Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

KR20220119063A - 치료용 조작 세포 - Google Patents

치료용 조작 세포 Download PDF

Info

Publication number
KR20220119063A
KR20220119063A KR1020227023757A KR20227023757A KR20220119063A KR 20220119063 A KR20220119063 A KR 20220119063A KR 1020227023757 A KR1020227023757 A KR 1020227023757A KR 20227023757 A KR20227023757 A KR 20227023757A KR 20220119063 A KR20220119063 A KR 20220119063A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell
receptor
cells
differentiated
rna
Prior art date
Application number
KR1020227023757A
Other languages
English (en)
Inventor
지. 그랜트 웰스테드
중 일 문
Original Assignee
에디타스 메디신, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에디타스 메디신, 인코포레이티드 filed Critical 에디타스 메디신, 인코포레이티드
Publication of KR20220119063A publication Critical patent/KR20220119063A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/605—Nanog
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/608—Lin28
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/65—MicroRNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

액티빈을 포함하는 배양 배지에서 배아 줄기세포, 유도된 만능성 줄기세포 및/또는 분화된 세포를 배양하는 방법이 기재되어 있다. 일 양태에서, 본 개시내용은 만능성 인간 줄기세포를 특징으로 하고, 줄기세포는 (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH)의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집 및 (ii) TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집, 또는 아데노신 A2a 수용체의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함한다.

Description

치료용 조작 세포
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 것으로서, 2019년 12월 18일에 출원된 미국 가출원 제 62/950,063호, 2020년 5월 15일에 출원된 미국 가출원 제 63/025,735호 및 2020년 11월 18일에 출원된 미국 가출원 제 63/115,592호의 이익을 주장한다.
치료적 개입을 위한 조작된 세포뿐만 아니라, 배아 줄기세포 및 유도된 만능성 세포와 같은 줄기세포를 배양하여 만능성이 유지되도록 하는 방법에 대한 요구가 남아 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 만능성 인간 줄기세포를 특징으로 하고, 줄기세포는 (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH)의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집 및 (ii) TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집, 또는 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A)의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집 및 ADORA2A의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함한다.
일부 구현예에서, 줄기세포는 TGF 베타 수용체 또는 TGF 베타 수용체의 우성-음성 변이체의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함한다. 일부 구현예에서, TGF 베타 수용체는 TGF 베타 수용체 II(TGFβRII)이다.
일부 구현예에서, 줄기세포는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-카드헤린(cadherin), UTF-1, Oct4, Rex1 및 Nanog로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 만능성 마커를 발현한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 분화된 세포를 특징으로 하고, 분화된 세포는 본 명세서에 기재된 만능성 인간 줄기세포의 딸 세포이다. 일부 구현예에서, 분화된 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 분화된 세포는 림프구이다. 일부 구현예에서, 분화된 세포는 자연 살해 세포이다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 인간 유도된 만능성 줄기세포(iPSC)이고, 분화된 딸 세포는 iNK 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 (a) 내인성 CD3, CD4 및/또는 CD8을 발현하지 않고; (b) (i) CD56(NCAM), CD49, CD43 및/또는 CD45, 또는 이의 임의의 조합; (ii) NK 세포 수용체 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγRIII, 분화 16의 덩어리(CD16)); (iii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D); (iv) CD69; (v) 자연 세포독성 수용체; 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 유전자를 발현한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포는 하나 이상의 추가의 게놈 편집을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체(예를 들어, 비 자연발생 변이체) (iii) 인터루킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체; (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리; 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 작제물을 특징으로 하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하고/하거나; (2) (i) ADORA2A; (ii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT); (iii) β-2 마이크로글로불린(B2M); (iv) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1); (v) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA); (vi) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A (자연 살해 그룹 2A); (vii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자; (viii) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B); (ix) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC); 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 손실을 야기하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 인간 유도된 만능성 줄기세포(iPSC)를 특징으로 하고, iPSC는 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A)의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함한다. 일부 구현예에서, iPSC는 TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집 또는 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH)의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함한다. 일부 구현예에서, iPSC는 TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집 및 CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함한다.
일부 구현예에서, iPSC는 TGF 베타 수용체 또는 TGF 베타 수용체의 우성-음성 변이체의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함한다. 일부 구현예에서, TGF 베타 수용체는 TGF 베타 수용체 II(TGFβRII)이다.
일부 구현예에서, iPSC는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-카드헤린, UTF-1, Oct4, Rex1 및 Nanog로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 만능성 마커를 발현한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 분화된 세포를 특징으로 하고, 분화된 세포는 본 명세서에 기재된 인간 iPSC의 딸 세포이다. 일부 구현예에서, 분화된 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 분화된 세포는 림프구이다. 일부 구현예에서, 분화된 세포는 자연 살해 세포이다. 일부 구현예에서, 분화된 딸 세포는 iNK 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 (a) 내인성 CD3, CD4 및/또는 CD8을 발현하지 않고; (b) (i) CD56(NCAM), CD49, CD43 및/또는 CD45, 또는 이의 임의의 조합; (ii) NK 세포 수용체 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγRIII, 분화 16의 덩어리(CD16)); (iii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D); (iv) CD69; (v) 자연 세포독성 수용체; 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 유전자를 발현한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포는 하나 이상의 추가의 게놈 편집을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체(예를 들어, 비 자연발생 변이체); (iii) 인터루킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체; (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리; 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 작제물을 특징으로 하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하고/하거나; (2) (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH); (ii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT); (iii) β-2 마이크로글로불린(B2M); (iv) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1); (v) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA); (vi) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A (자연 살해 그룹 2A); (vii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자; (viii) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B); (ix) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC); 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 손실을 야기하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집은 SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나와 동일하거나, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성되었다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집은 (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성되었다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집은 (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성되었다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 TGFβRII의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 TGFβRII의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집은 SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나와 동일하거나, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드를 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성되었다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 TGFβRII의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집은 (i) SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성되었다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 TGFβRII의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집은 (i) SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성되었다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 ADORA2A의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 ADORA2A의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집은 SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나와 동일하거나, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드를 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성되었다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 ADORA2A의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집은 (i) SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성되었다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 ADORA2A의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집은 (i) SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성되었다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나와 동일하거나, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 TGFβRII의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 TGFβRII의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나와 동일하거나, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 TGFβRII의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) (i) SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 TGFβRII의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) (i) SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 ADORA2A의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 ADORA2A의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나와 동일하거나, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 ADORA2A의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) (i) SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 세포에서 ADORA2A의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) (i) SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포, 예를 들어 본 명세서에 기재된 세포를 제조하는 방법을 특징으로 하고, 본 방법은 세포(예를 들어, 만능성 인간 줄기세포 또는 인간 유도된 만능성 줄기세포)를 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나와 동일하거나, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA; RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나와 동일하거나, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및/또는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나와 동일하거나, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA 중 하나 이상과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 세포를 (1) (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA; (2) (i) SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 (3) (i) SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA 중 하나 이상과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 세포를 (1) (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA; (2) (i) SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 (3) (i) SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA 중 하나 이상과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 Cas12a 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12a 변이체는 M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 변이체는 아미노산 치환 M537R, F870L 및 H800A를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 변이체는 SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포, 예를 들어 본 명세서에 기재된 세포를 제조하는 방법을 특징으로 하고, 본 방법은 세포(예를 들어, 만능성 인간 줄기세포 또는 인간 유도된 만능성 줄기세포)를 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나와 동일하거나, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체; (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나와 동일하거나, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체; 및/또는 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, Cas12a 변이체, 예를 들어, M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 아미노산 치환 중 1, 2 또는 3개를 포함하는 Cas12a 변이체, 예를 들어, SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 Cas12a 변이체) 및 (ii) SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나와 동일하거나, 1, 2 또는 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체 중 하나 이상과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 세포를 (1) (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 RNP; (2) (i) SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 RNP; 및 (3) (i) SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 RNP 중 하나 이상과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 세포를 (1) (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 RNP; (2) (i) SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 RNP; 및 (3) (i) SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 RNP 중 하나 이상과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 Cas12a 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12a 변이체는 M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 변이체는 아미노산 치환 M537R, F870L 및 H800A를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 변이체는 SEQ ID NO: 1148에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포, 예를 들어 본 명세서에 기재된 세포를 제조하는 방법을 특징으로 하고, 본 방법은 세포(예를 들어, 만능성 인간 줄기세포 또는 인간 유도된 만능성 줄기세포)를 (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA; SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 (ii) SEQ ID NO: 1144 내지 1151 (또는 이의 일부분) 중 하나에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포, 예를 들어 본 명세서에 기재된 세포를 제조하는 방법을 특징으로 하고, 본 방법은 세포(예를 들어, 만능성 인간 줄기세포 또는 인간 유도된 만능성 줄기세포)를 (1) (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 (ii) SEQ ID NO: 1144 내지 1151 (또는 이의 일부분) 중 하나에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제를 포함하는 RNP; (2) (i) SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA 및 (ii) SEQ ID NO: 1144 내지 1151 (또는 이의 일부분) 중 하나에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제를 포함하는 RNP; 및 (3) (i) SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA 및 (ii) SEQ ID NO: 1144 내지 1151 (또는 이의 일부분) 중 하나에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제를 포함하는 RNP와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포, 예를 들어 본 명세서에 기재된 세포를 제조하는 방법을 특징으로 하고, 본 방법은 세포(예를 들어, 만능성 인간 줄기세포 또는 인간 유도된 만능성 줄기세포)를 (1) (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA; (2) (i) SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA; (3) (i) SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 (4) SEQ ID NO: 1144 내지 1151 (또는 이의 일부분) 중 하나에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포, 예를 들어 본 명세서에 기재된 세포를 제조하는 방법을 특징으로 하고, 본 방법은 세포(예를 들어, 만능성 인간 줄기세포 또는 인간 유도된 만능성 줄기세포)를 (1) (a) (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 (b) SEQ ID NO: 1144 내지 1151 (또는 이의 일부분) 중 하나에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제를 포함하는 RNP; (2) (a) (i) SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 (b) SEQ ID NO: 1144 내지 1151 (또는 이의 일부분) 중 하나에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제를 포함하는 RNP; 및 (3) (a) (i) SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열 및 (ii) 표 3에 도시된 5' 연장 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 (b) SEQ ID NO: 1144 내지 1151 (또는 이의 일부분) 중 하나에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제를 포함하는 RNP와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포, 예를 들어 본 명세서에 기재된 세포를 제조하는 방법을 특징으로 하고, 본 방법은 세포(예를 들어, 만능성 인간 줄기세포 또는 인간 유도된 만능성 줄기세포)를 (1) (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA; (2) (i) SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA; (3) (i) SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 (4) SEQ ID NO: 1144 내지 1151 (또는 이의 일부분) 중 하나에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포, 예를 들어 본 명세서에 기재된 세포를 제조하는 방법을 특징으로 하고, 본 방법은 세포(예를 들어, 만능성 인간 줄기세포 또는 인간 유도된 만능성 줄기세포)를 (1) (a) (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 (b) SEQ ID NO: 1144 내지 1151 (또는 이의 일부분) 중 하나에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제를 포함하는 RNP; (2) (a) (i) SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 (b) SEQ ID NO: 1144 내지 1151 (또는 이의 일부분) 중 하나에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제를 포함하는 RNP; 및 (3) (a) (i) SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 표적화 도메인 서열, (ii) 표적화 도메인 서열의 5'에 위치한 SEQ ID NO: 1153의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 스캐폴드 서열 및 (iii) 스캐폴드 서열의 5'의 SEQ ID NO: 1154의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 (b) SEQ ID NO: 1144 내지 1151 (또는 이의 일부분) 중 하나에 대해 90%, 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제를 포함하는 RNP와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 만능성 인간 줄기세포를 특징으로 하고, 줄기세포는 형질전환 성장 인자 베타(TGF 베타) 신호전달 경로에서의 교란을 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형은 게놈 편집이다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGF 베타 수용체 또는 TGF 베타 수용체의 우성-음성 변이체의 기능 손실을 포함한다. 일부 구현예에서, TGF 베타 수용체는 TGF 베타 수용체 II(TGFβRII)이다.
일부 구현예에서, 줄기세포는 인터루킨 신호전달의 길항제의 기능 손실을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 인터루킨 신호전달의 길항제의 기능 손실을 야기하는 게놈 변형을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인터루킨 신호전달의 길항제는 IL-15 신호전달 경로 및/또는 IL-2 신호전달 경로의 길항제이다.
일부 구현예에서, 줄기세포는 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH)의 기능 손실을 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 줄기세포는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-카드헤린, UTF-1, Oct4, Rex1 및 Nanog로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 만능성 마커를 발현한다.
일부 구현예에서, 줄기세포는 하나 이상의 추가의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체(예를 들어, 비 자연발생 변이체); (iii) 인터루킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체; (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리; 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 작제물을 특징으로 하는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함하고/하거나; (2) (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH); (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A); (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT); (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M); (v) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1); (vi) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA); (vii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A (자연 살해 그룹 2A); (viii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자; (ix) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B); (x) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC); 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 손실을 야기하는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 TGFβRII 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 CISH 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 ADORA2A 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 631 내지 826 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 TIGIT 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 365 내지 576 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 B2M 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 577 내지 630 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 NKG2A 유전자의 유전자 변형을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 분화된 세포를 특징으로 하고, 분화된 세포는 본 명세서에 기재된 만능성 인간 줄기세포의 딸 세포이다. 일부 구현예에서, 분화된 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 분화된 세포는 림프구이다. 일부 구현예에서, 분화된 세포는 자연 살해 세포이다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 인간 유도된 만능성 줄기세포(iPSC)이고, 분화된 딸 세포는 유도된 자연 살해 (iNK) 세포이다.
일부 구현예에서, 분화된 세포는 (a) 내인성 CD3, CD4 및/또는 CD8을 발현하지 않고; (b) (i) CD56(NCAM), CD49, CD43 및/또는 CD45, 또는 이의 임의의 조합; (ii) NK 세포 수용체 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγRIII, 분화 16의 덩어리(CD16)); (iii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D); (iv) CD69; (v) 자연 세포독성 수용체; 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 유전자를 발현한다.
일부 구현예에서, 분화된 줄기세포는 하나 이상의 추가의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 분화된 줄기세포는 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체(예를 들어, 비 자연발생 변이체); (iii) 인터루킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체; (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리; 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 작제물을 특징으로 하는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함하고/하거나; (2) (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH); (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A); (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT); (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M); (v) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1); (vi) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA); (vii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A (자연 살해 그룹 2A); (viii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자; (ix) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B); (x) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC); 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 손실을 야기하는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 분화된 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 TGFβRII 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 분화된 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 CISH 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 분화된 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 ADORA2A 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 분화된 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 631 내지 826 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 TIGIT 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 분화된 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 365 내지 576 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 B2M 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 분화된 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 577 내지 630 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 NKG2A 유전자의 유전자 변형을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 만능성 인간 줄기세포를 배양하는 방법으로서, 액티빈(activin)을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 유도된 만능성 줄기세포이다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 TGFβRII을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 TGFβRII가 발현되지 않도록 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 TGFβRII를 인코딩하는 유전자가 녹아웃되도록 유전자 조작된다.
일부 구현예에서, 액티빈은 액티빈 A이다. 일부 구현예에서, 배지는 TGFβ를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 배양은 소정의 기간(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12일 이상) 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 배양 단계 동안 또는 그 후에 하나 이상의 시기에, 만능성 인간 줄기세포는 만능성을 유지한다(예를 들어, 하나 이상의 만능성 마커를 나타냄). 일부 구현예에서, 배양 단계 동안 또는 그 후에 하나 이상의 시기에, 만능성 인간 줄기세포는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-카드헤린, UTF-1, Oct4, Rex1 및 Nanog 중 하나 이상의 검출 가능한 수준을 발현한다. 일부 구현예에서, 배양 단계 동안 또는 그 후에 만능성 인간 줄기세포는 내배엽, 중배엽 및/또는 외배엽 주의 세포로 분화된다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포 또는 그의 자손은 자연 살해(NK) 세포로 추가로 분화된다.
일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 인간 혈청을 포함하는 배지에서 NK 세포로 분화된다. 일부 구현예에서, 배지는 NKMACS + 인간 혈청(예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20% 이상의 인간 혈청)을 포함한다. 일부 구현예에서, NK 세포는 무혈청 배지에서 분화된 NK 세포에 비해 개선된 세포 확장, 증가된 NK 성숙도(증가된 마커 발현(예를 들어, CD45, CD56, CD16 및/또는 KIR에 의해 나타남)) 및/또는 증가된 세포독성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체(예를 들어, 비 자연발생 변이체); (iii) 인터루킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체; (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리; 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 작제물을 특징으로 하는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함하고/하거나; (2) (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH); (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A); (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT); (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M); (v) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1); (vi) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA); (vii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A (자연 살해 그룹 2A); (viii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자; (ix) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B); (x) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC); 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 손실을 야기하는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 TGFβRII 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 CISH 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 ADORA2A 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 631-826 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 TIGIT 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 365 내지 576 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 B2M 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 577 내지 630 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 NKG2A 유전자의 유전자 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 (1) 만능성 인간 줄기세포가 (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) FcγRIII(CD16)의 비자연발생 변이체; (iii) 인터루킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체; (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리; 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 발현하도록 만능성 인간 줄기세포를 유전자 변형시키는 단계; 및/또는 (2) (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH); (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A); (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT); (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M); (v) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1); (vi) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA); (vii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A (자연 살해 그룹 2A); (viii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자; (ix) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B); (x) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC); 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능이 손실되도록 만능성 인간 줄기세포를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 TGFβRII 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 11162 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 CISH 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 ADORA2A 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 631-826 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 TIGIT 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 365 내지 576 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 B2M 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 577 내지 630 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 NKG2A 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 (i) 만능성 인간 줄기세포 및 (ii) 액티빈을 포함하는 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물을 특징으로 하고, 만능성 인간 줄기세포는 형질전환 성장 인자 베타(TGF 베타) 신호전달 경로에서의 교란을 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형은 게놈 편집이다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGF 베타 수용체 또는 TGF 베타 수용체의 우성-음성 변이체의 기능 손실을 포함한다. 일부 구현예에서, TGF 베타 수용체는 TGF 베타 수용체 II(TGFβRII)이다.
일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체(예를 들어, 비 자연발생 변이체); (iii) 인터루킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체; (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리; 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 작제물을 특징으로 하는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함하고/하거나; (2) (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH); (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A); (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT); (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M); (v) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1); (vi) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA); (vii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A (자연 살해 그룹 2A); (viii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자; (ix) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B); (x) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC); 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 손실을 야기하는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 TGFβRII 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 CISH 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 ADORA2A 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 631-826 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 TIGIT 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 365 내지 576 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 B2M 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 577 내지 630 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 NKG2A 유전자의 유전자 변형을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 방법은 (i) 형질전환 성장 인자 베타(TGF 베타) 신호전달 경로에서의 교란을 포함하는 만능성 인간 줄기세포를 제공하는 단계; 및 (ii) 만능성 인간 줄기세포를 iNK 세포로 분화시키는 단계를 포함하고, iNK 세포는 TGF 베타 신호전달 경로의 교란을 포함하지 않는 iNK 세포와 비교하여 더 높은 수준의 세포 활성을 나타내는 iNK 세포 활성 수준을 증가시키는 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, iNK는 액티빈을 포함하는 배지에서 배양된 만능성 인간 줄기 세포로부터 분화된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 분화 단계 전 및/또는 그 동안 액티빈을 포함하는 배지에서 만능성 인간 줄기세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 인간 혈청을 포함하는 배지에서 NK 세포로 분화된다. 일부 구현예에서, 배지는 NKMACS + 인간 혈청(예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20% 이상의 인간 혈청)을 포함한다. 일부 구현예에서, NK 세포는 무혈청 배지에서 분화된 NK 세포에 비해 개선된 세포 확장, 증가된 NK 성숙도(증가된 마커 발현(예를 들어, CD45, CD56, CD16 및/또는 KIR)에 의해 나타남)), 및/또는 증가된 세포독성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 방법은 만능성 인간 줄기세포에서 형질전환 성장 인자 베타(TGF 베타) 신호전달 경로를 교란하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형은 게놈 편집이다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGF 베타 수용체 또는 TGF 베타 수용체의 우성-음성 변이체의 기능 손실을 포함한다. 일부 구현예에서, TGF 베타 수용체는 TGF 베타 수용체 II(TGFβRII)이다.
일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체(예를 들어, 비 자연발생 변이체); (iii) 인터루킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체; (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리; 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 작제물을 특징으로 하는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함하고/하거나; (2) (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH); (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A); (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT); (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M); (v) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1); (vi) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA); (vii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A (자연 살해 그룹 2A); (viii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자; (ix) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B); (x) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC); 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 손실을 야기하는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 TGFβRII 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 CISH 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 ADORA2A 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 631-826 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 TIGIT 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 365 내지 576 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 B2M 유전자의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 만능성 인간 줄기세포는 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 577 내지 630 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 이루어진 NKG2A 유전자의 유전자 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 (1) 만능성 인간 줄기세포가 (i) 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체(예를 들어, 비 자연발생 변이체); (iii) 인터루킨 15(IL-15); (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체; (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리; 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 발현하도록 만능성 인간 줄기세포를 유전자 변형시키는 단계; 및/또는 (2) (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH); (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A); (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT); (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M); (v) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1); (vi) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA); (vii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A (자연 살해 그룹 2A); (viii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자; (ix) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B); (x) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC); 또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능이 손실되도록 만능성 인간 줄기세포를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 TGFβRII 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 CISH 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 ADORA2A 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 631-826 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 TIGIT 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 365 내지 576 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 B2M 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 577 내지 630 중 어느 하나와 동일하거나 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 사용하여 NKG2A 유전자를 유전자 변형시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 줄기세포, 예를 들어, 인간 줄기세포, 예컨대, 예를 들어, 인간 배아 줄기세포, 인간 유도된 만능성 줄기세포, 또는 인간 만능성 줄기세포를 배양하는 방법으로서, 액티빈, 예를 들어, 액티빈 A를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 유도된 만능성 줄기세포이다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 줄기세포에서 TGF (형질전환 성장 인자) 신호전달 경로를 교란하는 변형, 예를 들어, 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형은 줄기세포에서 TGF 베타 신호전달을 교란(예를 들어, 감소 또는 제거)하는 변형이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변형은 TGF 베타 신호전달 경로의 단백질, 예컨대 TGF 베타 수용체를 인코딩하는 유전자의 변형이다. 일부 구현예에서, 변형은 TGF 베타 신호전달 경로의 단백질의 기능 손실 및/또는 발현 손실을 야기한다. 일부 구현예에서, 변형은 TGF 베타 신호전달 경로의 단백질의 녹아웃을 야기한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 기능성 TGFβ 수용체 단백질을 발현하지 않고, 예를 들어 줄기세포는 TGFβRII 단백질을 발현하지 않거나 기능성 TGFβRII 단백질을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGF 베타 신호전달 경로의 단백질의 작용제의 우성 음성 변이체, 예를 들어 TGFβRII의 우성 음성 변이체를 발현한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGF 베타 신호전달 경로의 길항제를 과발현한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGFβRII를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGFβRII가 발현되지 않도록 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGFβRII를 인코딩하는 유전자가 녹아웃되도록 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 유전자 변형은 줄기세포에서 IL-15 신호전달을 향상(예를 들어, 유지 또는 증가)시키는 변형이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변형은 IL-15 신호전달의 음성 조절인자인 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH)과 같은 IL-15 신호전달 경로에 작용하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 변형이다. 일부 구현예에서, 변형은 IL-15 신호전달 경로에 작용하는 단백질의 기능 손실 및/또는 발현 손실을 야기한다. 일부 구현예에서, 변형은 IL-15 신호전달에 작용하는 단백질의 녹아웃을 야기한다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 기능적 CISH 유전자를 발현하지 않고, 예를 들어 줄기세포는 CISH 단백질을 발현하지 않거나 기능적 CISH 단백질을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 CISH를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 CISH가 발현되지 않도록 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 CISH(즉, CISH, 사이토카인 유도성 SH2-포함 단백질)를 인코딩하는 유전자가 녹아웃되도록 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGFβRII 또는 CISH를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 TGFβRII 또는 CISH 각각이 발현되지 않도록 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 줄기세포는 동일한 세포에서 TGFβRII를 인코딩하는 유전자 및 CISH를 인코딩하는 유전자가 녹아웃되도록 유전자 조작된다(이중 KO). 일부 구현예에서, 줄기세포는 세포의 게놈 내에서, 예를 들어 CIS 단백질을 인코딩하는 유전자와 같이, 예를 들어, IL-15 신호전달 또는 예를 들어, TGF 베타 RII 단백질을 인코딩하는 유전자와 같은 TGF 신호전달, 예를 들어, TGF 베타 신호전달에 관여하는 유전자 산물을 인코딩하는 유전자를 교란하기 위해, 예를 들어 CRISPR/Cas 편집 또는 다른 적합한 기술을 통해 편집되었다. 일부 구현예에서, 예를 들어, TGF 신호전달 및/또는 IL-15 신호전달에 관여하는 유전자 산물을 인코딩하는 유전자의 2개의 카피 또는 대립유전자가 세포에 존재하는 구현예에서, 세포는 변형(예를 들어, 편집)되어, 예를 들어 유전자의 발현 또는 유전자에 의해 인코딩된 기능적 유전자 산물의 발현이 두 대립 유전자로부터 교란, 감소 또는 제거되는 경우에 두 카피 또는 대립유전자가 모두 변형된다.
일부 구현예에서, 액티빈은 액티빈 A이다. 일부 구현예에서, 배지는 TGFβ를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 배양은 소정의 기간(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12일 이상) 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 배양 단계 동안 또는 그 후에 하나 이상의 시기에, 인간 줄기세포는 만능성을 유지한다(예를 들어, 하나 이상의 만능성 척도를 나타냄). 일부 구현예에서, 배양 단계 동안 또는 그 후에 하나 이상의 시기에, 인간 줄기세포는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-카드헤린, UTF-1, Oct4, Rex1 및 Nanog 중 하나 이상의 검출 가능한 수준을 발현한다. 일부 구현예에서, 배양 단계 동안 또는 그 후의 시간에, 인간 줄기세포는 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 배엽 세포로 분화하는 능력을 보유한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 (i) 배아 줄기세포 또는 유도된 만능성 줄기세포 및 (ii) 액티빈을 포함하는 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물을 특징으로 하고, 배아 줄기세포 또는 유도된 만능성 줄기세포는 TGFβRII 및/또는 CISH가 발현되지 않도록 유전자 조작된다.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 Cas12a 변이체이다. 일부 구현예에서, Cas12a 변이체는 M537R, F870L 및 H800A로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 변이체는 아미노산 치환 M537R, F870L 및 H800A를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12a 변이체는 SEQ ID NO: 1148에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 교시는 첨부 도면과 함께 읽을 때 다양한 예시적인 구현예의 다음 설명으로부터 더 완전히 이해될 것이다. 아래에 기재된 도면은 단지 예시를 위한 것이며 본 교시의 범위를 어떤 식으로든 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
도 1은 액티빈 A(1 ng/ml 또는 4 ng/ml ActA)의 부재 또는 존재 하에 다양한 배지에서 성장한 인간 유도된 만능성 줄기세포(hiPSC)의 만능성 마커의 세포 형태 및 유세포측정의 현미경 검사를 나타낸다.
도 2는 액티빈 A(1 ng/mL, 2 ng/mL, 4 ng/mL 또는 10 ng/mL)의 존재 또는 부재 하의 배지에서 배양된 TGFβRII 녹아웃 hiPSC(클론 7) 또는 CISH/TGFβRII DKO hiPSC(클론 7)의 형태를 나타낸다.
도 3은 액티빈 A(1 ng/mL, 2 ng/mL, 4 ng/mL, 또는 10 ng/mL)의 존재 또는 부재 하의 배지에서 배양된 TGFβRII 녹아웃 hiPSC(클론 9)의 형태를 나타낸다.
도 4a는 단일 녹아웃 및 이중 녹아웃 hiPSC에 대한 CISH 및 TGFβRII 유전자좌에서의 대규모 편집률을 나타낸다.
도 4b는 액티빈 A에서 배양된 TGFβRII 녹아웃 hiPSC, CISH 녹아웃 hiPSC 및 이중 녹아웃 hiPSC에서 Oct4 및 SSEA4의 발현을 나타낸다.
도 5는 액티빈 A에서 배양된 TGFβRII 녹아웃 hiPSC, CISH 녹아웃 hiPSC 및 이중 녹아웃 hiPSC에서 Nanog 및 Tra-1-60의 발현을 나타낸다.
도 6은 STEMdiff™ Trilineage 분화 키트(STEMCELL Technologies Inc.)와 관련된 절차의 개략도이다.
도 7a는 액티빈 A에서 배양된 TGFβRII 녹아웃 hiPSC, CISH 녹아웃 hiPSC 및 이중 녹아웃 hiPSC의 분화 마커의 발현을 나타낸다.
도 7b는 액티빈 A에서 배양된 TGFβRII/CISH 이중 녹아웃 hiPSC의 핵형을 나타낸다.
도 7c는 편집되지 않은 모 PSC 주, 편집된 TGFβRII KO 클론(C7) 및 RUCDR로 명명된 추가의 대표적인(편집되지 않은) 세포주에서 수행된 확장된 액티빈 A 농도 곡선을 나타낸다. 각 주를 유지하는데 필요한 액티빈 A의 최소 농도는 모 대조군과 비교하여 더 높은 기준 양의 액티빈 A가 필요한 TGFβRII KO 클론에 따라 약간 다르다(0.5 ng/ml 대 0.1 ng/ml).
도 7d는 기본 배지 단독(보충 액티빈 A 부재)과 함께 배양될 때 편집되지 않은 모 PSC 주, 편집된 TGFβRII KO 클론(C7) 및 편집되지 않은 RUCDR 세포주에서의 줄기성 마커 발현을 나타낸다. TGFβRII KO iPSC는 줄기성 마커 발현을 유지하지 않고, 두 개의 편집되지 않은 주는 E8에서 줄기성 마커 발현을 유지할 수 있었다.
도 8a는 편집된 iPSC 클론을 생성한 후 강화된 CD56+ iNK 세포로의 분화 및 특성화를 위한 예시적인 방법의 개략도이다.
도 8b는 분화 과정의 제2 단계 동안 STEMDiff APEL2를 이용하는 iNK 세포 분화 과정의 개략도이다.
도 8c는 분화 과정의 제2 단계 동안 15% 혈청을 포함하는 NK-MACS를 이용하는 iNK 세포 분화 과정의 개략도이다.
도 8d는 각각 도 8c 및 도 8b에 도시된 바와 같이 NK-MACS 또는 Apel2 방법을 사용하여 분화될 때 분화 39일차에 편집되지 않은 PCS 유래 iNK 세포의 확장 배수 및 CD45 및 CD56을 발현하는 iNK 세포의 백분율을 나타낸다.
도 8e는 각각 도 8c 및 도 8b에 도시된 바와 같이 NK-MACS 또는 APEL2 방법을 사용하여 분화될 때 편집되지 않은 PCS iPSC로부터 유래된 분화된 iNK 세포의 표면 발현 표현형(집단의 백분율로 측정됨)의 히트 맵을 상부 패널에 나타낸다. 하단 패널에는 두 가지 방법으로 생성된 iNK의 차이를 설명하기 위해 대표적인 히스토그램 그래프가 표시된다.
도 8f는 각각 도 8c 및 도 8b에 도시된 바와 같이 NK-MACS 또는 APEL2 방법을 사용하여 분화될 때 분화된 편집된 iNK(TGFβRII 녹아웃, CISH 녹아웃 및 이중 녹아웃(DKO)) 및 편집되지 않은 모 iPSC(WT)의 표면 발현 표현형(집단의 백분율로 측정됨)의 히트 맵을 나타낸다.
도 8g는 각각 도 8c 및 도 8b에 도시된 바와 같이 NK-MACS 또는 APEL2 방법을 사용하여 분화될 때 편집되지 않은 iNK 세포 효과기 기능을 나타낸다.
도 9는 모 야생형 클론과 비교하여 편집된 클론(TGFβRII 녹아웃, CISH 녹아웃 및 이중 녹아웃)의 분화 표현형을 나타낸다.
도 10은 모 클론 iNK 및 야생형 세포와 비교하여 편집된 iNK(TGFβRII 녹아웃, CISH 녹아웃 및 이중 녹아웃)의 표면 발현 표현형을 나타낸다.
도 11a는 모 클론 iNK("WT") 및 말초 혈액 유래 자연 살해 세포와 비교하여 편집된 iNK(TGFβRII 녹아웃, CISH 녹아웃 및 이중 녹아웃)의 표면 발현 표현형을 나타낸다.
도 11b는 모 클론 iNK 세포("편집되지 않은 iNK 세포")와 비교하여 편집된 iNK 세포(TGFβRII/CISH 이중 녹아웃)의 표면 발현 표현형을 보여주는 유세포측정 히스토그램 그래프이다.
도 11c는 hiPSC 분화 후 25일차, 32일차 및 39일차에 모 클론 iNK 세포("편집되지 않은 iNK 세포")와 비교하여 편집된 iNK 세포(TGFβRII/CISH 이중 녹아웃)의 표면 발현 표현형(집단의 백분율로 측정)을 나타낸다(적어도 5개의 개별 분화의 평균값).
도 11d는 IL-15 유도된 활성화 후 10분 및 120분째에 모 클론 CD56+ iNK 세포("편집되지 않은 iNK")와 비교하여 편집된 CD56+ iNK 세포("CISH KO iNK")의 pSTAT3 발현 표현형(집단의 백분율로 측정)을 나타낸다. 간단히 말해서, 39일차 또는 40일차 iNK를 사이토카인 결핍 조건에서 전날 플레이팅한다. 다음날 세포를 표시된 시간 동안 10 ng/ml의 IL15로 자극한다. 세포를 시점의 끝에서 즉시 고정시키고, CD56에 대해 염색한 후 세포내 염색을 수행한다. 세포를 NovoCyte Quanteon에서 처리하고 데이터를 FlowJo에서 분석하였다. 표시된 데이터는 수행된 3회 초과의 실험의 대표 실험이다.
도 11e는 IL-15 및 TGF-β 유도된 활성화 후 10분 및 120분째에 모 클론 CD56+ iNK 세포("편집되지 않은 iNK 세포")와 비교하여 편집된 CD56+ iNK 세포(TGFβRII/CISH 이중 녹아웃, "DKO iNK")의 pSMAD2/3 발현 표현형(집단의 백분율로 측정)을 나타낸다. 간단히 말해서, 39일차 또는 40일차 iNK를 사이토카인 결핍 조건에서 전날 플레이팅하였다. 다음날 세포를 표시된 시간 동안 10 ng/ml의 IL-15 및 50 ng/ml의 TGF-β로 자극했다. 세포를 시점의 끝에서 즉시 고정시키고, CD56에 대해 염색한 후 세포내 염색을 수행하였다. 세포를 NovoCyte Quanteon에서 처리하고 데이터를 FlowJo에서 분석하였다. 표시된 데이터는 수행된 3회 초과의 실험의 대표 실험이다.
도 11f는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA) 및 이오노마이신(IMN) 자극의 존재 또는 부재 하에 모 클론 CD56+ iNK 세포(편집되지 않은 iNK, "WT IFNg")와 비교하여 편집된 CD56+ iNK 세포(TGFβRII/CISH 이중 녹아웃, "DKO IFNg")의 IFN-γ 발현 표현형(집단의 백분율로 측정)을 나타낸다. 데이터는 대표예이다. 이는 단일 분화에서 생성되며 검정의 각 조건은 2개의 기술적 이중 반복 실험으로 실행된다. **p<0.05 대 편집되지 않은 iNK 세포(이원 t 테스트).
도 11g는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA) 및 이오노마이신(IMN) 자극의 존재 또는 부재 하에 모 클론 CD56+ iNK 세포(편집되지 않은 iNK 세포, "WT TNFa")와 비교하여 편집된 CD56+ iNK 세포(TGFβRII/CISH 이중 녹아웃, "DKO TNFα")의 TNF-α 발현 표현형(집단의 백분율로 측정)을 나타낸다. 데이터는 대표예이다. 이는 단일 분화에서 생성되며 검정의 각 조건은 2개의 기술적 이중 반복 실험으로 실행된다. **p<0.05 대 편집되지 않은 iNK 세포(이원 t 테스트).
도 12a는 IL-15 및 TGF-β의 존재 또는 부재 하에 SK-OV-3 난소 세포를 사멸시키기 위해 편집된 iNK 세포(TGFβRII/CISH 이중 녹아웃)의 사용을 도시하는, 예시적인 고형 종양 세포 사멸 검정의 개략도이다.
도 12b는 도 12a에 기재된 바와 같은 고형 종양 사멸 검정의 결과를 나타낸다. iNK 세포는 종양 세포 스페로이드(spheroid) 크기를 감소시키는 기능을 한다. 특정 편집된 iNK 세포(CISH 단일 녹아웃, "CISH_2, 4, 5 및 8")는 모 클론 iNK 세포("WT_2")와 크게 다르지 않고, 특정 편집된 iNK 세포(TGFβRII 단일 녹아웃, "TGFβRII_7" 및 TGFβRII/CISH 이중 녹아웃 "DKO")는 모 클론 iNK 세포("WT_2")와 비교하여 TGF-β의 존재 하에 측정할 때 1 이상의 효과기-표적(E:T) 비율에서 유의하게 더 잘 기능했다. ****p<0.0001 대 편집되지 않은 iNK 세포(이원 ANOVA, Sidak의 다중 비교 시험).
도 12c는 편집되지 않은 iNK 세포와 비교하여 편집된 iNK 세포 효과기 기능을 나타낸다.
도 13은 10 ng/ml의 IL-15 및 10 ng/ml의 TGF-β의 존재 하에 iNK 세포가 혈액암 세포(예를 들어, Nalm6 세포)로 연속 유발 시험된 시험관내 연속 사멸 검정의 결과를 나타내고; X축은 시간을 나타내고, 종양 세포는 48시간마다 추가되고 Y축은 정규화된 총 적색 물질 영역(예를 들어, 종양 세포의 존재)으로 측정된 사멸 효능을 나타낸다. 데이터는 편집된 iNK 세포(TGFβRII/CISH 이중 녹아웃)가 혈액암 세포를 계속 사멸시키며, 편집되지 않은 iNK 세포는 균등한 시점에서 이 기능을 손실한다는 것을 나타낸다.
도 14는 1 ng/mL 또는 10 ng/mL IL-15의 존재 하에 배양된 경우 hiPSC 분화 후 25일차, 32일차 및 39일차에 모 클론 iNK 세포("WT")와 비교하여, 특정 편집된 iNK 클론 세포(CISH 단일 녹아웃 "CISH_C2, C4, C5 및 C8", TGFβRII 단일 녹아웃 "TGFβRII-C7" 및 TGFβRII/CISH 이중 녹아웃 "DKO-C1")의 표면 발현 표현형(집단의 백분율로 측정)을 나타낸다.
도 15a는 생체내 종양 사멸 검정의 개략도이다. 마우스에 1 x 106 SKOV3-luc 세포를 복강내 접종하고, 마우스를 무작위화하고, 4일 후, 20 x 106 iNK 세포를 복강내 도입하였다. 종양 이식 후 최대 60일 동안 마우스를 추적했다. X축은 이식 후 시간을 나타내고 Y축은 총 생물발광(p/s)으로 측정한 사멸 효능을 나타낸다.
도 15b는 도 15a에 기재된 바와 같은 생체내 종양 사멸 검정의 결과를 나타낸다. 개별 마우스는 각 가로선으로 표시된다. 데이터는 편집되지 않은 iNK 세포("편집되지 않은 iNK") 및 DKO 편집된 iNK 세포(TGFβRII/CISH 이중 녹아웃)가 비히클보다 종양 성장을 더 잘 방지하고, 편집된 iNK 세포는 생체내에서 비히클보다 종양 세포를 훨씬 더 잘 사멸시킨다는 것을 나타낸다. 각 실험 그룹에는 각각 9마리의 동물이 있었다. ***p< 0.001, ****p<0.0001, 2원 ANOVA 분석.
도 15c는 도 15b에 기재된 생체내 종양 사멸 검정의 평균의 표준 오차를 갖는 평균 결과를 나타낸다. 마우스의 집합은 각 가로선으로 표시된다. 데이터는 DKO 편집된 iNK 세포(TGFβRII/CISH 이중 녹아웃) 둘 모두가 생체내에서 비히클 또는 편집되지 않은 iNK 세포보다 종양 성장을 방지하고 종양 세포를 훨씬 더 잘 사멸시킨다는 것을 나타낸다. ***p<0.001, ****p<0.0001, 2원 ANOVA 분석.
도 16a는 hiPSC 분화 후 25일차, 32일차 및 39일차 또는 28일차, 36일차 및 39일차에 모 클론 iNK 세포(" PCS_WT")와 비교하여 대규모 편집된 iNK 세포(좌측 패널 - ADORA2A 단일 녹아웃) 또는 특정 편집된 iNK 클론 세포 (우측 패널 - ADORA2A 단일 녹아웃)의 표면 발현 표현형(집단의 백분율로 측정)을 나타낸다. 데이터는 다중 분화의 대표값이다.
도 16b는 모 클론 iNK 세포("편집되지 않은 iNK")와 비교하여 편집된 iNK 클론 세포(ADORA2A 단일 녹아웃)에 대한 5'-(N-에틸카복사미도)아데노신("NECA", 아데노신 작용제) 활성화 후 사이클릭 AMP(cAMP) 농도 표현형을 나타낸다. Y축은 nM 단위의 평균 cAMP 농도(ADORA2A 활성화에 대한 프록시)를 나타내고 X축은 nM 단위의 NECA 농도를 나타낸다.
도 16c는 100 μM NECA 및 10 ng/ml의 IL-15의 존재 하에 iNK 세포가 혈액암 세포(예를 들어, Nalm6 세포)로 연속 유발 시험된 시험관내 연속 사멸 검정의 결과를 나타내고; X축은 시간을 나타내고, 종양 세포는 48시간마다 추가되고 Y축은 총 적색 물질 영역(예를 들어, 종양 세포의 존재)으로 측정된 사멸 효능을 나타낸다. 데이터는 편집된 iNK 세포("ADORA2A KO iNK")가 아데노신 억제를 모방하는 조건 하에 편집되지 않은 iNK 세포("Ctrl iNK")보다 혈액암 세포를 더 효과적으로 사멸시킨다는 것을 나타낸다.
도 17a는 hiPSC 분화 후 25일차, 32일차 및 39일차에 모 클론 iNK 세포("WT_2" )와 비교하여 특정 편집된 iNK 클론 세포(TGFβRII/CISH/ADORA2A 삼중 녹아웃, "CRA_6" 및 "CR+A_8")의 표면 발현 표현형(집단의 백분율로 측정)을 나타낸다. 데이터는 다중 분화의 대표값이다.
도 17b는 모 클론 iNK 세포("편집되지 않은 iNK")와 비교하여 편집된 iNK 클론 세포(TGFβRII/CISH/ADORA2A 삼중 녹아웃, "TKO iNK")에 대한 NECA(아데노신 작용제) 활성화 후의 사이클릭 AMP(cAMP) 농도 표현형을 나타낸다. Y축은 nM 단위의 평균 cAMP 농도(ADORA2A 활성화에 대한 프록시)를 나타내고 X축은 nM 단위의 NECA 농도를 나타낸다.
도 17c는 IL-15 부재 하에 도 12a에 기재된 고형 종양 사멸 검정의 결과를 나타낸다. iNK 세포는 종양 세포 스페로이드 크기를 감소시키는 기능을 한다. Y축은 전체 혼입된 적색 물질(예를 들어, 종양 세포의 존재)를 측정한 것이고 X축은 효과기 대 표적(E:T) 세포 비율을 나타낸다. 편집된 iNK 세포(ADORA2A 단일 녹아웃 "ADORA2A", TGFβRII/CISH 이중 녹아웃 "DKO" 또는 TGFβRII/CISH/ADORA2A 삼중 녹아웃 "TKO")는 모 클론 iNK 세포("대조군")와 비교하여 TGF-β의 존재 하에 측정했을 때 더 낮은 EC50 비율을 가졌다(적어도 3개의 개별 분화로부터의 평균값).
도 18은 iPSC에서 시험관내 편집을 사용하는 유전자좌 TGFβRII, CISH, ADORA2A, TIGIT 및 NKG2A에 대한 가이드 RNA 선택 검정의 결과를 나타낸다.
본 개시내용의 일부 양태는 놀랍게도 줄기세포, 예를 들어 배아 줄기세포 또는 유도된 만능성 줄기세포가 액티빈 A를 포함하는 배양 배지에서 배양될 수 있고, 배양 배지 내 액티빈의 존재는 배양 배지 내 TGF 신호전달 작용제, 예를 들어 TGF 베타의 존재에 대한 요건을 제거한다는 인식에 적어도 부분적으로 기반한다. 본 개시내용의 일부 양태는 놀랍게도, 예를 들어 인간 배아 줄기세포 또는 인간 유도된 만능성 줄기세포와 같은 인간 줄기세포를 포함하는 줄기세포가 액티빈, 예를 들어, 액티빈 A를 포함하는 배지에서 배양될 때, 예를 들어 TGF 베타와 같은 TGF 베타 신호전달 작용제가 배양 배지 내에 존재하지 않는 경우에도 그의 만능성을 유지한다는 인식에 관한 것이다. 추가로, 본 개시내용은 놀랍게도 TGFβIIR이 부재하는 iPSC(예를 들어, 유전자 편집을 통해 유전자가 녹아웃됨)가 액티빈을 포함하는 배양 배지에서 배양될 수 있고 그러한 세포는 성장할뿐만 아니라, 그의 만능성을 유지한다는 인식에 부분적으로 기반한다. 본 개시내용은 배아 줄기세포 및 액티빈을 포함하는 배양 배지를 포함하는 세포 배양물뿐만 아니라, 이러한 줄기세포 및/또는 그의 자손을 배양하는 방법을 추가로 포함한다.
정의 및 약어
달리 명시되지 않는 한, 다음 용어 각각은 이 섹션에 기재된 의미를 갖다.
단수형 부정관사("a" 및 "an")는 관련 명사 중 적어도 하나를 지칭하며, 용어 "적어도 하나" 및 "하나 이상"과 상호 혼용된다. 접속사 "또는" 및 "및/또는"은 비배타적 분리로 상호 혼용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "암"(또한 용어 "과증식성" 및 "신생물성"과 상호 혼용됨)은 자가 성장 능력을 갖는 세포, 즉 빠른 증식 세포 성장을 특징으로 하는 비정상적인 상태 또는 질병을 지칭한다. 암성 질환 상태는 병리, 즉, 질환 상태, 예를 들어, 악성 종양 성장을 특징으로 하거나, 이로 이루어진 것으로 분류될 수 있거나, 비병리, 즉, 정상으로부터 이탈되었으나, 질환 상태, 예를 들어, 상처 복구와 관련된 세포 증식과 관련되지 않은 것으로 분류될 수 있다. 이 용어는 조직병리학적 유형 또는 침습성 단계에 관계없이 모든 유형의 암성 성장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, "암"은 폐, 유방, 갑상선, 림프계, 위장관 및 비뇨생식기관과 같은 다양한 기관계의 악성 또는 이의 발병을 포함한다. 일부 구현예에서, "암"은 대부분의 결장암, 신세포 암종, 전립선암 및/또는 고환 종양, 폐의 비-소세포 암종, 소장암 및/또는 식도암과 같은 악성 종양을 포함하는 선암종을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "암종"은 호흡기계 암종, 위장계 암종, 비뇨생식기계 암종, 고환 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 내분비계 암종 및 흑색종을 포함하는 상피 또는 내분비 조직의 악성 종양을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 암종은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예시적인 암종은 자궁경부, 폐, 전립선, 유방, 두경부, 결장 및 난소의 조직으로부터 형성되는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 암종은 또한 예를 들어 암종 및 육종 조직으로 이루어진 악성 종양을 포함하는 암육종을 포함한다. 일부 구현예에서, "선암종"은 선 조직으로부터 유래되거나 종양 세포가 인식가능한 선 구조를 형성하는 암종이다. 일부 구현예에서, "육종"은 당업계에 인정되고 중간엽 유래의 악성 종양을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "분화"는 특화되지 않거나("수임되지 않거나"), 덜 특화된 세포가, 예를 들어 혈액 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 일부 구현예에서, 분화 또는 분화-유도된 세포는 세포 계통 내에서 보다 특화된("수임된") 위치를 취한 세포이다. 예를 들어, iPSC는 세포 배양 배지에서 적절한 분화 인자로 처리하면 더욱 분화된 다양한 세포 유형, 예를 들어 신경 또는 조혈 줄기세포, 림프구, 심근세포 및 다른 세포 유형으로 분화될 수 있다. 일부 구현예에서, 만능성 및 다능성 세포 유형을 보다 분화된 세포 유형으로 분화시키기 위한 적합한 방법, 분화 인자 및 세포 배양 배지는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 용어 "수임된"은 분화 과정에 적용되어 정상 상황에서 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위 집합으로 분화하거나 계속 분화할 지점까지 분화 경로를 통해 진행하고, 정상적인 상황에서는 다른 세포 유형(특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위 집합 제외)으로 분화하지 못하거나 덜 분화된 세포 유형으로 전환될 수 없는 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "분화 마커", "분화 마커 유전자" 또는 "분화 유전자"는 발현이 만능성 세포와 같은 세포 내에서 일어나는 세포 분화를 나타내는 유전자 또는 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 분화 마커 유전자는 하기 유전자를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: CD34, CD4, CD8, CD3, CD56(NCAM), CD49, CD45; NK 세포 수용체(분화 16의 덩어리(CD16)), 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D), CD69, NKp30, NKp44, NKp46, CD158b, FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GAT A3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, T 유전자(단미증), ZIC1, GATA1, GATA2, HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH4, PAX5, RBPJ, RUNX1, STAT1 및 STAT3.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "분화 마커 유전자 특성" 또는 "분화 유전자 특성", "분화 유전자 발현 특성", "분화 유전자 발현 시그니처", "분화 유전자 발현 패널", "분화 유전자 패널" 또는 "분화 유전자 시그니처"는 복수의 분화 마커 유전자의 발현 또는 발현 수준을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "편집된 iNK 세포"는 세포 발생의 어떤 시점에서 적어도 하나의 유전자의 적어도 하나의 발현 산물을 변화시키도록 변형된 자연 살해 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 변형은 예를 들어 CRISPR-Cas 또는 예를 들어 우성-음성 작제물과 같은 유전자 편집 기술을 사용하여 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, iNK 세포는 iNK 세포로 분화되기 전의 시점, 예를 들어 전구체 단계, 줄기세포 단계 등에서 편집된다. 일부 구현예에서, 편집된 iNK 세포는 편집되지 않은 iNK 세포와 비교된다(iPSC 세포의 분화에 의해 생성된 NK 세포, iPSC 세포 및/또는 iNK 세포는 변형, 예를 들어 유전자 변형되지 않음).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "배아 줄기세포"는 배아 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래된 만능성 줄기세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 배아 줄기세포는 만능성이고 발생 동안 3개의 1차 배엽: 외배엽, 내배엽 및 중배엽의 모든 유도체를 발생시킨다. 이러한 일부 구현예에서, 배아 줄기세포는 배아외 막 또는 태반에 관여하지 않으며, 즉, 만능성이 아니다.
핵산(예를 들어, 유전자, 단백질-인코딩 게놈 영역, 프로모터)과 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "내인성"은 천연 위치, 예를 들어 세포의 게놈 내의 천연 핵산 또는 단백질을 지칭한다.
핵산, 예를 들어 발현 작제물, cDNA, 삽입결실 및 핵산 벡터와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "외인성"은 예를 들어, 유전자 편집 또는 유전 공학 기술, 예를 들어 CRISPR 기반 편집 기술을 사용하여 세포의 게놈 내로 인공적으로 도입된 핵산을 지칭한다.
"게놈 편집 시스템"이라는 용어는 RNA-가이드된 DNA 편집 활성을 갖는 임의의 시스템을 지칭한다.
"가이드 RNA" 및 "gRNA"라는 용어는 Cas9 또는 Cpf1(Cas12a)과 같은 RNA-가이드된 뉴클레아제와 세포의 게놈 또는 에피솜 서열과 같은 표적 서열의 특이적 결합(또는 "표적화")을 촉진하는 임의의 핵산을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "조혈 줄기세포" 또는 "완성 조혈 줄기세포"는 CD34-양성 줄기세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, CD34-양성 줄기세포는 성숙한 골수 및/또는 림프 세포 유형을 발생시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 골수 및/또는 림프 세포 유형은 예를 들어 T 세포, 자연 살해 세포 및/또는 B 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유도된 만능성 줄기세포" 또는 "iPSC"는 재프로그래밍(예를 들어, 탈분화)으로 지칭되는 과정에 의해 분화된 체세포(예를 들어, 성체, 신생아 또는 태아 세포)로부터 획득된 줄기세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 재프로그래밍된 세포는 3개의 모든 배 또는 진피층, 즉 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 조직으로 분화할 수 있다. iPSC는 천연으로 존재하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "다능성 줄기세포"는 하나 이상의 배엽(외배엽, 중배엽 및 내배엽)의 세포로 분화할 수 있는 발생 잠재력을 갖지만 3개의 배엽 모두로 분화할 수 있는 것은 아닌 세포를 지칭한다. 따라서, 일부 구현예에서, 다능성 세포는 또한 "부분적으로 분화된 세포"로 지칭될 수 있다. 다능성 세포는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 다능성 세포의 예로는 조혈 줄기세포 및 신경 줄기세포와 같은 성체 줄기세포가 있다. 일부 구현예에서, "다능성"은 세포가 소정의 계통에서 많은 유형의 세포를 형성할 수 있지만 다른 계통의 세포는 형성하지 않을 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 다능성 조혈 세포는 다양한 유형의 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 등)를 형성할 수 있지만 뉴런을 형성할 수는 없다. 따라서, 일부 구현예에서, "다능성"은 전능성 및 만능성 미만인 발생 잠재력의 정도를 갖는 세포의 상태를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "만능성"은 신체 또는 체세포(즉, 고유 배아) 또는 소정의 유기체(예를 들어, 인간)의 모든 계통을 형성하는 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 배아 줄기세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 3개의 배엽 각각에서 세포를 형성할 수 있는 일종의 만능성 줄기세포이다. 일반적으로, 만능성은 완전한 유기체를 생성할 수 없는 불완전하거나 부분적 만능성 세포(예를 들어, 배반엽 줄기세포 또는 EpiSC)에서 완전한 유기체를 생성할 수 있는 보다 원시적이고 보다 만능성 세포(예를 들어, 배아 줄기세포 또는 유도된 만능성 줄기세포)에 이르는 발생 능력의 연속체로 기재될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "만능성"은 3개의 배엽(외배엽, 중배엽 및 내배엽) 모두의 세포로 분화할 수 있는 발생 잠재력을 갖는 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 만능성은 부분적으로 세포의 만능성 특성을 평가함으로써 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 만능성 특징은 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: (i) 만능성 줄기세포 형태; (ii) 무제한 자기 재생의 잠재력; (iii) SSEA1 (마우스 단독), SSEA3/4, SSEA5, TRA1- 60/81, TRAl-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 및/또는 CD50을 포함하지만 이에 제한되지 않는 만능성 줄기세포 마커의 발현; (iv) 3개의 체세포 계통(외배엽, 중배엽 및 내배엽) 모두로 분화하는 능력; (v) 3개의 체세포 계통으로 이루어진 기형종 형성; 및 (vi) 3개의 체세포 계통의 세포로 이루어진 배아유사체의 형성.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "만능성 줄기세포 형태"는 배아 줄기세포의 통상적인 형태학적 특징을 지칭한다. 일부 구현예에서, 정상 배아 줄기세포 형태는 높은 핵-대-세포질 비율, 핵소체의 현저한 존재 및 통상적인 세포간 간격을 갖는 작고 둥근 형태를 특징으로 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드"("뉴클레오타이드 서열", "핵산", "핵산 분자", "핵산 서열" 및 "올리고뉴클레오타이드"를 포함하지만 이에 제한되지 않음)는 일련의 DNA 및 RNA의 뉴클레오타이드 염기("뉴클레오타이드"라고도 함)를 지칭하며, 임의의 2개 이상의 뉴클레오타이드의 사슬을 의미한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 서열, 핵산 등은 단일 가닥 또는 이중 가닥의 키메라 혼합물 또는 유도체 또는 변형된 형태일 수 있다. 이러한 일부 구현예에서, 변형은 예를 들어 분자의 안정성, 그의 혼성화 매개변수 등을 개선하기 위해 염기 모이어티, 당 모이어티 또는 포스페이트 골격에서 이루어질 수 있다. 일반적으로, 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 단백질 및 효소를 생성하는 세포 기전에 의해 사용되는 정보를 포함하지만 이에 제한되지 않는 유전 정보를 전달한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 및/또는 유전 정보는 이중 가닥 또는 단일 가닥 게놈 DNA, RNA, 임의의 합성 및 유전자 조작된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 센스 및/또는 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 변형된 염기를 포함한다.
종래의 IUPAC 표기법은 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 본 명세서에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 사용된다(본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Cornish-Bowden A, Nucleic Acids Res. 1985 May 10; 13(9):3021-30] 참조). 그러나, "T"는 서열이 DNA 또는 RNA에 의해 인코딩될 수 있는 경우에서, 예를 들어 gRNA 표적화 도메인에서 "티민 또는 우라실"을 나타냄을 주지해야 한다.
[표 1]
IUPAC 핵산 표기법
Figure pct00001
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "역가" 또는 "발생 효능"은 특히, 예를 들어 세포 발생 잠재력의 관점에서 세포에 근접할 수 있는 모든 발생 옵션(즉, 발생 효능)의 합계를 지칭하며, 일부 구현예에서, 세포 효능의 연속체는 전능성 세포, 만능성 세포, 다능성 세포, 올리고능성 세포, 단능성 세포 및 최종 분화된 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 포유류, 예를 들어 인간에서 (a) 질환을 피하거나 예방하는 것; (b) 질환에 대한 소인에 영향을 미치는 것; 또는 (c) 질환의 적어도 하나의 증상의 발병을 예방하거나 지연시키는 것을 포함하는 질환의 예방을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는, 펩타이드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산의 순차적인 사슬을 지칭하는 데 통용된다. 이러한 용어는 개별 단백질, 함께 연관되는 단백질의 그룹 또는 복합체, 뿐만 아니라 이러한 단백질의 단편 또는 부분, 변이체, 유도체 및 유사체를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 펩타이드 서열은 종래의 표기법을 사용하여, 좌측에서 아미노 또는 N-말단으로 시작하고 우측에서 카르복실 또는 C-말단까지 진행되어 본 명세서에 제시된다. 표준 1-글자 또는 3-글자 약어가 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "재프로그래밍" 또는 "탈분화" 또는 "세포 효능 증가" 또는 "발생 효능 증가"는 세포의 효능을 증가시키거나 세포를 덜 분화된 상태로 탈분화시키는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 증가된 세포 효능을 갖는 세포는 재프로그래밍되지 않은 상태의 동일한 세포와 비교하여 더 많은 발생 가변성을 갖는다(즉, 더 많은 세포 유형으로 분화할 수 있음). 즉, 일부 구현예에서, 재프로그래밍된 세포는 재프로그래밍되지 않은 상태의 동일한 세포보다 덜 분화된 상태에 있는 세포이다. 일부 구현예에서, "재프로그래밍"은 체세포 또는 다능성 줄기세포를 유도된 만능성 줄기세포 또는 iPSC라고도 하는 만능성 줄기세포로 탈분화시키는 것을 지칭한다. 체세포 또는 다능성 줄기세포로부터 iPSC를 생성하기 위한 적합한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
용어 "RNA-가이드된 뉴클레아제" 및 "RNA-가이드된 뉴클레아제 분자"는 본 명세서에서 상호 혼용된다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 RNA-가이드된 DNA 엔도뉴클레아제 효소이다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 CRISPR 뉴클레아제이다. RNA-가이드된 뉴클레아제의 비제한적인 예는 하기 표 2에 나열되어 있고, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 본 명세서에 개시되거나 당업자에게 공지된 RNA-가이드된 뉴클레아제의 임의의 조합을 사용할 수 있다. 당업자는 본 개시내용의 관점에서 사용하기에 적합한 추가의 뉴클레아제 및 뉴클레아제 변이체를 인지할 것이며, 본 개시내용은 이러한 점에서 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다.
[표 2]
RNA 가이드된 뉴클레아제
Figure pct00002
Figure pct00003
추가의 적합한 RNA-가이드된 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9 및 Cas12 뉴클레아제는 본 개시내용의 관점에서 당업자에게 명백할 것이고, 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 예시적인 적합한 뉴클레아제에 의해 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 적합한 뉴클레아제는 Cas9 또는 Cpf1(Cas12a) 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 또한 뉴클레아제 변이체, 예를 들어 Cas9 또는 Cpf1 뉴클레아제 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 뉴클레아제의 야생형 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 특징으로 하는 아미노산 서열을 포함하는 뉴클레아제를 지칭하는 뉴클레아제 변이체이다. 일부 구현예에서, 적합한 뉴클레아제 및/또는 뉴클레아제 변이체는 또한 정제 태그(예를 들어, 폴리히스티딘 태그) 및/또는 예를 들어 핵 국재화 신호 서열을 포함하거나 이로 이루어진 신호전달 펩타이드를 포함할 수 있다. 적합한 뉴클레아제 및 뉴클레아제 변이체의 일부 비제한적 예는 본 명세서의 다른 부분에서 더 자세히 기재되어 있으며, 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 2019년 3월 14일자로 출원된 PCT 출원 제 PCT/US2019/22374호, "혈색소병증 치료를 위한 시스템 및 방법"에 기재된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 애시드아미노코커스 종(Acidaminococcus sp.) Cpf1 변이체(AsCpf1 변이체)이다. 일부 구현예에서, 적합한 AsCpf1 변이체를 포함하는 적합한 Cpf1 뉴클레아제 변이체는 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 공지되거나 명백할 것이며, 본 명세서에 개시되거나 그 외에는 당업계에 공지된 Cpf1 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 애시드아미노코커스 종 Cpf1 RR 변이체(AsCpf1-RR)이다. 다른 구현예에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 Cpf1 RVR 변이체이다. 예를 들어, 적합한 Cpf1 변이체는 M537R 치환, H800A 치환 및/또는 F870L 치환, 또는 이의 임의의 조합(AsCpf1 야생형 서열에 따른 넘버링 방식)을 갖는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 또는 비 인간 동물을 의미한다. 일부 구현예에서 인간 대상체는 임의의 연령(예를 들어, 태아, 유아, 소아, 청년 성인 또는 성인)일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 대상체는 질환의 위험이 있거나 질환을 앓을 수 있거나, 유전자 또는 특정 유전자의 조합의 변이가 필요 할 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 대상체는 포유류을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 비인간 동물일 수 있다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 비인간 영장류, 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니피그 등), 토끼, 개, 고양이 등이다. 본 개시내용의 특정 구현예에서, 비-인간 동물 대상체는 가축, 예를 들어 소, 말, 양, 염소 등이다. 특정 구현예에서, 비-인간 동물 대상체는 가금류, 예를 들어 닭, 칠면조, 오리 등이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 질환, 장애 또는 질병 또는 이의 하나 이상의 증상의 발병을 역전, 경감, 지연 또는 진행의 억제, 개선, 중증도 감소, 예방 또는 재발의 지연 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 질환, 장애 또는 질병의 하나 이상의 증상의 개선을 위한 임상적 개입을 지칭한다. 일부 구현예에서, 질병은 손상을 포함한다. 일부 구현예에서, 손상은 급성 또는 만성일 수 있다(예를 들어, 조직 손상과 같은 2차 상해를 유발하는 기저 질환 또는 장애로 인한 조직 상해). 일부 구현예에서, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 NK 세포 또는 변형된 NK 세포의 집합 형태의 치료는 하나 이상의 증상이 발생한 후 및/또는 질환이 진단된 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 치료는 예를 들어, 증상의 발병을 예방 또는 지연시키거나 질환의 발병 또는 진행을 억제하기 위해 증상이 없을 때 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서(예를 들어, 유전적 또는 다른 감수성 인자에 비추어), 증상의 발병 전에 감수성 개체에게 치료가 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 또한 예를 들어 증상의 재발을 예방하거나 지연시키기 위해 증상이 해결된 후에도 계속될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 질환, 장애 또는 질병의 하나 이상의 증상의 개선 및/또는 해결을 야기한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 기준 물질과 상당한 구조적 동일성을 나타내지만 기준 물질과 비교하여 하나 이상의 화학 물질의 존재 또는 수준에서 기준 물질과 구조적으로 다른 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 소분자와 같은 물질을 지칭한다. 많은 구현예에서, 변이체는 또한 기준 물질과 기능적으로 상이하다. 일반적으로 특정 물질이 기준 물질의 "변이체"로 적절하게 고려되는지는 기준 물질과의 구조적 동일성 정도를 기반으로 한다.
줄기세포
본 개시내용의 방법은 줄기세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 줄기세포는 일반적으로 변이되지 않은 딸 세포를 생성하고(자가 재생, 세포 분열은 모 세포와 동일한 적어도 하나의 딸 세포를 생성함) 특화된 세포 유형(역가)을 생성하는 능력을 가진 세포이다. 줄기세포에는 배아 줄기(ES) 세포, 배아 생식(EG) 세포, 생식 줄기(GS) 세포, 인간 중간엽 줄기세포(hMSC), 지방 조직 유래 줄기세포(ADSC), 다능성 성체 전구 세포(MAPC), 다능성 성체 생식 줄기세포(maGSC) 및 무제한 체세포 줄기세포(USSC)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로 줄기세포는 제한 없이 분열할 수 있다. 분열 후 줄기세포는 줄기세포로 남거나 전구체 세포가 되거나 최종 분화로 진행될 수 있다. 전구 세포는 적어도 하나의 소정의 세포 유형의 완전히 분화된 기능적 세포를 생성할 수 있는 세포이다. 일반적으로 전구 세포는 분열할 수 있다. 분열 후 전구 세포는 전구 세포로 남거나 최종 분화를 진행할 수 있다.
만능성 줄기세포는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 본 개시내용은 만능성 줄기세포와 관련된 기술(예를 들어, 시스템, 조성물, 방법 등)을 제공한다. 일부 구현예에서, 만능성 줄기세포는 (a) 면역결핍(SCID) 마우스에 이식될 때 기형종을 유도할 수 있고; (b) 세 배엽 모두의 세포 유형으로 분화할 수 있고/거나(예를 들어, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포 유형으로 분화할 수 있음); (c) 배아 줄기세포의 하나 이상의 마커를 발현하는(예를 들어, 인간 배아 줄기세포는 Oct 4, 알칼리성 포스파타제, SSEA-3 표면 항원, SSEA-4 표면 항원, nanog, TRA-1-60, TRA-1-81, SOX2, REX1 등을 발현함) 줄기세포이다. 일부 양태에서, 인간 만능성 줄기세포는 분화 마커의 발현을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 배양된 ES 세포 및/또는 iPSC는 그의 만능성을 유지한다(예를 들어, (a) 면역결핍(SCID) 마우스에 이식될 때 기형종을 유도할 수 있고; (b) 3개의 배엽 모두의 세포 유형으로 분화할 수 있고/거나(예를 들어, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포 유형으로 분화할 수 있음); (c) 배아 줄기세포의 하나 이상의 마커를 발현함).
일부 구현예에서, ES 세포(예를 들어, 인간 ES 세포)는 배반포 또는 손실배의 내부 세포 덩어리로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, ES 세포는 예를 들어 배아의 나머지 부분을 파괴하지 않고 배아의 하나 이상의 할구로부터 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, ES 세포는 체세포 핵 이식에 의해 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, ES 세포는 정자 또는 DNA에 이한 난세포의 수정, 핵 이식, 단위생식, 또는 예를 들어 HLA 영역에서 동형접합성을 갖는 ES 세포를 생성하기 위한 수단에 의해 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 ES 세포는 정자와 난자 세포의 융합, 핵 이식, 단위생식, 또는 염색질의 재프로그래밍 및 배아 세포의 생성을 위한 원형질막으로의 재프로그래밍된 염색질의 후속적인 혼입에 의해 생성된 접합자, 할구 또는 배반포 단계 포유류 배아로부터 생성되거나 유래될 수 있다. 예시적인 인간 ES 세포는 당업계에 공지되어 있고 MAO1, MAO9, ACT-4, No. 3, H1, H7, H9, H14 및 ACT30 ES 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 인간 ES 세포는 그의 공급원 또는 이를 생성하기 위해 사용되는 특정 방법에 관계없이, 예를 들어 (i) 3개의 배엽 모두의 세포로 분화하는 능력, (ii) 적어도 Oct-4 및 알칼리성 포스파타제의 발현 및/또는 (iii) 면역 저하 동물에 이식될 때 기형종을 생성하는 능력을 기반으로 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, ES 세포는 세포주로서 연속적으로 계대배양되었다.
iPSC
유도된 만능성 줄기세포(iPSC)는 특정 유전자의 발현을 유도함으로써 성체 체세포(예를 들어, 섬유아세포 또는 다른 적합한 체세포)와 같은 비-만능성 세포로부터 인공적으로 유도된 만능성 줄기세포의 한 유형이다. iPSC는 포유류과 같은 임의의 유기체에서 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, iPSC는 마우스, 랫트, 토끼, 기니피그, 염소, 돼지, 소, 비인간 영장류 또는 인간으로부터 생성된다. iPSC는 특정 줄기세포 유전자 및 단백질의 발현, 염색질 메틸화 패턴, 배가 시간, 배아유사체 형성, 기형종 형성, 생존 가능한 키메라 형성, 효능 및/또는 분화 잠재력과 같은 여러 측면에서 ES 세포와 유사하다. iPSC를 생성하기 위한 다양한 적합한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, iPSC는 특정 줄기세포 관련 유전자(예를 들어, Oct-3/4(Pouf51) 및 Sox2)를 성체 섬유아세포와 같은 비-만능성 세포로 형질감염시킴으로써 유도될 수 있다. 형질감염은 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터를 통해 달성할 수 있다. 추가의 적합한 재프로그래밍 방법은 숙주 세포의 게놈 내로 혼입되지 않은 벡터, 예를 들어 에피솜 벡터의 사용, 또는 인코딩 RNA를 통한 직접 재프로그래밍 인자의 전달 또는 단백질이 또한 기재되어 있는 바와 같은 것을 포함한다. 예를 들어, 세포는 레트로바이러스 시스템을 사용하여 Oct3/4, Sox2, Klf4 및/또는 c-Myc로, 또는 렌티바이러스 시스템을 사용하여 OCT4, SOX2, NANOG 및/또는 LIN28로 형질감염될 수 있다. 3 내지 4주 후에 소수의 형질감염된 세포가 형태학적 및 생화학적으로 만능성 줄기세포와 유사해지기 시작하며 형태학적 선택, 배가 시간 또는 리포터 유전자 및 항생제 선택을 통해 단리될 수 있다. 한 예에서, 성체 인간 세포의 iPSC는 문헌[Yu et al.(Science 318(5854):1224 (2007)) 또는 Takahashi et al.(Cell 131:861-72 (2007)]에 기재된 방법에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, iPSC는 상업적 공급원에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, iPSC는 판매자에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, iPSC는 계약 연구 기관에 의해 생성된다. 재프로그래밍을 위한 다수의 적합한 방법이 당업자에게 공지되어 있으며, 본 개시내용은 이러한 점에서 제한되지 않는다.
유전자 조작된 줄기세포
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 줄기세포(예를 들어, iPSC)는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 표적에 교란이 도입되도록 유전자 조작된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 줄기세포(예를 들어, iPSC)는 하나 이상의 표적 유전자의 전부 또는 일부를 녹아웃시키고, 하나 이상의 표적 유전자에 프레임시프트를 도입하고/거나, 인코딩된 유전자 산물의 절단을 유발하도록(예를 들어, 조기 종결 코돈 도입) 유전자 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 줄기세포(예를 들어, iPSC)는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자-편집 시스템을 사용하여 표적 유전자의 전부 또는 일부가 녹아웃되도록 유전자 조작될 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제 시스템, TALEN 및/또는 메가뉴클레아제이거나 이를 포함할 수 있다.
TGF 신호전달
특정 구현예에서, 본 개시내용은 TGF 신호전달, 예를 들어, TGF 베타 신호전달의 교란을 포함하는 유전자 조작된 줄기세포 및/또는 자손 세포를 제공한다. 이는 예를 들어, TGF 신호전달, 예를 들어, TGF 베타 신호전달이 분화된 세포에서 교란되는 만능성 줄기세포로부터 분화된 세포를 생성하는 것이 바람직한 상황에서 유용하다.
예를 들어, TGF 베타 신호전달은 치료 적용에 유용한 일부 분화된 세포 유형의 생존 및/또는 활성을 억제하거나 감소시키며, 예를 들어, TGF 베타 신호전달은 면역치료 적용에 사용될 수 있는 자연 살해 세포의 음성 조절인자이다. 일부 구현예에서, TGF 베타 신호전달을 교란하는 유전자 변형을 포함하는 임상적으로 유효한 수의 자연 살해 세포를 생성하여 이러한 세포의 임상적 유효성에 대한 TGF 베타의 부정적인 영향을 방지하는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 그러한 NK 세포를 만능성 줄기세포로부터 대신, 예를 들어 공여체로부터 획득한 성숙한 NK 세포로부터 공급하는 것이 유리하다. 분화된 세포 대신 줄기세포를 변형하는 것은 특히 특정 유전자형, 예를 들어 특정 유전자 변형(예를 들어, 임의의 부적절한(예를 들어, 표적외) 변형의 부재 하에 TGFβRII의 표적화된 교란)을 보유하는 특정 줄기세포 클론의 클론 유도, 특성화 및/또는 확장을 가능하게 하는 이점을 나타낸다. 일부 구현예에서, 줄기세포, 예를 들어 인간 iPSC는 하나 이상의 TGFβ 수용체, 예를 들어 TGFβRII를 발현하지 않거나 TGFβ 수용체의 우성 음성 변이체, 예를 들어 우성 음성 TGFβRII 변이체가 발현되지 않도록 유전자 조작된다. TGFβRII의 예시적인 서열은 KR710923.1, NM_001024847.2 및 NM_003242.5에 제시되어 있다. 예시적인 우성 음성 TGFβRII는 문헌[Immunity. 2000 Feb;12(2):171-81]에 개시되어 있다.
추가 기능 손실 수정
특정 구현예에서, 본 개시내용은 인터루킨 신호전달, 예를 들어 IL-15 신호전달의 교란을 추가로 또는 대안적으로 포함하는 유전자 조작된 줄기세포 및/또는 자손 세포를 제공한다. IL-15는 인터루킨-2(IL-2)와 구조적으로 유사한 사이토카인으로 IL-2/IL-15 수용체 베타 사슬(CD122)과 공통 감마 사슬(감마-C, CD132)로 이루어진 복합체에 결합하여 이를 통해 신호를 전달한다. IL-15의 예시적인 서열은 NG_029605.2에 제공된다. IL-15 신호전달의 교란은 예를 들어 만능성 줄기세포로부터 분화된 세포를 생성하는 것이 바람직하지만 분화된 세포에서 특정 신호전달 경로(예를 들어, IL-15)가 교란되는 상황에서 유용할 수 있다. IL-15 신호전달은 치료 적용에 유용할 수 있는 세포와 같은 일부 유형의 분화된 세포의 생존 및/또는 활성을 억제하거나 감소시킬 수 있다. 예를 들어, IL-15 신호전달은 자연 살해(NK) 세포의 음성 조절인자이다. CISH(CISH 유전자에 의해 인코딩됨)는 IL-15 수용체의 하류이며 NK 세포에서 IL-15 신호전달의 음성 조절인자로 작용할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CISH"는 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질을 지칭한다(예를 들어, 문헌[Delconte et al., Nat Immunol. 2016 Jul;17(7):816-24] 참조; CISH에 대한 예시적인 서열은 NG_023194.1로서 제시됨). 일부 구현예에서, CISH 조절의 교란은 Jak/STAT 경로의 활성화를 증가시켜 NK 세포의 생존, 증식 및/또는 효과기 기능을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 유전자 조작된 NK 세포(예를 들어, iNK 세포, 예를 들어 CISH 조절의 교란을 포함하는 유전자 조작된 hiPSC로부터 생성됨)는 유전자 조작되지 않은 NK 세포보다 IL-15 매개 신호전달에 대해 더 큰 반응성을 나타낸다. 일부 이러한 구현예에서, 유전자 조작된 NK 세포는 유전자 조작되지 않은 NK 세포에 비해 더 큰 효과기 기능을 나타낸다.
일부 구현예에서, 유전자 조작된 줄기세포 및/또는 자손 세포는 추가로 또는 대안적으로 B2M, NKG2A, PD1, TIGIT, ADORA2a, CIITA, HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자, HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자, CD32B, 또는 TRAC 중 하나 이상에서 교란 및/또는 기능 손실을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "B2M"(β2 마이크로글로불린)은 거의 모든 유핵 세포의 표면에서 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 중쇄와 관련하여 발견되는 혈청 단백질을 지칭한다. B2M에 대한 예시적인 서열은 NG_012920.2로 제시된다.
본 명세서에서, "NKG2A"(자연 살해 그룹 2A)라는 용어는 NK 세포에서 우선적으로 발현되는 막관통 단백질 그룹인 NKG2 패밀리라고도 하는 살해 세포 렉틴-유사 수용체 패밀리에 속하는 단백질을 지칭한다. 이 단백질의 패밀리는 II형 막 방향과 C형 렉틴 도메인의 존재를 특징으로 한다. 예를 들어 문헌[Kamiya-T et al., J Clin Invest 2019 https://doi.org/10.1172/JCI123955]을 참조한다. NKG2A에 대한 예시적인 서열은 AF461812.1로서 제시된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 또한 CD279(분화 덩어리 279)로도 공지되어 있는 용어 "PD1"(프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1)은 면역계를 하향 조절하고 T 세포 염증 활성을 억제하여 자기 내성을 촉진하여 인체의 세포에 면역계의 반응을 조절하는 역할을 하는 세포 표면에 존재하는 단백질을 지칭한다. PD1은 면역 체크포인트이며 자가면역을 방어한다. PD1에 대한 예시적인 서열은 NM_005018.3으로 제시된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "TIGIT"(Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체)는 면역글로불린 단백질의 PVR(폴리오바이러스 수용체) 패밀리의 구성원을 지칭한다. 이 유전자의 산물은 여포 B 보조 T 세포(TFH)를 포함하는 다수의 클래스의 T 세포에서 발현된다. TIGIT에 대한 예시적인 서열은 NM_173799.4에 제시되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "ADORA2A"는 클래스 및 하위유형으로 세분화되는 구아닌 뉴클레오타이드-결합 단백질(G 단백질)-결합 수용체(GPCR) 슈퍼패밀리의 구성원인 아데노신 A2a 수용체를 지칭한다. A2A 하위유형의 아데노신 수용체인 이 단백질은 적절한 내인성 작용제로 아데노신을 사용하고 세포내 cAMP 수준을 증가시키기 위해 G 단백질의 G(s) 및 G(olf) 패밀리와 우선적으로 상호작용한다. ADORA2a의 예시적인 서열은 NG_052804.1에 제공된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CIITA"는 클래스 II 주요 조직적합성 복합체 유전자 전사의 양성 조절인자로서 작용하는 핵에 위치한 단백질을 지칭하며, 이러한 유전자의 발현을 위한 "주요 제어 인자"로서 지칭된다. 이 단백질은 또한 GTP에 결합하고 GTP 결합을 사용하여 핵으로의 자체 수송을 촉진한다. 이 유전자의 돌연변이는 노출 림프구 증후군 II형(유전성 MHC 클래스 II 결핍 또는 HLA 클래스 II 결핍 조합 면역결핍이라고도 함), 류마티스 관절염, 다발성 경화증 및 심근 경색에 대한 감수성 증가와 관련이 있다. 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Chang et al., J Exp Med 180:1367-1374; 및 Chang et al., Immunity. 1996 Feb;4(2):167-78]을 참조한다. CIITA의 예시적인 서열은 NG_009628.1로 제시된다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자는 예를 들어 게놈 편집에 의해 교란, 예를 들어 녹아웃된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, HLA-DQA1, HLA-DRA, HLA-DPA1, HLA-DMA, HLA-DQA2 및 HLA-DOA로부터 선택되는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자가 교란되고, 예를 들어, 녹아웃된다. 또 다른 예에서, 일부 구현예에서, HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DQB3, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 및 HLA-DRB5로부터 선택되는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자가 교란되고, 예를 들어, 녹아웃된다. 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Crivello et al., J Immunol January 2019, ji1800257; DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1800257]을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CD32B"(분화 덩어리 32B)는 인간에서 FCGR2B 유전자에 의해 인코딩되는 저친화도 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 II-b 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Rankin-CT et al., Blood 2006 108(7):2384-91]을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "TRAC"는 TRAC 유전자좌에 의해 인코딩되는 T-세포 수용체 알파 하위단위(불변)을 지칭한다.
기능 획득 변형
일부 구현예에서, 유전자 조작된 줄기세포 및/또는 자손 세포는 추가로 또는 대안적으로 CAR; FcγRIII(CD16)의 비자연발생 변이체; 인터루킨 15(IL-15); IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체; 인터루킨 12(IL-12); IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체; 인간 백혈구 항원 G(HLA-G); 인간 백혈구 항원 E(HLA-E); 또는 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리 중 하나 이상의 발현을 유도하는 유전자 변형을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 CAR을 발현하는 세포에 특정 단백질을 표적화하는 새로운 능력을 제공하도록 변형된 수용체 단백질을 지칭한다. 본 개시내용의 관점 내에서, CAR을 포함하도록 변형된 세포는 질환 또는 장애와 관련된 세포, 예를 들어, 암 세포를 표적화하고 파괴하기 위해 면역요법에 사용될 수 있다.
대상 CAR에는 메조텔린, EGFR, HER2 및/또는 MICA/B를 표적화하는 CAR이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 현재까지, 메조텔린 표적화된 CAR T 세포 요법은 중피종, 비소세포폐암 및 유방암이 있는 대상체의 I상 임상 시험에서 효능의 초기 증거를 보여주었다(NCT02414269). 유사하게, EGFR, HER2 및 MICA/B를 표적화하는 CAR은 초기 연구에서 잠재력을 보여주었다(예를 들어, 각각 그 전문이 본 명세서에 명시적으로 참조로 포함되는 문헌[Li et al.(2018), Cell Death & Disease, 9(177); Han et al.(2018) Am. J Cancer Res., 8(1):106-119 및 Demoulin 2017) Future Oncology, 13(8)] 참조).
CAR은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 각각 그 전문이 본 명세서에 명시적으로 참조로 포함되는 제 WO13/063419호(메조텔린), 제 WO15/164594호(EGFR), 제 WO13/063419호(HER2), 제 WO16/154585호(MICA 및 MICB)에 기재된 것을 포함한다. 세포, 예를 들어, NK 세포를 표적 세포, 예를 들어 질환 또는 장애와 관련된 세포로 표적화하는 임의의 적합한 CAR, NK-CAR, 또는 다른 결합인자는 본 명세서에서 제공되는 변형된 NK 세포에서 발현될 수 있다. 예시적인 CAR 및 결합인자는 BCMA, CD19, CD22, CD20, CD33, CD123, 안드로겐 수용체, PSMA, PSCA, Muc1, HPV 바이러스 펩타이드(즉, E7), EBV 바이러스 펩타이드, CD70, WT1, CEA, EGFRvIII, IL13Rα2 및 GD2, CA125, CD7, EpCAM, Muc16, CD30에 결합하는 CAR 및 결합인자를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 명세서에서 제공되는 변형된 NK 세포에서 사용하기 위한 추가의 적합한 CAR 및 결합인자는 본 개시내용 및 당업계의 일반적인 지식에 기반하여 당업자에게 명백할 것이다. 그러한 추가의 적합한 CAR은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Davies and Maher, Adoptive T-cell Immunotherapy of Cancer Using Chimeric Antigen Receptor-Grafted T Cells, Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 58(3):165-78(2010)]의 도 3에 기재된 것을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CD16"은 면역글로불린 G의 Fc 부분에 대한 수용체(FcγRIII)를 지칭하며, 이는 순환계로부터 항원-항체 복합체의 제거뿐만 아니라, 다른 항체-의존성 반응에도 관여한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "IL-15/IL15RA" 또는 "인터루킨-15"(IL-15)는 인터루킨-2(IL-2)와 구조적 유사성을 갖는 사이토카인을 지칭한다. IL-2와 마찬가지로 IL-15는 IL-2/IL-15 수용체 베타 사슬(CD122)과 공통 감마 사슬(감마-C, CD132)로 이루어진 복합체에 결합하고 이를 통해 신호를 전달한다. IL-15는 바이러스(들) 감염 후 단핵 식세포(및 일부 다른 세포)에서 분비된다. 이 사이토카인은 바이러스에 감염된 세포를 사멸시키는 주된 역할을 하는 선천적 면역계의 세포인 자연 살해 세포의 세포 증식을 유도한다. IL-15 수용체 알파(IL15RA)는 매우 높은 친화도로 IL-15에 특이적으로 결합하며 다른 하위단위와 독립적으로 IL-15에 결합할 수 있다. 이 특성으로 인해 IL-15가 한 세포에서 생성되고 다른 세포에서 세포내이입되어 제3의 세포에 제시될 수 있다고 제안된다. IL15RA는 세포 증식 및 아폽토시스 억제인자 BCL2L1/BCL2-XL 및 BCL2의 발현을 향상시키는 것으로 보고되었다. IL-15의 예시적인 서열은 NG_029605.2에 제공되고, IL-15RA의 예시적인 서열은 NM_002189.4에 제공된다. 일부 구현예에서, IL-15R 변이체는 항시적 활성 IL-15R 변이체이다. 일부 구현예에서, 항시적 활성 IL-15R 변이체는 IL-15R과 IL-15R 작용제, 예를 들어 IL-15 단백질 또는 그의 IL-15R-결합 단편 사이의 융합체이다. 일부 구현예에서, IL-15R 작용제는 IL-15, 또는 그의 IL-15R-결합 변이체이다. 예시적인 적합한 IL-15R 변이체는 예를 들어 각각의 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Mortier E et al, 2006; Journal of Biological Chemistry 2006 281: 1612-1619; 또는 Bessard-A et al., Mol Cancer Ther. 2009 Sep;8(9):2736-45]에 기재된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "IL-12"는 T 및 자연 살해 세포에 작용하는 사이토카인인 인터루킨-12를 지칭한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작된 줄기세포 및/또는 자손 세포는 인터루킨 12(IL12) 경로 작용제, 예를 들어, IL-12, 인터루킨 12 수용체(IL-12R) 또는 이의 변이체(예를 들어, IL-12R의 항시적 활성 변이체, 예를 들어, IL-12R 작용제에 융합된 IL-12R(IL-12RA) 중 하나 이상의 발현을 유도하는 유전자 변형을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "HLA-G"는 HLA 비통상적 클래스 I 중쇄 파라로그를 지칭한다. 이 클래스 I 분자는 중쇄와 경쇄로 이루어진 이종이량체이다(베타-2 마이크로글로불린). 중쇄는 막에 고정되어 있다. HLA-G는 태아 유래 태반 세포에서 발현된다. HLA-G는 NK 세포 억제 수용체 KIR2DL4에 대한 리간드이므로 영양막에 의한 이 HLA의 발현은 NK 세포 매개 사멸로부터 HLA를 방어한다. 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Favier et al., Tolerogenic Function of Dimeric Forms of HLA-G Recombinant Proteins: A Compare Study In Vivo PLOS One 2011]을 참조한다. HLA-G의 예시적인 서열은 NG_029039.1로 제시된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "HLA-E"는 HLA 클래스 I 조직적합성 항원, 알파 사슬 E를 지칭하며, 때때로 MHC 클래스 I 항원 E로도 지칭된다. 인간의 HLA-E 단백질은 HLA-E 유전자에 의해 인코딩된다. 인간 HLA-E는 통상적인 파라로그보다 제한된 다형성 및 더 낮은 세포 표면 발현을 특징으로 하는 비통상적 MHC 클래스 I 분자이다. 이 클래스 I 분자는 중쇄와 경쇄로 이루어진 이종이량체이다(베타-2 마이크로글로불린). 중쇄는 막에 고정되어 있다. HLA-E는 다른 클래스 I 분자의 리더 펩타이드로부터 유래된 펩타이드의 제한된 하위세트에 결합한다. HLA-E 발현 세포는 NK 세포에 의한 동종이계 반응 및 용해를 방지한다. 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Geornalusse-G et al., Nature Biotechnology 2017 35(8)]을 참조한다. HLA-E 단백질의 예시적인 서열은 NM_005516.6에 제공되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 때때로 "인테그린 관련 단백질"(IAP)로도 지칭되는 용어 "CD47"은 인간에서 CD47 유전자에 의해 인코딩되는 막관통 단백질을 지칭한다. CD47은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하고 막 인테그린과 파트너가 되며 또한 리간드 트롬보스폰딘-1(TSP-1) 및 신호 조절 단백질 알파(SIRPα)에 결합한다. CD47은 대식세포에 대한 신호로 작용하여 CD47 발현 세포가 대식세포 공격을 회피할 수 있도록 한다. 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Deuse-T, et al., Nature Biotechnology 2019 37: 252-258]을 참조한다.
iNK 세포의 생성
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 줄기세포로부터 유래된 iNK 세포(예를 들어, 유전자 변형된 iNK 세포)를 생성하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 iNK 세포에 존재하는 유전자 변형(예를 들어, 게놈 편집)은 공여체 세포에서 iPSC로의 재프로그래밍 과정 동안 임의의 단계, iPSC 단계 동안 및/또는 iPSC가 iNK 상태로 분화되는 과정의 임의의 단계, 예를 들어 중간 상태, 예를 들어, iPSC 유래 HSC 상태, 또는 심지어 최종 iNK 세포 상태까지 또는 그 상태에서 이루어질 수 있다.
예를 들어, 본 개시내용의 편집된 iNK 세포에 존재하는 하나 이상의 게놈 편집은 하나 이상의 상이한 세포 단계(예를 들어, 공여체로부터 iPSC로의 재프로그래밍, iPSC로부터 iNK로의 분화)에서 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 변형된 유전자 변형된 iNK 세포에 존재하는 하나 이상의 게놈 편집은 공여체 세포를 iPSC 상태로 재프로그래밍하기 전에 이루어진다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 유전자 변형된 iNK 세포에 존재하는 모든 편집은 재프로그래밍/분화 과정의 동일한 시간에, 시간적으로 매우 근접하게 및/또는 동일한 세포 단계에서, 예를 들어, 공여체 세포 단계에서, 재프로그래밍 과정 동안, iPSC 단계에서, 또는 예를 들어 iPSC로부터 iNK로의 분화 과정 동안 이루어진다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 유전자 변형된 iNK 세포에 존재하는 2개 이상의 편집은 공여체 세포로부터 iPSC로, iNK로의 재프로그래밍/분화 과정의 상이한 시간 및/또는 상이한 세포 단계에서 이루어진다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제1 편집은 공여체 세포 단계에서 이루어지고 제2(상이한) 편집은 iPSC 단계에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 편집은 재프로그래밍 단계(예를 들어, 공여체로부터 iPSC)에서 이루어지고 제2(상이한) 편집은 iPSC 단계에서 이루어진다.
다양한 세포 유형이 본 명세서에 기재된 재프로그래밍, 분화 및/또는 게놈 편집 전략에 적용될 수 있는 공여체 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 공여체 세포는 만능성 줄기세포 또는 분화된 세포, 예를 들어, 섬유아세포 또는 T 림프구와 같은 체세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 공여체 세포를 조작하여(예를 들어, 재프로그래밍, 분화 및/또는 게놈 편집에 적용됨) 본 명세서에 기재된 iNK 세포를 생성한다.
공여체 세포는 임의의 적합한 유기체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 공여체 세포는 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포 또는 비-인간 영장류 세포이다. 일부 구현예에서, 공여체 세포는 체세포이다. 일부 구현예에서, 공여체 세포는 줄기세포 또는 전구 세포이다. 특정 구현예에서, 공여체 세포는 인간 배아가 아니거나 그의 일부가 아니었으며 그의 유도는 인간 배아의 교란을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 편집된 iNK 세포는 iPSC로부터 유래되고, 이는 결과적으로 체세포 공여체 세포로부터 유래된다. 임의의 적합한 체세포가 iPSC의 생성 및 결과적으로 iNK 세포의 생성에 사용될 수 있다. 다양한 체세포 공여체 세포 유형으로부터 iPSC를 유도하기 위한 적합한 전략이 기재되어 있고 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 체세포 공여체 세포는 섬유아세포이다. 일부 구현예에서, 체세포 공여체 세포는 성숙한 T 세포이다.
예를 들어, 일부 구현예에서, iPSC 및 후속적으로 iNK 세포가 유래되는 체세포 공여체 세포는 발생적으로 성숙한 T 세포(흉선 선택에 적용된 T 세포)이다. 발생적으로 성숙한 T 세포의 한 가지 특징은 재배열된 T 세포 수용체 유전자좌이다. T 세포 성숙 동안 TCR 유전자좌는 V(D)J 재배열에 적용되어 완전한 V 도메인 엑손을 생성한다. 이러한 재배열은 T 세포를 iPSC로 재프로그래밍하고 생성된 iPSC가 체세포로 분화하는 동안 유지된다.
특정 구현예에서, 체세포 공여체 세포는 CD8+ T 세포, CD8+ 나이브 T 세포, CD4+ 중심 기억 T 세포, CD8+ 중심 기억 T 세포, CD4+ 효과기 기억 T 세포, CD4+ 효과기 기억 T 세포, CD4+ T 세포, CD4+ 줄기세포 기억 T 세포, CD8+ 줄기세포 기억 T 세포, CD4+ 보조 T 세포, 조절 T 세포, 세포독성 T 세포, 자연 살해 T 세포, CD4+ 나이브 T 세포, TH17 CD4+ T 세포, TH1 CD4+ T 세포, TH2 CD4+ T 세포, TH9 CD4+ T 세포, CD4+ Foxp3+ T 세포, CD4+ CD25+ CD127- T 세포, 또는 CD4+ CD25+ CD127- Foxp3+ T 세포이다.
T 세포는 iPSC의 생성에 유리할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 예를 들어 CRISPR 기반 방법 또는 다른 유전자 편집 방법에 의해 비교적 쉽게 편집될 수 있다. 또한, 재배열된 TCR 유전자좌는 개별 세포와 딸 세포의 유전적 추적을 가능하게 한다. 예를 들어, NK 세포의 생성과 관련된 재프로그래밍, 확장, 배양 및/또는 분화 전략이 단일 세포의 클론 확장인 경우 재배열된 TCR 유전자좌는 세포와 그 딸 세포를 명확하게 확인하는 유전자 마커로 사용될 수 있다. 이는 결과적으로 세포 집합을 진정한 클론으로 특성화하거나 혼합 집합을 확인하거나 클론 집합에서 세포를 오염시키는 것을 가능하게 한다. 다중 편집을 수행하는 iNK 세포를 생성하는데 T 세포를 사용하는 또 다른 잠재적인 이점은 염색체 전위와 관련된 특정 핵형 이상이 T 세포 배양에서 선택된다는 것이다. 이러한 이탈은 CRISPR 기술로 세포를 편집할 때, 특히 다수의 편집을 수행하는 세포를 생성할 때 문제가 될 수 있다. 치료 림프구 유도를 위한 출발점으로 T 세포 유래 iPSC를 사용하면 예를 들어, 선택된 T 세포를 iPSC로 재프로그래밍한 다음, TCR(예를 들어, T 세포)을 발현하는 이러한 iPSC로부터 림프구를 유도하는 특정 항원, 예를 들어 종양 항원에 대한 결합 활성을 위해 T 세포를 선택함으로써 림프구에서 사전 스크리닝된 TCR의 발현을 가능하게 할 수 있다. 이 전략은 예를 들어 유전적 또는 후성적 전략에 의해 다른 세포 유형에서 TCR을 활성화하는 것을 가능하게 할 수 있다. 또한, T 세포는 재프로그래밍 과정 전반에 걸쳐 "후성적 기억"의 적어도 일부를 유지하므로, iNK 유도를 위한 출발점으로 섬유아세포와 같은 관련되지 않은 세포를 사용하는 접근법과 비교하여 iNK 세포와 같은 동일하거나 밀접하게 관련된 세포 유형의 후속 분화가 더 효율적이고/거나, 더 높은 품질의 세포 집합을 야기할 수 있다.
일부 구현예에서, 조작되는 공여체 세포, 예를 들어, 재프로그래밍되고/거나 게놈 편집이 진행 중인 세포는 장기 조혈 줄기세포, 단기 조혈 줄기세포, 다능성 전구 세포, 계통 제한 전구 세포, 림프 전구 세포, 골수 전구 세포, 공통 골수 전구 세포, 적혈구 전구 세포, 거핵구 적혈구 전구 세포, 망막 세포, 광수용기 세포, 간상 세포, 원추 세포, 망막 색소 상피 세포, 섬유주대 세포, 달팽이관 유모 세포, 외부 유모 세포, 내부 유모 세포, 폐 상피 세포, 기관지 상피 세포, 폐포 상피 세포, 폐 상피 전구 세포, 줄무늬 근육 세포, 심근세포, 근육위성세포, 신경세포, 신경줄기세포, 간엽줄기세포, 유도된 만능성 줄기세포(iPS), 배아줄기세포, 섬유아세포, 단핵구 유래 대식세포 또는 수지상 세포, 거핵구, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 망상적혈구, B 세포, 예를 들어 전구 B 세포, 프리 B 세포(Pre B cell), 프로 B 세포(Pro B cell), 기억 B 세포, 혈장 B 세포, 위장 상피 세포, 담도 상피 세포, 췌관 상피 세포, 장 줄기세포, 간세포, 간 성상 세포, 쿠퍼 세포(Kupffer cell), 조골 세포, 파골 세포, 지방 세포, 지방전 세포, 췌도 세포(예를 들어, 베타 세포, 알파 세포, 델타 세포), 췌장 외분비 세포, 슈반 세포(Schwann cell), 또는 희돌기아교세포 중 하나 이상이다.
일부 구현예에서, 공여체 세포는 순환 혈액 세포, 예를 들어 망상적혈구, 거핵구 적혈구 전구 세포(MEP), 골수 전구 세포(CMP/GMP), 림프 전구 세포(LP) 세포, 조혈 줄기/전구 세포(HSC) 또는 내피 세포(EC) 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 공여체 세포는 골수 세포(예를 들어, 망상적혈구, 적혈구계 세포(예를 들어, 적혈구모세포), MEP 세포, 골수 전구 세포(CMP/GMP), LP 세포, 적혈구 전구 세포(예를 들어, EP), HSC, 다능성 전구(MPP) 세포, 내피 세포(EC), 혈행 내피(HE) 세포, 또는 중간엽 줄기세포) 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 공여체 세포는 골수 전구 세포(예를 들어, 공통 골수 전구 세포(CMP) 또는 과립구 대식세포 전구 세포(GMP)) 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 공여체 세포는 림프 전구 세포, 예를 들어 공통 림프 전구 세포(CLP) 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 공여체 세포는 적혈구 전구 세포(예를 들어, MEP 세포) 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 공여체 세포는 조혈 줄기/전구 세포(예를 들어, 장기 HSC(LT-HSC), 단기 HSC(ST-HSC), MPP 세포, 또는 계통 제한 전구 세포(LRP)) 중 하나 이상이다. 특정 구현예에서, 공여체 세포는 CD34+ 세포, CD34+CD90+ 세포, CD34+CD38- 세포, CD34+CD90+CD49f+CD38-CD45RA- 세포, CD105+ 세포, CD31+, 또는 CD133+ 세포, 또는 CD34+CD90+ CD133+ 세포이다. 일부 구현예에서, 공여체 세포는 제대혈 CD34+ HSPC, 제대 정맥 내피 세포, 제대 동맥 내피 세포, 양수 CD34+ 세포, 양수 내피 세포, 태반 내피 세포, 또는 태반 조혈 CD34+ 세포 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 공여체 세포는 (환자가 동원제, 예를 들어, G-CSF 또는 플레릭사포르(Plerixafor)로 치료된 후) 동원된 말초 혈액 조혈 CD34+ 세포 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 공여체 세포는 말초 혈액 내피 세포이다. 일부 구현예에서, 공여체 세포는 말초 혈액 자연 살해 세포이다.
일부 구현예에서, 공여체 세포는 분열 세포이다. 일부 구현예에서, 공여체 세포는 비분열 세포이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법 및/또는 전략으로부터 생성된 유전자 변형된(예를 들어, 편집된) iNK 세포는, 예를 들어 면역종양 치료 접근법의 관점에서 필요한대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 공여체 세포, 또는 본 명세서에 제공된 재프로그래밍, 분화 및/또는 편집 전략의 임의의 단계의 임의의 세포는 예를 들어, 필요한대상체에 대한 후속 특성화 또는 투여를 위해 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 배양물에서 유지되거나 저장될 수 있다(예를 들어, 액체 질소에서 동결됨).
게놈 편집 시스템
본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 예를 들어 줄기세포를 편집하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 자연 발생 CRISPR 시스템으로부터 적응된 적어도 2개의 구성요소: 가이드 RNA(gRNA) 및 RNA-가이드된 뉴클레아제를 포함한다. 이들 2 개의 구성성분은, 예를 들어 단일-가닥 절단부(SSB 또는 닉), 이중 가닥 절단부(DSB) 및/또는 점 돌연변이 중 하나 이상을 만듦으로써 특이적인 핵산 서열과 연관되고 해당 핵산 서열에서 또는 그 주변에서 DNA를 편집할 수 있는 복합체를 형성한다.
자연-발생 CRISPR 시스템은 2 개의 부류 및 5 개의 유형으로 진화적으로 구조화되고(문헌[Makarova et al. Nat Rev Microbiol. 2011 Jun; 9(6): 467-477 ("Makarova")]), 본 개시내용의 게놈 편집 시스템이 임의의 유형 또는 부류의 자연-발생 CRISPR 시스템의 구성성분을 조정할 수 있으며, 본 명세서에 제시된 구현예는 일반적으로, 부류 2, 및 유형 II 또는 V CRISPR 시스템으로부터 조정된다. 유형 II 및 V를 포괄하는 부류 2 시스템은 상대적으로 큰 다중도메인 RNA-가이드된 뉴클레아제 단백질(예를 들어 Cas9 또는 Cpf1) 및 하나 이상의 가이드 RNA(예를 들어 crRNA 및 선택적으로 tracrRNA)를 특징으로 하며, 이는 crRNA의 표적화(또는 스페이서) 서열에 상보성인 특이적인 유전자좌와 회합하고(즉 표적화하고) 절단하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성한다. 본 개시내용에 따른 게놈 편집 시스템은 세포성 DNA 서열을 유사하게 표적화하고 편집하지만, 자연상에서 발생하는 CRISPR 시스템과 유의하게 상이하다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 단분자 가이드 RNA는 자연상에서 발생하지 않고, 본 개시내용에 따른 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 뉴클레아제 둘 모두는 임의의 수의 비-자연-발생 변형을 혼입할 수 있다.
게놈 편집 시스템은 여러 가지 방식으로 실시될 수 있고(예를 들어 세포 또는 대상체에게 투여되거나 전달될 수 있고), 상이한 실시는 별개의 적용에 적합할 수 있다. 예를 들어 소정의 구현예에서, 게놈 편집 시스템은 단백질/RNA 복합체(리보핵단백질, 또는 RNP)로서 실시되며, 이러한 복합체는 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 캡슐화제, 예컨대 지질 또는 중합체 미세- 또는 나노-입자, 미쉘, 리포좀 등을 선택적으로 포함하는 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 소정의 구현예에서, 게놈 편집 시스템은 상기 기재된 RNA-가이드된 뉴클레아제 및 가이드 RNA 구성성분을 인코딩하는 하나 이상의 핵산으로서 실시되며(선택적으로 하나 이상의 추가 구성성분과 함께); 소정의 구현예에서, 게놈 편집 시스템은 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터, 예를 들어 아데노-연관 바이러스와 같은 바이러스 벡터로서 실시되고; 소정의 구현예에서, 게놈 편집 시스템은 전술한 것 중 임의의 것의 조합으로서 실시된다. 본 명세서에 제시된 원리에 따라 작동하는 추가의 또는 변형된 실시는 당업자에게 명백할 것이며 본 개시내용의 범위 내에 있다.
본 개시내용의 게놈 편집 시스템은 단일 특이적 뉴클레오타이드 서열로 표적화될 수 있거나, 2 개 이상의 가이드 RNA의 사용을 통해 2 개 이상의 특이적 뉴클레오타이드 서열로 표적화되고-동시에 편집할 수 있음을 주지해야 한다. 다수의 gRNA의 사용은 본 개시내용 전반에 걸쳐 "다중화"로 지칭되고, 다수의 관련없는 관심 표적 서열을 표적화하거나 단일 표적 도메인 내에서 다수의 SSB 또는 DSB를 형성하고 일부 경우 이러한 표적 도메인 내에서 특이적인 편집물을 발생시키는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, Maeder 등에 의한 국제 특허 공개 WO 2015/138510("Maeder")은, 크립틱(cryptic) 스플라이스 부위의 생성을 초래하는 인간 CEP290 유전자에서의 점 돌연변이(C.2991+1655A->G)를 교정하기 위한 게놈 편집 시스템을 기재하고 있으며, 이는 결국 이러한 유전자의 기능을 감소시키거나 없앤다. Maeder의 게놈 편집 시스템은 점 돌연변이의 양측 상에 있는(즉 양 옆에 있는) 서열로 표적화된 2 개의 가이드 RNA를 활용하고, 이러한 돌연변이의 양 옆에서 DSB를 형성한다. 이는 결국, 돌연변이를 포함하여 개재 서열의 결실을 촉진함으로써, 크립틱 스플라이스 부위를 없애고 정상적인 유전자 기능을 수선시킨다.
또 다른 예로서, Cotta-Ramusino 등에 의한 WO 2016/073990("Cotta-Ramusino")은 "이중-닉카제(nickase) 시스템"이라고 하는 배열인 Cas9 닉카제(에스.피오게네스 D10A와 같은 단일-가닥 닉을 만드는 Cas9)와 조합된 2 개의 gRNA를 활용하는 게놈 편집 시스템을 기재하고 있다. Cotta-Ramusino의 이중-닉카제 시스템은 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 상쇄(offset)되는 관심 서열의 반대 가닥 상에 2 개의 닉을 만들도록 배치되고, 이러한 닉들은 조합되어, 오버행(overhang)(Cotta-Ramusino의 경우 5'이긴 하지만, 3' 오버행도 가능함)을 갖는 이중 가닥 절단부를 생성한다. 오버행은 결국 일부 상황에서 상동성 직접 수선 사건을 용이하게할 수 있다. 또한 또 다른 예로서, Palestrant 등의 WO 2015/070083("Palestrant")은 Cas9를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 표적화된 gRNA("지배 RNA"로 지칭됨)를 기재하고 있으며, 이는 Cas9의 일시적 발현을 허용하기 위해 하나 이상의 추가의 gRNA를 포함하는 게놈 편집 시스템에 포함될 수 있고, 그렇지 않다면 Cas9는 예를 들어 일부 바이러스 형질도입된 세포에서 구성적으로 발현될 것이다. 이들 다중화 적용은 제한적이기보다는 예시적인 것으로 하고자 하며, 당업자는, 다중화의 다른 적용이 일반적으로 본 명세서에 기재된 게놈 편집 시스템과 융화성임을 이해할 것이다.
게놈 편집 시스템은 일부 경우에 NHEJ 또는 HDR과 같은 세포 DNA 이중 가닥 절단 메커니즘에 의해 복구되는 이중 가닥 절단을 형성할 수 있다. 이러한 메커니즘은 문헌 전체에 걸쳐, 예를 들어 문헌[Davis & Maizels, PNAS, 111(10):E924-932, March 11, 2014 ("Davis") (describing Alt-HDR); Frit et al. DNA Repair 17(2014) 81-97 ("Frit") (describing Alt-NHEJ); 및 Iyama and Wilson III, DNA Repair(Amst.) 2013-Aug; 12(8): 620-636 ("Iyama") (describing canonical HDR and NHEJ pathways generally)]에 기재되어 있다.
게놈 편집 시스템이 DSB를 형성함으로써 작동되는 경우, 이러한 시스템은 선택적으로, 특정한 방식의 이중-가닥 절단부 수선 또는 특정한 수선 결과물을 촉진하거나 용이하게 하는 하나 이상의 구성성분을 포함한다. 예를 들어, Cotta-Ramusino가 또한, 게놈 편집 시스템을 기재하고 있는데, 이러한 시스템에서, 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 "공여체 주형"이 첨가되며; 공여체 주형은, 게놈 편집 시스템에 의해 절단되는 세포성 DNA의 표적 영역 내로 혼입되고, 표적 서열에서 변화를 초래할 수 있다.
소정의 구현예에서, 게놈 편집 시스템은 단일-가닥 또는 이중-가닥 절단부를 유발하지 않으면서, 표적 서열을 변형시키거나 표적 서열 내에서 또는 그 부근에서 표적 유전자의 발현을 변형시킨다. 예를 들어, 게놈 편집 시스템은, DNA 상에 작동하는 기능적 도메인에 융합된 RNA-가이드된 뉴클레아제를 포함하여, 이로써 표적 서열 또는 이의 발현을 변형시킬 수 있다. 일례로, RNA-가이드된 뉴클레아제는 시티딘 데아미나제 기능적 도메인에 연결(예를 들어 융합)될 수 있고, 표적화된 C에서 A로의 치환을 발생시킴으로써 작동할 수 있다. 예시적인 뉴클레아제/데아미나제 융합은 문헌[Komor et al. Nature 533, 420-424 (19 May 2016) ("Komor")]에 기재되어 있다. 대안적으로, 게놈 편집 시스템은 절단-비활성화된(즉 "데드") 뉴클레아제, 예컨대 데드 Cas9(dCas9)를 활용할 수 있고, 세포성 DNA의 하나 이상의 표적화된 영역 상에서 안정한 복합체를 형성하여 이로써 비제한적으로 mRNA 전사, 염색질 재건(remodeling) 등을 포함하여 표적화된 영역(들)을 수반하는 기능을 간섭함으로써 작동할 수 있다.
가이드 RNA (gRNA) 분자
본 개시내용의 가이드 RNA(gRNA)는 단분자(단일 RNA 분자를 포함하고 대안적으로 키메라로 지칭됨) 또는 모듈(하나 초과, 일반적으로 2개의 개별 RNA 분자, 예컨대 crRNA 포함) 및 일반적으로 예를 들어 이중화에 의해 서로 결합되는 tracrRNA일 수 있다. gRNA와 그 구성 요소는 문헌 전체에 걸쳐, 예를 들어 문헌[Briner et al.(Molecular Cell 56(2), 333-339, October 23, 2014 ("Briner")), and in Cotta-Ramusino]에 기재되어 있다.
박테리아 및 고세균에서, 유형 II CRISPR 시스템은 일반적으로, Cas9와 같은 RNA-가이드된 뉴클레아제 단백질, 외래 서열에 상보성인 5' 영역을 포함하는 CRISPR RNA(crRNA), 및 crRNA의 3' 영역에 상보적이고 이와 이중체(duplex)를 형성하는 5' 영역을 포함하는 trans-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함한다. 임의의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이러한 이중체는 Cas9/gRNA 복합체의 형성을 용이하게 하고, 이의 활성에 필요한 것으로 생각된다. 유형 II CRISPR 시스템은 유전자 편집에 사용하도록 조정되었기 때문에, crRNA 및 tracrRNA는 하나의 비제한적인 예에서, crRNA(이의 3' 말단에서) 및 tracrRNA(이의 5' 말단에서)의 상보성인 영역을 가교하는 4 개 뉴클레오타이드(예를 들어 GAAA) "테트라루프" 또는 "링커" 서열에 의해 단일 단분자 또는 키메라 가이드 RNA 내로 접합될 수 있을 것으로 발견되었다.(문헌[Mali et al. Science. 2013 Feb 15; 339(6121): 823-826 ("Mali"); Jiang et al. Nat Biotechnol. 2013 Mar; 31(3): 233-239 ("Jiang"); 및 Jinek et al., 2012 Science Aug. 17; 337(6096): 816-821 ("Jinek 2012")]).
단분자 또는 모듈식이든지 간에 가이드 RNA는, 편집이 요망되는 세포의 게놈 내의 DNA 서열과 같은 표적 서열 내의 표적 도메인에 전체적으로 또는 부분적으로 상보성인 "표적화 도메인"을 포함한다. 표적화 도메인은 비제한적으로 "가이드 서열"(문헌[Hsu et al., Nat Biotechnol. 2013 Sep; 31(9): 827-832, ("Hsu")]), "상보성 영역"(Cotta-Ramusino), "스페이서"(Briner 2014) 및 일반적으로 "crRNA"(Jiang)를 포함하여 문헌에서 다양한 명칭으로 지칭된다. 표적화 도메인에 주어지는 명칭과는 상관없이, 이들 도메인은 전형적으로 10 내지 30 개 뉴클레오타이드 길이이고, 소정의 구현예에서, 16 내지 24 개 뉴클레오타이드 길이(예를 들어, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개 뉴클레오타이드 길이)이고, Cas9 gRNA의 경우 5' 말단에 또는 그 부근에, 그리고 Cpf1 gRNA의 경우 3' 말단에 또는 그 부근에 위치한다.
표적화 도메인 외에도, gRNA는 전형적으로(그러나 하기 논의된 바와 같이 필수적으로는 아니게), gRNA/Cas9 복합체의 형성 또는 활성에 영향을 미칠 수 있는 복수의 도메인을 포함한다. 예를 들어 상기 언급된 바와 같이, gRNA의 제1 및 제2 상보성 도메인에 의해 형성된 이중체화된 구조(반복부:안티-반복부 이중체로도 지칭됨)는 Cas9의 인식(REC) 로브(lobe)와 상호작용하고, Cas9/gRNA 복합체의 형성을 매개할 수 있다(문헌[Nishimasu et al., Cell 156, 935-949, February 27, 2014 ("Nishimasu 2014") 및 Nishimasu et al., Cell 162, 1113-1126, August 27, 2015 ("Nishimasu 2015")]). 제1 및/또는 제2 상보성 도메인은 하나 이상의 폴리-A 트랙을 함유할 수 있으며, 이러한 트랙은 종결 신호로서 RNA 폴리머라제에 의해 인식될 수 있음을 주지해야 한다. 따라서, 제1 및 제2 상보성 도메인의 서열은 선택적으로, 예를 들어 Briner에 기재된 바와 같이 A-G 스왑(swap), 또는 A-U 스왑의 사용을 통해 이들 트랙을 없애고 gRNA의 완전한 시험관내 전사를 촉진하도록 변형된다. 제1 및 제2 상보성 도메인에 대한 이들 및 다른 유사한 변형은 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
제1 및 제2 상보성 도메인과 함께, Cas9 gRNA는 전형적으로, 필수적으로 시험관내에서는 아니지만 생체내에서 뉴클레아제 활성에 관여하는 2 개 이상의 추가의 이중체화된 영역을 포함한다.(Nishimasu 2015). 제2 상보성 도메인의 3' 부분 부근의 제1 스템-루프 영역은 "근위(proximal) 도메인"(Cotta-Ramusino), "스템 루프 1"(Nishimasu 2014 및 2015) 및 "넥서스(nexus)"(Briner)로서 다양하게 지칭된다. 하나 이상의 추가의 스템 루프 구조는 일반적으로, gRNA의 3' 말단 부근에 존재하고, 이때 그 수는 종에 따라 다양하다: 에스.피오게네스 gRNA는 전형적으로 2 개의 3' 스템 루프(반복부:안티-반복부 이중체를 포함하여 총 4 개의 스템 루프 구조에 대해)를 포함하는 한편, 에스.아우레우스 및 다른 종들은 단지 1 개만 갖는다(총 3 개의 스템 루프 구조에 대해). 종에 의해 구조화된 보존된 스템 루프 구조(및 보다 일반적으로 gRNA 구조)의 설명은 Briner에 제공된다.
전술한 설명은 Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA에 집중되었지만, 지금까지 기재된 것과 일부 방식으로 다른 gRNA를 활용하는 다른 RNA-가이드된 뉴클레아제가 발견되거나 발명되었다는(또는 미래에 그러할 수 있음) 것이 인식되어야 한다. 예를 들어, Cpf1("문헌[Prevotella 및 Franciscella 1]의 CRISPR")은 기능하기 위해 tracrRNA가 필요하지 않은 최근에 발견된 RNA 가이드된 뉴클레아제이다.(문헌[Zetsche et al., 2015, Cell 163, 759-771 October 22, 2015 ("Zetsche I")]). Cpf1 게놈 편집 시스템에 사용하기 위한 gRNA는 일반적으로, 표적화 도메인 및 상보성 도메인(대안적으로 "핸들(handle)"로 지칭됨)을 포함한다. Cpf1과 함께 사용하기 위한 gRNA에서, 표적화 도메인은 통상, Cas9 gRNA와 연관하여 상기 기재된 바와 같이 5' 말단보다는 3' 말단에 또는 그 부근에 존재함(핸들은 Cpf1 gRNA의 5' 말단에 또는 그 부근에 존재함)을 주지해야 한다.
그러나, 당업자는, 상이한 원핵 종으로부터의 gRNA 사이에 또는 Cpf1 gRNA와 Cas9 gRNA 사이에 구조적 차이가 존재할 수 있더라도, gRNA가 작동하는 원리는 일반적으로 일관됨을 이해할 것이다. 작동의 이러한 일관성때문에, gRNA는 광범위한 의미에서 이들의 표적화 도메인 서열에 의해 정의될 수 있고, 당업자는 주어진 표적화 도메인 서열이, 단분자 또는 키메라 gRNA 또는 하나 이상의 화학적 변형 및/또는 순차적 변형(치환, 추가의 뉴클레오타이드, 절두 등)을 포함하는 gRNA를 포함하여 임의의 적합한 gRNA 내에 혼입될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 개시내용에서 제시의 경제성을 위해, gRNA는 이들의 표적화 도메인 서열의 면에서만 기재될 수 있다.
보다 일반적으로 당업자는, 본 개시내용의 일부 양태가 다수의 RNA-가이드된 뉴클레아제에서 실시될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것임을 이해할 것이다. 이러한 이유에서 다르게 명시되지 않는 한, 용어 gRNA는, 특정 종의 Cas9 또는 Cpf1과 융화성인 gRNA뿐만 아니라 임의의 RNA-가이드된 뉴클레아제와 함께 사용될 수 있는 임의의 적합한 gRNA를 포괄하는 것으로 이해해야 한다. 예시로서 소정의 구현예에서, 용어 gRNA는 부류 2 CRISPR 시스템, 예컨대 유형 II 또는 유형 V 또는 CRISPR 시스템에서 발생하는 임의의 RNA-가이드된 뉴클레아제, 또는 이로부터 유래되거나 적응된 RNA-가이드된 뉴클레아제와 함께 사용하기 위한 gRNA를 포함할 수 있다.
gRNA 설계
표적 서열의 선택 및 검증뿐만 아니라, 표적외 분석의 방법은 이전에, 예를 들어 문헌[Mali; Hsu; Fu et al., 2014 Nat Biotechnol 32(3): 279-84, Heigwer et al., 2014 Nat methods 11(2):122-3; Bae et al. (2014) Bioinformatics 30(10): 1473-5; 및 Xiao A et al. (2014) Bioinformatics 30(8): 1180-1182]에 기재되어 있다. 비제한적 예로서, gRNA 설계는, 예를 들어, 게놈 전반에 걸쳐 총 표적외 활성을 최소화하기 위해, 사용자의 표적 서열에 상응하는 잠재적 표적 서열의 선택을 최적화하기 위한 소프트웨어 도구의 사용을 포함할 수 있다. 표적외 활성이 절단으로 제한되지는 않지만, 각각의 표적외 서열에서의 절단 효율은 예를 들어 실험적으로 유도된 가중치 체계를 사용하여 예측할 수 있다. 이러한 유도된 선택 방법 및 다른 유도된 선택 방법은 문헌[Maeder and Cotta-Ramusino]에 자세히 기재되어 있다.
예를 들어, 표적 서열의 선택 및 검증뿐만 아니라, 표적외 분석의 방법은 cas-offinder(문헌[Bae S, Park J, Kim J-S. Cas-OFFinder: fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 2014;30:1473-5])를 사용하여 수행할 수 있다. Cas-offinder는 가이드 서열에 대해 최대 지정된 수의 불일치가 있는 게놈의 모든 서열를 빠르게 확인할 수 있는 도구이다.
또 다른 예로서, 소정의 서열이 표적외일 가능성의 정도(예를 들어, 후보 표적 서열이 확인된 경우)를 점수화하는 방법이 수행될 수 있다. 예시적인 점수는 문헌[Doench JG, Fusi N, Sullender M, Hegde M, Vaimberg EW, Donovan KF, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 2016;34:184-91]에 의해 기재된 바와 같은 절단 빈도 결정(CFD) 점수를 포함한다.
gRNA 변형
특정 구현예에서, 본 명세서에 사용되는 gRNA는 변형되거나 변형되지 않은 gRNA일 수 있다. 특정 구현예에서, gRNA는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 변형은 포스포로티오에이트 연결 변형, 포스포로디티오에이트(PS2) 연결 변형, 2'-O-메틸 변형, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 변형은 gRNA의 5' 말단, gRNA의 3' 말단, 또는 이의 조합에서 이루어질 수 있다.
특정 구현예에서, gRNA 변형은 하나 이상의 포스포로디티오에이트(PS2) 연결 변형을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 사용되는 gRNA는 본 명세서에서 "DNA 연장"으로도 지칭되는 하나 이상의 데옥시리보핵산(DNA) 염기의 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 사용되는 gRNA는 gRNA의 5' 말단, gRNA의 3' 말단, 또는 이의 조합에서의 DNA 연장을 포함한다. 특정 구현예에서, DNA 연장은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 DNA 염기 길이일 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, DNA 연장은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 또는 25개의 DNA 염기 길이일 수 있다. 특정 구현예에서, DNA 연장은 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 또는 티민(T)으로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 염기를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, DNA 연장은 동일한 DNA 염기를 포함한다. 예를 들어, DNA 연장은 아데닌(A) 염기 가닥을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, DNA 연장은 티민(T) 염기 가닥을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, DNA 연장은 DNA 염기의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, DNA 연장은 표 3에 제시된 서열을 포함할 수 있다.
Cpf1 가이드 RNA에 대한 예시적인 적합한 5' 연장이 하기 표 3에 제공되어 있다:
[표 3]
예시적 Cpf1 gRNA 5' 연장
Figure pct00004
Figure pct00005
특정 구현예에서, 본 명세서에 사용되는 gRNA는 본 명세서에 개시된 DNA 연장뿐만 아니라, 화학적 변형, 예를 들어, 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결 변형, 하나 이상의 포스포로di티오에이트(PS2) 연결 변형, 하나 이상의 2'-O-메틸 변형, 또는 하나 이상의 추가의 적합한 화학적 gRNA 변형 또는 이의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 변형은 gRNA의 5' 말단, gRNA의 3' 말단, 또는 이의 조합에서 이루어질 수 있다.
이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, gRNA에 의해 표적화되는 표적 핵산에 혼성화하지 않고 또한 이러한 DNA 연장을 포함하지 않는 gRNA에 비해 표적 핵산 부위에서 편집할 때 증가를 나타내는 한, 임의의 DNA 연장이 본 명세서에 개시된 임의의 gRNA와 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 사용되는 gRNA는 본 명세서에서 "RNA 연장"으로도 지칭되는 하나 이상의 리보핵산(RNA) 염기의 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 사용되는 gRNA는 gRNA의 5' 말단, gRNA의 3' 말단, 또는 이의 조합에서 RNA 연장을 포함한다. 특정 구현예에서, RNA 연장은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 RNA 염기 길이일 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, RNA 연장은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 또는 25개의 RNA 염기 길이일 수 있다. 특정 구현예에서, RNA 연장은 아데닌(rA), 구아닌(rG), 시토신(rC), 또는 우라실(rU)로부터 선택된 하나 이상의 RNA 염기를 포함할 수 있으며, "r"은 RNA, 2'-하이드록시를 나타낸다. 특정 구현예에서, RNA 연장은 동일한 RNA 염기를 포함한다. 예를 들어, RNA 연장은 아데닌(rA) 염기 가닥을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RNA 연장은 상이한 RNA 염기의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 사용되는 gRNA는 본 명세서에 개시된 RNA 연장뿐만 아니라, 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결 변형, 하나 이상의 포스포로di티오에이트(PS2) 연결 변형, 하나 이상의 2'-O-메틸 변형, 하나 이상의 추가의 적합한 gRNA 변형, 예를 들어, 화학적 변형, 또는 이의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 변형은 gRNA의 5' 말단, gRNA의 3' 말단, 또는 이의 조합에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, RNA 연장을 포함하는 gRNA는 본 명세서에 제시된 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 gRNA는 또한 RNA 연장 및 DNA 연장을 포함할 수 있음이 고려된다. 특정 구현예에서, RNA 연장 및 DNA 연장은 gRNA의 5' 말단, gRNA의 3' 말단 둘 모두, 또는 이의 조합에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, RNA 연장은 gRNA의 5' 말단에 존재하고, DNA 연장은 gRNA의 3' 말단에 존재한다. 특정 구현예에서, RNA 연장은 gRNA의 3' 말단에 존재하고, DNA 연장은 gRNA의 5' 말단에 존재한다.
일부 구현예에서, 변형, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 5' 말단에서의 DNA 연장 및/또는 화학적 변형을 포함하는 gRNA는 RNA-가이드된 뉴클레아제, 예를 들어 AsCpf1 뉴클레아제와 복합체를 형성하여 RNP를 형성한 다음 표적 세포, 예를 들어 만능성 줄기세포 또는 이의 딸 세포를 편집하는데 사용된다.
추가의 적합한 gRNA 변형은 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 명백할 것이다. 적합한 gRNA 변형은 예를 들어, 각각의 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 "MODIFIED CPF1 GUIDE RNA"라는 명칭 하에 2018년 10월 2일에 출원된 PCT 출원 제 PCT/US2018/054027호, "GUIDE RNA WITH CHEMICAL MODIFICATIONS"이라는 명칭 하에 2015년 12월 3일에 출원된 PCT 출원 제 PCT/US2015/000143호; "CHEMICALLY MODIFIED GUIDE RNAS FOR CRISPR/CAS-MEDIATED GENE REGULATION"이라는 명칭 하에 2016년 4월 5일에 출원된 PCT 출원 제 PCT/US2016/026028호; 및 "NUCLEASE-MEDIATED GENOME EDITING OF PRIMARY CELLS AND ENRICHMENT THEREOF"이라는 명칭 하에 2016년 9월 23일에 출원된 PCT 출원 제 PCT/US2016/053344호에 기재된 것을 포함한다.
이 섹션에서 논의된 소정의 예시적인 변형은, 비제한적으로 5' 말단 또는 그 근처(예를 들어 5' 말단의 1 내지 10 개, 1 내지 5 개, 또는 1 내지 2 개 뉴클레오타이드 내) 및/또는 3' 말단 또는 그 근처(예를 들어 3' 말단의 1 내지 10 개, 1 내지 5 개, 또는 1 내지 2 개 뉴클레오타이드 내)를 포함하여 gRNA 서열 내의 임의의 위치에서 포함될 수 있다. 일부 경우, 변형은 기능적 모티프, 예컨대 Cas9 gRNA의 반복부-안티-반복부 이중체, Cas9 또는 Cpf1 gRNA의 스템 루프 구조, 및/또는 gRNA의 표적화 도메인 내에 위치한다.
일례로, gRNA의 5' 말단은 하기 보여진 바와 같이, 진핵의 mRNA 캡(cap) 구조 또는 캡 유사체(예를 들어 G(5')ppp(5')G 캡 유사체, m7G(5')ppp(5')G 캡 유사체, 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G 안티 리버스 캡 유사체(ARCA))를 포함할 수 있다:
Figure pct00006
캡 또는 캡 유사체는 gRNA의 화학적 또는 효소 합성 동안 포함될 수 있다.
유사하게는, gRNA의 5' 말단에 5' 트리포스페이트기가 결여되어 있을 수 있다. 예를 들어, 시험관내 전사된 gRNA는 5' 트리포스페이트기를 제거하기 위해(예를 들어 송아지 장 알칼리 포스파타제(calf intestinal alkaline phosphatase)를 사용하여) 포스파타제-처리될 수 있다.
또 다른 보편적인 변형은 gRNA의 3' 말단에서, 폴리A 트랙으로 지칭되는 복수의(예를 들어 1 내지 10 개, 10 내지 20개 또는 25 내지 200 개의) 아데닌(A) 잔기의 첨가를 수반한다. 폴리A 트랙은 화학적 또는 효소 합성 동안 폴리아데노신 폴리머라제(예를 들어 E. 콜라이 폴리(A)폴리머라제)를 사용하여, gRNA에 첨가될 수 있다.
가이드 RNA는 3' 말단 U 리보스에서 변형될 수 있다. 예를 들어, U 리보스의 2 개의 말단 하이드록실기는 알데하이드기로 산화되고, 리보스 고리의 공존적인 개환은 하기 제시된 바와 같이 변형된 뉴클레오사이드를 제공할 수 있으며:
Figure pct00007
여기서, "U"는 비변형된 또는 변형된 우리딘일 수 있다.
3' 말단 U 리보스는 하기 제시된 바와 같이 2'3' 사이클릭 포스페이트로 변형될 수 있으며:
Figure pct00008
여기서, "U"는 비변형된 또는 변형된 우리딘일 수 있다.
가이드 RNA는 예를 들어 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 혼입함으로써 분해에 대항해 안정화될 수 있는 3' 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 소정의 구현예에서, 우리딘은 변형된 우리딘, 예를 들어 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 및 5-브로모 우리딘, 또는 본 명세서에 기재된 변형된 우리딘 중 임의의 것으로 대체될 수 있으며; 아데노신 및 구아노신은 변형된 아데노신 및 구아노신, 예를 들어 8-위치에서의 변형, 예를 들어 8-브로모 구아노신, 또는 본 명세서에 기재된 변형된 아데노신 또는 구아노신 중 임의의 것으로 대체될 수 있다.
소정의 구현예에서, 당-변형된 리보뉴클레오타이드는 gRNA 내로 혼입될 수 있으며, 예를 들어 여기서, 2' OH-기는 H,- OR, -R(여기서, R은 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 할로, -SH, -SR(여기서, R은 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 아미노(여기서, 아미노는 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있음); 또는 시아노(-CN)로부터 선택되는 기에 의해 대체된다. 소정의 구현예에서, 포스페이트 백본은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어 포스포티오에이트(PhTx)기로 변형될 수 있다. 소정의 구현예에서, gRNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 각각 독립적으로, 비제한적으로 2'-당 변형된, 예컨대 2'-F 또는 2'-O-메틸을 포함하여 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 또는 2'-플루오로 변형된 아데노신(A), 2'-F 또는 2'-O-메틸, 시티딘(C), 2'-F 또는 2'-O-메틸, 우리딘(U), 2'-F 또는 2'-O-메틸, 티미딘(T), 2'-F 또는 2'-O-메틸, 구아노신(G), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘(Teo), 2'-O-메톡시에틸아데노신(Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸시티딘(m5Ceo) 및 이들의 임의의 조합을 포함하여 변형된 또는 비변형된 뉴클레오타이드일 수 있다.
가이드 RNA는 또한, "잠금(locked)" 핵산(LNA)을 포함할 수 있으며, 여기서 2' OH-기는 예를 들어 C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 가교에 의해 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있다. 임의의 적합한 모이어티는 이러한 가교를 제공하는 데 사용될 수 있으며, 비제한적으로 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 또는 아미노 가교; O-아미노(여기서, 아미노는 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음) 및 아미노알콕시 또는 O(CH2)n-아미노(여기서, 아미노는 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있음)를 포함한다.
소정의 구현예에서, gRNA는, 멀티사이클릭인 변형된 뉴클레오타이드(예를 들어 트리사이클로; 및 "비잠금(unlocked)" 형태, 예컨대 글리콜 핵산(GNA)(예를 들어 R-GNA 또는 S-GNA, 여기서 리보스는 포스포디에스테르 결합에 부착된 글리콜 단위에 의해 대체됨), 또는 트레오스 핵산(TNA, 여기서 리보스는 α-L-트레오푸라노실-(3'→2')로 대체됨)을 포함할 수 있다.
일반적으로, gRNA는 당 기(group) 리보스를 포함하고, 이러한 리보스는 산소를 갖는 5-원 고리이다. 예시적인 변형된 gRNA는 비제한적으로, 리보스에서(예를 들어 황(S), 셀레늄(Se), 또는 알킬렌, 예를 들어 메틸렌 또는 에틸렌으로의) 산소의 대체; 이중 결합의 첨가(예를 들어 리보스를 사이클로펜테닐 또는 사이클로헥세닐로 대체하기 위해); 리보스의 고리 축소(예를 들어 사이클로부탄 또는 옥세탄의 4-원 고리를 형성하기 위해); 리보스의 고리 팽창(예를 들어 추가의 탄소 또는 헤테로원자를 갖는 6-원 또는 7-원 고리, 예를 들어, 안하이드로헥시톨, 알트리톨, 만니톨, 사이클로헥사닐, 사이클로헥세닐, 및 포스포라미데이트 백본을 갖기도 하는 모르폴리노를 형성하기 위해)을 포함할 수 있다. 대부분의 당 유사체 변경이 2' 위치에 위치하더라도, 4' 위치를 포함하여 다른 부위도 변형을 받을 수 있다. 소정의 구현예에서, gRNA는 4'-S, 4'-Se 또는 4'-C-아미노메틸-2'-O-Me 변형을 포함한다.
소정의 구현예에서, 데아자 뉴클레오타이드, 예를 들어 7-데아자-아데노신이 gRNA 내로 혼입될 수 있다. 소정의 구현예에서, O-알킬화된 및 N-알킬화된 뉴클레오타이드, 예를 들어 N6-메틸 아데노신이 gRNA 내로 혼입될 수 있다. 소정의 구현예에서, gRNA 내의 하나 이상의 또는 모든 뉴클레오타이드는 데옥시뉴클레오타이드이다.
가이드 RNA는 또한 crRNA(이의 3' 말단) 및 tracrRNA(이의 5' 말단)의 상보적 영역 사이에 하나 이상의 교차 연결을 포함할 수 있다(예를 들어, "테트라루프" 구조 내에 및/또는 gRNA 내에서 발생하는 임의의 줄기 루프 구조에 위치함). 다양한 링커가 사용에 적합하다. 예를 들어, 가이드 RNA는 폴리비닐에테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리글리콜리드(PGA), 폴리락타이드(PLA), 폴리카프로락톤(PCL) 및 이의 공중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 공통 연결 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이중기능성 교차 링커는 제1 gRNA 단편의 5' 말단 및 제2 gRNA 단편의 3' 말단을 연결하는데 사용되고, 연결되는 gRNA 단편의 3' 또는 5' 말단은 교차 링커의 반응기와 반응하는 작용기로 변형된다. 일반적으로, 이러한 변형은 아민, 술프하이드릴, 카복실, 하이드록실, 알켄(예를 들어, 말단 알켄), 아지드 및/또는 다른 적합한 작용기 중 하나 이상을 포함한다. 다기능성(예를 들어, 이중기능성) 교차 링커는 또한 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 이종기능성 또는 동종기능성일 수 있으며, 제한 없이 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 아실 아지드, NHS 에스테르, 술포닐 클로라이드, 토실 에스테르, 트레실 에스테르, 알데하이드, 아민, 에폭시드, 카보네이트(예를 들어, 비스(p-니트로페닐) 카보네이트), 아릴 할라이드, 알킬 할라이드, 이미도 에스테르, 카복실레이트, 알킬 포스페이트, 무수물, 플루오로페닐 에스테르, HOBt 에스테르, 하이드록시메틸 포스핀, O -메틸이소우레아, DSC, NHS 카바메이트, 글루타르알데하이드, 활성화된 이중 결합, 사이클릭 헤미아세탈, NHS 카보네이트, 이미다졸 카바메이트, 아실 이미다졸, 메틸피리디늄 에테르, 아즐락톤, 시아네이트 에스테르, 사이클릭 이미도카보네이트, 클로로트리아진, 디히드로아제핀, 6-술포-시토신, 유도체, 말레이미드, 아지리딘, TNB 티올, Ellman 시약, 과산화물, 비닐술폰, 페닐티오에스테르, 디아조알칸, 디아조아세틸, 에폭사이드, 디아조늄, 벤조페논, 안트라퀴논, 디아조 유도체, 디아지린 유도체, 소랄렌 유도체, 알켄, 페닐 보론산 등을 포함하는 임의의 적합한 작용기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 gRNA 단편은 제1 반응기를 포함하고 제2 gRNA 단편은 제2 반응기를 포함한다. 예를 들어, 제1 및 제2 반응기는 각각 아민 모이어티를 포함할 수 있으며, 이는 카보네이트-포함 이중기능성 교차연결 시약으로 교차연결되어 우레아 연결을 형성한다. 다른 경우에, (a) 제1 반응기는 브로모아세틸 모이어티를 포함하고 제2 반응기는 술프하이드릴 모이어티를 포함하거나, 또는 (b) 제1 반응기는 술프하이드릴 모이어티를 포함하고 제2 반응기는 브로모아세틸 모이어티를 포함하며, 이는 브로모아세틸 모이어티와 술프하이드릴 모이어티의 반응에 의해 교차 연결되어 브로모아세틸-티올 결합을 형성한다. 이들 및 다른 교차 연결 화학은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌[Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 3rd Ed. 2013, published by Academic Press]을 포함하여 문헌에 요약되어 있다.
추가의 적합한 gRNA 변형은 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 명백할 것이다. 적합한 gRNA 변형은 예를 들어, 각각의 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 "MODIFIED CPF1 GUIDE RNA"라는 명칭 하에 2018년 10월 2일에 출원된 PCT 출원 제 PCT/US2018/054027호, "GUIDE RNA WITH CHEMICAL MODIFICATIONS"이라는 명칭 하에 2015년 12월 3일에 출원된 PCT 출원 제 PCT/US2015/000143호; "CHEMICALLY MODIFIED GUIDE RNAS FOR CRISPR/CAS-MEDIATED GENE REGULATION"이라는 명칭 하에 2016년 4월 5일에 출원된 PCT 출원 제 PCT/US2016/026028호; 및 "NUCLEASE-MEDIATED GENOME EDITING OF PRIMARY CELLS AND ENRICHMENT THEREOF"이라는 명칭 하에 2016년 9월 23일에 출원된 PCT 출원 제 PCT/US2016/053344호에 기재된 것을 포함한다.
예시적인 gRNA
본 개시내용에 포함되는 특정 구현예에 적합한 가이드 RNA의 비제한적 예는 본 명세서에서, 예를 들어 하기 표에 제공된다. 당업자는 표적화 도메인 서열의 개시내용으로부터 DNA 또는 RNA 서열로서 특정 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9 또는 Cpf-1 뉴클레아제에 대한 적합한 가이드 RNA 서열을 구상할 수 있을 것이다. 예를 들어, RNA 뉴클레오타이드로 이루어진 표적화 서열을 포함하는 가이드 RNA는 DNA 서열로 제공된 표적화 도메인 서열에 상응하는 RNA 서열을 포함할 것이고, 이는 티미딘 뉴클레오타이드 대신 우라실을 포함한다. 예를 들어, RNA 뉴클레오타이드로 이루어진 표적화 도메인 서열을 포함하고 DNA 서열 TCTGCAGAAATGTTCCCCGT(SEQ ID NO: 24)에 의해 기재된 가이드 RNA는 상응하는 RNA 서열 UCUGCAGAAAUGUUCCCCGU(SEQ ID NO: 25)의 표적화 도메인을 가질 것이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 이러한 표적화 서열은 적합한 가이드 RNA 스캐폴드, 예를 들어 crRNA 스캐폴드 서열 또는 키메라 crRNA/tracrRNA 스캐폴드 서열에 연결될 것이다. 적합한 gRNA 스캐폴드 서열은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, AsCpf1의 경우, 적합한 스캐폴드 서열은 표적화 도메인의 5' 말단에 추가된 서열 UAAUUUCUACUCUUGUAGAU(SEQ ID NO: 26)를 포함한다. 위의 예에서 이는 서열 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCUGCAGAAAUGUUCCCCGU(SEQ ID NO: 27)의 Cpf1 가이드 RNA를 생성한다. 당업자는 예를 들어, DNA 연장을 추가함으로써(예를 들어, 상기 예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 25량체 DNA 연장을 추가함으로써, 이러한 가이드 RNA를 변형하여 예를 들어, 서열 ATGTGTTTTTGTCAAAAGACCTTTTrUrArArUrUrUrCrUrArCrUrCrUrUrGrUrArGrArUrUrCrUrGrCrArGrArArArUrGrUrUrCrCrCrCrGrU)(SEQ ID NO: 28)의 가이드 RNA를 생성하는 방법을 추가로 이해한다. 본 명세서에 제공된 예시적인 표적화 서열은 제한적이지 않으며, 추가의 적합한 서열, 예를 들어 본 명세서에 개시된 특정 서열의 변이체는 문헌의 일반적인 지식의 관점에서 본 개시내용에 기반하여 숙련된 기술자에게 명백할 것이라는 것이 이해될 것이다.
일부 구현예에서 본 개시내용에 사용하기 위한 gRNA는 TGFβRII를 표적화하는 gRNA(TGFβRII gRNA)이다. 일부 구현예에서, TGFβRII를 표적화하는 gRNA는 표 4에 기재된 gRNA 중 하나 이상이다.
[표 4]
예시적 TGFβRII gRNA
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
일부 구현예에서 본 개시내용에 사용하기 위한 gRNA는 CISH를 표적화하는 gRNA(CISH gRNA)이다. 일부 구현예에서, CISH를 표적화하는 gRNA는 표 5에 기재된 gRNA 중 하나 이상이다.
[표 5]
예시적 CISH gRNA
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
일부 구현예에서, 본 개시내용에 사용하기 위한 gRNA는 B2M을 표적화하는 gRNA(B2M gRNA)이다. 일부 구현예에서, B2M을 표적화하는 gRNA는 표 6에 기재된 하나 이상의 gRNA이다.
[표 6]
예시적 B2M gRNA
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
일부 구현예에서, 본 개시내용에서 사용하기 위한 gRNA는 PD1을 표적화하는 gRNA이다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 B2M 및 PD1을 표적화하는 gRNA는 Welstead 등의 제 WO2015161276호 및 제 WO2017152015호에 추가로 기재되어 있고; 둘 모두 본 명세서에 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에서 사용하기 위한 gRNA는 NKG2A를 표적화하는 gRNA(NKG2A gRNA)이다. 일부 구현예에서, NKG2A를 표적화하는 gRNA는 표 7에 기재된 gRNA 중 하나 이상이다.
[표 7]
예시적 NKG2A gRNA
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
일부 구현예에서, 본 개시내용에 사용하기 위한 gRNA는 TIGIT를 표적화하는 gRNA(TIGIT gRNA)이다. 일부 구현예에서, TIGIT를 표적화하는 gRNA는 표 8에 기재된 gRNA 중 하나 이상이다.
[표 8]
예시적 TIGIT gRNA
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
일부 구현예에서 본 개시내용에 사용하기 위한 gRNA는 ADORA2a를 표적화하는 gRNA(ADORA2a gRNA)이다. 일부 구현예에서, ADORA2a를 표적화하는 gRNA 는 표 9에 기재된 gRNA 중 하나 이상이다.
[표 9]
예시적 ADORA2a gRNA
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
본 명세서에 개시된 예시적인 gRNA는 본 개시내용에 포함되는 비제한적인 구현예를 예시하기 위해 제공되는 것으로 이해될 것이다. 추가의 적합한 gRNA 서열은 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 명백할 것이고, 본 개시내용은 이와 관련하여 제한되지 않는다.
RNA-가이드된 뉴클레아제
본 개시내용에 따른 RNA-가이드된 뉴클레아제는 자연 발생 클래스 2 CRISPR 뉴클레아제 예컨대 Cas9 및 Cpf1뿐만 아니라, 이로부터 유래되거나 획득된 다른 뉴클레아제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 기능적 용어에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 (a) gRNA와 상호작용하고(예를 들어 복합체화하고); (b) gRNA와 함께, (i) gRNA의 표적화 도메인에 상보성인 서열 및 선택적으로, (ii) 하기에 보다 상세히 기재된 "프로토스페이서 인접 모티프," 또는 "PAM"으로 지칭되는 추가의 서열을 포함하는 DNA의 표적 영역에 회합되고 이를 선택적으로 절단하거나 변형시키는 뉴클레아제로서 정의된다. 하기 예가 예시할 바와 같이, RNA-가이드된 뉴클레아제는 광범위한 의미에서 이들의 PAM 특이성 및 절단 활성에 의해 정의될 수 있긴 하지만, 동일한 PAM 특이성 또는 절단 활성을 공유하는 개별 RNA-가이드된 뉴클레아제 사이에 변동이 존재할 수 있다. 당업자는, 본 개시내용의 일부 양태가 소정의 PAM 특이성 및/또는 절단 활성을 갖는 임의의 적합한 RNA-가이드된 뉴클레아제를 사용하여 실시될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것임을 이해할 것이다. 이러한 이유에서 다르게 명시되지 않는 한, 용어 RNA-가이드된 뉴클레아제는 일반 용어로서 이해되고, 임의의 특정 유형(예를 들어 Cas9 대(vs.) Cpf1), 종(예를 들어 에스.피오게네스 대 에스.아우레우스) 또는 변동(예를 들어 전장 대 절두 또는 분할; 자연-발생 PAM 특이성 대 조작된 PAM 특이성, 등)의 RNA-가이드된 뉴클레아제로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
PAM 서열은 그 명칭을 gRNA 표적화 도메인에 상보적인 "프로토스페이서(protospacer)" 서열(또는 "스페이서")에 대한 순차적 관계에서 정한다. 프로토스페이서 서열과 함께 PAM 서열은 특정 RNA-가이드된 뉴클레아제/gRNA 조합에 대한 표적 영역 또는 서열을 규정한다.
다양한 RNA-가이드된 뉴클레아제는 PAM과 프로토스페이서 사이의 상이한 순차 관계를 필요로 할 수 있다. 일반적으로, Cas9은 프로토스페이서의 3'인 PAM 서열을 인식한다. 한편, Cpf1은 일반적으로, 프로토스페이서의 5'인 PAM 서열을 인식한다.
PAM 및 프로토스페이서의 특이적인 순차 배향을 인식하는 것 외에도, RNA-가이드된 뉴클레아제는 또한, 특이적인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 에스.아우레우스 Cas9은 예를 들어 NNGRRT 또는 NNGRRV의 PAM 서열을 인식하며, 여기서 N 잔기는 gRNA 표적화 도메인에 의해 인식되는 영역의 3' 바로 옆에 존재한다. 에스.피오게네스 Cas9은 NGG PAM 서열을 인식한다. 에프.노비시다(F. novicida) Cpf1은 TTN PAM 서열을 인식한다. PAM 서열은 여러 가지 RNA-가이드된 뉴클레아제에 대해 식별되어 왔으며, 신규 PAM 서열을 식별하기 위한 전략은 문헌[Shmakov et al., 2015, Molecular Cell 60, 385-397, November 5, 2015]에 기재되어 있다. 또한, 조작된 RNA-가이드된 뉴클레아제는 기준 분자의 PAM 특이성과 상이한 PAM 특이성을 가질 수 있음을 주지해야 한다(예를 들어, 조작된 RNA-가이드된 뉴클레아제의 경우, 기준 분자는 RNA-가이드된 뉴클레아제가 유래되는 자연-발생 변이체, 또는 조작된 RNA-가이드된 뉴클레아제와 가장 큰 아미노산 서열 상동성을 갖는 자연-발생 변이체일 수 있음).
RNA-가이드된 뉴클레아제는 이들의 PAM 특이성 외에도, 이들의 DNA 절단 활성을 특징으로 할 수 있으며, 자연-발생 RNA-가이드된 뉴클레아제는 전형적으로 표적 핵산에서 DSB를 형성하지만, SSB만 발생시키거나(상기에서, 문헌[Ran & Hsu, et al., Cell 154(6), 1380-1389, September 12, 2013, ("Ran")]에 논의됨), 전혀 절단하지 않는 조작된 변이체가 생성되었다.
Cas9
유도된 단분자 RNA 및 표적 DNA(문헌[Nishimasu 2014; Anders et al., Nature. 2014 Sep 25;513(7519):569-73 ("Anders 2014"); 및 Nishimasu 2015])와의 복합체에서 S. 파이로제네스 Cas9(문헌[Jinek et al., Science 343(6176), 1247997, 2014 ("Jinek 2014"]) 및 S. 아우레우스 Cas9에 대한 결정 구조를 결정하였다.
자연 발생 Cas9 단백질은 하기 두 개의 로브를 포함한다: 인식(REC) 로브 및 뉴클레아제(NUC) 로브(이들 각각은 특정 구조적 및/또는 기능적 도메인을 포함한다). REC 로브는 아르기닌-풍부한 브리지 나선(BH) 도메인, 및 적어도 하나의 REC 도메인(예를 들어, REC1 도메인, 및 선택적으로, REC2 도메인)을 포함한다. REC 로브는 다른 알려진 단백질과 구조적 유사성을 공유하지 않으며, 이는 그것이 고유한 기능 도메인임을 나타낸다. 이론에 얽매이기를 원하지는 않지만, 돌연변이 분석은 BH 및 REC 도메인에 대한 특정한 기능적 역할을 시사한다: BH 도메인은 gRNA:DNA 인식을 담당하는 것으로 보이는 한편, REC 도메인은 gRNA의 반복부:안티-반복부 이중체와 상호작용하고 Cas9/gRNA 복합체의 형성을 매개하는 것으로 생각된다.
NUC 로브는 RuvC 도메인, HNH 도메인, 및 PAM-상호작용(PI) 도메인을 포함한다. RuvC 도메인은 레트로바이러스 인테그라제 수퍼패밀리 구성원과 구조적 유사성을 공유하고 표적 핵산의 비-상보성(즉, 하부) 가닥을 절단한다. 그것은 2 개 이상의 분할된 RuvC 모티프(예컨대 에스.피오게네스 및 에스.아우레우스의 RuvC I, RuvCII, 및 RuvCIII)로부터 형성될 수 있다. 한편, HNH 도메인은 HNN 엔도뉴클레아제 모티프와 구조적으로 유사하며, 표적 핵산의 상보성(즉, 상부) 가닥을 절단한다. PI 도메인은 그 명칭이 시사하듯이 PAM 특이성에 기여한다.
Cas9의 소정의 기능이 상기 제시된 특정 도메인과 연관되어 있지만(반드시 그에 의해 완전히 결정되는 것은 아님), 이들 및 기타 기능은 다른 Cas9 도메인에 의해, 또는 양 로브 상의 다수의 도메인에 의해 매개되거나 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 에스.피오게네스 Cas9에서, Nishimasu 2014에 기재된 바와 같이, gRNA의 반복부:안티반복부 이중체는 REC와 NUC 로브 사이의 홈 내에 속하고, 이중체의 뉴클레오타이드는 BH, PI, 및 REC 도메인의 아미노산과 상호작용한다. 제1 스템 루프 구조에서의 일부 뉴클레오타이드는, 제2 및 제3 스템 루프(RuvC 및 PI 도메인)에서의 일부 뉴클레오타이드와 마찬가지로, 다수의 도메인(PI, BH 및 REC1)의 아미노산과도 상호작용한다.
Cpf1
TTTN PAM 서열을 포함한 dsDNA 표적 및 crRNA와의 복합체에서 애시드아미노코커스 종 Cpf1의 결정 구조는 문헌[Yamano et al.(Cell. 2016 May 5; 165(4): 949-962 ("Yamano")](본 명세서에 참조로 포함됨)에 의해 해결되었다. Cas9와 마찬가지로 Cpf1은 다음의 2 개의 로브를 가진다: REC(인식) 로브 및 NUC(뉴클레아제). REC 로브는 REC1 및 REC2 도메인을 포함하며, 임의의 공지된 단백질 구조와의 유사성을 결여하고 있다. 한편, NUC 로브는 3 개의 RuvC 도메인(RuvC-I, RuvC-II 및 RuvC-III) 및 BH 도메인을 포함한다. 그러나, Cas9와는 대조적으로, Cpf1 REC 로브는 HNH 도메인을 결여하고 있고, 공지된 단백질 구조와의 유사성이 또한 결여되어 있는 다음의 다른 도메인을 포함한다: 구조적으로 독특한 PI 도메인, 3 개의 Ÿ‡지(Wedge)(WED) 도메인(WED-I, WED-II 및 WED-III), 및 뉴클레아제(Nuc) 도메인.
Cas9 및 Cpf1이 구조 및 기능 면에서 유사성을 공유하긴 하지만, 소정의 Cpf1 활성은 임의의 Cas9 도메인과 유사하지 않은 구조 도메인에 의해 매개됨을 이해해야 한다. 예를 들어, 표적 DNA의 상보성인 가닥의 절단은 Nuc 도메인에 의해 매개되는 것으로 보이며, 이러한 Nuc 도메인은 Cas9의 HNH 도메인으로부터 순차적으로 및 공간적으로 상이하다. 부가적으로, Cpf1 gRNA의 비-표적화 부분(핸들)은, Cas9 gRNA에서 반복부:안티반복부 이중체에 의해 형성되는 스템 루프 구조보다는 슈도노트(pseudoknot) 구조를 채택한다.
뉴클레아제 변이체
본 명세서에 기재된 RNA-가이드된 뉴클레아제는 여러 가지 적용에서 유용할 수 있는 활성 및 특성을 갖지만, 당업자는, RNA-가이드된 뉴클레아제가 소정의 경우, 절단 활성, PAM 특이성, 또는 다른 구조적 또는 기능적 특색을 변경하도록 변형될 수도 있음을 이해할 것이다.
먼저 절단 활성을 변이시키는 변형으로 돌아가서, NUC 엽 내 도메인의 활성을 감소시키거나 제거하는 돌연변이가 위에서 기재되었다. RuvC 도메인, Cas9 HNH 도메인 또는 Cpf1 Nuc 도메인에서 이루어질 수 있는 예시적인 돌연변이는 각각의 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Ran & Hsu, et al.,(Cell 154(6), 1380-1389, September 12, 2013), 및 Yamano, et al.(Cell. 2016 May 5; 165(4): 949-962)];뿐만 아니라 Cotta-Ramusino에 의한 제 WO 2016/073990호에 기재되어 있다. 일반적으로 두 개의 뉴클레아제 도메인 중 하나에서 활성을 감소 또는 제거하는 돌연변이는 닉카제 활성을 갖는 RNA-가이드된 뉴클레아제를 생성하지만, 닉카제 활성의 유형은 불활성화되는 도메인에 따라 다음에 유의해야 한다. 한 가지 예로서, RuvC 도메인 또는 Cas9 HNH 도메인의 불활성화는 닉카제를 생성한다.
자연 발생 Cas9 기준 분자에 대한 PAM 특이성의 변형은 S. 파이로제네스(문헌[Kleinstiver et al., Nature. 2015 Jul 23;523(7561):481-5]); 및 S. 아우레우스(문헌[Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2015 Dec; 33(12): 1293-1298]) 둘 모두에 대해 Kleinstiver 등에 의해 기재되었다. Kleinstiver 등은 또한 Cas9의 표적화 충실도를 개선하는 변형을 기재했다(문헌[Nature, 2016 January 28; 529, 490-495]). 이들 참조문헌 각각은 본 명세서에 참조로 포함된다.
RNA-가이드된 뉴클레아제는 2개 이상의 부분으로 분할되며, 이는 문헌[Zetsche et al.(Nat Biotechnol. 2015 Feb;33(2):139-42, 참조로 포함됨) 및 Fine et al.(Sci Rep. 2015 Jul 1;5:10777, 참조로 포함됨)]에 기재된 바와 같다.
소정의 구현예에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 예를 들어 gRNA 회합, 표적 및 PAM 인식, 및 절단 활성을 여전히 보유하면서도 뉴클레아제의 크기를 감소시키는 하나 이상의 결실을 통해 크기-최적화되거나 절두될 수 있다. 소정의 구현예에서, RNA 가이드 뉴클레아제는, 선택적으로 링커에 의해, 또 다른 폴리펩타이드, 뉴클레오타이드, 또는 다른 구조에 공유 또는 비-공유 결합된다. 예시적인 결합된 뉴클레아제 및 링커는 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Guilinger et al., Nature Biotechnology 32, 577-582 (2014)]에 기재되어 있다.
RNA-가이드된 뉴클레아제는 또한 선택적으로, 핵 내로의 RNA-가이드된 뉴클레아제 단백질의 이동을 용이하게 하기 위해 비제한적으로 핵 위치화 신호와 같은 태그를 포함한다. 소정의 구현예에서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 C-말단 및/또는 N-말단 핵 위치화 신호를 혼입할 수 있다. 핵 위치화 서열은 당업계에 공지되어 있고, Maeder에서와 다른 곳에서도 기재되어 있다.
상기 변형 목록은 그 성질이 예시적인 것으로 하고자 하며, 당업자는 본 개시내용의 양태에서 다른 변형이 소정의 적용에서 가능하거나 바람직할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 간략화를 위해, 본 개시내용의 예시적인 시스템, 방법 및 조성물은 특정 RNA-가이드된 뉴클레아제를 기준으로 하여 제시되지만, 사용되는 RNA-가이드된 뉴클레아제는 이들의 작동 원리를 변경시키지 않는 방식으로 변형될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 변형은 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
예시적인 적합한 뉴클레아제 변이체는 M537R 치환, H800A 치환 및/또는 F870L 치환, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 AsCpf1 변이체(AsCpf1 야생형 서열에 따른 넘버링 방식)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, ASCpf1 변이체는 M537R 치환, H800A 치환 및 F870L 치환을 포함한다. AsCpf1 아미노산 서열의 다른 적합한 변형은 당업자에게 공지되어 있다. 야생형 AsCpf1 및 AsCpf1 변이체의 일부 예시적인 서열이 아래에 제공된다:
His-AsCpf1-sNLS-sNLS H800A 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1144):
Figure pct00058
Cpf1 변이체 1 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1145):
Figure pct00059
Figure pct00060
Cpf1 변이체 2 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1146):
Figure pct00061
Cpf1 변이체 3 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1147):
Figure pct00062
Figure pct00063
Cpf1 변이체 4 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1148):
Figure pct00064
Cpf1 변이체 5 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1149):
Figure pct00065
Cpf1 변이체 6 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1150):
Figure pct00066
Figure pct00067
Cpf1 변이체 7 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1151):
Figure pct00068
예시적 AsCpf1 야생형 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1152):
Figure pct00069
Figure pct00070
추가의 적합한 뉴클레아제 및 뉴클레아제 변이체는 당업계의 지식을 고려하여 본 개시내용을 기반으로 하여 숙련된 기술자에게 명백할 것이다. 예시적인 적합한 뉴클레아제는 본 명세서의 표 2에 제공된 것들을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
RNA-가이드된 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산
RNA-가이드된 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9, Cpf1 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산이 본 명세서에 제공된다. RNA-가이드된 뉴클레아제를 인코딩하는 예시적인 핵산은 이전에 기재된 바 있다(예를 들어, Cong 2013; Wang 2013; Mali 2013; Jinek 2012 참고).
일부 경우, RNA-가이드된 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 합성 핵산 서열일 수 있다. 예를 들어, 합성 핵산 분자는 화학적으로 변형될 수 있다. 소정의 구현예에서, RNA-가이드된 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA는 하기 특성 중 하나 이상(예를 들어 모두)을 가질 것이다: mRNA는 캡핑되며; 폴리아데닐화되고; 5-메틸시티딘 및/또는 슈도우리딘으로 치환될 수 있다.
합성 핵산 서열은 또한, 코돈 최적화될 수 있으며, 예를 들어 적어도 하나의 비-보편적인 코돈 또는 덜-보편적인 코돈은 보편적인 코돈에 의해 대체되어 왔다. 예를 들어, 합성 핵산은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 포유류 발현 시스템에서 발현을 위해 최적화된 것과 같은 최적화된 메신저 mRNA의 합성을 명령할 수 있다. 코돈 최적화된 Cas9 코딩 서열의 예는 Cotta-Ramusino에 제시되어 있다.
이외에도 또는 대안적으로, RNA-가이드된 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 핵 위치화 서열(NLS)을 포함할 수 있다. 핵 위치화 서열은 당업계에 공지되어 있다.
예로서, Cpf1 변이체 4에 대한 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1177로서 하기에 제시된다.
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
액티빈
TGF-β 슈퍼패밀리는 액티빈, 인히빈, 미오스타틴, 골 형태형성 단백질(BMP), 성장 및 분화 인자(GDF) 및 결절을 포함하는 45개 초과의 구성원으로 이루어진다(예를 들어, 문헌[Morianos et al., Journal of Autoimmunity 104:102314 (2019)] 참조). 액티빈은 이황화 결합으로 연결된 βA 또는/및 βB 소단위의 동종이량체 또는 이종이량체로 발견된다. 액티빈의 3개의 기능적 이소형이 있다: 액티빈-A(βAβA), 액티빈 B(βBβB) 및 액티빈 AB(βAβB)(문헌[Xia et al., J. Endocrinol. 202:1-12 (2009)]). βC 및 βE 소단위는 포유류에서, βB 소단위는 제노푸스(Xenopus laevis)에서 발견된다. βA 및 βB 소단위체의 전사체는 인체의 거의 모든 조직에서 검출되고 생식계에서 증가된 발현을 나타내고, βC 및 βE 소단위는 주로 간에서 발현된다(문헌[Woodruff, Biochem. Pharmacol. 55:953-963). (1998)]). 액티빈-A는 약 25kDa의 사이토카인이며 액티빈 패밀리 중에서 가장 광범위하게 조사된 단백질을 나타낸다. 액티빈-A는 처음에 뇌하수체에서 난포 자극 호르몬의 생합성 및 분비를 유도하는 생식선 단백질로 확인되었다(문헌[Hedger et al., Cytokine Growth Factor Rev. 24:285-295 (2013)]). 이는 척추동물 사이에 고도로 보존되어 종 간 상동성이 최대 95%에 이른다. 액티빈-A는 조혈, 배아 발생, 줄기세포 유지 및 만능성, 조직 복구 및 섬유증과 같은 기본적인 생물학적 과정을 조절한다(문헌[Kariyawasam et al., Clin. Exp. Allergy 41:1505-1514 (2011)]).
액티빈, 예를 들어 액티빈 A는 널리 공지되어 있고 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, STEMCELL Technologies Inc., Cambridge, MA).
배양 방법
일반적으로, ES 세포(예를 들어, 하나 이상의 TGFβ 수용체, 예를 들어, TGFβRII가 발현되지 않도록 유전자 조작된 ES 세포)는 액티빈, 예를 들어, 특히, 유효 수준의 액티빈(예를 들어, 하나 이상의 배양 단계 동안)을 포함하는 배지에서 이러한 ES 세포를 배양함으로써 만능성을 유지하도록 배양될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ES 세포는 세포의 만능성을 유지하기 위해 액티빈, 예를 들어 증가된 수준의 액티빈을 포함하는 배지(예를 들어, 하나 이상의 배양 단계)에서 배양된다. 일부 구현예에서, 배양물로부터의 세포 샘플 중 하나 이상의 ES 마커(예를 들어, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-카드헤린, UTF-1, Oct4, Rex1 및/또는 Nanog)의 수준은 액티빈, 예를 들어, 증가된 수준의 액티빈을 포함하지 않는 동일한 배지를 사용하여 배양된 세포의 샘플 중 상응하는 수준(들)에 비해 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 ES 마커의 증가된 수준은 상응하는 수준의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% 이상만큼 상응하는 수준(들)보다 더 높다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "액티빈의 증가된 수준"은 표준 배지, 출발 배지, 하나 이상의 배양 단계에서 사용된 배지 및/또는 ES 세포가 배양된 배지에 존재하는 것보다 더 높은 농도의 액티빈을 의미한다. 일부 구현예에서, 액티빈은 표준 및/또는 출발 배지, 하나 이상의 다른 배양 단계에서 사용된 배지 및/또는 ES 세포가 배양된 배지에 존재하지 않으며, "증가된 수준"은 임의의 액티빈의 양이다. 배지는 초기에(즉, 배양 개시 시) 증가된 수준의 액티빈을 포함할 수 있고/있거나 배양 동안 배지에 액티빈을 보충하여 특정 시간 또는 시간들(예를 들어, 하나 이상의 단계)에 액티빈의 증가된 수준을 달성할 수 있다.
일부 구현예에서, 액티빈의 증가된 수준은 표준 배지, 출발 배지, 하나 이상의 배양 단계 동안의 배지 및/또는 ES 세포가 배양된 배지 중 액티빈의 수준에 비해 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000% 이상의 증가이다.
일부 구현예에서, 액티빈의 증가된 수준은 약 0.5 ng/mL, 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 4 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 15 ng/mL, 20 ng/mL, 25 ng/mL, 30 ng/mL, 35 ng/mL, 40 ng/mL, 45 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 100 ng/mL 이상의 액티빈이다. 일부 구현예에서, 액티빈의 증가된 수준은 약 0.5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL 액티빈, 약 0.5 ng/mL 내지 약 10 ng/mL 액티빈, 약 4 ng/mL 내지 약 10 ng/mL 액티빈이다.
세포는 당업계에 공지된 다양한 세포 배양 배지에서 배양될 수 있으며, 이는 본 명세서에 기재된 바와 같은 액티빈을 포함하도록 본 개시내용에 따라 변형된다. 세포 배양 배지는 동물 또는 포유류 세포와 같은 세포가 성장하는 영양 용액을 지칭하는 것으로 당업자에 의해 이해된다. 세포 배양 배지는 일반적으로 하기 성분 중 하나 이상을 포함한다: 에너지원(예를 들어, 글루코스와 같은 탄수화물); 아미노산; 비타민; 지질 또는 유리 지방산; 및 미량 원소, 예를 들어 무기 화합물 또는 자연 발생 원소(마이크로몰 범위). 세포 배양 배지는 또한 호르몬 및 다른 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장 인자, 혈청 등); 신호전달 인자(예를 들어, 인터루킨 15(IL-15), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β) 등); 염(예를 들어, 칼슘, 마그네슘 및 인산염); 완충액(예를 들어, HEPES); 뉴클레오사이드 및 염기(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 하이포잔틴); 항생제(예를 들어, 젠타마이신); 및 세포 보호제(예를 들어, 플루로닉 폴리올(Pluronic F68))와 같은 추가의 성분을 포함할 수 있다.
제조되었거나 상업적으로 입수가능한 배지는 본 명세서에 기재된 방법에서의 이용을 위해 본 개시내용에 따라 변형될 수 있다. 이러한 배지의 비제한적인 예는 최소 필수 배지(MEM, Sigma, St. Louis, Mo.); Ham's F10 배지(Sigma); 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium)(DMEM, Sigma); RPM I-1640 배지(Sigma); Hy클론 세포 배양 배지(Hy클론, Logan, Utah); Power CHO2(Lonza Inc., Allendale, NJ); 및 특정 세포 유형을 위해 제형화된 화학적으로 규정된(CD) 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 예를 들어 문헌[Chen et al., Nat. Methods 8:424-429(2011))]에 기재된 E8 배지이다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 액티빈을 포함하지만 TGFβ는 부재한다.
ES 세포에 적합한 세포 배양 조건(pH, O2, CO2, 교반 속도 및 온도 포함)은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대, 문헌[Schwartz et al., Methods Mol. Biol. 767:107-123 (2011) 및 Chen et al., Nat. Methods 8:424-429 (2011)]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 단계에서 배양되고, 세포는 하나 이상의 단계에서 증가된 수준의 액티빈을 갖는 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 배양 방법은 제1 단계(예를 들어, 액티빈이 부재하거나 감소된 수준의 액티빈을 갖는 배지 사용) 및 제2 단계(예를 들어, 증가된 수준의 액티빈을 갖는 배지 사용)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 방법은 제1 단계(예를 들어, 증가된 수준의 액티빈을 갖는 배지 사용) 및 제2 단계(예를 들어, 감소된 수준의 액티빈을 갖는 배지 사용)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 방법은 2개 초과의 단계, 예를 들어, 3, 4, 5, 6개 이상의 단계를 포함하고, 임의의 단계는 증가된 수준의 액티빈 또는 감소된 수준의 액티빈을 갖는 배지를 포함할 수 있다. 배양의 길이는 제한되지 않는다. 예를 들어, 배양 방법은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 방법은 적어도 2개의 단계를 포함한다. 예를 들어, 제1 단계는 감소된 수준의 액티빈을 갖는 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있고(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상 동안), 제2 단계는 증가된 수준의 액티빈을 갖는 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상 동안). 일부 구현예에서, 제1 단계는 증가된 수준의 액티빈을 갖는 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있고(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상 동안), 제2 단계는 감소된 수준의 액티빈을 갖는 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상 동안).
특정 방법에서, 세포 배양으로부터의 세포 샘플에서 발현되는 하나 이상의 ES 마커(예를 들어, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-카드헤린, UTF-1, Oct4, Rex1 및/또는 Nanog)를 세포 배양 중 1회 이상(예를 들어, 하나 이상의 단계) 동안 모니터링하여 조정하고(예를 들어, 배양 중 액티빈의 양을 증가 또는 감소시킴), 배양을 중단하고/하거나 배양으로부터 세포를 수확할 수 있다.
특성화 방법
세포 표현형을 특성화하는 단계를 포함하는 세포를 특성화하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 이러한 방법은 예를 들어 형태학적 분석 및 유세포측정을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 세포 계통 및 동일성 마커는 당업자에게 공지되어 있다. 하나 이상의 이러한 마커는 세포 집합의 조성 또는 하나 이상의 세포의 표현형 동일성을 결정하기 위해 하나 이상의 특성화 방법과 조합될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 특정 집합의 세포는 유세포측정을 사용하여 특성화될 것이다. 일부 이러한 구현예에서, 세포 집합의 샘플은 하나 이상의 세포 표면 마커 및/또는 하나 이상의 세포내 마커의 존재 및 비율에 대해 평가될 것이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 이러한 세포 표면 마커는 상이한 계통을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 만능성 세포는 예를 들어 CD34와 같은 이러한 세포와 관련된 것으로 알려진 마커 중 하나 이상에 의해 확인될 수 있다. 추가로, 일부 구현예에서, 세포는 일정 정도의 분화를 나타내는 마커에 의해 확인될 수 있다. 이러한 마커는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 분화된 세포의 마커는 예를 들어 CD43, CD45(분화된 조혈 세포)와 같은 분화된 조혈 세포와 관련된 것들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 분화된 세포의 마커는 예를 들어 CD56(신경 세포 부착 분자로도 공지됨), NK 세포 수용체 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγRIII, 분화 16의 덩어리(CD16), 자연 살해 그룹-2 구성원 A(NKG2A), 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D), CD69, 자연 세포독성 수용체(예를 들어, NCR1, NCR2, NCR3, NKp30, NKp44, NKp46 및/또는 CD158b), 살해 면역글로불린-유사 수용체(KIR) 및 CD94(살해 세포 렉틴-유사 수용체 하위패밀리 D, 구성원 1(KLRD1)로도 공지됨) 등과 같은 NK 세포 표현형과 관련될 수 있다. 일부 구현예에서, 마커는 T 세포 마커(예를 들어, CD3, CD4, CD8 등.)일 수 있다.
사용 방법
다양한 질환, 장애 및/또는 질병은 본 개시내용에 의해 제공되는 기술의 사용을 통해 치료될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 질환, 장애 및/또는 질병은 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 세포(예를 들어, 편집된 iNK 세포)를 대상체에게 도입함으로써 치료될 수 있다. 치료될 수 있는 질환의 예에는 암, 예를 들어 뇌, 전립선, 유방, 폐, 결장, 자궁, 피부, 간, 뼈, 췌장, 난소, 고환, 방광, 신장, 두부, 경부, 위, 자궁경부, 직장, 후두 또는 식도과 같은 고형 종양; 및 혈액 악성 종양, 예를 들어 급성 및 만성 백혈병, 림프종, 예를 들어 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종을 포함하는 B 세포 림프종, 다발성 골수종 및 골수이형성 증후군이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 필요한 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 치료제 또는 조성물은 질환, 장애 또는 질병(예를 들어, 손상 포함)의 발병 전, 동안 또는 후에 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 대상체는 세포 요법에 의해 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 질병을 갖는다. 일부 구현예에서, 세포 요법이 필요한 대상체는 질환, 장애 및/또는 질병이 있는 대상체이며, 세포 요법, 예를 들어 본 명세서에 기재된 세포를 포함하는 조성물이 대상체에게 투여되고, 이에 의해 세포 요법은 질환, 장애 및/또는 질병과 관련된 적어도 하나의 증상을 치료한다. 일부 구현예에서, 세포 요법이 필요한 대상체에는 골수 또는 줄기세포 이식의 후보, 화학요법 또는 방사선 요법을 받은 대상체, 과증식성 장애 또는 암, 예를 들어 과증식성 장애 또는 조혈계의 암이 있거나, 발병 위험이 있는 대상체, 종양, 예를 들어, 고형 종양이 있거나 발병할 위험이 있는 대상체 및/또는 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 관련된 질환이 있거나 발병 위험이 있는 대상체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
약제학적 조성물
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 유전자 변형된 세포, 예를 들어 본 명세서에 기재된 편집된 iNK 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC, 예를 들어, 유전자 변형된(예를 들어, 편집된) T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 포함하는 단리된 만능성 줄기세포 유래 조혈 계통 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 95% 내지 약 100% T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC, 예를 들어, 유전자 변형된(예를 들어, 편집된) T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 포함하는 단리된 만능성 줄기세포-유래 조혈 계통 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 만능성 줄기 세포-유래 조혈 계통 세포의 단리된 집합을 포함하고, 단리된 집합은 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30% 미만의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC, 예를 들어, 유전자 변형된(예를 들어, 편집된) T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 갖는다. 일부 구현예에서, 만능 줄기 세포 유래 조혈 계통 세포의 단리된 집합은 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 30% 초과의 T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC, 예를 들어, 유전자 변형된(예를 들어, 편집된) T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 갖는다. 일부 구현예에서, 만능성 줄기 세포 유래 조혈 계통 세포의 단리된 집합은 약 0.1% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 3%, 약 3% 내지 약 5%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 20%, 약 20% 내지 25%, 약 25% 내지 30%, 약 30% 내지 35%, 약 35% 내지 40%, 약 40% 내지 45%, 약 45% 내지 50%, 약 60% 내지 70%, 약 70% 내지 80%, 약 80% 내지 90%, 약 90% 내지 95%, 또는 약 95% 내지 약 100% T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC, 예를 들어, 유전자 변형된(예를 들어, 편집된) T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 갖는다.
일부 구현예에서, 만능성 줄기 세포 유래 조혈 계통 세포의 단리된 집합은 약 0.1%, 약 1%, 약 3%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100% T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC, 예를 들어, 유전자 변형된(예를 들어, 편집된) T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포 또는 HSC를 포함한다.
당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 자가 및 동종이계 세포 둘 모두가 입양 세포 요법에 사용될 수 있다. 자가 세포 요법은 일반적으로 다른 세포 요법에 비해 감염이 감소하고 GVHD의 가능성이 낮으며 면역 재구성이 빠르다. 동종이계 세포 요법은 일반적으로 다른 세포 요법에 비해 면역 매개 이식편대 악성종양(GVM) 효과와 낮은 재발률을 나타낸다. 세포 요법이 필요한 대상체의 특정 질병(들)에 기반하여, 당업자는 투여할 특정 유형의 요법(들)을 결정할 수 있을 것이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 대상체에 동종이계인 만능성 줄기세포 유래 조혈 계통 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 대상체에 자가 유래인 만능성 줄기세포-유래 조혈 계통 세포를 포함한다. 자가 이식의 경우, 만능성 줄기세포 유래 조혈 계통 세포의 단리된 집합은 환자 대상체와 완전 또는 부분 HLA 일치일 수 있다. 일부 구현예에서, 만능성 줄기세포 유래 조혈 계통 세포는 대상체에 HLA-일치되지 않는다.
일부 구현예에서, 만능성 줄기세포 유래 조혈 계통 세포는 투여 전에 생체외 또는 시험관내에서 확장되지 않고 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집합은 개선된 치료 잠재력을 갖는 면역 세포를 획득하기 위해 하나 이상의 제제를 사용하여 생체외에서 조절 및 처리된다. 일부 구현예에서, 유래된 조혈 계통 세포의 조절된 집합은 치료제(들)를 제거하기 위해 세척될 수 있고, 개선된 집합은 시험관내 집합의 추가 확장 없이 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집합은 단리된 집합을 하나 이상의 제제로 조절하기 전에 확장된다.
일부 구현예에서, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집합은 TCR, CAR 또는 다른 단백질을 발현하도록 유전자 변형될 수 있다(예를 들어, 재조합 방법에 의함). 재조합 TCR 또는 CAR을 발현하는 유전자 조작된 유래된 조혈 계통 세포의 경우, 세포의 유전자 변형 이전이든 이후이든, 세포는 예를 들어, 미국 특허 제 6,352,694호; 제 6,534,055호; 제 6,905,680호; 제 6,692,964호; 제 5,858,358호; 제 6,887,466호; 제 6,905,681호; 제 7,144,575호; 제 7,067,318호; 제 7,172,869호; 제 7,232,566호; 제 7,175,843호; 제 5,883,223호; 제 6,905,874호; 제 6,797,514호; 제 6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제 20060121005호에 기재된 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
암
임의의 암은 본 명세서에 기재된 조성물을 사용하여 치료될 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 치료 표적은 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 안구, 위장, 잇몸, 두부, 신장, 간, 폐, 비인두, 경부, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁의 암세포를 포함한다. 또한, 암은 구체적으로 하기 비제한적 조직학적 유형일 수 있다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두암; 편평 세포 암종; 림프상피암종; 기저 세포 암종; 모모체 암종; 이행 세포 암종; 유두 이행 세포 암종; 선암종; 가스트린종, 악성; 담관암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선양낭성암종; 샘종성 용종의 선암종; 선암종, 가족성 용종증 대장; 고형암종; 카르시노이드 종양, 악성; 분지-폐포 선암종; 유두 선암종; 발색단 암종; 호산구 암종; 호산성 선암종; 호염기구 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포 선암종; 유두 및 여포 선암종; 비피막 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지선암종; 귀질 선암종; 점막표피양암종; 낭선암종; 유두 낭선암; 유두 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 인장 고리 세포 암종; 침윤성 관 암종; 수질암; 소엽 암종; 염증성 암종; 파제트병, 유방; 포상 세포 암종; 선편평세포암종; 편평상피화생이 있는 선암종; 흉선종, 악성; 난소 기질 종양, 악성; 협막세포종, 악성; 과립막 세포 종양, 악성; 남성모세포종, 악성; 세르톨리 세포 암종; 라이디히 세포 종양, 악성; 지질 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 유방외 부신경절종, 악성; 갈색 세포종; 사구체육종; 악성 흑색종; 무멜라닌 흑색종; 표재성 확산 흑색종; 거대 색소 모반의 악성 흑색종; 상피세포 흑색종; 청색 모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유성 조직구종, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 혼합 종양, 악성; 뮬러 혼합 종양; 신모세포종; 간모세포종; 암육종; 간엽종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상 종양, 악성; 활액 육종; 중피종, 악성; 이상생식세포종; 배아 암종; 기형종, 악성; 난소 기질, 악성; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종; 혈관 주위 세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 피질옆 골육종; 연골육종; 연골모세포종, 악성; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유잉 육종; 치성 종양, 악성; 변색성 상아육종; 흑색모세포종, 악성; 변색성 섬유육종; 송과종, 악성; 척색종; 신경교종, 악성; 뇌실막종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 희소돌기아교종; 희소돌기모세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌 육종; 신경절신경모세포종; 신경 모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경연종, 악성; 과립 세포 종양, 악성; 악성 림프종; B 세포 림프종; 호지킨병; 호지킨 림프종; 부육아종; 악성 림프종, 소림프구성; 악성 림프종, 대세포, 미만성; 악성 림프종, 여포; 균상 식육종; 다른 특정 비호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적혈구백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수 육종; 및 모세포 백혈병.
일부 구현예에서, 암은 유방암이다. 일부 구현예에서, 암은 결장암이다. 일부 구현예에서, 암은 위암이다. 일부 구현예에서, 암은 RCC이다. 또 다른 구현예에서, 암은 비 소세포 폐암(NSCLC)이다.
일부 구현예에서, 단독으로 또는 하나 이상의 추가 암 치료 방식과 조합하여 본 명세서에 제공된 iNK 세포(예를 들어, 유전자 변형된 iNK 세포, 예를 들어, 편집된 iNK 세포)로 치료될 수 있는 고형 암 적응증은 다음을 포함한다: 방광암, 간세포 암종, 전립선암, 난소/자궁암, 췌장암, 중피종, 흑색종, 교모세포종, 자궁경부암 및 HPV+ 두경부암과 같은 HPV 관련 및/또는 HPV 양성 암, 구강암, 인두암, 갑상선암, 담낭암 및 연조직 육종. 일부 구현예에서, 단독으로 또는 하나 이상의 추가 암 치료 방식과 조합하여 본 명세서에 제공된 iNK 세포(예를 들어, 유전자 변형된 iNK 세포, 예를 들어, 편집된 iNK 세포)로 치료될 수 있는 혈액암 적응증은 다음을 포함한다: ALL, CLL, NHL, DLBCL, AML, CML 및 다발성 골수종(MM).
폐의 세포 증식성 및/또는 분화성 장애의 예는 부신생물 증후군, 세기관지폐포 암종, 신경내분비 종양, 예컨대 기관지 카르시노이드를 포함하는 기관지 암종, 다양한 종양, 전이성 종양 및 단독 섬유성 종양(흉막 섬유종) 및 악성 중피종을 포함하는 흉막 종양과 같은 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
유방의 세포 증식성 및/또는 분화성 장애의 예는 예를 들어 상피 증식증, 경화성 선종 및 소관 유두종을 포함하는 증식성 유방 질환; 종양, 예를 들어 섬유선종, 엽상 종양 및 육종과 같은 기질 종양 및 대관 유두종과 같은 상피 종양; 상피내 유관 암종(파제트병 포함) 및 소엽 상피내 암종을 포함하는 상피내(비침습) 암종 및 침습성 관 암종, 침윤성 소엽 암종, 수질 암종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 침습성(침윤성) 암종, 교질(점액성) 암종, 관상 암종, 침윤성 유두 암종 및 다른 악성 신생물을 포함하는 유방 암종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 남성 유방의 장애에는 여성형 유방 및 암종이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
결장을 포함하는 세포 증식성 및/또는 분화 장애의 예는 결장의 종양, 예컨대 비-신생물성 용종, 선종, 가족성 증후군, 결장직장 발암, 결장직장 암종 및 유암종 종양을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
암 또는 신생물 질병의 예는 상기 기재된 것 이외에 섬유육종, 근육육종, 지방육종, 연골육종, 골형성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉종양, 평활근육종, 횡문근육종, 위암, 식도암, 직장암, 췌장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 뇌암, 편평세포암종, 피지선암종, 유두암종, 유두선암종, 낭선암종, 수질암종, 기관지암종, 신세포암종, 간암, 담관암종, 융모막암종, 정액종, 배아암종, 빌름종양, 자궁경부암, 고환암, 소세포폐암, 비소세포 폐암, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개 인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종, 백혈병, 림프종 또는 카포시 육종을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 유용한 추가 암 치료 방식은 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 화학요법제는 티오테파(thiotepa) 및 CYTOXAN® 사이클로포스파미드(cyclosphosphamide)와 같은 알킬화제; 부술판(busulfan), 임프로술판(improsulfan) 및 피포술판(piposulfan)과 같은 알킬 술포네이트; 벤조도파(benzodopa), 카보쿠온(carboquone), 메투레도파(meturedopa), 우레도파(uredopa)와 같은 아지리딘(aziridine); 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌포스포르아미드(trietylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포르아미드(triethiylenethiophosphoramide) 및 트리메틸올로멜라민(trimethylolomelamine)을 포함하는 에틸렌이민(ethylenimine) 및 메틸아멜라민(methylamelamine); 아세토게닌(acetogenin)(특히 불라타신(bullatacin) 및 불라타시논(bullatacinone); 델타-9-테트라히드로칸나비놀(delta-9-tetrahydrocannabinol)(드로나비놀(dronabinol), MARINOL®); 베타-라파콘(beta-lapachone); 라파콜(lapachol); 콜히친(colchicines); 베툴린산(betulinic acid); 캄프토테신(camptothecin)(합성 유사체 토포테칸(topotecan)(HYCAMTIN®), CPT-11(이리노테칸(irinotecan), CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신(acetylcamptothecin), 스코폴렉틴(scopolectin) 및 9-아미노캄프토테신(9-aminocamptothecin) 포함); 브리오스타틴(bryostatin); 칼리스타틴(callystatin); CC-1065(이의 아도젤레신(adozelesin), 카르젤레신(carzelesin) 및 비젤레신(bizelesin) 합성 유사체 포함); 포도필로톡신(podophyllotoxin); 포도필린산(podophyllinic acid); 테니포사이드(teniposide); 크립토피신(cryptophycin)(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴(dolastatin); 듀오카르마이신(duocarmycin)(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈(eleutherobin); 판크라티스타틴(pancratistatin); 사르코딕틴(sarcodictyin); 스폰지스타틴(spongistatin); 클로람부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 콜로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파니드(ifosfanide), 메클로레타민(mechlorethamine), 메클로레타민 옥사이드 히드로클로라이드(mechlorethamine oxide hydrochloride), 멜팔란(melphalan), 노벤비친(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine) 및 라님누스틴(ranimnustine)과 같은 니트로우레아; 엔디인(enediyne ) 항생제(예를 들어, 칼리케아미신(calicheamicin), 특히 칼리케아미신 감마1I(calicheamicin 감마1I) 및 칼리케아미신 오메가11(calicheamicin omegal1)과 같은 항생제(예를 들어, 문헌[Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조)); 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신(dynemicin); 에스페라미신(esperamicin), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin) 발색단 및 관련 발색단백 엔디인 항생물질 발색단), 아클라시노마이신(aclacinomysin), 악티노마이신(actinomycin), 아우트라마이신(authramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycins), 락티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카미노마이신(caminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycinis), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신(6-diazo-5-oxo-L-norleucine), 독소루비신(doxorubicin)(ADRIAMYCIN®, 모르폴리노-독소루비신(morpholino-doxorubicin), 시아노모르폴리노-독소루비신(cyanomorpholino-doxorubicin), 2-피롤리노-독소루비신(2-pyrrolino-doxorubicin), 독소루비신 HCl 리포솜 주사(DOXIL®) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycin), 예컨대, 미토마이신 C( mitomycin C), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 퀘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 메토트렉세이트(methotrexate), 젬시타빈(gemcitabine)(GEMZAR®), 테가푸르(tegafur)(UFTORAL®), 카페시타빈(capecitabine)(XELODA®), 에포틸론(epothilone) 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질; 데놉테린(denopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 프테롭테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate)와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토퓨린(6-mercaptopurine), 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(6-azauridine), 카르모푸르(carmofur), 시타라빈(cytarabine), 디데옥시우리딘(dideoxyuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine)과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론 프로피오네이트(dromostanolone propionate), 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스탄(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone)과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 미토탄(mitotane), 트리로스탄(trilostane)과 같은 항부신; 프롤린산(frolinic acid)과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤(aceglatone); 알도포스파미드 배당체(aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산(aminolevulinic acid); 에닐루라실(eniluracil); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(bisantrene); 에다트락세이트(edatraxate); 데파민(defofamine); 데메콜신(demecolcine); 디아지쿠온(diaziquone); 엘포르미틴(elformithine); 엘립티늄 아세테이트(elliptinium acetate); 에토글루시드(etoglucid); 질산갈륨(gallium nitrate); 하이드록시우레아(hydroxyurea); 렌티난(lentinan); 로니다이닌(lonidainine); 메이탄신(maytansine) 및 아사미토신(ansamitocins)과 같은 메이탄시노이드(maytansinoids); 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론(mitoxantrone); 모피단몰(mopidanmol); 니트라에린(nitraerine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나멧(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 로속산트론(losoxantrone); 2-에틸히드라지드(2-ethylhydrazide); 프로카바진(procarbazine); PSK® 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산(razoxane); 리족신(rhizoxin); 시조푸란(sizofuran); 스피로게르마늄(spirogermanium); 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아지쿠온(triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민(2,2',2"-trichlorotriethylamine); 트리코테센(trichothecenes)(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A(verracurin A), 로리딘 A(roridin A) 및 안귀딘(anguidine)); 우레탄(urethan); 빈데신(vindesine0(ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미톨락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가시토신(gacytosine); 아라비노사이드(arabinoside)("Ara-C"); 티오테파(thiotepa); 탁소이드(taxoids), 예를 들어 파클리탁셀(paclitaxel)(TAXOL®), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형(ABRAXANET™) 및 독세탁셀(doxetaxel)(TAXOTERE®); 클로란부실(chloranbucil); 6-티오구아닌(6-thioguanine); 머캅토퓨린(mercaptopurine); 메토트렉세이트(methotrexate); 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin)과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴(vinblastine)(VELBAN®); 백금(platinum); 에토포사이드(etoposide)(VP-16); 이포스파미드(ifosfamide); 미톡산트론(mitoxantrone); 빈크리스틴(vincristine)(ONCOVIN®); 옥살리플라틴(oxaliplatin); 류코보빈(leucovovin); 비노렐빈(vinorelbine)(NAVELBINE®); 노반트론(novantrone); 에다트렉세이트(edatrexate); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 사이클로스포린(cyclosporine), 시롤리무스(sirolimus), 라파마이신(rapamycin), 라팔로그(rapalog), 이반드로네이트(ibandronate); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(difluoromethylornithine)(DMFO); 레티노산(retinoic acid)과 같은 레티노이드(retinoid); 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 독소루비신(doxorubicin), 빈크리스틴(vincristine) 및 프레드니솔론(prednisolone)의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP 및 5-FU, 류코보빈(leucovovin)과 조합된 옥살리플라틴(oxaliplatin)(ELOXATIN™)을 사용한 치료 요법에 대한 약어인 FOLFOX; 예를 들어, 타목시펜(tamoxifen)(NOLVADEX® 타목시펜 포함), 랄록시펜(raloxifene)(EVISTA®), 드롤록시펜(droloxifene), 4-하이드록시타목시펜(4-하이드록시tamoxifen), 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY117018, 오나프리스톤(onapristone) 및 토레미펜(toremifene)(FARESTON®)을 포함하는 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM); 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향 조절제(ERD); 풀베스트란트(fulvestrant)(FASLODEX®)와 같은 에스트로겐 수용체 길항제; 난소를 억제하거나 폐쇄하는 기능을 하는 제제, 예를 들어 류프롤리드 아세테이트(leuprolide acetate)(LUPRON® 및 ELIGARD®), 고세렐린 아세테이트(goserelin acetate), 부세렐린 아세테이트(buserelin acetate) 및 트립테렐린(tripterelin)과 같은 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH) 작용제; 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide) 및 비칼루타미드(bicalutamide)와 같은 다른 항안드로겐; 및 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제(aromatase)를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸(imidazoles), 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate)(MEGASE®), 엑세메스탄(exemestane)(AROMASIN®), 포르메스타니(formestanie), 파드로졸(fadrozole), 보로졸(vorozole)(RIVISOR®), 레트로졸(letrozole)(FEMARA®) 및 아나스트로졸(anastrozole)(ARIMIDEX®); 클로드로네이트(clodronate)(예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에타이드로네이트(etidronate)(DIDROCAL®), NE-58095, 졸레드론산(zoledronic acid)/졸레드로네이트(zoledronate)(ZOMETA®), 알렌드로네이트(alendronate)(FOSAMAX®), 파미드로네이트(pamidronate)(AREDIA®), 틸루드로네이트(tiludronate)(SKELID), 또는 리세드로네이트(risedronate)(ACTONEL®)와 같은 비스포스포네이트; 트록사시타빈(troxacitabine)(1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 유사체); 예를 들어 미국 특허 제 6,344,321호(본 명세서에 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 앱타머(aptamer); 항 HGF 단일클론 항체(예를 들어, Aveo의 AV299, Amgen의 AMG102); 절단된 mTOR 변이체(예를 들어, Compugen의 CGEN241); mTOR 유도된 경로를 차단하는 단백질 키나제 억제제(예를 들어, Arqule의 ARQ197, Exelexis의 XL880, SGX Pharmaceuticals의 SGX523, Supergen의 MP470, Pfizer의 PF2341066); THERATOPE® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 ALLLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신 및 VAXID® 백신과 같은 백신; 토포이소머라제 1 억제제(예를 들어, LURTOTECAN®); rmRH(예를 들어, ABAELIX®); 라파티닙 디토실레이트(lapatinib ditosylate)(ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제는 GW572016로도 알려짐); COX-2 억제제, 예를 들어 셀레콕시브(celecoxib)(CELEBREX®; 4-(5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일) 벤젠설폰아미드 및 상기 중 어느 하나의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
추가 암 치료 방식으로서 본 개시내용의 조성물 및 방법을 사용하기에 적합한 암 치료에 효과적인 다른 화합물은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 관련 부분이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌["Physicians' Desk Reference, 62nd edition. Oradell, N.J.: Medical Economics Co., 2008 ", Goodman & Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eleventh Edition. McGraw-Hill, 2005", "Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, Md.: Lippincott Williams & Wilkins, 2000", 및 "The Merck Index, Fourteenth Edition. Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories, 2006"]에 기재되어 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "~를 포함하다", "~를 포함한다" 및 "~를 포함하는"이라는 단어는 언급된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹을 배제하는 것은 아님을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "~로 이루어진"은 "~로 이루어진"이라는 문구 뒤에 오는 모든 것을 포함하고 이에 제한되는 것을 의미한다. 따라서 "~로 이루어진"이라는 문구는 나열된 요소가 요건이거나 필수이며 다른 요소가 존재하지 않을 수 있음을 나타낸다. "필질적으로 ~로 이루어진"은 문구 뒤에 나열된 임의의 요소를 포함하는 것을 의미하며, 나열된 요소에 대한 개시내용에 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 관여하지 않는 다른 요소로 제한된다. 따라서 "필수적으로 ~로 이루어진"이라는 문구는 나열된 요소가 요건이거나 필수이지만 다른 요소는 선택 사항이 아니며 나열된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지에 따라 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다.
이들 및 다른 변화는 상기 상세한 설명에 비추어 구현예에 대해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 다음의 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 구현예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 이러한 청구범위에 인정되는 균등물의 전체 범위와 함께 가능한 모든 구현예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
위에서 기재된 다양한 구현예는 추가 구현예를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 간행물, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물은 본 명세서에서 언급되고/되거나 출원 데이터 시트에 나열되어 있으며 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 명세서에 제공된 NCBI 뉴클레오타이드 또는 단백질 데이터베이스 항목과 같은 데이터베이스 항목의 내용은 그 전문이 본 명세서에 포함된다. 데이터베이스 항목이 시간이 지남에 따라 변화될 수 있는 경우, 본 출원의 출원일 현재 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다. 구현예의 양태는 추가 구현예를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 간행물의 개념을 사용하기 위해 필요한 경우 수정될 수 있다.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 실시예는 설명 목적으로만 제공된다. 이들은 어떤 식으로든 본 개시내용의 범위 또는 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: Cas12a를 사용한 편집된 iPSC 세포 생성 및 만능성에 대한 액티빈 A의 효과 시험
만능성 줄기세포로부터 자연살해세포를 생성하기 위해 대표적인 유도된 만능성 줄기세포(iPSC) 주를 생성하고 "PCS-201"로 명명하였다. 이 주를 상업적으로 이용 가능한 변형되지 않은 RNA 재프로그래밍 키트(Stemgent/Reprocell, USA)를 사용하여 ATCC(ATCC® PCS-201-012)에서 구입한 성인 남성 인간 1차 진피 섬유아세포를 재프로그래밍하여 생성하였다. 재프로그래밍 키트에는 302/367 덩어리의 면역 회피 mRNA(E3, K3, B18R)와 이중 가닥 마이크로RNA(miRNA)가 포함된 변형되지 않은 재프로그래밍 mRNA(OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG 및 LIN28)가 포함되어 있다. 섬유아세포를 섬유아세포 확장 배지(10% FBS가 포함된 DMEM/F12)에 시딩했다. 다음날, 배지를 뉴트리스템(Nutristem) 배지로 교체하고 4일(1 내지 4일차) 동안 매일 밤새 형질감염을 수행하였다. 1차 iPSC 콜로니는 7일차에 나타났고 10 내지 14일차에 선택하였다. 선택된 콜로니를 마스터 세포 뱅크을 확립하기에 충분한 수의 세포를 달성하기 위해 클론으로 확장하였다. 이 과정에서 선택되고 후속 실험에 사용되는 모 주는 줄기성 마커 발현, 정상 핵형 및 만능성 확인을 포함하여 표준 특질 제어를 통과했다.
편집된 iPSC 세포를 생성하기 위해, PCS-201(PCS) 세포를 대상 표적 유전자에서 절단하도록 설계된 Cas12a RNP로 전기천공하였다. 간단히 말해서, 세포를 ROCK 억제제(Y27632)로 형질감염시키기 24시간 전에 처리하였다. 형질감염 당일 아큐타제를 사용하여 단일 세포 용액을 생성하고 500,000 PCS iPS 세포를 적절한 전기천공 완충액 및 Cas12a RNP에 2 μM의 최종 농도로 재현탁시켰다. 2개의 RNP를 동시에 첨가했을 때, 총 RNP 농도는 4 μM(2+2)이었다. 이 용액을 Lonza 4D 전기천공기 시스템을 사용하여 전기천공했다. 전기천공 후, 세포를 클론R(Stemcell Technologies)을 포함하는 mTESR 배지의 6웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 매일 배지를 교체하면서 3 내지 5일 동안 성장하도록 하고 전기천공 후 48시간까지 배지에서 클론R을 제거했다. 단일 콜로니를 선택하기 위해, 확장된 세포를 단일 세포 현탁액에 재현탁시킨 후 10 cm 플레이트에 저밀도로 플레이팅하였다. Rock 억제제를 사용하여 플레이트 상의 콜로니 크기에 따라 플레이팅 후 3 내지 5일 동안 단일 세포 플레이팅 동안 세포를 지지하였다. 7 내지 10일 후, 허용 가능한 형태를 갖는 충분한 크기의 콜로니를 선택하고 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 선택된 콜로니를 후속 분석 및 세포주 동결보존을 위해 게놈 DNA를 수확할 수 있도록 충분한 수로 확장하였다. NGS에 의해 편집을 확인하고 선택된 클론을 추가로 확장하고 보관하였다. 궁극적으로, 핵형 분석, 줄기 흐름 및 분화 검정을 선택된 클론의 하위집합에 대해 수행하였다.
2개의 대상 표적 유전자는 CISH 및 TGFβRII였으며, 둘 모두 자연 살해 세포 기능을 향상시키는 것으로 가정하였다. TGFβ:TGFβRII 경로가 만능성 유지에 관여하는 것으로 고려되었기 때문에, iPSC에서 TGFβRII의 기능적 결실이 분화를 유도하고 TGFβRII 편집된 iPSC의 생성을 방지할 수 있다고 가정하였다. SMAD2/3 및 다른 세포내 분자를 조절하는 액티빈 수용체 신호전달 및 TGFβRII 신호전달의 수렴으로 인해 액티빈 A가 상업적으로 이용 가능한 만능성 줄기세포 배지 내의 TGFβ를 대체하여 편집된 주를 생성할 수 있다고 가정했다. 이 가정을 시험하기 위해 액티빈 A로 성장한 편집되지 않은 iPSC 및 TGFβRII 편집된 iPSC의 만능성을 평가했다. 다수의 상이한 배양 배지를 사용하였다: TGFβ의 부재 하에 "E6"(Essential 6™ Medium, #A1516401, ThermoFisher), 100 ng/ml의 bFGF가 보충된 E6인 "E7"(Peprotech, #100-18B), "E8"(Essential 8™ Medium, #A1517001, ThermoFisher) 및 100 ng/ml의 bFGF 및 다양한 농도의 액티빈 A(Peprotech #120-14P)로 보충된 E6인 "E7 + ActA". 일반적으로 E6 및 E7 배지는 일반적으로 배양에서 여러 계대에 걸쳐 PSC의 줄기성 및 만능성을 유지하기에 불충분하다.
액티빈 A가 외인성 TGFβ의 부재 하에 PCS iPSC를 유지할 수 있는지를 결정하기 위해, 편집되지 않은 PCS iPSC를 LaminStem™ 521(Biological Industries) 코팅된 6-웰 플레이트에 플레이팅하고 E6, E7, E8 또는 E7+ActA(1 ng/ml 및 4 ng/ml의 두 가지 상이한 농도의 액티빈 A 사용)에서 배양하였다. 2회 계대 후, 세포를 형태 및 줄기성 마커 발현에 대해 평가하였다. 도립 현미경에서 표준 위상차 설정을 사용하여 형태를 평가했다. 가장자리가 규정된 콜로니와 iPSC 콜로니의 통상적인 미분화된 세포를 줄기와 같은 것으로 고려하였다. 형태학적 관찰을 확인하기 위해 표준 iPS 세포 줄기성 마커의 발현을 세포내 유세포측정을 사용하여 측정하였다. 간단히 말해서, 세포를 해리하고 세포외 마커에 대해 염색한 다음 밤새 고정하고 Foxp3/전사 인자 염색 완충액 세트(eBioscience™)의 시약 및 표준 프로토콜을 사용하여 투과화했다. 세포를 항-인간 TRA-1-60-R_AF®488(Biolegend®; 클론 TRA-1-60-R), 항-인간 Nanog_AF®647(BD Pharmingen™; 클론 N31-355) 및 항-Oct4(Oct3)_PE(Biolegend®; 클론 3A2A20)로 유세포측정 분석을 위해 염색하였다. 세포를 NovoCyte Quanteon Flow Cytometer(Agilent)에 기록하고 FlowJo(FlowJo, LLC)를 사용하여 분석했다. 도 1에 나타난 바와 같이, 액티빈 A의 1 ng/mL 및 4 ng/mL 둘 모두 E8에서 성장된 세포에 대해 균등한 줄기성 마커 발현으로 만능성을 유지하기에 충분했다. 예상대로 E6 및 E7(TGFβ 부재)에서 성장한 세포는 E8과 동일한 정도로 줄기성 유전자 발현을 유지하지 않았으며, 이는 TGFβ 또는 액티빈 A의 부재 하에 iPSC 줄기성의 손실을 나타낸다. 이러한 결과는 액티빈 A가 TGFβ 신호전달의 부재 하에 iPSC 줄기성을 보충할 수 있음을 시사한다.
액티빈 A가 TGFβ의 부재 하에 iPSC 줄기성을 지원할 수 있다고 나타난 점을 감안하면, TGFβRII 녹아웃("KO") iPSC, CISH KO iPSC 및 TGFβRII/CISH 이중 녹아웃("DKO") iPSC 주가 생성되었다. 구체적으로, iPSC를 3개의 아미노산 치환(M537R, F870L 및 H800A(SEQ ID NO: 1148))이 있는 조작된 Cas12a 및 CISH 또는 TGFβRII에 특이적인 gRNA를 갖는 RNP를 사용하여 편집하였다. CISH/TGFβRII DKO iPSC를 생성하기 위해 iPSC를 CISH를 표적화하는 RNP와 TGFβRII를 표적화하는 RNP로 동시에 처리했다. 표 10의 특정 가이드 RNA 서열을 CISH 및 TGFβRII의 편집에 사용하였다. RNA, 표적화 도메인의 5'에 위치한 서열 UAAUUUCUACUCUUGUAGAU(SEQ ID NO: 1153)의 AsCpf1 스캐폴드 및 스캐폴드 서열의 5' 말단의 서열 ATGTGTTTTTGTCAAAAGACCTTTT(SEQ ID NO: 1154)의 25량체 DNA 연장으로 이루어진 표적화 도메인으로 두 가이드를 생성하였다.
[표 10]
가이드 RNA 서열
Figure pct00074
Figure pct00075
편집된 클론을 TGFβRII RNP로 처리된 세포에 대한 약간의 변형으로 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. 간단히 말해서, TGFβRII 편집된 PCS iPSC 및 TGFβRII/CISH 편집된 PCS iPSC를 편집된 클론의 생성을 지원하기 위해 10 ng/ml의 액티빈 A가 보충된 mTESR의 6웰 단계에서 전기천공 후 플레이팅하였다. 세포 콜로니 선택 및 초기 확장 단계를 통해 세포를 10 ng/ml의 액티빈 A와 함께 배양하였다. 정확한 단일 KO(CISH KO 또는 TGFβRII KO) 또는 이중 KO(CISH/TGFβRII DKO)를 갖는 것으로 평가된 콜로니를 선택하고 확장했다(클론 선택).
TGFβRII KO 및 TGFβRII/CISH DKO iPSC의 배양을 위한 액티빈 A의 최적 농도를 결정하기 위해, 약간 확장된 농도 곡선을 도 2에 나타낸 바와 같이 시험하였다. 이전에 수행된 평가와 유사하게, iPSC를 1 ng/ml, 2 ng/ml, 4 ng/ml 및 10 ng/ml 액티빈 A 농도로 Matrigel 처리된 6웰 플레이트에 배양하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 4 ng/mL 액티빈 A가 보충된 E7 배지에서 19일 동안(5회 계대) 배양된 TGFβRII KO 또는 CISH/TGFβRII DKO 세포는 야생형 형태를 유지했다. 도 3은 TGFβRII KO PCS-201 hiPSC 클론 9의 형태를 나타낸다.
도 4a에 도시된 바와 같이, CISH 및 TGFβRII RNP(클론 선택 전)로 동시에 처리된 iPSC의 초기 편집 효율은 CISH 대립유전자의 95%가 편집되고 TGFβRII 대립유전자의 78%가 편집되어 높았다. 편집되지 않은 iPSC 대조군에는 두 유전자좌 모두에서 삽입결실이 부재하였다. CISH 또는 TGFβRII RNP로 처리된 iPSC는 클론 선택 전에 개별적으로 93% 및 82% 편집률을 보였다(도 4a에 도시됨). KO 세포주(CISH KO iPSC, TGFβRII KO iPSC 및 CISH/TGFβRII DKO iPSC)를 보충 액티빈 A의 존재 하에서 배양한 후 만능성 마커 Oct4, SSEA4, Nanog 및 Tra-1-60의 존재에 대해 후속적으로 평가하였다. 도 4b 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 액티빈 A에서 KO 세포주를 배양하면 이러한 만능성 마커의 발현을 유지하였다.
이어서 액티빈 A에서 배양된 KO iPSC 주를 도 6에 개략적으로 도시된 바와 같이 STEMdiff™ Trilineage 분화 키트 검정(STEMCELL Technologies Inc., Vancouver, BC, CA)을 사용하여 분화하는 능력에 대해 평가하였다. 도 7a에 도시된 바와 같이, 보충 액티빈 A가 포함된 배지에서 단일 KO(TGFβRII KO iPSC 또는 CISH KO iPSC) 및 DKO(TGFβRII/CISH DKO iPSC) 세포주를 배양하면 외배엽(OTX2), 중배엽(단미증) 및 내배엽(GATA4) 마커의 발현에 나타나는 바와 같이, 3개의 배엽 모두의 초기 전구체로 분화하는 능력을 유지하였다(도 7a). 편집되지 않은 PCS 대조군 세포 또한 이러한 마커 각각을 발현할 수 있었다.
편집된 iPSC를 다음으로 Cas12a 편집이 전위와 같은 큰 유전적 이상을 유발했는지를 결정하기 위해 핵형을 분석했다. 도 7b에 도시된 바와 같이, 세포는 절단 부위 사이에 전위의 부재 하에 정상적인 핵형을 가졌다.
상기 기재된 결과를 추가로 뒷받침하기 위해, 편집되지 않은 모 PSC 주, 편집된 TGFβRII KO iPSC 클론(C7) 및 RUCDR로 명명된 추가의 대표적인(편집되지 않은) 세포주(RUCDR Infinite Biologics 그룹, Piscaway NJ)에서 확장된 액티빈 A 농도 곡선을 수행하였다. 처음에 iPSC를 1x LaminStem™ 521(Biological Industries) 코팅된 12웰 플레이트에 웰 당 1e5개의 세포로 시딩하였다. 웰이 75% 초과의 컨플루언시(confluency)를 달성할 때까지 세포를 1x PBS 해리 및 Y-27632(Biological Industries)에서 0.5 mM EDTA를 사용하여 약 40 내지 50일에 걸쳐 10회 계대했다. 세포를 대조군을 위해 Essential 6™ Medium(Gibco), TeSR™-E7™ 및 TeSR™-E8™(StemCell Technologies)에서 배양하고 4-로그 농도 투여량(0.001 내지 10 ng/mL)에 걸쳐 E. 콜라이(E. coli) 유래 재조합 인간/뮤린/랫트 액티빈 A가 보충된 TeSR™-E7™(PeproTech)을 사용하여 적정했다. 5 및 10회 계대 후, 세포를 해리한 다음 밤새 고정하고 Foxp3/전사 인자 염색 완충액 세트(eBioscience™)의 시약 및 표준 프로토콜을 사용하여 투과화했다. 세포를 항-인간 TRA-1-60-R_AF®488(Biolegend®; 클론 TRA-1-60-R), 항 Sox2_PerCP-Cy™5.5(BD Pharmingen™; 클론 O30-678), 항 인간 Nanog_AF®647(BD Pharmingen™; 클론 N31-355), 항-Oct4(Oct3)_PE(Biolegend®; 클론 3A2A20) 및 항-인간 SSEA-4_PE/Dazzle™ 594(Biolegend®; 클론 MC-813-70)로 유세포측정 분석을 위해 염색하였다. 세포를 NovoCyte Quanteon Flow Cytometer(Agilent)에 기록하고 FlowJo(FlowJo, LLC)를 사용하여 분석했다. 도 7c는 시험된 iPSC 주에 대한 적정 곡선을 나타낸다. 각 주를 유지하는데 필요한 액티빈 A의 최소 농도는 약간 다르며, TGFβRII KO iPSC는 모 대조군과 비교하여 더 높은 기준 양의 액티빈 A가 필요하다(0.5 ng/ml 대 0.1 ng/ml). 모든 3개의 세포주에서 4 ng/ml는 연장된 배양 기간 동안 줄기성 마커 발현을 유지하는데 필요한 최소량의 액티빈 A를 훨씬 초과했다. 도 7d는 기본 배지 단독(액티빈 A 부재)이 있는 세포 배양에서 줄기성 마커 발현을 나타낸다. 예상대로 TGFβRII KO iPSC는 발현을 유지하지 않고, 두 개의 편집되지 않은 주는 E8에서 줄기성 마커 발현을 유지할 수 있었다.
실시예 2: 편집된 CISH KO, TGFβRII KO 및 CISH/TGFβRII DKO iPSC에서 향상된 기능을 나타내는 iNK 세포로의 분화
도 8a는 향상된 CD56+ iNK 세포의 생성을 위한 CRISPR-Cas12a-편집된 iPSC 플랫폼의 개발을 위한 예시적인 작업 흐름도의 개략도를 도시한다. 도 8a에 도시된 바와 같이, CISH/TGFβRII DKO iPSC를 생성하기 위해 전기천공을 사용하여 세포에 RNP 전달을 통해 iPSC에서 CISH 및 TGFβRII 유전자를 표적화한다. 그런 다음 CISH 및 TGFβRII 유전자 모두에서 적절하게 편집된 iPSC를 선택하고 확장하여 마스터 iPSC 뱅크을 만들 수 있다. iPSC 마스터 뱅크로부터 편집된 세포는 이후 CD56+ CISH/TGFβRII DKO iNK 세포로 분화될 수 있다.
도 8b 및 도 8c는 iPSC를 iNK 세포로 분화시키는 과정의 2개의 예시적인 개략도를 도시한다. 도 8b 및 도 8c에 도시된 바와 같이, 편집된 세포(또는 편집되지 않은 대조군 세포)를 2단계 과정을 사용하여 분화시켰다. 먼저 "조혈 분화 단계"에서 hiPSC(편집 및 편집되지 않음)를 SCF(40 ng/mL), BMP4(20 ng/mL) 및 VEGF(20 ng/mL)가 포함된 StemDiff™ APEL2™ 배지(StemCell Technologies)에서 0 내지 10일 동안 배양하여, 스핀 배아유사체(SEB)를 생성했다. 도 8b에 나타난 바와 같이, SEB를 NK 세포 분화 단계에서 IL-3(5 ng/mL, 배양 첫 주에만 존재), IL-7(20 ng/mL), IL-15(10 ng/mL), SCF(20 ng/mL) 및 Flt3L(10 ng/mL)을 포함하는 StemDiff™ APEL2™ 배지에서 11 내지 39일 동안 배양하였다. CISH KO iPSC, TGFβRII KO iPSC, CISH/TGFβRII DKO iPSC 및 편집되지 않은 야생형 iPSC 주(PCS)를 도 8b의 개략도에 따라 iNK로 분화한 다음 NK 세포와 일치하는 표현형을 나타내는지를 평가하기 위해 특성화했다(도 9, 도 10 및 도 11a 참조). 도 11b, 도 11c, 도 12b, 도 12c 및 도 13에 기재된 CISH KO iPSC, TGFβRII KO iPSC, CISH/TGFβRII DKO iPSC 및 편집되지 않은 야생형 iPSC 주를 또한 도 8c에 표시된 대체 방법을 사용하여 iNK로 분화시킨 다음 NK 세포와 일치하는 표현형을 나타내는지를 평가하기 위해 특성화하였다(도 11b, 도 11c, 도 12b, 도 12c 및 도 13 참조).
구체적으로, CISH KO iNK, TGFβRII KO iNK, CISH/TGFβRII DKO iNK를 (i) 줄기세포(CD34); 및 (ii) 유세포측정에 의한 조혈 세포(CD43 및 CD45)의 예시적 표현형 마커에 대해 평가했다. 간단히 말해서, 각 유전자형에 대해 96웰 플레이트에서 두 줄의 배아유사체를 염색을 위해 수확했다. 트립신 및 기계적 교란을 사용하여 단일 세포 용액이 생성되면 인간 마커 CD34, CD45, CD31, CD43, CD235a 및 CD41에 대해 세포를 염색했다. 도 9에 도시된 바와 같이, CISH KO iNK, TGFβRII KO iNK, CISH/TGFβRII DKO iNK 및 야생형 모 클론(PCS)에서 유래한 iNK는 정제된 CD34+ HSC인 대조군 세포에 비해 더 낮은 수준의 CD34를 나타냈다. CD34 발현 수준은 이러한 iNK 세포 클론에 걸쳐 유사하여 iPSC의 편집이 CD34+ 단계로의 분화에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 도 10은 CISH KO iNK, TGFβRII KO iNK, CISH/TGFβRII DKO iNK 및 야생형 모 클론(PCS)로부터 유래된 iNK가 CD43 및 CD45에 대해 유사한 표면 발현 특성을 나타냄을 나타낸다. 따라서, 편집된 iPSC 및 편집되지 않은 iPSC에서 분화된 iNKS는 줄기세포 및 조혈 세포에 대해 유사한 수준의 마커를 나타내었고, 분화된 편집된 세포 및 편집되지 않은 세포 둘 모두 마커 발현 특성에 기반하여 특정 NK 세포 표현형을 나타냈다.
CISH KO iNK, TGFβRII KO iNK, CISH/TGFβRII DKO iNK, 야생형 모 클론(WT) 유래 iNK 및 말초혈액 유래 NK 세포(PBNK)를 NK 세포의 마커인 CD56의 표면 발현을 결정하기 위해 추가로 검정하였다. 간단히 말해서, 세포를 분화 39일차에 수확하고, 세척하고, 인간 CD56, CD16, NKp80, NKG2A, NKG2D, CD335, CD336, CD337, CD94, CD158을 인식하는 항체를 포함하는 유동 염색 완충액 재현탁시켰다. 세포 이벤트를 NovoCyte Quanteon Flow Cytometer(Agilent)에 기록하고 FlowJo(FlowJo, LLC)를 사용하여 분석하였다. 도 11a는 편집된 iPSC로부터 유래된 iNK 세포가 편집되지 않은 iPSC 모 클론 및 PBNK 세포로부터 유래된 iNK에 비해 유사한 CD56+ 표면 발현을 나타내었다는 것을 보여준다(배양 39일차). 도 11b는 편집된 iPSC로부터 유래된 iNK 세포가 편집되지 않은 iPSC 모 클론으로부터 유래된 iNK에 비해 유사한 CD56+ 및 CD16+ 표면 발현을 나타냈다는 것을 나타낸다(배양 39일차). 도 11c는 편집된 iPSC로부터 유래된 iNK 세포가 편집되지 않은 iPSC 모 클론 및 PBNK 세포로부터 유래된 iNK에 비해 유사한 CD56+, CD54+, KIR+, CD16+, CD94+, NKG2A+, NKG2D+, NCR1+, NCR2+ 및 NCR3+ 표면 발현을 나타내었다는 것을 보여준다(배양 39일차).
세포 기능을 확인하기 위해, xCelligence 플랫폼에서 종양 세포 세포독성 검정을 사용하여 세포를 평가하였다. 간단히 말해서, 종양 표적인 SK-OV-3 종양 세포를 플레이팅하고 96웰 xCelligence 플레이트에서 최적의 세포 밀도로 성장시켰다. 그런 다음 iNK를 TGFβ의 존재 하에 상이한 E:T 비율(1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 및 8:1)로 종양 표적에 추가했다. 도 12c는 세포용해 퍼센트로 측정되는 바와 같이, TGF-β의 존재 또는 부재(1:4, 1:2, 1:1 및 2:1의 E:T 비율) 하에 편집되지 않은 iNK 세포에 비해 TGFβRII KO 및 CISH/TGFβRII DKO 세포가 SK-OV-3 세포를 더 효과적으로 사멸시킴을 보여준다.
도 8b에 기재된 대안적 방법을 사용하여 생성된 iNK 세포는 CD56+이고 시험관내 세포독성 검정에서 종양 표적을 사멸시킬 수 있는 반면, iNK는 CD16, NKG2A 및 KIR과 같은 성숙한 NK 세포와 관련된 많은 정규 마커를 발현하지 않았다. K562 피더 세포주는 일반적으로 유사한 분화 방법론에 의해 생성된 iNK를 확장하고 성숙시키는데 사용된다. 피더에서 확장한 후 iNK는 종종 CD16, KIR 및 더 성숙한 표현형을 나타내는 다른 표면 마커를 발현한다. 기능이 향상된 보다 성숙한 iNK를 달성하기 위한 피더 부재 접근법을 확인하기 위해 대체 배지 조성물을 11일차 내지 39일차의 분화 단계에 대해 시험했다. APEL2에서 11일차 내지 39일차에 세포를 배양하는 대신(도 8b에 도시된 바와 같음), 스핀 배아유사체(SEB)를 위에서 언급한 것과 동일한 사이토카인의 존재 하에 15% 인간 AB 혈청과 함께 NK MACS® 배지(MACS Miltenyi Biotec)에서 배양하였다. 이 프로토콜은 도 8c에 나와 있다. 두 배지 조성물을 비교하기 위해 WT PCS, TGFβRII KO iPSC, CISH KO iPSC 및 DKO iPSC로부터의 11일차 SEB를 분화 과정의 후반부에 대해 2개의 조건으로서, 하나는 APEL2 베이스로 다른 하나는 NKMACS + 혈청 베이스로 분할하였다. 39일차에 세포 수율, 마커 발현 및 세포 독성 수준을 평가했다. 모든 경우에 NKMACS + 혈청 조건(도 8c에 도시됨)가 APEL2 조건(도 8b에 도시됨)보다 뛰어났다. 도 8d는 NKMACS + 혈청 조건이 39일 과정의 종료시 더 큰 확장 배수를 산출했음을 나타낸다(거의 300배 확장 대 100배 확장). NK 마커 발현을 위에서 기재한 대로 유세포측정에 의해 분석하였을 때, NKMACS + 혈청에서 배양된 iNK는 34% CD16 양성이었고 20% KIR 발현을 나타내는 반면 APEL2 조건은 두 마커에 대해 필수적으로 음성인 세포를 산출했다. 시험된 모든 유전자형의 경우가 이에 해당하였다. 시간 또는 조건에 대한 마커를 시각화하기 위해 유세포측정 데이터를 게이팅(gating)하고 FlowJo에서 분석하였으며 히트 맵을 작도하였다(도 8e 및 도 8f). 샘플을 먼저 생존 세포(FSC-H 대 LIVE/DEAD™ Fixable Yellow)에 대한 게이팅으로 세척한 다음 면역 세포(SSC-A 대 FSC-A), 단일(FSC-H 대 FSC-A) 및 자연 살해 세포 집합(CD56 대 CD45)에 대해 세척하였다. CD45+56+ 세포로 규정된 NK 집합을 게이팅하고 각 마커를 히스토그램/카운트 그래프(CD16+, CD94+, NKG2A+, NKG2D+, CD335+, CD336+, CD337+, NKp80+, panKIR+)와 동등한 분석에서 X축을 따라 분석하였다. 앞서 언급한 마커에 대한 통계를 흑색=0, 중간 강도 30<x<50, 최대 강도=100 매개변수로 설정된 키와 함께 이중 구배 히트 맵(GraphPad Prism 8)으로 시각화한다. 이 분석에 기반하여, 모든 유전자형에 걸친 발현 동역학 및 크기는 NKMACS + 혈청 조건에 의해 개선되었다. 세포를 또한 이전에 기재된 바와 같이 종양 세포 세포독성 검정에서 평가하였다. NKMACS + 혈청 조건에서 생성된 iNK는 APEL2에서 분화된 세포보다 더 낮은 E:T 비율로 사멸할 수 있었으며, 이는 개선된 NK 성숙이 세포의 기능에 긍정적인 영향을 미쳤음을 나타낸다(도 8g).
NKMACS + 혈청에서 추가 분화 마커의 분석은 CD16 발현의 존재를 확인하였다. 도 11b는 편집되지 않은 iPSC 또는 DKO iPSC로부터 유래된 특정 하위집합(CD45 대 CD56 및 CD56 대 CD16)의 분석을 나타낸다. 추가로, 도 11c에서 편집되지 않은 iNK 세포 및 CISH/TGFβRII DKO iNK의 세포 표면 마커 특성은 편집된 iNK 세포의 NK 세포 마커 특성이 편집되지 않은 iNK 세포의 것과 유사함을 확인시켜주었다. 종합하면, 이 데이터는 Cas12a로 편집된 단일 및 이중 KO iPSC 클론이 NK 세포 마커로 규정된 편집되지 않은 iPSC 클론과 유사한 방식으로 iNK 세포로 분화한다는 것을 나타낸다.
추가로, 특정 편집된 iNK 클론 세포(CISH 단일 녹아웃 "CISH_C2, C4, C5 및 C8", TGFβRII 단일 녹아웃 "TGFβRII-C7" 및 TGFβRII/CISH 이중 녹아웃 "DKO-C1") 및 모 클론 iNK 세포("WT")를 1 ng/mL 또는 10 ng/mL IL-15의 존재 하에 배양하고, 분화 마커를 hiPSC 분화 후 25일차, 32일차 및 39일차에 평가하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, 10 ng/mL IL-15에서 배양한 표면 발현 표현형(집합의 백분율로 측정)은 단일 녹아웃, 이중 녹아웃 및 모 클론 주에서 더 높은 비율의 표면 발현을 야기했다.
NK MACS® 배지 + 혈청 조건에서 분화된 편집된 iNK 세포를 다양한 분자 및 기능적 분석을 사용하여 시험관내에서 효과기 기능에 대해 평가하였다. 먼저, 39일차 iNK 세포에서 STAT3(pSTAT3) 및 SMAD2/3(pSMAD2/3)의 인산화 상태를 결정하기 위해 포스포유세포측정검정을 수행했다. CISH KO iNK는 IL-15 자극 시 증가된 pSTAT3를 나타내었고(도 11d), CISH/TGFβRII DKO iNK는 편집되지 않은 iNK 세포와 비교하여 TGF-β 자극 시 감소된 pSMAD2/3 수준을 나타냈다(도 11e). 이러한 데이터는 CISH/TGFβRII DKO iNK가 IL-15에 대한 감응성이 향상되고 TGF-β 매개 면역억제에 대한 내성이 향상되었음을 시사한다. 또한, CISH/TGFβRII DKO iNK를 포르볼 미리스테이트 아세테이트 및 이오노마이신(PMA/IMN) 자극 검정을 사용하여 IFNγ 및 TNFα 생성에 대해 특성화했다. 간단히 말해서, 세포를 4시간 동안 단백질 수송 억제제와 함께 2 ng/ml의 PMA 및 0.125 μM의 이오노마이신으로 처리하였다. 표준 세포내 염색 프로토콜을 사용하여 세포를 수확하고 염색하였다. CISH/TGFβRII DKO iNK는 PMA/IMN으로 자극될 때 상당히 더 많은 양의 IFNγ 및 TFNα를 생성하여(도 11f 및 도 11g), 편집되지 않은 대조군 iNK에 비해 자극 후 향상된 사이토카인 생성의 증거를 제공한다.
iNK 종양 세포 사멸 활성을 시험하기 위해, 3D 고형 종양 세포 사멸 검정(도 12a에 개략적으로 도시됨)을 사용하였다. 간단히 말해서, 5,000개의 NucLight 적색 표지된 SK-OV-3 세포를 96웰 초저 부착 플레이트에 시딩하여 스페로이드를 형성했다. 스페로이드를 효과기 세포(다른 E:T 비율) 및 10 ng/mL TGF-β를 추가하기 전에 37℃에서 인큐베이션한 후, 최대 120시간 동안 Incucyte S3 시스템을 사용하여 2시간마다 스페로이드를 이미지화했다. 제시된 데이터는 효과기 추가 시 적색 물질 강도로 정규화되었다. 스페로이드 곡선의 정규화는 비정규화 데이터에서 관찰된 것과 동일한 효능 패턴을 유지한다. 이 검정을 사용하여 4개의 CISH KO iPSC 클론, 2개의 TGFβRII KO iPSC 클론 및 1개의 CISH/TGFβRII DKO iPSC 클론에서 분화된 iNK의 세포독성을 편집되지 않은 모 iPSC로부터 유래된 대조군 iNK와 비교했다. 도 12b에 도시된 바와 같이, 편집된 iNK 세포는 편집되지 않은 iNK 대조군 세포보다 SK-OV-3 스페로이드의 크기를 더 효과적으로 감소시킬 수 있었다(6개 검정의 평균 데이터). 특히 CISH/TGFβRII DKO iNK 세포는 0.01보다 더 큰 모든 E:T 비율과 유의하게는 1 이상의 E:T 비율에서 편집되지 않은 iNK 세포보다 더 큰 정도로 SK-OV-3 스페로이드의 크기를 감소시켰다. TGFβRII KO 클론 7 iNK는 또한 편집되지 않은 iNK 세포와 비교할 때 상당히 향상된 사멸을 나타냈다. 다수의 단일 CISH KO 클론이 10:1 E:T 비율에서 사멸의 유의한 향상을 나타내지 않았지만, 대부분의 클론은 증가된 SK-OV-3 스페로이드 세포 사멸 경향을 나타내었으며, 가장 높은 E:T 비율에서 가장 큰 차이를 나타냈다. 편집된 iNK의 기능을 추가로 설명하기 위해 세포를 여러 날에 걸쳐 반복적으로 종양 표적을 사멸시키도록 적용하였고, 본 명세서에서는 시험관내 연속 사멸 검정으로서 기재되어 있다. 검정 0일차에 10 x 106개의 Nalm6 종양 세포(B 세포 백혈병 세포주) 및 2 x 105개의 iNK를 IL-15(10 ng/ml) 및 TGF-β(10 ng/ml)의 존재 하에 96웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅했다. 48시간 간격으로, 5 x 103개의 Nalm6 종양 세포(B 세포 백혈병 세포주)의 볼루스를 추가하여 iNK 집합을 재시험감염하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 편집된 iNK 세포(CISH/TGFβRII DKO iNK 세포)는 Nalm6 종양 세포로의 다회 시험감염 후에도 Nalm6 세포의 지속적인 사멸을 나타내고, 편집되지 않은 iNK 세포는 연속 사멸 효과가 제한적이었다. 데이터는 CISH 및 TGFβRII 편집이 세포 사멸의 연장된 향상을 야기한다는 결론을 뒷받침한다.
마지막으로, 편집된 iNK 세포(CISH/TGFβRII DKO iNK 세포)를 생체내 모델에서 종양 표적을 사멸시키는 능력에 대해 검정하였다. 이를 위해, 확립된 NOD scid 감마(NSG) 이종이식편 모델을 도 15a에 도시된 바와 같은 검정에 이용하였다. 간단히 말해서, 루시페라제를 발현하도록 조작된 1 x 106개의 SK-OV-3 세포를 0일차에 복강내(IP) 주사하였다. 3일차에, 접종된 마우스를 생체내 이미지화 시스템(IVIS)을 사용하여 이미지화하고 3개의 그룹으로 무작위화하였다. 다음날(4일차), 20 x 106개의 편집되지 않은 iNK 또는 CISH/TGFβRII DKO iNK를 IP 주사로 투여한 반면, 제3 그룹에는 대조군으로 비히클을 주사했다. 동물에 종양 세포를 접종한 후, 시간 경과에 따른 종양 양을 측정하기 위해 동물을 일주일에 한 번 이미지화하였다. 도 15b는 3개의 상이한 그룹(각 그룹에서 n=9), 비히클, 편집되지 않은 iNK 및 CISH/TGFβRII DKO iNK의 개별 마우스에서 종양의 생물발광을 도시한다. 이러한 동일한 동물에 대한 시간 경과에 따른 평균 종양 양은 도 15c에 도시되어 있다. 데이터에 대해 이원 anova 분석을 수행하였고, CISH/TGFβRII DKO iNK 처리된 동물은 편집되지 않은 iNK로 처리된 동물과 비교할 때 생물발광에 의해 측정된 바와 같이 종양 양이 유의하게 감소하였다(p 값: 0.0004). 종양 이식 후 10일차까지, CISH/TGFβRII DKO iNK를 주사한 마우스는 비히클 대조군 또는 편집되지 않은 iNK를 주사한 마우스에 비해 종양 크기가 상당히 감소한 것으로 나타났다. 종양 크기의 전반적인 감소는 수일 동안, 그리고 적어도 종양 이식 후 35일까지 나타난다. 이러한 데이터는 편집된 DKO iNK가 이 생체내 모델에서 종양 세포를 활발히 사멸시키고 있음을 나타낸다.
전반적으로, 이들 결과는 편집되지 않은 iPSC 및 CISH/TGFβRII DKO iPSC가 표준 NK 세포 마커를 나타내는 iNK 세포로 분화될 수 있음을 나타낸다. 또한, CISH/TGFβRII DKO iNK 세포는 고형 악성 종양 및 혈액 악성 종양 모두에서 유래한 종양 세포주에 대해 향상된 항종양 활성을 보여주었다.
실시예 3: ADORA2A 편집된 iPSC는 기능이 향상된 편집된 iNK를 생성한다.
ADORA2A는 또 다른 대상 표적 유전자이며, 이의 손실은 종양 미세환경(TME)에서 NK 세포 기능에 영향을 미치는 것으로 가정된다. ADORA2A 유전자는 TME의 아데노신에 반응하는 수용체를 인코딩하여 NK 세포에 대한 다수의 억제 효과를 유도하는 기능을 하는 cAMP를 생성한다. 본 발명자들은 ADORA2A의 기능을 녹아웃시키는 것이 iNK 세포 기능을 향상시킬 수 있다고 가정했다. 실시예 1 및 2에 기재된 것과 유사한 접근법을 이용하여, PCS iPSC 주를 3개의 아미노산 치환(M537R, F870L 및 H800A(SEQ ID NO: 1148))가 있는 조작된 Cas12a 및 ADORA2A에 특이적인 gRNA를 갖는 RNP를 사용하여 편집하였다(예외로, 2 μM RNP가 아니라 4 μM RNP를 세포에 전달함). 실시예 1에 기재된 바와 같이, gRNA를 RNA로 이루어진 표적화 도메인, 표적화 도메인의 5'에 위치한 서열 UAAUUUCUACUCUUGUAGAU(SEQ ID NO: 1153)의 AsCpf1 스캐폴드 및 스캐폴드 서열의 5' 말단에 서열 ATGTGTTTTTGTCAAAAGACCTTTT(SEQ ID NO: 1154)의 25량체 DNA 연장으로 생성하였다. ADORA2A gRNA 서열은 표 11에 나와 있다.
[표 11]
가이드 RNA 서열
Figure pct00076
Figure pct00077
클론 선택 전 Cas12a RNP에 의한 대규모 편집률은 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 결정된 바와 같이 49%였다. 그럼에도 불구하고 두 ADORA2A 대립유전자가 모두 편집된 다수의 클론을 확인하고, 확장하고 분화시켰다. ADORA2A 편집된 iPSC가 CD45+CD56+ iNK를 산출할 수 있는지를 결정하기 위해 대규모 및 단일 ADORA2A KO 클론 둘 모두를 실시예 2에 기재된 바와 같이 NKMACS + 혈청 프로토콜을 사용하여 분화시켰다(도 8c). 도 16a에 도시된 바와 같이, 편집된 iPSC는 편집되지 않은 대조군 iPSC와 비교하여 유사한 NK 세포 마커 발현을 갖는 iNK로 분화되었다.
Cas12a 매개 ADORA2A 편집이 유전자의 기능적 결실을 야기했는지 확인하기 위해, 5'-N-에틸카복사미드 아데노신("NECA", ADORA2A 작용제로서 작용하는 보다 안정한 아데노신 유사체) 처리에 대한 반응으로 cAMP 축적을 편집된 iNK 및 편집되지 않은 대조군 iNK 둘 모두에서 평가하였다. ADORA2A의 기능적 녹아웃이 있는 편집된 세포는 기능적 ADORA2A가 있는 세포에 비해 NECA에 대한 반응으로 세포에 많은 cAMP를 축적할 것으로 예상되지 않는다. 간단히 말해서, iNK 세포를 15분 동안 다양한 농도의 NECA로 처리하였다. 그런 다음 iNK 세포를 용해시킨 다음, 용해물 내의 cAMP를 CisBio cAMP 키트를 사용하여 측정하였다. 도 16b에 도시된 바와 같이, 편집되지 않은 iNK는 NECA의 농도가 증가함에 따라 증가된 cAMP 축적 수준을 가졌다(n=2). 반대로, ADORA2A("A2A KO") KO iNK는 증가하는 NECA 농도에서 최소의 cAMP 생성을 보여 Cas12a 유도된 편집이 ADORA2A 기능을 기능적으로 녹아웃시켰음을 나타낸다. 대규모 iNK(도 16b의 상위 2개 A2A KO iNK 주)는 선택된 ADORA2A KO 클론(도 16b의 하위 4개 A2A KO iNK 주)보다 약간 더 높은 수준의 cAMP를 나타냈으며, 이는 대규모 집합에서 더 낮은 편집률에서 예상되는 바와 같다. ADORA2A의 기능적 절제에 대한 이러한 분자적 증거에 기반하여, iNK는 종양 미세 환경에서 아데노신의 억제 효과에 대해 내성을 가질 것으로 예상된다.
ADORA2A KO iNK를 또한 실시예 2에 기재된 바와 같이 시험관내 NALM6 연속 사멸 검정에서 시험하였으며, 한 가지 주요 차이점은 100 μM의 NECA를 TGFβ 대신에 첨가하였다는 점이다. ADORA2A KO iNK는 NECA의 존재 하에 야생형 iNK에 비해 향상된 연속 사멸을 나타내어 ADORA2A KO iNK가 NECA 억제에 내성이 있음을 나타낸다(도 16c). 그 결과, ADORA2A KO iNK 세포는 편집되지 않은 iNK 세포에 비해 TME내 아데노신의 존재하에서 종양 세포에 대해 개선된 세포독성을 가질 것으로 예상될 것이다.
실시예 4: CISH/TGFβRII/ADORA2A 삼중 편집된(TKO) iPSC의 생성 및 분화된 TKO iNK의 특성화
CISH, TGFβRII 및 ADORA2A 삼중 편집된(TKO) iPSC를 생성하기 위해, 두 가지 접근법을 적용했다: 1) 실시예 1 및 2에 기재된 CISH/TGFβRII DKO(CR) iPSC 클론을 ADORA2A 표적화 RNP로 전기천공을 통해 ADORA2A 유전자좌에서 편집한 2단계 편집(실시예 3에 기재된 바와 같음) 및 2) 각 표적 유전자에 대해 하나씩 3개의 RNP 모두로 PCS iPS 세포의 동시 편집. 두 전략 모두 실시예 1에 간략히 기재된 편집 프로토콜을 활용했다. 동시 편집의 경우 총 RNP 농도는 8 μM(Cish:2 μM+ TGFβRII:2 μM+ADORA2A:4 μM)이었다. 접근법에 관계없이 위에서 기재한 대로 세포를 플레이팅하고 확장하고 콜로니를 선택했다. NGS를 사용하여 iPSC에서 수확된 gDNA를 분석한 결과, 모든 표적 유전자를 동시에 편집했을 때 CISH, TGFβRII 및 ADORA2A에 대해 대규모 편집률이 각각 96.70%, 97.17% 및 90.16%인 것으로 결정되었다. 추가 분석을 위해 6개 대립유전자 모두에서 삽입 및/또는 결실(삽입결실)이 있는 선택된 콜로니를 선택했다.
실시예 1에 기재된 분석과 유사하게, 편집되지 않은 iPSC 및 편집된 iPSC를 NK MACS + 혈청 조건(도 8c에 기재됨)을 사용하여 iNK로 분화시키고 배양 중 25일차, 32일차 및 39일차를 포함하는 상이한 시점에서 유세포측정에 의해 평가하였다. 도 17a에 도시된 바와 같이, 상이한 NK 표면 마커의 분석은 2단계 편집 방법(CR+A 8) 또는 동시 편집 방법(CRA 6)에 의해 생성된 클론 사이에 큰 차이를 나타내지 않았다. 두 TKO 클론(CR+A 8 및 CRA 6)은 각 시점에서 편집되지 않은 iNK(Wt)와 유사한 발현 특성을 보여주었다. TKO iNK 세포를 NECA에 대한 반응성에 대해 분석하였을 때(실시예 3에 기재된 바와 같음), 두 TKO iNK 모두 cAMP 축적이 거의 또는 전혀 없었으며(도 17b), 이는 ADORA2A가 기능적으로 녹아웃되었음을 나타낸다. 이와 달리, 편집되지 않은 iNK는 cAMP에서 NECA 투여량 의존적 증가를 보여주었다(도 17b). 이러한 결과는 TKO iNK가 TME에서 아데노신의 억제 효과에 대해 내성을 가질 것으로 예상된다는 것을 나타낸다. 마지막으로, CISH/TGFβRII/ADORA2A TKO iNK를 CISH/TGFβRII DKO iNK, ADORA2A 단일 KO(SKO) iNK 및 편집되지 않은 iNK와 함께 3D 종양 세포 사멸 검정에서 평가했다. 이 검정을 IL-15 및 TGFβ를 사용하지만 NECA 부재 하에 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 흥미롭게도, TKO(CRA6) 및 DKO(CR) iNK 둘 모두 종양 세포를 사멸시키는데 있어 편집되지 않은 iNK를 능가했으며, 이는 두 개의 다중 편집된 iNK 모두가 편집되지 않은 대조군 세포에 비해 기능이 향상되었음을 나타낸다(도 17c). 이러한 결과는 ADORA2A를 녹아웃시키면 종양 스페로이드 세포를 사멸시키는 CISH 및 TGFBRII KO를 갖는 iNK의 능력에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 5: CISH, TGFβRII, ADORA2A, TIGIT 및 NKG2A 표적화 gRNA의 선택.
CISH, TGFBRII, ADORA2A, TIGIT 및 NKG2A Cas12a 가이드 RNA의 절단 효율을 추가로 시험하였다. 가이드 RNA를 시험관 내에서 상업적으로 합성된 gRNA와 Cas12a를 복합화하고 전기천공을 통해 gRNA/Cas12a 리보핵단백질(RNP)을 IPSC에 전달하여 스크리닝하였다. iPSC를 3개의 아미노산 치환(M537R, F870L 및 H800A(SEQ ID NO: 1148))이 있는 조작된 Cas12a를 갖는 RNP를 사용하여 편집하였다. gRNA를 RNA로 이루어진 표적화 도메인, 표적화 도메인의 5'에 위치한 서열 UAAUUUCUACUCUUGUAGAU(SEQ ID NO: 1153)의 AsCpf1 스캐폴드 및 스캐폴드 서열의 5' 말단의 서열 ATGTGTTTTTGTCAAAAGACCTTTT(SEQ ID NO: 1154)의 25량체 DNA 연장으로 생성하였다. 표 12는 편집 활성에 대해 시험된 가이드 RNA의 표적화 도메인을 제공한다.
[표 12]
가이드 RNA 서열
Figure pct00078
Figure pct00079
간단히 말해서, 100,000 iPSC/웰을 대상 RNP로 형질감염시키고, 세포를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션한 다음, DNA 특성화를 위해 수확하였다. iPSC를 다양한 농도의 gRNA/Cas12a RNP로 형질감염시켰다. 백분율 편집 이벤트를 음성 대조군(0 mM)에서 8 mM 범위의 8가지 다른 RNP 농도에 대해 결정하였다.
도 18 패널 1에 도시된 바와 같이, TGFβRII gRNA(SEQ ID NO: 1161)는 약 79 nM RNP의 EC50을 나타내었다. 도 18 패널 2에 도시된 바와 같이, CISH gRNA(SEQ ID NO: 1162)는 약 50 nM RNP의 EC50을 나타냈다. 도 18 패널 3에 도시된 바와 같이, RNP2960에 포함된 ADORA2A gRNA(SEQ ID NO: 1163)는 약 63 nM RNP의 EC50을 나타내고, RNP3109에 포함된 ADORA2A gRNA(SEQ ID NO: 1164) 또는 RNP3108에 포함된 gRNA(SEQ ID NO: NO: 1165)는 각각 약 493 nM 및 약 280 nM RNP의 EC50 값을 나타냈다. 도 18 패널 4에 도시된 바와 같이, RNP2892에 포함된 TIGIT gRNA(SEQ ID NO: 1166)는 약 29 nM RNP의 EC50을 나타내고, RNP3106에 포함된 TIGIT gRNA(SEQ ID NO: 1167) 또는 RNP3107에 포함된 gRNA(SEQ ID NO: 167)는 각각 약 1146 nM 및 약 40 nM RNP의 EC50 값을 나타냈다. 도 18 패널 5에 도시된 바와 같이, RNP19142에 포함된 NKG2A gRNA(SEQ ID NO: 1169)는 약 8 nM RNP의 EC50을 나타내고, RNP3069에 포함된 NKG2A gRNA(SEQ ID NO: 1170) 또는 RNP2891에 포함된 gRNA(SEQ ID NO: 1171)는 각각 약 12 nM 및 약 13 nM RNP의 EC50 값을 나타냈다.
균등물
본 개시내용은 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위에 의해 규정되는 본 개시내용의 범위를 제한하지 않고 예시하기 위한 것임을 이해해야 한다. 다른 양태, 이점 및 수정은 다음 청구범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> EDITAS MEDICINE, INC. <120> ENGINEERED CELLS FOR THERAPY <130> 2011271-0141 <140> PCT/US2020/066256 <141> 2020-12-18 <150> 63/115,592 <151> 2020-11-18 <150> 63/025,735 <151> 2020-05-15 <150> 62/950,063 <151> 2019-12-18 <160> 1180 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 cuuuu 5 <210> 2 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 aagaccuuuu 10 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 auguguuuuu gucaaaagac cuuuu 25 <210> 4 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 aggccagcuu gccgguuuuu uagucgugcu gcuucaugug uuuuugucaa aagaccuuuu 60 <210> 5 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 ctttt 5 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 aagacctttt 10 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 atgtgttttt gtcaaaagac ctttt 25 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 aggccagctt gccggttttt tagtcgtgct gcttcatgtg tttttgtcaa aagacctttt 60 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 tttttgtcaa aagacctttt 20 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 gcttcatgtg tttttgtcaa aagacctttt 30 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 gccggttttt tagtcgtgct gcttcatgtg tttttgtcaa aagacctttt 50 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 tagtcgtgct gcttcatgtg tttttgtcaa aagacctttt 40 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 ccgaagtttt cttcggtttt 20 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 tttttccgaa gttttcttcg gtttt 25 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 aacgcttttt ccgaagtttt cttcggtttt 30 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 16 gcgttgtttt caacgctttt tccgaagttt tcttcggttt t 41 <210> 17 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 ggcttctttt gaagcctttt tgcgttgttt tcaacgcttt ttccgaagtt ttcttcggtt 60 tt 62 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 atgtgttttt gtcaaaagac ctttt 25 <210> 19 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 tttttttttt tttttttttt ttttt 25 <210> 21 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 auguguuuuu gucaaaagac cuuuu 25 <210> 22 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 25 <210> 23 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuu 25 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 tctgcagaaa tgttccccgt 20 <210> 25 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 ucugcagaaa uguuccccgu 20 <210> 26 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 27 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 uaauuucuac ucuuguagau ucugcagaaa uguuccccgu 40 <210> 28 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 28 atgtgttttt gtcaaaagac cttttuaauu ucuacucuug uagauucugc agaaauguuc 60 cccgu 65 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 caggacgatg tgcagcggcc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 accgcacgtt cagaagtcgg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 acaactgtgt aaattttgtg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 caactgtgta aattttgtga 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 acctgtgaca accagaaatc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 cctgtgacaa ccagaaatcc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 tgtggcttct cacagatgga 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 tctgtgagaa gccacaggaa 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 aagctcccct accatgactt 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 gaataaagtc atggtagggg 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 agaataaagt catggtaggg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 ctaccatgac tttattctgg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 taccatgact ttattctgga 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 taatgcactt tggagaagca 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 ttcataatgc actttggaga 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 aagtgcatta tgaaggaaaa 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 tgtgttcctg tagctctgat 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 tgtagctctg atgagtgcaa 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 agtgacaggc atcagcctcc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 agtggtggca ggaggctgat 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 aggttgaact cagcttctgc 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 caggttgaac tcagcttctg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 acctgggaaa ccggcaagac 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 cgtcttgccg gtttcccagg 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 gcgtcttgcc ggtttcccag 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 tgagcttccg cgtcttgccg 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 gcgagcactg tgccatcatc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 56 ggatgatggc acagtgctcg 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 57 aggatgatgg cacagtgctc 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 58 cgtgtgccaa caacatcaac 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 59 gctcaatggg cagcagctct 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 60 accagggtgt ccagctcaat 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 caccagggtg tccagctcaa 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 ccaccagggt gtccagctca 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 gcttggcctt atagacctca 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 gagcagtttg agacagtggc 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 agaggcatac tcctcatagg 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 ctatgaggag tatgcctctt 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 aagaggcata ctcctcatag 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 68 tatgaggagt atgcctcttg 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 gattgatgtc tgagaagatg 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 ctcctcagcc gtcaggaact 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 gttcctgacg gctgaggagc 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 gctcctcagc cgtcaggaac 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 73 tgacggctga ggagcggaag 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 tcttccgctc ctcagccgtc 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 aactccgtct tccgctcctc 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 caactccgtc ttccgctcct 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 ccaactccgt cttccgctcc 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 acgccaaggg caacctacag 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 cgccaagggc aacctacagg 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 agctgatgac atgccgcgtc 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 gggcgaggga gctgcccagc 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 cgggcgaggg agctgcccag 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 ccgggcgagg gagctgccca 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 tcgcccgggg gattgctcac 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 acatggagtg tgatcactgt 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 cagtgatcac actccatgtg 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 tgtgggaggc ccaagatgcc 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 tgtgcacgat gggcatcttg 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 89 cgaggatatt ggagctcttg 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 atatcctcgt gaagaacgac 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 gacgcaggga aagcccaaag 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 ctgcgtctgg accctactct 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 93 tgcgtctgga ccctactctg 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 94 cagacagagt agggtccaga 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 95 gccagcacga tcccaccgca 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 96 aaggaaaaaa aaaagcctgg 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 97 acaccagcaa tcctgacttg 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 actagcaaca agtcaggatt 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 99 gcaactccca gtggtggcag 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 tgtcatcatc atcttctact 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 gacctcagca aagcgacctt 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 aggccaagct gaagcagaac 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 aggagtatgc ctcttggaag 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 cctcttggaa gacagagaag 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 ttctcatgct tcagattgat 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 ctcgtgaaga acgacctaac 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 ggccgctgca catcgtcctg 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 gcggggtctg ccatgggtcg 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 agttgctcat gcaggatttc 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 ccagaataaa gtcatggtag 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 cccctaccat gactttattc 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 aagtcatggt aggggagctt 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 agtcatggta ggggagcttg 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 attgcactca tcagagctac 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 cctagagtga agagattcat 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 ccaatgaatc tcttcactct 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 aaagtcatgg taggggagct 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 gtgagcaatc ccccgggcga 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 gtcgttcttc acgaggatat 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 gccgcgtcag gtactcctgt 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 121 gacgcggcat gtcatcagct 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 122 gcttctgctg ccggttaacg 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 gtggatgacc tggctaacag 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 gtgatcacac tccatgtggg 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 gcccattgag ctggacaccc 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 gcggtcatct tccaggatga 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 gggagctgcc cagcttgcgc 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 gttgatgttg ttggcacacg 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 ggcatcttgg gcctcccaca 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 gcggcatgtc atcagctggg 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 gctcctcagc cgtcaggaac 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 gctggtgtta tattctgatg 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 ccgacttctg aacgtgcggt 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 tgctggcgat acgcgtccac 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 cccgacttct gaacgtgcgg 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 ccaccgcacg ttcagaagtc 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 tcacccgact tctgaacgtg 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 cccaccgcac gttcagaagt 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 cgagcagcgg ggtctgccat 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 acgagcagcg gggtctgcca 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 agcggggtct gccatgggtc 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 cctgagcagc ccccgaccca 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 ccatgggtcg ggggctgctc 20 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 aacgtgcggt gggatcgtgc 20 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 ggacgatgtg cagcggccac 20 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 gtccacagga cgatgtgcag 20 <210> 147 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 catgggtcgg gggctgctca 20 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 cagcggggtc tgccatgggt 20 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 atgggtcggg ggctgctcag 20 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 cggggtctgc catgggtcgg 20 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 aggaagtctg tgtggctgta 20 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 ctccatctgt gagaagccac 20 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 atgatagtca ctgacaacaa 20 <210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 gatgctgcag ttgctcatgc 20 <210> 155 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 acagccacac agacttcctg 20 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 156 gaagccacag gaagtctgtg 20 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 157 ttcctgtggc ttctcacaga 20 <210> 158 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 ctgtggcttc tcacagatgg 20 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 tcacaaaatt tacacagttg 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 gacaacatca tcttctcaga 20 <210> 161 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 161 tccagaataa agtcatggta 20 <210> 162 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 162 ggtaggggag cttggggtca 20 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 163 ttctccaaag tgcattatga 20 <210> 164 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 164 catcttccag aataaagtca 20 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 165 cacatgaaga aagtctcacc 20 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 166 ttccagaata aagtcatggt 20 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 ttttccttca taatgcactt 20 <210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 cacagttgtg gaaacttgac 20 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 cccaactccg tcttccgctc 20 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 ggctttccct gcgtctggac 20 <210> 171 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 171 ctgaggtcta taaggccaag 20 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 tgatgtgaga ttttccacct 20 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 173 cctatgagga gtatgcctct 20 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 174 aagtgacagg catcagcctc 20 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 175 ccatgacccc aagctcccct 20 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 176 cttcataatg cactttggag 20 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 177 ttcatgtgtt cctgtagctc 20 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 178 ttctggaaga tgctgcttct 20 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 179 cccaccaggg tgtccagctc 20 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 180 agacagtggc agtcaagatc 20 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 181 cctgcgtctg gaccctactc 20 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 182 cacaactgtg taaattttgt 20 <210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 183 gagaagcagc atcttccaga 20 <210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 184 tggttgtcac aggtggaaaa 20 <210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 185 ccaggttgaa ctcagcttct 20 <210> 186 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 186 atcacaaaat ttacacagtt g 21 <210> 187 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 187 ggcatcagcc tcctgccacc a 21 <210> 188 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 188 gttagccagg tcatccacag a 21 <210> 189 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 189 gctgggcagc tccctcgccc g 21 <210> 190 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 190 caggaggctg atgcctgtca c 21 <210> 191 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 191 gaggagcgga agacggagtt g 21 <210> 192 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 192 cgtctggacc ctactctgtc t 21 <210> 193 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 193 tttttccttc ataatgcact t 21 <210> 194 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 194 ccattgagct ggacaccctg g 21 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 195 cttctccaaa gtgcattatg a 21 <210> 196 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 196 gcccaagatg cccatcgtgc a 21 <210> 197 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 197 tcatgtgttc ctgtagctct g 21 <210> 198 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 198 gtgatgctgc agttgctcat g 21 <210> 199 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 199 tctcatgctt cagattgatg t 21 <210> 200 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 tccctatgag gagtatgcct c 21 <210> 201 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 201 catcacaaaa tttacacagt t 21 <210> 202 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 attgagctgg acaccctggt g 21 <210> 203 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 cagtcaagat ctttccctat g 21 <210> 204 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 204 aggatttctg gttgtcacag g 21 <210> 205 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 tccacagtga tcacactcca t 21 <210> 206 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 agcagaacac ttcagagcag t 21 <210> 207 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 ccggcaagac gcggaagctc a 21 <210> 208 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 gatgtcagag cggtcatctt c 21 <210> 209 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 tcattgcact catcagagct a 21 <210> 210 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 cttccagaat aaagtcatgg t 21 <210> 211 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 agattttcca cctgtgacaa c 21 <210> 212 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 actgcagcat cacctccatc t 21 <210> 213 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 agctgggcag ctccctcgcc c 21 <210> 214 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 tgacggctga ggagcggaag a 21 <210> 215 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 cattgagctg gacaccctgg t 21 <210> 216 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 agcaaagcga cctttcccca c 21 <210> 217 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 cgcgttaacc ggcagcagaa g 21 <210> 218 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 gaaatatgac tagcaacaag t 21 <210> 219 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 219 agacagagta gggtccagac g 21 <210> 220 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 caggatttct ggttgtcaca g 21 <210> 221 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 221 ctcctgtagg ttgcccttgg c 21 <210> 222 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 acagagtagg gtccagacgc a 21 <210> 223 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 gcttctccaa agtgcattat g 21 <210> 224 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 gcagcagaag ctgagttcaa c 21 <210> 225 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 tgaggagcgg aagacggagt t 21 <210> 226 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 226 ctttggagaa gcagcatctt c 21 <210> 227 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 ctcccctacc atgactttat t 21 <210> 228 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 228 gacagagtag ggtccagacg c 21 <210> 229 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 229 ctgaggagcg gaagacggag t 21 <210> 230 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 230 gggcatcttg ggcctcccac a 21 <210> 231 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 231 ccaagaggca tactcctcat a 21 <210> 232 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 232 agaatgacga gaacataaca c 21 <210> 233 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 233 cctgacgcgg catgtcatca g 21 <210> 234 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 agcgagcact gtgccatcat c 21 <210> 235 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 235 gcaggttagg tcgttcttca c 21 <210> 236 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 acctccatct gtgagaagcc a 21 <210> 237 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 taaagtcatg gtaggggagc t 21 <210> 238 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 tcagagctac aggaacacat g 21 <210> 239 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 239 tctcagacat caatctgaag c 21 <210> 240 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 240 catcagcctc ctgccaccac t 21 <210> 241 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 241 cgctcctcag ccgtcaggaa c 21 <210> 242 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 242 aacctgggaa accggcaaga c 21 <210> 243 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 243 tccacgccaa gggcaaccta c 21 <210> 244 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 244 gaggtgagca atcccccggg c 21 <210> 245 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 245 cagcagaagc tgagttcaac c 21 <210> 246 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 246 tccaagaggc atactcctca t 21 <210> 247 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 247 agcagaagct gagttcaacc t 21 <210> 248 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 248 ccagttcctg acggctgagg a 21 <210> 249 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 249 aggagtatgc ctcttggaag a 21 <210> 250 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 250 ttccaagagg catactcctc a 21 <210> 251 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 251 caactgtgta aattttgtga t 21 <210> 252 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 252 tgaaggaaaa aaaaaagcct g 21 <210> 253 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 253 cgtcttccgc tcctcagccg t 21 <210> 254 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 254 ccaggtcatc cacagacaga g 21 <210> 255 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 255 gcctagagtg aagagattca t 21 <210> 256 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 256 gttctccaaa gtgcattatg a 21 <210> 257 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 257 gcatcttcca gaataaagtc a 21 <210> 258 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 258 caaccgtctg gtggccgacg 20 <210> 259 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 259 caggatcggg gctgtcgctt 20 <210> 260 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 260 tcgggcctcg ctggccgtaa 20 <210> 261 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 261 gaggtagtcg gccatgcgcc 20 <210> 262 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 262 caggtgttgt cgggcctcgc 20 <210> 263 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 263 ggaggtagtc ggccatgcgc 20 <210> 264 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 264 ggcatactca atgcgtacat 20 <210> 265 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 265 ccgccttgtc atcaaccgtc 20 <210> 266 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 266 aggatcgggg ctgtcgcttc 20 <210> 267 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 267 ccttgtcatc aaccgtctgg 20 <210> 268 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 268 tactcaatgc gtacattggt 20 <210> 269 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 269 gggttccatt acggccagcg 20 <210> 270 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 270 ggcactgctt ctgcgtacaa 20 <210> 271 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 271 ggttgatgac aaggcggcac 20 <210> 272 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 272 tgctggggcc ttcctcgagg 20 <210> 273 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 273 ttgctggctg tggagcggac 20 <210> 274 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 274 ttctcctacc ttcgggaatc 20 <210> 275 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 275 gactggcttg ggcagttcca 20 <210> 276 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 276 catgcagccc ttgcctgctg 20 <210> 277 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 277 agcaaaggac gaggtctaga 20 <210> 278 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 278 gcctgctggg gccttcctcg 20 <210> 279 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 279 cagactcacc agattcccga 20 <210> 280 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 280 acctcgtcct ttgctggctg 20 <210> 281 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 281 ctcaccagat tcccgaaggt 20 <210> 282 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 282 tacgcagaag cagtgcccgc 20 <210> 283 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 283 aggtgtacag cagtggctgg 20 <210> 284 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 284 ggtgtacagc agtggctggt 20 <210> 285 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 285 cggatgtggt cagccttgtg 20 <210> 286 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 286 cactgacagc gtgaacaggt 20 <210> 287 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 287 actgacagcg tgaacaggta 20 <210> 288 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 288 gctcactctc tgtctgggct 20 <210> 289 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 289 ctggctgtgg agcggactgg 20 <210> 290 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 290 gctctgactg tacggggcaa 20 <210> 291 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 291 agctctgact gtacggggca 20 <210> 292 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 292 acagtacccc ttccagctct 20 <210> 293 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 293 cgtcggccac cagacggttg 20 <210> 294 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 294 ccagccactg ctgtacacct 20 <210> 295 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 295 accccggccc tgcctatgcc 20 <210> 296 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 296 ggtatcagca gtgcaggagg 20 <210> 297 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 297 gatgtggtca gccttgtgca 20 <210> 298 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 298 ggatgtggtc agccttgtgc 20 <210> 299 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 299 ggccacgcat cctggccttt 20 <210> 300 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 300 gaaaggccag gatgcgtggc 20 <210> 301 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 301 actgcttgtc caggccacgc 20 <210> 302 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 302 tctggactcc aactgcttgt 20 <210> 303 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 303 gtctggactc caactgcttg 20 <210> 304 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 304 gcttccgtct ggactccaac 20 <210> 305 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 305 gacggaagct ggagtcggca 20 <210> 306 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 306 cgctgtcagt gaaaaccact 20 <210> 307 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 307 ctgacagcgt gaacaggtag 20 <210> 308 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 308 ttacggccag cgaggcccga 20 <210> 309 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 309 attacggcca gcgaggcccg 20 <210> 310 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 310 ggaatctggt gagtctgagg 20 <210> 311 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 311 ccctcagact caccagattc 20 <210> 312 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 312 cgaaggtagg agaaggtctt 20 <210> 313 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 313 gaaggtagga gaaggtcttg 20 <210> 314 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 314 gcacctttgg ctcactctct 20 <210> 315 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 315 tcgaggaggt ggcagagggt 20 <210> 316 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 316 tggaactgcc caagccagtc 20 <210> 317 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 317 agggacgggg cccacagggg 20 <210> 318 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 318 gggacggggc ccacaggggc 20 <210> 319 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 319 ctccacagcc agcaaaggac 20 <210> 320 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 320 cagccagcaa aggacgaggt 20 <210> 321 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 321 ctgccttcta gacctcgtcc 20 <210> 322 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 322 cctaaggagg atgcgcctag 20 <210> 323 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 323 tggcctcctg cactgctgat 20 <210> 324 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 324 agcagtgcag gaggccacat 20 <210> 325 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 325 ccgactccag cttccgtctg 20 <210> 326 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 326 ggggttccat tacggccagc 20 <210> 327 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 327 cacagcagat cctcctctgg 20 <210> 328 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 328 attgccccgt acagtcagag 20 <210> 329 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 329 cccgtacagt cagagctgga 20 <210> 330 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 330 tggtggagga gcaggcagtg 20 <210> 331 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 331 tccttaggca taggcagggc 20 <210> 332 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 332 cggccctgcc tatgcctaag 20 <210> 333 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 333 taggcatagg cagggccggg 20 <210> 334 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 334 aggcagggcc ggggtgggag 20 <210> 335 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 335 gcaggatcgg ggctgtcgct 20 <210> 336 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 336 ctgcacaagg ctgaccacat 20 <210> 337 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 337 tgcacaaggc tgaccacatc 20 <210> 338 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 338 ctgaccacat ccggaaaggc 20 <210> 339 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 339 ggccacgcat cctggccttt 20 <210> 340 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 340 gcgtggcctg gacaagcagt 20 <210> 341 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 341 gacaagcagt tggagtccag 20 <210> 342 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 342 gttggagtcc agacggaagc 20 <210> 343 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 343 atgcgtacat tggtggggcc 20 <210> 344 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 344 tggccccacc aatgtacgca 20 <210> 345 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 345 gctacctgtt cacgctgtca 20 <210> 346 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 346 tgacagcgtg aacaggtagc 20 <210> 347 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 347 gtcgggcctc gctggccgta 20 <210> 348 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 348 gcacttgcct aggctggtat 20 <210> 349 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 349 gggaatctgg tgagtctgag 20 <210> 350 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 350 ctcaccagat tcccgaaggt 20 <210> 351 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 351 ctcctacctt cgggaatctg 20 <210> 352 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 352 caagaccttc tcctaccttc 20 <210> 353 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 353 ccaagacctt ctcctacctt 20 <210> 354 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 354 gccaagacct tctcctacct 20 <210> 355 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 355 tatgcacagc agatcctcct 20 <210> 356 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 356 caaaggtgct ggacccagag 20 <210> 357 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 357 ggctcactct ctgtctgggc 20 <210> 358 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 358 agggtacccc agcccagaca 20 <210> 359 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 359 agagggtacc ccagcccaga 20 <210> 360 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 360 gtaccctctg ccacctcctc 20 <210> 361 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 361 ccttcctcga ggaggtggca 20 <210> 362 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 362 atgactggct tgggcagttc 20 <210> 363 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 363 ggcccctgtg ggccccgtcc 20 <210> 364 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 364 aggacgaggt ctagaaggca 20 <210> 365 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 365 tataagtgga ggcgtcgcgc 20 <210> 366 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 366 gggcacgcgt ttaatataag 20 <210> 367 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 367 actcacgctg gatagcctcc 20 <210> 368 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 368 ggccgagatg tctcgctccg 20 <210> 369 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 369 cacgcgttta atataagtgg 20 <210> 370 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 370 aagtggaggc gtcgcgctgg 20 <210> 371 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 371 gagtagcgcg agcacagcta 20 <210> 372 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 372 agtggaggcg tcgcgctggc 20 <210> 373 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 373 gcccgaatgc tgtcagcttc 20 <210> 374 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 374 cgcgagcaca gctaaggcca 20 <210> 375 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 375 ctcgcgctac tctctctttc 20 <210> 376 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 376 ggccacggag cgagacatct 20 <210> 377 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 377 cgtgagtaaa cctgaatctt 20 <210> 378 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 378 agtcacatgg ttcacacggc 20 <210> 379 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 379 aagtcaactt caatgtcgga 20 <210> 380 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 380 cagtaagtca acttcaatgt 20 <210> 381 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 381 acccagacac atagcaattc 20 <210> 382 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 382 gcatactcat ctttttcagt 20 <210> 383 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 383 acagcccaag atagttaagt 20 <210> 384 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 384 ggcatactca tctttttcag 20 <210> 385 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 385 ttcctgaagc tgacagcatt 20 <210> 386 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 386 tcacgtcatc cagcagagaa 20 <210> 387 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 387 cagcccaaga tagttaagtg 20 <210> 388 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 388 aauucucucu ccauucuu 18 <210> 389 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 389 aauucucucu ccauucuuc 19 <210> 390 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 390 aauucucucu ccauucuuca 20 <210> 391 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 391 aauucucucu ccauucuuca g 21 <210> 392 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 392 aauucucucu ccauucuuca gu 22 <210> 393 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 393 aauucucucu ccauucuuca gua 23 <210> 394 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 394 aauucucucu ccauucuuca guaa 24 <210> 395 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 395 acuuuccauu cucugcug 18 <210> 396 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 396 acuuuccauu cucugcugg 19 <210> 397 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 397 acuuuccauu cucugcugga 20 <210> 398 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 398 acuuuccauu cucugcugga u 21 <210> 399 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 399 acuuuccauu cucugcugga ug 22 <210> 400 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 400 acuuuccauu cucugcugga uga 23 <210> 401 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 401 acuuuccauu cucugcugga ugac 24 <210> 402 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 402 agcaaggacu ggucuuuc 18 <210> 403 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 403 agcaaggacu ggucuuucu 19 <210> 404 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 404 agcaaggacu ggucuuucua 20 <210> 405 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 405 agcaaggacu ggucuuucua u 21 <210> 406 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 406 agcaaggacu ggucuuucua uc 22 <210> 407 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 407 agcaaggacu ggucuuucua ucu 23 <210> 408 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 408 agcaaggacu ggucuuucua ucuc 24 <210> 409 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 409 agugggggug aauucagu 18 <210> 410 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 410 agugggggug aauucagug 19 <210> 411 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 411 agugggggug aauucagugu 20 <210> 412 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 412 agugggggug aauucagugu a 21 <210> 413 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 413 agugggggug aauucagugu ag 22 <210> 414 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 414 agugggggug aauucagugu agu 23 <210> 415 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 415 agugggggug aauucagugu agua 24 <210> 416 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 416 auccauccga cauugaag 18 <210> 417 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 417 auccauccga cauugaagu 19 <210> 418 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 418 auccauccga cauugaaguu 20 <210> 419 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 419 auccauccga cauugaaguu g 21 <210> 420 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 420 auccauccga cauugaaguu ga 22 <210> 421 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 421 auccauccga cauugaaguu gac 23 <210> 422 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 422 auccauccga cauugaaguu gacu 24 <210> 423 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 423 caauucucuc uccauucu 18 <210> 424 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 424 caauucucuc uccauucuu 19 <210> 425 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 425 caauucucuc uccauucuuc 20 <210> 426 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 426 caauucucuc uccauucuuc a 21 <210> 427 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 427 caauucucuc uccauucuuc ag 22 <210> 428 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 428 caauucucuc uccauucuuc agu 23 <210> 429 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 429 caauucucuc uccauucuuc agua 24 <210> 430 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 430 cagugggggu gaauucag 18 <210> 431 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 431 cagugggggu gaauucagu 19 <210> 432 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 432 cagugggggu gaauucagug 20 <210> 433 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 433 cagugggggu gaauucagug u 21 <210> 434 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 434 cagugggggu gaauucagug ua 22 <210> 435 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 435 cagugggggu gaauucagug uag 23 <210> 436 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 436 cagugggggu gaauucagug uagu 24 <210> 437 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 437 cauucucugc uggaugac 18 <210> 438 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 438 cauucucugc uggaugacg 19 <210> 439 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 439 cauucucugc uggaugacgu 20 <210> 440 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 440 cauucucugc uggaugacgu g 21 <210> 441 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 441 cauucucugc uggaugacgu ga 22 <210> 442 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 442 cauucucugc uggaugacgu gag 23 <210> 443 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 443 cauucucugc uggaugacgu gagu 24 <210> 444 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 444 cccgauauuc cucaggua 18 <210> 445 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 445 cccgauauuc cucagguac 19 <210> 446 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 446 cccgauauuc cucagguacu 20 <210> 447 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 447 cccgauauuc cucagguacu c 21 <210> 448 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 448 cccgauauuc cucagguacu cc 22 <210> 449 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 449 cccgauauuc cucagguacu cca 23 <210> 450 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 450 cccgauauuc cucagguacu ccaa 24 <210> 451 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 451 ccgauauucc ucagguac 18 <210> 452 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 452 ccgauauucc ucagguacu 19 <210> 453 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 453 ccgauauucc ucagguacuc 20 <210> 454 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 454 ccgauauucc ucagguacuc c 21 <210> 455 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 455 ccgauauucc ucagguacuc ca 22 <210> 456 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 456 ccgauauucc ucagguacuc caa 23 <210> 457 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 457 ccgauauucc ucagguacuc caaa 24 <210> 458 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 458 cucacgucau ccagcaga 18 <210> 459 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 459 cucacgucau ccagcagag 19 <210> 460 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 460 cucacgucau ccagcagaga 20 <210> 461 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 461 cucacgucau ccagcagaga a 21 <210> 462 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 462 cucacgucau ccagcagaga au 22 <210> 463 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 463 cucacgucau ccagcagaga aug 23 <210> 464 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 464 cucacgucau ccagcagaga augg 24 <210> 465 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 465 cugaauugcu augugucu 18 <210> 466 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 466 cugaauugcu augugucug 19 <210> 467 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 467 cugaauugcu augugucugg 20 <210> 468 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 468 cugaauugcu augugucugg g 21 <210> 469 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 469 cugaauugcu augugucugg gu 22 <210> 470 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 470 cugaauugcu augugucugg guu 23 <210> 471 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 471 cugaauugcu augugucugg guuu 24 <210> 472 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 472 gaguaccuga ggaauauc 18 <210> 473 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 473 gaguaccuga ggaauaucg 19 <210> 474 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 474 gaguaccuga ggaauaucgg 20 <210> 475 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 475 gaguaccuga ggaauaucgg g 21 <210> 476 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 476 gaguaccuga ggaauaucgg ga 22 <210> 477 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 477 gaguaccuga ggaauaucgg gaa 23 <210> 478 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 478 gaguaccuga ggaauaucgg gaaa 24 <210> 479 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 479 uaucucuugu acuacacu 18 <210> 480 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 480 uaucucuugu acuacacug 19 <210> 481 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 481 uaucucuugu acuacacuga 20 <210> 482 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 482 uaucucuugu acuacacuga a 21 <210> 483 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 483 uaucucuugu acuacacuga au 22 <210> 484 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 484 uaucucuugu acuacacuga auu 23 <210> 485 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 485 uaucucuugu acuacacuga auuc 24 <210> 486 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 486 ucaauucucu cuccauuc 18 <210> 487 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 487 ucaauucucu cuccauucu 19 <210> 488 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 488 ucaauucucu cuccauucuu 20 <210> 489 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 489 ucaauucucu cuccauucuu c 21 <210> 490 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 490 ucaauucucu cuccauucuu ca 22 <210> 491 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 491 ucaauucucu cuccauucuu cag 23 <210> 492 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 492 ucaauucucu cuccauucuu cagu 24 <210> 493 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 493 ucacagccca agauaguu 18 <210> 494 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 494 ucacagccca agauaguua 19 <210> 495 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 495 ucacagccca agauaguuaa 20 <210> 496 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 496 ucacagccca agauaguuaa g 21 <210> 497 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 497 ucacagccca agauaguuaa gu 22 <210> 498 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 498 ucacagccca agauaguuaa gug 23 <210> 499 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 499 ucacagccca agauaguuaa gugg 24 <210> 500 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 500 ucaguggggg ugaauuca 18 <210> 501 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 501 ucaguggggg ugaauucag 19 <210> 502 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 502 ucaguggggg ugaauucagu 20 <210> 503 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 503 ucaguggggg ugaauucagu g 21 <210> 504 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 504 ucaguggggg ugaauucagu gu 22 <210> 505 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 505 ucaguggggg ugaauucagu gua 23 <210> 506 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 506 ucaguggggg ugaauucagu guag 24 <210> 507 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 507 uggccuggag gcuaucca 18 <210> 508 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 508 uggccuggag gcuauccag 19 <210> 509 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 509 uggccuggag gcuauccagc 20 <210> 510 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 510 uggccuggag gcuauccagc g 21 <210> 511 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 511 uggccuggag gcuauccagc gu 22 <210> 512 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 512 uggccuggag gcuauccagc gug 23 <210> 513 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 513 uggccuggag gcuauccagc guga 24 <210> 514 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 514 auagaucgag acauguaa 18 <210> 515 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 515 auagaucgag acauguaag 19 <210> 516 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 516 auagaucgag acauguaagc 20 <210> 517 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 517 auagaucgag acauguaagc a 21 <210> 518 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 518 auagaucgag acauguaagc ag 22 <210> 519 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 519 auagaucgag acauguaagc agc 23 <210> 520 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 520 auagaucgag acauguaagc agca 24 <210> 521 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 521 cauagaucga gacaugua 18 <210> 522 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 522 cauagaucga gacauguaa 19 <210> 523 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 523 cauagaucga gacauguaag 20 <210> 524 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 524 cauagaucga gacauguaag c 21 <210> 525 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 525 cauagaucga gacauguaag ca 22 <210> 526 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 526 cauagaucga gacauguaag cag 23 <210> 527 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 527 cauagaucga gacauguaag cagc 24 <210> 528 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 528 cuccacuguc uuuuucau 18 <210> 529 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 529 cuccacuguc uuuuucaua 19 <210> 530 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 530 cuccacuguc uuuuucauag 20 <210> 531 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 531 cuccacuguc uuuuucauag a 21 <210> 532 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 532 cuccacuguc uuuuucauag au 22 <210> 533 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 533 cuccacuguc uuuuucauag auc 23 <210> 534 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 534 cuccacuguc uuuuucauag aucg 24 <210> 535 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 535 ucauagaucg agacaugu 18 <210> 536 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 536 ucauagaucg agacaugua 19 <210> 537 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 537 ucauagaucg agacauguaa 20 <210> 538 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 538 ucauagaucg agacauguaa g 21 <210> 539 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 539 ucauagaucg agacauguaa gc 22 <210> 540 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 540 ucauagaucg agacauguaa gca 23 <210> 541 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 541 ucauagaucg agacauguaa gcag 24 <210> 542 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 542 uccacugucu uuuucaua 18 <210> 543 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 543 uccacugucu uuuucauag 19 <210> 544 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 544 uccacugucu uuuucauaga 20 <210> 545 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 545 uccacugucu uuuucauaga u 21 <210> 546 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 546 uccacugucu uuuucauaga uc 22 <210> 547 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 547 uccacugucu uuuucauaga ucg 23 <210> 548 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 548 uccacugucu uuuucauaga ucga 24 <210> 549 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 549 ucuccacugu cuuuuuca 18 <210> 550 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 550 ucuccacugu cuuuuucau 19 <210> 551 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 551 ucuccacugu cuuuuucaua 20 <210> 552 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 552 ucuccacugu cuuuuucaua g 21 <210> 553 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 553 ucuccacugu cuuuuucaua ga 22 <210> 554 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 554 ucuccacugu cuuuuucaua gau 23 <210> 555 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 555 ucuccacugu cuuuuucaua gauc 24 <210> 556 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 556 uucuccacug ucuuuuuc 18 <210> 557 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 557 uucuccacug ucuuuuuca 19 <210> 558 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 558 uucuccacug ucuuuuucau 20 <210> 559 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 559 uucuccacug ucuuuuucau a 21 <210> 560 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 560 uucuccacug ucuuuuucau ag 22 <210> 561 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 561 uucuccacug ucuuuuucau aga 23 <210> 562 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 562 uucuccacug ucuuuuucau agau 24 <210> 563 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 563 uuucuccacu gucuuuuu 18 <210> 564 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 564 uuucuccacu gucuuuuuc 19 <210> 565 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 565 uuucuccacu gucuuuuuca 20 <210> 566 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 566 uuucuccacu gucuuuuuca u 21 <210> 567 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 567 uuucuccacu gucuuuuuca ua 22 <210> 568 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 568 uuucuccacu gucuuuuuca uag 23 <210> 569 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 569 uuucuccacu gucuuuuuca uaga 24 <210> 570 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 570 uuuucuccac ugucuuuu 18 <210> 571 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 571 uuuucuccac ugucuuuuu 19 <210> 572 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 572 uuuucuccac ugucuuuuuc 20 <210> 573 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 573 uuuucuccac ugucuuuuuc a 21 <210> 574 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 574 uuuucuccac ugucuuuuuc au 22 <210> 575 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 575 uuuucuccac ugucuuuuuc aua 23 <210> 576 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 576 uuuucuccac ugucuuuuuc auag 24 <210> 577 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 577 gaggtaaagc gtttgcattt g 21 <210> 578 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 578 cctctaaagc ttatgcttac a 21 <210> 579 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 579 agtcgattta cttgtagcac t 21 <210> 580 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 580 cttgtagcac tgcacagtta a 21 <210> 581 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 581 tccattacag gataaaagac t 21 <210> 582 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 582 ctccattaca ggataaaaga c 21 <210> 583 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 583 tctccattac aggataaaag a 21 <210> 584 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 584 atcctgtaat ggagaaaaat c 21 <210> 585 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 585 tcctgtaatg gagaaaaatc c 21 <210> 586 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 586 aaacatgagt aagttgtttt g 21 <210> 587 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 587 gctttcaaac atgagtaagt t 21 <210> 588 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 588 aaagccaaac cattcattgt c 21 <210> 589 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 589 gtaacagcag tcatcatcca t 21 <210> 590 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 590 accatcctca tggattggtg t 21 <210> 591 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 591 tgtccatcat ttcaccatcc t 21 <210> 592 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 592 gaaatttctg tccatcattt c 21 <210> 593 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 593 agaaatttct gtccatcatt t 21 <210> 594 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 594 ttttagaaat ttctgtccat c 21 <210> 595 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 595 cttttagaaa tttctgtcca t 21 <210> 596 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 596 ttttctttta gaaatttctg t 21 <210> 597 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 597 taaaagaaaa gaaagaattt t 21 <210> 598 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 598 aaacatttac atcttaccat t 21 <210> 599 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 599 catcttacca tttcttcttc a 21 <210> 600 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 600 tatagataat gaagaagaaa t 21 <210> 601 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 601 ttcttcatta tctatagaaa g 21 <210> 602 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 602 ctggcctgta cttcgaagaa c 21 <210> 603 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 603 cttaccaatg tagtaacaac t 21 <210> 604 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 604 gcacgtcatt gtggccattg t 21 <210> 605 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 605 tttagcacgt cattgtggcc a 21 <210> 606 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 606 ccatcagctc cagagaagct c 21 <210> 607 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 607 tctccctgca gatttaccat c 21 <210> 608 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 608 aaatgcttta cctttgcagt g 21 <210> 609 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 609 aatgctttac ctttgcagtg a 21 <210> 610 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 610 cctttgcagt gataggtttt g 21 <210> 611 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 611 cagtgatagg ttttgtcatt c 21 <210> 612 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 612 aagggaatga caaaacctat c 21 <210> 613 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 613 caagggaatg acaaaaccta t 21 <210> 614 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 614 gtcattccct tgaaaatcct g 21 <210> 615 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 615 tcattccctt gaaaatcctg a 21 <210> 616 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 616 tgaaggttta attccgcata g 21 <210> 617 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 617 gaaggtttaa ttccgcatag g 21 <210> 618 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 618 aaggtttaat tccgcatagg t 21 <210> 619 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 619 attccgcata ggttatttcc t 21 <210> 620 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 620 gcaactgaac aggaaataac c 21 <210> 621 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 621 agcaactgaa caggaaataa c 21 <210> 622 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 622 ctgttcagtt gctaaaatgg a 21 <210> 623 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 623 tattgccttt aggttttcgt t 21 <210> 624 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 624 attgccttta ggttttcgtt g 21 <210> 625 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 625 ttgcctttag gttttcgttg c 21 <210> 626 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 626 ggttttcgtt gctgcctctt t 21 <210> 627 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 627 cgttgctgcc tctttgggtt t 21 <210> 628 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 628 gttgctgcct ctttgggttt g 21 <210> 629 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 629 ggtttggggg cagattcagg t 21 <210> 630 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 630 ggggcagatt caggtctgag t 21 <210> 631 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 631 tctgcagaaa tgttccccgt 20 <210> 632 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 632 tgcagagaaa ggtggctcta 20 <210> 633 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 633 taatgctgac ttggggtggc 20 <210> 634 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 634 taggacctcc aggaagattc 20 <210> 635 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 635 tagtcaacgc gaccaccacg 20 <210> 636 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 636 tcctgaggtc accttccaca 20 <210> 637 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 637 tattgtgcct gtcatcattc 20 <210> 638 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 638 tgacaggcac aatagaaaca a 21 <210> 639 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 639 gacaggcaca atagaaacaa c 21 <210> 640 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 640 aaacaacggg gaacatttct g 21 <210> 641 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 641 acaacgggga acatttctgc a 21 <210> 642 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 642 tgatagagcc acctttctct g 21 <210> 643 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 643 gggtcacttg tgccgtggtg g 21 <210> 644 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 644 ggcacaagtg acccaggtca a 21 <210> 645 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 645 gtcctgctgc tcccagttga c 21 <210> 646 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 646 tggccatttg taatgctgac t 21 <210> 647 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 647 tggcacatct ccccatcctt c 21 <210> 648 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 648 catctcccca tccttcaagg a 21 <210> 649 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 649 ccactcgatc cttgaaggat g 21 <210> 650 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 650 ggccactcga tccttgaagg a 21 <210> 651 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 651 cctggggcca ctcgatcctt g 21 <210> 652 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 652 gactggaggg tgaggcccag g 21 <210> 653 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 653 atcgttcacg gtcagcgact g 21 <210> 654 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 654 gtcgctgacc gtgaacgata c 21 <210> 655 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 655 cgctgaccgt gaacgataca g 21 <210> 656 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 656 gcatctatca cacctaccct g 21 <210> 657 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 657 cctaccctga tgggacgtac a 21 <210> 658 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 658 taccctgatg ggacgtacac t 21 <210> 659 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 659 ccctgatggg acgtacactg g 21 <210> 660 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 660 ttctcccagt gtacgtccca t 21 <210> 661 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 661 ggagaatctt cctggaggtc c 21 <210> 662 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 662 catggctcca agcaatggaa t 21 <210> 663 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 663 cgcggccatg gctccaagca a 21 <210> 664 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 664 tcgcggccat ggctccaagc a 21 <210> 665 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 665 catcgtggtg gtcgcgttga c 21 <210> 666 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 666 aaagccctca gaatccattc t 21 <210> 667 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 667 cattctgtgg aaggtgacct c 21 <210> 668 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 668 ttctgtggaa ggtgacctca g 21 <210> 669 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 669 cctgaggtca ccttccacag a 21 <210> 670 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 670 ttctcctgag gtcaccttcc a 21 <210> 671 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 671 aggagaaaat cagctggaca g 21 <210> 672 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 672 ggagaaaatc agctggacag g 21 <210> 673 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 673 gccccagtgc tccctcaccc c 21 <210> 674 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 674 tggacacagc ttcctggggg t 21 <210> 675 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 675 tctgcctgga cacagcttcc t 21 <210> 676 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 676 agctgcacct gctgggctct g 21 <210> 677 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 677 gctgggctct gtggagagca g 21 <210> 678 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 678 tgggctctgt ggagagcagc g 21 <210> 679 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 679 ctgcatgact acttcaatgt c 21 <210> 680 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 680 aatgtcctga gttacagaag c 21 <210> 681 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 681 tgggtaactg cagcttcttc a 21 <210> 682 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 682 gacaggcaca atagaaacaa 20 <210> 683 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 683 acaggcacaa tagaaacaac 20 <210> 684 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 684 caggcacaat agaaacaacg 20 <210> 685 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 685 gggaacattt ctgcagagaa 20 <210> 686 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 686 aacatttctg cagagaaagg 20 <210> 687 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 687 atgtcacctc tcctccacca 20 <210> 688 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 688 cttgtgccgt ggtggaggag 20 <210> 689 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 689 ggtcacttgt gccgtggtgg 20 <210> 690 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 690 caccacggca caagtgaccc 20 <210> 691 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 691 ctgggtcact tgtgccgtgg 20 <210> 692 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 692 gacctgggtc acttgtgccg 20 <210> 693 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 693 cacaagtgac ccaggtcaac 20 <210> 694 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 694 acaagtgacc caggtcaact 20 <210> 695 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 695 ccaggtcaac tgggagcagc 20 <210> 696 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 696 ctgctgctcc cagttgacct 20 <210> 697 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 697 cctgctgctc ccagttgacc 20 <210> 698 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 698 ggagcagcag gaccagcttc 20 <210> 699 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 699 cattacaaat ggccagaagc 20 <210> 700 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 700 ggccatttgt aatgctgact 20 <210> 701 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 701 gccatttgta atgctgactt 20 <210> 702 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 702 ccatttgtaa tgctgacttg 20 <210> 703 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 703 tttgtaatgc tgacttgggg 20 <210> 704 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 704 ccccaagtca gcattacaaa 20 <210> 705 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 705 gcacatctcc ccatccttca 20 <210> 706 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 706 cccatccttc aaggatcgag 20 <210> 707 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 707 cactcgatcc ttgaaggatg 20 <210> 708 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 708 ccactcgatc cttgaaggat 20 <210> 709 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 709 gccactcgat ccttgaagga 20 <210> 710 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 710 ttcaaggatc gagtggcccc 20 <210> 711 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 711 tggggccact cgatccttga 20 <210> 712 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 712 gatcgagtgg ccccaggtcc 20 <210> 713 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 713 agtggcccca ggtcccggcc 20 <210> 714 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 714 gtggccccag gtcccggcct 20 <210> 715 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 715 gaggcccagg ccgggacctg 20 <210> 716 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 716 tgaggcccag gccgggacct 20 <210> 717 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 717 gtgaggccca ggccgggacc 20 <210> 718 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 718 tggagggtga ggcccaggcc 20 <210> 719 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 719 ctggagggtg aggcccaggc 20 <210> 720 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 720 gcgactggag ggtgaggccc 20 <210> 721 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 721 cggtcagcga ctggagggtg 20 <210> 722 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 722 gttcacggtc agcgactgga 20 <210> 723 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 723 cgttcacggt cagcgactgg 20 <210> 724 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 724 tatcgttcac ggtcagcgac 20 <210> 725 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 725 tcgctgaccg tgaacgatac 20 <210> 726 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 726 cgctgaccgt gaacgataca 20 <210> 727 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 727 gctgaccgtg aacgatacag 20 <210> 728 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 728 gtactcccct gtatcgttca 20 <210> 729 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 729 atctatcaca cctaccctga 20 <210> 730 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 730 tctatcacac ctaccctgat 20 <210> 731 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 731 taccctgatg ggacgtacac 20 <210> 732 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 732 accctgatgg gacgtacact 20 <210> 733 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 733 agtgtacgtc ccatcagggt 20 <210> 734 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 734 tcccagtgta cgtcccatca 20 <210> 735 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 735 ctcccagtgt acgtcccatc 20 <210> 736 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 736 gtacactggg agaatcttcc 20 <210> 737 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 737 cactgggaga atcttcctgg 20 <210> 738 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 738 ctgagctttc taggacctcc 20 <210> 739 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 739 aggttccaga ttccattgct 20 <210> 740 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 740 aagcaatgga atctggaacc 20 <210> 741 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 741 gattccattg cttggagcca 20 <210> 742 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 742 tggctccaag caatggaatc 20 <210> 743 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 743 gcggccatgg ctccaagcaa 20 <210> 744 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 744 tggagccatg gccgcgacgc 20 <210> 745 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 745 agccatggcc gcgacgctgg 20 <210> 746 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 746 gaccaccagc gtcgcggcca 20 <210> 747 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 747 gcagatgacc accagcgtcg 20 <210> 748 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 748 catctgcaca gcagtcatcg 20 <210> 749 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 749 ctgcacagca gtcatcgtgg 20 <210> 750 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 750 agccctcaga atccattctg 20 <210> 751 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 751 ctcagaatcc attctgtgga 20 <210> 752 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 752 ttccacagaa tggattctga 20 <210> 753 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 753 cttccacaga atggattctg 20 <210> 754 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 754 attctgtgga aggtgacctc 20 <210> 755 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 755 tgaggtcacc ttccacagaa 20 <210> 756 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 756 gacctcagga gaaaatcagc 20 <210> 757 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 757 caggagaaaa tcagctggac 20 <210> 758 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 758 gtccagctga ttttctcctg 20 <210> 759 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 759 gagaaaatca gctggacagg 20 <210> 760 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 760 aatcagctgg acaggaggaa 20 <210> 761 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 761 cccagtgctc cctcaccccc 20 <210> 762 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 762 ctgggggtga gggagcactg 20 <210> 763 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 763 cctgggggtg agggagcact 20 <210> 764 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 764 tcctgggggt gagggagcac 20 <210> 765 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 765 acacagcttc ctgggggtga 20 <210> 766 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 766 gacacagctt cctgggggtg 20 <210> 767 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 767 acccccagga agctgtgtcc 20 <210> 768 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 768 gcctggacac agcttcctgg 20 <210> 769 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 769 tgcctggaca cagcttcctg 20 <210> 770 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 770 ctgcctggac acagcttcct 20 <210> 771 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 771 tctgcctgga cacagcttcc 20 <210> 772 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 772 caggcagaag ctgcacctgc 20 <210> 773 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 773 aggcagaagc tgcacctgct 20 <210> 774 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 774 cagcaggtgc agcttctgcc 20 <210> 775 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 775 gctgcacctg ctgggctctg 20 <210> 776 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 776 tgctctccac agagcccagc 20 <210> 777 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 777 ctgggctctg tggagagcag 20 <210> 778 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 778 tgggctctgt ggagagcagc 20 <210> 779 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 779 gggctctgtg gagagcagcg 20 <210> 780 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 780 ctgtggagag cagcggggag 20 <210> 781 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 781 attgaagtag tcatgcagct 20 <210> 782 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 782 tgtcctgagt tacagaagcc 20 <210> 783 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 783 gtcctgagtt acagaagcct 20 <210> 784 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 784 tacccaggct tctgtaactc 20 <210> 785 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 785 tgaagaagct gcagttaccc 20 <210> 786 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 786 tgcagcttct tcacagagac 20 <210> 787 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 787 gttgtttcta ttgtgcctgt 20 <210> 788 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 788 cgttgtttct attgtgcctg 20 <210> 789 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 789 ccgttgtttc tattgtgcct 20 <210> 790 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 790 ccacggcaca agtgacccag 20 <210> 791 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 791 agttgacctg ggtcacttgt 20 <210> 792 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 792 aagtcagcat tacaaatggc 20 <210> 793 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 793 catccttcaa ggatcgagtg 20 <210> 794 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 794 atccttcaag gatcgagtgg 20 <210> 795 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 795 aggatcgagt ggccccaggt 20 <210> 796 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 796 aggtcccggc ctgggcctca 20 <210> 797 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 797 ggcctgggcc tcaccctcca 20 <210> 798 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 798 cggtcagcga ctggagggtg 20 <210> 799 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 799 gtcgctgacc gtgaacgata 20 <210> 800 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 800 tgtatcgttc acggtcagcg 20 <210> 801 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 801 ctgtatcgtt cacggtcagc 20 <210> 802 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 802 atcagggtag gtgtgataga 20 <210> 803 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 803 agtgtacgtc ccatcagggt 20 <210> 804 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 804 ggaagattct cccagtgtac 20 <210> 805 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 805 tggaggtcct agaaagctca 20 <210> 806 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 806 agcaatggaa tctggaacct 20 <210> 807 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 807 agattccatt gcttggagcc 20 <210> 808 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 808 gattccattg cttggagcca 20 <210> 809 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 809 attgcttgga gccatggccg 20 <210> 810 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 810 ttgcttggag ccatggccgc 20 <210> 811 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 811 cagaatggat tctgagggct 20 <210> 812 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 812 acagaatgga ttctgagggc 20 <210> 813 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 813 ttctgtggaa ggtgacctca 20 <210> 814 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 814 gctgattttc tcctgaggtc 20 <210> 815 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 815 tcctgtccag ctgattttct 20 <210> 816 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 816 ttcctcctgt ccagctgatt 20 <210> 817 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 817 tgggggtgag ggagcactgg 20 <210> 818 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 818 agtgctccct cacccccagg 20 <210> 819 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 819 tcacccccag gaagctgtgt 20 <210> 820 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 820 caggaagctg tgtccaggca 20 <210> 821 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 821 aggaagctgt gtccaggcag 20 <210> 822 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 822 ggcagaagct gcacctgctg 20 <210> 823 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 823 cagagcccag caggtgcagc 20 <210> 824 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 824 gctgctctcc acagagccca 20 <210> 825 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 825 cgctgctctc cacagagccc 20 <210> 826 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 826 atgtcctgag ttacagaagc 20 <210> 827 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 827 gagcacaccc actgcgatgt 20 <210> 828 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 828 gatggccagg agactgaaga 20 <210> 829 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 829 ctgctcaccg gagcgggatg 20 <210> 830 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 830 gtctgtggcc atgcccatca 20 <210> 831 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 831 tcaccggagc gggatgcgga 20 <210> 832 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 832 gtggcaggca gcgcagaacc 20 <210> 833 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 833 agcacaccag cacattgccc 20 <210> 834 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 834 caggttgctg ttgagccaca 20 <210> 835 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 835 cttcattgcc tgcttcgtcc 20 <210> 836 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 836 gtacaccgag gagcccatga 20 <210> 837 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 837 gatggcaatg tagcggtcaa 20 <210> 838 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 838 ctcctcggtg tacatcacgg 20 <210> 839 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 839 cgaggagccc atgatgggca 20 <210> 840 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 840 gggctcctcg gtgtacatca 20 <210> 841 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 841 ctttgtggtg tcactggcgg 20 <210> 842 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 842 ccgctccggt gagcagggcc 20 <210> 843 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 843 gggttctgcg ctgcctgcca 20 <210> 844 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 844 ggacgaagca ggcaatgaag 20 <210> 845 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 845 gtgctgatgg tgatggcaaa 20 <210> 846 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 846 agcgcagaac ccggtgctga 20 <210> 847 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 847 gagctccatc ttcagtctcc 20 <210> 848 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 848 tgctgatggt gatggcaaag 20 <210> 849 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 849 ggcggcggcc gacatcgcag 20 <210> 850 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 850 aatgaagagg cagccgtggc 20 <210> 851 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 851 gggcaatgtg ctggtgtgct 20 <210> 852 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 852 catgcccatc atgggctcct 20 <210> 853 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 853 aatgtagcgg tcaatggcga 20 <210> 854 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 854 agtagttggt gacgttctgc 20 <210> 855 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 855 agcggtcaat ggcgatggcc 20 <210> 856 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 856 cgcatcccgc tccggtgagc 20 <210> 857 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 857 gcatcccgct ccggtgagca 20 <210> 858 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 858 tgggcaatgt gctggtgtgc 20 <210> 859 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 859 caactacttt gtggtgtcac 20 <210> 860 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 860 cgctccggtg agcagggccg 20 <210> 861 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 861 gatggtgatg gcaaagggga 20 <210> 862 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 862 ggtgtacatc acggtggagc 20 <210> 863 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 863 gaacgtcacc aactactttg 20 <210> 864 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 864 cagtgacacc acaaagtagt 20 <210> 865 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 865 ggccatcctg ggcaatgtgc 20 <210> 866 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 866 cccggccctg ctcaccggag 20 <210> 867 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 867 caccagcaca ttgcccagga 20 <210> 868 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 868 tttgccatca ccatcagcac 20 <210> 869 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 869 ctccaccgtg atgtacaccg 20 <210> 870 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 870 ggagctggcc attgctgtgc 20 <210> 871 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 871 caggatggcc agcacagcaa 20 <210> 872 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 872 gaacccggtg ctgatggtga 20 <210> 873 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 873 tggagctctg cgtgaggacc 20 <210> 874 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 874 cccgctccgg tgagcagggc 20 <210> 875 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 875 aggcaatgaa gaggcagccg 20 <210> 876 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 876 ccggccctgc tcaccggagc 20 <210> 877 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 877 gcggcggccg acatcgcagt 20 <210> 878 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 878 ggtgctgatg gtgatggcaa 20 <210> 879 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 879 ctactttgtg gtgtcactgg 20 <210> 880 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 880 tacaccgagg agcccatgat 20 <210> 881 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 881 tctgtggcca tgcccatcat 20 <210> 882 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 882 attgctgtgc tggccatcct 20 <210> 883 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 883 cgtgaggacc aggacgaagc 20 <210> 884 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 884 ttgccatcac catcagcacc 20 <210> 885 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 885 ggatgcggat ggcaatgtag 20 <210> 886 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 886 ttgccatccg catcccgctc 20 <210> 887 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 887 tgaagatgga gctctgcgtg 20 <210> 888 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 888 cattgctgtg ctggccatcc 20 <210> 889 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 889 tgctggtgtg ctgggccgtg 20 <210> 890 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 890 ggctcctcgg tgtacatcac g 21 <210> 891 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 891 gagctctgcg tgaggaccag g 21 <210> 892 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 892 gatggagctc tgcgtgagga c 21 <210> 893 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 893 ccagcacacc agcacattgc c 21 <210> 894 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 894 aggaccagga cgaagcaggc a 21 <210> 895 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 895 tgccatccgc atcccgctcc g 21 <210> 896 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 896 gtgtggctca acagcaacct g 21 <210> 897 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 897 agctccaccg tgatgtacac c 21 <210> 898 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 898 gtagcggtca atggcgatgg c 21 <210> 899 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 899 cggtgctgat ggtgatggca a 21 <210> 900 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 900 ccctgctcac cggagcggga t 21 <210> 901 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 901 gtgacgttct gcaggttgct g 21 <210> 902 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 902 gctccaccgt gatgtacacc g 21 <210> 903 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 903 actgaagatg gagctctgcg t 21 <210> 904 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 904 ccagctccac cgtgatgtac a 21 <210> 905 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 905 cctttgccat caccatcagc a 21 <210> 906 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 906 ccggtgctga tggtgatggc a 21 <210> 907 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 907 cctgggcaat gtgctggtgt g 21 <210> 908 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 908 aggcagccgt ggcaggcagc g 21 <210> 909 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 909 gcgatggcca ggagactgaa g 21 <210> 910 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 910 cgatggccag gagactgaag a 21 <210> 911 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 911 tcccgctccg gtgagcaggg c 21 <210> 912 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 912 tgcttcgtcc tggtcctcac g 21 <210> 913 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 913 accaggacga agcaggcaat g 21 <210> 914 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 914 atgtacaccg aggagcccat g 21 <210> 915 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 915 tcgtctgtgg ccatgcccat c 21 <210> 916 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 916 tcaatggcga tggccaggag a 21 <210> 917 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 917 ggtgctgatg gtgatggcaa a 21 <210> 918 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 918 tagcggtcaa tggcgatggc c 21 <210> 919 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 919 tccgcatccc gctccggtga g 21 <210> 920 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 920 ctggcggcgg ccgacatcgc a 21 <210> 921 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 921 gccattgctg tgctggccat c 21 <210> 922 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 922 atcccgctcc ggtgagcagg g 21 <210> 923 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 923 agactgaaga tggagctctg c 21 <210> 924 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 924 ccccggccct gctcaccgga g 21 <210> 925 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 925 atggtgatgg caaaggggat g 21 <210> 926 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 926 gctcctcggt gtacatcacg g 21 <210> 927 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 927 tgtcgatggc aatagccaag 20 <210> 928 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 928 agaagttggt gacgttctgc 20 <210> 929 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 929 ttcgccatca ccatcagcac 20 <210> 930 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 930 gaagaagagg cagccatggc 20 <210> 931 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 931 cacaagcacg ttacccagga 20 <210> 932 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 932 caacttcttc gtggtatctc 20 <210> 933 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 933 caggatggcc agcacagcaa 20 <210> 934 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 934 aattccactc cggtgagcca 20 <210> 935 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 935 agcgcagaag ccagtgctga 20 <210> 936 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 936 gtgctgatgg tgatggcgaa 20 <210> 937 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 937 ggagctggcc attgctgtgc 20 <210> 938 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 938 aatagccaag aggctgaaga 20 <210> 939 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 939 ctcctcggtg tacatcatgg 20 <210> 940 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 940 ggacaaagca ggcgaagaag 20 <210> 941 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 941 tctggcggcg gctgacatcg 20 <210> 942 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 942 tgggtaacgt gcttgtgtgc 20 <210> 943 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 943 gatgtacacc gaggagccca 20 <210> 944 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 944 taacccctgg ctcaccggag 20 <210> 945 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 945 tcaccggagt ggaattcgga 20 <210> 946 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 946 gcggcggctg acatcgcggt 20 <210> 947 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 947 gatggtgatg gcgaatggga 20 <210> 948 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 948 ggcttctgcg ctgcctgcca 20 <210> 949 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 949 attccactcc ggtgagccag 20 <210> 950 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 950 ggtgtacatc atggtggagc 20 <210> 951 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 951 attgctgtgc tggccatcct 20 <210> 952 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 952 ctccaccatg atgtacaccg 20 <210> 953 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 953 ggcggcggct gacatcgcgg 20 <210> 954 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 954 tacaccgagg agcccatggc 20 <210> 955 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 955 gggtaacgtg cttgtgtgct 20 <210> 956 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 956 caggttgctg ttgatccaca 20 <210> 957 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 957 tgaagatgga actctgcgtg 20 <210> 958 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 958 gatggcgatg tatctgtcga 20 <210> 959 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 959 cttcttcgcc tgctttgtcc 20 <210> 960 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 960 aggcgaagaa gaggcagcca 20 <210> 961 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 961 tgcttgtgtg ctgggccgtg 20 <210> 962 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 962 gaagccagtg ctgatggtga 20 <210> 963 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 963 cgtgaggacc aggacaaagc 20 <210> 964 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 964 tggaactctg cgtgaggacc 20 <210> 965 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 965 cattgctgtg ctggccatcc 20 <210> 966 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 966 ttctcccgcc atgggctcct 20 <210> 967 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 967 tggctcaccg gagtggaatt 20 <210> 968 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 968 tgctgatggt gatggcgaat 20 <210> 969 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 969 cttcgtggta tctctggcgg 20 <210> 970 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 970 agcacacaag cacgttaccc 20 <210> 971 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 971 gggctcctcg gtgtacatca 20 <210> 972 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 972 gtacaccgag gagcccatgg 20 <210> 973 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 973 gaacgtcacc aacttcttcg 20 <210> 974 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 974 tcgccatccg aattccactc 20 <210> 975 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 975 gagttccatc ttcagcctct 20 <210> 976 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 976 gaattccact ccggtgagcc 20 <210> 977 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 977 cagagatacc acgaagaagt 20 <210> 978 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 978 cttcttcgtg gtatctctgg 20 <210> 979 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 979 cagtgctgat ggtgatggcg a 21 <210> 980 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 980 cgaattccac tccggtgagc c 21 <210> 981 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 981 ccgaattcca ctccggtgag c 21 <210> 982 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 982 gctgaagatg gaactctgcg t 21 <210> 983 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 983 cgtgcttgtg tgctgggccg t 21 <210> 984 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 984 gtgaggacca ggacaaagca g 21 <210> 985 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 985 tcgatggcaa tagccaagag g 21 <210> 986 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 986 catcgacaga tacatcgcca t 21 <210> 987 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 987 gtacaccgag gagcccatgg c 21 <210> 988 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 988 gctccaccat gatgtacacc g 21 <210> 989 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 989 aagccagtgc tgatggtgat g 21 <210> 990 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 990 caccgcgatg tcagccgccg c 21 <210> 991 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 991 aggctgaaga tggaactctg c 21 <210> 992 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 992 gccgccgcca gagataccac g 21 <210> 993 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 993 agctccacca tgatgtacac c 21 <210> 994 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 994 aggcagccat ggcaggcagc g 21 <210> 995 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 995 cctggctcac cggagtggaa t 21 <210> 996 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 996 ccagctccac catgatgtac a 21 <210> 997 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 997 accaggacaa agcaggcgaa g 21 <210> 998 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 998 cctgggtaac gtgcttgtgt g 21 <210> 999 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 999 aggaccagga caaagcaggc g 21 <210> 1000 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1000 tcagccgccg ccagagatac c 21 <210> 1001 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1001 ggctcctcgg tgtacatcat g 21 <210> 1002 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1002 ctggcggcgg ctgacatcgc g 21 <210> 1003 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1003 gatggaactc tgcgtgagga c 21 <210> 1004 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1004 gctcctcggt gtacatcatg g 21 <210> 1005 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1005 tgtacaccga ggagcccatg g 21 <210> 1006 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1006 gccattgctg tgctggccat c 21 <210> 1007 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1007 caatagccaa gaggctgaag a 21 <210> 1008 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1008 atggtgatgg cgaatgggat g 21 <210> 1009 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1009 atgtacaccg aggagcccat g 21 <210> 1010 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1010 gtgtggatca acagcaacct g 21 <210> 1011 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1011 tgctttgtcc tggtcctcac g 21 <210> 1012 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1012 gtaacccctg gctcaccgga g 21 <210> 1013 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1013 ccagcacaca agcacgttac c 21 <210> 1014 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1014 tatctgtcga tggcaatagc c 21 <210> 1015 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1015 gcaatagcca agaggctgaa g 21 <210> 1016 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1016 agtgctgatg gtgatggcga a 21 <210> 1017 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1017 acaccgagga gcccatggcg g 21 <210> 1018 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1018 cgccatccga attccactcc g 21 <210> 1019 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1019 tggtgtcact ggcggcggcc 20 <210> 1020 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1020 ccatcaccat cagcaccggg 20 <210> 1021 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1021 ccatcggcct gactcccatg 20 <210> 1022 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1022 gctgaccgca gttgttccaa 20 <210> 1023 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1023 aggatgtggt ccccatgaac 20 <210> 1024 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1024 cctgtgtgct ggtgcccctg 20 <210> 1025 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1025 cggatcttcc tggcggcgcg 20 <210> 1026 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1026 ccctctgctg gctgccccta 20 <210> 1027 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1027 ttctgccccg actgcagcca 20 <210> 1028 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1028 aaggcagctg gcaccagtgc 20 <210> 1029 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1029 taagggcatc attgccatct g 21 <210> 1030 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1030 cggcctgact cccatgctag g 21 <210> 1031 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1031 gcagttgttc caacctagca t 21 <210> 1032 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1032 ccgcagttgt tccaacctag c 21 <210> 1033 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1033 caagaaccac tcccagggct g 21 <210> 1034 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1034 cttggccctc cccgcagccc t 21 <210> 1035 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1035 cacttggccc tccccgcagc c 21 <210> 1036 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1036 ggccaagtgg cctgtctctt t 21 <210> 1037 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1037 ttcatgggga ccacatcctc a 21 <210> 1038 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1038 tgaagtacac catgtagttc a 21 <210> 1039 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1039 ctggtgcccc tgctgctcat g 21 <210> 1040 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1040 gctcatgctg ggtgtctatt t 21 <210> 1041 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1041 cttcagctgt cgtcgcgccg c 21 <210> 1042 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1042 cgcgacgaca gctgaagcag a 21 <210> 1043 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1043 gatggagagc cagcctctgc c 21 <210> 1044 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1044 gcgtggctgc agtcggggca g 21 <210> 1045 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1045 acgatggcca ggtacatgag c 21 <210> 1046 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1046 ctctcccaca ccaattcggt t 21 <210> 1047 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1047 gattcacaac cgaattggtg t 21 <210> 1048 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1048 gggattcaca accgaattgg t 21 <210> 1049 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1049 cgtagatgaa gggattcaca a 21 <210> 1050 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1050 ggatacggta ggcgtagatg a 21 <210> 1051 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1051 tcatctacgc ctaccgtatc c 21 <210> 1052 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1052 cggatacggt aggcgtagat g 21 <210> 1053 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1053 gcggaaggtc tggcggaact c 21 <210> 1054 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1054 aatgatcttg cggaaggtct g 21 <210> 1055 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1055 gacgtggctg cgaatgatct t 21 <210> 1056 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1056 ttgctgcctc aggacgtggc t 21 <210> 1057 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1057 caaggcagct ggcaccagtg c 21 <210> 1058 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1058 cgggcactgg tgccagctgc c 21 <210> 1059 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1059 cttggcagct catggcagtg a 21 <210> 1060 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1060 ccgtctcaac ggccacccgc c 21 <210> 1061 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1061 cacactcctg gcgggtggcc g 21 <210> 1062 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1062 tgccgttggc ccacactcct g 21 <210> 1063 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1063 ccattgggcc tccgctcagg g 21 <210> 1064 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1064 catagccatt gggcctccgc t 21 <210> 1065 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1065 aatggctatg ccctggggct g 21 <210> 1066 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1066 atgccctggg gctggtgagt g 21 <210> 1067 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1067 gccctggggc tggtgagtgg a 21 <210> 1068 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1068 tggtgagtgg agggagtgcc c 21 <210> 1069 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1069 gagggagtgc ccaagagtcc c 21 <210> 1070 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1070 agggagtgcc caagagtccc a 21 <210> 1071 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1071 gtctgggagg cccgtgttcc c 21 <210> 1072 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1072 catggctaag gagctccacg t 21 <210> 1073 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1073 gagctcctta gccatgagct c 21 <210> 1074 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1074 gctccttagc catgagctca a 21 <210> 1075 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1075 ggcctagatg accccctggc c 21 <210> 1076 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1076 ccccctggcc caggatggag c 21 <210> 1077 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1077 ctcctgctcc atcctgggcc a 21 <210> 1078 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1078 ccgtgatgta caccgaggag 20 <210> 1079 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1079 ctttgccatc accatcagca 20 <210> 1080 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1080 tttgccatca ccatcagcac 20 <210> 1081 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1081 ttgcctgctt cgtcctggtc 20 <210> 1082 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1082 tcctggtcct cacgcagagc 20 <210> 1083 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1083 tcttcagtct cctggccatc 20 <210> 1084 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1084 gtctcctggc catcgccatt 20 <210> 1085 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1085 acctagcatg ggagtcaggc 20 <210> 1086 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1086 aacctagcat gggagtcagg 20 <210> 1087 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1087 atgctaggtt ggaacaactg 20 <210> 1088 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1088 gcagccctgg gagtggttct 20 <210> 1089 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1089 cgcagccctg ggagtggttc 20 <210> 1090 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1090 agggctgcgg ggagggccaa 20 <210> 1091 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1091 tggggaccac atcctcaaag 20 <210> 1092 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1092 catgaactac atggtgtact 20 <210> 1093 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1093 atgaactaca tggtgtactt 20 <210> 1094 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1094 acttctttgc ctgtgtgctg 20 <210> 1095 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1095 tgctgctcat gctgggtgtc 20 <210> 1096 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1096 caaatagaca cccagcatga 20 <210> 1097 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1097 gctgtcgtcg cgccgccagg 20 <210> 1098 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1098 tggcggcgcg acgacagctg 20 <210> 1099 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1099 tctgcttcag ctgtcgtcgc 20 <210> 1100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1100 ggcagaggct ggctctccat 20 <210> 1101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1101 cggcagaggc tggctctcca 20 <210> 1102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1102 ccggcagagg ctggctctcc 20 <210> 1103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1103 cactgcagaa ggaggtccat 20 <210> 1104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1104 tgctgccaag tcactggcca 20 <210> 1105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1105 acaatgatgg ccagtgactt 20 <210> 1106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1106 tacacatcat caactgcttc 20 <210> 1107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1107 ctttcttctg ccccgactgc 20 <210> 1108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1108 gactgcagcc acgcccctct 20 <210> 1109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1109 tctctggctc atgtacctgg 20 <210> 1110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1110 caaccgaatt ggtgtgggag 20 <210> 1111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1111 acaccaattc ggttgtgaat 20 <210> 1112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1112 gttgtgaatc ccttcatcta 20 <210> 1113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1113 ttcatctacg cctaccgtat 20 <210> 1114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1114 tctacgccta ccgtatccgc 20 <210> 1115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1115 cgagttccgc cagaccttcc 20 <210> 1116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1116 gccagacctt ccgcaagatc 20 <210> 1117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1117 ccagaccttc cgcaagatca 20 <210> 1118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1118 gcaagatcat tcgcagccac 20 <210> 1119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1119 caagatcatt cgcagccacg 20 <210> 1120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1120 cagccacgtc ctgaggcagc 20 <210> 1121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1121 aggcagctgg caccagtgcc 20 <210> 1122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1122 tcactgccat gagctgccaa 20 <210> 1123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1123 tctcaacggc cacccgccag 20 <210> 1124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1124 ctcagggtgg ggagcactgc 20 <210> 1125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1125 caccctgagc ggaggcccaa 20 <210> 1126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1126 accctgagcg gaggcccaat 20 <210> 1127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1127 agggcatagc cattgggcct 20 <210> 1128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1128 ctcaccagcc ccagggcata 20 <210> 1129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1129 tccactcacc agccccaggg 20 <210> 1130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1130 tgggactctt gggcactccc 20 <210> 1131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1131 ctgggactct tgggcactcc 20 <210> 1132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1132 cctgggactc ttgggcactc 20 <210> 1133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1133 aggggaacac gggcctccca 20 <210> 1134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1134 cgtctgggag gcccgtgttc 20 <210> 1135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1135 agacgtggag ctccttagcc 20 <210> 1136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1136 ttgagctcat ggctaaggag 20 <210> 1137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1137 ctggcctaga tgaccccctg 20 <210> 1138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1138 tggcctagat gaccccctgg 20 <210> 1139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1139 tcctgggcca gggggtcatc 20 <210> 1140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1140 ctggcccagg atggagcagg 20 <210> 1141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1141 tggcccagga tggagcagga 20 <210> 1142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1142 cgcgagttcc gccagacctt 20 <210> 1143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1143 ccctggggct ggtgagtgga 20 <210> 1144 <211> 1334 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1144 Met Gly His His His His His His Gly Ser Thr Gln Phe Glu Gly Phe 1 5 10 15 Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro 20 25 30 Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu 35 40 45 Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp 50 55 60 Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu 65 70 75 80 Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys 85 90 95 Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg 100 105 110 Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp 115 120 125 Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala 130 135 140 Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr 145 150 155 160 Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr 165 170 175 Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu 180 185 190 Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro 195 200 205 Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val 210 215 220 Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile 225 230 235 240 Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn 245 250 255 Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly 260 265 270 Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu 275 280 285 Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn Asp Glu Thr Ala His Ile Ile 290 295 300 Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser 305 310 315 320 Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu 325 330 335 Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu 340 345 350 Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile 355 360 365 Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser 370 375 380 Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu 385 390 395 400 Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu 405 410 415 Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile 420 425 430 Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr 435 440 445 Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro 450 455 460 Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu 465 470 475 480 Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp 485 490 495 Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile 500 505 510 Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn 515 520 525 Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe 530 535 540 Gln Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn 545 550 555 560 Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile 565 570 575 Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr 580 585 590 Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro 595 600 605 Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val 610 615 620 Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn 625 630 635 640 Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn 645 650 655 Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr 660 665 670 Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe 675 680 685 Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu 690 695 700 Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr 705 710 715 720 Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala 725 730 735 Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe 740 745 750 Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys Gly His His Gly Lys Pro Asn 755 760 765 Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala 770 775 780 Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro 785 790 795 800 Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala Ala Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu 805 810 815 Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr 820 825 830 Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His Arg Leu Ser His Asp Leu Ser 835 840 845 Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn Val Ile Thr Lys Glu Val Ser 850 855 860 His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe 865 870 875 880 His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys 885 890 895 Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Thr Pro 900 905 910 Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val 915 920 925 Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile 930 935 940 Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg 945 950 955 960 Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu 965 970 975 Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile His Glu Ile Val Asp Leu Met 980 985 990 Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe 995 1000 1005 Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln 1010 1015 1020 Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Cys Leu Val Leu Lys 1025 1030 1035 Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly Val Leu Asn Pro Tyr Gln 1040 1045 1050 Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala Lys Met Gly Thr Gln Ser 1055 1060 1065 Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Asp 1070 1075 1080 Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe Val Trp Lys Thr Ile Lys 1085 1090 1095 Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu Glu Gly Phe Asp Phe Leu 1100 1105 1110 His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe Ile Leu His Phe Lys Met 1115 1120 1125 Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly Leu Pro Gly Phe Met Pro 1130 1135 1140 Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn Glu Thr Gln Phe Asp Ala 1145 1150 1155 Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys Arg Ile Val Pro Val Ile 1160 1165 1170 Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr Arg Asp Leu Tyr Pro Ala 1175 1180 1185 Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val Phe Arg 1190 1195 1200 Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu Leu Glu Asn Asp Asp Ser 1205 1210 1215 His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu Ile Arg Ser Val Leu Gln 1220 1225 1230 Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr Ile Asn Ser 1235 1240 1245 Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys Phe Asp Ser Arg Phe Gln 1250 1255 1260 Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His 1265 1270 1275 Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu Asn His Leu Lys Glu Ser 1280 1285 1290 Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln Asp Trp Leu 1295 1300 1305 Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg 1310 1315 1320 Lys Val Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1325 1330 <210> 1145 <211> 1363 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1145 Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr 1 5 10 15 Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln 20 25 30 Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln 50 55 60 Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile 65 70 75 80 Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly 100 105 110 Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile 115 120 125 Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys 130 135 140 Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg 145 150 155 160 Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg 165 170 175 Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg 180 185 190 Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe 195 200 205 Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn 210 215 220 Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val 225 230 235 240 Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp 245 250 255 Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu 260 265 270 Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn 275 280 285 Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro 290 295 300 Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu 305 310 315 320 Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr 325 330 335 Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu 340 345 350 Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His 355 360 365 Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr 370 375 380 Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys 385 390 395 400 Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu 405 410 415 Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser 420 425 430 Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala 435 440 445 Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys 450 455 460 Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu 465 470 475 480 Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe 485 490 495 Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser 500 505 510 Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val 515 520 525 Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Arg Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp 530 535 540 Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn 545 550 555 560 Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys 565 570 575 Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys 580 585 590 Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys 595 600 605 Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr 610 615 620 Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys 625 630 635 640 Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln 645 650 655 Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala 660 665 670 Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr 675 680 685 Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr 690 695 700 Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His 705 710 715 720 Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu 725 730 735 Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys 740 745 750 Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu 755 760 765 Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln 770 775 780 Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His 785 790 795 800 Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr 805 810 815 Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His 820 825 830 Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn 835 840 845 Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe 850 855 860 Thr Ser Asp Lys Phe Leu Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln 865 870 875 880 Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu 885 890 895 Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg 900 905 910 Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu 915 920 925 Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu 930 935 940 Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val 945 950 955 960 Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile 965 970 975 His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu 980 985 990 Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu 995 1000 1005 Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu 1010 1015 1020 Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly 1025 1030 1035 Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala 1040 1045 1050 Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro 1055 1060 1065 Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe 1070 1075 1080 Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu 1085 1090 1095 Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe 1100 1105 1110 Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly 1115 1120 1125 Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn 1130 1135 1140 Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys 1145 1150 1155 Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr 1160 1165 1170 Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu 1175 1180 1185 Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu 1190 1195 1200 Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu 1205 1210 1215 Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly 1220 1225 1230 Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys 1235 1240 1245 Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp 1250 1255 1260 Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu 1265 1270 1275 Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile 1280 1285 1290 Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Gly 1295 1300 1305 Arg Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ala Ala 1310 1315 1320 Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1325 1330 1335 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1340 1345 1350 Gly Ser Leu Glu His His His His His His 1355 1360 <210> 1146 <211> 1363 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1146 Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr 1 5 10 15 Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln 20 25 30 Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln 50 55 60 Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile 65 70 75 80 Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly 100 105 110 Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile 115 120 125 Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys 130 135 140 Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg 145 150 155 160 Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg 165 170 175 Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg 180 185 190 Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe 195 200 205 Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn 210 215 220 Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val 225 230 235 240 Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp 245 250 255 Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu 260 265 270 Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn 275 280 285 Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro 290 295 300 Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu 305 310 315 320 Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr 325 330 335 Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu 340 345 350 Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His 355 360 365 Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr 370 375 380 Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys 385 390 395 400 Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu 405 410 415 Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser 420 425 430 Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala 435 440 445 Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys 450 455 460 Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu 465 470 475 480 Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe 485 490 495 Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser 500 505 510 Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val 515 520 525 Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp 530 535 540 Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn 545 550 555 560 Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys 565 570 575 Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys 580 585 590 Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys 595 600 605 Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr 610 615 620 Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys 625 630 635 640 Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln 645 650 655 Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala 660 665 670 Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr 675 680 685 Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr 690 695 700 Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His 705 710 715 720 Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu 725 730 735 Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys 740 745 750 Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu 755 760 765 Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln 770 775 780 Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His 785 790 795 800 Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr 805 810 815 Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His 820 825 830 Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn 835 840 845 Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe 850 855 860 Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln 865 870 875 880 Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu 885 890 895 Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg 900 905 910 Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu 915 920 925 Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu 930 935 940 Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val 945 950 955 960 Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile 965 970 975 His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu 980 985 990 Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu 995 1000 1005 Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu 1010 1015 1020 Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly 1025 1030 1035 Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala 1040 1045 1050 Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro 1055 1060 1065 Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe 1070 1075 1080 Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu 1085 1090 1095 Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe 1100 1105 1110 Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly 1115 1120 1125 Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn 1130 1135 1140 Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys 1145 1150 1155 Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr 1160 1165 1170 Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu 1175 1180 1185 Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu 1190 1195 1200 Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu 1205 1210 1215 Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly 1220 1225 1230 Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys 1235 1240 1245 Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp 1250 1255 1260 Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu 1265 1270 1275 Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile 1280 1285 1290 Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Gly 1295 1300 1305 Arg Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ala Ala 1310 1315 1320 Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1325 1330 1335 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1340 1345 1350 Gly Ser Leu Glu His His His His His His 1355 1360 <210> 1147 <211> 1363 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1147 Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr 1 5 10 15 Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln 20 25 30 Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln 50 55 60 Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile 65 70 75 80 Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly 100 105 110 Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile 115 120 125 Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys 130 135 140 Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg 145 150 155 160 Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg 165 170 175 Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg 180 185 190 Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe 195 200 205 Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn 210 215 220 Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val 225 230 235 240 Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp 245 250 255 Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu 260 265 270 Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn 275 280 285 Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro 290 295 300 Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu 305 310 315 320 Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr 325 330 335 Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu 340 345 350 Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His 355 360 365 Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr 370 375 380 Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys 385 390 395 400 Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu 405 410 415 Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser 420 425 430 Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala 435 440 445 Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys 450 455 460 Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu 465 470 475 480 Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe 485 490 495 Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser 500 505 510 Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val 515 520 525 Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Arg Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp 530 535 540 Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn 545 550 555 560 Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys 565 570 575 Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys 580 585 590 Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys 595 600 605 Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr 610 615 620 Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys 625 630 635 640 Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln 645 650 655 Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala 660 665 670 Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr 675 680 685 Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr 690 695 700 Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His 705 710 715 720 Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu 725 730 735 Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys 740 745 750 Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu 755 760 765 Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln 770 775 780 Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala Ala 785 790 795 800 Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr 805 810 815 Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His 820 825 830 Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn 835 840 845 Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe 850 855 860 Thr Ser Asp Lys Phe Leu Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln 865 870 875 880 Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu 885 890 895 Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg 900 905 910 Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu 915 920 925 Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu 930 935 940 Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val 945 950 955 960 Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile 965 970 975 His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu 980 985 990 Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu 995 1000 1005 Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu 1010 1015 1020 Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly 1025 1030 1035 Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala 1040 1045 1050 Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro 1055 1060 1065 Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe 1070 1075 1080 Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu 1085 1090 1095 Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe 1100 1105 1110 Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly 1115 1120 1125 Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn 1130 1135 1140 Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys 1145 1150 1155 Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr 1160 1165 1170 Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu 1175 1180 1185 Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu 1190 1195 1200 Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu 1205 1210 1215 Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly 1220 1225 1230 Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys 1235 1240 1245 Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp 1250 1255 1260 Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu 1265 1270 1275 Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile 1280 1285 1290 Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Gly 1295 1300 1305 Arg Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ala Ala 1310 1315 1320 Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1325 1330 1335 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1340 1345 1350 Gly Ser Leu Glu His His His His His His 1355 1360 <210> 1148 <211> 1331 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1148 Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr 1 5 10 15 Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln 20 25 30 Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln 50 55 60 Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile 65 70 75 80 Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly 100 105 110 Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile 115 120 125 Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys 130 135 140 Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg 145 150 155 160 Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg 165 170 175 Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg 180 185 190 Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe 195 200 205 Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn 210 215 220 Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val 225 230 235 240 Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp 245 250 255 Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu 260 265 270 Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn 275 280 285 Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro 290 295 300 Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu 305 310 315 320 Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr 325 330 335 Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu 340 345 350 Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His 355 360 365 Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr 370 375 380 Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys 385 390 395 400 Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu 405 410 415 Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser 420 425 430 Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala 435 440 445 Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys 450 455 460 Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu 465 470 475 480 Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe 485 490 495 Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser 500 505 510 Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val 515 520 525 Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Arg Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp 530 535 540 Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn 545 550 555 560 Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys 565 570 575 Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys 580 585 590 Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys 595 600 605 Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr 610 615 620 Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys 625 630 635 640 Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln 645 650 655 Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala 660 665 670 Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr 675 680 685 Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr 690 695 700 Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His 705 710 715 720 Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu 725 730 735 Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys 740 745 750 Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu 755 760 765 Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln 770 775 780 Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala Ala 785 790 795 800 Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr 805 810 815 Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His 820 825 830 Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn 835 840 845 Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe 850 855 860 Thr Ser Asp Lys Phe Leu Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln 865 870 875 880 Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu 885 890 895 Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg 900 905 910 Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu 915 920 925 Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu 930 935 940 Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val 945 950 955 960 Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile 965 970 975 His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu 980 985 990 Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu 995 1000 1005 Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu 1010 1015 1020 Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly 1025 1030 1035 Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala 1040 1045 1050 Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro 1055 1060 1065 Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe 1070 1075 1080 Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu 1085 1090 1095 Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe 1100 1105 1110 Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly 1115 1120 1125 Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn 1130 1135 1140 Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys 1145 1150 1155 Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr 1160 1165 1170 Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu 1175 1180 1185 Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu 1190 1195 1200 Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu 1205 1210 1215 Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly 1220 1225 1230 Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys 1235 1240 1245 Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp 1250 1255 1260 Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu 1265 1270 1275 Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile 1280 1285 1290 Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Gly 1295 1300 1305 Arg Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ala Ala 1310 1315 1320 Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1325 1330 <210> 1149 <211> 1331 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1149 Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr 1 5 10 15 Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln 20 25 30 Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln 50 55 60 Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile 65 70 75 80 Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly 100 105 110 Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile 115 120 125 Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys 130 135 140 Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg 145 150 155 160 Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg 165 170 175 Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg 180 185 190 Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe 195 200 205 Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn 210 215 220 Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val 225 230 235 240 Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp 245 250 255 Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu 260 265 270 Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn 275 280 285 Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro 290 295 300 Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu 305 310 315 320 Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr 325 330 335 Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu 340 345 350 Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His 355 360 365 Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr 370 375 380 Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys 385 390 395 400 Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu 405 410 415 Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser 420 425 430 Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala 435 440 445 Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys 450 455 460 Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu 465 470 475 480 Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe 485 490 495 Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser 500 505 510 Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val 515 520 525 Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Arg Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp 530 535 540 Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn 545 550 555 560 Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys 565 570 575 Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys 580 585 590 Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys 595 600 605 Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr 610 615 620 Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys 625 630 635 640 Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln 645 650 655 Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala 660 665 670 Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr 675 680 685 Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr 690 695 700 Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His 705 710 715 720 Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu 725 730 735 Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys 740 745 750 Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu 755 760 765 Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln 770 775 780 Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His 785 790 795 800 Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr 805 810 815 Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His 820 825 830 Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn 835 840 845 Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe 850 855 860 Thr Ser Asp Lys Phe Leu Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln 865 870 875 880 Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu 885 890 895 Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg 900 905 910 Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu 915 920 925 Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu 930 935 940 Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val 945 950 955 960 Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile 965 970 975 His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu 980 985 990 Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu 995 1000 1005 Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu 1010 1015 1020 Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly 1025 1030 1035 Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala 1040 1045 1050 Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro 1055 1060 1065 Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe 1070 1075 1080 Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu 1085 1090 1095 Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe 1100 1105 1110 Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly 1115 1120 1125 Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn 1130 1135 1140 Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys 1145 1150 1155 Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr 1160 1165 1170 Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu 1175 1180 1185 Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu 1190 1195 1200 Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu 1205 1210 1215 Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly 1220 1225 1230 Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys 1235 1240 1245 Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp 1250 1255 1260 Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu 1265 1270 1275 Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile 1280 1285 1290 Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Gly 1295 1300 1305 Arg Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ala Ala 1310 1315 1320 Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1325 1330 <210> 1150 <211> 1363 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1150 Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr 1 5 10 15 Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln 20 25 30 Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln 50 55 60 Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile 65 70 75 80 Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly 100 105 110 Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile 115 120 125 Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys 130 135 140 Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg 145 150 155 160 Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg 165 170 175 Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg 180 185 190 Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe 195 200 205 Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn 210 215 220 Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val 225 230 235 240 Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp 245 250 255 Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu 260 265 270 Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn 275 280 285 Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro 290 295 300 Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu 305 310 315 320 Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr 325 330 335 Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu 340 345 350 Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His 355 360 365 Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr 370 375 380 Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys 385 390 395 400 Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu 405 410 415 Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser 420 425 430 Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala 435 440 445 Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys 450 455 460 Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu 465 470 475 480 Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe 485 490 495 Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser 500 505 510 Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val 515 520 525 Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Arg Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp 530 535 540 Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn 545 550 555 560 Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys 565 570 575 Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys 580 585 590 Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys 595 600 605 Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr 610 615 620 Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys 625 630 635 640 Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln 645 650 655 Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala 660 665 670 Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr 675 680 685 Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr 690 695 700 Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His 705 710 715 720 Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu 725 730 735 Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys 740 745 750 Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu 755 760 765 Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln 770 775 780 Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His 785 790 795 800 Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr 805 810 815 Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His 820 825 830 Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn 835 840 845 Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe 850 855 860 Thr Ser Asp Lys Phe Leu Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln 865 870 875 880 Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu 885 890 895 Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg 900 905 910 Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu 915 920 925 Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu 930 935 940 Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val 945 950 955 960 Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile 965 970 975 His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu 980 985 990 Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu 995 1000 1005 Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu 1010 1015 1020 Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly 1025 1030 1035 Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala 1040 1045 1050 Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro 1055 1060 1065 Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe 1070 1075 1080 Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu 1085 1090 1095 Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe 1100 1105 1110 Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly 1115 1120 1125 Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn 1130 1135 1140 Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys 1145 1150 1155 Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr 1160 1165 1170 Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu 1175 1180 1185 Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu 1190 1195 1200 Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu 1205 1210 1215 Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly 1220 1225 1230 Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys 1235 1240 1245 Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp 1250 1255 1260 Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu 1265 1270 1275 Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile 1280 1285 1290 Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Gly 1295 1300 1305 Arg Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ala Ala 1310 1315 1320 Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1325 1330 1335 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1340 1345 1350 Gly Ser Leu Glu His His His His His His 1355 1360 <210> 1151 <211> 1361 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1151 Met Gly Arg Asp Pro Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu 1 5 10 15 Asp Ser Thr Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val 20 25 30 Pro Ala Ala Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser 35 40 45 Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His 50 55 60 Ile Gln Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His 65 70 75 80 Tyr Lys Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala 85 90 95 Asp Gln Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala 100 105 110 Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala 115 120 125 Leu Ile Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe 130 135 140 Ile Gly Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala 145 150 155 160 Glu Ile Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val 165 170 175 Leu Lys Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu 180 185 190 Leu Arg Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu 195 200 205 Asn Arg Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro 210 215 220 His Arg Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His 225 230 235 240 Ile Phe Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe 245 250 255 Glu Asn Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu 260 265 270 Glu Val Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln 275 280 285 Ile Asp Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly 290 295 300 Thr Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln 305 310 315 320 Lys Asn Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe 325 330 335 Ile Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe 340 345 350 Ile Leu Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys 355 360 365 Lys Tyr Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu 370 375 380 Ala Leu Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile 385 390 395 400 Ser His Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp 405 410 415 Asp Thr Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr 420 425 430 Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys 435 440 445 His Glu Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu 450 455 460 Leu Ser Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala 465 470 475 480 His Ala Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu 485 490 495 Glu Lys Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr 500 505 510 His Leu Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro 515 520 525 Glu Phe Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser 530 535 540 Leu Ser Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr 545 550 555 560 Ser Val Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Met Pro Thr Leu Ala Ser 565 570 575 Gly Trp Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val 580 585 590 Lys Asn Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg 595 600 605 Tyr Lys Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe 610 615 620 Asp Lys Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro 625 630 635 640 Lys Cys Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His 645 650 655 Thr Thr Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile 660 665 670 Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys 675 680 685 Phe Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg 690 695 700 Glu Ala Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys 705 710 715 720 Tyr Thr Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser 725 730 735 Gln Tyr Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu 740 745 750 Tyr His Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala 755 760 765 Val Glu Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe 770 775 780 Ala Lys Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr 785 790 795 800 Gly Leu Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn 805 810 815 Gly Gln Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met 820 825 830 Ala His Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln 835 840 845 Lys Thr Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val 850 855 860 Asn His Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu 865 870 875 880 Pro Asn Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg 885 890 895 Arg Phe Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn 900 905 910 Tyr Gln Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala 915 920 925 Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly 930 935 940 Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile 945 950 955 960 Leu Glu Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys 965 970 975 Lys Leu Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp 980 985 990 Ser Val Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln 995 1000 1005 Val Ile His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val 1010 1015 1020 Val Val Leu Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr 1025 1030 1035 Gly Ile Ala Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu 1040 1045 1050 Ile Asp Lys Leu Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu 1055 1060 1065 Lys Val Gly Gly Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe 1070 1075 1080 Thr Ser Phe Ala Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr 1085 1090 1095 Val Pro Ala Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe 1100 1105 1110 Val Asp Pro Phe Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg 1115 1120 1125 Lys His Phe Leu Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys 1130 1135 1140 Thr Gly Asp Phe Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser 1145 1150 1155 Phe Gln Arg Gly Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val 1160 1165 1170 Phe Glu Lys Asn Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe 1175 1180 1185 Ile Ala Gly Lys Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe 1190 1195 1200 Thr Gly Arg Tyr Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala 1205 1210 1215 Leu Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile 1220 1225 1230 Leu Pro Lys Leu Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr 1235 1240 1245 Met Val Ala Leu Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn 1250 1255 1260 Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu 1265 1270 1275 Asn Gly Val Cys Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro 1280 1285 1290 Met Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly 1295 1300 1305 Gln Leu Leu Leu Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu 1310 1315 1320 Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu 1325 1330 1335 Leu Arg Asn Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Lys Leu Ala Ala Ala 1340 1345 1350 Leu Glu His His His His His His 1355 1360 <210> 1152 <211> 1307 <212> PRT <213> Acidaminococcus sp. <400> 1152 Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr 1 5 10 15 Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln 20 25 30 Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln 50 55 60 Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile 65 70 75 80 Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly 100 105 110 Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile 115 120 125 Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys 130 135 140 Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg 145 150 155 160 Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg 165 170 175 Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg 180 185 190 Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe 195 200 205 Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn 210 215 220 Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val 225 230 235 240 Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp 245 250 255 Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu 260 265 270 Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn 275 280 285 Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro 290 295 300 Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu 305 310 315 320 Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr 325 330 335 Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu 340 345 350 Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His 355 360 365 Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr 370 375 380 Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys 385 390 395 400 Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu 405 410 415 Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser 420 425 430 Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala 435 440 445 Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys 450 455 460 Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu 465 470 475 480 Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe 485 490 495 Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser 500 505 510 Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val 515 520 525 Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp 530 535 540 Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn 545 550 555 560 Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys 565 570 575 Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys 580 585 590 Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys 595 600 605 Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr 610 615 620 Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys 625 630 635 640 Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln 645 650 655 Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala 660 665 670 Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr 675 680 685 Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr 690 695 700 Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His 705 710 715 720 Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu 725 730 735 Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys 740 745 750 Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu 755 760 765 Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln 770 775 780 Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His 785 790 795 800 Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr 805 810 815 Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His 820 825 830 Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn 835 840 845 Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe 850 855 860 Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln 865 870 875 880 Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu 885 890 895 Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg 900 905 910 Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu 915 920 925 Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu 930 935 940 Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val 945 950 955 960 Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile 965 970 975 His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu 980 985 990 Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu 995 1000 1005 Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu 1010 1015 1020 Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly 1025 1030 1035 Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala 1040 1045 1050 Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro 1055 1060 1065 Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe 1070 1075 1080 Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu 1085 1090 1095 Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe 1100 1105 1110 Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly 1115 1120 1125 Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn 1130 1135 1140 Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys 1145 1150 1155 Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr 1160 1165 1170 Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu 1175 1180 1185 Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu 1190 1195 1200 Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu 1205 1210 1215 Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly 1220 1225 1230 Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys 1235 1240 1245 Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp 1250 1255 1260 Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu 1265 1270 1275 Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile 1280 1285 1290 Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn 1295 1300 1305 <210> 1153 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1153 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 1154 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1154 atgtgttttt gtcaaaagac ctttt 25 <210> 1155 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1155 gguguacagc aguggcuggu 20 <210> 1156 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1156 atgtgttttt gtcaaaagac cttttuaauu ucuacucuug uagauggugu acagcagugg 60 cuggu 65 <210> 1157 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1157 ugaugugaga uuuuccaccu 20 <210> 1158 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1158 atgtgttttt gtcaaaagac cttttuaauu ucuacucuug uagauugaug ugagauuuuc 60 caccu 65 <210> 1159 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1159 ccaucggccu gacucccaug 20 <210> 1160 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 1160 atgtgttttt gtcaaaagac cttttuaauu ucuacucuug uagauccauc ggccugacuc 60 ccaug 65 <210> 1161 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1161 ugaugugaga uuuuccaccu g 21 <210> 1162 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1162 acugacagcg ugaacaggua g 21 <210> 1163 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1163 ccaucggccu gacucccaug c 21 <210> 1164 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1164 ccaucaccau cagcaccggg u 21 <210> 1165 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1165 ccugugugcu ggugccccug c 21 <210> 1166 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1166 ugcagagaaa gguggcucua u 21 <210> 1167 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1167 ucugcagaaa uguuccccgu u 21 <210> 1168 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1168 uaggaccucc aggaagauuc u 21 <210> 1169 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1169 gcaacugaac aggaaauaac c 21 <210> 1170 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1170 guugcugccu cuuuggguuu g 21 <210> 1171 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1171 aagggaauga caaaaccuau c 21 <210> 1172 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1172 tgatgtgaga ttttccacct g 21 <210> 1173 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1173 actgacagcg tgaacaggta g 21 <210> 1174 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1174 ccatcggcct gactcccatg c 21 <210> 1175 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1175 tgcagagaaa ggtggctcta t 21 <210> 1176 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1176 gcaactgaac aggaaataac c 21 <210> 1177 <211> 3993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1177 atgacccagt ttgaaggttt caccaatctg tatcaggtta gcaaaaccct gcgttttgaa 60 ctgattccgc agggtaaaac cctgaaacat attcaagaac agggcttcat cgaagaggat 120 aaagcacgta acgatcacta caaagaactg aaaccgatta tcgaccgcat ctataaaacc 180 tatgcagatc agtgtctgca gctggttcag ctggattggg aaaatctgag cgcagcaatt 240 gatagttatc gcaaagaaaa aaccgaagaa acccgtaatg cactgattga agaacaggca 300 acctatcgta atgccatcca tgattatttc attggtcgta ccgataatct gaccgatgca 360 attaacaaac gtcacgccga aatctataaa ggcctgttta aagccgaact gtttaatggc 420 aaagttctga aacagctggg caccgttacc accaccgaac atgaaaatgc actgctgcgt 480 agctttgata aattcaccac ctatttcagc ggcttttatg agaatcgcaa aaacgtgttt 540 agcgcagaag atattagcac cgcaattccg catcgtattg tgcaggataa tttcccgaaa 600 ttcaaagaga actgccacat ttttacccgt ctgattaccg cagttccgag cctgcgtgaa 660 cattttgaaa acgttaaaaa agccatcggc atctttgtta gcaccagcat tgaagaagtt 720 tttagcttcc cgttttacaa tcagctgctg acccagaccc agattgatct gtataaccaa 780 ctgctgggtg gtattagccg tgaagcaggc accgaaaaaa tcaaaggtct gaatgaagtg 840 ctgaatctgg ccattcagaa aaatgatgaa accgcacata ttattgcaag cctgccgcat 900 cgttttattc cgctgttcaa acaaattctg agcgatcgta ataccctgag ctttattctg 960 gaagaattca aatccgatga agaggtgatt cagagctttt gcaaatacaa aacgctgctg 1020 cgcaatgaaa atgttctgga aactgccgaa gcactgttta acgaactgaa tagcattgat 1080 ctgacccaca tctttatcag ccacaaaaaa ctggaaacca tttcaagcgc actgtgtgat 1140 cattgggata ccctgcgtaa tgccctgtat gaacgtcgta ttagcgaact gaccggtaaa 1200 attaccaaaa gcgcgaaaga aaaagttcag cgcagtctga aacatgagga tattaatctg 1260 caagagatta ttagcgcagc cggtaaagaa ctgtcagaag catttaaaca gaaaaccagc 1320 gaaattctgt cacatgcaca tgcagcactg gatcagccgc tgccgaccac cctgaaaaaa 1380 caagaagaaa aagaaatcct gaaaagccag ctggatagcc tgctgggtct gtatcatctg 1440 ctggactggt ttgcagttga tgaaagcaat gaagttgatc cggaatttag cgcacgtctg 1500 accggcatta aactggaaat ggaaccgagc ctgagctttt ataacaaagc ccgtaattat 1560 gccaccaaaa aaccgtatag cgtcgaaaaa ttcaaactga actttcagcg tccgaccctg 1620 gcaagcggtt gggatgttaa taaagaaaaa aacaacggtg ccatcctgtt cgtgaaaaat 1680 ggcctgtatt atctgggtat tatgccgaaa cagaaaggtc gttataaagc gctgagcttt 1740 gaaccgacgg aaaaaaccag tgaaggtttt gataaaatgt actacgacta ttttccggat 1800 gcagccaaaa tgattccgaa atgtagcacc cagctgaaag cagttaccgc acattttcag 1860 acccatacca ccccgattct gctgagcaat aactttattg aaccgctgga aatcaccaaa 1920 gagatctacg atctgaataa cccggaaaaa gagccgaaaa aattccagac cgcatatgca 1980 aaaaaaaccg gtgatcagaa aggttatcgt gaagcgctgt gtaaatggat tgatttcacc 2040 cgtgattttc tgagcaaata caccaaaacc accagtatcg atctgagcag cctgcgtccg 2100 agcagccagt ataaagatct gggcgaatat tatgcagaac tgaatccgct gctgtatcat 2160 attagctttc agcgtattgc cgagaaagaa atcatggacg cagttgaaac cggtaaactg 2220 tacctgttcc agatctacaa taaagatttt gccaaaggcc atcatggcaa accgaatctg 2280 cataccctgt attggaccgg tctgtttagc cctgaaaatc tggcaaaaac ctcgattaaa 2340 ctgaatggtc aggcggaact gttttatcgt ccgaaaagcc gtatgaaacg tatggcagct 2400 cgtctgggtg aaaaaatgct gaacaaaaaa ctgaaagacc agaaaacccc gatcccggat 2460 acactgtatc aagaactgta tgattatgtg aaccatcgtc tgagccatga tctgagtgat 2520 gaagcacgtg ccctgctgcc gaatgttatt accaaagaag ttagccacga gatcattaaa 2580 gatcgtcgtt ttaccagcga caaattcctg tttcatgtgc cgattaccct gaattatcag 2640 gcagcaaata gcccgagcaa atttaaccag cgtgttaatg catatctgaa agaacatcca 2700 gaaacgccga ttattggtat tgatcgtggt gaacgtaacc tgatttatat caccgttatt 2760 gatagcaccg gcaaaatcct ggaacagcgt agcctgaata ccattcagca gtttgattac 2820 cagaaaaaac tggataatcg cgagaaagaa cgtgttgcag cacgtcaggc atggtcagtt 2880 gttggtacaa ttaaagacct gaaacagggt tatctgagcc aggttattca tgaaattgtg 2940 gatctgatga ttcactatca ggccgttgtt gtgctggaaa acctgaattt tggctttaaa 3000 agcaaacgta ccggcattgc agaaaaagca gtttatcagc agttcgagaa aatgctgatt 3060 gacaaactga attgcctggt gctgaaagat tatccggctg aaaaagttgg tggtgttctg 3120 aatccgtatc agctgaccga tcagtttacc agctttgcaa aaatgggcac ccagagcgga 3180 tttctgtttt atgttccggc accgtatacg agcaaaattg atccgctgac cggttttgtt 3240 gatccgtttg tttggaaaac catcaaaaac catgaaagcc gcaaacattt tctggaaggt 3300 ttcgattttc tgcattacga cgttaaaacg ggtgatttca tcctgcactt taaaatgaat 3360 cgcaatctga gttttcagcg tggcctgcct ggttttatgc ctgcatggga tattgtgttt 3420 gagaaaaacg aaacacagtt cgatgcaaaa ggcaccccgt ttattgcagg taaacgtatt 3480 gttccggtga ttgaaaatca tcgtttcacc ggtcgttatc gcgatctgta tccggcaaat 3540 gaactgatcg cactgctgga agagaaaggt attgtttttc gtgatggctc aaacattctg 3600 ccgaaactgc tggaaaatga tgatagccat gcaattgata ccatggttgc actgattcgt 3660 agcgttctgc agatgcgtaa tagcaatgca gcaaccggtg aagattacat taatagtccg 3720 gttcgtgatc tgaatggtgt ttgttttgat agccgttttc agaatccgga atggccgatg 3780 gatgcagatg caaatggtgc atatcatatt gcactgaaag gacagctgct gctgaaccac 3840 ctgaaagaaa gcaaagatct gaaactgcaa aacggcatta gcaatcagga ttggctggca 3900 tatatccaag aactgcgtaa cggtcgtagc agtgatgatg aagcaaccgc agatagccag 3960 catgcagcac cgcctaaaaa gaaacgtaaa gtt 3993 <210> 1178 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> This sequence may encompass 1-10 nucleotides <400> 1178 aaaaaaaaaa 10 <210> 1179 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> This sequence may encompass 10-20 nucleotides <400> 1179 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20 <210> 1180 <211> 200 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(200) <223> This sequence may encompass 25-200 nucleotides <400> 1180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 200

Claims (82)

  1. 만능성 인간 줄기세포로서, 줄기세포는
    (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH)의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집 및
    (ii) TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집, 또는 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A)의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집
    을 포함하는, 만능성 인간 줄기세포.
  2. 제1항에 있어서, 줄기세포는 TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집 및 ADORA2A의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함하는, 만능성 인간 줄기세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 줄기세포는 TGF 베타 수용체 또는 TGF 베타 수용체의 우성-음성 변이체의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함하는, 만능성 인간 줄기세포.
  4. 제3항에 있어서, TGF 베타 수용체는 TGF 베타 수용체 II(TGFβRII)인, 만능성 인간 줄기세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-카드헤린(cadherin), UTF-1, Oct4, Rex1 및 Nanog로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 만능성 마커를 발현하는, 만능성 인간 줄기세포.
  6. 분화된 세포로서, 분화된 세포는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 만능성 인간 줄기세포의 딸 세포인, 분화된 세포.
  7. 제6항에 있어서, 분화된 세포는 면역 세포인, 분화된 세포.
  8. 제6항에 있어서, 분화된 세포는 림프구인, 분화된 세포.
  9. 제6항에 있어서, 분화된 세포는 자연 살해 세포인, 분화된 딸 세포.
  10. 제6항에 있어서, 줄기세포는 인간 유도된 만능성 줄기세포(iPSC)이고, 분화된 딸 세포는 iNK 세포인, 분화된 세포.
  11. 제6항에 있어서, 세포는
    (a) 내인성 CD3, CD4 및/또는 CD8을 발현하지 않고;
    (b) (i) CD56(NCAM), CD49, CD43 및/또는 CD45, 또는 이의 임의의 조합;
    (ii) NK 세포 수용체 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγRIII, 분화 16의 덩어리(CD16));
    (iii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D);
    (iv) CD69;
    (v) 자연 세포독성 수용체;
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 유전자를 발현하는, 분화된 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 하나 이상의 추가의 게놈 편집을 포함하는, 세포.
  13. 제12항에 있어서, 세포는
    (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR);
    (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체;
    (iii) 인터루킨 15(IL-15);
    (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G);
    (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E);
    (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리;
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 작제물을 특징으로 하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하고/거나;
    (2) (i) ADORA2A;
    (ii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT);
    (iii) β-2 마이크로글로불린(B2M);
    (iv) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1);
    (v) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA);
    (vi) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A);
    (vii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자;
    (viii) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B);
    (ix) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 손실을 야기하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하는, 세포.
  14. 인간 유도된 만능성 줄기세포(iPSC)로서, iPSC는 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A)의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함하는, 인간 유도된 줄기세포(iPSC).
  15. 제14항에 있어서, iPSC는 TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집 또는 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH)의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함하는, 인간 iPSC.
  16. 제15항에 있어서, iPSC는 TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집 및 CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함하는, 인간 iPSC.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, iPSC는 TGF 베타 수용체 또는 TGF 베타 수용체의 우성-음성 변이체의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함하는, 인간 iPSC.
  18. 제17항에 있어서, TGF 베타 수용체는 TGF 베타 수용체 II(TGFβRII)인, 인간 iPSC.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, iPSC는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-카드헤린, UTF-1, Oct4, Rex1 및 Nanog로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 만능성 마커를 발현하는, 인간 iPSC.
  20. 분화된 세포로서, 분화된 세포는 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항의 인간 iPSC의 딸 세포인, 분화된 세포.
  21. 제20항에 있어서, 분화된 세포는 면역 세포인, 분화된 세포.
  22. 제20항에 있어서, 분화된 세포는 림프구인, 분화된 세포.
  23. 제20항에 있어서, 분화된 세포는 자연 살해 세포인, 분화된 딸 세포.
  24. 제20항에 있어서, 분화된 딸 세포는 iNK 세포인, 분화된 세포.
  25. 제20항에 있어서, 세포는
    (a) 내인성 CD3, CD4 및/또는 CD8을 발현하지 않고;
    (b) (i) CD56(NCAM), CD49, CD43 및/또는 CD45, 또는 이의 임의의 조합;
    (ii) NK 세포 수용체 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγRIII, 분화 16의 덩어리(CD16));
    (iii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D);
    (iv) CD69;
    (v) 자연 세포독성 수용체;
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 유전자를 발현하는, 분화된 세포.
  26. 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 하나 이상의 추가의 게놈 편집을 포함하는, 세포.
  27. 제26항에 있어서, 세포는
    (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR);
    (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체;
    (iii) 인터루킨 15(IL-15);
    (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G);
    (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E);
    (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리;
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 작제물을 특징으로 하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하고/거나;
    (2) (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH);
    (ii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT);
    (iii) β-2 마이크로글로불린(B2M);
    (iv) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1);
    (v) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA);
    (vi) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A);
    (vii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자;
    (viii) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B);
    (ix) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 손실을 야기하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하는, 세포.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성하고;
    TGFβRII의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성하고/하거나;
    ADORA2A의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 사용하여 생성하는, 세포.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제 및 (ii) SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성하고;
    TGFβRII의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제 및 (ii) SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성하고/하거나;
    ADORA2A의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 (i) RNA-가이드된 뉴클레아제 및 (ii) SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 사용하여 생성하는, 세포.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 세포를 제조하는 방법으로서, 본 방법은
    RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA;
    RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및/또는
    RNA-가이드된 뉴클레아제 및 SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA
    중 하나 이상과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 세포를 제조하는 방법으로서, 본 방법은
    (i) RNA-가이드된 뉴클레아제 및 (ii) SEQ ID NO: 258 내지 364, 1155 및 1162 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체;
    (i) RNA-가이드된 뉴클레아제 및 (ii) SEQ ID NO: 29 내지 257, 1157 및 1161 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체; 및/또는
    (i) RNA-가이드된 뉴클레아제 및 (ii) SEQ ID NO: 827 내지 1143, 1159 및 1163 중 어느 하나에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체
    중 하나 이상과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드된 뉴클레아제는 Cas12a 변이체인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, Cas12a 변이체는 M537R, F870L 및 H800A로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 방법.
  34. 제32항에 있어서, Cas12a 변이체는 아미노산 치환 M537R, F870L 및 H800A를 포함하는, 방법.
  35. 제32항에 있어서, Cas12a 변이체는 SEQ ID NO: 1148의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO: 1155 또는 1162의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA; SEQ ID NO: 1157 또는 1161의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및 SEQ ID NO: 1159 또는 1163의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표적화 도메인 서열을 포함하는 가이드 RNA; 및
    (ii) SEQ ID NO: 1144 내지 1151(또는 이의 일부분) 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 RNA 가이드된 뉴클레아제
    와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 만능성 인간 줄기세포로서, 줄기세포는 형질전환 성장 인자 베타(TGF 베타) 신호전달 경로에서의 교란을 포함하는, 만능성 인간 줄기세포.
  38. 제34항에 있어서, 줄기세포는 TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함하는, 만능성 인간 줄기세포.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, TGF 베타 수용체 또는 TGF 베타 수용체의 우성-음성 변이체의 기능 손실을 포함하는, 만능성 인간 줄기세포.
  40. 제39항에 있어서, TGF 베타 수용체는 TGF 베타 수용체 II(TGFβRII)인, 만능성 인간 줄기세포.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 인터루킨 신호전달의 길항제의 기능 손실을 추가로 포함하는, 만능성 인간 줄기세포.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포는 인터루킨 신호전달의 길항제의 기능 손실을 야기하는 게놈 변형을 추가로 포함하는, 만능성 인간 줄기세포.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 인터루킨 신호전달의 길항제는 IL-15 신호전달 경로 및/또는 IL-2 신호전달 경로의 길항제인, 만능성 인간 줄기세포.
  44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH)의 기능 손실을 포함하는, 만능성 인간 줄기세포.
  45. 제44항에 있어서, 줄기세포는 CISH의 기능 손실을 야기하는 게놈 변형을 포함하는, 만능성 인간 줄기세포.
  46. 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-카드헤린, UTF-1, Oct4, Rex1 및 Nanog로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 만능성 마커를 발현하는, 만능성 인간 줄기세포.
  47. 분화된 세포로서, 분화된 세포는 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항의 만능성 인간 줄기세포의 딸 세포인, 분화된 세포.
  48. 제47항에 있어서, 분화된 세포는 면역 세포인, 분화된 세포.
  49. 제47항에 있어서, 분화된 세포는 림프구인, 분화된 세포.
  50. 제47항에 있어서, 분화된 세포는 자연 살해 세포인, 분화된 딸 세포.
  51. 제47항에 있어서, 줄기세포는 인간 유도된 만능성 줄기세포(iPSC)이고, 분화된 딸 세포는 iNK 세포인, 분화된 세포.
  52. 제47항에 있어서, 세포는
    (a) 내인성 CD3, CD4 및/또는 CD8을 발현하지 않고;
    (b) (i) CD56(NCAM), CD49, CD43 및/또는 CD45, 또는 이의 임의의 조합;
    (ii) NK 세포 수용체 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III(FcγRIII, 분화 16의 덩어리(CD16));
    (iii) 자연 살해 그룹-2 구성원 D(NKG2D);
    (iv) CD69;
    (v) 자연 세포독성 수용체;
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 적어도 하나의 내인성 유전자를 발현하는, 분화된 세포.
  53. 제37항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 하나 이상의 추가의 게놈 편집을 포함하는, 세포.
  54. 제53항에 있어서, 세포는
    (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR);
    (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체;
    (iii) 인터루킨 15(IL-15);
    (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G);
    (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E);
    (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리;
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 작제물을 특징으로 하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하고/거나;
    (2) (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH);
    (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A);
    (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT);
    (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M);
    (v) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1);
    (vi) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA);
    (vii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A);
    (viii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자;
    (ix) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B);
    (x) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 손실을 야기하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하는, 세포.
  55. 만능성 인간 줄기세포를 배양하는 방법으로서, 액티빈(activin)을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 만능성 인간 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 유도된 만능성 줄기세포인, 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 만능성 인간 줄기세포는 TGFβRII을 발현하지 않는, 방법.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 만능성 인간 줄기세포는 TGFβRII가 발현되지 않도록 유전자 조작되는, 방법.
  59. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 만능성 인간 줄기세포는 TGFβRII를 인코딩하는 유전자가 녹아웃되도록 유전자 조작되는, 방법.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 액티빈은 액티빈 A인, 방법.
  61. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 배지는 TGFβ를 포함하지 않는, 방법.
  62. 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 배양은 소정의 기간(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12일, 또는 그 이상) 동안 수행되는, 방법.
  63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 단계 동안 또는 그 후에 하나 이상의 시기에, 만능성 인간 줄기세포는 만능성을 유지하는(예를 들어, 하나 이상의 만능성 마커를 나타냄), 방법.
  64. 제63항에 있어서, 배양 단계 동안 또는 그 후에 1회 이상에서, 만능성 인간 줄기세포는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-카드헤린, UTF-1, Oct4, Rex1 및 Nanog 중 하나 이상의 검출 가능한 수준을 발현하는, 방법.
  65. 제63항에 있어서, 배양 단계 동안 또는 그 후에 만능성 인간 줄기세포는 내배엽, 중배엽 및/또는 외배엽 주의 세포로 분화되는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 만능성 인간 줄기세포 또는 이의 자손이 자연 살해(NK) 세포로 추가로 분화되는 방법.
  67. 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 만능성 인간 줄기세포는
    (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR);
    (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체;
    (iii) 인터루킨 15(IL-15);
    (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G);
    (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E);
    (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리;
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 작제물을 특징으로 하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하고/거나;
    (2) (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH);
    (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A);
    (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT);
    (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M);
    (v) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1);
    (vi) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA);
    (vii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A);
    (viii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자;
    (ix) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B);
    (x) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 손실을 야기하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하는, 방법.
  68. (i) 만능성 인간 줄기세포 및 (ii) 액티빈을 포함하는 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물로서, 만능성 인간 줄기세포는 형질전환 성장 인자 베타(TGF 베타) 신호전달 경로에서의 교란을 포함하는, 세포 배양물.
  69. 제68항에 있어서, 줄기세포는 TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함하는, 세포 배양물.
  70. 제69항에 있어서, 게놈 편집은 게놈 편집인, 세포 배양물.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포는 TGF 베타 수용체 또는 TGF 베타 수용체의 우성-음성 변이체의 기능 손실을 포함하는, 세포 배양물.
  72. 제71항에 있어서, TGF 베타 수용체는 TGF 베타 수용체 II(TGFβRII)인, 세포 배양물.
  73. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 만능성 인간 줄기세포는
    (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR);
    (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체;
    (iii) 인터루킨 15(IL-15);
    (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G);
    (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E);
    (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리;
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 작제물을 특징으로 하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하고/거나;
    (2) (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH);
    (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A);
    (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT);
    (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M);
    (v) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1);
    (vi) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA);
    (vii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A);
    (viii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자;
    (ix) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B);
    (x) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 손실을 야기하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하는, 세포 배양물.
  74. iNK 세포 활성 수준을 증가시키는 방법으로서,
    (i) 형질전환 성장 인자 베타(TGF 베타) 신호전달 경로에서의 교란을 포함하는 만능성 인간 줄기세포를 제공하는 단계; 및
    (ii) 만능성 인간 줄기세포를 iNK 세포로 분화시키는 단계
    를 포함하고,
    iNK 세포는 TGF 베타 신호전달 경로의 교란을 포함하지 않는 iNK 세포와 비교하여 더 높은 수준의 세포 활성을 나타내는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, iNK는 액티빈을 포함하는 배지에서 배양된 만능성 인간 줄기세포로부터 분화되는, 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 분화 단계 전 및/또는 그 동안 액티빈을 포함하는 배지에서 만능성 인간 줄기세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  77. 제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 만능성 인간 줄기세포에서 형질전환 성장 인자 베타(TGF 베타) 신호전달 경로를 교란시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  78. 제73항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포는 TGF 베타 신호전달 경로의 작용제의 기능 손실을 야기하는 게놈 편집을 포함하는, 방법.
  79. 제73항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포는 TGF 베타 수용체 또는 TGF 베타 수용체의 우성-음성 변이체의 기능 손실을 포함하는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, TGF 베타 수용체는 TGF 베타 수용체 II(TGFβRII)인, 방법.
  81. 제73항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 만능성 인간 줄기세포는
    (1) (i) 키메라 항원 수용체(CAR);
    (ii) FcγRIII(CD16) 또는 FcγRIII(CD16)의 변이체;
    (iii) 인터루킨 15(IL-15);
    (iv) IL-15 수용체(IL-15R) 작용제 또는 IL-15 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (v) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (vi) IL-12 수용체(IL-12R) 작용제 또는 IL-12 수용체의 항시적 활성 변이체;
    (vii) 인간 백혈구 항원 G(HLA-G);
    (viii) 인간 백혈구 항원 E(HLA-E);
    (ix) 분화 CD47(CD47)의 백혈구 표면 항원 덩어리;
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산 발현 작제물을 특징으로 하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하고/거나;
    (2) (i) 사이토카인 유도성 SH2 포함 단백질(CISH);
    (ii) 아데노신 A2a 수용체(ADORA2A);
    (iii) Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT);
    (iv) β-2 마이크로글로불린(B2M);
    (v) 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1);
    (vi) 클래스 II, 주요 조직적합성 복합체, 트랜스작용인자(CIITA);
    (vii) 자연 살해 세포 수용체 NKG2A(자연 살해 그룹 2A);
    (viii) 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 알파 사슬 유전자 및/또는 2개 이상의 HLA 클래스 II 조직적합성 항원 베타 사슬 유전자;
    (ix) 분화 덩어리 32B(CD32B, FCGR2B);
    (x) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);
    또는 이 중 2개 이상의 임의의 조합 중 적어도 하나의 기능 손실을 야기하는 적어도 하나의 게놈 편집을 포함하는, 방법.
  82. 암을 갖거나 암 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 본 방법은 제6항 내지 제13항, 제20항 내지 제29항, 또는 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항의 세포를 대상체에 투여함으로써 대상체의 암을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
KR1020227023757A 2019-12-18 2020-12-18 치료용 조작 세포 KR20220119063A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962950063P 2019-12-18 2019-12-18
US62/950,063 2019-12-18
US202063025735P 2020-05-15 2020-05-15
US63/025,735 2020-05-15
US202063115592P 2020-11-18 2020-11-18
US63/115,592 2020-11-18
PCT/US2020/066256 WO2021127594A1 (en) 2019-12-18 2020-12-18 Engineered cells for therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220119063A true KR20220119063A (ko) 2022-08-26

Family

ID=76478017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227023757A KR20220119063A (ko) 2019-12-18 2020-12-18 치료용 조작 세포

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230053028A1 (ko)
EP (1) EP4076479A4 (ko)
JP (1) JP2023507118A (ko)
KR (1) KR20220119063A (ko)
CN (1) CN114929250A (ko)
AU (1) AU2020405203A1 (ko)
CA (1) CA3164660A1 (ko)
IL (1) IL293946A (ko)
WO (1) WO2021127594A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202237826A (zh) 2020-11-30 2022-10-01 瑞士商克里斯珀醫療股份公司 基因編輯的自然殺手細胞
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
JP2024500847A (ja) 2020-12-18 2024-01-10 センチュリー セラピューティクス，インコーポレイテッド 適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム
EP4444877A2 (en) * 2021-12-10 2024-10-16 Beam Therapeutics Inc. Modified immune cells and methods of using the same
WO2024077145A1 (en) * 2022-10-05 2024-04-11 Garuda Therapeutics, Inc. Modified hematopoietic stem cells and progenies thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008307007A (ja) * 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
US9233926B2 (en) * 2008-09-17 2016-01-12 Sanford-Burnham Medical Research Institute Compounds for stem cell differentiation
JP2019536447A (ja) * 2016-10-27 2019-12-19 インティマ バイオサイエンス， インコーポレイテッド Ｔ細胞療法のウイルス法
MX2020004608A (es) * 2017-11-01 2020-10-05 Editas Medicine Inc Metodos, composiciones y componentes para edicion crispr-cas9 de tgfbr2 en celulas t para inmunoterapia.
CN112040960B (zh) * 2018-05-11 2024-02-13 加利福尼亚大学董事会 修饰免疫细胞以增加活性

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021127594A1 (en) 2021-06-24
EP4076479A1 (en) 2022-10-26
CA3164660A1 (en) 2021-06-24
JP2023507118A (ja) 2023-02-21
AU2020405203A1 (en) 2022-07-14
IL293946A (en) 2022-08-01
CN114929250A (zh) 2022-08-19
EP4076479A4 (en) 2024-05-22
US20230053028A1 (en) 2023-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220143084A1 (en) Modified natural killer (nk) cells for immunotherapy
CN108368520B (zh) 多能细胞的基因组工程改造
KR20220119063A (ko) 치료용 조작 세포
KR20190057387A (ko) 만능 줄기 세포를 hla 동형 접합 면역 세포로 직접 분화시키기 위한 방법
JP2023524976A (ja) 必須遺伝子ノックインによる選択
US20240293543A1 (en) Engineered cells for therapy
JP2023544324A (ja) 人工多能性幹細胞のための改善されたリプログラミング、維持及び保存
AU2021369476A9 (en) Methods of inducing antibody-dependent cellular cytotoxicity (adcc) using modified natural killer (nk) cells
JP2024517864A (ja) 治療用の改変細胞
EA047969B1 (ru) Модифицированные естественные клетки-киллеры (nk) для иммунотерапии
WO2024102860A1 (en) Engineered cells for therapy
CN116848234A (zh) 使用修饰的自然杀伤（nk）细胞诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（adcc）的方法
WO2023220207A2 (en) Genome editing of cells
CN118076728A (zh) 用于疗法的工程细胞

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination