信号，其与‘参考’成像模块的组合将使我们能够使用我们完善建立的结肠癌模型系统在体外和体内跟踪治疗RNA纳米颗粒的分布和转运。我们的RNA构建体本质上是聚阴离子的，因此可以避免带负电的细胞膜上的非特异性细胞进入[G67-70]。此外，它们可以在温育后向细胞递送治疗剂，而不是通常用于其他系统的转染和微孔化[G101，G103，G105，G106，G109，G110]。
常规分子信标是一端上使用荧光团且另一端上使用淬灭剂双标记的寡核苷酸的茎环(发夹)结构(图4A)。荧光团和淬灭剂保持接近，导致没有或低荧光信号。在与完全匹配的互补RNA靶标杂交时，‘报告’荧光团和淬灭剂分离并恢复荧光。我们含有通过紧密接近的淬灭剂变暗的‘报告’荧光团的RNA-3WJ-信标将在细胞中通过Dicer切割断裂掺入的siRNA/miRNA时引发荧光信号(图21)。‘参考’探针(荧光染料或放射性标记)存在于3WJ复合物的另一条链上，并且保持活性，而与RNA纳米颗粒的构象无关。
2.1：结肠癌细胞中RNA-3WJ-信标-(FA或EpCAM适体)-(siRNA或抗-miRNA)的体外 表征
2.1.1测定多功能RNA-3WJ-信标的特异性细胞识别和进入：携带FA(或EpCAM适体)的RNA-3WJ-信标将特异性识别HT29结肠癌细胞并通过受体介导的胞吞作用内化入细胞。RNA-3WJ-信标的结合和内化将通过流式细胞术和共聚焦显微镜检查，使用适当的对照(图15-16)。该测定在[G9-11，G22，G23]中很好地建立。IRdye 800在774nm/789nm具有激发/发射最大值，而Alexa647在647nm/668nm具有激发/发射最大值。177Lu、111In或64Cu放射性核素将用作替代的‘参考’成像模块以在体内跟踪RNA-3WJ-信标。
2.1.2测定多功能RNA-3WJ-信标的基因沉默效果：将具有合适的杂乱对照的RNA-3WJ-信标-(FA或EpCAM适体)-(siRNA或抗miRNA，来自实施例2中描述的1.3节)用没有转染试剂的结肠癌细胞温育。一旦内化到细胞中并从内体释放，RNAi诱导的沉默复合物(RISC)将结合到含有siRNA或抗miRNA的pRNA-3WJ-信标的分支。如果siRNA/抗miRNA被正确加工，它将从3WJ复合物释放并远离淬灭剂，从而恢复‘报告’染料Alexa647的荧光(图21)。释放的siRNA/抗miRNA将以剂量依赖性方式触发靶基因的敲低，这可以通过遵循公开的程序[G101，G102，G105，G109]通过监测‘报告’染料Alexa647的荧光来实时跟踪。基因敲低效果将通过功能测定验证：
为了定量荧光素酶siRNA沉默效应，我们将使用HT29-荧光素酶表达细胞并使用IVIS Spectrum系统对细胞成像。将记录和绘制来自每个孔的发光强度、每秒的光子计数。如我们的出版物[G10，G11]中所描述的，通过用磺酰罗丹明B(SRB)测定法染色来定量细胞数量。相对荧光素酶活性将用于通过用SRB读数标准化萤火虫荧光素酶活性来反映萤火虫荧光素酶基因的表达水平。对于存活蛋白siRNA，我们将使用RT-PCR和蛋白质印迹分别确定mRNA的基因表达和蛋白质水平，类似于我们以前的出版物[G9，G10，G21-23]。RNA纳米颗粒对细胞生长和凋亡的影响将通过常规测定[G9，G10，G21-23]如WST-1、TUNEL、原位胱天蛋白酶活性、DNA片段化和膜联蛋白V/PI染色来测定。
为了评估miR-21敲低，在不同的时间点，通过荧光显微镜或与miRCURYTM LNA检测探针的原位杂交，根据已建立的方案[G111]监测温育效率。我们将使用实时PCR分离和分析miR-21水平的总RNA。通过在mRNA水平的RT-PCR和在蛋白质水平的蛋白质印迹或免疫染色测定miR-21对其经验证的靶(例如PTEN、PDCD4、RECK)的功能。
不受理论的束缚，连接到siRNA或抗miRNA的3′-端的Alex647染料(图12)可能干扰siRNA或miRNA功能。这可以通过交替siRNA的有义或反义链来解决。已经显示siRNA上的有义链或反义链的修饰对基因沉默的效率产生了差异[G112]。(2)为了解释非特异性RNA-3WJ-信标效果，我们将实施用于使用比率分析来确定非特异性开放的程度公布的程序[G113]。简言之，在细胞内递送之前，将与相同的RNA-3WJ-信标样品比较荧光比率(总的整合的‘报告’荧光/总的整合的‘参考’荧光)。(3)常规分子信标与靶mRNA结合的程度高度依赖于靶序列的选择及其可接近性[G103]。我们的RNA-3WJ-信标构建体设计不利用具有延伸序列的发夹。一旦Dicer处理siRNA离开3WJ，siRNA保留其可靠的大小和形状(～21nt双链RNA)用于最佳功能。
替代方法：(1)在一个实施方案中，将掺入siRNA链和3WJ核复合物之间的二硫键。在细胞质中存在还原环境的情况下，二硫键将切割并触发siRNA和缀合的‘报告’荧光的激活。(2)我们将采用使用光可切割接头的光分解策略，其中分子信标的分子活性被光响应性封闭基团掩蔽，然后在指定时间和位置通过特异性光照射回收[G114]。在另一个实施方案中，在siRNA链和3WJ核复合物之间使用酸不稳定接头。
2.1.3确定在体外携带FA(或EpCAM适体)、siRNA(或抗miRNA)的RNA-3WJ-信标的毒性特征：关于RNA干扰的评价的一个问题是激活固有的免疫应答[G115-117]。我们已经表明我们的pRNA纳米颗粒显示有利的药理分布[G12]。我们将使用RT-PCR分析、ELISA和流式细胞术来监视人外周血单核细胞(PBMC)中蛋白激酶R(PKR)、toll样受体(TLR)和干扰素(INF)途径的活化[G12，G118](图25)。还将进行细胞增殖(MTT)和凋亡测定(TUNEL)以测定细胞毒性效果。
2.2使用小鼠模型验证我们的多价RNA纳米颗粒
2.2.1皮下异种移植模型：皮下异种移植是良好的模型系统，因为它们模拟肿瘤-细胞外基质相互作用、炎症和血管生成。我们将首先通过将1×106个HT29肿瘤细胞直接注射到侧腹中来建立皮下异种移植物，然后静脉内注射多功能RNA构建体。初步数据表明，Alexa647标记的pRNA-3WJ-叶酸构建体可以在全身注射后有效靶向小鼠中的皮下HT29结肠癌异种移植物，而不在正常器官和组织中累积(图22)。实验设计将包括：(1)pRNA-3WJ-信标-(FA或EpCAM适体)-(siRNA/抗-miRNA)；(2)pRNA-3WJ-信标-(w/o靶向配体)；和(3)pRNA-3WJ-信标-(FA或EpCAM适体)-(混杂的siRNA/抗-miRNA)。实现肿瘤生长抑制所需的给药频率将凭经验确定，并且在处死小鼠之前将通过全身NIRF和PET/SPECT成像随时间监测。
基于以前的放射性核素经验，我们将向每只小鼠的尾静脉注射～0.5-1.5mCi的放射性标记的(177Lu、111In或64Cu)RNA-3WJ-信标[G73、G74、G76、G119、G120]。成像时间点和获取的持续时间将取决于放射性核素半衰期和生物分布数据。全身小动物SPECT和PET图像将在西门子INVEON多模态SPECT/CT系统上结合对接的西门子INVEON PET系统(图23)获得。将在PET研究之前立即执行解剖成像和x射线计算机断层摄影(CT)。
将进行器官和肿瘤成像、完全尸检和组织学概况以评估肿瘤消退、肿瘤生长延迟、存活时间延长和无肿瘤治愈。siRNA和抗miRNA介导的治疗的详细的靶基因表达特征将在mRNA和蛋白质水平上确定(参见第2.1.2节)。
2.2.2原位模型：原位模型更接近地模拟肿瘤的微环境，因为癌细胞在其自然位置生长，因此以高保真度复制结肠癌。我们将通过在外科手术(剖腹手术用于暴露盲肠)后将表达荧光素酶的1×106个HT29细胞直接注射到裸鼠的盲肠内，在裸鼠中产生一些原位异种移植物。肿瘤生长将通过生物发光成像监测(图24A)。然后，如第2.2.1节所述，从处死小鼠之前，通过全身荧光和PET/SPECT成像将来自皮下异种移植物测定的有希望的RNA构建体全身注射到随时间监测的小鼠中。
替代方法：直接衍生自患者的异种移植物具有更好的形态学特征的保留，例如人类基质，并且比来自建立的细胞系的肿瘤更异质的，并且因此在体内模型中表现重要性。我们将使用这些异质患者衍生的肿瘤细胞产生原位异种移植物，并评估我们的RNA纳米颗粒的治疗效果。
2.2.3转移模型：我们将测试我们的新RNA构建体是否可用于追踪结肠癌转移。通过将表达荧光素酶的HT29细胞直接注射到脾或盲肠壁中并通过生物发光成像监测来建立肝转移(图21A)。初步数据显示，在小鼠全身注射后，Alexa647标记的pRNA-3WJ纳米颗粒有效靶向HT29肝转移细胞，而不是正常肝实质细胞(图24)。如在实施例3中描述的2.2.1节中所述，在处死小鼠之前，通过全身NIRF和PET/SPECT成像静脉内注射并且随时间监测RNA-3WJ-信标。
不受理论的约束，靶向单一途径例如抗细胞凋亡机制可能不会导致体内显著的肿瘤消退。因此，我们将使用含有siRNA/抗miRNA的多功能RNA构建体评估鸡尾酒治疗策略。(2)对于RNA治疗剂的体内递送，重要的考虑是内体逃逸。我们目前正在开发一种‘点击化学’方法，将内体破坏剂(用于质子海绵效应)引入我们的3WJ支架。(3)在SCID小鼠中缺乏免疫系统可以深入影响肿瘤的发展和进展。我们将使用IL2rg-/-NOG(NOD-SCID IL2rg-/-)小鼠，其可以使用造血干细胞容易地人源化。在小鼠中建立原位异种移植后，我们将注射人PBMC和骨髓以开发功能性血液和免疫系统[G121]。然后我们可以全身注射RNA构建体并测定治疗效果。
2.2.4小鼠中生物分布和药代动力学特征的评估：我们的pRNA支架显示有利的药理学特性：与常规siRNA对应物相比，半衰期增加10倍(5-10小时)(0.25-0.75小时)；CL＜0.13L/kg/小时；Vd为1.2L/kg；在小鼠中非诱导干扰素-I或细胞因子产生。在小鼠中重复静脉内施用，高达30mg/kg，没有导致任何毒性(图25)。先前的研究使用Alexa647标记的RNA纳米颗粒进行，并且由于血液的淬灭，可能低估肿瘤和器官的总体摄取。我们将添加额外的放射性标记组分(177Lu、111In或64Cu)，以定量评估RNA构建体的生物分布(器官和肿瘤积累)、PK/PD和毒性特征，遵循我们以前的出版物[G12，G76，G77]。将计算每个组织的每克注射剂量百分比(％ID/g)和注射剂量百分比(％ID)。
实施例4
设计pRNA-3WJ树枝状聚合物以携带MRI造影剂和放射性核素用于在结肠癌小鼠模型中成像
这项研究的重点是构建携带靶向配体、用于MRI的造影剂和用于PET/SPECT成像的放射性同位素的RNA树枝状聚合物，并在结肠癌小鼠模型中非侵入性地评估它们的功能。
MRI由于其非侵入性质，在亚毫米范围的极好的空间分辨率和纵向研究的优秀潜力是一种强大的成像模式109，122。造影剂已被用于增强MRI扫描的灵敏度。临床使用的FDA批准的低分子量造影剂，例如Gd(DTPA)或Gd(DOTA)具有非特异性、相对低信号增强效果、从血管快速外渗、并从循环系统中快速消除。因此，它们经常需要重复给药和高剂量，这进而诱导假阳性对比增强和Gd介导的毒性(肾源性系统纤维化)[G123]。
近年来，称作树枝状聚合物的广泛支化的3D结构已经成为构建多功能大分子纳米材料作为诊断和治疗剂的有吸引力的平台[G124-131]。与单一螯合单元类似物[G109]相比，由在树枝状聚合物平台上装配的多种Gd(III)螯合物组成的MRI造影剂在调节水质子的纵向弛豫速率和时间方面更有效可行的。这利用延长血管内保留和循环时间以及减慢分子旋转的到高分子量载体聚(酰胺基胺)(PAMAM)和聚(丙烯亚胺)(PPI)树枝状聚合物的Gd(III)螯合物[G125，G127，G129，G131-133]来证明，减慢分子旋转导致短的弛豫时间，并增加弛豫性，这进而改善分辨率和灵敏度。
不受理论的束缚，如果带负电荷的RNA聚合物可以代替PAMAM和PPI以构建树枝状大分子，则其将避免与带负电荷的细胞膜的相互作用，并且不会引发非特异性细胞进入和相关毒性[G134，G135]。身体将RNA作为其自身的材料处理，并且将减少由于吞噬作用引起的肝/肺积累。与其他化学聚合物相比，通过调整化学修饰的稳定核苷酸的百分比和位置，可以及时控制RNA的降解[G13，G56-58]。此外，我们的基于RNA的树枝状聚合物-Gd(III)-螯合物复合物将保留报道的pRNA-3WJ纳米颗粒的有利属性[G9-12]，例如热力学稳定性、包括无正常器官积累和强癌靶向、无毒性质和良好限定的结构(单分散)的期望的药代动力学特征，同时提供MRI造影剂的额外的高弛豫性质。
3.1使用含有钆造影剂、放射性核素和靶向配体的pRNA-3WJ基序构建RNA树枝状聚 合物
我们以前应用基于RNA纳米技术的自下而上方法通过pRNA-3WJ基序的分支延伸构建RNA纳米颗粒的大分子组件(图26)[G11]。最近，我们解决了pRNA-3WJ支架的晶体结构14，这将促进RNA树枝状聚合物的设计。3WJ基序是高度可编程的构件，并且可以用于产生方形构造(由在每个角的3WJ基序组成)以用作G0核。方形形状将消除在构建较高阶结构的过程中可能产生的任何空间阻碍。然后将逐步迭代装配方法通过在pRNA-3WJ基序之间的分子间相互作用应用，以构建具有尺寸(～60nm)、形状(3D球形)和化学计量的精确控制的高度分支的代-3(G3)RNA树枝状聚合物(图26)。从实施例2的1.1-1.2节，我们将已经构建具有NIR荧光团、放射性核素、钆造影剂和叶酸靶向配体的pRNA-3WJ。这些功能化的pRNA-3WJ单元将与对照放置在G3构建体内的任何所需位置，以产生含有用于MRI的钆、用于PET/SPECT成像的放射性核素和作为靶向配体的叶酸的多功能G3 RNA树枝状聚合物(图26)。
我们的方法不需要任何接头，例如已经用于更高阶树枝状聚合物以增加Gd-有效载荷，但具有适度增加的弛豫性(由于在树枝状聚合物内由PEG接头引起的大量内部运动)的PEG[G124]。此外，我们的构建体可以在外表面以及内核(其容易接近水)上用Gd-螯合物标记，从而确保更高的Gd有效载荷而没有任何交联，例如最近用于产生树枝状聚合物多孔纳米簇的那些[G124]。这进而将减少用于体内成像和相关金属毒性的剂量(低于临床上用于MagnevistTM的0.2mmol/kg)。最后，RNA树枝状聚合物构建体允许整合靶向和成像模块，导致靶向造影剂的新设计。
我们将Gd(DOTA)缀合到我们的RNA树枝状聚合物(参见实施例2的1.1.3节用于缀合)，已知其在化学稳定性方面是更好的造影剂(即使在低pH(2-4)下，金属离子的解离也非常缓慢，大约几天)，因此与Gd(DTPA)[G136]相比潜在地毒性更小。RNA树枝状聚合物的装配将通过凝胶测定和AFM(参见实施例2的1.4节)来验证。然后使用透射电子显微镜(TEM)来确认用Gd对RNA树枝状聚合物的标记。由于Gd离子是电子致密的，RNA-Gd树枝状聚合物可以直接成像在碳涂覆的铜网上，而不需要任何额外的染色试剂。
3.2 RNA树枝状聚合物的体外表征
3.2.1摩尔弛豫度测量：弛豫度表示顺磁材料作为MRI造影剂进行的能力。Gd化合物的水质子弛豫增强取决于浓度。它由等式(1/T1)＝(1/T10)+r1[Gd]定量描述，其中T1是水质子的弛豫时间，T10是纯水的水质子弛豫时间，[Gd]是钆化合物的浓度，r1定义为化合物的弛豫度。钆化合物的弛豫度可以通过Solomon-Bloembergen-Morgan理论137定量描述。简化模型由等式r1＝qPm/(T1m+τm)表示，其中Pm是水质子的浓度，其为恒定的，q是水合数(与每个Gd阳离子结合的水分子的数目)，以及τm是结合水分子的寿命。最后，T1m是拟合参数(结合水质子弛豫时间)，并且由因素如磁场的强度和Gd化合物的尺寸决定。Solomon-Bloembergen-Morgan理论准确地预测了基于Gd的MRI造影剂的性能，并帮助设计具有高弛豫和‘机敏’特征的造影剂。将在不同磁场强度和溶液条件下将RNA-Gd树枝状聚合物的弛豫度和弛豫速率常数与商业造影剂相比较。
3.2.2.测定细胞结合和摄取：为了证实多功能RNA树枝状聚合物的叶酸受体靶向能力，将HT29结肠癌细胞用RNA树枝状聚合物-Gd-FA-Alexa647构建体温育，使用合适的对照，随后通过流式细胞术和共聚焦荧光显微镜分析(图15-16)，如在2.1节的实施例3所述。还将进行细胞增殖(MTT)和凋亡(TUNEL)测定以测定特异性细胞毒性效应。
为了进一步研究MRI造影能力，将HT29细胞用RNA树枝状聚合物-GD-FA-Alexa647构建体温育，并通过获取在PCR管中成颗粒的HT29细胞的T1加权磁共振图像来评估。HT29细胞在Gd存在下将表现出与对照细胞相比MR信号强度明显增强。
3.3结肠癌小鼠模型中RNA树枝状聚合物的表征
先进的3T Siemens Magnetom Trio扫描仪具有高性能梯度、回波平面全身成像和氢谱分析功能，可用于人类和动物研究。对于专门的动物研究，将使用现代的Bruker/Siemens 7T MR扫描仪[G138，G139](图27)来评估我们的RNA树枝状聚合物。
我们将产生皮下、原位和转移性结肠癌小鼠模型(参见实施例3中描述的2.2节)，以用适当的对照来评估多功能RNA树枝状聚合物-Gd-叶酸-放射性标记构建体。携带肿瘤的小鼠的轴向MR图像将在造影之前和在静脉内注射RNA树枝状聚合物后的不同时间点获得。在造影前的图像中，在肿瘤和周围肌肉之间将存在很小的内在对比度。随着时间的推移，与周围组织相比，将观察到来自肿瘤的特异性信号增强。血液清除率将从颈静脉的强度测量确定。可替换的，在各个时间点收集血液样品并分析Gd含量。详细的生物分布和药代动力学性质将在我们的出版物[G12]后并如实施例3第2.2.4节中所述进行评估。
由于RNA树枝状聚合物的多峰性质，可以通过荧光(使用Alexa647)和SPECT/PET(使用177Lu、111In或64Cu)成像进一步验证肿瘤和转移细胞的靶向。在医学成像中存在对将功能PET图像与提供详细的解剖结构的MRI进行共注册的关键需求。PET由于使用放射性示踪剂而提供了最高的肿瘤检测灵敏度。然而，由于PET图像中缺乏解剖结构，具有高放射性的肿瘤位点不能精确地定位于运动器官的腹部或边界附近。MRI提供优异的软组织对比，从而促进肿瘤定位在共注册的MRI和PET图像中。
实施例5
这项研究涉及使用RNA作为构件的分支、3D球状、单分散和纳米级大小的树枝状聚合物的可编程自装配。RNA树枝状聚合物的中心核和重复单元是来自噬菌体phi29马达pRNA的超稳定三向结(3WJ)基序的衍生物。RNA树枝状聚合物通过模块化3WJ构件的逐步自装配构建，模块化3WJ构件的自装配用具有突出的粘性末端并以直至第4代的层以放射状方式进行的单个3WJ核(第0代)发起。最终构建体在控制下产生，没有以高产率和纯度的任何的结构缺陷，如通过凝胶电泳和AFM成像所证明。当叶酸结合到RNA树枝状聚合物的外周分支上时，所得构建体显示出高度结合并内化到癌细胞中。RNA树枝状聚合物被设想在不久的将来在靶向、疾病治疗、分子诊断和生物电子学中具有重大影响。
方法
RNA合成和纯化：通过使用从Trilink Biotechnologies，Inc.(San Diego，CA，USA)定制的寡核苷酸合成仪通过化学合成或通过含有T7启动子46的各PCR扩增双链DNA的体外转录而制备RNA寡核苷酸。通过HPLC或通过8％尿素PAGE纯化RNA链。单链DNA模板和引物购自Integrated DNA Technologies(Coralville，IA，USA)。
G-0至G-4树枝状聚合物的构建：使用组分链的一锅自装配(参见下面的序列)构建树枝状聚合物结构G-0、G-1、G-2和G-3。对于G-0，三种组分链(3WJ-a)∶(3WJ-b)∶(3WJ-c)＝1∶1∶1摩尔比；对于G-1，五种组分链(方形A)∶(方形B)∶(方形C)∶(方形D)∶(方形E)＝1∶1∶1∶1∶1摩尔比。对于G-2，七组分链(b-方形A)∶(b-方形B)∶(b-方形C)∶(b-方形D)∶(方形E)∶(3WJ-a)∶(3WJ-c)＝1∶1∶1∶1∶1∶4∶4摩尔比。对于G-3，九组分链(b-方形A)∶(b-方形B)∶(b-方形C)∶(b-方形D)∶(方形E)∶(3WJ-c-b_rev)∶(3WJ-a-b_rev)∶(3WJ-a_rev)∶(3WJ-c_rev)＝1∶1∶1∶1∶1∶4∶4∶8∶8摩尔比。将所需的树枝状聚合物RNA链以化学计量比在TMS缓冲液(25mM Tris，50mM NaCl，5mM MgCl2)中混合在一起，将混合物加热至95℃5分钟，然后在Eppendorf热循环仪上以2℃/min的速率缓慢冷却至4℃。使用8％天然PAGE或2％琼脂糖凝胶验证装配效率。
对于G-4树枝状聚合物的构建，使用两步法。首先，具有粘性末端的树枝状聚合物纳米结构G-2通过将所需的RNA链以合适的化学计量在TMS缓冲液中混合在一起而构建。将混合物加热至95℃持续5分钟，然后如上所述缓慢冷却，用于构建G-1、G-2和G-3树枝状聚合物代。通过使混合物通过具有100KDa截留的Amicon超速离心旋转过滤器，根据制造商方案除去游离链，并用TMS缓冲液洗涤两次。从柱收集具有粘性末端的纯G-2。在第二步中，将具有粘性末端的G-2以化学计量比与形成G-4所需的其它RNA链混合。11个G-4组分链的最终摩尔比为(b-方形A)∶(b-方形B)∶(b-方形C)∶(b-方形D)∶(方形E)∶(3WJ-cb_rev)∶(3WJ-a-b_rev)∶(3WJ-b-a_rev)∶(3WJ-b-c_rev)∶(3WJ-a)∶(3WJ-c)＝1∶1∶1∶1∶1∶4∶4∶8∶8∶16∶16。将混合物在室温下温育1小时。然后，运行琼脂糖凝胶以检查装配效率。在TMS缓冲液中以1μM的最大终浓度构建G-4。
RNA树枝状聚合物的所有链的序列如下(序列5′→3′)：
(1)3WJ-a：UUG CCA UGU GUA UGU GGG(SEQ ID NO：1)
(2)3WJ-b：CCC ACA UAC UUU GUU GA U CC(SEQ ID NO：2)
(3)3WJ-c：GGA UCA AUC AUG GCA A(SEQ ID NO：3)
(4)3WJ-a_rev：GGG UGU AUG UGU ACC GUU(SEQ ID NO：4)
(5)3WJ-b_rev：CCU AGU UGU UUC AUA CAC CC(SEQ ID NO：5)
(6)3WJ-c_rev：AAC GGU ACU AAC UAG G(SEQ ID NO：6)
(7)3WJ-c-叶酸：GGA UCA AUC AUG GCA A-叶酸(SEQ ID NO：7)
(8)方形A：GGG AGC CGU CAA UCA UGG CAA GUG UCC GCC AUA CUU UGU UGC ACGCAC(SEQ ID NO：8)
(9)方形B：GGG AGC GUG CAA UCA UGG CAA GCG CAU CGC AUA CUU UGU UGC GACCUA(SEQ ID NO：9)
(10)方形C：GGG AGG UCG CAA UCA UGG CAA CGA UAG AGC AUA CUU UGU UGG CUGGAG(SEQ ID NO：10)
(11)方形D：GGG ACC AGC CAA UCA UGG CAA UAU ACA CGC AUA CUU UGU UGA CGGCGG(SEQ ID NO：11)
(12)方形E：GGA CAC UUG UCA UGU GUA UGC GUG UAU AUU GUC AUG UGU AUG CUCUAU CGU UGU CAU GUG UAU GCG AUG CGC UUG UCA UGU GUA UGG C(SEQ ID NO：12)
(13)b-方形A：GGC CCA CAU ACU UUG UUG AUC CAU GGU GCG UAG GGU CGU CAAUCA UGG CAA GUG UCC GCC AUA CUU UGU UGC ACU CCC UUG CUC AUC A(SEQ ID NO：13)
(14)b-方形B：GGC CCA CAU ACU UUG UUG AUC CUG AUG AGC AAG GGA GUG CAAUCA UGG CAA GCG UAU CGC AUA CUU UGU UGA GAA CCC UAU GUG ACU U(SEQ ID NO：14)
(15)b-方形C：GGC CCA CAU ACU UUG UUG AUC CAA GUC ACA UAG GGU UCG CAAUCA UGG CAA CGA UAG AGC AUA CUU UGU UGG AGU CCC UUA GAG UAG A(SEQ ID NO：15)
(16)b-方形D：GGC CCA CAU ACU UUG UUG AUC CUC UAC UCU AAG GGA CUC CAAUCA UGG CAA UAU ACA CGC AUA CUU UGU UGA CGA CCC UAC GCA CCA U(SEQ ID NO：16)
(17)3WJ-a-b_rev：UUG CCA UGU GUA UGU GGG CCU AGU UGU UUC AUA CAC CC(SEQ ID NO：17)
(18)3WJ-c-b_rev：GGA UCA AUC AUG GCAA CCU AGU UGU UUC AUA CAC CC(SEQID NO：18)
(19)3WJ-b-a_rev：CCC ACA UAC UUU GUU GAU CC GGG UGU AUG UGU ACC GUU(SEQ ID NO：19)
(20)3WJ-b-c_rev：CCC ACA UAC UUU GUU GAU CC AAC GGU ACU AAC UAG G(SEQID NO：20)
凝胶分析：使用2％琼脂糖凝胶和6-8％PAGE分析RNA树枝状聚合物。制备凝胶并在TMS缓冲液中在90V下运行1小时。将凝胶用溴化乙锭染色并使用Typhoon FLA 7000(GEHealthcare，Cincinnati，OH，USA)进行扫描。
AFM成像：使用如先前所述的47以轻敲模式操作的多模式AFM纳米示波器IV系统(Veeco/Digital Instruments，Town of Oyster Bay，NY，USA)，使用APS改性的表面使树枝状结构成像。
血清稳定性测定：通过用50％胎牛血清(FBS)在37℃下以1μM的终浓度温育树枝状聚合物来研究RNA树枝状聚合物的化学稳定性。在每个时间点(0、0.16小时、1小时、3小时、6小时、18小时和24小时)收集10μL样品，并经受用TBM运行缓冲液的2％琼脂糖凝胶测定。凝胶在120V下运行120分钟，通过Typhoon FLA 7000(GE Healthcare，Cincinnati，OH，USA)成像，并通过ImageJ定量凝胶带。
流式细胞术分析：叶酸受体(+)KB细胞在T75烧瓶中培养，并用0.25％胰蛋白酶以1×106细胞/ml的密度收获。用Opti-MEM培养基洗涤细胞一次，然后与不同浓度的Cy5标记的2′-F RNA树枝状聚合物在Opti-MEM培养基中在37℃避光温育1小时。然后将细胞洗涤三次并悬浮于PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，100mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH 7.4)中用于分析。
共聚焦成像：将KB细胞在盖玻片(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)中在24孔底部培养皿中在其完全培养基中生长过夜。将细胞以2×105个细胞/ml的密度接种到500μl的体积中。在测试当天，用Opti-MEM培养基洗涤细胞两次，将RNA树枝状聚合物(具有全链Cy5标记的SquareE链)悬浮于200μl Opti-MEM培养基中，并用细胞在37℃下温育1小时。用PBS洗涤细胞两次，用PBS中的4％多聚甲醛溶液(Microscopy Sciences，Hatfield，PA，USA)在室温固定20分钟，然后用PBS洗涤，并在室温下用0.05％Triton-X 100在PBS中渗透3分钟。然后将细胞用Alexa488 phallodin(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)在室温下染色20分钟，用PBS洗涤孔并空气干燥。用gold antifade(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)对细胞染色，用于使用Zeiss LSM 510激光扫描系统的共聚焦显微镜成像的DAPI染色。
结果
RNA树状大分子的部分和中间体的设计和装配
我们开发了三个模块作为构建RNA树枝状聚合物的构件。模块-1是由具有三个末端的三个单独链(3WJ-a、3WJ-b和3WJ-c)组成的3WJ基序(图28A)。为了构建高阶结构，我们需要以径向方式互连3WJ基序，并且这需要使用具有接近相同的折叠属性的两个不同的3WJ，以避免层之间的串扰。否则，可能发生错误折叠和聚集。我们生成了反向pRNA-3WJ，表示为pRNA-3WJ-rev，其是具有5′-和3′-端交换的pRNA-3WJ的镜像图像(图28B)。pRNA-3WJ-rev具有与常规pRNA-3WJ关于热力学稳定性相同的性质，以及在天然和8M变性PAGE中的装配。
模块-2由三组pRNA-3WJ构件组成，每个构件含有用作粘性末端(3WJ-a_rev、3WJb_rev和3WJ-c_rev)的pRNA-3WJ-rev的组分链之一。使用3WJ核链作为粘性末端确保接近自发的3WJ装配，具有最小的非特异性杂交，否则可能导致错误折叠，并且也消除了对3WJ之间的额外的连接序列的需要。当以化学计量比混合三个构件时，pRNA-3WJ-rev从三个粘性末端装配，从而以高效率产生模块-2(图29)。模块2由5个组成链组成并具有6个末端。
类似地，模块-3是通过使用3WJ组成链之一作为粘性末端通过分支延伸在模块2复合物顶部上的反复逐步装配构建的。最终的复合物由7个链和12个末端与交替的pRNA-3WJ核和pRNA-3WJ-rev核组成(图29)。
所有三个模块可以在一个步骤中或通过在室温下在TMS缓冲液(40mM Tris、10mMMgCl2、100mM NaCl)中简单混合链或通过退火(加热至95℃并在1小时内冷却至室温)逐步装配。这些模块的使用将使得能够构建具有所需功能部分的RNA树枝状聚合物，例如RNAi试剂siRNA、miRNA、抗miRNA；化疗药物；受体靶向RNA适体或化学配体；核糖开关；核酶；内体破坏剂；和成像荧光团或放射性标记(图30)。
RNA树枝状聚合物G-0至G-4的设计和装配
RNA树枝状聚合物具有与基于小分子的树枝状聚合物类似的结构，其由起始核、重复单元的内层和在最外面一代的外围末端的末端单元组成。在传统意义上，我们采用‘发散生长’方法，其中树枝状聚合物从核位点开始并逐层径向生长。我们使用pRNA-3WJ作为G-0启动核(图29A，32A-B)，然后构建用作G-1的平面方形纳米颗粒(图31A，32A-B)。pRNA-3WJ支架高度可调，并且内角可以从方形构型中的天然60°延伸到90°，如前所证明的30。在每个角的pRNA-3WJ核通过双链RNA序列连接，整个方形构建体(G-1)由5条链和4个末端(MW～83KDa)组成(图31A)。方形图案确保突出的角分支之间的相等间距，并最小化用于添加构件的空间位阻。然后我们采用与上述类似的策略，使用3WJ组分链之一作为粘性端以顺序构建G-2(7个独特链；8个末端；MW～187kDa)(图31B，32A-B)、G-3(9个独特链；16个末端；MW～328kDa)(图31C，32A-B)和最后G-4(11个独特链；32个末端；MW～610kDa)(图31D，32A-B)(表4)。通过以等摩尔比混合组分链然后退火，除了需要与模块-2另外温育步骤的G-4(图29，31D)，可以以高产率装配G-0至G-3树枝状聚合物。我们的设计不需要任何酶连接步骤，并且简单地依赖于单个嵌段的自装配用于构建更高阶的树枝状聚合物。使用Mfold算法[D48]优化树枝状聚合物代的所有序列以避免任何非特异性相互作用。
表4 RNA树枝状聚合物的特征
RNA树枝状聚合物的热力学稳定性和血清稳定性的表征
各个构件的热力学稳定性对于确保RNA树枝状聚合物在体内不解离而保持完整至关重要。pRNA-3WJ和pRNA-3WJ-rev支架均以高效率装配，如天然PAGE所示(图28A-B；顶部凝胶)。两种3WJ在存在强变性的8M尿素的情况下保持稳定，从而表现出稳固的属性(图28A-B；底部凝胶)。熔融实验表明，三组分链具有比任何一个或两个组分链更高的彼此相互作用的亲和力。熔融曲线的斜率非常陡，这表明如先前所计算的37具有非常低的自由能(ΔG°37°Cof-28千卡/mol)的三个链的协同装配。对于pRNA-3WJ和pRNA-3WJ-rev支架，Tm值分别为59±0.5℃和58.5±0.5℃(图28A-B)几乎相同。RNA树枝状聚合物的Tm分析是涉及多个链和多步折叠中间体的挑战。
为了成功地临床应用RNA树枝状聚合物，主要的障碍是它们在生物培养基例如血清中的稳定性。未修饰的RNA对于降解固有地敏感，因为在血清或半衰期从几分钟到几小时变化的细胞中存在核酸酶[D40，D49，D50]。化学修饰例如对RNA的核糖的2′-氟(2′-F)修饰已经显示出对核酸酶抗性[D22，D51，D52]，并且还增强RNA纳米颗粒的热力学稳定性[D37]。在树枝状聚合物RNA序列内，在固态合成或者在体外转录中U和C核苷酸被2′-F修饰的U和C核苷酸替代。装配2′-F修饰的G-4 RNA树枝状聚合物并且在天然凝胶测定中显示与未修饰的G-4 RNA树枝状聚合物类似的装配效率。为了测试血清稳定性，将2′-F修饰的G-4树枝状聚合物与10％胎牛血清(FBS)在37℃温育。在特定时间点，提取等分试样并快速冷冻。凝胶测定证明2′-F G-4 RNA树枝状聚合物对核酸酶降解耐受超过24小时(图32C)，而未修饰的构建体在10-15分钟内降解。
通过原子力显微镜(AFM)和凝胶电泳表征RNA树状聚合物
通过天然凝胶电泳测试树枝状聚合物的装配(图32B)。G-0、G-1、G-2、G-3和G-4树枝状聚合物都在凝胶中显示单个条带，没有任何污点，这表明所采用的装配策略的高效率。从较低代到较高代没有观察到装配效率的明显变化。使用离心膜过滤柱在树枝状聚合物装配后除去游离RNA链。凝胶带从G-0到G-4的缓慢迁移清楚地表明构建体的尺寸增加，如所预期的。
为了进一步证实该结果，通过AFM成像检查了来自G-0至G-4的所有构建的树枝状聚合物代，其强烈支持具有分支构象的所有树枝状聚合物的形成(图32A)。对于G-4树枝状聚合物，可以容易地观察到外层的臂中的分叉，并且在从G-1到G-4的大多数结构中可以看到中心方块。树枝状聚合物结构的确是三维的，如模拟(in silico)利用刨床3WJ结构基序的晶体结构时所设计的[D44]。基于pRNA-3WJ(PDB ID：4KZ2)的可用晶体结构[D44]，使用Swiss PDB Viewer(www.spdbv.vital-it.ch)和Pymol(https：//www.pymol.org/)将3WJ构件排列成三维结构模型(图32A)。树枝状聚合物的三维性质使得该结构在表面上以不同的取向出现用于AFM成像，从而使树枝状聚合物臂在不同图像中看起来彼此接近或更远离。RNA树枝状聚合物高度带负电荷，并且不在溶液中聚集。这种阴离子性质和无聚集物理性质将最小化非特异性细胞进入，以及肺和脾巨噬细胞和肝库普弗细胞的包埋[D53]。
表征用于细胞受体靶向的RNA树枝状聚合物
为了研究RNA树枝状聚合物在靶向特异性细胞中的潜在应用，将2′-F修饰的RNA树枝状聚合物在外周端用靶向配体装配。在上皮起源的癌细胞54中经常观察到叶酸受体的增加的表达。本文中，我们使用叶酸作为靶向配体。在G-4内，G-1的核正方形E链用Cy5荧光标记用于检测。末端序列(3WJ-c)之一3′-末端在用叶酸标记(从Trilink定制)，然后用于装配G-4树枝状聚合物，导致在G-4树枝状聚合物表面16个叶酸均匀分布。叶酸受体阳性KB细胞用不同浓度的G-4树枝状聚合物温育，并使用流式细胞术分析温育效率(图33A)。与不含任何叶酸的G-4树枝状聚合物相比，使用从1nM增加至3nM至6nM的RNA浓度，具有叶酸的G-4树枝状聚合物显示增加的细胞内摄取。这归因于叶酸受体介导的内吞作用。共聚焦荧光显微镜(图33B)图像进一步证实了G-4树枝状聚合物用叶酸的内化，如由细胞质(绿色)和树枝状聚合物(红色)的强重叠所指示。该结果表明，RNA树枝状聚合物可用于将包括放射性配体、药物分子和RNAi模块的各种有效载荷递送到细胞中。
讨论
我们表明RNA可以作为新一代的构件，形成具有确定大小和形状的同质超分子3D树枝状聚合物。我们利用强大的pRNA-3WJ基序的逐步自装配策略高度有效且在控制下可以产生具有高产率和纯度的同质树枝状聚合物。2′-F RNA的引入使得树枝状聚合物对血清具有抗性，并且具有靶向配体的树枝状聚合物的装饰导致向特异性靶细胞的高细胞内递送。
与基于小分子的化学聚合物相比，RNA树枝状聚合物可以制得足够大(＞10nm)以避免快速肾排泄，但足够小(对于G-4树枝状聚合物为65nm)以通过受体介导的胞吞作用进入细胞。可以通过调整化学修饰的2′-F核苷酸的百分比和位置来及时控制RNA的降解。此外，RNA树状聚合物内的单个核苷酸可以在化学合成期间在树枝状聚合物自装配之前被标记，因此确保充分利用空隙空间，这对于基于小分子的树枝状聚合物是艰巨的挑战。与DNA对应物相比，除了在2′-F修饰后增强的化学稳定性之外，RNA树枝状聚合物在热力学上更稳定[D15-16，D22，D37，D55-56]，因此在体内不会在超低浓度下解离，并且治疗性RNA干扰模块例如siRNA和miRNA可以无缝地整合到序列设计中。
RNA链的化学合成的容易性、没有合成反应的自装配的简单性、在装配之前模块单元的功能化的容易性以及RNA树枝状聚合物的多价性质将有助于所需功能模块的高负载，例如用于生物电子学、模拟生物膜、成像、诊断和治疗中的多种应用的药物、靶向、治疗和成像剂。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引证并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地表明通过引证并入，包括以下清单中给出的参考文献：
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将理解，在不脱离本文所公开的主题的范围的情况下，可以改变本发明公开的主题的各种细节。此外，前面的描述仅仅是为了说明的目的，而不是为了限制的目的。

Claims (131)

1.一种人造RNA纳米结构分子，其中所述分子包含：包含多个分支的RNA连接基序和至少一个成像模块，其中所述RNA连接基序的分支包含至少一个RNA寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的分子，进一步包含与所述RNA连接基序偶联的至少一个癌靶向模块。
3.根据权利要求1所述的分子，进一步包含与所述RNA连接基序偶联的至少一个治疗模块。
4.根据权利要求1所述的分子，其中所述多个分支包括三个分支、四个分支、六个分支或八个分支。
5.根据权利要求1所述的分子，其中所述成像模块包括荧光染料、放射性核素或造影剂。
6.根据权利要求5所述的分子，其中所述荧光染料包括Alexa染料、Cy染料或近红外染料。
7.根据权利要求1所述的分子，其中所述成像模块包括报告成像模块。
8.根据权利要求1所述的分子，其中所述成像模块包括参考成像模块。
9.根据权利要求8所述的分子，其中所述参考成像模块包括参考染料和淬灭剂。
10.根据权利要求5所述的分子，其中所述荧光染料是Alexa染料、Cy染料或近IR染料，包括IRdye800、Alexa647、Cy5、Cy5.5、Alexa680、Iowa Black RQ、QSY21、IRDyeQC、BBQ650、BHQ-3、吲哚菁绿(ICG)。
11.根据权利要求1所述的分子，其中所述成像模块与所述RNA连接基序的至少一个分支偶联。
12.根据权利要求2所述的分子，其中所述成像模块与所述癌靶向模块偶联。
13.根据权利要求3所述的分子，其中所述成像模块与所述治疗模块偶联。
14.根据权利要求1所述的分子，其中所述成像模块包括放射性核素。
15.根据权利要求14所述的分子，其中所述放射性核素用177Lu、111In、64Cu、99mTc、203Pb、188Re、212Pb或212Bi标记。
16.根据权利要求14所述的分子，其中所述放射性核素与所述RNA连接基序的至少一个分支偶联。
17.根据权利要求14所述的分子，其中所述放射性核素通过螯合剂螯合。
18.根据权利要求17所述的分子，其中所述螯合剂是DOTA。
19.根据权利要求17所述的分子，其中所述螯合剂是NOTA。
20.根据权利要求17所述的分子，其中所述螯合剂与所述RNA连接基序的至少一个分支缀合。
21.根据权利要求5所述的分子，其中所述造影剂是MRI造影剂。
22.根据权利要求19所述的分子，其中所述MRI造影剂是钆造影剂。
23.根据权利要求1所述的分子，其中所述纳米结构在所述RNA寡核苷酸的2′位置包含至少一个化学修饰。
24.根据权利要求23所述的分子，其中所述化学修饰包括2’氟、2’胺基和2’O-甲基。
25.根据权利要求1所述的分子，其中所述包含多个分支的RNA连接基序包含三分支RNA连接基序。
26.根据权利要求1所述的分子，其中所述包含多个分支的RNA连接基序包含四分支RNA连接基序。
27.根据权利要求25所述的分子，其中所述三分支RNA连接基序的分支包含a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)或c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。
28.根据权利要求25所述的分子，其中所述三分支RNA连接基序包含a3WJ RNA模块(SEQID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)和c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。
29.根据权利要求27或28所述的分子，其中SEQ ID NO：1与核苷酸序列5′-UUG CCA UGUGUA UGU GGG-3′具有至少90％的同一性。
30.根据权利要求27或28所述的分子，其中SEQ ID NO：1包含核苷酸序列5′-UUG CCAUGU GUA UGU GGG-3′。
31.根据权利要求27或28所述的分子，其中SEQ ID NO：2与核苷酸序列5′-CCC ACA UACUUU GUU GAUCC-3′具有至少90％的同一性。
32.根据权利要求27或28所述的分子，其中SEQ ID NO：2包含核苷酸序列5′-CCC ACAUAC UUU GUU GAUCC-3′。
33.根据权利要求27或28所述的分子，其中SEQ ID NO：3与核苷酸序列5′-GGA UCA AUCAUG GCA A-3′具有至少90％的同一性。
34.根据权利要求27或28所述的分子，其中SEQ ID NO：3包含核苷酸序列5′-GGA UCAAUC AUG GCA A-3′。
35.根据权利要求2所述的分子，其中所述癌靶向模块包括结合至少一种癌细胞表面标记物的配体。
36.根据权利要求2所述的分子，其中所述癌靶向模块是结肠癌靶向模块。
37.根据权利要求35所述的分子，其中所述配体包括叶酸。
38.根据权利要求35所述的分子，其中所述细胞表面标记物包括叶酸受体。
39.根据权利要求35所述的分子，其中所述配体结合上皮细胞粘附分子(EpCAM)。
40.根据权利要求35所述的分子，其中所述细胞表面标记物包括上皮细胞粘附分子(EpCAM)。
41.根据权利要求35所述的分子，其中所述癌靶向模块包括适体。
42.根据权利要求41所述的分子，其中所述适体是EpCAM RNA适体。
43.根据权利要求2所述的分子，其中所述癌靶向模块是叶酸。
44.根据权利要求37或43所述的分子，其中所述叶酸是氧化型叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸或它们的组合。
45.根据权利要求3所述的分子，其中所述治疗模块包括siRNA、miRNA、抗mRNA、核酶RNA或反义RNA。
46.根据权利要求3所述的分子，其中所述治疗模块包括化疗药物、核糖开关或内体破坏剂。
47.根据权利要求3所述的分子，其中所述治疗模块是siRNA。
48.根据权利要求45或47所述的分子，其中所述siRNA直接结合存活蛋白。
49.根据权利要求47所述的分子，其中所述siRNA直接结合PI3K、Akt或mTOR。
50.根据权利要求3所述的分子，其中所述治疗模块是微RNA序列。
51.根据权利要求3所述的分子，其中所述治疗模块是针对包含miR-9、miR-10b、miR-21或miR-26的miRNA的抗miRNA分子。
52.根据权利要求41所述的分子，其中所述治疗模块是用于包含let-7a、miR-10b、miR-25、miR-34a、miR-124、miR-145或miR-181b的miRNA的miRNA分子。
53.根据权利要求3所述的分子，其中所述治疗模块是细胞毒性药物。
54.根据权利要求53所述的分子，其中所述细胞毒性药物包含多柔比星。
55.根据权利要求53所述的分子，其中所述细胞毒性药物是紫杉醇。
56.根据权利要求53所述的分子，其中所述细胞毒性药物是喜树碱。
57.一种人造RNA纳米结构分子，其中所述分子包含：包含多个分支的RNA连接基序，其中所述RNA连接基序的分支包含至少一个RNA寡核苷酸，并且其中基于辐射的治疗模块与所述RNA连接基序偶联。
58.根据权利要求57所述的分子，进一步包含与所述RNA连接基序偶联的癌靶向模块。
59.根据权利要求57所述的分子，进一步包含与所述RNA连接基序偶联的成像模块。
60.根据权利要求57所述的分子，其中所述纳米结构在所述RNA寡核苷酸的2′位置包含至少一个化学修饰。
61.根据权利要求57所述的分子，其中所述化学修饰包括2’氟、2’胺基和2’O-甲基。
62.根据权利要求57所述的分子，其中所述多个分支包括三个分支、四个分支、六个分支或八个分支。
63.根据权利要求57所述的分子，其中所述包含多个分支的RNA连接基序包含三分支RNA连接基序。
64.根据权利要求57所述的分子，其中所述包含多个分支的RNA连接基序包含四分支RNA连接基序。
65.根据权利要求63所述的分子，其中所述三分支RNA连接基序的分支包含a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)或c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。
66.根据权利要求63所述的分子，其中所述三分支RNA连接基序包含a3WJ RNA模块(SEQID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)和c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。
67.根据权利要求65或66所述的分子，其中SEQ ID NO：1与核苷酸序列5′-UUG CCA UGUGUA UGU GGG-3′具有至少90％的同一性。
68.根据权利要求65或66所述的分子，其中SEQ ID NO：1包含核苷酸序列5′-UUG CCAUGU GUA UGU GGG-3′。
69.根据权利要求65或66所述的分子，其中SEQ ID NO：2与核苷酸序列5′-CCC ACA UACUUU GUU GAUCC-3′具有至少90％的同一性。
70.根据权利要求65或66所述的分子，其中SEQ ID NO：2包含核苷酸序列5′-CCC ACAUAC UUU GUU GAUCC-3′。
71.根据权利要求65或66所述的分子，其中SEQ ID NO：3与核苷酸序列5′-GGA UCA AUCAUG GCA A-3′具有至少90％的同一性。
72.根据权利要求65或66所述的分子，其中SEQ ID NO：3包含核苷酸序列5′-GGA UCAAUC AUG GCA A-3′。
73.根据权利要求58所述的分子，其中所述癌靶向模块是癌细胞特异性配体。
74.根据权利要求58所述的分子，其中所述癌靶向模块是叶酸。
75.根据权利要求58所述的分子，其中所述癌靶向模块是RNA适体。
76.根据权利要求57所述的分子，其中所述基于辐射的治疗模块是包含177Lu、111In、64Cu、99mTc、203Pb、188Re、212Pb、212Bi、I-125或Cs-131的同位素。
77.根据权利要求57所述的分子，其中所述基于辐射的治疗模块是同位素I-125。
78.根据权利要求57所述的分子，其中所述基于辐射的治疗模块是同位素Cs-131。
79.一种RNA树枝状聚合物分子，所述分子包含(a)中心核多分支RNA连接基序，其中所述中心核基序包含多个分支，并且其中分支包含至少一个RNA寡核苷酸；和(b)包含至少一个重复多分支RNA连接基序单元的外表面多分支RNA连接基序，其中所述重复单元包含多个分支，并且其中分支包含至少一个RNA寡核苷酸。
80.根据权利要求78所述的RNA树枝状聚合物分子，进一步包含至少一个成像模块。
81.根据权利要求78所述的RNA树枝状聚合物分子，进一步包含至少一个靶向模块。
82.根据权利要求78所述的RNA树枝状聚合物分子，进一步包含至少一个治疗模块。
83.根据权利要求78所述的RNA树枝状聚合物分子，其中包含多个分支的所述中心核多分支RNA连接基序包含三分支RNA连接基序、或四分支RNA连接基序、六分支RNA连接基序或八分支RNA连接基序。
84.根据权利要求78所述的RNA树枝状聚合物分子，其中包含多个分支的所述重复多分支RNA连接基序单元包含三分支RNA连接基序、或四分支RNA连接基序、六分支RNA连接基序和八分支RNA连接基序。
85.根据权利要求82和83所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述三分支RNA连接基序的分支包含a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)或c3WJ RNA模块(SEQ ID NO：3)。
86.根据权利要求82和83所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述三分支RNA连接基序包含a3WJ RNA模块(SEQ ID NO：1)、b3WJ RNA模块(SEQ ID NO：2)和c3WJ RNA模块(SEQ IDNO：3)。
87.根据权利要求82或83所述的RNA树枝状聚合物分子，其中SEQ ID NO：1与核苷酸序列5′-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3′具有至少90％的同一性。
88.根据权利要求82或83所述的RNA树枝状聚合物分子，其中SEQ ID NO：1包含核苷酸序列5′-UUG CCA UGU GUA UGU GGG-3′。
89.根据权利要求82或83所述的RNA树枝状聚合物分子，其中SEQ ID NO：2与核苷酸序列5′-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3′具有至少90％的同一性。
90.根据权利要求82或83所述的RNA树枝状聚合物分子，其中SEQ ID NO：2包含核苷酸序列5′-CCC ACA UAC UUU GUU GAUCC-3′。
91.根据权利要求82或83所述的RNA树枝状聚合物分子，其中SEQ ID NO：3与核苷酸序列5′-GGA UCA AUC AUG GCA A-3′具有至少90％的同一性。
92.根据权利要求82或83所述的RNA树枝状聚合物分子，其中SEQ ID NO：3包含核苷酸序列5′-GGA UCA AUC AUG GCA A-3′。
93.根据权利要求82或83所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述中心核多分支RNA连接基序是在每个角包含三分支RNA连接基序的多角形结构。
94.根据权利要求78所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述成像模块包含荧光染料、放射性核素或造影剂。
95.根据权利要求93所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述荧光染料是Alexa染料、Cy染料或近IR染料，包括IRdye800、Alexa647、Cy5、Cy5.5、Alexa680、Iowa Black RQ、QSY21、IRDyeQC、BBQ650、BHQ-3、吲哚菁绿(ICG)。
96.根据权利要求93所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述成像模块包括报告成像模块。
97.根据权利要求93所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述成像模块包括参考成像模块。
98.根据权利要求93所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述参考成像模块包括参考染料和淬灭剂。
99.根据权利要求93所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述成像模块包括至少一种荧光染料。
100.根据权利要求93所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述成像模块包括至少一种放射性核素。
101.根据权利要求93所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述成像模块包含至少一种MRI造影剂。
102.根据权利要求93所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述成像模块包括至少一种钆造影剂。
103.根据权利要求80所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述靶向模块包括癌靶向模块。
104.根据权利要求102所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述癌靶向模块是结合至少一种癌细胞表面标记物的配体。
105.根据权利要求102所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述靶向模块包括化学配体或RNA适体。
106.根据权利要求103所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述配体包括叶酸。
107.根据权利要求103所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述细胞表面标记物包括叶酸受体。
108.根据权利要求103所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述配体结合上皮细胞粘附分子(EpCAM)。
109.根据权利要求103所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述细胞表面标记物包括上皮细胞粘附分子(EpCAM)。
110.根据权利要求102所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述癌靶向模块包括适体。
111.根据权利要求109所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述适体是EpCAM RNA适体。
112.根据权利要求102所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述癌靶向模块是叶酸。
113.根据权利要求111所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述叶酸是氧化型叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸或它们的组合。
114.根据权利要求81所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述治疗模块包括siRNA、miRNA、抗mRNA、核酶RNA或反义RNA。
115.根据权利要求81所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述治疗模块包括化疗药物、核糖开关或内体破坏剂。
116.根据权利要求81所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述治疗模块是细胞毒性药物。
117.根据权利要求115所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述细胞毒性药物包括多柔比星、紫杉醇、紫杉醇衍生物和类似物、细胞松弛素D、雷帕霉素、雷帕霉素衍生物和类似物、喜树碱、地塞米松和5-氟尿嘧啶、喹唑啉酮衍生物、金属银、曲尼司特、依维莫司和/或相关化合物。
118.根据权利要求78所述的RNA树枝状聚合物分子，其中所述多分支的多个分支与以下至少一种的核苷酸序列包含至少90％的同一性：
3WJ-a：UUG CCA UGU GUA UGU GGG(SEQ ID NO：1)
3WJ-b：CCC ACA UAC UUU GUU GAU CC(SEQ ID NO：2)
3WJ-c：GGA UCA AUC AUG GCA A(SEQ ID NO：3)
3WJ-a_rev：GGG UGU AUG UGU ACC GUU(SEQ ID NO：4)
3WJ-b_rev：CCU AGU UGU UUC AUA CAC CC(SEQ ID NO：5)
3WJ-c_rev：AAC GGU ACU AAC UAG G(SEQ ID NO：6)
3WJ-c-叶酸：GGA UCA AUC AUG GCA A-叶酸(SEQ ID NO：7)
方形A：GGG AGC CGU CAA UCA UGG CAA GUG UCC GCC AUA CUU UGU UGC ACG CAC(SEQID NO：8)
方形B：GGG AGC GUG CAA UCA UGG CAA GCG CAU CGC AUA CUU UGU UGC GAC CUA(SEQID NO：9)
方形C：GGG AGG UCG CAA UCA UGG CAA CGA UAG AGC AUA CUU UGU UGG CUG GAG(SEQID NO：10)
方形D：GGG ACC AGC CAA UCA UGG CAA UAU ACA CGC AUA CUU UGU UGA CGG CGG(SEQID NO：11)
方形E：GGA CAC UUG UCA UGU GUA UGC GUG UAU AUU GUC AUG UGU AUG CUC UAU CGUUGU CAU GUG UAU GCG AUG CGC UUG UCA UGU GUA UGG C(SEQ ID NO：12)
b-方形A：GGC CCA CAU ACU UUG UUG AUC CAU GGU GCG UAG GGU CGU CAA UCA UGGCAA GUG UCC GCC AUA CUU UGU UGC ACU CCC UUG CUC AUC A(SEQ ID NO：13)
b-方形B：GGC CCA CAU ACU UUG UUG AUC CUG AUG AGC AAG GGA GUG CAA UCA UGGCAA GCG UAU CGC AUA CUU UGU UGA GAA CCC UAU GUG ACU U(SEQ ID NO：14)
b-方形C：GGC CCA CAU ACU UUG UUG AUC CAA GUC ACA UAG GGU UCG CAA UCA UGGCAA CGA UAG AGC AUA CUU UGU UGG AGU CCC UUA GAG UAG A(SEQ ID NO：15)
b-方形D：GGC CCA CAU ACU UUG UUG AUC CUC UAC UCU AAG GGA CUC CAA UCA UGGCAA UAU ACA CGC AUA CUU UGU UGA CGA CCC UAC GCA CCA U(SEQ ID NO：16)
3WJ-a-b_rev：UUG CCA UGU GUA UGU GGG CCU AGU UGU UUC AUA CAC CC(SEQ ID NO：17)
3WJ-c-b_rev：GGA UCA AUC AUG GCA A CCU AGU UGU UUC AUA CAC CC(SEQ ID NO：18)
3WJ-b-a_rev：CCC ACA UAC UUU GUU GAU CC GGG UGU AUG UGU ACC GUU(SEQ ID NO：19)
3WJ-b-c_rev：CCC ACA UAC UUU GUU GAU CC AAC GGU ACU AAC UAG G(SEQ ID NO：20)。
119.一种组合物，包含治疗有效量的权利要求1-117中任一项所述的RNA纳米结构和RNA树枝状聚合物分子。
120.根据权利要求118所述的组合物，进一步包含药学上可接受的载体。
121.一种药物递送系统，所述系统包含治疗有效量的权利要求1-117中任一项的RNA纳米结构和RNA树枝状聚合物分子。
122.根据权利要求120所述的药物递送系统，进一步包含药学上可接受的载体。
123.一种治疗剂的图像引导药物递送至需要其的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求1-117中任一项所述的RNA纳米结构分子，以及将成像检测装置应用于所述受试者。
124.根据权利要求122所述的方法，其中所述成像检测装置是MRI成像系统。
125.根据权利要求122所述的方法，其中所述成像检测装置是NIRF成像系统。
126.根据权利要求122所述的方法，其中，所述成像检测装置是CT/PET/SPECT成像系统。
127.一种在患有或处于患癌症风险的受试者中诊断和/或治疗结肠癌的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含权利要求1-117中任一项的分子的组合物。
128.根据权利要求126所述的方法，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
129.根据权利要求126所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物或非哺乳脊椎动物。
130.根据权利要求126所述的方法，其中所述受试者是人。
131.根据权利要求126所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
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