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KR20200108289A - 항체 프로탁 컨쥬게이트 - Google Patents

항체 프로탁 컨쥬게이트 Download PDF

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KR20200108289A
KR20200108289A KR1020207021320A KR20207021320A KR20200108289A KR 20200108289 A KR20200108289 A KR 20200108289A KR 1020207021320 A KR1020207021320 A KR 1020207021320A KR 20207021320 A KR20207021320 A KR 20207021320A KR 20200108289 A KR20200108289 A KR 20200108289A
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KR
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protein
cancer
antibody
immunoconjugate
target
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KR1020207021320A
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English (en)
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시-시엔 츄앙
츄-빈 리아오
웨이-팅 순
첸-시엔 리앙
운-유에이 린
츈-리앙 라이
허-시엥 린
Original Assignee
재단법인 생물기술개발중심
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Publication date
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Abstract

식 Ab-[L1-(A-L2-B)m]n을 가지는 면역컨쥬게이트로서, 식에서: (a) Ab는 항체 또는 그것의 결합 단편이고; (b) L1 및 L2는 각각 독립적으로 링커이며, L1 및 L2는 동일하거나 상이할 수 있고, L1은 L2에 결합되며; (c) A는 표적-단백질 리간드/결합제이고; (d) B는 유비퀴틴 결찰효소 리간드/결합제이며, 그리고 (e) n 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 8의 정수이다. 표적 단백질은 키나제, G 단백질-결합된 수용체, 전사 인자, 포스파타제, 및 RAS 수퍼패밀리 구성원을 포함한다.

Description

항체 프로탁 컨쥬게이트
본 발명은 ADC 및 프로탁(PROTAC) 기술을 토대로 한 신규한 치료제에 관한 것이다.
항체는 표적 항원에 대한 그것의 높은 특이성 및 친화성으로 인해 의학적 용도뿐만 아니라 기본적인 연구에서 오랫동안 통합적인 도구였다. 항체의 중요한 특징은, 보체-의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)에 의한 제거를 위해 표적 항원을 표시하는, 표적 항원에 대한 그것의 높은 특이성 및 그것의 결합 능력이다. 항체는 또한 표적 항원에 결합하여 그것의 기능을 억제함으로써 치료적 장점을 줄 수 있다. 그러나, 종양-특이적 항원에 대한 많은 미변형 항체는 자주 치료 활성이 결핍되어 있다. 비록 일부 항체가 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)의 형태로 강력한 세포독성 약물을 전달하기 위한 유도 미사일로서 성공적으로 대신 공급될 수 있긴 하지만, 많은 ADC가 제한된 치료 잠재력을 가지며 추가의 개선이 필요할 수 있다.
단백질 가수분해 표적화 키메라 ( pro teolysis targeting c himera,　프로탁(PROTAC))는 원치 않은 단백질을 선택적 세포내 단백질가수분해를 유도함으로써 제거할 수 있는 이중헤드 분자이다. 프로탁(PROTAC)은 2개의 단백질 결합 분자로 구성되는데, 하나는 E3 유비퀴틴 결찰효소에 결합하기 위한 것이고 다른 하나는 표적 단백질에 결합하기 위한 것이다. 두 단백질에 결합함으로써, 프로탁은 표적 단백질을 E3 결찰효소로 가져가서 프로테아좀에 의한 후속 분해를 위해 표적 단백질의 태깅 (즉, 유비퀴틴화)을 유발시킨다.
유비퀴틴화는 3가지 주요 단계: 각각 유비퀴틴-활성화 효소 (E1), 유비퀴틴-컨쥬게이션 효소 (E2), 및 유비퀴틴 결찰효소 (E3)에 의해 수행되는 활성화, 컨쥬게이션, 및 결찰을 포함한다. 이런 순차적인 캐스케이드의 결과는 유비퀴틴을 표적 단백질에 공유 결합시키는 것이다. 유비퀴틴화된 단백질은 결국 프로테아좀에 의해 분해된다.
프로탁 기술은 2001년에 처음 기술되었다 (Sakamoto　et al., "Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation,"　Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.　98　(15): 8554-9). 그 이후로, 이 기술은 여러 약물 설계: pVHL, MDM2, 베타-TrCP1, 세레브론(cereblon), 및 c-IAP1에서 사용되어 왔다. 이들 선행 기술 프로탁 약물은 매우 유용하지만, 여전히 더 나은 프로탁 약물에 대한 필요성이 있다.
개요
발명의 구체예들은 분지형 항체-프로탁 컨쥬게이트 (APC)에 관한 것이다. 발명의 분지형 항체-프로탁 컨쥬게이트는 ADC 접근법과 프로탁 접근법 두 가지의 장점을 조합하며, APC의 분지형 형태는 APC의 선형 형태와 비교하여 개발 또는 가공에서 여러 장점을 가진다. 발명의 분지형 항체-프로탁 컨쥬게이트에서, 종래의 ADC의 페이로드 (약물)는 프로탁으로 대체되고 프로탁 분자의 링커 부분에 연결된다. 이 새로운 치료제는 고도로 선택적이로, 독성이 더 적으며, 사용하기에 더 안전하고, 더 긴 생체내 반감기를 가진다.
발명의 한 측면은 면역컨쥬게이트에 관한 것이다. 발명의 한 구체예에 따르는 면역컨쥬게이트는 식 (I): Ab-[L2-(A-L1-B)m]n을 가지며, 식에서: (a) Ab는 항체 또는 그것의 결합 단편이고; (b) L1 및 L2는 각각 독립적으로 링커이며, L1 및 L2는 동일하거나 상이할 수 있고; (c) A는 표적-단백질 리간드/결합제이며; (d) B는 유비퀴틴 결찰효소 리간드/결합제이고, 그리고 (e) n 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 8의 정수이다.
발명의 일부 구체예에 따르면, 표적 단백질은 키나제, G 단백질-결합된 수용체, 전사 인자, 포스파타제, 및 RAS 수퍼패밀리 구성원일 수 있다.
발명의 다른 측면은 다음의 설명 및 APC 및 포함된 도면으로 명백해질 것이다.
도 1은 선형 (비분지형) APC의 구조 및 분지형 APC의 구조를 개략적으로 도시한다.
도 2는 SDS-PAGE 전기영동 및 웨스턴 블롯으로 분석된 바, BT-474 유방암 세포 배양물에서, 다양한 농도의 ARV-825 및 발명의 화합물 5에 의한 BRD4 분해의 촉진을 도시하며, 발명의 화합물 7은 그렇지 않은 것을 도시한다. ARV-825는 공지된 소분자 BRD4-표적화 프로탁이다. 발명의 화합물 5는 ARV-825의 분지형 형태이다. 결과는 화합물 5가 ARV-825에 비해 BRD4에 대한 비슷한 분해 활성을 가지는 것을 보여준다. 대조적으로, 추가적인 리소좀에 의해 절단 가능한 다이펩타이드 (발린-시트룰린)를 가진 화합물 5인 발명의 화합물 7은 1 mM까지의 화합물 7 치료에서도 BRD4 단백질을 분해할 수 없다. 이런 결과는 발린-시트룰린 다이펩타이드로 인해 상대적으로 더 낮은 투과도를 가진 화합물 7이 세포 내부에 효율적으로 내부화될 수 없다는 사실로부터 파생될 가능성이 있다. BRD4 및 AKT는 BRD4 및 AKT의 밴드의 위치를 표시하며, 액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 3은 실시예 1이 HER2-음성 MDA-MB-231 유방암 세포 대신 HER2-양성 BT-474 유방암 세포에서 특이적 BRD4 단백질 분해 활성을 나타내는 것을 도시한다. 실시예 1은 분지형 트라스투주맙-화합물 7 면역컨쥬게이트 (즉, 항체로서 트라스투주맙 및 프로탁으로서 화합물 7을 가진 분지형 APC)이다. 더욱이, 이 분지형 APC는 AKT 단백질 또는 액틴 단백질의 분해를 유발하지 않을 것이다.
도 4는 ARV-825에서 A 결합체를 통해 연결됨으로 인한, 선형 APC에 대한 합성 개략도를 도시한다.
발명의 구체예들은 분지형 APC에 관한 것이다. 분지형 APC는 항체를 프로탁의 링커 부분을 통해 프로탁에 결합시킨다. 발명의 분지형 APC는, 종래의 ADC에서 페이로드 (약물)가 프로탁의 링커를 통해 항체와 컨쥬게이트되는 프로탁으로 대체되어 있는, 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)의 유사체로서 간주될 수 있다. 즉, 발명의 분지형 APC에서, 항체 (또는 그것의 결합 단편)는 표적 단백질 결합부(A) 또는 유비퀴틴 결찰효소 결합제 (B)를 통해 결합하는 대신, 링커 (L2)를 통해, 프로탁의 링커 부분 (L1)을 통해 프로탁과 공유 결합된다. 항체 상의 공유 결합은 단백질 부분 (예컨대, 불변 영역 또는 가변 영역) 상에 있거나 탄수화물 (당-부분)에 있을 수 있다.
도 1은 선형 APCDHK 분지형 APC 사이의 차이를 개략적으로 도시한다. 선형 APC를 뛰어넘는 분지형 APC의 장점은 다음을 포함할 수 있다:
1. 프로탁 모이어티에서 표적 리간드 (A) 및 E3 결찰효소 리간드 (B)의 원래 구조를, A와 B의 결합 친화도가 변경되지 않도록 유지하는 것, 이것은 항체의 부착이 프로탁 모이어티의 어느 한 단부 (A 또는 B)에서 일어나는 대신 링커 (L1)에 대한 것이기 때문이다.
2. 링커 상의 부착 기에 대한 구조 변형이 리간드 (A 또는 B) 상의 변형보다 훨씬 쉽고, 두 링커 모이어티 (L1 및 L2) 사이의 부착이 더 유연하다.
3. 링커 상의 변형이 대부분의 APC에 적합하다. 그러므로, 링커를 설계하기 위하여 상이한 항체 모이어티가 동일한 프로탁과 쉽게 결합되거나 동일한 항체가 상이한 프로탁과 쉽게 결합될 수 있도록 일반적인 결합 작용기를 사용하는 것이 가능하다.
발명의 구체예에 따르는 분지형 APC는 다음 식 (I)로 표시될 수 있다:
Figure pct00001
,
식에서:
(a) Ab는 항체 또는 그것의 결합 단편이고;
(b) L1 및 L2는 독립적으로 링커이며, L1은 프로탁 모이어티 내에 있는 링커이고 (즉, 프로탁 = A-L1-B), L2는 프로탁의 링커 부분 (L1)을 통하여 프로탁과 항체를 연결시키는 링커이며;
(c) A는 표적-단백질 리간드/결합제 (즉, 표적 단백질에 대한 결합제로, 키나제, G 단백질-결합된 수용체, 전사 인자, 포스파타제, RAS 수퍼패밀리 구성원, 등일 수 있음)이고;
(d) B는 유비퀴틴 결찰효소 리간드/결합제이며, 유비퀴틴 결찰효소는 E2 또는 E3 유비퀴틴 결찰효소일 수 있고, 그리고
(e) n 및 m은 독립적으로 1 내지 8의 정수이다.
발명의 분지형 APC는 ADC와 프로탁의 장점을 조합시키며 새로운 부류의 치료제를 대표한다. 용어 "분지형"은 상기 식 (I)에서 나타난 구조를 나타내는데, 식에서 항체-L2 링커는 프로탁의 L1 링커에 결합된다. 항체-L2 링커가 프로탁의 어느 한 단부 (A 또는 B)에 부착되어 있는 다른 유형의 APC는 "비분지형" 또는 "선형"으로서 언급될 것이다. 이들 새로운 분지형 APC는 고도로 선택적이며, 긴 생체내 반감기를 가지고, 큰 치료 창을 가지며, 넓은 적용성을 가지고, 사용하기에 더 안전하다. 더불어, 이들 분지형 APC는 비분지형 (선형) APC보다 합성이 더 용이하다.
항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)는 약물 (또는 페이로드)이 항체에 또는 그것의 항원-결합 단편에 부착되어 있는 부류의 치료제이다. ADC에서 항체는 선택된 표적 (전형적으로, 세포 상의 표적)에 결합함으로써, 약물을 표적에 근접하게 가져가서 고도로 선택적인 치료 효과를 초래한다. ADC의 예는 암세포상에서 발현된 단백질을 표적화하는 항체일 수 있고, 페이로드는 세포독성제 (예컨대, 탁솔)일 수 있다.
ADC는 항체의 존재로 인해 큰 분자로, 분자량은 전형적으로 약 150 KDa 또는 그 이상이다. 그러므로, ADC는 신장 여과에 의해 제거되지 않을 것이다. 더불어, 항체 불변 영역은 신장에서 수용체와 상호작용하는 부위를 포함하여 항체를 수송하고 순환으로 다시 순환시킬 수 있다. 그러므로, 항체는 긴 생체내 반감기, 전형적으로 수주의 반감기를 가진다. 나아가, 항체는 세포에 의해 쉽게 내부화될 수 있어서, 페이로드의 세포로의 전달을 매우 효율적으로 만든다. ADC가 특이적이고 오래 작용하기 때문에, 그것은 유망한 치료제이다. 그러나, ADC의 작용은 촉매처럼 기능하지 않는 페이로드에 의존적이다. 그러므로, 표적 단백질 또는 세포를 살해 또는 억제하기 위해 충분한 양의 페이로드가 필요하다. 과다한 페이로드는 독성을 유발할 수 있다.
프로탁은 2개의 단백질-결합 모이어티로 구성되는데, 하나는 E3 유비퀴틴 결찰효소에 결합하기 위한 것이고 다른 하나는 표적 단백질에 결합하기 위한 것이다. 프로탁은 그것의 표적 단백질에 결합할 수 있고 그것을 E3 유비퀴틴 결찰효소로 가져갈 수 있다. 3차 복합체가 형성될 때, E3 유비퀴틴 결찰효소는 유비퀴틴을 표적 단백질의 표면 리신으로 전달하여 프로테아좀 기계에 의해 분해될 운명인 유비퀴틴화된 표적 단백질로 이어진다. 유비퀴틴화 후에, 프로탁이 방출되고 계속해서 유비퀴틴화 및 분해를 위한 표적 단백질을 찾는다. 그로써, 프로탁은 촉매처럼 작용하고, 소량의 프로탁으로 실질적인 결과를 달성할 수 있다.
상기 식 (I)에서, A 구성요소는 분해도도록 의도된 표적 단백질에 결합하는 기이다. A 구성요소는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 임의의 모이어티를 포함할 수 있다. 다음은 소분자 표적 단백질-결합 모이어티의 비제한적 예이다: 다른 것들 중에서도 Hsp90 억제자, 키나제 억제자, MDM2 억제자, 인간 BET 브로모도메인-함유 단백질을 표적화하는 화합물, HDAC 억제자, 인간 리신 메틸트랜스퍼라제 억제자, 혈관신생 억제자, 면역억제 화합물, 및 아릴 탄화수소 수용체 (AHR)를 표적화하는 화합물. 하기 기술되는 조성물은 이들 유형의 소분자 표적 단백질-결합 모이어티의 일부 구성원을 예시한 것이다. 이러한 소분자 표적 단백질-결합 모이어티는 또한 이들 조성물의 제약학적으로 허용되는 염, 거울상 이성질체, 용매화합물 및 다형태, 뿐만 아니라 관심 있는 단백질을 표적화할 수 있는 다른 소분자를 포함한다.
일반적으로, 표적 단백질은, 예를 들어, 구조 단백질, 수용체, 효소, 세포 표면 단백질, 세포 기능에 적절한 단백질, 등을 포함할 수 있다. 따라서, ADC-프로탁의 A 구성요소는 단백질 표적, 예컨대 다음에 결합하는 임의의 펩타이드 또는 소분자일 수 있다: FoxOl, HDAC, DP-1, E2F, ABL, AMPK, BRK, BRSK I, BRSK2, BTK, CAMKK1, CAMKK 알파, CAMKK 베타, Rb, Suv39HI, SCF, p19INK4D, GSK-3, pi8 INK4, myc, 사이클린 E, CDK2, CDK9, CDG4/6, 사이클린 D, pl6 INK4A, cdc25A, BMI1, SCF, Akt, CHKl/2, C 1 델타, CK1 감마, C 2, CLK2, CSK, DDR2, DYRK1A/2/3, EF2K, EPH-A2/A4/B 1/B2/B3/B4, EIF2A 3, Smad2, Smad3, Smad4, Smad7, p53, p21 Cipl, PAX, Fyn, CAS, C3G, SOS, Tal, Raptor, RACK-1, CRK, Rapl, Rac, KRas, NRas, HRas, GRB2, FAK, PI3K, spred, Spry, mTOR, MPK, LKBl, PAK 1/2/4/5/6, PDGFRA, PYK2, Src, SRPK1, PLC, PKC, PKA, PKB 알파/베타, PKC 알파/감마/제타, PKD, PLKl, PRAK, PRK2, WAVE-2, TSC2, DAPKI, BAD, IMP, C-TAK1, TAKl, TAOl, TBK1, TESK1, TGFBR1, TIE2, TLK1, TrkA, TSSK1, TTBK1/2, TTK, Tpl2/cotl, MEK1, MEK2, PLDL Erk1, Erk2, Erk5, Erk8, p90RSK, PEA-15, SRF, p27 KIP1, TIF la, HMGN1, ER81, MKP-3, c-Fos, FGF-R1, GCK, GSK3 베타, HER4, HIPK1/2/3/, IGF-1R, cdc25, UBF, LAMTOR2, Statl, StaO, CREB, JAK, Src, PTEN, NF-kappa B, HECTH9, Bax, HSP70, HSP90, Apaf-1, Cyto c, BCL-2, Bcl-xL, Smac, XIAP, 카스파제(Caspase)-9, 카스파제-3, 카스파제-6, 카스파제-7, CDC37, TAB, IKK, TRADD, TRAF2, R1P1, FLIP, TAKl, JNKl/2/3, Lck, A-Raf, B-Raf, C-Raf, MOS, MLKl/3, MN 1/2, MSKl, MST2/3/4, MPSK1, MEKKI, ME K4, MEL, ASK1, MINK1, MKK 1 /2/3/4/6/7, NE 2a/6/7, NUAK1, OSR1, SAP, STK33, Syk, Lyn, PDK1, PHK, PIM 1/2/3, 아탁신(Ataxin)-1, mTORCl, MDM2, p21 Wafl, 사이클린 Dl, Lamln A, Tpl2, Myc, 카테닌(catenin), Wnt, IKK-베타, IKK- 감마, IKK-알파, IKK-엡실론, ELK, p65RelA, IRAKI, IRA 2, IRAK4, IRR, FADD, TRAF6, TRAF3, MKK3, MKK6, ROCK2, RSK1/2, SGK 1, SmMLCK, SIK2/3, ULK1/2, VEGFR1, WNK l, YES1, ZAP70, MAP4K3, MAP4K5, MAPKlb, MAPKAP-K2 K3, p38 알파/베타/델타/감마 MAPK, 오로라(Aurora) A, 오로라 B, 오로라 C, MCAK, Clip, MAPKAPK, FAK, MARK 1/2/3/4, Mucl, SHC, CXCR4, Gap-1, Myc, 베타-카테닌/TCF, Cbl, BRM, Mcl-1, BRD2, BRD3, BRD4, AR, RAS, ErbB3, EGFR, IRE1, HPK1, RIPK2, 및 ERct, 및 이들 열거된 표적 단백질의 모든 변이체, 돌연변이, 스플라이스 변이체, 삽입삭제물(indel) 및 융합물.
B 구성요소는 E3 유비퀴틴 결찰효소에 결합하는 기이다. E3 유비퀴틴 결찰효소 (600개 이상의 것이 인간에서 알려져 있음)는 유비퀴틴화에 대한 기질 특이성을 준다. 이들 결찰효소에 결합하는 리간드들이 알려져 있다. 본원에서 기술되는 바, E3 유비퀴틴 결찰효소 결합 기는 E3 유비퀴틴 결찰효소에 결합할 수 있는 펩타이드 또는 소분자일 수 있다. E3 유비퀴틴 결찰효소의 예로 다음을 들 수 있다: 본 히펠-린다우(von Hippel-Lindau, VHL); 세레브론, XIAP, E3A; MDM2; 분열후기(anaphase)-촉진 복합체; UBR5 (EDDI); SOC S/ BC-박스/ eloBC/ CUL5/ RING; LNXp80; CBX4; CBLL1; HACE1; HECTD1; HECTD2; HECTD3; HECW1; HECW2; HERC1; HERC2; HERC3; HERC4; HUWE1; ITCH; NEDD4; NEDD4L; PPIL2; PRPF19; PIAS1; PIAS2; PIAS3; PIAS4; RANBP2; RNF4; RBX1; SMURF1; SMURF2; STUB1; TOPORS; TRIP12; UBE3A; UBE3B; UBE3C; UBE4A; UBE4B; UBOXS; UBR5; WWP1; WWP2; Parkin; A20/TNFAIP3; AMFR/gp78; ARA54; 베타-TrCPl/BTRC; BRCA1; CBL; CHIP/STUB 1; E6; E6AP/UBE3A; F-박스 단백질 15/FBXO15; FBXW7/Cdc4; GRAIL/RNF128; HOIP/RNF31; cIAP-1/HIAP-2; cIAP-2/HIAP-1; cIAP (pan); ITCH/AIP4; KAP1; MARCH8, Mind Bomb 1/MIB1; Mind Bomb 2/MIB2; MuRF1/TRIM63; NDFIP1; NEDD4; NleL; Parkin; RNF2; RNF4; RNF8; RNF168; RNF43; SART1; Skp2; SMURF2; TRAF-1; TRAF-2; TRAF-3; TRAF-4; TRAF-5; TRAF-6; TRIMS; TRIM21; TRIM32; UBR5; 및 ZNRF3.
예시의 E3 유비퀴틴 결찰효소는 본 히펠-린다우 (VHL) 종양 억제자로, 그것은 E3 결찰효소 복합체 VCB-Cul2의 기질 인식 하위유닛이다. VCCB-Cul2 복합체는 VHL, 엘론긴(elongin) B 및 C, Cul2 및 Rbxl로 구성된다. VHL의 일차 기질은 저산소증 유도성 인자 let (HIF-let), 유전자를 상향조절하는 전사 인자, 예컨대 전-혈관신생 성장 인자 VEGF 및 낮은 산소 수준에 반응하여 적혈구를 유도하는 사이토카인 에리트로포이에틴이다. VHL에 결합하는 화합물은 하이드록시프롤린 화합물, 예컨대 WO2013/106643에서 개시된 화합물, 및 US2016/0045607, WO2014187777, US20140356322, 및 US 9,249,153에서 기술된 다른 화합물일 수 있다.
다른 예시의 E3 유비퀴틴 결찰효소는 세레브론이다. 세레브론은 손상된 DNA 결합 단백질 1 (DDB1), 컬린-4A (CUL4A), 및 컬린 1의 조절자 (ROC 1)와 E3 유비퀴틴 결찰효소 복합체를 형성하는 단백질이다. 이 복합체는 많은 다른 단백질을 유비퀴틴화한다. 표적 단백질의 세레브론 유비퀴틴화는 증가된 수준의 섬유모세포 성장 인자 8 (FGF8) 섬유모세포 성장 인자 10 (FGF10)을 초래한다. FGF8은 계속해서 많은 발달 과정, 예컨대 사지 및 청각 소포 형성을 조절한다. 세레브론이 없을 때, DDB1은 DNA 손상-결합 단백질로서 기능하는 DDB2와 복합체를 형성한다. 탈리도미드(Thalidomide), 레날리도미드(lenalidomide), 포말리도미드(pomalidomide) 및 그것들의 유사체가 세레브론에 결합하는 것으로 알려져 있다. 세레브론에 결합하는 다른 소분자 화합물들이 또한 알려져 있는데, 예컨대, US2016/0058872 및 US2015/0291562에서와 같이 개시된 화합물이다. 추가로, 결합제, 예컨대 BET 브로모도메인의 길항물질과의 프탈이미드 컨쥬게이션은 고도로 선택적인 세레브론-의존성 BET 단백질 분해를 수반하는 프로탁을 제공할 수 있다. Winter et al., Science, June 19, 2015, p. 1376. 그러한 프로탁은 APC를 형성하기 위하여 본원에서 기술된 항체에 컨쥬게이션될 수 있다.
프로탁의 특이성은 분해를 위해 표적 단백질에 결합하는 그것의 표적 리간드에 좌우된다. 만약 특이성이 높지 않으면, 이것은 표적 외 효과 (부작용)를 유발할 수 있다. 더불어, 프로탁은 일반적으로 소분자이다 (대략 1000의 분자량). 이것들은 세포로 들어가기 위하여 확산에 의존하는데, 그것은 덜 효율적이다 (특히 대략 1000의 분자량인 경우). 나아가, 그것들이 소분자이기 때문에, 그것은 전형적으로 신장 여과로 인해 짧은 생체내 반감기를 가진다. 그러므로, 프로탁은 더 높은 투여 빈도로 제공될 필요가 있을 수 있다.
발명의 항체-프로탁 컨쥬게이트 (APC)는 긴 생체내 반감기를 가지는 항체 또는 ADC와 크기가 유사하다. 그러므로, 발명의 APC는 또한 긴 생체내 반감기 (예컨대, 수주)를 가지며, 항체의 존재로 인한 내부화에 의해 세포 안으로 들어갈 수 있다. 이에 더불어, APC는 이중 선택성을 가진다: 항체로부터 유래된 선택성 및 프로탁의 표적 단백질 결합제로부터 유래된 선택성. 예를 들어, 발명의 APC의 항체는 암세포 상의 특정 항원에 결합할 수 있고, 그런 후 APC는 내부화를 통해 세포로 들어갈 수 있다. 세포 안에서는, 프로탁 부분의 표적 단백질 결합제가 표적 단백질을 찾아서 그것을 유비퀴틴화를 위해 E3 유비퀴틴 결찰효소로 가져간다. 유비퀴틴화된 표적 단백질은 프로테아좀에 의한 분해에 대해 표시된다. 그로써, 발명의 APC는 고도로 선택적이고 부작용을 덜 가질 것이다.
이에 더불어, 발명의 APC는 프로탁과 유사하게, 촉매적 작용 모드라는 장점을 가진다. 그러므로, APC의 치료적 유효량은 더 낮을 수 있고, 그것은 그것의 긴 생체 반감기로 인해 더 적은 빈도로 제공될 수 있다. 이들 특성은 발명의 APC를 보다 특이적이고 사용하기에 더 안전하게 만들어준다.
하기의 표 1은 ADC, 프로탁, 및 APC의 일부 특성을 요약하고 비교한 것이다.
이상적 ADC 이상적 프로탁 이상적 APC
분자량 약 150 KD 약 1000 약 150 KD
반감기 길다 (수주) 짧다 (수시간) 길다 (수주)
투여 정맥내 경구/정맥내 정맥내
세포 침투 내부화 확산 내부화
MOA 페이로드 세포독성 표적 분해 (촉매적) 표적 분해 (촉매적)
효과적인 용량 낮음 높음 낮음
치료 창 낮음 낮음 높음
선택성 mAb로부터 표적 리간드로부터 이중 선택성
독성 페이로드 유도 (안정성) 표적 외 효과 더 안전함
그러므로, APC 포맷은 신규하고 새로운 치료제에 대한 유망한 접근법을 나타낸다. 이 접근법은 일반적으로 임의의 장애와 관련된 임의의 표적 단백질에 적용될 수 있다 (Crews et al., "Proteolysis-Targeting Chimeras: Induced Protein Degradation as a Therapeutic Strategy," ACS Chem. Biol. 2017, 12(4), 892-898 참조).
발명의 구체예들은 항체를 얻은 후 그 항체를 프로탁과 결합시키기 위해 사용함으로써 (즉, E3 유비퀴틴 결찰효소 리간드 또는 억제자에 결합된 표적 단백질 결합제), 질환 또는 장애를 유발하는 임의의 표적 단백질에 적용될 수 있다. 항체는 표적 단백질을 함유하는 세포 상에서 발현된 항원에 대해 지시된다. 프로탁의 표적 단백질은 어떤 단백질이 표적화될 것인지에 따라 좌우될 것이다. 예를 들어, 표적 효소 (예컨대, 키나제)의 경우, 당업자는 리간드/결합제로서 억제자를 설계할 수 있다.
E3 유비퀴틴 결찰효소 리간드/결합제의 경우, 여러 분자가 다양한 E3 유비퀴틴 결찰효소에 결합하는 것으로 알려져 있다. 예로는 다음을 들 수 있다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
뉴트린 유도체는 p53 종양 억제자의 음성 조절자인 MDM2 (2 분 2 상동체: E3 유비퀴틴-단백질 결찰효소 Mdm2로도 알려져 있음)에 결합한다. Mdm2는 p53 종양 억제자의 N-말단 트랜스-활성화 도메인 (TAD)을 인식하는 E3 유비퀴틴 결찰효소로서 및 p53 전사 활성화의 억제자로서 기능한다. 베스타틴 (우베니멕스)은 cIAP1 (세포자멸성 단백질-1의 세포 억제자)와 맞물린다. IMiD 탈리도미드 및 그것의 유도체인 포말리도미드 및 레날리도미드는 세레브론에 결합한다.
다음의 설명은 발명의 구체예들을 예시하기 위하여 특정 실시예를 사용할 것이다. 실시예는 표적 단백질로서 단백질의 브로모도메인 및 외부 말단 도메인 (BET) 패밀리, 및 항체로서 트라스투주맙을 사용한다. 그러나, 이들 실시예에서 사용된 임의의 특정 BET 억제자, 유비퀴틴 결찰효소 3 억제자, 및 트라스투주맙은 단지 예시를 위한 것이고 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 기술분야에 숙련된 사람은 다른 변형 및 변화가 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 가능한 것을 인정할 것이다.
BRD2, BRD3, 및 BRD4를 포함한, 단백질의 브로모도메인 및 가외 말단 도메인 (BET) 패밀리는 염증성 유전자 발현, 유사분열, 및 바이러스/숙주 상호작용을 포함한 많은 세포 과정에서, 히스톤 아세틸화-의존성 크로마틴 복합체의 어셈블리를 제어함으로써 핵심 역할을 수행한다. BET 단백질의 억제자는 브로모도메인 또는 BET 단백질:　BRD2, BRD3, BRD4, 및 BRDT에 가역적으로 결합한다. 이것들은 BET 단백질과 아세틸화된 히스톤 및 전사 인자 사이의 단백질-단백질 상호작용을 방지할 수 있다. 그러므로, BET 억제자는 항암, 면역억제, 및 다른 효과를 가진다. APC에서 BET 억제자의 사용은 유비퀴틴화를 위해 BET 패밀리 단백질을 표적으로 할 것이고, 그로써 프로테아좀에 의한 BET 패밀리 단백질의 제거로 어어지게 될 것이다.
다음은 발명의 몇몇 구체예를 상세하게 기술한 것이다. 그러나, 이들 상세한 설명은 단지 예시를 위한 것이고, 기술분야에 숙련된 사람은 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 다른 변형 및 변화가 가능한 것을 인정할 것이다.
실시예 1: 트라스투주맙-BRD4-프로탁-1의 제조
화합물 2의 합성
Figure pct00008
이 실시예에서, BET 억제자는 경구로 생체 이용 가능하고, BRD2, BRD3, 및 BRD4의 소분자 억제제 (EC50 = 10-19 nM)인 OTX015이다. OTX015는 c-Myc 발현을 하향 조절하고 세포 사이클 정지 및 세포자멸사를 유도한다. 그로써, 그것은 다양한 고체 종양 및 백혈병에 대해 항증식 효과를 가진다.
화합물 2: 다이메틸포름아미드 (5 mL) 중의 OTX015 (1) (0.2 mmol) 및 1-브로모-2-(2-브로모에톡시)에탄 (1 mmol)의 혼합물에 탄산 칼륨 (0.6 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안 50℃에서 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 다이클로로메탄 및 물로 추출하였다. 그런 후, 유기 층을 식염수로 세척하고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 유기 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 메탄올 : 다이클로로메탄 (1 : 19)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색 고체 화합물 2를 얻었다 (58% 수율). 1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) : δ 7.45 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.78 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 4.71 (dd, J = 8.0, 6.2 Hz, 1H), 4.06 (dd, J = 5.4, 4.5 Hz, 2H), 3.86 - 3.82 (m, 4H), 3.78 (dd, J = 14.5, 8.0 Hz, 1H), 3.57 (dd, J = 14.5, 6.2 Hz, 1H), 3.47 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 2.66 (s, 3H), 2.38 (d, J = 0.6 Hz, 3H), 1.65 (d, J = 0.6 Hz, 3H). LCMS (ESI): m/z [C33H37ClN6O4S+H]+에 대한 계산값 642.08, 실측값 642.52 [M+H]+.
화합물 4의 합성
Figure pct00009
화합물 4: DMF (5 mL) 중의 포말리도미드 (3) (0.2 mmol) 및 tert-부틸 (2-(2-아미노에톡시)에틸) 카바메이트 (0.22 mmol)의 용액에 N,N-다이아이소프로필아민 (0.4 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 90℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 다이클로로메탄 및 물로 추출하였다. 그런 후, 유기 층을 식염수로 세척하고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 유기 용매를 감압 하에 제거하였다. 에틸 아세테이트 : 헥산 (2 : 3)을 사용하여 플래시 칼럼 상에서 정제한 후, 황색 잔류물을 다이클로로메탄에 용해시키고 트라이플루오로아세트산 (1 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 그런 후, 반응 혼합물을 다이클로로메탄 및 물로 추출하였다. 그런 후, 유기 층을 식염수로 세척하고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 유기 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 메탄올 : 다이클로로메탄 (1 : 9)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색 고체 화합물 4를 얻었다. 1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 7.35 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 4.81 (dd, J = 11.6, 5.1 Hz, 1H), 3.62 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 3.56 (d, J = 4.5 Hz, 2H), 3.33 (d, J = 4.1 Hz, 2H), 3.05 - 3.04 (m, 2H), 2.71 - 2.53 (m, 3H), 2.01 - 1.93 (m, 1H). LCMS (ESI): m/z [C33H37ClN6O4S+H]+에 대한 계산값 361.14, 실측값 361.22 [M+H]+.
화합물 5의 합성
Figure pct00010
화합물 5: 아세토니트릴 / 다이메틸포름아미드 (3:1, 4 mL) 중의 화합물 2 (0.2 mmol), 화합물 4 (0.6 mmol) 및 요오드화 칼륨 (0.2 mmol)의 용액에 탄산 칼륨 (0.6 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 72시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 다이클로로메탄 및 물로 추출하였다. 그런 후, 유기 층을 식염수로 세척하고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 유기 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 메탄올 : 다이클로로메탄 (1 : 12)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색 고체 화합물 5를 얻었다 (19.7% 수율). 1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 7.53 - 7.36 (m, 5H), 7.36 - 7.29 (m, 2H), 7.09 (dd, J = 7.0, 3.7 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 8.7, 1.4 Hz, 2H), 4.89 (dt, J = 12.5, 6.1 Hz, 1H), 4.66 (ddd, J = 7.9, 6.0, 3.5 Hz, 1H), 4.10 - 4.02 (m, 2H), 3.84 - 3.58 (m, 9H), 3.55 - 3.41 (m, 2H), 3.41 - 3.30 (m, 2H), 3.02 - 2.91 (m, 3H), 2.87 - 2.68 (m, 3H), 2.67 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 2.10 - 2.07 (m, 1H), 1.67 (s, 3H). LCMS (ESI): m/z [C33H37ClN6O4S+H]+에 대한 계산값 922.30, 실측값 922.49 [M+H]+
화합물 7의 합성
Figure pct00011
Figure pct00012
화합물 7: 다이메틸포름아미드 (5 mL) 중의 화합물 5 (0.2 mmol) 및 Mal-C5-VC-PAB-PNP 화합물 6 (0.2 mmol)의 용액에 하이드록시벤조트리아졸 (0.4 mmol) 및 피리딘 (0.4 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 72시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 다이클로로메탄 및 물로 추출하였다. 그런 후, 유기 층을 식염수로 세척하고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 유기 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 메탄올 : 다이클로로메탄 (1 : 16)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색 고체 화합물 7을 얻었다 (46.3% 수율). 1H NMR (600 MHz, 클로로포름-d) δ 7.55 - 7.40 (m, 7H), 7.33 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.25 - 7.19 (m, 2H), 7.08 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.92 - 6.83 (m, 1H), 6.79 - 6.68 (m, 2H), 6.68 - 6.65 (m, 2H), 5.07 - 5.00 (m, 2H), 4.77 - 4.71 (m, 1H), 4.71 - 4.60 (m, 1H), 4.37 - 4.29 (m, 1H), 4.04 - 3.96 (m, 1H), 3.93 - 3.85 (m, 1H), 3.77 - 3.34 (m, 21H), 3.28 - 3.14 (m, 1H), 3.11 - 3.02 (m, 1H), 2.93 - 2.71 (m, 3H), 2.69 (s, 3H), 2.42 (s, 3H), 2.04 - 2.01 (m, 1H), 1.91 - 1.81 (m, 2H), 1.77 - 1.70 (m, 1H), 1.69 (s, 3H), 1.62 - 1.54 (m, 4H), 1.33 - 1.25 (m, 5H), 0.91 - 0.87 (m, 6H). LCMS (ESI): m/z [C33H37ClN6O4S+H]+에 대한 계산값 1520.58, 실측값 1521.14 [M+H]+.
트라스투주맙-BRD4-프로탁 1의 컨쥬게이션
Figure pct00013
완충액 (25 mM 붕산 나트륨 pH 8, 0.025 M NaCl, 1 mM 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산 (DTPA)) 중의 트라스투주맙 1 mg (5.0 mg / mL)의 용액을 트리스(2-카르복시에틸)포스파인 (TCEP, 4.0 몰 당량)으로 37℃에서 2시간 동안 처리하였다. 과잉 TCEP를 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 장치를 사용하여 완충액 (25 mM 붕산 나트륨 pH 8, 0.025 M NaCl, 1 mM DTPA) 중의 30 kDa NMWL을 사용하여 제거한 후, 화합물 7 (20 몰 당량)로 25℃에서 4시간 동안 처리하였다. 반응 혼합물을 컷오프하고 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 장치를 사용하여 pH 7.4 PBS 완충액 중의 30 kDa NMWL을 사용하여 농축하여 트라스투주맙-BRD4-프로탁 1을 얻었다.
실시예 2: 트라스투주맙-BRD4-프로탁-2의 제조
화합물 8의 합성
Figure pct00014
화합물 8: 아세토니트릴 (7 mL) 중의 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC) (0.75 mmol)의 용액에 1,2-에탄다이티올 (0.82 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 다이클로로메탄 및 물로 추출하였다. 그런 후, 유기 층을 식염수로 세척하고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 유기 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 : 헥산 (3 : 2)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 고체 화합물 8을 얻었다 (34.8% 수율).
화합물 9의 합성
Figure pct00015
화합물 9: 아세토니트릴 / 다이메틸포름아미드 (1 : 1, 6 mL) 중의 화합물 7 (0.02 mmol)의 용액에 화합물 8 (0.04 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 다이클로로메탄 및 물로 추출하였다. 그런 후, 유기 층을 식염수로 세척하고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 유기 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 : 헥산 (3 : 2)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 고체 화합물 9를 얻었다 (86.2% 수율).
트라스투주맙-BRD4-프로탁 2의 컨쥬게이션
Figure pct00016
완충액 (50 mM 인산 칼륨, 50 mM 염화 나트륨, 2 mM EDTA; pH 6.5) 중의 트라스투주맙 1 mg (5.0 mg/mL)의 용액에 30 당량의 9 (DMSO 중의 5 mM)를 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 18시간 동안 교반하였다. 항체 조제물을 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 장치를 사용하여 pH 7.4 PBS 완충액 중의 30 kDa NMWL을 사용하여 탈염하고 농축하여 트라스투주맙-BRD4-프로탁 2를 얻었다.
상기에서 주지한 것과 같이, 발명의 APC는 항체-L2 링커가 프로탁의 L1 링커에 부착되어 있는 분지형 형태를 가진다. 상기 실시예에서 예시한 것과 같이, L1 링커에 대한 L2 링커의 부착이 프로탁의 A 결합제 또는 B 결합제를 변경시키지 않을 것이고 부착 반응은 상대적으로 쉽다. 비교를 위해, 다음의 실시예는 L2 링커가 A 결합제 또는 B 결합제에 결합되어 있는 선형 (비분지형) APC를 합성하기 위한 시도를 예시한다.
실시예 3: 선형 형태 (17)를 가진 BRD4-프로탁의 합성
도 4는 ARV-825의 A 결합제를 통한 결합의 가능한 합성에 대한 합성 개략도를 도시한다. 단백질 리간드 또는 결찰효소 결합제의 작용기 변형은 쉽지 않다. 나아가, 모든 단백질 리간드 또는 결찰효소 결합제가 변형에 적합한 작용기를 가지는 것이 아니다. 이 실시예에서, 프로탁 ARV-825의 단백질 리간드인 OTXO15 상의 클로라이드 원자는 아미노 기와 같은 또 다른 작용기로 변형되기가 어렵다. OTX015 또는 ARV-825는 부흐발트 반응(Buchwald reaction, 팔라듐 촉매된 결합 반응) 및 울만 반응(Ullman reaction, 구리 촉매된 결합 반응) 하에서 반응성을 보이지 않는다. 엄격한 반응 조건, 예컨대 금속 할로겐화물 교환이 화합물 분해로 이어질 것이다. 문헌 (EP1887008A1)에 따르면, BRD4 억제자의 상이한 작용기가 아주 초기에 도입되어야 한다. 달리 표현하면, 단백질 리간드 또는 결찰효소 결합제를 링커에 직접 결합시키는 것이 합성을 보다 복잡하게 만들 것이다.
대조적으로, 본 발명에서 개시된 분지형 링커 전략은 임의의 단백질 리간드 또는 결찰효소 결합제를 연결시켜서 다음의 장점을 가지는 APC를 형성하는 새로운 방법을 제공한다. APC는 표적 단백질 리간드 및 E3 결찰효소 리간드의 구조를 유지하고, 그러므로 결합 친화도가 변화하지 않을 것이다. 링커 상의 부착 기에 대한 구조적 변형은 리간드 상에서보다 훨씬 더 쉽다. 링커 상의 변형은 대부분의 프로탁에 적합하며 당업자는 동일한 항체가 상이한 프로탁과 결합하거나 동일한 프로탁이 상이한 항체와 결합할 수 있도록 상이한 프로탁에 대한 "공통" 결합 작용기를 설계할 수 있다.
실시예 4: 생물학적 활성
식 (I)의 다양한 면역컨쥬게이트를 표적화 단백질에 대한 그것의 특이성 및 그것을 분해하는 능력에 대해 테스트하였다. 상이한 검정의 간단한 설명을 하기에서 기술한다.
웨스턴 블롯
BRD4 단백질 분해에서 식 (I)의 화합물의 세포 능력을 평가한다. 브로모도메인 단백질 4 (BRD4)는 BET (브로모도메인 및 가외-말단) 패밀리 단백질 중 하나이고 혈액 악성종양 및 고체 종양의 종양형성에 연루된다. BRD4는 아세틸화된 히스톤을 인식하고 그것에 결합하여 세포 분할 및 전사 제어를 가로질러 후성유전자 기억의 전파에 핵심 역할을 한다. 강력한 억제자 표적화 BRD4는 항종양 활성을 나타내며, 다양한 암세포의 증식 및 변형을 억제한다. 이것은 BRD4를 암 치료를 위한 유망한 치료 표적으로서 인도하였다. BRD4 단백질 가수분해 표적화 키메라 (프로탁)는 BRD4 단백질 분해를 유도함으로써 항암 활성을 가지는 것으로 나타났다. 그러나, 항암 효과에 더불어, 정상 세포 또는 이들 작용제에 의해 영향을 받는다. 이것은 BET 억제의 부작용, 예컨대 자폐증-유사 증후군 및 기억 형성의 손상과 관련된다.
본 발명에서, BRD4-프로탁 양식을 온전하게 유지하고, 암세포 표적화의 특이성을 향상시키며, 잠재적인 표적 외 효과를 감소시키기 위하여, 분지형 포맷을 가진 BRD4-프로탁 항체 컨쥬게이트를 생성하였다. "BRD4-프로탁"은 BRD4 단백질에 대한 표적 결합제를 포함하는 프로탁을 나타낸다. "BRD4-프로탁"을 암세포 상의 항원을 인식하는 항체와 결합시킴으로써, 항체의 높은 특이성이 결과적으로 생성된 컨쥬게이트 (즉, Ab-BRD4-프로탁)가 특정 암세포를 표적화하고 건강한 세포에는 적은 독성을 유발하게 한다. 예를 들어, 항체는 트라스투주맙일 수 있고 암세포는 HER2-양성 BT-474 유방암 세포일 수 있다. 식 (I)의 다양한 화합물 (즉, 상이한 BRD4 결합제, 상이한 E3 결합제, 및/또는 상이한 항체를 가지는 화합물)을 웨스턴 블롯팅 검정을 통해 세포의 BRD4 단백질 분해에서 테스트하였다. 다음은 발명의 구체예의 장점을 예시하기 위하여 트라스투주맙-결합 BRD4-프로탁을 사용한다.
웨스턴 블롯 실험을 위해, HER2-양성 BT-474 및 HER2-음성 MDA-MB-231 유방암 세포를 각각 DMEM 및 10% FBS가 첨가된 L15 배지에서 배양하고, 밤새 배양하였다. 검정하는 날에, 2십만개의 세포를 각각의 테스트 화합물로 24시간 동안 사전 처리하였다. 24시간 후에, 전체 세포 용해물을 2x SDS 샘플 완충액을 첨가함으로써 수득하였다. 단백질을 SDS-PAGE 전기영동에 의해 분리하고 PVDF 막에 옮겼다. 단백질 발현을 표준 프로토콜을 따라 다양한 일차 항체 및 이차 항체를 사용한 면역블롯을 사용하여 검출하였다. BRD4에 대한 항체 및 항-토끼 IgG, HRP-결합된 이차 항체를 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)로부터 구입하였다. 액틴에 대한 항체를 Millipore (Burlington, MA)로부터 구입하였다. 면역블롯을 화학발광에 의해 나타냈고 (SuperSignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate, Thermo Fisher, Waltham, MA) ChemiDocTM MP 영상 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA)에 의해 검출하였다.　웨스턴 블롯의 밴드 세기를 또한 ChemiDocTM MP 영상 시스템에 의해 정량화하였다. 약물 처리 그룹에 상응하는 밴드의 상대적 세기를 미처리 그룹의 그것과 비교하였다.
도 2는 검정의 결과를 도시한다. ARV-825 (CAS # 1818885-28-7)는 E3 결찰효소 세레브론 결합 모이어티에 결합된 BRD4 결합 모이어티를 포함하는 헤테로-이중기능성 분자이다. ARV-825는 단백질 가수분해 표적화 키메라 (프로탁)이다. (Lu, J.　et al.,　"Hijacking the E3　ubiquitin ligase cereblon to efficiently targetBRD4,"　Chem. Biol.　22(6),　755-763　(2015) 참조). 발명의 화합물 5는 ARV-825의 분지 형태이다. 발명의 화합물 7은 추가적인 리소좀에 의해 절단 가능한 다이펩타이드 (발린-시트룰린) 링커를 가진 화합물 5이다.
도 2에서 나타낸 것과 같이, 화합물 5는 이 세포 배양 검정에서 BRD4의 분해를 촉진하는데 있어 ARV-825만큼 효과적이다. 대조적으로, 화합물 7은 1 mM까지의 화합물 7 처리로 BRD4 단백질을 분해할 수 없는데, 그것은 더 낮은 투과성을 유발하는 발린-시트룰린 다이펩타이드로부터 유발될 가능성이 있다. 이런 결과는 APC가 세포로 유입되기 전에 조기에 절단된다면, 방출된 프로탁 (예컨대, 화합물 7)은 표적 외 효과를 유발하지 않을 것임을 시사한다. 그러므로, 발명의 APC는 더 높은 안전성 마진을 가질 것이다.
도 3은 화합물 7 트라스투주맙 항체 컨쥬게이트 (즉, 실시예 1)가 HER2-음성 MDA-MB-231 유방암 세포 대신 HER2-양성 BT-474 유방암 세포에서 특이적 BRD4 단백질 분해를 나타내는 것을 보여준다. 이 APC는 AKT 단백질 또는 액틴 단백질의 분해를 유발하지 않을 것이다. 이것은 항체의 프로탁의 링커에 대한 분지형 결합이 프로탁의 활성을 손상시키지 않았음을 나타낸다. 중요하게, 생체내 상황 하에서, 항체 (트라스투주맙)는 특정 항원 (예컨대, HER2)을 발현하는 그런 세포들에 대해 APC를 지시할 것이고, 그로써 표적 외 효과를 감소시킬 것이다. 따라서, 실시예 1은 임상 적용에서 AV-825만큼 효과적이지만 더 안전할 것이다.
이들 결과는 발명의 항체 컨쥬게이트 (분지형 APC)가 암세포 표적화의 특이성을 향상시키고, 프로탁 양식의 세포 흡수를 강화시키며, 잠재적인 표적 외 효과를 감소시킬 수 있음을 나타냈다. 이에 더불어, 만약 항체가 조기에 분리되면, 방출된 프로탁 (예컨대, 화합물 7)은 발린-시트룰린 다이펩타이드로 인해 상대적으로 더 낮은 투과도를 가지며 바람직하지 못한 표적 외 효과를 유발하지 않아서, 매우 안전한 마진을 유발할 것이다.
항-증식 활성
상기에서 주지한 것과 같아. 발명의 APC는 특정 항원을 은닉하는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 질환은 암, 자가면역 질환, 감염성 질환, 또는 혈관 증식성 장애일 수 있다. 암은 폐암, 결장암, 대장암, 유방암, 전립선암, 간암, 췌장암, 방광암, 위암, 신장암, 침샘암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 구강암, 피부암, 뇌암, 림프종, 또는 백혈병일 수 있다. 발명의 APC에 의한 세포 성장의 억제를 CellTiterTM-96 검정을 사용하여 측정하였다. APC의 세포독성을 상아힌 HER2 발현 표현형을 가진 유방암 세포주에서 평가하였다. 결과는 본 발명의 APC가 HER2-양성 유방암 세포에만 독성이고, 이때 BRD4 단백질, Src 키나제, 또는 RAS 단백질은 트라스투주맙에 결합된 적절한 프로탁을 사용함으로써 프로테아좀 분해에 대해 특이적으로 표적화될 수 있음을 보여준다.
발명의 APC는 그것이 ADC 및 프로탁의 장점들을 가지기 때문에 유망한 새로운 치료제이다. 더욱이, 발명의 분지형 APC는 선형 ADC 프로탁을 뛰어넘는 장점을 보이며 특정 항원을 은닉한 장애의 치료에 유용하다.
발명의 일부 구체예는 발명이 APC를 사용하여 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 질환은 암일 수 있다. 암의 특정 예로는 유방암, 위암, 편평 세포 암종, 결장암, 및 특정 항원을 발현하는 백혈병을 들 수 있다. APC에서 사용된 항체는 트라스투주맙, 세툭시맙(cetuximab), 리툭시맙(rituximab), 브렌툭시맙(brentuximab), 겜투주맙(gemtuzumab), 이노투주맙(inotuzumab), 사키투주맙(sacituzumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 니모투주맙(nimotuzumab)일 수 있다. APC의 특정 예는 HER2를 발현하는 유방암 또는 위암을 표적화하기 위한 분지형 트라스투주맙-결합 프로탁일 수 있다.
분지형 항체-결합 프로탁은 상이한 링커 또는 상이한 항체 컨쥬게이션 방법과 같이 상이한 포맷으로 합성할 수 있다. 화합물 18 및 화합물 19는 리신 컨쥬게이션을 위한 상이한 링커 포맷을 보여주는 예이다. 화합물 18 및 화합물 19에서 프로탁의 합성은 PEG 링커를 가진 화합물 9와 동일한 과정을 따른다. 화합물 18 및 화합물 19를 상기 기술된 실시예 2와 동일한 과정으로 합성할 수 있다. PEG 링커를 가진 분지형 프로탁은 더 나은 용해도 및 항체와의 컨쥬게이션을 수행할 수 있다.
Figure pct00017
Figure pct00018
발명의 구체예들이 제한된 수의 실시예로 예시되었다. 기술분야의 숙련된 사람은 다른 변형 및 변화가 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 가능한 것을 인정할 것이다. 그러므로, 보호 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정되어야 한다.

Claims (13)

  1. 식 (I)의 구조를 가지는 면역컨쥬게이트:
    Figure pct00019

    식에서:
    (a) Ab는 항체 또는 그것의 결합 단편이고;
    (b) L1 및 L2는 각각 독립적으로 링커이며, L1 및 L2는 동일하거나 상이할 수 있고, L1은 L2에 결합되며;
    (c) A는 표적-단백질 리간드/결합제이고;
    (d) B는 유비퀴틴 결찰효소 리간드/결합제이며, 그리고
    (e) n 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 8의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 표적 단백질은 키나제, G 단백질-결합된 수용체, 전사 인자, 포스파타제, 및 RAS 수퍼패밀리 구성원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역컨쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, A는 열 충격 단백질 90 (HSP90) 억제자, 키나제 또는 포스파타제 억제자, MDM2 억제자, HDAC 억제자, 인간 리신 메틸트랜스퍼라제 억제자, 혈관신생 억제자, 면역억제 화합물, 및 인간 BET 브로모도메인-함유 단백질, 아릴 탄화수소 수용체 (AHR), REF 수용체 키나제, FKBP, 안드로겐 수용체 (AR), 에스트로겐 수용체 (ER), 갑상선 호르몬 수용체, HIV 프로테아제, HIV 인티그라제, HCV 프로테아제, 또는 아실-단백질 티오에스테라제-1 및 -2 (APT1 및 APT2)를 표적으로 하는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  4. 제1항에 있어서, B는 XIAP, VHL, 세레브론, 및 MDM2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 E3 결찰효소에 결합하는 기인 것을 특징으로 하는 면역컨쥬게이트.
  5. 제1항에 있어서, Ab는 단클론성 항체 또는 그것의 변이체인 것을 특징으로 하는 면역컨쥬게이트.
  6. 제1항에 있어서, Ab는 DLL3, EDAR, CLL1; BMPR1B; E16; STEAP1; 0772P; MPF; NaPi2b; Sema 5b; PSCA hlg; ETBR; MSG783; STEAP2; TrpM4; CRIPTO; CD21; CD79b; FcRH2; B7-H4; HER2; NCA; MDP; IL20Rct; 브레비칸; EphB2R; ASLG659; PSCA; GEDA; BAFF-R; CD22; CD79a; CXCRS; HLA-DOB; P2X5; CD72; LY64; FcRH1; IRTA2; TENB2; PMEL17; TMEFF1; GDNF-Ra1; Ly6E; TMEM46; Ly6G6D; LGR5; RET; LY6K; GPR19; GPR54; ASPHD1; 티로시나제; TMEM118; GPR172A; MUC16, 및 CD33으로 이루어지는 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 중 하나 이상에 결합하는 것을 특징으로 하는 면역컨쥬게이트.
  7. 제5항에 있어서, Ab는 트라스투주맙, 세툭시맙, 리툭시맙, 브렌툭시맙, 겜투주맙, 이노투주맙, 사키투주맙, 알렘투주맙, 또는 니모투주맙인 것을 특징으로 하는 면역컨쥬게이트.
  8. 제1항의 면역컨쥬게이트 및 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물.
  9. 질환을 치료하기 위한 제약학적 조성물로서, 제약학적 조성물이 제1항의 면역컨쥬게이트 또는 제8항의 조성물의 유효량을 포함하는 것인 제약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 질환은 암인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 암은 유방암 또는 위암이고, Ab는 트라스투주맙인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 암은 결장암 또는 편평 세포 암종이고 Ab는 세툭시맙인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 질환은 백혈병이고 Ab는 리툭시맙, 브렌툭시맙, 겜투주맙, 이노투주맙, 또는 알렘투주맙인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
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