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JP2019536447A - Ｔ細胞療法のウイルス法 - Google Patents

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Abstract

ウイルスまたは非ウイルスベクターを使用して遺伝子改変細胞の集団を産生する方法。遺伝子改変細胞の集団を産生するため、および／またはがんの処置のための改変ウイルスも開示される。過去５０年間における、がん治療法における目覚ましい進歩にも拘らず、特に、進行した病期において、化学療法、放射線療法、または生物療法に対して抵抗性であり、外科法により対処できない多くの腫瘍型が依然として存在する。近年、腫瘍上の分子標的をｉｎ ｖｉｖｏで認識するリンパ球の遺伝子操作が著しく進歩した結果として、標的腫瘍寛解の目覚ましい症例がもたらされている。

Description

相互参照
本出願は、２０１６年１０月２７日出願の米国仮出願第６２／４１３，８１４号および２０１７年１月３０日出願の米国仮出願第６２／４５２，０８１号の利益を主張し、当該出願の各々は、全ての目的について全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
過去５０年間における、がん治療法における目覚ましい進歩にも拘らず、特に、進行した病期において、化学療法、放射線療法、または生物療法に対して抵抗性であり、外科法により対処できない多くの腫瘍型が依然として存在する。近年、腫瘍上の分子標的をｉｎ ｖｉｖｏで認識するリンパ球の遺伝子操作が著しく進歩した結果として、標的腫瘍寛解の目覚ましい症例がもたらされている。しかし、これらの成功は、主に、造血系腫瘍に限定されており、特定の腫瘍内の細胞が発現する、同定可能な分子の欠如、および腫瘍破壊を媒介するために、腫瘍標的に特異的に結合するのに使用され得る分子の欠如により、固形腫瘍へのより広範な適用は、限定的である。近年におけるいくつかの進歩は、場合によって、抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する、腫瘍特異的変異の同定に焦点を当てている。例えば、これらの内因性変異は、全エクソーム−シーケンシング法を使用して同定することができる（Ｔｒａｎ Ｅら、「Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４４巻：６４１〜６４４頁（２０１４年））。
参照による組込み
本明細書における全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、および特許出願が、参照により組み込まれるように、具体的かつ個別に指し示された場合と同じ程度に、参照により組み込まれる。万一、本明細書の用語と、組み込まれる参考文献の用語との間で齟齬が生じた場合は、本明細書の用語が優先される。
Ｔｒａｎ Ｅら、「Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４４巻：６４１〜６４４頁（２０１４年）
本明細書では、遺伝子改変細胞の集団を産生する方法であって、ヒト対象に由来する細胞の集団を提供するステップ；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を使用してサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子中に切断を導入することによって細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで改変するステップ；およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞に導入して、前記外因性トランス遺伝子を、前記切断において、前記少なくとも１個の細胞のゲノム中に組み込むステップを含み；前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むための前記ＡＡＶベクターの使用が、前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を同等の細胞に組み込むためのミニサークルベクターの使用と比較して細胞毒性を低減する、方法が開示される。
本明細書では、遺伝子改変細胞の集団を産生する方法であって、ヒト対象に由来する細胞の集団を提供するステップ；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を使用してサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子中に切断を導入することによって細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで改変するステップ；およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞に導入して、前記外因性トランス遺伝子を、前記切断において、前記少なくとも１個の細胞のゲノム中に組み込むステップを含み；細胞の前記集団が、前記ＡＡＶベクターを導入した約４日後に、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって測定された場合、少なくとも約９０％の生細胞を含む、方法が開示される。
本明細書では、遺伝子改変細胞の集団を産生する方法であって、ヒト対象に由来する細胞の集団を提供するステップ；ガイドポリ核酸を含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を細胞の前記集団に導入するステップであって、前記ガイドポリ核酸が細胞の前記集団内の複数の細胞中のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子に特異的に結合し、前記ＣＲＩＳＰＲ系が前記ＣＩＳＨ遺伝子中に切断を導入することによって、前記複数の細胞中でＣＩＳＨタンパク質機能を抑制する、ステップ；およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記複数の細胞に導入することによって、遺伝子改変細胞の集団を産生するステップであって、前記ＡＡＶベクターが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を、前記切断において、前記複数の細胞のゲノム中に組み込む、ステップを含み；遺伝子改変細胞の前記集団中の細胞の少なくとも約１０％が、前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を発現する、方法が開示される。
本明細書では、ヒト対象におけるがんを処置する方法であって、治療有効量のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団を投与するステップを含み、前記ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の少なくとも１個が、前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞中でのサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）機能の抑制をもたらす、ＣＩＳＨ遺伝子中のゲノム変化を含み、前記ゲノム変化がクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系によって誘導され；前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性トランス遺伝子をさらに含み、前記外因性トランス遺伝子が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって、前記ＣＩＳＨ遺伝子中において、前記少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中に導入され；前記投与が、前記ヒト対象におけるがんを処置するか、またはがんの少なくとも１つの症状を改善する、方法が開示される。
本明細書では、ヒト対象における消化器がんを処置する方法であって、治療有効量のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団を投与するステップを含み、前記ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の少なくとも１個が、前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞中でのサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）機能の抑制をもたらす、ＣＩＳＨ遺伝子中のゲノム変化を含み、前記ゲノム変化がクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系によって誘導され；前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性トランス遺伝子をさらに含み、前記外因性トランス遺伝子が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって、前記ＣＩＳＨ遺伝子中において、前記少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中に導入され；前記投与が、前記ヒト対象におけるがんを処置するか、またはがんの少なくとも１つの症状を改善する、方法が開示される。
本明細書では、ヒト対象におけるがんを処置する方法であって、治療有効量のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団を投与するステップを含み、前記ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の少なくとも１個が、前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞中でのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質機能の抑制をもたらす、ＴＣＲ遺伝子中のゲノム変化、および前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞中でのサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）機能の抑制をもたらす、ＣＩＳＨ遺伝子中のゲノム変化を含み、前記ゲノム変化がクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系によって誘導され；前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性トランス遺伝子をさらに含み、前記外因性トランス遺伝子が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって、前記ＣＩＳＨ遺伝子中において、前記少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中に導入され；前記投与が、前記ヒト対象におけるがんを処置するか、またはがんの少なくとも１つの症状を改善する、方法が開示される。
本明細書では、少なくとも１個の遺伝子改変細胞中のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）機能を抑制するＣＩＳＨ遺伝子中の外因性ゲノム変化と、前記ＣＩＳＨ遺伝子中における、前記少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中への挿入のためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとを含む、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団が開示される。
本明細書では、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団の少なくとも１個の遺伝子改変細胞中のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）機能を抑制するＣＩＳＨ遺伝子中の外因性ゲノム変化と、前記ＣＩＳＨ遺伝子中における、前記ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団の少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中への挿入のためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとを含む、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団が開示される。
本明細書では、少なくとも１個の遺伝子改変細胞中のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）機能を抑制するＣＩＳＨ遺伝子中の外因性ゲノム変化およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質機能を抑制するＴＣＲ遺伝子中の外因性ゲノム変化と、前記ＣＩＳＨ遺伝子中における、前記少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中への挿入のためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとを含む、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団が開示される。
本明細書では、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を細胞に導入するための系であって、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、少なくとも１個の細胞のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子中に二本鎖切断を導入し、前記ＡＡＶベクターが前記切断において、前記細胞のゲノム中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を導入し；前記系が、ミニサークルおよび前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む同様の系と比較して、前記ゲノム中への前記トランス遺伝子のより高い導入効率を有し、より低い細胞毒性をもたらし、前記ミニサークルが前記ゲノム中に前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を導入する、系が開示される。
本明細書では、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を細胞に導入するための系であって、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、少なくとも１個の細胞のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子中に二本鎖切断を導入し、前記ＡＡＶベクターが前記切断において、前記細胞のゲノム中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を導入し；前記系が、ミニサークルおよび前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む同様の系と比較して、前記ゲノム中への前記トランス遺伝子のより高い導入効率を有し、より低い細胞毒性をもたらし、前記ミニサークルが前記ゲノム中に前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を導入する、系が開示される。
本明細書では、がんを処置する方法であって、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を使用してヒト対象に由来する細胞の集団中のＣＩＳＨ遺伝子をｅｘ ｖｉｖｏで改変するステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲ系が、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子中に二本鎖切断を導入して、操作細胞の集団を生成する、ステップ；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含むアデノ随伴ウイルス遺伝子送達系を使用して前記操作細胞の集団中にがん応答性受容体を導入して、前記二本鎖切断に少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むことによって、がん応答性細胞の集団を生成するステップ；および治療有効量の前記がん応答性細胞の集団を前記対象に投与するステップを含む、方法が開示される。
本明細書では、消化器がんを処置する方法であって、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を使用してヒト対象に由来する細胞の集団中のＣＩＳＨ遺伝子をｅｘ ｖｉｖｏで改変するステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲ系が、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子中に二本鎖切断を導入して、操作細胞の集団を生成する、ステップ；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含むアデノ随伴ウイルス遺伝子送達系を使用して前記操作細胞の集団中にがん応答性受容体を導入して、前記二本鎖切断に少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むことによって、がん応答性細胞の集団を生成するステップ；および治療有効量の前記がん応答性細胞の集団を前記対象に投与するステップを含む、方法が開示される。
本明細書では、遺伝子改変細胞を作製する方法であって、宿主細胞の集団を提供するステップ；組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターと、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系とを導入するステップを含み；前記ヌクレアーゼがサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子中に切断を導入し、前記ＡＡＶベクターが前記切断に外因性核酸を導入し；前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むための前記ＡＡＶベクターの使用が、同等の細胞中で前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むためのミニサークルベクターの使用と比較して細胞毒性を低減し；前記外因性核酸が、前記ＣＲＩＳＰＲ系と対応する野生型ＡＡＶベクターとが導入された同等の宿主細胞の集団と比較して、より高い効率で導入される、方法が開示される。
本明細書では、遺伝子改変された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を産生する方法であって、ヒト対象に由来するＴＩＬの集団を提供するステップ；前記ＴＩＬの集団に、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系をｅｘ ｖｉｖｏで電気穿孔するステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲ系が、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を含むヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含み；前記ｇＲＮＡがサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子と相補的な配列を含み、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記ＴＩＬの集団中の少なくとも１個のＴＩＬの前記ＣＩＳＨ遺伝子中に二本鎖切断を導入し；前記ヌクレアーゼがＣａｓ９であるか、または前記ポリヌクレオチドがＣａｓ９をコードする、ステップ；および前記ＣＲＩＳＰＲ系の電気穿孔の約１時間〜約４日後に前記ＴＩＬの集団中の前記少なくとも１個のＴＩＬにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを導入して、前記二本鎖切断中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むステップを含む、方法が開示される。
本明細書では、遺伝子改変された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を産生する方法であって、ヒト対象に由来するＴＩＬの集団を提供するステップ；前記ＴＩＬの集団に、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系をｅｘ ｖｉｖｏで電気穿孔するステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲ系が、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を含むヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含み；前記ｇＲＮＡがサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子と相補的な配列を含み、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記ＴＩＬの集団中の少なくとも１個のＴＩＬの前記ＣＩＳＨ遺伝子中に二本鎖切断を導入し；前記ヌクレアーゼがＣａｓ９であるか、または前記ポリヌクレオチドがＣａｓ９をコードする、ステップ；および前記ＣＲＩＳＰＲ系の電気穿孔の約１時間〜約３日後に前記ＴＩＬの集団中の前記少なくとも１個のＴＩＬにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを導入して、前記二本鎖切断中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むステップを含む、方法が開示される。
本明細書では、遺伝子改変された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を産生する方法であって、ヒト対象に由来するＴＩＬの集団を提供するステップ；前記ＴＩＬの集団に、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系をｅｘ ｖｉｖｏで電気穿孔するステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲ系が、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、少なくとも１個のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）とを含み；前記少なくとも１個のｇＲＮＡが、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子と相補的な配列を含むｇＲＮＡと、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子と相補的な配列を含むｇＲＮＡとを含み；前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記ＴＩＬの集団中の少なくとも１個のＴＩＬの前記ＣＩＳＨ遺伝子中に第１の二本鎖切断を導入し、前記ＴＣＲ遺伝子中に第２の二本鎖切断を導入し；前記ヌクレアーゼがＣａｓ９であるか、または前記ポリヌクレオチドがＣａｓ９をコードする、ステップ；および前記ＣＲＩＳＰＲ系の電気穿孔の約１時間〜約４日後に前記ＴＩＬの集団中の前記少なくとも１個のＴＩＬにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを導入して、前記第１の二本鎖切断または前記第２の二本鎖切断の少なくとも１つ中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むステップを含む、方法が開示される。
本明細書では、遺伝子改変細胞の集団を産生する方法であって、ヒト対象に由来する細胞の集団を提供するステップ；ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリペプチドと、ガイドポリ核酸とを使用してサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子中に切断を導入することによって、細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞をｅｘ ｖｉｖｏで改変するステップ；およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞に導入して、前記切断において、前記少なくとも１個の細胞のゲノム中に前記外因性トランス遺伝子を組み込むステップを含み；前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むための前記ＡＡＶベクターの使用が、同等の細胞中で前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むためのミニサークルベクターの使用と比較して細胞毒性を低減する、方法が開示される。
本明細書では、遺伝子改変細胞の集団を産生する方法であって、ヒト対象に由来する細胞の集団を提供するステップ；少なくとも１個のガイドポリ核酸を含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を細胞の前記集団に導入するステップであって、前記少なくとも１個のガイドポリ核酸が、細胞の前記集団内の複数の細胞中でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子に特異的に結合するガイドポリ核酸と、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子に特異的に結合するガイドポリ核酸とを含み、前記ＣＲＩＳＰＲ系が前記ＴＣＲ遺伝子と前記ＣＩＳＨ遺伝子中に切断を導入することによって、前記複数の細胞中でのＴＣＲタンパク質機能とＣＩＳＨタンパク質機能とを抑制する、ステップ；およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記複数の細胞に導入するステップであって、前記ＡＡＶベクターが、前記切断において、前記複数の細胞のゲノム中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むことによって、遺伝子改変細胞の集団を産生する、ステップを含み；遺伝子改変細胞の前記集団中の細胞の少なくとも約１０％が前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を発現する、方法が開示される。
場合によって、本開示の方法は、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して内因性ＴＣＲ遺伝子中に切断を導入するステップをさらに含み得る。場合によって、少なくとも１個の細胞へのＡＡＶベクターの導入は、切断（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ遺伝子中の切断）を含む細胞へのＡＡＶベクターの導入を含む。
場合によって、本開示の方法または系は、電気穿孔および／またはヌクレオフェクションを含み得る。場合によって、本開示の方法または系は、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリペプチドをさらに含み得る。場合によって、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ＣＩＳＨ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子中に切断を導入しうる。場合によって、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ＣＩＳＨ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子の不活化または発現の低減を含み得る。場合によって、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系、亜鉛フィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥＮ）、およびＴＡＬリピートに対するメガヌクレアーゼ（ＭＥＧＡＴＡＬ）からなる群から選択される。場合によって、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。場合によって、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ系に由来する。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系は、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。場合によって、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９およびＣａｓ９ＨｉＦｉからなる群から選択される。場合によって、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドである。場合によって、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、触媒的に不活性である。場合によって、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）またはｄＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドである。
場合によって、本開示の方法は、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子中に切断を導入することによって細胞の集団中の少なくとも１個の細胞をｅｘ ｖｉｖｏで改変するステップを含み得る（またはさらに含み得る）。場合によって、改変は、ガイドポリ核酸を使用して改変することを含む。場合によって、改変は、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系は、ガイドポリ核酸を含む。場合によって、本開示の方法または系または集団は、ガイドポリ核酸をさらに含み得る。場合によって、前記ガイドポリ核酸は、前記ＣＩＳＨ遺伝子に対する相補配列を含む。場合によって、前記ガイドポリ核酸は、前記ＴＣＲ遺伝子に対する相補配列を含む。場合によって、前記ガイドポリ核酸は、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）である。場合によって、前記ガイドポリ核酸は、ガイドデオキシリボ核酸（ｇＤＮＡ）である。
場合によって、細胞生存率が測定される。場合によって、細胞生存率は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって測定される。場合によって、遺伝子改変細胞の集団または腫瘍浸潤リンパ球の集団は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって測定された場合、ＡＡＶベクターの導入後に少なくとも約９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の細胞生存率を含む。場合によって、細胞生存率は、ＡＡＶベクターの導入後、約４時間、６時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間、１３２時間、１４４時間、１５６時間、１６８時間、１８０時間、１９２時間、２０４時間、２１６時間、２２８時間、２４０時間で、または２４０時間よりも後に測定される。場合によって、細胞生存率は、ＡＡＶベクターの導入後、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、４５日、５０日、６０日、７０日、９０日で、または９０日よりも後に測定される。場合によって、遺伝子改変細胞の集団または腫瘍浸潤リンパ球の集団は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって測定された場合、ＡＡＶベクターの導入後約４日で、少なくとも約９２％の細胞生存率を含み得る。場合によって、遺伝子改変細胞の集団は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって測定された場合、組換えＡＡＶベクターの導入後約４日で、少なくとも約９２％の細胞生存率を含み得る。
場合によって、ＡＡＶベクターは、対応する非修飾または野生型ＡＡＶベクターと比較して細胞毒性を低減する。場合によって、細胞毒性が測定される。場合によって、毒性は、フローサイトメトリーによって測定される。場合によって、ＡＡＶベクターを使用する少なくとも１個の外因性トランス遺伝子の組込みは、ミニサークルまたは対応する非修飾もしくは野生型ＡＡＶベクターを使用する同等の細胞の集団中への前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子の組込みと比較して細胞毒性を低減する。場合によって、毒性は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低減する。場合によって、毒性は、前記ＡＡＶベクターまたは前記対応する非修飾もしくは野生型ＡＡＶベクターまたは前記ミニサークルベクターの導入後、約４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間、１３２時間、１４４時間、１５６時間、１６８時間、１８０時間、１９２時間、２０４時間、２１６時間、２２８時間、２４０時間で、または２４０時間よりも後に測定される。場合によって、毒性は、前記ＡＡＶベクターまたは前記対応する非修飾もしくは野生型ＡＡＶベクターまたは前記ミニサークルの導入後、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、４５日、５０日、６０日、７０日、９０日で、または９０日よりも後に測定される。
場合によって、遺伝子改変細胞の集団の少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または最大で１００％が、細胞のゲノムのＣＩＳＨ遺伝子中の切断において、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子の組込みを含む。場合によって、遺伝子改変細胞の集団の少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または最大で１００％が、細胞のゲノムのＴＣＲ遺伝子中の切断において、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子の組込みを含む。
場合によって、遺伝子改変細胞の集団および／または遺伝子改変された腫瘍浸潤リンパ球の集団を、本開示の方法に従って調製することができる。場合によって、細胞または細胞の集団または遺伝子改変細胞の集団は、腫瘍浸潤リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団であり得る。場合によって、細胞の集団または遺伝子改変細胞の集団は、それぞれ、初代細胞または初代細胞の集団である。場合によって、初代細胞または初代細胞の集団は、初代リンパ球または初代リンパ球の集団である。場合によって、初代細胞または初代細胞の集団は、ＴＩＬまたはＴＩＬの集団である。場合によって、ＴＩＬは自家細胞である。場合によって、ＴＩＬはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。場合によって、ＴＩＬはＢ細胞である。場合によって、ＴＩＬはＴ細胞である。
場合によって、ＡＡＶベクターは、細胞１つ当たり約１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、または最大で約９×１０９個のゲノムコピー／ウイルス粒子の感染多重度（ＭＯＩ）で導入される。場合によって、野生型ＡＡＶベクターは、細胞１つ当たり約１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、または最大で約９×１０９個のゲノムコピー／ウイルス粒子の感染多重度（ＭＯＩ）で導入される。場合によって、ＡＡＶベクターは、前記ＣＲＩＳＰＲまたは前記ヌクレアーゼもしくは前記ヌクレアーゼをコードするポリ核酸の導入後、１〜３時間、３〜６時間、６〜９時間、９〜１２時間、１２〜１５時間、１５〜１８時間、１８〜２１時間、２１〜２３時間、２３〜２６時間、２６〜２９時間、２９〜３１時間、３１〜３３時間、３３〜３５時間、３５〜３７時間、３７〜３９時間、３９〜４１時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１４日、１６日、２０日で、または２０日よりも後に前記細胞に導入される。場合によって、ＡＡＶベクターは、ＣＲＩＳＰＲ系またはヌクレアーゼもしくは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの導入の１５〜１８時間後に細胞に導入される。場合によって、ＡＡＶベクターは、ＣＲＩＳＰＲ系またはヌクレアーゼもしくは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの導入の１６時間後に細胞に導入される。
場合によって、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲをコードする外因性トランス遺伝子）は、ゲノム中にランダムに挿入される。場合によって、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子は、ゲノムのＣＩＳＨ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子中に挿入される。場合によって、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子は、ゲノムのＣＩＳＨ遺伝子中に挿入される。場合によって、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子は、ゲノムのＣＩＳＨ遺伝子中に挿入されない。場合によって、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子は、ゲノムのＣＩＳＨ遺伝子中の切断に挿入される。場合によって、トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲをコードする少なくとも１個のトランス遺伝子）は、ＴＣＲ遺伝子中に挿入される。場合によって、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子は、ＣＩＳＨ遺伝子へと、ランダムに、かつ／または部位特異的に挿入される。場合によって、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子は、ＣＩＳＨ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子中の切断と相補的な操作部位で挟まれる。場合によって、細胞の集団または遺伝子改変細胞の集団または遺伝子改変されたＴＩＬの集団中の細胞の少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含む。
場合によって、がんを処置する方法は、治療有効量の本開示の細胞の集団を投与するステップを含み得る。場合によって、治療有効量の細胞の集団は、それぞれ、対応する非修飾もしくは野生型ＡＡＶベクターまたはミニサークルからもたらされる同じ治療効果を提供するのに必要とされる細胞数と比較して、より少数の細胞を含み得る。
本発明の新規の特色は、付属の特許請求の範囲において詳細に明示される。本発明の原理が用いられる例示的な事例と、付属の図面とを明示する、以下の詳細な記載を参照することにより、本発明の特色および利点のよりよい理解が得られるであろう。
図１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（例えば全エクソームシーケンシング）を使用して、がん患者から得られた試料に由来するがん関連標的配列、例えば、ネオ抗原を同定し得る方法の例を示す。方法は、標的配列を認識する第１のＴ細胞に由来するＴＣＲトランス遺伝子をさらに同定することができる。がん関連標的配列およびＴＣＲトランス遺伝子は、同じ患者の試料から得ることもでき、または異なる患者の試料から得ることもできる。方法は、ＴＣＲトランス遺伝子を含む核酸を、第２のＴ細胞の膜を超えて、効果的かつ効率的に送達することができる。いくつかの場合には、第１および第２のＴ細胞は、同じ患者から得ることができる。他の場合には、第１および第２のＴ細胞は、異なる患者から得ることができる。他の場合には、第１および第２のＴ細胞は、異なる患者から得ることができる。方法は、非ウイルス性組込み系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベース、ＺＥＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ−ＴＡＬ）を使用して、ＴＣＲトランス遺伝子を安全かつ効率的にＴ細胞のゲノムへと組み込んで操作Ｔ細胞を生成することが可能であり、したがって、ＴＣＲトランス遺伝子は、操作Ｔ細胞内で、信頼できる形で発現され得る。操作Ｔ細胞は、免疫学的効力および抗腫瘍効力を維持する状態で増殖させ、拡大することができ、がんを処置するために患者にさらに投与することができる。
図２は、ＴＣＲトランス遺伝子の組込みおよびＴＣＲ発現のためのいくつかの例示的なトランスポゾン構築物を示す。
図３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｍＲＮＡの転写、および任意の細胞型（例えば、初代細胞、細胞株など）内で、相同組換え（ＨＲ）基質を作製するための鋳型としてのその使用を示す。ウイルスカセットの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写のために、ウイルスゲノムの５’ＬＴＲ領域の上流に、Ｔ７、Ｔ３、または他の転写開始配列を置くことができる。ウイルスベクターのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方をコードするｍＲＮＡを使用して、収率を改善することができる。
図４は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼプラスミド、ＨＰＲＴ ｇＲＮＡプラスミド、Ａｍａｘａ ＥＧＦＰｍａｘプラスミド、およびＨＰＲＴ標的ベクターを含む、４つのプラスミドの構造を示す。
図５は、０．５ｋｂのターゲティングアームを含む例示的なＨＰＲＴ標的ベクターを示す。
図６は、例示的な遺伝子（例えば、ＨＰＲＴ遺伝子）をターゲティングする、３つの潜在的なＴＣＲトランス遺伝子ノックインデザインを示す。（１）外因性プロモーター：外因性プロモーター（「プロモーター」）により転写されるＴＣＲトランス遺伝子（「ＴＣＲ」）；（２）ＳＡインフレーム転写：スプライシングを介して内因性プロモーター（矢印により示される）により転写されるＴＣＲトランス遺伝子；および（３）融合体インフレーム翻訳：インフレーム翻訳を介して内因性プロモーターにより転写されるＴＣＲトランス遺伝子。３つの例示的なデザイン全てが、遺伝子機能をノックアウトし得る。例えば、ＨＰＲＴ遺伝子またはＰＤ−１遺伝子を、ＴＣＲトランス遺伝子の挿入によりノックアウトする場合、６−チオグアニン（thiogaunine）選択を、選択アッセイとして使用することができる。
図７は、Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡ＋標的プラスミドの共トランスフェクションが、バルク集団内で、良好なトランスフェクション効率をもたらしたことを示す。
図８は、ＣＤ３＋ Ｔ細胞についての、ＥＧＦＰ ＦＡＣＳ解析の結果を示す。
図９は、Ｔ細胞受容体の２つの種類を示す。
図１０は、２つのプラットフォームを使用する、Ｔ細胞トランスフェクション効率の達成を示す。
図１１は、Ｔ細胞数をスケールアップした場合、例えば、Ｔ細胞数を増大させた場合の、効率的トランスフェクションを示す。
図１２は、潜在的な標的部位において、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡにより生じる遺伝子改変の％を示す。
図１３は、刺激Ｔ細胞内のＣＲＩＳＰＲ誘導性ＤＳＢを示す。
図１４は、ＲＮＡ送達の最適化を示す。
図１５は、標的部位における二本鎖切断を示す。遺伝子ターゲティングは、ターゲティングされるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入する前に、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で活性化させたＴ細胞内の、二本鎖切断の誘導に成功した。例示を目的として述べると、免疫チェックポイント遺伝子である、ＰＤ−１、ＣＣＲ５、およびＣＴＬＡ４を使用して、系を検証した。
図１６は、ＣＣＲ５におけるＴＣＲの組込みを表したものを示す。ＣＣＲ５に対する１ｋｂの組換えアームを含むプラスミドターゲティングベクターの例示的なデザインである。相同組換えを使用して他の目的の遺伝子をターゲティングするためには、３ｋｂのＴＣＲ発現トランス遺伝子を、異なる遺伝子に対する組換えアームを含む類似のベクターに挿入することができる。組換えアームの外側のプライマーを使用するＰＣＲによる解析により、遺伝子におけるＴＣＲの組込みの成功を示すことができる。
図１７は、刺激Ｔ細胞内のＣＣＲ５遺伝子におけるＴＣＲの組込みを示す。陽性ＰＣＲ結果は、トランスフェクションの７２時間後のＣＣＲ５遺伝子における相同組換えの成功を示す。
図１８は、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションに応答したＴ細胞の死を示す。
図１９は、Ｔ細胞を含むがこれらに限定されない、異なる細胞型内に存在する、細胞質ＤＮＡの生得的免疫センシング経路についての概略を示す。Ｔ細胞は、外来ＤＮＡを検出するために、両方の経路を発現する。細胞毒性は、ゲノム操作時における、これらの経路の活性化から生じ得る。
図２０は、図１９のインヒビターが、アポトーシスおよびピロトーシスを遮断することを示す。
図２１は、代表的なプラスミド修飾の概略を示す。標準的プラスミドは、生得的免疫センシング系を誘発し得る、細菌性メチル化を含有する。細菌性メチル化を除去することにより、標準的プラスミドにより引き起こされる毒性を低減することができる。また、ベクターが、「自己のＤＮＡ」と類似するように、細菌性メチル化を除去し、哺乳動物性メチル化を付加することもできる。修飾はまた、合成一本鎖ＤＮＡの使用も含み得る。
図２２は、代表的な機能的操作ＴＣＲ抗原受容体を示す。この操作ＴＣＲは、ＭＡＲＴ−１を発現する黒色腫細胞株に対して高度に反応性である。ＴＣＲαとβ鎖とは、フリン切断部位、およびこれに続く２Ａリボソームスキップペプチドにより連結されている。
図２３Ａおよび２３Ｂは、ガイドＲＮＡのトランスフェクション後６日目における、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−２、またはＣＣＲ５、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４の発現を示す。代表的ガイド：ＰＤ−１（Ｐ２、Ｐ６、Ｐ２／６）、ＣＴＬＡ−４（Ｃ２、Ｃ３、Ｃ２／３）、またはＣＣＲ５（ＣＣ２）である。Ａ．は、阻害性受容体の発現パーセントを示す。Ｂ．は、対照ガイドＲＮＡに照らして正規化した、阻害性受容体の発現を示す。
図２４Ａおよび２４Ｂは、非染色の、ガイドを伴わない対照と比較した、ＣＲＩＳＰＲ、ならびにＣＴＬＡ−４特異的ガイドＲＮＡである、ガイド＃２および＃３の電気穿孔の後における、初代ヒトＴ細胞内のＣＴＬＡ−４の発現を示す。Ｂ．は、非染色の、ガイドを伴わない対照と比較した、ＣＲＩＳＰＲ、ならびにＰＤ−１特異的ガイドＲＮＡである、ガイド＃２および＃６の電気穿孔の後における、初代ヒトＴ細胞内のＰＤ−１の発現を示す。
図２５は、ＣＲＩＳＰＲ、ならびにマルチプレックス化させたＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡおよびＰＤ−１ガイドＲＮＡの電気穿孔の後における、初代ヒトＴ細胞内のＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１の発現についてのＦＡＣＳ結果を示す。
図２６Ａおよび２６Ｂは、ＣＲＩＳＰＲによる処置後における、初代ヒトＴ細胞内の二重ノックアウトパーセントを示す。Ａ．は、ＣＴＬＡ−４ガイド＃２、＃３、＃２および＃３、ＰＤ−１ガイド＃２およびＣＴＬＡ−４ガイド＃２、ＰＤ−１ガイド＃６およびＣＴＬＡ−４ガイド＃３で処置したＴ細胞内の、ＣＴＬＡ−４ノックアウトパーセントであって、Ｚａｐのみ、Ｃａｓ９のみ、および全てのガイドＲＮＡ対照と比較したノックアウトパーセントを示す。Ｂ．は、ＰＤ−１ガイド＃２、ＰＤ−１ガイド＃６、ＰＤ−１ガイド＃２および＃６、ＰＤ−１ガイド＃２およびＣＴＬＡ−４ガイド＃２、ＰＤ−１ガイド＃６およびＣＴＬＡ−４ガイド＃３で処置したＴ細胞内の、ＰＤ−１ノックアウトパーセントであって、Ｚａｐのみ、Ｃａｓ９のみ、および全てのガイドＲＮＡ対照と比較したノックアウトパーセントを示す。
図２７は、ＣＲＩＳＰＲ、およびＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはこれらの組合せに特異的なガイドＲＮＡの電気穿孔後における、Ｔ細胞の生存率を示す。
図２８は、ＰＤ−１ガイドＲＮＡのみを導入する条件下、ＰＤ−１ガイドＲＮＡおよびＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡを導入する条件下、またはＣＣＲ５ガイドＲＮＡ、ＰＤ−１ガイドＲＮＡ、およびＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡを導入する条件下、Ｚａｐのみによる対照条件下、またはｇＲＮＡのみによる対照条件下における、ＰＤ−１ガイドＲＮＡ＃２、＃６、＃２および＃６による切断を示す、ＣＥＬ−Ｉアッセイの結果を示す。
図２９は、ＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡのみを導入する条件下、ＰＤ−１ガイドＲＮＡおよびＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡを導入する条件下、またはＣＣＲ５ガイドＲＮＡ、ＰＤ−１ガイドＲＮＡ、およびＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡを導入する条件下、Ｚａｐのみによる対照条件下、またはｇＲＮＡのみによる対照条件下における、ＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡ＃２、＃３、＃２および＃３による切断を示す、ＣＥＬ−Ｉアッセイの結果を示す。
図３０は、Ｚａｐのみによる対照条件下、Ｃａｓ９のみによる対照条件下、またはガイドＲＮＡのみによる対照条件下と比較した、ＣＣＲ５ガイドＲＮＡを導入する条件下、ＣＣＲ５ガイドＲＮＡ、ＰＤ−１ガイドＲＮＡ、またはＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡを導入する条件下における、ＣＣＲ５ガイドＲＮＡ＃２による切断を示す、ＣＥＬ−Ｉアッセイの結果を示す。
図３１は、２’Ｏ−メチルＲＮＡ修飾を伴う、最適化されたＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを、５マイクログラムおよび１０マイクログラムで用いる、初代ヒトＴ細胞内の、ＴＣＲアルファのノックアウトであって、ＦＡＣＳにおけるＣＤ３の発現により測定されるノックアウトを示す。
図３２は、ＣＲＩＳＰＲ、およびＣＴＬＡ−４へのガイドＲＮＡによる処置後における、Ｔ細胞の生存率および表現型を測定する方法を描写する。表現型は、正常ＦＳＣ／ＳＳＣプロファイルを呈する処置細胞の頻度であって、電気穿孔単独による対照の頻度に照らして正規化された頻度を定量化することにより測定した。生存率はまた、ＦＳＣ／ＳＳＣゲートをかけた集団内の細胞による、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅの除外によっても測定した。Ｔ細胞表現型は、ＣＤ３およびＣＤ６２Ｌにより測定する。
図３３は、ＣＲＩＳＰＲ、ならびにＰＤ−１へのガイドＲＮＡ、ならびにＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４へのガイドＲＮＡによる処置後における、Ｔ細胞の生存率および表現型を測定する方法を示す。表現型は、正常ＦＳＣ／ＳＳＣプロファイルを呈する処置細胞の頻度であって、電気穿孔単独による対照の頻度に照らして正規化された頻度を定量化することにより測定した。生存率はまた、ＦＳＣ／ＳＳＣゲートをかけた集団内の細胞による、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅの除外によっても測定した。Ｔ細胞表現型は、ＣＤ３およびＣＤ６２Ｌにより測定する。
図３４は、初代ヒトＴ細胞およびＪｕｒｋａｔ対照への、ＰＤ−１ガイドＲＮＡまたはＣＴＫＡ−４ガイドＲＮＡのトランスフェクション後４日目における、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を検出する、Ｔ７Ｅ１アッセイの結果を示す。ＮＮとは、Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼを伴わない対照である。
図３５は、ＴＩＤＥ（ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）解析の結果を示す。遺伝子編集効率パーセントを、ＰＤ−１ガイドＲＮＡおよびＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡについて示す。
図３６は、単一のガイドのトランスフェクションについての、ＴＩＤＥ（ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）解析の結果を示す。欠失または挿入を伴う配列のパーセントを、ＰＤ−１ガイドＲＮＡまたはＣＴＬＡ−１ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトした初代ヒトＴ細胞について示す。
図３７は、二重ターゲティングによるＰＤ−１配列の欠失を示す。
図３８は、二重ターゲティングによるＰＤ−１配列の欠失についての、ＰＣＲ産物のシーケンシング結果を示す。試料６および１４は、介在する１３５ｂｐを切り出した、２つのｇＲＮＡ配列の融合体により示される。
図３９は、二重ターゲティングによるＣＴＬＡ−４配列の欠失を示す。二重ガイドによりターゲティングされたＣＴＬＡ−４のシーケンシングにおいてもまた、２つのガイドＲＮＡ配列間の欠失が存在する（試料９および１４）。Ｔ７Ｅ１アッセイは、ＰＣＲによる欠失を確認する。
図４０Ａおよび４０Ｂは、Ａ．ＣＲＩＳＰＲのトランスフェクション後６日目における、ヒトＴ細胞の生存率；Ｂ．ヒトＴ細胞のトランスフェクション効率（ＧＦＰ陽性％）についてのＦＡＣＳ解析を示す。
図４１は、抗ＣＴＬＡ−４ ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをトランスフェクトした染色ヒトＴ細胞内のＣＴＬＡ−４発現についてのＦＡＣＳ解析を示す。ＰＥは、抗ヒトＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）である。
図４２Ａおよび４２Ｂは、抗ＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲのトランスフェクション後における、ＣＴＬＡ−４陽性ヒトＴ細胞についてのＣＴＬＡ−４ ＦＡＣＳ解析を示す。Ｂ．は、抗ＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲのトランスフェクション後における、ヒトＴ細胞内の、パルス対照と比べた、ＣＴＬＡ−４ノックアウト効率を示す。
図４３は、操作ＴＣＲを含有するミニサークルＤＮＡを示す。
図４４は、ＣＩＳＨ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、およびＡＡＶＳ１のための修飾ｓｇＲＮＡを描写する。
図４５は、ＣＲＩＳＰＲおよび抗ＰＤ−１ガイドＲＮＡのトランスフェクション後１４日目における、ＰＤ−１ ＫＯについてのＦＡＣＳ結果を描写する。ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５は、マウス抗ヒトＣＤ２７９（ＰＤ−１）である。
図４６Ａおよび４６Ｂは、Ａ．は、抗ＰＤ−１ ＣＲＩＳＰＲ系のトランスフェクション後における、ＰＤ−１の発現パーセントを示す。Ｂ．は、Ｃａｓ９のみによる対照と比較した、ＰＤ−１ノックアウト効率パーセントを示す。
図４７は、抗ＰＤ−１ガイド＃２、抗ＰＤ−１ガイド＃６、抗ＰＤ１ガイド＃２および＃６、または抗ＰＤ−１ガイド＃２および＃６および抗ＣＴＬＡ−４ガイド＃２および＃３と共に、ＣＲＩＳＰＲ系をトランスフェクトしたヒトＴ細胞の、ＦＳＣ／ＳＳＣサブセットについてのＦＡＣＳ解析を示す。
図４８は、ＣＲＩＳＰＲおよび抗ＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡのトランスフェクション後６日目における、ヒトＴ細胞についてのＦＡＣＳ解析を示す。ＰＥは、マウス抗ヒトＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）である。
図４９は、ＣＲＩＳＰＲならびに抗ＰＤ−１ガイドＲＮＡおよび抗ＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡのトランスフェクション後１日目における、ヒトＴ細胞および対照Ｊｕｒｋａｔ細胞についてのＦＡＣＳ解析を示す。ヒトＴ細胞の生存率およびトランスフェクション効率を、トランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞と比較して示す。
図５０は、ＣＲＩＳＰＲおよび抗ＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡをトランスフェクトした、ＣＴＬＡ−４染色ヒトＴ細胞についてのＦＡＣＳ解析による定量化データを描写する。トランスフェクション後６日目における、ＣＴＬＡ−４の発現パーセントおよびノックアウトパーセントについてのデータを示す。
図５１は、ＣＲＩＳＰＲおよび抗ＰＤ−１ガイドＲＮＡをトランスフェクトした、ＰＤ−１染色ヒトＴ細胞についてのＦＡＣＳ解析を示す。トランスフェクション後１４日目における、ＰＤ−１の発現（抗ヒトＣＤ２７９ ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）についてのデータを示す。
図５２は、ＣＲＩＳＰＲおよび抗ＰＤ−１ガイドＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＴ細胞についての、Ｃａｓ９のみによる対照と比較した、ＰＤ−１の発現パーセントおよびＰＤ−１のノックアウトパーセントを示す。
図５３は、ＣＲＩＳＰＲ、抗ＣＴＬＡ−４、および抗ＰＤ−１ガイドＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＴ細胞の、１４日目における細胞数および生存率を示す。
図５４は、ＣＲＩＳＰＲ、ならびに抗ＰＤ−１ガイド＃２単独、抗ＰＤ−１ガイド＃２および＃６、または抗ＣＴＬＡ−４ガイド＃３単独の電気穿孔後１４日目における、ヒトＴ細胞についてのＦＡＣＳデータを示す。操作Ｔ細胞を、４８時間にわたり再刺激して、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１の発現について評価し、ガイドＲＮＡを伴わずに電気穿孔した対照細胞と比較した。
図５５は、ＣＲＩＳＰＲ、ならびに抗ＣＴＬＡ−４ガイド＃２および＃３、抗ＰＤ−１ガイド＃２および抗ＣＴＬＡ−４ガイド＃３、または抗ＰＤ−１ガイド＃２および＃６、抗ＣＴＬＡ−４ガイド＃３および＃２の電気穿孔後１４日目における、ヒトＴ細胞についてのＦＡＣＳデータを示す。操作Ｔ細胞を、４８時間にわたり再刺激して、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１の発現について評価し、ガイドＲＮＡを伴わずに電気穿孔した対照細胞と比較した。
図５６は、初代ヒトＴ細胞内のＣＩＳＨ遺伝子座の、ＣＲＩＳＰＲを媒介する遺伝子改変についてのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果を描写する。
図５７Ａ、５７Ｂ、および５７Ｃ。Ａ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の概略を示す。Ｂ．キメラ抗原受容体の概略を示す。Ｃ．Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の概略を示す。
図５８は、体細胞の変異負荷が、腫瘍型間で変動することを示す。腫瘍特異的ネオ抗原の作製および提示は理論的に、変異負荷と正比例する。
図５９は、核酸に対して施し得る、シュードウリジン−５’−三リン酸修飾および５−メチルシチジン−５’−三リン酸修飾を示す。
図６０は、ＣＲＩＳＰＲおよびＣＩＳＨ ｇＲＮＡ１、３、４、５、または６をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞についての、ＴＩＤＥおよび密度測定のデータ比較を示す。
図６１は、ＣＲＩＳＰＲおよびＣＩＳＨ ｇＲＮＡ１、３、４、５、または６をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞についての、密度測定解析の二連の実験を描写する。
図６２Ａおよび６２Ｂは、ＣＩＳＨ ｇＲＮＡ １についての、二連のＴＩＤＥ解析Ａ．およびＢ．を示す。
図６３Ａおよび６３Ｂは、ＣＩＳＨ ｇＲＮＡ ３についての、二連のＴＩＤＥ解析Ａ．およびＢ．を示す。
図６４Ａおよび６４Ｂは、ＣＩＳＨ ｇＲＮＡ ４についての、二連のＴＩＤＥ解析Ａ．およびＢ．を示す。
図６５Ａおよび６５Ｂは、ＣＩＳＨ ｇＲＮＡ ５についての、二連のＴＩＤＥ解析Ａ．およびＢ．を示す。
図６６Ａおよび６６Ｂは、ＣＩＳＨ ｇＲＮＡ ６についての、二連のＴＩＤＥ解析Ａ．およびＢ．を示す。
図６７は、初代Ｔ細胞内のＣＲＩＳＰＲノックアウト後における、ＣＩＳＨタンパク質の喪失を示すウェスタンブロットを示す。
図６８Ａ、６８Ｂ、および６８Ｃは、細胞数によるＤＮＡ生存率であって、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡのトランスフェクションのＡ．１日後、Ｂ．２日後、Ｃ．３日後におけるＤＮＡ生存率を描写する。Ｍ１３のｓｓ／ｄｓＤＮＡは、７．２５ｋｂである。ｐＵＣ５７は、２．７ｋｂである。ＧＦＰプラスミドは、６．０４ｋｂである。
図６９は、操作細胞の調製時または調製後においてモジュレートされ得る機構経路を示す。
図７０Ａおよび７０Ｂは、Ａ．３日目およびＢ．７日目の、ＣＲＩＳＰＲ系（１５ｕｇのＣａｓ９、１０ｕｇのｇＲＮＡ）のトランスフェクション後における細胞数を示す。試料１：非処置である。試料２：パルスのみである。試料３：ＧＦＰ ｍＲＮＡである。試料４：パルスのみを施したＣａｓ９である。試料５：パルスのみを施した、５マイクログラムのミニサークルドナーである。試料６：パルスのみを施した、２０マイクログラムのミニサークルドナーである。試料７：プラスミドドナー（５マイクログラム）である。試料８：プラスミドドナー（２０マイクログラム）である。試料９：＋ガイドＰＤ１−２／＋Ｃａｓ９／−ドナーである。試料１０：＋ガイドＰＤ１−６／＋Ｃａｓ９／−ドナーである。試料１１：＋ガイドＣＴＬＡ４−２／＋Ｃａｓ９／−ドナーである。試料１２：＋ガイドＣＴＬＡ４−３／＋Ｃａｓ９／−ドナーである。試料１３：ＰＤ１−２／５ｕｇのドナーである。試料１４：ＰＤ１（二重）／５ｕｇのドナーである。試料１５：ＣＴＬＡ４−３／５ｕｇのドナーである。試料１６：ＣＴＬＡ４（二重）／５ｕｇのドナーである。試料１７：ＰＤ１−２／２０ｕｇのドナーである。試料１８：ＰＤ１（二重）／２０ｕｇのドナーである。試料１９：ＣＴＬＡ４−３／２０ｕｇのドナーである。試料２０：ＣＴＬＡ４（二重）／２０ｕｇのドナーである。
図７１Ａおよび７１Ｂは、４日目における、ドナー核酸を伴わないＰＤ−１の、Ａ．ｇＲＮＡ ２、およびＢ．ｇＲＮＡ６についてのＴＩＤＥ解析を示す。
図７２Ａおよび７２Ｂは、４日目における、ドナー核酸を伴わない、ＣＴＬＡ４の、Ａ．ｇＲＮＡ ２、およびＢ．ｇＲＮＡ３についてのＴＩＤＥ解析を示す。
図７３は、対照細胞内、５マイクログラムのドナーＤＮＡ（ミニサークル）を電気穿孔した細胞内、または２０マイクログラムのドナーＤＮＡ（ミニサークル）を電気穿孔した細胞内の、７日目におけるＴＣＲベータの検出についてのＦＡＣＳ解析を示す。
図７４は、ＣＲＩＳＰＲ系、およびポリ核酸ドナーなし（対照）、５マイクログラムのポリ核酸ドナー（ミニサークル）、または２０マイクログラムのポリ核酸ドナー（ミニサークル）のいずれかを電気穿孔した、７日目におけるＴ細胞の概要を示す。ＴＣＲ陽性細胞のＦＡＣＳ解析の概要を示す。
図７５は、順方向におけるＰＤ１ ｇＲＮＡ＃２切断部位へのＴＣＲミニサークルの組込みを示す。
図７６Ａおよび７６Ｂは、増大させる二本鎖ポリ核酸ドナー濃度で、ＣＲＩＳＰＲ、および５’修飾または３’修飾（またはこれらの両方）を伴う、ＰＤ−１ ｇＲＮＡまたはＣＩＳＨ ｇＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＴ細胞についてのＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ投与試験を使用する、４日目における生細胞の百分率を示す。Ｂ．は、ＣＲＩＳＰＲ、およびＰＤ−１特異的ｇＲＮＡまたはＣＩＳＨ特異的ｇＲＮＡをトランスフェクトしたヒトＴ細胞の、ＰＤ−１遺伝子座またはＣＩＳＨ遺伝子座における組込み効率を示す。
図７７は、ＰＤ−１遺伝子部位またはＣＩＳＨ遺伝子部位における、ｄｓＤＮＡの組込みについての、ＧｏＴａｑおよびＰｈｕｓｉｏｎＦｌｅｘ解析を示す。
図７８は、ＣＲＩＳＰＲ、および外因性ＴＣＲをコードする５マイクログラムまたは２０マイクログラムのミニサークルＤＮＡをトランスフェクトしたヒトＴ細胞の１５日目のＦＡＣＳ解析を示す。
図７９は、ＣＲＩＳＰＲ系、およびポリ核酸ドナーなし（対照）、５マイクログラムのポリ核酸ドナー（ミニサークル）、または２０マイクログラムのポリ核酸ドナー（ミニサークル）のいずれかを電気穿孔した、１５日目におけるＴ細胞の概要を示す。ＴＣＲ陽性細胞のＦＡＣＳ解析の概要を示す。
図８０は、ＣＲＩＳＰＲ、およびｍＴＣＲｂ鎖をコードするミニサークルのトランスフェクション後４日目における、デジタルＰＣＲコピー数データによる、ＲＮａｓｅＰと比べたコピー数を示す。ｍＴＣＲｂ鎖をコードするプラスミドドナーを、対照として使用した。
図８１Ａおよび８１Ｂは、Ａ．外因性ＴＣＲをコードするミニサークルの用量の増加に伴う３日目のＴ細胞の生存率；Ｂ．外因性ＴＣＲをコードするミニサークルの用量の増加に伴う７日目のＴ細胞の生存率を示す。
図８２Ａおよび８２Ｂは、Ａ．Ｌｏｎｚａヌクレオフェクションによる、Ｔ細胞への二本鎖ＤＮＡのトランスフェクションのための最適化条件（細胞数を、ＧＦＰをコードするプラスミドの濃度と対比する）；Ｂ．Ｔ細胞への、ＧＦＰタンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡの、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクションのための最適化条件を示す（遺伝子導入パーセントを、トランスフェクションのために使用されるＧＦＰプラスミドの濃度と対比して示す）。
図８３Ａおよび８３Ｂ。Ａ．ＡＡＶ ＴＣＲ送達のための、ｐＤＧ６−ＡＡＶヘルパーフリーパッケージングプラスミドを示す。Ｂ．ウイルス産生のための、２９３細胞のＡＡＶ一過性トランスフェクションのプロトコールの概略を示す。ウイルスは、初代ヒトＴ細胞への遺伝子導入のために精製および保存される。
図８４は、内因性免疫チェックポイント（ＣＴＬＡ４およびＰＤ１を例示的な例として示す）に対する９００ｂｐの相同性アームで挟んだ、外因性ＴＣＲをコードするｒＡＡＶドナーを示す。
図８５は、ＡＡＶＳ１遺伝子に対する相同性アームで挟んだ外因性ＴＣＲをコードするｒＡＡＶ相同組換えドナーの、ゲノム組込みの概略を示す。
図８６Ａ、８６Ｂ、８６Ｃ、および８６Ｄは、ＡＡＶＳ１系を使用して生じ得る、可能な組換えイベントを示す。Ａ．は、トランス遺伝子の組込みによる、ＡＡＶＳ１における、二本鎖切断の、相同性により導かれる修復を示す。Ｂ．は、ＡＡＶＳ１遺伝子の一方の鎖と、ＡＡＶＳ１の相補鎖の非相同末端結合性インデルとによる、相同性により導かれる修復を示す。Ｃ．は、トランス遺伝子の、ＡＡＶＳ１遺伝子部位への、非相同末端結合性挿入と、ＡＡＶＳ１における非相同末端結合性インデルとを示す。Ｄ．は、両方のＡＡＶＳ１位置における非相同インデルであって、トランス遺伝子の、ゲノム部位への、ランダム組込みを伴う非相同インデルを示す。
図８７は、外因性ＴＣＲをコードするトランス遺伝子を免疫チェックポイント遺伝子に導入する、ＣＲＩＳＰＲおよびｒＡＡＶの組合せターゲティングアプローチを示す。
図８８Ａおよび８８Ｂは、３日目のデータを示す。Ａ．外因性ＴＣＲをコードする７．５マイクログラムのミニサークルドナーの電気穿孔時に、カスパーゼおよびＴＢＫインヒビターを使用したＣＲＩＳＰＲ電気穿孔実験を示す。生存率を、使用されるインヒビターの濃度と比較してプロットする。Ｂ．電気穿孔の効率を示す。陽性ＴＣＲパーセントを、使用されるインヒビターの濃度と対比して示す。
図８９は、ＣＲＩＳＰＲ、および外因性ＴＣＲをコードするミニサークルＤＮＡ（７．５マイクログラム）を電気穿孔したヒトＴ細胞のＦＡＣＳデータを示す。カスパーゼおよびＴＢＫインヒビターを、電気穿孔時に添加した。
図９０Ａおよび９０Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ、および外因性ＴＣＲをコードするミニサークルＤＮＡ（２０マイクログラム）を電気穿孔したヒトＴ細胞のＦＡＣＳデータを示す。Ａ．ＴＣＲ陽性細胞を、使用される免疫チェックポイント特異的ガイドと対比して示す、電気穿孔効率を示す。Ｂ．ＴＣＲ陽性細胞を、使用される免疫チェックポイント特異的ガイドと対比して示す、電気穿孔効率のＦＡＣＳデータを示す。
図９１は、ＣＲＩＳＰＲ、およびミニサークルの様々な濃度での、外因性ＴＣＲをコードするミニサークルの電気穿孔後１３日目のＴＣＲ発現を示す。
図９２Ａおよび９２Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ、および外因性ＴＣＲをコードするミニサークルＤＮＡのトランスフェクション前に、ヒトＴ細胞をブレフェルジンＡおよびＡＴＭインヒビターで前処理した、細胞死インヒビター研究を示す。Ａ．電気穿孔後３日目におけるＴ細胞の生存率を示す。Ｂ．電気穿孔後７日目におけるＴ細胞の生存率を示す。
図９３Ａおよび９３Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ、および外因性ＴＣＲをコードするミニサークルＤＮＡのトランスフェクション前に、ヒトＴ細胞をブレフェルジンＡおよびＡＴＭインヒビターで前処理した、細胞死インヒビター研究を示す。Ａ．電気穿孔後３日目における、Ｔ細胞におけるＴＣＲ発現を示す。Ｂ．電気穿孔後７日目における、Ｔ細胞におけるＴＣＲ発現を示す。
図９４は、外因性トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ）の組込みを迅速に検出する、スプライスアクセプターＧＦＰレポーターアッセイを示す。
図９５は、外因性トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ）の組込みを迅速に検出する、遺伝子座特異的デジタルＰＣＲアッセイを示す。
図９６は、ＰＧＫプロモーターまたはスプライスアクセプターのいずれかを使用する、外因性ＴＣＲをコードする組換え（ｒＡＡＶ）ドナー構築物を示す。各構築物を、ＡＡＶＳ１チェックポイント遺伝子に対する８５０塩基対の相同性アーム（ＨＡ）で挟む。
図９７は、ｒＡＡＶ ＡＡＶＳ１−ＴＣＲ遺伝子ターゲティングベクターを示す。トランスジェニックＴＣＲ発現カセットを、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のイントロン領域内のＡＡＶＳ１「セーフハーバー」遺伝子座に挿入するのに使用される、ｒＡＡＶターゲティングベクターの概略的描示である。主要な特色を、それらのヌクレオチド数サイズ（ｂｐ）と共に示す。ＩＴＲ：内部タンデムリピート；ＰＧＫ：ホスホグリセリン酸キナーゼ；ｍＴＣＲ：マウスＴ細胞受容体ベータ；ＳＶ４０ポリＡ：サルウイルス４０ポリアデニル化シグナル。
図９８は、修飾ｇＲＮＡによる刺激の４８時間後において、ＧＦＰ＋トランス遺伝子を電気穿孔したＴ細胞を示す。ｇＲＮＡは、シュードウリジン、５’ｍｏＣ、５’ｍｅＣ、５’ｍｏＵ、５’ｈｍＣ＋５’ｍｏＵ、ｍ６Ａ、または５’ｍｏＣ＋５’ｍｅＣで修飾した。
図９９Ａおよび９９Ｂは、修飾ｇＲＮＡによる刺激の４８時間後において、ＧＦＰ＋トランス遺伝子を電気穿孔したＴ細胞について、ＧＦＰ発現細胞のＡ．生存率、およびＢ．ＭＦＩを描写する。ｇＲＮＡは、シュードウリジン、５’ｍｏＣ、５’ｍｅＣ、５’ｍｏＵ、５’ｈｍＣ＋５’ｍｏＵ、ｍ６Ａ、または５’ｍｏＣ＋５’ｍｅＣで修飾した。
図１００Ａおよび１００Ｂは、Ａ．修飾キャップ除去型Ｃａｓ９タンパク質、またはＢ．非修飾Ｃａｓ９タンパク質の比較についてのＴＩＤＥ結果を示す。ゲノムの組込みは、Ｃａｓ９ １５マイクログラムおよび化学修飾ｇＲＮＡ １０マイクログラムで、非修飾Ｃａｓ９またはキャップ除去型Ｃａｓ９を電気穿孔した、Ｔ細胞のＣＣＲ５遺伝子座において測定した。
図１０１Ａおよび１０１Ｂは、逆転写酵素（ＲＴ）レポーターＲＮＡを発現するＪｕｒｋａｔ細胞であって、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＲＴをコードするプラスミドおよびプライマー（濃度についての表を参照されたい）をトランスフェクトされ、トランスフェクション後３日目において、細胞の生存率およびＧＦＰの発現についてアッセイされる、Ｊｕｒｋａｔ細胞についてのＡ．生存率、およびＢ．逆転写酵素活性を示す。ＧＦＰ陽性細胞は、ＲＴ活性を伴う細胞を表す。
図１０２Ａおよび１０２Ｂは、ヒトＴＩＬの刺激前および刺激後における絶対細胞数を示す。Ａ．は、刺激前および刺激後における、ＲＰＭＩ培地中またはｅｘ ｖｉｖｏ培地中で培養された、第１のドナーの細胞数を示す。Ｂ．は、刺激前および刺激後における、ＲＰＭＩ培地中で培養された、第２のドナーの細胞数を示す。
図１０３Ａおよび１０３Ｂは、Ａ．自家フィーダーの添加を伴うか、またはＢ．自家フィーダーの添加を伴わない、ＰＤ−１遺伝子座をターゲティングするＣＲＩＳＰＲ系を電気穿孔したヒト腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または対照細胞の細胞拡大を示す。
図１０４Ａおよび１０４Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ系単独（対照）；ＧＦＰプラスミド（ドナー）単独（対照）；ドナーおよびＣＲＩＳＰＲ系；ドナー、ＣＲＩＳＰＲ、およびｃＦＬＰタンパク質；ドナー、ＣＲＩＳＰＲ、およびｈＡｄ５ Ｅ１Ａ（Ｅ１Ａ）タンパク質；またはドナー、ＣＲＩＳＰＲ、およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質を電気穿孔したヒトＴ細胞を示す。ＧＦＰについてのＦＡＣＳ解析は、電気穿孔の、Ａ．４８時間後、またはＢ．８日間後において測定した。
図１０５は、血清を用いてトランスフェクション後４日目における、ＣＲＩＳＰＲ系を使用してスプライスアクセプターＧＦＰをコードするトランス遺伝子を含有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターをトランスフェクトしたＴ細胞のフローサイトメトリー解析を示す。示された条件は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ、ＧＦＰ ｍＲＮＡ、Ｖｉｒａｐｕｒ低力価ウイルス、Ｖｉｒａｐｕｒ低力価ウイルスおよびＣＲＩＳＰＲ、ＳＡ−ＧＦＰ ｐＡＡＶプラスミド、ＳＡ−ＧＦＰ ｐＡＡＶプラスミドおよびＣＲＩＳＰＲ、ＡＡＶａｎａｎｃｅｄウイルス、またはＡＡＶａｎｃｅｄウイルスおよびＣＲＩＳＰＲである。
図１０６は、血清なしでトランスフェクション後４日目における、ＣＲＩＳＰＲ系を使用してスプライスアクセプターＧＦＰをコードするトランス遺伝子を含有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターをトランスフェクトしたＴ細胞のフローサイトメトリー解析を示す。示された条件は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ、ＧＦＰ ｍＲＮＡ、Ｖｉｒａｐｕｒ低力価ウイルス、Ｖｉｒａｐｕｒ低力価ウイルスおよびＣＲＩＳＰＲ、ＳＡ−ＧＦＰ ｐＡＡＶプラスミド、ＳＡ−ＧＦＰ ｐＡＡＶプラスミドおよびＣＲＩＳＰＲ、ＡＡＶａｎａｎｃｅｄウイルス、またはＡＡＶａｎｃｅｄウイルスおよびＣＲＩＳＰＲである。
図１０７Ａおよび図１０７Ｂは、Ａ．血清を用いてトランスフェクション後７日目における、ＣＲＩＳＰＲ系を使用してスプライスアクセプターＧＦＰをコードするトランス遺伝子を含有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターをトランスフェクトしたＴ細胞のフローサイトメトリー解析を示す。示された条件は、ＳＡ−ＧＦＰ ｐＡＡＶプラスミドならびにＳＡ−ＧＦＰ ｐＡＡＶプラスミドおよびＣＲＩＳＰＲである。Ｂ．血清を用いてまたは血清なしでトランスフェクション後７日目における、ＣＲＩＳＰＲ系を使用してスプライスアクセプターＧＦＰをコードするトランス遺伝子を含有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターをトランスフェクトしたＴ細胞のフローサイトメトリー解析を示す。示された条件は、ＡＡＶａｎｃｅｄウイルスのみまたはＡＡＶａｎｃｅｄウイルスおよびＣＲＩＳＰＲである。
図１０８は、トランスフェクション（＋）時点、血清除去およびトランスフェクション後４時間、または血清除去およびトランスフェクション後１６時間における、ＳＡ−ＧＦＰ ｐＡＡＶプラスミドまたはＳＡ−ＧＦＰ ｐＡＡＶプラスミドおよびＣＲＩＳＰＲのトランスフェクション後の細胞生存率を示す。
図１０９は、血清条件下３〜４日、血清除去４時間、または血清除去１６時間における、スプライスアクセプター−ＧＦＰ（ＳＡ−ＧＦＰ）ｐＡＡＶプラスミドのノックインの読み出しを示す。対照（非トランスフェクト）細胞を、ＳＡ−ＧＦＰ ｐＡＡＶプラスミドのみ、またはＳＡ−ＧＦＰ ｐＡＡＶプラスミドおよびＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトした細胞と比較する。
図１１０は、１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、または１×１０６ＭＯＩの濃度でトランスフェクション後３日目における、ＳＡ−ＧＦＰトランス遺伝子をコードするｒＡＡＶまたはｒＡＡＶおよびＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。
図１１１は、１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、または１×１０６ＭＯＩの濃度でトランスフェクション後７日目における、ＳＡ−ＧＦＰトランス遺伝子をコードするｒＡＡＶまたはｒＡＡＶおよびＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。
図１１２は、１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、または１×１０６ＭＯＩの濃度でトランスフェクション後３日目における、ＴＣＲトランス遺伝子をコードするｒＡＡＶまたはｒＡＡＶおよびＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。
図１１３は、１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、または１×１０６ＭＯＩの濃度でトランスフェクション後７日目における、ＴＣＲトランス遺伝子をコードするｒＡＡＶまたはｒＡＡＶおよびＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。
図１１４Ａおよび図１１４Ｂは、４時間、６時間、８時間、１２時間、１８時間、および２４時間の時点の、Ａ．Ｃａｓ９およびｇＲＮＡのみ、またはＢ．ｒＡＡＶ、ＣＲＩＳＰＲ、およびＳＡ−ＧＦＰトランス遺伝子をトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。
図１１５Ａおよび図１１５Ｂは、Ａ．刺激後４日目における時間の関数としてのｒＡＡＶ遺伝子導入（％ＧＦＰ＋）を示す。Ｂ．は、刺激後４日目における、４時間、６時間、８時間、１２時間、１８時間、および２４時間の時点の、ｒＡＡＶのトランスフェクトまたは非トランスフェクト細胞の生細胞数を示す。
図１１６は、１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、１×１０６ＭＯＩ、３×１０６ＭＯＩ、または５×１０６ＭＯＩの濃度でトランスフェクション後４日目における、ＳＡ−ＧＦＰトランス遺伝子をコードするｒＡＡＶまたはｒＡＡＶおよびＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。
図１１７Ａおよび図１１７Ｂは、Ａ．種々の感染多重度（mulitiplicitiy of infection）（ＭＯＩ）レベル、１〜５×１０６で刺激後４日目における、ＳＡ−ＧＦＰトランス遺伝子をコードするＡＡＶベクターをトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋ｖｅ）発現を示す。Ｂ．０〜５×１０６のＭＯＩレベルでＳＡ−ＧＦＰトランス遺伝子をコードするＡＡＶをトランスフェクトした、またはトランスフェクトしていないヒトＴ細胞の刺激後４日目における生細胞数を示す。
図１１８は、刺激後４日目における、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶおよびＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。細胞は、１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、１×１０６ＭＯＩ、３×１０６ＭＯＩ、または５×１０６ＭＯＩのＭＯＩレベルでトランスフェクトした。
図１１９は、種々の感染多重度（ＭＯＩ）レベル、１〜５×１０６で刺激後４日目における、ＴＣＲトランス遺伝子をコードするＡＡＶベクターをトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＴＣＲ陽性（ＴＣＲ＋ｖｅ）発現を示す。
図１２０Ａおよび１２０Ｂは、以下を示す。Ａ．ＳＡ−ＧＦＰトランス遺伝子をコードするＡＡＶ、ＴＣＲトランス遺伝子をコードするＡＡＶ、ＣＩＳＨをターゲティングするＣＲＩＳＰＲおよびＴＣＲトランス遺伝子、またはＣＴＬＡ−４をターゲティングするＣＲＩＳＰＲおよびＴＣＲトランス遺伝子をウイルスでトランスフェクトしたヒトＴ細胞の発現効率パーセントを示す。Ｂ．ｒＡＡＶ、またはｒＡＡＶおよび、ＣＩＳＨまたはＣＴＬＡ−４遺伝子をターゲティングするＣＲＩＳＰ ｇＲＮＡをトランスフェクトした細胞の、刺激後４日目におけるＴＣＲ発現を示すＦＡＣＳプロットである。
図１２１Ａおよび１２１Ｂは、刺激後４日目のヒトＴ細胞におけるＴＣＲ発現のＦＡＣＳプロットを示す。Ａ．は、対照非トランスフェクト細胞を示す図であり、Ｂ．は、ＡＡＳ１ｐＡＡＶプラスミドのみ、ＣＩＳＨをターゲティングするＣＲＩＳＰＲおよびｐＡＡＶ、ＣＴＬＡ−４をターゲティングするＣＲＩＳＰＲおよびｐＡＡＶ、ＮＨＥＪミニサークルベクター、ＡＡＶＳ１ｐＡＡＶおよびＣＲＩＳＰＲ、ＣＩＳＨをターゲティングするＣＲＩＳＩＲおよびｐＡＡＶ−ＣＩＳＨプラスミド、ＣＴＬＡ−４ｐＡＡＶプラスミドおよびＣＲＩＳＰＲ、またはＮＨＥＪミニサークルおよびＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトした細胞を示す。
図１２２Ａおよび１２２Ｂは、以下を示す。Ａ．１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、１×１０６ＭＯＩのＭＯＩでトランスフェクション後３日目またはトランスフェクション前（対照）における、ＳＡ−ＧＦＰをコードするｒＡＡＶをトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）発現パーセントを示す。Ｂ．１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、１×１０６のＭＯＩでトランスフェクション後３日目またはトランスフェクション前（対照）の、ＴＣＲトランス遺伝子をコードするｒＡＡＶをトランスフェクトしたヒトＴ細胞におけるＴＣＲ陽性発現を示す。
図１２３Ａおよび１２３Ｂは、Ａ．ＴＣＲをコードするｒＡＡＶウイルスをトランスフェクション後４〜１９日目の、ヒトＴ細胞における外因性ＴＣＲの発現を示す図；Ｂ．ＳＡ−ＧＦＰをコードするｒＡＡＶウイルスをトランスフェクション後２〜１９日目の、ヒトＴ細胞におけるＳＡ−ＧＦＰの発現を示す。
図１２４は、トランスフェクション後１４日目における、各ｒＡＡＶがＳＡ−ＧＦＰトランス遺伝子をコードする、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ＋ＣＲＩＳＰＲを１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、または１×１０６のＭＯＩでトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳプロットを示す。
図１２５は、トランスフェクション後１４日目における、各ｒＡＡＶがＴＣＲトランス遺伝子をコードする、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ＋ＣＲＩＳＰＲを１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、または１×１０６のＭＯＩでトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳプロットを示す。
図１２６は、トランスフェクション後１９日目における、各ｒＡＡＶがＳＡ−ＧＦＰトランス遺伝子をコードする、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ＋ＣＲＩＳＰＲを１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、または１×１０６のＭＯＩでトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳプロットを示す。
図１２７は、トランスフェクション後１９日目における、各ｒＡＡＶがＴＣＲトランス遺伝子をコードする、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ＋ＣＲＩＳＰＲを１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、または１×１０６のＭＯＩでトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳプロットを示す。
図１２８は、トランスフェクション後３もしくは４日目、７、１４または１９日目における、ＳＡ−ＧＦＰまたはＴＣＲをコードするＡＡＶをトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳプロットを示す。Ｘ軸は、トランス遺伝子発現を示す。
図１２９Ａおよび１２９Ｂは、以下を示す。Ａ．刺激後３〜１４日目の、ＴＣＲをコードするｒＡＡＶを１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、１×１０６ＭＯＩ、３×１０６ＭＯＩ、または５×１０６のＭＯＩでトランスフェクトしたヒトＴ細胞におけるＴＣＲ発現を示す。Ｂ．ＴＣＲをコードするｒＡＡＶを、ＣＲＩＳＰＲありでおよびＣＲＩＳＰＲなしで１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、１×１０６ＭＯＩ、３×１０６ＭＯＩ、または５×１０６のＭＯＩでトランスフェクトした細胞の、刺激後１４日目の生細胞数を示す。
図１３０は、刺激後１４日目における、１×１０５ＭＯＩ、３×１０５ＭＯＩ、１×１０６ＭＯＩ、３×１０６ＭＯＩ、または５×１０６のＭＯＩでｒＡＡＶのみまたはｒＡＡＶおよびＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトした細胞のＴＣＲ発現を示す。
図１３１は、４日目〜１４日目における、ｒＡＡＶのみ、またはＣＩＳＨ遺伝子をターゲティングし、ＴＣＲをコードするｒＡＡＶおよびＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトした細胞のＴＣＲ発現を示す。
図１３２は、４日目〜１４日目における、ｒＡＡＶのみ、またはＣＴＬＡ−４遺伝子をターゲティングし、ＴＣＲをコードするｒＡＡＶおよびＣＲＩＳＰＲをトランスフェクトした細胞のＴＣＲ発現を示す。
図１３３Ａおよび１３３Ｂは、ＳＡ−ＧＦＰをコードするトランス遺伝子をトランスフェクトしたヒトＴ細胞の、刺激後３日目におけるＧＦＰ ＦＡＣＳデータを示す。Ａ．非トランスフェクト対照またはＧＦＰ ｍＲＮＡトランスフェクト対照細胞を示す。Ｂ．ウイルスタンパク質なし、Ｅ４ｏｒｆ６のみ、Ｅ１ｂ５５ｋ Ｈ３７３Ａ、またはＥ４ｏｒｆ６＋Ｅ１ｂ５５Ｋ Ｈ３７３Ａを有する、ｒＡＡＶをパルスした細胞、またはｒＡＡＶおよびＣＲＩＳＰＲトランスフェクト細胞を示す。
図１３４は、ウイルスタンパク質を利用しない、またはＥ４ｏｒｆ６およびＥ１ｂ５５ｋ Ｈ３７３Ａを利用して、パルスしたｒＡＡＶまたはｒＡＡＶおよびＣＲＩＳＰＲで刺激後３日目における、ＴＣＲをコードするｒＡＡＶをトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。ＡＡＶＳ１遺伝子を、ＴＣＲの組込みに利用した。
図１３５Ａおよび１３５Ｂは、ウイルスタンパク質を利用しない、またはＥ４ｏｒｆ６およびＥ１ｂ５５ｋ Ｈ３７３Ａを利用して、パルスしたｒＡＡＶ、またはｒＡＡＶおよびＣＲＩＳＰＲで刺激後３日目における、ＴＣＲをコードするｒＡＡＶをトランスフェクトしたヒトＴ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。ＣＴＬＡ４遺伝子を、ＴＣＲの組込みに利用した。Ｂは、非トランスフェクト対照およびミニサークルのみ対照のＦＡＣＳデータを示す。
図１３６Ａおよび１３６Ｂは、刺激後３日目における、ＴＣＲをコードするｒＡＡＶをトランスフェクトしたヒトＴ細胞の発現データを示す。Ａ．対照細胞（ＮＴ）と比較した、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＡＡＶＳ１、またはＣＩＳＨのゲノム修飾を有するＴ細胞における、ＴＣＲ発現のフローサイトメトリーデータの概要を示す。Ｂ．対照細胞（ＮＴ）と比較した、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＡＡＶＳ１、またはＣＩＳＨのゲノム修飾を有するＴ細胞のＴＣＲ発現のフローデータを示す。
図１３７Ａおよび１３７Ｂは、刺激後３日目および７日目における、ＴＣＲをコードするｒＡＡＶをトランスフェクトしたヒトＴ細胞の発現データを示す。Ａ．３および７日目の、対照細胞（ＮＴ）と比較した、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＡＡＶＳ１、またはＣＩＳＨのゲノム修飾を有するＴ細胞における、ＴＣＲ発現のフローサイトメトリーデータの概要を示す図である。Ｂ．刺激後７日目の、対照細胞（ＮＴ）と比較した、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＡＡＶＳ１、またはＣＩＳＨのゲノム修飾を有するＴ細胞のＴＣＲ発現のフローデータを示す。
図１３８は、ｒＡＡＶドナーデザインの概略を示す。
図１３９は、ｒＡＡＶを遺伝子導入後１４日目のＴＣＲ発現を示す。細胞は、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４をノックダウンするためにＣＲＩＳＰＲも用いて修飾する。データは、非遺伝子導入（ＮＴ）細胞と比較した操作細胞を示す。
図１４０は、ｒＡＡＶによるＴＣＲノックイン後のＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４発現を示す。トランスフェクション後１７日目のＦＡＣＳデータを示す。
図１４１Ａは、複数のＰＢＭＣドナーについての、ＣＲＩＳＰＲおよびｒＡＡＶ操作細胞のＴＣＲ発現パーセントを示す。図１４１Ｂは、ドナー９１、９２、および９３の一塩基多型（ＳＮＰ）データを示す。
図１４２は、複数のドナーについての、ＰＤ−１、ＡＡＶＳ１、ＣＩＳＨ、およびＣＴＬＡ−４におけるＳＮＰ頻度を示す。
図１４３は、ＴＣＲを発現し、ＣＩＳＨノックアウトを有するように操作された細胞のｍＴＯＲアッセイからのデータを示す。データ概要は、電気穿孔後３、７、および１４日目のものである。
図１４４は、ＣＲＩＳＰＲおよびｒＡＡＶを使用して外因性ＴＣＲを発現し、ＣＩＳＨノックアウトを有するように操作されたＴ細胞についての、参照対照と比較したＣＩＳＨのコピー数を示す。
図１４５Ａは、ＣＩＳＨ ＫＯ後３、７、１４日目における、ＧＡＰＤＨ対照と対比したｍＴＯＲ１のｄｄＰＣＲデータを示す。図１４５Ｂは、ｒＡＡＶによるＣＩＳＨ ＫＯおよびＴＣＲノックイン後３、７、１４日目における、ＴＣＲ発現を示す。
図１４６Ａは、ＰＤ−１におけるインデルの存在についてのオフターゲット（ＯＴ）解析の概要を示す。図１４６Ｂは、ＣＩＳＨにおけるインデルの存在についてのオフターゲット解析の概要を示す。
図１４７Ａは、組み込んだＴＣＲと比べた、デジタルＰＣＲプライマーおよびプローブの配置を示す。図１４７Ｂは、非処理細胞およびＣＲＩＳＰＲ ＣＩＳＨ ＫＯ＋ｒＡＡＶ修飾細胞についての、参照遺伝子と比べた組み込んだＴＣＲを示すデジタルＰＣＲデータを示す。
図１４８Ａは、ＣＩＳＨ ＫＯ細胞における、ｄｄＰＣＲによるＴＣＲの組込みパーセントを示す。図１４８Ｂは、ＣＲＩＳＰＲの電気穿孔およびｒＡＡＶ遺伝子導入後３、７、および１４日目における、ＴＣＲの組込みおよびタンパク質発現を示す。
図１４９は、非処理細胞およびＣＲＩＳＰＲ ＣＴＬＡ−４ ＫＯ＋ｒＡＡＶ修飾細胞についての、参照遺伝子と比べた組み込んだＴＣＲを示すデジタルＰＣＲデータを示す。
図１５０Ａは、３、７、および１４日目の、ＣＴＬＡ−４ ＫＯ細胞におけるｄｄＰＣＲによるＴＣＲの組込みパーセントを示す。図１５０Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ ＣＴＬＡ−４ ＫＯの電気穿孔および外因性ＴＣＲをコードするｒＡＡＶの遺伝子導入後３、７、および１４日目における、ＴＣＲの組込みおよびタンパク質発現を示す。
図１５１は、ｒＡＡＶのトランスフェクション（２×１０５細胞の小規模トランスフェクションおよび１×１０６細胞の大規模トランスフェクション）およびＣＲＩＳＰＲの電気穿孔後３、７、および１４日目における、完全なＴＣＲ発現についてのフローサイトメトリーデータを示す。
図１５２は、ＣＲＩＳＰＲ処理細胞（２×１０５細胞）におけるｒＡＡＶを遺伝子導入後１４日目の、ＦＡＣＳ解析によるＴＣＲ発現を示す。細胞に、ＣＲＩＳＰＲおよび、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１に対するガイドＲＮＡの電気穿孔も行った。
図１５３は、複数のＰＢＭＣドナーについての、ｒＡＡＶおよび、ＡＡＶＳ１、ＰＤ−１、ＣＩＳＨ、またはＣＴＬＡ−４におけるＣＲＩＳＰＲ ＫＯを遺伝子導入後１４日目のＴＣＲ発現パーセントを示す。
図１５４は、８ｐｍｏｌ二本鎖（ｄｓ）または１６ｐｍｏｌ ｄｓドナー（ＯＤＮ）を利用する、ＣＩＳＨにおけるＧＵＩＤＥ−ｓｅｑデータを示す。
図１５５Ａは、ＰＤ−１に対する相同性アームを有する、外因性ＴＣＲをコードするｒＡＡＶベクターについてのベクターマップを示す。図１５５Ｂは、ＰＤ−１に対する相同性アームおよびＭＮＤプロモーターを有する、外因性ＴＣＲをコードするｒＡＡＶベクターについてのベクターマップを示す。
図１５６は、溶解緩衝液を使用しないまたは溶解緩衝液を用いる、単一細胞ＰＣＲの比較を示す。細胞はＣＲＩＳＰＲで処理され、ＣＩＳＨ遺伝子においてノックアウトを有する。
図１５７Ａは、ＴＣＲノックインを示す概略を示す。図１５７Ｂは、ｒＡＡＶ ＴＣＲノックインを有する細胞のウェスタンブロットを示す。
図１５８は、ＣＲＩＳＰＲおよび抗ＣＩＳＨガイドＲＮＡをトランスフェクション後２８日目の、ＣＩＳＨ遺伝子座における単一細胞ＰＣＲを示す。細胞に、外因性ＴＣＲをコードするｒＡＡＶも遺伝子導入した。
図１５９Ａは、外因性ＴＣＲをコードするｒＡＡＶを遺伝子導入後７日目における、ＴＣＲ発現を示す。図１５９Ｂは、外因性ＴＣＲをコードするｒＡＡＶを遺伝子導入後７日目におけるウェスタンブロットを示す。
図１６０は、ＨＩＦ−１および代謝へのその関与の概略を示す。
開示の詳細な説明
以下の記載および実施例は、本開示の実施形態を詳細に例示する。本開示は、本明細書で記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって変化し得ることを理解されたい。当業者は、その範囲内に包含される本開示の多数の変形および改変が存在することを認識するであろう。
定義
「ＡＡＶ」または「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、もしくはＡＡＶ−１２、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、ｒｈ１０、もしくはハイブリッドＡＡＶなどの公知の血清型のいずれかのアデノ随伴ウイルス、またはその任意の組合せ、誘導体、もしくは変異体を指す。ＡＡＶは、小さい非エンベロープ型一本鎖ＤＮＡウイルスである。それらは非病原性パルボウイルスであり、複製のために、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびＣＭＶなどのヘルパーウイルスを必要としうる。野生型ＡＡＶは、一般的な集団において共通であり、いかなる公知の病原体とも関連しない。ハイブリッドＡＡＶは、ＡＡＶおよび異なるウイルスに由来する遺伝子素材を含むＡＡＶである。キメラＡＡＶは、２つまたはそれよりも多いＡＡＶ血清型に由来する遺伝子素材を含むＡＡＶである。ＡＡＶ変異体は、その親ＡＡＶと比較して、そのカプシドタンパク質中に１または複数のアミノ酸変異を含むＡＡＶである。本明細書で使用されるＡＡＶは、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含み、ここで、霊長類ＡＡＶは、非霊長類に感染するＡＡＶを指し、非霊長類ＡＡＶは、鳥類動物に感染する鳥類ＡＡＶなどの、非霊長類動物に感染するＡＡＶを指す。場合によって、野生型ＡＡＶは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有し、ここで、ｒｅｐ遺伝子は、ウイルス複製にとって必要とされ、ｃａｐ遺伝子は、カプシドタンパク質の合成にとって必要とされる。
「組換えＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクター」または「ＡＡＶベクター」という用語は、上述のＡＡＶ血清型のいずれか由来のベクターを指す。場合によって、ＡＡＶベクターは、全体または部分、例えば、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が欠失したＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１または複数を含み得るが、遺伝子治療のためのＡＡＶウイルスのパッケージングおよび使用に必要とされる機能エレメントを含有する。例えば、オープンリーディングフレームまたはクローニングされた外因性配列を挟む機能的なＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）またはＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製およびパッケージングに重要であることが公知であるが、ＡＡＶが、本明細書で記載される実施形態、例えば、遺伝子治療または遺伝子送達系のための使用に適するように、ＩＴＲ配列は、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含んで、野生型ヌクレオチド配列から修飾され得る。一部の態様では、本明細書に参照により組み込まれる、Wu、Hum Gene Ther.、２００７年、１８巻（２号）：１７１〜８２頁で説明される通り、自己相補的ベクター（ｓｃ）、例えば、ウイルス第二鎖ＤＮＡ合成のための必要条件をバイパスすることができ、トランス遺伝子タンパク質の発現のより高率を引き起こし得る自己相補的ＡＡＶベクターが使用され得る。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、最適血清型、プロモーター、およびトランス遺伝子の選択を可能にするように作製され得る。場合によって、ベクターは、免疫細胞に選択的に結合または感染するターゲティングされたベクターまたは修飾ベクターであり得る。
「ＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶビリオン」という用語は、本明細書で記載されるＡＡＶベクターをキャプシド形成する少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質を含むカプシドを含むウイルス粒子を指し、ベクターは、一部の実施形態において異種ポリヌクレオチド配列またはトランス遺伝子をさらに含み得る。
本明細書で使用される基準数値およびその文法的同等物に関する、「約」という用語およびその文法的同等物は、その値からプラスまたはマイナス１０％の範囲の値を含み得る。例えば、「約１０」という量は、９〜１１の量を含む。基準数値に関する「約」という用語はまた、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％の範囲の値も含み得る。
本明細書で使用される「活性化」という用語およびその文法的同等物は、細胞が、休眠状態から、活性状態へと移行する過程を指す場合がある。この過程は、抗原への応答、遊走、および／または機能的活性状態への、表現型もしくは遺伝子的変化を含み得る。例えば、「活性化」という用語は、Ｔ細胞活性化の段階的過程を指す場合がある。例えば、Ｔ細胞は、完全に活性化するのに、少なくとも２つのシグナルを要求し得る。第１のシグナルは、抗原−ＭＨＣ複合体の、ＴＣＲへの係合の後で生じることが可能であり、第２のシグナルは、共刺激性分子の係合により生じ得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、抗ＣＤ３は、第１のシグナルを模倣することが可能であり、抗ＣＤ２８は、第２のシグナルを模倣し得る。
本明細書で使用される「隣接する」という用語およびその文法的同等物は、基準の対象物のすぐ隣を指す場合がある。例えば、ヌクレオチド配列の文脈における隣接するという用語は、間にヌクレオチドを伴わないことを意味し得る。例えば、ポリヌクレオチドＢと隣接するポリヌクレオチドＡとは、ＡとＢとの間にヌクレオチドを伴わないＡＢを意味し得る。
本明細書で使用される「抗原」という用語およびその文法的同等物は、１または複数の受容体が結合することが可能な、１または複数のエピトープを含有する分子を指す場合がある。例えば、抗原は、宿主の免疫系を刺激して、抗原が提示されている場合の、細胞性の抗原特異的免疫応答をもたらす場合もあり、体液性抗体応答をもたらす場合もある。抗原はまた、それ自体により、または別の分子と組み合わせて存在する場合に、細胞性応答および／または体液性応答を誘発する能力も有し得る。例えば、腫瘍細胞抗原は、ＴＣＲにより認識され得る。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語およびその文法的同等物は、抗体、Ｂ細胞、Ｔ細胞、または操作細胞により認識され得る、抗原の一部を指す場合がある。例えば、エピトープは、ＴＣＲにより認識されるがんエピトープであり得る。また、抗原内の複数のエピトープも認識することができる。エピトープはまた、変異している場合もある。
本明細書で使用される「自家」という用語およびその文法的同等物は、同じ存在に由来することを指す場合がある。例えば、試料（例えば、細胞）を採取し、加工し、後に同じ対象（例えば、患者）へと戻すことができる。自家工程は、ドナーとレシピエントとが異なる対象である、同種工程と区別される。
「〜へとバーコードづけされた」という用語は、第１の分子が、第２の分子を同定するのに使用し得るバーコードを含有する場合における、分子間の関係を指す。
本明細書で使用される「がん」という用語およびその文法的同等物は、細胞の過剰増殖であって、その固有の形質（正常な制御の喪失）が、調節されていない増殖、分化の欠如、限局的な組織浸潤、および転移を結果としてもたらす過剰増殖を指す場合がある。本発明の方法との関連で、がんは、急性リンパ球がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、肛門がん、肛門管がん、直腸がん、眼がん、肝臓内胆管がん、関節がん、頸部がん、胆嚢がん、または胸膜がん、鼻がん、鼻腔がん、または中耳がん、口腔がん、外陰がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、悪性中皮腫、マスト細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜がん、網がん、および腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、固体腫瘍、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、および／または膀胱がんのうちのいずれかを含む、任意のがんであり得る。本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、細胞または組織の異常な増殖であって、例えば、悪性型または良性型の増殖を指す。
本明細書で使用される「がんネオ抗原」または「ネオ抗原」または「ネオエピトープ」という用語およびその文法的同等物は、正常な、変異していない宿主のゲノム内ではコードされない抗原を指す場合がある。「ネオ抗原」は、場合によって、腫瘍形成性のウイルスタンパク質、または体細胞変異の帰結として発生する異常なタンパク質を表し得る。例えば、ネオ抗原は、ウイルスタンパク質の活性を介する、細胞機構の破壊により発生し得る。別の例は、場合によって、体細胞変異をもたらし得る、発がん性化合物への曝露であり得る。この体細胞変異は最終的に、腫瘍／がんの形成をもたらし得る。
本明細書で使用される「細胞傷害作用」という用語は、細胞の正常状態の、意図されないかまたは所望されない変化を指す。細胞の正常状態とは、細胞傷害性組成物、細胞傷害剤、および／または細胞傷害性状態への細胞の曝露の前に顕在化されるかまたは存在する状態を指す場合がある。一般に、正常状態にある細胞とは、ホメオスタシスにある細胞である。細胞の正常状態の、意図されないかまたは所望されない変化は、例えば、細胞死（例えば、プログラム細胞死）、複製の潜在能の減殺、膜の完全性などの細胞の完全性の減殺、代謝活性の減殺、発生能の減殺、または本出願で開示される細胞傷害作用のうちのいずれかの形態で顕在化され得る。
「細胞傷害作用を低減すること」または「細胞傷害作用を低減する」という語句は、細胞傷害性組成物、細胞傷害剤、および／または細胞傷害性状態への曝露時における、細胞の正常状態の、意図されないかまたは所望されない変化の程度または頻度の低減を指す。語句は、細胞傷害性組成物、細胞傷害剤、および／または細胞傷害性状態へと曝露された個々の細胞内の細胞傷害作用の程度を低減することを指す場合もあり、細胞の集団を、細胞傷害性組成物、細胞傷害剤、および／または細胞傷害性状態へと曝露した場合に、細胞傷害作用を呈する集団の細胞数を低減することを指す場合もある。
本明細書で使用される「操作された」という用語およびその文法的同等物は、核酸、例えば、生物のゲノム内の核酸の、１または複数の変化を指す場合がある。「操作された」という用語は、遺伝子の変化、付加、および／または欠失を指す場合がある。操作細胞とはまた、遺伝子を付加し、欠失させ、かつ／または変化した細胞も指す場合がある。
本明細書で使用される「細胞」または「操作細胞」または「遺伝子改変細胞」という用語およびこれらの文法的同等物は、ヒトまたは非ヒト動物起源の細胞を指す場合がある。「操作細胞」および「遺伝子改変細胞」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
本明細書で使用される「チェックポイント遺伝子」という用語およびその文法的同等物は、免疫応答の振幅を調節するように作用する阻害性過程（例えば、フィードバックループ）、例えば、有害な応答の、制御されない伝播を緩和させる、免疫阻害性フィードバックループ（例えば、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１）に関与する、任意の遺伝子を指す場合がある。これらの応答は、感染症に対する免疫応答時に生じ得る付帯的な組織損傷に対して防御する分子シールド、および／または末梢における自己寛容の維持への寄与を含み得る。チェックポイント遺伝子の非限定的な例は、拡張ＣＤ２８ファミリーの受容体のメンバーおよびそれらのリガンド、ならびに共阻害性経路（例えば、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１）に関与する遺伝子を含み得る。「チェックポイント遺伝子」という用語はまた、免疫チェックポイント遺伝子も指す場合がある。
「ＣＲＩＳＰＲ」、「ＣＲＩＳＰＲ系」、または「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ系」、およびこれらの文法的同等物は、ＤＮＡに結合する非コードＲＮＡ分子（例えば、ガイドＲＮＡ）と、ヌクレアーゼの機能性（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を伴うＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）とを含み得る。例えば、Sander, J.D.ら、「CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes」、Nature Biotechnology、３２巻：３４７〜３５５頁（２０１４年）を参照されたい。例えば、Hsu, P.D.ら、「Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering」、Cell、１５７巻（６号）：１２６２〜１２７８頁（２０１４年）もまた、参照されたい。
本明細書で使用される「〜を破壊すること」という用語およびその文法的同等物は、例えば、切断、欠失、挿入、変異、再配列、またはこれらの任意の組合せにより遺伝子を変化する工程を指す場合がある。破壊は、タンパク質発現のノックアウトまたはノックダウンをもたらす場合がある。ノックアウトは、完全または部分的ノックアウトであり得る。例えば、遺伝子は、ノックアウトまたはノックダウンにより破壊することができる。遺伝子の破壊は、遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を部分的に低減することの場合もあり、これを完全に抑制することの場合もある。遺伝子の破壊はまた、異なる遺伝子、例えば、下流における遺伝子の活性化も引き起こし得る。場合によって、「〜を破壊すること」という用語は、抑制すること、妨害すること、または操作することなどの用語と互換的に使用することができる。
本明細書で使用される「機能」という用語およびその文法的同等物は、意図される目的を果たすか、有するか、またはこれに適う能力を指す場合がある。「機能的」とは、正常機能の、ベースラインから１００％までの任意のパーセントを含み得る。例えば、機能的とは、正常機能の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０，５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および／もしくは１００％を含み得るか、またはほぼこれらの比率を含み得る。場合によって、機能的という用語は、正常機能の１００％またはほぼ１００％を超える、例えば、正常機能の１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００％、および／もしくはこれを上回ることを意味し得る。
本明細書で使用される「遺伝子編集」という用語およびその文法的同等物は、ゲノムにおいて、１または複数のヌクレオチドを挿入するか、置き換えるか、または除去する遺伝子操作を指す場合がある。遺伝子編集は、ヌクレアーゼ（例えば、天然で存在するヌクレアーゼまたは人工的に操作されたヌクレアーゼ）を使用して実施することができる。
本明細書で使用される「変異」という用語およびその文法的同等物は、ポリヌクレオチド内の、１または複数のヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を含み得る。例えば、ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ、遺伝子）配列内またはポリペプチド配列内で、最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも多い、ヌクレオチド／アミノ酸を、置換し、欠失させ、かつ／または挿入することができる。変異は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を及ぼし得る。変異はまた、ゲノム配列構造、またはコードされるｍＲＮＡの構造／安定性にも影響を及ぼし得る。
本明細書で使用される「非ヒト動物」という用語およびその文法的同等物は、ヒト以外の全ての動物種であって、天然動物の場合もあり、遺伝子改変された非ヒト動物の場合もある、非ヒト哺乳動物を含む動物種を含み得る。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語、ならびにこれらの文法的同等物は、互換的に使用することができ、直鎖状コンフォメーションまたは環状コンフォメーションにあり、一本鎖形態または二本鎖形態にある、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指し得る。本開示の目的では、これらの用語は、長さに関して限定的とはみなされるべきではない。用語は、天然ヌクレオチドの類似体のほか、塩基部分、糖部分、および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドも包含し得る。用語の変化形はまた、脱メチル化、ＣｐＧメチル化の付加、細菌性メチル化の除去、および／または哺乳動物性メチル化の付加も包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有し得る、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対であり得る。
本明細書で使用される「末梢血リンパ球」（ＰＢＬ）という用語およびその文法的同等物は、血液（例えば、末梢血）中を循環するリンパ球を指す場合がある。末梢血リンパ球とは、臓器へと局在化しないリンパ球を指す場合がある。末梢血リンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
本明細書で使用される「表現型」という用語およびその文法的同等物は、生物の観察可能な特徴または形質の複合物であって、その形状、発生、生化学的特性または生理学的特性、生物季節学、挙動、および挙動の結果などの複合物を指す場合がある。文脈に応じて、「表現型」という用語は、ある場合には、集団の観察可能な特徴または形質の複合物を指す。
本明細書で使用される「プロトスペーサー」という用語およびその文法的同等物は、ＰＡＭに隣接する核酸配列であって、ガイドＲＮＡのスペーサー配列または操作されたターゲティング部分など、ガイドＲＮＡの部分にハイブリダイズすることが可能な核酸配列を指す場合がある。プロトスペーサーは、遺伝子内、ゲノム内、または染色体内のヌクレオチド配列であって、ガイドＲＮＡにターゲティングされるヌクレオチド配列であり得る。天然状態では、プロトスペーサーは、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）と隣接する。ＲＮＡにガイドされるヌクレアーゼの切断部位は、プロトスペーサー配列内にある。例えば、ガイドＲＮＡが、特異的プロトスペーサーをターゲティングする場合、Ｃａｓタンパク質は、プロトスペーサー配列内で二本鎖切断を生じ、これにより、プロトスペーサーを切断するであろう。切断後、プロトスペーサーの破壊は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）を結果としてもたらし得る。プロトスペーサーの破壊は、プロトスペーサーの欠失を結果としてもたらし得る。加えて、または代替的に、プロトスペーサーの破壊は、プロトスペーサーへと挿入されるか、またはこれを置き換える外因性核酸配列を結果としてもたらし得る。
本明細書で使用される「レシピエント」という用語およびその文法的同等物は、ヒトまたは非ヒト動物を指す場合がある。レシピエントはまた、それを必要とするレシピエントでもあり得る。
本明細書で使用される「組換え」という用語およびその文法的同等物は、２つのポリ核酸の間の遺伝情報の交換過程を指す場合がある。本開示の目的では、「相同組換え」または「ＨＲ」とは、例えば、二本鎖切断の修復時において生じ得る、このような遺伝子交換の特化形態を指す場合がある。この過程は、例えば、標的分子（例えば、二本鎖切断を経た分子）を修復するための鋳型として、ドナー分子を使用して、ヌクレオチド配列相同性を要求する場合があり、ある場合には、非交叉型遺伝子変換またはショートトラクト型遺伝子変換として公知である。このような移入はまた、破壊される標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチの是正、および／または標的の一部となりうる遺伝情報を再合成するのにドナーを使用し得る合成依存性鎖アニーリング、および／または関連する過程も伴いうる。このような特化したＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部を、標的ポリヌクレオチドへと組み込みうるように、標的分子の配列の変化を結果としてもたらし得ることが多い。場合によって、「組換えアーム」という用語と、「相同性アーム」という用語は、本明細書で互換的に使用することができる。
本明細書では、「標的ベクター」という用語と、「ターゲティングベクター」という用語とを、互換的に使用する。
本明細書で使用される「トランス遺伝子」という用語およびその文法的同等物は、生物へと移入される遺伝子または遺伝子素材を指す場合がある。例えば、トランス遺伝子は、生物へと導入される遺伝子を含有する、ＤＮＡの連なりまたはセグメントであり得る。トランス遺伝子を生物へと移入する場合、生物を、トランスジェニック生物と称する。トランス遺伝子は、トランスジェニック生物において、ＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、タンパク質）を産生するその能力を保持し得る。トランス遺伝子は、異なる核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡから構成され得る。トランス遺伝子は、操作Ｔ細胞受容体、例えば、ＴＣＲトランス遺伝子をコードし得る。トランス遺伝子は、ＴＣＲ配列を含み得る。トランス遺伝子は、組換えアームを含み得る。トランス遺伝子は、操作部位を含み得る。
本明細書で使用される「Ｔ細胞」という用語およびその文法的同等物は、任意の由来のＴ細胞を指す場合がある。例えば、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、自家Ｔ細胞、細胞株などであり得る。Ｔ細胞はまた、ヒトＴ細胞の場合もあり、非ヒトＴ細胞の場合もある。
本明細書で使用される「ＴＩＬ」または腫瘍浸潤リンパ球という用語およびこれらの文法的同等物は、腫瘍から単離された細胞を指す場合がある。例えば、ＴＩＬは、腫瘍へと遊走した細胞であり得る。ＴＩＬはまた、腫瘍に浸潤した細胞でもあり得る。ＴＩＬは、腫瘍内で見出される任意の細胞であり得る。例えば、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、またはこれらの任意の組合せであり得る。ＴＩＬは、混合細胞の集団であり得る。ＴＩＬの集団は、表現型の異なる細胞、分化程度の異なる細胞、系統の異なる細胞、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
「治療効果」は、処置される状態に変化が見られる場合に生じ得る。変化は、肯定的変化の場合もあり、否定的変化の場合もある。例えば、「肯定的効果」は、対象における活性化Ｔ細胞数の増大に対応し得る。別の例では、「否定的効果」は、対象における腫瘍の量またはサイズの減少に対応し得る。少なくとも１０％の改善、好ましくは、少なくとも２５％、より好ましくは、少なくとも５０％、なおより好ましくは、少なくとも７５％、および最も好ましくは、１００％の改善が見られる場合に、処置される状態には「変化」が見られる。変化は、個体において処置される状態の重症度の改善に基づく場合もあり、本発明の組成物をそれと組み合わせて投与する治療用組成物による処置を伴う個体およびこれを伴わない個体の集団における、状態の改善の頻度の差違に基づく場合もある。同様に、本開示の方法は、対象へと、「治療有効」量の細胞を投与するステップを含み得る。「治療的に有効な」という用語は、「治療効果を及ぼすこと」に対応する定義を有するように理解されるべきである。
本明細書で使用される「セーフハーバー」および「免疫セーフハーバー」という用語ならびにこれらの文法的同等物は、外因性核酸を組み込むために使用され得るゲノム内の場所であって、組込みが、核酸単独の添加により、宿主細胞の増殖に対して、著明な効果を引き起こさない場所を指す場合がある。セーフハーバーの非限定的な例は、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ＣＣＲ５、またはＲｏｓａ２６を含み得る。例えば、ヒトパルボウイルス、ＡＡＶは、ヒト染色体１９ｑ１３．３−ｑｔｅｒまたはＡＡＶＳ１遺伝子座に優先的に組み込まれることが公知である。ＡＡＶＳ１遺伝子座での目的の遺伝子の組込みは、様々な細胞型におけるトランス遺伝子の安定な発現を支援し得る。場合によって、ヌクレアーゼを操作して、ＡＡＶＳ１遺伝子座での二本鎖切断の作製をターゲティングしてＡＡＶＳ１遺伝子座でのトランス遺伝子の組み込みを可能にする場合もあり、ＡＡＶＳ１部位での外因性核酸配列、例えば、トランス遺伝子、細胞受容体、または本明細書で開示する任意の目的の遺伝子の組み込みのためにＡＡＶＳ１遺伝子座での相同組換えを容易とする場合もある。場合によって、ＡＡＶウイルスベクターは、外因性ヌクレアーゼを伴うかまたは伴わないＡＡＶＳ１部位での組み込みのためにトランス遺伝子を送達するために使用される。
本明細書で使用される「配列」という用語およびその文法的同等物は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もあり；直鎖状の場合もあり、環状の場合もあり、分枝状の場合もあり；一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある、ヌクレオチド配列を指す場合がある。配列は、変異させることができる。配列は、任意の長さ、例えば、２〜１，０００，０００の間、またはそれよりも多いヌクレオチドの長さ（またはこれらの間であるか、もしくはこれらを上回る、任意の整数値）、例えば、約１００〜約１０，０００ヌクレオチドの間または約２００〜約５００ヌクレオチドの間であり得る。
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルスに由来する遺伝子移入ベクターまたは遺伝子送達系を指す。このようなベクターは、当技術分野で公知の組換え技法を使用して構築することができる。一部の態様では、このようなベクターを派生させるためのウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存性アデノウイルス、ハイブリッドアデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、センダイウイルス（ＨＶＪ）、モロニーマウス白血病ウイルス、ポックスウイルス、およびＨＩＶベースのウイルスから選択される。
概観
本明細書では、遺伝子改変細胞の集団を産生する方法が開示される。場合によって、少なくとも１つの方法は、ヒト対象に由来する細胞の集団を提供するステップを含む。場合によって、少なくとも１つの方法は、少なくとも１個の遺伝子（例えば、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子）中に少なくとも１個の切断を導入することによって細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞を改変すること（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏで）を含む。場合によって、切断は、前記少なくとも１個の遺伝子のタンパク質機能を抑制しうる（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲタンパク質機能を抑制する）。場合によって、遺伝子抑制は、部分的または完全であり得る。場合によって、切断は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系および／またはガイドポリ核酸を使用して導入される。場合によって、切断は、ヌクレアーゼおよび／またはガイドポリ核酸を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用して導入される。場合によって、切断は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼおよび／もしくはガイドポリ核酸を含むポリペプチドを使用して導入される。場合によって、ガイドポリ核酸は、少なくとも１個の細胞または複数の細胞中の少なくとも１個の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）に特異的に結合する。場合によって、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞に導入される。場合によって、前記ＡＡＶは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含む。場合によって、前記ＡＡＶは、前記外因性トランス遺伝子を、前記少なくとも１個の細胞のゲノム中に組み込む。場合によって、前記ＡＡＶは、ＣＲＩＳＰＲ系および／またはガイドポリ核酸および／またはヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼをコードするポリペプチドの後に、それと同時に、またはその前に導入される。場合によって、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を、ミニサークルベクターを使用して少なくとも１個の細胞のゲノム中に組み込むことができる。場合によって、前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子は、前記切断において、組み込まれる。場合によって、前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子は、前記ゲノム中にランダムに、および／または部位特異的に組み込まれる。場合によって、前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子は、前記ゲノム中に少なくとも１回組み込まれる。場合によって、ＡＡＶベクターを使用する前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子の組込みは、同等の細胞中でのミニサークルベクターの使用と比較して細胞毒性を低減する。場合によって、細胞の前記集団は、前記ＡＡＶベクターの導入後約４日で少なくとも約９０％の生細胞を含む。場合によって、細胞生存率は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって測定される。場合によって、遺伝子改変細胞の前記集団中の細胞の少なくとも約１０％が、前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を発現する。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、修飾ＡＡＶを含む。
本明細書では、ヒト対象におけるがんを処置する方法が開示される。１つの場合には、方法は、治療有効量のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団を、ヒト対象に投与するステップを含む。場合によって、前記ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の少なくとも１個は、少なくとも１個の遺伝子（例えば、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子および／またはＴＣＲ）中にゲノム変化を含む。場合によって、前記ゲノム変化は、前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞中の前記少なくとも１個の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）のタンパク質機能の抑制（例えば、部分的な、または完全な）をもたらす。場合によって、前記ゲノム変化は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系によって導入される。場合によって、前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性トランス遺伝子をさらに含む。場合によって、前記外因性トランス遺伝子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって前記少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中に導入される。場合によって、治療有効量の遺伝子改変細胞の前記集団の投与は、ヒト対象におけるがんを処置するか、またはがんの少なくとも１つの症状を改善する。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、修飾ＡＡＶを含む。
本明細書では、遺伝子改変細胞のｅｘ ｖｉｖｏ集団が開示される。１つの場合には、遺伝子改変細胞のｅｘ ｖｉｖｏ集団は、少なくとも１個の遺伝子（例えば、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子）中に外因性ゲノム変化を含む。場合によって、前記ゲノム変化は、少なくとも１個の遺伝子改変細胞中の前記少なくとも１個の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）のタンパク質機能を抑制する。場合によって、前記集団は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをさらに含む。場合によって、前記集団は、ＡＡＶベクターよりもむしろミニサークルベクターを含む。場合によって、前記ＡＡＶベクター（またはミニサークルベクター）は、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含む。場合によって、前記外因性トランス遺伝子は、前記少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中への挿入のためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、修飾ＡＡＶを含む。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、非修飾または野生型ＡＡＶを含む。場合によって、治療有効量の前記集団は、がんを処置または改善するために対象に投与される。場合によって、前記治療有効量の前記集団は、それぞれ、対応する非修飾もしくは野生型ＡＡＶベクターまたはミニサークルからもたらされる同じ治療効果を提供するのに必要とされる細胞数と比較して、より少数の細胞を含む。
本明細書では、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を細胞に導入するための系が開示される。場合によって、系は、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。場合によって、前記系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをさらに含む。場合によって、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも１個の細胞の少なくとも１個の遺伝子（例えば、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子）中に二本鎖切断を導入する。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を、前記細胞のゲノム中に導入する。場合によって、前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする。場合によって、系は、ＡＡＶベクターよりもむしろミニサークルベクターを含む。場合によって、前記ミニサークルベクターは、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を、細胞のゲノム中に導入する。場合によって、前記系は、ミニサークルと、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む同様の系と比較して、前記ゲノム中への前記トランス遺伝子の導入のより高い効率を有し、より低い細胞毒性をもたらし、ここで、前記ミニサークルは、前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を前記ゲノム中に導入する。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、修飾ＡＡＶを含む。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、非修飾または野生型ＡＡＶを含む。
本明細書では、ヒト対象におけるがんを処置する方法が開示される。場合によって、がんを処置する方法は、ヒト対象に由来する細胞集団中の少なくとも１個の遺伝子（例えば、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子）をｅｘ ｖｉｖｏで改変するステップを含む。場合によって、前記改変は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を使用することを含む。場合によって、前記改変は、ガイドポリ核酸および／またはヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼを含むポリペプチドを使用することを含む。場合によって、前記ＣＲＩＳＰＲ系（または前記ガイドポリ核酸および／またはヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼを含むポリペプチド）は、前記少なくとも１個の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子）中に二本鎖切断を導入して、操作細胞の集団を生成する。場合によって、前記方法は、がん応答性受容体を、前記操作細胞の集団中に導入するステップをさらに含む。場合によって、前記導入は、アデノ随伴ウイルス遺伝子送達系を使用して、前記二本鎖切断に少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むことによって、がん応答性細胞の集団を生成することを含む。場合によって、前記導入は、ミニサークル非ウイルス遺伝子送達系を使用して、前記二本鎖切断に少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むことによって、がん応答性細胞の集団を生成することを含む。場合によって、前記アデノ随伴ウイルス遺伝子送達系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。場合によって、前記方法は、治療有効量のがん応答性細胞の前記集団を、前記対象に投与するステップをさらに含む。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、修飾ＡＡＶを含む。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、非修飾または野生型ＡＡＶを含む。場合によって、治療有効量のがん応答性細胞の前記集団は、がんを処置または改善するために対象に投与される。場合によって、前記治療有効量のがん応答性細胞の前記集団は、それぞれ、対応する非修飾もしくは野生型ＡＡＶベクターまたはミニサークルからもたらされる同じ治療効果を提供するのに必要とされる細胞数と比較して、より少数の細胞を含む。
本明細書では、遺伝子改変細胞を作製する方法が開示される。場合によって、方法は、宿主細胞の集団を提供することを含む。場合によって、方法は、修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターおよびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を導入するステップを含む。場合によって、方法は、ミニサークルベクターおよびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を導入するステップを含む。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系は、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。場合によって、前記ヌクレアーゼは、少なくとも１個の遺伝子（サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子）中に切断を導入する。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、外因性核酸を導入する。場合によって、前記ミニサークルベクターは、外因性核酸を導入する。場合によって、前記外因性核酸は、前記切断において導入される。一部の実施形態では、前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むための前記ＡＡＶベクターの使用は、同等の細胞中に前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むためのミニサークルベクターの使用と比較して細胞毒性を低減する。場合によって、前記外因性核酸は、前記ＣＲＩＳＰＲ系と対応する非修飾または野生型ＡＡＶベクターとが導入された同等の宿主細胞の集団と比較して、より高い効率で導入される。
本明細書では、遺伝子改変された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を産生する方法が開示される。１つの場合には、方法は、ヒト対象に由来するＴＩＬの集団を提供するステップを含む。場合によって、方法は、前記ＴＩＬの集団に、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系をｅｘ ｖｉｖｏで電気穿孔するステップを含む。場合によって、前記ＣＲＩＳＰＲ系は、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、少なくとも１個のガイドポリ核酸（例えば、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ））とを含む。場合によって、前記ＣＲＩＳＰＲ系は、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を含むヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。場合によって、前記ｇＲＮＡは、少なくとも１個の遺伝子（サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子および／またはＴＣＲ）と相補的な配列を含む。場合によって、前記少なくとも１個のｇＲＮＡは、第１の遺伝子（例えば、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子）と相補的な配列を含むｇＲＮＡと、第２の遺伝子（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子）と相補的な配列を含むｇＲＮＡとを含む。場合によって、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、前記ＴＩＬの集団中の少なくとも１個のＴＩＬの前記少なくとも１個の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ遺伝子および／またはＴＣＲ）中に二本鎖切断を導入する。場合によって、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、前記ＴＩＬの集団中の少なくとも１個のＴＩＬの前記第１の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ遺伝子）および／または前記第２の遺伝子（例えば、ＴＣＲ遺伝子）中に二本鎖切断を導入する。場合によって、前記ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であるか、または前記ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９をコードする。場合によって、方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、前記ＴＩＬの集団中の前記少なくとも１個のＴＩＬに導入するステップをさらに含む。場合によって、前記導入は、前記ＣＲＩＳＰＲ系の電気穿孔後、約１時間〜約４日を含む。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、前記ＣＲＩＳＰＲ系の電気穿孔後、約１時間よりいくらか後の時間に導入される（例えば、前記ＣＲＩＳＰＲ系の前記電気穿孔の１０時間後、１日後、２日後、５日後、１０日後、３０日後、１カ月後、２カ月後など）。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、前記ＣＲＩＳＰＲ系の電気穿孔の前に導入される（例えば、前記ＣＲＩＳＰＲ系の前記電気穿孔の３０分前、１時間前、２時間前、５時間前、１０時間前、１８時間前、１日前、２日前、３日前、５日前、８日前、１０日前、３０日前、１カ月前、２カ月前など）。場合によって、前記導入は、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を、前記二本鎖切断中に、または前記二本鎖切断の少なくとも１個中に組み込む。場合によって、前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、修飾ＡＡＶを含む。場合によって、前記ＡＡＶベクターは、非修飾または野生型ＡＡＶを含む。
場合によって、本明細書に開示される方法のいずれかおよび／または系のいずれかは、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドをさらに含み得る。場合によって、本明細書に開示される方法のいずれかおよび／または系のいずれかは、ガイドポリ核酸をさらに含み得る。場合によって、本明細書に開示される方法のいずれかおよび／または系のいずれかは、電気穿孔および／またはヌクレオフェクションを含み得る。
細胞
本明細書に開示される組成物および方法は、細胞を用いることができる。細胞は、初代細胞であり得る。初代細胞は、初代リンパ球であり得る。初代細胞の集団は、初代リンパ球の集団であり得る。細胞は、組換え細胞であり得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な供給源から得ることができる。例えば、任意のＴ細胞株を使用することができる。代替的に、細胞は、健常ドナーに由来する場合もあり、がんを伴うと診断された患者に由来する場合もあり、感染を伴うと診断された患者に由来する場合もある。別の場合では、細胞は、異なる表現型特徴を提示する混合細胞の集団の一部であり得る。細胞はまた、細胞療法バンクから得ることもできる。免疫抑制処置に対して抵抗性の破壊された細胞を得ることができる。所望の細胞の集団はまた、改変の前に選択することもできる。選択は、磁気分離、フローサイトメトリー選択、抗生物質選択のうちの少なくとも１つを含み得る。１個または複数の細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ球、単球またはマクロファージなどの任意の血液細胞であり得る。１個または複数の細胞は、リンパ球、Ｂ細胞、またはＴ細胞などの任意の免疫細胞であり得る。細胞を、自然食品、アフェレーシス、または対象の腫瘍試料から得ることもできる。細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であり得る。場合によって、アフェレーシスは、白血球アフェレーシスであり得る。白血球アフェレーシスは、血液細胞が血液から単離される手順であり得る。白血球アフェレーシス中に、血液を対象の腕の中の針から除去し、全血を赤血球、血漿およびリンパ球に分ける機械を通して循環させた後、血漿および赤血球を、他方の腕の中の針を通して対象に戻すことができる。場合によって、細胞は、処置レジメンおよび細胞療法の投与後に単離される。例えば、アフェレーシスを、細胞投与と連続的または同時に実施することができる。場合によって、アフェレーシスは、細胞生成物の投与前および投与の最大約６週間後に実施される。場合によって、アフェレーシスは、細胞生成物の投与後、−３週、−２週、−１週、０、１週、２週、３週、４週、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、または最大約１０年で実施される。場合によって、アフェレーシスによって獲得された細胞は、特異的溶解に関する試験、サイトカイン放出、メタボロミック試験、バイオエナジェティックス試験、サイトカイン産生の細胞内ＦＡＣｓ、ＥＬＩＳＡ−スポットアッセイ、およびリンパ球サブセット解析を受けうる。場合によって、細胞生成物またはアフェレーシス生成物の試料を、注入された細胞表現型および機能の後ろ向き解析のために凍結保存することができる。
本明細書では、細胞内ゲノム移植を実施するために有用な、組成物および方法が開示される。ゲノム移植のための例示的な方法は、全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４８５８に記載されている。細胞内ゲノム移植は、治療適用のために、細胞および核酸を遺伝子改変することを含み得る。全体を通して記載される組成物および方法は、操作細胞の、生理学的および免疫学的な抗腫瘍効力を改善する形で、腫瘍特異的ＴＣＲを送達するために、核酸を媒介する遺伝子操作工程を使用し得る。効果的な養子細胞移入ベースの免疫療法（ＡＣＴ）は、がん（例えば、転移性がん）患者を処置するのに有用であり得る。例えば、ウイルスまたは非ウイルス法を使用して、がん細胞上の固有の変異であるネオ抗原を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などのトランス遺伝子を発現するように、自家末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を改変し、開示される、細胞内ゲノム移植の組成物および方法において使用することができる。ネオ抗原は、変異負荷が大きな腫瘍と関連しうる（図５８）。
細胞は、遺伝子改変された、または操作されたものであり得る。細胞（例えば、遺伝子改変細胞、または操作細胞）は、患者に投与されたらその性能を改善し得る条件で、増殖および拡大することができる。操作細胞は、選択することができる。例えば、細胞の拡大および操作の前に、様々な非限定的な方法により、細胞の供給源を、対象から得ることができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な供給源から得ることができる。例えば、任意のＴ細胞株を使用することができる。代替的に、細胞は、健常ドナーに由来する場合もあり、がんを伴うと診断された患者に由来する場合もあり、感染を伴うと診断された患者に由来する場合もある。別の場合には、細胞は、異なる表現型特徴を提示する混合細胞の集団の一部であり得る。細胞株はまた、既に記載されている方法に従い、形質転換されたＴ細胞から得ることもできる。細胞はまた、細胞療法バンクから得ることもできる。免疫抑制処置に対して抵抗性の改変細胞を得ることができる。所望の細胞の集団はまた、改変の前に選択することもできる。操作細胞の集団はまた、改変の後で選択することもできる。
場合によって、操作細胞は、自家移植において使用することができる。代替的に、操作細胞は、同種移植において使用することができる。場合によって、操作細胞は、がん関連標的配列および／またはトランス遺伝子（例えば、ＴＣＲトランス遺伝子）を同定するのにその試料が使用された同じ患者へと投与することができる。場合によって、操作細胞は、がん関連標的配列および／またはトランス遺伝子（例えば、ＴＣＲトランス遺伝子）を同定するのにその試料が使用された患者と異なる患者へと投与することができる。１または複数の相同組換えエンハンサーは、本開示の細胞と共に導入することができる。エンハンサーは、二本鎖切断の、相同性により導かれる修復を容易とし得る。エンハンサーは、トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲトランス遺伝子）の本開示の細胞への組込みを容易とし得る。エンハンサーは、二本鎖切断の、相同性により導かれる修復が優先的に生じるように、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を遮断し得る。
１または複数のサイトカインは、本開示の細胞と共に導入することができる。サイトカインは、細胞傷害性Ｔリンパ球（養子移入させる腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を含む）をブーストして、腫瘍微小環境内で拡大するのに用いることができる。場合によって、ＩＬ−２を使用して、本明細書で記載される細胞の拡大を容易とすることができる。ＩＬ−１５などのサイトカインもまた、利用することができる。ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはこれらの任意の組合せなど、免疫療法の分野において妥当である、他のサイトカインもまた、用いることができる。場合によって、ＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５を使用して、本発明の細胞を培養する。
場合によって、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞性能を改善するための薬剤、例えば、Ｓ−２−ヒドロキシグルタル酸塩（Ｓ−２ＨＧ）で処理することができる。Ｓ−２ＨＧでの処理は、非処理細胞と比較して、細胞増殖およびｉｎ ｖｉｖｏでの持続性を改善し得る。Ｓ−２ＨＧはまた、Ｓ−２ＨＧで処理していない細胞と比較して、処理細胞において抗腫瘍効能を改善し得る。場合によって、Ｓ−２ＨＧでの処理は、ＣＤ６２Ｌの発現増大をもたらし得る。場合によって、Ｓ−２ＨＧで処理した細胞は、非処理細胞と比較して、より高レベルのＣＤ１２７、ＣＤ４４、４−１ＢＢ、Ｅｏｍｅｓを発現し得る。場合によって、Ｓ−２ＨＧで処理した細胞は、非処理細胞と比較して、ＰＤ−１の発現低減を有し得る。ＣＤ１２７、ＣＤ４４、４−１ＢＢ、およびＥｏｍｅｓのレベルの増大は、非処理細胞と比較して、Ｓ−２ＨＧで処理した細胞におけるＣＤ１２７、ＣＤ４４、４−１ＢＢ、およびＥｏｍｅｓの発現において約５％〜約７００％、例えば、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、または最大で７００％の増大であり得る。場合によって、Ｓ−２ＨＧで処理した細胞は、非処理細胞と比較して、フローサイトメトリー解析により測定される約５％〜約７００％増大した細胞拡大および／または増殖、例えば、非処理細胞と比較して、フローサイトメトリー解析により測定される約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、または最大で７００％増大した細胞拡大および／または増殖を有し得る。
Ｓ−２ＨＧで処理される細胞は、約１０μＭ〜約５００μＭの濃度に曝露され得る。濃度は、約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、４５０μＭ、または最大で５００μＭであり得る。
細胞傷害作用は一般に、細胞に対して毒性である、組成物、薬剤、および／または状態（例えば、外因性ＤＮＡ）の資質を指す場合がある。一部の態様では、本開示の方法は一般に、遺伝子改変時に、１または複数の細胞へと導入される、外因性ＤＮＡの細胞傷害効果を低減することに関する。場合によって、細胞傷害作用、または細胞に対して細胞傷害性である物質の効果は、ＤＮＡの切断、細胞死、オートファジー、アポトーシス、核凝縮、細胞の溶解、壊死、細胞運動性の変化、細胞硬直性の変化、細胞質タンパク質発現の変化、膜タンパク質発現の変化、所望されない細胞分化、膨張、膜完全性の喪失、代謝活性の停止、代謝活性の低下、代謝活性の亢進、反応性酸素分子種の増大、細胞質の収縮、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＤＮＡセンシング経路の産物としての）の産生、またはこれらの任意の組合せを含み得る。炎症促進性サイトカインの非限定的な例は、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）、Ｃ−Ｃモチーフリガンド４（ＣＣＬ４）、Ｃ−Ｃモチーフリガンド５（ＣＣＬ５）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１β）、ＩＬ−１８およびＩＬ−３３を含む。場合によって、細胞傷害作用は、トランス遺伝子またはＴＣＲなど、ポリ核酸の導入の影響を受ける場合がある。細胞傷害作用の変化を、当技術分野で公知である、多数の方式のうちのいずれかにより測定することができる。場合によって、細胞傷害作用の変化は、細胞死または所望されない細胞分化など、細胞傷害作用関連効果の発生の程度および／または頻度に基づき評価することができる。場合によって、細胞傷害作用の低減は、当技術分野で公知のアッセイであって、色素除外、細胞の生存率と関連する形状特徴の検出、損傷および／または死、ならびに目的の細胞型と関連する酵素活性および／または代謝活性の測定など、標準的な検査室法を含むアッセイを使用して、細胞毒性の量を測定することにより評価する。
場合によって、ゲノム移植を経る細胞は、組織または細胞と共培養することにより、活性化させることもでき、拡大することもできる。細胞は、抗原提示細胞であり得る。人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、Ｔ細胞受容体および共刺激性分子に対するリガンドを発現することが可能であり、場合によって、それらの効力および機能を改善しながら、移入のためのＴ細胞を活性化させ、拡大し得る。ａＡＰＣは、Ｔ細胞活性化のための任意の遺伝子を発現するように操作することができる。ａＡＰＣは、Ｔ細胞拡大のための任意の遺伝子を発現するように操作することができる。ａＡＰＣは、ビーズ、細胞、タンパク質、抗体、サイトカイン、またはこれらの任意の組合せであり得る。ａＡＰＣは、ゲノム移植を経る可能性のある細胞の集団へと、シグナルを送達し得る。例えば、ａＡＰＣは、シグナル１、シグナル２、シグナル３、またはこれらの任意の組合せを送達し得る。シグナル１は、抗原認識シグナルであり得る。例えば、シグナル１は、ＴＣＲへの、ペプチド−ＭＨＣ複合体のライゲーション、またはＣＤ３に対するアゴニスト抗体であって、ＣＤ３シグナル−形質導入複合体の活性化をもたらし得るアゴニスト抗体の結合であり得る。シグナル２は、共刺激性シグナルであり得る。例えば、共刺激性シグナルは、それぞれ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＣＤ７０、および４−１ＢＢＬに結合する、抗ＣＤ２８、誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）であり得る。シグナル３は、サイトカインシグナルであり得る。サイトカインは、任意のサイトカインであり得る。サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはこれらの任意の組合せであり得る。
場合によって、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用して、細胞の集団を活性化させ、かつ／または拡大することができる。場合によって、人工抗原提示細胞は、アロ特異性を誘導しえない。ａＡＰＣは場合によって、ＨＬＡを発現しえない。ａＡＰＣは、活性化および／または刺激のために使用し得る遺伝子を安定的に発現するように、遺伝子改変することができる。場合によって、Ｋ５６２細胞を、活性化のために使用することができる。Ｋ５６２細胞はまた、拡大のために使用することもできる。Ｋ５６２細胞は、ヒト赤白血病細胞株であり得る。Ｋ５６２細胞は、目的の遺伝子を発現するように操作することができる。Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡクラスＩ分子、ＨＬＡクラスＩＩ分子、またはＣＤ１ｄ分子を内因的に発現しえないが、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を発現し得る。Ｋ５６２は、シグナル１を、Ｔ細胞へと送達するように操作することができる。例えば、Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡクラスＩを発現するように操作することができる。場合によって、Ｋ５６２細胞は、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４−１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、膜結合型ＩＬ−１５、膜結合型ＩＬ−１７、膜結合型ＩＬ−２１、膜結合型ＩＬ−２、切断型ＣＤ１９、または任意の組合せなど、さらなる分子を発現するように操作することができる。場合によって、操作Ｋ５６２細胞は、ＣＤ８０およびＣＤ８３に加えて、抗ＣＤ３ ｍＡｂの膜形態である、クローンＯＫＴ３を発現し得る。場合によって、操作Ｋ５６２細胞は、ＣＤ８０およびＣＤ８３に加えて、抗ＣＤ３ ｍＡｂの膜形態である、クローンＯＫＴ３、抗ＣＤ２８ ｍＡｂの膜形態を発現し得る。
ａＡＰＣは、ビーズであり得る。球形ポリスチレンビーズを、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体でコーティングし、Ｔ細胞を活性化させるために使用することができる。ビーズは、任意のサイズであり得る。場合によって、ビーズは、３および６マイクロメートルであり得るか、またはほぼこの長さであり得る。ビーズは、４．５マイクロメートルのサイズであり得るか、またはほぼこのサイズであり得る。ビーズは、任意の細胞対ビーズ比で用いることができる。例えば、１ミリメートル当たり１００万個の細胞で、３対１のビーズ対細胞比を使用することができる。ａＡＰＣはまた、剛性球形粒子、ポリスチレンラテックスマイクロビーズ、磁性ナノ粒子または磁性マイクロ粒子、ナノサイズ量子ドット、４、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、非球形粒子、５、カーボンナノチューブバンドル、６、楕円体のＰＬＧＡマイクロ粒子、７、ナノワーム、流体脂質二重層含有系、８、２Ｄ支援型脂質二重層（２Ｄ−ＳＬＢ）、９、リポソーム、１０、ＲＡＦＴソーム／マイクロドメインリポソーム、１１、ＳＬＢ粒子、またはこれらの任意の組合せでもあり得る。
場合によって、ａＡＰＣは、ＣＤ４ Ｔ細胞を拡大し得る。例えば、ａＡＰＣは、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４ Ｔ細胞の抗原プロセシングおよび提示経路を模倣するように操作することができる。Ｋ５６２は、ＨＬＡ−Ｄ、ＤＰα．ＤＰβ鎖、Ｉｉ、ＤＭα、ＤＭβ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、またはこれらの任意の組合せを発現するように操作することができる。例えば、操作Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡ拘束性抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を拡大するために、ＨＬＡ拘束性ペプチドでパルスすることができる。
場合によって、ａＡＰＣの使用は、細胞（例えばＴ細胞）の活性化、拡大、または任意の組合せのために外因的に導入されるサイトカインと組み合わせることができる。細胞はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、ゲノム移植された細胞の、対象への投与の後における、対象の血液中で拡大することもできる。
細胞内ゲノム移植のためのこれらの組成物および方法は、がん治療に、多くの利点をもたらし得る。例えば、これらの組成物および方法は、高効率の遺伝子の移入、発現、細胞生存率の増大、組換え誘導性二本鎖切断の効率的導入、および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構により、相同性により導かれる修復（ＨＤＲ）を優先する工程、および相同な組換え体の効率的回収および拡大をもたらし得る。
細胞内ゲノム移植
細胞内ゲノム移植は、治療適用のために、細胞および核酸を遺伝子改変する方法であり得る。全体を通して記載される組成物および方法は、Ｔ細胞の、生理学的および免疫学的な抗腫瘍効力を撹乱せずに置く方法で腫瘍特異的なＴＣＲの発現のための、核酸を媒介する遺伝子操作工程を使用し得る。効果的な養子細胞移入ベースの免疫療法（ＡＣＴ）は、がん（例えば、転移性がん）患者を処置するのに有用であり得る。例えば、非ウイルス法を使用して、がん細胞上の固有の変異であるネオ抗原を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように、自家末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を改変し、開示される、細胞内ゲノム移植の組成物および方法において使用することができる。
患者のがんにおける、固有の免疫原性変異を認識する、がん特異的ＴＣＲの配列を同定する、１つの例示的な方法は、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５８７９６に記載されている。例えば、トランス遺伝子（例えば、がん特異的ＴＣＲ、または外因性トランス遺伝子）を、ランダム挿入または特異的挿入を使用して、細胞（例えば、Ｔ細胞）のゲノムへと挿入することができる。場合によって、挿入は、ウイルス挿入であり得る。場合によって、挿入は、非ウイルス挿入によるものであり得る（例えば、ミニサークルベクターを用いる）。場合によって、トランス遺伝子のウイルス挿入を、特定のゲノム部位に対してターゲティングするか、または場合によって、トランス遺伝子のウイルス挿入は、ゲノム部位へのランダム挿入であり得る。場合によって、トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ））または核酸（例えば、少なくとも１個の外因性核酸）は、細胞のゲノム中に１回挿入される。場合によって、トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ））または核酸（例えば、少なくとも１個の外因性核酸）は、ゲノム遺伝子座中にランダムに挿入される。場合によって、トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ））または核酸（例えば、少なくとも１個の外因性核酸）は、１つを超えるゲノム遺伝子座中にランダムに挿入される。場合によって、トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ））または核酸（例えば、少なくとも１個の外因性核酸）は、少なくとも１個の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中に挿入される。場合によって、トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子、ＴＣＲ）または核酸（例えば、少なくとも１個の外因性核酸）は、遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中の切断に挿入される。場合によって、１つを超えるトランス遺伝子（例えば、外因性トランス遺伝子、ＴＣＲ）は、細胞のゲノム中に挿入される。場合によって、１つを超えるトランス遺伝子は、１または複数のゲノム遺伝子座中に挿入される。場合によって、トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子）または核酸（例えば、少なくとも１個の外因性核酸）は、少なくとも１個の遺伝子中に挿入される。場合によって、トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子）または核酸（例えば、少なくとも１個の外因性核酸）は、２個またはそれよりも多い遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中に挿入される。場合によって、トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子）または核酸（例えば、少なくとも１個の外因性核酸）は、ランダムおよび／または特異的様式で細胞のゲノム中に挿入される。場合によって、トランス遺伝子は、外因性トランス遺伝子である。場合によって、トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子）は、遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）の少なくとも一部と相補的な操作部位で挟まれる。場合によって、トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子）は、遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中の切断と相補的な操作部位で挟まれる。場合によって、トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子）は、遺伝子中に挿入されない（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ中に挿入されない）。場合によって、トランス遺伝子は、遺伝子中の切断（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ中の切断）に挿入されない。
場合によって、遺伝子改変細胞の集団、または遺伝子改変されたＴＩＬの集団中の細胞の少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子（例えば、外因性ＴＣＲ）を含む。場合によって、本開示の方法はいずれも、遺伝子改変細胞の集団、または遺伝子改変されたＴＩＬの集団中の細胞の少なくとも約もしくは約５％、または少なくとも約もしくは約１０％、または少なくとも約もしくは約１５％、または少なくとも約もしくは約２０％、または少なくとも約もしくは約２５％、または少なくとも約もしくは約３０％、または少なくとも約もしくは約３５％、または少なくとも約もしくは約４０％、または少なくとも約もしくは約４５％、または少なくとも約もしくは約５０％、または少なくとも約もしくは約５５％、または少なくとも約もしくは約６０％、または少なくとも約もしくは約６５％、または少なくとも約もしくは約７０％、または少なくとも約もしくは約７５％、または少なくとも約もしくは約８０％、または少なくとも約もしくは約８５％、または少なくとも約もしくは約９０％、または少なくとも約もしくは約９５％、または少なくとも約もしくは約９７％、または少なくとも約もしくは約９８％、または少なくとも約もしくは約９９％が、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ）を含むような結果をもたらすことができる。場合によって、遺伝子改変細胞の集団中の細胞の少なくとも約もしくは約３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％が、少なくとも１個の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中の切断に組み込まれた少なくとも１個の外因性トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ）を含む。場合によって、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子は、１または複数の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中の切断に組み込まれる。場合によって、遺伝子改変細胞の集団中の細胞の少なくとも約もしくは約３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％が、細胞のゲノム中に組み込まれた少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含む。場合によって、遺伝子改変細胞の集団中の細胞の少なくとも約もしくは約３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％が、ゲノム遺伝子座（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中に組み込まれた少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含む。場合によって、組込みは、ウイルス（例えば、ＡＡＶもしくは修飾ＡＡＶ）または非ウイルス（例えば、ミニサークル）系を含む。
場合によって、本開示は、遺伝子改変細胞の集団および／または腫瘍浸潤リンパ球（例えば、遺伝子改変されたＴＩＬ）の集団ならびに遺伝子改変細胞（例えば、遺伝子改変されたＴＩＬ）の集団を産生する方法を提供する。場合によって、遺伝子改変細胞の前記集団は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の細胞生存率を含む（例えば、細胞生存率は、ＡＡＶベクター（または非ウイルスベクター（例えば、ミニサークルベクター））が細胞の集団に導入された後のある時点で測定される、および／または細胞生存率は、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子が少なくとも１個の細胞のゲノム遺伝子座（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）に組み込まれた後のある時点で測定される）。場合によって、細胞生存率は、ＦＡＣＳによって測定される。場合によって、細胞生存率は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）または非ウイルス（例えば、ミニサークル）ベクターが細胞および／または細胞の集団に導入された、約、少なくとも約、または最大で約４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、２０時間、２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間、１３２時間、１４４時間、１５６時間、１６８時間、１８０時間、１９２時間、２０４時間、２１６時間、２２８時間、２４０時間後、または２４０時間後よりも後に測定される。場合によって、細胞生存率は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）または非ウイルス（例えば、ミニサークル）ベクターが細胞および／または細胞の集団に導入された、約、少なくとも約、または最大で約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、４５日、５０日、６０日、７０日、９０日後、または９０日後よりも後に測定される。場合によって、細胞生存率は、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ）が少なくとも１個の細胞のゲノム遺伝子座（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中に組み込まれた後に測定される。場合によって、細胞生存率は、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ）が少なくとも１個の細胞のゲノム遺伝子座中に組み込まれた、約、少なくとも約、または最大で約４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、２０時間、２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間、１３２時間、１４４時間、１５６時間、１６８時間、１８０時間、１９２時間、２０４時間、２１６時間、２２８時間、２４０時間後、２４０時間後よりも後に、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、４５日、５０日、６０日、７０日、９０日後、または９０日後よりも後に測定される。場合によって、細胞毒性は、ウイルスまたは非ウイルス系が細胞または細胞の集団に導入された後に測定される。場合によって、細胞毒性は、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ）が少なくとも１個の細胞のゲノム遺伝子座（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中に組み込まれた後に測定される。場合によって、細胞毒性は、野生型もしくは非修飾ＡＡＶまたは非ウイルス系（例えば、ミニサークルベクター）が同等の細胞または同等の細胞の集団に導入された場合よりも、修飾ＡＡＶベクターが使用される場合に低い。場合によって、細胞毒性は、非ウイルスベクター（例えば、ミニサークルベクター）が同等の細胞または同等の細胞の集団に導入された場合よりも、ＡＡＶベクターが使用される場合に低い。場合によって、細胞毒性は、フローサイトメトリーによって測定される。場合によって、細胞毒性は、野生型もしくは非修飾ＡＡＶベクターまたはミニサークルベクターを使用して少なくとも１個の外因性トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ）を組み込む場合と比較して、修飾ＡＡＶ、または組換えＡＡＶベクターを使用して少なくとも１個の外因性トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ）を組み込む場合に、約、少なくとも約、または最大で約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％低減される。場合によって、細胞毒性は、ミニサークルベクターまたは別の非ウイルス系を使用して少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込む場合と比較して、ＡＡＶベクターを使用する場合に、約、少なくとも約、または最大で約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％低減される。場合によって、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、修飾ＡＡＶ、ハイブリッドＡＡＶ、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、およびその任意の組合せからなる群から選択される。
場合によって、本明細書で開示される方法は、細胞へと、１または複数の核酸（例えば、第１の核酸および／または第２の核酸）を導入するステップを含む。当業者は、核酸は一般に、その分子が、長鎖に連結された、多くのヌクレオチドからなる物質を指す場合があることを認識するであろう。核酸の非限定的な例は、人工核酸類似体（例えば、ペプチド核酸、モルホリノオリゴマー、ロックト核酸、グリコール核酸、またはトレオース核酸）、環状核酸、ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、プラスミド、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスベクター、ガンマ−レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、ｐｓｉＲＮＡ、および／またはこれらのハイブリッド体もしくは組合せを含む。場合によって、方法は、核酸を含むことが可能であり、核酸は、合成核酸である。場合によって、試料は、核酸を含むことが可能であり、核酸は、断片化することができる。場合によって、核酸は、ミニサークルである。
場合によって、核酸は、プロモーター領域、バーコード、制限部位、切断部位、エンドヌクレアーゼ認識部位、プライマー結合部位、選択用マーカー、固有の識別配列、耐性遺伝子、リンカー配列、またはこれらの任意の組合せを含み得る。核酸は、細菌を使用することなく作製することができる。例えば、核酸は、低減された微量の細菌性要素を有する、または細菌性要素を完全に含まない場合がある。プラスミドベクターと比較した場合、核酸は、ＰＣＲによって測定して、２０％〜４０％、４０％〜６０％、６０％〜８０％、または８０％〜１００％、プラスミドベクターよりも少ない細菌の痕跡を有し得る。プラスミドベクターと比較した場合、核酸は、ＰＣＲによって測定して、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％から、または最大で１００％、プラスミドベクターよりも少ない細菌の痕跡を有し得る。一部の態様では、これらの部位は、酵素的消化、増幅、シーケンシング、結合のターゲティング、精製、耐性特性（例えば、抗生物質耐性）の付与、またはこれらの任意の組合せに有用であり得る。場合によって、核酸は、１または複数の制限部位を含み得る。制限部位は一般に、部位特異的分子（例えば、プロテアーゼ、エンドヌクレアーゼ、または酵素）が、核酸を切断し得る、特異的ペプチド配列または特異的ヌクレオチド配列を指す場合がある。一例では、核酸は、１または複数の制限部位を含むことが可能であり、この場合、制限部位における核酸の切断は、核酸を断片化する。場合によって、核酸は、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ認識部位を含み得る。
場合によって、核酸は、別の核酸にたやすく結合し得る（例えば、核酸は、粘着末端またはヌクレオチドの突出を含む）。例えば、核酸は、核酸の第１の末端において、突出を含み得る。一般に、粘着末端または突出とは、核酸の末端における、一連の非対合ヌクレオチドを指す場合がある。場合によって、核酸は、核酸の１または複数の末端において、一本鎖突出を含み得る。場合によって、突出は、核酸の３’末端において生じ得る。場合によって、突出は、核酸の５’末端において生じ得る。突出は、任意の数のヌクレオチドを含み得る。例えば、突出は、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、または５もしくはそれよりも多いヌクレオチドを含み得る。場合によって、核酸は、別の核酸への結合の前に、修飾を要求し得る（例えば、核酸は、エンドヌクレアーゼによる消化を必要とし得る）。場合によって、核酸の修飾により、ヌクレオチドの突出を作製することができ、突出は、任意の数のヌクレオチドを含み得る。例えば、突出は、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、または５もしくはそれよりも多いヌクレオチドを含み得る。一例では、核酸は、制限部位を含むことが可能であり、この場合、核酸を、制限部位において、制限酵素（例えば、ＮｏｔＩ）で消化することにより、４ヌクレオチドの突出を産生する。場合によって、修飾は、核酸の１または複数の末端において、平滑末端を作製することを含む。一般に、平滑末端とは、両方の鎖が、塩基対で終結する二本鎖核酸を指す場合がある。一例では、核酸は、制限部位を含むことが可能であり、この場合、核酸を、制限部位において、制限酵素（例えば、ＢｓａＩ）で消化することにより、平滑末端を産生する。
プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の結合を制御し、遺伝子転写の効率、遺伝子が、細胞内のどこで発現し得るのか、および／または遺伝子を、どの細胞型内で発現し得るのかに対して大きな影響を及ぼし得る核酸配列である。プロモーターの非限定的な例は、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｃｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、ｓｉｍｉａｎ ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ（ＳＶ４０）ウイルスプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーター、ヒトベータアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＵＡＳプロモーター、Ａｃｔｉｎ５ｃ（Ａｃ５）プロモーター、ポリヘドロンプロモーター、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩａ）プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、グリセルアルデヒド３−三リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｇｅ）デヒドロゲナーゼ（ＧＤＳ）プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｕｂｉプロモーター、ヒトポリメラーゼＩＩＩ ＲＮＡ（Ｈ１）プロモーター、Ｕ６プロモーター、またはこれらの組合せを含む。
プロモーターは、ＣＭＶ、Ｕ６、ＭＮＤ、またはＥＦ１ａであり得る（図１５５Ａ）。場合によって、プロモーターは、外因性ＴＣＲ配列と隣接し得る。場合によって、ｒＡＡＶベクターは、スプライシングアクセプターをさらに含み得る。場合によって、スプライシングアクセプターは、外因性ＴＣＲ配列と隣接し得る。プロモーター配列は、ＰＫＧプロモーターまたはＭＮＤプロモーターであり得る（図１５５Ｂ）。ＭＮＤプロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを伴う修飾ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーターであり得る。
ウィルスベクター
場合によって、ウイルスベクターを用いて、トランス遺伝子を細胞中に導入することができる。ウイルスベクターは、限定されるものではないが、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノ随伴ウイルスであり得る。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターであってよい（図１３９および図１４０）。場合によって、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクター、変異体ＡＡＶベクター、およびこれらの任意の組合せであり得る。場合によって、アデノ随伴ウイルスを使用して、外因性トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子）を導入することができる。ウイルスベクターは、場合によって、同質遺伝子的であり得る。場合によって、ウイルスベクターを、既知のＳＮＰを含むゲノムの一部に組み込むことができる。他の場合、ウイルスベクターを、既知のＳＮＰを含むゲノムの一部に組み込まなくてもよい。例えば、ｒＡＡＶを対象自身のゲノムＤＮＡと同質遺伝子的または相同であるようにデザインすることができる。場合によって、同質遺伝子的ベクターは、相同組換えの効率を改善しうる。場合によって、ｇＲＮＡを、それが既知のＳＮＰを含む領域をターゲティングしないようにデザインして、組み込まれたベクタートランス遺伝子の発現を改善することができる。ＰＤ−１、ＣＩＳＨ、ＡＡＶＳ１、およびＣＴＬＡ−４などの、チェックポイント遺伝子でのＳＮＰの頻度を決定することができる（図１４１Ａ、図１４１Ｂ、および図１４２）。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非病原性の一本鎖ＤＮＡパルボウイルスであり得る。ＡＡＶは、約２６ｎｍのカプシド直径を有し得る。場合によって、カプシド直径はまた、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍであり得る。ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡゲノムの各末端はＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）を含有し得、これはゲノム複製およびパッケージングに必要とされる唯一のシス作用性エレメントであり得る。ゲノムは２つのウイルス遺伝子：ｒｅｐおよびｃａｐを保有する。ウイルスは、２つのプロモーターおよび選択的スプライシングを用いて、複製に必要な４つのタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）を産生し、一方で第３のプロモーターは、選択的スプライシングおよび代替翻訳開始コドンの組合せを通じて、３つのウイルスカプシド構造タンパク質１、２、および３（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）の転写物を産生する。３つのカプシドタンパク質は、同一のＣ末端５３３アミノ酸を共有し、一方でＶＰ２およびＶＰ１は、それぞれ６５アミノ酸および２０２アミノ酸の、追加のＮ末端配列を含有する。ＡＡＶビリオンは、Ｔ＝１の正二十面体対称に配置されている、全部で６０コピーのＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を、１：１：２０の比率で含むことができる。
細胞レベルにおいて、ＡＡＶは、遺伝子発現を達成する前に５つの主要なステップを経ることができる：１）細胞表面受容体への結合または付着、２）エンドサイトーシス、３）核へのトラフィッキング、４）ゲノムを放出するためのウイルスの脱コート、および５）一本鎖から、核内での転写のための鋳型としての二本鎖ＤＮＡへのゲノムの変換。ｒＡＡＶが各個別のステップを成功裏に実行することができる累積効率により、全体の形質導入効率を決定することができる。ｒＡＡＶの形質導入における律速ステップには、ウイルスの付着および内在化に必要な細胞表面受容体が存在しないまたは少量であること、リソソーム分解をもたらす非効率的なエンドソーム脱出、および一本鎖から二本鎖ＤＮＡ鋳型への遅い変換が含まれ得る。したがって、遺伝子治療のための、細胞または組織へのより効率的な、またはより特異的な形質導入を容易にするために、ゲノムおよび／またはカプシドに対する修飾を有するベクターを設計することができる。
場合によって、ウイルスカプシドは修飾されていてもよい。修飾は、カプシド構成要素の組合せを修飾することを含み得る。例えば、モザイクカプシドＡＡＶは、異なる血清型由来のウイルスカプシドタンパク質の混合物から構成され得るビリオンである。カプシドタンパク質は、種々の比率で混合された個別のプラスミドによる補完によって提供され得る。ウイルスのアセンブリー中、補完プラスミドの比率を化学量論的に反映したサブユニット比率で、異なる血清型のカプシドタンパク質を各ビリオンに混合することができる。モザイクカプシドは、非修飾カプシドと比較して、ある特定の細胞型に対する結合効率の増大または性能の向上をもたらすことができる。
場合によって、キメラカプシドＡＡＶを作製することができる。キメラカプシドは、別の野生型（ｗｔ）ＡＡＶ配列または無関係のタンパク質のいずれかに由来する外来タンパク質配列の、カプシド遺伝子のオープンリーディングフレームへの挿入を有し得る。キメラ修飾は、特定の機能を欠いており、別のカプシド由来のＤＮＡ配列と共トランスフェクトされるＡＡＶカプシド配列を含み得る、天然に存在する血清型の、鋳型としての使用を含み得る。相同組換えは交叉点で起こり、新たな特色および固有の特性を有するカプシドをもたらす。他の場合には、カプシドコード配列のＮまたはＣ末端のいずれかに融合したエピトープコード配列を使用して、遺伝子機能に影響を及ぼさずにウイルスカプシドの表面に新たなペプチドを露出させることを試みている。しかしながら、場合によって、カプシドコード配列の特定の位置へと挿入されたエピトープ配列の使用は、コード配列自体にエピトープをタグ付けする異なる手法を使用して実施することができる。キメラカプシドはまた、カプシドコード配列中の特定の位置へと挿入されたペプチドライブラリーから同定されたエピトープの使用を含み得る。スクリーニングのための遺伝子ライブラリーの使用も実施することができる。スクリーニングにより、意図通りに機能しない挿入を捕捉することができ、続いてこれを除去することができる。ｒＡＡＶベクター中のキメラカプシドは、トランスフェクトすることができる細胞型の範囲を拡大することができ、形質導入の効率を増大させることができる。形質導入の増大は、非修飾カプシドを使用した形質導入と比較して、約１０％の増大〜約３００％の増大であり得る。キメラカプシドは、縮重、組換え、シャッフルまたは他の方法で修飾されたＣａｐタンパク質を含有し得る。例えば、ＶＰタンパク質のＮ末端への受容体特異的リガンドまたは単鎖抗体の挿入のターゲティングを実施することができる。リンパ球抗体または標的のＡＡＶへの挿入は、Ｔ細胞の結合および感染を改善するために実施することができる。
場合によって、キメラＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質における修飾（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３カプシドタンパク質における修飾）を有し得る。場合によって、ＡＡＶベクターは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシド遺伝子配列の少なくとも１つにおける修飾を含む。場合によって、少なくとも１つのカプシド遺伝子は、ＡＡＶから除去され得る。場合によって、ＡＡＶベクターは、１または複数のカプシド遺伝子配列の欠失を含み得る。場合によって、ＡＡＶベクターは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシド遺伝子配列のうちの少なくとも１つにおける少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を有し得る。
場合によって、キメラカプシド（例えば、縮重または他の方法で修飾されたＣａｐタンパク質を含有するカプシド）を有するビリオンを作製することができる。そのようなビリオンのカプシドをさらに変化するために、例えば、リンパ球などの特定の細胞型に対する結合親和性を増強または修飾するために、さらなる変異をビリオンのカプシドへと導入することができる。例えば、適切なキメラカプシドは、特定の細胞型に対するウイルスのターゲティングを容易にするためにリガンド挿入変異を有し得る。挿入変異体、アラニンスクリーニング変異体、およびエピトープタグ変異体を含むＡＡＶカプシド変異体の構築および特徴付けについては、Wuら、J. Virol.７４巻：８６３５〜４５頁、２０００年に記載されている。ＡＡＶカプシド変異体を作製する方法は公知であり、部位特異的変異誘発（Wuら、J. Virol.７２巻：５９１９〜５９２６頁）；分子育種、核酸、エクソン、およびＤＮＡファミリーシャッフリング（Soongら、Nat. Genet.２５巻：４３６〜４３９頁、２０００年；Cocoら、Nature Biotech.２００１年；１９巻：３５４頁；ならびに米国特許第５，８３７，４５８号；同第５，８１１，２３８号；および同第６，１８０，４０６号；KolkmanおよびStemmer、Nat. Biotech.１９巻：４２３〜４２８頁、２００１年；Fischら、Proceedings of the National Academy of Sciences９３巻：７７６１〜７７６６頁、１９９６年；Christiansら、Nat. Biotech.１７巻：２５９〜２６４頁、１９９９年）；リガンド挿入（Girodら、Nat. Med.９巻：１０５２〜１０５６頁、１９９９年）；カセット変異誘発（Ruedaら、Virology２６３巻：８９〜９９頁、１９９９年；Boyerら、J. Virol.６６巻：１０３１〜１０３９頁、１９９２年）；ならびに短いランダムオリゴヌクレオチド配列の挿入を含む。
場合によって、カプシド転換を実施することができる。カプシド転換は、ある血清型のＡＡＶのＩＴＲを異なる血清型のカプシドにパッケージングすることを含むプロセスであり得る。別の場合には、ＡＡＶカプシド表面への受容体リガンドの吸着を実施することができ、ＡＡＶカプシドの表面への外来ペプチドの付加であり得る。場合によって、これは、ＡＡＶ血清型が現在指向性を有していない細胞に対して特異的にターゲティングする能力を付与することができ、これは遺伝子治療ツールとしてのＡＡＶの使用を大幅に拡大することができる。
場合によって、ｒＡＡＶベクターを修飾することができる。例えば、ｒＡＡＶベクターは、挿入、欠失、化学的変化、または合成修飾などの修飾を含み得る。場合によって、単一のヌクレオチドを、ｒＡＡＶベクター中に挿入する。他の場合、複数のヌクレオチドをベクター中に挿入する。挿入することができるヌクレオチドは、約１ヌクレオチド〜約５ｋｂの範囲であり得る。挿入することができるヌクレオチドは、機能的タンパク質をコードしうる。挿入することができるヌクレオチドは、ベクターを受容する対象に対して内因性または外因性であり得る。例えば、ヒト細胞は、ＴＣＲの一部などの、マウスゲノムの少なくとも一部を含有しうるｒＡＡＶベクターを受容しうる。場合によって、ｒＡＡＶの挿入または欠失などの修飾は、ベクターのタンパク質コード領域または非コード領域を含み得る。場合によって、修飾は、細胞に導入された場合、ベクターの活性を改善してもよい。例えば、修飾は、ヒト細胞に導入された場合、ベクターのタンパク質コード領域の発現を改善しうる。
場合によって、本開示は、ｒＡＡＶベクター（例えば、外因性受容体配列をコードするベクター）およびキメラカプシド（例えば、縮重、組換え、シャッフルまたは他の方法で修飾されたＣａｐタンパク質を含有するカプシド）から構成されるビリオンのストックを産生するためのＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をもたらすヘルパーベクターの構築を提供する。場合によって、修飾は、修飾されているＡＡＶのｃａｐ核酸、例えば、１つより多いＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ血清型１〜８）に由来する配列の一部を含有するｃａｐ核酸の産生を含み得る。そのようなキメラ核酸は、いくつかの変異誘発技術によって産生することができる。キメラｃａｐ遺伝子を作製するための方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ増幅反応における縮重オリゴヌクレオチドの使用を含み得る。縮重変異（例えば、異なるＡＡＶ血清型由来の多型）の核酸配列への組込みのためのプロトコールは、Cocoら（Nature Biotechnology２０巻：１２４６〜１２５０頁、２００２年）において記載される。縮重ホモ二本鎖組換えとして公知の、この方法では、遺伝子ファミリー内の遺伝子由来の多型（縮重）を含有する「トップストランド」オリゴヌクレオチドが構築される。相補的縮重が、複数の架橋「足場」オリゴヌクレオチドに、操作により導入されている。アニーリング、ギャップ充填、およびライゲーションステップの単一の配列は、親多型のあらゆる可能な順列を捕捉する核酸のライブラリーの産生をもたらす。カプシド遺伝子の任意の部分は、縮重ホモ二本鎖組換えなどの方法を使用して変異させることができる。しかしながら、特定のカプシド遺伝子配列が好ましい。例えば、ＡＡＶ２カプシドの、その細胞表面受容体のヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）への結合を担う重要な残基がマッピングされている。５８５位および５８８位のアルギニン残基は、これらの残基内の非保存的変異がヘパリン−アガロースへの結合を排除するので、結合に重要であると思われる。ＡＡＶ２およびＡＡＶ４原子構造のコンピューターによるモデリングは、アルギニン残基５８５および５８８と重複し、カプシドの表面に露出している７つの超可変領域を同定した。これらの超可変領域は、受容体結合を媒介するカプシドの表面ループとして露出していると考えられている。したがって、これらのループは、野生型ビリオンとは異なる指向性を有するキメラビリオンを産生する方法における変異誘発のための標的として使用され得る。場合によって、修飾は、ＡＡＶ血清型６カプシドのものであり得る。
本開示の方法において使用され得る別の変異誘発技術はＤＮＡシャフリングである。ＤＮＡまたは遺伝子シャフリングは、遺伝子ファミリーのメンバーのランダム断片の創出およびこれらの組換えを含み、多くの新たな組合せをもたらす。ＡＡＶカプシド遺伝子をシャッフルするためには、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の関与ならびに８つの血清型間の異なる程度の相同性を含む、いくつかのパラメータを考慮することができる。細胞特異的または組織特異的指向性を有する生存可能なｒｃＡＡＶベクターを得る可能性を高めるために、例えば、高い多様性および多数の順列をもたらすシャフリングプロトコールが好ましい。キメラｒｃＡＡＶの作製のためのＤＮＡシャフリングプロトコールの例は、一過性の鋳型でのランダムキメラ生成（ＲＡＣＨＩＴＴ）である（Cocoら、Nat. Biotech.１９巻：３５４〜３５８頁、２００１年）。ＲＡＣＨＩＴＴ法は、２つの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ ５ｄ ＡＡＶ６）のＡＡＶゲノム由来の２つのＰＣＲ断片を組み換えるために使用できる。例えば、８５％同一であり、約１ｋｂｐにわたり、３つ全ての遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）の開始コドンを含むセグメントであるｃａｐ遺伝子の保存領域は、ｉｎ ｖｉｖｏシャフリングプロトコール（米国特許第５，０９３，２５７号；Volkovら、NAR２７巻：ｅ１８頁、１９９９年；および、Wang P. L. 、Dis. Markers１６巻：３〜１３頁２０００年）を含む、ＲＡＴＣＨＩＴＴまたは他のＤＮＡシャフリングプロトコールを使用して、シャッフルすることができる。得られたコンビナトリアルキメラライブラリーは、ＷＴ ＡＡＶゲノムのそれぞれの断片を置き換えるために適切なＡＡＶ ＴＲ含有ベクターにクローニングすることができる。ランダムクローンは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ７ Ｓｕｉｔｅ ＳｏｆｔｗａｒｅのＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用してシーケンシングし、親ゲノムとアラインメントさせることができる。シーケンシングおよびアラインメントから、１Ｋｂｐの遺伝子当たりの組換え交叉の数を決定することができる。代替的に、ＡＡＶゲノムの可変ドメインは、本開示の方法を使用してシャッフルすることができる。例えば、変異は、ＶＰ３において粒子表面ループを形成する可能性のある、ＡＡＶの２つのアミノ酸クラスター（アミノ酸５０９〜５２２および５６１〜５９１）内に作製することができる。この低相同性ドメインをシャッフルするために、親の相同性と無関係である組換えプロトコール（Ostermeierら、Nat. Biotechnol.１７巻：１２０５〜１２０９頁、１９９９年；Lutzら、Proceedings of the National Academy of Sciences９８巻：１１２４８〜１１２５３頁、２００１年；およびLutzら、NAR２９巻：Ｅ１６頁、２００１年）、または、低相同性のＤＮＡ断片をアニールおよび組換えするよう修飾されたＲＡＣＨＩＴＴプロトコールを用いることができる。
場合によって、ＡＡＶカプシド上のＳ／Ｔ／Ｋ残基のターゲティングされた変異を実施することができる。受容体媒介性エンドサイトーシスによるＡＡＶの細胞内在化の後、それは細胞質ゾルを通って移動し、放出される前にエンドソーム中で酸性化を受けうる。エンドソーム脱出の後、ＡＡＶは核輸送を受け、そこで、ウイルスカプシドの脱殻が起こり、そのゲノムの放出および遺伝子発現の誘導をもたらす。Ｓ／Ｔ／Ｋ残基は、カプシドタンパク質のプロテアソーム分解のための合図として働くリン酸化およびその後のポリユビキチン化のための潜在的な部位である。これは、ベクターの核への輸送を防止して、そのトランス遺伝子である外因性ＴＣＲを発現させ、低い遺伝子発現をもたらすことができる。また、プロテアソーム分解されたカプシド断片は、ＣＤ８ Ｔ細胞認識のために細胞表面上にＭＨＣ−クラスＩ分子によって提示されうる。これは、免疫応答をもたらし、かくして、形質導入された細胞を破壊し、さらに、持続的なトランス遺伝子発現を減少させる。Ｓ／ＴからＡおよびＫからＲへの点変異は、カプシド上のリン酸化部位を防止する／減少させることができる。これは、ユビキチン化およびプロテオソーム分解の減少をもたらし、より多数の無傷ベクターが核に進入し、トランス遺伝子を発現することができる。カプシド分解全体の防止／低下はまた、Ｔ細胞への抗原提示を減少させ、ベクターに対するより低い宿主免疫応答をもたらす。
一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲに挟まれる目的のヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクターは、異種配列をＡＡＶベクターへと直接挿入することによって構築することができる。これらの構築物は当技術分野で周知の技術を使用して設計することができる。例えば、Carter B、Adeno-associated virus vectors、Curr. Opin. Biotechnol.、３巻：５３３〜５３９頁（１９９２年）；およびKotin RM、Prospects for the use of adeno-associated virus as a vector for human gene therapy、Hum Gene Ther５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）を参照されたい。
場合によって、ＡＡＶ発現ベクターは、治療効果を有するトランス遺伝子などの目的の異種核酸配列を含む。ｒＡＡＶビリオンは、当技術分野で公知の方法を使用して構築することができる。例えば、Koerberら（２００９年）Mol. Ther.１７巻：２０８８頁；Koerberら（２００８年）Mol Ther.１６巻：１７０３〜１７０９頁；米国特許第７，４３９，０６５号および同第６，４９１，９０７号を参照されたい。例えば、外因性配列または異種性配列は、ＡＡＶゲノムへと挿入することができ、そこではその主要なＡＡＶオープンリーディングフレームがこれらから切り出されている。ＡＡＶゲノムの他の部分も削除することができ、ＩＴＲのある特定の部分は複製およびパッケージング機能を支援するために無傷のままである。そのような構築物は当技術分野で周知の技術を使用して設計することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；Lebkowskiら（１９８８年）Molec. Cell. Biol.８巻：３９８８〜３９９６頁を参照されたい。
本出願は、細胞中で目的の１または複数のタンパク質を発現しうる組換えＡＡＶを産生するための方法および材料を提供する。本明細書に記載されるように、本明細書に開示される方法および材料は、ｉｎ ｖｉｖｏで治療効果を達成しうるレベルの目的のタンパク質の高い産生または産生を可能にする。目的のタンパク質の例は、外因性受容体である。外因性受容体は、ＴＣＲであり得る。
一般に、ｒＡＡＶビリオンもしくはｒＡＡＶウイルス粒子、またはＡＡＶ発現ベクターは、トランスフェクションによるなどの公知の技術を使用して適切な宿主細胞へと導入される。トランスフェクション技術は当技術分野で公知である。例えば、Grahamら（１９７３年）Virology、５２巻：４５６頁、Sambrookら（１９８９年）Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratories、New York、Davisら（１９８６年）Basic Methods in Molecular Biology、Elsevier、およびChuら（１９８１年）Gene１３巻：１９７頁を参照されたい。適切なトランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈法、直接マイクロインジェクション、電気穿孔、リポソームを媒介する遺伝子導入、および高速マイクロプロジェクタイルを使用した核酸送達が含まれ、これらは当技術分野で公知である。
場合によって、組換えＡＡＶを産生するための方法は、本明細書で記載されるようなＡＡＶの５’ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）および３’ＡＡＶ ＩＴＲを含むウイルス構築物、増殖性ＡＡＶ感染を生じさせためのヘルパー機能、ならびにＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を有するパッケージング細胞株を提供するステップと、パッケージング細胞株の上清から組換えＡＡＶを回収するステップとを含む。パッケージング細胞株としては様々な種類の細胞を使用することができる。例えば、使用することができるパッケージング細胞株には、ほんの数例を挙げると、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＶｅｒｏ細胞が含まれるが、これらに限定されない。場合によって、パッケージング細胞株の上清を、ウイルスを濃縮するためにＰＥＧ沈殿によって処理する。他の場合には、遠心分離ステップを使用してウイルスを濃縮することができる。例えば、カラムを使用して遠心分離中にウイルスを濃縮することができる。場合によって、沈殿は、約４℃以下（例えば、約３℃、約２℃、約１℃、または約１℃）で少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１２時間、または少なくとも約２４時間で起きる。場合によって、組換えＡＡＶを、ＰＥＧ沈殿上清から、低速遠心分離とそれに続くＣｓＣｌ勾配によって単離する。低速遠心分離は、約４０００ｒｐｍ、約４５００ｒｐｍ、約５０００ｒｐｍ、または約６０００ｒｐｍで、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間または約６０分間であり得る。場合によって、約５０００ｒｐｍで約３０分間の遠心分離とそれに続くＣｓＣｌ勾配により、組換えＡＡＶをＰＥＧ沈殿上清から単離する。
場合によって、ヘルパー機能は、アデノウイルスヘルパー遺伝子を含む１または複数のヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルスによって提供される。アデノウイルスヘルパー遺伝子の非限定的な例には、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡが含まれ、これらは、ＡＡＶパッケージングにヘルパー機能を提供することができる。場合によって、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子はプラスミド中に存在し得る。プラスミドはＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をさらに含み得る。
血清学は、ある血清型のウイルスカプシドタンパク質に反応する抗体が、別の血清型のこれらを中和することができないこととして規定することができる。場合によって、任意のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびこれらの任意の変異体または誘導体を含むが、これらに限定されない）由来のｃａｐ遺伝子および／またはｒｅｐ遺伝子は、本明細書において、目的の１または複数のタンパク質を発現するための、本明細書で開示される組換えＡＡＶを産生するのに使用することができる。アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ５もしくはＡＡＶ６またはこれらの変異体であり得る。場合によって、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、血清型１、血清型２、血清型３、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、血清型１０、血清型１１、血清型１２、またはこれらの変異体由来のカプシドをコードし得る。場合によって、パッケージング細胞株に、ヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルス、ウイルス構築物、およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドをトランスフェクトすることができ、共トランスフェクション後の様々な時点で組換えＡＡＶウイルスを回収することができる。例えば、組換えＡＡＶウイルスは、共トランスフェクション後、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、またはこれら２つの時点のいずれかの間の時間で収集することができる。
ＡＡＶのヘルパーウイルスは当技術分野で公知であり、例えば、アデノウイルス科およびヘルペスウイルス科に由来するウイルスが含まれる。ＡＡＶのヘルパーウイルスの例には、米国特許出願公開第２０１１０２０１０８８号に記載されるＳＡｄＶ−１３ヘルパーウイルスおよびＳＡｄＶ−１３様ヘルパーウイルス、ヘルパーベクターｐＨＥＬＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｍｉｃｓ）が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、ＡＡＶに十分なヘルパー機能を提供することができるＡＡＶの任意のヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドを本明細書において使用できることを理解するであろう。本明細書で開示される組換えＡＡＶウイルスはまた、感染性組換えＡＡＶを産生するのに適した当技術分野で公知の任意の従来の方法を使用して産生され得る。場合によって、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子産生のために必要な構成要素のいくつかを安定に発現する細胞株を使用することによって産生され得る。例えば、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子などの選択用マーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）は、細胞（パッケージング細胞）のゲノムへと組み込むことができる。したがって、パッケージング細胞株は、ヘルパーウイルス（例えば、ヘルパー機能を提供するアデノウイルス）、ならびに５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲおよび目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターによって共感染することができる。別の非限定的な例では、プラスミドではなくアデノウイルまたはバキュロウイルスを使用して、パッケージング細胞へとｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を導入することができる。さらに別の非限定的な例として、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲを含有するウイルスベクターとｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子を含有するウイルスベクターとの両方が産生細胞のＤＮＡへと安定に組み込まれ得、組換えＡＡＶを産生するためにヘルパー機能を野生型アデノウイルスによって提供することができる。
ｒＡＡＶビリオンまたはウイルス粒子を産生するために使用することができる適切な宿主細胞としては、酵母細胞、昆虫細胞、微生物、および哺乳動物細胞が挙げられる。限定されるものではないが、２９３細胞などの様々な安定なヒト細胞株を使用することができる。宿主細胞を操作して、ヘルパー機能を提供し、ＡＡＶ ＩＴＲで挟まれるヌクレオチド配列を複製およびカプシドで包み、ウイルス粒子またはＡＡＶビリオンを産生することができる。ＡＡＶヘルパー機能を、ＡＡＶの複製およびパッケージングのためにトランスにＡＡＶ遺伝子産物を提供するために宿主細胞中で発現されるＡＡＶ由来コード配列によって提供することができる。ＡＡＶウイルスを、複製可能または複製欠損にすることができる。一般に、複製欠損ＡＡＶウイルスは、１または複数のＡＡＶパッケージング遺伝子を欠く。細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで、本明細書に記載のウイルスベクター、ウイルス粒子、またはウイルスと接触させることができる。場合によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで接触される細胞は、対象に戻すためにｅｘ ｖｉｖｏで改変された、確立された細胞株もしくは対象に由来する初代細胞に由来するか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養物中で増殖させることができる。一部の態様では、ウイルスを使用して、ｅｘ ｖｉｖｏでウイルスベクターを初代細胞中に送達して、外因性核酸配列、トランス遺伝子、または操作細胞受容体を免疫細胞、または特に、Ｔ細胞に導入するなど、細胞を改変した後、そのような改変細胞を対象に戻す前に培養物中で拡大し、選択し、または限定回数の継代を行う。一部の態様では、そのような改変細胞を細胞ベース療法において使用して、がんなどの疾患または状態を処置する。場合によって、初代細胞は、初代リンパ球であり得る。場合によって、初代細胞の集団は、初代リンパ球の集団であり得る。場合によって、初代細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。場合によって、初代細胞の集団は、ＴＩＬの集団である。
場合によって、組換えＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ではない。ＡＡＶを精製するために適した任意の従来の方法は、組換えＡＡＶを精製するために本明細書で記載される実施形態において使用され得る。例えば、組換え体は、パッケージング細胞および／またはパッケージング細胞の上清から単離および精製することができる。場合によって、ＡＡＶは、ＣｓＣｌ勾配を使用する分離方法によって精製され得る。同様に、米国特許出願公開第２００２０１３６７１０号は、ＡＡＶ付着を媒介する人工受容体または受容体様分子が固定化されているマトリックスを含む固体支持体を使用して、試料からＡＡＶを単離および精製する、ＡＡＶを精製するための方法の別の非限定的な例を記載する。
場合によって、細胞の集団に、例えば、ウイルスベクター、ＡＡＶ、修飾ＡＡＶ、またはｒＡＡＶを形質導入することができる。ウイルスの形質導入は、ＣＲＩＳＰＲ系を用いるゲノム破壊の前、ＣＲＩＳＰＲ系を用いるゲノム破壊の後、またはＣＲＩＳＰＲ系を用いるゲノム破壊と同時に行うことができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ系を用いるゲノム破壊は、外因性ポリ核酸の、ゲノムの一部への組込みを容易としうる。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、免疫チェックポイント遺伝子またはセーフハーバー遺伝子座などの遺伝子を含むゲノムの一部に二本鎖切断を導入することができる。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、少なくとも１個の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中に切断を導入することができる。二本鎖切断を、場合によって、ウイルスベクター、ＡＡＶまたは修飾ＡＡＶまたはｒＡＡＶによって細胞に送達される外因性受容体配列を導入することによって修復することができる。場合によって、二本鎖切断を、前記切断中に外因性トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ）を組み込むことによって修復することができる。ＡＡＶまたは修飾ＡＡＶまたはｒＡＡＶは、ＣＲＩＳＰＲ系によって破壊される遺伝子の一部に対する組換えアームを有するポリ核酸を含み得る。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系は、ガイドポリ核酸を含む。場合によって、ガイドポリ核酸は、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）および／またはガイドデオキシリボ核酸（ｇＤＮＡ）である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ遺伝子に二本鎖切断を導入してもよい。次いで、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ系によって予め破壊されたゲノムの一部と相補的な領域を有する組換えアームで挟まれうるトランス遺伝子（例えば、外因性ＴＣＲをコードするトランス遺伝子）の導入によって修復することができる。ゲノム破壊およびウイルス導入を含む細胞の集団を形質導入することができる。形質導入された細胞の集団は、約５％〜約１００％であり得る。例えば、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または最大で約１００％の細胞の集団を形質導入することができる。
場合によって、ウイルス（例えば、ＡＡＶもしくは修飾ＡＡＶ）および／またはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクターもしくは修飾ＡＡＶベクター）、および／または非ウイルスベクター（例えば、ミニサークルベクター）を、ＣＲＩＳＰＲ系の後、またはヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの後、またはガイドポリ核酸を細胞もしくは細胞の集団に導入した後、約、少なくとも約、または最大で約１〜３時間、３〜６時間、６〜９時間、９〜１２時間、１２〜１５時間、１５〜１８時間、１８〜２１時間、２１〜２３時間、２３〜２６時間、２６〜２９時間、２９〜３１時間、３１〜３３時間、３３〜３５時間、３５〜３７時間、３７〜３９時間、３９〜４１時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１４日、１６日、２０日で、または２０日よりも後に前記細胞または細胞の前記集団に導入する。場合によって、ウイルスベクターは、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含む（例えば、ＡＡＶベクターは、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含む）。場合によって、非ウイルスベクターは、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含む（例えば、ミニサークルベクターは、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含む）。場合によって、ＡＡＶベクター（例えば、修飾ＡＡＶベクター）は、少なくとも１個の外因性核酸を含む。場合によって、ＡＡＶベクター（例えば、修飾ＡＡＶベクター）を、少なくとも１個の外因性核酸を少なくとも１個の細胞のゲノム遺伝子座に組み込むために細胞の集団中の少なくとも１個の細胞に導入する。
場合によって、核酸は、バーコードまたはバーコード配列を含み得る。バーコードまたはバーコード配列とは、ポリヌクレオチドにより構成される、天然または合成の核酸配列であって、前記バーコード配列を有するポリヌクレオチドにより構成される、ポリヌクレオチドおよび他の配列の一義的な識別を可能とする核酸配列に関する。例えば、バーコードを含む核酸は、コードされるトランス遺伝子の識別を可能とし得る。バーコード配列は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、４５、または５０もしくはそれよりも多い連続ヌクレオチドの配列を含み得る。核酸は、２つまたはそれよりも多いバーコード配列またはそれらの相補体を含み得る。バーコード配列は、ランダムにアセンブルされたヌクレオチド配列を含み得る。バーコード配列は、縮重配列であり得る。バーコード配列は、公知の配列であり得る。バーコード配列は、あらかじめ規定された配列であり得る。
場合によって、本明細書で開示される方法は、核酸（例えば、第１の核酸および／または第２の核酸）を含み得る。場合によって、核酸は、トランス遺伝子をコードし得る。一般に、トランス遺伝子とは、複数のヌクレオチドサブユニットを含む直鎖状ポリマーを指す場合がある。トランス遺伝子は、任意の数のヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、約１００未満のヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、少なくとも約１００ヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、少なくとも約２００ヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、少なくとも約３００ヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、少なくとも約４００ヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、少なくとも約５００ヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、少なくとも約１０００ヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、少なくとも約５０００ヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、少なくとも約１０，０００ヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、少なくとも約２０，０００ヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、少なくとも約３０，０００ヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、少なくとも約４０，０００ヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、少なくとも約５０，０００ヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、約５００〜約５０００の間のヌクレオチドを含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、約５０００〜約１０，０００の間のヌクレオチドを含み得る。本明細書で開示される場合のうちのいずれかでは、トランス遺伝子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッド体を含み得る。場合によって、トランス遺伝子は、一本鎖であり得る。場合によって、トランス遺伝子は、二本鎖であり得る。
ａ．ランダム挿入
本明細書で記載される方法の、１または複数のトランス遺伝子は、細胞ゲノムへと、ランダムに挿入することができる。これらのトランス遺伝子は、ゲノム内のいずれの場所に挿入されても機能的であり得る。例えば、トランス遺伝子は、それ自体のプロモーターをコードする場合もあり、内因性プロモーターの制御下にある位置へと挿入される場合もある。代替的に、トランス遺伝子は、遺伝子のイントロン、遺伝子のエクソン、プロモーター、または非コード領域などの遺伝子へと挿入することができる。
トランス遺伝子配列をコードする核酸、例えば、ＲＮＡは、細胞の染色体へと、ランダムに挿入することができる。ランダムな組込みは、核酸、例えば、ＲＮＡを、細胞へと導入する任意の方法から得ることができる。例えば、方法は、電気穿孔、超音波穿孔、遺伝子銃の使用、リポトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマーの使用、マイクロインジェクション、ならびにアデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、およびレトロウイルスベクターを含むウイルスベクターの使用、ならびに／またはＩＩ群のリボザイムであり得るがこれらに限定されない。
トランス遺伝子をコードするＲＮＡはまた、レポーター遺伝子の活性化を介して、トランス遺伝子またはその発現産物の存在を検出し得るよう、レポーター遺伝子を含むようにデザインすることもできる。上記で開示したレポーター遺伝子など、任意のレポーター遺伝子を使用することができる。細胞培養物中で、レポーター遺伝子が活性化した細胞を選択することにより、トランス遺伝子を含有する細胞を選択することができる。
挿入されるトランス遺伝子は、ゲノム内の標的二本鎖切断部位と類似する操作部位で挟んで、トランス遺伝子をポリ核酸から切り出し得るので、二本鎖切断領域に挿入することができる。場合によって、トランス遺伝子は、ウイルスにより導入することができる。例えば、ＡＡＶウイルスを用いて、細胞に、トランス遺伝子を感染させることができる。ＡＡＶウイルスによって組み込まれたトランス遺伝子発現を測定するためにフローサイトメトリーを用いることができる（図１０７Ａ、図１０７Ｂ、および図１２８）。ＡＡＶウイルスによるトランス遺伝子の組込みは、細胞毒性を誘導しない（図１０８）。場合によって、ＡＡＶウイルスを用いて操作された細胞の集団のフローサイトメトリーによって測定される細胞生存率は、約３０％〜１００％生存可能であり得る。操作細胞の集団のフローサイトメトリーによって測定される細胞生存率は、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％〜約１００％であり得る。場合によって、ｒＡＡＶウイルスは、細胞のゲノムへとトランス遺伝子を導入することができる（図１０９、図１３０、図１３１、および図１３２）。組み込まれたトランス遺伝子は、ゲノム導入の直後から、操作細胞の寿命まで、操作細胞によって発現することができる。例えば、組み込まれたトランス遺伝子は、細胞のゲノムへの導入の後、約０．１分から、トランス遺伝子の細胞への最初の導入後、１時間〜５時間、５時間〜１０時間、１０時間〜２０時間、２０時間〜１日、１日〜３日、３日〜５日、５日〜１５日、１５日〜３０日、３０日〜５０日、５０日〜１００日、または、１０００日まで測定することができる。トランス遺伝子の発現は、３日目から検出することができる（図１１０、および図１１２）。トランス遺伝子の発現は、７日目から検出することができる（図１１１、および図１１３）。トランス遺伝子の発現は、細胞のゲノムへのトランス遺伝子の導入の後、約４時間、６時間、８時間、１２時間、１８時間〜約２４時間検出することができる（図１１４Ａ、図１１４Ｂ、図１１５Ａ、および図１１５Ｂ）。場合によって、ウイルス力価は、トランス遺伝子の発現のパーセントに影響を及ぼし得る（図１１６、図１１７Ａ、図１１７Ｂ、図１１８、図１１９Ａ、図１２０Ａ、図１２０Ｂ、図１２１Ａ、図１２１Ｂ、図１２２Ａ、図１２２Ｂ、図１２３Ａ、図１２３Ｂ、図１２４、図１２５、図１２６、図１２７、図１２９Ａ、図１２９Ｂ、図１３０Ａ、図１３０Ｂ）。
場合によって、目的の遺伝子、または本明細書で記載されるトランス遺伝子を含有する、ＡＡＶウイルスベクターなどのウイルスベクターは、ウイルスベクターを含有するウイルス粒子による細胞のトランスフェクションに続いて、細胞のゲノムへとランダムに挿入され得る。そのような挿入のランダム部位は、二本鎖切断を有するゲノム部位を含む。レトロウイルスなどの一部のウイルスは、ウイルスベクターのランダム挿入をもたらし得るインテグラーゼなどの因子を含む。
場合によって、修飾ＡＡＶウイルスまたは操作ＡＡＶウイルスを使用して、トランス遺伝子を、細胞へと導入することができる（図８３Ａおよび図８３Ｂ）。修飾ＡＡＶまたは野生型ＡＡＶは、少なくとも１つのゲノム位置に対する相同性アームを含み得る（図８４〜図８６Ｄ）。
トランス遺伝子をコードするＲＮＡは、電気穿孔を介して、細胞へと導入することができる。ＲＮＡはまた、リポフェクション、感染、または形質転換を介して、細胞へと導入することもできる。電気穿孔および／またはリポフェクションを使用して、初代細胞にトランスフェクトすることができる。電気穿孔および／またはリポフェクションを使用して、初代造血系細胞にトランスフェクトすることができる。場合によって、ＲＮＡは、細胞内で、ＤＮＡへと逆転写することができる。次いで、ＤＮＡ基質を、相同組換え反応において使用することができる。ＤＮＡはまた、相同組換えを使用せずに、細胞ゲノムへと導入することもできる。場合によって、ＤＮＡは、ゲノム内の標的二本鎖切断領域と相補的な操作部位で挟むことができる。場合によって、ＤＮＡは、ポリ核酸から切り出すことができるので、相同組換えを伴わずに、二本鎖切断領域に挿入することができる。
トランス遺伝子の発現は、発現アッセイ、例えば、ｑＰＣＲによって、またはＲＮＡのレベルを測定することによって検証され得る。発現レベルはまた、コピー数も示し得る（図１４３および図１４４）。例えば、発現レベルが極度に高度である場合、これは、トランス遺伝子の１つを超えるコピーが、ゲノム内に組み込まれたことを指し示し得る。代替的に、高度な発現は、トランス遺伝子が、高度な転写領域内に、例えば、高度に発現するプロモーターの近傍に組み込まれたことを指し示し得る。発現はまた、ウェスタンブロット法を介するなど、タンパク質レベルを測定することにより検証することもできる。場合によって、スプライスアクセプターアッセイを、トランス遺伝子の組込みを測定するレポーター系と共に使用することができる（図９４）。場合によって、トランス遺伝子がＡＡＶ系を使用してゲノムへと導入される場合、スプライスアクセプターアッセイを、トランス遺伝子の組込みを測定するレポーター系と共に使用することができる（図１０６）。
ｂ．部位特異的挿入
本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおける、１または複数のトランス遺伝子の挿入は、部位特異的であり得る。例えば、１または複数のトランス遺伝子は、プロモーターと隣接して、またはこの近傍に挿入することができる。別の例では、１または複数のトランス遺伝子は、遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子）のエクソンと隣接して、この近傍に、またはこの中に挿入することができる。そのような挿入を使用して、トランス遺伝子（例えば、がん特異的ＴＣＲトランス遺伝子）をノックインしながら、同時に、別の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ遺伝子および／またはＴＣＲ）を破壊することができる。別の例では、１または複数のトランス遺伝子は、遺伝子のイントロンと隣接して、この近傍に、またはこの中に挿入することができる。トランス遺伝子は、ＡＡＶウイルスベクターにより導入することができ、標的ゲノム位置へと組み込むことができる（図８７）。場合によって、ｒＡＡＶベクターを用いて、トランス遺伝子の、ある特定の位置への挿入を導くことができる。例えば、場合によって、トランス遺伝子を、ｒＡＡＶまたはＡＡＶベクターによって、ＴＣＲ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＡＡＶＳ１、ＴＣＲ、またはＣＩＳＨ遺伝子の少なくとも一部に組み込むことができる（図１３６Ａ、図１３６Ｂ、図１３７Ａ、および図１３７Ｂ）。
細胞のターゲティングされた遺伝子座の修飾は、標的遺伝子座に対する相同性を有するＤＮＡを、細胞へと導入することによりもたらし得る。ＤＮＡは、構築物の組込みを含む細胞の選択を可能とするマーカー遺伝子を含み得る。標的ベクター内の相補的ＤＮＡは、標的遺伝子座において、染色体ＤＮＡを組み換えうる。マーカー遺伝子は、相補的ＤＮＡ配列、３’側組換えアーム、および５’側組換えアームで挟むことができる。細胞内の複数の遺伝子座をターゲティングすることができる。例えば、複数のゲノムの修飾が、単一のステップで生じるように、１つまたは複数の標的遺伝子座に特異的な組換えアームを伴うトランス遺伝子を、一度に導入することができる。
場合によって、特定のゲノム部位に対する組換えアームまたは相同性アームは、約０．２ｋｂ〜約５ｋｂの長さであり得る。組換えアームは、約０．２ｋｂ、０．４ｋｂ、０．６ｋｂ、０．８ｋｂ、１．０ｋｂ、１．２ｋｂ、１．４ｋｂ、１．６ｋｂ、１．８ｋｂ、２．０ｋｂ、２．２ｋｂ、２．４ｋｂ、２．６ｋｂ、２．８ｋｂ、３．０ｋｂ、３．２ｋｂ、３．４ｋｂ、３．６ｋｂ、３．８ｋｂ、４．０ｋｂ、４．２ｋｂ、４．４ｋｂ、４．６ｋｂ、４．８ｋｂ〜約５．０ｋｂの長さであり得る。
様々な酵素が、外来ＤＮＡの、宿主ゲノムへの挿入を触媒し得る。例えば、部位特異的リコンビナーゼは、顕著に異なる生化学的特性を伴う、２つのタンパク質ファミリー、すなわちチロシンリコンビナーゼ（この場合、ＤＮＡを、チロシン残基へと共有結合的に接合させる）と、セリンリコンビナーゼ（この場合共有結合的接合は、セリン残基において生じる）とへとクラスター分けすることができる。場合によって、リコンビナーゼは、Ｃｒｅ、ｆＣ３１インテグラーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属ファージｆＣ３１に由来するセリンリコンビナーゼ）、またはバクテリオファージ由来の部位特異的リコンビナーゼ（Ｆｌｐ、ラムダインテグラーゼ、バクテリオファージＨＫ０２２リコンビナーゼ、バクテリオファージＲ４インテグラーゼ、およびファージＴＰ９０１−１インテグラーゼを含む）を含み得る。
構築物内では、発現制御配列もまた使用することができる。例えば、発現制御配列は、多種多様な細胞型内で発現する、構成的プロモーターを含み得る。組織特異的プロモーターもまた、使用することができ、発現を、特異的細胞系統へと導くのに使用することができる。
部位特異的遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ（米国特許第１４／１９３，０３７号を参照されたい）、トランスポゾンベースのＺＥＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ−ＴＡＬ、またはトランスポゾンベースの系など、非ウイルス的遺伝子編集を使用して達成することができる。例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系（Ｍｏｒｉａｒｔｙ， Ｂ．Ｓ．ら、「Ｍｏｄｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｉｎｔｅｇｒａｔａｂｌｅ ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ＲｅｃＷａｙ ａｓｓｅｍｂｌｙ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（８号）：ｅ９２頁（２０１３年）を参照されたい）またはＳｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系（Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ， Ｅ．Ｌら、「Ｔｈｅ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｓｙｓｔｅｍ： ａ ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．、２０巻（Ｒ１号）：Ｒ１４〜Ｒ２０頁（２０１１年）を参照されたい）を使用することができる。
部位特異的遺伝子編集はまた、相同組換えを伴わずに達成することもできる。外因性ポリ核酸は、相同組換えを使用せずに、細胞ゲノムへと導入することができる。場合によって、トランス遺伝子は、ゲノム内の標的二本鎖切断領域と相補的な操作部位で挟むことができる。トランス遺伝子は、ポリ核酸から切り出すことができるので、相同組換えを伴わずに、二本鎖切断領域に挿入することができる。
場合によって、トランス遺伝子のゲノム組込みが望まれる場合、ヌクレアーゼがゲノムＤＮＡを切断する部位におけるトランス遺伝子の組込みを容易にするために、外因性ヌクレアーゼまたは操作ヌクレアーゼを、トランス遺伝子を含むプラスミド、直線状ポリヌクレオチドまたは環状ポリヌクレオチド、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターに加えて細胞へと導入することができる。細胞のゲノムへのトランス遺伝子の組込みは、トランス遺伝子の長期にわたる安定的な発現を可能にする。一部の態様では、ウイルスベクターを使用して、トランス遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを導入することができる。他の場合には、ウイルスベクターはプロモーターを含んでおらず、挿入されたトランス遺伝子を発現するために、内因性プロモーターを含む標的遺伝子座におけるトランス遺伝子の挿入を必要とする。
場合によって、ウイルスベクター（図１３８）は、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲおよび／またはセーフハーバー部位などの、標的ゲノム遺伝子座へのトランス遺伝子の組込みを導く相同性アームを含む。場合によって、第１のヌクレアーゼを、特定のゲノム部位で切断するように操作して、がん遺伝子、チェックポイントインヒビター遺伝子、またはがんなどの疾患もしくは状態に関与する遺伝子などの、有害な遺伝子を抑制する（例えば、遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／もしくはＴＣＲ）の部分的もしくは完全な抑制）か、または無効化する。ヌクレアーゼによってそのようなゲノム遺伝子座で二本鎖切断を生じた後、非ウイルスまたはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶウイルスベクター）を導入して、ＤＮＡ切断部位またはヌクレアーゼによって生じる二本鎖切断の部位での、トランス遺伝子または治療効果を有する任意の外因性核酸配列の組込みを可能にすることができる。あるいは、トランス遺伝子を、相同組換えによる部位特異的挿入、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲまたはセーフハーバー遺伝子座などの、所望の挿入部位と相補的な配列を含む相同性アームの使用などの、当技術分野で公知の方法を使用して異なるゲノム部位に挿入することができる。場合によって、第２のヌクレアーゼを提供して、第１のヌクレアーゼによるＤＮＡ切断部位とは異なる遺伝子座でのトランス遺伝子の部位特異的挿入を容易とすることができる。場合によって、ＡＡＶウイルスまたはＡＡＶウイルスベクターを、Ｔ細胞受容体などのトランス遺伝子を導入するための送達系として使用することができる。ｒＡＡＶドナー上の相同性アームは、５００塩基対〜２０００塩基対であり得る。例えば、ｒＡＡＶドナー上の相同性アームは、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、または最大で２０００ｂｐの長さであり得る。相同性アームの長さは、８５０ｂｐであり得る。他の場合、相同性アームの長さは、１０４０ｂｐであり得る。場合によって、相同性アームを伸長させて、ドナーの正確な組込みを可能にする。他の場合、相同性アームを伸長させて、ドナーの組込みを改善する。場合によって、ドナーポリ核酸のサイズを傷付けることなく相同性アームの長さを増加させるために、ドナーポリ核酸の交互部分を除去することができる。場合によって、ポリＡテールを減少させて、相同性アームの長さを増加させることができる。
ｃ．目的のトランス遺伝子または核酸配列
トランス遺伝子は、内因性遺伝子を、トランス遺伝子を伴わない場合より高レベルで発現させる、例えば、過剰発現させるために有用であり得る。加えて、トランス遺伝子を使用して、バックグラウンド、すなわち、トランス遺伝子をトランスフェクトされていない細胞より高レベルで、外因性遺伝子を発現させることができる。トランス遺伝子はまた、他の種類の遺伝子、例えば、ドミナントネガティブの遺伝子も包含し得る。
トランス遺伝子は、トランス遺伝子の産物を産生するように、生物、細胞、組織、または臓器へと入れることができる。ポリ核酸は、トランス遺伝子を含み得る。ポリ核酸は、外因性受容体をコードし得る（図５７Ａ、図５７Ｂ、および図５７Ｃ）。例えば、本明細書では、アデノシンＡ２ａ受容体、ＣＤ２７６、Ｖセットドメイン含有Ｔ細胞活性化インヒビター１、Ｂリンパ球およびＴリンパ球関連、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３ドメイン、長細胞質テール、１、リンパ球活性化遺伝子３、プログラム細胞死１、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー、またはナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４であるゲノム配列内のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する、少なくとも２つの組換えアームで挟んだ、少なくとも１つの外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列を含むポリ核酸が開示される。１または複数のトランス遺伝子は、１または複数の破壊と組み合わせることができる。
場合によって、トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子）または核酸（例えば、少なくとも１個の外因性核酸）を、非ウイルス組込みまたはウイルス組込み法を使用して、ゲノム遺伝子座中に、および／または遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／もしくはＴＣＲ）中の切断に組み込むことができる。場合によって、ウイルス組込みは、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶベクターまたは修飾ＡＡＶベクターまたは組換えＡＡＶベクター）を含む。場合によって、ＡＡＶベクターは、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含む。場合によって、細胞生存率は、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子）を含むＡＡＶベクターを細胞または細胞の集団に導入した後に測定される。場合によって、細胞生存率は、トランス遺伝子を細胞の集団中の少なくとも１個の細胞のゲノム遺伝子座に組み込んだ後に測定される（例えば、ウイルスまたは非ウイルス法によって）。場合によって、細胞生存率は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって測定される。場合によって、細胞生存率は、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むウイルスまたは非ウイルスベクターを細胞または細胞の集団に導入した後に測定される。場合によって、細胞の集団中の細胞の少なくとも約、または最大で約、または約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％が、ウイルスベクター（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むＡＡＶベクター）または非ウイルスベクター（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むミニサークルベクター）を細胞または細胞の集団に導入した後に生存している。場合によって、細胞生存率は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）または非ウイルス（例えば、ミニサークル）ベクターを細胞および／または細胞の集団に導入した後、約、少なくとも約、または最大で約４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、２０時間、２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間、１３２時間、１４４時間、１５６時間、１６８時間、１８０時間、１９２時間、２０４時間、２１６時間、２２８時間、２４０時間で、または２４０時間よりも後に測定される。場合によって、細胞生存率は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）または非ウイルス（例えば、ミニサークル）ベクターを細胞および／または細胞の集団に導入した後、約、少なくとも約、または最大で約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、４５日、５０日、６０日、７０日、９０日で、または９０日よりも後に測定される。場合によって、細胞生存率は、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を細胞の集団中の少なくとも１個の細胞に導入した後に測定される。場合によって、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含む。場合によって、細胞生存率および／または細胞毒性は、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を、非ウイルス法（例えば、ミニサークルベクター）を使用する場合と比較して、ウイルス法（例えば、ＡＡＶベクター）を使用して細胞および／または細胞の集団に組み込んだ場合に改善される。場合によって、細胞毒性は、フローサイトメトリーによって測定される。場合によって、細胞毒性は、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むウイルスまたは非ウイルスベクターを、細胞または細胞の集団に導入した後に測定される。場合によって、細胞毒性は、非ウイルスベクター（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むミニサークル）を導入する場合と比較して、ウイルスベクター（例えば、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むＡＡＶベクター）を細胞または細胞の集団に導入する場合に、少なくとも約、または最大で約、または約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、または１００％低減される。場合によって、細胞毒性は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを細胞または細胞の集団に導入した後（例えば、細胞または細胞の集団への、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むＡＡＶベクターの導入後または少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むミニサークルベクターの導入後）、約、少なくとも約、または最大で約４時間、６時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、７８時間、８４時間、９０時間、９６時間、１０２時間、１０８時間、１１４時間、１２０時間、１２６時間、１３２時間、１３８時間、１４４時間、１５０時間、１５６時間、１６８時間、１８０時間、１９２時間、２０４時間、２１６時間、２２８時間、２４０時間で、または２４０時間よりも後に測定される。場合によって、細胞毒性は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを細胞または細胞の集団に導入した後（例えば、細胞または細胞の集団への、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むＡＡＶベクターの導入後または少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むミニサークルベクターの導入後）、約、少なくとも約、または最大で約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、４５日、５０日、６０日、７０日、９０日で、または９０日よりも後に測定される。場合によって、細胞毒性は、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を細胞の集団中の少なくとも１個の細胞に組み込んだ後に測定される。
場合によって、トランス遺伝子を、ランダムまたは部位特異的挿入を使用して細胞（例えば、Ｔ細胞）のゲノム中に挿入することができる。場合によって、挿入は、ウイルス挿入によるものであり得る。場合によって、トランス遺伝子のウイルス挿入は、特定のゲノム部位をターゲティングしうるか、または他の場合、トランス遺伝子のウイルス挿入は、ゲノム部位へのランダム挿入であり得る。場合によって、トランス遺伝子は、細胞のゲノム中に１回挿入される。場合によって、トランス遺伝子は、ゲノム中の遺伝子座にランダムに挿入される。場合によって、トランス遺伝子は、ゲノム中の１つを超える遺伝子座にランダムに挿入される。場合によって、トランス遺伝子は、遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中に挿入される。場合によって、トランス遺伝子は、遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中の切断に挿入される。場合によって、１つを超えるトランス遺伝子が、細胞のゲノム中に挿入される。場合によって、１つを超えるトランス遺伝子が、ゲノム中の１または複数の遺伝子座に挿入される。場合によって、トランス遺伝子は、少なくとも１個の遺伝子に挿入される。場合によって、トランス遺伝子は、２個またはそれよりも多い遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）に挿入される。場合によって、トランス遺伝子または少なくとも１個のトランス遺伝子は、ランダムおよび／または特異的様式で細胞のゲノム中に挿入される。場合によって、トランス遺伝子は、外因性トランス遺伝子である。場合によって、トランス遺伝子は、遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）の少なくとも一部と相補的な操作部位で挟まれる。場合によって、トランス遺伝子は、遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中の切断と相補的な操作部位で挟まれる。場合によって、トランス遺伝子は、遺伝子中に挿入されない（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ遺伝子中に挿入されない）。場合によって、トランス遺伝子は、遺伝子中の切断（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ中の切断）に挿入されない。場合によって、トランス遺伝子は、ゲノム遺伝子座中の切断と相補的な操作部位で挟まれる。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
Ｔ細胞は、１または複数のトランス遺伝子を含み得る。１または複数のトランス遺伝子は、抗原上の少なくとも１つのエピトープ（例えば、がんエピトープ）を認識し、これらに結合するか、または抗原上の変異エピトープに結合する、ＴＣＲアルファ鎖タンパク質、ＴＣＲベータ鎖タンパク質、ＴＣＲガンマ鎖タンパク質、および／またはＴＣＲデルタ鎖タンパク質を発現させうる。ＴＣＲは、がんネオ抗原に結合し得る。ＴＣＲは、図２２および図２６に示される通り、機能的ＴＣＲであり得る。ＴＣＲは、本明細書で規定されるアルファ鎖配列またはベータ鎖配列（例えば、それぞれ、さらなるアルファ鎖またはベータ鎖と組み合わせた）のうちの１つのみを含む場合もあり、両方の鎖を含む場合もある。ＴＣＲは、本明細書で規定されるガンマ鎖配列またはデルタ鎖配列（例えば、それぞれ、さらなるガンマ鎖またはデルタ鎖と組み合わせた）のうちの１つのみを含む場合もあり、両方の鎖を含む場合もある。機能的ＴＣＲは、融合タンパク質内の、少なくとも実質的な生体活性を維持する。ＴＣＲのアルファ鎖および／またはベータ鎖の場合、これは、両方の鎖が、その生物学的機能、特に、ＴＣＲの特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体への結合、および／またはペプチド活性化における機能的シグナル伝達を果たす、Ｔ細胞受容体を形成する（非修飾アルファ鎖および／もしくはベータ鎖と共に、または別の融合タンパク質のアルファ鎖および／もしくはベータ鎖と共に）ことがなおも可能であることを意味する。ＴＣＲのガンマ鎖および／またはデルタ鎖の場合、これは、両方の鎖が、その生物学的機能、特に、ＴＣＲの特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体への結合、および／またはペプチド活性化における機能的シグナル伝達を果たす、Ｔ細胞受容体を形成する（非修飾ガンマ鎖および／もしくはデルタ鎖と共に、または別の融合タンパク質のガンマ鎖および／もしくはデルタ鎖と共に）ことがなおも可能であることを意味する。Ｔ細胞はまた、１または複数のＴＣＲも含み得る。Ｔ細胞はまた、１つを超える標的に特異的な、単一のＴＣＲも含み得る。
ＴＣＲは、様々な方法を使用して同定することができる。場合によって、ＴＣＲは、全エクソームシーケンシングを使用して同定することができる。例えば、ＴＣＲは、全エクソームシーケンシングにより同定されたＥ８０５Ｇ変異を含有する、ＥＲＢＢ２ＩＰ（ＥｒｂＢ２ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）抗原をターゲティングし得る。代替的に、ＴＣＲは、自家レパートリーから同定することもでき、同種レパートリーから同定することもでき、異種レパートリーから同定することもできる。自家および同種の同定は、マルチステップの工程を伴いうる。自家および同種のいずれの同定においても、ＣＤ１４で選択した単球から、樹状細胞（ＤＣ）を作製し、成熟の後、特異的ペプチドでパルスするか、またはこれをトランスフェクトすることができる。ペプチドでパルスしたＤＣを使用して、自家Ｔ細胞または同種Ｔ細胞を刺激することができる。限界希釈法により、単一細胞のペプチド特異的Ｔ細胞クローンを、これらのペプチドでパルスしたＴ細胞株から単離することができる。目的のＴＣＲを、同定および単離することができる。目的のＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、クローニングし、コドン最適化し、ベクターまたはトランス遺伝子へとコードすることができる。ＴＣＲの一部は、置き換えることができる。例えば、ヒトＴＣＲの定常領域は、対応するマウス領域で置き換えることができる。ヒト定常領域の、対応するマウス領域による置換を実施して、ＴＣＲの安定性を増大させることができる。ＴＣＲはまた、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、高アビディティーまたは超生理学的アビディティーで同定することもできる。
腫瘍特異的ＴＣＲの作製に成功するには、適切な標的配列を同定すべきである。配列は、希少な腫瘍反応性Ｔ細胞の単離により見出すこともでき、これが可能でない場合、代替的な技術を利用して、高活性の抗腫瘍Ｔ細胞抗原を作製することもできる。１つの手法は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系を発現するトランスジェニックマウスを、ヒト腫瘍タンパク質で免疫化して、ヒト抗原に対するＴＣＲを発現するＴ細胞を作製するステップを伴いうる（例えば、Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋｉら、「Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａ ｈｕｍａｎ ＭＤＭ２−ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ＴＣＲ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２巻、９６２〜９７０頁（２００１年）を参照されたい）。代替的な手法は、腫瘍特異的Ｔ細胞を、腫瘍の寛解を経つつある患者から単離し、反応性のＴＣＲ配列を、疾患は共有するが、非応答性であり得る、別の患者に由来するＴ細胞へと移入し得る、同種ＴＣＲ遺伝子移入であり得る（ｄｅ Ｗｉｔｔｅ， Ｍ． Ａ．ら、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＴＣＲ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」、Ｂｌｏｏｄ、１０８巻、８７０〜８７７頁（２００６年））。最後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ技術を利用して、ＴＣＲの配列を変化し、反応性の弱い腫瘍特異的ＴＣＲの、標的抗原との相互作用（アビディティー）の強度を増大させることにより、それらの腫瘍殺滅活性を増強することができる（Ｓｃｈｍｉｄ， Ｄ． Ａ．ら、「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ＴＣＲ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｄｅｌｉｍｉｔｉｎｇ ｍａｘｉｍａｌ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８４巻、４９３６〜４９４６頁（２０１０年））。代替的に、ＴＣＲは、全エクソームシーケンシングを使用して同定することができる。
本機能的ＴＣＲ融合タンパク質は、ＭＨＣにより提示されたエピトープに対しするものとすることができる。ＭＨＣは、クラスＩ分子、例えば、ＨＬＡ−Ａであり得る。ＭＨＣは、クラスＩＩ分子であり得る。本機能的ＴＣＲ融合タンパク質はまた、抗原をターゲティングするために、ペプチドベースの機能またはペプチドにガイドされる機能も有し得る。本機能的ＴＣＲは、連結することができ、例えば、本機能的ＴＣＲは、２Ａ配列と連結することができる。本機能的ＴＣＲはまた、図２６に示される通り、フリン−Ｖ５−ＳＧＳＧＦ２Ａと連結することもできる。本機能的ＴＣＲはまた、哺乳動物性構成要素も含有し得る。例えば、本機能的ＴＣＲは、マウス定常領域を含有し得る。本機能的ＴＣＲはまた、場合によって、ヒト定常領域も含有し得る。ペプチドにガイドされる機能は、原理的に、ペプチド配列を、ＴＣＲへと導入し、これらのペプチド配列により、腫瘍をターゲティングすることにより達成することができる。これらのペプチドは、ファージディスプレイライブラリーまたは合成ペプチドライブラリーに由来し得る（例えば、Ａｒａｐ， Ｗ．ら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ Ｔｕｍｏｒ Ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９巻、３７７〜３８０頁（１９９８年）；Ｓｃｏｔｔ， Ｃ．Ｐ．ら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、８巻：８０１〜８１５頁（２００１年）を参照されたい）。とりわけ、乳癌、前立腺癌、および結腸癌に特異的なペプチドのほか、血管新生に特異的なペプチドも、既に単離に成功しており、本開示で使用することができる（Ｓａｍｏｙｌｏｖａ， Ｔ． Ｉ．ら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６巻（１号）：９〜１７頁（９）（２００６年）。本機能的ＴＣＲ融合タンパク質は、変異させたがんエピトープまたは変異させたがん抗原に対するものとすることができる。
使用することが可能であり、具体的に想定されるトランス遺伝子は、本明細書で開示される遺伝子、例えば、ＴＣＲ遺伝子に対する、一定の同一性および／または相同性を呈する遺伝子を含み得る。したがって、遺伝子は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性、または少なくともほぼこれらの比率の相同性（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）を呈する場合、トランス遺伝子として使用し得ることが想定される。また、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性、または少なくともほぼこれらの比率の同一性（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）を呈する遺伝子は、トランス遺伝子として使用し得ることも想定される。場合によって、トランス遺伝子は、機能的であり得る。
トランス遺伝子は、細胞へと組み込むことができる。例えば、トランス遺伝子は、生物の生殖細胞系列へと組み込むことができる。細胞へと挿入されると、トランス遺伝子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のコピーである、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）セグメントの場合もあり、ゲノムＤＮＡ（イントロンを伴うかまたは伴わない）の、その元の領域内に存在する遺伝子自体の場合もある。Ｘタンパク質のトランス遺伝子とは、Ｘタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むトランス遺伝子を指す場合がある。場合によって、本明細書で使用される、Ｘタンパク質をコードするトランス遺伝子は、Ｘタンパク質のアミノ酸配列の１００％または約１００％をコードするトランス遺伝子であり得る。他の場合には、Ｘタンパク質をコードするトランス遺伝子は、Ｘタンパク質のアミノ酸配列のうちの、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、もしくは１％、または少なくともほぼこれらの比率のアミノ酸配列をコードするトランス遺伝子であり得る。トランス遺伝子の発現は最終的に、機能的タンパク質、例えば、部分的に、完全に、または過剰に機能的なタンパク質を結果としてもたらし得る。上記で論じた通り、部分配列を発現させる場合、最終結果は、非機能的タンパク質またはドミナントネガティブのタンパク質であり得る。非機能的タンパク質またはドミナントネガティブのタンパク質はまた、機能的（内因性または外因性）タンパク質と競合する場合もある。トランス遺伝子はまた、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ）もコードし得る。場合によって、トランス遺伝子が、ｍＲＮＡをコードする場合、これを、ポリペプチド（例えば、タンパク質）へと翻訳することができる。したがって、トランス遺伝子は、タンパク質をコードし得ることが想定される。場合によって、トランス遺伝子は、タンパク質をコードする場合もあり、タンパク質の部分をコードする場合もある。加えて、タンパク質は、野生型ポリペプチドと比較して、１または複数の変異（例えば、欠失、挿入、アミノ酸の置換、または再配列）を有し得る。タンパク質は、天然ポリペプチドの場合もあり、人工ポリペプチド（例えば、組換えポリペプチド）の場合もある。トランス遺伝子は、２つまたはそれよりも多いポリペプチドにより形成される融合タンパク質をコードし得る。Ｔ細胞は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはそれよりも多いトランス遺伝子を含むか、またはほぼこれらの数のトランス遺伝子を含み得る。例えば、Ｔ細胞は、ＴＣＲ遺伝子を含む、１または複数のトランス遺伝子を含み得る。
トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ遺伝子）は、セーフハーバー遺伝子座内に挿入することができる。セーフハーバーは、トランス遺伝子が、内因性活性を撹乱されずに、組み込まれ、機能する、ゲノム位置を含み得る。例えば、１または複数のトランス遺伝子は、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ＣＣＲ５、ｈＲＯＳＡ２６のうちのいずれか１つ、および／またはこれらの任意の組合せへと挿入することができる。トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ遺伝子）はまた、内因性免疫チェックポイント遺伝子内に挿入することもできる。内因性免疫チェックポイント遺伝子は、刺激性チェックポイント遺伝子の場合もあり、阻害性チェックポイント遺伝子の場合もある。トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ遺伝子）はまた、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、またはＩＣＯＳなど、刺激性チェックポイント遺伝子内に挿入することもできる。免疫チェックポイント遺伝子の位置は、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３８ ｐａｔｃｈ ｒｅｌｅａｓｅ ２（ＧＲＣｈ３８．ｐ２）アセンブリーを使用して提示する。トランス遺伝子（例えば、ＴＣＲ遺伝子）はまた、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＴＣＲ、またはＣＩＳＨなど、内因性阻害性チェックポイント遺伝子内に挿入することもできる。例えば、１または複数のトランス遺伝子は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＨＤ３、ＣＣＲ５、ＴＣＲ、ＣＩＳＨ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃのうちのいずれか１つ、および／またはこれらの任意の組合せへと挿入することができる。トランス遺伝子は、内因性ＴＣＲ遺伝子内に挿入することができる。トランス遺伝子は、コードゲノム領域内に挿入することができる。トランス遺伝子はまた、非コードゲノム領域内に挿入することもできる。トランス遺伝子は、相同組換えを伴わずに、ゲノムへと挿入することができる。トランス遺伝子の挿入は、細胞内ゲノム移植のステップを含み得る。トランス遺伝子は、ＰＤ−１遺伝子に挿入することができる（図４６Ａおよび図４６Ｂ）。場合によって、１つを超えるガイドは、免疫チェックポイントをターゲティングし得る（図４７）。他の場合には、トランス遺伝子は、ＣＴＬＡ−４遺伝子に組み込むことができる（図４８および図５０）。他の場合には、トランス遺伝子は、ＣＴＬＡ−４遺伝子およびＰＤ−１遺伝子に組み込むことができる（図４９）。トランス遺伝子はまた、ＡＡＶＳ１などのセーフハーバーへと組み込むこともできる（図９６および図９７）。トランス遺伝子は、ＣＩＳＨ遺伝子へと挿入することができる。トランス遺伝子は、ＴＣＲ遺伝子へと挿入することができる。トランス遺伝子は、ＡＡＶ組込み部位へと挿入することができる。場合によって、ＡＡＶ組込み部位は、セーフハーバーであり得る。第５染色体上のＡＡＶＳ２または第３染色体上のＡＡＶＳ３など、代替的なＡＡＶ組込み部位も存在し得る。ＡＡＶＳ２、ＡＡＶＳ３、ＡＡＶＳ４、ＡＡＶＳ５、ＡＡＶＳ６、ＡＡＶＳ７、ＡＡＶＳ８など、さらなるＡＡＶ組込み部位もまた、ＴＣＲなどの外因性受容体のための、可能な組込み部位と考えられる。本明細書で使用されるＡＡＶＳとは、ＡＡＶＳ１ならびに類縁のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶＳ）組込み部位を指す場合がある。
キメラ抗原受容体は、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞の活性化を制御するシグナル伝達領域から構成され得る。細胞外抗原認識ドメインは、マウスモノクローナル抗体に由来する場合もあり、ヒト化モノクローナル抗体に由来する場合もあり、完全ヒトモノクローナル抗体に由来する場合もある。具体的には、細胞外抗原認識ドメインは、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域であって、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形態でクローニングされ、ヒンジドメインおよび膜貫通ドメインを介して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の細胞内シグナル伝達分子および少なくとも１つの共刺激性分子へと結合した可変領域からなる。場合によって、共刺激性ドメインは使用しない。
本開示のＣＡＲは、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞の細胞膜内に存在することが可能であり、この場合、適する哺乳動物細胞は、細胞傷害性細胞、Ｔリンパ球、幹細胞、幹細胞の子孫細胞、前駆細胞、前駆細胞の子孫細胞、およびＮＫ細胞を含むがこれらに限定されない。真核細胞の細胞膜内に存在する場合、ＣＡＲは、それが結合する標的の存在下で活性であり得る。標的は、膜上で発現し得る。標的はまた、可溶性でもあり得る（例えば、細胞に結合していない場合もある）。標的は、標的細胞など、細胞の表面上に存在し得る。標的は、脂質二重層など、固体表面上に提示することができる。標的は、可溶性抗原など、可溶性であり得る。標的は、抗原であり得る。抗原は、標的細胞など、細胞の表面上に存在し得る。抗原は、脂質二重層など、固体表面上に提示することができる。場合によって、標的は、抗原のエピトープであり得る。場合によって、標的は、がんネオ抗原であり得る。
近年におけるいくつかの進歩は、場合によって、抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する、腫瘍特異的変異の同定に焦点を当てている。例えば、これらの内因性変異は、全エクソーム−シーケンシング法を使用して同定することができる（Ｔｒａｎ Ｅら、「Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４４巻：６４１〜６４４頁（２０１４年））。したがって、ＣＡＲは、腫瘍特異的ネオ抗原を標的とするｓｃＦｖから構成され得る。
方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（例えば、全エクソームシーケンシング）を使用して、がん患者から得られた試料に由来する、がん関連標的配列を同定し得る。方法はさらに、標的配列を認識する第１のＴ細胞に由来するＴＣＲトランス遺伝子も同定し得る。がん関連標的配列およびＴＣＲトランス遺伝子は、同じ患者の試料から得ることもでき、異なる患者の試料から得ることもできる。がん関連標的配列を、ＣＡＲトランス遺伝子上にコードして、ＣＡＲを、標的配列に特異的とし得る。方法は、ＣＡＲトランス遺伝子を含む核酸を、Ｔ細胞の膜を越えて、効率的に送達し得る。場合によって、第１のＴ細胞と、第２のＴ細胞とは、同じ患者から得ることができる。他の場合には、第１のＴ細胞と、第２のＴ細胞とは、異なる患者から得ることができる。他の場合には、第１のＴ細胞と、第２のＴ細胞とは、異なる患者から得ることができる。方法は、非ウイルス性組込み系またはウイルス性組込み系を使用して、ＣＡＲトランス遺伝子を、安全かつ効率的に、Ｔ細胞のゲノムへと組み込んで操作Ｔ細胞を生成することが可能であり、したがって、ＣＡＲトランス遺伝子を、操作Ｔ細胞内で、信頼できる形で発現させることができる。
Ｔ細胞は、１または複数の遺伝子の破壊、および１または複数のトランス遺伝子を含み得る。例えば、それらの発現が破壊される、１または複数の遺伝子は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＨＤ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＣＲ、ＣＩＳＨ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＴＣＲのうちのいずれか１つ、および／またはこれらの任意の組合せを含み得る。例えば、多様な組合せを例示するためだけに述べると、それらの発現が破壊される、１または複数の遺伝子は、ＰＤ−１を含むことが可能であり、１または複数のトランス遺伝子は、ＴＣＲを含む。例えば、多様な組合せを例示するためだけに述べると、それらの発現が破壊される、１または複数の遺伝子は、ＣＩＳＨを含むことが可能であり、１または複数のトランス遺伝子は、ＴＣＲを含む。例えば、多様な組合せを例示するためだけに述べると、それらの発現が破壊される、１または複数の遺伝子は、ＴＣＲを含むことが可能であり、１または複数のトランス遺伝子は、ＴＣＲを含む。別の例では、それらの発現が破壊される、１または複数の遺伝子はまた、ＣＴＬＡ−４を含むことが可能であり、１または複数のトランス遺伝子は、ＴＣＲを含む。破壊は、破壊される遺伝子またはその一部のゲノム転写物のコピー数の減少をもたらしうる。例えば、破壊することができる遺伝子は、破壊されていない細胞中の同じ遺伝子と比較して転写物量が減少していてもよい。破壊は、１４５コピー／μＬ、１４０コピー／μＬ、１３５コピー／μＬ、１３０コピー／μＬ、１２５コピー／μＬ、１２０コピー／μＬ、１１５コピー／μＬ、１１０コピー／μＬ、１０５コピー／μＬ、１００コピー／μＬ、９５コピー／μＬ、１９０コピー／μＬ、１８５コピー／μＬ、８０コピー／μＬ、７５コピー／μＬ、７０コピー／μＬ、６５コピー／μＬ、６０コピー／μＬ、５５コピー／μＬ、５０コピー／μＬ、４５コピー／μＬ、４０コピー／μＬ、３５コピー／μＬ、３０コピー／μＬ、２５コピー／μＬ、２０コピー／μＬ、１５コピー／μＬ、１０コピー／μＬ、５コピー／μＬ、１コピー／μＬ、または０．０５コピー／μＬ未満の破壊結果をもたらしうる。場合によって、破壊は、１００コピー／μＬ未満をもたらしうる。
Ｔ細胞は、１または複数の遺伝子の抑制、および１または複数のトランス遺伝子を含み得る。例えば、それらの発現が抑制される、１または複数の遺伝子は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＨＤ３、ＶＩＳＴＡ、ＣＩＳＨ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＴＣＲのうちのいずれか１つ、および／またはこれらの任意の組合せを含み得る。例えば、多様な組合せを例示するためだけに述べると、それらの発現が抑制される、１または複数の遺伝子は、ＰＤ−１を含むことが可能であり、１または複数のトランス遺伝子は、ＴＣＲを含む。例えば、多様な組合せを例示するためだけに述べると、それらの発現が抑制される、１または複数の遺伝子は、ＣＩＳＨを含むことが可能であり、１または複数のトランス遺伝子は、ＴＣＲを含む。例えば、多様な組合せを例示するためだけに述べると、それらの発現が抑制される、１または複数の遺伝子は、ＴＣＲを含むことが可能であり、１または複数のトランス遺伝子は、ＴＣＲを含む。別の例では、それらの発現が抑制される、１または複数の遺伝子はまた、ＣＴＬＡ−４を含むことが可能であり、１または複数のトランス遺伝子は、ＴＣＲを含む。
Ｔ細胞はまた、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはそれよりも多いドミナントネガティブのトランス遺伝子も含み得るか、または、ほぼこれらの数のドミナントネガティブのトランス遺伝子も含み得る。ドミナントネガティブのトランス遺伝子の発現は、ドミナントネガティブのトランス遺伝子の野生型対応物の発現および／または機能を抑制しうる。したがって、例えば、ドミナントネガティブのトランス遺伝子Ｘを含むＴ細胞は、その発現が抑制されるＸ遺伝子を含む、異なるＴ細胞と比較して、類似の表現型を有し得る。１または複数のドミナントネガティブのトランス遺伝子は、ドミナントネガティブのＣＤ２７、ドミナントネガティブのＣＤ４０、ドミナントネガティブのＣＤ１２２、ドミナントネガティブのＯＸ４０、ドミナントネガティブのＧＩＴＲ、ドミナントネガティブのＣＤ１３７、ドミナントネガティブのＣＤ２８、ドミナントネガティブのＩＣＯＳ、ドミナントネガティブのＡ２ＡＲ、ドミナントネガティブのＢ７−Ｈ３、ドミナントネガティブのＢ７−Ｈ４、ドミナントネガティブのＢＴＬＡ、ドミナントネガティブのＣＴＬＡ−４、ドミナントネガティブのＩＤＯ、ドミナントネガティブのＫＩＲ、ドミナントネガティブのＬＡＧ３、ドミナントネガティブのＰＤ−１、ドミナントネガティブのＴＩＭ−３、ドミナントネガティブのＶＩＳＴＡ、ドミナントネガティブのＰＨＤ１、ドミナントネガティブのＰＨＤ２、ドミナントネガティブのＰＨＤ３、ドミナントネガティブのＣＩＳＨ、ドミナントネガティブのＴＣＲ、ドミナントネガティブのＣＣＲ５、ドミナントネガティブのＨＰＲＴ、ドミナントネガティブのＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ドミナントネガティブのＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、またはこれらの任意の組合せであり得る。
また、遺伝子発現を抑制し得る、例えば、遺伝子をノックダウンし得る、１または複数の核酸をコードする、１または複数のトランス遺伝子を含むＴ細胞も提示される。遺伝子発現を抑制するＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびマイクロＲＮＡを含むがこれらに限定されない。例えば、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、および／またはマイクロＲＮＡを、Ｔ細胞へと送達して、遺伝子発現を抑制することができる。さらに、Ｔ細胞は、ｓｈＲＮＡをコードする、１または複数のトランス遺伝子を含み得る。ｓｈＲＮＡは、特定の遺伝子に特異的であり得る。例えば、ｓｈＲＮＡは、本出願で記載される任意の遺伝子であって、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＨＤ３、ＣＣＲ５、ＴＣＲ、ＣＩＳＨ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、および／またはこれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない遺伝子に特異的であり得る。
１または複数のトランス遺伝子は、異なる種に由来し得る。例えば、１または複数のトランス遺伝子は、ヒト遺伝子、マウス遺伝子、ラット遺伝子、ブタ遺伝子、ウシ遺伝子、イヌ遺伝子、ネコ遺伝子、サル遺伝子、チンパンジー遺伝子、またはこれらの任意の組合せを含み得る。例えば、トランス遺伝子は、ヒト遺伝子的配列を有するヒトに由来し得る。１または複数のトランス遺伝子は、ヒト遺伝子を含み得る。場合によって、１または複数のトランス遺伝子は、アデノウイルス遺伝子ではない。
トランス遺伝子は、上記で記載した通り、Ｔ細胞のゲノムへと、ランダムに挿入することもでき、部位特異的に挿入することもできる。例えば、トランス遺伝子は、Ｔ細胞のゲノム内のランダムな遺伝子座へと挿入することができる。これらのトランス遺伝子は、機能的、例えば、ゲノム内のいずれの場所に挿入されても完全に機能的であり得る。例えば、トランス遺伝子は、それ自体のプロモーターをコードする場合もあり、内因性プロモーターの制御下にある位置へと挿入される場合もある。代替的に、トランス遺伝子は、遺伝子のイントロンもしくは遺伝子のエクソン、プロモーター、または非コード領域などの遺伝子へと挿入することができる。トランス遺伝子は、挿入が、遺伝子、例えば、内因性チェックポイントを破壊するように挿入することができる。トランス遺伝子の挿入は、内因性チェックポイント領域を含み得る。トランス遺伝子の挿入は、トランス遺伝子を挟みうる組換えアームでガイドすることができる。
ある場合には、トランス遺伝子の１つを超えるコピーを、ゲノム内の、１つを超えるランダムな遺伝子座へと挿入することができる。例えば、複数のコピーを、ゲノム内のランダムな遺伝子座へと挿入することができる。これは、トランス遺伝子を、ランダムに、１回挿入する場合と比較した、全発現の増大をもたらし得る。代替的に、トランス遺伝子のコピーを、ある遺伝子へと挿入し、トランス遺伝子の別のコピーを、異なる遺伝子へと挿入することもできる。トランス遺伝子は、Ｔ細胞のゲノム内の特異的遺伝子座へと挿入され得るようにターゲティングすることができる。
トランス遺伝子の発現は、１または複数のプロモーターにより制御することができる。プロモーターは、遍在性プロモーター、構成的プロモーター（関連遺伝子の連続的転写を可能とする非調節性プロモーター）、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターであり得る。プロモーターと隣接して、またはこの近傍に挿入されるトランス遺伝子の発現は、調節することができる。例えば、トランス遺伝子は、遍在性プロモーターの近傍に、またはこの隣に挿入することができる。一部の遍在性プロモーターは、ＣＡＧＧＳプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはＲＯＳＡ２６プロモーターであり得る。
プロモーターは、内因性プロモーターの場合もあり、外因性プロモーターの場合もある。例えば、１または複数のトランス遺伝子は、内因性または外因性のＲＯＳＡ２６プロモーターと隣接して、またはこれらの近傍に挿入することができる。さらに、プロモーターは、Ｔ細胞に特異的であり得る。例えば、１または複数のトランス遺伝子は、ブタＲＯＳＡ２６プロモーターと隣接して、またはこれらの近傍に挿入することができる。
組織特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターを使用して、発現の位置を制御することができる。例えば、１または複数のトランス遺伝子は、組織特異的プロモーターと隣接して、またはこれらの近傍に挿入することができる。組織特異的プロモーターは、ＦＡＢＰプロモーター、Ｌｃｋプロモーター、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ケラチンプロモーター、アルブミンプロモーター、ａＰ２プロモーター、インスリンプロモーター、ＭＣＫプロモーター、ＭｙＨＣプロモーター、ＷＡＰプロモーター、またはＣｏｌ２Ａプロモーターであり得る。
組織特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターを使用して、発現の位置を制御することができる。例えば、１または複数のトランス遺伝子は、組織特異的プロモーターと隣接して、またはこれらの近傍に挿入することができる。組織特異的プロモーターは、ＦＡＢＰプロモーター、Ｌｃｋプロモーター、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ケラチンプロモーター、アルブミンプロモーター、ａＰ２プロモーター、インスリンプロモーター、ＭＣＫプロモーター、ＭｙＨＣプロモーター、ＷＡＰプロモーター、またはＣｏｌ２Ａプロモーターであり得る。
誘導性プロモーターも同様に、使用することができる。これらの誘導性プロモーターは、所望の場合、誘導剤を添加または除去することにより、オンにすることもでき、オフにすることもできる。誘導性プロモーターは、Ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢＡＤ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ＰＬ、ｃｓｐＡ、Ｔ７、ＶＨＢ、Ｍｘ、および／またはＴｒｅｘであり得るがこれらに限定されないことが想定される。
細胞は、内因性遺伝子をノックアウトするように操作することができる。ノックアウトされ得る内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含み得る。免疫チェックポイント遺伝子は、刺激性チェックポイント遺伝子の場合もあり、阻害性チェックポイント遺伝子の場合もある。免疫チェックポイント遺伝子の位置は、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３８ ｐａｔｃｈ ｒｅｌｅａｓｅ ２（ＧＲＣｈ３８．ｐ２）アセンブリーを使用して提示することができる。
ノックアウトされる遺伝子は、データベースを使用して選択することができる。場合によって、ある特定の内因性遺伝子は、ゲノム操作により適する。データベースは、エピジェネティクスにより許容性の標的部位を含み得る。データベースは、場合によって、ＥＮＣＯＤＥ（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ＤＮＡ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｇｏｖ／１０００５１０７）であり得る。データベースは、ゲノム操作の許容性がより大きい可能性がある、オープンクロマチンを伴う領域を同定し得る。
Ｔ細胞は、１または複数の遺伝子の破壊を含み得る。例えば、それらの発現が破壊される、１または複数の遺伝子は、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ）、ＣＤ２７６、Ｖセットドメイン含有Ｔ細胞活性化インヒビター１（ＶＴＣＮ１）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球関連（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、ＫＩＲ３ＤＬ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３ドメイン、長細胞質テール、１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）、ＶＩＳＴＡ（T細胞活性化のVドメイン免疫グロブリンサプレッサー）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＩＳＨ（サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、アデノ随伴ウイルス組込み部位（ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など））、またはケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（遺伝子／偽遺伝子）（ＣＣＲ５）、ＣＤ１６０分子（ＣＤ１６０）、ＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）、ＣＤ９６分子（ＣＤ９６）、ＣＲＴＡＭ（細胞傷害性および制御性Ｔ細胞分子）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン７（ＳＩＧＬＥＣ７）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン９（ＳＩＧＬＥＣ９）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、カスパーゼ８（ＣＡＳＰ８）、カスパーゼ１０（ＣＡＳＰ１０）、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、カスパーゼ６（ＣＡＳＰ６）、カスパーゼ７（ＣＡＳＰ７）、ＦＡＤＤ（Ｆａｓ関連細胞死ドメイン）、Ｆａｓ細胞表面細胞死受容体（ＦＡＳ）、形質転換増殖因子ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲＩＩ）、形質転換増殖因子ベータ受容体Ｉ（ＴＧＦＢＲ１）、ＳＭＡＤファミリーメンバー２（ＳＭＡＤ２）、ＳＭＡＤファミリーメンバー３（ＳＭＡＤ３）、ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）、ＳＫＩがん原遺伝子（ＳＫＩ）、ＳＫＩ様がん原遺伝子（ＳＫＩＬ）、ＴＧＩＦ１（ＴＧＦＢ誘導因子ホメオボックス１）、インターロイキン１０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１０ＲＡ）、インターロイキン１０受容体サブユニットベータ（ＩＬ１０ＲＢ）、ＨＭＯＸ２（ヘムオキシゲナーゼ２）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＩＬ６ＳＴ（インターロイキン６シグナル伝達因子）、ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ（ＣＳＫ）、ＰＡＧ１（グリコスフィンゴ脂質ミクロドメインにより膜アンカーされるリンタンパク質１）、ＳＩＴ１（シグナル閾値調節膜貫通アダプター１）、ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）、ＰＲドメイン１（ＰＲＤＭ１）、塩基性ロイシンジッパー転写因子、ＡＴＦ様（ＢＡＴＦ）、可溶型グアニル酸シクラーゼ１アルファ２（ＧＵＣＹ１Ａ２）、可溶型グアニル酸シクラーゼ１アルファ３（ＧＵＣＹ１Ａ３）、可溶型グアニル酸シクラーゼ１ベータ２（ＧＵＣＹ１Ｂ２）、可溶型グアニル酸シクラーゼ１ベータ３（ＧＵＣＹ１Ｂ３）、ＣＩＳＨ（サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質）、タンパク質のプロリルヒドロキシラーゼドメイン（ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＨＤ３）ファミリー、ＴＣＲのうちのいずれか１つ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。場合によって、内因性ＴＣＲもまた、ノックアウトすることができる。例えば、多様な組合せを例示するためだけに述べると、それらの発現が破壊される、１または複数の遺伝子は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＣＲ、およびＣＩＳＨを含み得る。
Ｔ細胞は、１または複数の遺伝子の抑制を含み得る。例えば、それらの発現が抑制される、１または複数の遺伝子は、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ）、ＣＤ２７６、Ｖセットドメイン含有Ｔ細胞活性化インヒビター１（ＶＴＣＮ１）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球関連（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、ＴＣＲ、ＫＩＲ３ＤＬ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３ドメイン、長細胞質テール、１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＩＳＨ（サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、アデノ随伴ウイルス組込み部位（ＡＡＶＳ１）、またはケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（遺伝子／偽遺伝子）（ＣＣＲ５）、ＣＤ１６０分子（ＣＤ１６０）、ＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）、ＣＤ９６分子（ＣＤ９６）、ＣＲＴＡＭ（細胞傷害性および制御性Ｔ細胞分子）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン７（ＳＩＧＬＥＣ７）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン９（ＳＩＧＬＥＣ９）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、カスパーゼ８（ＣＡＳＰ８）、カスパーゼ１０（ＣＡＳＰ１０）、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、カスパーゼ６（ＣＡＳＰ６）、カスパーゼ７（ＣＡＳＰ７）、ＦＡＤＤ（Ｆａｓ関連細胞死ドメイン）、Ｆａｓ細胞表面細胞死受容体（ＦＡＳ）、形質転換増殖因子ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲＩＩ）、形質転換増殖因子ベータ受容体Ｉ（ＴＧＦＢＲ１）、ＳＭＡＤファミリーメンバー２（ＳＭＡＤ２）、ＳＭＡＤファミリーメンバー３（ＳＭＡＤ３）、ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）、ＳＫＩがん原遺伝子（ＳＫＩ）、ＳＫＩ様がん原遺伝子（ＳＫＩＬ）、ＴＧＩＦ１（ＴＧＦＢ誘導因子ホメオボックス１）、インターロイキン１０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１０ＲＡ）、インターロイキン１０受容体サブユニットベータ（ＩＬ１０ＲＢ）、ＨＭＯＸ２（ヘムオキシゲナーゼ２）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＩＬ６ＳＴ（インターロイキン６シグナル伝達因子）、ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ（ＣＳＫ）、ＰＡＧ１（グリコスフィンゴ脂質ミクロドメインにより膜アンカーされるリンタンパク質１）、ＳＩＴ１（シグナル閾値調節膜貫通アダプター１）、ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）、ＰＲドメイン１（ＰＲＤＭ１）、塩基性ロイシンジッパー転写因子、ＡＴＦ様（ＢＡＴＦ）、可溶型グアニル酸シクラーゼ１アルファ２（ＧＵＣＹ１Ａ２）、可溶型グアニル酸シクラーゼ１アルファ３（ＧＵＣＹ１Ａ３）、可溶型グアニル酸シクラーゼ１ベータ２（ＧＵＣＹ１Ｂ２）、可溶型グアニル酸シクラーゼ１ベータ３（ＧＵＣＹ１Ｂ３）、タンパク質のプロリルヒドロキシラーゼドメイン（ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＨＤ３）ファミリー、ＣＩＳＨ（サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質）のうちのいずれか１つ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。例えば、多様な組合せを例示するためだけに述べると、それらの発現が抑制される、１または複数の遺伝子は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＣＲ、および／またはＣＩＳＨを含み得る。
ｄ．がん標的
操作細胞は、抗原をターゲティングし得る。操作細胞はまた、エピトープもターゲティングし得る。抗原は、腫瘍細胞抗原であり得る。エピトープは、腫瘍細胞エピトープであり得る。このような腫瘍細胞エピトープは、変異から生じる腫瘍に由来する抗原（ネオ抗原またはネオエピトープ）、共通の腫瘍特異的抗原、分化抗原、および腫瘍内で過剰発現する抗原など、多種多様な腫瘍抗原に由来し得る。これらの抗原は、例えば、少数を挙げれば、アルファ−アクチニン−４、ＡＲＴＣ１、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質（ｂ３ａ２）、Ｂ−ＲＡＦ、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ベータ−カテニン、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＯＡ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、ＧＰＮＭＢ、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２ｄ、ＨＬＡ−Ａｌ ｌｄ、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、ＭＡＲＴ２、ＭＥ１、ＭＵＭ−１ｆ、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐ５３、ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合タンパク質またはＳＹＴ−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、トリオースリンサンイソメラーゼ、ＢＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−１、２、８、Ｇａｇｅ ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶｆ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＬＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａｌ２、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ｍｕｃｉｎｋ、ＮＡ−８８、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＳＡＧＥ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２ｇ、ＸＡＧＥ−１ｂ、ＣＥＡ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、カリクレイン４、マンマグロビンＡ、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ＯＡ１、ＰＳＡ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、ａｄｉｐｏｐｈｉｌｉｎ、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＭＡ、ＢＩＮＧ−４、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、ＥＰ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＩＬ１３Ｒアルファ２、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファフェトタンパク質、Ｍ−ＣＳＦＴ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、ＭＭＰ−２、ＭＵＣ１、ｐ５３、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＧＳ５、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、セセルニン１、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、スルビビン、テロメラーゼ、ＶＥＧＦ、および／またはＷＴ１に由来し得る。腫瘍関連抗原は、宿主が正常では発現しない抗原の場合もあり；変異しているか、切断されているか、ミスフォールディングしているか、または他の形で、宿主が正常では発現しない分子の異常な兆候の場合もあり；正常でも発現するが、異常な高レベルで発現する分子と同一な場合もあり；異常な関連または環境で発現する場合もある。腫瘍関連抗原は、例えば、タンパク質もしくはタンパク質断片、複合体炭水化物、ガングリオシド、ハプテン、核酸、他の生物学的分子、またはこれらの任意の組合せであり得る。
場合によって、標的は、ネオ抗原またはネオエピトープである。例えば、ネオ抗原は、ＥＲＢＢ２ＩＰ内のＥ８０５Ｇ変異であり得る。場合によって、ネオ抗原およびネオエピトープは、全エクソームシーケンシングにより同定することができる。場合によって、ネオ抗原標的およびネオエピトープ標的は、消化器がん細胞が発現し得る。ネオ抗原およびネオエピトープは、上皮癌において発現し得る。
ｅ．他の標的
エピトープは、間質エピトープであり得る。このようなエピトープは、腫瘍微小環境の間質上にあり得る。抗原は、間質抗原であり得る。このような抗原は、腫瘍微小環境の間質上にあり得る。これらの抗原およびこれらのエピトープは、少数を挙げれば、例えば、腫瘍内皮細胞、腫瘍血管系、腫瘍線維芽細胞、腫瘍周皮細胞、腫瘍間質、および／または腫瘍間葉細胞において存在し得る。これらの抗原は、例えば、ＣＤ３４、ＭＣＳＰ、ＦＡＰ、ＣＤ３１、ＰＣＮＡ、ＣＤ１１７、ＣＤ４０、ＭＭＰ４、および／またはテネイシンを含み得る。
ｆ．遺伝子の破壊
トランス遺伝子の挿入は、遺伝子の破壊を伴って行うこともでき、これを伴わずに行うこともできる。トランス遺伝子を、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ＣＣＲ５、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＴＣＲ、またはＣＩＳＨなどの遺伝子と隣接して、これらの近傍に、またはこれらの中に挿入して、遺伝子の活性または発現を低減するかまたは消失させることができる。例えば、がん特異的ＴＣＲトランス遺伝子を、遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）と隣接して、この近傍に、またはこの中に挿入して、遺伝子の活性または発現を低減するかまたは消失させることができる。トランス遺伝子の挿入は、内因性ＴＣＲ遺伝子において行うことができる。
遺伝子の破壊は、任意の特定の遺伝子の破壊であり得る。本出願内の遺伝子の遺伝子相同体（例えば、遺伝子の任意の哺乳動物形）を対象とすることが想定される。例えば、破壊される遺伝子は、本明細書で開示される遺伝子、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＨＰＲＴ、ＣＣＲ５、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＴＣＲ、および／またはＣＩＳＨに対する、一定の同一性および／または相同性を呈し得る。したがって、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を呈するか、またはほぼこれらの比率の相同性（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）を呈する遺伝子は、破壊し得ることが想定される。また、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を呈するか、またはほぼこれらの比率の同一性（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）を呈する遺伝子は、破壊し得ることも想定される。当技術分野では、一部の遺伝子相同体は公知であるが、場合によって、相同体は公知ではない。しかし、哺乳動物の間で相同な遺伝子は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴなど、公表されているデータベースを使用して、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列またはタンパク質配列を比較することにより見出すことができる。
破壊され得る遺伝子は、遺伝子ファミリーのメンバーであり得る。例えば、破壊され得る遺伝子は、がん免疫療法の治療可能性を改善し得る。場合によって、遺伝子は、ＣＩＳＨであり得る。ＣＩＳＨ遺伝子は、ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質ファミリーまたはＳＴＡＴ誘導性ＳＴＡＴインヒビター（ＳＳＩ）タンパク質ファミリーとしてもまた公知である、サイトカイン誘導性ＳＴＡＴインヒビター（ＣＩＳ）タンパク質ファミリーのメンバーであり得る（例えば、Ｐａｌｍｅｒら、Ｃｉｓｈ ａｃｔｉｖｅｌｙ ｓｉｌｅｎｃｅｓ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｍａｉｎｔａｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０２巻（１２号）、２０９５〜２１１３頁（２０１５年）を参照されたい）。遺伝子は、サイトカインによるシグナル伝達を調節し得る、古典的な負のフィードバック系の一部を形成し得る、ＳＯＣＳタンパク質ファミリーの一部であり得る。破壊される遺伝子は、ＣＩＳＨであり得る。ＣＩＳＨは、エリスロポエチン、プロラクチン、またはインターロイキン３（ＩＬ−３）受容体など、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ５経路を介してシグナル伝達するサイトカインの負の調節に関与し得る。遺伝子は、そのチロシンリン酸化を抑制することにより、ＳＴＡＴ５のトランス活性化を阻害し得る。ＣＩＳＨファミリーメンバーは、サイトカインによるシグナル伝達の、サイトカイン誘導性の負の調節因子であることが公知である。遺伝子の発現は、造血系細胞内のＩＬ２、ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＥＰＯにより誘導することができる。プロテアソームを媒介する、遺伝子のタンパク質の分解は、エリスロポエチン受容体の不活化に関与し得る。場合によって、ターゲティングされる遺伝子は、腫瘍特異的Ｔ細胞内で発言し得る。ターゲティングされる遺伝子は、破壊されると、操作細胞の、抗原に関連する腫瘍への浸潤を増大させることができる。場合によって、ターゲティングされる遺伝子は、ＣＩＳＨであり得る。
破壊され得る遺伝子は、ＴＣＲシグナル伝達、機能的アビディティー、またはがんに対する免疫の減衰に関与し得る。場合によって、破壊される遺伝子は、ＴＣＲが刺激されると、上方調節される。遺伝子は、細胞の拡大、機能的アビディティー、またはサイトカインの多機能性の阻害に関与し得る。遺伝子は、細胞によるサイトカインの産生を負に調節することに関与し得る。例えば、遺伝子は、例えば、エフェクターサイトカイン、ＩＦＮ−ガンマ、および／またはＴＮＦの産生の阻害に関与し得る。遺伝子はまた、ＴＣＲの刺激の後で、ＩＬ−２など、補助的サイトカインの発現の阻害にも関与し得る。このような遺伝子は、ＣＩＳＨであり得る。
遺伝子の抑制はまた、多数の方式で行うこともできる。例えば、遺伝子の発現は、ノックアウトにより抑制することもでき、遺伝子のプロモーターを変化することにより抑制することもでき、かつ／または干渉性ＲＮＡを投与することにより抑制することもできる。これは、生物レベルで行うこともでき、組織レベル、臓器レベル、および／または細胞レベルで行うこともできる。細胞内、組織内、および／または臓器内で、１または複数の遺伝子をノックダウンする場合、１または複数の遺伝子は、ＲＮＡ干渉性試薬、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡを投与することにより抑制することができる。例えば、ｓｈＲＮＡを発現させうる核酸を、細胞へと、安定的にトランスフェクトして、発現をノックダウンすることができる。さらに、ｓｈＲＮＡを発現させうる核酸を、Ｔ細胞のゲノムへと挿入し、これにより、Ｔ細胞内の遺伝子をノックダウンすることもできる。
破壊法はまた、ドミナントネガティブのタンパク質を過剰発現させるステップも含み得る。この方法は、機能的な野生型遺伝子の機能の、全体的な減殺を結果としてもたらし得る。加えて、ドミナントネガティブの遺伝子を発現させるステップは、ノックアウトおよび／またはノックダウンの表現型と類似の表現型を結果としてもたらし得る。
ある場合には、終止コドンを、１または複数の遺伝子内に、挿入または創出（例えば、ヌクレオチドの置換により）することができ、これは、非機能的転写物または非機能的タンパク質を結果としてもたらし得る（ある場合には、ノックアウトと称する）。例えば、終止コドンを、１または複数の遺伝子の中央部において創出する場合、結果として得られる転写および／またはタンパク質は切断される可能性があり、非機能的であり得る。しかし、場合によって、切断は、活性（部分的に活性であるか、または過剰に活性の）タンパク質をもたらし得る。タンパク質が過剰に活性である場合、これは、ドミナントネガティブのタンパク質を結果としてもたらし得る。
このドミナントネガティブのタンパク質は、任意のプロモーターの制御下にある核酸内で発現させうる。例えば、プロモーターは、遍在性プロモーターであり得る。プロモーターはまた、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、および／または発生特異的プロモーターでもあり得る。
次いで、ドミナントネガティブのタンパク質をコードする核酸を、細胞へと挿入することができる。任意の方法を使用することができる。例えば、安定的なトランスフェクションを使用することができる。加えて、ドミナントネガティブのタンパク質をコードする核酸は、Ｔ細胞のゲノムへも挿入することができる。
Ｔ細胞内の１または複数の遺伝子は、任意の方法を使用して、ノックアウトまたは破壊することができる。例えば、１または複数の遺伝子のノックアウトは、１または複数の遺伝子を、Ｔ細胞のゲノムから欠失させることを含み得る。ノックアウトはまた、遺伝子配列の全部または一部を、Ｔ細胞から除去することも含み得る。また、ノックアウトは、Ｔ細胞のゲノム内の遺伝子の全部または一部を、１または複数のヌクレオチドで置き換えることを含み得ることも想定される。１または複数の遺伝子のノックアウトはまた、配列を、１または複数の遺伝子内に挿入し、これにより、１または複数の遺伝子の発現を破壊することも含み得る。例えば、配列の挿入は、終止コドンを、１または複数の遺伝子の中央部に作製し得る。配列の挿入はまた、１または複数の遺伝子のオープンリーディングフレームもシフトさせうる。
ノックアウトは、任意の細胞内、臓器内、および／または組織内、例えば、Ｔ細胞内、造血幹細胞内、骨髄中、および／または胸腺内で行うことができる。例えば、ノックアウトは、全身におけるノックアウトであることが可能であり、例えば、１または複数の遺伝子の発現が、ヒトの全ての細胞内で抑制される。ノックアウトはまた、ヒトの、１または複数の細胞、組織、および／または臓器に特異的でもあり得る。これは、１または複数の遺伝子の発現を、１または複数の臓器、組織、または細胞型において選択的に抑制する、条件的ノックアウトにより達成することができる。条件的ノックアウトは、ｃｒｅを、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、および／または臓器特異的プロモーターの制御下で発現させる、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系により実施することができる。例えば、１または複数の遺伝子を、１または複数の組織内または臓器内でノックアウトし得る（または発現を抑制し得る）が、この場合、１または複数の組織または臓器は、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、膵臓、小腸、大腸、骨格筋、平滑筋、皮膚、骨、脂肪組織、毛髪、甲状腺、気管、胆嚢、腎臓、尿管、膀胱、大動脈、静脈、食道、横隔膜、胃、直腸、副腎、気管支、耳、眼、網膜、生殖器、視床下部、喉頭、鼻、舌、脊髄、または尿管、子宮、卵巣、精巣、および／またはこれらの任意の組合せを含み得る。また、１つの細胞型内の、１または複数の遺伝子も、ノックアウトし得る（または発現を抑制し得る）が、この場合、１または複数の細胞型は、毛胞、角化細胞、性腺刺激物質産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｅ）、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、ソマトトロピン産生細胞、プロラクチン産生細胞、クロム親和性細胞、傍濾胞細胞、グロムス細胞、メラニン細胞、母斑細胞、メルケル細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、角膜実質細胞、網膜ミュラー細胞、網膜色素上皮細胞、ニューロン、グリア（例えば、希突起膠細胞、星状細胞）、脳室上衣細胞、松果体細胞、肺細胞（例えば、Ｉ型肺細胞およびＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、杯細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、腸管クロム親和性細胞、胃主細胞、壁細胞、胃小窩細胞、Ｋ細胞、Ｄ細胞、Ｉ細胞、杯細胞、パネート細胞、腸細胞、Ｍ細胞、肝細胞、肝星細胞（例えば、中胚葉に由来するクッパー細胞）、胆嚢細胞、腺房中心細胞、膵星細胞、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞、膵ε細胞、甲状腺（例えば、濾胞細胞）、副甲状腺（例えば、上皮小体主細胞）、好酸性細胞、尿路上皮細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋芽細胞、筋細胞、筋サテライト細胞、腱細胞、心筋細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、カハール介在細胞、血管芽細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞（例えば、糸球体内メサンギウム細胞および糸球体外メサンギウム細胞）、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）、間質細胞（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｅｌｌ）、テロサイト、単純上皮細胞、有足細胞、腎近位尿細管刷子縁細胞、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、顆粒膜細胞、非繊毛性上皮細胞、胚細胞、精子、卵子、リンパ球、骨髄性細胞、内皮前駆細胞、内皮幹細胞、血管芽細胞、中胚葉性血管芽細胞、周皮細胞、壁細胞、および／またはこれらの任意の組合せを含む。
場合によって、本開示の方法は、１または複数の細胞を、対象から得るステップを含み得る。細胞は一般に、膜内に封入された、細胞質、タンパク質、核酸、および／または細胞小器官を含む、任意の生物学的構造を指す場合がある。場合によって、細胞は、哺乳動物細胞であり得る。場合によって、細胞とは、免疫細胞を指す場合がある。細胞の非限定的な例は、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ系細胞、生得的リンパ系細胞（ＩＬＣ）、マクロファージ、マスト細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、前駆体細胞、形質細胞、前駆細胞、調節性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、これらの任意の分化細胞もしくは脱分化細胞、またはこれらの任意の細胞の混合物もしくは組合せを含み得る。
場合によって、細胞は、ＩＬＣであることが可能であり、ＩＬＣは、群１ ＩＬＣ、群２ ＩＬＣ、または群３ ＩＬＣである。群１ ＩＬＣは一般に、Ｔ−ｂｅｔ転写因子により制御され、細胞内の病原体に応答して、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファなど、１型サイトカインを分泌する細胞として記載することができる。群２ ＩＬＣは一般に、ＧＡＴＡ−３転写因子およびＲＯＲ−アルファ転写因子に依拠し、細胞外の寄生虫感染症に応答して、２型サイトカインを産生する細胞として記載することができる。群３ ＩＬＣは一般に、ＲＯＲ−ガンマ転写因子により制御され、ＩＬ−１７および／またはＩＬ−２２を産生する細胞として記載することができる。
場合によって、細胞は、所与の因子について陽性の細胞の場合もあり、所与の因子について陰性の細胞の場合もある。場合によって、細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ３−細胞、ＣＤ５＋細胞、ＣＤ５−細胞、ＣＤ７＋細胞、ＣＤ７−細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１４−細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ８−細胞、ＣＤ１０３＋細胞、ＣＤ１０３−細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１１ｂ−細胞、ＢＤＣＡ１＋細胞、ＢＤＣＡ１−細胞、Ｌ−セレクチン＋細胞、Ｌ−セレクチン−細胞、ＣＤ２５＋、ＣＤ２５−細胞、ＣＤ２７＋、ＣＤ２７−細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ２８−細胞、ＣＤ４４＋細胞、ＣＤ４４−細胞、ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ５６−細胞、ＣＤ５７＋細胞、ＣＤ５７−細胞、ＣＤ６２Ｌ＋細胞、ＣＤ６２Ｌ−細胞、ＣＤ６９＋細胞、ＣＤ６９−細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ−細胞、ＣＤ１２７＋細胞、ＣＤ１２７−細胞、ＣＤ１３２＋細胞、ＣＤ１３２−細胞、ＩＬ−７＋細胞、ＩＬ−７−細胞、ＩＬ−１５＋細胞、ＩＬ−１５−細胞、レクチン様受容体Ｇ１陽性細胞、レクチン様受容体Ｇ１陰性細胞、またはこれらの分化細胞もしくは脱分化細胞であり得る。細胞が発現する因子の例は、限定的であることを意図するものではなく、当業者は、細胞が、当技術分野で公知の任意の因子について陽性の場合もあり、陰性の場合もあることを察知するであろう。場合によって、細胞は、２つまたはそれよりも多い因子について陽性であり得る。例えば、細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋であり得る。場合によって、細胞は、２つまたはそれよりも多い因子について陰性であり得る。例えば、細胞は、ＣＤ２５−、ＣＤ４４−、およびＣＤ６９−であり得る。場合によって、細胞は、１または複数の因子について陽性であり得、かつ、１または複数の因子について陰性であり得る。例えば、細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８−であり得る。次いで、選択した細胞を、対象へと注入することができる。場合によって、細胞を、１または複数の所与の因子を有するかまたは有さないことについて選択することができる（例えば、細胞を、１または複数の因子の有無に基づき分離することができる）。分離効率は、細胞の生存率と、トランス遺伝子を、細胞のゲノムへと組み込み、かつ／または発現させ得る効率とに影響を及ぼし得る。場合によって、選択した細胞はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大することもできる。選択した細胞は、注入の前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大することができる。本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおいて使用される細胞は、本明細書で開示される細胞のうちのいずれかの混合物（例えば、２つまたはそれよりも多い異なる細胞）であり得ることを理解されたい。例えば、本開示の方法は、細胞を含むことが可能であり、細胞は、ＣＤ４＋細胞と、ＣＤ８＋細胞との混合物である。別の例では、本開示の方法は、細胞を含むことが可能であり、細胞は、ＣＤ４＋細胞と、ナイーブ細胞との混合物である。
ナイーブ細胞は、本明細書で開示される方法に特に有用であり得る、いくつかの特性を保持する。例えば、ナイーブ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける拡大およびＴ細胞受容体トランス遺伝子の発現がたやすく可能であり、少数の末端分化マーカーを呈し（細胞の注入後におけるより大きな効能と関連し得る資質）、増殖のより大きな潜在的可能性を示唆する、長いテロメアを保持する（Hinrichs, C.S.ら、「Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy」、Blood、１１７巻（３号）：８０８〜１４頁（２０１１年））。本明細書で開示される方法は、ナイーブ細胞に特異的なマーカーの選択または負の選択を含み得る。場合によって、細胞は、ナイーブ細胞であり得る。ナイーブ細胞は一般に、抗原へと曝露されていない、任意の細胞を指す場合がある。本開示における任意の細胞は、ナイーブ細胞であり得る。一例では、細胞は、ナイーブＴ細胞であり得る。ナイーブＴ細胞は一般に、骨髄中で分化し、胸腺内の中枢性選択の正の過程および負の過程を経ることに成功し、かつ／または特異的マーカーの発現もしくは非存在（例えば、Ｌ−セレクチンの表面発現、活性化マーカーである、ＣＤ２５、ＣＤ４４、またはＣＤ６９の非存在、メモリーＣＤ４５ＲＯアイソフォームの非存在）によって特徴付けられ得る細胞であると記載することができる。
場合によって、細胞は、細胞株（例えば、不死化細胞株）を含み得る。細胞株の非限定的な例は、ヒトＢＣ−１細胞、ヒトＢＪＡＢ細胞、ヒトＩＭ−９細胞、ヒトＪｉｙｏｙｅ細胞、ヒトＫ−５６２細胞、ヒトＬＣＬ細胞、マウスＭＰＣ−１１細胞、ヒトＲａｊｉ細胞、ヒトＲａｍｏｓ細胞、マウスＲａｍｏｓ細胞、ヒトＲＰＭＩ８２２６細胞、ヒトＲＳ４−１１細胞、ヒトＳＫＷ６．４細胞、ヒト樹状細胞、マウスＰ８１５細胞、マウスＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＨＬ−６０細胞、ヒトＮＡＭＡＬＷＡ細胞、ヒトマクロファージ細胞、マウスＲＡＷ ２６４．７細胞、ヒトＫＧ−１細胞、マウスＭ１細胞、ヒトＰＢＭＣ細胞、マウスＢＷ５１４７（Ｔ２００−Ａ）５．２細胞、ヒトＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、マウスＥＬ４細胞、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞、ヒトＳＣＩＤ．ａｄｈ細胞、ヒトＵ−９３７細胞、またはこれらの細胞の任意の組合せを含む。
幹細胞は、様々な体細胞をもたらすことが可能であり、したがって、原理的に、事実上任意の種類の治療用細胞の、無限の供給源として用いられる潜在的可能性を有し得る。幹細胞の再プログラム能力はまた、再プログラム細胞の治療的価値を増強するように、さらなる操作も可能とする。本開示の方法のうちのいずれかにおいて、１または複数の細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞の非限定的な例は、胚性幹細胞、成体幹細胞、組織特異的幹細胞、神経幹細胞、同種幹細胞、全能性幹細胞、複能性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、臍帯幹細胞、上皮幹細胞、または脂肪由来幹細胞を含む。一例では、細胞は、造血幹細胞由来のリンパ系前駆細胞であり得る。別の例では、細胞は、胚性幹細胞由来のＴ細胞であり得る。さらに別の例では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のＴ細胞であり得る。
条件的ノックアウトは、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター、発生特異的プロモーターを使用することによる、誘導性ノックアウトであり得る。これは、任意の時点または特異的時点において、遺伝子／タンパク質の発現を消失させるか、または抑制することを可能とし得る。例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーターの場合、テトラサイクリンは、生後任意の時点において、Ｔ細胞へ与えることができる。ｃｒｅ／ｌｏｘ系はまた、発生特異的プロモーターの制御下も可能である。例えば、一部のプロモーターは、生後なおまたは思春期の開始後にオンとなる。これらのプロモーターは、ｃｒｅ発現を制御するのに使用することができ、したがって、発生特異的ノックアウトにおいて使用することができる。
また、ノックアウト技術の任意の組合せを実行し得ることも想定される。例えば、組織特異的ノックアウトまたは細胞特異的ノックアウトを、誘導技術と組み合わせ、組織特異的または細胞特異的な誘導性ノックアウトを創出することができる。さらに、発生特異的プロモーターなどの他の系を、組織特異的プロモーターおよび／または誘導性ノックアウトと組み合わせて使用することもできる。
ノックアウト技術はまた、遺伝子編集も含み得る。例えば、遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびメガヌクレアーゼを含むヌクレアーゼを使用して実施することができる。ヌクレアーゼは、天然で存在するヌクレアーゼの場合もあり、遺伝子改変ヌクレアーゼの場合もあり、かつ／または組換えヌクレアーゼの場合もある。遺伝子編集はまた、トランスポゾンベースの系（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ）を使用して実施することもできる。例えば、遺伝子編集は、トランスポザーゼを使用して実施することができる。
場合によって、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドは、少なくとも１個の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）中に切断を導入する。場合によって、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドは、少なくとも１個の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）の不活化または発現の低減を含む、および／またはもたらす。場合によって、遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＴＣＲ、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ）、ＣＤ２７６、Ｖセットドメイン含有Ｔ細胞活性化インヒビター１（ＶＴＣＮ１）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球関連（ＢＴＬＡ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、ＫＩＲ３ＤＬ１（ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｔｈｒｅｅ ｄｏｍａｉｎｓ，ｌｏｎｇ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ １）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー）、ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、アデノ随伴ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）、またはケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（遺伝子／偽遺伝子）（ＣＣＲ５）、ＣＤ１６０分子（ＣＤ１６０）、ＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）、ＣＤ９６分子（ＣＤ９６）、ＣＲＴＡＭ（細胞傷害性および制御性Ｔ細胞分子）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン７（ＳＩＧＬＥＣ７）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン９（ＳＩＧＬＥＣ９）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ａ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、カスパーゼ８（ＣＡＳＰ８）、カスパーゼ１０（ＣＡＳＰ１０）、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、カスパーゼ６（ＣＡＳＰ６）、カスパーゼ７（ＣＡＳＰ７）、ＦＡＤＤ（Ｆａｓ関連細胞死ドメイン）、Ｆａｓ細胞表面細胞死受容体（ＦＡＳ）、形質転換増殖因子ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲＩＩ）、形質転換増殖因子ベータ受容体Ｉ（ＴＧＦＢＲ１）、ＳＭＡＤファミリーメンバー２（ＳＭＡＤ２）、ＳＭＡＤファミリーメンバー３（ＳＭＡＤ３）、ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）、ＳＫＩがん原遺伝子（ＳＫＩ）、ＳＫＩ様がん原遺伝子（ＳＫＩＬ）、ＴＧＩＦ１（ＴＧＦＢ誘導因子ホメオボックス１）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、インターロイキン１０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１０ＲＡ）、インターロイキン１０受容体サブユニットベータ（ＩＬ１０ＲＢ）、ＨＭＯＸ２（ヘムオキシゲナーゼ２）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＩＬ６ＳＴ（インターロイキン６シグナル伝達因子）、ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ（ＣＳＫ）、ＰＡＧ１（グリコスフィンゴ脂質ミクロドメインにより膜アンカーされるリンタンパク質１）、ＳＩＴ１（シグナル閾値調節膜貫通アダプター１）、ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）、ＰＲドメイン１（ＰＲＤＭ１）、塩基性ロイシンジッパー転写因子、ＡＴＦ様（ＢＡＴＦ）、可溶型グアニル酸シクラーゼ１アルファ２（ＧＵＣＹ１Ａ２）、可溶型グアニル酸シクラーゼ１アルファ３（ＧＵＣＹ１Ａ３）、可溶型グアニル酸シクラーゼ１ベータ２（ＧＵＣＹ１Ｂ２）、タンパク質のプロリルヒドロキシラーゼドメイン（ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＨＤ３）ファミリー、または可溶型グアニル酸シクラーゼ１ベータ３（ＧＵＣＹ１Ｂ３）、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子座（ＴＲＡ）、Ｔ細胞受容体ベータ遺伝子座（ＴＲＢ）、ｅｇｌ−９ファミリーの低酸素症誘導性因子１（ＥＧＬＮ１）、ｅｇｌ−９ファミリーの低酸素症誘導性因子２（ＥＧＬＮ２）、ｅｇｌ−９ファミリーの低酸素症誘導性因子３（ＥＧＬＮ３）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（タンパク質ホスファターゼ１調節サブユニット１２Ｃ）、およびこれらの任意の組合せまたは誘導体からなる群から選択される。
ＣＲＩＳＰＲ系
本明細書で記載される方法は、ＣＲＩＳＰＲ系を利用し得る。少なくとも５つの種類のＣＲＩＳＰＲ系が存在し、これらは全て、ＲＮＡタンパク質およびＣａｓタンパク質を包含する。Ｉ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型は、ｃｒＲＮＡと相補的な核酸を切断することが可能な、多Ｃａｓタンパク質複合体をアセンブルする。Ｉ型およびＩＩＩ型はいずれも、プロセシングされたｃｒＲＮＡを、多Ｃａｓタンパク質複合体へとアセンブリングする前に、プレｃｒＲＮＡのプロセシングを要求する。ＩＩ型およびＶ型のＣＲＩＳＰＲ系は、少なくとも１つのガイドＲＮＡと複合体化させた、単一のＣａｓタンパク質を含む。
ＣＲＩＳＰＲ系の一般的な機構および近年における進歩については、Ｃｏｎｇ， Ｌ．ら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３９巻（６１２１号）：８１９〜８２３頁（２０１３年）；Ｆｕ， Ｙ．ら、「Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１巻、８２２〜８２６頁（２０１３年）；Ｃｈｕ， ＶＴら、「Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３３巻、５４３〜５４８頁（２０１５年）；Ｓｈｍａｋｏｖ， Ｓ．ら、「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、６０巻、１〜１３頁（２０１５年）；Ｍａｋａｒｏｖａ， ＫＳら、「Ａｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，」、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１３巻、１〜１５頁（２０１５年）において論じられている。標的ＤＮＡの部位特異的切断は、１）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡ（また、プロトスペーサーとも呼ばれる）との塩基対合相補性、および２）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称する、標的ＤＮＡ内の短いモチーフの両方により決定される位置において生じる。例えば、操作細胞は、ＣＲＩＳＰＲ系、例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系を使用して作製することができる。本明細書で開示される方法において使用されるＣａｓ酵素は、ＤＮＡの切断を触媒するＣａｓ９であり得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、または任意の近縁のＣａｓ９による酵素作用により、２０ヌクレオチドのガイド配列にハイブリダイズし、２０ヌクレオチドの標的配列に後続してプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する標的部位配列において、二本鎖切断を生じることができる。
ＣＲＩＳＰＲ系は、任意の手段を使用して細胞または細胞の集団へと導入することができる。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系は、電気穿孔またはヌクレオフェクションによって導入し得る。電気穿孔は、例えば、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施することができ、またはＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）もまた、細胞への核酸の送達のために使用することができる。電気穿孔パラメータは、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するように調整することができる。電気穿孔デバイスは、指数関数的減衰、時定数、および方形波など、複数の電気波形パルスの設定項目を有し得る。あらゆる細胞型は、適用されるパルスパラメータ（例えば、電圧、キャパシタンス、および抵抗）に依存する、固有の最適電界強度（Ｅ）を有する。最適電界強度の適用は、膜貫通電圧の誘導による電気透過化であって、核酸が細胞膜を通過することを可能とする電気透過化を引き起こす。場合によって、電気穿孔パルスの電圧、電気穿孔パルス幅、パルス数、細胞密度、およびチップ型は、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するように調整することができる。
ａ．Ｃａｓタンパク質
ベクターは、Ｃａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）など、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする、酵素コード配列に作動可能に連結することができる。場合によって、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドはＣＲＩＳＰＲ系に由来する（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）。Ｃａｓタンパク質の比限定的な例は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としてもまた公知である）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体、またはそれらの修飾形を含み得る。場合によって、触媒不活性なＣａｓタンパク質を使用することができる（例えば、触媒不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９））。Ｃａｓ９などの非修飾のＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ切断活性を有し得る。場合によって、ヌクレアーゼはＣａｓ９である。場合によって、ポリペプチドはＣａｓ９をコードする。場合によって、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドは、触媒不活性である。場合によって、ヌクレアーゼは、触媒不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である。場合によって、ポリペプチドは、触媒不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）をコードする。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内および／または標的配列の相補体内などの、標的配列の一方または両方の鎖の切断を導くことができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから、塩基対内の、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００もしくはそれより多くの塩基対内の一方または両方の鎖の切断を導くことができる。変異体ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素と比べて変異させたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを使用することができる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９ＨｉＦｉなど、高忠実度のＣａｓタンパク質であり得る。
１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０を超えるＮＬＳ、またはほぼこれらの数を超えるＮＬＳなど、１または複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを使用することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端において、またはこの近傍に、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０を超えるＮＬＳ、またはほぼこれらの数を超えるＮＬＳを含む場合もあり、カルボキシル末端において、またはこの近傍に、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０を超えるＮＬＳ、またはほぼこれらの数を超えるＮＬＳを含む場合もあり、これらの任意の組合せ（例えば、アミノ末端における１または複数のＮＬＳと、カルボキシル末端における１または複数のＮＬＳとの組合せ）を含む場合もある。１つを超えるＮＬＳが存在する場合、単一のＮＬＳが、１つを超えるコピーで、かつ／または１もしくは複数のコピーで存在する、他の１もしくは複数のＮＬＳと組み合わせて存在し得るように、各ＮＬＳは、他のＮＬＳから独立に選択することができる。
Ｃａｓ９とは、例示的な野生型のＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９ ）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／もしくは配列類似性、または少なくともほぼこれらの比率の配列同一性および／もしくは配列類似性を伴うポリペプチドを指す場合がある。Ｃａｓ９とは、例示的な野生型のＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する）に対して、最大で５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／もしくは配列類似性、または最大でほぼこれらの比率の配列同一性および／もしくは配列類似性を伴うポリペプチドを指す場合がある。Ｃａｓ９とは、Ｃａｓ９タンパク質の野生型形態を指す場合もあり、欠失、挿入、置換、変異体、変異、融合、キメラ、またはこれらの任意の組合せなどのアミノ酸変化を含み得る、Ｃａｓ９タンパク質の修飾形態を指す場合もある。
ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質）をコードするポリヌクレオチドは、真核細胞など、特定の細胞内の発現のために、コドンを最適化することができる。この種の最適化は、同一のタンパク質をコードしながら、意図される宿主生物または宿主細胞のコドン優先性を模倣するように、外来由来の（例えば、組換え）ＤＮＡの変異を伴い得る。
方法において使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＮＬＳを含み得る。ＮＬＳは、ポリペプチド鎖内の任意の位置、例えば、Ｎ末端またはＣ末端の近傍に位置し得る。例えば、ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端から、ポリペプチド鎖に沿って、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０アミノ酸以内であるか、またはほぼこれらの数のアミノ酸以内であり得る。ある場合には、ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端から、５０アミノ酸もしくはそれよりも多い数のアミノ酸、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００アミノ酸以内であるか、またはほぼこれらの数のアミノ酸以内であり得る。
ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼは、例示的な野生型の部位指向型ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９）のヌクレアーゼドメインに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性、または少なくともほぼこれらの比率のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（表１１）を一般に、ゲノム操作のためのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとして使用するが、どの標的切出し部位にも最良のエンドヌクレアーゼではない場合もある。例えば、ＳｐＣａｓ９のためのＰＡＭ配列（５’ＮＧＧ３’）は、ヒトゲノム全体を通して夥多であるが、ＮＧＧ配列は、修飾に所望される遺伝子を適正にターゲティングするように位置しない場合がある。場合によって、異なるエンドヌクレアーゼを使用して、ある特定のゲノム標的をターゲティングすることができる。場合によって、ＮＧＧ以外のＰＡＭ配列を伴う、合成ＳｐＣａｓ９由来の変異体を使用することができる。加えて、多様な種に由来する、他のＣａｓ９オーソログも同定されており、これらの「非ＳｐＣａｓ９」は、様々なＰＡＭ配列に結合し、これらもまた、本開示に有用であり得るだろう。例えば、ＳｐＣａｓ９の比較的大きなサイズ（約４ｋｂのコード配列）は、ＳｐＣａｓ９ ｃＤＮＡを保有するプラスミドは、細胞内で効率的に発現しえないことを意味する。逆に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）のコード配列はおよそ、ＳｐＣａｓ９より１キロベース短く、おそらく、細胞内の効率的な発現を可能とする。ＳｐＣａｓ９と同様に、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼも、ｉｎ ｖｉｔｒｏの哺乳動物細胞内、およびマウスのｉｎ ｖｉｖｏにおいて、標的遺伝子を修飾することが可能である。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９への代替法は、Ｃｐｆ１ファミリーに由来する、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼであって、哺乳動物細胞内の切断活性を提示するエンドヌクレアーゼを含み得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼと異なり、Ｃｐｆ１を媒介するＤＮＡの切断の結果は、短い３’突出を伴う二本鎖切断である。Ｃｐｆ１の付着末端型切断パターンは、従来の制限酵素クローニングと類似する指向性遺伝子移入であって、遺伝子編集の効率を増大させる指向性遺伝子移入の可能性を開きうる。上記で記載したＣａｓ９の変異体およびオーソログと同様に、Ｃｐｆ１もまた、ＣＲＩＳＰＲにより、ＳｐＣａｓ９が優先するＮＧＧ ＰＡＭ部位を欠く、ＡＴリッチ領域またはＡＴリッチゲノムへとターゲティングし得る部位の数を拡大し得る。
任意の機能的濃度のＣａｓタンパク質を、細胞へと導入することができる。例えば、１５マイクログラムのＣａｓ ｍＲＮＡを、細胞へと導入することができる。他の場合には、０．５マイクログラム〜１００マイクログラムのＣａｓ ｍＲＮＡを導入することができる。０．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００マイクログラムのＣａｓ ｍＲＮＡを導入することができる。
場合によって、二重ニカーゼ法を使用して、二本鎖切断またはゲノム切断を導入することができる。Ｃａｓタンパク質は、いずれかのヌクレアーゼドメイン内の公知のアミノ酸において変異させ、これにより、１つのヌクレアーゼドメインの活性を欠失させ、一本鎖切断を生じることが可能な、ニカーゼＣａｓタンパク質を作製することができる。２つの顕著に異なるガイドＲＮＡターゲティング逆鎖を伴うニカーゼは、標的部位内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するのに使用することができる（「二重ニック」ＣＲＩＳＰＲ系または「二重ニカーゼ」ＣＲＩＳＰＲ系と称することが多い）。この手法は、２つのオフターゲットニックが、ＤＳＢを引き起こすのに十分に近接して作製される可能性は小さいので、標的特異性を増大させ得る。
ｂ．ガイディングポリ核酸（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）
ガイディングポリ核酸（またはガイドポリ核酸）は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ガイディングポリ核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。場合によって、ガイディングポリ核酸は、一本鎖領域と二本鎖領域との領域を含有し得る。ガイディングポリ核酸はまた、二次構造を形成し得る。場合によって、ガイディングポリ核酸は、ホスホロチオエートであり得るヌクレオチド間連結を含有し得る。任意の数のホスホロチオエートが存在し得る。例えば、１〜約１００のホスホロチオエートが、ガイディングポリ核酸配列内に存在し得る。場合によって、１〜１０のホスホロチオエートが存在する。場合によって、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のホスホロチオエートがガイディングポリ核酸配列内に存在する。
本明細書で使用される「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」という用語、およびその文法的同等物は、標的ＤＮＡに特異的であることが可能であり、Ｃａｓタンパク質などのヌクレアーゼと複合体を形成し得るＲＮＡを指す場合がある。ガイドＲＮＡは、標的部位を指定し、ＲＮＡ／Ｃａｓ複合体を、切断のために指定される標的ＤＮＡへとガイドする、ガイド配列またはスペーサー配列を含み得る。例えば、図１５は、ガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ複合体を、３つの遺伝子へとターゲティングし、ターゲティングされた二本鎖切断を実施し得ることを裏付ける。標的ＤＮＡの部位特異的切断は、１）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの塩基対合相補性（また、プロトスペーサーとも呼ばれる）、および２）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称する、標的ＤＮＡ内の短いモチーフの両方により決定される位置において生じる。同様に、ガイドＲＮＡ（「ｇＤＮＡ」）は、標的ＤＮＡに特異的であり得、ヌクレアーゼと複合体を形成して、その核酸切断活性を導くことができる。
本明細書で開示される方法はまた、細胞もしくは胚または細胞の集団へと、少なくとも１つのガイドポリ核酸（例えば、ガイドＤＮＡ、もしくはガイドＲＮＡ）または核酸（例えば、少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）を導入するステップを含み得る。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼと相互作用して、エンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼを、ガイドＲＮＡの５’末端が染色体配列内の特異的プロトスペーサー配列と塩基対合する特異的標的部位へと導きうる。場合によって、ガイドポリ核酸は、ｇＲＮＡおよび／またはｇＤＮＡであり得る。場合によって、ガイドポリ核酸は、少なくとも１個の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ）に対する相補配列を有しうる。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系は、ガイドポリ核酸を含む。場合によって、ＣＲＩＳＰＲ系は、ガイドポリ核酸および／またはヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼをコードするポリペプチドを含む。場合によって、本開示の方法または系は、ガイドポリ核酸および／またはヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼをコードするポリペプチドをさらに含む。場合によって、ガイドポリ核酸は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドが細胞または細胞の集団に導入されるのと同時に、その前に、またはその後に導入される。場合によって、ガイドポリ核酸は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターまたは非ウイルス（例えば、ミニサークル）ベクターが細胞または細胞の集団に導入されるのと同時に、その前に、またはその後に導入される（例えば、ガイドポリ核酸は、少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むＡＡＶベクターが細胞または細胞の集団に導入されるのと同時に、その前に、またはその後に導入される）。
ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。ガイドＲＮＡは、ある場合には、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの部分（例えば、機能的な部分）の融合により形成される、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み得る。ガイドＲＮＡはまた、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡでもあり得る。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含むことが可能であり、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠きうる。さらに、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡまたはプロトスペーサー配列とハイブリダイズし得る。
上記で論じた通り、ガイドＲＮＡは、発現産物であり得る。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターであり得る。ガイドＲＮＡは、細胞または生物に、ガイドＲＮＡをコードする配列およびプロモーターを含む単離ガイドＲＮＡまたは単離プラスミドＤＮＡをトランスフェクトすることにより、細胞または生物へと移入させることができる。ガイドＲＮＡはまた、ウイルスを媒介する遺伝子送達を使用するなど、他の形で、細胞または生物へと移入させることもできる。
ガイドＲＮＡは、単離ガイドＲＮＡであり得る。例えば、ガイドＲＮＡは、単離ＲＮＡの形態で、細胞または生物へとトランスフェクトすることができる。ガイドＲＮＡは、任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系を使用する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により調製することができる。ガイドＲＮＡは、細胞へと、ガイドＲＮＡのコード配列を含むプラスミドの形態ではなく、単離ＲＮＡの形態で移入させることができる。
ガイドＲＮＡは、ＤＮＡターゲティングセグメントおよびタンパク質結合性セグメントを含み得る。ＤＮＡターゲティングセグメント（またはＤＮＡターゲティング配列、またはスペーサー配列）は、標的ＤＮＡ内の特異的配列（例えば、プロトスペーサー）と相補的であり得るヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合性セグメント（またはタンパク質結合性配列）は、部位指向型修飾性ポリペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質など、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼと相互作用し得る。「セグメント」とは、分子のセグメント／区画／領域、例えば、ＲＮＡ内のヌクレオチドの連続的連なりを意味する。セグメントはまた、セグメントが、１つを超える分子の領域を含み得るように、複合体の領域／区画も意味する。例えば、場合によって、ＤＮＡターゲティングＲＮＡのタンパク質結合性セグメントは、１つのＲＮＡ分子およびタンパク質結合性セグメントであり、したがって、このＲＮＡ分子の領域を含む。他の場合には、ＤＮＡターゲティングＲＮＡのタンパク質結合性セグメントは、相補性領域に沿ってハイブリダイズさせた、２つの個別の分子を含む。
ガイドＲＮＡは、２つの個別のＲＮＡ分子を含む場合もあり、単一のＲＮＡ分子を含む場合もある。例示的な単一分子のガイドＲＮＡは、ＤＮＡターゲティングセグメントおよびタンパク質結合性セグメントの両方を含む。
例示的な２分子型ＤＮＡターゲティングＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含み得る。第１のＲＮＡ分子は、ＤＮＡターゲティングセグメント（例えば、スペーサー）を含み得るｃｒＲＮＡ様分子（ターゲターＲＮＡ）と、ガイドＲＮＡのタンパク質結合性セグメントを含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）による二重鎖の半分を形成し得る、ヌクレオチドの連なりとであり得る。第２のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡのタンパク質結合性セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の他の半分を形成し得る、ヌクレオチドの連なりを含み得る、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（アクチベーターＲＮＡ）であり得る。言い換えれば、ｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチドの連なりは、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチドの連なりと相補的であることが可能であり、これとハイブリダイズして、ガイドＲＮＡのタンパク質結合性ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成し得る。したがって、各ｃｒＲＮＡ様分子は、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を有するということができる。加えて、ｃｒＲＮＡ様分子は、一本鎖ＤＮＡターゲティングセグメントまたはスペーサー配列ももたらし得る。したがって、ｃｒＲＮＡ様分子と、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（対応する対としての）とは、ハイブリダイズして、ガイドＲＮＡを形成し得る。対象の２分子型ガイドＲＮＡは、任意の対応する、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの対を含み得る。
ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントまたはスペーサー配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントが、標的部位またはプロトスペーサーと塩基対合し得るように、染色体配列内の標的部位における配列、例えば、プロトスペーサー配列と相補的であり得る。場合によって、ガイドＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメントは、１０ヌクレオチドまたはほぼこの数のヌクレオチド〜２５もしくはほぼこの数のヌクレオチドまたはそれよりも多いヌクレオチドを含み得る。例えば、ガイドＲＮＡの第１の領域と、染色体配列内の標的部位との塩基対合の領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、もしくは２５を超えるヌクレオチドの長さであり得るか、またはほぼこの長さであり得る。ある場合には、ガイドＲＮＡの第１の領域は、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチドの長さであり得るか、またはほぼこの長さであり得る。
ガイドＲＮＡは、２０ヌクレオチドの核酸配列をまたはほぼこの長さの核酸配列をターゲティングし得る。標的核酸は、２０ヌクレオチド未満またはほぼこの長さ未満であり得る。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、もしくはそれよりも多いヌクレオチド、または少なくともほぼこの長さであり得る。標的核酸は、最大で、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、もしくはそれよりも多いヌクレオチド、または最大でこの長さであり得る。標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドのすぐの５’側の２０塩基であり得るか、またはほぼこの長さであり得る。ガイドＲＮＡは、核酸配列をターゲティングし得る。場合によって、ガイドＲＮＡなどのガイディングポリ核酸は、約１塩基対〜約２０塩基対、ＰＡＭから離れたゲノム領域に結合し得る。ガイドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大約２０塩基対、ＰＡＭから離れたゲノム領域に結合し得る。
ガイド核酸、例えば、ガイドＲＮＡは、別の核酸、例えば、細胞ゲノム内の標的核酸またはプロトスペーサーにハイブリダイズし得る核酸を指す場合がある。ガイド核酸は、ＲＮＡであり得る。ガイド核酸は、ＤＮＡであり得る。ガイド核酸は、核酸部位の配列に特異的に結合するように、プログラムまたはデザインすることができる。ガイド核酸は、ポリヌクレオチド鎖を含むことが可能であり、単一のガイド核酸と呼ばれうる。ガイド核酸は、２つのポリヌクレオチド鎖を含むことが可能であり、二重ガイド核酸と呼ばれうる。
ガイド核酸は、核酸に新たな特色または増強された特色をもたらす、１または複数の修飾を含み得る。ガイド核酸は、核酸アフィニティータグを含み得る。ガイド核酸は、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、および／または修飾ヌクレオチドを含み得る。
ガイド核酸は、例えば、５’末端もしくは３’末端において、またはこの近傍に、標的核酸内の配列（例えば、プロトスペーサー）にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列（例えば、スペーサー）を含み得る。ガイド核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して、配列特異的に、標的核酸と相互作用し得る。スペーサー配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側または３’側に位置する標的核酸にハイブリダイズし得る。スペーサー配列の長さは、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、もしくはそれよりも多いヌクレオチド、または少なくともほぼこの長さであり得る。スペーサー配列の長さは、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、もしくはそれよりも多いヌクレオチド、または最大でほぼこの長さであり得る。
ガイドＲＮＡはまた、二次構造を形成するｄｓＲＮＡ二重鎖領域も含み得る。例えば、ガイドＲＮＡにより形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）およびループを含み得る。ループおよびステムの長さは、変動し得る。例えば、ループは、約３〜約１０ヌクレオチドの長さの範囲であることが可能であり、ステムは、約６〜約２０塩基対の長さの範囲であり得る。ステムは、１〜約１０ヌクレオチドの、１または複数のバルジを含み得る。第２の領域の全長は、約１６〜約６０ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。例えば、ループは、４ヌクレオチドの長さであり得るか、またはほぼこの長さであることが可能であり、ステムは、１２塩基対であり得るか、またはほぼこの長さであり得る。ｄｓＲＮＡ二重鎖領域は、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓタンパク質など、ＲＮＡ結合性タンパク質と複合体を形成し得る、タンパク質結合性セグメントを含み得る。
ガイドＲＮＡはまた、５’末端または３’末端において、本質的に一本鎖であり得るテール領域も含み得る。例えば、テール領域は、ある場合には、目的の細胞内の任意の染色体配列と相補性ではなく、ある場合には、ガイドＲＮＡの残余部分と相補性ではない。さらに、テール領域の長さは、変動し得る。テール領域は、４ヌクレオチドの長さを超えうるか、またはほぼこの長さを超えうる。例えば、テール領域の長さは、５または約５〜６０または約６０ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。
ガイドＲＮＡは、細胞または胚へと、ＲＮＡ分子として導入することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写することもでき、かつ／または化学的に合成することもできる。次いで、ガイドＲＮＡは、細胞または胚へと、ＲＮＡ分子として導入することができる。ガイドＲＮＡはまた、細胞または胚へと、ＲＮＡ以外の核酸分子、例えば、ＤＮＡ分子の形態で導入することもできる。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、目的の細胞内または胚内のガイドＲＮＡの発現のためのプロモーター制御配列に作動可能に連結することができる。ＲＮＡコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）により認識されるプロモーター配列に作動可能に連結することができる。
ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子はまた、直鎖状でもあり得る。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子はまた、環状でもあり得る。
ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列はまた、ベクターの一部でもあり得る。ベクターの一部の例は、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクターを含み得る。例えば、ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡは、プラスミドベクター内に存在する。適切なプラスミドベクターの、他の非限定的な例は、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびこれらの変異体を含む。さらに、ベクターは、さらなる発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択用マーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含み得る。
ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの両方を、細胞へと、ＤＮＡ分子として導入する場合、各々は、個別の分子（例えば、融合タンパク質のコード配列を含有する１つのベクターと、ガイドＲＮＡのコード配列を含有する第２のベクターと）の一部の場合もあり、同じ分子（例えば、融合タンパク質およびガイドＲＮＡの両方のコード（および調節）配列を含有する１つのベクター）の一部の場合もある。
Ｃａｓ９タンパク質またはその任意の誘導体などのＣａｓタンパク質は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するように、ガイドＲＮＡと、あらかじめ複合体化させることができる。ＲＮＰ複合体は、初代免疫細胞へと導入することができる。ＲＮＰ複合体の導入は、時限的であり得る。細胞は、細胞周期のＧ１期、Ｓ期、および／またはＭ期において、他の細胞と同期し得る。ＲＮＰ複合体は、ＨＤＲを増強するような細胞期において送達することができる。ＲＮＰ複合体は、相同性により導かれる修復を容易とし得る。
ガイドＲＮＡはまた、修飾することもできる。修飾は、化学的変化、合成修飾、ヌクレオチド付加、および／またはヌクレオチド控除を含み得る。修飾はまた、ＣＲＩＳＰＲゲノムの操作も増強し得る。修飾は、ｇＲＮＡのキラリティーを変化し得る。場合によって、キラリティーは、修飾後において、一様または立体的に純粋であり得る。ガイドＲＮＡは、合成したものであり得る。合成ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲゲノムの操作を増強し得る。ガイドＲＮＡはまた、切断型でもあり得る。切断を使用して、所望されないオフターゲットの変異誘発を低減することができる。切断は、任意の数のヌクレオチド欠失を含み得る。例えば、切断は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも多いヌクレオチドを含み得る。ガイドＲＮＡは、任意の長さの標的相補性領域を含み得る。例えば、標的相補性領域は、２０ヌクレオチド未満の長さであり得る。標的相補性領域は、２０ヌクレオチドを超える長さであり得る。標的相補性領域は、ＰＡＭ配列に直接近接した約５ｂｐ〜約２０ｂｐをターゲティングし得る。標的相補性領域は、ＰＡＭ配列に直接近接した約１３ｂｐをターゲティングし得る。
場合によって、ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ解析を実施して、操作ガイドＲＮＡの特異性を決定することができる。ＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼによる、オフターゲット切断についての、ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑプロファイリングの一般的な機構およびプロトコールについては、Ｔｓａｉ， Ｓ．ら、「ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、３３巻：１８７〜１９７頁（２０１５年）において論じられている。
ｇＲＮＡは、任意の機能的な濃度で導入することができる。例えば、ｇＲＮＡは、細胞へと、１０マイクログラムで導入することができる。他の場合には、ｇＲＮＡは、０．５マイクログラム〜１００マイクログラムで導入することができる。ｇＲＮＡは、０．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００マイクログラムで導入することができる。
場合によって、方法は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、その相同体またはその修飾形からなる群から選択されるヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを含み得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９であり得る。場合によって、方法は、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み得る。ｇＲＮＡは、少なくとも１個の修飾を含み得る。外因性ＴＣＲは、がんネオ抗原に結合しうる。
本明細書では、少なくとも１個の外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）受容体配列をコードする少なくとも１個のポリ核酸を導入するステップ；少なくとも１個の修飾を含む少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入するステップ；および少なくとも１個のエンドヌクレアーゼを導入するステップを含み；ｇＲＮＡが少なくとも１個の内因性ゲノムと相補的な少なくとも１個の配列を含む、操作細胞を生成する方法が開示される。場合によって、修飾は、５’末端上の修飾、３’末端上の修飾、５’末端〜３’末端における修飾、単一塩基の修飾、２’−リボース修飾、またはこれらの任意の組合せである。修飾は、塩基の置換、挿入、欠失、化学修飾、物理修飾、安定化、精製、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。
場合によって、修飾は、化学修飾である。修飾は、５’アデニル酸、５’グアノシン三リン酸キャップ、５’Ｎ７−メチルグアノシン三リン酸キャップ、５’三リン酸キャップ、３’リン酸、３’チオリン酸、５’リン酸、５’チオリン酸、Ｃｉｓ−Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄＳｐａｃｅｒ、ＰＣスペーサー、ｒＳｐａｃｅｒ、Ｓｐａｃｅｒ １８、Ｓｐａｃｅｒ ９、３’−３’修飾、５’−５’修飾、脱塩基、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ ＴＥＧ、ＤＮＰ−Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ−ビオチン、二重ビオチン、ＰＣビオチン、ソラーレンＣ２、ソラーレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２、ＤＡＢＣＹＬ ＳＥ、ｄＴ−ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ−１、ＱＳＹ−２１、ＱＳＹ−３５、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、２’デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、２’−０−メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾類似体、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ−メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）ＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン−５’−三リン酸、５−メチルシチジン−５’−三リン酸、２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート、またはこれらの任意の組合せから選択することができる。修飾は、図９８に示される、シュードウリジン（ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｅ）修飾であり得る。場合によって、修飾は、生存率に影響を及ぼさなくてもよい（図９９Ａおよび図９９Ｂ）。
場合によって、修飾は、２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加である。２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加は、１塩基〜１５０塩基において実施することができる。２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加は、１塩基〜４塩基において実施することができる。２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加は、２つの塩基上で実施することができる。２−Ｏ−メチル３ホスホロチオエート付加は、４つの塩基上で実施することができる。修飾はまた、切断でもあり得る。切断は、５つの塩基の切断であり得る。
場合によって、５つの塩基の切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は、Ｃａｓタンパク質による切断（ｃｕｔ）の実施を防止し得る。エンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ系、ＴＡＬＥＮ、亜鉛フィンガー、トランスポゾンベース、ＺＥＮ、メガヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ−ＴＡＬ、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。場合によって、エンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ系に由来するものであり得る。エンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドは、ＣａｓまたはＣａｓをコードするポリペプチドであり得る。場合によって、エンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、その相同体、またはその修飾形からなる群から選択することができる。Ｃａｓの修飾形は、図１００Ａおよび１００Ｂにおいて示される、キャップ除去型Ｃａｓであり得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９であり得る。Ｃａｓ９は、前記少なくとも１つの内因性ゲノム内で、二本鎖切断を創出し得る。場合によって、エンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするポリペプチドであり得る。場合によって、エンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドは、触媒的に不活性であってもよい。場合によって、エンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするポリペプチドは、触媒的に不活性なＣａｓ９または触媒的に不活性なＣａｓ９をコードするポリペプチドであり得る。場合によって、内因性ゲノムは、少なくとも１個の遺伝子を含む。遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＴＣＲ、ＴＲＡ、ＴＲＢ、またはこれらの組合せであり得る。場合によって、二本鎖切断は、相同性により導かれる修復（ＨＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロ相同性媒介型末端結合（ＭＭＥＪ）、またはこれらの任意の組合せもしくは誘導体を使用して修復することができる。ＴＣＲは、二本鎖切断へと組み込むことができる。
ｃ．トランス遺伝子
トランス遺伝子の挿入（例えば、外因性配列）は、例えば、ポリペプチドを発現させるために使用することもでき、変異体遺伝子を是正するために使用することもでき、野生型遺伝子の発現を増大させるために使用することもできる。トランス遺伝子は、それが置かれるゲノム配列とは同一でないことが典型的である。ドナートランス遺伝子は、目的の場所において、効率的ＨＤＲを可能とするように、相同性である２つの領域で挟んだ非相同配列を含有し得る。加えて、トランス遺伝子配列は、細胞内クロマチンの、目的の領域と相同ではない配列を含有するベクター分子を含み得る。トランス遺伝子は、細胞内クロマチンと相同性である、いくつかの不連続領域を含有し得る。例えば、目的の領域内に正常では存在しない配列のターゲティング挿入のために、配列は、ドナー核酸分子内に存在することが可能であり、目的の領域内の配列に対して相同性の領域で挟むことができる。
トランス遺伝子のポリ核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖であることが可能であり、細胞へと、直鎖状形態または環状形態で導入することができる。トランス遺伝子配列は、細胞へと、環状形態または直鎖状形態で導入され得る、ＤＮＡミニサークル内に含有され得る。直鎖状形態で導入する場合、トランス遺伝子配列の末端を、任意の方法で保護する（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）ことができる。例えば、１または複数のジデオキシヌクレオチド残基を、直鎖状分子の３’末端へと付加することもでき、かつ／または自己相補的オリゴヌクレオチドを、一方または両方の末端へとライゲーションすることもできる。外因性ポリヌクレオチドを、分解から保護するためのさらなる方法は、末端アミノ基の付加、ならびに、例えば、ホスホロチオエート残基、ホスホルアミダイト残基、およびＯ−メチルリボース残基またはデオキシリボース残基など、修飾ヌクレオチド間連結の使用を含むがこれらに限定されない。
トランス遺伝子は、組換えアームで挟むことができる。場合によって、組換えアームは、トランス遺伝子を、所望の組込み部位へとターゲティングする、相補的領域を含み得る。トランス遺伝子はまた、挿入が、内因性遺伝子を破壊するように、ゲノム領域へと組み込むこともできる。トランス遺伝子は、任意の方法、例えば、非組換え末端結合および／または組換え指向修復により組み込むことができる。トランス遺伝子はまた、二本鎖切断を修復する組換えイベント時に組み込むこともできる。トランス遺伝子はまた、相同組換えエンハンサーを使用することにより組み込むこともできる。例えば、エンハンサーは、相同性により導かれる修復を実施して、二本鎖切断を修復するように、非相同末端結合を遮断し得る。
トランス遺伝子は、組換えアームで挟むことができ、この場合、アームと、その相補的配列との相同性の程度は、２つの間の相同組換えを可能とするのに十分である。例えば、アームと、その相補的配列との相同性の程度は、５０％またはこれを超えうる。２つの相同な非同一配列は、任意の長さであることが可能であり、それらの非相同性の程度は、単一のヌクレオチドという低度の場合（例えば、ターゲティングされた相同組換により、ゲノムの点変異を是正する場合）もあり、１０キロベースまたはそれよりも多いという高度な場合（例えば、染色体内の所定の異所性部位に遺伝子を挿入する場合）もある。相同な非同一配列を含む、２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要がない。例えば、ＣＣＲ５に対する組換えアームを伴う、代表的なトランス遺伝子を、図１６に示す。他の任意の遺伝子、例えば、本明細書で記載される遺伝子を使用して、組換えアームを作製することができる。
トランス遺伝子は、ゲノム内の標的二本鎖切断領域と相補的な操作部位で挟むことができる。場合によって、操作部位は、組換えアームではない。操作部位は、二本鎖切断領域に対する相同性を有し得る。操作部位は、遺伝子に対する相同性を有し得る。操作部位は、ゲノムコード領域に対する相同性を有し得る。操作部位は、ゲノム非コード領域に対する相同性を有し得る。場合によって、トランス遺伝子は、ポリ核酸から切り出すことができるので、相同組換えを伴わずに、二本鎖切断領域に挿入することができる。トランス遺伝子は、相同組換えを伴わずに、二本鎖切断へと組み込むことができる。
ポリヌクレオチドは、細胞へと、例えば、複製起点、プロモーター、および抗生物質耐性をコードする遺伝子など、さらなる配列を有するベクター分子の一部として導入することができる。さらに、トランス遺伝子のポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸として導入することもでき、リポソームまたはポロキサマーなどの薬剤と複合体化させた核酸として導入することもでき、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、およびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達することもできる。トランス遺伝子を送達し得るウイルスは、ＡＡＶウイルスであり得る。
トランス遺伝子は一般に、その発現が、組込み部位における内因性プロモーター、すなわち、トランス遺伝子が挿入される内因性遺伝子（例えば、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ）の発現を駆動するプロモーターにより駆動されるように挿入する。トランス遺伝子は、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたは組織／細胞特異的プロモーターを含み得る。ミニサークルベクターは、トランス遺伝子をコードし得る。
非コード核酸配列の挿入のターゲティングもまた達成することができる。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列もまた、挿入のターゲティングに使用することができる。
トランス遺伝子は、内因性遺伝子の全て、一部を発現させるように、内因性遺伝子へと挿入することもでき、内因性遺伝子を発現させないように内因性遺伝子へと挿入することもできる。例えば、本明細書で記載されるトランス遺伝子は、内因性配列のうちの一部（トランス遺伝子に対するＮ末端側および／またはＣ末端側）を、例えば、トランス遺伝子との融合体として発現させるように、内因性遺伝子座へと挿入することもでき、内因性配列を、例えば、トランス遺伝子との融合体として発現させないように、内因性遺伝子座へと挿入することもできる。他の場合には、トランス遺伝子（例えば、内因性遺伝子などの、さらなるコード配列を伴うかまたは伴わない）を、任意の内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座へと組み込む。例えば、ＴＣＲトランス遺伝子は、内因性ＴＣＲ遺伝子へと挿入することができる。例えば、図１７は、トランス遺伝子を、内因性ＣＣＲ５遺伝子へと挿入し得ることを示す。トランス遺伝子は、任意の遺伝子、例えば、本明細書で記載される遺伝子へと挿入することができる。
内因性配列をトランス遺伝子と共に（内因性配列またはトランス遺伝子の一部を）発現させる場合、内因性配列は、全長配列（野生型または変異体）の場合もあり、部分配列の場合もある。内因性配列は、機能的であり得る。これらの全長配列または部分配列の機能の非限定的な例は、トランス遺伝子（例えば、治療用遺伝子）が発現するポリペプチドの血清半減期を延長すること、および／または担体として作用することを含む。
さらに、発現には要求されないが、外因性配列はまた、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列も含み得る。
場合によって、外因性遺伝子（例えば、トランス遺伝子）は、目的のタンパク質の融合体と、その融合パートナーとして、融合タンパク質を細胞の表面に位置させる、膜タンパク質の細胞外ドメインとを含む。場合によって、トランス遺伝子は、ＴＣＲをコードするが、この場合、ＴＣＲを発現させるように、ＴＣＲコード配列を、セーフハーバーへと挿入する。場合によって、ＴＣＲコード配列を、ＣＩＳＨ遺伝子座および／またはＴＣＲ遺伝子座へと挿入する。他の場合には、ＴＣＲを、ランダム挿入のために、レンチウイルスにより、細胞へと送達するが、ＣＩＳＨおよび／またはＴＣＲ特異的ヌクレアーゼを、ｍＲＮＡとして供給することができる。場合によって、ＴＣＲを、レトロウイルス、ＡＡＶ、またはアデノウイルスなどのウイルスベクター系を介して、セーフハーバー（例えば、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ＣＣＲ５、アルブミン、またはＨＰＲＴ）に特異的なヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと共に送達する。細胞はまた、ＰＤ１特異的なヌクレアーゼおよび／またはＣＴＬＡ−４特異的なヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡで処置することもできる。場合によって、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを、ウイルス送達系を介して、ＨＰＲＴ特異的ヌクレアーゼおよびＰＤ１特異的ヌクレアーゼまたはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと併せて供給する。ＨＰＲＴ遺伝子座に組み込んだ、ＴＣＲをコードするヌクレオチドを含む細胞は、細胞の停止を結果としてもたらす場合もあり、かつ／または細胞内でアポトーシスを惹起する場合もある、６−チオグアニン、グアニン類似体を、無傷ＨＰＲＴ遺伝子と共に使用して選択することができる。本開示の方法および組成物と共に使用され得るＴＣＲは、これらのキメラタンパク質の全ての種類であって、第１世代、第２世代、および第３世代のデザインを含む種類を含む。本開示ではまた、受容体、リガンド、および操作ポリペプチドに由来する特異性ドメインも想定され得るが、抗体に由来する特異性ドメインを含むＴＣＲが、特に有用であり得る。細胞間シグナル伝達ドメインは、ゼータ鎖、ならびにγ鎖およびＥ鎖など、ＣＤ３複合体の他のメンバーなどのＴＣＲ鎖に由来し得る。場合によって、ＴＣＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢとしてもまた公知である）、またはＣＤ１３４に由来する細胞間ドメインなど、さらなる共刺激性ドメインを含み得る。なおさらなる場合には、２つの種類の共刺激因子ドメインを同時に使用することもできる（例えば、ＣＤ２８＋ＣＤ１３７と共に使用されるＣＤ３ゼータ）。
場合によって、操作細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、およびＩＬ−７Ｒα＋から構成される、ステムメモリー（ｓｔｅｍ ｍｅｍｏｒｙ）ＴＳＣＭ細胞であることが可能であり、ステムメモリー細胞はまた、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、およびＬＦＡ−１も発現することが可能であり、ステムメモリー細胞特有の、多数の機能的な属性を示す。操作細胞はまた、Ｌ−セレクチンおよびＣＣＲ７を含む、セントラルメモリー細胞であるＴＣＭ細胞でもあることが可能であり、この場合、セントラルメモリー細胞は、例えば、ＩＬ−２を分泌し得るが、ＩＦＮγまたはＩＬ−４は分泌しえない。操作細胞はまた、Ｌ−セレクチンまたはＣＣＲ７を含む、エフェクターメモリー細胞であるＴＥＭ細胞でもあることが可能であり、例えば、ＩＦＮγおよびＩＬ−４など、エフェクターサイトカインを産生し得る。場合によって、細胞の集団を、対象へと導入することができる。例えば、細胞の集団は、Ｔ細胞とＮＫ細胞との組合せであり得る。他の場合には、集団は、ナイーブ細胞とエフェクター細胞との組合せであり得る。
相同組換えＨＲエンハンサーの送達
場合によって、相同組換えＨＲエンハンサーを使用して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を抑制することができる。非相同末端結合は、二本鎖切断部の末端におけるヌクレオチドの喪失を結果としてもたらすことが可能であり、非相同末端結合はまた、フレームシフトも結果としてもたらし得る。したがって、相同性により導かれる修復は、遺伝子をノックインする場合に使用するのに、より魅力的な機構であり得る。非相同末端結合を抑制するために、ＨＲエンハンサーを送達することができる。場合によって、１つを超えるＨＲエンハンサーを送達することができる。ＨＲエンハンサーは、非相同末端結合に関与するタンパク質、例えば、ＫＵ７０、ＫＵ８０、および／またはＤＮＡリガーゼＩＶを阻害し得る。場合によって、Ｓｃｒ７などのリガーゼＩＶインヒビターを送達することができる。場合によって、ＨＲエンハンサーは、Ｌ７５５５０７であり得る。場合によって、異なるリガーゼＩＶインヒビターを使用することができる。場合によって、ＨＲエンハンサーは、４型アデノウイルスのタンパク質、例えば、Ｅ１Ｂ５５Ｋおよび／またはＥ４ｏｒｆ６であり得る。場合によって、化学的インヒビターを使用することができる。
ＫＵ７０、ＫＵ８０、および／またはＤＮＡリガーゼＩＶなどの非相同末端結合分子は、様々な方法を使用することにより抑制することができる。例えば、ＫＵ７０、ＫＵ８０、および／またはＤＮＡリガーゼＩＶなどの非相同末端結合分子は、遺伝子サイレンシングにより抑制することができる。例えば、非相同末端結合分子である、ＫＵ７０、ＫＵ８０、および／またはＤＮＡリガーゼＩＶは、因子の転写または翻訳時において、遺伝子サイレンシングにより抑制することができる。非相同末端結合分子である、ＫＵ７０、ＫＵ８０、および／またはＤＮＡリガーゼＩＶはまた、因子の分解により抑制することもできる。非相同末端結合分子である、ＫＵ７０、ＫＵ８０、および／またはＤＮＡリガーゼＩＶはまた、阻害することもできる。ＫＵ７０、ＫＵ８０、および／またはＤＮＡリガーゼＩＶのインヒビターは、Ｅ１Ｂ５５Ｋおよび／またはＥ４ｏｒｆ６を含み得る。非相同末端結合分子である、ＫＵ７０、ＫＵ８０、および／またはＤＮＡリガーゼＩＶはまた、封鎖により阻害することもできる。遺伝子の発現は、ノックアウトにより抑制することもでき、遺伝子のプロモーターを変化することにより抑制することもでき、かつ／または因子に対する干渉性ＲＮＡを投与することにより抑制することもできる。
非相同末端結合を抑制するＨＲエンハンサーは、プラスミドＤＮＡにより送達することができる。ある場合には、プラスミドは、二本鎖ＤＮＡ分子であり得る。プラスミド分子はまた、一本鎖ＤＮＡでもあり得る。プラスミドはまた、少なくとも１つの遺伝子も保有し得る。プラスミドはまた、１つを超える遺伝子も保有し得る。少なくとも１つのプラスミドもまた、使用することができる。１つを超えるプラスミドもまた、使用することができる。非相同末端結合を抑制するＨＲエンハンサーは、プラスミドＤＮＡにより、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ、プライマー、および／または修飾剤化合物と共に送達することができる。修飾剤化合物は、プラスミドＤＮＡの細胞毒性を低減することが可能であり、細胞生存率を改善し得る。ＨＲエンハンサーおよび修飾剤化合物は、ゲノム操作の前に、細胞へと導入することができる。ＨＲエンハンサーは、低分子であり得る。場合によって、ＨＲエンハンサーは、Ｔ細胞懸濁液へと送達することができる。ＨＲエンハンサーは、二本鎖ＤＮＡをトランスフェクトされた細胞の生存率を改善し得る。場合によって、二本鎖ＤＮＡの導入は、毒性であり得る（図８１Ａおよび図８１Ｂ）。
非相同末端結合を抑制するＨＲエンハンサーは、組み込まれるＨＲ基質と共に送達することができる。基質は、ポリ核酸であり得る。ポリ核酸は、ＴＣＲトランス遺伝子を含み得る。ポリ核酸は、ｍＲＮＡとして送達することができる（図１０および図１４を参照されたい）。ポリ核酸は、ＴＣＲトランス遺伝子の組込みのための、ゲノムの内因性領域に対する組換えアームを含み得る。ポリ核酸は、ベクターでありうる。ベクターは、センスまたはアンチセンスの配向性で、別のベクター（例えば、ウイルスベクター）へと挿入することができる。ウイルスカセットの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写のために、ウイルスゲノムの５’ＬＴＲ領域の上流に、Ｔ７、Ｔ３、または他の転写開始配列を置くことができる（図３を参照されたい）。次いで、このベクターカセットを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ｍＲＮＡの転写のための鋳型として使用することができる。例えば、このｍＲＮＡを、任意の細胞へと、そのコグネイトの逆転写酵素と共に送達する場合、また、ｍＲＮＡまたはタンパク質としても送達する場合、トランス遺伝子カセットを、ゲノム内の意図される標的部位に組み込むのに所望される、相同組換えイベントのためのＨＲ基質として使用され得る、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の形態で、数百〜数千コピーを作製するための鋳型として、一本鎖ｍＲＮＡカセットを使用することができる。この方法は、ＣＲＩＳＰＲを媒介する相同組換えのための、毒性のプラスミドＤＮＡの送達への必要性を回避し得る。加えて、各ｍＲＮＡ鋳型は、数百または数千コピーのｄｓＤＮＡへとなるので、細胞内で利用可能な相同組換え鋳型の量は、極めて高量であり得る。高量の相同組換え鋳型は、所望の相同組換えイベントを駆動し得る。さらに、ｍＲＮＡはまた、一本鎖ＤＮＡも作製し得る。一本鎖ＤＮＡはまた、例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）による遺伝子ターゲティングと共に、相同組換えのための鋳型として使用することもできる。ｍＲＮＡは、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて、ＤＮＡ相同組換えのためのＨＲエンハンサーへと逆転写することができる。この戦略により、毒性のプラスミドＤＮＡの送達を避けることができる。加えて、ｍＲＮＡにより、相同組換え基質を、プラスミドＤＮＡより高レベルへと増幅することもでき、かつ／または相同組換えの効率を改善することもできる。
非相同末端結合を抑制するＨＲエンハンサーは、化学的インヒビターとして送達することができる。例えば、ＨＲエンハンサーは、リガーゼＩＶ−ＤＮＡ間結合に干渉することにより作用し得る。ＨＲエンハンサーはまた、内因性アポトーシス経路も活性化させうる。ＨＲエンハンサーはまた、リガーゼＩＶインヒビターのペプチド模倣剤でもあり得る。ＨＲエンハンサーはまた、Ｃａｓ９系と共に共発現させることもできる。ＨＲエンハンサーはまた、Ｅ１Ｂ５５Ｋおよび／またはＥ４ｏｒｆ６など、ウイルスタンパク質と共に共発現させることもできる。ＨＲエンハンサーはまた、ＳＣＲ７、Ｌ７５５５０７、またはこれらの任意の誘導体でもあり得る。ＨＲエンハンサーは、外因性ＤＮＡの挿入の毒性を低減する化合物と共に送達することができる。
万一、細胞内で、一本鎖ＤＮＡの頑健な逆転写のみが生じる場合は、ウイルスベクターのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方をコードするｍＲＮＡを導入することができる（図３を参照されたい）。この場合、両方のｍＲＮＡ鎖を、細胞内で逆転写して、ｄｓＤＮＡを作製することもでき、かつ／または自然にアニールさせて、ｄｓＤＮＡを作製することもできる。
ＨＲエンハンサーは、初代細胞へと送達することができる。相同組換えＨＲエンハンサーは、任意の適する手段により送達することができる。相同組換えＨＲエンハンサーはまた、ｍＲＮＡとして送達することもできる。相同組換えＨＲエンハンサーはまた、プラスミドＤＮＡとして送達することもできる。相同組換えＨＲエンハンサーはまた、免疫細胞へと、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓと共に送達することもできる。相同組換えＨＲエンハンサーはまた、免疫細胞へと、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ、ＴＣＲ配列を含むポリ核酸、および／または外因性ＤＮＡの挿入の毒性を低減する化合物と共に送達することもできる。
相同組換えＨＲエンハンサーは、任意の細胞、例えば、免疫細胞へと送達することができる。例えば、相同組換えＨＲエンハンサーは、初代免疫細胞へと送達することができる。相同組換えＨＲエンハンサーはまた、Ｔ細胞株を含むがこれらに限定されないＴ細胞および初代Ｔ細胞へと送達することもできる。相同組換えＨＲエンハンサーはまた、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、および／または腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）へと送達することもできる。相同組換えＨＲエンハンサーはまた、免疫細胞へと、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓと共に送達することもできる。
場合によって、相同組換えＨＲエンハンサーを使用して、非相同末端結合を抑制することができる。場合によって、相同組換えＨＲエンハンサーを使用して、相同性により導かれる修復を促進することができる。場合によって、相同組換えＨＲエンハンサーを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓによる二本鎖切断の後における、相同性により導かれる修復を促進することができる。場合によって、相同組換えＨＲエンハンサーを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓによる二本鎖切断の後における、１または複数の遺伝子の、相同性により導かれる修復、ならびにノックインおよびノックアウトを促進することができる。ノックインされる遺伝子は、ＴＣＲであり得る。ノックアウトされる遺伝子はまた、任意の数の内因性チェックポイント遺伝子でもあり得る。例えば、内因性チェックポイント遺伝子は、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２など）、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＴＣＲ、および／またはＣＩＳＨからなる群から選択することができる。場合によって、遺伝子は、ＣＩＳＨであり得る。場合によって、遺伝子は、ＴＣＲであり得る。場合によって、遺伝子は、内因性ＴＣＴであり得る。場合によって、遺伝子は、コード領域を含み得る。場合によって、遺伝子は、非コード領域を含み得る。
ＨＲエンハンサーによるＨＲ効率の増大は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であり得るか、またはほぼこの比率であり得る。
ＨＲエンハンサーによるＮＨＥＪの減少は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であり得るか、またはほぼこの比率であり得る。
低毒性の細胞操作
外因性ポリ核酸への細胞毒性を緩和して、Ｔ細胞を含む細胞の操作を改善することができる。例えば、細胞毒性は、ポリ核酸への細胞応答を変化することにより低減することができる。
ポリ核酸は、細胞と接触させることができる。次いで、ポリ核酸を、細胞へと導入することができる。場合によって、ポリ核酸を用いて、細胞ゲノムを変化する。ポリ核酸の挿入の後、細胞は、死滅する場合がある。例えば、ポリ核酸の挿入は、図１８に示される通り、細胞のアポトーシスを引き起こし得る。ポリ核酸に誘導される毒性は、修飾剤化合物を使用することにより低減することができる。
例えば、修飾剤化合物は、細胞の免疫センシング応答を破壊し得る。修飾剤化合物はまた、細胞のアポトーシスおよびピロトーシスも低減し得る。状況に応じて、修飾剤化合物は、アクチベーターの場合もあり、インヒビターの場合もある。修飾剤化合物は、図１９に示される経路の任意の構成要素に作用し得る。例えば、修飾剤化合物は、カスパーゼ１、ＴＢＫ１、ＩＲＦ３、ＳＴＩＮＧ、ＤＤＸ４１、ＤＮＡ−ＰＫ、ＤＡＩ、ＩＦＩ１６、ＭＲＥ１１、ｃＧＡＳ、２’３’−ｃＧＡＭＰ、ＴＲＥＸ１、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、またはこれらの任意の組合せに作用し得る。修飾剤はＴＢＫ１修飾剤であり得る。修飾剤はカスパーゼ１修飾剤であり得る。修飾剤化合物はまた、生得的シグナル伝達系にも作用する場合があり、したがって、生得的シグナル伝達修飾剤であり得る。場合によって、外因性核酸は、細胞に対して毒性であり得る。細胞の生得的免疫センシング応答を阻害する方法は、操作細胞生成物の細胞生存率を改善し得る。修飾化合物は、ブレフェルジンＡおよび／またはＡＴＭ経路のインヒビターであり得る（図９２Ａ、図９２Ｂ、図９３Ａ、および図９３Ｂ）。
外因性ポリ核酸への毒性の低減は、化合物と細胞とを接触させることにより実施することができる。場合によって、細胞は、ポリ核酸と接触させる前に、化合物で前処置することができる。場合によって、化合物とポリ核酸とを、細胞へと、同時に導入（例えば、同時に導入）する。修飾化合物は、ポリ核酸内に含ませることができる。場合によって、ポリ核酸は修飾化合物を含む。場合によって、化合物は、ポリ核酸、ＨＲエンハンサー、および／またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを含むカクテルとして導入することができる。本明細書で開示される、組成物および方法は、効率的かつ低毒性の方法であって、それにより、細胞療法、例えば、がん特異的細胞療法を案出し得る方法をもたらし得る。
本明細書で記載される方法および／または系および／または組成物において使用され得る化合物は、以下の特徴のうちの１または複数を有することが可能であり、本明細書で記載される機能のうちの１または複数を有し得る。その１または複数の機能にも拘らず、本明細書で記載される化合物は、外因性ポリヌクレオチドの毒性を減少させうる。例えば、化合物は、外因的に導入されたポリ核酸に由来する毒性を結果としてもたらす経路をモジュレートし得る。場合によって、ポリ核酸は、ＤＮＡであり得る。ポリ核酸はまた、ＲＮＡでもあり得る。ポリ核酸は、一本鎖であり得る。ポリ核酸はまた、二本鎖でもあり得る。ポリ核酸は、ベクターであり得る。ポリ核酸はまた、ネイキッドポリ核酸でもあり得る。ポリ核酸は、タンパク質をコードし得る。ポリ核酸はまた、任意の数の修飾も有し得る。ポリ核酸の修飾は、脱メチル化、ＣｐＧメチル化の付加、細菌性メチル化の除去、および／または哺乳動物性メチル化の付加であり得る。ポリ核酸はまた、細胞へと、さらなるポリ核酸、任意の数のＨＲエンハンサー、および／またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを含む試薬カクテルとして導入することもできる。ポリ核酸はまた、トランス遺伝子も含み得る。ポリ核酸は、ＴＣＲ配列を有するトランス遺伝子を含み得る。
化合物はまた、外因性ＤＮＡへの毒性の惹起に関与する経路もモジュレートし得る。経路は、任意の数の因子を含有し得る。例えば、因子は、ＤＡＩ（ＩＦＮ調節因子のＤＮＡ依存性アクチベーター）、ＩＦＮ誘導性タンパク質１６（ＩＦＩ１６）、ＤＥＡＤボックスポリペプチド４１（ＤＤＸ４１）、ＡＩＭ２（ａｂｓｅｎｔ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ２）、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ、環状グアノシン一リン酸−アデノシン一リン酸シンターゼ（ｃＧＡＳ）、ＳＴＩＮＧ（ＩＦＮ遺伝子の刺激因子）、ＴＡＮＫ結合性キナーゼ（ＴＢＫ１）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ＭＲＥ１１（減数分裂組み換え１１）、Ｔｒｅｘ１、アスパルテート特異性を有するシステインプロテアーゼ（カスパーゼ１）、３’修復エキソヌクレアーゼ、ＤＡＩ（ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＩＲＦ）、ＩＦＩ１６、ＤＤＸ４１、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）、ＭＲＥ１１（減数分裂組み換え１１）相同体Ａ、および／またはＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ）３もしくは７、および／またはこれらの任意の誘導体を含み得る。
場合によって、ＤＮＡセンシング経路は一般に、細胞内核酸の検出に関与する、１または複数のタンパク質（例えば、ＤＮＡセンシングタンパク質）を含む、任意の細胞シグナル伝達経路を指す場合があり、場合によって、外因性核酸を指す場合がある。場合によって、ＤＮＡセンシング経路は、インターフェロン（ＳＴＩＮＧ）の刺激因子を含み得る。場合によって、ＤＮＡセンシング経路は、ＤＡＩ（ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＩＦＮ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）を含み得る。ＤＮＡセンシングタンパク質の非限定的な例は、３’修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）、ＤＥＡＤボックスヘリカーゼ４１（ＤＤＸ４１）、ＤＡＩ（ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＩＦＮ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）、Ｚ型ＤＮＡ結合性タンパク質１（ＺＢＰ１）、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質１６（ＩＦＩ１６）、ＬＲＲＦＩＰ１（ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ（Ｉｎ ＦＬＩＩ）ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＤＥＡＨボックスヘリカーゼ９（ＤＨＸ９）、ＤＥＡＨボックスヘリカーゼ３６（ＤＨＸ３６）、Ｋｕ７０（Ｌｕｐｕｓ Ｋｕ ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐ７０）である、ＸＲＣＣ６（Ｘ−ｒａｙ ｒｅｐａｉｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｃｅｌｌｓ ６）、ＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅ）、膜貫通タンパク質１７３（ＴＭＥＭ１７３）、ＴＲＩＭ３２（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｍｏｔｉｆ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ３２）、ＴＲＩＭ５６（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｍｏｔｉｆ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ５６）、β−カテニン（ＣＴＮＮＢ１）、ＭｙＤ８８（ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ８８）、ＡＩＭ２（ａｂｓｅｎｔ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ２）、ＡＳＣ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｐｅｃｋ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ＣＡＲＤ）、プロカスパーゼ１（ｐｒｏ−ＣＡＳＰ１）、カスパーゼ１（ＣＡＳＰ１）、プロインターロイキン１ベータ（ｐｒｏ−ＩＬ−１β）、プロインターロイキン１８（ｐｒｏ−ＩＬ−１８）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ１）、インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）、インターフェロン調節因子７（ＩＲＦ７）、ＩＳＲＥ７（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ７）、ＩＳＲＥ１／７（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ １／７）、ＮＦ−κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ）、黒色腫分化関連タンパク質５（ＭＤＡ−５）、ＬＧＰ２（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２）、レチノイン酸誘導性遺伝子１（ＲＩＧ−Ｉ）、ＩＰＳ−１（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｎｔｉｖｉｒａｌ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＴＮＦ受容体関連因子３（ＴＲＡＦ３）、ＴＡＮＫ（ＴＲＡＦ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＮＦＫＢ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ＮＡＰ１（ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）、Ａｔｇ９ａ（ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｌａｔｅｄ ９Ａ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターフェロンラムダ１（ＩＦＮλ１）、環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、ＡＭＰ、ＧＭＰ、環状ＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）、これらのタンパク質のリン酸化形態、またはこれらの任意の組合せもしくは誘導体を含む。ＤＮＡセンシング経路の一例では、ＤＡＩは、Ｉ型インターフェロンおよび他のサイトカインの産生をもたらす、ＩＲＦおよびＮＦ−κＢ転写因子を活性化させる。ＤＮＡセンシング経路の別の例では、外因性の細胞内ＤＮＡを感知すると、ＡＩＭ２は、インフラマソームのアセンブリーを誘発し、インターロイキンの成熟およびピロトーシスに至る。ＤＮＡセンシング経路のさらに別の例では、ＰｏｌＩＩＩのＲＮＡは、外因性ＤＮＡを、ＲＮＡセンサーであるＲＩＧ−Ｉによる認識のために、ＲＮＡへと転換し得る。
一部の態様では、本開示の方法は、１または複数の細胞へと、少なくとも１つの抗ＤＮＡセンシングタンパク質をコードする、第１のトランス遺伝子を含む核酸を導入するステップを含む。
抗ＤＮＡセンシングタンパク質は一般に、ＤＮＡセンシング経路（例えば、ＤＮＡセンシングタンパク質）に対応するタンパク質の活性または発現レベルを変化する、任意のタンパク質を指す場合がある。場合によって、抗ＤＮＡセンシングタンパク質は、１または複数のＤＮＡセンシングタンパク質を分解し得る（例えば、これらの全タンパク質レベルを低減し得る）。場合によって、抗ＤＮＡセンシングタンパク質は、１または複数のＤＮＡセンシングタンパク質を完全に阻害し得る。場合によって、抗ＤＮＡセンシングタンパク質は、１または複数のＤＮＡセンシングタンパク質を部分的に阻害し得る。場合によって、抗ＤＮＡセンシングタンパク質は、少なくとも１つのＤＮＡセンシングタンパク質の活性を、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約５％阻害し得る。場合によって、抗ＤＮＡセンシングタンパク質は、少なくとも１つのＤＮＡセンシングタンパク質の量を、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約５％減少させうる。
細胞生存率は、ゲノム操作手順中に、外因性ＤＮＡを検出する細胞の能力を阻害し得るウイルスタンパク質を導入することにより増大させることができる。場合によって、抗ＤＮＡセンシングタンパク質は、１または複数のＤＮＡセンシングタンパク質の翻訳を促進し得る（例えば、これらの全タンパク質レベルを上昇させうる）。場合によって、抗ＤＮＡセンシングタンパク質は、１または複数のＤＮＡセンシングタンパク質を保護するか、またはこれらの活性を増大させうる。場合によって、抗ＤＮＡセンシングタンパク質は、少なくとも１つのＤＮＡセンシングタンパク質の活性を、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約５％増大させうる。場合によって、抗ＤＮＡセンシングタンパク質は、少なくとも１つのＤＮＡセンシングタンパク質の量を、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約５％増大させうる。場合によって、抗ＤＮＡセンシングインヒビターは、１または複数のＤＮＡセンシングタンパク質の、競合的インヒビターまたはアクチベーターであり得る。場合によって、抗ＤＮＡセンシングインヒビターは、ＤＮＡセンシングタンパク質の、非競合的インヒビターまたはアクチベーターであり得る。
本開示の場合によって、抗ＤＮＡセンシングタンパク質はまた、ＤＮＡセンシングタンパク質（例えば、ＴＲＥＸ１）でもあり得る。抗ＤＮＡセンシングタンパク質の非限定的な例は、ｃ−ＦＬｉＰ（ｃｅｌｌｕｌａｒ ＦＬＩＣＥ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ヒトサイトメガロウイルステグメントタンパク質（ＨＣＭＶ ｐＵＬ８３）、デングウイルス特異的ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３（ＤＥＮＶ ＮＳ２Ｂ〜ＮＳ３）、１８型ヒトパピローマウイルスＥ７タンパク質（ＨＰＶ１８ Ｅ７）、ｈＡｄ５ Ｅ１Ａ、単純ヘルペスウイルス即初期タンパク質ＩＣＰ０（ＨＳＶ１ ＩＣＰ０）、ワクシニアウイルスＢ１３（ＶＡＣＶ Ｂ１３）、ワクシニアウイルスＣ１６（ＶＡＣＶ Ｃ１６）、３’修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ−ＮＬ６３）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡポリメラーゼ（ＨＢＶ Ｐｏｌ）、ブタ伝染性下痢症ウイルス（ＰＥＤＶ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、Ｅ３Ｌ、ｐ２０２、これらのタンパク質のリン酸化形態、およびこれらの任意の組合せまたは誘導体を含む。場合によって、ＨＣＭＶ ｐＵＬ８３は、パイリンドメインであるＩＦＩ１６（例えば、核内のＩＦＩ１６）と相互作用し、そのオリゴマー化、および後続の下流における活性化を遮断することにより、ＳＴＩＮＧ−ＴＢＫ１−ＩＲＦ３経路の活性化を阻害することにより、ＤＮＡセンシング経路を破壊し得る。場合によって、ＤＥＮＶ Ｎｓ２Ｂ−ＮＳ３は、ＳＴＩＮＧを分解することにより、ＤＮＡセンシング経路を破壊し得る。場合によって、ＨＰＶ１８ Ｅ７は、ＳＴＩＮＧに結合することにより、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路シグナル伝達を遮断することにより、ＤＮＡセンシング経路を破壊し得る。場合によって、ｈＡｄ５ Ｅ１Ａは、ＳＴＩＮＧに結合することにより、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路シグナル伝達を遮断することにより、ＤＮＡセンシング経路を破壊し得る。例えば、図１０４Ａおよび図１０４Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ系、外因性ポリ核酸、およびｈＡｄ５ Ｅ１Ａタンパク質またはＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質をトランスフェクトされた細胞を示す。場合によって、ＨＳＶ１ ＩＣＰ０は、ＩＦＩ１６の分解により、かつ／またはウイルスゲノムへのＩＦＩ１６の動員を遅延させることにより、ＤＮＡセンシング経路を破壊し得る。場合によって、ＶＡＣＶ Ｂ１３は、カスパーゼ１依存性のインフラマソームの活性化およびカスパーゼ８依存性の外因性アポトーシスを遮断することにより、ＤＮＡセンシング経路を破壊し得る。場合によって、ＶＡＣＶ Ｃ１６は、ＤＮＡに対する生得的免疫応答を遮断し、サイトカイン発現の低下をもたらすことにより、ＤＮＡセンシング経路を破壊し得る。
化合物は、インヒビターであり得る。化合物はまた、アクチベーターでもあり得る。化合物は、第２の化合物と組み合わせることができる。化合物はまた、少なくとも１つの化合物と組み合わせることができる。場合によって、１または複数の化合物は、相乗作用的に挙動し得る。例えば、１または複数の化合物は、図２０に示される通り、細胞へと一度に導入されると、細胞毒性を低減し得る。
化合物は、汎カスパーゼインヒビターであるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、および／またはＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫであり得る。化合物は、外因性ＤＮＡへの毒性の惹起に関与する経路をモジュレートする、任意の数の公知の化合物の誘導体であり得る。化合物はまた、修飾することもできる。化合物は、任意の数の手段により修飾することができ、例えば、化合物への修飾は、重水素化、脂質化、グリコシル化、アルキル化、ＰＥＧ化、酸化、リン酸化、硫酸化、アミド化、ビオチニル化、シトルリン化、異性体化、ユビキチン化、プロトン化、低分子のコンジュゲーション、還元、脱リン酸化、ニトロシル化、および／またはタンパク質分解を含み得る。修飾はまた、翻訳後修飾でもあり得る。修飾は、翻訳前修飾であり得る。修飾は、顕著に異なるアミノ酸側鎖またはペプチド連結において生じる場合があり、酵素的活性により媒介され得る。
修飾は、化合物の合成内の任意のステップにおいて生じ得る。例えば、タンパク質内では、適正な化合物のフォールディングもしくは安定性を媒介するか、または新生化合物を、顕著に異なる細胞的コンパートメントへと導くように、翻訳が進行中であるかまたは完了した直後に、多くの化合物が修飾される。他の修飾は、触媒活性を活性化もしくは不活化させるか、または化合物の生体活性に他の形で影響を及ぼすように、フォールディングおよび局在化が完了した後で生じる。化合物はまた、分解のために化合物をターゲティングするタグへと、共有結合的に連結することもできる。単一の修飾のほかに、化合物は、翻訳後切断と、化合物の成熟または活性化の段階的機構を介する官能基の付加との組合せを介して修飾されることが多い。
化合物は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、例えば、ＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−βの産生を低減し得る。化合物はまた、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）および／またはインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）など、炎症促進性サイトカインの産生も低減し得る。化合物はまた、Ｊａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）−シグナル伝達兼転写アクチベーター（ＳＴＡＴ）経路のモジュレーションを介して、抗ウイルス遺伝子の誘導もモジュレートし得る。化合物はまた、転写因子である、ＮＦ−κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κ−ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ）、ならびにＩＦＮ調節因子のＩＲＦ３およびＩＲＦ７もモジュレートし得る。化合物はまた、例えば、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体によるＩκＢのリン酸化を修飾して、ＮＦ−κＢの活性化もモジュレートし得る。化合物はまた、ＩκＢのリン酸化をモジュレートする場合もあり、ＩκＢのリン酸化を防止する場合もある。化合物はまた、ＩＲＦ３および／またはＩＲＦ７の活性化もモジュレートし得る。例えば、化合物は、ＩＲＦ３および／またはＩＲＦ７の活性化をモジュレートし得る。化合物は、ＴＢＫ１および／またはＩＫＫεを活性化させうる。化合物はまた、ＴＢＫ１および／またはＩＫＫεも阻害し得る。化合物は、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＮＦ−κＢ、およびＩ型ＩＦＮ遺伝子の転写をオンにする他の転写因子から構成される、エンハンセオソーム複合体の形成を防止し得る。修飾化合物は、ＴＢＫ１化合物および少なくとも１つのさらなる化合物であり得る（図８８Ａおよび図８８Ｂ）。場合によって、ＴＢＫ１化合物およびカスパーゼインヒビター化合物を使用して、二本鎖ＤＮＡの毒性を低減することができる（図８９）。
化合物は、細胞のアポトーシスおよび／またはピロトーシスを防止し得る。化合物はまた、インフラマソームの活性化も防止し得る。インフラマソームは、タンパク質分解酵素カスパーゼ１の活性化およびＩＬ−１βの成熟を媒介する、細胞内多タンパク質複合体であり得る。化合物はまた、ＡＩＭ２（ａｂｓｅｎｔ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ２）もモジュレートし得る。例えば、化合物は、ＡＩＭ２が、アダプタータンパク質であるＡＳＣ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｐｅｃｋ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ＣＡＲＤ）と会合することを防止し得る。化合物はまた、ＰＹＤ：ＰＹＤ間同型相互作用もモジュレートし得る。化合物はまた、ＣＡＲＤ：ＣＡＲＤ間同型相互作用もモジュレートし得る。化合物は、カスパーゼ１をモジュレートし得る。例えば、化合物は、カスパーゼ１が、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の不活性の前駆体を、成熟サイトカインへと変換する過程を阻害し得る。
化合物は、ＧＭＰ適合性細胞療法を作製するためのプラットフォームの構成要素であり得る。化合物を使用して、細胞療法を改善することができる。化合物は、試薬として使用することができる。化合物は、組合せ療法として組み合わせることができる。化合物は、ｅｘ ｖｉｖｏで用いることができる。化合物は、免疫療法のために使用することができる。化合物は、それを必要とする患者のためのＴ細胞療法を作製する工程の一部であり得る。
場合によって、毒性を低減するのに、化合物を使用しない。場合によって、ポリ核酸を修飾してまた、毒性も低減することができる。例えば、ポリ核酸を修飾して、ポリ核酸、例えば、外因性ポリ核酸の検出を低減することができる。ポリ核酸を修飾してまた、細胞毒性も低減することができる。例えば、ポリ核酸は、図２１に描示される方法のうちの１または複数により修飾することができる。ポリ核酸はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで修飾することもでき、ｉｎ ｖｉｖｏで修飾することもできる。
化合物または修飾剤化合物は、プラスミドＤＮＡの細胞毒性を、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％、またはほぼこれらの比率だけ低減し得る。修飾剤化合物は、細胞生存率を、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％、またはほぼこれらの比率だけ改善し得る。
非メチル化ポリ核酸もまた、毒性を低減し得る。例えば、少なくとも１つのゲノム領域と相補的な、少なくとも２つの組換えアームで挟んだ、少なくとも１つの操作抗原受容体を含む、非メチル化ポリ核酸を使用して、細胞毒性を低減することができる。ポリ核酸はまた、ネイキッドポリ核酸でもあり得る。ポリ核酸はまた、哺乳動物性メチル化も有することが可能であり、場合によって、これも同様に、毒性を低減するであろう。場合によって、ポリ核酸はまた、細菌性メチル化を除去し、哺乳動物性メチル化を導入するように修飾することもできる。本明細書で記載される修飾のうちのいずれかを、本明細書で記載されるポリ核酸のうちのいずれかへと適用することができる。
ポリ核酸の修飾は、脱メチル化、ＣｐＧメチル化の付加、細菌性メチル化の除去、および／または哺乳動物性メチル化の付加を含み得る。修飾は、二本鎖ポリ核酸の、一本鎖ポリ核酸への転換であり得る。また、一本鎖ポリ核酸を、二本鎖ポリ核酸へと転換することもできる。
ポリ核酸は、メチル化（例えば、ヒト性メチル化）させて、細胞毒性を低減することができる。修飾ポリ核酸は、ＴＣＲ配列またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み得る。ポリ核酸はまた、操作細胞外受容体も含み得る。
少なくとも１つの操作抗原受容体を含む、哺乳動物性メチル化ポリ核酸を使用して、細胞毒性を低減することができる。ポリ核酸は、哺乳動物性メチル化を含むように修飾することができる。ポリ核酸は、細胞により外来として認識されないように、哺乳動物性メチル化によるメチル化であり得る。
ポリ核酸の修飾はまた、培養工程の一部として実施することもできる。ポリ核酸の脱メチル化は、ゲノム修飾された細菌培養物であって、細菌性メチル化を導入しない細菌培養物によりもたらすことができる。これらのポリ核酸は、哺乳動物性メチル化、例えば、ヒト性メチル化を含有するように、後で修飾することができる。
毒性はまた、ゲノム操作手順時に、ウイルスタンパク質を導入することにより低減することもできる。例えば、ウイルスタンパク質を使用して、ＤＮＡセンシングを遮断し、外因性ＴＣＲまたはＣＲＩＳＰＲ系をコードするドナー核酸の毒性を低減することができる。ＤＮＡセンシングを遮断するように、ウイルスにより利用される逃避戦略は、ウイルス核酸の封鎖もしくは修飾；ＰＲＲもしくはそれらのアダプタータンパク質の特異的翻訳後修飾への干渉；パターン認識受容体（ＰＲＲ）もしくはそれらのアダプタータンパク質の分解もしくは切断；ＰＲＲの封鎖もしくは再局在化、またはこれらの任意の組合せであり得る。場合によって、ウイルスにより利用される逃避戦略のうちのいずれかにより、ＤＮＡセンシングを遮断し得る、ウイルスタンパク質を導入することができる。
場合によって、ウイルスタンパク質は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１）、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶｓ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ−Ｃｏｖ）、Ｂ型肝炎ウイルス、ブタ伝染性下痢症ウイルス、またはこれらの任意の組合せなどのウイルスであり得るか、またはこれらに由来し得る。
導入されるウイルスタンパク質は、細胞膜により密閉され得る、特異的複製コンパートメントの形成を誘導することにより、または、他の場合には、小胞体、ゴルジ装置、ミトコンドリア、またはこれらの任意の組合せなどの細胞小器官上で複製されるように、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）が、ウイルスＲＮＡに接近することを防止し得る。例えば、本開示のウイルスは、ＲＬＲによる検出を防止するか、またはＲＬＲの活性化を妨げる修飾を有し得る。他の場合には、ＲＬＲシグナル伝達経路を阻害し得る。例えば、Ｌｙｓ６３結合型ＲＩＧ−Ｉのユビキチン化を阻害または遮断して、ＲＩＧ−Ｉシグナル伝達の活性化を防止することができる。他の場合には、ウイルスタンパク質は、ＲＩＧ−Ｉのユビキチン化の一因となり得る、細胞内Ｅ３ユビキチンリガーゼをターゲティングし得る。ウイルスタンパク質はまた、ＲＩＧ−Ｉのユビキチン化も除去し得る。さらに、ウイルスは、細胞内マイクロＲＮＡの存在度をモジュレートすることにより、またはＲＮＡ−タンパク質間相互作用を介して、タンパク質間相互作用とは独立に、ＲＩＧ−Ｉのユビキチン化（例えば、Ｌｙｓ６３結合型）を阻害し得る。
場合によって、ＲＩＧ−Ｉの活性化を防止するために、ウイルスタンパク質が、ウイルスＲＮＡ内の５’−三リン酸部分をプロセシングする場合もあり、ウイルス的ヌクレアーゼが、遊離二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を消化する場合もある。さらに、ウイルスタンパク質は、ウイルスＲＮＡに結合して、ＲＩＧ−Ｉによる病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の認識も阻害し得る。一部のウイルスタンパク質は、ＲＩＧ−Ｉおよび／またはＭＤＡ５の特異的翻訳後修飾を操り、これにより、これらのシグナル伝達能を遮断し得る。例えば、ウイルスは、ウイルス性脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）をコードすることにより、Ｌｙｓ６３結合型ＲＩＧ−Ｉのユビキチン化を防止し得る。他の場合には、ウイルスタンパク質は、細胞内Ｅ３ユビキチンリガーゼ、ＴＲＩＭ２５（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｍｏｔｉｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ２５）、および／またはＲｉｐｌｅｔをアンタゴナイズすることが可能であり、これにより、また、ＲＩＧ−Ｉのユビキチン化も阻害し、したがって、その活性化も阻害し得る。さらに、他の場合には、ウイルスタンパク質は、ＴＲＩＭ２５に結合して、持続的なＲＩＧ−Ｉシグナル伝達も遮断し得る。ＭＤＡ５の活性化を抑制するために、ウイルスタンパク質は、ＰＰ１αを媒介するかまたはＰＰ１γを媒介する、ＭＤＡ５の脱リン酸化を防止し、ＭＤＡ５を、そのリン酸化不活性状態に保つことができる。例えば、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）は、プロテインキナーゼＲアクチベーター（ＰＡＣＴ）をターゲティングして、ＲＩＧ−Ｉをアンタゴナイズし得る。ＤＥＮＶウイルスに由来するＮＳ３タンパク質は、トラフィッキング因子である１４−３−３εをターゲティングして、ミトコンドリアのＭＡＶＳへの、ＲＩＧ−Ｉの転移を防止し得る。場合によって、ウイルスタンパク質は、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、および／またはＭＡＶＳを切断し得る。細胞内の分解経路を壊滅させて、ＲＬＲ−ＭＡＶＳ依存性シグナル伝達を阻害するように、他のウイルスタンパク質を導入することもできる。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に由来するＸタンパク質と、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）に由来する９ｂタンパク質とは、ＭＡＶＳのユビキチン化および分解を促進し得る。
場合によって、導入されるウイルスタンパク質は、ｃＧＡＳ、ＩＦＩ１６、ＳＴＩＮＧ、またはこれらの任意の組合せの免疫逃避を可能とし得る。例えば、環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の活性化を防止するため、ウイルスタンパク質は、逆転写された過剰なウイルスＤＮＡを分解するのに、細胞内３’修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）を使用し得る。加えて、ウイルスカプシドは、逆転写されたＤＮＡの、ｃＧＡＳによるセンシングを防止し得る、シクロフィリンＡ（ＣＹＰＡ）など、宿主コード因子を動員し得る。さらに、導入されるウイルスタンパク質は、ウイルスＤＮＡおよびｃＧＡＳの両方に結合して、ｃＧＡＳの活性を阻害し得る。他の場合には、ＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ＩＦＮ）ｇｅｎｅｓ）の活性化をアンタゴナイズするために、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、およびヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ−ＮＬ６３）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）のパパイン様プロテアーゼ（ＰＬＰ）は、ＳＴＩＮＧのＬｙｓ６３結合型ユビキチン化を防止または除去する。導入されるウイルスタンパク質はまた、ＳＴＩＮＧに結合し、その活性化を阻害することもでき、ＳＴＩＮＧを切断して、それを不活化させることもできる。場合によって、ＩＦＩ１６を不活化させることができる。例えば、ウイルスタンパク質は、プロテアソーム分解のためにＩＦＩ１６をターゲティングすることもでき、ＩＦＩ１６に結合して、そのオリゴマー化を防止し、これにより、その活性化を防止することもできる。
例えば、導入されるウイルスタンパク質は、ＨＣＭＶ ｐＵＬ８３、ＤＥＮＶ ＮＳ２Ｂ〜ＮＳ３、ＨＰＶ１８ Ｅ７、ｈＡｄ５ Ｅ１Ａ、ＨＳＶ１ ＩＣＰ０、ＶＡＣＶ Ｂ１３、ＶＡＣＶ Ｃ１６、ＴＲＥＸ１、ＨＣｏＶ−ＮＬ６３、ＳＡＲＳ−Ｃｏｖ、ＨＢＶ Ｐｏｌ、ＰＥＤＶ、またはこれらの任意の組合せであるか、またはこれらに由来し得る。ウイルスタンパク質は、アデノウイルスタンパク質であり得る。アデノウイルスタンパク質は、４型アデノウイルスのＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質であり得る。ウイルスタンパク質は、Ｂ１３ワクチンウイルスタンパク質であり得る。導入されるウイルスタンパク質は、細胞質ＤＮＡの認識、センシング、またはこれらの組合せを阻害し得る。場合によって、細胞を操作する場合、ウイルスタンパク質を利用してウイルス組込み生物学の条件を再現することができる。ＣＲＩＳＰＲを利用して、トランス遺伝子組込みまたはゲノム修飾の間にウイルスタンパク質を細胞へと導入することができる（図１３３Ａ、図１３３Ｂ、図１３４、図１３５Ａおよび図１３５Ｂ）。
場合によって、ＲＩＰ経路を阻害し得る。他の場合には、ｃ−ＦＬＩＰ（ｃｅｌｌｕｌａｒ ＦＬＩＣＥ（ＦＡＤＤ−ｌｉｋｅ ＩＬ−１ベータ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）経路を、細胞へと導入することができる。ｃ−ＦＬＩＰは、ヒト細胞内で、長型スプライス変異体（ｃ−ＦＬＩＰＬ）、短型スプライス変異体（ｃ−ＦＬＩＰＳ）、およびｃ−ＦＬＩＰＲスプライス変異体として発現し得る。ｃ−ＦＬＩＰは、スプライス変異体として発現し得る。ｃ−ＦＬＩＰはまた、Ｃａｓｐｅｒ、ｉＦＬＩＣＥ、ＦＬＡＭＥ−１、ＣＡＳＨ、ＣＬＡＲＰ、ＭＲＩＴ、またはｕｓｕｒｐｉｎとしても公知であり得る。ｃ−ＦＬＩＰは、ＦＡＤＤおよび／またはカスパーゼ８もしくはカスパーゼ１０およびＴＲＡＩＬ受容体５（ＤＲ５）に結合し得る。この相互作用は、ＤＩＳＣ（Ｄｅａｔｈ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成と、後続するカスパーゼカスケードの活性化とを防止する。ｃ−ＦＬＩＰＬおよびｃ−ＦＬＩＰＳはまた、多様なシグナル伝達経路のほか、Ａｋｔ、ＥＲＫ、およびＮＦ−κＢを含むいくつかの細胞保護性および生存促進性のシグナル伝達タンパク質の活性化および／または上方調節においても、多機能性の役割を有することが公知である。場合によって、ｃ−ＦＬＩＰを、細胞へと導入して、生存率を増大させることができる。
他の場合には、ＳＴＩＮＧを阻害し得る。場合によって、カスパーゼ経路を阻害する。ＤＮＡセンシング経路は、サイトカインベースの炎症経路および／またはインターフェロンアルファ発現経路であり得る。場合によって、少なくとも１つのＤＮＡセンシング経路インヒビターを細胞へと導入する、多モード法を取る。場合によって、ＤＮＡセンシングのインヒビターは、細胞死を低減することが可能であり、外因性ＴＣＲトランス遺伝子の組込みの改善を可能とする。多モード法は、ＴＢＫインヒビターと組み合わせた、ＳＴＩＮＧ／カスパーゼインヒビターであり得る。
正確な遺伝子改変の挿入を可能とするＨＤＲを増強するために、本発明者らは、遺伝子サイレンシング、リガーゼＩＶインヒビターＳＣＲ７、または４型アデノウイルスＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質およびＥ４ｏｒｆ６タンパク質の共発現により、ＮＨＥＪのカギとなる分子である、ＫＵ７０、ＫＵ８０、またはＤＮＡリガーゼＩＶを抑制した。
導入されるウイルスタンパク質は、プラスミドＤＮＡの細胞毒性を、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％、またはほぼこれらの比率だけ低減し得る。ウイルスタンパク質は、細胞生存率を、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％、またはほぼこれらの比率だけ改善し得る。
場合によって、ｇＲＮＡを使用して、毒性を低減することができる。例えば、ｇＲＮＡは、ベクターのフィラー領域内に結合するように操作することができる。ベクターは、ミニサークルＤＮＡベクターであり得る。場合によって、ミニサークルベクターは、ウイルスタンパク質と共に使用することができる。他の場合には、ミニサークルベクターは、ウイルスタンパク質、および少なくとも１つのさらなる毒性低減剤と共に使用することができる。場合によって、二本鎖ＤＮＡなど、外因性ＤＮＡと関連する毒性を低減することにより、ゲノム破壊を、より効率的に実施することができる。
場合によって、酵素を使用して、ＤＮＡの毒性を低減することができる。例えば、ＤｐｎＩなどの酵素を用いて、ＤＮＡベクター上またはトランス遺伝子上のメチル化標的を除去することができる。電気穿孔の前に、ベクターまたはトランス遺伝子を、ＤｐｎＩで前処理することができる。ＤｐｎＩなどのＩＩＭ型制限エンドヌクレアーゼは、メチル化ＤＮＡを認識および切断することが可能である。場合によって、ミニサークルＤＮＡを、ＤｐｎＩで処理する。天然の制限エンドヌクレアーゼは、４つの群（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型）へと類別される。場合によって、ＤｐｎＩなどの制限エンドヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ系エンドヌクレアーゼを用いて、操作細胞を調製する。
本明細書では、操作細胞を作製する方法であって、少なくとも１つの操作アデノウイルスタンパク質またはその機能的部分を導入するステップと；少なくとも１つの外因性受容体配列をコードする、少なくとも１つのポリ核酸を導入するステップと；少なくとも１つのゲノムを、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼまたはその部分で、ゲノム的に破壊するステップとを含む方法が開示される。場合によって、アデノウイルスタンパク質またはその機能的部分は、Ｅ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｓｃｒ７、Ｌ７５５５０７、ＮＳ２Ｂ３、ＨＰＶ１８ Ｅ７、ｈＡｄ５ Ｅ１Ａ、またはこれらの組合せである。アデノウイルスタンパク質は、血清型１〜５７から選択することができる。場合によって、アデノウイルスタンパク質の血清型は、血清型５である。
場合によって、操作アデノウイルスタンパク質またはその部分は、少なくとも１個の修飾を有する。修飾は、前記アデノウイルスタンパク質の配列の、置換、挿入、欠失、または修飾であり得る。修飾は、挿入であり得る。挿入は、ＡＧＩＰＡの挿入であり得る。場合によって、修飾は、置換である。置換は、タンパク質配列のアミノ酸３７３位における、ＨからＡへの置換であり得る。ポリ核酸は、ＤＮＡの場合もあり、ＲＮＡの場合もある。ポリ核酸は、ＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、ミニサークルＤＮＡであり得る。場合によって、外因性受容体配列は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびこれらの任意の部分または誘導体の配列からなる群から選択することができる。外因性受容体配列は、ＴＣＲ配列であり得る。エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベース、ＺＥＮ、メガヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ−ＴＡＬ、およびこれらの任意の部分または誘導体からなる群から選択することができる。エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲであり得る。ＣＲＩＳＰＲは、少なくとも１つのＣａｓタンパク質を含み得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、ｃ２ｃ１、ｃ２ｃ３、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、これらの相同体、またはこれらの修飾形からなる群から選択することができる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９であり得る。
場合によって、ＣＲＩＳＰＲは、ゲノム内に、二本鎖切断を創出する。ゲノムは、少なくとも１つの遺伝子を含み得る。場合によって、外因性受容体配列を、少なくとも１つの遺伝子へと導入する。導入は、少なくとも１つの遺伝子を破壊し得る。遺伝子は、ＣＩＳＨ、ＴＣＲ、ＴＲＡ、ＴＲＢ、またはこれらの組合せであり得る。細胞は、ヒト細胞であり得る。ヒト細胞は、免疫細胞であり得る。免疫細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはこれらの任意の組合せであり得る。方法は、細胞を拡大するステップをさらに含み得る。
本明細書では、操作細胞を作製する方法であって、少なくとも１つの外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列をコードする、少なくとも１つのポリ核酸を、ウイルスにより導入するステップと；少なくとも１つの遺伝子を、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼまたはその機能的な部分によりゲノム破壊するステップとを含む方法が開示される。場合によって、ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはこれらの任意の誘導体から選択することができる。ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり得る。ＡＡＶは、血清型５であり得る。ＡＡＶは、血清型６であり得る。ＡＡＶは、少なくとも１つの修飾を含み得る。修飾は、化学修飾であり得る。ポリ核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの任意の修飾体であり得る。ポリ核酸は、ＤＮＡであり得る。場合によって、ＤＮＡは、ミニサークルＤＮＡである。場合によって、ポリ核酸は、ＴＣＲ配列を挟む、少なくとも１つの相同性アームをさらに含み得る。相同性アームは、少なくとも１つの遺伝子において、相補配列を含み得る。遺伝子は、内因性遺伝子であり得る。内因性遺伝子は、チェックポイント遺伝子であり得る。
場合によって、本開示の任意の実施形態による方法または系は、少なくとも１つの毒性低減剤をさらに含み得る。場合によって、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つのさらなる毒性低減剤と共に使用することができる。他の場合には、ミニサークルベクターは、少なくとも１つのさらなる毒性低減剤と共に使用することができる。毒性低減剤は、ウイルスタンパク質、または細胞質ＤＮＡセンシング経路のインヒビターであり得る。ウイルスタンパク質は、Ｅ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｓｃｒ７、Ｌ７５５５０７、ＮＳ２Ｂ３、ＨＰＶ１８ Ｅ７、ｈＡｄ５ Ｅ１Ａ、またはこれらの組合せであり得る。方法は、細胞の拡大をさらに含み得る。場合によって、細胞質ＤＮＡセンシング経路のインヒビターを使用することができ、それは、ｃ−ＦＬＩＰ（ｃｅｌｌｕｌａｒ ＦＬＩＣＥ（ＦＡＤＤ−ｌｉｋｅ ＩＬ−１β−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）であり得る。
細胞生存率、および／または１もしくは複数の細胞のゲノムへのトランス遺伝子の組込みの効率は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して測定することができる。場合によって、細胞生存率および／または組込みの効率は、トリパンブルー排除、ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）、所与の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８）の有無、テロメアの長さ、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、リアルタイムＰＣＲ、またはＤｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲを使用して測定することができる。例えば、ＦＡＣＳを使用して、電気穿孔後における、トランス遺伝子の組込みの効率を検出することができる。別の例では、アポトーシスは、ＴＵＮＥＬを使用して測定することができる。場合によって、毒性は細胞のゲノム操作によって起こり得る（D.R. Senら、Science 10.1126/science.aae0491（２０１６年））。毒性は、腫瘍標的に対する細胞の細胞傷害性に影響を及ぼし得る細胞の疲弊をもたらし得る。場合によって、疲弊したＴ細胞は、機能的メモリーＴ細胞とは異なる分化状態を占め得る。場合によって、変化した細胞状態を同定すること、およびそれをベースラインに戻す方法は、本明細書中の方法によって記載され得る。例えば、疲弊したＴ細胞における状態特異的エンハンサーのマッピングは、養子Ｔ細胞療法のための改善されたゲノム編集を可能にし得る。場合によって、Ｔ細胞を疲弊に耐性にするためのゲノム編集は、養子Ｔ細胞療法を改善し得る。場合によって、疲弊したＴ細胞は、機能的メモリーＴ細胞と比較した場合、変化したクロマチンランドスケープを有し得る。クロマチンランドスケープの変化には、エピジェネティックな変化が含まれ得る。
ベクターの細胞膜への送達
ヌクレアーゼおよび転写因子、これらをコードするポリヌクレオチド、ならびに／または任意のトランス遺伝子のポリヌクレオチド、ならびに本明細書で記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の適切な手段により、標的細胞へと送達することができる。
適切な細胞は、真核細胞および／または真核細胞株、ならびに原核細胞および／または原核細胞株を含み得るがこれらに限定されない。このような細胞、またはこのような細胞から作製された細胞株の非限定的な例は、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞のほか、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属などの真菌細胞を含む。場合によって、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、またはＨＥＫ２９３細胞株である。場合によって、細胞または細胞の集団は、初代細胞または初代細胞の集団である。場合によって、初代細胞または初代細胞の集団は、初代リンパ球または初代リンパ球の集団である。場合によって、適切な初代細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、およびＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、ナチュラルキラーＴ細胞、単球前駆細胞、造血幹細胞、または非多能性幹細胞などであるがこれらに限定されない、他の血液細胞サブセットを含む。場合によって、細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞などの腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、または他の任意の種類のＴ細胞など、任意のＴ細胞を含む、任意の免疫細胞であり得る。Ｔ細胞はまた、メモリーＴ細胞、メモリーステムＴ細胞、またはエフェクターＴ細胞も含み得る。Ｔ細胞はまた、バルク集団から選択することもでき、例えば、Ｔ細胞を、全血液から選択することもできる。Ｔ細胞はまた、バルク集団から拡大することもできる。Ｔ細胞はまた、特定の集団および表現型に偏る場合もある。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）、および／またはＩＬ−７Ｒα（＋）を表現型的に含むように、偏り得る。ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）、および／またはＩＬ−７Ｒα（＋）を含むリストから選択される、１または複数のマーカーを含む、適切な細胞を選択することができる。適切な細胞はまた、例示を目的として述べると、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉幹細胞などの幹細胞も含み得る。適切な細胞は、ヒト細胞、非ヒト細胞、および／またはマウス細胞など、任意の数の初代細胞を含み得る。適切な細胞は、前駆細胞であり得る。適切な細胞は、処置される対象（例えば、患者）に由来し得る。適切な細胞は、ヒトドナーに由来し得る。適切な細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、およびＩＬ−７Ｒα＋から構成される、ステムメモリーＴＳＣＭ細胞であることが可能であり、ステムメモリー細胞はまた、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、およびＬＦＡ−１も発現することが可能であり、ステムメモリー細胞固有の、多数の機能的な属性を示す。適切な細胞は、Ｌ−セレクチンおよびＣＣＲ７を含む、セントラルメモリー細胞であるＴＣＭ細胞であることが可能であり、セントラルメモリー細胞は、例えば、ＩＬ−２を分泌し得るが、ＩＦＮγまたはＩＬ−４は分泌し得ない。適切な細胞はまた、Ｌ−セレクチンまたはＣＣＲ７を含む、エフェクターメモリー細胞であるＴＥＭ細胞でもあることが可能であり、例えば、ＩＦＮγおよびＩＬ−４など、エフェクターサイトカインを産生し得る。場合によって、初代細胞は初代リンパ球であり得る。場合によって、初代細胞の集団は、リンパ球集団であり得る。
適切な細胞を獲得する方法は、細胞を選択するステップを含み得る。場合によって、細胞は、細胞に対して選択され得るマーカーを含み得る。例えば、このようなマーカーは、ＧＦＰ、耐性遺伝子、細胞表面マーカー、内因性タグを含み得る。細胞は、任意の内因性マーカーを使用して選択することができる。適切な細胞は、任意の技術を使用して選択することができる。このような技術は、フローサイトメトリーおよび／または磁気カラムを含み得る。次いで、選択した細胞を、対象へと注入することができる。選択した細胞はまた、大きな個数へと拡大することもできる。選択した細胞は、注入の前に拡大することができる。
本明細書で記載される転写因子およびヌクレアーゼは、例えば、タンパク質のうちの１または複数をコードする配列を含有するベクターを使用して送達することができる。トランス遺伝子をコードするポリヌクレオチドも、同様に送達することができる。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含むがこれらに限定されない、任意のベクター系を使用することができる。さらに、これらのベクターのうちのいずれかは、１または複数の転写因子、ヌクレアーゼ、および／またはトランス遺伝子も含み得る。したがって、１または複数の、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベースのＺＥＮ、メガヌクレアーゼ、もしくはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子、および／またはトランス遺伝子を、細胞へと導入する場合、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベースのＺＥＮ、メガヌクレアーゼ、もしくはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子、および／またはトランス遺伝子は、同じベクター上に保有される場合もあり、異なるベクター上に保有される場合もある。複数のベクターを使用する場合、各ベクターは、１または複数の、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベースのＺＥＮ、メガヌクレアーゼ、もしくはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子、および／またはトランス遺伝子をコードする配列を含み得る。
従来型のウイルスベースの遺伝子導入法および非ウイルスベースの遺伝子移入法を使用して、操作されたＣＲＩＳＰＲ分子、ＴＡＬＥＮ分子、トランスポゾンベースのＺＥＮ分子、メガヌクレアーゼ分子、もしくはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子、および／またはトランス遺伝子をコードする核酸を、細胞（例えば、哺乳動物細胞）内および標的組織内に導入することができる。このような方法はまた、ＣＲＩＳＰＲ分子、ＴＡＬＥＮ分子、トランスポゾンベースのＺＥＮ分子、メガヌクレアーゼ分子、もしくはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子、および／またはトランス遺伝子をコードする核酸を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞へと投与するのに使用することもできる。一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ分子、ＴＡＬＥＮ分子、トランスポゾンベースのＺＥＮ分子、メガヌクレアーゼ分子、もしくはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子、および／またはトランス遺伝子をコードする核酸を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける免疫療法への使用のために投与することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなど、送達媒体と複合体化させた核酸を含み得る。ウイルスベクター送達系は、エピソームゲノム、または細胞への送達の後で組み込まれたゲノムを有する、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含み得る。
核酸のウイルスまたは非ウイルスの送達法は、電気穿孔、リポフェクション、ヌクレオフェクション、金ナノ粒子送達、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ウィロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ビリオン、および薬剤増強型ＤＮＡ取込みを含む。核酸を送達するために、例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用する超音波穿孔もまた、使用することができる。
さらなる例示的な核酸送達系は、ＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｍｄ．）、ＭＡＸＣＹＴＥ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）により提供されている核酸送達系を含む。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標））。送達は、細胞への送達（ｅｘ ｖｉｖｏ投与）の場合もあり、標的組織への送達（ｉｎ ｖｉｖｏ投与）の場合もある。さらなる送達法は、送達される核酸の、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達媒体（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用を含む。これらのＥＤＶは、抗体の１つのアームが、標的組織に対する特異性を有し、他のアームがＥＤＶに対する特異性を有する、二特異性抗体を使用して、標的組織へと特異的に送達される。抗体により、ＥＤＶは、標的細胞の表面に至り、次いで、ＥＤＶは、エンドサイトーシスにより、細胞内に至る。
操作されたＣＲＩＳＰＲ分子、ＴＡＬＥＮ分子、トランスポゾンベースのＺＥＮ分子、メガヌクレアーゼ分子、もしくはＭｅｇａ−ＴＡＬ分子、トランスポゾン、および／またはトランス遺伝子をコードする核酸を含有する、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含むベクターもまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞への形質導入のために、生物へと、直接投与することができる。代替的に、ネイキッドＤＮＡまたはｍＲＮＡも投与することができる。投与は、分子を、血液または組織細胞と、最終的に接触させるために通常使用される経路であって、注射、注入、局所適用、および電気穿孔を含むがこれらに限定されない経路のうちのいずれかによる。１つを超える経路を使用して、特定の組成物を投与することができる。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するのに使用される特定の方法により、部分的に決定される。
場合によって、外因性ＴＣＲをコードするベクターは、細胞内ヌクレアーゼへとシャトリングすることができる。例えば、ベクターは、核局在化配列（ＮＬＳ）を含有し得る。ベクターはまた、タンパク質またはタンパク質複合体によりシャトリングすることもできる。場合によって、Ｃａｓ９は、ミニサークルベクターをシャトリングする手段として使用することができる。Ｃａｓは、ＮＬＳを含み得る。場合によって、ベクターは、電気穿孔の前に、Ｃａｓタンパク質とあらかじめ複合体化させることができる。シャトリングのために使用され得るＣａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質であり得る。シャトリングのために使用され得るＣａｓタンパク質は、ヌクレアーゼコンピテントＣａｓ９であり得る。場合によって、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡ、および外因性ＴＣＲをコードするプラスミドと、あらかじめ混合することができる。
本明細書で開示される、ある特定の態様は、ベクターを用いうる。例えば、使用され得るベクターは、細菌用：ｐＢｓ、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４Ｏ、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核細胞用：ｐＷＬ−ｎｅｏ、ｐＳｖ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰｖ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍｉａｃｉａ）を含むがこれらに限定されない。それらが、選択された宿主内で、複製可能であり、生存する限りにおいて、他の任意のプラスミドおよびベクターもまた、使用することができる。任意のベクターおよび市販のベクター（およびこれらの変異体または誘導体）は、方法における使用のための、１または複数の組換え部位を含むように操作することができる。このようなベクターは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、およびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓから得ることができる。目的の他のベクターは、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、およびｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、およびｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、およびｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、およびｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）、およびｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａ−ｃＨｉｓ Ａ、Ｂ、およびＣ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ１１１、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３ ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、およびｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．）、ならびにこれらの変異体または誘導体などの真核細胞用発現ベクターを含む。他のベクターは、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、コスミド、ファージミド、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌的人工染色体）、Ｐ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉファージ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（Ｑｕａｇａｎ）、ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０およびｐＳＹＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにこれらの変異体または誘導体を含む。さらなる目的のベクターはまた、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＬＥＸ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅＢａ−ｃＨｉｓ２、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＳｅｃＴａｇ、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡ０８１Ｓ、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺＡ、ｐＰＩＣＺＢ、ｐＰＩＣＺＣ、ｐＧＡＰＺＡ、ｐＧＡＰＺＢ、ｐＧＡＰＺＣ、ｐＢｌｕｅ−Ｂａｃ４．５、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ｐＳｉｎＨｉｓ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＶｇＲＸＲ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐＹＥＳ２、ｐＺＥｒ０１．１、ｐＺＥｒＯ−２．１、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐＳｅ、ＳＶ２、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ｐＲＥＰ８、ｐＲＥＰ９、ｐＲＥＰ １０、ｐＣＥＰ４、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＣＲ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ、およびｐＣＲＢａｃ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ製のＸ ＥｘＣｅｌｌ、Ｘ ｇｔ１１、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−１Ｘ Ｔ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐＳＬ１１８０、ｐＮＥＯ、およびｐＵＣ４Ｋ；Ｎｏｖａｇｅｎ製のｐＳＣＲＥＥＮ−ｌｂ（＋）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、ｐＣＩＴＥ−４−ａｂｃ（＋）、ｐＯＣＵＳ−２、ｐＴＡｇ、ｐＥＴ−３２Ｌ１Ｃ、ｐＥＴ−３０ＬＩＣ、ｐＢＡＣ−２ ｃｐ ＬＩＣ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ ｃｐ ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、Ｘ ＳＣＲＥＥＮ−１、Ｘ ＢｌｕｅＳＴＡＲ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−７ａｂｃ、ｐＥＴ９ａｂｃｄ、ｐＥＴ１１ ａｂｃｄ、ｐＥＴ１２ａｂｃ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１７ｂ−ｐＥＴ−１７ｘｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＢＡＣ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ−１、ｐＢＡＣ４ｘ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ４ｘ−１、ｐＢＡＣ−３ ｃｐ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ ｃｐ、ｐＢＡＣｓｕｒｆ−１、ｐｌｇ、Ｓｉｇｎａｌ ｐｌｇ、ｐＹＸ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ−Ｎｅｏ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ−Ｈｙｇ、およびＳｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ−Ｇｐｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製のｐＬｅｘＡ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＧＢＴ９、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤ ＧＬ、ｐＧＡＤ ＧＨ、ｐＧＡＤ１０、ｐＧｉｌｄａ、ｐＥＺＭ３、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＰ−１、ｐＥＧＦＰＮ、ｐＥＧＦＰ−Ｃ、ｐＥＢＦＰ、ｐＧＦＰｕｖ、ｐＧＦＰ、ｐ６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒａｌ、ｐＳＥＡＰ２−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＳＥＡＰ２−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐ Ｉ３ｇａｌ−Ｂａｓｉｃ、ｐｌ３ｇａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐ Ｉ３ｇａｌ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐ Ｉ３ｇａｌ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＭＶ、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ、ｐＴＫ−Ｈｙｇ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳ１ｈｙｇ、ｐＬＸＳＮ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＡＰＳＮ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＣＡＴ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＬＵＣ、ｐＰＵＲ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＹＥＸ４Ｔ−１／２／３、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＡｃＵＷ３１、ＢａｃＰＡＫ６、ｐＴｒｉｐｌＥｘ、２Ｘｇｔ１０、Ｘｇｔ１１、ｐＷＥ１５、およびＸ ＴｒｉｐｌＥｘ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＬａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋／−、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋／−、ｐＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＢＤ−ＧＡＬ４ Ｃａｍ、ｐＳｕｒｆｓｃｒｉｐｔ、Ｌａｍｂｄａ ＦＩＸ ＩＩ、Ｌａｍｂｄａ ＤＡＳＨ、Ｌａｍｂｄａ ＥＭＢＬ３、Ｌａｍｂｄａ ＥＭＢＬ４、ＳｕｐｅｒＣｏｓ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｇｔ Ａｍｐ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｄｉｒｅｃｔ、ｐＢＳ＋／−、ｐＢＣ ＫＳ＋／−、ｐＢＣ ＳＫ＋／−、Ｐｈａｇ−ｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＣＡＬ−ｎ、ｐＣＡＬ−ｃ、ｐＣＡＬ−ｋｃ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−ｌｌａｂｃｄ、ｐＳＰＵＴＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ、ｐＯＰＩ３ ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、ｐＭＣｌｎｅｏ Ｐｏｌｙ Ａ、ｐＯＧ４４、ｐ０Ｇ４５、ｐＦＲＴＩ３ＧＡＬ、ｐＮＥ０Ｉ３ＧＡＬ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、およびｐＲＳ４１６；ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤ１−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ、ｐＹＥＳＴｒｐ、ならびにこれらの変異体または誘導体も含み得る。
これらのベクターを使用して、目的の遺伝子、例えば、トランス遺伝子、または目的の遺伝子の部分を発現させることができる。遺伝子の部分または遺伝子は、任意の方法を使用することにより挿入することができる。例えば、方法は、制限酵素ベースの技法であり得る。
ベクターは、下記で記載される通り、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、個別の患者への投与により、典型的に、全身投与（例えば、静脈内注入、腹腔内注入、筋内注入、皮下注入、または頭蓋内注入）または局所適用により送達することができる。代替的に、ベクターは、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、個別の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、Ｔ細胞、骨髄吸引物、組織生検）などの細胞へと送達することもできるが、通例、ベクターを組み込んだ細胞についての選択の後、患者への細胞の再移植がこれに続く。選択の前に、または選択の後で、細胞は、拡大することができる。ベクターは、ミニサークルベクターであり得る（図４３）。
細胞に、ミニサークルベクターおよびＣＲＩＳＰＲ系をトランスフェクトすることができる。場合によって、ミニサークルベクターは、ＣＲＩＳＰＲ系ならびに／またはヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼをコードするポリペプチドを細胞または細胞の集団へと導入するのと同時に、その前に、またはその後に、細胞または細胞の集団へと導入される。ミニサークルベクターの濃度は、０．５ナノグラム〜５０マイクログラムであり得る。場合によって、電気穿孔により細胞へと導入され得る核酸（例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ）の量を変動させて、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。場合によって、約１００ピコグラム未満の核酸を、各細胞試料（例えば、電気穿孔される、１または複数の細胞）へと添加することができる。場合によって、少なくとも約１００ピコグラム、少なくとも約２００ピコグラム、少なくとも約３００ピコグラム、少なくとも約４００ピコグラム、少なくとも約５００ピコグラム、少なくとも約６００ピコグラム、少なくとも約７００ピコグラム、少なくとも約８００ピコグラム、少なくとも約９００ピコグラム、少なくとも約１マイクログラム、少なくとも約１．５マイクログラム、少なくとも約２マイクログラム、少なくとも約２．５マイクログラム、少なくとも約３マイクログラム、少なくとも約３．５マイクログラム、少なくとも約４マイクログラム、少なくとも約４．５マイクログラム、少なくとも約５マイクログラム、少なくとも約５．５マイクログラム、少なくとも約６マイクログラム、少なくとも約６．５マイクログラム、少なくとも約７マイクログラム、少なくとも約７．５マイクログラム、少なくとも約８マイクログラム、少なくとも約８．５マイクログラム、少なくとも約９マイクログラム、少なくとも約９．５マイクログラム、少なくとも約１０マイクログラム、少なくとも約１１マイクログラム、少なくとも約１２マイクログラム、少なくとも約１３マイクログラム、少なくとも約１４マイクログラム、少なくとも約１５マイクログラム、少なくとも約２０マイクログラム、少なくとも約２５マイクログラム、少なくとも約３０マイクログラム、少なくとも約３５マイクログラム、少なくとも約４０マイクログラム、少なくとも約４５マイクログラム、または少なくとも約５０マイクログラムの核酸を、各細胞試料（例えば、電気穿孔される、１または複数の細胞）へと添加することができる。例えば、１マイクログラムのｄｓＤＮＡを、電気穿孔のために、各細胞試料へと添加することができる。場合によって、最適のトランスフェクション効率および／または細胞生存率に要求される核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の量は、細胞型に特異的であり得る。場合によって、各試料のために使用される核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の量は、トランスフェクション効率および／または細胞生存率に直接対応し得る。例えば、ミニサークルトランスフェクションの濃度範囲を、図７０Ａ、図７０Ｂ、および図７３に示す。５および２０マイクログラムの濃度でトランスフェクトされた、ミニサークルベクターの組込みの効率についての概要について描示する、代表的なフローサイトメトリー実験を、図７４、図７８、および図７９に示す。ミニサークルベクターによりコードされるトランス遺伝子は、細胞ゲノムへと組み込まれ得る。場合によって、ミニサークルベクターによりコードされるトランス遺伝子の組込みは、順方向でなされる（図７５）。他の場合には、ミニサークルベクターによりコードされるトランス遺伝子の組込みは、逆方向でなされる。場合によって、非ウイルス系（例えば、ミニサークル）は、細胞または細胞の集団へと、ＣＲＩＳＰＲ系、またはヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼをコードするポリ核酸を前記細胞または前記細胞の集団へと導入した後、約１〜３時間、３〜６時間、６〜９時間、９〜１２時間、１２〜１５時間、１５〜１８時間、１８〜２１時間、２１〜２３時間、２３〜２６時間、２６〜２９時間、２９〜３１時間、３１〜３３時間、３３〜３５時間、３５〜３７時間、３７〜３９時間、３９〜４１時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１４日間、１６日間、２０日間、または２０日間よりも長い期間、ほぼこれらの期間から、少なくともほぼこれらの期間、または最大でで、導入する。
本明細書で記載される核酸送達プラットフォーム、例えば、ヌクレオフェクションまたは電気穿孔のうちのいずれかによる、細胞のトランスフェクション効率は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％を超えうるか、またはほぼこれらの比率であり得る。
例えば、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＡＭＡＸＡ（登録商標）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する電気穿孔もまた、細胞への核酸の送達のために使用することができる。電気穿孔パラメータは、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するように調整することができる。電気穿孔デバイスは、指数関数的減衰、時定数、および方形波など、複数の電気波形パルスの設定項目を有し得る。あらゆる細胞型は、適用されるパルスパラメータ（例えば、電圧、キャパシタンス、および抵抗）に依存する、固有の最適電界強度（Ｅ）を有する。最適電界強度の適用は、膜貫通電圧の誘導による電気透過化であって、核酸が細胞膜を通過することを可能とする電気透過化を引き起こす。場合によって、電気穿孔パルスの電圧、電気穿孔パルス幅、パルス数、細胞密度、およびチップ型は、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するように調整することができる。
場合によって、電気穿孔パルスの電圧を変動させて、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。場合によって、電気穿孔電圧は、約５００ボルト未満であり得る。場合によって、電気穿孔電圧は、少なくとも約５００ボルト、少なくとも約６００ボルト、少なくとも約７００ボルト、少なくとも約８００ボルト、少なくとも約９００ボルト、少なくとも約１０００ボルト、少なくとも約１１００ボルト、少なくとも約１２００ボルト、少なくとも約１３００ボルト、少なくとも約１４００ボルト、少なくとも約１５００ボルト、少なくとも約１６００ボルト、少なくとも約１７００ボルト、少なくとも約１８００ボルト、少なくとも約１９００ボルト、少なくとも約２０００ボルト、少なくとも約２１００ボルト、少なくとも約２２００ボルト、少なくとも約２３００ボルト、少なくとも約２４００ボルト、少なくとも約２５００ボルト、少なくとも約２６００ボルト、少なくとも約２７００ボルト、少なくとも約２８００ボルト、少なくとも約２９００ボルト、または少なくとも約３０００ボルトであり得る。場合によって、最適のトランスフェクション効率および／または細胞生存率に要求される電気穿孔パルスの電圧は、細胞型に特異的であり得る。例えば、１９００ボルトの電気穿孔電圧は、マクロファージ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。別の例では、約１３５０ボルトの電気穿孔電圧は、Ｊｕｒｋａｔ細胞、またはＴ細胞などの初代ヒト細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。場合によって、電気穿孔電圧の範囲は、所与の細胞型に最適であり得る。例えば、約１０００ボルト〜約１３００ボルトの間の電気穿孔電圧は、ヒト５７８Ｔ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。場合によって、初代細胞は初代リンパ球であり得る。場合によって、初代細胞の集団は、リンパ球集団であり得る。
場合によって、電気穿孔パルス幅を変動させて、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。場合によって、電気穿孔パルス幅は、約５ミリ秒未満であり得る。場合によって、電気穿孔幅は、少なくとも約５ミリ秒、少なくとも約６ミリ秒、少なくとも約７ミリ秒、少なくとも約８ミリ秒、少なくとも約９ミリ秒、少なくとも約１０ミリ秒、少なくとも約１１ミリ秒、少なくとも約１２ミリ秒、少なくとも約１３ミリ秒、少なくとも約１４ミリ秒、少なくとも約１５ミリ秒、少なくとも約１６ミリ秒、少なくとも約１７ミリ秒、少なくとも約１８ミリ秒、少なくとも約１９ミリ秒、少なくとも約２０ミリ秒、少なくとも約２１ミリ秒、少なくとも約２２ミリ秒、少なくとも約２３ミリ秒、少なくとも約２４ミリ秒、少なくとも約２５ミリ秒、少なくとも約２６ミリ秒、少なくとも約２７ミリ秒、少なくとも約２８ミリ秒、少なくとも約２９ミリ秒、少なくとも約３０ミリ秒、少なくとも約３１ミリ秒、少なくとも約３２ミリ秒、少なくとも約３３ミリ秒、少なくとも約３４ミリ秒、少なくとも約３５ミリ秒、少なくとも約３６ミリ秒、少なくとも約３７ミリ秒、少なくとも約３８ミリ秒、少なくとも約３９ミリ秒、少なくとも約４０ミリ秒、少なくとも約４１ミリ秒、少なくとも約４２ミリ秒、少なくとも約４３ミリ秒、少なくとも約４４ミリ秒、少なくとも約４５ミリ秒、少なくとも約４６ミリ秒、少なくとも約４７ミリ秒、少なくとも約４８ミリ秒、少なくとも約４９ミリ秒、または少なくとも約５０ミリ秒であり得る。場合によって、最適のトランスフェクション効率および／または細胞生存率に要求される電気穿孔パルス幅は、細胞型に特異的であり得る。例えば、３０ミリ秒の電気穿孔パルス幅は、マクロファージ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。別の例では、約１０ミリ秒の電気穿孔幅は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。場合によって、電気穿孔幅の範囲は、所与の細胞型に最適であり得る。例えば、約２０ミリ秒〜約３０ミリ秒の間の電気穿孔幅は、ヒト５７８Ｔ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。
場合によって、電気穿孔パルスの数を変動させて、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。場合によって、電気穿孔は、単一のパルスを含み得る。場合によって、電気穿孔は、１つを超えるパルスを含み得る。場合によって、電気穿孔は、２つのパルス、３つのパルス、４つのパルス、５つのパルス６つのパルス、７つのパルス、８つのパルス、９つのパルス、または１０もしくはそれよりも多いパルスを含み得る。場合によって、最適のトランスフェクション効率および／または細胞生存率に要求される電気穿孔パルスの数は、細胞型に特異的であり得る。例えば、単一のパルスによる電気穿孔は、マクロファージ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。別の例では、３つのパルスによる電気穿孔は、初代細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。場合によって、電気穿孔幅の範囲は、所与の細胞型に最適であり得る。例えば、約１つ〜約３つの間のパルスによる電気穿孔は、ヒト細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。
場合によって、電気穿孔のための出発細胞密度を変動させて、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化することができる。場合によって、電気穿孔のための出発細胞密度は、細胞約１×１０５個未満であり得る。場合によって、電気穿孔のための出発細胞密度は、細胞少なくとも約１×１０５個、細胞少なくとも約２×１０５個、細胞少なくとも約３×１０５個、細胞少なくとも約４×１０５個、細胞少なくとも約５×１０５個、細胞少なくとも約６×１０５個、細胞少なくとも約７×１０５個、細胞少なくとも約８×１０５個、細胞少なくとも約９×１０５個、細胞少なくとも約１×１０６個、細胞少なくとも約１．５×１０６個、細胞少なくとも約２×１０６個、細胞少なくとも約２．５×１０６個、細胞少なくとも約３×１０６個、細胞少なくとも約３．５×１０６個、細胞少なくとも約４×１０６個、細胞少なくとも約４．５×１０６個、細胞少なくとも約５×１０６個、細胞少なくとも約５．５×１０６個、細胞少なくとも約６×１０６個、細胞少なくとも約６．５×１０６個、細胞少なくとも約７×１０６個、細胞少なくとも約７．５×１０６個、細胞少なくとも約８×１０６個、細胞少なくとも約８．５×１０６個、細胞少なくとも約９×１０６個、細胞少なくとも約９．５×１０６個、細胞少なくとも約１×１０７個、細胞少なくとも約１．２×１０７個、細胞少なくとも約１．４×１０７個、細胞少なくとも約１．６×１０７個、細胞少なくとも約１．８×１０７個、細胞少なくとも約２×１０７個、細胞少なくとも約２．２×１０７個、細胞少なくとも約２．４×１０７個、細胞少なくとも約２．６×１０７個、細胞少なくとも約２．８×１０７個、細胞少なくとも約３×１０７個、細胞少なくとも約３．２×１０７個、細胞少なくとも約３．４×１０７個、細胞少なくとも約３．６×１０７個、細胞少なくとも約３．８×１０７個、細胞少なくとも約４×１０７個、細胞少なくとも約４．２×１０７個、細胞少なくとも約４．４×１０７個、細胞少なくとも約４．６×１０７個、細胞少なくとも約４．８×１０７個、または細胞少なくとも約５×１０７個であり得る。場合によって、最適のトランスフェクション効率および／または細胞生存率に要求される電気穿孔のための出発細胞密度は、細胞型に特異的であり得る。例えば、電気穿孔のための出発細胞密度であって、細胞１．５×１０６個の出発細胞密度は、マクロファージ細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。別の例では、電気穿孔のための出発細胞密度であって、細胞５×１０６個の出発細胞密度は、ヒト細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。場合によって、電気穿孔のための出発細胞密度の範囲は、所与の細胞型に最適であり得る。例えば、電気穿孔のための出発細胞密度であって、細胞５．６×１０６〜５×１０７個の間の出発細胞密度は、Ｔ細胞などのヒト細胞に最適であり得る（例えば、最高の生存率および／またはトランスフェクション効率をもたらし得る）。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ系による、外因性ＴＣＲをコードする核酸配列の、細胞ゲノムへの組込みの効率は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、もしくは９９．９％を超えうるか、またはほぼこれらの比率であり得る。
ＴＣＲなど、外因性ポリ核酸の組込みは、任意の技法を使用して測定することができる。例えば、組込みは、フローサイトメトリー、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ（図５６）、ＴＩＤＥ（ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）（図７１および図７２）、ジャンクションＰＣＲ、またはこれらの任意の組合せにより測定することができる。代表的なＴＩＤＥ解析を、ＰＤ−１ガイドＲＮＡおよびＣＴＬＡ−４ガイドＲＮＡについて示される、遺伝子編集効率パーセントについて示す（図３５および図３６）。ＣＩＳＨガイドＲＮＡについての代表的なＴＩＤＥ解析を、図６２〜図６７Ａおよび６７Ｂにより示す。他の場合には、トランス遺伝子の組込みは、ＰＣＲにより測定することができる（図７７、図８０、および図９５）。また、ＴＩＤＥ解析を、ｒＡＡＶ形質導入、次いで、内因性チェックポイント遺伝子のＣＲＩＳＰＲによるノックアウトによって、外因性ＴＣＲを発現するように操作された細胞上で実施することもできる（図１４６Ａおよび図１４６Ｂ）。
診断法、研究、または遺伝子治療のために、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞へのトランスフェクション（例えば、トランスフェクトされた細胞の、宿主生物への再注入を介する）もまた、使用することができる。場合によって、細胞は、対象生物から単離し、核酸（例えば、遺伝子またはｃＤＮＡ）をトランスフェクトし、対象生物（例えば、患者）へと再注入し戻すことができる。
患者において治療的に有効であるのに必要な細胞の量は、細胞の生存率と、細胞を遺伝子改変した効率（例えば、トランス遺伝子が１または複数の細胞へと組み込まれた効率）とに応じて変動し得る。場合によって、遺伝子改変後における細胞の生存率と、トランス遺伝子の組込みの効率との積（例えば、乗算の結果）は、対象への投与に利用可能な細胞の治療用アリコートに対応し得る。場合によって、遺伝子改変後における細胞生存率の増大は、患者において治療的に有効な投与に必要な細胞の量の減少に対応し得る。場合によって、トランス遺伝子が１または複数の細胞へと組み込まれた効率の増大は、患者において治療的に有効な投与に必要な細胞の量の減少に対応し得る。場合によって、治療的に有効であるのに必要な細胞の量の決定は、細胞生存率の、時間経過にわたる変化に対応する関数の決定を含み得る。場合によって、治療的に有効であるのに必要な細胞の量の決定は、トランス遺伝子を１または複数の細胞へと組み込みうる効率の、時間依存的な変数（例えば、細胞の培養時間、電気穿孔時間、細胞の刺激時間）に対する変化に対応する関数の決定を含み得る。
本明細書で記載される、ｒＡＡＶなどのウイルス粒子を使用して、目的の遺伝子またはトランス遺伝子を含むウイルスベクターを、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの細胞へと送達することができる（図１０５）。場合によって、本明細書で開示されるウイルスベクターは、ｐｆｕ（プラーク形成単位）として測定され得る。場合によって、本開示の組成物および方法の組換えウイルスまたはウイルスベクターのｐｆｕは、約１０８〜約５×１０１０ｐｆｕであり得る。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、および５×１０１０ｐｆｕである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、最大で約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、および５×１０１０ｐｆｕである。一部の態様では、本開示のウイルスベクターは、ベクターゲノムとして測定され得る。場合によって、本開示の組換えウイルスは、１×１０１０〜３×１０１２ベクターゲノム、または１×１０９〜３×１０１３ベクターゲノム、または１×１０８〜３×１０１４ベクターゲノム、または少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８ベクターゲノムであるか、または１×１０８〜３×１０１４ベクターゲノムであるか、または最大で約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８ベクターゲノムである。
場合によって、本開示のウイルスベクター（例えば、ＡＡＶまたは修飾ＡＡＶ）は、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定され得る。場合によって、ＭＯＩは、ベクターまたはウイルスゲノムの、核が送達され得る細胞に対する比率または倍数を指し得る。場合によって、ＭＯＩは１×１０６であり得る。場合によって、ＭＯＩは１×１０５〜１×１０７であり得る。場合によって、ＭＯＩは１×１０４〜１×１０８であり得る。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８ＭＯＩである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、１×１０８〜３×１０１４ＭＯＩであるか、または最大で約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８ＭＯＩである。場合によって、ＡＡＶおよび／または修飾ＡＡＶベクターは、約１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７から、または細胞当たり最大で約９×１０９ゲノムコピー／ウイルス粒子の感染多重度（ＭＯＩ）で、導入される。
一部の態様では、非ウイルスベクターまたは核酸は、ウイルスを使用することなく送達され得、核酸の量に従って測定され得る。一般に、核酸の任意の適切な量が、本開示の組成物および方法と共に使用され得る。場合によって、核酸は、少なくとも約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、または５ｇであり得る。場合によって、核酸は、最大で約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、または５ｇであり得る。
場合によって、ウイルス（ＡＡＶまたは修飾ＡＡＶ）または非ウイルスベクターは、細胞または細胞の集団へと導入される。場合によって、細胞毒性は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターが細胞または細胞の集団へと導入された後に測定される。場合によって、細胞毒性は、野生型ＡＡＶまたは非ウイルスベクター（例えば、ミニサークル）が、同等の細胞または同等の細胞の集団へと導入される場合より、修飾ＡＡＶベクターが使用される場合に低い。場合によって、細胞毒性は、フローサイトメトリーによって測定される。場合によって、細胞毒性は、野生型または非修飾ＡＡＶまたはミニサークルと比較して、修飾ＡＡＶが使用される場合、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％、少なくともほぼこれらの比率、または最大でほぼこれらの比率だけ低減される。場合によって、細胞毒性は、ミニサークルベクターまたは非ウイルスベクターが使用される場合と比較して、ＡＡＶベクターが使用される場合、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％、少なくともほぼこれらの比率、または最大でほぼこれらの比率だけ低減される。
ａ．機能的移植
移植前、移植後、および／または移植時における細胞（例えば、操作細胞または操作された初代Ｔ細胞）は、機能的であり得る。例えば、移植された細胞は、移植後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００日間、または少なくともほぼこれらの期間にわたり機能的であり得る。移植された細胞は、移植後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２カ月間、または少なくともほぼこれらの期間にわたり機能的であり得る。移植された細胞は、移植後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、もしくは３０年間、または少なくともほぼこれらの期間にわたり機能的であり得る。場合によって、移植された細胞は、最長でレシピエントの生涯にわたり機能的であり得る。
さらに、移植された細胞は、その意図される正常な働きの１００％で機能し得る。移植された細胞はまた、その意図される正常な働きの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％でも機能し得る。
移植された細胞はまた、その意図される正常な働きの１００％を超えても機能し得る。例えば、移植された細胞は、その意図される正常な働きの１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００％、またはそれよりも多く機能し得る。
医薬組成物および医薬製剤
全体を通して記載される組成物は、医薬への製剤化であることが可能であり、それを必要とするヒトまたは哺乳動物であって、疾患、例えば、がんを伴うと診断されたヒトまたは哺乳動物を処置するのに使用することができる。これらの医薬は、１または複数のＴ細胞（例えば、操作Ｔ細胞）と共に、１または複数の化学療法剤または化学療法化合物と併せて、ヒトまたは哺乳動物へと共投与することができる。
本明細書で使用される「化学療法剤」または「化学療法化合物」およびこれらの文法的同等物は、がんの処置において有用な化合物であり得る。開示されるＴ細胞と組み合わせて使用され得るがん化学療法剤は、有糸分裂インヒビター（ビンカアルカロイド）を含むがこれらに限定されない。これらは、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびＮａｖｅｌｂｉｎｅ（商標）（ビノレルビン；５’−ノルアンヒドロブラスチン）を含む。さらに他の場合には、がん化学療法剤は、カンプトテシン化合物などのトポイソメラーゼＩインヒビターを含む。本明細書で使用される「カンプトテシン化合物」は、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（商標）（イリノテカンＨＣＬ）、Ｈｙｃａｍｔｉｎ（商標）（トポテカンＨＣＬ）、ならびにカンプトテシンおよびその類似体に由来する他の化合物を含む。本明細書で開示される方法および組成物において使用され得るがん化学療法剤の別の類別は、エトポシド、テニポシド、およびミトポドジドなどのポドフィロトキシン誘導体である。本開示はさらに、アルキル化剤として公知の、他のがん化学療法剤であって、腫瘍細胞内の遺伝子素材をアルキル化するがん化学療法剤も包含する。これらは、限定なしに、シスプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、およびダカルバジンを含む。本開示は、化学療法剤としての代謝拮抗剤を包含する。これらの種類の薬剤の例は、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン、およびプロカルバジンを含む。本明細書で開示される方法および組成物において使用され得るがん化学療法剤のさらなる類別は、抗生物質を含む。例は、限定なしに、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、およびダウノマイシンを含む。これらの化合物のために、多数のリポソーム製剤が市販されている。本開示はさらに、限定なしに、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、イホスファミド、およびミトキサントロンを含む、他のがん化学療法剤も包含する。
本明細書で開示されるＴ細胞は、細胞傷害剤／抗新生物剤および抗血管新生剤を含む、他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。細胞傷害剤／抗新生物剤は、がん細胞を攻撃し、死滅させる薬剤と規定することができる。一部の細胞傷害剤／抗新生物剤は、腫瘍細胞内の遺伝子素材をアルキル化するアルキル化剤、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、およびダカルバジン（ｄａｃａｂａｚｉｎｅ）であり得る。他の細胞傷害剤／抗新生物剤は、腫瘍細胞のための代謝拮抗剤、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン、およびプロカルバジンであり得る。他の細胞傷害剤／抗新生物剤は、抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、およびダウノマイシンであり得る。これらの化合物のために、多数のリポソーム製剤が市販されている。さらに他の細胞傷害剤／抗新生物剤は、有糸分裂インヒビター（ビンカアルカロイド）であり得る。これらは、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびエトポシドを含む。種々の細胞傷害剤／抗新生物剤は、タキソールおよびその誘導体、Ｌ−アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ−２６、イホスファミド、ミトキサントロン、およびビンデシンを含む。
抗血管新生剤もまた、使用することができる。開示される方法および組成物における使用に適する抗血管新生剤は、ヒト化抗体およびキメラ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマー、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の血管新生インヒビターは、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（αおよびβを含む）、インターロイキン１２、レチノイン酸、ならびにＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２（ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１およびｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）を含む。抗血管新生活性を伴うトポイソメラーゼＩＩインヒビターである、ラゾキサンなどのトポイソメラーゼインヒビターを含む低分子もまた使用することができる。
開示されるＴ細胞と組み合わせて使用され得る他の抗がん剤は、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アデルスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アバスチン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；プロピオン酸ドロモスタノロン；ズアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸エステルナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドリン酸塩；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；フルダラビンリン酸エステル；フルオロウラシル；フルロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモフォシン；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸エステル；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；マイトカルシン；マイトクロミン；マイトギリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンレウロシン；ビノレルビン酒石酸塩；硫酸ビンロシジン；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩を含むがこれらに限定されない。他の抗がん薬は、２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アデルスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生インヒビター；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アントラレリックス；ＡＤＭＰ（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）−１；前立腺癌用の抗アンドロゲン；抗エストロゲン；抗ネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシネート；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス調節剤；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベータクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦインヒビター；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキサミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ Ｍ３；ＣＡＲＮ ７００；軟骨由来インヒビター；カルゼレシン；カゼインキナーゼインヒビター（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；ｃｉｓ−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペントアントラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスフェート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デキスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン：ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；９−ジヒドロタキソール；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルフォシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；エトポシドリン酸塩；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルニシン塩酸塩；フォルフェニメックス；ホルメスタン；フォストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼインヒビター；ゲムシタビン；グルタチオンインヒビター；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様成長因子１受容体インヒビター；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；４−イポメアノール；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリンＮトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害性因子；白血球アルファインターフェロン；ロイポロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；メイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシンインヒビター；マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦインヒビター；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシンである線維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；ヒト絨毛性ゴナドトロピンに対するモノクローナル抗体；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子インヒビター；ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ １ベースの治療；マスタード系抗がん剤；ミカペロキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ置換ベンザミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン：ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；窒素酸化物による抗酸化剤；ニトルリン；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導剤；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ポリ硫酸ペントサンナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼインヒビター；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソームインヒビター；プロテインＡベースの免疫モジュレーター；プロテインキナーゼＣインヒビター；小型藻類のプロテインキナーゼＣインヒビター；プロテインチロシンホスファターゼインヒビター；プリンヌクレオシドホスホリラーゼインヒビター；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラ


モセトロン；ｒａｓファルネシルプロテイントランスフェラーゼインヒビター；ｒａｓインヒビター；ｒａｓ−ＧＡＰインヒビター；脱メチル化レテリプチン；レニウム（Ｒｅ１８６）エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビジノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣体；セムスチン；老齢由来インヒビター１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達インヒビター；シグナル伝達モジュレーター；単鎖抗原結合性タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプテートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合性タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞インヒビター；幹細胞分裂インヒビター；スチピアミド；ストロメリシンインヒビター；スルフィノシン；過活動血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼインヒビター；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チロコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；チマルファシン；チモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激性ホルモン；エチルエチオプルプリンすず；チラパザミン；チタノセンジクロリド；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳インヒビター；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼインヒビター；チルホスチン；ＵＢＣインヒビター；ウベニメクス；尿生殖洞由来成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；赤血球遺伝子治療のためのベクター系；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマーを含むがこれらに限定されない。場合によって、抗がん薬は、５−フルオロウラシル、タキソール、またはロイコボリンである。
場合によって、例えば、がんを処置する組成物、製剤、および方法において、投与される組成物または製剤の単位投与量は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｍｇであり得る。場合によって、投与される組成物または製剤の総量は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｇであり得る。
場合によって、本開示は、Ｔ細胞を含む医薬組成物であって、単独で、または薬学的に許容される担体または賦形剤と併せて、任意の経路により投与され得る医薬組成物を提供するが、このような投与は、単回投与および複数回投与の両方で実行することができる。より特定すると、医薬組成物は、多様な薬学的に許容される不活性の担体であって、錠剤、カプセル、薬用ドロップ、トローチ、ハンドキャンディー、粉剤、スプレー、水性懸濁液、注射用溶液、エリキシル剤、シロップなどの形態の担体と組み合わせることができる。このような担体は、固体の希釈剤または充填剤、滅菌水性媒体、および多様な非毒性有機溶媒などを含む。さらに、このような経口医薬製剤は、このような目的で一般に利用される多様な種類の薬剤により、適切に甘味および／または芳香添加することができる。
例えば、細胞は、患者へと、任意の数の妥当な処置モダリティーであって、抗ウイルス療法であるシドフォビルおよびインターロイキン２またはシタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしてもまた公知である）などの薬剤による処置を含むがこれらに限定されないモダリティーと共に（例えば、これらの前に、これらと同時に、またはこれらの後で）投与することができる。場合によって、操作細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリンなどの免疫抑制剤、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨなど、他の免疫除去剤、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法、細胞毒素（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｌｉｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および放射線照射と組み合わせて使用することができる。操作細胞組成物はまた、患者へと、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用するＴ細胞除去療法と共に（例えば、これらの前に、これらと同時に、またはこれらの後で）投与することもできる。場合によって、本開示の操作細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、ＲｉｔｕｘａｎなどのＢ細胞除去療法の後で投与することができる。例えば、対象は、高用量化学療法による標準的な処置に続き、末梢血幹細胞移植を経る場合がある。ある特定の場合には、移植後、対象は、本開示の操作細胞、例えば、拡大された操作細胞の注入を受けることができる。加えて、拡大された操作細胞は、手術の前に投与することもでき、手術の後で投与することもできる。本開示の特定の態様では、それを必要とする患者を、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して処置するために、本明細書で記載される方法のうちのいずれか１つにより得られる操作細胞を使用することができる。したがって、それを必要とする患者を、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して処置する方法であって、患者へと、有効量の操作細胞であり、不活化ＴＣＲアルファ遺伝子および／または不活化ＴＣＲベータ遺伝子を含む操作細胞を投与することにより患者を処置するステップを含む方法が想定される。
使用法
細胞は、本明細書で記載される通り、ヒトから抽出することができる。細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて遺伝子的に変化し、状況に応じて使用することができる。これらの細胞は、細胞ベースの治療のために使用することができる。これらの細胞を使用して、レシピエント（例えば、ヒト）における疾患を処置することができる。例えば、これらの細胞を使用して、がんを処置することができる。
本明細書では、レシピエントにおける疾患（例えば、がん）を処置する方法であって、レシピエントへの、操作細胞を含む、１または複数の細胞（臓器および／または組織を含む）の移植を含む方法について記載される。細胞内ゲノム移植により調製される細胞を使用して、がんを処置することができる。
本明細書では、レシピエントにおける疾患（例えば、がん）を処置する方法であって、レシピエントへの、操作細胞を含む、１または複数の細胞（臓器および／または組織を含む）の移植を含む方法について記載される。場合によって、細胞５×１０１０個を、患者へと投与する。他の場合には、細胞５×１０１１個を、患者へと投与する。
場合によって、細胞約５×１０１０個を、対象へと投与する。場合によって、細胞約５×１０１０個は、対象へと投与される細胞の量の中央値を表す。場合によって、細胞約５×１０１０個は、対象において、治療応答をもたらすのに必要である。場合によって、細胞少なくとも約１×１０７個、細胞少なくとも約２×１０７個、細胞少なくとも約３×１０７個、細胞少なくとも約４×１０７個、細胞少なくとも約５×１０７個、細胞少なくとも約６×１０７個、細胞少なくとも約６×１０７個、細胞少なくとも約８×１０７個、細胞少なくとも約９×１０７個、細胞少なくとも約１×１０８個、細胞少なくとも約２×１０８個、細胞少なくとも約３×１０８個、細胞少なくとも約４×１０８個、細胞少なくとも約５×１０８個、細胞少なくとも約６×１０８個、細胞少なくとも約６×１０８個、細胞少なくとも約８×１０８個、細胞少なくとも約９×１０８個、細胞少なくとも約１×１０９個、細胞少なくとも約２×１０９個、細胞少なくとも約３×１０９個、細胞少なくとも約４×１０９個、細胞少なくとも約５×１０９個、細胞少なくとも約６×１０９個、細胞少なくとも約６×１０９個、細胞少なくとも約８×１０９個、細胞少なくとも約９×１０９個、細胞少なくとも約１×１０１０個、細胞少なくとも約２×１０１０個、細胞少なくとも約３×１０１０個、細胞少なくとも約４×１０１０個、細胞少なくとも約５×１０１０個、細胞少なくとも約６×１０１０個、細胞少なくとも約６×１０１０個、細胞少なくとも約８×１０１０個、細胞少なくとも約９×１０１０個、細胞少なくとも約１×１０１１個、細胞少なくとも約２×１０１１個、細胞少なくとも約３×１０１１個、細胞少なくとも約４×１０１１個、細胞少なくとも約５×１０１１個、細胞少なくとも約６×１０１１個、細胞少なくとも約６×１０１１個、細胞少なくとも約８×１０１１個、細胞少なくとも約９×１０１１個、または細胞少なくとも約１×１０１２個である。例えば、細胞約５×１０１０個を、対象へと投与することができる。別の例では、細胞３×１０６個で始めて、細胞を、細胞約５×１０１０個へと拡大し、対象へと投与することができる。場合によって、細胞は、治療に十分な数へと拡大する。例えば、細胞５×１０７個は急速な拡大を経て、治療的使用に十分な数を作製することができる。場合によって、治療的使用に十分な数は、５×１０１０個であり得る。任意の数の細胞を、治療的使用のために注入することができる。例えば、患者に、端点を含む、１×１０６〜５×１０１２個の間の数の細胞を注入することができる。患者に、患者のために作製し得るだけの数の細胞を注入することができる。場合によって、患者へと注入される細胞は、全てが操作細胞であるわけではない。例えば、患者へと注入される細胞のうちの、少なくとも９０％は、操作細胞であり得る。他の場合には、患者へと注入される細胞のうちの、少なくとも４０％は、操作細胞であり得る。
場合によって、本開示の方法は、対象へと、対象において治療的応答をもたらすのに必要な量の操作細胞を計算および／または投与するステップを含む。場合によって、治療的応答をもたらすのに必要な操作細胞の量の計算は、細胞の生存率および／またはトランス遺伝子が細胞ゲノムへと組み込まれた効率を含む。場合によって、対象において治療的応答をもたらすために、対象へと投与される細胞は、生細胞であり得る。場合によって、対象において治療的応答をもたらすために、細胞のうちの、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％は、生細胞である。一部の場合、対象において治療的応答をもたらすために、対象へと投与される細胞は、細胞ゲノムへの、１または複数のトランス遺伝子の組込みに成功した細胞であり得る。場合によって、対象において治療的応答をもたらすために、細胞のうちの、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％は、細胞ゲノムへの、１または複数のトランス遺伝子の組込みに成功している。
本明細書で開示される方法を、がん、心血管疾患、肺疾患、肝臓疾患、皮膚疾患、または神経疾患を含むがこれらに限定されない疾患を処置または予防するために使用することができる。
移植は、任意の種類の移植による移植であり得る。部位は、肝臓被膜下腔、脾臓被膜下腔、腎臓被膜下腔、網、胃または腸粘膜下層、小腸の血管セグメント、静脈嚢、精巣、脳、脾臓、または角膜を含み得るがこれらに限定されない。例えば、移植は、被膜下移植であり得る。移植はまた、筋内移植でもあり得る。移植は、門脈内移植であり得る。
移植は、ヒトに由来する１または複数の細胞の移植であり得る。例えば、１または複数の細胞は、脳、心臓、肺、眼、胃、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛髪、爪、耳、腺、鼻、口腔、口唇、脾臓、歯茎、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸、直腸、肛門、甲状腺、胸腺、骨、軟骨、腱、靭帯、腎上体、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、幽門、副腎、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節、またはリンパ管であり得る臓器に由来し得る。１または複数の細胞はまた、脳、心臓、肝臓、皮膚、腸、肺、腎臓、眼、小腸、または膵臓にも由来し得る。１または複数の細胞は、膵臓、腎臓、眼、肝臓、小腸、肺、または心臓に由来し得る。１または複数の細胞は、膵臓に由来し得る。１または複数の細胞は、膵島細胞、例えば、膵β細胞であり得る。１または複数の細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ球、単球、またはマクロファージなど、任意の血液細胞であり得る。１または複数の細胞は、リンパ球、Ｂ細胞、またはＴ細胞など、任意の免疫細胞であり得る。
本明細書で開示される方法はまた、１または複数の細胞を移植するステップも含むことが可能であり、この場合、１または複数の細胞は、任意の細胞型であり得る。例えば、１または複数の細胞は、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、角化細胞、造血系細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、他の筋肉細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞、表皮細胞、内皮細胞、膵島細胞、血液細胞、血液前駆体細胞、骨細胞、骨前駆体細胞、神経幹細胞、始原幹細胞、肝細胞、角化細胞、臍帯静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、細小血管内皮細胞、線維芽細胞、肝星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅ）、ニューロン、クッパー細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞、および上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球、白血球、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、毛髪細胞、膀胱細胞、腎細胞、網膜細胞、杆体細胞、錐体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、メモリー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、筋肉細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、胚細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、精管周囲細胞、セルトリ細胞、黄体細胞、子宮頸部細胞、子宮内膜細胞、乳腺細胞、濾胞細胞、粘膜細胞、繊毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱上皮細胞、ドーパミン作動性（ｄｏｐａｍｉｅｒｇｉｃ）細胞、扁平上皮上皮細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、ドーパミン作動性細胞、胚性幹細胞、線維芽細胞、および胎児線維芽細胞であり得る。さらに、１または複数の細胞は、膵島細胞および／または膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞（例えば、ＰＰ細胞）、もしくは膵ε細胞を含むがこれらに限定されない細胞クラスターなどであり得る。１つの場合には、１または複数の細胞は、膵α細胞であり得る。別の場合には、１または複数の細胞は、膵β細胞であり得る。
ドナーは、胎児、新生児、若齢者、および成年者を含むがこれらに限定されない、任意の発生段階にあり得る。例えば、ドナーＴ細胞は、成体ヒトから単離することができる。ドナーヒトＴ細胞は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１歳未満であり得る。例えば、Ｔ細胞は、６歳未満のヒトから単離することができる。Ｔ細胞はまた、３歳未満のヒトから単離することもできる。ドナーは、１０歳より高齢であり得る。
ａ．移植
本明細書で開示される方法は、移植を含み得る。移植は、自家移植、同種移植、異種移植、または他の任意の移植であり得る。例えば、移植は、異種移植であり得る。移植はまた、同種移植でもあり得る。
本明細書で使用される「異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」およびその文法的同等物は、細胞、組織、または臓器の、レシピエントへの、移植、植込み、または注入を伴う任意の手順であって、レシピエントとドナーとが異なる種である手順を包含し得る。本明細書で記載される、細胞、臓器、および／または組織の移植は、ヒトへの異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）のために使用することができる。異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）は、血管化異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、部分血管化異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、非血管化異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、異種ドレッシング、異種バンデッジ、および異種構造を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「同種移植（ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」およびその文法的同等物（例えば、同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ））は、細胞、組織、または臓器の、レシピエントへの、移植、植込み、または注入を伴う任意の手順であって、レシピエントとドナーとが同じ種であるが異なる個体である手順を包含し得る。本明細書で記載される、細胞、臓器、および／または組織の移植は、ヒトへの同種移植（ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）のために使用することができる。同種移植（ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）は、血管化同種移植（ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、部分血管化同種移植（ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、非血管化同種移植（ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、同種ドレッシング、同種バンデッジ、および同種構造を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「自家移植（ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」およびその文法的同等物（例えば、自家移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ））は、細胞、組織、または臓器の、レシピエントへの、移植、植込み、または注入を伴う任意の手順であって、レシピエントとドナーとが同じ個体である手順を包含し得る。本明細書で記載される、細胞、臓器、および／または組織の移植は、ヒトへの自家移植（ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）のために使用することができる。自家移植（ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）は、血管化自家移植（ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、部分血管化自家移植（ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、非血管化自家移植（ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、自家ドレッシング、自家バンデッジ、および自家構造を含むがこれらに限定されない。
処置（例えば、本明細書で開示される処置のうちのいずれか）の後、移植片拒絶は、１または複数の野生型細胞を、レシピエントへと移植する場合と比較して、改善され得る。例えば、移植片拒絶は、超急性拒絶であり得る。移植片拒絶はまた、急性拒絶でもあり得る。他の種類の拒絶は、慢性拒絶を含み得る。移植片拒絶はまた、細胞を媒介する拒絶またはＴ細胞を媒介する拒絶でもあり得る。移植片拒絶はまた、ナチュラルキラー細胞を媒介する拒絶でもあり得る。
本明細書で使用される「〜を改善すること」およびその文法的同等物は、当業者により認識される、任意の改善を意味し得る。例えば、移植の改善とは、超急性拒絶の減少であって、所望されない影響または症状の減殺、減少、または減弱を包含し得る減少を意味し得る。
移植後、移植された細胞は、レシピエントにおいて機能的であり得る。機能性は、場合によって、移植が成功したのかどうかを決定し得る。例えば、移植された細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日間、もしくはそれよりも多い期間、または少なくともほぼこれらの期間にわたり機能的であり得る。これは、移植が成功したことを指し示し得る。これはまた、移植された細胞、組織、および／または臓器の拒絶が、見られないことも指し示す。
ある特定の場合には、移植された細胞は、少なくとも１日間にわたり機能的であり得る。移植された細胞はまた、少なくとも７日間にわたり機能的でもあり得る。移植された細胞は、少なくとも１４日間にわたり機能的であり得る。移植された細胞は、少なくとも２１日間にわたり機能的であり得る。移植された細胞は、少なくとも２８日間にわたり機能的であり得る。移植された細胞は、少なくとも６０日間にわたり機能的であり得る。
移植の成功の別の指標は、レシピエントが免疫抑制療法を要求しない日数であり得る。例えば、本明細書で提供される処置（例えば、移植）の後、レシピエントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日間、もしくはそれよりも多い期間、または少なくともほぼこれらの期間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。これは、移植が成功したことを指し示し得る。これはまた、移植された細胞、組織、および／または臓器の拒絶が、見られないことも指し示す。
場合によって、レシピエントは、少なくとも１日間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。レシピエントはまた、少なくとも７日間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。レシピエントは、少なくとも１４日間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。レシピエントは、少なくとも２１日間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。レシピエントは、少なくとも２８日間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。レシピエントは、少なくとも６０日間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。さらに、レシピエントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間、またはそれよりも多い期間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。
移植の成功の別の指標は、レシピエントが、低減された免疫抑制療法を要求する日数であり得る。例えば、本明細書で提供される処置の後、レシピエントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日間、またはそれよりも多い期間にわたり、低減された免疫抑制療法を要求する場合がある。これは、移植が成功したことを指し示し得る。これはまた、移植された細胞、組織、および／または臓器の拒絶が、見られないか、または見られても最小限であることも指し示し得る。
場合によって、レシピエントは、少なくとも１日間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。レシピエントはまた、少なくともまたは少なくとも約７日間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約１４日間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約２１日間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約２８日間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約６０日間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。さらに、レシピエントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間、もしくはそれよりも多い期間、または少なくともほぼこれらの期間にわたり、免疫抑制療法を要求しなくてもよい。
移植の成功の別の指標は、レシピエントが、低減された免疫抑制療法を要求する日数であり得る。例えば、本明細書で提供される処置の後、レシピエントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日間、もしくはそれよりも多い期間、または少なくともほぼこれらの期間にわたり、低減された免疫抑制療法を要求する場合がある。これは、移植が成功したことを指し示し得る。これはまた、移植された細胞、組織、および／または臓器の拒絶が、見られないか、または見られても最小限であることも指し示し得る。
本明細書で使用される「低減された」およびその文法的同等物は、１または複数の野生型細胞を、レシピエントへと移植する場合に要求される免疫抑制療法と比較して、低用量の免疫抑制療法を指す場合がある。
免疫抑制療法は、免疫系を抑制する任意の処置をさらに含み得る。免疫抑制療法は、レシピエントにおける移植片拒絶を軽減するか、最小化するか、または消失させる一助となりうる。例えば、免疫抑制療法は、免疫抑制薬を含み得る。移植前、移植時、および／または移植後に使用され得る免疫抑制薬は、ＭＭＦ（ミコフェノール酸モフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ））、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、抗ＣＤ１５４（ＣＤ４ＯＬ）、抗ＣＤ４０（２Ｃ１０、ＡＳＫＰ１２４０、ＣＣＦＺ５３３Ｘ２２０１）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、抗ＣＤ２０（リツキシマブ）、抗ＩＬ−６Ｒ抗体（トシリズマブ；Ａｃｔｅｍｒａ）、抗ＩＬ−６抗体（サリルマブ、オロキズマブ）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ａｂａｔａｃｅｐｔ／Ｏｒｅｎｃｉａ）、ベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ）、シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）、エベロリムス、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）、ダクリズマブ（Ｚｅ−ｎａｐａｘ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、シクロスポリン、デオキシスパガリン、可溶性補体受容体１、コブラ毒因子、コンプスタチン、抗Ｃ５抗体（エクリズマブ／Ｓｏｌｉｒｉｓ）、メチルプレドニゾロン、ＦＴＹ７２０、エベロリムス、レフルノミド、抗ＩＬ−２Ｒ−Ａｂ、ラパマイシン、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体、および抗ＣＤ１２２抗体を含むがこれらに限定されない。さらに、１つまたは１つを超える免疫抑制剤／薬物を、併せて使用することもでき、逐次的に使用することもできる。１つまたは１つを超える免疫抑制剤／薬物は、誘導療法のために使用することもでき、維持療法のために使用することもできる。同じ薬物または異なる薬物を、誘導期に使用することもでき、維持期に使用することもできる。場合によって、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）は、誘導療法のために使用することができ、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）およびシロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）は、維持療法のために使用することができる。ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）はまた、誘導療法のために使用することもでき、低用量タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ）および低用量シロリムス（Ｒａｐｉｍｕｎｅ）は、維持療法のために使用することができる。免疫抑制はまた、全身放射線照射、胸腺放射線照射、ならびに脾臓全摘出および／または脾臓部分摘出を含むがこれらに限定されない非薬物レジメンを使用して達成することもできる。これらの技法はまた、１または複数の免疫抑制薬と組み合わせて使用することもできる。
（実施例１）
種々の核酸送達プラットフォームのトランスフェクション効率の決定
ＬｅｕｋｏＰａｋからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
本実施例では、正常末梢血から回収された、Ｌｅｕｋｏｐａｋを使用した。血液細胞を、冷却した１倍濃度のＰＢＳで、３対１に希釈した。希釈した血液を、５０ｍｌの三角フラスコ内の１５ｍＬのＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に、滴下により（例えば、極めてゆっくりと）添加した。細胞を、ブレーキなし、４００×Ｇで、２５分間にわたりスピンした。バフィーコートを、ゆっくりと除去し、滅菌三角フラスコに入れた。細胞を、冷却した１倍濃度のＰＢＳで洗浄し、４００×Ｇで、１０分間にわたりスピンした。上清を除去し、細胞を、培地中に再懸濁させ、カウントし、凍結培地（４５ｍＬの熱不活化ＦＢＳおよび５ｍＬのＤＭＳＯ）中で、生存可能な状態で凍結させた。
ＣＤ３＋Ｔ細胞の単離
ＰＢＭＣを融解させ、培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０（フェノールレッドを伴わない）、２０％のＦＢＳ（熱不活化させた）、および１倍濃度のＧｌｕｔａ−ＭＡＸ）中、１〜２時間にわたり播種した。細胞を回収し、カウントし、細胞密度を、５×１０７個／ｍＬへと調整し、１４ｍＬの滅菌ポリスチレン丸底試験管へと移した。ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、５０ｕＬ／ｍＬのＩｓｏｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌを、細胞へと添加した。混合物を、ピペッティングにより混合し、室温で５分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓを、３０秒間にわたりボルテックスし、５０ｕＬ／ｍＬで、試料へと添加し、ピペッティングにより混合した。混合物を、４ｍＬ未満の試料について、５ｍＬまで満たすか、または４ｍＬを超える試料について、１０ｍＬまで満たした。滅菌ポリスチレン試験管を、「Ｂｉｇ Ｅａｓｙ」磁石へと添加し、室温で３分間にわたりインキュベートした。磁石および試験管を、滑らかな動きで倒立させ、濃縮された細胞懸濁液を、未使用の滅菌試験管へと注ぎ込んだ。
ＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化および刺激
単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞をカウントし、２４ウェルプレート内、細胞２×１０６個／ｍＬの密度で播種した。Ｄｙｎａｍａｇｎｅｔを使用して、０．２％ＢＳＡを伴う、１倍濃度のＰＢＳで洗浄した後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ ｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３：１（ビーズ：細胞）で、細胞へと添加した。ＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、３００ＩＵ／ｍＬの濃度で添加した。細胞を、４８時間にわたりインキュベートし、次いで、Ｄｙｎａｍａｇｎｅｔを使用して、ビーズを除去した。細胞を、電気穿孔またはヌクレオフェクションに先立って、さらに６〜１２時間にわたり培養した。
ＣＤ３＋ Ｔ細胞のＡｍａｘａトランスフェクション
Ａｍａｘａ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、非刺激Ｔ細胞または刺激Ｔ細胞にヌクレオフェクトした（図８２Ａおよび図８２Ｂ）。細胞をカウントし、室温のＡｍａｘａ緩衝液１００ｕＬ中に、細胞１〜８×１０６個の密度で再懸濁させた。１〜１５ｕｇのｍＲＮＡまたはプラスミドを、細胞混合物へと添加した。Ｕ−０１４プログラムを使用して、細胞をヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション後、細胞を、６ウェルプレート内の培養培地２ｍＬ中に播種した。
ＣＤ３＋ Ｔ細胞のＮｅｏｎトランスフェクション
Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（１０ｕＬ Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、非刺激Ｔ細胞または刺激Ｔ細胞に電気穿孔した。細胞をカウントし、１０ｕＬのＴ緩衝液中に、細胞２×１０５個の密度で再懸濁させた。１ｕｇのＧＦＰプラスミドまたはｍＲＮＡまたは１ｕｇのＣａｓ９および１ｕｇのｇＲＮＡプラスミドを、細胞混合物へと添加した。細胞に、１４００Ｖ、１０ミリ秒間ずつ、３つのパルスで電気穿孔した。トランスフェクション後、細胞を、４８ウェルプレート内の培養培地２００ｕＬ中に播種した。
リポフェクションによる、ＣＤ３＋ Ｔ細胞への、ＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡのトランスフェクション
非刺激Ｔ細胞を、２４ウェルプレート内、１ｍＬ当たり細胞５×１０５個の密度で播種した。ＲＮＡトランスフェクションのために、製造元のプロトコールに従い、ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を使用して、Ｔ細胞に、５００ｎｇのｍＲＮＡをトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡのトランスフェクションのために、製造元のプロトコールに従い、ＴｒａｎｓＩＴ−Ｘ２ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を使用して、Ｔ細胞に、５００ｎｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。細胞を、３７℃で４８時間にわたりインキュベートしてから、フローサイトメトリーで解析した。
ＣＤ３＋Ｔ細胞による、金ナノ粒子であるＳｍａｒｔＦｌａｒｅの取込み
非刺激Ｔ細胞または刺激Ｔ細胞を、培養培地２００ｕＬ中の４８ウェルプレート内ウェル１つ当たり細胞１〜２×１０５個の密度で播種した。Ｃｙ５またはＣｙ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）へと複合体化させた金ナノ粒子である、ＳｍａｒｔＦｌａｒｅを、３０秒間にわたりボルテックスしてから、細胞へと添加した。１ｕＬの金ナノ粒子であるＳｍａｒｔＦｌａｒｅｄを、各ウェルの細胞へと添加した。プレートを、１分間にわたりロッキングし、３７℃で２４時間にわたりインキュベートしてから、フローサイトメトリーにより、Ｃｙ５またはＣｙ３の発現について解析した。
フローサイトメトリー
電気穿孔およびヌクレオフェクトされたＴ細胞を、トランスフェクションの２４〜４８時間後、フローサイトメトリーにより、ＧＦＰの発現について解析した。０．５％ＦＢＳを伴う、１倍濃度の冷却ＰＢＳで洗浄することにより、細胞を調製し、ＡＰＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ３ε（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）およびＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｏｕｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）で染色した。細胞は、ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）およびＦｌｏｗＪｏ ｖ．９を使用して解析した。
結果
表２に示す通り、４つの例示的なトランスフェクションプラットフォームを使用して、細胞とＤＮＡ／ＲＮＡとの合計６つの組合せについて調べた。細胞とＤＮＡ／ＲＮＡとの６つの組合せは、ＥＧＦＰプラスミドＤＮＡの、非刺激ＰＢＭＣへの添加；ＥＧＦＰプラスミドＤＮＡの、非刺激Ｔ細胞への添加；ＥＧＦＰプラスミドＤＮＡの、刺激Ｔ細胞への添加；ＥＧＦＰ ｍＲＮＡの、非刺激ＰＢＭＣへの添加；ＥＧＦＰ ｍＲＮＡの、非刺激Ｔ細胞への添加；およびＥＧＦＰ ｍＲＮＡの、刺激Ｔ細胞への添加であった。４つの例示的なトランスフェクションプラットフォームは、ＡＭＡＸＡヌクレオフェクション、ＮＥＯＮ電気穿孔、脂質ベースのトランスフェクション、および金ナノ粒子の送達であった。種々の条件下における、トランスフェクション効率（トランスフェクト細胞の％）結果を、表１に列挙するが、ＡＭＡＸＡプラットフォームを使用して、ｍＲＮＡの、刺激Ｔ細胞への添加が、最高の効率をもたらした。
将来的には、類似の方法を使用して、エクソソームを媒介するトランスフェクションを含む、他のトランスフェクション条件についても調べる。加えて、また、類似の方法を使用して、ＤＮＡ Ｃａｓ９／ＤＮＡ ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ Ｃａｓ９／ＤＮＡ ｇＲＮＡ、タンパク質Ｃａｓ９／ＤＮＡ ｇＲＮＡ、ＤＮＡ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡのＰＣＲ産物、ＤＮＡ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡのＰＣＲ産物、ｍＲＮＡ Ｃａｓ９／ｇＲＮＡのＰＣＲ産物、タンパク質Ｃａｓ９／ｇＲＮＡのＰＣＲ産物、ＤＮＡ Ｃａｓ９／修飾ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ Ｃａｓ９／修飾ｇＲＮＡ、およびタンパク質Ｃａｓ９／修飾ｇＲＮＡを含む他の送達組合せについても調べる。本明細書で開示される方法では、送達効率の高い組合せを使用することができる。
（実施例２）
Ｔ細胞内の、ＧＦＰプラスミドのトランスフェクション効率の決定
ＧＦＰプラスミドを使用する、Ａｍａｘａヌクレオフェクションによる、初代Ｔ細胞のトランスフェクション効率である。図４は、この実験のために調製された４つのプラスミド：Ｃａｓ９ヌクレアーゼプラスミド、ＨＰＲＴ ｇＲＮＡプラスミド（ヒトＨＰＲＴ遺伝子をターゲティングするＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ）、Ａｍａｘａ ＥＧＦＰｍａｘプラスミド、およびＨＰＲＴ標的ベクターの構造を示した。ＨＰＲＴ標的ベクターは、０．５ｋｂのターゲティングアームを有した（図５）。試料の調製、フローサイトメトリー、および他の方法は、実験１と同様であった。プラスミドは、エンドトキシン非含有キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した。細胞数およびプラスミドの組合せを含む、異なる条件（表３に示す）について調べた。
結果
図７は、Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡ＋標的プラスミド共トランスフェクションが、バルク集団内で、良好なトランスフェクション効率をもたらすことを裏付けた。図８は、ＣＤ３＋ Ｔ細胞についての、ＥＧＦＰＦＡＣＳ解析の結果を示した。上記条件を使用して、異なるトランスフェクション効率を裏付けた。図４０Ａおよび図４０Ｂは、ＣＲＩＳＰＲによる、ドナートランス遺伝子によるトランスフェクションの６日後における、生存率およびトランスフェクション効率（ＧＦＰ＋％）を示す。
（実施例３）
各遺伝子部位において、二本鎖切断（ＤＳＢ）誘導が最高度であるｇＲＮＡを同定する。ガイドＲＮＡのデザインおよび構築：
ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｚｈａｎｇ Ｌａｂ、ＭＩＴ ２０１５）を使用して、所望の遺伝子領域へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をデザインした。オフターゲット位置により決定される、最高のランク付け値に基づき、ｇＲＮＡを作製するための複数のプライマー（表４に示す）を選び出した。ｇＲＮＡは、オリゴヌクレオチド対：５’−ＣＡＣＣＧ−ｇＲＮＡ配列−３’および５’−ＡＡＡＣ−逆相補体ｇＲＮＡ配列−Ｃ−３’により注文した（オリゴヌクレオチド対の配列を、表４に列挙する）。
標的配列クローニングプロトコール（Ｚｈａｎｇ Ｌａｂ、ＭＩＴ）を使用して、ｇＲＮＡを、併せてクローニングした。略述すると、以下のプロトコール：３７℃で３０分間、９５℃で５分間、次いで、５℃／分で、２５℃へと降下することにより、サーモサイクラー内で、Ｔ４ ＰＮＫ（ＮＥＢ）および１０倍濃度のＴ４ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）を使用して、オリゴヌクレオチド対を、併せてリン酸化およびアニールさせた。ｐＥＮＴＲ１−Ｕ６−Ｓｔｕｆｆｅｒ−ｇＲＮＡベクター（社内で作製した）を、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＢｂｓＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で消化し、ＦａｓｔＡＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および１０倍濃度のＦａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ Ｂｕｆｆｅｒを、ライゲーション反応のために使用した。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）を使用して、消化されたｐＥＮＴＲ１ベクターを、前のステップによる、リン酸化およびアニールさせたオリゴ二重鎖（希釈率を１：２００とする）と併せてライゲーションした。ライゲーション物を、室温で１時間にわたりインキュベートし、次いで、形質転換し、その後、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、Ｍｉｎｉｐｒｅｐした。プラスミドをシーケンシングして、適正な挿入を確認した。
操作ｇＲＮＡによりターゲティングされるゲノム配列を、表５および表６に示す。図４４Ａおよび図４４Ｂは、修飾ｇＲＮＡによる、ＣＩＳＨ遺伝子のターゲティングを示す。
ｇＲＮＡの検証
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４ウェルプレート内、ウェル１つ当たりの細胞１×１０５個の密度で播種した。１５０ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を、１．５ｕｇのｇＲＮＡプラスミド、１．５ｕｇのＣａｓ９プラスミドと組み合わせた。別の１５０ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を、５ｕｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と組み合わせた。溶液を、併せて組み合わせ、室温で１５分間にわたりインキュベートした。ＤＮＡ−脂質複合体を、滴下により、２４ウェルプレートのウェルへと添加した。細胞を、３７℃で３日間にわたりインキュベートし、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ゲノムＤＮＡを回収した。ｇＲＮＡの活性を、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ消化、ゲル電気泳動、および密度測定により定量化した（図６０および図６１）（Ｇｕｓｃｈｉｎ， Ｄ． Ｙ．ら、「Ａ Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６４９巻：２４７〜２５６頁（２０１０年））。
プラスミドターゲティングベクターの構築
標的組込み部位の配列は、データベースの総体から収集した。Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアを使用して、これらの配列に基づき、１ｋｂ、２ｋｂ、および４ｋｂのサイズの長さを保有するターゲティングベクターを作製するように、ＰＣＲプライマーをデザインした。次いで、製造元の指示書に従い、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｔａｑ ＨｉＦｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ターゲティングベクターアームをＰＣＲにより増幅した。次いで、ＴＯＰＯ−ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、結果として得られるＰＣＲ産物をサブクローニングし、配列を検証した。代表的なターゲティングベクター構築物を、図１６に示す。
結果
異なるｇＲＮＡ配列を一助とする、二本鎖切断（ＤＳＢ）の創出におけるＣａｓ９の効率を、表７に列挙した。表７中の百分率数は、試料中の遺伝子改変のパーセントを指し示した。
５つ全ての被験標的遺伝子部位において、ＤＳＢを創出した。これらのうちで、ＣＣＲ５、ＰＤ１、およびＣＴＬＡ４が、最高のＤＳＢ効率をもたらした。本明細書で記載される方法と同じ方法を使用して、ｈＲｏｓａ２６を含む、他の標的遺伝子部位についても調べる。
異なるｇＲＮＡ配列と共に二本鎖切断を創出する際の、Ｃａｓ９による比率を、図１５に示す。ドナー対照およびＣａｓ９のみによる対照と比較した、二本鎖切断のパーセントを列挙する。３つの代表的な標的遺伝子部位（すなわち、ＣＣＲ５、ＰＤ１、およびＣＴＬＡ４）について調べた。
（実施例４）
免疫チェックポイント遺伝子もまた破壊する、操作ＴＣＲを含むＴ細胞の作製
免疫チェックポイント遺伝子もまた破壊する操作ＴＣＲを発現するＴ細胞の集団を生成するために、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベース、ＺＥＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ−ＴＡＬ遺伝子編集法を使用する。ＰＤ−１および他の内因性チェックポイントの概要を、表９に示す。細胞（例えば、ＰＢＭＣ、Ｔ細胞、例えばＴＩＬ、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞など）を、がん患者（例えば、転移性黒色腫）から精製し、標準的な手順に従い培養および／または拡大する。細胞を、刺激する（例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズを使用して）、または刺激せずにおく。細胞に、ＴＣＲトランス遺伝子を有する標的ベクターをトランスフェクトする。例えば、ＭＢＶｂ２２のＴＣＲトランス遺伝子配列を得て、ＩＤＴによりｇＢＬＯＣＫとして合成する。フランキングａｔｔＢ配列を有するｇＢＬＯＣＫをデザインし、製造元の指示書に従い、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介してｐＥＮＴＲ１にクローニングし、配列を検証する。３つの異なる方法でＴＣＲトランス遺伝子を発現する３つの異なるトランス遺伝子構成（図６を参照されたい）を調べる：１）外因性プロモーター：ＴＣＲトランス遺伝子は、外因性プロモーターにより転写される；２）ＳＡインフレーム転写：ＴＣＲトランス遺伝子は、スプライシングを介して内因性プロモーターにより転写される；および３）融合体インフレーム翻訳：ＴＣＲトランス遺伝子は、インフレーム翻訳を介して内因性プロモーターにより転写される。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集法を使用する場合、Ｃａｓ９ヌクレアーゼプラスミドおよびｇＲＮＡプラスミド（図４に示すプラスミドと類似のプラスミド）にもまた、ＴＣＲトランス遺伝子を保有する標的ベクターを伴うＤＮＡプラスミドをトランスフェクトする。１０マイクログラムのｇＲＮＡおよび１５マイクログラムのＣａｓ９ ｍＲＮＡを用いることができる。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、組込み部位、例えば、ＰＤ−１などの内因性チェックポイント遺伝子へとガイドする。代替的に、ｇＲＮＡのＰＣＲ産物または修飾ＲＮＡ（Ｈｅｎｄｅｌ、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１５年により裏付けられている）も使用する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ遺伝子およびｇＲＮＡの両方を伴う、別のプラスミドもまた調べる。プラスミドは、併せて、または別個にトランスフェクトする。代替的に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを使用して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼプラスミドを置き換える。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集法を使用して、組み込まれるＴＣＲトランス遺伝子への相同組換え率を最適化するために、０．５ｋｂｐ、１ｋｂｐ、および２ｋｂｐを含む、異なる長さの標的ベクターアームについて調べる。例えば、アームの長さを０．５ｋｂｐとするターゲティングベクターを、図５に例示する。加えて、ＳＣＲ７薬およびＤＮＡリガーゼＩＶインヒビター（例えば、アデノウイルスタンパク質）など、いくつかのＣＲＩＳＰＲエンハンサーの効果についてもまた調べる。
プラスミドを使用して、トランス遺伝子を保有する相同組換えＨＲエンハンサーを送達することに加えて、ｍＲＮＡの使用についてもまた調べる。ｍＲＮＡ相同組換えＨＲエンハンサーの、ＤＮＡへの、ｉｎ ｓｉｔｕにおける、高効率の転換が可能な、最適の逆転写プラットフォームを同定する。造血幹細胞および初代Ｔ細胞を操作するための逆転写プラットフォームもまた、最適化および実現する。
トランスポゾンベースの遺伝子編集法（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）を使用する場合は、トランスポザーゼプラスミドにもまた、ＴＣＲトランス遺伝子を保有する標的ベクターを伴うＤＮＡプラスミドをトランスフェクトする。図２は、ＴＣＲトランス遺伝子の組込みおよび発現のためのトランスポゾンベースの構築物のうちの一部について例示する。
次いで、操作細胞を、ＰＤ１特異的ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡで処理し、集団を、Ｃｅｌ−Ｉアッセイにより解析して（図２８〜図３０）、ＰＤ１の破壊およびＴＣＲトランス遺伝子の挿入について検証する。次いで、検証の後、操作細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、増殖させ、拡大する。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）アッセイを使用して、培養細胞内の、オンターゲットのＣＲＩＳＰＲイベントを検出することができる（図３４および図３９）。二重シーケンシングによる欠失を、図３７および図３８に示す。
一部の操作細胞は、自家移植において使用する（例えば、操作細胞を作製するのにその細胞が使用されるがん患者へと投与し戻す）。一部の操作細胞は、同種移植において使用する（例えば、異なるがん患者へと投与し戻す）。患者の処置における、Ｔ細胞の効能および特異性を決定する。遺伝子操作された細胞は、内因性チェックポイント遺伝子の発現を駆動するように、抗原または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で再刺激することができる（図９０Ａおよび図９０Ｂ）。
結果
操作ＴＣＲによるＴ細胞の作製、および免疫チェックポイント遺伝子の破壊についての代表的な例を、図１７に示す。陽性のＰＣＲ結果は、ＣＣＲ５遺伝子における、組換えの成功を裏付ける。免疫チェックポイントノックアウトの効率を、図２３Ａ、図２３Ｂ、図２４Ａ、および図２４Ｂにおける代表的な実験に示す。フローサイトメトリーデータを、図２５における代表的な実験について示す。図２６Ａおよび図２６Ｂは、ＣＲＩＳＰＲによる処置後における、初代ヒトＴ細胞内の二重ノックアウトパーセントを示す。ＣＲＩＳＰＲおよび抗ＰＤ−１ガイドＲＮＡのトランスフェクション後１４日目における、フローサイトメトリー結果の代表例を、図４５、図５１、および図５２に示す。トランスフェクションの１４日後における細胞生存率および遺伝子編集効率を、ＣＲＩＳＰＲ系と、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１をターゲティングするｇＲＮＡとをトランスフェクトした細胞について、図５３、図５４、および図５５に示す。
（実施例５）
Ｔ細胞内の相同組換えの検出
遺伝子もまた破壊する操作ＴＣＲを発現する操作Ｔ細胞の集団を生成するために、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、トランスポゾンベース、ＺＥＮ、メガヌクレアーゼ、またはＭｅｇａ−ＴＡＬ遺伝子編集法を使用する。相同組換えエンハンサーの使用により、相同組換えが容易になるかどうかを決定するために、以下の例では代表的な実験を具体化する。ＮＥＯＮトランスフェクションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、刺激ＣＤ３＋Ｔ細胞に電気穿孔した。細胞をカウントし、１００ｕＬのＴ緩衝液中に１．０〜３．０×１０６細胞の密度で再懸濁させた。１５ｕｇ ｍＲＮＡ Ｃａｓ９（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｕｇ ｍＲＮＡ ｇＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１０ｕｇの相同組換え（ＨＲ）ターゲティングベクターを、ＨＲを調べるために使用した。１０ｕｇのＨＲターゲティングベクター単独、または１５ｕｇ Ｃａｓ９を１０ｕｇ ｍＲＮＡ ｇＲＮＡと一緒に、対照として使用した。電気穿孔の後、細胞を４つの条件：１）ＤＭＳＯのみ（媒体対照）、２）ＳＣＲ７（１ｕＭ）、３）Ｌ７５５５０７（５ｕＭ）、ならびに４）ＳＣＲ７およびＬ７５５５０７に分けて、ＨＲを促進することが示唆される２つの薬物を調べた。Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、３日ごとに細胞をカウントして、これらの多様な条件下における増殖をモニタリングした。ＨＲについてモニタリングするために、細胞をフローサイトメトリーにより解析し、ＰＣＲにより調べた。フローサイトメトリーのために、細胞を毎週１回、３週間にわたり解析した。Ｔ細胞は、ＡＰＣ抗マウスＴＣＲβ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。細胞を、ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏ ｖ．９を使用して解析した。ＰＣＲによりＨＲについて調べるために、ｇＤＮＡをＴ細胞から単離し、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用するＰＣＲにより増幅した。ＣＣＲ５遺伝子の両方およびＨＲターゲティングベクターの両方の末端に対するプライマーをデザインして、５’末端および３’末端の両方における適正な相同組換えを探索した。
（実施例６）
外因性プラスミドＤＮＡにより誘導される毒性の防止
外因性プラスミドＤＮＡは、Ｔ細胞内で毒性を誘導する。毒性が生じる機構は、図１９および図６９の生得的免疫センシング経路により説明される。外因性ポリ核酸に対する応答を修飾する化合物の付加により、細胞毒性を低減し得るのかどうかを決定するために、以下の代表的な実験を完遂した。ＮＥＯＮトランスフェクションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＣＤ３＋ Ｔ細胞に、量を増大させるプラスミドＤＮＡ（０．１ｕｇ〜４０ｕｇ）を電気穿孔した（図９１）。電気穿孔の後、細胞を４つの条件：１）ＤＭＳＯのみ（媒体対照）、２）ＢＸ７９５（１ｕＭ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、３）Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（５０ｕＭ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ならびに４）ＢＸ７９５およびＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫへと分けて、二本鎖ＤＮＡにより誘導されるアポトーシスを遮断することが可能な、２つの薬物について調べた。細胞は、４８時間後において、フローサイトメトリーにより解析した。Ｔ細胞は、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏ ｖ．９を使用して解析した。
結果
プラスミドＤＮＡをトランスフェクトしたＴ細胞が被る毒性の代表的な例を、図１８、図２７、図３２、および図３３に示す。細胞数による生存率を、図８６に示す。生得的免疫経路インヒビターを添加した後で、死を経るＴ細胞のパーセントは低減される。例示を目的として述べると、図２０は、２つの異なるインヒビターで処理されたＴ細胞培養物のアポトーシスの低減を表したものを示す。
（実施例７）
ゲノム領域に対する組換えアームを伴う、少なくとも１つの操作抗原受容体を含む、非メチル化ポリ核酸
ポリ核酸に対する修飾は、図２１に示される通りに実施することができる。非メチル化ポリ核酸が、外因性プラスミドＤＮＡにより誘導される毒性を低減し、ゲノム操作を改善し得るのかどうかを決定するために、以下の実施例を利用することができる。Ｍａｘｉｐｒｅｐを開始するために、相同組換えターゲティングベクターを含有する細菌コロニーを採取し、カナマイシン（１：１０００）を伴う、５ｍＬのＬＢ培養液中に接種し、３７℃で、４〜６時間にわたり増殖させた。次いで、出発培養物を、カナマイシンを伴う、２５０ｍＬのＬＢ培養液による大容量の培養物へと添加し、ＳｓｓＩ酵素の存在下、３７℃で１２〜１６時間にわたり増殖させた。１つの例外を除き、製造元のプロトコールに従い、Ｈｉ Ｓｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、Ｍａｘｉｐｒｅｐを調製した。Ｍａｘｉｐｒｅｐの溶解および中性化の後、２．５ｍＬの内毒素除去緩衝液を、Ｍａｘｉｐｒｅｐへと添加し、氷上で４５分間にわたりインキュベートした。Ｍａｘｉｐｒｅｐは、無菌性を維持するように、クリーンベンチ内で終えた。Ｍａｘｉｐｒｅｐの濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して決定した。
（実施例８）
ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑライブラリーの調製
固相可逆性固定化磁気ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ）を使用して、ゲノムＤＮＡを、トランスフェクトした、対照の（非トランスフェクト細胞および外因性ＴＣＲ（表１０）を保有するミニサークルＤＮＡをトランスフェクトしたＣＲＩＳＰＲ細胞）単離ヒトＴ細胞から単離し、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２００装置により、末端修復され、Ａテールである、平均長５００ｂｐへとせん断処理し、８ヌクレオチドのランダム分子指標が組み込まれた半機能的アダプターへとライゲーションした。標的濃縮のために、オリゴタグと相補的なプライマーによる、２ラウンドのネステッドアンカードＰＣＲを使用した。末端修復サーモサイクラープログラム：１２℃で１５分間、３７℃で１５分間；７２℃で１５分間；４℃で保持する。
ゲノムにマッピングし戻されたＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑリードの開始部位は、ＤＳＢの位置特定を数塩基対以内で可能とする。製造元の指示書に従い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ用のＫａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｋｉｔを使用してライブラリーを定量する。各試料についてｑＰＣＲランにより与えられる、１ｕＬ当たりの分子数の推定量の平均を使用して、次にライブラリーの全セットを１．２×１０１０分子に正規化するように進め、シーケンシングのために一緒にプールされるライブラリー数で除する。これは、各試料についての分子ごとのインプットを与え、およびまた、各試料についての容量ごとのインプットも与える。本発明者らがＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑにより評価した、切断ｇＲＮＡにより誘導される３つのＲＧＮのオンターゲットおよびオフターゲット部位のマッピングリードを示す。全ての場合において、標的部位配列をｘ軸の左側のプロトスペーサー配列および右側のＰＡＭ配列と共に示す。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ２によるシーケンシングのためのＩｌｌｕｍｉｎａの標準的なプロトコールに従い（３００サイクル（２×１５０ｂｐのペアエンド））、ライブラリーを変性させ、Ｍｉｓｅｑにロードする。図７６Ａおよび図７６Ｂは、代表的なＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ実験のデータを示す。
（実施例９）
アデノウイルス血清型５変異体タンパク質の作製
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）により、変異体ｃＤＮＡ（表８）をコドン最適化し、ｇＢｌｏｃｋ断片として合成した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍＲＮＡ合成のために、合成断片をｍＲＮＡ産生ベクターにサブクローニングした。
（実施例１０）
ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびＣＩＳＨをノックアウトするための、ＴＩＬのゲノム操作
適切な腫瘍を、適格性の病期であるＩＩＩｃ−ＩＶ期のがん患者から切除し、３〜５ｍｍ２の小さな断片へと切り刻み、増殖培地および高用量（ＨＤ）ＩＬ−２を伴う培養プレートまたは小型培養フラスコに入れた。まず、ＴＩＬを、この「前急速拡大プロトコール」（前ＲＥＰ）期中の３〜５週間にわたり、少なくとも細胞５０×１０６個へと拡大する。Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（１００ｕＬ Ｋｉｔまたは１０ｕｌ Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＴＩＬを電気穿孔する。ＴＩＬをペレット化させ、Ｔ緩衝液で１回洗浄する。ＴＩＬを、１０ｕｌのチップには、１０ｕＬのＴ緩衝液中の細胞２×１０５個の密度で再懸濁させ、１００ｕｌチップには、１００ｕｌＴ緩衝液中の細胞３×１０６個の密度で再懸濁させる。次いで、１５ｕｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ならびに１０〜５０ｕｇのＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびＣＩＳＨ ｇＲＮＡ−ＲＮＡ（１００ｍｃｌのチップ）を用いて、ＴＩＬを、１４００Ｖ、１０ミリ秒間ずつ、３つのパルスで電気穿孔する。トランスフェクション後、ＴＩＬを、抗生物質非含有培養培地中、細胞１０００個／ｕｌで播種し、５％のＣＯ２中、３０℃で２４時間にわたりインキュベートする。回収の２４時間後、ＴＩＬを、抗生物質含有培地へと移し、５％のＣＯ２中、３７℃で培養することができる。
次いで、ＰＢＭＣフィーダー細胞およびＩＬ−２の存在下で、抗ＣＤ３を使用して、ＴＩＬを刺激することにより、細胞を、２週間にわたり、急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）にかけた。拡大されたＴＩＬ（ここでは、細胞数十億個）を洗浄し、プールし、患者へと注入し、１または２サイクルのＨＤ ＩＬ−２療法が続いた。ＴＩＬを移入させる前に、ＴＩＬの存続を容易とするために、シクロホスファミド（Ｃｙ）およびフルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）（Ｆｌｕ）を使用する準備レジメンであって、宿主リンパ球を一過性に枯渇させ、注入されるＴＩＬに「場所を空け」、サイトカインシンクおよび調節性Ｔ細胞を除去する準備レジメンで、患者を処置することができる。対象は、対象自身の修飾ＴＩＬ細胞の注入を、３０分間にわたり受け、処置から回復するまで、院内にとどまって、有害事象についてモニタリングされる。図１０２Ａおよび図１０２Ｂは、２例の異なる対象のＴＩＬの細胞拡大を示す。図１０３Ａおよび図１０３Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ系および抗ＰＤ−１ガイドを電気穿孔され、フィーダーの添加を伴う（Ａ）か、またはフィーダーの添加を伴わずに（Ｂ）培養されたＴＩＬの細胞拡大を示す。
（実施例１１）
ｇＲＮＡの修飾
修飾ガイドＲＮＡのデザインおよび構築：
ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｚｈａｎｇ Ｌａｂ、ＭＩＴ ２０１５）を使用して、遺伝子の所望の領域へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をデザインした。オフターゲット位置により決定される、最高のランク付け値に基づき、複数のｇＲＮＡ（表１２に示す）を選び出した。ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、およびＣＩＳＨの遺伝子配列をターゲティングするｇＲＮＡを、２’−Ｏ−メチル３’ホスホロチオエート付加を含有するように修飾した（図４４および図５９）。
（実施例１２）
ｒＡＡＶターゲティングベクターの構築およびウイルス産生
図１３８に記載されているターゲティングベクターは、相同性アームのＤＮＡ合成およびｍＴＣＲ発現カセットのＰＣＲ増幅により作製した。合成断片およびｍＴＣＲカセットを、制限酵素消化およびＡＡＶ−２ ＩＴＲ配列の２コピー間のｐＡＡＶ−ＭＣＳ骨格プラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ）へのライゲーションによりクローニングして、ウイルスパッケージングを促進した。ライゲートしたプラスミドを、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）に形質転換した。ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ベクターごとに１ｍｇのプラスミドＤＮＡを細菌から精製し、感染性ｒＡＡＶの産生のためにＶｉｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＤ ＵＳＡへ送った。１ｍｌ当たり１×１０１３ウイルスゲノムコピーを上回る精製ウイルスの力価を決定し、凍結ストックを作製した。
（実施例１３）
ｒＡＡＶによるＴ細胞感染
ヒトＴ細胞を、１細胞当たり１×１０６ゲノムコピー／ウイルス粒子の感染多重度（ＭＯＩ）で精製ｒＡＡＶに感染させた。適切な容量のウイルスを、１０％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）、３００単位／ｍｌヒト組換えＩＬ−２、５ｎｇ／ｍｌヒト組換えＩＬ−７、および５ｎｇ／ｍｌヒト組換えＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有するＸ−ＶＩＶＯ１５培養培地（Ｌｏｎｚａ）に希釈した。希釈したウイルスを、ＣＲＩＳＰＲ試薬による電気穿孔の２時間後に、６ウェルディッシュ中のＴ細胞に添加した。細胞を、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで３０℃、約１８時間インキュベートした後、ウイルス含有培地を、ウイルスなしの上記のような新鮮な培地で置き換えた。Ｔ細胞を戻して３７℃でさらに１４日間培養した。この間、細胞を一定の時点で解析して、フローサイトメトリーによりｍＴＣＲ発現（図１５１、図１５２、図１５３）、およびデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によりｍＴＣＲ発現カセットのＴ細胞ＤＮＡへの組込み（図１４５Ａ、図１４５Ｂ、図１４７Ａ、図１４７Ｂ、図１４８Ａ、図１４８Ｂ、図１４９、図１５０Ａ、および図１５０Ｂ）を測定した。
（実施例１４）
ｍＴＣＲカセットのヒトＴ細胞へのｄｄＰＣＲ検出
ｍＴＣＲ発現カセットのＴ細胞標的遺伝子座への挿入は、ｍＴＣＲカセット内に位置するフォワードプライマー、およびゲノムＤＮＡ領域内の右の相同性アームの外側に位置するリバースプライマーを使用してｄｄＰＣＲにより検出し、定量化した。全てのＰＣＲ反応は、ｄｄＰＣＲ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ、カタログ番号＃１８６−３０２４）を用いて製造元により指定された条件を使用して行った。ＰＣＲ反応は、２０μｌ合計容量の液滴内で、以下のＰＣＲサイクル条件：９６℃、１０分間の１サイクル；９６℃、３０秒間、５５℃〜６１℃、３０秒間、７２℃、２４０秒間の４０サイクル；９８℃、１０分間の１サイクルを使用して行った。デジタルＰＣＲデータは、Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して解析した。
（実施例１５）
単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ
培養液中の単一Ｔリンパ球におけるＴＣＲノックイン発現を、単一細胞リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ＣＲＩＳＰＲ（ＣＩＳＨ ＫＯ）／ｒＡＡＶ操作細胞からの単一細胞内容物を回収した。略述すると、予め滅菌したガラス電極に、Ａｍｂｉｏｎ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ−ｔｏ−ＣＴ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）からの溶解緩衝液を充填し、次いで、培養液中のリンパ球の全細胞パッチを得るために使用した。細胞内内容物（約４〜５μｌ）を、陰圧を加えてパッチピペットの先端に吸引し、次いで、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリーチューブに移した。各チューブの容量を、Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＤＮａｓｅ Ｉ／Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して１０μｌに増やし、次いで、内容物を室温で５分間インキュベートした。サーマルサイクラーで逆転写を行なって（２５℃、１０分間、４２℃、６０分間、および８５℃、５分間）ｃＤＮＡ合成後、ＴＣＲ遺伝子発現プライマーを、キットからの指示書に基づき前増幅反応ミックスと混合した（９５℃、１０分間、ならびに９５℃、１５秒間、６０℃、４分間、および６０℃、４分間の１４サイクル）。前増幅段階からの産物を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＴ反応に使用した（５０℃、２分間、９５℃、１０分間、ならびに９５℃、５秒間、および６０℃、１分間の４０サイクル）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲからの産物を、１μｌ／ｍｌ臭化エチジウムを含有する３％アガロースゲルでの電気泳動により分離した。
結果
単一細胞ＲＴ−ＰＣＲデータは、ＣＲＩＳＰＲおよびｒＡＡＶ修飾後、Ｔリンパ球が、電気穿孔および遺伝子導入後７日目に（図１５６、図１５７Ａ、図１５７Ｂ、図１５８、および図１５９Ｂ）、２５％で（図１５９Ａ）外因性ＴＣＲを発現したことを示した。
（実施例１６）
ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑライブラリー調製
ゲノムＤＮＡを、トランスフェクト対照（非トランスフェクトおよび外因性ＴＣＲを有するｒＡＡＶとのＣＲＩＳＰＲトランスフェクト細胞から単離した。８ｐｍ ｄｓ ＴＣＲドナーまたは１６ｐｍｏｌ ｄｓ ＴＣＲドナーを利用する遺伝子導入を比較した。固相可逆性固定化磁気ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅ）を使用して単離したヒトＴ細胞を、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２００装置で５００ｂｐの平均長にせん断し、末端修復し、Ａテール付加し、８−ｎｔランダム分子指標を組み込む半機能的アダプターにライゲートした。オリゴタグに相補的なプライマーによる２ラウンドのネステッドアンカーＰＣＲを、標的濃縮のために使用した。末端修復サーモサイクラープログラム：１２℃、１５分間、３７℃、１５分間；７２℃、１５分間；４℃で保持する。
ゲノムにマッピングし戻されたＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑリードの開始部位は、ＤＳＢの位置特定を数塩基対内で可能にする。製造元の指示書に従い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ用のＫａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｋｉｔを使用してライブラリーを定量する。各試料についてｑＰＣＲランにより与えられる、１ｕＬ当たりの分子数の推定量の平均を使用して、次にライブラリーの全セットを１．２×１０１０分子に正規化するように進め、シーケンシングのために一緒にプールされるライブラリー数で除する。これは、各試料についての分子ごとのインプットを与え、およびまた、各試料についての容量ごとのインプットも与えた。本発明者らがＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑにより評価した、切断ｇＲＮＡにより誘導される３つのＲＧＮのオンターゲットおよびオフターゲット部位のマッピングリードを示す。全ての場合において、標的部位配列をｘ軸の左側のプロトスペーサー配列および右側のＰＡＭ配列と共に示す。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ２によるシーケンシングのためのＩｌｌｕｍｉｎａの標準的なプロトコールに従い（３００サイクル（２×１５０ｂｐのペアエンド））、ライブラリーを変性させ、Ｍｉｓｅｑにロードする。図１５４は、代表的なＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ実験のデータを示す。

Claims (80)

  1. 遺伝子改変細胞の集団を産生する方法であって、
    ヒト対象に由来する細胞の集団を提供するステップ；
    クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を使用してサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子中に切断を導入することによって細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで改変するステップ；および
    Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞に導入して、前記外因性トランス遺伝子を、前記切断において、前記少なくとも１個の細胞のゲノム中に組み込むステップ
    を含み；前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むための前記ＡＡＶベクターの使用が、前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を同等の細胞に組み込むためのミニサークルベクターの使用と比較して細胞毒性を低減する、方法。
  2. 遺伝子改変細胞の集団を産生する方法であって、
    ヒト対象に由来する細胞の集団を提供するステップ；
    クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を使用してサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子中に切断を導入することによって細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで改変するステップ；および
    Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞に導入して、前記外因性トランス遺伝子を、前記切断において、前記少なくとも１個の細胞のゲノム中に組み込むステップ
    を含み；細胞の前記集団が、前記ＡＡＶベクターを導入した約４日後に、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって測定された場合、少なくとも約９０％の生細胞を含む、方法。
  3. 遺伝子改変細胞の集団を産生する方法であって、
    ヒト対象に由来する細胞の集団を提供するステップ；
    ガイドポリ核酸を含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を細胞の前記集団に導入するステップであって、前記ガイドポリ核酸が細胞の前記集団内の複数の細胞中のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子に特異的に結合し、前記ＣＲＩＳＰＲ系が前記ＣＩＳＨ遺伝子中に切断を導入することによって、前記複数の細胞中でＣＩＳＨタンパク質機能を抑制する、ステップ；および
    アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記複数の細胞に導入することによって、遺伝子改変細胞の集団を産生するステップであって、前記ＡＡＶベクターが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を、前記切断において、前記複数の細胞のゲノム中に組み込む、ステップ
    を含み；遺伝子改変細胞の前記集団中の細胞の少なくとも約１０％が、前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を発現する、方法。
  4. ヒト対象におけるがんを処置する方法であって、
    治療有効量のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団を投与するステップを含み、前記ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の少なくとも１個が、前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞中でのサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）タンパク質機能の抑制をもたらす、ＣＩＳＨ遺伝子中のゲノム変化を含み、前記ゲノム変化がクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系によって導入され；前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性トランス遺伝子をさらに含み、前記外因性トランス遺伝子が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって、前記ＣＩＳＨ遺伝子中において、前記少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中に導入され；前記投与が、前記ヒト対象におけるがんを処置するか、またはがんの少なくとも１つの症状を改善する、方法。
  5. ヒト対象における消化器がんを処置する方法であって、
    治療有効量のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団を投与するステップを含み、前記ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の少なくとも１個が、前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞中でのサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）タンパク質機能の抑制をもたらす、ＣＩＳＨ遺伝子中のゲノム変化を含み、前記ゲノム変化がクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系によって導入され；前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性トランス遺伝子をさらに含み、前記外因性トランス遺伝子が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって、前記ＣＩＳＨ遺伝子中において、前記少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中に導入され；前記投与が、前記ヒト対象におけるがんを処置するか、またはがんの少なくとも１つの症状を改善する、方法。
  6. ヒト対象におけるがんを処置する方法であって、
    治療有効量のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団を投与するステップを含み、前記ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の少なくとも１個が、前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞中でのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質機能の抑制をもたらす、ＴＣＲ遺伝子中のゲノム変化および前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞中でのサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）タンパク質機能の抑制をもたらす、ＣＩＳＨ遺伝子中のゲノム変化を含み、前記ゲノム変化がクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系によって導入され；前記少なくとも１個のｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性トランス遺伝子をさらに含み、前記外因性トランス遺伝子が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって、前記ＣＩＳＨ遺伝子中において、前記少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中に導入され；前記投与が、前記ヒト対象におけるがんを処置するか、またはがんの少なくとも１つの症状を改善する、方法。
  7. 少なくとも１個の遺伝子改変細胞中のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）タンパク質機能を抑制するＣＩＳＨ遺伝子中の外因性ゲノム変化と、前記ＣＩＳＨ遺伝子中における、前記少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中への挿入のためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとを含む、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団。
  8. ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団の少なくとも１個の遺伝子改変細胞中のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）タンパク質機能を抑制するＣＩＳＨ遺伝子中の外因性ゲノム変化と、前記ＣＩＳＨ遺伝子中における、前記ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団の少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中への挿入のためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとを含む、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団。
  9. 少なくとも１個の遺伝子改変細胞中のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）タンパク質機能を抑制するＣＩＳＨ遺伝子中の外因性ゲノム変化およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質機能を抑制するＴＣＲ遺伝子中の外因性ゲノム変化と、前記ＣＩＳＨ遺伝子中における、前記少なくとも１個の遺伝子改変細胞のゲノム中への挿入のためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとを含む、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された細胞の集団。
  10. 少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を細胞に導入するための系であって、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、少なくとも１個の細胞のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子中に二本鎖切断を導入し、前記ＡＡＶベクターが前記切断において、前記細胞のゲノム中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を導入し；前記系が、ミニサークルおよび前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む同様の系と比較して、前記ゲノム中への前記トランス遺伝子のより高い導入効率を有し、より低い細胞毒性をもたらし、前記ミニサークルが前記ゲノム中に前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を導入する、系。
  11. 少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を細胞に導入するための系であって、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、少なくとも１個の細胞のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子中に二本鎖切断を導入し、前記ＡＡＶベクターが前記切断において、前記細胞のゲノム中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を導入し；前記系が、ミニサークルおよび前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む同様の系と比較して、前記ゲノム中への前記トランス遺伝子のより高い導入効率を有し、より低い細胞毒性をもたらし、前記ミニサークルが前記ゲノム中に前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を導入する、系。
  12. がんを処置する方法であって、
    クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を使用して、ヒト対象に由来する細胞の集団中のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子をｅｘ ｖｉｖｏで改変するステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲ系が、前記ＣＩＳＨ遺伝子中に二本鎖切断を導入して、操作細胞の集団を生成する、ステップ；
    アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含むアデノ随伴ウイルス遺伝子送達系を使用して、前記操作細胞の集団中にがん応答性受容体を導入して、前記二本鎖切断に少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むことによって、がん応答性細胞の集団を生成するステップ；および
    治療有効量の前記がん応答性細胞の集団を前記対象に投与するステップ
    を含む、方法。
  13. 消化器がんを処置する方法であって、
    クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を使用して、ヒト対象に由来する細胞の集団中のサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子をｅｘ ｖｉｖｏで改変するステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲ系が、前記ＣＩＳＨ遺伝子中に二本鎖切断を導入して、操作細胞の集団を生成する、ステップ；
    アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含むアデノ随伴ウイルス遺伝子送達系を使用して前記操作細胞の集団中にがん応答性受容体を導入して、前記二本鎖切断に少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むことによって、がん応答性細胞の集団を生成するステップ；および
    治療有効量の前記がん応答性細胞の集団を前記対象に投与するステップ
    を含む、方法。
  14. 遺伝子改変細胞を作製する方法であって、
    宿主細胞の集団を提供するステップ；
    組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターと、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系とを導入するステップ
    を含み；前記ヌクレアーゼがサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子中に切断を導入し、前記ＡＡＶベクターが前記切断に外因性核酸を導入し；
    前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むための前記ＡＡＶベクターの使用が、同等の細胞中で前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むためのミニサークルベクターの使用と比較して細胞毒性を低減し；
    前記外因性核酸が、前記ＣＲＩＳＰＲ系と対応する野生型ＡＡＶベクターとが導入された同等の宿主細胞の集団と比較して、より高い効率で導入される、方法。
  15. 遺伝子改変された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を産生する方法であって、
    ヒト対象に由来するＴＩＬの集団を提供するステップ；
    前記ＴＩＬの集団に、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系をｅｘ ｖｉｖｏで電気穿孔するステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲ系が、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を含むヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含み；前記ｇＲＮＡがサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子と相補的な配列を含み、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記ＴＩＬの集団中の少なくとも１個のＴＩＬの前記ＣＩＳＨ遺伝子中に二本鎖切断を導入し；前記ヌクレアーゼがＣａｓ９であるか、または前記ポリヌクレオチドがＣａｓ９をコードする、ステップ；および
    前記ＣＲＩＳＰＲ系の電気穿孔の約１時間〜約４日後に前記ＴＩＬの集団中の前記少なくとも１個のＴＩＬにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを導入して、前記二本鎖切断中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むステップ
    を含む、方法。
  16. 遺伝子改変された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を産生する方法であって、
    ヒト対象に由来するＴＩＬの集団を提供するステップ；
    前記ＴＩＬの集団に、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系をｅｘ ｖｉｖｏで電気穿孔するステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲ系が、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を含むヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含み；前記ｇＲＮＡがサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子と相補的な配列を含み、前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記ＴＩＬの集団中の少なくとも１個のＴＩＬの前記ＣＩＳＨ遺伝子中に二本鎖切断を導入し；前記ヌクレアーゼがＣａｓ９であるか、または前記ポリヌクレオチドがＣａｓ９をコードする、ステップ；および
    前記ＣＲＩＳＰＲ系の電気穿孔の約１時間〜約３日後に前記ＴＩＬの集団中の前記少なくとも１個のＴＩＬにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを導入して、前記二本鎖切断中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むステップ
    を含む、方法。
  17. 遺伝子改変された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を産生する方法であって、
    ヒト対象に由来するＴＩＬの集団を提供するステップ；
    前記ＴＩＬの集団に、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系をｅｘ ｖｉｖｏで電気穿孔するステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲ系が、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、少なくとも１個のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）とを含み；前記少なくとも１個のｇＲＮＡが、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子と相補的な配列を含むｇＲＮＡと、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子と相補的な配列を含むｇＲＮＡとを含み；前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記ＴＩＬの集団中の少なくとも１個のＴＩＬの前記ＣＩＳＨ遺伝子中に第１の二本鎖切断を導入し、前記ＴＣＲ遺伝子中に第２の二本鎖切断を導入し；前記ヌクレアーゼがＣａｓ９であるか、または前記ポリヌクレオチドがＣａｓ９をコードする、ステップ；および
    前記ＣＲＩＳＰＲ系の電気穿孔の約１時間〜約４日後に前記ＴＩＬの集団中の前記少なくとも１個のＴＩＬにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを導入して、前記第１の二本鎖切断または前記第２の二本鎖切断の少なくとも１つ中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むステップ
    を含む、方法。
  18. 遺伝子改変細胞の集団を産生する方法であって、
    ヒト対象に由来する細胞の集団を提供するステップ；
    ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリペプチドと、ガイドポリ核酸とを使用してサイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子中に切断を導入することによって、細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞をｅｘ ｖｉｖｏで改変するステップ；および
    Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、細胞の前記集団中の少なくとも１個の細胞に導入して、前記切断において、前記少なくとも１個の細胞のゲノム中に前記外因性トランス遺伝子を組み込むステップ
    を含み；前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むための前記ＡＡＶベクターの使用が、同等の細胞中で前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むためのミニサークルベクターの使用と比較して細胞毒性を低減する、方法。
  19. 遺伝子改変細胞の集団を産生する方法であって、
    ヒト対象に由来する細胞の集団を提供するステップ；
    少なくとも１個のガイドポリ核酸を含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を細胞の前記集団に導入するステップであって、前記少なくとも１個のガイドポリ核酸が、細胞の前記集団内の複数の細胞中でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子に特異的に結合するガイドポリ核酸と、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子に特異的に結合するガイドポリ核酸とを含み、前記ＣＲＩＳＰＲ系が前記ＴＣＲ遺伝子と前記ＣＩＳＨ遺伝子中に切断を導入することによって、前記複数の細胞中でのＴＣＲタンパク質機能とＣＩＳＨタンパク質機能とを抑制する、ステップ；および
    アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記複数の細胞に導入するステップであって、前記ＡＡＶベクターが、前記切断において、前記複数の細胞のゲノム中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を組み込むことによって、遺伝子改変細胞の集団を産生する、ステップ
    を含み；遺伝子改変細胞の前記集団中の細胞の少なくとも約１０％が前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を発現する、方法。
  20. ＣＲＩＳＰＲ系を使用して内因性ＴＣＲ遺伝子中に切断を導入するステップをさらに含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
  21. 請求項１から３および１８から１９のいずれか一項に記載の方法に従って調製された遺伝子改変細胞の集団。
  22. 請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法に従って調製された遺伝子改変された腫瘍浸潤リンパ球の集団。
  23. 前記細胞または細胞の前記集団もしくは遺伝子改変細胞の前記集団が、腫瘍浸潤リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団である、請求項１から６、１２から１４、および１８から１９のいずれか一項に記載の方法、または請求項７から８のいずれか一項に記載の集団、または請求項１０から１１のいずれか一項に記載の系。
  24. 前記ＴＩＬがＴ細胞である、請求項１５から１７および２３のいずれか一項に記載の方法、または請求項２３に記載の系、または請求項２３に記載の集団。
  25. 前記ＴＩＬがＢ細胞である、請求項１５から１７および２３のいずれか一項に記載の方法、または請求項２３に記載の系、または請求項２３に記載の集団。
  26. 前記ＴＩＬがナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１５から１７および２３のいずれか一項に記載の方法、または請求項２３に記載の系、または請求項２３に記載の集団。
  27. 前記細胞または細胞の前記集団もしくは遺伝子改変細胞の前記集団が、それぞれ、初代細胞または初代細胞の集団である、請求項１から６、１２から１４、および１８から１９のいずれか一項に記載の方法、または請求項７から８のいずれか一項に記載の集団、または請求項１０から１１のいずれか一項に記載の系。
  28. 前記初代細胞または初代細胞の前記集団が、初代リンパ球または初代リンパ球の集団である、請求項２７に記載の方法または集団または系。
  29. 前記初代細胞または初代細胞の前記集団が、ＴＩＬまたはＴＩＬの集団である、請求項２７に記載の方法または集団または系。
  30. 前記改変が、ガイドポリ核酸を使用して改変することを含む、請求項１から２および１２から１３のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記ＣＲＩＳＰＲ系が、ガイドポリ核酸を含む、請求項１から２、４から６、および１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記方法または前記集団または前記系が、それぞれ、ガイドポリ核酸をさらに含む、請求項１から２、および１２から１４のいずれか一項に記載の方法、または請求項７から９のいずれか一項に記載の集団、または請求項１０から１１のいずれか一項に記載の系。
  33. 前記ガイドポリ核酸が、前記ＣＩＳＨ遺伝子に対する相補配列を含む、請求項３、１８、１９、および３０から３２のいずれか一項に記載の方法、または請求項３２に記載の集団、または請求項３２に記載の系。
  34. 前記ガイドポリ核酸が、前記ＴＣＲ遺伝子に対する相補配列を含む、請求項３、１８、１９、および３０から３２のいずれか一項に記載の方法、または請求項３２に記載の集団、または請求項３２に記載の系。
  35. 前記ガイドポリ核酸が、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）である、請求項３、１８から１９、および３０から３４のいずれか一項に記載の方法、または請求項３２から３４のいずれか一項に記載の集団、または請求項３２から３４のいずれか一項に記載の系。
  36. 前記ガイドポリ核酸が、ガイドデオキシリボ核酸（ｇＤＮＡ）である、請求項３、１８から１９、および３０から３４のいずれか一項に記載の方法、または請求項３２から３４のいずれか一項に記載の集団、または請求項３２から３４のいずれか一項に記載の系。
  37. 前記方法が、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１から６、１２から１３、および１９のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記改変が、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む、請求項１から２および１２から１３のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記ＣＩＳＨ遺伝子および／または前記ＴＣＲ遺伝子中に切断を導入する、請求項１４から１８および３７から３８のいずれか一項に記載の方法または請求項１０から１１のいずれか一項に記載の系。
  40. 前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記ＣＩＳＨ遺伝子および／または前記ＴＣＲ遺伝子の不活化または発現の低減を含む、請求項１４から１８および３７から３８のいずれか一項に記載の方法または請求項１０から１１のいずれか一項に記載の系。
  41. 前記ＣＲＩＳＰＲ系が、ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３、１２から１３、および１９のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ系に由来する、請求項１４から１８および３７から４０のいずれか一項に記載の方法または請求項１０から１１のいずれか一項に記載の系。
  43. 前記ＣＲＩＳＰＲ系が、ガイドポリ核酸をさらに含む、請求項４２に記載の方法または系。
  44. 前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、Ｃａｓ９およびＣａｓ９ＨｉＦｉからなる群から選択される、請求項１４から１８および３７から４３のいずれか一項に記載の方法または請求項１０から１１、３９から４０、および４２から４３のいずれか一項に記載の系。
  45. 前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドである、請求項４４に記載の方法または系。
  46. 前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、触媒的に不活性である、請求項４４に記載の方法または系。
  47. 前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）またはｄＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドである、請求項４６に記載の方法または系。
  48. 前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子が前記ゲノム中にランダムに挿入される、請求項１から６、および１８から１９のいずれか一項に記載の方法、または請求項７から９のいずれか一項に記載の集団、または請求項１０から１１のいずれか一項に記載の系。
  49. 前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子が、前記ゲノムのＣＩＳＨ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子中に挿入される、請求項４９に記載の方法または集団または系。
  50. 前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子が、前記ゲノムの前記ＣＩＳＨ遺伝子中に挿入される、請求項１から４、６、１２、１４、１８、１９、および４９のいずれか一項に記載の方法、または請求項７、９、および４９のいずれか一項に記載の集団、または請求項１０、１１、および４９のいずれか一項に記載の系。
  51. 前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子が、前記ゲノムの前記ＣＩＳＨ遺伝子中に挿入されない、請求項１から４、６、１２、１４、１８、１９、および４９のいずれか一項に記載の方法、または請求項７、９、および４９のいずれか一項に記載の集団、または請求項１０、１１、および４９のいずれか一項に記載の系。
  52. 前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子が、前記ゲノムの前記ＣＩＳＨ遺伝子中の切断に挿入される、請求項１から４、６、１２、１４、１８、１９、４９、および５０のいずれか一項に記載の方法、または請求項７、９、５１から５４、および５０のいずれか一項に記載の集団、または請求項１０、１２、４９、および５０のいずれか一項に記載の系。
  53. 前記外因性トランス遺伝子が、ＴＣＲ遺伝子中に挿入される、請求項１から４、６、１２、１４、１８、１９、および４９のいずれか一項に記載の方法、または請求項７、９、および４９のいずれか一項に記載の集団、または請求項１０、１１、および４９のいずれか一項に記載の系。
  54. 前記外因性トランス遺伝子が、前記ＴＣＲ遺伝子中に挿入される、請求項５、６、１３、１９、および４９のいずれか一項に記載の方法、または請求項８、９、および４９のいずれか一項に記載の集団、または請求項１１および４９のいずれか一項に記載の系。
  55. 前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子が、ＣＩＳＨ遺伝子へと、ランダムに、かつ／または部位特異的に挿入される、請求項１から６および１８から１９のいずれか一項に記載の方法、または請求項７から９のいずれか一項に記載の集団、または請求項１０から１１のいずれか一項に記載の系。
  56. 前記外因性トランス遺伝子が、前記ＣＩＳＨ遺伝子および／または前記ＴＣＲ遺伝子中の切断と相補的な操作部位で挟まれる、請求項４９に記載の方法または集団または系。
  57. 細胞の前記集団または遺伝子改変細胞の前記集団または遺伝子改変されたＴＩＬの前記集団中の細胞の少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子を含む、請求項１から６、１２から１３、１５から１７、および１８から１９のいずれか一項に記載の方法、または請求項７から８のいずれか一項に記載の集団。
  58. 遺伝子改変細胞の前記集団または腫瘍浸潤リンパ球の前記集団が、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって測定された場合、前記ＡＡＶベクターの導入後、約４日で少なくとも約９２％の細胞生存率を含む、請求項１から６、１２から１３、および１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
  59. 遺伝子改変細胞の前記集団が、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって測定された場合、前記組換えＡＡＶベクターの導入後、約４日で少なくとも約９２％の細胞生存率を含む、請求項１４に記載の方法。
  60. 遺伝子改変細胞の前記集団または腫瘍浸潤リンパ球の前記集団が、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって測定された場合、前記ＡＡＶベクターの導入後、少なくとも約９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の細胞生存率を含む、請求項１から６、１２から１３、および１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 細胞生存率が、前記ＡＡＶベクターの導入後、約４時間、６時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間、１３２時間、１４４時間、１５６時間、１６８時間、１８０時間、１９２時間、２０４時間、２１６時間、２２８時間、２４０時間で、または２４０時間よりも後に測定される、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記細胞生存率が、前記ＡＡＶベクターの導入後、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、４５日、５０日、６０日、７０日、９０日で、または９０日よりも後に測定される、請求項６０に記載の方法。
  63. 前記ＡＡＶベクターが対応する非修飾または野生型ＡＡＶベクターと比較して細胞毒性を低下させる、請求項１から６、１２から１３、および１５から１９のいずれか一項に記載の方法または請求項７から９のいずれか一項に記載の集団または請求項１０から１１のいずれか一項に記載の系。
  64. 治療有効量の請求項７から９および２１から２３のいずれか一項に記載の集団を投与するステップを含む、がんを処置する方法。
  65. 前記治療有効量の前記集団が、それぞれ、対応する非修飾もしくは野生型ＡＡＶベクターまたはミニサークルからもたらされる同じ治療効果を提供するのに必要とされる細胞数と比較して、より少数の細胞数を含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記方法または系が電気穿孔またはヌクレオフェクションを含む、請求項１から６、１２から１４、および１８から１９のいずれか一項に記載の方法、または請求項１０から１１のいずれか一項に記載の系。
  67. 前記ＡＡＶベクターが、細胞１つ当たり約１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、または最大で約９×１０９個のゲノムコピー／ウイルス粒子の感染多重度（ＭＯＩ）で導入される、請求項１から６、１２から１３、および１５から１９のいずれか一項に記載の方法、または請求項１０から１１のいずれか一項に記載の系。
  68. 前記野生型ＡＡＶベクターが、細胞１つ当たり約１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、または最大で約９×１０９個のゲノムコピー／ウイルス粒子の感染多重度（ＭＯＩ）で導入される、請求項１４に記載の方法。
  69. 前記ＡＡＶベクターが、前記ＣＲＩＳＰＲまたは前記ヌクレアーゼもしくは前記ヌクレアーゼをコードするポリ核酸の導入後、１〜３時間、３〜６時間、６〜９時間、９〜１２時間、１２〜１５時間、１５〜１８時間、１８〜２１時間、２１〜２３時間、２３〜２６時間、２６〜２９時間、２９〜３１時間、３１〜３３時間、３３〜３５時間、３５〜３７時間、３７〜３９時間、３９〜４１時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１４日、１６日、２０日で、または２０日よりも後に前記細胞に導入される、請求項３、１２から１８、１９、３７から３８、および４１から４４のいずれか一項に記載の方法、または請求項１０から１１および４２から４４のいずれか一項に記載の系。
  70. 前記ＡＡＶベクターが、前記ＣＲＩＳＰＲ系または前記ヌクレアーゼもしくは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの導入の１５〜１８時間後に前記細胞に導入される、請求項６９に記載の方法または系。
  71. 前記ＡＡＶベクターが、前記ＣＲＩＳＰＲ系または前記ヌクレアーゼもしくは前記ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの導入の１６時間後に前記細胞に導入される、請求項７０に記載の方法または系。
  72. 前記ＡＡＶベクターによる前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子の組込みが、ミニサークルベクターまたは対応する非修飾もしくは野生型ＡＡＶベクターによる同等の細胞集団中の細胞への前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子の組込みと比較して細胞毒性を低減する、請求項１から６、１２から１３、１５から１９のいずれか一項に記載の方法または請求項１０から１１のいずれか一項に記載の系。
  73. 前記毒性がフローサイトメトリーによって測定される、請求項７２に記載の方法または系。
  74. 前記毒性が、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低減する、請求項７２に記載の方法または系。
  75. 前記毒性が、前記ＡＡＶベクターまたは前記対応する非修飾もしくは野生型ＡＡＶベクターまたは前記ミニサークルの導入後、約４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、１２０時間、１３２時間、１４４時間、１５６時間、１６８時間、１８０時間、１９２時間、２０４時間、２１６時間、２２８時間、２４０時間で、または２４０時間よりも後に測定される、請求項７２に記載の方法または系。
  76. 前記毒性が、前記ＡＡＶベクターまたは前記対応する非修飾もしくは野生型ＡＡＶベクターまたは前記ミニサークルの導入後、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、４５日、５０日、６０日、７０日、９０日で、または９０日よりも後に測定される、請求項７２に記載の方法または系。
  77. 遺伝子改変細胞の前記集団の少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または最大で１００％が、前記ゲノムのＣＩＳＨ遺伝子中の切断に前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子の組込みを含む、請求項７から９および５２のいずれか一項に記載の集団。
  78. 遺伝子改変細胞の前記集団の少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または最大で１００％が、前記ゲノムのＴＣＲ遺伝子中の切断に前記少なくとも１個の外因性トランス遺伝子の組込みを含む、請求項７から９および５２のいずれか一項に記載の集団。
  79. 少なくとも１個の細胞へのＡＡＶベクターの前記導入が、前記切断を含む細胞へのＡＡＶベクターの導入を含む、請求項１から２および１８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記ＴＩＬが自家である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
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