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KR20200103882A - 히스티딘 엔지니어링된 경쇄 항체 및 그것을 생성하기 위한 유전자 변형된 비-인간 동물 - Google Patents

히스티딘 엔지니어링된 경쇄 항체 및 그것을 생성하기 위한 유전자 변형된 비-인간 동물 Download PDF

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KR20200103882A
KR20200103882A KR1020207024599A KR20207024599A KR20200103882A KR 20200103882 A KR20200103882 A KR 20200103882A KR 1020207024599 A KR1020207024599 A KR 1020207024599A KR 20207024599 A KR20207024599 A KR 20207024599A KR 20200103882 A KR20200103882 A KR 20200103882A
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KR
South Korea
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human
light chain
sequence
histidine
substitution
Prior art date
Application number
KR1020207024599A
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Inventor
존 맥훠터
린 맥도날드
앤드류 제이. 머피
Original Assignee
리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Application filed by 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 filed Critical 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

면역화될 때 항원에 pH 의존적으로 결합할 수 있는 항체 레퍼토리를 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 생식선 서열에 히스티딘 변형을 포함하는 제한된 레퍼토리의 인간 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 절편으로부터 유도된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 면역글로불린 경쇄 뉴클레오티드 서열에 도입된 히스티딘 코돈들에 의해 코드화된 히스티딘 잔기들을 포함하는 항체들을 발현하는 비-인간 동물의 제조방법이 제공된다.

Description

히스티딘 엔지니어링된 경쇄 항체 및 그것을 생성하기 위한 유전자 변형된 비-인간 동물{HISTIDINE ENGINEERED LIGHT CHAIN ANTIBODIES AND GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMALS FOR GENERATING THE SAME}
pH 의존성 방식으로 항원에 결합할 수 있는 항체를 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물 (예컨대 설치류, 예를 들면 마우스 또는 래트)이 제공된다. 비-인간 동물의 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열에 대한 변형을 제조하는 방법이 제공되는데, 이때 변형은 상보성 결정 영역 (CDR) 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 코드화하는 경쇄 가변 영역 유전자, 예컨대 뉴클레오티드 내의 잔기의 돌연변이생성을 포함하여서 항원에 대해 pH 의존성 결합을 나타내는 경쇄 도메인을 포함하는 항체의 생체 내 발현을 촉진한다. 또한 pH-의존성 항원 결합을 나타내는 항체의 제조 방법도 제공된다.
항체는 전형적으로 단일이량체 중쇄 성분을 포함하는데, 이때 각각의 중쇄 단량체는 동일한 경쇄와 결합된다. 이종이량체 중쇄 성분을 가지는 항체 (예컨대 이중특이성 항체)는 치료 항체로서 바람직하다. 그러나 이중특이성 항체의 각각의 중쇄와 만족스럽게 결합할 수 있는 적당한 경쇄 성분을 가지는 이중특이성 항체를 만드는 것은 문제가 많은 것으로 증명되었다.
한 접근법으로, 경쇄는 모든 경쇄 가변 도메인에 대한 용법 통계자료를 조사하고, 인간 항체에서 가장 빈번하게 사용된 경쇄를 확인하며, 그 경쇄를 상이한 특이성의 2개의 중쇄와 짝을 이루게 함으로써 선택될 수 있을 것이다.
다른 접근법으로, 경쇄는 파지 디스플레이 라이브러리 (예컨대 인간 경쇄 가변 영역 서열, 예를 들면 인간 scFv 라이브러리를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리)를 관찰하고, 가장 통상적으로 사용된 경쇄 가변 영역을 그 라이브러리로부터 선택함으로써 선택될 수 있을 것이다. 그런 다음 경쇄는 관심의 2개의 상이한 중쇄에 대해 시험될 수 있다.
또 다른 접근법으로, 경쇄는 프로브로서 관심의 두 중쇄의 중쇄 가변 서열을 사용하여 경쇄 가변 서열의 파지 디스플레이 라이브러리를 분석함으로써 선택될 수 있을 것이다. 2개의 중쇄 가변 서열과 결합하는 경쇄는 그 중쇄에 대한 경쇄로서 선택될 수 있을 것이다.
또 다른 접근법으로, 후보 경쇄는 중쇄의 동족 경쇄와 배열될 수 있고, 변형은 두 중쇄의 동족 경쇄에 대해 공통적인 서열 특성을 더 밀접하게 매치시키기 위해 경쇄에 만들어진다. 만약 면역원성의 변화가 최소화될 필요가 있다면, 변형은 바람직하게 공지된 인간 경쇄 서열에 존재하는 서열을 초래하고, 그로써 단백질 가수분해 프로세싱은 면역원성의 가능성을 평가하기 위하여 해당 기술분야에 공지되어 있는 매개변수와 방법 (즉 가상 환경뿐 아니라 습식 분석)을 토대로 T 세포 에피토프를 생성하는 것으로 보이지는 않는다.
상기 접근법들은 모두 많은 선행 규제들, 예컨대 서열 동일성, 특이한 예비-선택된 중쇄와의 결합 능력 등을 포함하는 시험관 내 방법에 의존한다. 따라서 시험관 내 조건을 조작하는 것에 의존하지 않고, 대신 공통 경쇄를 포함하는 인간 에피토프-결합 단백질을 제조하기 위한 생물학적으로 보다 민감한 접근법을 사용하는 조성물 및 방법에 대한 요구가 해당 기술분야에 있다.
또한, 치료 항체, 예컨대 이중특이성 치료 항체는 그것들이 때로 원하는 효능을 이루기 위하여 고용량을 필요로 하는 점에서 약간의 제한을 가진다. 이것은 부분적으로는 항체-항원 복합체가 엔도솜 안에 내재화되고, 표적-중재된 소멸로 불리는 과정에서 리소좀성 분해에 대한 표적이 된다는 사실에 기인한다. 그러므로 해당 기술분야에는 보다 효과적인 항체 재순환, 예컨대 이중특이성 항체 재순환을 유도하고, 항원에 대한 항체의 특이성 및 친화성을 손상시키지 않으면서 엔도솜 구획에서 항체-항원 복합체의 해리를 촉진함으로써 항체의 분해를 방지하는 방법 및 조성물에 대한 요구가 존재한다.
발명의 요약
한 측면으로, 중성 pH에서 표적 항원에 결합하지만 산성 pH (예컨대 pH 5.0 내지 6.0)에서 동일한 항원의 감소된 결합을 나타내는 항체 또는 항체 가변 도메인을 생성하기 위한 생물학적 시스템이 제공된다. 그 생물학적 시스템은 하나 또는 그 이상의 히스티딘 변형을 포함하는 재배열된 경쇄 서열 (예컨대 재배열된 V-J)을 가지는 비-인간 동물, 예컨대 설치류 (예를 들면 마우스 또는 래트)를 포함한다. 다양한 측면에서, 하나 또는 그 이상의 히스티딘 변형은 경쇄 CDR3 코돈에 있다. 다양한 측면에서, 비-인간 동물은 인간 또는 인간화된 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 다양한 측면으로, 비-인간 동물은 내인성 비-인간 중쇄 가변 유전자 절편의 하나 또는 그 이상의 인간 중쇄 VH, DH 및 JH 절편으로의 대체를 포함하며, 이때 인간 절편은 비-인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결된다. 다양한 측면에서, 비-히스티딘 잔기의 히스티딘 잔기에 대한 치환을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고 있는 보편적인 경쇄를 가지는 비-인간 동물이 제공된다. 다양한 측면에서 이들 히스티딘-변형된 보편적 경쇄 비-인간 동물 (예컨대 설치류, 예를 들면 마우스)은 히스티딘-보편적 경쇄 마우스, 히스티딘-ULC 마우스 또는 HULC 마우스로 언급된다.
그러므로 한 측면으로, 본원에는 그것의 생식선에 인간 VL 및 JL 절편 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공되는데, 이때 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 가변 영역 서열은 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열이다. 한 구체예에서, 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 내인성 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열이다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 기능성 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 결핍되어 있다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 내인성 비-인간 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있다.
한 구체예에서, 동물은 추가로 그것의 생식선에 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 인간 VH, DH 및 JH 절편을 포함하는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 비-인간 중쇄 불변 영역 유전자 서열이다. 한 구체예에서, 비-인간 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 있다.
한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 상보성 결정 영역 (CDR)을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 일어난다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 CDR3을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 일어난다. 한 구체예에서, 치환은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 CDR3 코돈의 치환이다. 한 측면으로, 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 포함된 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 유도된다. 한 구체예에서, 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 절편의 Vκ 서열은 히스티딘 변형이 없다면 생식선 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 서열이다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열로부터 유도되고, Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함한다. 다른 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도되고, Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함한다.
한 측면으로, 본원에 기술된 비-인간 동물은 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배의 해리성 반감기 (t1/ 2)의 감소를 나타내는 항체에 대해 풍부해진 관심의 항원에 대한 반응으로 B 세포들의 집단을 포함한다. 한 구체예에서, 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 t1/2의 감소는 약 30배 또는 그 이상이다. 한 구체예에서, 그런 풍부화는 적어도 약 2배이다.
한 구체예에서, 동물은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열에서 치환된 적어도 하나의 코돈에 의해 코드화된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 비-히스티딘 잔기의 히스티딘 잔기로의 치환을 가지는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현한다. 한 구체예에서, 동물은 체세포성 과돌연변이에도 불구하고, 발현된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 비-히스티딘 잔기의 히스티딘 잔기로의 치환을 보유하는 항체를 발현한다.
한 구체예에서, 비-인간 동물은 포유류이다. 한 구체예에서, 포유류는 설치류, 예컨대 래트 또는 마우스이다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 마우스이다. 그러므로 한 측면으로, 본원에는 또한 그것의 생식선에 인간 VL 및 JL 절편 서열을 포함하는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하고 있는 유전자 변형된 마우스가 제공되며, 이때 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 기능성 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 결핍되어 있다.
한 구체예에서, 마우스의 생식선에 있는 단일한 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 래트 또는 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열로부터 선택된다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열은 마우스 서열이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있다.
추가의 구체예에서, 마우스는 또한 그것의 생식선에 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 인간 VH, DH 및 JH 절편을 포함하는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함한다. 한 측면으로, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 래트 또는 마우스 중쇄 불변 영역 유전자 서열이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 마우스 서열이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 있다.
한 측면으로, 마우스는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는데, 그 치환은 CDR을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 있다. 한 구체예에서, 치환은 CDR3 코돈에서, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 CDR3 코돈에서 일어난다. 한 구체예에서, 마우스의 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 유도된 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는데, 예를 들면 단일한 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열로부터 유도되고, Vκ1-39/Jκ5 유전자 서열은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 그런 대체는 위치 105, 106, 108 및 111에서 히스티딘을 대체하기 위해 디자인된다. 다른 구체예에서, 그런 대체는 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 대체하기 위해 디자인된다.
다른 구체예에서, 단일한 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도되고, Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 그런 대체는 위치 105, 106, 107 및 109에서 히스티딘을 대체하도록 디자인된다. 다른 구체예에서, 그런 대체는 위치 105, 106 및 109에서 히스티딘을 대체하도록 디자인된다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 마우스는 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배의 해리성 반감기 (t1/ 2)의 감소를 나타내는 항체에 대해 풍부해진 관심의 항원에 대한 반응으로 B 세포들의 집단을 포함한다. 한 구체예에서, 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 t1/2의 감소는 약 30배 또는 그 이상이다. 그런 구체예에서, 항체의 그런 풍부화는 적어도 약 2배이다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 마우스는 관심의 항원에 대한 반응으로 항원-특이적 항체의 집단을 발현하는데, 이때 모든 항체는 (a) 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 동일한 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열로부터 유도된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인, 및 (b) 인간 중쇄 V, D 및 J 절편의 레퍼토리로부터 유도된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함한다.
또한 본원에는 인간 VL 및 JL 절편 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 비-인간 유전자좌, 예컨대 마우스 유전자좌가 제공되는데, 이때 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 유전자좌는 비-인간 동물의 생식선에 포함된다. 한 구체예에서, 유전자좌는 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 유도된, 예컨대 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도된 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함한다. 유전자좌에 존재하는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열이 Vκ1-39/Jκ5 서열로부터 유도되는 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 유전자좌에 존재하는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열이 Vκ3-20/Jκ1 서열로부터 유도되는 다른 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 다양한 구체예에서, 본원에 기술된 비-인간 유전자좌는 유전자 변형된 비-인간 동물을 제조하기 위하여 아래에서 설명되는 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
또 다른 측면으로, 본원에는 그것의 생식선에 유전자 변형된 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물의 제조 방법이 제공되는데, 그 방법은 비-인간 동물의 게놈을 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 내인성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 절편을 결실시키거나 비-기능성이 되도록 변형시키고, 그 게놈에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 위치시키는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 그런 방법은 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 항체에 대해 풍부해진 B 세포들의 집단을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물을 유발한다. 한 구체예에서, 게놈에 위치한 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20, 예컨대 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도된다. 그러므로 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열이 Vκ1-39/Jκ5 서열로부터 유도되는 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열이 Vκ3-20/Jκ1 서열로부터 유도되는 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다.
다른 측면으로, 본원에는 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 항체의 제조 방법이 제공되는데, 그 방법은 (a) 본원에 기술된 마우스를 제조하고 (예컨대 인간 VL 및 JL 절편 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역과 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 그것의 재배열된 경쇄 가변 영역 서열에 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 그것의 생식선에 포함하는 마우스), (b) 그 마우스를 관심의 항원으로 면역시키며, (c) 관심의 항원에 중성 pH에서 원하는 친화성으로 결합하는 한편 산성 pH에서는 항원에 대해 감소된 결합을 나타내는 항체를 선택하는 것으로 이루어진다. 한 구체예에서, 그 방법은 산성 pH 및 37℃에서 약 2분 또는 그 미만의 t1/2를 나타내는 항체의 생성을 유발한다. 한 구체예에서, 방법은 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배 감소한 해리성 반감기 (t1/2)를 나타내는 항체의 생성을 유발한다.
또 다른 측면으로, 본원에는 관심의 항원에 pH-의존성 결합을 나타내는 항체를 제조하는 추가의 방법이 제공된다. 그런 한 가지 방법은 (a) 원하는 친화성으로 관심의 항원에 결합하는 제 1 항체를 선택하고, (b) 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하도록 제 1 항체의 면역글로불린 경쇄 뉴클레오티드 서열을 변형시키며, (c) 제 1 항체의 면역글로불린 중쇄 및 변형된 면역글로불린 경쇄를 세포에서 발현시키고, (d) 중성 pH에서 관심의 항원에 대한 원하는 친화성을 보유하는 한편 산성 pH에서 관심의 항원에 대한 감소된 결합을 나타내는, 세포에서 발현된 제 2 항체를 선택하는 것으로 이루어진다. 한 구체예에서, 제 1 항체의 면역글로불린 경쇄 뉴클레오티드 서열은 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 제 1 항체는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열로부터 유도된 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하는 비-인간 동물, 예컨대 마우스에서 생성되고, 면역글로불린 경쇄의 변형은 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 영역에서 이루어진다. 한 구체예에서, 제 1 항체는 추가로 인간 VH, DH 및 JH 절편의 레퍼토리로부터 유도된 면역글로불린 중쇄 서열을 포함하는 비-인간 동물, 예컨대 마우스에서 생성된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 유전자 서열로부터 유도된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열이 Vκ1-39/Jκ5 서열로부터 유도되는 경우에, 제 1 항체의 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열의 변형은 CDR3 코돈의 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 이루어진다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열이 Vκ3-20/Jκ1 서열로부터 유도되는 경우에, 제 1 항체의 면역글로불린 경쇄 뉴클레오티드 서열의 변형은 CDR3 코돈의 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 이루어진다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 항체의 제조 방법은 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배 감소한 해리성 반감기 (t1/ 2)를 나타내는 항체를 유발한다. 한 구체예에서, 항체의 제조 방법은 산성 pH 및 37℃에서 약 2분 또는 그 미만의 t1/2를 나타낸다.
다른 다양한 측면으로, 본원에는 제한된 레퍼토리의 경쇄 가변 유전자 절편, 예컨대 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 마우스 또는 래트 경쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결되어 있는 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편, 비-인간 불변 영역에 작동가능하게 연결되어 있는 하나 또는 그 이상의 인간 DH 및 하나 또는 그 이상의 인간 JH 유전자 절편을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물, 예컨대 마우스가 제공되고; 이때 인간 유전자 절편은 항체의 인간 가변 도메인을 재배열하고 코드화할 수 있으며, 추가로 마우스는 면역글로불린 경쇄를 형성하기 위해 재배열할 수 있는 내인성 VL 유전자 절편을 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 래트 또는 마우스 불변 영역, 예컨대 래트 또는 마우스 Cκ 불변 영역이다. 한 구체예에서, 마우스는 5개의 인간 Jκ 유전자 절편, 예컨대 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5 유전자 절편을 포함한다. 한 구체예에서, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편은 인간 Vκ1-39, Vκ3-20 및 그것들의 조합으로부터 선택되며, 예컨대 2개의 인간 VL 절편은 Vκ1-39 및 Vκ3-20이다. 한 구체예에서, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편은 내인성 경쇄 유전자좌, 예컨대 내인성 카파 경쇄 유전자좌에 존재한다. 한 구체예에서, 마우스는 기능성 λ 경쇄 유전자좌를 포함한다. 다른 구체예에서, 마우스는 비-기능성 λ 경쇄 유전자좌를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 인간 VH, 하나 또는 그 이상의 인간 DH 및 하나 또는 그 이상의 인간 JH 유전자 절편은 마우스 또는 래트 중쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되어 있다.
어떤 구체예에서, 또한 본원에는 제한된 레퍼토리의 인간 가변 유전자 절편을 포함하는 비-인간 유전자좌, 예컨대 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 면역글로불린 불변 영역 서열 (예컨대 비-인간 면역글로불린 불변 영역 서열, 예컨대 래트 또는 마우스 서열)에 작동가능하게 연결되어 있는 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 비-인간 유전자좌가 제공된다. 한 구체예에서, 유전자좌는 5개의 인간 Jκ 유전자 절편, 예컨대 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5 유전자 절편을 포함한다. 한 구체예에서, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편은 Vκ1-39 및 Vκ3-20, 및 그것들의 조합으로부터 선택된다 (예컨대 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편은 Vκ1-39 및 Vκ3-20이다). 다양한 구체예에서, 본원에 기술되는 비-인간 유전자좌들은 유전자 변형된 비-인간 동물을 제조하기 위하여 본 출원을 통틀어 기술되는 방법들을 사용하여 생성될 수 있다. 그러므로, 제한된 레퍼토리의 인간 가변 유전자 절편을 포함하는, 예컨대 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 면역글로불린 불변 영역 서열 (예컨대 비-인간 면역글로불린 불변 영역 서열, 예컨대 래트 또는 마우스 서열)에 작동가능하게 연결되어 있는 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 유전자좌의 제조 방법이 또한 제공된다.
다양한 구체예에서, 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 중 하나와 1, 2, 3, 4 또는 5개의 인간 Jκ 유전자 절편 중 하나의 재배열로부터 생성된 면역글로불린 경쇄를 발현하는 마우스가 제공되는데, 이때 마우스는 하나 또는 그 이상의 인간 면역글로불린 VH, 하나 또는 그 이상의 DH 및 하나 또는 그 이상의 JH 유전자 절편으로의 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 VH 유전자 절편의 대체를 포함하고, 마우스는 (a) λ 경쇄를 가지는 면역글로불린을 발현하는 골수의 B 세포 대 (b) κ 경쇄를 가지는 면역글로불린을 발현하는 골수의 B 세포의, 약 1 내지 약 15의 비율을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 재배열은 인간 Vκ1-39 유전자 절편을 포함한다. 어떤 구체예에서, 재배열은 인간 Vκ3-20 유전자 절편을 포함한다. 어떤 구체예에서, 내인성 면역글로불린 VH 유전자 절편의 대체는 내인성 면역글로불린 VH 유전자좌에서 일어난다. 어떤 구체예에서, 2개의 인간 Vκ 유전자 절편은 내인성 면역글로불린 Vκ 유전자좌에 있고, 어떤 구체예에서, 2개의 인간 Vκ 유전자 절편은 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 면역글로불린 Vκ 유전자 절편을 대체한다. 어떤 구체예에서, 2개의 인간 Vκ 유전자 절편은 내인성 면역글로불린 Vκ 유전자좌에 있고, 어떤 구체예에서, 2개의 인간 Vκ 유전자 절편은 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 면역글로불린 Vκ 및 Jκ 유전자 절편을 대체한다. 다양한 구체예에서, 2개의 인간 Vκ 유전자 절편은 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4, 5개의)의 인간 Jκ 유전자 절편에 작동가능하게 연결된다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 인간 Vκ1-39 유전자 절편 또는 인간 Vκ3-20 유전자 절편과 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 인간 Jκ 유전자 절편 중 하나의 재배열을 통하여 생성된 경쇄를 발현하고, 이때 λ 경쇄를 가지는 면역글로불린을 발현하는 골수의 미성숙 B 세포 대 κ 경쇄를 가지는 면역글로불린을 발현하는 미성숙 B 세포의 비율은 약 1 내지 약 13이다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 인간 Vκ1-39 유전자 절편 또는 인간 Vκ3-20 유전자 절편과 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 인간 Jκ 유전자 절편 중 하나의 재배열을 통하여 생성된 경쇄를 발현하고, 이때 λ 경쇄를 가지는 면역글로불린을 발현하는 골수의 성숙 B 세포 대 κ 경쇄를 가지는 면역글로불린을 발현하는 미성숙 B 세포의 비율은 약 1 내지 약 7이다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 인간 Vκ1-39 유전자 절편 또는 인간 Vκ3-20 유전자 절편 및 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 인간 Jκ 유전자 절편 중 하나의 재배열을 통하여 생성된 경쇄를 발현하고, 약 2.5x104 내지 약 1.5x105 세포의 범위 내에서, 이를테면 예를 들어 약 2.5x104, 3.0x104, 3.5x104, 4.0x104, 4.5x104, 5.0x104, 5.5x104, 6.0x104, 6.5x104, 7.0x104, 7.5x104, 8.0x104, 8.5x104, 9.0x104, 9.5x104, 1.0x105 또는 1.5x105 세포의 골수의 프로 B 세포들의 집단을 가지며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 2.88x104 세포의 골수의 프로 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 6.42x104 세포의 골수의 프로 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 9.16x104 세포의 골수의 프로 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.19x104 세포의 골수의 프로 B 세포들의 집단을 포함한다. 본원에서 기술되는 유전자 변형된 마우스의 골수의 예시적인 프로 B 세포는 CD19, CD43, c-kit 및/또는 그것들의 조합 (예컨대 CD19+, CD43+, c-kit+)의 발현을 특징으로 한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 인간 Vκ1-39 유전자 절편 또는 인간 Vκ3-20 유전자 절편과 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 인간 Jκ 유전자 절편 중 하나의 재배열을 통하여 생성된 경쇄를 발현하고, 약 1x106 내지 약 2x106 세포의 범위 내에서, 이를테면 예를 들어 약 1.0x106, 1.1x106, 1.2x106, 1.3x106, 1.4x106, 1.5x106, 1.6x106, 1.7x106, 1.8x106, 1.9x106 또는 2.0x106 세포의 골수의 프레 B 세포들의 집단을 가지며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.25x106 세포의 골수의 프레 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.46x106 세포의 골수의 프레 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.64x106 세포의 골수의 프레 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 2.03x106 세포의 골수의 프레 B 세포들의 집단을 포함한다. 본원에서 기술되는 유전자 변형된 마우스의 골수의 예시적인 프레 B 세포는 CD19, CD43, c-kit 및/또는 그것들의 조합 (예컨대 CD19+, CD43+, c-kit+)의 발현을 특징으로 한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 인간 Vκ1-39 유전자 절편 또는 인간 Vκ3-20 유전자 절편과 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 인간 Jκ 유전자 절편 중 하나의 재배열을 통하여 생성된 경쇄를 발현하고, 약 5x105 내지 약 7x105 세포의 범위 내에서, 이를테면 예를 들어 약 5.0x105, 5.1x105, 5.2x105, 5.3x105, 5.4x105, 5.5x105, 5.6x105, 5.7x105, 5.8x105, 5.9x105, 6.0x105, 6.1x105, 6.2x105, 6.3x105, 6.4x105, 6.5x105, 6.6x105, 6.7x105, 6.8x105, 6.9x105 또는 7.0x105 세포의 골수의 미성숙 B 세포들의 집단을 가지며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 5.33x105 세포의 골수의 미성숙 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 5.80x105 세포의 골수의 미성숙 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 5.92x105 세포의 골수의 미성숙 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 6.67x105 세포의 골수의 미성숙 B 세포들의 집단을 포함한다. 본원에서 기술되는 유전자 변형된 마우스의 골수의 예시적인 미성숙 B 세포는 IgM, B220 및/또는 그것들의 조합 (예컨대 IgM+, B220int)의 발현을 특징으로 한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 인간 Vκ1-39 유전자 절편 또는 인간 Vκ3-20 유전자 절편과 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 인간 Jκ 유전자 절편 중 하나의 재배열을 통하여 생성된 경쇄를 발현하고, 약 3x104 내지 약 1.5x105 세포의 범위 내에서, 이를테면 예를 들어 약 3.0x104, 3.5x104, 4.0x104, 4.5x104, 5.0x104, 5.5x104, 6.0x104, 6.5x104, 7.0x104, 7.5x104, 8.0x104, 8.5x104, 9.0x104, 9.5x104, 1.0x105 또는 1.5x105 세포의 골수의 성숙 B 세포들의 집단을 가지며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 3.11x104 세포의 골수의 성숙 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.09x105 세포의 골수의 성숙 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.16x105 세포의 골수의 성숙 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.44x105 세포의 골수의 성숙 B 세포들의 집단을 포함한다. 본원에서 기술되는 유전자 변형된 마우스의 골수의 예시적인 성숙 B 세포는 IgM, B220 및/또는 그것들의 조합 (예컨대 IgM+, B220hi)의 발현을 특징으로 한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 인간 Vκ1-39 유전자 절편 또는 인간 Vκ3-20 유전자 절편과 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 인간 Jκ 유전자 절편 중 하나의 재배열을 통하여 생성된 경쇄를 발현하고, 약 1x106 내지 약 3x106 세포의 범위 내에서, 이를테면 예를 들어 약 1.0x106, 1.1x106, 1.2x106, 1.3x106, 1.4x106, 1.5x106, 1.6x106, 1.7x106, 1.8x106, 1.9x106, 2.0x106, 2.1x106, 2.2x106, 2.3x106, 2.4x106, 2.5x106, 2.6x106, 2.7x106, 2.8x106, 2.9x106 또는 2.0x106 세포의 골수의 총 B 세포들의 집단을 가지며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.59x106 세포의 골수의 총 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.75x106 세포의 골수의 총 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 2.13x106 세포의 골수의 총 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 2.55x106 세포의 골수의 총 B 세포들의 집단을 포함한다. 본원에서 기술되는 유전자 변형된 마우스의 골수의 예시적인 총 B 세포는 CD19, CD20 및/또는 그것들의 조합 (예컨대 CD19+)의 발현을 특징으로 한다.
어떤 구체예에서, 재배열된 인간 면역글로불린 Vκ/Jκ 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현하는 유전자 변형된 마우스가 제공되고, 이때 마우스는 기능성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌를 포함하며, 마우스는 약 1 내지 약 8; 어떤 구체예에서 약 1 내지 약 5인, Ig+ B 세포 대 Ig+ B 세포의 비율을 포함하는 비장의 B 세포들의 집단을 포함한다. 어떤 구체예에서, 재배열된 인간 면역글로불린 Vκ/Jκ 서열은 2개의 인간 면역글로불린 Vκ 유전자 절편 중 하나와 1, 2, 3, 4 또는 5개의 인간 면역글로불린 Jκ 유전자 절편 중 하나의 재배열을 통해 생성된다. 어떤 구체예에서, 재배열된 인간 면역글로불린 Vκ/Jκ 서열은 인간 면역글로불린 Vκ1-39 유전자 절편과 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 및 그것들의 조합으로부터 선택된 인간 면역글로불린 Jκ 유전자 절편의 재배열을 통해 생성된다. 어떤 구체예에서, 재배열된 인간 면역글로불린 Vκ/Jκ 서열은 인간 면역글로불린 Vκ3-20 유전자 절편과 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 및 그것들의 조합으로부터 선택된 인간 면역글로불린 Jκ 유전자 절편의 재배열을 통해 생성된다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 2x106 내지 약 7x106 세포의 범위 내에서, 이를테면 예를 들어 약 2.0x106, 2.5x106, 3.0x106, 3.5x106, 4.0x106, 4.5x106, 5.0x106, 5.5x106, 6.0x106, 6.5x106 또는 7.0x106 세포의 CD19+ 비장 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 2.74x106 세포의 CD19+ 비장 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 4.30x106 세포의 CD19+ 비장 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 5.53x106 세포의 CD19+ 비장 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 6.18x106 세포의 CD19+ 비장 B 세포들의 집단을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1x106 내지 약 4x106 세포의 범위 내에서, 이를테면 예를 들어 약 1.0x106, 1.5x106, 2.0x106, 2.5x106, 3.0x106, 3.5x106, 4.0x106 세포의 CD19+, IgDhi, IgMlo 비장 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.30x106 세포의 CD19+, IgDhi, IgMlo 비장 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 2.13x106 세포의 CD19+, IgDhi, IgMlo 비장 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 3.15x106 세포의 CD19+, IgDhi, IgMlo 비장 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 3.93x106 세포의 CD19+, IgDhi, IgMlo 비장 B 세포들의 집단을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 9x105 내지 약 2x106 세포의 범위 내에서, 이를테면 예를 들어 약 9.0x105, 9.25x105, 9.5x105, 9.75x105, 1.0x106, 1.25x106, 1.50x106, 1.75x106, 2.0x106 세포의 CD19+, IgDlo, IgMhi 비장 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 9.52x105 세포의 CD19+, IgDlo, IgMhi 비장 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.23x106 세포의 CD19+, IgDlo, IgMhi 비장 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.40x106 세포의 CD19+, IgDlo, IgMhi 비장 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.42x106 세포의 CD19+, IgDlo, IgMhi 비장 B 세포들의 집단을 포함한다.
어떤 구체예에서, 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 마우스는 2개의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 Vκ 유전자 절편 및 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 재배열되지 않은 인간 Jκ 유전자 절편을 포함하는 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 여기서 그 마우스는 면역글로불린 κ 경쇄 V 및 J 유전자 절편의 야생형 보충물을 포함하는 마우스와 거의 동일한 이행 (예컨대 T1, T2 및 T3) B 세포들의 집단을 포함하는 말초 비장 B 세포들의 집단을 포함한다. 본원에서 기술되는 유전자 변형된 마우스의 비장의 예시적인 이행 B 세포들의 집단 (예컨대 T1, T2 및 T3)은 IgM, CD23, CD93, B220 및/또는 그것들의 조합의 발현을 특징으로 한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 2x106 내지 약 7x106 세포의 범위 내에서, 이를테면 예를 들어 약 2.0x106, 2.5x106, 3.0x106, 3.5x106, 4.0x106, 4.5x106, 5.0x106, 5.5x106, 6.0x106, 6.5x106 또는 7.0x106 세포의 비장의 T1 B 세포들의 집단 (예컨대 CD93+, B220+, IgMhi, CD23-)을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 2.16x106 세포의 비장의 T1 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 3.63x106 세포의 비장의 T1 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 3.91x106 세포의 비장의 T1 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 6.83x106 세포의 비장의 T1 B 세포들의 집단을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1x106 내지 약 7x106 세포의 범위 내에서, 이를테면 예를 들어 약 1.0x106, 1.5x106, 2.0x106, 2.5x106, 3.0x106, 3.5x106, 4.0x106, 4.5x106, 5.0x106, 5.5x106, 6.0x106, 6.5x106 또는 7.0x106 세포의 비장의 T2 B 세포들의 집단 (예컨대 CD93+, B220+, IgMhi, CD23+)을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.30x106 세포의 비장의 T2 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 2.46x106 세포의 비장의 T2 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 3.24x106 세포의 비장의 T2 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 6.52x106 세포의 비장의 T2 B 세포들의 집단을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1x106 내지 약 4x106 세포의 범위 내에서, 이를테면 예를 들어 약 1.0x106, 1.5x106, 2.0x106, 2.5x106, 3.0x106, 3.5x106 또는 4.0x106 세포의 비장의 T3 B 세포들의 집단 (예컨대 CD93+, B220+, IgMlo, CD23+)을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.08x106 세포의 비장의 T3 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.35x106 세포의 비장의 T3 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 3.37x106 세포의 비장의 T3 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 3.63x106 세포의 비장의 T3 B 세포들의 집단을 포함한다.
어떤 구체예에서, 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 마우스는 2개의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 Vκ 유전자 절편 및 1, 2, 3, 4 또는 5개의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 Jκ 유전자 절편을 포함하는 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 마우스는 면역글로불린 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 야생형 보충물을 포함하는 마우스와 거의 동일한 변연 지대 및 변연 지대 전구체 B 세포들의 집단을 포함하는 말초 비장 B 세포들의 집단을 포함한다. 본원에서 기술되는 유전자 변형된 마우스의 비장의 예시적인 변연 지대 B 세포들의 집단은 IgM, CD21/35, CD23, CD93, B220 및/또는 그것들의 조합의 발현을 특징으로 한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1x106 내지 약 3x106 세포의 범위 내에서, 이를테면 예를 들어 약 1.0x106, 1.5x106, 2.0x106, 2.5x106 또는 3.0x106 세포의 비장의 변연 지대 B 세포들의 집단 (예컨대 CD93-, B220+, IgMhi, CD21/35hi, CD23-)을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.47x106 세포의 비장의 변연 지대 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.49x106 세포의 비장의 변연 지대 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 2.26x106 세포의 비장의 변연 지대 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 2.33x106 세포의 비장의 변연 지대 B 세포들의 집단을 포함한다.
어떤 구체예에서, 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 그 마우스는 2개의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 Vκ 유전자 절편 및 1, 2, 3, 4 또는 5개의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 Jκ 유전자 절편을 포함하는 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌를 포함하고, 마우스는 면역글로불린 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 야생형 보충물을 포함하는 마우스와 거의 동일한 여포성 (예컨대 FO-I 및 FO-II) B 세포들의 집단 (들)을 포함하는 말초 비장 B 세포들의 집단을 포함한다. 본원에서 기술되는 유전자 변형된 마우스의 비장의 예시적인 여포성 B 세포들의 집단 (예컨대 FO-I 및 FO-II)은 IgM, IgD, CD21/35, CD93, B220 및/또는 그것들의 조합의 발현을 특징으로 한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 3x106 내지 약 1.5x107 세포의 범위 내에서, 이를테면, 예를 들어 약 3.0x106, 3.5x106, 4.0x106, 4.5x106, 5.0x106, 5.5x106, 6.0x106, 6.5x106, 7.0x106, 7.5x106, 8.0x106, 8.5x106, 9.0x106, 9.5x106, 1.0x107 또는 1.5x107 세포의 비장의 1 여포형 B 세포들의 집단 (예컨대 CD93-, B220+, CD21/35int, IgMlo, IgDhi)을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 3.57x106 세포의 비장의 1 여포형 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 6.31x106 세포의 비장의 1 여포형 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 9.42x106 세포의 비장의 1 여포형 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.14x107 세포의 비장의 1 여포형 B 세포들의 집단을 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1x106 내지 약 2x106 세포의 범위 내에서, 이를테면, 예를 들어 1.0x106, 1.25x106, 1.5x106, 1.75x106 또는 2.0x106 세포의 비장의 2 여포형 B 세포들의 집단 (예컨대 CD93-, B220+, CD21/35int, IgMint, IgDhi)을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.14x106 세포의 비장의 2 여포형 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.45x106 세포의 비장의 2 여포형 B 세포들의 집단을 포함하며; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 1.80x106세포의 비장의 2 여포형 B 세포들의 집단을 포함하고; 어떤 구체예에서, 본 발명의 마우스는 약 2.06x106 세포의 비장의 2 여포형 B 세포들의 집단을 포함한다.
어떤 다른 다양한 구체예에서, 본원에는 또한 그것의 생식선에 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공되며, 이때 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편은 각각 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편은 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 재배열하고 코드화할 수 있다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 면역글로불린 경쇄를 형성하기 위하여 재배열할 수 있는 내인성 VL 유전자 절편을 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열은 비-인간 경쇄 불변 영역 서열, 즉 내인성 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열, 예컨대 래트 또는 마우스 서열이다. 한 구체예에서, 동물은 추가로 그것의 생식선에, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 인간 VH, DH 및 JH 유전자 절편을 포함하는 재배열되지 않은 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함한다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 비-인간 중쇄 불변 영역 서열, 즉 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열, 예컨대 래트 또는 마우스 서열이다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편은 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 존재한다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역은 Cκ 영역이다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 그 치환은 CDR3 코돈(들), 예컨대 3 또는 4개의 비-히스티딘 코돈에서 일어난다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편은 2개의 인간 VL 유전자 절편, 예컨대 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편이다. 한 구체예에서, 동물은 설치류, 예컨대 래트 또는 마우스이다. 한 구체예에서, 동물은 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편에 의해 코드화된 아미노산 서열을 포함하는 항체를 발현하고 그 항체는 인간 VL 유전자 절편의 적어도 하나의 히스티딘 코돈에 의해 코드화된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 보유한다.
한 구체예에서, 본원에는 또한 그것의 생식선에 제한된 레퍼토리의 인간 경쇄 가변 영역 유전자 절편들, 예컨대 제한된 레퍼토리의 인간 VL 및 JL 유전자 절편들을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공되며, 이때 인간 경쇄 가변 유전자 절편의 제한된 레퍼토리는 해당하는 인간 생식선 서열에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함한다. 한 구체예에서, 본원에는 그것의 생식선에 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공되며, 이때 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편의 각각은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함한다. 한 구체예에서, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편은 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 한 구체예에서, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편은 Vκ 및 Jκ 유전자 절편이다. 다양한 구체예에서, 인간 VL 유전자 절편 및 인간 JL 유전자 절편은 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 재배열하고 코드화할 수 있다. 한 구체예에서, 동물은 면역글로불린 경쇄를 형성하기 위하여 재배열할 수 있는 내인성 VL 유전자 절편을 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열은 비-인간 면역글로불린 불변 영역 서열, 예컨대 설치류 서열, 예컨대 마우스 또는 래트 서열이다. 한 구체예에서, 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열은 내인성 서열이다. 다른 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열은 인간 서열이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열은 Cκ 서열이다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 추가로 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 인간 VH, DH 및 JH 유전자 절편을 포함하는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 그것의 생식선에 포함한다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열, 예컨대 설치류 서열, 예컨대 래트 또는 마우스 서열이다. 한 구체예에서, 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열이다. 한 구체예에서, 중쇄 불변 영역 서열은 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열이다. 한 구체예에서, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편은 내인성 비-인간 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 존재한다.
한 구체예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편을 포함하고, 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 JL 유전자 절편은 5개의 인간 Jκ 절편, 예컨대 인간 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5 유전자 절편이다. 한 구체예에서, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편 및 그것들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편이다. 한 구체예에서, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편의 각각은 해당하는 인간 생식선 VL 절편 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 치환은 1, 2, 3 또는 4개의 코돈 (예컨대 3 또는 4개의 코돈)의 치환이다. 한 구체예에서, 치환은 CDR3 코돈(들)에서 일어난다. 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편이 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편인 구체예에서, 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편의 각각은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편의 각각은 3 또는 4개의 히스티딘 코돈의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 3 또는 4개의 치환은 CDR3 영역에서 일어난다. 치환이 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 3개의 비-히스티딘 코돈의 치환인 구체예에서, 치환은 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 치환이 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 4개의 비-히스티딘 코돈의 치환인 다른 구체예에서, 치환은 위치 105, 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 치환이 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 3개의 비-히스티딘 코돈의 치환인 또 다른 구체예에서, 치환은 위치 105, 106 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 치환이 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 4개의 비-히스티딘 코돈의 치환인 또 다른 구체예에서, 치환은 위치 105, 106, 107 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트이다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 마우스이다. 한 구체예에서, 동물은 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 중 하나에 의해 코드화된 아미노산을 포함하는 항체를 발현하고, 그 항체는 인간 VL 유전자 절편에 도입된 적어도 하나의 히스티딘 코돈에 의해 코드화된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 보유한다. 한 구체예에서, 동물은 항원에 대한 반응으로 항원-특이적 항체들의 집단을 발현하는데, 이때 그 집단의 모든 항체는 (a) 2개 이하의 VL 유전자 절편과 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 JL 유전자 절편의 재배열로부터 유도된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인, 여기서 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편의 각각은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하며, 및 (b) 인간 중쇄 V, D 및 J 절편의 레퍼토리로부터 유도된 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함한다.
한 구체예에서, 본원에 기술되는 동물은 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 해리성 반감기 (t1/ 2)의, 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배의 감소를 나타내는 항체들에 대해 풍부화된 관심의 항원에 대한 반응으로 B 세포들의 집단을 포함한다. 한 구체예에서, t1/2의 감소를 나타내는 항체에서 그런 풍부화는 적어도 약 2배이다.
또한 본원에는 본원에 기술되는 비-인간 동물 (예컨대 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 비-인간 동물; 예컨대 제한된 레퍼토리의 인간 경쇄 가변 영역 유전자 절편을 포함하는 비-인간 동물; 예컨대 생식선에 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물 - 여기서 상기 동물의 생식선에 존재하는 인간 VL 유전자 절편의 각각은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함한다)을 제조하는 단계, 상기 동물을 관심의 항원으로 면역시키는 단계 및 중성 pH에서 바람직한 친화성으로 항원에 결합하는 한편 산성 pH에서 관심의 항원에 대해 감소된 결합을 나타내는 항체를 선택하는 단계를 포함하는, 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 항체의 제조 방법이 제공된다.
본원에는 또한 생식선에 유전자 변형된 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물의 제조 방법이 제공되는데, 그 방법은 (a) 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 내인성 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 절편이 결실되거나 비-기능성이 되도록 비-인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계 및 (b) 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열이 면역글로불린 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되도록 비-인간 동물의 게놈에 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편과 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 배치하는 단계를 포함하고; 이때 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편은 각각 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 VL 유전자 절편(들) 및 JL 유전자 절편(들)은 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 재배열하고 코드화할 수 있다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 내인성 비-인간 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편은 2개의 인간 VL 유전자 절편이고, 이때 2개의 인간 VL 유전자 절편은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편이다. 어떤 구체예에서, 비-인간 동물은 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트이다. 한 구체예에서, 이 방법은 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 항체에 대해 풍부화된 B 세포들의 집단을 포함하는 비-인간 동물을 초래한다.
어떤 구체예에서, 본원에는 또한 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편 및 면역글로불린 불변 영역서열에 작동가능하게 연결되어 있는 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 비-인간 면역글로불린 경쇄 유전자좌가 제공되는데, 이때 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편은 각각 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함한다. 어떤 구체예에서, 또한 제한된 레퍼토리의 인간 가변 유전자 절편을 포함하는 비-인간 면역글로불린 경쇄 유전자좌, 예컨대 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 면역글로불린 불변 영역서열 (예컨대 비-인간 면역글로불린 불변 영역 서열, 예컨대 래트 또는 마우스 서열)에 작동가능하게 연결되어 있는 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 비-인간 유전자좌가 제공되고, 이때 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편은 각각 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함한다. 한 구체예에서, 유전자좌는 5개의 인간 Jκ 유전자 절편, 예컨대 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5 유전자 절편을 포함한다. 한 구체예에서, 히스티딘 변형을 가지는 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편은 Vκ1-39 및 Vκ3-20이다. 다양한 구체예에서, 본원에 기술되는 비-인간 유전자좌는 유전자 변형된 비-인간 동물을 만들기 위해 본 출원을 통틀어 기술된 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 그러므로, 적어도 하나의 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 JL 유전자 절편을 포함하거나; 제한된 레퍼토리의 인간 가변 유전자 절편을 포함하거나; 또는 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 면역글로불린 불변 영역 서열 (예컨대 비-인간 면역글로불린 불변 영역 서열, 예컨대 래트 또는 마우스 서열)에 작동가능하게 연결되어 있는 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편을 포함하고, 이때 각각의 인간 VL 유전자 절편은 해당하는 인간 생식선 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 제조 방법이 또한 제공된다.
본원에 기술된 어떠한 구체예 및 측면이든지 다르게 표시되거나 맥락으로부터 벗어나지 않는 한, 상호 결합하여 사용될 수 있다. 다른 구체예들도 다음의 설명으로부터 당업자들에게 명백해질 것이다.
도 1은 다양한 항원-특이적 항체 (A 내지 K 항체, 각각 SEQ ID NO:136 내지 146에 해당함)로부터의 인간 Vκ1-39-유도된 경쇄의 아미노산 배열을 도시한다. 각각의 경쇄 서열 내에 위치한 히스티딘(H) 잔기는 진하게 표시된다. 다양한 경쇄 영역 (프레임워크 및 CDR)은 배열 위에 표시된다.
도 2는 돌연변이생성에 의하여 인간 Vκ1-39-유도된 경쇄의 CDR3 영역에 공학적으로 도입된 히스티딘 잔기의 조합 및 위치를 도시한다. 돌연변이생성을 통하여 도입된 히스티딘 잔기와 해당하는 핵산 잔기는 진하게 표시된다. 아미노산 위치 (105, 106 등)는 Lefranc et al. (2003) Dev. Copm. Immunol. 27:55-77에 기술된 독특한 넘버링을 토대로 하고, 국제 면역유전학 정보 시스템 (IMGT)의 웹사이트 상에서도 볼 수 있다.
도 3은 5개 (1 내지 5)의 상이한 중쇄 및 CDR3의 표시된 위치 (X축 참조)에서 공학적으로 도입된 히스티딘 잔기를 가지는 Vκ1-39-유도된 경쇄를 코드화하는 핵산으로 형질전환된 CHO 세포의 상층액에서 검출된, ng/mL로 표시되는 항체 발현의 수준을 도시한다.
도 4는 CHO 세포 상층액에서 히스티딘 엔지니어링된 경쇄를 함유하는 선택된 항원-특이적 인간 항체의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 5a 내지 도 5e는 중성 (7.4) 및 산성 (5.75) pH에서 다양한 히스티딘 엔지니어링된 경쇄와 짝을 이룬 항원-특이적 항체로부터 선택된 중쇄 (1 내지 5)에 대한 결합 동역학을 나타낸다. ka, kd, kD 및 t1/2를 포함한 다양한 동역학적 매개변수가 도시된다. NB=결합 없음.
도 6은 표시된 중쇄 (2, 3 및 6)와 짝을 이룬 원래의 보편적 경쇄 또는 히스티딘-변형된 보편적 경쇄를 포함하는 항체에 대한 동역학적 매개변수 (KD 및 t1/ 2)를 도시한다. 히스티딘 치환은 여러 항체에서 강력한 pH 의존성을 유도한다. 히스티딘 치환은 서열 105QQSYSTP111 (SEQ ID NO:3)을 괄호 안의 히스티딘 변형된 CDR3서열로 반전시키기 위하여 CDR3에서 이루어졌다. NB=검출할만한 결합 없음 (KD>10마이크로몰).
도 7은 재배열된 인간 Vκ1-39/Jκ5 경쇄 서열의 CDR3에 히스티딘 잔기를 공학적으로 도입하기 위해 사용된 선택된 돌연변이생성 프라이머의 서열 및 특성 (%GC 함량, N, % 미스매치, Tm)을 도시한다. 서열 목록에서 사용된 이들 프라이머에 대한 SEQ ID NO는 아래의 표에 포함된다. F=전방 프라이머, R=역프라이머.
도 8a 내지 도 8b는 변형된 인간 경쇄를 함유하는 항체를 발현하는 유전자 변형된 마우스를 제조하기 위하여 Vκ1-39/Jκ5 가변 영역으로부터 유도된 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 서열로 히스티딘 잔기를 공학적으로 도입하기 위한 표적화 벡터의 구성을 위한 일반적인 전략을 도시한다. 도 8c 내지 도 8d는 ES 세포 안으로의 ULC-H105/106/108/111 치환과 그것으로부터 이형접합성 마우스를 생성하기 위한 표적화 벡터의 도입을 도시하는 한편; 도 8e 내지 도 8f는 ES 세포 안으로의 ULC-H106/108/111 치환과 그것으로부터 이형접합성 마우스를 생성하기 위한 표적화 벡터의 도입을 도시한다. 도면은 실제 크기로 제시되지 않는다. 다른 표시가 없는 한, 진한 도형과 실선은 마우스 서열을 나타내고, 하얀 도형과 이중선은 인간 서열을 나타낸다.
도 9는 히스티딘 보편적 경쇄 (HULC)(4개의 His 치환 포함-HULC 1927 마우스; 3개의 His 치환 포함-HULC 1930 마우스)와 제 2 출혈시 야생형 동물에 대한 이형접합성 마우스로부터의 면역원에 대한 항혈청을 도시한다.
도 10은 총 항원 포지티브 클론의 수 및 이형접합성 HULC (1927 대 1930) 및 WT 마우스로부터의 하이브리도마 융합으로부터 얻어진 pH 민감성 항원을 나타내는 항원 포지티브 클론의 수를 비교한다. 도면은 각 마우스 유형에 대하여 두 마리씩의 마우스에 대한 데이터를 포함한다 ("마우스 1" 및 "마우스 2").
도 11a 내지 도 11c는 각각의 이형접합성 HULC 또는 WT 마우스 중 어느 하나로부터의 단클론성 항체 (AA, BB, CC, DD, HH, GG, NN 및 OO)가 중성 pH (pH 7.4)에서 면역원과 결합하도록 허용되고 이어서 해리 단계를 위해 7.4 또는 6.0의 어느 하나의 pH를 가지는 완충액에 시프트되는 표면 플라스몬 공명 결합 실험으로부터의 센서그램을 도시한다. 각 그래프에서 개별적인 라인은 각각의 항체의 상이한 농도에서 결합 반응을 나타낸다. 모든 실험은 25℃에서 수행되었다. 해리성 반감기 값 (t1/2)은 각각의 센서그램 위에 표시되고, t1/2의 배수 변화는 각 센서그램의 우측에 포함된다. 항체 AA, BB, SS, DD, HH 및 GG는 His-치환된 경쇄를 사용하여 이형접합성 HULC 1927 마우스로부터 유래하였고, NN은 WT 경쇄를 사용하여 이형접합성 HULC 1927 마우스로부터 유래하였으며, OO는 WT 마우스로부터 유래한다 (명확한 것은 표 4 참조).
도 12는 돌연변이생성에 의해 인간 Vκ3-20-유도된 경쇄의 CDR3 영역에 공학적으로 도입된 히스티딘 잔기의 위차를 도시한다. 돌연변이생성을 통해 도입된 히스티딘 잔기와 해당하는 예시적인 핵산 잔기는 진하게 표시된다. 아미노산 위치 (105, 106 등)는 Lefranc et al. (2003) Dev. Copm. Immunol. 27:55-77에 기술된 독특한 넘버링을 토대로 하고, 국제 면역유전학 정보 시스템 (IMGT)의 웹사이트 상에서도 볼 수 있다.
도 13은 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1 경쇄 서열의 CDR3에 히스티딘 잔기를 공학적으로 도입하기 위해 사용된 선택된 돌연변이생성 프라이머의 서열 및 특성 (%GC 함량, N, % 미스매치, Tm)을 도시한다. 서열 목록에서 사용된 이들 프라이머에 대한 SEQ ID NO는 아래의 표에 포함된다. F=전방 프라이머, R=역프라이머.
도 14a 내지 도 14b는 변형된 인간 경쇄를 함유하는 항체를 발현하는 유전자 변형된 마우스를 제조하기 위하여 Vκ3-20/Jκ1 경쇄 가변 영역으로부터 유도된 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 서열에 히스티딘 잔기를 공학적으로 도입하기 위한 표적화 벡터의 구성을 위한 일반적인 전략을 도시한다. 도 14c는 ES 세포 안에 ULC-Q105H/Q106H/Y107H/S109H 치환을 위한 표적화 벡터의 도입과 그것으로부터 이형접합성 마우스의 생성을 도시하고; 한편 도 14d는 ES 세포 안에 ULC-Q105H/Q106H/S109H 치환을 위한 표적화 벡터의 도입과 그것으로부터 이형접합성 마우스의 생성을 도시한다. 다이아그램은 실제 크기로 제시되지 않는다. 다르게 표시되지 않는 한, 진한 도형 및 실선은 마우스 서열을 나타내고, 하얀 도형 및 이중선은 인간 서열을 나타낸다.
도 15는 재배열 전 (상부) 및 재배열 후 (하부)의 마우스의 면역글로불린 κ 경쇄 대립유전자의 V 및 J 유전자 절편과 경쇄 유전자좌의 구조의 재조합을 일반적으로 도시한다. 이 도면에 도시된 재배열은 단지 여러 가지 가능한 재배열 사건들 중 하나이다. 도표는 실제 크기로 제시되지 않는다.
도 16a는 재배열된 인간 Vκ1-39/Jκ5 가변 영역 서열을 포함하는 보편적 경쇄 유전자좌 (상부), 재배열된 인간 Vκ3-20/Jκ1 가변 영역 서열을 포함하는 보편적 경쇄 유전자좌 (하부)의 두 가지 보편적 경쇄 유전자좌를 개략적으로 도시한다. 도표는 실제 크기로 제시되지 않는다. 다르게 표시되지 않는 한, 검은색 모양은 마우스 서열을 나타내고, 흰색 모양은 인간 서열을 나타낸다. 도 16b는 2개의 유전자 변형된 이중 경쇄 (DLC) 유전자좌의 실례를 도시한다. 상부의 유전자좌 (DLC-5J)는 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편을 함유하는 엔지니어링된 인간 DNA 절편을 함유한다. 하부의 유전자좌 (DLC-1J)는 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 및 1개의 인간 Jκ 유전자 절편을 함유하는 엔지니어링된 인간 DNA 절편을 함유한다. 각 유전자좌는 내인성 경쇄 불변 영역 (예컨대 Cκ)에 작동가능하게 연결되어 있는 인간 Vκ 영역을 형성하기 위해 재배열될 수 있다. 면역글로불린 프로모터 (P, 유전자좌 위의 흰색 화살표), 리더 엑손 (L, 짧은 흰색 화살표) 및 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 (긴 흰색 화살표)이 도시되는데, 모두 Frt 재조합 부위를 함유하고 있는 네오마이신 카세트가 상류 쪽으로 옆에 있다 (5'). 인간 유전자 절편들 각각 (Vκ 및 Jκ)을 사용하여 엔지니어링된 재조합 신호 서열들은 각각의 유전자 절편과 나란히 놓여있는 흰색 타원형으로 표시된다. DLC-5J 유전자좌는 5개의 Jκ 유전자 절편들 각각과 나란히 놓여있는 RSS를 함유한다. 대부분의 구체예에서, 다르게 표시되지 않는 한, 검은색 모양들과 실선은 마우스 서열을 나타내고, 흰색 모양들과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. 도표는 실제 크기로 제시되지 않는다.
도 17a 내지 17c는 2개의 인간 Vκ 절편 (hVκ1-39 및 hVκ3-20) 및 하나의 인간 Jκ 절편 (Jκ5), 뿐만 아니라 마우스 인핸서 및 IgκC 아암을 포함하는 면역글로불린 카파 유전자좌의 엔지니어링을 위한 표적화 벡터의 구성을 위한 일반적인 전략을 도시한다. 도 17d는 이 표적화 벡터의 ES 세포 안으로의 도입 및 그것을 사용한 이형접합 마우스의 제조를 도시하는 한편; 도 17e는 ES 세포에서의 FLP 효소를 사용한 선택 카세트의 결실을 도시한다. 대부분의 구체예에서, 다르게 표시되지 않는 한, 검은색 모양들과 실선은 마우스 서열을 나타내고, 흰색 모양들과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. 도표는 실제 크기로 제시되지 않는다.
도 18a 내지 18d는 2개의 인간 Vκ 절편 (hVκ1-39 및 hVκ3-20) 및 하나의 인간 Jκ 절편 (Jκ5)을 포함하는 면역글로불린 κ 유전자좌의 엔지니어링된 부분의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:82)을 도시하고; 이때 뉴클레오티드 서열은 엔지니어링된 인간 서열에 걸쳐있고 5' 및 3' 양 단부에 약 100 염기쌍의 내인성 마우스 서열을 포함한다. 도 18d의 하부는 다양한 서열을 도시하기 위해 사용된 상이한 폰트를 설명한다.
도 19a 및 19b는 2개의 인간 Vκ 절편 (hVκ1-39 및 hVκ3-20) 및 5개의 인간 Jκ 절편을 포함하는 면역글로불린 카파 유전자좌, 뿐만 아니라 마우스 인핸서 및 IgκC 아암의 엔지니어링을 위한 표적화 벡터의 구성을 위한 일반적인 전략을 도시한다. 도 19c는 이 표적화 벡터의 ES 세포 안으로의 도입 및 그것을 사용한 이형접합 마우스의 제조를 도시하는 한편; 도 17e는 ES 세포에서의 FLP 효소를 사용한 선택 카세트의 결실을 도시한다. 대부분의 구체예에서, 다르게 표시되지 않는 한, 검은색 모양들과 실선은 마우스 서열을 나타내고, 흰색 모양들과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. 도표는 실제 크기로 제시되지 않는다.
도 20a 내지 20d는 2개의 인간 Vκ 절편 (hVκ1-39 및 hVκ3-20) 및 5개의 인간 Jκ 절편을 포함하는 엔지니어링된 면역글로불린 κ 유전자좌의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:83)을 도시하고; 이때 뉴클레오티드 서열은 엔지니어링된 서열에 걸쳐있고 5' 및 3' 양 단부에 약 100 염기쌍의 내인성 마우스 서열을 포함한다. 도 20d의 하부는 다양한 서열을 도시하기 위해 사용된 상이한 폰트를 설명한다.
도 21a는, 상부 패널에서, 야생형 마우스 (WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J)로부터의 B 및 T 세포 (각각 CD19+ 및 CD3+)에 대해 염색된 골수의 대표적인 등고선 선도를 도시한다. 하부 패널은 야생형 마우스 (WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J)로부터의 CD19+ 상에 게이팅된 및 ckit+ 및 CD43+에 대해 염색된 골수의 대표적인 등고선 선도를 도시한다. Pro 및 Pre B 세포가 하부 패널의 등고선 선도 상에 표시된다.
도 21b는 야생형 마우스 (WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J)의 대퇴골로부터 회수된 골수의 Pro (CD19+CD43+ckit+) 및 Pre (CD19+CD43-ckit-) B 세포의 수를 도시한다.
도 22a는 야생형 마우스 (WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J)로부터의 면역글로불린 M (IgM) 및 B220에 대해 염색된 싱글렛 (singlet) 상에 게이팅된 골수의 대표적인 등고선 선도를 도시한다. 미성숙, 성숙 및 pro/pre B 세포가 각각의 등고선 선도 상에 표시된다.
도 22b는 야생형 마우스 (WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J)의 대퇴골로부터 분리된 골수의 B (CD19+), 미성숙 B (B220intIgM+) 및 성숙 B (B220hiIgM+) 세포의 총 수를 도시한다.
도 23a는 야생형 마우스 (WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J)로부터의 면역글로불린 M (IgM) 및 B220에 대해 염색된 싱글렛 상에 게이팅된 골수의 대표적인 등고선 선도를 도시한다. 미성숙, 성숙 및 pro/pre B 세포가 각각의 등고선 선도 상에 표시된다.
도 23b는 야생형 마우스 (WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J)의 대퇴골로부터 분리된 Igλ 및 Igκ 발현에 대해 염색된 미성숙 (B220intIgM+) 및 성숙 (B220hiIgM+) B 세포 상에 게이팅된 골수의 대표적인 등고선 선도를 도시한다.
도 24a는, 상부 패널에서, 야생형 마우스 (WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J)로부터의 B 및 T 세포 (각각 CD19+ 및 CD3+)에 대해 염색되고 싱글렛 상에 게이팅된 비장세포의 대표적인 등고선 선도를 도시한다. 하부 패널은 야생형 마우스 (WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J)로부터의 CD19+ 상에 게이팅된 및 면역글로불린 D (IgD) 및 면역글로불린 M (IgM)에 대해 염색된 비장세포의 대표적인 등고선 선도를 도시한다. 성숙 (WT에 대해 54, DLC-5J에 대해 56.9) 및 이행 (WT에 대해 23.6, DLC-5J에 대해 25.6) B 세포가 각각의 등고선 선도 상에 표시된다.
도 24b는 야생형 마우스 (WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J)로부터 회수된 비장에서의 CD19+ B 세포, 이행 B 세포 (CD19+IgMhiIgDlo) 및 성숙 B 세포 (CD19+IgMloIgDhi)의 총 수를 도시한다.
도 25a는 야생형 마우스 (WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J)로부터의 Igl+ 및 Igk+ 상에 게이팅된 비장세포의 대표적인 등고선 선도를 도시한다.
도 25b는 야생형 마우스 (WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J)로부터 회수된 비장에서의 B 세포 (CD19+), Igk+ B 세포 (CD19+Igk+) 및 Igl+ B 세포 (CD19+Igl+)의 총 수를 도시한다.
도 26a는 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스에서의 말초 B 세포 발달을 도시한다. 제 1 (가장 왼쪽) 등고선 선도는 미성숙 (39.6) 및 성숙 (57.8) B 세포를 나타내는, CD19+ 상에 게이팅된 CD93+ 및 B220+ 비장세포를 도시한다. 제 2 (가운데 상부) 등고선 선도는 T1 (33.7; IgD-IgM+CD21loCD23-), T2 (21.2; IgDhiIgMhiCD21midCD23+) 및 T3 (29.1) B 세포들의 집단을 나타내는, 미성숙 B 세포에서의 IgM+ 및 CD23+ 발현을 도시한다. 제 3 (가운데 하부) 등고선 선도는 변연 지대 B 세포에 대해 발생된 작은 집단 (14.8) 및 여포형 (FO) B 세포에 대해 발생된 제 2 집단 (70.5)을 나타내는, 성숙 B 세포에서의 CD21+ (CD35+) 및 IgM+ 발현을 도시한다. 제 4 (우측 상부) 등고선 선도는 변연 지대 (90.5; MZ) 및 변연 지대 전구체 (7.3; IgMhiIgDhiCD21hiCD23+) B 세포들의 집단을 나타내는, 성숙 B 세포에서의 B220+ 및 CD23+ 발현을 도시한다. 제 5 (우측 하부) 등고선 선도는 FO-I (79.0; IgDhiIgMloCD21midCD23+) 및 FO-II (15.1; IgDhiIgMhiCD21midCD23+) B 세포들의 집단을 나타내는, 성숙 B 세포에서의 IgD+ 및 IgM+ 발현을 도시한다. 각각의 게이팅된 영역 내에서 세포의 백분율이 표시된다.
도 26b는 야생형 마우스에서의 말초 B 세포 발달을 도시한다. 제 1 (가장 왼쪽) 등고선 선도는 미성숙 (31.1) 및 성숙 (64.4) B 세포를 나타내는, CD19+ 상에 게이팅된 CD93+ 및 B220+ 비장세포를 도시한다. 제 2 (가운데 상부) 등고선 선도는 T1 (28.5; IgD-IgM+CD21loCD23-), T2 (28.7; IgDhiIgMhiCD21midCD23+) 및 T3 (30.7) B 세포들의 집단을 나타내는, 미성숙 B 세포에서의 IgM+ 및 CD23+ 발현을 도시한다. 제 3 (가운데 하부) 등고선 선도는 변연 지대 B 세포에 대해 발생된 작은 집단 (7.69) 및 여포형 (FO) B 세포에 대해 발생된 제 2 집단 (78.5)을 나타내는, 성숙 B 세포의 CD21+ (CD35+) 및 IgM+ 발현을 도시한다. 제 4 (우측 상부) 등고선 선도는 변연 지대 (79.9; MZ) 및 변연 지대 전구체 (19.4; IgMhiIgDhiCD21hiCD23+) B 세포들의 집단을 나타내는, 성숙 B 세포에서의 B220+ 및 CD23+ 발현을 도시한다. 제 5 (우측 하부) 등고선 선도는 FO-I (83.6; IgDhiIgMloCD21midCD23+) 및 FO-II (13.1; IgDhiIgMhiCD21midCD23+) B 세포들의 집단을 나타내는, 성숙 B 세포에서의 IgD+ 및 IgM+ 발현을 도시한다. 각각의 게이팅된 영역 내에서 세포의 백분율이 표시된다.
도 27은 야생형 마우스 (WT) 및 2개의 인간 Vκ 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J)의 수확된 비장에서의 이행, 변연 지대 및 여포성 B 세포들의 집단의 총 수를 도시한다.
도 28은 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 절편 (Hκ) (VELOCIMMUNETM 마우스의 인간 경쇄)으로의 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 대체에 대해 동형접합성인 마우스, 야생형 마우스 (WT), 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J) 및 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 및 1개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-1J)에서 Vκ3-20 또는 Vκ1-39 유전자 절편에 특이적인 프로브를 사용하는 정량적 PCR 분석에서 Vκ3-20-유도된 및 Vκ1-39-유도된 경쇄의 골수에서의 상대적인 mRNA 발현 (y-축)을 도시한다. 부호는 마우스 Cκ의 발현에 대해 정규화된다. ND: 검출되지 않음.
도 29는 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 절편 (Hκ) (VELOCIMMUNETM 마우스의 인간 경쇄)으로의 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 대체에 대해 동형접합성인 마우스, 야생형 마우스 (WT), 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-5J) 및 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 및 1개의 인간 Jκ 유전자 절편에 대해 동형접합성인 마우스 (DLC-1J)에서 Vκ3-20 또는 Vκ1-39 유전자 절편에 특이적인 프로브를 사용하는 정량적 PCR 분석에서 Vκ3-20-유도된 및 Vκ1-39-유도된 경쇄의 전체 비장에서의 상대적인 mRNA 발현 (y-축)을 도시한다. 부호는 마우스 Cκ의 발현에 대해 정규화된다. ND: 검출되지 않음.
도 30은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 경쇄 서열의 CDR3에 4개의 히스티딘 잔기를 엔지니어링하기 위해 사용된 선택된 돌연변이생성 프라이머들의 서열 및 특성 (% GC 함량, N, % 미스매치, Tm)을 도시한다. 서열 목록에 사용된 이들 프라이머들에 대한 SEQ ID NO들은 아래의 표에 포함된다. F=전방 프라이머, R=후방 프라이머.
도 31a는 각각 4개의 히스티딘 잔기 (****) 및 5개의 인간 Jκ로 치환되어 있는 2개의 인간 Vκ 경쇄 절편을 포함하는 표적화 벡터의 ES 세포 안으로의 도입 및 그것을 가지는 이형접합 마우스의 생성을 도시하고; 도 31b는 FLPo 효소를 사용하는 ES 세포에서의 선택 카세트의 결실을 도시한다. 대부분의 구체예에서, 다르게 표시되지 않는 한, 검은색 모양 및 실선은 마우스 서열을 나타내고, 흰색 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. 도표는 실제 크기로 제시되지 않는다.
도 32는 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 경쇄 서열의 CDR3에 3개의 히스티딘 잔기를 엔지니어링하기 위해 사용된 선택된 돌연변이생성 프라이머들의 서열 및 특성 (% GC 함량, N, % 미스매치, Tm)을 도시한다. 서열 목록에 사용된 이들 프라이머들에 대한 SEQ ID NO들은 아래의 표에 포함된다. F=전방 프라이머, R=후방 프라이머.
도 33a는 각각 3개의 히스티딘 잔기 (***) 및 5개의 인간 Jκ로 치환되어 있는 2개의 인간 Vκ 경쇄 절편을 포함하는 표적화 벡터의 ES 세포 안으로의 도입 및 그것을 가지는 이형접합 마우스의 생성을 도시하고; 도 33b는 FLPo 효소를 사용하는 ES 세포에서의 선택 카세트의 결실을 도시한다. 대부분의 구체예에서, 다르게 표시되지 않는 한, 검은색 모양 및 실선은 마우스 서열을 나타내고, 흰색 모양과 이중 선은 인간 서열을 나타낸다. 도표는 실제 크기로 제시되지 않는다.
도 34a는 인간 생식선 Vκ3-20 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열 (하부 서열)과 각각 CDR3 서열에서 3개의 히스티딘 잔기로 치환되어 있는 (상부 서열) 2개의 V 카파 절편 (Vκ3-20 및 Vκ1-39)을 포함하는 마우스에서 발현된 예시적인 IgM 경쇄 카파 가변 서열의 아미노산 번역과의 배열을 도시하고; 이때 배열은 IgM 카파 사슬 가변 서열이 생식선 서열 안에 도입되어 있는 3개의 히스티딘 치환을 모두 보유하고 있는 마우스에서 발현되는 것을 보여준다. 도 34b는 인간 생식선 Vκ1-39 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열 (각 배열에서 하부 서열)과 각각 CDR3 서열에서 3개의 히스티딘 잔기로 치환되어 있는 (각 배열에서 상부 서열) 2개의 V 카파 절편 (Vκ3-20 및 Vκ1-39)을 포함하는 마우스에서 발현된 예시적인 IgM 경쇄 카파 가변 서열의 아미노산 번역과의 배열을 도시하고; 이때 상부 배열은 IgM 카파 사슬 가변 서열이 생식선 서열 안에 도입되어 있는 3개의 히스티딘 변형을 모두 보유하고 있는 마우스에서 발현되는 것을 보여주며, 하부 배열은 IgM 카파 사슬 가변 서열이 생식선 서열 안에 도입되어 있는 3개의 히스티딘 변형 중 2개를 보유하고 있는 마우스에서 발현되는 것을 보여준다. 어떤 구체예에서, Vκ의 마지막 위치에 도입된 히스티딘은 V-J 재배열 중에 소실될 수 있다.
정의
본 발명은 그것의 게놈, 예컨대 생식선에 pH-의존성 항원 결합을 나타내는 인간 항체 분자를 코드화하는 뉴클레오티드 서열(들), 예컨대 pH-의존성 항원 결합을 나타내는 항체를 코드화하는 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄의 뉴클레오티드 서열, 예컨대 pH-의존성 항원 결합을 나타내는 항체를 재배열하고 코드화하는 제한된 레퍼토리의 인간 VL 및 JL 유전자 절편을 포함하는 면역글로불린 경쇄의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물 (예컨대 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 등); 그것을 포함하는 배(embryo), 세포 및 조직; 그것의 제조 방법; 뿐만 아니라 그것의 사용 방법이 제공된다. 다르게 규정되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어 및 구절은 명백하게 반대로 표시되거나 명백하게 그 용어 또는 구절이 사용되는 맥락으로부터 벗어나지 않는 한, 해당 기술분야에서 그 용어 및 구절이 획득한 의미를 포함한다.
용어 "항체"는 본원에서 사용되는 것과 같이, 이황화 결합에 의해 상호 연결된 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 2개의 무거운(H) 사슬과 2개의 가벼운(L) 사슬을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인과 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인과 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 또 다시 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 과가변성 영역과 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존되고 사이사이 끼어 있는 영역으로 나누어질 수 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3로 약칭될 수 있고; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 약칭될 수 있다). 용어 "고친화성" 항체는 그것의 표적 에피토프와 관련하여 약 10-9M 또는 그 이하 (예컨대 약 1×10-9M, 1×10-10M, 1×10-11M 또는 약 1×10-12M)의 KD를 가지는 항체를 말한다. 한 구체예에서, KD는 표면 플라스몬 공명, 예컨대 BIACORETM에 의해 측정되고; 다른 구체예에서, KD는 ELISA에 의해 측정된다.
구절 "이중특이성 항체"는 선택적으로 둘 또는 그 이상의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이성 항체는 일반적으로 2개의 동일하지 않은 중쇄를 포함하는데, 각각의 중쇄는 상이한 에피토프 - 2개의 상이한 분자 중 어느 하나 (예컨대 2개의 상이한 면역원 상의 상이한 에피토프) 또는 동일한 분자 상 (예컨대 동일한 면역원 상의 상이한 에피토프)에 특이적으로 결합한다. 만약 이중특이성 항체가 선택적으로 2개의 상이한 에피토프 (제 1 에피토프와 제 2 에피토프)에 결합할 수 있다면, 제 1 에피토프에 대한 제 1 중쇄의 친화성은 일반적으로 제 2 에피토프에 대한 제 1 중쇄의 친화성보다 적어도 1 내지 2 또는 3 또는 4 또는 그 이상의 차수의 크기만큼 낮을 것이고, 그 역도 마찬가지이다. 이중특이성 항체에 의해 특이적으로 결합된 에피토프는 동일하거나 상이한 표적 상에 있을 것이다 (예컨대 동일하거나 상이한 단백질). 그런 이중특이성 항체의 예를 들면 종양 항원에 대해 특이한 제 1 중쇄 및 세포독성 마커, 예컨대 Fc 수용체 (예컨대 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 등) 또는 T 세포 마커 (예컨대 CD3, CD28 등)에 대해 특이한 제 2 중쇄를 가지는 이중특이성 항체가 있다. 나아가, 제 2 중쇄 가변 도메인은 상이한 원하는 특이성을 가지는 중쇄 가변 도메인으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 종양 항원에 대해 특이한 제 1 중쇄와 독소에 대해 특이한 제 2 중쇄를 가지는 이중특이성 항체는 종양 세포에 독소 (예컨대 사포린, 빈카 알카로이드 등)를 전달하기 위해 짝을 이룰 수 있다. 다른 예시적인 이중특이성 항체로는 활성화 수용체 (예컨대 B 세포 수용체, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcαRI, T 세포 수용체 등)에 대해 특이한 제 1 중쇄 및 억제 수용체 (예컨대 FcγRIIB, CD5, CD22, CD72, CD300a 등)에 대해 특이한 제 2 중쇄를 가지는 것들을 포함한다. 그런 이중특이성 항체는 세포 활성화 (예컨대 알레르기 및 천식)와 관련된 치료 조건을 위해 구성될 수 있다. 이중특이성 항체는 예를 들면 동일한 면역원의 상이한 에피토프를 인지하는 중쇄를 조합시킴으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어 동일한 면역원의 상이한 에피토프를 인지하는 중쇄 가변 서열을 코드화하는 핵산 서열은 동일 또는 상이한 중쇄 불변 영역을 코드화하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 그런 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중특이성 항체는 각각 3개의 중쇄 CDR과, 이어서 (N-말단에서 C-말단 방향으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 가지는 2개의 중쇄, 및 에피토프-결합 특이성을 부여하지는 않지만 각각의 중쇄와 결합할 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 결합할 수 있고 중쇄 에피토프-결합 영역에 의해 결합된 하나 또는 그 이상의 에피토프에 결합할 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 결합할 수 있고 하나 또는 2개 전부의 에피토프에 하나 또는 2개 전부의 중쇄를 결합시킬 수 있는 면역글로불린 경쇄를 가진다. 유사하게, 용어 "삼중특이성 항체"는 3 또는 그 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하기에 적당한 모든 세포를 포함한다. 세포는 원핵 및 진핵 세포 (단일-세포 또는 다중-세포), 박테리아 세포 (예컨대 대장균, 바실루스 종, 스트렙토마이세스 종 등의 균주), 미코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포 (예컨대 맥주효모균, S. 폼베, P. 파스토리스, P. 메탄올리카 등), 식물 세포, 곤충 세포 (예컨대 SF-9, SF-21, 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합물, 예컨대 하이브리도마 또는 콰드로마를 포함한다. 어떤 구체예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트 또는 마우스 세포이다. 어떤 구체예에서, 세포는 진핵세포이고 다음의 세포로부터 선택된다: CHO (예컨대 CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예컨대 COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (예컨대 HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60 (예컨대 BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (상피성), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT 1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포 및 상기 언급된 세포로부터 유도된 셀라인. 어떤 구체예에서, 세포는 하나 또는 그 이상의 바이러스 유전자, 예컨대 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포 (예컨대 PER.C6TM 세포)를 포함한다.
구절 "상보성 결정 영역" 또는 용어 "CDR"은 정상적으로 (즉 야생형 동물에서) 면역글로불린 분자 (예컨대 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에 있는 2개의 프레임워크 영역 사이에서 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은 예를 들면 생식선 서열 또는 재배열된 또는 재배열되지 않은 서열에 의해 코드화될 수 있고, 예컨대 단순한(naive) 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 코드화될 수 있다. CDR은 체세포성 돌연변이될 수 있고 (예컨대 동물의 생식선에 코드화된 서열로부터 달라진다), 인간화될 수 있으며, 및/또는 아미노산 치환, 첨가 또는 결실로 변형될 수 있다. 어떤 상황에서는 (예컨대 CDR3에 대해), CDR은 연속적이지 않지만 (예컨대 재배열되지 않은 핵산 서열에서), 예컨대 서열의 스플라이싱 또는 연결 (예컨대 중쇄 CDR3를 형성하기 위한 V-D-J 재조합)의 결과로서 B 세포 핵산 서열에서 연속적인 둘 또는 그 이상의 서열 (예컨대 생식선 서열)에 의해 코드화될 수 있다.
용어 "보존성"은 보존성 아미노산 치환을 설명하기 위해 사용될 때, 유사한 화학적 특성 (예컨대 전하 또는 소수성)을 가지는 측쇄 R 기를 가지는 다른 아미노산 잔기에 의해 아미노산 잔기가 치환되는 것을 포함한다. 일반적으로 보존성 아미노산 치환은 실질적으로는 단백질의 관심의 기능적 특성, 예를 들면 가변 영역이 원하는 친화성으로 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성을 가지는 측쇄를 가지는 아미노산 그룹의 실례로는 글리신, 알라닌, 발린, 로이신 및 이소로이신과 같은 지방족 측쇄; 세린 및 쓰레오닌과 같은 지방족-하이드록실 측쇄; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드-함유 측쇄; 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판과 같은 방향족 측쇄; 라이신, 아르기닌 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄; 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 황-함유 측쇄를 들 수 있다. 보존성 아미노산 치환기로는 예를 들면 발린/로이신/이소로이신, 페닐알라닌/타이로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파테이트 및 아스파라긴/글루타민이 있다. 어떤 구체예에서, 보존성 아미노산 치환은 예를 들면 알라닌 스캐닝 돌연변이생성에 사용되는 것과 같이, 알라닌으로 단백질의 어떠한 천연 잔기를 치환하는 것일 수 있다. 어떤 구체예에서, 문헌에 개시된 PAM250 로그-유사성 매트릭스 (Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45)에서 포지티브 값을 가지는 보존성 아미노산 치환이 만들어진다. 어떤 구체예에서, 치환은 치환이 PAM250 로그-유사성 매트릭스에서 음이 아닌 값을 가지는 적당하게 보존성인 치환이다.
어떤 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에서 잔기 위치는 하나 또는 그 이상의 보존성 아미노산 치환만큼 다르다. 어떤 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 그것의 기능성 단편 (예컨대 B 세포로부터의 발현 및 분비를 가능하게 하는 단편)에서 잔기 위치는 그것의 아미노산 서열이 본원에서 열거된 경쇄와 동일하지는 않지만, 하나 또는 그 이상의 보존성 아미노산 치환만큼 상이하다.
구절 "에피토프-결합 단백질"은 적어도 하나의 CDR를 가지고 있고 선택적으로 에피토프를 인지할 수 있는, 예컨대 약 1 마이크로몰 또는 그 이하의 KD (예컨대 약 1×10-6M, 1×10-7M, 1×10-8M, 1×10-9M, 1×10-10M, 1×10-11M 또는 약 1×10-12M인 KD)로 에피토프에 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 치료적 에피토프-결합 단백질 (예컨대 치료적 항체)은 자주 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD를 필요로 한다.
구절 "기능성 단편"은 발현되고, 분비되며, 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프-결합 단백질의 단편을 포함한다. 특이적 인지는 적어도 마이크로몰 범위, 나노몰 범위, 또는 피코몰 범위의 KD를 가지는 것을 포함한다.
면역글로불린 핵산 서열과 관련하여 용어 "생식선"은 자손에게 계대될 수 있는 핵산 서열을 포함한다.
구절 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 어떠한 유기체로부터의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하여, 면역글로불린 중쇄 서열을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 다르게 명시되지 않는 한 3개의 중쇄 CDR 및 4개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄 단편은 CDR, CDR과 FR 및 그것들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 가변 도메인 다음에 (N-말단으로부터 C-말단 쪽으로), CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 가진다. 중쇄의 기능성 단편은 에피토프를 특이적으로 인지할 수 있고 (예컨대 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프를 인지할 수 있는), 세포로부터 발현되고 분비될 수 있으며, 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 일반적으로 생식선에 존재하는 VH, DH 및 JH 절편의 레퍼토리로부터 유도된 VH, DH 및 JH 절편을 포함하는 가변 영역 유전자 서열에 의해 코드화된다. 다양한 유기체에 대하여 V, D 및 J 중쇄 절편에 대한 서열, 위치 및 명명법은 IMGT 데이터베이스, 국제 면역유전학 정보 시스템의 웹사이트에서 찾아볼 수 있다.
용어 "동일성"은 서열과 관련하여 사용될 때, 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는, 해당 기술분야에 공지되어 있는 많은 상이한 알고리즘에 의해 측정된 것과 같은 동일성을 포함한다. 본원에서 기술되는 어떤 구체예에서, 동일성은 10.0의 오픈 갭 페널티, 0.1의 연장 갭 페널티를 사용하는 ClustalW v.1.83(slow) 배열을 사용하고, Gonnet 유사성 매트릭스 (MACVECTORTM 10.0.2, MacVector Inc., 2008)를 사용하여 측정된다. 서열의 동일성과 관련하여 비교되는 서열의 길이는 특정 서열에 따라 좌우되겠지만, 경쇄 불변 도메인의 경우 길이는 자체-결합되어 규준적인 경쇄 불변 도메인을 형성할 수 있는, 예컨대 베타 가닥을 포함하는 2개의 베타 시트를 형성할 수 있고 인간 또는 마우스의 적어도 하나의 CH1 도메인과 상호작용할 수 있는 경쇄 불변 도메인으로 접히기에 충분한 길이의 서열을 함유하여야 한다. CH1 도메인의 경우, 서열의 길이는 베타 가닥을 포함하는 2개의 베타 시트를 형성할 수 있고 인간 또는 마우스의 적어도 하나의 경쇄 불변 도메인과 상호작용할 수 있는 CH1 도메인으로 접히기에 충분한 길이의 서열을 함유하여야 한다.
구절 "면역글로불린 분자"는 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 중쇄는 동일하거나 상이하며, 경쇄는 동일하거나 상이할 수 있다.
구절 "경쇄"는 어떠한 유기체로부터의 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하고, 다르게 명시되지 않는 한 인간 카파 및 람다 경쇄 및 VpreB, 및 대체 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 전형적으로, 다르게 명시되지 않는 한 3개의 경쇄 CDR과 4개의 프레임워크 (FR) 영역을 포함한다. 일반적으로 전체 길이의 경쇄는 아미노 말단으로부터 카르복실 말단 방향으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 가변 도메인과 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 일반적으로 생식선에 존재하는 경쇄 V 및 J 유전자 절편의 레퍼토리로부터 유도된 VL 및 JL 절편을 포함하는 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 의해 코드화된다. 다양한 유기체에 대한 V 및 J 경쇄 절편에 대한 서열, 위치 및 명명법은 IMGT 데이터베이스, www.imgt.org에서 찾아볼 수 있다. 경쇄는 예를 들면 그것들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 제 1 또는 제 2 에피토프 중 어느 하나에 선택적으로 결합하지 않는 것들을 포함한다. 경쇄는 또한 그것들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 하나 또는 그 이상의 에피토프에 결합하고 그것들을 인지함으로써 중쇄와 결합하고, 인지하거나 또는 보조하는 것들을 포함한다. 통상적이거나 보편적인 경쇄는 인간 Vκ1-39Jκ5 유전자 또는 인간 Vκ3-20Jκ1 유전자로부터 유도된 것들을 포함하고, 그것들의 체세포성 돌연변이된 (예컨대 친화성 성숙된) 버전을 포함한다. 이중 경쇄 (DLC)는 2개 이하의 인간 Vκ 절편, 예컨대 인간 Vκ1-39 유전자 절편 및 인간 Vκ3-20 유전자 절편을 포함하는 경쇄 유전자좌로부터 유도된 것들을 포함하고, 그것의 체세포성 돌연변이된 (예컨대 친화성 성숙된) 버전을 포함한다.
구절 "마이크로몰 범위"는 1 내지 999 마이크로몰을 의미하는 것으로 의도되고; 구절 "나노몰 범위"는 1 내지 999 나노몰을 의미하는 것으로 의도되며; 구절 "피코몰 범위"는 1 내지 999 피코몰"을 의미하는 것으로 의도된다.
구절 "체세포성 돌연변이된"은 본원에서 사용되는 것과 같이, 부류간 스위칭을 진행하는 B 세포로부터의 핵산 서열에 대한 언급을 포함하는데, 이때 부류간 스위칭된 B 세포의 면역글로불린 가변 영역의 핵산 서열 (예컨대 중쇄 가변 도메인을 코드화하거나 또는 중쇄 CDR 또는 FR 서열을 포함하는 뉴크레오티드 서열)은 예를 들면 부류간 스위칭이 진행되지 않은 B 세포와 부류간 스위칭이 진행된 B 세포 사이의 CDR 또는 프레임워크 핵산 서열의 차이와 같이, 부류간 스위칭 전의 B 세포의 핵산 서열과 동일하지 않다. "체세포성 돌연변이된"은 친화성-성숙되지 않은 B 세포의 해당하는 면역글로불린 가변 영역 서열 (즉 생식 세포의 게놈 서열)에 동일하지 않은 친화성-성숙된 B 세포로부터의 핵산 서열에 대한 언급을 포함한다. 구절 "체세포성 돌연변이된"은 또한 관심의 에피토프에 대한 B 세포의 노출 후에 B 세포로부터의 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열에 대한 언급을 포함하는데, 이때 핵산 서열은 관심의 에피토프에 대한 B 세포의 노출 전의 해당하는 핵산 서열과는 다르다. 구절 "체세포성 돌연변이된"은 또한 면역원 도전에 대한 반응으로 인간 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열을 가지는 동물, 예컨대 마우스에서 생성된, 그리고 그런 동물에서 고유하게 작동하는 선택 과정으로부터 유발된 항체로부터의 서열을 말한다.
핵산 서열과 관련하여 용어 "재배열되지 않은"은 동물 세포의 생식선에 존재하는 핵산 서열을 포함한다.
구절 "가변 도메인"은 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 (다른 표시가 없는 한) 순서대로 다음의 아미노산 영역: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4를 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄의 아미노산 서열을 포함한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 성분들이 그것들의 의도된 방식으로 작동가능하게 연결되어 기능하게 되는 관계를 말한다. 한 가지 경우에, 단백질을 코드화하는 핵산 서열은 적절한 전사 조절을 보유하기 위하여 조절 서열 (예컨대 프로모터, 인핸서, 침묵 서열 등)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 한 가지 경우에, 면역글로불린 가변 영역 (또는 V(D)J 절편)의 핵산 서열은 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 서열 안으로의 서열 사이에 적절한 재조합이 가능하도록 면역글로불린 불변 영역의 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
용어 "대체"는 유전자 대체와 관련하여, 내인성 유전자 유전자좌에 외인성 유전자 물질을 놓고, 그로써 내인성 유전자의 전부 또는 부분을 이종상동성 또는 상동성 핵산 서열로 대체하는 것을 말한다.
예를 들어 기능성 폴리펩티드와 관련하여 본원에서 사용된 것과 같은 용어 "기능성"은 천연 단백질과 정상적으로 관련된 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 경우에 기능성 면역글로불린 유전자 절편은 재배열된 면역글로불린 유전자 서열을 생성하기 위해 재생적으로 재배열할 수 있는 가변 유전자 절편을 포함할 수 있다.
"중성 pH"는 약 7.0과 약 8.0 사이의 pH, 예컨대 약 7.0과 약 7.4 사이의 pH, 예를 들면 약 7.2와 약 7.4 사이의 pH, 예컨대 생리적 pH를 포함한다. "산성 pH"는 6.0 또는 그 이하의 pH, 예컨대 약 5.0과 약 6.0 사이의 pH, 약 5.75와 약 6.0 사이의 pH, 예를 들면 엔도솜 또는 리소좀 구획의 pH를 포함한다.
면역글로불린 경쇄 유전자에 엔지니어링된 히스티딘 잔기
본 발명자들은 pH 의존성 방식으로 항원에 결합할 수 있는 항체를 발현하는 비-인간 동물이 경쇄의 서열을 따라 하나 또는 그 이상의 위치에서 면역글로불린 경쇄 가변 영역의 변형을 만듦으로써 제조될 수 있다는 것을 발견하였다. 비-인간 동물의 생식선에 변형을 만들어서 동물이 항체의 CDR에서 히스티딘을 발현하도록 하는 방법이 기술된다. 특히 마우스의 생식선의 면역글로불린 경쇄 가변 서열에 변형을 만드는 방법이 기술된다. 예를 들어 경쇄의 가변 영역 서열은 전형적으로 가변 영역 서열을 따라 체세포성 과돌연변이를 나타내고, 어떤 경우에는 그런 돌연변이가 히스티딘 잔기의 치환을 유발할 수 있다 (도 1 참조). 그런 돌연변이는 항원 결합에 기여하는 가변 도메인 영역인 상보성 결정 영역 (CDR)에서도 일어날 수 있다. 어떤 경우에는 그런 돌연변이는 pH-의존성 항원 결합, 예컨대 중성 pH에서의 항원 결합에 비교하여 산성 pH에서 감소된 항원 결합을 나타내는 항체를 유발할 수 있다. 그런 pH-의존성 항원 결합은 그것으로 인해 세포 외부에서 항원에 항체가 결합하는 것이 가능해지고, 엔도솜으로 내재화될 때 항원이 방출되어 표적-중재된 소멸을 피하면서 표면으로 되돌아가서 또 다른 항원에 결합하도록 재순환되기 때문에 바람직하다. 이런 효과를 이루기 위하여 pH-의존성 결합 특성을 항-IL-6R 항체에 엔지니어링하기 위하여 무작위 his-주사 (scanning) 돌연변이생성을 사용함으로써 히스티딘 잔기를 도입하기 위한 접근법이 보고된 바 있다 (US 2011/0111406 A1). 그러나 항체 잔기의 무작위 돌연변이생성은 항원에 대한 항체의 감소된 친화성을 유발할 수 있다. 항체 서열에 히스티딘 치환을 발현하도록 유전자 변형된 비-인간 동물은 관심의 항원에 대한 반응으로, 히스티딘 변형(들)으로 인해 또한 pH-의존성 항원 결합을 나타낼 고친화성 항체를 생성하는 것이 가능해진다.
그러므로 다양한 구체예에서, 본원에는 pH-의존성 방식으로 항원에 결합할 수 있는 항체를 발현하는 동물을 유발하는 변형을 포함하는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 그것의 게놈, 예컨대 생식선에 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물 (예컨대 설치류, 예를 들면 마우스 또는 래트)이 제공된다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈 (예컨대 해당하는 인간 생식선 VL 및/또는 JL 절편 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈)의 히스티딘 코돈으로의 치환 (어떤 경우에는 "히스티딘 치환", "히스티딘 코돈 치환" 등으로도 언급될 수 있다)을 포함하는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열 (예컨대 VL 및/또는 JL 절편 서열)의 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 동물은 pH 의존성 항체의 수율을 증가시키기 위하여 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3, N 말단, 루프 4 및 심지어 프레임워크 영역에서도 히스티딘 치환을 허용하는 생식선 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈 (예컨대 해당하는 인간 생식선 VL 및/또는 JL 절편 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈)의 히스티딘 코돈으로의 치환을 인간 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR; 예컨대 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)에 포함한다. 한 구체예에서, 치환은 CDR3 코돈에 있다. 한 구체예에서, 경쇄는 κ경쇄이다. 한 구체예에서, 동물은 적어도 하나의 아미노산의 히스티딘으로의 치환을 포함하는 면역글로불린 경쇄, 예컨대 경쇄 CDR, 예를 들면 경쇄 CDR를 발현한다. 다른 구체예에서, 경쇄는 λ경쇄이다. 또 다른 구체예에서, 마우스는 κ 및 λ경쇄에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다.
히스티딘 잔기는 2개의 상이한 코돈, CAT와 CAC (데옥시리보핵산 잔기)에 의해 코드화된다. 그러므로 비-히스티딘 코돈은 CAT 또는 CAC로 치환될 수 있다. 치환은 그것의 생식선 형태 (즉 비-체세포성 돌연변이 상태)에서 히스티딘 잔기를 코드화하지 않는 코돈에서 엔지니어링된다. 그러므로, 뉴클레오티드 서열은 해당하는 인간 생식선 경쇄 가변 유전자 절편 (예컨대 해당하는 인간 생식선 VL 및/또는 JL 유전자 절편)에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함한다.
다양한 구체예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물의 경쇄 서열에서 히스티딘 변형은 다양한 방식으로 디자인될 수 있다. 어떤 구체예에서, 히스티딘 치환은 단지 하나의 뉴클레오티드 변화만을 필요로 하는 그런 위치로 제한될 수 있다. 어떤 구체예에서 히스티딘 변형은 인공 서열 (예컨대 인공 DH 절편, 확인된 항체의 N 첨가 등)에 만들어질 수 있으며, 이들 인공 서열은 경쇄 서열에 삽입될 수 있다.
한 구체예에서, 경쇄는 보편적 경쇄 (또한 공통 경쇄로도 언급된다)이다. 미국 특허 출원 13/022,759, 13/093,156, 13/412,936, 13/488,628 및 13/798,310 (미국 출원 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300, 2013/0045492 및 2013/0185821, 모두 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있는 것과 같이, 다수의 중쇄에 대해 공통 경쇄를 선택하는 비-인간 동물 (예컨대 마우스)이 실제로 활용된다. 다양한 구체예에서, 공통 경쇄만을 포함하는 비-인간 동물에서 발현된 항체는 동일한 또는 실질적으로 동일한 경쇄와 결합하고 발현할 수 있는 중쇄를 가질 것이다. 이것은 특히 이중특이성 항체를 만들 때 유용하다. 예를 들어 그런 동물은 특이적으로 제 1 에피토프에 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하기 위해 제 1 면역원으로 면역될 수 있다. 동물 (또는 유전적으로 동일한 동물)은 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하기 위하여 제 2 면역원으로 면역될 수 있다. 가변 중쇄 영역은 B 세포로부터 클론될 수 있고, 이중특이성 항체를 제조하기 위하여 세포에서 동일한 중쇄 불변 영역 및 동일한 경쇄 (예컨대 공통 경쇄)와 함께 발현될 수 있는데, 이때 이중특이성 항체의 중쇄 성분은 동일한 경쇄 성분과 결합하여 발현하는 동물에 의해 선택될 수 있다. 기술된 다양한 구체예에서, 유전자 엔지니어링된 마우스의 가변 영역은 인간 가변 영역이다.
다른 구체예에서, 경쇄는 한정된 (제한된) 경쇄 가변 절편 레퍼토리, 예컨대 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편을 포함하는 경쇄 가변 절편 레퍼토리 (예컨대 이중 경쇄 또는 "DLC")로부터 유도된다. 미국 특허 출원 공보 번호 2013/0198880으로서 공개된 미국 특허 출원 번호 13/798,455호에서 보다 상세하게 기술되는 것과 같이, 그런 제한된 경쇄 가변 절편 레퍼토리는 또한 이중특이성 또는 다중특이성 항체를 제조하는 데 유용한 항체 성분들의 생성을 보조하는 제한된 경쇄 레퍼토리의 생성을 초래한다.
어떤 구체예에서, 이중 경쇄 마우스는 보다 다양한 경쇄 레퍼토리를 나타낼 수 있다. 어떤 구체예에서, 이중 경쇄 마우스는 더 큰 수율의 결합 항체를 허용하고, 다양성을 제한하면서 동시에 단일한 재배열된 경쇄 가변 영역을 포함하는 마우스, 예컨대 보편적 경쇄 마우스에서 생성된 중쇄와의 성공적인 짝짓기를 증가시킨다. 어떤 구체예에서, 경쇄 자체는 항원 결합 특성을 나타낼 수 있다. 어떤 구체예에서, 마우스는 경쇄에 있는 항원 특이성을 나타내는 항체를 제조하도록 유도될 수 있다 (예컨대 마우스의 면역글로불린 중쇄 레퍼토리를 제한함으로써, 예를 들면 단일한 재배열된 중쇄 가변 영역을 포함하는 유전자좌로 마우스 중쇄 유전자좌를 대체함으로써). 어떤 구체예에서, 그런 동물에서 생성된 항체들은 특정 제 1 에피토프 (예컨대 이펙터 항원, 세포독성 분자, Fc 수용체, 독소, 활성화 또는 억제성 수용체, T 세포 마커, 면역글로불린 수송체 등)에 대해 그것들의 경쇄 결합을 통해 특이적이 될 것이다. 이중 경쇄 마우스로부터 유도된 그런 에피토프-특이적 인간 경쇄는 제한된 경쇄 레퍼토리를 가지는 마우스, 예컨대 ULC 마우스로부터 유도된 인간 중쇄와 함께 공동-발현될 수 있고, 이때 중쇄는 제 2 에피토프 (예컨대 상이한 항원 상의 제 2 에피토프)에 결합하는 능력을 토대로 선택된다.
그러므로, 중쇄의 보다 다양한 패밀리, 이를테면 그것의 인간 가변 영역이 생식선 서열과는 동떨어진 중쇄, 예컨대 친화성 성숙된 또는 체세포성 돌연변이된 가변 영역과 적절하게 짝을 이룰 면역글로불린 경쇄를 생성할 수 있는 마우스들이 전에 엔지니어링되었다. 다양한 구체예에서, 마우스는 인간 경쇄 가변 도메인이 체세포성 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 가변 도메인과 짝을 이루게 하고, 그로써 고친화성 결합 단백질로의 경로가 인간 치료제로서 사용하기에 적당하게 되도록 고안된다.
유기체 내에서 길고 복잡한 항체 선택 과정을 거쳐 유전자 공학제조된 마우스는 다양하게 수집된 인간 중쇄 가변 도메인을 제한된 수의 인간 경쇄 옵션과 짝을 이루는 데 있어 생물학적으로 적절한 선택을 하게 된다. 이것을 이루기 위하여, 마우스는 광범위한 다양한 인간 중쇄 가변 도메인 옵션과 함께 제한된 수의 인간 경쇄 가변 도메인 옵션을 제공하도록 엔지니어링된다. 면역원으로 도전받을 때, 마우스는 그것의 레퍼토리에서 크게 또는 수 또는 경쇄 옵션에 단독으로 제한되는, 면역원에 대한 항체를 발생시키기 위해 그것의 레퍼토리에서 해결의 수를 최대화시킨다. 다양한 구체예에서, 이것은 마우스가 그럼에도 불구하고 상대적으로 매우 다양한 인간 중쇄 가변 도메인, 이를테면 특히 체세포성 돌연변이된 인간 중쇄 가변 도메인과 부합하게 될 경쇄 가변 도메인의 적절하고 부합하는 체세포성 돌연변이를 이루는 것을 허용하는 것을 포함한다.
미국 출원 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300, 2013/0045492, 2013/0185821 및 2013/0198880에 기술되어 있는 엔지니어링된 공통 경쇄 또는 제한된 경쇄 레퍼토리 마우스들은 제한된 레퍼토리의 경쇄 옵션, 예컨대 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함한 공통 또는 보편적인 경쇄 "ULC", 예를 들면 2개 이하의 인간 VL 절편을 포함한 경쇄, 예컨대 2개의 인간 VL 절편을 포함한 이중 경쇄를 코드화하는 핵산 서열을 포함하였다. 그런 제한된 레퍼토리를 이루기 위하여, 마우스들은 천연 마우스 경쇄 가변 도메인을 만들거나 재배열하는 능력이 비기능적으로 되거나 또는 실질적으로 비기능적이 되도록 엔지니어링되었다. 한 측면으로, 이것은 예를 들면 마우스의 경쇄 가변 영역 유전자 절편을 결실시킴으로써 이루어졌다. 앞서 기술된 것과 같이, 내인성 마우스 유전자좌는 그런 다음, 외인성 인간 가변 영역 유전자 절편이 내인성 마우스 경쇄 불변 영역 유전자와 조합되어 재배열된 역 키메릭 경쇄 유전자 (인간 가변, 마우스 불변)를 형성할 수 있는 방식으로, 내인성 마우스 경쇄 불변 도메인에 작동가능하게 연결된, 선택된 적절한 외인성 인간 경쇄 가변 영역 유전자 절편에 의해 변형될 수 있다. 다양한 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 체세포성 돌연변이될 수 있다. 다양한 구체예에서, 체세포성 돌연변이를 획득하기 위해 경쇄 가변 영역의 능력을 최대화하기 위해 적절한 인핸서(들)이 마우스에 보유된다. 한 측면으로, 내인성 마우스 κ경쇄 유전자 절편을 인간 κ경쇄 유전자 절편으로 대체하기 위해 마우스 κ경쇄 유전자좌를 변형시킬 때, 마우스 κ 인트로닉 인핸서 및 마우스 κ3' 인핸서가 기능적으로 유지되거나 또는 파괴되지 않는다.
그러므로 다양한 역 키메릭 (인간 가변, 마우스 불변) 중쇄와 결합된 제한된 레퍼토리의 역 키메릭 (인간 가변, 마우스 불변) 경쇄를 발현하는 유전자 엔지니어링된 마우스가 제공되었다. 다양한 구체예에서, 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 절편은 결실되고 내인성 마우스 Cκ 유전자에 작동가능하게 연결된 단일한 (또는 2개의) 재배열된 인간 경쇄 영역으로 대체된다. 다양한 구체예에서, 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 절편들이 결실되고 인간 경쇄 J 절편 (하나 또는 다수의 JL 절편으로부터 선택됨)과 재배열할 수 있고 면역글로불린 경쇄의 인간 가변 도메인을 코드화할 수 있는 단일한 인간 VL 절편으로 대체되며, 이때 단일한 VL 및 하나 또는 다수의 JL 절편은 내인성 마우스 Cκ 유전자에 작동가능하게 연결된다. 다른 다양한 구체예에서, 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 절편들이 결실되고 인간 경쇄 J 절편 (하나 또는 다수의 JL 절편, 예컨대 둘 또는 그 이상의 JL 절편으로부터 선택됨)과 재배열할 수 있고 면역글로불린 경쇄의 인간 가변 도메인을 코드화할 수 있는 2개 이하의 인간 VL 절편으로 대체되며, 이때 2개 이하의 VL 유전자 절편 및 하나 또는 다수의 JL 절편은 내인성 마우스 Cκ 유전자에 작동가능하게 연결된다. 다른 구체예에서, 카파 경쇄 유전자 절편 (예컨대 인간 VL 및 JL 유전자 절편)은 인간 Cκ 유전자에 작동가능하게 연결된다. 재배열된 인간 경쇄 영역의 체세포성 과돌연변이를 최대화하기 위한 구체예에서, 마우스 κ 인트로닉 인핸서 및 마우스 κ 3' 인핸서가 유지된다. 다양한 구체예에서, 마우스는 또한 비기능성 λ 경쇄 유전자좌, 또는 그것의 결실 또는 유전자좌가 λ 경쇄를 만들 수 없도록 만드는 결실을 포함한다. 어떤 특정 구체예에서, 한정된 경쇄 레퍼토리로 유전자 엔지니어링된 마우스의 유전자좌는 실질적으로 도 16a 및 16b에 도시된 유전자좌들과 동일하다.
제한된 레퍼토리의 경쇄 옵션을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 엔지니어링된 마우스들, 예컨대 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열, 예컨대 2개 이하의 인간 VL 절편을 포함하는 경쇄를 포함하는 ULC 마우스, 예를 들면 2개의 인간 VL 절편을 포함하는 DLC 마우스들에서, 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 야생형 면역글로불린 경쇄 유전자좌와 상이하다.
어떤 구체예에서, 제한된 레퍼토리의 경쇄 옵션을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스 (예컨대 ULC 마우스, 예를 들면 DLC 마우스)의 경쇄 유전자좌의 구조는 적어도 하나의, 및 어떤 구체예에서는 모든 마우스 VL 유전자 절편이 하나의 인간 VL 유전자 절편 또는 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편에 의해 대체되어 있는 점에서 도 15의 참조 구조의 그것과 상이하다. 어떤 구체예에서, 단일한 인간 VL 유전자 절편은 인간 JL 유전자 절편에 대해 재배열된 생식선에 존재한다. 어떤 구체예에서, 마우스의 인간 VL 유전자 절편은 항체의 면역글로불린 VL 도메인을 코드화하기 위하여 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편 중 하나에 재배열할 수 있다. 어떤 구체예에서, 본원에 기술되는 마우스의 경쇄 유전자좌의 인간 VL 유전자 절편(들)은 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 인간 JL 유전자 절편에 작동가능하게 연결된다.
어떤 구체예에서, 제한된 레퍼토리의 경쇄 옵션을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스 (예컨대 ULC 마우스, 예를 들면 DLC 마우스)의 경쇄 유전자좌의 구조는 그것이 재배열 전에 내인성 VL 유전자 절편을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않는다는 점에서 도 15의 참조 구조의 그것과 상이하다. 어떤 구체예에서, 그런 마우스의 경쇄 유전자좌의 구조는 그것이 재배열 전에 내인성 JL 유전자 절편을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않는다는 점에서 도 15의 참조 구조의 그것과 상이하다. 어떤 구체예에서, 그런 마우스의 경쇄 유전자좌의 구조는 그것이 재배열 전에 내인성 VL 및 JL 유전자 절편을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않는다는 점에서 도 15의 참조 구조의 그것과 상이하다.
어떤 구체예에서, 제한된 레퍼토리의 경쇄 옵션을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스 (예컨대 ULC 마우스, 예를 들면 DLC 마우스)의 경쇄 유전자좌의 구조는 그것이 재배열 후에 내인성 VL 유전자 절편을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않는다는 점에서 도 15의 참조 구조의 그것과 상이하다. 어떤 구체예에서, 그런 마우스의 경쇄 유전자좌의 구조는 그것이 재배열 후에 내인성 JL 유전자 절편을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않는다는 점에서 도 15의 참조 구조의 그것과 상이하다. 어떤 구체예에서, 그런 마우스의 경쇄 유전자좌의 구조는 그것이 재배열 후에 내인성 VL 및 JL 유전자 절편을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않는다는 점에서 도 15의 참조 구조의 그것과 상이하다.
어떤 구체예에서, 제한된 레퍼토리의 경쇄 옵션을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스 (예컨대 ULC 마우스, 예를 들면 DLC 마우스)의 경쇄 유전자좌의 구조는 그것이 재배열 전에 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 인간 JL 유전자 절편을 함유한다는 점에서 도 15의 참조 구조의 그것과 상이하다. 어떤 구체예에서, 그런 마우스의 경쇄 유전자좌는 그것이 재배열 전에 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 5개의 인간 JL 유전자 절편을 함유한다는 점에서 도 15의 참조 구조의 그것과 상이하다.
어떤 구체예에서, 제한된 레퍼토리의 경쇄 옵션을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스 (예컨대 ULC 마우스, 예를 들면 DLC 마우스)의 경쇄 유전자좌의 구조는 그것이 재배열 후에 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 5개 이하 (예컨대 5, 4, 3, 2 또는 1개)의 인간 JL 유전자 절편을 함유한다는 점에서 도 15의 참조 구조의 그것과 상이하다. 어떤 구체예에서, 그런 마우스의 경쇄 유전자좌는 그것이 재배열 후에 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 1, 2, 3, 4 또는 5개의 인간 JL 유전자 절편을 함유한다는 점에서 도 15의 참조 구조의 그것과 상이하다. 한 구체예에서, 제한된 레퍼토리의 경쇄 옵션을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스 (예컨대 ULC 마우스, 예를 들면 DLC 마우스)의 경쇄 유전자좌의 구조는 그것이 재배열 후에 하나의 인간 VL 및 5개 이하 (예컨대 5, 4, 3, 2 또는 1개)의 인간 JL 유전자 절편을 함유한다는 점에서 도 15의 참조 구조의 그것과 상이하다.
다양한 구체예에서, 인간 VL 및 JL 유전자 절편은 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 절편이다. 다양한 구체예에서, 인간 Vκ 절편은 인간 Vκ1-39 유전자 절편 및 인간 Vκ3-20 유전자 절편으로부터 선택된다. 어떤 구체예에서, 인간 Vκ 절편은 인간 Vκ1-39 및 인간 Vκ3-20이다. 어떤 구체예에서, 인간 Jκ 절편은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 유전자 절편 및 그것들의 조합으로부터 선택된다. 어떤 구체예에서,인간 Jκ 유전자 절편은 인간 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5이다.
어떤 구체예에서, 제한된 레퍼토리의 경쇄 옵션을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스 (예컨대 ULC 마우스, 예를 들면 DLC 마우스)의 경쇄 유전자좌의 구조는 그것이 재배열 전에 도 16a 및 16b의 구조의 그것과 실질적으로 동일한 구조 (예컨대 도 8c, 8e, 14c, 14d, 17e, 19d, 31 및 33의 구조)를 함유한다는 점에서 도 15의 참조 구조의 그것과 상이하다. 어떤 구체예에서, 재배열 전에 도 16a 및 16b의 구조와 동일한 구조를 가지는 경쇄 유전자좌를 포함하는 마우스가 제공된다.
마우스 게놈 안에 무작위로 삽입되어 있는 인간 면역글로불린 유전자좌, 가변 및 불변 영역을 함유하고 있는 마우스들은 기술분야에 알려져 있다. 그런 마우스들의 초기 계통은 제한된 수의 인간 면역글로불린 유전자 절편을 함유하였다. 구체적으로, 인간 면역글로불린 경쇄 유전자 절편을 함유하고 있는 소수의 계통은 1, 3 또는 4개의 인간 면역글로불린 VL 유전자 절편 및 5개의 인간 면역글로불린 JL 유전자 절편을 함유하였다 (Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295; Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14:845-851; Lonberg et al. 1994, Nature 368:856-859; Green et al. 1994, Nature Genetics 7:13-21; Green and Jakobovits 1998, J. Exp. Med. 188(3):483-495; Green 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23). 마우스 게놈 안에 무작위로 삽입된 전체 인간 도입유전자의 일부로서 단지 소수의 인간 면역글로불린 VL 유전자 절편을 함유한 이들 마우스는 면역손상된 B 세포 수, 손상된 B 세포 발달 및 다른 면역 결핍을 보였다. B 세포 상에서의 인간 Cκ의 표면 발현에 의해 검출되는 바, 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자의 발현은 야생형에 비교하여 내인성 κ 경쇄보다 낮았다. 놀랍게도, 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌에서 하나 또는 2개의 인간 면역글로불린 Vκ 유전자 절편을 함유하도록 엔지니어링된 마우스와 같이 제한된 레퍼토리의 경쇄 옵션을 가지는 마우스들은 거의 야생형에 가까운 B 세포 수 및 발달을 나타낸다 (예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0198880 및 본 실시예들 참조). 나아가, 어떤 구체예에서, 이들 마우스는 항원에 대한 반응으로 인간 가변 경쇄 및 중쇄 도메인들을 함유하는 여러 개의 고친화성 역 키메릭 항체를 생성할 수 있고, 이때 가변 경쇄 도메인들은 각각 2개의 가능한 인간 VL 유전자 절편 중 하나와 5개의 가능한 인간 JL 유전자 절편 중 하나를 함유한다 (예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0198880 및 본 실시예들 참조). 그러므로, 인간 면역글로불린 경쇄 미니유전자좌로 엔지니어링된 마우스들의 예비 계통 (즉 제한된 수의 인간 면역글로불린 유전자 절편)과 대조적으로, 제한된 수의 인간 면역글로불린 VL 유전자 절편 (하나 또는 2개) 및, 어떤 구체예에서 2 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 인간 면역글로불린 JL 유전자 절편을 함유하는 마우스들은 놀랍게도, 정상적인 B 세포 수, 정상적인 면역글로불린 경쇄 발현 및 정상적인 B 세포 발달을 나타낸다. 나아가, 그런 마우스들은 또한 제한된 면역글로불린 경쇄 레퍼토리의 결과로서 다중 항원들에 대한 왕성한 면역 반응을 일으키는 능력이 감소되거나 손상되지 않은 것으로 나타난다. 따라서, 어떤 구체예에서, 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 VL 유전자 절편 및 2 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 인간 면역글로불린 JL 유전자 절편 -또는 2개 이하의 재배열된 인간 VLJL 절편- 을 포함하는 인간화된 가변 경쇄 유전자좌를 포함하는 마우스들은 수에 있어 야생형 B 세포들의 집단을 나타내고, 야생형 B 세포 발달을 나타냈다.
보편적인 경쇄 마우스들 또는 제한된 경쇄 레퍼토리를 가지는 마우스들 (예컨대 이중 경쇄 마우스)에서 다양한 항원에 대한 반응으로 생성된 항체들은 VH, DH 및 JH 절편의 다양한 레퍼토리를 포함하고 있는 다양한 레퍼토리의 중쇄 가변 영역 서열을 활용할 수 있다. 그렇게 유전자 엔지니어링된 ULC 마우스들에서 생성된 항체는 이중특이성 치료 항체를 디자인하는 데 유용하다; 그러나 어떠한 다른 항체와 같이, 각각의 이중특이성 항체는 그것의 혈장 내에서의 반감기 동안 오직 하나의 표적에만 결합할 수 있고; 항체는 엔도솜 안에 내재화되어 리소좀 분해에 대해 표적화된다. 연구 결과들은 MHC-부류-I-유사 Fcγ 수용체 FcRn이 면역글로불린을 분류하는 엔도솜으로부터 세포 표면으로 재순환시킴으로써 리소좀 분해로부터 면역글로불린을 구할 수 있음을 보여주었다 (Simister and Mostov (1989) An Fc receptor structually related to MHC class I antigens. Nature 337:184-187). 상기에서 설명된 것과 같이, 항체 재순환의 효율을 개선하기 위하여, 항체 서열에 대한 추가의 변형, 예컨대 산성 pH (예컨대 엔도솜의 pH)에서 감소된 항원 결합을 유발하는 변형을 만드는 한편, 중성 pH (예컨대 혈액과 같은 신체 체액의 pH)에서 항체-항원 친화성과 특이성을 보유하는 것이 유익하다. 경쇄 서열에서 비-히스티딘 잔기에 대해 히스티딘 잔기가 치환되어 있는, 본원에서 기술된 비-인간 동물이 유익한데, 왜냐하면 그것들은 pH-의존성 결합, 예컨대 중성 pH에 비해 산성 pH에서 항원에 대한 감소된 결합을 나타내는 보편적 경쇄 또는 한정된 경쇄 레퍼토리 (예컨대 DLC) 방식을 토대로 하여 고친화성 항체를 생성할 수 있기 때문이다.
그러므로 한 구체예에서, 그것의 게놈, 예컨대 생식선에 인간 경쇄 가변 유전자 절편의 제한된 레퍼토리로부터의 제한된 레퍼토리의 인간 경쇄 가변 영역, 또는 단일한 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 비-인간 동물 (예컨대 설치류, 예를 들면 마우스 또는 래트)이 본원에 제공되는데, 이때 인간 경쇄 가변 영역(들)은 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 적어도 하나의 치환을 포함한다. 어떤 구체예에서, 단일한 경쇄를 발현하는 (또는 2개의 경쇄 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하는) 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 (또는 2개의 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자)를 형성하도록 재배열하는 단일한 재배열되지 않은 인간 경쇄 가변 영역 유전자 절편 (또는 2개의 인간 경쇄 가변 영역 유전자 절편)을 포함하도록 유전자 엔지니어링된 비-인간 동물이 제공되는데, 이때 경쇄 가변 영역 유전자(들)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 이들 히스티딘-치환된 경쇄 가변 영역 유전자(들)에 의해 코드화된 재배열된 인간 경쇄 가변 도메인은 동물에 의해 선택된 다수의 친화성-성숙된 인간 중쇄와 짝을 이룰 수 있고, 이때 중쇄 가변 영역은 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다양한 구체예에서 비-히스티딘 잔기의 히스티딘 잔기로의 적어도 하나의 치환은, 동족의 중쇄와 함께 발현될 때 pH-의존성 방식으로 그것의 항원에 결합하는 재배열된 인간 경쇄를 유발한다.
제한된 레퍼토리의 인간 경쇄 가변 도메인, 또는 단일한 인간 경쇄 가변 도메인을 제한된 레퍼토리의 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열로부터 발현하는 유전자 엔지니어링된 동물이 제공되는데, 이때 가변 영역 유전자 서열은 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 적어도 하나의 치환을 포함한다. 어떤 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 단일 경쇄의 가변 영역을 발현하는 (또는 2개의 가변 영역 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하는) 단일한 V/J 인간 경쇄 서열 (또는 2개의 V/J 서열)을 포함하도록 유전자 엔지니어링된 동물이 제공된다. 한 측면으로, 가변 서열을 포함하는 경쇄는 동물에 의해 클론적으로 선택된 다수의 친화성-성숙된 인간 중쇄와 짝을 이룰 수 있고, 이때 중쇄 가변 영역은 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, 항체는 그것의 항원(들)에 pH-의존성 방식으로 결합한다. 한 구체예에서, 단일한 V/J 인간 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1로부터 선택된다. 한 구체예에서, 2개의 V/J 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1이다. 한 구체예에서, Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 서열은 재배열된 V/J 서열이다.
한 측면으로, 인간 JL 유전자 절편 (하나 또는 다수의 JL 절편으로부터 선택됨)과 재배열될 수 있고 면역글로불린 경쇄의 인간 가변 도메인을 코드화할 수 있는 단일한 인간 면역글로불린 경쇄 VL 유전자 절편을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공되는데, 이때 단일한 인간 면역글로불린 경쇄 VL 유전자 절편 및/또는 인간 JL 유전자 절편은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환 (예컨대 해당하는 인간 생식선 VL 및/또는 JL 유전자 절편에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환)을 포함한다. 다른 측면으로, 둘 이하의 인간 VL 유전자 절편을 포함하는 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이것들은 각각 인간 JL 유전자 절편 (하나 또는 다수의 JL 절편으로부터 선택됨)과 재배열될 수 있고 면역글로불린 경쇄의 인간 가변 도메인을 코드화할 수 있으며, 이때 둘 이하의 VL 유전자 절편 및/또는 JL 유전자 절편의 각각은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환 (예컨대 해당하는 인간 생식선 VL 및/또는 JL 유전자 절편에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환)을 포함한다. 어떤 특정 구체예에서, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편은 인간 Vκ1-39 유전자 절편, 인간 Vκ3-20 유전자 절편 및 그것들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 어떤 특정 구체예에서, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편은 인간 Vκ1-39 유전자 절편 및 인간 Vκ3-20 유전자 절편이다.
한 측면으로, 면역글로불린 경쇄의 인간 가변 도메인을 코드화하는 단일한 재배열된 (V/J) 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (즉 VL/JL 영역)을 포함하는 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 단일한 재배열된 가변 영역은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 다른 측면으로, 마우스는 면역글로불린 경쇄의 인간 가변 도메인을 코드화할 수 있는 2개 이하의 재배열된 인간 가변 영역을 포함하고, 이때 2개 이하의 재배열된 가변 영역의 각각은 적어도 하나의 히스티딘 코돈의 치환을 포함한다.
그러므로, 본원에는 또한 그것의 게놈, 예컨대 생식선에 인간 VL 및 JL 서열을 포함하는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공되는데, 이때 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환 (예컨대 해당하는 인간 생식선 VL 및/또는 JL 유전자 절편에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환)을 포함한다. 한 측면으로, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 인간 생식선 VL 및 JL 유전자 서열로부터 유도되지만, 히스티딘 치환(들)에 대해서는 그렇지 않다. 한 구체예에서, 인간 면역글로불린 경쇄는 인간 면역글로불린 κ사슬이다. 그러므로 한 구체예에서, 인간 VL 유전자 서열은 Vκ1-39 및 Vκ3-20으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 재배열된 Vκ1-39/J 또는 Vκ3-20/J 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 JL 유전자 서열은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5로부터 선택된다. 한 구체예에서, 인간 JL 서열은 Jκ1 및 Jκ5로부터 선택된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1으로부터 선택된다 (예컨대 그러나 히스티딘 치환(들)에 대해서는 그렇지 않다). 대체 구체예에서, 인간 면역글로불린 경쇄는 인간 λ 사슬이다.
또한, 한 구체예에서, 본원에는 게놈에, 예컨대 생식선에, 제한된 레퍼토리의, 예컨대 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공되며, 이때 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 및/또는 인간 JL 유전자 절편은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환, 예컨대 생식선 서열에 존재하는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함한다. 다른 구체예에서, 본원에는 게놈에, 예컨대 생식선에, 제한된 레퍼토리의, 예컨대 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공되며, 이때 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 및, 임의로, 인간 JL 유전자 서열(들)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환, 예컨대 해당하는 인간 생식선 서열에 존재하는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함한다. 그러므로, 한 측면으로, 동물의 생식선의 가변 유전자 절편 서열은, 히스티딘 치환(들)만 없다면 인간 생식선 VL 및/또는 JL 유전자 서열이다. 히스티딘 치환은, 재배열시, 재배열된 경쇄 서열이 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 함유하기 위해 디자인되도록 배치된다. 한 구체예에서, 인간 면역글로불린 경쇄는 인간 면역글로불린 κ 사슬이다. 그러므로, 한 구체예에서, 인간 VL 유전자 서열은 Vκ1-39 및 Vκ3-20으로부터 선택된다. 그러므로, 한 구체예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 그것의 게놈에, 예컨대 생식선에, 재배열되지 않은 인간 Vκ1-39 및 재배열되지 않은 인간 Vκ3-20 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 재배열되지 않은 인간 JL 절편 (예컨대 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및/또는 Jκ5 유전자 절편)을 포함하고, 이때 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편은 상기 인간 JL 절편과 재배열할 수 있으며, 생식선에 존재하는 각각의 가변 영역 유전자 절편 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환, 예컨대 생식선 서열에 존재하는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 다른 구체예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 그것의 게놈, 예컨대 생식선에, 재배열되지 않은 인간 Vκ1-39 및 재배열되지 않은 인간 Vκ3-20 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 재배열되지 않은 인간 JL 절편 (예컨대 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및/또는 Jκ5 유전자 절편)을 포함하고, 이때 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편은 상기 인간 JL 절편과 재배열할 수 있으며, 각각의 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고, 임의로 JL 절편은 또한 히스티딘 치환(들)을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5 유전자 절편을 포함한다. 그러므로, 한 구체예에서, κ 경쇄 유전자좌에 있는 VL 및, 임의로 JL 서열은 본질적으로 히스티딘 치환(들)만 없다면 생식선 서열이다.
한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환은 경쇄 가변 도메인의 상보성 결정 영역 (CDR)을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 일어난다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환은 경쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 또는 CDR3를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 일어난다. 한 특정 구체예에서, 치환은 CDR3를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 일어난다.
한 측면으로, 치환은 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 CDR3 코돈에서 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환이다. 한 구체예에서, 그 치환은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 CDR3 코돈의 치환이다. 비-인간 동물이 Vκ1-39Jκ5 가변 영역인 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하거나 또는 비-인간 동물이 그 중 하나가 Vκ1-39 유전자 절편인 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편을 포함하는 구체예에서, Vκ1-39 서열에서 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체는 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 CDR3를 코드화하는 면역글로불린 경쇄 유전자 서열의 위치에서의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105 및 106에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105 및 108에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 106 및 108에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 106 및 108에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 106 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 또 다른 구체예에서, 대체는 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 106 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 히스티딘-치환된 CDR3 영역의 핵산 및 아미노산 서열은 도 2의 서열 배열에 도시되고 SEQ ID NO:4 내지 33에 표시된다. 한 구체예에서, 야생형 CDR3 핵산 및 아미노산 서열 (도 2에 도시됨)은 각각 SEQ ID NO:2와 3에 표시된다. 히스티딘-치환된 CDR3 서열의 핵산 및 아미노산 서열의 다른 구체예들은 명세서 전체 및 서열 목록에 나타내고, 기술분야의 숙련자들에게 명백해야 한다.
비-인간 동물이 Vκ3-20Jκ1 가변 영역인 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하거나 또는 비-인간 동물이 그 중 하나가 Vκ3-20 유전자 절편인 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편을 포함하는 구체예에서, Vκ3-20 서열에서 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체는 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된 CDR3 영역을 코드화하는 면역글로불린 경쇄 유전자 서열의 위치에서의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105 및 106에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105 및 107에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 106 및 107에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 106 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 107 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 106 및 107에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 107 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 또 다른 구체예에서, 대체는 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 106 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 대체는 위치 105, 106, 107 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 히스티딘-치환된 영역의 핵산 및 아미노산 서열은 도 12의 서열 배열에 도시되고 SEQ ID NO:76 내지 79에 표시된다. 야생형 CDR3 핵산 및 아미노산 서열 (도 12에 도시됨)은 각각 SEQ ID NO:74와 75에 표시된다. 히스티딘-치환된 CDR3 서열의 핵산 및 아미노산 서열의 다른 구체예들은 명세서 전체 및 서열 목록에 나타내고, 기술분야의 숙련자들에게 명백해야 한다.
아미노산 위치 (105, 106 등)는 Lefranc et al. (2003) Dev. Comp. Immunol. 27:55-77에 기술된 독특한 넘버링을 토대로 하고, 또한 www.imgt.org 상에서도 볼 수 있다.
한 구체예에서, 인간 VL 유전자 절편은 인간 또는 비-인간 리더 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 리더 서열은 비-인간 리더 서열이다. 특정 구체예에서, 비-인간 리더 서열은 마우스 Vκ3-7 리더 서열이다. 특정 구체예에서, 리더 서열은 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편에 작동가능하게 연결된다. 특정 구체예에서, 리더 서열은 재배열된 인간 VL/JL 서열에 작동가능하게 연결된다. 그러므로 한 특정 구체예에서, 적어도 하나의 히스틴 치환을 포함하고 있는 단일한 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 가변 영역 유전자 서열은 마우스 Vκ3-7 리더 서열에 작동가능하게 연결된다. 다른 특정 구체예에서, 적어도 하나의 히스티딘 치환을 포함하고 있는 재배열되지 않은 인간 Vκ1-39 및/또는 Vκ3-20 유전자 절편은 마우스 Vκ3-7 리더 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 또 다른 구체예에서, 재배열되지 않은 인간 Vκ1-39 및/또는 Vκ3-20 유전자 절편은 인간 Vκ 리더 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 히스티딘 치환을 포함하는 재배열되지 않은 인간 Vκ1-39 유전자 절편은 인간 Vκ1-39 리더 서열에 연결되고, 적어도 하나의 히스티딘 치환을 포함하는 재배열되지 않은 인간 Vκ3-20 유전자 절편은 인간 Vκ3-20 리더 서열에 연결된다.
한 구체예에서, VL 유전자 절편은 면역글로불린 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 프로모터 서열은 인간 프로모터 서열이다. 특정 구체예에서, 인간 면역글로불린 프로모터는 인간 Vκ3-15 프로모터이다. 다른 특정 구체예에서, 인간 면역글로불린 프로모터는 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 프로모터이다. 특정 구체예에서, 프로모터는 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편에 작동가능하게 연결된다. 특정 구체예에서, 프로모터는 재배열된 인간 VL/JL 서열에 작동가능하게 연결된다. 그러므로 한 특정 구체예에서, 적어도 하나의 히스티딘 치환을 포함하고 있는 단일한 재배열된 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1 가변 영역 유전자 서열은 인간 Vκ3-15 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 다른 특정 구체예에서, 적어도 하나의 히스티딘 치환을 포함하고 있는 재배열되지 않은 인간 Vκ1-39 및/또는 Vκ3-20 유전자 절편은 각각 인간 Vκ3-15 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 다른 특정 구체예에서, 적어도 하나의 히스티딘 치환을 포함하고 있는 재배열되지 않은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편은 각각 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 프로모터에 연결된다.
한 구체예에서, 경쇄 유전자좌는 (a) 5' (VL 유전자 절편의 전사 방향에 대하여)에 인간 면역글로불린 프로모터와 (b) 3'에 인간 JL 절편과 재배열되는 인간 VL 유전자 절편이 있는 리더 서열을 포함하고 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하며; 경쇄 유전자좌는 역 키메릭 경쇄의 가변 도메인 및 내인성 비-인간 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 코드화한다. 특정 구체예에서, VL 및 JL 유전자 절편은 비-인간 Vκ 유전자좌에 있고, 비-인간 CL은 비-인간 Cκ (예컨대 마우스 Cκ)에 있다. 한 특정 구체예에서, 가변 영역 서열은 비-인간 불변 영역 서열, 예컨대 비-인간 Cκ 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열은 내인성 비-인간 서열이다. 다른 특정 구체예에서, CL은 인간 Cκ이다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 마우스이고 Cκ 유전자 서열은 마우스 Cκ 유전자 서열이다. 한 구체예에서, 인간 JL 절편과 재배열하고 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 인간 VL 유전자 절편은 내인성 비-인간 (예컨대 마우스) 면역글로불린 경쇄 유전자좌 (유전자좌)에 있다. 그 유전자좌의 예시적인 구체예들은 도 31a 및 33a에 제시된다.
한 구체예에서, 경쇄 유전자좌는 (a) 5'(VL 유전자 절편의 전사 방향에 대하여)에 인간 면역글로불린 프로모터와 (b) 3'에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 재배열된 인간 가변 영역 서열(VL/JL 서열)을 포함하고 경쇄 유전자좌는 역 키메릭 경쇄의 가변 도메인 및 내인성 비-인간 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 코드화한다. 특정 구체예에서,재배열된 인간 VL/JL 서열은 비-인간 카파(κ) 유전자좌에 있고, 비-인간 CL은 비-인간 Cκ이다. 한 특정 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 재배열된 인간 가변 영역 서열은 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열, 예컨대 비-인간 Cκ 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열은 내인성 비-인간 서열이다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 마우스이고 Cκ 유전자 서열은 마우스 Cκ 유전자 서열이다. 한 구체예에서, CL은 인간 CL이다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 내인성 비-인간 (예컨대 마우스) 면역글로불린 경쇄 유전자좌 (κ 유전자좌)에 있다. 유전자좌의 예시적인 구체예는 도 8c, 도 8e, 도 14c 및 도 14d에 도시된다.
한 구체예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스이고, 마우스의 가변 영역 유전자좌는 κ경쇄 유전자좌이며, κ경쇄 유전자좌는 마우스 κ 인트로닉 인핸서, 마우스 κ3' 인핸서 또는 인트로닉 인핸서와 3' 인핸서 둘 다를 포함한다.
한 구체예에서, 비-인간 동물 (예컨대 설치류, 예를 들면 래트 또는 마우스)은 비기능성 면역글로불린 람다 (λ) 경쇄 유전자좌를 포함한다. 특정 구체예에서, λ 경쇄 유전자좌는 유전자좌의 하나 또는 그 이상의 서열의 결실을 포함하는데, 그 하나 또는 그 이상의 결실은 λ 경쇄 유전자좌를 경쇄 유전자를 형성하기 위해 재배열하지 못하도록 만든다. 다른 구체예에서, λ 경쇄 유전자좌의 모든 또는 실질적으로 모든 VL 유전자 절편이 결실된다. 한 구체예에서, 비-인간 동물 (예컨대 설치류, 예를 들면 래트 또는 마우스)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고, 재배열되지 않은 기능성 면역글로불린 경쇄 가변 영역, 예컨대 재배열되지 않은 내인성 경쇄 가변 영역이 결핍되어 있는 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 재배열되고 히스티딘-치환된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 재배열되지 않은 내인성 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 대체한다. 다른 구체예에서, 비-인간 동물 (예컨대 설치류, 예를 들면 마우스 또는 래트)은 2개 이하의 인간 VL 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 절편을 포함하고, 이때 2개 이하의 인간 VL의 각각 및, 임의로, 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 절편은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고, 동물은 기능성 내인성 비-인간 경쇄 가변 영역이 결핍되어 있으며; 한 구체예에서, 히스티딘-치환된 서열은 내인성 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 대체한다. 다른 구체예에서, 비-인간 동물 (예컨대 설치류, 예를 들면 마우스 또는 래트)은 2개 이하의 인간 VL 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 절편을 포함하고, 이때 2개 이하의 인간 VL 의 각각 및/또는 인간 JL 절편은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고, 동물은 기능성 내인성 비-인간 경쇄 가변 영역이 결핍되어 있으며; 한 구체예에서, 히스티딘-치환된 서열은 내인성 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 대체한다.
한 구체예에서, 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 인간 가변 영역 서열로부터 유도된 체세포성 돌연변이된 가변 도메인을 포함하는 경쇄를 만든다. 한 구체예에서, 경쇄는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 인간 가변 영역 서열으로부터 유도된 체세포성 돌연변이된 가변 도메인과, 비-인간 또는 인간 Cκ 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 λ경쇄를 발현하지 않는다.
해당 기술분야의 숙련자는 비록 적어도 하나의 비-히스티딘 잔기의 히스티딘 잔기로의 치환(들)이 체세포성 과돌연변이로 인해 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역안으로 유전적으로 엔지니어링되긴 하지만, 유전자 변형된 비-인간 동물에서 생성된 모든 항체가 엔지니어링된 위치(들)에 히스티딘 잔기(들)을 은닉하지 않을 것임을 인지할 것이다. 그러나, 비-인간 동물에서 광범위한 레퍼토리의 항체의 생성은 생체 내에서 관심의 항원에 대해 고친화성을 나타내는 한편 생식선 안에 도입된 히스티딘 변형을 보유하고, 그로써 pH-의존성 항원 결합을 나타내는 항원-특이적 항체의 생성에 대한 선택을 허용할 것이다.
그러므로 한 구체예에서, 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 아미노산의 히스티딘으로의 치환을 보유한다. 한 구체예에서, 동물은 그것의 가변 영역 유전자 안으로 도입된 체세포성 돌연변이된 경쇄 가변 도메인에 모든 또는 실질적으로 모든 히스티딘 치환을 보유한다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물은 또한 그것의 게놈, 예컨대 생식선에 VH, DH 및 JH 유전자 절편 서열을 포함하는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, VH, DH 및 JH 유전자 절편 서열은 인간 VH, DH 및 JH 유전자 절편 서열이고, 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 인간 중쇄 가변 영역이다. 한 구체예에서, 인간 VH, DH 및 JH 유전자 절편 서열은 비-인간 중쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 비-인간 중쇄 불변 영역 서열은 내인성 비-인간 중쇄 불변 영역 서열이다. 다른 구체예에서, 중쇄 불변 영역 서열은 인간 중쇄 불변 영역 서열이다. 한 구체예에서, 인간 중쇄 유전자 절편 서열은 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 있다. 한 구체예에서, 비-인간 동물에 포함된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열은 또한 해당하는 생식선 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 비-인간 동물은 비-인간 경쇄 불변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 인간 경쇄 불변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 비-인간 동물은 CH1 서열, 힌지 서열, CH2 서열, CH3 서열 및 그것들의 조합으로부터 선택된 비-인간 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현한다.
한 구체예에서, 비-인간 동물은 CH1 서열, 힌지 서열, CH2 서열, CH3 서열 및 그것들의 조합으로부터 선택된 인간 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현한다.
동물이 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 동물이 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하고, 이때 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 및, 임의로, 인간 JL 서열(들)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함하는 (또는 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 및/또는 인간 JL 서열(들)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함하는) 구체예에서, 상기 동물의 생식선의 가변 영역 서열 또는 인간 VL 및 JL 절편들은 내인성 비-인간 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있다. 특정 구체예에서, 동물의 생식선에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 내인성 비-인간 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 비-인간 경쇄 V 및 J 절편 서열을 대체한다. 다른 특정 구체예에서, 동물의 생식선에 있는 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편, 이때 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 및, 임의로, 인간 JL 유전자 서열(들)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로에 대한 치환을 포함하는 (또는 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 및/또는 인간 JL 유전자 서열이 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로에 대한 치환을 포함하는) 유전자 절편들은 내인성 비-인간 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 비-인간 경쇄 V 및 J 절편 서열을 대체한다.
한 구체예에서, 비-인간 동물은 내인성 VH 유전자 절편의 하나 또는 그 이상의 인간 VH 유전자 절편으로의 대체를 포함하는데, 이때 인간 VH 유전자 절편은 비-인간 CH 영역 유전자에 작동가능하게 연결되어서 비-인간 동물이 인간 VH 유전자 절편을 재배열하고, 인간 VH 도메인과 비-인간 CH를 포함하는 역 키메릭 면역글로불린 중쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 90 내지 100%의 재배열되지 않은 비-인간 VH 유전자 절편이 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 절편으로 대체된다. 특정 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 (예컨대 90 내지 100%) 내인성 비-인간 VH 유전자 절편은 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 절편으로 대체된다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 19, 적어도 39 또는 적어도 80 또는 81의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 절편으로 일어난다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 12개의 기능성 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 절편으로, 적어도 25개의 기능성 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 절편으로 또는 적어도 43개의 기능성 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 절편으로 일어난다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 모든 비-인간 DH 및 JH 절편의 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 DH 절편 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JH 절편으로의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 모든 비-인간 DH 및 JH 절편의 모든 재배열되지 않은 인간 DH 절편 및 모든 재배열되지 않은 인간 JH 절편으로의 대체를 포함한다.
그것의 게놈, 예컨대 생식선에, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(들)을 가지는 제한된 레퍼토리의 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역, 예컨대 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (예컨대 Vκ1-39/Jκ5 또는 Vκ3-20/Jκ1), 예를 들면 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상 (예컨대 둘 또는 그 이상)의 인간 JL 유전자 절편 및 다양한 레퍼토리의 재배열되지 않은 인간 VH, DH 및 JH 절편을 가지는, 상기 기술된 비-인간 동물, 예컨대 마우스는 재배열되지 않은 인간 VH, DH 및 JH 절편의 다양한 과돌연변이로부터 유도된 중쇄 가변 영역 서열에 의해 코드화된 항원 결합 단백질을 생성할 수 있는데, 이때 중쇄 가변 서열에 존재하는 VH, DH 및 JH 절편은 동물의 게놈에 존재하는 모든 또는 실질적으로 모든 기능성 인간 VH, DH 및 JH 절편으로부터 유도된다. 본원에서 기술된 (즉 다양한 기능성 인간 V, D 및 J 절편의 조합으로부터 유도된) 유전자 변형된 동물의 세포, 예컨대 B 세포에서 발현된 중쇄 가변 도메인 서열에 대한 다양한 활용가능한 가능성은 미국 출원 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/192300 및 2013/0045492, 2013/0185821 및 2013/0198880에 기술되며, 그것들은 모두 본원에 참조로 포함된다. 다양한 구체예에서, 본원에서 기술된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(들) 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고 있는 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열 또는 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편은 비-인간 동물의 생식선에 포함된다. 어떤 구체예에서, 본원에 기술된 비-인간 동물은 그것의 이중 경쇄 유전자좌에 의해 코드화된 에피토프 결합 단백질을 생성할 수 있다.
한 구체예에서, 히스티딘-치환된 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고 있는 비-인간 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(들) 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열의 하나 또는 둘 다의 하나의 복사물을 포함한다. 다른 구체예에서, 비-인간 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(들) 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고 있는 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열의 하나 또는 둘 다의 2개의 복사물을 포함한다. 그러므로 비-인간 동물은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(들) 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고 있는 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열의 하나 또는 둘 다에 대해 동형접합성이거나 이형접합성일 수 있다.
다른 구체예에서, 2개 이하의 히스티딘-치환된 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 다수의 JL 절편 (예컨대 둘 또는 그 이상의 JL 절편)을 포함하고 있는 비-인간 동물은 2개의 히스티딘-치환된 인간 VL 유전자 절편이 동물의 게놈에서 나란히 놓이도록 포함된다. 어떤 구체예에서, 비-인간 동물은 2개의 히스티딘-치환된 인간 VL 유전자 절편이 나란히 놓여있는 유전자좌의 한 복사물을 포함하고; 다른 구체예에서, 비-인간 동물은 2개의 히스티딘-치환된 인간 VL 유전자 절편이 나란히 놓여있는 유전자좌의 2개의 복사물을 포함한다. 그러므로, 어떤 구체예에서, 비-인간 동물은 2개 이하의 나란히 놓여 있는 인간 VL 유전자 절편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성이거나 이형접합성이다. 어떤 구체예에서, 2개의 히스티딘-치환된 인간 VL 유전자 절편은 동물의 게놈에서 상이한 유전자좌에 있다 (예컨대 이형접합체로, 제 1 경쇄 대립유전자에 제 1 히스티딘-치환된 인간 VL 절편과 제 2 경쇄 대립유전자에 제 2 히스티딘-치환된 인간 VL 절편을 포함하며, 이때 제 1 및 제 2 인간 VL 절편은 동일하지 않다). 어떤 구체예에서, 동물은 또한 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 가변 유전자좌에 대해 이형접합성이거나 동형접합성이다. 어떤 구체예에서, 2개의 인간 히스티딘-치환된 VL 유전자 절편은 인간 Vκ1-39 유전자 절편 및 인간 Vκ3-20 유전자 절편이다. 한 구체예에서, 인간 JL 유전자 절편은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 및 그것들의 쌍을 이룬 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다양한 구체예에서, 내인성 VL 유전자 절편을 함유하는 면역글로불린 경쇄를 발현할 수 없는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 예를 들면 한 구체예에서, 제공되는 유전적으로 엔지니어링된 비-인간 동물은 내인성 VL 유전자 절편의 부분 또는 전부를 비활성화 및/또는 제거하는 유전자 변형을 함유한다.
그들의 게놈에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(들)을 포함하고 있는 (예컨대 경쇄의 CDR3에) 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열 (예컨대 제한된 레퍼토리의 경쇄 가변 유전자 절편을 가지는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열, 예를 들면 단일한 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열)을 포함하고 있는 유전자 변형된 비-인간 동물에 더불어, 본원에는 하나 또는 그 이상의 히스티딘 코돈(들)이 첨가된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하고 있어서, 발현된 가변 도메인이 만약 체세포성 과돌연변이가 일어나지 않는다면 히스티딘일 추가의 아미노산(들)을 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 한 구체예에서, 그런 히스티딘 코돈의 첨가는 인간 히스티딘-치환된 DH 서열을 마우스의 인간 경쇄 유전자좌에 삽입함으로써 도입될 수 있다. 또한, 경쇄 가변 도메인에 히스티딘 변형을 포함하고 있는 본원에 기술되는 동물들은 또한 중쇄 가변 도메인에도 히스티딘 변형을 함유할 수 있다, 예컨대 동물들은 또한 인간 중쇄 가변 도메인에 히스티딘 변형을 함유할 수 있다.
본원에서 기술된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하고 있는 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소 (예컨대 젖소, 황소, 물소), 양, 사슴, 염소, 닭, 고양이, 개, 페럿, 영장류 (예컨대 마모셋, 붉은털 원숭이)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 적당한 유전자 변형가능한 ES 세포를 쉽게 구할 수 없는 비-인간 동물인 경우에 본원에 기술된 것과 다른 방법들이 유전자 변형을 포함하는 비-인간 동물을 제조하기 위하여 사용된다. 그러한 방법으로는 예를 들면 비-ES 세포 게놈 (예컨대 섬유아세포 또는 유도된 다능성 세포)을 변형시키고, 변형된 게놈을 적당한 세포, 예컨대 난모세포에 전달하기 위해 핵전달을 사용하며, 변형된 세포 (예컨대 변형된 난모세포)를 배 (embryo)를 형성하기에 적당한 조건 하에서 비-인간 동물에 잉태시키는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 본원에 기술되는 비-인간 동물은 4배체 상보성을 통해 생성될 수 있다.
한 측면으로, 비-인간 동물은 포유류이다. 한 측면으로, 비-인간 동물은 작은 포유류, 예컨대 다이포도이데아 또는 뮤로이데아 슈퍼패밀리의 포유류이다. 한 구체예에서, 유전자 변형된 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택된다. 한 구체예에서, 설치류는 뮤로이데아 슈퍼패밀리로부터 선택된다. 한 구체예에서, 유전자 변형된 동물은 칼로마이시다에 (예컨대 마우스-유사 햄스터), 크리세티다에 (예컨대 햄스터, 신세계 래트 및 마우스, 들쥐), 뮤리다에 (트루 마우스 및 래트, 게르빌루스쥐, 아프리카 가시쥐 및 크레스티드 래트), 네소마이다에 (클라이밍 마우스, 락 마우스, 꼬리가 달린 래트, 마다가스카라 래트 및 마우스), 플라타칸토마이다에 (예컨대 가시가 있는 동면쥐류) 및 스팔라시다에 (예컨대 두더지, 대나무 쥐 및 조코)로부터 선택된 패밀리로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 유전자 변형된 설치류는 트루 마우스 또는 래트 (뮤리다에 패밀리), 게르빌루스 래트, 아프리카 가시쥐 및 크레스티드 래트로부터 선택된다. 한 구체예에서, 유전자 변형된 마우스는 뮤리다에 패밀리의 구성원으로부터 유래한다. 한 구체예에서, 동물은 설치류이다. 특정 구체예에서, 설치류는 마우스와 래트로부터 선택된다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 마우스이다.
한 구체예에서, 비-인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C58BL 계통의 마우스이다. 다른 구체예에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예컨대 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/ScEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2로 구성되는 군으로부터 선택된 129 계통이다 (예컨대 Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, Auerbach et al. (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). 특정 구체예에서, 유전자 변형된 마우스는 상기 언급된 129 계통과 상기 언급된 C57BL/6 계통의 혼합이다. 다른 특정 구체예에서, 마우스는 상기언급된 129 계통끼리의 혼합, 또는 상기 언급된 BL/6 계통의 혼합이다. 특정 구체예에서, 혼합의 129 계통은 129S6 (129/SvEvTac) 계통이다. 다른 구체예에서, 마우스는 BALB 계통, 예컨대 BALB/c 계통이다. 또 다른 구체예에서, 마우스는 BALB 계통과 다른 상기 언급된 계통의 혼합이다.
한 구체예에서, 비-인간 동물은 래트이다. 한 구체예에서, 래트는 위스타 래트, LEA 계통, 스프라그 도울리 계통, 피셔 계통, F344, F6 및 검은 아구터로부터 선택된다. 한 구체예에서, 래트 계통은 위스타, LEA, 스프라그 도울리, 피셔, F344, F6 및 검은 아구터로 구성되는 군으로부터 선택된 둘 또는 그 이상의 계통의 혼합이다.
그러므로 한 구체예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 래트 또는 마우스이다. 한 구체예에서, 동물은 마우스이다. 그러므로, 한 구체예에서, 본원에는 그것의 게놈, 예컨대 생식선에 인간 VL 및 JL 유전자 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하고 있는 유전자 변형된 마우스가 제공되는데, 이때 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 해당하는 인간 생식선 서열에 의해 코드화된 적어도 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 재배열되지 않은 기능성 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 결핍되어 있다 (예컨대 재배열되지 않은 기능성 Vκ 및 Jκ 유전자 절편 서열이 결핍되어 있다). 한 구체예에서, 히스티딘 코돈의 치환(들)이 포함된 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 Vκ1-39/Jκ 또는 Vκ3-20/Jκ 가변 영역이다. 한 구체예에서, Jκ 절편 서열은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5로부터 선택된다. J 절편 서열은 Jκ1 또는 Jκ5이다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 CDR3 영역을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 있다. 한 구체예에서, 재배열된 가변 영역 서열이 Vκ1-39/Kκ5인 경우, 히스티딘 치환(들)은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 발현되도록 디자인된다. 다른 구체예에서, 재배열된 가변 영역 서열이 Vκ3-20/Jκ1 서열인 경우, 히스티딘 치환(들)은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 발현되도록 디자인된다. 한 구체예에서, 치환된 히스티딘 코돈(들)을 가지는 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 내인성 마우스 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열 (예컨대 Cκ 유전자 서열)에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 마우스는 추가로 그것의 게놈, 예컨대 생식선에 인간 VH, DH 및 JH 절편을 포함하는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 VH, DH 및 JH 절편은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다. 다양한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환(들)을 포함하는 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열과 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열은 마우스의 생식선에 포함된다.
또한 어떤 구체예에서, 본원에는 게놈, 예컨대 생식선에, 제한된 레퍼토리의, 예컨대 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 유전자 변형된 마우스가 제공되며, 이때 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 및/또는 인간 JL 유전자 절편은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환, 예컨대 해당하는 인간 생식선 서열에 존재하는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본원에는 게놈, 예컨대 생식선에, 제한된 레퍼토리의, 예컨대 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상 (예컨대 2, 3, 4 또는 5개)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 유전자 변형된 마우스가 제공되며, 이때 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 및, 임의로, 인간 JL 유전자 절편(들)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환, 예컨대 해당하는 인간 생식선 서열에 존재하는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 기능성 재배열되지 않은 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 결핍되어 있다 (예컨대 기능성 재배열되지 않은 내인성 면역글로불린 V 및 J 유전자 절편 서열이 결핍되어 있다). 한 구체예에서, 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편은 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편이다. 한 구체예에서, J절편 서열은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 및 그것들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 CDR3 영역을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 일어난다. 재배열되지 않은 VL 절편이 Vκ1-39 유전자 절편인 한 구체예에서, 히스티딘 치환(들)은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 발현되도록 디자인된다. 재배열되지 않은 VL 절편이 Vκ3-20유전자 절편인 다른 구체예에서, 히스티딘 치환(들)은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 발현되도록 디자인된다. 한 구체예에서, 히스티딘 코돈(들)의 치환(들)을 포함하는, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상, 인간 JL 유전자 절편을 포함하고 있는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 내인성 마우스 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열 (예컨대 Cκ 유전자 서열)에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 히스티딘 코돈(들)의 치환(들)을 포함하는, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편을 포함하고 있는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 인간 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열 (예컨대 Cκ 유전자 서열)에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 마우스는 추가로 그것의 게놈, 예컨대 생식선에, 인간 VH, DH, and JH 절편을 포함하는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 VH, DH 및 JH 절편은 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다. 다른 구체예에서, 인간 VH, DH 및 JH 절편은 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다. 다양한 구체예에서, 히스티딘 코돈(들)의 치환(들)을 포함하는, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편 및 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하고 있는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열은 마우스의 생식선에 포함된다.
또한 본원에는 본원에서 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물, 예컨대 마우스를 제조하기 위한 표적화 벡터가 제공된다. 한 측면으로, 벡터의 5' 마우스 상동성 아암, 인간 또는 마우스 면역글로불린 프로모터, 인간 또는 마우스 리더 서열, 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1로부터 선택되고 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 인간 가변 영역 및 3' 마우스 상동성 아암을 포함하는 표적화 벡터가 제공된다. 한 구체예에서, 5' 및 3' 상동성 아암은 5'에 및 마우스 Cκ 유전자 가까이에 존재하는 인핸서 서열에 대하여 서열 5'에 벡터를 표적화한다. 다른 구체예에서, 표적화 벡터는 5' 마우스 상동성 아암과 이어서 양옆에 재조합 부위가 있는 선택 카세트, 인간 또는 마우스 면역글로불린 프로모터, 인간 또는 마우스 리더 서열, 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1로부터 선택되고 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 인간 가변 영역과, 이어서 마우스 인핸서 및 불변 영역 (Cκ) 서열을 포함하는 3' 마우스 상동성 아암을 포함한다.
다른 측면으로, 본원에는 5' 마우스 상동성 아암; 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 다수 (예컨대 둘 또는 그 이상, 예를 들면 2, 3, 4 또는 5개)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하고, 이때 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 및, 임의로, 인간 JL 유전자 절편 서열(들)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환, 예컨대 인간 생식선 서열에 존재하는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함하며, 각각의 재배열되지 않은 VL 유전자 절편은 인간 또는 마우스 리더 서열 및 인간 또는 마우스 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 인간 가변 영역; 및 3' 마우스 상동성 아암을 포함하는 표적화 벡터가 제공된다. 한 구체예에서, 5' 및 3' 상동성 아암은 벡터를 5' 및 마우스 Cκ 유전자에 근접하게 존재하는 인핸서 서열에 대하여 5' 서열쪽으로 표적화한다. 다른 구체예에서, 표적화 벡터는 5' 마우스 상동성 아암과 이어서 재조합 부위가 양옆에 있는 선택 카세트; 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 다수 (예컨대 둘 또는 그 이상, 예를 들면 2, 3, 4 또는 5개)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하고, 이때 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 및, 임의로, 인간 JL 유전자 절편 서열(들)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환, 예컨대 인간 생식선 서열에 존재하는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함하며, 각각의 재배열되지 않은 VL 유전자 절편은 인간 또는 마우스 리더 서열 및 인간 또는 마우스 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 인간 가변 영역; 이어서 마우스 인핸성 및 불변 영역 (Cκ) 서열을 포함하는 3' 마우스 상동성 아암을 포함한다.
선택 카세트는 관심의 구성물이 통합되어 있는 세포 (예컨대 박테리아 세포, ES 세포 등)의 선택을 용이하게 하기 위해 표적화 구성물 안에 도입된 뉴클레오티드 서열이다. 많은 적당한 선택 카세트가 해당 기술분야에 공지되어 있다. 통상적으로, 선택 카세트는 특정 항생물질 (예컨대 Neo, Hyg, Pur, CM, Spec 등)의 존재하에 포지티브 선택을 가능하게 한다. 또한 선택 카세트는 양옆에 재조합 부위가 있을 수 있는데, 그것은 재조합 효소로 처리될 때 선택 카세트의 결실을 가능하게 한다. 통상적으로 사용되는 제한 부위는 Cre와 Flp 효소에 의해 인지되는 loxP와 Frt이지만, 다른 것들도 해당 기술분야에 알려져 있다.
한 구체예에서, 프로모터는 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 절편 프로모터이다. 특정 구체예에서, 프로모터는 인간 Vκ3-15 프로모터이다. 다른 구체예에서, 프로모터는 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 프로모터이다. 한 구체예에서, 리더 서열은 마우스 리더 서열이다. 특정 구체예에서, 마우스 리더 서열은 마우스 Vκ3-7 리더 서열이다. 다른 구체예에서, 리더 서열은 인간 리더 서열이다. 특정 구체예에서, 인간 리더 서열은 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 리더 서열이다. 단일한 재배열된 인간 가변 영역을 포함하는 표적화 벡터의 예시적인 구체예는 도 8b와 도 14b에 제시된다. 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 다수의 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 인간 가변 영역을 포함하는 표적화 벡터의 예시적인 구체예들은 도 31a 및 33a에 제시된다.
한 측면으로 상기에서 기술된 것과 같은 표적화 벡터가 제공되지만, 5' 마우스 상동성 아암 대신 인간 또는 마우스 프로모터가 부위-특정 재조합효소 인지 부위 (SRRS)와 함께 5' 옆에 있고, 3' 마우스 상동성 아암 대신 인간 VL 영역이 SRRS와 함께 3' 옆에 있다.
또한 본원에는 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물 (예컨대 설치류, 예를 들면 마우스 또는 래트)을 제조하는 방법이 제공된다. 한 측면으로, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물의 제조방법은 VELOCIGENE® 기술을 사용하여, 실시예에서 기술되는 것과 같이, 구성물을 ES 세포 안에 도입시키고, 표적화된 ES 세포를 VELOCIMOUSE® 기술을 사용하여 마우스 배 안에 도입시키는 표적화 벡터를 활용한다. 히스티딘 변형은 다양한 분자 생물학 기법, 예컨대 부위 특정 돌연변이생성 또는 새로운 DNA 합성을 사용하여 표적화 벡터 안에 도입될 수 있다. 유전자 표적화가 완료되면, 유전자 변형된 비-인간 동물의 ES 세포가 스크리닝되어 관심의 외인성 뉴클레오티드 서열의 성공적인 통합 또는 외인성 폴리펩티드의 발현이 확인된다. 많은 기법들이 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는데, 예를 들면 (그것들에 한정되는 것은 아니지만) 서던 블롯팅, 긴 PCR, 정량적 PCR (예컨대 TAQMAN®을 사용하는 실시간 PCR), 형광 제자리 혼성화, 노던 블롯팅, 유동세포 분석, 웨스턴 분석, 면역세포 화학, 면역조직학 등을 포함한다. 한 실시예에서, 관심의 유전자 변형을 포함하고 있는 비-인간 동물 (예컨대 마우스)은 문헌 (Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659)에서 기술된 대립유전자 분석의 변형을 사용하여 마우스 대립유전자의 손실 및/또는 인간 대립유전자의 획득에 대해 스크리닝됨으로써 확인될 수 있다. 유전자 변형된 동물에서 특정 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 확인하는 다른 분석은 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있다.
그러므로 한 구체예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물의 제조 방법은 동물의 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열 (인간 VL 및 JL 유전자 절편을 포함한다)로 대체하는 것을 포함하고, 이때 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 CDR 영역, 예컨대 CDR3 영역을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 있다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물의 제조 방법은 동물의 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 인간 VL 및 JL 유전자 절편 서열을 포함하고 있는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열로 대체하는 것을 포함하는데, 이때 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열은 해당하는 인간 생식선 서열에 의해 코드화되지 않은 적어도 하나의 히스티딘을 포함하고, 예를 들면 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환, 예컨대 해당하는 인간 생식선 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 치환은 CDR 코돈에 있다. 한 구체예에서, 치환은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 CDR3 코돈(들)의 치환이다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 Vκ1-39/Jκ5 및 Vκ3-20/Jκ1로부터 선택된 인간 생식선 재배열된 경쇄 가변 영역 서열을 토대로 한다. 그러므로 한 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열이 Vκ1-39Jκ5로부터 유도된 경우, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체는 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열이 Vκ3-20κ1로부터 유도된 경우, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체는 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물의 제조 방법은 동물의 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을, 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 다수 (예컨대 둘 또는 그 이상, 예를 들면 2, 3, 4 또는 5개)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하고, 이때 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 및, 임의로, 인간 JL 유전자 절편 서열(들)은 해당하는 인간 생식선 가변 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘을 포함하며, 예를 들면 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 및, 임의로, 인간 JL 유전자 절편 서열(들)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환, 예컨대 인간 생식선 서열에 존재하는 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 서열로 대체하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 치환은 CDR 코돈에서 일어난다. 한 구체예에서, 치환은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 CDR3 코돈(들)의 치환이다. 한 구체예에서, 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편은 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편이다. 한 구체예에서, 재배열되지 않은 인간 JL 절편은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 및 그것들의 조합으로부터 선택된다. 그러므로, 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편이 Vκ1-39인 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체는 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다. 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편이 Vκ3-20인 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 대체는 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘을 발현하도록 디자인된다.
다른 구체예에서, 본원에 기술된 비-인간 동물 (즉 본원에 기술된 유전자 변형된 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하는)의 제조 방법은 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있는 비-기능성 내인성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 절편을 결실시키거나 비-기능성으로 만들기 위하여 비-인간 동물의 게놈을 변형시키고, 게놈에 (1) 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열 또는 (2) 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 다수 (예컨대 둘 또는 그 이상, 예를 들면 2, 3, 4 또는 5개)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하고, 이때 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 및, 임의로, 인간 JL 유전자 절편 서열(들)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함하는 (또는 각각의 인간 VL 및/또는 인간 JL 유전자 절편 서열(들)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함하는) 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 서열을 위치시키는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 관심의 항원에 대해 pH 의존성 결합을 나타내는 항체에 대해 풍부해진 B 세포들의 집단을 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물을 유발한다.
어떤 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물의 제조 방법은 상기에서 설명된 것과 같이, 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열이 인간 VH, DH 및 JH 서열의 각각 또는 레퍼토리의 적어도 하나를 포함하고 있는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열로 대체되어 있는 동물에서 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로이 치환(들)을 포함하고 있는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열로 대체하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열로 내인성 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 대체하는 것과 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열로의 대체를 포함하고 있는 비-인간 동물을 제조하기 위하여, 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 대체를 포함하는 동물은 중쇄 가변 영역 유전자 서열의 대체를 포함하는 동물로 사육된다.
본 발명자들은 하나 또는 그 이상의 히스티딘 변형을 포함하는 보편적 경쇄, 예컨대 인간 보편적 경쇄 (예컨대 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역으로부터 유도된 경쇄), 또는 제한된 또는 한정된 가변 절편 레퍼토리 (예컨대 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 다수 (예컨대 둘 또는 그 이상)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하는)를 가지는 경쇄를 포함하는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체를 발현하는 유전자 엔지니어링된 비-인간 동물 (예컨대 설치류, 예를 들면 래트 또는 마우스)을 제공하는데, 이때 항원-결합 단백질은 표적 항원의 pH-의존성 항원 결합을 나타낸다. 어떤 구체예에서, 동물은 하나 또는 그 이상의 히스티딘 변형을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하도록 유전자 엔지니어링된다. 다양한 구체예에서, 경쇄 CDR3는 클러스터로 2, 3 또는 4 또는 그 이상의 히스티딘 잔기를 포함한다.
한 구체예에서, 본원에는 야생형 동물에 비교하여 면역글로불린 경쇄, 예컨대 면역글로불린 가변 도메인, 예를 들면 면역글로불린 CDR에 증대된 히스티딘 존재를 특징으로 하는 B 세포들의 집단을 포함하는 유전자 엔지니어링된 비-인간 동물 (예컨대 마우스 또는 래트)이 제공된다.
한 구체예에서, 본원에는 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 코돈 변형의 결과로서 히스티딘 잔기(들)를 발현하는 항원-특이적 항체의 집단을 포함하고 표적 항원의 pH-의존성 결합을 나타내는 유전자 엔지니어링된 비-인간 동물이 제공된다. 한 구체예에서, 이들 동물은 항체, 예컨대 항원-특이적 항체에 대해 풍부해지고, 본원에 기술된 면역글로불린 경쇄 가변 영역에 인간 생식선 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하지 않은 동물에서 생성된 항원-특이적 항체의 집단에 비교하여 pH-의존성 결합 특성 (예컨대 산성 pH 대 중성 pH에서 감소된 해리성 반감기 (t1/2))을 나타내는 B 세포들의 집단을 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 영역에 히스티딘 치환을 포함하는 유사한 동물에 비교하여 본원에서 기술된 유전자 엔지니어링된 동물에서 생성된 pH-의존성 항원 결합 특성을 나타내는 항원-특이적 항체의 풍부화는 약 2배 이상, 예컨대 약 5배 이상, 예를 들면 약 10배 이상 더 크다. 한 구체예에서, 풍부화는 약 2 내지 3배이다. 그러므로, 발명의 유전자 변형된 동물은 향상된 항체 재활용 특성을 가지는 항체들에 대해 풍부해지고, 그것은 그런 생체 내 생성된 항체 방식을 토대로 개발된 치료 항원-결합 단백질의 용량 및/또는 투여 빈도를 줄이기 위해서뿐 아니라 표적-중재된 클리어런스를 감소시키기 위해 바람직하다.
그러므로 본원에는 본원에서 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 생성된 항원-결합 단백질이 제공되는데, 그 항원-결합 단백질은 pH-의존성 항원 결합을 나타낸다. 한 구체예에서 항원-결합 단백질은 항체, 예컨대 항원-특이적 항체이다. 한 구체예에서, 항체는 생식선 유전자 서열에서 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈이 히스티딘 코돈에 대해 치환되어 있고, 항체가 그것의 발현된 인간 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유하고 있는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 절편의 재배열로부터 유도된 인간 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열로부터 유도된 인간 경쇄 가변 도메인을 포함하는데, 이때 단일한 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고, 항체는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유한다. 한 구체예에서, 항체는 인간 Vκ1-39/J 또는 Vκ3-20/J (예컨대 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1) 재배열로부터 유도된 경쇄를 포함하는데, 이때 인간 Vκ1-39J 또는 Vκ3-20J 유전자 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고, 항체는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유한다. 다른 구체예에서, 항체는 생식선 유전자좌에 존재하는 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 재배열로부터 유도된 인간 경쇄 가변 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하고, 이때 생식선 유전자좌에 존재하는 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 다수 (예컨대 둘 또는 그 이상)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하며, 각각의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및, 임의로, 인간 JL 유전자 절편(들)은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈에 대한 치환을 포함하며, 항체는 그것의 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유한다. 한 구체예에서, 항체는 J 절편과 재배열된 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20으로부터 유도된 경쇄를 포함하며, 그렇게 재배열된 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 서열은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고, 항체는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유한다. 어떤 구체예에서, 항체는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 모든 또는 실질적으로 모든 히스티딘 치환을 보유한다. 한 구체예에서, 항체는 그것의 경쇄 가변 도메인에 모든 히스티딘 치환의 적어도 50%, 적어도 66%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%를 보유한다. 한 구체예에서, 치환은 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 CDR3를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 3개의 비-히스티딘 코돈의 3개의 히스티딘 코돈으로의 치환이고, 항체는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 3개의 모든 히스티딘 치환을 보유한다. 다른 구체예에서, 치환은 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 CDR3을 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 3개의 비-히스티딘 코돈의 3개의 히스티딘 코돈으로의 치환이고, 항체는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 둘 또는 3개의 히스티딘 치환을 보유한다. 한 구체예에서, 치환은 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 CDR3를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에서 4개의 비-히스티딘 코돈의 3개의 히스티딘 코돈으로의 치환이고, 항체는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 3개 또는 4개의 히스티딘 치환을 보유한다. 다른 구체예에서, 항체는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 1, 2, 3, 4 및 거의 전부의 히스티딘 변형을 보유한다.
한 구체예에서, 항체의 경쇄는 추가로 비-인간 경쇄 불변 영역 아미노산 서열, 예컨대 내인성 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 또한 본원에서 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 생성된 항체, 예컨대 항원-특이적 항체는 인간 중쇄 V, D 및 J 절편의 재배열로부터 유도된 인간 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 인간 중쇄 V, D 및 J 절편은 내인성 비-인간 중쇄 유전자좌에 존재하는 인간 중쇄 절편의 레퍼토리, 예컨대 적어도 하나의 기능성 V, 적어도 하나의 기능성 D 및 적어도 하나의 기능성 J 절편, 예를 들면 거의 완전한 레퍼토리의 기능성 인간 V, D 및 J 절편으로부터 선택될 수 있다. 인간 중쇄 가변 절편의 예시적인 가능한 재배열은 IMGT 데이터베이스의 기능성 인간 V, D 및 J 절편의 목록으로부터, 및 미국 출원 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192309 및 2013/0045492로부터 얻을 수 있다. 나아가 한 구체예에서, 항체의 중쇄는 비-인간 중쇄 불변 영역 아미노산 서열, 예컨대 내인성 비-인간 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 비-인간 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 IgG, IgE, IgD, IgM 또는 IgA 아이소타입이다.
그러므로, 한 구체예에서, 본원에는 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 생성된 결합 단백질이 제공되며, 그 결합 단백질은 (a) 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 인간 Vκ1-39 내지 Jκ 재배열 (예컨대 Vκ1-39Jκ5 재배열)로부터 유도된 경쇄 가변 도메인, 이때 경쇄는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유하고, 및 (b) 비-인간, 예컨대 마우스 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 역 키메릭 경쇄를 포함하는데, 이때 경쇄는 (a) 동물에 존재하는 인간 V, D 및 J 절편의 레퍼토리로부터 선택된 인간 V, D 및 J 절편의 재배열로부터 유도된 중쇄 가변 도메인 및 (b) 비-인간, 예컨대 마우스 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 역 키메릭 중쇄와 결합된다. 한 구체예에서, 인간 V, D 및 J 절편의 레퍼토리는 적어도 하나의 기능성 V, 적어도 하나의 기능성 D 및 적어도 하나의 기능성 J 절편, 예컨대 기능성 인간 V, D 및 J 절편의 거의 완전한 레퍼토리를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인은 내인성 중쇄 및 경쇄 불변 도메인이다. 한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 체세포성 돌연변이된 도메인이다. 한 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 경쇄 도메인은 생식선 서열 안에 도입된 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유한다. 어떤 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 경쇄 도메인은 생식선 서열 안에 도입된 모든 또는 실질적으로 모든 히스티딘 치환을 보유한다. 한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 pH-의존성 항원 결합 특성을 나타낸다.
다른 구체예에서, 본원에는 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 생성된 결합 단백질이 제공되며, 그 결합 단백질은 (a) 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 인간 Vκ3-20 내지 Jκ 재배열 (예컨대 Vκ3-20Jκ1 재배열)로부터 유도된 경쇄 가변 도메인, 이때 경쇄는 그것의 발현된 경쇄 가변 도메인에 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유하고, 및 (b) 비-인간, 예컨대 마우스 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 역 키메릭 경쇄를 포함하는데, 이때 경쇄는 (a) 동물에 존재하는 인간 V, D 및 J 절편의 레퍼토리로부터 선택된 인간 V, D 및 J 절편의 재배열로부터 유도된 중쇄 가변 도메인 및 (b) 비-인간, 예컨대 마우스 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하는 역 키메릭 중쇄와 결합된다. 한 구체예에서, 인간 V, D 및 J 절편의 레퍼토리는 적어도 하나의 기능성 V, 적어도 하나의 기능성 D 및 적어도 하나의 기능성 J 절편, 예컨대 기능성 인간 V, D 및 J 절편의 거의 완전한 레퍼토리를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인은 내인성 중쇄 및 경쇄 불변 영역이다. 한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 체세포성 돌연변이된 도메인이다. 한 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 경쇄 도메인은 생식선 서열 안에 도입된 적어도 하나의 히스티딘 치환을 보유한다. 어떤 구체예에서, 체세포성 돌연변이된 경쇄 도메인은 생식선 서열 안에 도입된 모든 또는 실질적으로 모든 히스티딘 치환을 보유한다. 한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 pH-의존성 항원 결합 특성을 나타낸다.
한 구체예에서, 본원에는 또한 그것의 생식선에 히스티딘-변형된 인간 경쇄 가변 영역 서열, 예컨대 본원에 기술된 히스티딘-변형된 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 서열 또는 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 다수 (예컨대 둘 또는 그 이상)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하고 있는 히스티딘-변형된 인간 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고 본원에 기술된 항원-결합 단백질을 발현하는, 본원에 기술된 유전자 변형된 동물의 B 세포가 제공된다. 한 구체예에서, B 세포에서 발현된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 생식선에 도입된 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 보유하고, pH-의존성 항원-결합 특성을 나타낸다. 어떤 구체예에서, B 세포에서 발현된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 생식선 안에 도입된 모든 또는 실질적으로 모든 히스티딘 잔기를 보유하고, pH-의존성 항원-결합 특성을 나타낸다.
다양한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자-변형된 비-인간 동물은 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열, 예컨대 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환 (또는 히스티딘 코돈의 생식선 서열 안으로의 첨가)을 포함하는 히스티딘-변형된 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열 (예컨대 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 서열) 또는 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 다수 (예컨대 둘 또는 그 이상)의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하고 있는 히스티딘-변형된 인간 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 이들 첨가 또는 치환은 그것들의 항원에 대해 pH 의존성 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질에 대해 풍부해진 B 세포들의 집단을 포함하는 비-인간 동물을 유발한다. 한 구체예에서, 항원 자극에 대한 반응으로 본원에 기술된 비-인간 동물에서 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 pH 의존성 항원 결합을 나타내는 한편, 혈액과 같은 체액의 중성 pH, 예컨대 약 7.0 내지 약 8.0의 pH, 예를 들면 약 7.0 내지 약 7.4의 pH, 예컨대 약 7.2 내지 약 7.4의 pH에서 항원에 대해 고친화성을 나타낸다. 한 구체예에서, 중성 pH에서 해리 상수 (KD)로서 표시되는 항원-결합 단백질의 그것의 항원에 대한 친화성은 10-6M 미만, 예컨대 10-8M 미만, 예컨대 10-9M 미만, 예컨대 10-10M 미만, 예컨대 10-11M 미만, 예컨대 10-12M 미만이다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 중성 pH에 비교하여 산성 pH (예컨대 6.0 또는 그 이하의 pH, 예컨대 약 5.0 내지 약 6.0의 pH, 약 5.75 내지 약 6.0의 pH, 예컨대 엔도솜 또는 리소좀 구획의 pH)에서 그것의 항원에 대해 감소된 결합을 나타낸다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 산성 pH에서 항원에 해한 결합을 나타내지 않는 반면, 중성 pH에서는 항원에 대한 결합을 보유한다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 생성된 항원-결합 단백질은 중성 pH에서의 항원-결합 단백질의 해리성 반감기 (t1/ 2)에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배의 해리성 반감기 (t1/ 2)의 감소를 나타낸다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 발현된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 37℃에서 약 2분 또는 그 이하의 t1/2를 나타낸다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 발현된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 37℃에서 약 1분 또는 그 이하의 t1/2를 나타낸다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 발현된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 25℃에서 약 2분 또는 그 이하의 t1/2를 나타낸다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 발현된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 25℃에서 약 1분 또는 그 이하의 t1/2를 나타낸다.
동역학적 매개변수, 예컨대 평형 해리 상수 (K D) 및 해리성 반감기 (t1/ 2)는 다음 식과 같이 동역학 속도 상수로부터 계산될 수 있다: K D (M)=k d/k a; 및 t1/2 (분)=ln2/(60*k d).
한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 FcRn 분자에 대해 증가된 결합을 나타낸다. 상기에서 기술된 것과 같이, FcRn은 산성 pH에서 면역글로불린에 결합할 수 있고 그것들을 표면으로 되돌려보낼 수 있는, 엔도솜 구획 내부에 존재하는 수용체이다. 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 항체 분자를 스크리닝하는 것은 다음의 세 가지 유익한 매개변수를 가지는 항체에 대한 독특한 선택의 기회를 제공한다: 항원에 대한 높은 친화성, pH-의존성 항원 결합 (산성 pH에서는 보다 더 약하게 항원에 결합한다) 및 FcRn에 대한 증가된 결합.
한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물은, 생성되고, 치료제 안에 재구성될 때, 그것의 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 히스티딘 변형(들)을 포함하지 않은 비-인간 동물에서 동일한 항원에 대한 반응으로 생성된 동등한 B 세포들의 집단을 능가하는 치료적 용량으로 대상에게 투여될 때 증가된 혈청 반감기를 나타내는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체에 대해 풍부해지는, 항원에 대한 반응인 B 세포들의 집단을 포함한다. 그러므로 한 구체예에서, 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 관심의 항원에 대한 반응으로 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 치료제 안에 재구성될 때, 그것의 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 히스티딘 변형(들)을 포함하지 않는 비-인간 동물에서 동일한 항원에 대한 반응으로 생성된 항원-결합 단백질 (치료제 안에 재구성되고 동일한 치료 용량으로 투여될 때)의 혈청 반감기를 능가하는 치료제 용량으로 대상에게 투여될 때 증가된 혈청 반감기를 나타낸다. 어떤 구체예에서, 혈청 반감기의 증가는 약 2배, 예컨대 약 5배, 예컨대 약 10배, 예컨대 약 15배, 예컨대 약 20배 또는 그 이상이다.
한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같이 비-인간으로부터 유도된 다능성, 유도된 다능성 또는 분화전능성 세포가 제공된다. 특정 구체예에서, 세포는 배 줄기 (ES) 세포이다.
한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 비-인간 동물로부터 유도된 조직이 제공된다. 한 구체예에서, 조직은 본원에 기술된 것과 같은 비-인간 동물의 비장, 림프절 또는 골수로부터 유도된다.
한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 비-인간 동물로부터 유도된 핵이 제공된다. 한 구체예에서, 핵은 B 세포가 아닌 2배체 세포로부터 유래한다.
한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같이 비-인간 동물 (예컨대 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)로부터 분리된 비-인간 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 세포는 ES 세포이다. 한 구체예에서, 세포는 림프구이다. 한 구체예에서, 림프구는 B 세포이다. 한 구체예에서, B 세포는 인간 중쇄 유전자 절편으로부터 유도된 가변 도메인과; 생식선에서 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 재배열된 인간 Vκ1-39/J 서열, 생식선에서 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 재배열된 인간 Vκ3-20/J 서열 및 그것들의 조합으로부터 유도된 경쇄를 포함하고 이때 경쇄는 히스티딘에 대해 생식선에 코드화된 적어도 하나의 아미노산의 치환을 포함하는 키메릭 중쇄를 발현하며, 이때 중쇄 가변 도메인은 비-인간 불변 영역에 융합되고 경쇄 가변 도메인은 비-인간 또는 인간 불변 영역에 융합된다. 다른 구체예에서, B 세포는 인간 중쇄 유전자 절편으로부터 유도된 가변 도메인을 포함하는 키메릭 중쇄; 인간 Vκ1-39 의 생식선에서 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 인간 J 서열로의 재배열로부터 유도된 또는 인간 Vκ3-20 의 생식선에서 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 인간 J 서열로의 재배열로부터 유도된 경쇄를 발현하고, 이때 경쇄는 생식선에 코드화된 적어도 하나의 아미노산의 히스티딘에 대한 치환을 포함하며; 중쇄 가변 도메인은 비-인간 또는 인간 중쇄 불변 영역에 융합되고 경쇄 가변 도메인은 비-인간 또는 인간 경쇄 불변 영역에 융합된다.
한 측면으로, 하이브리도마가 제공되는데, 그 하이브리도마는 본원에서 기술된 것과 같은 비-인간 동물의 B 세포로 제조된다. 특정 구체예에서, B 세포는 관심의 에피토프를 포함하는 면역원으로 면역된 본원에 기술된 것과 같은 마우스로부터 유래하며, B 세포는 관심의 에피토프에 결합하는 결합 단백질을 발현하고, 결합 단백질은 체세포성 돌연변이된 인간 가변 중쇄 도메인과 마우스 CH를 가지며, 각각 생식선에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 (1) 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5, (2) 인간 Vκ1-39의 인간 J로의 재배열, (3) 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1 또는 (4) 인간 Vκ3-20의 인간 J로의 재배열로부터 유도된 인간 가변 경쇄 도메인 및 마우스 CL을 가지며, 이때 인간 경쇄 도메인은 생식선에 코드화된 적어도 하나의 아미노산의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함한다.
또한 본원에 기술된 비-인간 동물에서 생성된 항원-결합 단백질을 발현하는 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 세포는 CHO, COS, 293, HeLa 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포 (예컨대 PERC.6TM 세포)로부터 선택된다.
한 측면으로, 비-인간 배 (embryo)가 제공되는데, 그 배는 본원에 기술된 것과 같은 비-인간 동물로부터 유도된 공여 ES 세포를 포함한다.
본원에 기술된 비-인간 동물은 CDR3에 히스티딘을 가지는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하기에 유용하다. 히스티딘을 CDR3에 넣는 동물은 일반적으로 항체의 제조에 유용하고, 특히 중성 pH 주변에서 충분한 친화성으로 표적에 결합하지만 산성 pH에서는 동일한 표적에 결합하지 않거나 더 약하게 결합하는 항체를 개발하는 데에 유용하다.
비-인간 동물은 예컨대 CDR3에 히스티딘을 포함하는 인간 면역글로불린 가변 도메인에 의해 그것의 표적에 결합하는 인간 치료적 결합 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있는 항체의 가변 영역을 생성하는 데 유용하다. 더 낮은 pH에서의 변경된 결합은 어떤 상황에서는 더 빠른 전환을 허용하는데, 왜냐하면 치료제는 세포 표면의 표적에 결합하고, 엔도솜에 내재화되며, 더 쉽게 또는 더 신속하게 엔도솜의 표적으로부터 해리되어서, 치료제가 재순환되어 표적의 또 다른 분자 (예컨대 다른 세포 상의 또는 동일한 세포 상의)에 결합할 수 있게 되기 때문이다. 어떤 상황에서는 이것은 더 낮은 용량으로 치료제를 투약하거나 덜 빈번하게 치료제를 투약하는 능력을 유발할 것이다. 이것은 특히 안전성 또는 독성의 이유로 빈번하게 투여하거나, 또는 특정 단위용량 이상으로 투여하는 것이 바람직하지 않은 경우에 유용하다. 그 결과로서, 항체 치료제의 혈청 반감기는 대상에게 투여될 때 증가될 것이다.
비-인간 동물, 예컨대 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트는 하나 또는 그 이상의 히스티딘을 그 안에 포함하는 CDR3를 가지는 항체 가변 영역을 나타내는 동물에서 B 세포의 수를 증가시키기 위한 방법에 유용하다. 비-인간 동물은 pH-의존성 항원 결합을 나타낼 항체 서열을 생성하는 데 유용하다. 비-인간 동물은 단일 면역화로부터 유발되는 항체 서열의 더 많은 수를 생성하는 데 유용한데, 이때 항체는 pH-의존성 항원 결합을 나타낼 것이다.
항원-결합 단백질 및 그것의 제조 방법
한 측면으로, 본원에는 또한 본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물로부터, 해당 기술분야에 사용된 표준 방법들을 사용하여, pH-의존성 항원 결합을 나타내는 인간 항원-결합 단백질, 예컨대 항체의 제조 방법이 제공된다.
항체를 제조하는 여러 가지 기법들이 기술되어 있다. 예를 들어 다양한 구체예에서, 본원에 기술된 것과 같이 마우스에서 키메릭 항체가 제조된다. 항체는 면역된 마우스의 B 세포로부터 직접 분리되거나 (예컨대 U.S. 2007/0280945A1) 및/또는 면역된 마우스의 B 세포는 하이브리도마를 제조하기 위하여 사용될 수 있다 (Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497). 본원에 기술된 것과 같은 비-인간 동물로부터의 항체 (인간 중쇄 및/또는 경쇄)를 코드화하는 DNA는 종래 기법들을 사용하여 쉽게 분리되고 서열화된다. 본원에 기술된 것과 같은 비-인간 동물로부터 유도된 하이브리도마 및/또는 B 세포는 그런 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 분리되면 DNA는 발현 벡터에 도입될 수 있고, 그런 다음 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생성하는 숙주 세포 안에 형질전환되어 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 얻을 수 있다. DNA는 또한 예를 들면 비-인간 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대해 코딩 서열을 치환함으로써 변형될 수 있다. 그러므로 일단 원하는 특징, 예컨대 친화성, 에피토프, pH-의존성 항원 결합 등을 가지는 항체의 핵산 서열이 결정되면, 비-인간 불변 영역 유전자 서열은 원하는 인간 불변 영역 서열로 대체되어 비-IgM 아이소타입, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 함유하는 전체 인간 항체가 생성된다.
그러므로 한 구체예에서, 본원에는 본원에 기술된 것과 같은 비-인간 동물 (예컨대 마우스)을 제조하고, 마우스를 관심의 항원으로 면역시켜서 비-인간 동물이 항원에 대한 면역 반응을 시작하도록 허용하며, 비-인간 동물에서 pH 의존성 항원 결합 특성을 나타내는, 예컨대 중성 pH에서보다 산성 pH에서 더 약한 결합을 나타내는 항원-특이적 항체를 선택하는 것으로 이루어지는, pH-의존성 항원 결합 특성을 나타내는 항체의 제조 방법이 제공된다.
또한 본원에는 다중-특이성 항원 결합 단백질, 예컨대 이중특이성 또는 삼중특이성 항원-결합 단백질의 제조 방법이 제공된다. 이것들은 높은 친화성으로 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있는 분자이다. 본 발명의 장점은 각각이 단일한 경쇄에 결합할 적당하게 높은 결합 (예컨대 친화성 성숙된) 중쇄 면역글로불린 사슬을 선택하는 능력을 포함한다. 또한 본 발명의 장점은 pH-의존성 항원 결합을 나타내는 다중-특이성, 예컨대 이중특이성 또는 삼중특이성 항원-결합 단백질을 생성하는 능력을 포함한다. 본원의 아래에서 기술되는 이중특이성 항체들을 사용하는 다양한 측면은 또한 삼중특이성 또는 다른 다중특이성 항체들에도 적용될 수 있다.
이중특이성 항체의 이중 성질 (즉 하나의 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 대해 특이적이거나 하나 이상의 표적 폴리펩티드에 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수 있다, 예컨대 Tutt et al., 1991, J. Immunol . 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol . 22:238-244) 때문에, 이중특이성 항체는 치료 용도에 많은 유용한 장점을 제공한다. 예를 들어 이중특이성 항체는 재지시된 세포독성 (예컨대 종양 세포를 사멸하기 위한)에 대해, 백신 보조제로서, 혈전에 혈전 용해제를 전달하기 위하여, 표적 부위 (예컨대 종양)에서 효소 활성화된 선구약물을 전환시키기 위하여, 감염성 질병을 치료하기 위하여, 세포표면 수용체에 면역 복합체를 표적화하기 위하여, 또는 면역독소를 종양 세포에 전달하기 위하여 사용될 수 있다.
본원에 기술된 이중특이성 항체는 또한 여러 치료적 및 비-치료적 및/또는 진단적 분석 방법, 예컨대 효소 면역분석, 2-부위 면역분석, 여러 질병 (예컨대 암)의 시험관 내 또는 생체 내 면역진단, 경합성 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석에 사용될 수 있다. 이중특이성 항체에 대한 다른 용도들은 당업자들에게 드러날 것이다.
재조합 세포 배양물로부터 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 여러 가지 기법들이 보고되어 있다. 그러나 이중특이성 결합 단백질의 합성 및 발현은 부분적으로는 2개의 상이한 중쇄와 결합하고 그것들을 발현할 수 있는 적당한 경쇄를 확인하는 것과 관련된 문제들로 인해, 그리고 부분적으로는 분리 문제로 인해 문제가 되어왔다. 다양한 구체예에서, 본원에 기술된 조성물 및 방법은 성분들의 안정성/상호작용을 증가시킴으로써 관례적인 면역글로불린 구조를 유지하기 위해 특수한 변형(들)을 필요로 하지 않는 전체 길이의 이중특이성 항체의 장점을 제공한다. 다양한 구체예에서, 그런 변형(들)은 번잡하고 이중특이성 항체 기법의 개발 및 인간 질병에 대한 치료에 사용되는 그것들의 잠재적 사용에 대한 장애물로 작용하는 것으로 증명되었다. 그러므로 다양한 구체예에서, 다중 특이성의 첨가된 특성을 가지는 천연 면역글로불린 구조 (즉 전체 길이)를 제공하는 것을 통하여 전체 길이의 이중특이성 항체는 이전의 이중특이성 단편들에 결핍되어 있던 그것들의 결정적인 이펙터 기능을 유지하고, 나아가 더 긴 반감기의 중요한 약물동력학적 매개변수를 증명하는 치료제를 제공한다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 유전자 변형된 마우스가 그렇지 않은 경우 천연 과정들을 통하여, 하나 이상의 중쇄, 이를테면 체세포성 돌연변이된 (예컨대 친화성 성숙된) 중쇄를 포함한 중쇄와 결합하여 그것을 발현할 수 있는 적당한 경쇄를 선택하는 것을 가능하게 하는데, 이때 경쇄는 추가로 그것의 pH-의존성 결합 특성을 항원-결합 단백질에 부여한다. 역 키메릭 중쇄를 가지는 친화성 성숙된 항체 (즉 인간 가변 및 마우스 불변)를 발현하는, 본원에 기술된 것과 같은 면역된 마우스의 적당한 B 세포로부터의 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 적당한 인간 불변 영역 유전자 서열 (예컨대 인간 IgG1)을 가지는 발현 벡터에서 확인되고 한 프레임으로 클론될 수 있다. 그러한 2개의 구성물, 즉 각각의 구성물이 상이한 에피토프에 결합하는 인간 중쇄 가변 도메인을 코드화하는 구성물이 제조될 수 있다. 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는, 인간 경쇄 가변 영역 (예컨대 인간 Vκ1-39/J 또는 인간 Vκ3-20/J, 예를 들면 인간 Vκ1-39Jκ5 또는 인간 Vκ3-20Jκ1) 중 하나는 적당한 인간 경쇄 불변 영역 유전자 (예컨대 인간 κ 불변 유전자)에 한 프레임으로 융합될 수 있다. 이들 3개의 전체 인간 중쇄 및 경쇄 구성물은 적당한 세포에 발현을 위해 도입될 수 있다. 세포는 2개의 주요 종을 발현할 것이다: 동일한 경쇄를 가지는 단일이량체 중쇄, 및 동일한 경쇄를 가지는 이종이량체 중쇄. 이들 주요 종의 용이한 분리를 가능하게 하기 위해 중쇄 중 하나는 단백질 A-결합 결정기를 생략하도록 변형되어, 그 결과 이종이량체 결합 단백질과는 다른 단일이량체 결합 단백질의 친화성이 유발된다. 이런 문제를 해결하는 조성물 및 방법은 2010년 6월 25일에 USSN 12/832,838로 출원되고, "Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native 면역글로불린 Format"의 제목으로 공개된 US 2010/0331527A1에 기술되어 있다. 일단 동일한 경쇄를 가지는 이종이량체 중쇄를 포함하는 종이 선택되면, 이 이중특이성 항원 결합 단백질은 그것의 pH-의존성 항원 결합 특성의 보유를 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다.
다르게는, 이중특이성 또는 삼중특이성 항체들은 이중 경쇄 유전자좌, 예를 들면 2개 이하의 인간 VL 및 하나 또는 다수 (예컨대 둘 또는 그 이상)의 인간 JL 유전자 절편 서열을 포함하는 경쇄 유전자좌로부터 유도된 항원-특이적 경쇄, 및 제한된 레퍼토리의 인간 중쇄 (예컨대 단일한 재배열된 인간 중쇄 가변 영역)를 활용하여 제조될 수 있다. 그런 항원-특이적, 히스티딘-변형된 역 키메릭 (인간 가변 마우스 불변) 경쇄는 적합한 인간 경쇄 불변 영역 서열을 가지는 발현 벡터 안에 한 프레임으로 클론될 수 있는 항원-특이적 경쇄 가변 영역 서열을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 보편적 경쇄 유전자좌, 예컨대 단일한 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 경쇄 유전자좌를 포함하는 마우스로부터의 (항원-특이적 경쇄와 동일하거나 상이한 항원상의 상이한 에피토프에 대해 특이적인) 항원-특이적 인간 중쇄 가변 영역(들)은 인간 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 발현 벡터 안에 한 프레임으로 클론될 수 있고, 항원-특이적 인간 경쇄 및 중쇄는 이중특이성 또는 삼중특이성 인간 항체를 얻기에 적합한 세포에서 공동-발현될 수 있다. 다르게는, 이전에 선택된 항원-특이적 중쇄, 예컨대 이중 경쇄 마우스 유전자좌에 사용된 것과 동일한 가변 영역 유전자 절편으로부터 유도된 경쇄를 포함하는 항체로부터의 중쇄는 인간 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 발현 벡터 안에 한 프레임으로 클론될 수 있고, 항원-특이적 인간 경쇄 및 중쇄는 이중특이성 또는 삼중특이성 인간 항체를 얻기에 적합한 세포에서 공동-발현될 수 있다. 한 구체예에서, 그런 항체는 예컨대 경쇄에서의 히스티딘 치환으로 인한, pH-의존성 항원 결합을 나타낸다.
한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 에피토프-결합 단백질이 제공되는데, 이때 인간 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열은 관심의 에피토프를 포함하는 항원으로 면역된 본원에 기술된 동물로부터 유도된다.
한 구체예에서, 제 1 및 제 2 폴리펩티드를 포함하는 에피토프-결합 단백질이 제공되는데, 제 1 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단쪽으로 제 1 에피토프에 선택적으로 결합하는 제 1 에피토프-결합 영역과 이어서 IgG1, IgG2, IgG4 및 그것들의 조합으로부터 선택된 인간 IgG의 제 1 CH3 영역을 포함하는 불변 영역을 포함하고, 제 2 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단 쪽으로 제 2 에피토프에 선택적으로 결합하는 제 2 에피토프-결합 영역과 이어서 IgG1, IgG2, IgG4 및 그것들의 조합으로부터 선택된 인간 IgG의 제 2 CH3 영역을 포함하는 불변 영역을 포함하며, 이때 제 2 CH3 영역은 단백질 A에 대한 제 2 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함한다. 다양한 그런 변형은 예컨대 미국 출원 공개 번호 2010/0331527 및 2011/0195454에 기술되어 있다.
하나 이상의 에피토프에 결합하고 pH-의존성 에피토프 결합 특성을 나타내는 에피토프-결합 단백질을 제조하기 위한 한 가지 방법은 본 발명에 따르는 제 1 마우스를 관심의 제 1 에피토프를 포함하는 항원으로 면역시키는 것이고, 이때 마우스는 (1) 경쇄를 재배열하고 형성할 수 있는 내인성 마우스 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 함유하지 않는 내인성 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌를 함유하며, 그 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자좌는 마우스 내인성 경쇄 불변 영역 유전자에 작동가능하게 연결된 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역이고, 어떤 구체예에서, 재배열된 인간 경쇄 가변 영역은 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 인간 Vκ1-39Jκ5 및 인간 Vκ3-20Jκ1으로부터 선택되며, (2) 전체적으로 또는 부분적으로 인간 VH 유전자 절편으로 대체된 내인성 마우스 VH 유전자 절편을 포함함으로써 마우스에 의해 생성된 면역글로불린 중쇄가 단독으로 또는 실질적으로 인간 가변 도메인과 마우스 불변 도메인을 포함하는 중쇄가 된다. 그런 마우스는 면역될 때 2개의 인간 경쇄 가변 도메인 중 단지 하나 (예컨대 인간 Vκ1-39Jκ5 또는 인간 Vκ3-20Jκ1 중 하나, 예컨대 적어도 하나의 아미노산의 히스티딘으로의 치환을 포함하고 있음)를 포함하는 역 키메릭 항체를 생성할 것이다. 통상적으로, 생식선 서열 안에 도입된 치환된 히스티딘 잔기의 적어도 일부는 역 키메릭 항체에 보유될 것이다. 일단 B 세포가 관심의 에피토프에 결합하고 pH-의존성 항원 결합 특성을 나타내는 항체를 발현하는 중쇄 가변 도메인을 코드화하는 것으로 확인되면, 중쇄 가변 영역 (및 임의로, 경쇄 가변 영역)의 뉴클레오티드 서열은 회복되고 (예컨대 PCR에 의해), 발현 벡터 구성물 안에 적당한 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열과 한 프레임으로 클론될 수 있다. 이 과정은 제 2 에피토프에 결합하는 제 2 중쇄 가변 도메인을 확인하기 위해 반복될 수 있고, 제 2 중쇄 가변 영역 유전자 서열은 회복되어 발현 벡터 안에 제 2의 적당한 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열과 한 프레임으로 클론될 수 있다. 불변 영역 유전자 서열에 의해 코드화된 제 1 및 제 2 면역글로불린 불변 도메인은 동일하거나 상이한 아이소타입일 수 있고, 면역글로불린 불변 도메인 중 하나 (그러나 다른 것은 아님)는 본원에 또는 US 2010/0331527A1에 기술된 것과 같이 변형될 수 있으며, 에피토프-결합 단백질은 적당한 세포에서 발현될 수 있고, US 2010/0331527A1에 기술된 것과 같이 동종이량체 에피토프-결합 단백질에 비교하여 그것의 단백질 A에 대한 상이한 친화성을 토대로 분리될 수 있다.
그러므로 다양한 구체예에서, DNA의 분리와 원하는 특이성/친화성을 가지는 제 1 및 제 2 인간 중쇄 가변 도메인을 코드화하는 제 1 및 제 2 핵산 서열, 및 인간 경쇄 도메인 (본원에 기술된 것과 같이 비-인간 동물로부터 분리된 생식선 재배열된 서열 또는 경쇄 서열)을 코드화하고 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 제 3 핵산 서열의 선택에 이어서, 해당 기술분야에서 광범위하게 사용되는 재조합 기법을 사용하여 이중특이성 항체를 형성하기 위하여 분자들을 코드화하는 3개의 핵산 서열이 발현된다. 때로 선택된 발현 시스템은 포유류 세포 발현 벡터 및 숙주를 포함하여서 이중특이성 항체가 적절하게 글리코실화된다 (예컨대 글리코실화된 항체 도메인을 포함하는 이중특이성 항체의 경우에). 그러나 분자는 또한 원핵 발현 시스템에서도 생성될 수 있다. 정상적으로, 숙주 세포는 제 1 인간 중쇄 가변 도메인, 제 2 인간 중쇄 가변 도메인 둘 다와, 인간 경쇄 도메인을 단일한 벡터 또는 독립적인 벡터 상에서 코드화하는 DNA로 형질전환될 것이다. 그러나 독립적인 발현 시스템에서 제 1 인간 중쇄 가변 도메인, 제 2 인간 중쇄 가변 도메인 및 인간 경쇄 도메인 (이중특이성 항체 성분들)을 발현하고, 시험관 내에서 발현된 폴리펩티드들을 결합시키는 것이 가능하다. 다양한 구체예에서, 인간 경쇄 도메인은 예컨대 CDR 코돈에 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환에 대해 생식선 서열로부터 유도된다. 다양한 구체예에서, 인간 경쇄 도메인은 경쇄 도메인의 경쇄 가변 서열 내에 하나 이하의, 2개 이하의, 3 이하의, 4 이하의 또는 5 이하의 체세포성 과돌연변이를 포함한다. 어떤 구체예에서, 체세포성 과돌연변이는 경쇄 가변 영역의 생식선 서열 안에 도입된 적어도 하나의 히스티딘 잔기의 존재를 변경시키지 않는다.
다양한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 2개의 중쇄 및 단일한 인간 경쇄를 코드화하는 핵산(들) (예컨대 cDNA 또는 게놈 DNA)은 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 및/또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 안에 삽입된다. 많은 벡터가 활용가능하고, 일반적으로는 그것들에 제한되는 것은 아니지만, 하나 또는 그 이상의 다음의 것들을 포함한다: 신호 서열, 복제 기원, 하나 또는 그 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열. 각각의 성분은 개별적으로 선택되거나 또는 선택된 숙주 세포 또는 실험적으로 결정된 다른 기준을 토대로 선택될 수 있다. 각 성분의 여러 실례들은 해당 기술분야에 공지되어 있다.
발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인지되고 이중특이성 항체의 각각의 또는 모든 성분을 코드화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 강력한 숙주 세포에 의해 인지되는 대다수의 프로모터가 잘 알려져 있다. 이들 프로모터는 공급원 DNA로부터 제한 효소 소화에 의해 프로모터를 제거하고 분리된 프로모터 서열을 벡터에 삽입함으로써 이중특이성 항체-코드화 DNA에 작동가능하게 연결된다.
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 핵화 세포)에서 사용된 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 그런 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 임의로 3' 미번역 영역으로부터 활용될 수 있다. 이들 영역은 이중특이성 항체 성분을 코드화하는 mRNA의 미번역 부분에 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 다양한 구체예에 적당한 발현 벡터로는 이중특이성 항체를 코드화하는 DNA의 포유류 세포에서의 일과성 발현을 제공하는 것들을 포함한다. 일반적으로 일과성 발현은 숙주 세포에서 효과적으로 복제할 수 있는 발현 벡터의 사용을 포함함으로써, 숙주 세포가 발현 벡터의 많은 복사물을 축적하고, 계속해서 발현 벡터에 의해 코드화된 원하는 폴리펩티드가 고수준으로 합성된다. 적당한 발현 벡터와 숙주 세포를 포함하는 일과성 발현 시스템은 크론된 DNA에 의해 코드화된 폴리펩티드의 편리한 포지티브 확인뿐만 아니라, 제 1 또는 제 2 인간 중쇄 가변 도메인의 동종이량체를 가지는 원래의 항체에 비교하여, 원하는 결합 특이성/친화성 또는 원하는 겔 이동 특징을 가지는 이중특이성 항체의 신속한 스크리닝을 가능하게 한다.
다양한 구체예에서, 일단 이중특이성 항체의 성분을 코드화하는 DNA가 상기에서 기술된 것과 같은 원하는 벡터(들)에 조립되면, 그것들은 발현 및 회수를 위해 적당한 숙주 세포 안에 도입된다. 숙주세포를 형질전환시키는 것은 선택된 숙주 세포에 대해 적절한 해당 기술분야에서 공지되어 있는 표준 기법들 (예컨대 일렉트로포레이션, 핵 마이크로주사, 박테리아 원형질의 무상세포, 또는 다가 양이온, 예컨대 폴리브렌, 폴리오르니틴과의 융합 등)을 사용하여 이루어질 수 있다.
다양한 구체예에서, 성분들을 함유하는 발현 벡터와 가장 잘 맞고 이중특이성 항체 종의 가장 효과적이고 선호할 수 있는 생성을 허용하는 숙주 세포가 선택된다. 발현을 위한 예시적인 숙주 세포로는 원핵 및 진핵 세포 (단일한 세포 또는 다중 세포), 박테리아 세포 (예컨대 대장균, 바실루스 종, 스트렙토마이세스 종 등의 균주), 미코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포 (예컨대 맥주효모균, S. 폼베, P. 파스토리스, P. 메탄올리카 등), 식물 세포, 곤충 세포 (예컨대 SF-9, SF-21, 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포 또는 세포 융합물, 예컨대 하이브리도마 또는 콰드로마를 포함한다. 다양한 구체예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트 또는 마우스 세포이다. 다양한 구체예에서, 세포는 CHO (예컨대 CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예컨대 COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (예컨대 HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB8065, HL-60 (예컨대 BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (상피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포 및 상기 언급된 세포로부터 유도된 셀라인으로부터 선택된 진핵 세포이다. 다양한 구체예에서, 세포는 하나 또는 그 이상의 바이러스 유전자를 포함하는데, 예를 들면 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포 (예컨대 PER.C6TM 세포)를 포함한다.
이중특이성 항체를 생성하기 위해 사용된 포유류 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 활용가능한 배지, 예컨대 Ham'S F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 둘베코 변형 이글스 배지 ((DMEM), Sigma)가 숙주 세포의 배양에 적당하다. 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오시드 (예컨대 아데노신 및 싸이미딘), 항생물질 (예컨대 GENTAMYCINTM), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 규정됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지 공급원이 첨가될 수 있다. 어떠한 다른 첨가물이 또한 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 것과 같이 적절한 농도로 포함될 수 있다. 다양한 구체예에서, 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 앞서 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사용된 것들이고, 당업자들에게 명백해질 것이다.
이중특이성 항체는 배양 배지로부터 분비된 폴리펩티드로부터 회수될 수 있지만, 또한 분비 신호 없이 직접 생성될 때 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 만약 이중특이성 항체가 막-결합된다면, 적당한 계면활성제 용액 (예컨대 트리톤-X 100)을 사용하여 막으로부터 방출될 수 있다.
적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 선택된, 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열로부터 유도된 2개의 인간 중쇄 및 단일한 인간 경쇄를 포함하고 있는 이중특이성 항체는 분리된 후에 그것의 항원 중 하나, 바람직하게는 둘 다에 대한 pH 의존성 결합을 나타내는 능력에 대해 스크리닝된다. 중성 및 산성 pH에서 이중특이성 항체의 그것의 항원에 상이하게 결합하는 능력 (예컨대 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 감소된 t1/2를 증명하는 능력)은 해당 기술분야에서 활용되고 다음의 실시예에서 기술되는 다양한 기법, 예컨대 BIACORETM 분석에 의해 측정될 수 있다.
2개 이하의 인간 VL 및 히스티딘 변형을 가지는 하나 또는 그 이상, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 마우스로부터 유도된 경쇄, 및 동일하거나 상이한 마우스 (예컨대 보편적 경쇄 마우스)로부터 유도된 중쇄(들)을 활용함으로써, 하나 이상의 에피토프에 결합하고 pH-의존성 에피토프 결합 특성을 나타내는 결합 단백질을 제조하기 위한 유사한 방법이 또한 제공되며, 본 개시로부터 드러나게 될 것이다. 간단히 설명하면, 본원에 기술된 마우스들 (예컨대 이중 경쇄 유전자좌를 포함하는 마우스들)은 관심의 항원으로 인간화될 수 있고, 관심의 에피토프에 결합하는 B 세포로부터의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인이 확인될 수 있으며, 뉴클레오티드 서열은 적합한 불변 영역을 포함하는 벡터 안에 한 프레임으로 클론되고; 동일한 과정이 관심의 다른 가변 도메인을 얻기 위해 반복되며, 가변 도메인들은 상기에서 보다 상세하게 기술된 것과 같은 적합한 셀라인에서 공동-발현된다.
pH-의존성 항원 결합을 가지는 항원-결합 단백질의 추가의 제조 방법
본원에 기술된 유전자 변형된 비-인간 동물에서 pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질을 제조하는 다양한 방법이 제공된다. 또한 시험관 내에서 pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원 결합 단백질의 제조 방법에 제공된다. 그런 방법은 유전자 변형된 비-인간 동물에서 생체 내에서 항원-결합 단백질의 다양한 성분을 생성시키고, 그런 다음 그것들을 변형시킨 후 포유류 세포 배양물에서 발현된 단백질 복합체로서 유기체 외부에서 시험관 내로 재조립하는 것을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질의 제조 방법은 경쇄 가변 영역 V 및 J 절편의 제한된 레퍼토리, 예컨대 인간 경쇄 가변 영역 V 및 J 절편을 포함하는 마우스, "보편적 경쇄" 또는 "공통 경쇄" 마우스 ("ULC" 마우스), 예컨대 미국 출원 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300, 2013/0045492 및 2013/0185821 (모두 참조로 본원에 포함된다)에 기술되어 있는 마우스에서 생성된 항원-결합 단백질 서열, 예컨대 항체 서열을 활용한다. 한 구체예에서, pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질의 제조 방법은 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하고 있는 마우스에서 생성된 항원 결합 단백질 서열을 활용한다. 한 구체예에서, 방법은 인간 Vκ1-39Jκ5 및 인간 Vκ3-20Jκ1로부터 선택된 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하고 있는 마우스에서 생성된 항원 결합 단백질을 활용한다. 다른 구체예에서, pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질의 제조 방법은 제한된 가변 유전자 절편 마우스, 예컨대 이중 경쇄 마우스에서 생성된 항원-결합 단백질 서열을 활용한다.
한 구체예에서, pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체의 제조 방법은 관심의 항원에 결합하는 (예컨대 원하는 친화성으로 관심의 항원에 결합하는) 제 1 항체를 선택하고, 제 1 항체의 면역글로불린 경쇄 뉴클레오티드 서열을 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하도록 변형시키며, 제 1 항체의 면역글로불린 중쇄 및 변형된 면역글로불린 경쇄를 세포에서 발현시키고, 중성 pH에서 관심의 항원에 대한 결합을 보유하고 (예컨대 관심의 항원에 대한 원하는 친화성을 보유하고) 산성 pH에서 관심의 항원에 대해 감소된 결합을 나타내는, 세포에서 발현된 제 2 항체를 선택하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체의 제조 방법은, 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 가지는 면역글로불린 경쇄를 포함하며, 항체가 관심의 항원에 결합하는 (예컨대 관심의 항원에 원하는 친화성으로 결합하는) 항체로부터 면역글로불린 중쇄를 선택하고 (예컨대 비-인간 동물, 예를 들면 마우스, 예컨대 ULC 마우스로부터 얻고); 면역글로불린 경쇄의 핵산 서열을 변형시켜서 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열이 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하도록 하며; 그것의 가변 도메인에 적어도 하나의 아미노산의 히스티딘으로의 치환을 포함하고 있는 선택된 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 발현시키고; 그리고 중성 pH에서 관심의 항원에 대한 결합을 보유하고 (예컨대 관심의 항원에 대한 원하는 친화성을 보유하고) 한편으로 산성 pH에서 관심의 항원에 대해 감소된 결합을 나타내는 항체를 선택하는 것을 포함한다. 다양한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄는 인간 중쇄 가변 유전자 절편 (인간 V, D 및 J 절편)으로부터 유도된다.
한 구체예에서, pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체를 제조하는 방법은 (1) 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열과 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 유전자 절편 (V, D 및 J 절편)의 레퍼토리를 포함하고 있는 비-인간 동물, 예컨대 마우스를 관심의 항원으로 면역시키고, 마우스가 상기 항원에 대한 면역 반응을 시작하도록 허용하며, (2) 비-인간 동물에서, 예컨대 마우스에서 관심의 항원에 원하는 친화성으로 결합하는 항체를 선택하고, (3) 비-인간 동물로부터, 예컨대 마우스로부터 관심의 항원에 원하는 친화성으로 결합하는 항체의 면역글로불린 중쇄의 뉴클레오티드 서열을 분리하며, (4) 상기 중쇄의 뉴클레오티드 서열을 측정하고, (5) 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 함유하는 면역글로불린 경쇄의 뉴클레오티드 서열을 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하도록 변형시키며, (6) 관심의 항원에 원하는 친화성으로 결합하는 항체의 면역글로불린 중쇄 및 히스티딘 변형을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 세포에서 발현시키고, 그리고 (7) 세포에서 발현된 항체가 중성 pH에서 항원에 대한 결합을 유지하는 한편 산성 pH에서 감소된 결합을 나타내는 지를 측정하는 것으로 이루어진다. 한 구체예에서, 세포에서 발현된 항체는 중성 pH에서 항원에 대한 원하는 친화성을 나타낸다. 다양한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄는 인간 중쇄 가변 유전자 절편 (인간 V, D 및 J 절편)의 재배열로부터 유도된다. 다른 구체예에서, 본원에는 또한 pH-의존성 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질을 제조하기 위한 유사한 방법이 제공되는데, 그 방법은 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 마우스를 면역시키는 대신, 제한된 레퍼토리의 경쇄 가변 유전자 절편을 포함하는 마우스, 예컨대 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 다수, 예컨대 둘 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 마우스를 면역시키는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하고 있는 마우스는 예컨대 미국 출원 공개 번호 2011//0195454, 2012/0021409, 2012/0192300, 2013/0045492 및 2013/0185821에 기술되어 있는 보편적 경쇄 또는 공통 경쇄 "ULC" 마우스이다. 한 구체예에서, 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 인간 Vκ1-39Jκ5 및 인간 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 선택된다.
한 구체예에서, 관심의 항원은 가용성 항원, 세포 표면 항원 (예컨대 종양 항원) 및 세포 표면 수용체로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 세포 표면 수용체는 면역글로불린 수용체이다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 수용체는 Fc 수용체이다.
한 구체예에서, 중성 pH에서 해리 상수 (KD)로서 표시되는 항원에 대한 항체의 원하는 친화성은 10-6M 미만, 예컨대 10-8M 미만, 예컨대 10-9M 미만, 예컨대 10-10M 미만, 예컨대 10-11M 미만, 예컨대 10-12M 미만이다.
상기에서 설명된 것과 같이, 한 구체예에서, ULC 마우스는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 서열을 포함하고, 항원에 대한 반응으로 항체를 발현하는데, 항원에 대한 항체의 친화성은 주로 그것들의 항체의 중쇄를 통해 중재된다. 이들 마우스는 항체의 인간 중쇄 가변 도메인을 코드화하도록 재배열되고 또한 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 서열로부터 유도된 경쇄를 포함하는 인간 중쇄 가변 (V, D 및 J) 절편의 레퍼토리를 포함한다. 한 구체예에서, 이들 마우스는 항원에 노출될 때, 항원에 대한 친화성 및 특이성으로 항체를 생성하기 위하여 인간 중쇄 가변 (V, D 및 J) 절편의 다양한 레퍼토리를 활용한다. 그러므로, 항원에 노출될 때 ULC 마우스에서 생성된 항체의 면역글로불린 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 또한 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열 (예컨대 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 가지는 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열)로부터 유도된 면역글로불린 경쇄를 포함하는 원하는 결합 단백질을 생성하기 위하여 분리되고 활용될 수 있다.
ULC 마우스의 한 구체예에서, 90 내지 100%의 재배열되지 않은 비-인간 VH 유전자 절편은 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 절편으로 대체된다. 특정 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 (예컨대 90 내지 100%) 내인성 비-인간 VH 유전자 절편이 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 절편으로 대체된다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 19, 적어도 30, 또는 적어도 80 또는 81개의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 절편으로 이루어진다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 12개의 기능성 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 절편, 적어도 25개의 기능성 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 절편 또는 적어도 43개의 기능성 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 절편으로 이루어진다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 모든 비-인간 DH 및 JH 절편의 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 DH 절편 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JH 절편으로의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 모든 비-인간 DH 및 JH 절편의 모든 재배열되지 않은 인간 DH 절편 및 모든 재배열되지 않은 인간 JH 절편으로의 대체를 포함한다. 그로써, ULC 마우스는 관심의 항원에 대한 반응으로 항체를 생성하기 위하여 다양한 레퍼토리의 인간 가변 영역 유전자 절편 (V, D 및 J 절편)을 활용한다.
일단 관심의 항원에 원하는 친화성으로 결합하는 항체의 중쇄가 결정되면, 중쇄의 뉴클레오티드 서열이 분리되고 서열화된다. 그 서열은 발현을 위해 적당한 숙주 세포, 예컨대 진핵 세포, 예를 들면 CHO 세포에 클론된다. 한 구체예에서, 인간 중쇄 불변 영역의 서열은 마우스 (예컨대 ULC 마우스)로부터 분리된 인간 중쇄 가변 영역 서열의 하류에 클론된다.
한 구체예에서, pH-의존성 항원-결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질을 제조하는 것은 면역글로불린 경쇄의 뉴클레오티드 서열, 특히 단일한 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역의 서열을 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하도록 변형시키는 것을 포함한다. 뉴클레오티드 서열을 변형시키기 위한 다양한 기법들이 해당 기술분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 부위 특정 돌연변이생성이 있다. 또한 원하는 히스티딘 치환을 포함하는 뉴클레오티드 서열은 새롭게 합성될 수 있다.
한 구체예에서, 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 히스티딘 잔기의 발현을 유발하는 치환을 포함한다. 한 구체예에서, 치환(들)은 3 또는 4개의 히스티딘 잔기의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환(들)은 면역글로불린 경쇄 가변 영역에 있다. 한 구체예에서, 치환(들)은 CDR 코돈, 예컨대 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에 있다. 한 구체예에서, 치환(들)은 CDR3 코돈에 있다.
한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 핵산 서열이 Vκ1-39Jκ5 유전자 서열을 포함하고, 치환(들)이 CDR3 코돈에 있는 경우, 치환은 105, 106, 108, 111 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 106, 108 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105 및 106에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105 및 108에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 106 및 108에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 106 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 108 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 106 및 108에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 106 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 108 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 다양한 히스티딘 치환을 포함하는 Vκ1-39Jκ5 CDR3 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 2에 도시되고, 서열 목록에 포함된다.
한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 핵산 서열이 Vκ3-20Jκ1 유전자 서열을 포함하고, 치환(들)이 CDR3 코돈에 있는 경우, 치환은 105, 106, 107, 109 및 그것들의 조합으로부터 선택된 위치에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 106, 107 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105 및 106에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105 및 107에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 106 및 107에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 106 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 107 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 106 및 107에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 106 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 105, 107 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 한 구체예에서, 치환은 위치 106, 107 및 109에서 히스티딘의 발현을 유발한다. 다양한 히스티딘 치환을 포함하는 Vκ3-20Jκ1 CDR3 영역의 아미노산 및 핵산 서열은 도 12에 도시되고, 서열 목록에 포함된다.
일단 면역글로불린 경쇄, 예컨대 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인의 서열이 원하는 위치에서 히스티딘 잔기를 포함하도록 변형되면, 경쇄의 뉴클레오티드 서열은 적당한 숙주 세포, 예컨대 진핵 세포, 예를 들면 CHO 세포에서 발현을 위한 벡터 안에 클론된다. 한 구체예에서, 인간 경쇄 불변 영역의 서열은 인간 가변 영역의 변형된 뉴클레오티드 서열의 하류에 클론된다.
한 구체예에서, 변형된 인간 면역글로불린 경쇄 및 선택된 인간 면역글로불린 중쇄를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 적당한 숙주 세포, 예컨대 진핵 세포, 예를 들면 CHO 세포에서 항원-결합 단백질을 생성하기 위해 공동-발현된다. 발현을 위해 사용될 수 있는 다양한 숙주 세포가 해당 기술분야에 공지되어 있고, 본 명세서를 통해 언급된다.
숙주 세포에서 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 세포 상층액에 분비될 수 있고, 그것은 적절한 발현 및 중성 pH에서 원래의 항원에 대한 친화성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 단백질은 또한 세포 용해물로부터 회수되거나, 또는 만약 막에 결합되어 있다면 적당한 계면활성제 (예컨대 트리톤-X)를 사용하여 막으로부터 방출될 수 있다. 원하는 특징을 가지는 항원-결합 단백질은 정제될 수 있다.
한 구체예에서, 히스티딘 변형(들)을 가지는 항원-결합 단백질은 히스티딘 변형(들)을 포함하지 않은 동일한 (원래의) 항원-결합 단백질의 항원에 대한 친화성에 비교할만한 항원에 대한 친화성을 보유한다. 한 구체예에서, 중성 pH에서 해리 상수 (KD)로서 표시된 관심의 항원에 대한 히스티딘-변형된 항원-결합 단백질의 친화성은 10-6M 미만, 예컨대 10-8M 미만, 예컨대 10-9M 미만, 예컨대 10-10M 미만, 예컨대 10-11M 미만, 예컨대 10-12M 미만이다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 히스티딘 변형을 포함하는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 pH 의존성 항원 결합 특성을 나타낸다. 한 구체예에서, 히스티딘 변형을 포함하는 항원-결합 단백질은 히스티딘 변형을 포함하지 않은 동등한 항원-결합 단백질 (동일한 아미노산 서열을 갖지만 히스티딘 변형이 없는 항원-결합 단백질)을 능가하는 증강된 pH-의존성 특성을 가지고 있다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질은 중성 pH에서 항원에 대한 결합을 보유하는 (예컨대 중성 pH에서 항원에 대한 원하는 친화성을 보유한다) 한편, 산성 pH에서 감소된 결합을 나타낸다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 산성 pH에서 항원에 대한 결합을 나타내지 않는 한편, 중성 pH에서 항원에 대한 결합을 보유한다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질은 중성 pH에서의 항원-결합 단백질의 해리성 반감기 (t1/ 2)에 비교하여 산성 pH에서 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배 감소된 해리성 반감기 (t1/2)를 가진다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 37℃에서 약 2분 또는 그 미만의 t1/2를 가진다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 37℃에서 약 1분 미만의 t1/2를 가진다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 25℃에서 약 2분 또는 그 미만의 t1/2를 가진다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 항원-결합 단백질은 산성 pH 및 25℃에서 약 1분 미만의 t1/2를 가진다.
한 구체예에서, 본원에 기술된 히스티딘 변형을 포함하는 항원-결합 단백질, 예컨대 항체는 대상에 치료적 용량으로 투여될 때, 히스티딘 변형을 포함하지 않은 항원-결합 단백질 (예컨대 히스티딘 변형을 포함하지 않은 원래의 항원-결합 단백질)의 동등한 치료적 용량이 투여될 때의 혈청 반감기에 비교하여 증가된 혈청 반감기를 나타낸다. 어떤 구체예에서, 본원에 기술된 히스티딘 변형을 포함하는 항원-결합 단백질의 용량의 투여시, 히스티딘 변형을 포함하지 않은 항원-결합 단백질의 동일한 용량의 투여시 혈청 반감기를 능가하는 혈청 반감기의 증가는 약 2배, 예컨대 약 5배, 예컨대 약 10배, 예컨대 약 15배, 예컨대 약 20배 또는 그 이상이다. 한 구체예에서, 혈청 반감기는 적어도 약 1일, 예컨대 적어도 약 2일, 예컨대 적어도 약 7일, 예컨대 적어도 약 14일, 예컨대 적어도 약 30일, 예컨대 적어도 약 60일이다.
상기에서 기술된 pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질의 시험관 내 제조 방법 외에, 본원에는 또한 상기 방법에 의해 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체가 제공된다. 또한 상기 방법은 마우스에서 공통 (보편적인) 경쇄에 결합하는 2개의 상이한 인간 면역글로불린 중쇄를 선택하고, 보편적 경쇄를 상기에서 기술된 것과 같은 히스티딘 치환을 포함하도록 변형시키며, 단일한 히스티딘-변형된 보편적 경쇄를 가지는 2개의 인간 중쇄를 숙주 세포에서 공동 발현시킴으로써 다중-특이성, 예컨대 이중특이성 항원-결합 단백질을 생성하기 위해 활용될 수 있다. 상기에서 기술된 항원-결합 단백질을 생성하기 위한 다양한 단계는 이중특이성 항원-결합 단백질을 제조하는 방법에도 적용될 수 있다. 항원(들)에 대한 원하는 친화성 및 pH-의존성 항원 결합 특성을 가지는 것으로 확인된 이중특이성 항원 결합 단백질은 정제될 수 있다. 그러므로 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하고 있는 인간 가변 영역 유전자, 예컨대 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ5 가변 영역 유전자에 의해 코드화된 인간 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하고 있는 2개의 인간 중쇄 및 단일한 인간 경쇄를 포함하는 이중특이성 항체가 제공된다.
또한 어떤 구체예에서 본원에는 이중 경쇄 마우스에서 생성된 경쇄, 예컨대 항원-특이적 경쇄를 활용하여 pH-의존성 결합 특성을 가지는 항원-결합 단백질을 제조하기 위한 방법; 뿐만 아니라 상기 방법에 의해 생성된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체들이 제공된다. 그런 방법 및 상기 방법에 의해 생성된 항체들은 본 명세서로부터 명백해질 것이다.
또한 어떤 구체예에서 히스티딘 치환을 포함하고 있는 인간 면역글로불린 중쇄 및 인간 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항원-결합 단백질의 제조에 활용되는 구성물이 제공된다. 본원에 기술된 항원-결합 단백질, 예컨대 항체를 발현하는 숙주 세포 또한 제공된다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명의 제조 및 사용 방법의 완전한 개시 및 설명을 해당 기술분야의 숙련자들에게 제공하기 위해 제공되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하려고 의도하거나 아래의 실험이 전부이거나 유일하게 수행된 실험인 것을 나타내려고 의도한 것은 아니다. 사용된 수치 (예컨대 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력이 기울여졌지만, 일부 실험적 에러와 편차는 해명될 것이다. 다른 표시가 없는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.
실시예 1. 항원-특이적 인간 경쇄에서 히스티딘 잔기의 확인
통상적 경쇄 마우스 (예컨대 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 통상적 경쇄 마우스) 및 그런 마우스에서의 항원-특이적 항체의 제조는 예컨대 미국 특허 출원 13/022,759, 13/093,156 및 13/412,936 (각각 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409 및 2012/0192300)에 기술되어 있다. 간단히 설명하면, 재배열된 인간 생식선 경쇄 표적화 벡터를 VELOCIGENE® 기법 (예컨대 미국 특허 6,586,251호 및 Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659 참조)을 사용하여 만들어서 마우스 게놈 박테리아 인공 염색체 (BAC) 클론을 변형시키고, 게놈 구성물을 단일한 재배열된 인간 생식선 경쇄 영역을 함유하도록 엔지니어링하여, 앞서 내인성 κ가변 및 연결용 유전자 절편을 결실시켜 놓은 내인성 κ 경쇄 유전자좌 안에 삽입하였다. 그런 다음 표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 ES 세포를 일렉트로포레이션하여, 재배열된 인간 생식선 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 영역을 발현하는 키메릭 마우스를 제조하기 위하여 변형된 ES 세포를 만들었다. 표적화된 ES 세포를 공여 ES 세포로서 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배안에 도입하였다 (예컨대 미국 특허 7,294,754 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived fromthe donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotype analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). 엔지니어링된 인간 생식선 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역을 독립적으로 내포하는 VELOCIMICE®를 독특한 재배열된 인간 생식선 경쇄 영역의 존재를 검출하는 대립유전자 분석 (Valenzuela et al., 상기 동일)을 변형시켜 사용하여 유전자형 분류에 의해 확인하였다.
엔지니어링된 인간 생식선 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 마우스 (ULC 마우스)를 내인성 마우스 중쇄 가변 유전자 유전자좌가 인간 중쇄 가변 유전자 유전자좌로 대체되어 있는 마우스 (US 6,596,541 참조; VELOCIMMUNE® 마우스, Regeneron Pharmaceyticals, Inc.)로 사육하였다.
단일한 재배열된 인간 생식선 경쇄 영역을 함유하고 있는 VELOCIMMUNE® 마우스를 관심의 항원으로 도전하고, 보편적 경쇄를 포함하는 항체 (예컨대 Vκ1-39Jκ5)를 분리하고 서열화하였다.
항원-특이적 인간 항체로부터의 Vκ1-39를 함유하는 선택된 경쇄 (A 내지 K, 각각 SEQ ID NO:136 내지 146에 해당함)의 아미노산 서열을 일렬 배열하였다. 항원-특이적 인간 항체의 선택된 번호에 대한 인간 Vκ1-39-유도된 경쇄의 CDR의 히스티딘 돌연변이를 확인하였다 (도 1). 생식선 Vκ1-39의 아미노산 서열을 배열 위에 도시하고 SEQ ID NO:1에 표시하며, Vκ1-39Jκ5에 대한 완전한 가변 도메인 아미노산 서열을 SEQ ID NO:80에 표시한다.
실시예 2. 히스티딘-치환된 인간 보편적 경쇄 항체의 엔지니어링 및 특성 확인
실시예 2.1. 생식선 인간 재배열된 경쇄 안으로의 히스티딘 잔기의 엔지니어링
히스티딘 잔기를, 인간 Vκ1-39Jκ5 경쇄의 Q105, Q106, Y108 및 P111 위치에 엔지니어링된 히스티딘 잔기를 도입하기 위하여 특이하게 디자인된 부위 특정 돌연변이생성 프라이머를 사용하여 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 경쇄 안에 엔지니어링하였다. 부위 특정 돌연변이생성을 해당 기술분야에 공지되어 있는 분자 기법을 사용하여 수행하였다 (예컨대 QuikChange II XL 부위 특정 돌연변이생성 키트, Agilent Technologies). 엔지니어링된 잔기의 CDR3 내 위치는 도 2에 도시하는데, 도 2에 도시된 히스티딘-치환된 CDR3의 핵산 서열은 SEQ ID NO:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32에 표시된다 (해당하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 및 33에 표시된다). 생식선 재배열된 Vκ1-39Jκ5 CDR3의 핵산 및 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2 및 3에 각각 표시한다.
실시예 2.2. 히스티딘 엔지니어링된 경쇄의 구성 및 발현
실시예 2에 따라 만들어진 생식선 엔지니어링된 히스티딘 잔기를 함유하고 있는 인간 Vκ1-39-유도된 경쇄를 구성하고, CHO 세포에서의 발현을 분석하기 위하여 인간 세포 표면 수용체에 특이적인 다양한 인간 중쇄 (1 내지 5로 표지함)와 짝을 이루었다. 히스티딘-치환된 Vκ1-39-유도된 경쇄와 짝을 이룬 인간 세포 표면 수용체에 특이적인 5개의 인간 중쇄를 단일한 재배열된 인간 경쇄 (인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열된 경쇄; US2011/0195454A1 참조)를 가지는 마우스로부터 얻었다.
효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA): CHO 세포로부터의 항체 분비를, 표시된 히스티딘 변형을 포함하는 경쇄에 대하여 Fc ELISA를 사용하여 5개의 상이한 중쇄를 사용하여 검출하였다. 경쇄 및 중쇄 서열 (변형을 위한)을 단일한 재배열 인간 경쇄 (예컨대 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열된 경쇄; US2011/0195454A1 참조)를 가지는 마우스에서 제조하였다. 포획 항체는 염소 항-인간 IgG였고 검출 항체는 염소 항-인간 (Fc 감마-특이적)-HRP였다. 그 결과는 도 3에 도시한다. ULC+heavy: 특이한 중쇄 및 비변형 인간 Vκ1-39-유도된 경쇄. 도 3에 도시된 것과 같이, 발현은 거의 모든 돌연변이에서 검출되었다.
단백질 면역블롯. 히스티딘 엔지니어링된 경쇄와 짝을 이룬 항원-특이적 중쇄의 CHO 세포의 상층액 중에서의 발현을 추가로 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 샘플을 4 내지 12%의 트리스-글리신 겔 위에서 달리도록 하였다. 선택된 중쇄 (중쇄 3)를 사용한 결과를 도 4에 도시한다. ULC는 재배열된 인간 Vκ1-39-유도된 경쇄를 말한다 (상기 기술된 것과 같음).
실시예 2.3. 히스티딘 엔지니어링된 경쇄의 결합 친화성의 측정
선택된 항체 상층액에 대한 평형 해리 상수 (KD), 해리성 반감기 (t1/2) 및 다른 동역학적 매개변수를 BIACORETM T200 기구 (GE Healthcare)를 사용하여 SPR (표면 플라스몬 공명)에 의하여 측정하였다. 동역학을 pH 7.4 및 pH 5.75에서 측정하였다. 그 결과를 도 5a 내지 도 5e에 도시한다.
중성 pH (pH 7.4) 및 산성 pH (pH 5.75)에서 면역원에 결합하는 항체의 동역학적 결합 특성 (예컨대 k a, k d, K D, t1/2 등)에 대한 수치는 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서 (Biacore T200)를 사용하여 얻었다. Biacore CM5 센서 칩을 마우스 항-인간 Fc 항체로 유도체화하여 상층액으로부터의 항체를 포획하였다. 그런 다음 단일 농도 (50nM)의 면역원을 30㎕/분의 유속으로 항체-포획된 표면 위로 주입하였다. 항체-항원 결합을 2.5분 동안 모니터한 후 포획된 항체로부터 항원의 해리를 8분 동안 모니터하였다. 동역학적 결합 (ka) 및 해리 (kd) 속도 상수를, Biacore T200 Evaluation 소프트웨어 버전 1.0을 사용하여 질량 수송 모델로 1:1 결합에 대한 데이터를 프로세싱하고 맞춤으로써 측정하였다. 평형 해리 상수 (K D) 및 해리성 반감기 (t1/ 2)를 동역학적 속도 상수로부터 계산하였다: K D(M)=k d/k a; 및 t1/2 (분)=ln2(60* k d ).
도 5에서 알 수 있는 것과 같이, 세포 표면 수용체에 대한 항체의 결합 분석에서, 항원-특이적 인간 중쇄와 짝을 이룬 히스티딘-변형된 통상 경쇄 (Vκ1-39/Jκ5 경쇄의 히스티딘 변형된 CDR3)를 포함하는 5개의 항체 중 2개가 pH 7.4 및 pH 5.75에서 상이한 친화성으로 항원 (예컨대 세포 표면 수용체)에 대한 결합을 나타냈다. pH 7.4에서의 결합을 보유하지만, pH 5.75에서 낮은 결합을 보이거나 검출할만한 결합이 없는 히스티딘 변형을 가지는 항체들이 바람직하다. pH 7.4에 비교하여 pH 5.75에서 감소된 t1/2를 나타내는 히스티딘 변형을 가지는 항체가 바람직하다.
상이한 pH에서 히스티딘-변형된 통상 경쇄 및 3개의 항원-특이적 중쇄 (2, 3 및 6으로 표지됨)를 포함하는 3개의 항체에 대한 항원 결합 데이터는 도 6에 추가로 요약한다. 이들 항체는 예컨대 pH 5.75에서 t1/2의 감소 또는 검출된 결합이 없음에 의해 증명되는 것과 같이, pH 7.4에 비교하여 pH 5.75에서 항원 결합의 상당한 감소를 나타냈다.
실시예 3. 인간 히스티딘-치환된 Vκ1 - 39Jκ5 보편적 경쇄를 포함하는 유전자 변형된 마우스의 엔지니어링 및 특성 확인
실시예 3.1. 재배열된 인간 경쇄 가변 영역에 히스티딘 잔기를 엔지니어링하기 위한 표적화 벡터의 구성
인간 경쇄의 CDR 영역에 엔지니어링된 히스티딘 잔기를 가지고 있는 재배열된 인간 경쇄 유전자를 함유하는 유전자 변형된 마우스를 해당 기술분야에 공지되어 있는 표준 분자 클로닝 기술에 의해 제조한 표적화 벡터를 사용하여 제조한다.
간단히 설명하면, 다양한 재배열된 인간 생식선 경쇄 표적화 벡터를, 단일한 재배열된 인간 생식선 경쇄 영역을 함유하도록 VELOCIGENE® 기법 (예컨대 미국 특허 6,586,251호 및 Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659 참조)을 사용하여 마우스 게놈 박테리아 인공 염색체 (BAC) DNA를 변형시켜 만들어서, 앞서 내인성 κ가변 및 연결용 유전자 절편을 결실시켜 놓은 내인성 κ 경쇄 유전자좌 안에 삽입하였다. 재배열된 인간 생식선 경쇄 영역을, 경쇄의 서열 내 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 위치에서 생식선 서열의 각각의 위치에서 정상적으로 존재하지 않는 히스티딘 잔기를 코드화하도록 변형시킨다. 표적화 벡터를 마우스 배 줄기 (ES) 세포 안에 일렉트로포레이션시켜서 제조하고 정량 PCR 분석 (예컨대 TAQMANTM)을 사용하여 확인하였다.
구체적으로, 이들 표적화 벡터를 구성하기 위한 전략을 도 8a 내지 도 8f에 도시한다. pBS+FRT-Ub-Hyg-FRT+마우스 Vκ3-7 리더+인간 Vκ1-39Jκ5를 함유하고 있는 공통 (보편적인) 경쇄 마우스 ("ULC 마우스", 예컨대 US2011/0195454A1에 기술됨)를 Q105, Q106, Y108 및 P111 또는 Q106, Y108 및 P111을 CDR3 영역의 히스티딘 잔기로 대체하기 위하여 도 7에 표시된 (이 엔지니어링 단계에 대해서는 도 8a 참조) 부위-특정 돌연변이생성 프라이머를 사용하여 부위 특정 돌연변이생성 (QuickChange II XL 키트)에 의해 변형시켰다. 그 결과 생성된 벡터 (H105/106/108/111 및 H106/108/111)를 추가로 변형시키고, 마우스 Igκ 불변 영역, 마우스 인핸서, 마우스 3' 상동성 아암 및 SPEC 카세트를 포함하고 있는 벡터 안에 결찰시켰다 (도 8b). 추가의 변형은 5' 마우스 아암을 운반하고 Frt-Ub-NEO-Frt 카세트를 포함하고 있는 벡터 안으로의 결찰을 포함하였다 (도 8b). 그 결과 생성된 표적화 벡터를 마우스 Igκ 가변 유전자좌 (κ 가변 및 연결용 유전자 절편을 포함함)의 결실을 포함하고 있는 ES 세포 안으로 일렉트로포레이션시켰다 (도 8c 내지 도 8f).
포지티브 ES 세포 클론을 내인성 κ 경쇄 유전자좌 안에 삽입된 엔지니어링된 Vκ1-39Jκ5 경쇄에 특이적인 프로브를 사용하여 대립유전자 분석 (Valenzuela et al.)을 변형시켜 사용함으로써 확인하였다. 분석에 사용한 프라이머와 프로브를 아래의 표 1에 제시하고, 서열 목록에 나타낸다; 프로브의 위치는 도 8c 내지 도 8f에 도시된다.
ES 세포 스크리닝에 사용된 프라이머 및 프로브
프로브 명칭 분석 프로브 서열 5' 프라이머 3' 프라이머
　Neo 　GOA TGGGCACAACAGACAATCGGCTG
(SEQ ID NO:38)		 GGTGGAGAGGCTATTCGGC
(SEQ ID NO:39)		 GAACACGGCGGCATCAG
(SEQ ID NO:40)
　ULC-m1 　GOA CCATTATGATGCTCCATGCCTCTCTGTTC
(SEQ ID NO:41)		 AGGTGAGGGTACAGATAAGTGTTATGAG
(SEQ ID NO:42)		 TGACAAATGCCCTAATTATAGTGATCA
(SEQ ID NO:43)
　1633h2
(Vκ1-39Jκ5-특이적)		 　GOA ATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCT (SEQ ID NO:44) GGGCAAGTCAGAGCATTAGCA
(SEQ ID NO:45)		 TGCAAACTGGATGCAGCATAG
(SEQ ID NO:46)
mIgKd2 보유 GGCCACATTCCATGGGTTC
(SEQ ID NO:47)		 GCAAACAAAAACCACTGGCC
(SEQ ID NO:48)		 CTGTTCCTCTAAAACTGGACTCCACAGTAAATGGAAA
(SEQ ID NO:49)
mIgKp15 보유 GGGCACTGGATACGATGTATGG
(SEQ ID NO:50)		 CACAGCTTGTGCAGCCTCC
(SEQ ID NO:51)		 AGAAGAAGCCTGTACTACAGCATCCGTTTTACAGTCA
(SEQ ID NO:52)
표적화 구성물에 의해 도입된 NEO 선택 카세트를, FLP를 발현하는 플라스미드로 ES 세포를 형질전환시킴으로써 결실시켰다 (도 8c 및 도 8e). 임의로, 네오마이신 카세트를 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스로 사육함으로써 제거할 수 있다 (예컨대 US 6,774,279). 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스에서 보유된다.
상기에서 기술된 표적화된 ES 세포를 공여 ES 세포로서 사용하고 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배에 도입하였다 (예컨대 미국 특허 7,294,754 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotype analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). 서열을 따라 하나 또는 그 이상의 위치에 돌연변이된 히스티딘 잔기를 함유하는 엔지니어링된 인간 경쇄 유전자를 독립적으로 내포하고 있는 VELOCIMICE®를 상기 기술된 표적화된 ES 세포로부터 만들었다.
새끼를 유전형 분류하고 엔지니어링된 히스티딘-변형된 인간 경쇄에 대해 이형접합성인 새끼를 선택하여 발현된 항체의 경쇄의 발현 및 결합 능력의 특성을 확인하였다. 3개 (H106/108/111; "1930") 또는 4개 (H105/106/108/111; "1927")의 히스티딘 변형을 가지는 보편적 경쇄 유전자를 특이하게 포함하고 있는 마우스의 유전형 분류에 대한 프라이머 및 프로브는 아래의 표 2에 열거하고, 서열 목록에 나타낸다. 그것들의 보편적 경쇄에 히스티딘 변형을 함유하고 있는 마우스를 본원에서는 "HULC" 마우스 (히스티딘 보편적 경쇄 마우스)로 언급한다.
유전형 분류에 사용된 프라이머 및 프로브
프로브 명칭 분석 프로브 서열 5' 프라이머 3' 프라이머
1927jxn3 GOA 1927 (4 His)
마우스-특이적		 ACCATAGTCACAGTACCCA
(SEQ ID NO: 53)		 AGCAGTCTGCAACCTGAAGATTT
(SEQ ID NO:54)		 CCCTTGGCCGAAGGTGAT
(SEQ ID NO:55)
1930jxn3 GOA 1930 (3 His)
마우스-특이적		 ATAGTCACAGTACCCATCC
(SEQ ID NO: 56)		 GTCTGCAACCTGAAGATTTTGC
(SEQ ID NO:67)		 CCCTTGGCCGAAGGTGAT
(SEQ ID NO:58)
실시예 3.2. 히스티딘-치환된 보편적 경쇄를 가지는 마우스에서 항원에 대한 면역반응의 분석
세포 표면 수용체 ("항원 A")를 면역원으로서 사용하여 CDR3에 4개의 히스티딘 치환을 가지는 Vκ1-39 및 Jκ5를 활용하여 사전-배열된 인간 카파 경쇄의 발현에 대해 이형접합성 (이하 "HULC 1927")이거나 CDR3에 3개의 히스티딘 치환을 가지는 Vκ1-39 및 Jκ5를 활용하여 사전-배열된 인간 카파 경쇄의 발현에 대해 이형접합성 (이하 "HULC 1930")인 마우스, 또는 동종접합성 WT 마우스를 면역화하였다. 사전-면역 혈청을 면역화 개시 전에 마우스들로부터 수집하였다. 면역원을 초기 프라이밍 면역화를 위해 보조제 (Invivogen)로서 10㎍의 CpG 올리고뉴클레오티드와 혼합된 2.35㎍의 단백질로 25㎕의 부피로 발바닥 (f.p.)을 통해 투여하였다. 계속해서 마우스를 동일한 경로를 통해, 2.35㎍의 항원 A를 보조제로서 10㎍의 CpG 및 25㎍의 Adju-Phos (Brenntag)와 함께 제 3, 6, 11, 13, 17, 20일에 총 6회의 추가면역을 위해 부스팅하였다. 마우스를 4번째와 6번째의 추가면역 후에 각각 15일과 22일 후에 출혈시켰다. 마우스들의 항혈청을 항원 A에 대한 항체 역가에 대해 분석하였다.
면역원에 대한 항체 혈청 역가를 표준 ELISA에 의해 측정하였다. ELISA를 수행하기 위하여, 96-웰 미세역가 플레이트 (Thermo Scientific)를 2㎍/ml의 인산염-완충된 식염수 (PBS, Irvine Scientific) 중의 항원 A로 4℃에서 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 0.05%의 트윈 20을 함유하고 있는 인산염-완충된 식염수 (PBS-T, Sigma-Aldrich)로 플레이트 세척기 (Molecular Devices)를 사용하여 4회 세척하였다. 그런 다음 플레이트를 PBS 중의 250㎕의 0.5% 소혈청 알부민 (BSA, Sigma-Aldrich)으로 차단하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하였다. 면역된 마우스로부터의 혈청과 면역-전 혈청을 연속적으로 1:300 또는 1:1000에서 시작하여 0.5% BSA-PBS로 3-배 희석하여 차단된 플레이트에 이중으로 첨가한 후, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 마지막 2개의 웰을 블랭크로 남겨서 이차 항체 대조표준 (바탕값 대조표준)으로서 사용하였다. 플레이트를 다시 PBS-T로 플레이트 세척기에서 4회 세척하였다. 그런 다음 염소 항-마우스 IgG-Fc-서양고추냉이 과산화효소 (HRP) 포합된 이차 항체 (Jackson Immunoresearch)를 1:5000/1:10,000 희석률로 플레이트에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 PBS-T로 8회 세척하고, 기질로서 TMB/H2O2를 사용하여 전개시켰다. 기질을 20분 동안 인큐베이션하고, 반응을 2N 황산 (H2SO4, VWR, cat# BDH3500-1) 또는 1N 인산 (JT Baker, Cat# 7664-38-2)을 사용하여 중단시켰다. 플레이트를 분광계 (Victor, Perkin Elmer) 상에서 450nm에서 판독하였다. 항체 역가를 Graphpad PRISM 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터화하였다.
주입된 면역원에 대하여 마우스에서 유도된 면역반응을 항체 역가로서 표시하고, 그것을 가장 높은 혈청 희석률의 역수로 규정하고, 가장 높은 혈청 희석률에서 항원 결합 흡광도는 바탕값보다 2-배 더 높았다. 그러므로 수가 클수록 면역원에 대한 체액성 면역반응은 더 크다. 면역원에 대해 유도된 항체 역가는 HULC 마우스의 두 계통과 WT 마우스에서 매우 높았고, 계통 간에 관찰된 유의미한 차이는 없었다 (도 9).
실시예 3.3. pH-민감성 단클론성 항체의 제조
면역원에 대한 원하는 면역반응이 HULC 마우스의 두 계통 및 WT 마우스에서 이루어졌을 때, 각 마우스 계통으로부터 비장 세포를 수득하고 마우스 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 제조하고, 그것을 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. 10일 동안 성장시킨 후, 각 하이브리도마 세포-함유 웰로부터의 상층액을 면역원-특이적 ELISA를 통해 스크리닝하여 포지티브 항원 결합 샘플을 확인하였다. ELISA에 대해서는, 96 웰 미세 역가 플레이트를 1㎍/mL의 항-myc 다클론성 항체 (Novus Biologicals, #NB600-34)로 밤새 4℃에서 코팅하여 myc-태그 항원을 고정시킨 후 PBS 중의 0.5% (w/v) BSA 용액으로 차단하였다. 플레이트를 세척하고, 항원 용액을 플레이트에 1㎍/mL의 농도로 첨가하여 코팅된 플레이트에 결합하도록 1시간 동안 실온에서 놓아두었다. 계속해서, 하이브리도마 웰로부터의 상층액을 웰에 1:50의 희석률로 첨가하고, 결합되도록 1시간 동안 실온에 놓아두었다. 플레이트 결합된 항체를 HRP에 포합된 항-마우스 IgG 다클론성 항체 (Jackson Immunoresearch, #115-035-164)를 사용하여 검출하였다. TMB 기질을 플레이트에 첨가하고 (BD Biosciences, #51-2606KC/51-2607KC), 비색 신호를 제조업체의 권장된 프로토콜을 따라 전개시켰다. 흡광도를 Victor Wallac 플레이트 판독기 상에서 450nm에서 기록하였다. 0.5보다 크거나 같은 OD를 가지는 것으로 규정된 항원 포지티브 샘플 (기준선은 약 0.1의 OD를 가짐)에 대해 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서 (Biacore 4000)를 사용하여 친화성 스크리닝을 수행하였다.
중성 pH (pH 7.4) 및 산성 pH (pH 6.0)에서의 면역원에 대한 항체 결합에 대한 동역학적 결합 매개변수 (예컨대 k a, k d, K D, t1/2 등)를 기록하였다. Biacore CM4 센서 칩을 다클론성 염소 항-마우스 Fc 항체로 유도체화하여 상층액으로부터의 항체를 포획하였다. 그런 다음 단일 농도 (100nM)의 면역원을 항체-포획된 표면 위로 30㎕/분의 유속으로 주입하였다. 항체-항원 결합을 1.5분 동안 모니터한 후 포획된 항체로부터의 항원의 해리를 2.5분 동안 모니터하였다. 동역학적 결합 (k a) 및 해리 (k d ) 속도 상수를, Biacore 4000 Evaluation 소프트웨어 버전 1.0을 사용하여 질량 수송 모델로 1:1 결합에 대한 데이터를 프로세싱하고 맞춤으로써 측정하였다. 평형 해리 상수 (K D) 및 해리성 반감기 (t1/ 2)를 동역학적 속도 상수로부터 다음과 같이 계산하였다: K D (M)=k d/k a; 및 t1/2 (분)=ln2(60* k d ). pH 7.4에서의 결합과 비교하여 pH 6.0에서 감소된 결합을 나타내는 샘플 세트 (pH 민감성)뿐 아니라 pH 7.4와 pH 6.0 사이에서 유의미한 속도 변화를 나타내지 않는 대조표준 샘플 세트 (pH 둔감성 대조표준)를 선택하여 클론에 의해 제조하였다. 도 25는 총 항원 포지티브의 수와 HULC 및 WT 마우스로부터의 pH-민감성 항원 결합을 나타내는 항원 포티지브의 수를 비교한 것을 도시한다.
항원 포지티브 중에서 2개의 이형접합성 HULC 1927 마우스와 2개의 HULC 1930으로부터 각각 분리된 18 및 7개의 클론과, WT 마우스로부터의 1개의 클론을 단클론으로 제조하였다. 단클론성 하이브리도마의 상층액에 대해 중성 및 낮은 pH 항원 해리 속도 (오프-속도) 분석을 수행하였고, 세포 펠릿을 경쇄 가변 도메인 DNA 서열화에 대해 사용하였다.
실시예 3.4. 인간 Vκ1 - 39Jκ5 -기초 히스티딘 보편적 경쇄 마우스의 CDR3 영역에서의 서열화 및 체세포성 과돌연변이
HULC 및 WT 마우스로부터의 단클론성 하이브리도마로부터의 세포 펠릿을 경쇄 가변 도메인 DNA 서열화를 위해 사용하였다. 26개의 클론으로부터 단클론을 만들고 (상기 실시예 3.3 참조) 서열화를 수행하여, 15개가 HULC 또는 WT 마우스 경쇄 (MM 및 NN, 표 4 참조)를 사용하는 것으로 확인하였다. 14개의 클론을 HULC 이형접합성 마우스 (1927 또는 1930 마우스)로부터 유도하였고, 1개를 WT 마우스 (OO, 표 4 참조)로부터 유도하였다.
HULC 이형접합성 마우스로부터 유도된 14개의 항원 포지티브 샘플 중에서, 12개의 단클론성 항체가 그것들의 해당하는 HULC 경쇄를 활용한 반면, 2개는 WT 마우스 경쇄를 활용하였다. HULC를 활용하는 항체들은 하나를 제외한 전부가 표 3에서 알 수 있는 것과 같이 도입된 히스티딘 돌연변이를 모두 보유하였다 (이탤릭체로 표시된 항체). 클론 AA의 서열화로 2개의 상이한 HULC 서열이 생성되었는데, 그것은 아래의 표 3에 2개의 엔트리에 의해 반영된다.
HULC 경쇄를 활용하는 클론으로부터의 경쇄 서열의 보존된 히스티딘 삽입 및 체세포성 과돌연변이의 수
　 　 HULC를 활용하는 마우스로부터의 경쇄 서열
클론 명칭 마우스 계통 CDR3의 보존된 His 돌연변이의 수 프레임워크의 체세포성 과돌연변이의 수 CDR의 체세포성 과돌연변이의 수
AA
(서열 1)		 1927 4 3 0
AA
(서열 2)		 1927 4 1 1
BB 1927 4 3 3
CC 1927 4 0 0
DD 1927 3 1 1
EE 1927 4 2 2
FF 1927 4 0 1
GG 1927 4 1 1
HH 1927 4 2 0
II 1930 3 1 1
JJ 1930 3 4 5
KK 1930 3 1 2
LL 1930 3 1 0
실시예 3.5. Vκ1 - 39Jκ5 -기초 히스티딘 보편적 경쇄 마우스에서 생성된 단 클론성 항체의 pH-의존성 결합
추가로 HULC 및 WT 마우스로부터 분리된 단클론성 항체의 pH-의존성 결합 특성을 평가하기 위하여, 항체/항원 결합 단계를 중성 pH에서 관찰하고 항체/항원 해리 단계를 중성 또는 산성 pH에서 관찰하는 결합 실험을 수행하였다.
Biacore CM4 센서 칩을 다클론성 토끼 항-마우스 Fc 항체를 사용하여 유도체화하였다. 단클론성 항체 상층액이 항-마우스 Fc 센서 표면 위에 포획되었다. 2개의 농도, 즉 50nM (이중으로) 및 16.7nM의 면역원을 단클론성 항체가 포획되어 있는 표면 위로 30㎕/분의 유속으로 주입하였다. 항체-항원 결합을 pH 7.4에서 4분 동안 모니터한 후, 포획된 단클론성 항체로부터 항원의 해리를 pH 7.4 또는 6.0에서 15분 동안 모니터하였다. 해리 (k d) 속도 상수를 Scrubber 버전 2.0 곡선 맞춤 소프트웨어를 사용하여 데이터를 프로세싱하고 맞춤으로써 측정하였고, 그 결과를 표 6에 나타낸다. 해리성 반감기 (t1/ 2)를 다음: t1/2(분)=(ln2/k d)/60과 같이 해리 속도 상수로부터 계산하고, 그 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4에서 다양한 pH 조건 하에서 열거한 여러 항체의 결합/해리 특성을 나타내는 센서그램을 도 11에 그래프로 도시한다. 각 그래프에서 개별적인 라인들은 각각의 항체의 상이한 농도에서의 결합 반응을 나타낸다. 모든 실험은 25℃에서 수행하였다. 해리성 반감기 (t1/ 2)는 각각의 센서그램 위에 표시한다. 반응은 RU로 측정한다.
중성 및 낮은 pH에서 그것들의 면역원에 결합하는 단클론성 HULC 또는 WT 항체의 결합 (kd) 속도 상수 및 해리성 반감기 (t1/2)
　 　 pH 7.4 결합/pH 7.4 해리 pH 7.4 결합/pH 6.0 해리 pH 6.0/pH7.4 비율
클론 명칭 사용된 경쇄 중성 mAb 포획 결합된 50nM 면역원 (RU) k d (1/s) t1/2
(분)		 낮은
mab 포획		 결합된 50nM 면역원 (RU) k d (1/s) t1/2
(분)		 k d t1/2
AA HULC (1927) 129 70 5.60E-05 206 122 73 2.18E-04 53 3.9 0.3
BB HULC (1927) 350 165 6.00E-04 19 378 185 2.20E-03 5 3.7 0.3
CC HULC (1927) 611 251 2.03E-04 57 545 226 6.68E-03 2 33.0 0.03
DD HULC (1927) 182 75 3.55E-04 33 168 74 6.44E-04 18 1.8 0.6
HH HULC (1927) 268 92 1.36E-04 85 251 91 5.39E-04 21 4.0 0.3
GG HULC (1927) 353 110 2.78E-04 42 328 102 8.97E-04 13 3.2 0.3
FF HULC (1927) 334 202 4.79E-05 241 364 220 6.90E-05 167 1.4 0.7
EE HULC (1927) 339 124 5.08E-04 23 299 120 4.66E-04 25 0.9 1.1
II HULC (1930) 387 174 1.22E-04 95 334 147 2.14E-04 54 1.8 0.6
JJ HULC (1930) 363 14 9.83E-04 12 333 12 5.30E-04 22 0.5 1.9
KK HULC (1930) 490 303 7.41E-05 156 484 295 1.29E-04 90 1.7 0.6
LL HULC (1930) 636 41 3.09E-04 37 597 36 5.77E-04 20 1.9 0.5
MM* WT (1927 마우스) 245 6 NA NA 203 6 NA NA NA NA
NN WT
(1927 마우스)		 394 231 5.26E-04 22 378 231 9.35E-04 12 1.8 0.6
OO WT 413 89 2.94E-04 39 400 83 3.57E-04 32 1.2 0.8
* k d와 t1/2 값은 낮은 항원 결합 신호로 인해 측정할 수 없었다.
실시예 4. 히스티딘-치환된 인간 Vκ3 - 20Jκ1 보편적 경쇄를 포함하는 유전자 변형된 마우스의 엔지니어링
공통 Vκ3-20Jκ1 경쇄를 포함하는 마우스를 예컨대 미국 특허 출원 13/022,759, 13/093,156, 13/412,936 및 13/488,628 (각각 공개 번호 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300 및 2013/0045492), 및 상기 실시예 1에 기술된 것과 같이 제조하였다. 생식선 보편적 Vκ3-20Jκ1 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 SEQ ID NO:59에 표시한다.
히스티딘 치환을 Vκ3-20Jκ1 보편적 경쇄 표적화 벡터 안에 도입하고, Vκ1-39Jκ5 히스티딘 변형된 보편적 경쇄 마우스 (HULC 1927 및 1930)에 대해 실시예 3에서 상술된 것과 유사한 전략을 사용하여 그 표적화 벡터로부터 마우스를 제조하였다.
간단히 설명하면, 히스티딘-변형된 Vκ3-20Jκ1 보편적 경쇄 표적화 벡터를 제조하기 위한 전략은 도 29a 내지 도 29d에 요약되어 있다. pBS+FRT-Ub-Hyg-FRT+마우스 Vκ3-7 리더+인간 Vκ3-20Jκ1을 함유하고 있는 통상적 (보편적) 경쇄 마우스 ("ULC 마우스", 예컨대 US2011/0195454A1)를 제조하기 위해 사용된 플라스미드를 부위 특정 돌연변이생성 (QuickChange Lightning 키트)에 의하여 Q105, Q106, Y107 및 S109 또는 Q105, Q106 및 S109 (도 12의 배열 참조)를 CDR3의 히스티딘 잔기로 대체하기 위하여 도 28에 도시된 부위-특정 돌연변이생성 프라이머를 사용하여 변형시켰다 (이 엔지니어링 단계에 대해서는 도 14a 참조). 그 결과의 벡터 (H105/106/107/109 및 H105/106/109)를 추가로 변형시키고 마우스 Igκ 불변 영역, 마우스 인핸서, 마우스 3' 상동성 아암 및 SPEC 카세트를 포함하는 벡터에 결찰시켰다 (도 14b). 추가의 변형은 5' 마우스 아암을 운반하고 Frt-UB-NEO-Frt 카세트를 포함하고 있는 벡터 안으로의 결찰을 포함하였다 (도 14b). 그 결과의 표적화 벡터를 마우스 Igκ 가변 유전자좌 (κ 가변 및 연결용 유전자 절편을 포함함)의 결실을 포함하는 ES 세포 안에 일렉트로포레이션시켰다 (도 14c 내지 14d).
포지티브 ES 세포 클론을 내인성 κ 경쇄 유전자좌 안에 삽입된 엔지니어링된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역에 특이적인 프로브를 사용하여 대립유전자 분석 (Valenzuela et al.)을 변형시켜 사용함으로써 확인하였다. 분석에 사용한 프라이머와 프로브를 아래의 표 5에 제시하고, 서열 목록에 나타낸다; 프로브의 위치는 도 14c 내지 도 14d에 도시된다.
ES 세포 스크리닝에 사용된 프라이머 및 프로브
프로브 명칭 분석 프로브 서열 5' 프라이머 3' 프라이머
　Neo GOA TGGGCACAACAGACAATCGGCTG
(SEQ ID NO:38)		 GGTGGAGAGGCTATTCGGC
(SEQ ID NO:39)		 GAACACGGCGGCATCAG
(SEQ ID NO:40)
ULC-m1 GOA CCATTATGATGCTCCATGCCTCTCTGTTC
(SEQ ID NO:41)		 AGGTGAGGGTACAGATAAGTGTTATGAG
(SEQ ID NO:42)		 TGACAAATGCCCTAATTATAGTGATCA
(SEQ ID NO:43)
1635h2
(Vκ3-20Jκ1 특이적)		 GOA AAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGG
(SEQ ID NO:65)		 TCCAGGCACCCTGTCTTTG
(SEQ ID NO:66)		 AAGTAGCTGCTGCTAACACTCTGACT
(SEQ ID NO:67)
mIgKd2 보유 GGCCACATTCCATGGGTTC
(SEQ ID NO:47)		 GCAAACAAAAACCACTGGCC
(SEQ ID NO:48)		 CTGTTCCTCTAAAACTGGACTCCACAGTAAATGGAAA (SEQ ID NO:49)
mIgKp15 보유 GGGCACTGGATACGATGTATGG
(SEQ ID NO:50)		 CACAGCTTGTGCAGCCTCC
(SEQ ID NO:51)		 AGAAGAAGCCTGTACTACAGCATCCGTTTTACAGTCA (SEQ ID NO:52)
표적화 구성물에 의해 도입된 NEO 선택 카세트는 FLP를 발현하는 플라스미드로 ES 세포를 형질전환시킴으로써 결실된다 (도 14c 및 도 14d). 임의로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스로 사육함으로써 제거될 수 있다 (예컨대 US 6,774,279). 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스에 보유된다.
상기에서 기술된 표적화된 ES 세포를 공여 ES 세포로서 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배에 도입하였다 (예컨대 미국 특허 7,294,754 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotype analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). 서열을 따라 하나 또는 그 이상의 위치에 돌연변이된 히스티딘 잔기를 함유하는 엔지니어링된 인간 경쇄 유전자를 독립적으로 내포하고 있는 VELOCIMICE®를 상기 기술된 표적화된 ES 세포로부터 만들었다.
새끼를 유전형 분류하고 엔지니어링된 히스티딘-변형된 인간 경쇄에 대해 이형접합성인 새끼를 선택하여 발현된 항체의 경쇄의 발현 및 결합 능력의 특성을 확인하였다. 3개 (H105/106/109; "6183") 또는 4개 (H105/106/108/111; "6181")의 히스티딘 변형을 가지는 보편적 경쇄 유전자를 특이하게 포함하고 있는 마우스의 유전형 분류에 대한 프라이머 및 프로브는 표 6에 열거하고, 서열 목록에 나타낸다. 그것들의 보편적 경쇄에 히스티딘 변형을 함유하고 있는 마우스를 본원에서는 "HULC" 마우스 (히스티딘 보편적 경쇄 마우스)로 언급한다.
유전형 분류에 사용된 프라이머 및 프로브
프로브 명칭 분석 프로브 서열 5' 프라이머 3' 프라이머
hVI494-1 GOA 6181 (4 His) 마우스-특이적 CTGTCATCACCATGG (SEQ ID NO:68) GCAGACTGGAGCCTGAAGATTTT (SEQ ID NO:69) CCGAACGTCCAAGGTGAGTG
(SEQ ID NO:70)
hVI495-1 GOA 6183 (3 His) 마우스-특이적 TACTGTCATCACTATGG (SEQ ID NO:71) GCAGACTGGAGCCTGAAGATTT (SEQ ID NO:72) CCGAACGTCCAAGGTGAGTG
(SEQ ID NO:73)
마우스를 관심의 항원으로 면역시키고, pH-의존성 결합을 가지는 항체를 생성하는 능력에 대해 시험한다.
실시예 5. 히스티딘-치환된 인간 보편적 경쇄 ( HULC )를 포함하고 있는 마우스의 사육
이 실시예는 여러 다른 유전자 변형된 마우스가 다수의 유전자 변형된 면역글로불린 유전자좌를 은닉하고 있는 다수의 유전자 변형된 마우스 계통을 제조하기 위하여 본원에 기술된 인간 HULC 마우스 중 어떠한 하나로 사육될 수 있다는 것을 설명한다.
내인성 Igλ 녹아웃 (KO). 엔지니어링된 경쇄 유전자좌의 이용을 최대화하기 위하여, 상기 기술된 HULC 동물들 (예컨대 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 히스티딘-치환된 보편적 경쇄를 포함함) 중 어느 것이든지 내인성 λ 경쇄 유전자좌가 결실되어 있는 다른 마우스로 사육될 수 있다. 이런 방식으로, 얻어진 자손은 그것의 유일한 경쇄로서, 상기 실시예 3 및 4에서 설명된 것과 같이, 재배열된 히스티딘-치환된 인간 생식선 경쇄 영역을 발현할 것이다. 사육은 해당 기술분야에 인지되어 있는 표준 기법에 의해 수행되고, 또는 다르게는 상업적인 사육자 (예컨대 The Jackson Laboratory)에 의해 수행된다. 엔지니어링된 히스티딘-치환된 경쇄 유전자좌와 내인성 λ 경쇄 유전자좌의 결실을 내포하고 있는 마우스 계통을 독특한 경쇄 영역의 존재 및 내인성 마우스 λ 경쇄의 부재에 대해 스크리닝한다.
인간화된 내인성 중쇄 유전자좌. 엔지니어링된 인간 생식선 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 마우스 (HULC 마우스)를 내인성 마우스 중쇄 가변 유전자 유전자좌가 인간 중쇄 가변 유전자 유전자좌로 대체되어 있는 마우스와 교배시켰다 (US 6,596,541; VELOCIMMUNE® 마우스, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). VELOCIMMUNE® 마우스는 내인성 마우스 불변 영역 유전자좌에 작동가능하게 연결된 인간 중쇄 가변 영역을 포함함으로써 마우스가 항원 자극에 대한 반응으로 인간 중쇄 가변 도메인과 마우스 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 생성하게 되는 게놈을 포함한다.
내인성 마우스 중쇄 가변 영역 유전자좌가 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌로 대체되어 있고 히스티딘-치환된 단일한 재배열된 인간 경쇄 가변 영역을 내인성 κ 경쇄 유전자좌에 내포하고 있는 마우스가 얻어진다. 히스티딘-치환된 단일한 인간 경쇄 (HULC, 인간 경쇄 가변 도메인과 마우스 CL)를 포함하는 체세포성 돌연변이된 중쇄 (인간 중쇄 가변 도메인 및 마우스 CH)를 함유하는 역 키메릭 항체는 관심의 항원으로 면역화할 때 얻어진다. 그런 마우스에서 생성된 pH-의존성 인간 항체는 해당 기술분야에 공지되어 있거나 상기 기술된 항체 분리 및 스크리닝 방법을 사용하여 확인된다. 항체, 예컨대 pH-민감성 항체를 발현하는 B 세포의 가변 경쇄 및 중쇄 영역 뉴클레오티드 서열을 확인하고, 전체 인간 항체는 적당한 발현 시스템에서 가변 중쇄 및 경쇄 영역 뉴클레오티드 서열을 각각 인간 CH 및 CL 뉴클레오티드 서열과 융합함으로써 만들어진다.
실시예 6: 히스티딘-치환된 인간 보편적 경쇄 ( HULC ) 및 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 마우스에서 생성된 항체들의 pH-의존성 결합
4개의 히스티딘 치환 (HULC 1927) 또는 3개의 히스티딘 치환 (HULC 1930) 중 어느 하나를 포함하는 엔지니어링된 Vκ1-39/Jκ5 ULC (1633) 또는 Vκ1-39/Jκ5를 내포하는 마우스들을 인간 가변 영역 유전자좌로 내인성 마우스 중쇄 가변 영역 유전자좌가 대체되어 있는 마우스들로 사육하였다 (US 6,596,541 및 US 8,502,018 참조, VELOCIMMUNE® 마우스, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). 인간 중쇄 가변 영역 유전자좌 및 엔지니어링된 ULC ("ULC 1633ho/인간 중쇄 ho"로 표지됨), 4개의 히스티딘 치환을 포함하는 Vκ1-39/Jκ5 ("HULC 1927ho/인간 중쇄 ho"로 표지됨), 또는 3개의 히스티딘 치환을 포함하는 Vκ1-39/Jκ5 ("HULC 1930ho/인간 중쇄 ho"로 표지됨) 중 어느 하나 두 가지에 대해 동형접합성인 마우스들을 얻었다.
계속해서, 상기에서 기술된 경쇄 및 중쇄 유전자좌 둘 다에서의 변형에 대해 동형접합성인 유전자 엔지니어링된 마우스들을 사이토킨 수용체 ("항원 B")를 사용한 면역화에 대해 사용하였다. 3개의 ULC 1633ho/인간 중쇄 ho, 7개의 HULC 1927ho/인간 중쇄 ho 및 6개의 HULC 1930ho/인간 중쇄 ho를 면역화에 사용하였다.
마우스들을 종결하고 비장세포들을 수확하였다. 적혈구를 용해와 이어서 수확한 비장세포의 펠릿화에 의해 제거하였다. 재현탁된 비장세포를 항원 포지티브 B 세포의 확인 및 분리를 허용할 수 있는 시약들의 칵테일과 함께 인큐베이션하였다. 세포들을 유동 세포분석에 의해 분석하였다. 각각의 IgG 포지티브, IgM 네거티브 및 항원 포지티브 B 세포를 분류하고, 별도의 웰에 384 웰 플레이트 상에 플레이팅하였다. 각각의 B 세포에 대해 PCR을 수행하여 항원-특이적 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들을 증폭시켰다. 증폭된 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들을 각각 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 함유하고 있는 항체 벡터에 클론하였다. 동일한 B 세포로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 가지고 있는 정제된 재조합 플라스미드들을 CHO 숙주 셀라인에서 공동-형질전환시키고 발현시켰다.
발현된 항체들에 대해 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서 (Biacore 4000)를 사용하여 친화성 스크리닝을 수행하였다. 중성 pH (pH 7.4) 및 산성 pH (pH 6.0)에서 면역원에 결합하는 항체에 대한 동역학적 결합 변수들 (예컨대 k a, k d, K D, t1/2 등)을 기록하였다. Biacore CM4 센서 칩을 단클론성 마우스 항-인간 Fc 항체로 유도체화하여 상층액으로부터의 항체를 포획하였다. 그런 다음 단일 농도 (100 nM)의 면역원을 항체-포획된 표면 위로 30 ㎕/분의 유속으로 주입하였다. 항체-항원 결합을 1.5분 동안 모니터링한 후 포획된 항체로부터의 항원의 해리를 2.5분 동안 모니터링하였다. 동역학적 결합 (k a) 및 해리 (k d) 속도 상수를, 데이터를 Biacore 4000 평가 소프트웨어 버전 1.0을 사용하여 질량 이동 모델을 사용하여 1:1 결합에 프로세싱하고 적용함으로써 측정하였다. 평형 해리 상수 (K D) 및 해리성 반감기 (t1/ 2)를 동역학적 속도 상수로부터 다음과 같이 계산하였다: K D (M) = k d / k a; 및 t1/2 (분) = ln2/(60*k d).
Biacore 결합제를 측정가능한 KD를 가지는 임의의 항체로서 정의하였다. 이 실험에서, pH-의존성 결합제를 약 2보다 큰, pH 7.4에서의 t1/2 대 pH 6.0에서의 t1/2의 비율을 가지는 임의의 항체로서 정의하였다.
아래의 표 7에서 나타내는 것과 같이, 1633 ULC 마우스에 비교하여 1927 및 1930 HULC 마우스에서 pH-의존성 항원 결합을 나타낸 항체들의 백분율에 2 내지 3배 증가가 있었다.
HULC 마우스에서 생성된 pH-의존성 항체들의 백분율
마우스 계통 Biacore 결합제 pH 의존성 결합 % pH 의존성
ULC 1633ho/인간 중쇄 ho 115 10 8%
HULC 1930ho/인간 중쇄 ho 205 49 24%
HULC 1927ho/인간 중쇄 ho 34 7 21%
실시예 7: 2개의 인간 V 절편을 포함하는 마우스들의 제조 및 분석
실시예 7.1: 2개의 인간 V 절편을 포함하는 마우스들의 제조를 위한 표적화 벡터의 구성
2개의 인간 Vκ 유전자 절편 (예컨대 인간 Vκ1-39 및 인간 Vκ3-20 유전자 절편)을 함유하는 2개의 엔지니어링된 경쇄 유전자좌를 구성하였다 (도 16b). 한 개의 엔지니어링된 경쇄 유전자좌는 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편을 재배열되지 않은 형태로 함유하였다 (DLC-5J). 엔지니어링된 제 2 경쇄 유전자좌는 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 및 1개의 인간 Jκ 유전자 절편을 재배열되지 않은 형태로 함유하였다 (DLC-1J). 2개의 추가의 엔지니어링된 경쇄 유전자좌의 각각에 대해, 인간 유전자 절편의 3'에는 B 세포에서 인간 유전자 절편의 생체 내 재배열을 허용하기 위해 재조합 신호 서열이 있다.
DLC -1J 마우스의 엔지니어링 및 제조. 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 (Vκ1-39 및 Vκ3-20) 및 하나의 인간 Jκ 유전자 절편 (Jκ5)을 포함하는, 다르게는 DLC-1J로 명명되는 경쇄 유전자좌 생성을 초래하는 엔지니어링 단계들은 도 17에 도시한다. 구체적으로, 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 서열을 BAC 주형 (Invitrogen)으로부터 PCR에 의해 증폭시키고, 재조합 신호 서열 (rss) 및 인간 Jκ5 절편을 함유하는 증폭된 서열과 함께 UB-하이그로마이신 선택 카세트를 함유하고 있는 플라스미드에 4-방향 결찰을 통해 클론하였다 (도 17a). 5' 및 3' 아암을 도 17b 및 17c에 도시한 것과 같이 부착하였다.
그 결과의 표적화 구성물을 도 16b에 도시하는데 (하부 도표; DLC-1J), 재조합 신호 서열 (RSS)은 흰색 타원형으로 표시된다. 마우스 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 엔지니어링 된 DLC-1J 경쇄 유전자좌의 변형된 BAC DNA 클론 (즉 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 상류 및 하류 서열)을 2개의 인간 Vκ 유전자 절편을 함유하고 있는 엔지니어링된 경쇄 유전자좌 내의 서열에 위치한 프라이머들을 사용한 PCR과, 이어서 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 중 어느 하나를 발현하는 마우스를 제조하기 위한 마우스 Igκ 가변 유전자좌 (κ 가변 및 연결 유전자 절편을 포함함)(도 17d)의 결실을 포함하는 ES 세포 안으로의 일렉트로포레이션에 의해 확인하였다. 엔지니어링된 DLC-1J 경쇄 유전자좌를 함유한 포지티브 ES 세포 클론들을 TaqmanTM 스크리닝 및 엔지니어링된 DLC-1J 경쇄 유전자좌에 특이적인 프로브들을 사용한 염색체분석에 의해 확인하였다. DLC-1J ES 세포의 ES 세포 스크리닝에 사용된 프라이머들과 프로브들의 서열을 아래의 표 8에 나타내고 이것들을 서열 목록에 포함시킨다.
ES 세포 스크리닝에 사용된 프라이머 및 프로브들
프로브
명칭 		프로브의
분석/유형 		검출된 위치 프로브 서열 전방 프라이머 역 프라이머
1633h2 GOA/
TaqmanTM 		Vk1-39 ATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCT (SEQ ID NO:44) GGGCAAGTCAGAGCATTAGCA (SEQ ID NO:45 TGCAAACTGGATGCAGCATAG (SEQ ID NO:46)
1635h2 GOA/
TaqmanTM 		Vk3-20 AAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGG (SEQ ID NO:65) TCCAGGCACCCTGTCTTTG (SEQ ID NO:66) AAGTAGCTGCTGCTAACACTCTGACT (SEQ ID NO:67)
Neo GOA neo 　TGGGCACAACAGACAATCGGCTG
(SEQ ID NO:38)		 　GGTGGAGAGGCTATTCGGC
(SEQ ID NO:39)		 　GAACACGGCGGCATCAG
(SEQ ID NO:40)
Jxn 1-39/3-20 GOA/BHQ1 1-39/3-20 BamHI 접합 TCTTTTGCCCCGGATCCGATCAG (SEQ ID NO:84; 진한 부분은 제한 부위임) GGGAGGCTCCTCTGAACTCTAAG (SEQ ID NO:85) GTCCAGTCACTCGGTTGCTAT (SEQ ID NO:86)
그런 다음 확인한 ES 셀라인을 사용하여 암컷 마우스에 이식하여 한배 새끼들이 DLC-1J 경쇄 유전자좌를 포함하고 마우스 Cκ 도메인과 융합된 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하도록 하였다. 새끼들의 유전형 분석에 사용된 프라이머 및 프로브들의 서열은 상기 표 8에 열거된다. 삽입된 엔지니어링된 서열의 상류 및 하류의 마우스 서열의 약 100 뉴클레오티드를 포함하는, 엔지니어링된 DLC-1J 유전자좌에 걸쳐있는 서열은 도 18에 나타내고 SEQ ID NO:82로 제시한다.
엔지니어링된 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 ES 세포는 표적화 구성물에 의해 도입된 ERTed 네오마이신 카세트를 제거하기 위하여 FLP를 발현하는 구성물로 트랜스펙션될 수 있다 (도 17e 참조). 임의로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스들로 사육함으로써 제거된다 (예컨대 US 6,774,279). 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스에서 보유된다.
DLC -5J 마우스의 엔지니어링 및 제조. 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 (Vκ1-39 및 Vκ3-20) 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편 (Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5)을 포함하는, 다르게는 DLC-5J로 명명되는 경쇄 유전자좌를 제조하기 위하여, 모든 5' 인간 Jκ를 포함하는 2000 염기쌍의 증폭된 서열을, 도 17b에 도시되어 있는, 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 및 하나의 인간 Jκ를 포함하는 벡터 안에 결찰하였다 (도 19a 참조). 3' 및 5' 아암의 부착을 포함하는 이어지는 엔지니어링 단계들은 도 19b에 도시한다.
그 결과의 표적화 구성물을 도 16b에 도시하는데 (상부 도표: DLC-5J), 재조합 신호 서열 (RSS)은 흰색 타원으로 표시된다. 마우스 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 변형된 BAC DNA 클론 엔지니어링된 DLC-5J 경쇄 유전자좌 (즉 내인성 면역글로불린 κ 경쇄 유전자좌의 상류 및 하류 서열)를, 2개의 인간 Vκ 유전자 절편을 함유하고 있는 엔지니어링된 경쇄 유전자좌 내의 서열들에 위치한 프라이머들을 사용한 PCR과, 이어서 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 중 어느 하나를 발현하는 마우스를 제조하기 위해 마우스 Igκ 가변 유전자좌 (κ 가변 및 연결 유전자 절편을 포함함)의 결실을 포함하고 있는 ES 세포 안으로의 일렉트로포레이션에 의해 확인하였다. 엔지니어링된 DLC-5J 경쇄 유전자좌를 함유한 포지티브 ES 세포 클론들을 TaqmanTM 스크리닝 및 엔지니어링된 DLC-5J 경쇄 유전자좌에 특이적인 프로브들을 사용한 염색체 분석에 의해 확인하였다. DLC-5J ES 세포들의 ES 세포 스크리닝에 사용된 프라이머 및 프로브들의 서열을 아래의 표 9에 나타내고 서열 목록에 포함시킨다.
프로브
명칭 		프로브의
분석/유형 		검출된 위치 프로브 서열 전방 프라이머 역 프라이머
1633h2 GOA/
TaqmanTM 		Vk1-39 ATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCT (SEQ ID NO:44) GGGCAAGTCAGAGCATTAGCA (SEQ ID NO:45 TGCAAACTGGATGCAGCATAG (SEQ ID NO:46)
1635h2 GOA/
TaqmanTM
Vk3-20 AAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGG (SEQ ID NO:65) TCCAGGCACCCTGTCTTTG (SEQ ID NO:66) AAGTAGCTGCTGCTAACACTCTGACT (SEQ ID NO:67)
Neo GOA neo 　TGGGCACAACAGACAATCGGCTG
(SEQ ID NO:38)		 　GGTGGAGAGGCTATTCGGC
(SEQ ID NO:39)		 　GAACACGGCGGCATCAG
(SEQ ID NO:40)
Jxn 1-39/3-20 GOA/BHQ1 1-39/3-20 BamHI 접합 TCTTTTGCCCCGGATCCGATCAG (SEQ ID NO:84; 진한 곳은 제한 부위) GGGAGGCTCCTCTGAACTCTAAG (SEQ ID NO:85) GTCCAGTCACTCGGTTGCTAT (SEQ ID NO:86)
Jxn 3-20/Jκ1-5 GOA/BHQ1 3-20/Jk1-5 BsiWI 접합 CTTCAACTGTGGCGTACGCACC (SEQ ID NO:87, 진한 곳은 제한 부위임) ACGCAGATGTAGCCAAACCCT (SEQ ID NO:88) CAGCTGCTGAAGCTCAACTC (SEQ ID NO:89)
그런 다음 확인된 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스들에 이식하여 한배 새끼들이 DLC-5J 경쇄 유전자좌를 포함하고 마우스 Cκ 도메인과 융합된 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하도록 하였다. 새끼들의 유전형 분석에 사용된 프라이머 및 프로브들의 서열은 상기 표 9에 열거된다. 삽입된 엔지니어링된 서열의 상류 및 하류의 마우스 서열의 약 100 뉴클레오티드를 포함하는, 엔지니어링된 DLC-5J 유전자좌에 걸쳐있는 서열은 도 20에 나타내고 SEQ ID NO:83으로 제시한다.
엔지니어링된 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 ES 세포는 표적화 구성물에 의해 도입된 ERTed 네오마이신 카세트를 제거하기 위하여 FLP를 발현하는 구성물로 트랜스펙션될 수 있다 (도 19d 참조). 임의로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스들로 사육함으로써 제거된다 (예컨대 US 6,774,279). 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스에서 보유된다.
실시예 7.2: 2개의 인간 V 절편을 포함하는 마우스들의 특성확인
유동 세포분석. DLC 마우스에서의 B 세포 집단 및 B 세포 발달을 비장세포 및 골수 제제의 유동 세포분석에 의해 확인하였다. 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편 (n=4)에 대해 동형접합성인 마우스, 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 및 1개의 인간 Jκ 유전자 절편 (n=4)에 대해 동형접합성인 마우스 및 야생형 마우스 (n=4)로부터의 세포 현탁액을 표준 방법을 사용하여 제조하고 형광 표지된 항체로 염색하였다.
간단하게 설명하면, 1x106 세포를 항-마우스 CD16/CD32 (클론 2.4G2, BD Pharmigen)와 함께 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 얼음 위에서 30분 동안 다음의 항체 칵테일로 표지화하였다: APC-H7 포합된 항-마우스 CD19 (클론 1D3, BD Pharmigen), 퍼시픽 블루(Pacific Blue) 포합된 항-마우스 CD3 (클론 17A2, BioLegend), FITC 포합된 항-마우스 Igκ (클론 187.1, BD Pharmigen) 또는 항-ㅁ마우스 CD43 (클론 1B11, BioLegend), PE 포합된 항-마우스 Igλ (클론 RML-42, BioLegend) 또는 항-마우스 c-kit (클론 2B8, BioLegend), PerCP-Cy5.5 포합된 항-마우스 IgD (BioLegend), PE-Cy7 포합된 항-마우스 IgM (클론 II/41, eBioscience), APC 포합된 항-마우스 B220 (클론 RA3-6B2, eBioscience). 염색에 이어서, 세포를 세척하고 2% 포름알데하이드에 고정시켰다. 데이터 획득은 LSRII 유동 세포분석기 상에서 수행하였고, FlowJo (Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석하였다. 게이팅: 총 B 세포 (CD19+CD3-), Ig+ B 세포 (Igκ+Igλ-CD19+CD3-), Ig+ B 세포 (Igκ-Igλ+CD19+CD3-). 골수 구획에 대한 결과는 도 21a 내지 23b에 도시된다. 비장 구획에 대한 결과는 도 24a 내지 도 27에 도시된다.
이 실시예에서 알 수 있는 것과 같이, DLC-5J 마우스들은 비장 및 골수 구획 내에 있는 정상적인 B 세포 집단을 증명한다 (도 21a 내지 27). DLC-5J 마우스들은 실질적으로 야생형 한배 새끼들에서 관찰된 것과 동일한 골수 구획 내의 미성숙, 성숙 및 프레/프로 B 세포 집단을 증명하였다. 실제로, DLC-5J 유전자좌는 야생형 마우스에서 관찰된 것과 실질적으로 동일한 κ:λ 비율을 유발하기 위하여 내인성 λ 경쇄 유전자좌와 경합할 수 있었다 (도 25b). 또한 DLC-5J 마우스들은 비장 구획에서 다양한 단계를 통한 B 세포의 진전(즉, 미성숙, 성숙, T1, T2, T3, 변연 지대 전구체, 변연 지대, 여포성-I, 여포성-II 등)이 야생형 마우스들에서 관찰되는 것과 실질적으로 동일한 방식으로 일어나는 한 정상적인 말초 B 세포 발달을 증명한다 (도 26a 내지 27). 대조적으로, DLC-1J 마우스들은 엔지니어링된 κ 경쇄에 비교하여 더 낮은 B 세포의 총 수 및 증가된 κ 경쇄 용법을 증명하였다 (데이터는 제시되지 않음).
이중 경쇄 발현. 두 가지 인간 Vκ 유전자 절편의 발현을 정량 PCR 분석을 사용하여 동형접합성 마우스들에서 분석하였다. 간단하게 설명하면, CD19+ B 세포를 야생형 마우스, 마우스 중쇄 및 κ 경쇄 가변 유전자좌의 해당하는 인간 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 유전자좌 (Hκ)로의 대체에 대해 동형접합성인 마우스, 뿐만 아니라 2개의 인간 Vκ 유전자 절편 및 5개의 인간 Jκ 유전자 절편 (DLC-5J) 또는 하나의 인간 Jκ 유전자 절편 (DLC-1J) 중 어느 하나를 함유하고 있는 엔지니어링된 κ 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스들의 골수 및 전체 비장으로부터 정제하였다. 상대적인 발현을 마우스 Cκ 영역의 발현에 대해 표준화하였다 (n=그룹당 3 내지 5마리 마우스). 그 결과들을 도 28 및 도 29에 도시한다.
재배열된 인간 Vκ3-20 또는 인간 Vκ1-39 유전자 절편을 함유하고 있는 경쇄들의 발현을 DLC-5J 및 DLC-1J 마우스들의 골수 및 비장 둘 다에서 검출하였다 (도 28 및 도 29). 골수 구획에서, 두 가지 계통의 DLC 마우스에서 인간 Vκ3-20-유도된 및 인간 Vκ1-39-유도된 경쇄 둘 다의 발현은 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 해당하는 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 절편으로의 대체를 포함하고 있는 마우스들 (Hκ; 도 28)에 비교하여 상당히 더 높았다. 인간 Vκ3-20-유도된 경쇄 발현은 Hκ 마우스에서보다 약 6배 (DLC-5J) 내지 15배 (DLC-1J) 더 높은 것으로 관찰되었다. DLC-1J 마우스들은 골수 구획에서 DLC-5J 마우스들보다 약 2배 더 높은 인간 Vκ3-20-유도된 경쇄의 발현을 입증하였다. 인간 Vκ1-39-유도된 경쇄 발현은 Hκ 마우스에서보다 약 6배 (DLC-5J) 내지 13배 (DLC-1J) 더 높은 것으로 관찰되었다. DLC-1J 마우스들은 골수 구획에서 DLC-5J 마우스들보다 약 2배 더 높은 인간 Vκ1-39-유도된 경쇄의 발현을 입증하였다.
비장 구획에서, 두 가지 계통의 DLC 마우스들에서 인간 Vκ3-20-유도된 및 인간 Vκ1-39-유도된 경쇄 둘 다의 발현은 Hκ 마우스에 비교하여 상당히 더 높았다 (도 29). DLC-1J 마우스들은 비장 구획에서 DLC-5J 마우스들보다 약 2배 더 높은 인간 Vκ3-20-유도된 경쇄의 발현을 입증하였다. 인간 Vκ1-39-유도된 경쇄 발현은 Hκ 마우스에서보다 약 4배 (DLC-5J) 내지 5배 (DLC-1J) 더 높은 것으로 관찰되었다. DLC-1J 마우스들은 비장 구획에서 DLC-5J 마우스들에 비교하여 유사한 인간 Vκ1-39-유도된 경쇄의 발현을 입증하였다.
DLC -5J 마우스에서 인간 V L / J L 용법. 2개의 재배열되지 않은 인간 Vκ 유전자 절편 및 5개의 재배열되지 않은 인간 Jκ 유전자 절편 (DLC-5J)에 대해 동형접합성인 마우스들을 비장 B 세포에서 역-전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 인간 Vκ/Jκ 유전자 절편 용법에 대해 분석하였다.
간단하게 설명하면, 동형접합성 DLC-5J (n=3) 및 야생형 (n=2) 마우스들로부터의 비장을 수확하고 10% 열-비활성화된 우태아 혈청을 함유하고 있는 RPMI 1640 (Sigma) 10 mL에서 불투명 유리 슬라이드를 사용하여 체질하여 단일 세포 현탁액을 만들었다. 비장세포를 원심분리로 (1200 rpm에서 5분 동안) 펠릿화하고 적혈구를 5 mL의 ACK 용해 완충액 (GIBCO)에 3분 동안 용해시켰다. 비장세포를 PBS (Irvine Scientific)로 희석하고, 0.7 ㎛ 세포 거르개를 사용하여 여과하고, 다시 원심분리하여 세포를 원심분리한 후, 1 mL의 PBS에 재현탁하였다.
펠릿화된 비장세포로부터 RNA를 AllPrep DNA/RNA 미니키트 (Qiagen)를 제조업체의 명세를 따라 사용하여 분리하였다. 비장세포 RNA에 대하여 마우스 Cκ 유전자에 특이적인 프라이머들을 포함한 5' RACE (cDNA 단부의 신속한 증폭, Rapid Amplification of cDNA ends) 시스템을 제조업체 (Invitrogen)의 명세를 따라 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 마우스 Cκ 유전자에 특이적인 프라이머들은 3' mIgκC RACE1 (AAGAAGCACA CGACTGAGGC AC; SEQ ID NO:90) 및 mIgκC3'-1 (CTCACTGGAT GGTGGGAAGA TGGA; SEQ ID NO:91)이었다. PCR 생성물을 겔-정제하고 pCR®2.1-TOPO® 벡터에 클론한 후, 벡터 내에서 클로닝 부위 양옆의 위치에 위치한 M13 전방 (GTAAAACGAC GGCCAG; SEQ ID NO:92) 및 M13 역 (CAGGAAACAG CTATGAC; SEQ ID NO:93) 프라이머들을 사용하여 서열화하였다. 각 비장 샘플로부터 10개의 클론을 서열화하였다. 서열들을 IMGT/V-QUEST 참조 디렉토리 세트로부터의 마우스 및 인간 면역글로불린 세트에 비교하여 Vκ/Jκ 용법을 측정하였다. 아래의 표 10은 각각의 비장세포 샘플로부터의 RT-PCR 클론들에서 관찰된 선택된 클론들에 대한 Vκ/Jκ 조합을 나타낸다. 표 11은 DLC-5J 동형접합 마우스들로부터 선택된 RT-PCR 클론들의 인간 Vκ/인간 Jκ 및 인간 Jκ/마우스 Cκ 접합의 아미노산 서열을 나타낸다. 소문자들은 재조합 중에 N 및/또는 P 첨가로부터 유발된 가변 영역 또는 비-주형 첨가의 아미노산 서열의 돌연변이를 나타낸다.
이 실시예에서 알 수 있는 것과 같이, 마우스 Cκ 유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 2개의 재배열되지 않은 인간 Vκ 유전자 절편 및 5개의 재배열되지 않은 인간 Jκ 유전자 절편 (DLC-5J)에 대해 동형접합성인 마우스들은 인간 Vκ 유전자 절편을 배가시키기 위해 두 가지의 인간 Jκ 유전자 절편을 생산적으로 재조합할 수 있어서 제한된 면역글로불린 경쇄 레퍼토리를 생성할 수 있다. 표 10에 나타낸 DLC-5J 동형접합 마우스에서의 재배열 중에서, 독특한 인간 Vκ/Jκ 재배열이 Vκ1-39/Jκ2 (1), Vκ1-39/Jκ3 (1), Vκ3-20/Jκ1 (7), Vκ3-20/Jκ2 (4) 및 Vκ3-20/Jκ3 (1)에 대해 관찰되었다. 나아가, 그런 독특한 재배열은 발달 중에 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 절편의 돌연변이 및/또는 재조합 중 어느 것으로부터 유발된 경쇄의 CDR3 영역 내에 있는 독특한 아미노산들의 존재 (표 11)를 통한 접합부의 다양성을 증명하였다. 모든 재배열은 마우스 Cκ를 통해 전체적으로 볼 때 기능성인 것으로 나타났다 (표 11).
이들 데이터는, 함께 모아져서, 선택된 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편, 이때 이것들은 둘 다 면역글로불린 경쇄의 인간 VL 도메인을 (예컨대 하나 또는 그 이상의 및, 어떤 구체예에서, 5개까지의 인간 JL 유전자 절편과) 재배열하고 코드화할 수 있는 인간 VL 유전자 절편을 제시하기 위해 엔지니어링된 마우스들이 모든 측면에서 거의 야생형과 같은 B 세포 수 및 발달을 나타내는 것을 증명한다. 그런 마우스들은 콜렉션에 존재하는 2개의 가능한 인간 VL 유전자 절편 중 하나를 가지는 면역글로불린 경쇄를 가지고 있는 항체들의 콜렉션을 생성할 수 있다. 이런 항체들의 콜렉션은 항원 도전에 대한 반응으로 마우스에 의해 생성되고 다양한 역 키메라 (인간 가변/마우스 불변) 중쇄들과 결합한다.
비장 세포 샘플에서 관찰된 Vκ/Jκ 조합
마우스 ID No. 유전형 클론 Vκ/Jκ 조합
1089451 DLC-5J 1-2 1-39/3
1-4 3-20/2
1-7 3-20/1
1-8 3-20/2
1089452 DLC-5J 2-2 3-20/1
2-3 3-20/1
2-6 3-20/2
2-8 3-20/2
2-9 3-20/1
2-10 1-39/2
1092594 DLC-5J 3-1 3-20/1
3-2 3-20/1
3-4 3-20/1
3-6 3-20/3
3-9 3-20/2
1092587 WT 1-1 19-93/1
1-2 6-25/1
1-3 4-91/5
1-5 3-10/4
1-6 4-86/4
1-8 19-93/1
1-10 19-93/2
1092591 WT 2-1 19-93/1
2-3 6-20/5
2-4 6-25/5
2-5 1-117/1
2-6 8-30/1
2-7 8-19/2
2-8 8-30/1
2-10 1-117/1
DLC-5J 동형접합 마우스로부터의 인간 Vκ/인간 Jκ 및 인간 Jκ/마우스 Cκ 접합부의 아미노산 서열
클론 Vκ/Jκ hVκ/hJκ/mCκ 접합부 서열
(CDR3 밑줄, mIgκC 이탤릭체)		 SEQ ID NO:
2-10 1-39/2 QPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIKRADAAPTVSI 94
1-2 1-39/3 QPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKRADAAPTVSI 95
1-7 3-20/1 EPEDFAVYYCQQYGSSPrTFGQGTKVEIKRADAAPTVSI 96
2-2 3-20/1 EPEDFAVYYCQQYGSSrTFGQGTKVEIKRADAAPTVSI 97
2-3 3-20/1 EPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRADAAPTVSI 98
2-9 3-20/1 dPEDFAVYYCQQYGSSPrTFGQGTKVEIKRADAAPTVSI 99
3-1 3-20/1 EPEDFAVYYCQQYGSSPrTFGQGTKVEIKRADAAPTVSI 100
3-2 3-20/1 EPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRADAAPTVSI 101
3-4 3-20/1 EPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGQGTKVEIKRADAAPTVSI 102
3-9 3-20/2 EPEDFAVYYCQQYGSSPYTFGQGTKLEIKRADAAPTVSI 103
3-6 3-20/3 EPEDFAVYYCQQYGSSiFTFGPGTKVDIKRADAAPTVSI 104
실시예 8: 2개의 히스티딘-치환된 인간 경쇄를 포함하는 마우스들의 제조 및 특성확인
실시예 8.1: 각각 4개의 히스티딘 치환을 함유하고 있는 2개의 V 카파 절편을 포함하는 마우스들의 엔지니어링 및 제조
히스티딘 치환을 상기에서 Vκ1-39 및 Vκ3-20 ULC 마우스들에 대해 기술한 것과 같이 이중 경쇄 유전자좌에 도입하였다. 간단히 설명하면, 도 19a (하부)에 도시한 DLC 서열에 대해, 도 30에 도시한 프라이머들을 사용하여 부위-특정 돌연변이생성을 수행하는데, 먼저 Vκ1-39 서열을 변형한 후, 계속해서 Vκ3-20 서열을 변형시켰다. 그 결과의 이중 경쇄 서열은 위치 105, 106, 108 및 111에서 생식선 서열에 도입된 히스티딘들을 가지는 Vκ1-39 절편, 위치 105, 106, 107 및 109에서 생식선 서열에 도입된 히스티딘들을 가지는 Vκ3-20 절편, 뿐만 아니라 5개의 모든 Jκ 절편 (Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5)을 함유하였다. 후속되는 엔지니어링 단계는 FRT-UB-NEO-FRT 카세트를 운반하는 5' 아암, 및 마우스 Igκ 인핸서 및 불변 영역을 운반하는 3' 아암의 부착을 포함하였다. 이 표적화 벡터를 도 31a (재조합 신호 서열 RSS는 이 도면에서 생략되어 있음)에 도시한 것과 같이, 마우스 Igκ 가변 유전자좌 (κ 가변 및 연결 유전자 절편을 포함함)의 결실을 포함하는 ES 세포 안에 일렉트로포레이션하였다. 표적화된 ES 세포를 상기에서 기술한 것과 같이 대립유전자 분석을 변형하여, 표 1, 5, 8 및 9에서 기술한 영역들을 검출한 프라이머 및 프로브들 (구체적으로 1633h2, 1635h2, neo, Jxn 1-39/3-20, mIgKd2 및 mIgKp15), 뿐만 아니라 아래의 표 12에 열거한 프라이머와 프로브들의 2개의 추가 세트를 사용하여 스크리닝하였다. 이들 2개의 프라이머와 프로브들의 추가 세트를 서열 목록에 포함시킨다.
ES 세포 스크리닝에 사용된 프라이머 및 프로브들
프로브
명칭 		프로브의 분석/유형 결실된 위치 프로브 서열 전방 프라이머 역 프라이머
hVI492 1-39 GOA/
FAM-BHQ+ 		MAID 6185 (4 HIS-1-39 특이적) AACTTACTACTGTCACCA (SEQ ID NO:111) CAGCAGTCTGCAACCTGAA (SEQ ID NO:112) GGCTCGTCCTCACACATC (SEQ ID NO:113)
hVI492 3-20 GOA/FAM-BHQ+ MAID 6185 (4 HIS-3-20 특이적) TTACTGTCAC CATCATG (SEQ ID NO:114) GCAGACTGGAGCCTGAAGA (SEQ ID NO:115 AAGCTGAATCACTGTGGGAGGTG (SEQ ID NO:116)
그런 다음 확인한 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스에 이식하여 한배 새끼들이 2개의 제시된 VL 절편 서열의 각각에서 4개의 히스티딘 변형을 가지는 DLC-5J 경쇄 유전자좌를 포함하고, 마우스 Cκ 도메인과 융합된 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하도록 하였다. ES 세포 스크리닝에 대해 사용한 것과 동일한 서열의 일부를 또한 새끼들의 유전형 분류에 대해서도 사용한다.
엔지니어링된 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 ES 세포들은 표적화 구성물에 의해 도입된 FRTed 네오마이신 카세트를 제거하기 위하여 FLP를 발현하는 구성물 (예컨대 FLPo)로 트랜스펙션될 수 있다 (도 31b 참조, RSS는 이 도면에서 생략됨). 임의로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스들로 사육됨으로써 제거된다 (예컨대 US 6,774,279). 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스들에서 보유된다.
실시예 8.2: 각각이 3개의 히스티딘 치환을 함유하고 있는 2개의 V 카파 절편을 포함하는 마우스들의 엔지니어링 및 제조
3개의 히스티딘 치환을 이중 경쇄 마우스들의 각각의 Vκ1-39 및 Vκ3-20에 도입하였다. 간단히 설명하면, 도 19a (하부)에 도시한 DLC 서열에 대해, 도 32에 도시한 프라이머들을 사용하여 부위-특정 돌연변이생성을 수행하는데, 먼저 Vκ1-39 서열을 변형한 후, 계속해서 Vκ3-20 서열을 변형시켰다. 그 결과의 이중 경쇄 서열은 위치 106, 108 및 111에서 생식선 서열에 도입된 히스티딘들을 가지는 Vκ1-39 절편, 위치 105, 106 및 109에서 생식선 서열에 도입된 히스티딘들을 가지는 Vκ3-20 절편, 뿐만 아니라 5개의 모든 Jκ 절편 (Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5)을 함유하였다. 후속되는 엔지니어링 단계는 FRT-UB-NEO-FRT 카세트를 운반하는 5' 아암, 및 마우스 Igκ 인핸서 및 불변 영역을 운반하는 3' 아암의 부착을 포함하였다. 이 표적화 벡터를 도 33a (RSS는 이 도면에서 생략되어 있음)에 도시한 것과 같이, 마우스 Igκ 가변 유전자좌 (κ 가변 및 연결 유전자 절편을 포함함)의 결실을 포함하는 ES 세포 안에 일렉트로포레이션하였다. 표적화된 ES 세포를 상기에서 기술한 것과 같이 대립유전자 분석을 변형하여, 표 1, 5, 8 및 9에서 기술한 영역들을 검출한 프라이머 및 프로브들 (구체적으로 1633h2, 1635h2, neo, Jxn 1-39/3-20, mIgKd2 및 mIgKp15), 뿐만 아니라 아래의 표 13에 열거한 프라이머와 프로브들의 2개의 추가 세트를 사용하여 스크리닝하였다. 이들 2개의 프라이머와 프로브들의 추가 세트를 서열 목록에 포함시킨다.
ES 세포 스크리닝에 사용된 프라이머 및 프로브들
프로브
명칭 		프로브의 분석/유형 검출된 위치 프로브 서열 전방 프라이머 역 프라이머
hVI493 1-39 GOA/
FAM-BHQ+ 		MAID 6187 (3 HIS-1-39 특이적) CTTACTACTGTCAACATAG (SEQ ID NO:123) CAGCAGTCTGCAACCTGAA (SEQ ID NO:124) GGCTCGTCCTCACACATC (SEQ ID NO:125)
hVI493 3-20 GOA/FAM-BHQ+ MAID 6187 (3 HIS-3-20 특이적) TACTGTCAC CATTATGG (SEQ ID NO:126) GCAGACTGGAGCCTGAAGA (SEQ ID NO:127 AAGCTGAATCACTGTGGGAGGTG (SEQ ID NO:128)
그런 다음 확인한 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스에 이식하여 한배 새끼들이 2개의 제시된 VL 절편 서열의 각각에서 3개의 히스티딘 변형을 가지는 DLC-5J 경쇄 유전자좌를 포함하고, 마우스 Cκ 도메인과 융합된 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하도록 하였다. ES 세포 스크리닝에 대해 사용한 것과 동일한 서열의 일부를 또한 새끼들의 유전형 분류에 대해서도 사용한다.
엔지니어링된 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 ES 세포들은 표적화 구성물에 의해 도입된 FRTed 네오마이신 카세트를 제거하기 위하여 FLP를 발현하는 구성물 (예컨대 FLPo)로 트랜스펙션될 수 있다 (도 33b 참조, RSS는 이 도면에서 생략됨). 임의로, 네오마이신 카세트는 FLP 재조합효소를 발현하는 마우스들로 사육됨으로써 제거된다 (예컨대 US 6,774,279). 임의로, 네오마이신 카세트는 마우스들에서 보유된다.
실시예 8.3: 인간 히스티딘-치환된 이중 경쇄를 포함하고 있는 마우스들의 사육
엔지니어링된 인간 히스티딘-치환된 이중 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 마우스들을, 그것들의 유일한 경쇄로서 이중 경쇄 유전자좌로부터 유도된 엔지니어링된 히스티딘-치환된 경쇄를 발현하는 자손을 생성하기 위하여, 내인성 λ 경쇄 유전자좌가 결실되어 있는 마우스들과 교배시킨다.
엔지니어링된 인간 히스티딘-치환된 이중 경쇄 유전자좌를 내포하고 있는 마우스들을, 내인성 마우스 중쇄 가변 유전자좌의 인간 중쇄 가변 유전자좌로의 대체를 함유하는 마우스들과 교배시킨다 (US 6,596,541 및 US 8,502,018 참조; VELOCIMMUNE® 마우스, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.).
본원에서 기술된 것과 유사한 사육을 상기 실시예 7에서 기술된 이중 경쇄 마우스들에 대해 세팅한다.
이들 사육 방법 및 인간 가변 경쇄 및 중쇄 영역들로부터의 전체 인간 항체의 제조에 대한 추가의 상세한 설명은 상기 실시예 5에서 설명된다.
실시예 8.4: 각각이 3개의 히스티딘 치환을 함유하고 있는 2개의 V 카파 절편을 포함하고 있는 마우스들로부터 얻어진 면역글로불린 경쇄의 히스티딘 변형의 결실
비장의 B 세포 mRNA로부터의 V 카파 암플리콘을 역-전사효소 PCR (RT-PCR) 및 고속 대량 스크리닝을 사용하여 제조하였다.
간단하게 설명하면, 각각이 3개의 히스티딘 치환을 함유하고 있는 2개의 V 카파 절편 (Vκ1-39 및 Vκ3-20) 및 내인성 마우스 중쇄를 포함하고 있는 5마리의 이형접합 마우스 (그것의 카파 유전자좌가 도 33에 도시되어 있는 마우스)로부터 비장을 수확하고, 유리 슬라이드를 사용하여 1xPBS (Gibco)에 균등화하였다. 세포를 원심분리로 (5분 동안 500xg) 펠릿화하고, 적혈구를 ACK 용해 완충액 (Gibco)에서 3분 동안 용해시켰다. 세포를 1xPBS로 세척하고 0.7 ㎛ 세포 거르개를 사용하여 여과하였다. B-세포를 비장 세포로부터 CD19 (Miltenyi Biotec)에 대한 MACS 자성 포지티브 선택을 사용하여 분리하였다. 총 RNA를 펠릿화된 B-세포로부터 RNeasy 플러스 키트 (Qiagen)를 사용하여 분리하였다. 폴리A+ mRNA를 총 RNA로부터 Oligotex Direct mRNA 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 분리하였다.
이중-가닥의 cDNA를 비장의 B 세포 mRNA로부터 5' RACE에 의해 SMARTer Pico cDNA 합성 키트 (Clontech)를 사용하여 제조하였다. Clontech 역 전사효소 및 dNTP들을 Invitrogen으로부터의 Superscript II 및 dNTP로 치환하였다. 면역글로불린 경쇄 레퍼토리를 IgK 불변 영역에 특이적인 프라이머 및 SMARTer 5' RACE 프라이머 (표 14)를 사용하여 cDNA로부터 증폭시켰다. PCR 생성물들을 QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 세정하였다. PCR의 제 2 라운드를 동일한 5' RACE 프라이머 및 IgK 불변 영역에 특이적인 중첩된 3' 프라이머 (표 15)를 사용하여 시행하였다. 제 2 라운드의 PCR 생성물을 SizeSelect E-겔 시스템 (Invitrogen)을 사용하여 정제하였다. 제 3 PCR을 454 어댑터 및 바코드를 첨가한 프라이머들을 사용하여 수행하였다. 제 3 라운드의 PCR 생성물을 Agencourt AMPure XP 비즈를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 SYBR-qPCR에 의해 KAPA 라이브러리 정량 키트 (KAPA Biosystems)를 사용하여 정량하였다. 모아진 라이브러리에 대해 에멀션 PCR (emPCR)을 454 GS Junior 티타늄 시리즈 Lib-A emPCR 키트 (Roche Diagnostics)를 사용하여 수행하고 Roche 454 GS Junior 기기를 제조업체의 프로토콜을 따라 사용하여 양방향으로 서열화하였다.
제 1 라운드 PCR 프라이머
명칭 서열 (SEQ ID NO)
3' mIgK 외부 AAGAAGCACACGACTGAGGCAC
(SEQ ID NO:129)
제 2 라운드 PCR 프라이머
명칭 서열 (SEQ ID NO)
3' mIgK 내부 GGAAGATGGATACAGTTGGTGC
(SEQ ID NO:130)
생물정보학 분석을 위해, 454 서열 판독을 샘플 바코드 완벽 매치를 토대로 분류하고 품질에 대해 트리밍하였다. 인간 생식선 V 및 J 절편 데이터베이스에 대한 재배열된 Ig 서열들의 일렬배열을 토대로, igblast (NCBI, v2.2.25+)의 국소 설치를 사용하여 서열에 주석을 달았다. 동일한 스코어와 가장 잘 맞는 것이 여러 번 검출되었을 때 서열을 모호한 것으로서 표시하고 분석으로부터 제거하였다. 결과들을 분석하고 데이터를 mysql 데이터베이스에 저장하기 위하여 perl 스크립트의 세트를 개발하였다. 카파 경쇄의 CDR3 영역을 보존된 C 코돈과 FGXG 모티프 사이에 있는 것으로 정의하였다.
도 34는 인간 생식선 IGKV3-20 (도 34a) 또는 IGKV1-39 (도 34b) 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열과 히스티딘-변형된 DLC-5J (각각의 절편이 상기에서 기술된 것과 같은 3개의 히스티딘 변형을 가지고 있는 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편을 포함하고 있는 경쇄 가변 유전자좌를 포함함)를 포함하고 있는 마우스에서 생성된 생산적으로 재배열된 항체들로부터 얻어진 예시적인 Vκ 서열의 아미노산 번역과의 배열을 나타낸다. 서열 판독은 대부분의 생산적으로 재배열된 경쇄들이 그것의 생식선 CDR3에 도입된 적어도 하나의 히스티딘을 보유하였음을 나타냈다. 어떤 경우에, 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 보유하는 Vκ3-20 서열을 포함하고 있는 모든 생산적으로 재배열된 인간 경쇄의 대부분에서, 그것들의 생식선 CDR3에 도입된 3개의 히스티딘 변형은 모두 보유된다 (도 34a 참조). 어떤 경우에, 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 보유하는 Vκ1-39 서열을 포함하고 있는 생산적으로 재배열된 인간 경쇄들에서, 약 50%의 경쇄가 그것들의 생식선 CDR3에 도입된 3개의 히스티딘을 모두 보유하는 (도 34b 상부 배열 참조) 한편, 약 50%의 경쇄는 그것들의 생식선 CDR3에 도입된 3개의 히스티딘 중 2개를 보유한다 (도 34b 하부 배열 참조). 어떤 경우에, V 절편 서열의 마지막 위치에 있는 히스티딘은 V-J 재배열로 인해 손실될 수 있다.
본원에 개시된 발명의 59개의 비-제한적인 구체예를 아래에 제공한다.
1. 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편을 포함하고 있는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 생식선에 포함하고 있는 유전자 변형된 비-인간 동물로서,
각각의 인간 VL 유전자 절편은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하고,
적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편은 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 재배열하고 코드화할 수 있는 동물.
2. 동물이 면역글로불린 경쇄를 형성하기 위해 재배열할 수 있는 내인성 VL 유전자 절편을 포함하지 않는, 구체예 1의 동물.
3. 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열이 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열인, 구체예 1의 동물.
4. 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열이 마우스 또는 래트 서열인, 구체예 1의 동물.
5. 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열이 내인성 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열인, 구체예 3의 동물.
6. 생식선에, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 인간 VH, DH 및 JH 유전자 절편을 포함하고 있는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 더 포함하고 있는, 구체예 1의 동물.
7. 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열이 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열인, 구체예 6의 동물.
8. 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열이 마우스 또는 래트 서열인, 구체예 7의 동물.
9. 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열이 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열인, 구체예 7의 동물.
10. 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편이 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 존재하는, 구체예 1의 동물.
11. 면역글로불린 경쇄 불변 영역이 Cκ 영역인, 구체예 1의 동물.
12. 각각의 인간 VL 유전자 절편이 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는, 구체예 1의 동물.
13. 치환이 CDR3 코돈(들)에 있는, 구체예 12의 동물.
14. 치환이 3개 또는 4개의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환인, 구체예 13의 동물.
15. 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편이 2개의 인간 VL 유전자 절편인, 구체예 1의 동물.
16. 2개의 인간 VL 유전자 절편이 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편인, 구체예 15의 동물.
17. 동물이 설치류인, 구체예 1의 동물.
18. 설치류가 래트 또는 마우스인, 구체예 17의 동물.
19. 설치류가 마우스인, 구체예 18의 동물.
20. 동물이 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편에 의해 코드화된 아미노산 서열을 포함하는 항체를 발현하고, 그 항체는 인간 VL 유전자 절편의 적어도 하나의 히스티딘 코돈에 의해 코드화된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 보유하는, 구체예 1의 동물.
21. 동물이 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 해리성 반감기 (t1/ 2)의, 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배의 감소를 나타내는 항체들에 대해 풍부화된 관심의 항원에 대한 반응으로 B 세포들의 집단을 포함하는, 구체예 1의 동물.
22. t1/2의 감소를 나타내는 항체들에서의 풍부화가 적어도 약 2배인, 구체예 21의 동물.
23. 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편을 포함하고 있는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 생식선에 포함하고 있는 유전자 변형된 비-인간 동물로서,
2개 이하의 인간 VL 유전자 절편의 각각은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하고,
인간 VL 유전자 절편 및 JL 유전자 절편은 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 재배열하고 코드화할 수 있는 동물.
24. 동물이 면역글로불린 경쇄를 형성하기 위해 재배열할 수 있는 내인성 VL 유전자 절편을 포함하지 않는, 구체예 23의 동물.
25. 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열이 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열인, 구체예 23의 동물.
26. 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열이 마우스 또는 래트 서열인, 구체예 25의 동물.
27. 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열이 내인성 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열인, 구체예 25의 동물.
28. 생식선에, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 인간 VH, DH 및 JH 유전자 절편을 포함하고 있는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 더 포함하고 있는, 구체예 23의 동물.
29. 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열이 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열인, 구체예 28의 동물.
30. 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열이 마우스 또는 래트 서열인, 구체예 29의 동물.
31. 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열이 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열인, 구체예 29의 동물.
32. 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상의 인간 JL 유전자 절편이 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 존재하는, 구체예 23의 동물.
33. 면역글로불린 경쇄 불변 영역이 Cκ 영역인, 구체예 23의 동물.
34. 동물이 5개의 인간 Jκ 절편을 포함하고, 그 5개의 인간 Jκ 절편이 인간 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5 절편인, 구체예 23의 동물.
35. 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편이 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편인, 구체예 23의 동물.
36. 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편의 각각이 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는, 구체예 23의 동물.
37. 치환이 CDR3 코돈(들)에 있는, 구체예 36의 동물.
38. 치환이 3개 또는 4개의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환인, 구체예 37의 동물.
39. 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편의 각각이 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는, 구체예 35의 동물.
40. 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편의 각각이 3개 또는 4개의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는, 구체예 39의 동물.
41. 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 3개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는, 구체예 40의 동물.
42. 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 4개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 위치 105, 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는, 구체예 40의 동물.
43. 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 3개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 위치 105, 106 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는, 구체예 40의 동물.
44. 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 4개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 위치 105, 106, 107 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는, 구체예 40의 동물.
45. 동물이 설치류인, 구체예 23의 동물.
46. 설치류가 래트 또는 마우스인, 구체예 45의 동물.
47. 설치류가 마우스인, 구체예 46의 동물.
48. 동물이 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편 중 하나에 의해 코드화된 아미노산 서열을 포함하는 항체를 발현하고, 그 항체는 인간 VL 유전자 절편의 적어도 하나의 히스티딘 코돈에 의해 코드화된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 보유하는, 구체예 23의 동물.
49. 구체예 1의 동물을 제조하는 단계,
관심의 항원으로 그 동물을 면역시키는 단계, 및
중성 pH에서 바람직한 친화성으로 관심의 항원에 결합하는 한편 산성 pH에서 관심의 항원에 대해 감소된 결합을 나타내는 항체를 선택하는 단계를 포함하는,
관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 항체의 제조 방법.
50. 동물이 항원에 대한 반응으로 항원-특이적 항체의 집단을 발현하고, 이때 그 집단의 모든 항체는:
각각의 인간 VL 유전자 절편이 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하는 2개 이하의 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상의 JL 유전자 절편의 재배열로부터 유도된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인, 및
인간 중쇄 V, D 및 J 절편들의 레퍼토리로부터 유도된 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하고 있는 면역글로불린 중쇄를 포함하는,
구체예 23의 동물.
51. 동물이 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 해리성 반감기 (t1/ 2)의, 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배의 감소를 나타내는 항체들에 대해 풍부화된 관심의 항원에 대한 반응으로 B 세포들의 집단을 포함하는, 구체예 23의 동물.
52. t1/2의 감소를 나타내는 항체들에서의 풍부화가 적어도 약 2배인, 구체예 51의 동물.
53. 생식선에 유전자 변형된 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물의 제조 방법으로서, 그 방법은:
비-인간 동물의 게놈을 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 내인성 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 절편을 결실시키거나 비-기능성으로 만들기 위해 변형시키는 단계, 및
비-인간 동물의 게놈에 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편을 포함하고 있는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 위치시켜서, 그 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열이 면역글로불린 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되도록 하는 단계를 포함하고,
이때 각각의 인간 VL 유전자 절편은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하며,
적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편은 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 재배열하고 코드화할 수 있는, 방법.
54. 방법은 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 항체들에 대해 풍부화된 B 세포들의 집단을 포함하는 비-인간 동물을 초래하는, 구체예 53의 방법.
55. 면역글로불린 경쇄 가변 영역이 내인성 비-인간 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있는, 구체예 53의 방법.
56. 동물이 설치류인, 구체예 53의 방법.
57. 설치류가 마우스 또는 래트인, 구체예 56의 방법.
58. 적어도 하나의 인간 VL 유전자 절편이 2개의 인간 VL 유전자 절편인, 구체예 53의 방법.
59. 2개의 인간 VL 유전자 절편이 인간 Vκ1-39 유전자 절편 및 Vκ3-20 유전자 절편인, 구체예 58의 방법.
동등물
당업자들은 기본적인 실험 이상의 것을 사용하지 않아도 본원에 기술된 본 발명의 특정 구체예의 많은 동등물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 그런 동등물은 다음의 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 전체에 인용된 모든 비-특허 문서, 특허 출원 및 특허의 전체 내용은 본원에 그것의 전체 내용을 참조함으로써 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. MCWHIRTER, John MACDONALD, Lynn MURPHY, Andrew J. <120> Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same <130> 8825A-WO <140> To be assigned <141> 2014-09-18 <150> 14/030,424 <151> 2013-09-18 <160> 146 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> CDS <222> (1)..(21) <400> 2 cag cag agc tac agc acc ccc 21 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT 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Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln His Leu Thr Phe Gly Gly Gly 85 90 95 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 <210> 138 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 138 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser His Asn Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Thr Leu His Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Ser Met 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 139 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 139 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 140 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 140 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Tyr Ile Thr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 141 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 141 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu His Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Thr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 142 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 142 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Thr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 143 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 143 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Phe Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 144 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 144 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Lys Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile His Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 145 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 145 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Ile Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 146 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 146 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Arg 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105

Claims (93)

  1. 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 적어도 2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하고 있는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열로서,
    2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 중 적어도 하나는 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하고,
    적어도 2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편은 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 재배열하고 코드화할 수 있는, 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  2. 제 1항에 있어서, 각각의 인간 VL 유전자 절편은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  3. 제 1항에 있어서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열은 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열인 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  4. 제 3항에 있어서, 비-인간 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열은 마우스 또는 래트 서열인 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  5. 제 1항에 있어서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역은 Cκ 영역인 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  6. 제 2항에 있어서, 치환은 CDR3 코드화 서열에 있는 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  7. 제 6항에 있어서, 치환은 3개 또는 4개의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환인 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  8. 제 1항에 있어서, 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  9. 제 8항에 있어서, 2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편인 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  10. 제 9항에 있어서, 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편의 각각은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  11. 제 10항에 있어서, 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편의 각각은 3개 또는 4개의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  12. 제 11항에 있어서, 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 3개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  13. 제 11항에 있어서, 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 4개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 위치 105, 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  14. 제 11항에 있어서, 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 3개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 위치 105, 106 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  15. 제 11항에 있어서, 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 4개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 위치 105, 106, 107 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  16. 제 1항에 있어서, 5개의 인간 Jκ 유전자 절편을 포함하고, 그 5개의 인간 Jκ 유전자 절편은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5 절편인 것을 특징으로 하는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따르는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열을 생식선에 포함하고 있는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  18. 제 17항에 있어서, 동물은 면역글로불린 경쇄를 형성하기 위해 재배열할 수 있는 내인성 VL 유전자 절편을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  19. 제 17항에 있어서, 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열은 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 있는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  20. 제 19항에 있어서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열은 내인성 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열인 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  21. 제 17항에 있어서, 추가로 생식선에, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 인간 VH, DH 및 JH 유전자 절편을 포함하고 있는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 더 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  22. 제 21항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열인 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  23. 제 22항에 있어서, 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 마우스 또는 래트 서열인 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  24. 제 22항에 있어서, 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열인 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  25. 제 17항에 있어서, 동물은 설치류인 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  26. 제 25항에 있어서, 설치류는 래트 또는 마우스인 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  27. 제 26항에 있어서, 설치류는 마우스인 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  28. 제 17항에 있어서, 동물은 적어도 2개의 인간 VL 유전자 절편 중 하나에 의해 코드화된 아미노산 서열을 포함하는 항체를 발현하고, 그 항체는 인간 VL 유전자 절편의 적어도 하나의 히스티딘 코돈에 의해 코드화된 아미노산 위치에서 적어도 하나의 히스티딘 잔기를 보유하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  29. 제 17항에 있어서, 동물은 항원에 대한 반응으로 항원-특이적 항체의 집단을 발현하고, 이때 그 집단의 모든 항체는:
    적어도 2개의 VL 유전자 절편 및 하나 또는 그 이상의 JL 유전자 절편의 재배열로부터 유도된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인, 및
    인간 중쇄 V, D 및 J 절편의 레퍼토리로부터 유도된 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  30. 제 17항에 있어서, 동물은 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 해리성 반감기 (t1/2)의, 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배 또는 적어도 약 30-배의 감소를 나타내는 항체들에 대해 풍부화된 관심의 항원에 대한 반응으로 B 세포들의 집단을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 비-인간 동물.
  31. 제 30항에 있어서, t1/2의 감소를 나타내는 항체들에서 풍부화는 적어도 약 2배인 것을 특징으로 하는 동물.
  32. 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 항체의 제조 방법으로서,
    제 17항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따르는 동물을 관심의 항원으로 면역시키는 단계, 및
    산성 pH에서 관심의 항원에 대해 감소된 결합을 나타내면서 중성 pH에서 바람직한 친화성으로 관심의 항원에 결합하는 B 세포 또는 결합 단백질을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 생식선에 유전자 변형된 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물의 제조 방법으로서, 그 방법은
    면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 내인성 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 절편을 결실시키거나 비-기능성으로 만들기 위해 비-인간 동물의 게놈을 변형시키는 단계, 및
    그 비-인간 동물의 게놈에 적어도 2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 배치하여 그 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열이 면역글로불린 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되도록 하는 단계를 포함하고,
    이때 적어도 하나의 각각의 인간 VL 유전자 절편은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않은 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하며,
    적어도 2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편은 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 재배열하고 코드화할 수 있는, 비-인간 동물의 제조 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 방법은 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 항체들에 대해 풍부화된 B 세포들의 집단을 포함하는 비-인간 동물을 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 33항에 있어서, 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 내인성 비-인간 면역글로불린 경쇄 유전자좌인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 동물은 설치류인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 설치류는 마우스 또는 래트인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 33항에 있어서, 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38항에 있어서, 2개의 인간 VL 유전자 절편은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편의 각각은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편의 각각은 3개 또는 4개의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 3개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 41항에 있어서, 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 4개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 위치 105, 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 41항에 있어서, 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 3개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 위치 105, 106 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 41항에 있어서, 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 4개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 위치 105, 106, 107 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 33항에 있어서, 5개의 인간 Jκ 유전자 절편을 포함하고, 그 5개의 인간 Jκ 유전자 절편은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5 절편인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따르는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열을 게놈에 포함하고 있는 분리된 세포.
  48. 제 47항에 있어서, 세포는 면역글로불린 경쇄를 형성하기 위해 재배열할 수 있는 내인성 VL 유전자 절편을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  49. 제 47항에 있어서, 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열은 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌인 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  50. 제 49항에 있어서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열은 내인성 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열인 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  51. 제 47항에 있어서, 추가로 게놈에, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 인간 VH, DH 및 JH 유전자 절편을 포함하고 있는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 더 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  52. 제 51항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열인 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  53. 제 52항에 있어서, 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 마우스 또는 래트 서열인 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  54. 제 52항에 있어서, 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열인 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  55. 제 47항에 있어서, 세포는 설치류 세포인 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  56. 제 55항에 있어서, 설치류는 래트 또는 마우스인 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  57. 제 55항에 있어서, 설치류는 마우스인 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  58. 제 17항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 따르는 비-인간 동물로부터 유도된 세포 또는 조직.
  59. 제 58항에 있어서, 세포는 배 줄기 세포 또는 B 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  60. 제 33항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 따라 제조된 비-인간 동물로부터 유도된 세포 또는 조직.
  61. 제 60항에 있어서, 세포는 배 줄기 세포 또는 B 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  62. 5' 쥐과 동물의 상동성 아암; 적어도 2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하는 인간 가변 영역 핵산 서열, 및 3' 쥐과 동물의 상동성 아암을 포함하는 표적화 벡터로서,
    2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 중 적어도 하나는 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편에 의해 코드화되지 않는 적어도 하나의 히스티딘 코돈을 포함하고,
    적어도 2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편은 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 재배열하고 코드화할 수 있으며,
    각각의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편은 인간 또는 마우스 리더 서열 및 인간 또는 마우스 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고,
    및 상동성 아암은 인간 가변 영역 핵산 서열이 내인성 쥐과 동물의 경쇄 불변 영역 서열에 작동가능하게 연결되도록 벡터를 내인성 쥐과 동물의 면역글로불린 경쇄 유전자좌로 향하게 하는, 표적화 벡터.
  63. 제 62항에 있어서, 면역글로불린 경쇄 불변 영역은 Cκ 영역인 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  64. 제 62항에 있어서, 각각의 인간 VL 유전자 절편은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  65. 제 62항에 있어서, 치환은 CDR3 코드화 서열에 있는 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  66. 제 64항에 있어서, 치환은 3개 또는 4개의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환인 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  67. 제 61항에 있어서, 2개 이하의 인간 VL 유전자 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  68. 제 67항에 있어서, 2개의 인간 VL 유전자 절편은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편인 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  69. 제 68항에 있어서, 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편의 각각은 해당하는 인간 생식선 VL 유전자 절편 서열에 의해 코드화된 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  70. 제 69항에 있어서, 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편의 각각은 3개 또는 4개의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  71. 제 70항에 있어서, 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 3개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 위치 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  72. 제 70항에 있어서, 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 4개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ1-39 유전자 절편의 위치 105, 106, 108 및 111에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  73. 제 70항에 있어서, 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 3개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 위치 105, 106 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  74. 제 70항에 있어서, 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 4개의 비-히스티딘 코돈의 치환이고, 그 치환은 인간 Vκ3-20 유전자 절편의 위치 105, 106, 107 및 109에서 히스티딘을 발현하도록 디자인되는 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  75. 제 62항에 있어서, 5개의 인간 Jκ 유전자 절편을 포함하고, 그 5개의 인간 Jκ 유전자 절편은 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 및 Jκ5 절편인 것을 특징으로 하는 표적화 벡터.
  76. 제 32항의 방법에 따라 제조된, 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 결합 단백질.
  77. 제 76항에 따르는 결합 단백질의 면역글로불린 경쇄의 가변 도메인을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 핵산.
  78. 제 77항에 따르는 핵산을 포함하고 있는 숙주 세포.
  79. 제 32항의 방법에 따라 제조된, 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 B 세포.
  80. 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 결합 단백질의 제조 방법으로서,
    (i) 제 1 항체의 중쇄 가변 도메인을 포함하고 있는 제 1 면역글로불린 중쇄, 이때 제 1 항체는
    (a) 중성 pH에서 바람직한 친화성으로 관심의 항원에 결합하고,
    (b) 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 재배열하고 코드화할 수 있는 적어도 2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하고 있는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열을 생식선에 포함하고 있는 유전자 변형된 비-인간 동물에서 생성되며, 및
    (c) 적어도 2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 중 하나 및 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편에 의해 코드화된 경쇄 성분을 포함하는 제 1 면역글로불린 중쇄,
    (ii) (a) 제 1 항체의 경쇄 성분을 코드화하는 적어도 2개의 인간 VL 유전자 절편 중 하나 및 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편으로부터 유도되고, 및
    (b) 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하도록 변형된 면역글로불린 경쇄 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화된 경쇄 가변 도메인을 포함하고 있는 면역글로불린 경쇄
    를 세포에서 공동-발현시키는 단계, 및
    제 1 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하고, 중성 pH에서 관심의 항원에 대한 바람직한 친화성을 보유하며 산성 pH에서 관심의 항원에 대해 감소된 결합을 나타내는, 세포에서 발현된 결합 단백질을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  81. 제 80항에 있어서, 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열은 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제 81항에 있어서, 2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편인 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제 80항에 있어서, 결합 단백질은 전체 인간 중쇄 및 전체 인간 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제 80항에 있어서, 면역글로불린 경쇄 뉴클레오티드 서열은 추가로 생식선 핵산 서열에 의해 코드화되지 않는 체세포성 돌연변이를 코드화하는 적어도 하나의 코돈을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제 84항에 있어서, 결합 단백질은 전체 인간 제 1 면역글로불린 중쇄 및 전체 인간 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제 80항의 방법에 따라 제조된, 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 결합 단백질.
  87. 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 결합 단백질의 제조 방법으로서,
    (i) 중성 pH에서 바람직한 친화성으로 관심의 제 1 항원에 결합하는 제 1 항체의 제 1 중쇄 가변 도메인을 포함하고 있는 제 1 면역글로불린 중쇄,
    (ii) 중성 pH에서 바람직한 친화성으로 관심의 제 2 항원에 결합하는 제 2 항체의 제 2 중쇄 가변 도메인을 포함하고 있는 제 2 면역글로불린 중쇄,
    이때 제 1 및 제 2 항체는
    (a) 항체의 인간 경쇄 가변 도메인을 재배열하고 코드화할 수 있는 적어도 2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JL 유전자 절편을 포함하고 있는 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열을 생식선에 포함하고 있는 유전자 변형된 비-인간 동물에서 생성되고, 및
    (b) 적어도 2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편 중 하나 및 적어도 하나의 인간 JL 유전자 절편에 의해 코드화된 동일한 경쇄 성분을 포함하며,
    (iii) (a) 제 1 및 제 2 항체의 경쇄 성분을 코드화하는 적어도 2개의 인간 VL 유전자 절편 중 하나 및 적어도 하나의 JL 유전자 절편으로부터 유도되고, 및
    (b) 적어도 하나의 비-히스티딘 코돈의 히스티딘 코돈으로의 치환을 포함하도록 변형된 면역글로불린 경쇄 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화된 경쇄 가변 도메인을 포함하고 있는 면역글로불린 경쇄
    를 세포에서 공동-발현시키는 단계, 및
    제 1 면역글로불린 중쇄, 제 2 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는 세포에서 발현된 결합 단백질을 선택하는 단계로서, 이때 결합 단백질은 항원(들)에 대한 바람직한 친화성 및 pH-의존성 항원 특성을 가지는 단계를 포함하는 방법.
  88. 제 87항에 있어서, 재조합 면역글로불린 경쇄 핵산 서열은 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제 88항에 있어서, 2개의 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 절편은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 절편인 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제 87항에 있어서, 결합 단백질은 전체 인간 중쇄 및 전체 인간 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제 87항에 있어서, 면역글로불린 경쇄 뉴클레오티드 서열은 추가로 생식선 핵산 서열에 의해 코드화되지 않는 체세포성 돌연변이를 코드화하는 적어도 하나의 코돈을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제 91항에 있어서, 결합 단백질은 전체 인간 제 1 면역글로불린 중쇄 및 전체 인간 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제 87항의 방법에 따라 제조된, 관심의 항원에 대해 pH-의존성 결합을 나타내는 결합 단백질.
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