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JP2018508224A - 抗原を結合する軽鎖可変領域を選択する非ヒト動物 - Google Patents

抗原を結合する軽鎖可変領域を選択する非ヒト動物 Download PDF

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JP2018508224A
JP2018508224A JP2017549035A JP2017549035A JP2018508224A JP 2018508224 A JP2018508224 A JP 2018508224A JP 2017549035 A JP2017549035 A JP 2017549035A JP 2017549035 A JP2017549035 A JP 2017549035A JP 2018508224 A JP2018508224 A JP 2018508224A
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Abstract

再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、単一の再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを含む、非ヒト動物及び細胞が提供され、更に、それらを作るための方法及び組成物、それらを使うための方法及び組成物が提供される。再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメントは、重鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。また、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を得るための方法も提供され、そのドメインは、同種の可変ドメインの不在下で、抗原を結合することが可能であり、そのような核酸配列を、例えば宿主細胞内に発現し、多重特異性抗原結合タンパク質を生成することが可能である。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１５年３月１９日に出願された、米国仮特許出願第６２／１３５，４１９号の関連出願であり、米国特許法第１１９条（ｅ）の下でこの仮出願に基づく優先権を主張し、この出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
（配列表）
本明細書と同時に、配列表の公式な複製が、２０１６年３月１８日作成の、２０１６−０３−１８−１１５０ＷＯ０１−ＳＥＱ−ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔというファイル名、約８．６２キロバイトのサイズのＡＳＣＩＩ形式の配列表として、ＥＦＳウェブを介して電子的に提出される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、かつ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本明細書で提供されるのは、ユニバーサル軽鎖に属する免疫グロブリンハイブリッド鎖由来で、かつユニバーサル軽鎖の同種の可変ドメインとは独立に（例えば、それなしで）抗原を結合し得る、免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ）ドメインであり、また、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを発現する遺伝子改変非ヒト動物及び細胞であり、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする核酸であり、１つ以上のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む抗原結合タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合タンパク質）であり、更にはｉｎ ｖｉｔｒｏで、１つ以上のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む抗原結合タンパク質（例えば、多重特異性抗原結合タンパク質）を生成する方法である。
生物製剤は、一般に、従来型の抗体フォーマットに基づくいくつかの有望な新しい診断法及び治療法となっている。しかしながら従来の抗体ベースの設計には、抗原結合が典型的には、４つのポリペプチド（２つの同一な免疫グロブリン重鎖及び２つの同一な免疫グロブリン軽鎖）を含む抗体分子を要するがゆえの制約があり得る。本発明は、免疫グロブリンベースの治療デザインの改善及び多様化に対する必要性が未だ存在するという認識を含むものである。
本発明は、免疫グロブリンフォーマットに基づく抗原結合タンパク質の開発、製造、及び／又は使用のためのテクノロジーの改良を提供するものである。本発明は、そのようなテクノロジーに対して、従来の抗体ベースのフォーマットはある制約を課すという認識を含むものである。例えば本発明は、抗原結合部位が重鎖及び軽鎖可変ドメインからなるように要求することは、一部の抗原決定基に関して実現できる、利用可能な親和性及び／又は特異性を制約し得るということを認識するものである。
本発明は、これらの問題を解決するテクノロジーを提供するものである。とりわけ本発明は、「ユニバーサル」又は「コモン」免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現し、かつ、例えば、新たな抗原結合タンパク質フォーマットの開発及び／又は製造に有用な、遺伝子操作された非ヒト動物を提供する。しかも本発明は驚くべきことに、ユニバーサル免疫グロブリン軽鎖を発現している動物を用いることにより、パートナー（又は同種の）免疫グロブリン鎖の可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合にも、抗原結合部位内でその可変ドメイン結合特性が支配的となり得るパートナー免疫グロブリン鎖を選択するように向けることが可能であるということを示すものである。したがって、当該技術分野で予想されるのとは反対に、本発明は、例えば、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと関連付けられた場合、及び／又は同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインなしで、即ち、それとは独立に抗原を結合し、免疫グロブリン軽鎖可変領域が参加する抗原結合部位の、特異性及び／又は親和性を決定する又は制御する免疫グロブリン軽鎖可変領域を開発することが可能であるということを示すものである。
即ち、一部の実施形態では、本発明は、ユニバーサル軽鎖可変ドメインに関連付けられた場合に、かつ／又は、同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインとは独立に抗原を結合し、１つ以上の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む多重特異性抗原結合タンパク質を含む、抗原結合タンパク質を提供する。また、例えば、抗原特異性及び親和性が、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの多様性のみに又は主としてその多様性に由来し、かつ／又は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの多様性のみに又はその多様性に主として存在する、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列の、開発、製造、及び／又は使用のためのテクノロジー、例えばそのような非ヒト動物及びｉｎ ｖｉｔｒｏの組み換え方法も提供される。
本明細書に記載の様々な態様及び実施形態は、再配列された軽鎖可変遺伝子配列（例えば、再配列された軽鎖ＶＬＪＬ配列）によってコードされている重鎖定常領域及び免疫グロブリン軽鎖可変ドメインに、作動可能に連結された免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む結合タンパク質を発現する、遺伝子改変非ヒト動物が、本明細書において認識された様々な問題を解決し、かつ／又は驚くべき結果を提供し得る、という驚くべき発見に部分的に基づくものである。非ヒト動物のゲノムが、（ｉ）例えば、内因性の重鎖遺伝子座で重鎖定常領域配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメント（例えば、ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント）を含む、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖の遺伝子座と、（ｉｉ）軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結された、再配列された免疫グロブリン軽鎖可変配列（例えばユニバーサル軽鎖可変領域配列のような、単一の再配列された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列がその例である）を含む、免疫グロブリン軽鎖の遺伝子座と、を含む場合に、その非ヒト動物は、重鎖定常領域に作動可能に連結された、再配列されていない（即ち、多様化可能な）免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメント上での抗体の多様化のメカニズムに焦点を当てることが可能である。再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメントを再配列すると、そのセグメントは、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された軽鎖可変領域遺伝子配列を形成し、免疫グロブリンハイブリッド鎖をコードする、即ち、重鎖定常領域と融合する軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列を形成する。本明細書に記載のゲノムを有する非ヒト動物は、それぞれが、典型的な四量体型抗体フォーマットで同種のユニバーサル軽鎖に関連付けられる、二量体型免疫グロブリンハイブリッド鎖を含む抗原結合タンパク質を生成することが可能であり、その場合に、免疫グロブリンハイブリッド鎖は、ユニバーサル軽鎖の軽鎖可変ドメイン、例えば、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ可変ドメインと同種の軽鎖可変ドメインを含む。
本明細書において示されるように、免疫グロブリンハイブリッド鎖（例えば、免疫グロブリンハイブリッド鎖可変ドメインをコードするＶＬ／ＪＬ遺伝子配列によってコードされている）に由来する軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインであって、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種である軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインの存在下又は不在下で、目的の抗原を結合することができる。ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインが免疫グロブリンハイブリッド鎖に由来する場合、そのハイブリッド鎖は、好ましくは体細胞超変異されるが、単一ドメイン抗体ではなく、例えば、好ましくは、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＡからなる群から選択されるアイソタイプを有し、かつ機能的ＣＨ１ドメインを含む、重鎖定常領域を有する。また、このような可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインが、異なるエピトープに対して特異的な非同種の別の可変ドメインと関連付けられた場合、可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインが重鎖定常領域又は軽鎖定常領域に操作可能に融合されているかどうかに関わらず、その可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、抗原を結合することが可能である。
したがって、本明細書において提供されるのは、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、例えば軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む、少なくとも第１の結合成分を含む抗原結合タンパク質であって、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、（１）例えば、Ｉｇμ、Ｉｇδ、Ｉｇγ、Ｉｇα及び／又はＩｇεのような１つ以上の重鎖定常領域遺伝子で、それぞれが機能的ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された軽鎖配列によってコードされている、免疫グロブリンハイブリッド鎖に由来し、（２）軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された、再配列された軽鎖配列によってコードされているユニバーサル軽鎖に対して同種のものである。
一部の実施形態では、軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、ＶκＯＨｘＵＬＣドメインであり、例えば、κ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列に由来し、かつ／又はそれによりコードされており、そのヌクレオチド配列は、例えば、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であってよく、具体的には例えば、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、又はＶκ７−３遺伝子セグメント配列であってよく、これらは、（ヒト）Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、又はＪκ５遺伝子セグメント、又は、それらの体細胞超変異された変異体で再配列されていてもよい。一部の実施形態では、軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、ＶλＯＨｘＵＬＣドメインであり、例えば、λ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列に由来し、かつ／又はそれによってコードされ、そのヌクレオチド配列は、例えば、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であってよく、具体的には例えば、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１、Ｖλ５−５２、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１、又はＶλ４−６９遺伝子セグメント配列であってよく、これらは、（ヒト）Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、又はＪλ７遺伝子セグメント配列、又は、それらの体細胞超変異された変異体で再配列されていてもよい。
特に、再配列されていない免疫グロブリンＶＬとＪＬ遺伝子セグメントのとのハイブリッドの免疫グロブリンの遺伝子座における再配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれより多くのＮ領域の付加を含む遺伝子配列をコードする、再配列された免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを結果としてもたらし得る。１つの実施形態では、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする再配列された免疫グロブリン軽鎖遺伝子において観察される、Ｎ領域の付加及び／又は体細胞突然変異は、内因性の軽鎖遺伝子座で再配列されている、再配列された軽鎖可変配列（ただし、同じＶＬ遺伝子セグメントと同じＪＬ遺伝子セグメントとに由来するもの）において観察される、Ｎ領域の付加及び／又は体細胞突然変異の数よりも、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、又は少なくとも５倍多い。遺伝子配列をコードするＶＬ／ＣＨｘＵＬＣにおける、Ｎ領域の付加数が増加すると、内因性の軽鎖遺伝子座で組み替えられたＶＬ／ＪＬ遺伝子配列によってコードされている軽鎖可変ＶＬドメインと比較して、ＣＤＲ３により多くのアミノ酸を有する軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインがコード可能になる。したがって、一部の実施形態では、本明細書において提供される抗原結合タンパク質は、その可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインが、９、１０、１１、１２個、又はそれより多くのアミノ酸長を有するＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む。一部の実施形態では、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、９個のアミノ酸長であるＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、１０個のアミノ酸長であるＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、１１個のアミノ酸長であるＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、１２個のアミノ酸長であるＣＤＲ３を含む。
好ましい実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、単一ドメイン結合タンパク質ではなく、例えば、重鎖のみ結合タンパク質ではない。したがって、一部の実施形態では、説明される第１の結合成分は、例えば、少なくとも機能性ＣＨ１ドメイン又は軽鎖定常ドメインを含む重鎖定常領域のような定常領域に融合された軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含み、その可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインが、（１）機能性ＣＨ１ドメインを含み、かつ（２）ユニバーサル軽鎖と同種のものである免疫グロブリンハイブリッド鎖に由来するものであり、例えば、免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、少なくとも機能性ＣＨ１ドメインをコードする、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるか又はされていたものであり、かつそれゆえに、９、１０、１１、１２個、又はそれより多くのアミノ酸長であるＣＤＲ３を含み得る、ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣドメイン（それぞれ、再配列された（ヒト）Ｖκ／Ｊκ又はＶλ／Ｊλ配列によってコードされているものである）である。
したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、少なくとも機能性ＣＨ１ドメインを含み、かつ任意選択で、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、又はそれらの組合せを更に含む、重鎖定常領域に融合された免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む（例えば、免疫グロブリン軽鎖ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインが、軽鎖定常領域とジスルフィド結合を形成可能なＣＨ１ドメインに融合されている）少なくとも第１の結合成分を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、少なくとも機能性ＣＨ１ドメインを含む、非ヒト重鎖定常領域である。一部の実施形態では、非ヒト重鎖定常領域は、少なくとも機能性ＣＨ１ドメインを含む、齧歯類（例えば、ラット又はマウス）又はニワトリの重鎖定常領域である。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、少なくとも機能性ＣＨ１ドメインを含む、ヒト重鎖定常領域である。一部の実施形態では、重鎖定常領域（又はＣＨ１ドメイン）は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＡからなる群から選択されるアイソタイプを有する。一部の実施形態では、可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる群から選択される下位クラスを有するＩｇＧ重鎖定常領域（又はＣＨ１ドメイン）に融合される。一部の実施形態では、可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、ＣＨ３ドメインを含む、ヒトの、かつ突然変異したＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４重鎖定常領域（又はＣＨ１ドメイン）に融合され、その突然変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４重鎖定常領域のＣＨ３ドメインで起こり、かつＣＨ３ドメインのＡタンパク質との結合を減少又は消滅させるものであり、例えば、その突然変異は、ＩＭＧＴ番号付けシステムにおける、（ａ）９５Ｒ、並びに（ｂ）９５Ｒ及び９６Ｆ、又はＥＵ番号付けシステムにおける、（ａ’）４３５Ｒ、並びに（ｂ’）４３５Ｒ及び４３６Ｆからなる群から選択されるものである。一部の実施形態では、ヒトの、かつ突然変異した重鎖定常領域は、ヒトの、かつ突然変異したＩｇＧ１定常領域であり、かつ、（ａ）９５Ｒ又は（ｂ）９５Ｒ及び９６Ｆ（ＩＭＧＴ番号付けシステムで）の突然変異に加えて、ＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける、１６Ｅ、１８Ｍ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍ、及び８２Ｉ、又はＥＵ番号付けシステムにおける、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、及び４２２Ｉからなる群から選択される、１〜５つの一時変異を更に含む。一部の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ２定常領域であり、かつ（ａ）９５Ｒ又は（ｂ）９５Ｒ及び９６Ｆ（ＩＭＧＴ番号付けシステムで）の突然変異に加えて、ＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける、４４Ｓ、５２Ｎ、８２Ｉ、又は、ＥＵ番号付けシステムにおける、３４８Ｓ、３９２Ｎ、及び４２２Ｉからなる群から選択される、１〜２つの一時変異を更に含む。他の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４定常領域であり、かつ（ａ）９５Ｒ又は（ｂ）９５Ｒ及び９６Ｆ（ＩＭＧＴ番号付けシステムで）の突然変異に加えて、ＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける、１５Ｒ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍ、６９Ｋ、７９Ｑ、及び８２Ｉ、又はＥＵ番号付けシステムにおける、３５５Ｒ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４０９Ｋ、４１９Ｑ、及び４２２Ｉからなる群から選択される、１〜７つの一時変異、及び／又は、ＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける１０５Ｐ、又はＥＵ番号付けシステムにおける４４５Ｐの一時変異を更に含む。
加えて、一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、軽鎖定常ドメインに融合された免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む、少なくとも第１の結合成分を含む。一部の実施形態では、軽鎖定常ドメインは、非ヒト軽鎖定常ドメインである。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常ドメインは、齧歯類（例えば、ラット又はマウス）、又はニワトリの軽鎖定常ドメインである。一部の実施形態では、軽鎖定常ドメインは、ヒト軽鎖定常ドメインである。一部の実施形態では、軽鎖定常ドメインは、軽鎖κ定常ドメインである。一部の実施形態では、軽鎖定常ドメインは、軽鎖λ定常ドメインである。
一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ（例えば、ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣ）ドメインは、同種のユニバーサル軽鎖の不在下で、目的の抗原を結合する。したがって、本明細書に記載の第１の結合成分は、免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン、又は定常領域、例えば、少なくとも機能性ＣＨ１ドメインを含む重鎖定常領域、又は軽鎖定常領域に融合された免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインから本質的になるか、又は、それからなり、その可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、ユニバーサル軽鎖と同種の免疫グロブリンハイブリッド鎖に由来し、例えば、免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されているか又はされていたものであり、かつそれゆえに、９、１０、１１、１２個、又はそれより多くのアミノ酸長であるＣＤＲ３を含み得る、再配列された（ヒト）Ｖκ／Ｊκ又はＶλ／Ｊλ配列によってコードされている。
他の実施形態では、第１の結合成分は、免疫グロブリン軽鎖ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ可変ドメインに関連付けられた、同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインを更に含み、可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、免疫グロブリンハイブリッド鎖に由来し（例えば、免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されているか又はされていたものであり、かつそれゆえに、９、１０、１１、１２個、又はそれより多くのアミノ酸長であるＣＤＲ３を含み得る、再配列された（ヒト）Ｖκ／Ｊκ又はＶλ／Ｊλ配列によってコードされている）、かつ免疫グロブリンハイブリッド鎖は、再配列されたＶＬ／ＪＬ遺伝子配列によってコードされている、ユニバーサル軽鎖と同種のものであり、かつユニバーサル軽鎖可変ドメインは、再配列されたＶＬ／ＪＬ遺伝子配列、又はその体細胞超変異された変異体によってコードされている。
一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、κ配列、例えば、ヒトκ配列によってコードされているか、又はそれに由来し、例えば、その配列は具体的には、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、又はＶκ７−３遺伝子セグメント配列であってよく、これらは、（ヒト）Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、又はＪκ５遺伝子セグメント配列、又はそれらの体細胞超変異された変異体で再配列されていてよい。一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、ヒトＪκ５遺伝子セグメント配列によって再配列されたヒトＶκ１−３９遺伝子セグメント配列、又は、それらの体細胞超変異された変異体を含むヌクレオチド配列によってコードされているか、又はそれに由来する。一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、ヒトＪκ１遺伝子セグメント配列によって再配列されたヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント配列、又は、それらの体細胞超変異された変異体を含むヌクレオチド配列によってコードされているか、又はそれに由来する。一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、λ配列によってコードされるか、又はそれに由来し、その配列は、例えば、ヒトＶλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１、Ｖλ５−５２、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１、又はＶλ４−６９遺伝子セグメント配列であり、それらは、（ヒト）Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、若しくはＪλ７遺伝子セグメント配列、又はそれらの体細胞超変異された変異体で再配列されている。一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、Ｊλ３遺伝子セグメント配列、又はその体細胞超変異された変異体で再配列されたＶλ２〜１４の遺伝子セグメント配列を含む、ヌクレオチド配列によってコードされているか、又はそれに由来する。一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、Ｊλ７遺伝子セグメント配列、又はその体細胞超変異された変異体で再配列されたＶλ２〜１４の遺伝子セグメント配列を含む、ヌクレオチド配列によってコードされているか、又はそれに由来する。
本明細書に記載の第１の結合成分は、免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ（例えば、ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣ）ドメインと、ジスルフィド結合又はペプチドリンカーによって関連付け、例えばリンクされる、同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインとを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の第１の結合成分は、同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインに、例えば、ｓｃＦＶ型フォーマットで、ペプチドリンカーを介してリンクされる、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ可変ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の第１の結合成分は、（ｉ）少なくとも機能性ＣＨ１ドメイン、例えば、機能性ＣＨ１ドメインに融合された免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ（例えば、ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣ）ドメイン、を含む、重鎖定常領域に融合された免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ（例えば、ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣ）ドメインと、（ｉｉ）軽鎖定常ドメインに融合されたユニバーサル軽鎖可変ドメインとを含み、ＣＨ１ドメインが、ジスルフィド結合又はペプチドリンカーによって、軽鎖定常ドメインにリンクされる。１つの実施形態では、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ−可変ドメインは、少なくとも機能性ＣＨ１ドメインを含む（かつ任意選択で、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、又はそれらの組合せを更に含む）重鎖定常領域に融合され、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、軽鎖定常ドメインに融合され、機能性ＣＨ１ドメインは、ジスルフィド結合により、軽鎖定常ドメインにリンクされる。別の１つの実施形態では、第１の結合成分は、ｓｃＦａｂフォーマットであり、例えば、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ可変ドメインは、少なくとも機能性ＣＨ１ドメインを含む重鎖定常領域に融合され、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、軽鎖定常ドメインに融合され、かつ機能性ＣＨ１ドメインは、ペプチドリンカーによって、軽鎖定常ドメインにリンクされている。
一部の実施形態では、第１の結合成分は、任意選択でＣＨ１ドメインを含むヒト重鎖又はヒト軽鎖定常ドメインと融合されている、ヒトＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ（例えば、ヒトＶκＯＨｘＵＬＣ、又はヒトＶλＯＨｘＵＬＣ）ドメインを含む。１つの実施形態では、本明細書において提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の第１の結合成分のみから本質的になるか、又はそれからなっており、その第１の結合成分が目的の抗原と結合している。
また、本明細書に記載のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ（例えば、ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣ）可変ドメインを含む第１の結合成分を含むことに加えて、重鎖又はハイブリッド鎖に由来する第２の免疫グロブリン可変ドメインを含む第２の結合成分を更に含む抗原結合タンパク質も提供されるが、第１の成分のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ可変ドメインと第２の結合成分の第２の可変ドメインとの両方が、同一な再配列された軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する、例えば、それによってコードされている、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものであり得るが、好ましくは同種のものである。したがって、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ及び第２の可変ドメインがそれぞれ同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインにおけるいかなる差異も、体細胞超変異の結果であり、例えば、体細胞超変異又は親和性成熟のプロセスから生じたものと判定され得る。
本明細書において提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の第１及び第２の結合成分を含み得るが、第１及び第２の結合成分は、同一のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ可変ドメインを含み、かつ抗原結合タンパク質は単一特異性のものであり、例えば、目的の単一のエピトープに特異的に結合し得る。
一部の実施形態では、第１及び第２の結合成分は同一ではなく、例えば、同じ抗原に存在し得る、又は異なる抗原に存在し得る異なるエピトープを結合する。したがって、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、多重特異性抗原結合タンパク質であり得、かつ、（ｉ）第１のエピトープに対して特異的な第１の可変ドメイン、例えば、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン（例えば、ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣ）を含む第１の結合成分と、（ｉｉ）第２のエピトープに対して特異的な第２の可変ドメインを含む第２の結合成分とを含み得るが、その第２の可変ドメインは、第２のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン又はＶＨｘＵＬＣドメイン（重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されたＶＨＤＪＨ遺伝子配列によってコードされている重鎖に由来する重鎖可変ドメインで、その重鎖可変ドメインは、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものである）のいずれか一方であり、第１及び第２のエピトープは同一ではなく、かつ第１及び第２の可変ドメインはそれぞれ、同じ単一の、再配列された軽鎖可変領域遺伝子配列に由来し、それゆえに、同一であるか、又は体細胞超変異された変異体（例えば、体細胞超変異を通じてのみアミノ酸配列が異なる）である、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものである。一部の実施形態では、第１及び第２の可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、同じ単一の、再配列された軽鎖可変領域遺伝子配列に由来し、それゆえに、同一であるか、又は体細胞超変異された変異体である、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものであるが、第２の可変ドメインは、第１のエピトープとは異なる第２のエピトープを結合する第２のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ（例えば、ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣ）ドメインである。一部の実施形態では、第２の可変ドメインは、第１のエピトープとは異なる第２のエピトープを結合する、免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨｘＵＬＣ）ドメインであるが、第１の結合成分のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ可変ドメイン及び、第２の結合成分のＶＨｘＵＬＣ可変ドメインは、同じ単一の、再配列された軽鎖可変領域遺伝子配列に由来し、それゆえに、同一であるか、又は体細胞超変異された変異体である、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものである。本明細書において提供される、同一ではない第１及び第２の結合成分を含む多重特異性抗原結合タンパク質は、目的の２つ以上のエピトープと特異的に結合し得る。
第２の結合成分が、ＶＨｘＵＬＣドメインである第２の可変ドメインを含む一部の実施形態では、ＶＨドメインは、重鎖可変領域ヌクレオチド配列、例えば、ヒト重鎖可変領域ヌクレオチド配列、例えば、ヒトのレパートリー、例えば、ＩＭＧＴデータベース（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に記載の、任意のヒト重鎖可変遺伝子セグメント又はその体細胞超変異された変異体内に存在する、任意のヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメント配列によってコードされている。
加えて、第１の結合成分及び第２の結合成分は、１つ以上のペプチドリンカー、１つ以上のジスルフィド結合、及び／又は１つ以上のロイシンジッパーにより、本明細書において提供される多重特異性抗原結合タンパク質が、同種のユニバーサル軽鎖を含む典型的な抗体に類似の、Ｆａｂ様構造、ｓｃＦａｂ様構造、二重特異性抗体様構造、ｓｃＦｖ様構造、ｓｃＦｖ−Ｆｃ様構造、ｓｃＦｖ−ジッパー様構造、又は四量体型構造からなる群から選択される形態であるように関連付けられ得る。したがって、一部の実施形態では、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ（例えば、ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣ）及び第２の可変ドメインのいずれか一方又は両方が、定常領域（例えば、機能性ＣＨ１ドメインを含む重鎖定常領域、又は軽鎖定常ドメイン）に融合されていても、あるいはされていなくてもよく、かつ／又は同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインに関連付けられていても、あるいはされていなくてもよい。
一部の実施形態では、第１の成分の可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ（例えば、ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣ）ドメインが、第２の結合成分の第２の可変（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ又はＶＨｘＵＬＣ）ドメインに、抗原結合タンパク質が二重特異性抗体様構造、ｓｃＦｖ様構造、ｓｃＦｖ−Ｆｃ様構造、又はｓｃＦｖ−ジッパー様構造を有し得るように、ペプチドリンカーによりリンクされる。一部の実施形態では、（１）（ａ）第１の成分のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ可変ドメイン、又は（ｂ）第２の結合成分の第２の可変ドメインのうちの少なくとも一方が、少なくとも機能性ＣＨ１ドメインを含む（かつ任意選択で、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、又はそれらの組合せを更に含む）（非ヒト又はヒト）重鎖定常領域に融合され、かつ（２）（ａ）第１の成分のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ可変ドメイン、又は（ｂ）第２の結合成分の第２の可変ドメインのうちの他方が、（非ヒト又はヒト）軽鎖定常（ＣＬ）ドメインに融合され、ＣＨ１ドメインが、ＣＬドメインに、抗原結合タンパク質がＦａｂ様構造を有するように、ジスルフィド結合によってリンクされるか、又はＣＨ１ドメインが、ＣＬドメインに、抗原結合タンパク質がｓｃＦａｂ様構造を有し得るように、ペプチドリンカーによってリンクされる。
一部の実施形態では、第１のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ（ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣ）と第２の（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ又はＶＨｘＵＬＣ）可変ドメインとの両方が、それぞれ対応する第１及び第２の重鎖定常領域に融合し、第１及び第２の重鎖定常領域のそれぞれは、それぞれ対応する第１の機能性ＣＨ１ドメイン及び第２の機能性ＣＨ１ドメイン（各重鎖定常領域は、任意選択で、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、又はそれらの組合せを更に含む）を含み、かつ第１及び第２の重鎖定常領域は、例えば、ジスルフィド結合又はペプチドリンカーによりリンクされる。一部の実施形態では、重鎖定常領域のうちの少なくとも一方（又は両方）が、非ヒト重鎖定常領域、例えば、齧歯類（例えば、ラット又はマウス）、又はニワトリ重鎖定常領域である。一部の実施形態では、重鎖定常領域のうちの少なくとも一方（又は両方）が、ヒト重鎖定常領域である。一部の実施形態では、重鎖定常領域のうちの少なくとも一方（又は両方）が、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＡからなる群から選択されるアイソタイプを有する。一部の実施形態では、第１の可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ及び第２の可変ドメインのうちの少なくとも一方（又は両方）が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる群から選択される下位クラスを有するＩｇＧ重鎖定常領域に融合される。一部の実施形態では、第１の可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ及び第２の可変ドメインが、同一のアイソタイプ及び／又は下位クラスを有する重鎖定常領域に融合されるが、任意選択で、重鎖定常領域は、Ａタンパク質に対する親和性が異なっている。第１の可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣと第２の可変ドメインとの両方が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４重鎖定常領域に融合されている一部の実施形態では、第１の可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ及び第２の可変ドメインのうちの一方のみが、ＣＨ３ドメインのＡタンパク質への結合を減少又は消滅させる、ＣＨ３ドメインに突然変異、例えば、ＩＭＧＴ番号付けシステムにおける、（ａ）９５Ｒ、並びに（ｂ）９５Ｒ及び９６Ｆ、又はＥＵ番号付けシステムにおける、（ａ’）４３５Ｒ、並びに（ｂ’）４３５Ｒ及び４３６Ｆからなる群から選択される突然変異を含む、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４重鎖定常領域に融合される。一部の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、かつＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける、１６Ｅ、１８Ｍ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍ、及び８２Ｉ、又はＥＵ番号付けシステムにおける、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、及び４２２Ｉからなる群から選択される、１〜５つの一時変異を更に含む。一部の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ２定常領域であり、かつＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける、４４Ｓ、５２Ｎ、及び８２Ｉ、又はＥＵ番号付けシステムにおける、３４８Ｓ、３９２Ｎ、及び４２２Ｉからなる群から選択される、１つ又は２つの一時変異を更に含む。他の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４定常領域であり、かつ、ＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける、１５Ｒ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍ、６９Ｋ、７９Ｑ、及び８２Ｉ、又は、ＥＵ番号付けシステムにおける、３５５Ｒ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４０９Ｋ、４１９Ｑ、４２２Ｉからなる群から選択される１〜７つの一時変異、及び／又は、ＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける一時変異１０５Ｐ若しくはＥＵ番号付けシステムにおける４４５Ｐを更に含む。
一部の実施形態では、第１及び第２の結合成分は、それぞれに、それぞれ対応する第１及び第２の軽鎖定常（ＣＬ）ドメインに融合されている、それぞれ対応する第１及び第２のユニバーサル軽鎖可変ドメインを更に含み、第１及び第２のＣＬドメインは、例えばジスルフィド結合によって、それぞれ対応する第１及び第２の重鎖定常領域の第１及び第２のＣＨ１ドメインにリンクされ、第１及び第２のユニバーサル軽鎖可変ドメインは、同じ単一の再配列された軽鎖可変領域遺伝子配列に由来し、かつそれゆえに、同一のものであるか、又は体細胞超変異された変異体である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、任意選択で、少なくともＣＨ１ドメインを含むヒト重鎖又はヒト軽鎖定常ドメインに融合されている、ヒトＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ（ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣ）ドメインを含む第１の結合成分と、任意選択で、ＣＨ１ドメインを含むヒト重鎖又はヒト軽鎖定常ドメインに融合されている、第２のヒトＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ又はヒトＶＨｘＵＬＣドメインを含む、第２の結合成分と、任意選択で、ヒト軽鎖定常ドメインに融合されているヒトユニバーサル軽鎖可変ドメインを含むヒトユニバーサル軽鎖と、を含む。
非ヒト動物には、例えば、哺乳類が挙げられ、かつ特定の実施形態では、齧歯類（例えば、マウス、ラット、又はハムスター）が挙げられる。一部の実施形態では、非ヒト動物には、鳥類、例えば、ニワトリが挙げられる。本発明は、（例えば、それらの生殖系のゲノム及び／又はそれらのＢ細胞のゲノムに）本明細書に記載の核酸配列を含有し、かつ／又は本明細書に記載の抗原結合タンパク質（例えば、免疫グロブリン鎖及び／又は抗体）を発現するように遺伝子操作された非ヒト動物を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を遺伝子操作して、抗原特異性及び親和性が、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの多様性によって支配される（例えば、結果それのみから若しくはそれから主として生じる、及び／又は、それにのみ若しくはそれに主として存在する）、免疫グロブリン軽鎖ドメインの生成のための改善されたｉｎ ｖｉｖｏ系を提供することは望ましいという認識を、特に含むものである。一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を遺伝子操作して、免疫グロブリン重鎖可変ドメインから独立して抗原を結合する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインに対する、改善されたｉｎ ｖｉｖｏ親和性成熟及び／又は選択を可能にすることは望ましいという認識を含むものである。一部の実施形態では、本発明は、例えば、前述の特性の一部又は全部を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣ）の選択に用いるため、そのゲノムが、重鎖定常領域に作動可能に連結された再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントと、再配列されたヒト軽鎖可変領域核酸配列とを含む非ヒト動物は望ましいという認識を含むものである。
一部の実施形態では、本発明は、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ可変ドメインを生成可能な非ヒト動物を提供し、その非ヒト動物は、その生殖系のゲノムに、（ａ）例えば、内因性の非ヒト重鎖遺伝子座に、それぞれが機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つと、を含む１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列された（ヒト）ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を形成するように再配列することが可能な、再配列されていない（ヒト）免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ及びＪＬ）遺伝子セグメントを含む、第１のハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座であって、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列が、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖をコードする第１のハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座と、（ｂ）例えば、内因性の非ヒト軽鎖遺伝子座に、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む第２の軽鎖免疫グロブリン遺伝子座であって、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ユニバーサル軽鎖をコードし、かつ非ヒト動物は、免疫グロブリンハイブリッド鎖及びユニバーサル軽鎖を含む抗原結合タンパク質を発現する細胞、例えば、リンパ球、例えば、Ｂ細胞を生成可能であるか又は実際に生成し、かつ免疫グロブリンハイブリッド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインである第２の軽鎖免疫グロブリン遺伝子座と、を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列についてホモ接合型である。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列についてヘテロ接合型である。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、ハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座についてホモ接合型である。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、ハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座についてヘテロ接合型である。一部の実施形態では、再配列されていない（ヒト）免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントは、それぞれが、機能性ＣＨ１ドメイン、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つとをコードする配列を含む、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが、機能性ＣＨ１ドメイン、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つとをコードする配列を含む、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、マウス、ラット、又はニワトリの重鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントは、それぞれが、機能性ＣＨ１ドメイン、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つとをコードする配列を含む、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、かつ再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。
一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、κ配列である。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、λ配列である。
一部の実施形態では、第２の免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖κ遺伝子座である。一部の実施形態では、第２の免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖λ遺伝子座である。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ及びＪλ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、第１の遺伝子座は、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３からなる群から選択される、１つ以上の再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子座は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５を含む、再配列されていないヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３からなる群から選択される（ヒト生殖系）Ｖκ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｖκ遺伝子セグメントは、ヒト生殖系Ｖκ１−３９遺伝子セグメント及びヒト生殖系Ｖκ３−２０遺伝子セグメントからなる群から選択される。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５、例えば、ヒト生殖系Ｊκ１遺伝子セグメント、ヒト生殖系Ｊκ２遺伝子セグメント、ヒト生殖系Ｊκ３遺伝子セグメント、ヒト生殖系Ｊκ４遺伝子セグメント、及びヒト生殖系Ｊκ５遺伝子セグメントからなる群から選択される。
一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖκ１−３９及びＪκ５を含む。一部のある実施形態では、Ｖκ１−３９は、Ｊκ５によって再配列されている。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号１と記載される。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖκ３−２０及びＪκ１を含む。一部のある実施形態では、Ｖκ３−２０は、Ｊκ１によって再配列されている。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号２と記載される。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのＣκ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが、機能性ＣＨ１ドメインをコードする、Ｉｇμ、Ｉｇδ、Ｉｇγ、Ｉｇε、Ｉｇαからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、第１の遺伝子座は、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１、Ｖλ５−５２、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１、及びＶλ４−６９からなる群から選択される１つ以上の再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子座は、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７を含む、再配列されていないヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１、Ｖλ５−５２、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１、及びＶλ４−６９からなる群から選択される、（ヒト生殖系）Ｖλ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ２−１４、例えばヒト生殖系Ｖλ２−１４遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７からなる群から選択される。
一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖλ２−１４Ｊλ１を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖλ２−１４Ｊλ２である。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖλ２−１４Ｊλ３である。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖλ２−１４Ｊλ７である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのＣλ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが機能性ＣＨ１ドメインをコードする、Ｉｇμ、Ｉｇδ、Ｉｇγ、Ｉｇε、Ｉｇα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、実質的にすべての内因性の機能性可変重鎖ＶＨ、Ｄ、ＪＨ遺伝子セグメントは、非ヒト動物の内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失されるか、又は、非機能性にされる。一部の実施形態では、実質的にすべての内因性の機能性軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、非ヒト動物の内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から欠失されるか、又は、非機能性にされる。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、組み込まれたＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、又はその両方を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、機能的、異所性マウスＡｄａｍ６遺伝子を含む。
一部の実施形態では、第１の免疫グロブリン遺伝子座は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列の複数の複製を含む。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を作製する方法を提供し、その方法は、一般に、非ヒト動物の生殖系のゲノムを、（ｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を形成するように再配列することが可能な、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）と、を含むように改変することを含む。一部の実施形態では、その方法は、（ａ）非ヒト動物のゲノムを、すべて又は実質的にすべての（ｉ）内因性の機能性免疫グロブリン重鎖ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメント、並びに（ｉｉ）内因性の機能性軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを、欠失するか又は非機能性にするように改変することと、（ｂ）再配列されていない軽鎖可変遺伝子セグメントが、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを、ゲノム中に配置することと、（ｃ）再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列が、軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を、ゲノム中に配置することと、を含む。一部の実施形態では、その方法は、（ａ）再配列されていない軽鎖可変遺伝子セグメントが、内因性の重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、内因性の重鎖遺伝子座にあるすべての内因性の機能性免疫グロブリン重鎖ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントで置き換えること、及び（ｂ）再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列が、内因性の軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、内因性の軽鎖遺伝子座にあるすべての内因性の機能性軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列で置き換えることを含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、かつ再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、κ配列である。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、λ配列である。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖遺伝子座に配置されている。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖遺伝子座に配置されている。
一部のある実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ及びＪλ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５を含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域中のＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３からなる群から選択される、（ヒト生殖系）Ｖκ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｖκ遺伝子セグメントは、ヒト生殖系Ｖκ遺伝子セグメント、例えばヒト生殖系Ｖκ１−３９遺伝子セグメント又はヒト生殖系Ｖκ３−２０遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、ＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５からなる群、例えば、ヒト生殖系Ｊκ１遺伝子セグメント、ヒト生殖系Ｊκ２遺伝子セグメント、ヒト生殖系Ｊκ３遺伝子セグメント、ヒト生殖系Ｊκ４遺伝子セグメント、及びヒト生殖系Ｊκ５遺伝子セグメントからなる群から選択される。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列は、Ｖκ１−３９及びＪκ５を含む（例えば、Ｖκ１−３９は、Ｊκ５によって再配列される）。一部の実施形態では、再配列された免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号１と記載される配列を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列は、Ｖκ３−２０及びＪκ１を含む（例えば、Ｖκ３−２０は、Ｊκ１によって再配列される）。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号２と記載される配列を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのＣκ定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが機能性ＣＨ１ドメインをコードする、Ｉｇμ、Ｉｇδ、Ｉｇγ、Ｉｇε、Ｉｇα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１、Ｖλ５−５２、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１、及びＶλ４−６９からなる群から選択される、１つ以上の再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７を含む、再配列されていないヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１、Ｖλ５−５２、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１、及びＶλ４−６９からなる群から選択される、（ヒト生殖系）Ｖλ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ２−１４、例えば、ヒト生殖系Ｖλ２−１４遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７からなる群から選択される。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖλ２−１４Ｊλ１である。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖλ２−１４Ｊλ２を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖλ２−１４Ｊλ３を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖλ２−１４Ｊλ７を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのＣλ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが機能性ＣＨ１ドメインをコードする、Ｉｇμ、Ｉｇδ、Ｉｇγ、Ｉｇε、Ｉｇα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に配置されている。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト動物の生殖系のゲノムに存在している。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の異所性遺伝子座に配置されている。一部の実施形態では、非ヒト動物は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数の複製を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、又はその両方を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、機能的、異所性マウスＡｄａｍ６遺伝子を含む。
一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖をコードする核酸配列は、対応するヒト生殖系軽鎖可変遺伝子セグメントによってコードされていない、１つ以上のヒスチジンコドンを含む。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書において提供されるか又は本明細書において開示される方法によって作製される、遺伝子改変非ヒト動物を用いるための方法を提供し、その方法は一般に、非ヒト動物から、重鎖定常領域に融合されるＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖（ユニバーサル軽鎖と同種のもの）を発現する細胞、例えばリンパ球、例えばＢ細胞を単離することと、かつ／又は、細胞から、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする核酸を得ることを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする核酸配列を得るための方法は、（ａ）任意選択で、そのゲノムに、（ｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）非ヒト動物が免疫反応を起こすように、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）とを含む非ヒト動物に、エピトープ又はその免疫原性部分を含む抗原で免疫を与えること；及び、免疫を与えられた非ヒト動物から、抗原を結合することができる軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする核酸配列を発現する細胞、及び／又は抗原を結合することができる軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする核酸配列を単離することを含む。
一部の実施形態では、抗原を結合することができる軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする核酸配列は、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）に由来する。
一部の実施形態では、単離するステップは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又はフローサイトメトリーを介して実行される。一部の実施形態では、単離するステップは、免疫を与えられた非ヒト動物から、細胞を得ることと、その細胞から、抗原を結合することができる軽鎖ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする核酸配列を得ることとを含み、その細胞はリンパ球である。一部のある実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞を含む。
一部の実施形態では、その方法は、リンパ球を、癌細胞と融合させて、ハイブリドーマを形成することを更に含む。一部のある実施形態では、癌細胞は骨髄腫細胞である。
一部の実施形態では、単離された核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、例えば、それぞれが機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む１つ以上の重鎖定常領域遺伝子、例えば、少なくともインタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つとを含む、マウス又はラットの免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、例えば、それぞれが機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む１つ以上の重鎖定常領域遺伝子、例えば、少なくともインタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つとを含む、ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、かつ再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、κ配列である。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、λ配列である。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５のうちの１つ以上を含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域中のＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３からなる群から選択される、（ヒト生殖系）Ｖκ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−３９（例えば、ヒト生殖系Ｖκ１−３９遺伝子セグメント）及びＶκ３−２０（例えば、ヒト生殖系Ｖκ３−２０遺伝子セグメント）からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１（例えば、ヒト生殖系Ｊκ１遺伝子セグメント）、Ｊκ２（例えば、ヒト生殖系Ｊκ２遺伝子セグメント）、Ｊκ３（例えば、ヒト生殖系Ｊκ３遺伝子セグメント）、Ｊκ４（例えば、ヒト生殖系Ｊκ４遺伝子セグメント）、及びＪκ５（例えば、ヒト生殖系Ｊκ５遺伝子セグメント）からなる群から選択される。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列は、Ｖκ１−３９及びＪκ５を含む（例えば、Ｖκ１−３９は、Ｊκ５によって再配列され、例えば、ヒト生殖系Ｖκ１−３８遺伝子セグメントは、ヒト生殖系Ｊκ５遺伝子セグメントによって再配列されている）。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号１と記載される配列を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列は、Ｖκ３−２０及びＪκ１を含む（例えば、Ｖκ３−２０は、Ｊκ１によって再配列され、例えば、ヒト生殖系Ｖκ３−２０遺伝子セグメントは、ヒト生殖系Ｊκ１遺伝子セグメントによって再配列されている）。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号２と記載される配列を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのＣκ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが機能性ＣＨ１ドメインをコードする、Ｉｇμ、Ｉｇδ、Ｉｇγ、Ｉｇε、Ｉｇα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１、Ｖλ５−５２、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１、及びＶλ４−６９のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７を含む、再配列されていないヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１、Ｖλ５−５２、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１、及びＶλ４−６９からなる群から選択される、（ヒト生殖系）Ｖλ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ２−１４、例えば、ヒト生殖系Ｖλ２−１４遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７からなる群から選択される。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖλ２−１４Ｊλ１を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖλ２−１４Ｊλ２を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖλ２−１４Ｊλ３を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Ｖλ２−１４Ｊλ７を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのＣλ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが機能性ＣＨ１ドメインをコードする、Ｉｇμ、Ｉｇδ、Ｉｇγ、Ｉｇε、Ｉｇα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト動物の生殖系のゲノムに存在している。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の、転写的に活性な遺伝子座に組み込まれている。一部の実施形態では、非ヒト動物は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数の複製を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、組み込まれたＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、又はその両方を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、機能的、異所性マウスＡｄａｍ６遺伝子を含む。
一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖をコードする核酸配列は、対応するヒト生殖系軽鎖可変遺伝子セグメントによってコードされていない、１つ以上のヒスチジンコドンを含む。
一部の実施形態では、本発明は、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ（ＶκＯＨｘＵＬＣ又はＶλＯＨｘＵＬＣ）ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法を提供し、その方法は一般に、宿主細胞内で、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする核酸配列を含み、任意選択で、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む重鎖定常領域遺伝子、又は軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された第１の核酸を発現させることを含み、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものであり、かつ、抗原結合タンパク質は、単一のドメイン抗原結合タンパク質ではない。一部の実施形態では、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする核酸配列が、そのゲノムに、（ｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）と、を含む非ヒト動物から単離され、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする核酸配列は、例えば、それぞれが、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子、例えば、少なくともインタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つとを含む、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）に由来する。一部の実施形態では、その方法は、（ａ）そのゲノムに、（ｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を形成するように再配列可能な、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）と、を含む非ヒト動物が、エピトープ又はその免疫原性部分に対して免疫反応を起こすように、任意選択で、その非ヒト動物に、エピトープ又はその免疫原性部分を含む抗原で免疫を与えることと、その後で、（ｂ）非ヒト動物から、エピトープ又はその免疫原性部分を特異的に結合する軽鎖可変ドメインであって、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸に作動可能に連結された、再配列されたＶＬ／ＪＬ遺伝子配列に由来する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を単離することと、を更に含む。追加的な実施形態は、（ｃ）単離された核酸配列を、任意選択で、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に作動可能に連結された発現構築物に採用することと、その後で、（ｄ）核酸配列、又はそれを含む発現構築物を生成細胞系、例えば宿主細胞に発現させて、抗原結合タンパク質を得ることと、を含む方法を含む。
一部の実施形態では、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む抗原結合タンパク質を作製する方法は、宿主細胞に、（ｉ）任意選択で、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む第１の重鎖定常領域遺伝子又は第１の軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された第１のエピトープに対して特異的な、第１の可変ドメイン、例えば、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む第１の結合成分をコードする核酸配列を含む第１の核酸と、（ｉｉ）第２のエピトープに対して特異的な第２の可変ドメインを含む、第２の成分をコードする第２の核酸と、を同時発現させることを含み、第２の可変ドメインは、第２のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン又はＶＨｘＵＬＣドメインのいずれか一方であり、第１及び第２のエピトープは同一ではなく、しかも、第１及び第２の可変ドメインはそれぞれ、同じ単一の、再配列された軽鎖可変領域遺伝子配列に由来するユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものであり、かつそれゆえに、同一であるか、又は体細胞超変異された変異体である、例えば、体細胞超変異を介してのみ、アミノ酸配列が異なる。
そのため、一部の実施形態では、その方法は（ａ）そのゲノムに、（ｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）再配列して、（第２の結合成分の第２のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする）再配列されたＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を形成可能な、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）、又は再配列して、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、（第２の結合成分のＶＨｘＵＬＣドメインをコードする）再配列されたＶＨ／Ｄ／ＪＨ遺伝子配列を形成可能な、再配列されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ）のいずれか一方を含む第２の非ヒト動物が、エピトープ又はその免疫原性部分に対して免疫反応を起こすように、その第２の非ヒト動物に、エピトープ又はその免疫原性部分を含む抗原によって免疫を与えることと、その後で、（ｂ）その非ヒト動物から、第２のエピトープ又はその免疫原性部分を特異的に結合する第２のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ又はＶＨｘＵＬＣドメインをコードする、第２の核酸配列を単離することと、を含む。追加的な実施形態は、（ｃ）単離された第２の核酸配列を、任意選択で、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に作動可能に連結された発現構築物に採用することと、その後に、（ｄ）第１及び第２の核酸配列、又はそれらを含む発現構築物を、生成細胞系、例えば宿主細胞に発現させて、単一ドメイン抗原結合タンパク質ではない抗原結合タンパク質を得ることと、を含む方法を含む。
追加的な実施形態では、その方法は、生成宿主細胞に、第１のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン（又はそれを含む発現構築物）をコードする第１の核酸と、任意選択で、第２のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン又はＶＨｘＵＬＣドメイン（又はそれを含む発現構築物）をコードする第２の核酸と、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインと、任意選択の、第２のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン又はＶＨｘＵＬＣドメインと同種の、ヒトユニバーサル軽鎖可変ドメイン、又はその体細胞超変異された変異体をコードする、再配列されたＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含むヌクレオチド配列と、を同時発現することを更に含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ヒト軽鎖定常ドメインに融合された、ユニバーサル軽鎖可変ドメインをコードする。
第１の核酸配列及び、第２の核酸配列と、ヒトユニバーサル軽鎖可変ドメインをコードする、再配列されたＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含む、ヌクレオチド配列とのうちの一方又は両方が、同じ又は異なる発現構築物に用いられ得るが、１つ以上の発現構築物は、抗原結合タンパク質、例えば、第１の結合成分、及び第２の結合成分と、Ｆａｂ様構造、ｓｃＦａｂ様構造、二重特異性抗体様構造、ｓｃＦｖ様構造、ｓｃＦｖ−Ｆｃ様構造、ｓｃＦｖ−ジッパー様構造、及び典型的な抗体と同様で、かつ同種のユニバーサル軽鎖を含む四量体型構造、からなる群から選択されるフォーマットの、ユニバーサル軽鎖とのいずれか一方又は両方とを発現する。したがって、一部の実施形態では、第１及び第２の核酸配列のいずれか一方又は両方が、定常領域、例えば、機能性ＣＨ１ドメイン又は（ヒト）軽鎖定常ドメインを含む（ヒト）重鎖定常領域に融合されていても、されていなくてもよい、第１の可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ及び第２の可変（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ又はＶＨｘＵＬＣ）ドメインをそれぞれコードし得る。
一部の実施形態では、第１及び第２の核酸配列のいずれか一方又は両方が、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＡからなる群から選択されるアイソタイプを有するヒト重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる群から選択される下位クラスを有する、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする重鎖定常領域核酸を含む。一部の実施形態では、第１及び第２の核酸配列は、同一のアイソタイプ及び／又は下位クラスを有する重鎖定常領域に融合されている第１の可変ドメインＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ及び第２の可変ドメイン（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ又はＶＨｘＵＬＣ）をコードするが、任意選択で、重鎖定常領域は、そのＡタンパク質に対する親和性が異なっている。第１の可変ドメインＶＬ／ＣＨｘＵＬＣと、第２の可変ドメイン（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ又はＶＨｘＵＬＣ）ドメインとの両方が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４重鎖定常領域に融合されている一部の実施形態では、第１の可変ドメインＶＬ／ＣＨｘＵＬＣと第２の可変ドメイン（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ又はＶＨｘＵＬＣ）とのうちの一方のみが、ＣＨ３ドメインのＡタンパク質に対する結合を減少させるか、又は消滅させる突然変異、例えば、ＩＭＧＴ番号付けシステムにおける（ａ）９５Ｒ、並びに（ｂ）９５Ｒ及び９６Ｆ、又はＥＵ番号付けシステムにおける、（ａ’）４３５Ｒ、並びに（ｂ’）４３５Ｒ及び４３６Ｆからなる群から選択される突然変異を、ＣＨ３ドメインに含む、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４重鎖定常領域に融合される。一部の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であり、かつＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける、１６Ｅ、１８Ｍ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍ、及び８２Ｉ、又はＥＵ番号付けシステムにおける、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、及び４２２Ｉからなる群から選択される、１〜５つの一時変異を更に含む。一部の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ２定常領域であり、かつＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける、４４Ｓ、５２Ｎ、及び８２Ｉ、又はＥＵ番号付けシステムにおける、３４８Ｓ、３９２Ｎ、及び４２２Ｉからなる群から選択される、１つ又は２つの一時変異を更に含む。他の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４定常領域であり、かつ、ＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける、１５Ｒ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍ、６９Ｋ、７９Ｑ、及び８２Ｉ、又は、ＥＵ番号付けシステムにおける、３５５Ｒ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４０９Ｋ、４１９Ｑ、４２２Ｉからなる群から選択される１〜７つの一時変異、及び／又は、ＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける１０５Ｐ若しくはＥＵ番号付けシステムにおける４４５Ｐを更に含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ又はＪＬ遺伝子セグメントの少なくとも一方が、対応するヒト生殖系軽鎖可変遺伝子セグメントによってコードされていない１つ以上のヒスチジン残基をコードする。
一部の実施形態では、第１及び第２の核酸配列がそれに由来する第１及び／又は第２の非ヒト動物は、哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、それぞれが、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む、例えば、少なくともインタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つとをコードする配列を含む、例えば１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、例えば、それぞれが機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む１つ以上の重鎖定常領域遺伝子、例えば、少なくともインタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つとを含む、マウス又はラットの免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、例えば、それぞれが機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む１つ以上の重鎖定常領域遺伝子、例えば、少なくともインタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つとを含む、ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、かつ再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、κ配列である。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、λ配列である。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ及びＪλ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５を含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域中のＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３からなる群から選択される、（ヒト生殖系）Ｖκ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−３９（例えば、ヒト生殖系Ｖκ１−３９遺伝子セグメント）及びＶκ３−２０（例えば、ヒト生殖系Ｖκ３−２０遺伝子セグメント）からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５からなる群から選択される。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列は、Ｖκ１−３９及びＪκ５を含む（例えば、Ｖκ１−３９は、Ｊκ５によって再配列され、例えば、ヒト生殖系Ｖκ１−３９遺伝子セグメントは、ヒト生殖系Ｊκ５遺伝子セグメントによって再配列されている）。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は、配列番号１と記載される配列を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列は、Ｖκ３−２０及びＪκ１を含む（例えば、Ｖκ３−２０は、Ｊκ１によって再配列され、例えば、ヒト生殖系Ｖκ３−２０遺伝子セグメントは、ヒト生殖系Ｊκ１遺伝子セグメントによって再配列されている）。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号２と記載される配列を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのＣκ定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが少なくとも機能性ＣＨ１ドメインをコードする、Ｉｇμ、Ｉｇδ、Ｉｇγ、Ｉｇε、Ｉｇα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト動物の生殖系のゲノムに存在している。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の、転写的に活性な遺伝子座にある。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数の複製を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、又はその両方を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、機能的、異所性マウスＡｄａｍ６遺伝子を含む。
一部の実施形態では、本発明は、そのゲノムが、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む第１の免疫グロブリン遺伝子座と、（ｂ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列された非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、第２の免疫グロブリン遺伝子座とを含む、非ヒト動物を提供する。
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、再配列された非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、齧歯類免疫グロブリンＶκ及びＪκ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態では、齧歯類免疫グロブリンＶκ及びＪκ遺伝子セグメントは、マウス遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、齧歯類免疫グロブリンＶκ及びＪκ遺伝子セグメントは、ラット遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を作製する方法を提供するが、その方法は、（ａ）非ヒト動物のゲノムを、すべて又は実質的にすべての（ｉ）内因性の機能性免疫グロブリン重鎖ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメント、並びに（ｉｉ）内因性の機能性軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを、欠失するか又は非機能性にするように改変することと、（ｂ）再配列されていない軽鎖可変遺伝子セグメントが、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを、ゲノム中に配置することと、（ｃ）再配列された非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列が、軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を、ゲノム中に配置することと、を含む。
一部の実施形態では、本発明は、重鎖可変ドメインとは独立に抗原を結合可能である免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸配列を得るための方法を提供し、その方法は、（ａ）そのゲノムに（ｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列された非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）とを含む非ヒト動物に、エピトープ又はその免疫原性部分を含む抗原によって免疫を与えることと、（ｂ）その非ヒト動物が免疫反応を起こすのを可能にすることと、（ｃ）免疫を与えられた非ヒト動物から、抗原を結合することが可能な軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を得ることと、を含む。
一部の実施形態では、本発明は、重鎖可変ドメインとは独立に抗原を結合可能である免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法を提供し、その方法は、（ａ）そのゲノムに（ｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列された非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）とを含む非ヒト動物に、エピトープ又はその免疫原性部分を含む抗原によって免疫を与えることと、（ｂ）その非ヒト動物が、第１のエピトープ又はその免疫原性部分に対して、免疫反応を起こすのを可能にすることと、（ｃ）その非ヒト動物から、エピトープ又はその免疫原性部分を特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を得ることと、（ｄ）（ｃ）の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合されている発現構築物に用いることと、（ｅ）（ｃ）の核酸配列を、生成細胞系において発現させて、その軽鎖が（ｃ）の核酸によってコードされ、かつ重鎖とは独立にエピトープ又はその免疫原性部分を結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を提供する。その生殖系のゲノムに、（ａ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座と、（ｂ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントについて、ホモ接合型である。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントは、非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態では、非ヒト重鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの重鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、かつ２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、κ配列である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、λ配列である。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、κ遺伝子座である。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、λ遺伝子座である。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３からなる群から選択される。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５からなる群から選択される。
一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、２つ以上の可変領域遺伝子セグメントのＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３からなる群から選択される。一部のある実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−３９、Ｖκ３−２０、及びそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒトＶＬ遺伝子セグメントと、１つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントを含み、かつＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、又はそれらの組合せのうちの１つ以上のものを含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのＣκ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが機能性ＣＨ１ドメインをコードする、Ｉｇμ、Ｉｇδ、Ｉｇγ、Ｉｇε、Ｉｇα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、実質的にすべての内因性の可変重鎖ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントが、非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失されるか、又は非機能性にされる。
一部の実施形態では、実質的にすべての内因性の軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントが、非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から欠失されるか、又は非機能性にされる。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、又はその両方を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、機能的、異所性マウスＡｄａｍ６遺伝子を含む。
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）の複数の複製を含む。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を作製する方法を提供するが、その方法は、（ａ）非ヒト動物のゲノムを、すべて又は実質的にすべての（ｉ）内因性の免疫グロブリン重鎖ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメント、並びに（ｉｉ）内因性の軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを、欠失するか又は非機能性にするように改変することと、（ｂ）再配列されていない軽鎖可変遺伝子セグメントが、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを、ゲノム中に配置することと、（ｃ）ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを、ゲノム中に配置することと、を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、かつ２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、κ配列である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、λ配列である。
一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、κ軽鎖遺伝子座に配置されている。一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、λ軽鎖遺伝子座に配置されている。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３からなる群から選択される。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５からなる群から選択される。
一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、２つ以上のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントのＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３からなる群から選択される。一部のある実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−３９、Ｖκ３−２０、及びそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒトＶＬ遺伝子セグメントと、１つ以上のＪＬ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒトＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−２９及びＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのＣκ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが、機能性ＣＨ１ドメインをコードする、Ｉｇμ、Ｉｇδ、Ｉｇγ、Ｉｇε、Ｉｇαからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ゲノム中の内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に配置されている。一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、非ヒト動物の生殖系のゲノムに存在している。一部の実施形態では、２つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ゲノム中の異所性遺伝子座に存在している。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、又はその両方を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、機能的、異所性マウスＡｄａｍ６遺伝子を含む。
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、下記の詳細な説明において明らかである。しかしながら、この詳細な説明は、本発明の実施形態を示すものの、限定ではなく、説明のみを目的とすることを理解するべきである。本発明の範囲内での様々な変更及び改変は、詳細な説明から当業者に明らかとなるであろう。
下記の図面からなる本明細書に含まれる図面は、限定ではなく、説明のみを目的とする。
マウス重鎖遺伝子座の（実寸ではない）模式図（上）と、ヒトκ軽鎖遺伝子座の（実寸ではない）模式図（下）とを示す。マウス重鎖遺伝子座は、その長さが約３Ｍｂであり、約２００個の重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメントと、１３個の重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメントと、４個の重鎖接合（ＪＨ）遺伝子セグメントと、エンハンサー（Ｅｎｈ）、及び重鎖定常（ＣＨ）領域とを含む。ヒトκ軽鎖遺伝子座は、それぞれ約４４０ｋｂ及び６００ｋｂに及ぶ反対極性の遠位側及び近位側コンティグに複製されている。その２つのコンティグ間は、Ｖκ遺伝子セグメントを有しないと考えられる、約８００ｋｂのＤＮＡがある。ヒトκ軽鎖遺伝子座は、約７６個のＶκ遺伝子セグメントと、５つのＪκ遺伝子セグメントと、イントロンエンハンサー（Ｅｎｈ）と、単一の定常領域（Ｃκ）とを含む。
４０個のヒトＶκ遺伝子セグメントと、５個のヒトＪκ遺伝子セグメントとを、マウス重鎖遺伝子座の中にプログレッシブに挿入するための、標的化戦略を示す。ヒグロマイシン（ｈｙｇ）及びネオマイシン（ｎｅｏ）の選択カセットが、リコンビナーゼ認識部位（Ｒ１、Ｒ２、等）により図示されている。改変されたマウス重鎖遺伝子座、例えば、マウスＣＨ領域に作動可能に連結された、ヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメントを含むハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座が、一番下に示されている。
ヒトＶλ及びヒトＪλ遺伝子セグメント（４つのヒトＪλ遺伝子セグメント）を、マウス重鎖遺伝子座に、プログレッシブに挿入するための例示的標的化戦略を示す。ヒグロマイシン（ｈｙｇ）及びネオマイシン（ｎｅｏ）の選択カセットが、リコンビナーゼ認識部位（Ｒ１、Ｒ２等）とともに示されている。改変されたマウス重鎖遺伝子座、例えば、マウスＣＨ領域に作動可能に連結された、（１つ又は４つの）ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントを含むハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座が、一番下に示されている。
内因性のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変領域遺伝子セグメントを、再配列されたヒトＶＬ／ＪＬ配列で交換するための例示的標的化戦略を図示している。
内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントを、再配列されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列（ＭＡＩＤ １６３３；配列番号１）又は再配列されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列（ＭＡＩＤ １６３５；配列番号２）で交換するための、２つの例示的標的ベクターを図示している。
改変されたマウス重鎖遺伝子座、例えば、マウスＣＨ領域に作動可能に連結されたヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメントを含む、ハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座と、再配列されたヒトＶκＪκ配列を含む、改変されたマウスκ軽鎖遺伝子座とを示す。１つの特定の実施形態では、（ＫＯＨ×ＵＬＣ）として示されている、改変された重鎖遺伝子座と改変されたκ軽鎖遺伝子座とを有するマウスは、「ＫＯＨ」マウスと「ＵＬＣ」マウスとを掛け合わせて創り出される。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（ＶＩ３）と、重鎖遺伝子座で、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントについてホモ接合型で、かつκ軽鎖遺伝子座で、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶκ及びＪκ遺伝子セグメントと組み込まれたＡｄａｍ６遺伝子についてホモ接合型のマウス（「ＫＯＨ」マウス；１９９４ＨＯ １２４２ＨＯ）と、及びκ軽鎖遺伝子座（ＶＫ３−２０ＪＫ１又はＶＫ１−３９ＪＫ５のいずれか一方）で、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列についてホモ接合型で、かつ重鎖遺伝子座で、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶκ及びＪκ遺伝子セグメントと、組み込まれたＡｄａｍ６遺伝子についてホモ接合型のマウス、（ＶＫ３−２０ＪＫ１の場合１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ；ＶＫ１−３９ＪＫ５の場合１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ；「ＫＯＨ×ＵＬＣ」マウス）とから得られる、代表的なＢ細胞及びＴ細胞用に染色された骨髄のコンタープロット（上段；それぞれ、ＣＤ１９＋及びＣＤ３＋）ＣＤ１９＋にゲート設定され、かつｃ−ｋｉｔ＋及びＣＤ４３＋用に染色された骨髄のコンタープロット（下段）を示す。プロＢ細胞及びプレＢ細胞が、コンタープロットに注記されている。各ゲートされた領域内にある細胞のパーセンテージが示されている。
ＫＯＨ×ＵＬＣマウス（１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ：Ｖκ１−３９Ｊκ５；１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ：Ｖκ３−２０Ｊκ１）、ＫＯＨマウス（１９９４ＨＯ １２４２ＨＯ）及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）の大腿骨から単離された骨髄中の、細胞の総数（上段左）と、Ｂ（ＣＤ１９＋）細胞の総数（上段右）と、プロＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃ−ｋｉｔ＋）の数と、プレＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４３−ｃ−ｋｉｔ−）の数と、を示す。
ＫＯＨ×ＵＬＣマウス（１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ、１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ）、ＫＯＨマウス（１９９４ＨＯ １２４２ＨＯ）、及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）からの、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）及びＢ２２０用に染色された骨髄の、シングレットにゲート設定された、代表的なコンタープロット（上段）を示す。未成熟、成熟、及びプロ／プレＢ細胞が、各コンタープロット上に注記されている。各ゲート設定された領域内にある細胞のパーセンテージが示されており、下段は、ＫＯＨ×ＵＬＣマウス（１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ：Ｖκ１−３９Ｊκ５；１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ：Ｖκ３−２０Ｊκ１）、ＫＯＨマウス（１９９４ＨＯ １２４２ＨＯ）、及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）の大腿骨から単離した骨髄内の、細胞総数、未成熟Ｂ（左、ＩｇＭ＋Ｂ２２０ｉｎｔ）細胞、成熟Ｂ（ＩｇＭ＋Ｂ２２０ｈｉ）細胞の数を示す。
ＫＯＨ×ＵＬＣマウス（１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ、１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ）、ＫＯＨマウス（１９９４ＨＯ １２４２ＨＯ）、及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）からの、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）及びＢ２２０用に染色された骨髄の、シングレットにゲート設定された、代表的なコンタープロット（左列）を示す。未成熟、成熟、及びプロ／プレＢ細胞が、各コンタープロット上に注記されているが、右の２列には、ＫＯＨ×ＵＬＣマウス（１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ：Ｖκ１−３９Ｊκ５；１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ：Ｖκ３−２０Ｊκ１）、ＫＯＨマウス（１９９４ＨＯ １２４２ＨＯ）、及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）の大腿骨から単離された、ＩｇκとＩｇλ発現用に染色された骨髄の、未成熟Ｂ細胞（左、ＩｇＭ＋Ｂ２２０ｉｎｔ）及び成熟Ｂ細胞（右、ＩｇＭ＋Ｂ２２０ｈｉ）にゲート設定された、代表的なコンタープロットを示す。各ゲートされた領域内にある細胞のパーセンテージが示されている。
ＫＯＨ×ＵＬＣマウス（１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ：Ｖκ１−３９Ｊκ５；１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ：Ｖκ３−２０Ｊκ１）、ＫＯＨマウス（１９９４ＨＯ １２４２ＨＯ）、及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）からの、Ｂ細胞及びＴ細胞（上段；それぞれＣＤ１９＋及びＣＤ３＋）用に染色された脾臓細胞、及びＣＤ１９＋にゲート設定され、Ｉｇκ＋及びＩｇλ＋発現用に染色された脾臓細胞の、代表的なコンタープロットを示す。各ゲートされた領域内にある細胞のパーセンテージが示されている。
ＫＯＨ×ＵＬＣマウス（１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ：Ｖκ１−３９Ｊκ５；１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ：Ｖκ３−２０Ｊκ１）、ＫＯＨマウス（１９９４ＨＯ １２４２ＨＯ）、及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）から得た脾臓中の、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、Ｉｇκ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋κ＋）、及びＩｇλ＋Ｂ細胞（ＣＤ１９＋λ＋）の総数を示す。
ＫＯＨ×ＵＬＣマウス（１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ：Ｖκ１−３９Ｊκ５；１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ：Ｖκ３−２０Ｊκ１）、ＫＯＨマウス（１９９４ＨＯ １２４２ＨＯ）、及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）からの、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）及び免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）用に染色された脾臓細胞の、ＣＤ１９＋にゲート設定された、代表的なコンタープロットを示す。各ゲートされた領域内にある細胞のパーセンテージが示されている。成熟（ＣＤ１９＋ＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ）及び、移行／未成熟（ＣＤ１９＋ＩｇＤｉｎｔＩｇＭｈｉ）Ｂ細胞が、各コンタープロットに注記されている。各ゲートされた領域内にある細胞のパーセンテージが示されている。
ＫＯＨ×ＵＬＣマウス（１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ：Ｖκ１−３９Ｊκ５；１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ：Ｖκ３−２０Ｊκ１）、ＫＯＨマウス（１９９４ＨＯ １２４２ＨＯ）、及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）から得た脾臓中の、脾臓細胞（上段左）の絶対数と、Ｂ細胞（上段右；ＣＤ１９＋）、移行Ｂ細胞（下段左；ＣＤ１９＋ＩｇＤｌｏＩｇＭｈｉ）、及び成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤｈｉＩｇＭｌｏ）の総数とを示す。
ＫＯＨ×ＵＬＣマウス（１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ：Ｖκ１−３９Ｊκ５；１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ：Ｖκ３−２０Ｊκ１）、ＫＯＨマウス（１９９４ＨＯ １２４２ＨＯ）、及びＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＶＩ３）の末梢Ｂ細胞発生の、代表的なコンタープロットを示す。コンタープロットの第１の列（左）は、未成熟及び成熟Ｂ細胞を指す、ＣＤ１９＋にゲート設定された、ＣＤ９３＋及びＢ２２０＋脾臓細胞を示す。コンタープロットの第２の列（中央）は、Ｔ１（ＩｇＤ−ＩｇＭ＋ＣＤ２１ｌｏＣＤ２３−）、Ｔ２（ＩｇＤｈｉＩｇＭｈｉＣＤ２１ｍｉｄＣＤ２３＋）、及びＴ３Ｂ細胞集団を指す、未成熟Ｂ細胞中のＩｇＭ＋及びＣＤ２３＋発現を示す。コンタープロットの第３列（右）は、辺縁帯Ｂ細胞のもとである、より少ない第１の細胞集団と、濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞のもとである、第２の細胞集団とを指す、成熟Ｂ細胞のＣＤ２１＋（ＣＤ３５＋）及びＩｇＭ＋発現を示す。各ゲートされた領域内にある細胞のパーセンテージが示されている。
免疫付与、休止期、及び追加免疫手順後の、異なるＫＯＨ×ＵＬＣマウスの抗抗原１抗体価を示す。ＫＯＨ×ＵＬＣマウスは、休止期及び追加免疫後に、ＶＩ３マウス及びＵＬＣマウスと比較して、強い、高力価抗原特異性抗体反応を起こす。マウスは、足蹠経由で免疫を与えられた。２回目のブリードは、６回の追加免疫後のものであり；３回目のブリードは、４回の追加免疫後のものである。マウスは、第２回目のブリードの後で、４．５週間、休息させた。抗原１は、キャリアータンパク質である。ＶＩ３マウスは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６４２，８３５号に開示されている。１６３３は、Ｖκ１−３９を有するＵＬＣマウスである。１６３５は、Ｖκ３−２０を有するＵＬＣマウスである。
ＫＯＨ×ＵＬＣマウスから作られた、抗原特異性結合タンパク質Ｆａｂの模式図を示す。抗原陽性Ｂ細胞は、免疫原抗原２により免疫を付与する手順の後で、２匹のＫＯＨ×ＵＬＣマウスから仕分けられた。陽性のＫＯＨ可変ドメインは、Ｆａｂプラスミドにクローニングされた。ＫＯＨ可変ドメインは、重鎖定常領域にクローニングされた。ＥＬＩＳＡによる抗原陽性スクリーニング用のタンパク質を生成するための、一過性トランスフェクションが実行された。ＫＯＨ−ＣＨ１ Ｆａｂが、ヒトＶκ３−２０生殖系（ＧＬ）ＵＬＣによって、トランスフェクトされた。Ｆａｂは、抗原２、細胞表面タンパク質への結合について、ＥＬＩＳＡ及びＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によってアッセイした。いくつかの抗原特異性結合剤がＥＬＩＳＡ及びＢＩＡＣＯＲＥ（商標）アッセイによって、同定された。ＥＬＩＳＡによって決定されるように、中性ｐＨで抗原２に１４個のサンプルが結合した。結合は、１４個のＥＬＩＳＡ結合剤のうちの１３個についてＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって確認された
関連のない酵素に対する抗体、抗抗原３抗体からのＶＨｘＵＬＣドメインと対にされた場合、抗原２に対する結合を保持する、代表的なＶＬドメインに対する、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合データの表を示す。データは、ＫＯＨ×ＵＬＣマウスからの結合タンパク質は、特異性単一のＶＬドメインにおいてのみ特異性を有するということを示している。
異なる多重特異性抗原結合タンパク質フォーマットの模式図を示す。（Ａ）は、多重特異性抗原結合タンパク質の生成の模式図を示しており、その多重特異性抗原結合タンパク質は、（１）ヒト重鎖定常領域に融合され、第１のユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種で、かつ第１の抗原Ａ（ＡｇＡ）を結合することが可能なヒトＶκ（ｈＶκ／ＣＨｘＵＬＣ）ドメインを有する第１の重鎖と、（２）第２のヒト重鎖定常領域と融合され、第２のユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種で、かつ第２の抗原Ｂ（ＡｇＢ）を結合することが可能な、ヒトＶＨ（ｈＶＨｘＵＬＣ）ドメインを有する第２の重鎖と、を含み、これらの重鎖のそれぞれは、ヒト軽鎖定常領域に融合された第３のユニバーサル軽鎖可変ドメインを含む同一のユニバーサル軽鎖と対にされ、第３のユニバーサル軽鎖は、第１及び第２のユニバーサル軽鎖が由来した再配列されたＶＬ／ＪＬ遺伝子配列によってコードされている。最終的な多重特異性抗原結合タンパク質のｈＶκ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、マウス重鎖定常領域に融合され、かつマウス軽鎖定常ドメインと融合されたヒトユニバーサル軽鎖可変ドメインを含むユニバーサル軽鎖と対にされた、ｈＶκ／ＣＨｘＵＬＣドメインを生成するＫＯＨ×ＵＬＣマウス内で、抗原Ａに対して惹起された抗原結合タンパク質に由来する。最終的な多重特異性抗原結合タンパク質のｈＶＨｘＵＬＣドメインは、マウス重鎖定常領域に融合され、かつマウス軽鎖定常ドメインと融合されたヒトユニバーサル軽鎖可変ドメインを含むユニバーサル軽鎖と対にされた、ｈＶＨｘＵＬＣドメインを生成するＵＬＣマウス内で、抗原Ｂに対して惹起された抗原結合タンパク質に由来する。（Ｂ）は、多重特異性抗原結合タンパク質の生成の模式図を示しており、その多重特異性抗原結合タンパク質は、（１）ヒト重鎖定常領域に融合され、第１のユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種で、かつ第１の抗原Ａ（ＡｇＡ）を結合することが可能な、第１のヒトＶκ（ｈＶκ／ＣＨｘＵＬＣ）ドメインを有する第１の重鎖と、（２）第２のヒト重鎖定常領域と融合され、第２のユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種で、かつ第２の抗原Ｂ（ＡｇＢ）を結合することが可能な、第２のヒトＶκ（ｈＶκＣＨｘＵＬＣ）ドメインを有する第２の重鎖と、を含み、これらの重鎖のそれぞれは、ヒト軽鎖定常領域に融合された第３ユニバーサル軽鎖可変ドメインを含む同一のユニバーサル軽鎖と対にされ、第３のユニバーサル軽鎖は、第１及び第２のユニバーサル軽鎖が由来した再配列されたＶＬ／ＪＬ遺伝子配列によってコードされている。最終的な多重特異性抗原結合タンパク質の第１のｈＶκ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、マウス重鎖定常領域に融合され、かつマウス軽鎖定常ドメインと融合されたヒトユニバーサル軽鎖可変ドメインを含むユニバーサル軽鎖と対にされた、第１のｈＶκ／ＣＨｘＵＬＣドメインを生成するＫＯＨ×ＵＬＣマウス内で、抗原Ａに対して惹起された抗原結合タンパク質に由来する。最終的な多重特異性抗原結合タンパク質の第２のｈＶκ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、マウス重鎖定常領域に融合され、かつマウス軽鎖定常ドメインと融合されたヒトユニバーサル軽鎖可変ドメインを含むユニバーサル軽鎖と対にされた、第２のｈＶκ／ＣＨｘＵＬＣドメインを生成するＫＯＨ×ＵＬＣマウス（例えば、第２のＫＯＨ×ＵＬＣマウス）内で、抗原Ｂに対して惹起された抗原結合タンパク質に由来する。
図１９Ａに描かれた構造を有する、代表的な抗原結合タンパク質（Ｂ１〜Ｂ３）に対するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合データの表を示す。対照抗体（ＣＫＯＨ１〜ＣＫＯＨ２、ＣＶＨ、ＣＩ、及びＣ）に対する結合データも含まれている。ＮＴ＝試験されず、ＮＡ＝適用外、ＮＢ＝無効。
（定義）
記載の特定の方法又は実験条件は変化し得るため、本発明はかかる方法及び条件に限定されるものではない。また、本発明の範囲は特許請求の範囲によって定められるため、本明細書で使用した用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことを理解するべきである。
別途定義しない限り、本明細書で使用するすべての用語及び語句は、これらの用語及び語句が当該技術分野で得た意味を含む。ただし、その反対が明確に示されるか、用語及び語句を使用する文脈から明らかである場合は除く。本発明の実施又は試験では、本明細書に記載の方法及び材料に類似、又は等価の任意の方法及び材料を使用できる。ここで、特定の方法及び材料について説明する。記載のすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、数個のドメイン、例えば、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、ＣＨ３、及び任意選択で、ＣＨ４を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む。重鎖及び軽鎖可変ドメインは、超可変性のいわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）、より保存されている領域が組み入れられている、いわゆるフレームワーク領域（ＦＲ）の領域へと更に細分化され得る。各重及び軽鎖可変ドメインは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と省略することができ、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と省略することができる）。「高親和性」抗体という用語は、標的エピトープに対するＫＤが約１０−９Ｍ以下である抗体を指す（例えば、約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、又は約１×１０−１２Ｍ）。１つの実施形態では、ＫＤは、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって測定される表面プラズモン共鳴であり；別の１つの実施形態では、ＫＤは、ＥＬＩＳＡによって測定される。
本明細書で使用するとき、用語「生物学的に活性な」は、生物系、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、有機体内）で活性を有する任意の作用物質の特性を含む。例えば、作用物質が有機体内に存在するとき、その有機体内で生物学的効果を有する作用物質は、生物学的に活性であるとみなされる。タンパク質又はポリペプチドが生物学的に活性である特定の実施形態では、そのタンパク質又はポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するタンパク質又はポリペプチドの部分は、通常、「生物学的に活性な」部分と呼ぶ。
「抗原結合タンパク質」という語句には、それぞれ、選択的に、１つ、２つ、又はそれより多くの抗原決定基を結合する、単一特異性の、二重特異性の、又はそれより高次の抗原結合タンパク質が含まれる。二重特異性の抗原結合タンパク質は一般に、２つの非同一的な結合成分を含み、それぞれの結合成分は、２つの異なる分子上の異なるエピトープ（例えば、２つの異なる免疫原上の異なるエピトープ）、又は同じ分子上の異なるエピトープ（例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ）の、いずれかを特異的に結合する。二重特異性抗原結合タンパク質が、選択的に２つの異なるエピトープ（第１のエピトープ及び第２のエピトープ）を結合することが可能な場合には、第１の結合成分の、第１のエピトープに対する親和性は一般的に、少なくとも１〜２、又は３、又は４、又はそれより多くの桁だけ、第１の結合成分の、第２のエピトープに対する親和性よりも低くなるか、その逆の関係になっている。二重特異性抗原結合タンパク質によって特異的に結合されるエピトープは、同じ又は異なる標的上（例えば、同じ又は異なるタンパク質上）に存在し得る。例示的二重特異性抗原結合タンパク質には、腫瘍抗原に対して特異的な第１の結合成分と、細胞毒性のマーカーに対して特異的な第２の結合成分とを有するものがあり、例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ等）又はＴ細胞マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８等）がある。更に、第２の結合成分は、異なる所望の特異性を有する結合成分によって置換されることが可能である。例えば、腫瘍抗原に対して特異的な第１の結合成分と、毒素に対して特異的な第２の結合成分とを有する二重特異性抗原結合タンパク質は、毒素（例えば、サポリン、ビンカアルカロイドなど）を腫瘍細胞に送達するように、対にすることができる。他の例示的二重特異性抗原結合タンパク質には、活性化受容体に対して特異的な第１の結合成分（例えば、Ｂ細胞受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩ、ＦｃεＲＩ、Ｔ細胞受容体等）と、阻害性受容体に対して特異的な第２の結合成分（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ３００ａ等）とを有するものが挙げられる。そのような二重特異性抗原結合タンパク質は、細胞活性化（例えば、アレルギー及び喘息）に関連する治療的状態を求めて構成され得る。二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する結合成分を組み合わせることによって作製され得る。例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する結合成分をコードする核酸配列（例えば、軽鎖又は重鎖可変配列）は、同じ又は異なる重鎖定常領域、同じ又は異なる軽鎖、又はそれぞれに重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をコードする核酸配列に融合され得るが、そのような配列は、Ｆａｂ構造、ｓｃＦａｂ構造、二重特異性抗体構造、ｓｃＦｖ構造、ｓｃＦｖ−Ｆｃ構造、ｓｃＦｖ−ジッパー構造、又は同種のユニバーサル軽鎖を含む典型的な抗体と類似の四量体型構造と類似のあるフォーマットの多重特異性抗原結合タンパク質として、細胞中に発現され得る。ある例示的な二重特異性抗原結合タンパク質は、それぞれ３つの軽鎖ＣＤＲを有する２つの重鎖、続いて（Ｎ末端からＣ末端へ）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、並びにエピトープ結合特異性を付与しないが各軽鎖と結合することができる、又は各軽鎖と結合することができ、軽鎖エピトープ結合性領域によって結合されたエピトープのうち１つ以上に結合することができる、又は各軽鎖と結合することができ、軽鎖の一方若しくは両方をエピトープの一方若しくは両方に結合可能である、のいずれかである免疫グロブリン軽鎖を有する。同様に、「三重特異性抗体」という用語には、３つ以上のエピトープを選択的に結合することが可能な、抗原結合タンパク質が含まれる。
「相補的決定領域」という語句又は「ＣＤＲ」という用語は、通常（即ち野生動物において）免疫グロブリン分子（例えば、抗体又はＴ細胞受容体）の軽又は重鎖の様々な領域で２つのフレームワーク領域間に現れる有機体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされているアミノ酸配列を含む。例えば、生殖細胞系配列又は再配列された若しくは再配列されていない配列によって、及び、例えば、無感作又は成熟Ｂ細胞又はＴ細胞によって、ＣＤＲをコードすることができる。ＣＤＲは、体細胞変異（例えば、動物の生殖細胞系でコードされている配列と異なる）、ヒト化、及び／又はアミノ酸の置換、付加、若しくは欠失によって改変され得る。いくつかの状況では（例えば、ＣＤＲ３について）、（例えば、再配列されていない核酸配列では）隣接していないが、例えば、配列のスプライシング又は接続（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するためのＶ−Ｄ−Ｊ組み換え）の結果としてＢ細胞核酸配列で隣接している２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系配列）によってＣＤＲをコードすることができる。
本明細書で使用するとき、用語「同等」は、互いに同一ではないかもしれないが、これらを比較できるほど十分に類似しており、観察した相違点又は類似点に基づいて合理的に結論を出すことができる、２つ以上の作用物質、実体、状況、条件セット等を含む。当業者は、文脈において、任意の所与の状況で２つ以上のかかる作用物質、実体、状況、条件セットなどを同等とみなすために必要とされる同一性の程度を理解するであろう。
保存的アミノ酸置換を説明するために本明細書で使用するとき、用語「保存的」は、類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有するアミノ酸残基による、別のアミノ酸残基の置換を含む。概して、保存的アミノ酸置換は、対象タンパク質の機能特性、例えば、リガンドに対する受容体の結合能力を実質的に変化させない。類似の化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸基の例としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンなどの脂肪族側鎖；セリン及びスレオニンなどの脂肪族水酸基側鎖；アスパラギン及びグルタミンなどのアミド含有側鎖；フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンなどの芳香族側鎖；リジン、アルギニン、及びヒスチジンなどの塩基性側鎖；アスパラギン酸及びグルタミン酸などの酸性側鎖；並びにシステイン及びメチオニンなどの硫黄含有側鎖が挙げられる。保存的アミノ酸置換基としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、及びアスパラギン／グルタミンが挙げられる。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング突然変異で使用するように、タンパク質中の任意の天然残基と、アラニンとの置換であり得る。一部の実施形態では、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｎｎｅｔらの、Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ Ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｔｉｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３〜４５（１９９２）に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度行列内の正の値を有するものである。一部の実施形態では、置換が、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負ではない値を有する場合、その置換は「中程度に保存的な」ものと考えられる。
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖中の残基の位置は、１つ以上の保存的アミノ酸置換により異なる。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖又はその機能性断片（例えば、Ｂ細胞からの発現及び分泌を可能にする断片）中の残基の位置は、そのアミノ酸配列が本明細書に列挙されている軽鎖と同一ではなく、１つ以上の保存的アミノ酸置換によって異なっている。
本明細書において用いられる場合、「破壊」という用語は、（例えば、相同的組み換えを介して）ＤＮＡを中断する事象の結果を含む。一部の実施形態では、破壊は、ＤＮＡ配列の欠失、挿入、反転、改変、交換、置換、又はそれらの任意の組合せを実現又は意味し得る。一部の実施形態では、破壊は、ＤＮＡ内のコード配列における、突然変異の導入、例えば、ミスセンス変異、ナンセンス変異、又はフレームシフト突然変異、又はそれらの任意の組合せを実現又は意味し得る。一部の実施形態では、破壊は、細胞にとって内因性の遺伝子又は遺伝子座において起こり得る。一部の実施形態では、挿入は、遺伝子全体又は遺伝子の断片、例えばエキソンの、細胞内又はゲノム内の内因性の部位への挿入を含み得る。一部の実施形態では、挿入は、ある配列をある内因性の配列に導入し得るが、その配列は、それが挿入される内因性の配列の起源以外の起源のものである。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物（例えば、遺伝子でコードされているタンパク質）の発現、及び／又は活性を増強させてよい。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物の発現、及び／又は活性を低減させてよい。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物（例えば、コードされているタンパク質）の配列を変更させ得る。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物（例えば、コードされているタンパク質）を、切断又は断片化し得る。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物を延長させ得るが、一部のそのような実施形態では、破壊により、融合タンパク質の集合体を実現し得る。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物のレベルに影響を及ぼしてよいが、これらの活性には影響を及ぼさない。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物の活性に影響を及ぼしてよいが、これらのレベルには影響を及ぼさない。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物のレベルに対する有意な作用を有さなくてよい。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物の活性に対する有意な作用を有さなくてよい。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性にいずれに対しても有意な作用を有さなくてよい。
本明細書において用いられる場合、「内因性の遺伝子座」又は「内因性の遺伝子」という語句は、親又は参照有機体で、破壊（本明細書に記載されるように、例えば、欠失、挿入、反転、改変、交換、置換、又はそれらの組合せ）の導入に先立って見いだされた遺伝子座を含む。一部の実施形態では、内因性遺伝子座は天然に見出される配列を有する。一部の実施形態では、内因性遺伝子座は野生型ものである。一部の実施形態では、本明細書に記載の内因性の遺伝子座を含む参照有機体は、野生型の有機体である。一部の実施形態では、本明細書に記載の内因性の遺伝子座を含む参照有機体は、遺伝子操作された有機体である。一部の実施形態では、本明細書に記載の内因性の遺伝子座を含む参照有機体は、実験室で培養された有機体（野生型又は遺伝子操作を受けた有機体のいずれか）である。
語句「内因性プロモーター」は、例えば野生型有機体内で、内因性遺伝子と天然で関連しているプロモーターを含む。
「エピトープ結合タンパク質」という語句は、少なくとも１つのＣＤＲを有するタンパク質で、選択的にエピトープを認識することが可能な、例えば、約１マイクロモル以下の濃度のＫＤ（例えば、約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、又は約１×１０−１２ＭのＫＤ）で、エピトープを結合することが可能なタンパク質を含む。治療用エピトープ結合タンパク質（例えば、治療用抗体）はしばしば、ナノモル又はピコモルの範囲の濃度のＫＤを必要とする。
例えば、機能性ポリペプチドに関連してなど、本明細書で使用するとき「機能性」は、通常天然タンパク質に関連する少なくとも１つの生物活性を維持するポリペプチドを含む。別の１つの例では、機能性免疫グロブリン遺伝子セグメントは、生産的再配列をして、再配列された免疫グロブリン遺伝子配列を生成することが可能である、可変遺伝子セグメントを含み得る。
「機能性断片」という語句は、発現され、分泌され、マイクロモル、ナノモル又はピコモルの範囲のＫＤで、エピトープに特異的に結合することができるエピトープ結合タンパク質の断片を含む。特異的認識は、ＫＤが少なくともマイクロモルの範囲、ナノモルの範囲、又はピコモルの範囲であるものを含む。
免疫グロブリン核酸配列に関する用語「生殖細胞系」には、子孫に継承できる核酸配列が含まれる。
本明細書で使用するとき、用語「異種」は異なる供給源からの作用物質又は実体を含む。例えば、特定の細胞又は有機体内に存在するポリペプチド、遺伝子、又は遺伝子産物への言及で使用するとき、この用語は、関連するポリペプチド、遺伝子、又は遺伝子産物が、１）人為的な遺伝子操作を受けたこと、２）人為的に（例えば、遺伝子操作によって）細胞若しくは有機体（若しくはこれらの前駆体）に導入されたこと、及び／又は３）関連する細胞若しくは有機体（例えば、関連する細胞型若しくは有機体型）によって天然に産生されたものではないこと、若しくはこれらに存在しないことを明確にする。
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、異種（例えば、外因性）核酸又はタンパク質が導入されている細胞を含む。本開示を読んだ当業者は、かかる用語が、特定の対象細胞を指すだけではなく、かかる細胞の子孫を指すためにも使用されることを理解するであろう。特定の改変は、突然変異又は環境の影響により後の世代で生じ得るため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではないことがあるが、それでもなお、本明細書で使用するとき、用語「宿主細胞」の範囲内にそれでもなお含まれると当業者によって理解される。一部の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞若しくは真核細胞であるか、又はこれらを含む。概して、宿主細胞は、細胞が指定されている生物界にかかわらず、異種の核酸若しくはタンパク質を受容する、及び／又は産生するのに好適な任意の細胞である。本開示に従って、宿主細胞として使用され得る例示的細胞としては、原核細胞及び真核細胞（単細胞又は多細胞）、細菌性細胞（例えば、大腸菌、バチルス属、ストレプトミセス属などの菌株）、ミコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．ポンベ、Ｐ．パストリス、Ｐ．メタノリカ等）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、又は細胞融合（例えば、ハイブリドーマ又はクアドローマ）が挙げられる。一部の実施形態では、この細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、又はマウス細胞である。一部の実施形態では、この細胞は真核細胞であり、以下の細胞、つまりＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、ベロ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞に由来する細胞株から選択される。一部の実施形態では、この細胞は、例えば、ウイルス遺伝子（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）を発現する網膜細胞など、１つ以上のウイルス遺伝子を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は単離された細胞であるか、これを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は組織の一部である。一部の実施形態では、宿主細胞は有機体の一部である。
「ヒト化（された）」という用語は、本明細書においては、当該技術分野で理解される意味に従って用いられ、ある核酸又はタンパク質の構造（即ち、ヌクレオチド又はアミノ酸配列）が、自然界で非ヒト動物に見いだされる関連する核酸又はタンパク質のバージョンに実質的に又は同一的に対応し、かつ自然界でヒトに見いだされる対応するバージョンから区別可能である部位を含み、かつその構造が、非ヒト動物バージョンに存在する構造とは異なり、むしろヒトバージョンに見いだされる同等の構造とより近く対応する部位をも含む場合に、そのような核酸又はタンパク質を、「ヒト化（された）」という用語は含む。一部の実施形態では、「ヒト化」遺伝子は、ヒトポリペプチド（例えば、ヒトタンパク質又はその部分、例えば、その特性部分）のアミノ酸配列のようなアミノ酸配列を実質的に有するポリペプチドをコードする遺伝子である。１つだけ例を挙げると、膜受容体の場合、「ヒト化」遺伝子は、そのアミノ酸配列が、ヒト細胞外部分のアミノ酸配列と、同一であるか又は実質的に同一であり、かつその残りの配列が、非ヒト（例えば、マウス）のポリペプチドの配列と同一であるか又は実質的に同一である細胞外部分を有するポリペプチドをコードし得る。一部の実施形態では、ヒト化遺伝子は、ヒト遺伝子のＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、ヒト化遺伝子は、ヒト遺伝子に見いだされるＤＮＡ配列全体を含む。一部の実施形態では、ヒト化タンパク質は、ヒトタンパク質中に現れる部分を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ヒト化タンパク質は、その配列全体がヒトタンパク質に見いだされるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、（例えば、ヒト化タンパク質は、その配列全体がヒトタンパク質に見いだされるアミノ酸配列を有する一部の実施形態を含む）、ヒト化タンパク質は、非ヒト動物の内因性の遺伝子座から発現され、その内因性の遺伝子座は、タンパク質をコードする関連するヒト遺伝子のホモログ又はオルソログに対応する。
配列比較に関して本明細書で使用する場合、用語「同一性」は、ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の同一性の測定に使用できる、当該技術分野において公知のいくつかの異なるアルゴリズムのうちのいずれかによって判定される同一性を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の同一性は、オープンギャップペナルティ１０．０、伸長ギャップペナルティ０．１を使用したＣｌｕｓｔａｌＷ ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アライメント及びＧｏｎｎｅｔ類似性マトリックス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）１０．０．２，ＭａｃＶｅｃｔｏｒ社製、２００８）を使用して判定される。本明細書において用いられる場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子どうしの間の、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）どうしの間の、及び／又はポリペプチド分子どうしの間の全体的な関連性を指す。一部の実施形態では、ポリマー分子は、その配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一である場合に、互いに「実質的に同一である」と見なされる。当業者によって理解されるように、異なる配列において、どの残基が互いに「対応」しているかを考える際に、ある１つの配列において、別の１つの配列に対して、指定された長さのギャップを許すことによる方法を含む、配列の相同性の程度を判定するために配列の比較を可能にする様々なアルゴリズムが利用可能である。例えば、２つの核酸配列どうしの間のパーセント同一性を計算することは、最適な比較目的で２つの配列を位置揃えすることにより実行可能である（例えば、最適な位置揃えのため、第１及び第２の核酸配列の一方又は両方に、ギャップを導入することが可能であり、かつ非対応配列は、比較目的では無視し得る）。ある実施形態では、比較目的で位置揃えされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は実質的に１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置にあるヌクレオチドどうしを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置を占めているのと同じヌクレオチドによって占められている場合には、その場所で、分子同士が同一である。２つの配列どうしの間のパーセント同一性は、配列により共有されている同一的な位置の数の関数であり、２つの配列の最適な位置揃えのために導入される必要があるギャップの数と各ギャップの長さとを考慮する。２つのヌクレオチド配列どうしの間のパーセント同一性を判定するのに有用な、代表的なアルゴリズム及びコンピュータープログラムには、例えば、Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９、４：１１〜１７）が挙げられ、これは、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２であるギャップ長ペナルティ、及び４であるギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に既に組み込まれている。あるいは、２つのヌクレオチド配列どうしの間のパーセント同一性は、例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用い、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて判定可能である。
本明細書で使用するとき、「単離（された）」という用語は、（１）（天然及び／若しくは実験環境において）最初に産生されたときに関係していた成分の少なくとも一部から分離されており、並びに／又は（２）人為的にデザイン、産生、調製、及び／若しくは製造された物質及び／若しくは実体を含む。単離された物質及び／又は実体は、最初に会合していた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超から分離されてよい。一部の実施形態では、単離された作用物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超純粋である。本明細書で使用するとき、物質が他の成分を実質的に含まない場合、その物質は「純粋」である。一部の実施形態では、当業者によって理解されるように、物質は、例えば、１つ以上の担体又は賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）など特定の他の成分と組み合わせた後、依然として「単離された」又は更に「純粋」とみなすことができる。かかる実施形態において、物質の単離率及び純度は、かかる担体又は賦形剤を含めずに計算する。１つだけ例を挙げると、一部の実施形態では、ポリペプチド又はポリヌクレオチドのような、自然界に産出する生物学的ポリマーは、次の場合に「単離された」と見なされる：ａ）その誘導の起源又は源ゆえに、その生物学的ポリマーが、自然界における天然の状態でそれに伴う成分の一部又はすべてに関連づけられていない；ｂ）その生物学的ポリマーが、自然界でそれを生成する種と同じ種の他のポリペプチド又は核酸を実質的に含まない；ｃ）その生物学的ポリマーが、細胞又は他の発現系からの成分によって発現されているか、又はそうでない場合には、自然界でその生物学的ポリマーを産生する種と同じではない細胞又は他の発現系からの成分に関連している。したがって、例えば、一部の実施形態では、化学合成されるか、天然にそのポリペプチドが産生される細胞系と異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドとみなす。あるいは又は加えて、一部の実施形態では、１つ以上の精製技術に供されたあるポリペプチドが、ａ）自然界では関連づけられている他の成分であって、かつ／又は、ｂ）最初に産生された際に関連付けられていた他の成分、から分離されている程度まで、そのポリペプチドを「単離された」ポリペプチドとみなしてよい。
語句「軽鎖」には、あらゆる生物由来の免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記しない限り、ヒトκ及びλ軽鎖及びＶｐｒｅＢ、並びに代替軽鎖が含まれる。特に明記しない限り、軽鎖可変ドメインは典型的には３つの軽鎖ＣＤＲ及び４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。通常、全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む可変ドメインと、軽鎖定常領域と、を含む。軽鎖可変ドメインは、軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされ、通常、生殖細胞系に存在するＶ及びＪセグメントのレパートリーに由来するＶＬ及びＪＬセグメントを含む。様々な有機体のＶ及びＪ軽鎖セグメント用の配列、位置、及び命名法は、ＩＭＧＴデータベース（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に見出すことが可能である。軽鎖には、例えば、それが出現するエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される、第１又は第２のエピトープのいずれかと選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖にはまた、それが出現するエピトープ結合タンパク質によって、選択的に結合される１つ以上のエピトープと結合及び認識するもの、又は重鎖又は別の１つの軽鎖が当該抗原決定基を結合及び認識することを補助するものが含まれる。コモン又はユニバーサル軽鎖には、ヒトＶκ１−３９Ｊκ遺伝子、又はヒトＶκ３−２０Ｊκ遺伝子に由来するもの、及びその体細胞変異（例えば、親和性が成熟した）バージョンが挙げられる。例示的ヒトＶＬセグメントには、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメント、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント、ヒトＶλ１−４０遺伝子セグメント、ヒトＶλ１−４４遺伝子セグメント、ヒトＶλ２−８遺伝子セグメント、ヒトＶλ２−１４遺伝子セグメント、及びヒトＶλ３−２１遺伝子セグメントが挙げられ、かつそれらの、体細胞変異（例えば、親和性が成熟した）バージョンも挙げられる。軽鎖は、１つの有機体（例えば、ヒト、又は齧歯類（例えば、ラット若しくはマウス）、又は鳥類（例えばニワトリ））からの可変ドメインと、同じ又は別の有機体（（例えば、ヒト、又は齧歯類（例えば、ラット若しくはマウス）、又は鳥類（例えばニワトリ））からの定常領域とを含むように作製することが可能である。
「中性のｐＨ」には、約７．０〜約８．０の間のｐＨが含まれ、例えば約７．０〜約７．４の間のｐＨ、例えば約７．２〜約７．４の間のｐＨが含まれ、例えば生理学的ｐＨが含まれる。「酸性のｐＨ」には、６．０以下のｐＨが含まれ、例えば約５．０〜約６．０の間のｐＨ、約５．７５〜約６．０の間のｐＨが含まれ、例えばエンドソーム又はリソソームコンパートメントのｐＨが含まれる。
本明細書で使用するとき、「非ヒト動物」という語句は、ヒトではない脊椎動物有機体を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、円口類、硬骨魚類、軟骨魚類（例えばサメ又はエイ）、両生類、爬虫類、哺乳類（例えば齧歯類（例えばマウス又はラット））、又は鳥類（例えばニワトリ）である。一部の実施形態では、非ヒト哺乳類は、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、又は齧歯類である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、ラット又はマウスなどの齧歯類である。
本明細書において用いられる場合、「作動可能に連結された」という語句は、直接又は間接的に互いに相互作用するか、あるいはそうでない場合には、互いに調和協調して、生物学的事象に参加する、成分又は要素を物理的に近くに配置すること（例えば、三次元空間に）であって、相互作用及び／又は調和協調は、近くに配置することにより実現又は可能になる状況を含む。１つだけ例を挙げると、核酸中の対照配列（例えば、発現対照配列）は、コード化配列に対して、自身の存在又は不存在がコード化配列の発現及び／又は活性に影響を及ぼすように配置された場合に、コード化配列に「作動可能に連結されている」と言われている。多くの実施形態では、「作動可能な連結」には、関連する成分又は要素どうしの、共有結合性の連結が伴う。しかしながら当業者ならば、一部の実施形態では、共有結合性の連結は、効果的な作動可能な連結を実現するのに必要ではないということを即座に理解するであろう。例えば、一部の実施形態では、核酸対照配列が自身が制御するコード化配列と作動可能に連結されている場合、その核酸対照配列は、目的の遺伝子と隣接している。あるいは又は加えて、一部の実施形態では、１つ以上のそのような対照配列が、トランス又はある距離で、目的のコード化配列を制御するために作用する。一部の実施形態では、本明細書で使用される「発現対照配列」は、ライゲーションされるコード化配列の発現及びプロセッシングに影響を及ぼすのに必要かつ／又は十分なポリヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、発現対照配列は、適切な転写開始、終了、プロモーター、及び／又はエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなど）；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を向上させる配列；及び／又は、一部の実施形態では、タンパク質の分泌を向上させる配列であり得るか、又は含み得る。一部の実施形態では、１つ以上の対照配列は、優先的に又は排他的に、特定の宿主細胞若しくは有機体内、又はそれらのタイプで、活性である。１つだけ例を挙げると、原核生物においては、対照配列は典型的には、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み、真核生物においては、多くの実施形態において、対照配列は典型的には、プロモーター、エンハンサー、及び／又は転写終結配列を含む。当業者は、文脈から、多くの実施形態において、「対照配列」という用語は、ある成分の存在が、発現及びプロセッシングにとって必要不可欠である場合に、その成分を指し、一部の実施形態では、ある成分の存在が発現にとって有利な場合に、その成分（例えば、リーダー配列、標的化配列、及び／又は融合パートナー配列）を含むということを理解するであろう。
本明細書において用いられる場合、「組み換え体」という用語は、組み換え手段により、設計され、遺伝子操作され、調製され、発現され、作製され、又は単離されたポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるような、Ｂ細胞活性化因子タンパク質）を含み、例としては、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを用いて発現されたポリペプチド、組み換え、組合せのヒトポリペプチドライブラリ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．Ｒ、（１９９７）ＴＩＢ Ｔｅｃｈ．１５：６２〜７０；Ａｚｚａｚｙ Ｈ、及びＨｉｇｈｓｍｉｔｈ（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５〜４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ Ｊ．Ｖ．及びＬａｒｒｙｃｋ Ｊ．Ｗ．（２００３）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：１２８〜１４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．及びＣｈａｍｅｓ Ｐ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２１：３７１〜３７８）から単離されたポリペプチド、動物（例えば、マウス）から単離され、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対して遺伝子導入された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ、Ｌ．Ｄ．らの、（１９９２） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０：６２８７〜６２９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ Ｓ−Ａ、及びＧｒｅｅｎ Ｌ．Ｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５９３〜５９７；Ｌｉｔｔｌｅ Ｍ．ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２１：３６４〜３７０参照）、又は任意の他の方法で調製され、発現され、創り出され、又は互いのスプライシング選択配列要素を伴う任意の他の手段で単離されたポリペプチド、を含む。一部の実施形態では、かかる選択した配列要素の１つ以上は天然に見出される。一部の実施形態では、そのような選択された配列要素のうちの１つ以上は、インシリコで設計されている。一部の実施形態では、かかる選択した配列要素の１つ以上は、例えば、天然又は合成供給源由来の、既知の配列要素の突然変異誘発（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ）に起因する。例えば、一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、目的の供給源有機体（例えば、ヒト、マウスなど）のゲノムに見出される配列を含む。一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、突然変異誘発（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ、例えば、非ヒト動物における）に起因するアミノ酸配列を有し、したがって、組み換えポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチド配列を起源とし、これに関連する一方で、ｉｎ ｖｉｖｏで非ヒト動物のゲノム内に天然に存在しないかもしれない配列である。
用語「交換」は、宿主遺伝子座（例えば、ゲノム）で見出された「交換された」核酸配列（例えば、遺伝子）が遺伝子座から除去され、異なる「交換」核酸がその位置に位置するプロセスを指すために本明細書で使用する。一部の実施形態では、交換された核酸配列及び交換核酸配列は、例えば、互いに相同である、及び／又は対応する要素（例えば、タンパク質コーディング要素、調節要素など）を含むという点で互いに同等である。一部の実施形態では、交換された核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、スプライスドナー部位、スプライスレシーバー部位、イントロン、エキソン、非翻訳領域（ＵＴＲ）のうち１つ以上を含み、一部の実施形態では、交換核酸配列は、１つ以上のコード化配列を含む。一部の実施形態では、交換核酸配列は、交換された核酸配列のホモログである。一部の実施形態では、交換核酸配列は、交換された配列のオルソログである。一部の実施形態では、交換核酸配列は、ヒト核酸配列であるか、これを含む。一部の実施形態では、交換核酸配列がヒト核酸配列であるか、これを含む場合、交換された核酸配列は、齧歯類配列（例えば、マウス配列）であるか、これを含む。このように配置された核酸配列は、このように配置された配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’−又は３’−非翻訳領域など）を得るために使用した起源核酸配列の一部である、１つ以上の制御配列を含んでよい。例えば、様々な実施形態では、交換とは、内因性の配列の、異種配列での置換であり、その結果として遺伝子生成物が、このように配置された（異種配列を含む）核酸配列から生成するが、内因性の配列は発現しない；その交換は、内因性のゲノム配列を、内因性の配列によってコードされているタンパク質と類似の機能を有するタンパク質をコードする核酸配列（例えば、内因性のゲノム配列は、可変ドメインをコードし、ＤＮＡ断片は、１つ以上のヒト可変ドメインをコードする）によって交換することである。様々な実施形態では、内因性遺伝子又はその断片は、対応するヒト遺伝子又はその断片で交換される。対応するヒト遺伝子又はその断片は、オルソログである、又は、交換される内因性遺伝子若しくはその断片と構造及び／若しくは機能が実質的に類似する、若しくは同一である、ヒト遺伝子又は断片である。
「重鎖のみ抗体」、「重鎖のみ抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン結合タンパク質」等の用語は、典型的には機能性ＣＨ１ドメインを欠くために軽鎖に連結できない重鎖定常領域に、作動可能に連結された可変ドメインを含む免疫グロブリン様の鎖を含む、単量体又はホモ二量体型免疫グロブリン分子を指す。したがって、「重鎖のみ抗体」、「重鎖のみ抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン結合タンパク質」等の用語は、（ｉ）機能性ＣＨ１ドメインを欠く重鎖定常領域に作動可能に連結された可変ドメインを含む免疫グロブリン様の鎖の１つを含む単量体単一ドメイン抗原結合タンパク質、又は（ｉｉ）それぞれが、機能性ＣＨ１ドメインを欠く重鎖定常領域に作動可能に連結された可変ドメインを含む、２つの免疫グロブリン様の鎖を含むホモ二量体型単一ドメイン抗原結合タンパク質、の両方を含むものである。様々な態様では、ホモ二量体型単一ドメイン抗原結合タンパク質は、２つの同一な免疫グロブリン様の鎖を含み、そのそれぞれが、機能性ＣＨ１ドメインを欠く同一な重鎖定常領域に作動可能に連結された同一な可変ドメインを含む。また、単一ドメイン抗原結合タンパク質のそれぞれの免疫グロブリン様の鎖は、可変ドメインを含み、その可変ドメインは、重鎖定常領域遺伝子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はそれらの組合せ）のＣＨ１コード化配列（及び、任意選択で、ヒンジ領域）における突然変異の欠失又は不活性化を含む、重鎖定常領域（ＣＨ）遺伝子配列に連結された重鎖可変領域遺伝子セグメント（例えば、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ）、軽鎖遺伝子セグメント（例えば、ＶＬ、ＪＬ）、又はそれらの組合せ、に由来し得る。重鎖遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む単一ドメイン抗原結合タンパク質は、「ＶＨ−単一ドメイン抗体」又は「ＶＨ−単一ドメイン抗原結合タンパク質」と呼び得るものであるが、それについては、例えば、米国特許第８，７５４，２８７号、並びに米国特許出願公開第２０１４０２８９８７６号、同第２０１５０１９７５５３号、同第２０１５０１９７５５４号、同第２０１５０１９７５５５号、同第２０１５０１９６０１５号、同第２０１５０１９７５５６号、及び同第２０１５０１９７５５７号を参照のこと（なお、それぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。軽鎖遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む、単一ドメイン抗原結合タンパク質は、「ＶＬ−単一ドメイン抗原結合タンパク質」と呼び得るものであるが、それについて詳しくは、例えば、米国特許出願公開第２０１５０２８９４８９号を参照のこと（なお、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。
「体細胞変異した」は、Ｂ細胞内の対応する、親和性成熟していない免疫グロブリン可変領域配列（即ち、生殖系細胞のゲノム中の配列）と同一ではない親和性成熟Ｂ細胞由来の核酸又はアミノ酸配列への言及を含む。「体細胞変異した」という語句はまた、目的のエピトープにさらした後のＢ細胞由来の免疫グロブリン可変領域核酸又はアミノ酸配列への言及を含むが、この核酸又はアミノ酸配列は、Ｂ細胞が目的のエピトープにさらされる前の対応する核酸又はアミノ酸配列とは異なる。「体細胞変異した」という語句は、免疫原の刺激に反応して、ヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有する動物（例えばマウス）に生成された、そのような動物において、生得的に動作する選択プロセスから生じる結合タンパク質由来の配列に言及するものである。
本明細書で使用するとき、用語「実質的に」は、対象とする特徴又は特性の全体、又はほぼ全体の範囲又は程度を示す、定性的状態を含む。生物学的分野における当業者は、生物学的及び化学的現象が、仮にあるとしてもめったに完了しない、及び／若しくは完了に向かわない、又は絶対的結果に達成しない、若しくは回避しないことを理解するだろう。したがって、用語「実質的に」は、多くの生物学的及び化学的現象に固有の、完全性を欠くという可能性を捕捉するために本明細書では使用する。
本明細書で使用するとき、「実質的な相同性」という語句は、アミノ酸又は核酸配列間の比較を含む。当業者に理解されるように、２つの配列が対応する位置に相同残基を含有する場合、通常、「実質的に相同」であるとみなされる。相同残基は、同一残基であってよい。あるいは、相同残基は、構造的及び／又は機能的特徴が適切に類似する非同一残基であってよい。例えば、当業者に周知であるように、特定のアミノ酸は、通常、「疎水性」若しくは「親水性」アミノ酸として、及び／又は「極性」若しくは「非極性」側鎖を有するものとして分類される。１つのアミノ酸を別の同一種類のアミノ酸と置換すると、「相同」置換とみなさ得ることが多い。当該技術分野において周知であるように、アミノ酸又は核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ、並びにアミノ酸配列に対するＢＬＡＳＴＰ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなど市販のコンピュータープログラムで使用可能なアルゴリズムなど、任意の様々なアルゴリズムを用いて比較してよい。そのようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌらの、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５（３）：４０３〜４１０、１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌらの、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌらの、「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２、１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓらの、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ、１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒら編集の、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１３２）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９９９に記載されている。相同性配列の同定に加えて、上記プログラムは、通常、相同性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ超が、関連する残基長にわたって相同である場合、２つの配列は実質的に相同であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する残基長は完全配列である。一部の実施形態では、関連する残基長は、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又はそれ超の残基である。一部の実施形態では、関連する残基長は、完全配列に沿った隣接残基を含む。一部の実施形態では、関連する残基長は、完全配列に沿った不連続な残基を含む。一部の実施形態では、関連する残基長は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はそれ超の残基である。
本明細書で使用するとき、語句「実質的な同一性」は、アミノ酸又は核酸配列間の比較を含む。当業者に理解されるように、２つの配列が対応する位置に同一残基を含有する場合、通常、「実質的に同一」であるとみなされる。当該技術分野において周知であるように、アミノ酸又は核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮ、並びにアミノ酸配列に対するＢＬＡＳＴＰ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなど市販のコンピュータープログラムで使用可能なアルゴリズムなど、任意の様々なアルゴリズムを用いて比較してよい。そのようなプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌらの、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５（３）：４０３〜４１０、１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌらの、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌらの、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２、１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓらの、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ、１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒら編集の、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１３２）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９９９に記載されている。同一配列の同定に加えて、上記プログラムは、通常、同一性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ超が、関連する残基長にわたって同一である場合、２つの配列は実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する残基長は完全配列である。一部の実施形態では、関連する残基長は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はそれ超の残基である。
本明細書で使用するとき、語句「標的ベクター」又は「標的化構築物」は、標的化領域を含むポリヌクレオチド分子を含む。標的化領域は、標的細胞、組織、又は動物内の配列と同一であるか、実質的に同一である配列を含み、相同組み換えによって、細胞、組織又は動物のゲノム内の位置への標的化構築物の組み込みをもたらす。部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ又はＦｒｔ部位）を用いて標的化する標的化領域も含まれる。一部の実施形態では、本発明の標的化構築物は、特に対象とする核酸配列又は遺伝子、選択マーカー、対照及び／又は制御配列、かかる配列を含む組み換えを補助する、又は促進するタンパク質を外来的に付加することによって介在される、組み換えを可能とする他の核酸配列を更に含む。一部の実施形態では、本発明の標的化構築物は、対象とする遺伝子の全体又は一部を更に含み、対象とする遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を有する、タンパク質の全体又は一部をコードする異種遺伝子である。
核酸配列に言及する際の「再配列されていない」という用語は、例えば、動物細胞の野生型生殖細胞系に存在する、核酸配列を含む。
「可変ドメイン」という語句は、以下のアミノ酸領域：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４を、（他に特に断らない限り）Ｎ−末端からＣ−末端に順に含む、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖（必要に応じて改変されたもの）のアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用するとき、用語「変異体」は、参照実体との顕著な構造的同一性を示すが、参照実体と比較して、１つ以上の化学的部分の存在又はそのレベルにおいて参照実体と構造的に異なる実体を含む。多くの実施形態では、「変異体」は参照実体と機能的にも異なる。概して、特定の実体が厳密に参照実体の「変異体」であるとみなされるかどうかは、参照実体との構造的同一性の程度に基づいている。当業者に理解されるように、任意の生物学的又は化学的参照実体は、特定の特徴的構造要素を有する。「変異体」は、定義によると、１つ以上のかかる特徴的構造要素を共有する、異なる化学的実体である。いくつかだけ例を挙げると、小分子は、特徴的コア構造要素（例えば、大環状コア）及び／又は１つ以上の特徴的ペンダント部分を有してよく、したがって、小分子の変異体は、コア構造要素及び特徴的ペンダント部分を共有するが、他のペンダント部分、及び／又はコア内に存在する結合の種類（一重対二重、Ｅ対Ｚなど）が異なるものであってよく、ポリペプチドは、線形若しくは三次元空間内に互いに相対的な指定位置を有する、及び／又は、特定の生物学的機能に寄与する、複数のアミノ酸からなる特徴的配列要素を有してよく、核酸は、線形又は三次元空間に互いに相対的な指定位置を有する、複数のヌクレオチド残基からなる特徴的配列要素を有してよい。例えば、「変異体ポリペプチド」は、アミノ酸配列中の１つ以上の差異、及び／又は、ポリペプチド骨格に共有結合される化学的部分（例えば、炭水化物、脂質など）の１つ以上の差異の結果、参照ポリペプチドと異なっていてよい。一部の実施形態では、「変異体ポリペプチド」は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９９％である参照ポリペプチドとの総配列同一性を示す。あるいは又は加えて、一部の実施形態では、「変異体ポリペプチド」は、少なくとも１つの特徴的配列要素を参照ポリペプチドと共有しない。一部の実施形態では、参照ポリペプチドは、１つ以上の生物学的活性を有する。一部の実施形態では、「変異体ポリペプチド」は、参照ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性を共有する。一部の実施形態では、「変異体ポリペプチド」は、参照ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性を欠く。一部の実施形態では、「変異体ポリペプチド」は、参照ポリペプチドと比較して、低下したレベルの１つ以上の生物学的活性を示す。多くの実施形態では、対象とするポリペプチドが、親の配列と同一であるアミノ酸配列を有しているが、特定の位置において少数の配列が変更している場合、対象とするポリペプチドは、親又は参照ポリペプチドの「変異体」であるとみなされる。通常、変異体の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満の残基が、親と比べて置換されている。一部の実施形態では、「変異体」は、親と比べて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個の置換された残基を有する。多くの場合、「変異体」は、非常に少数（例えば、５、４、３、２、又は１未満）の置換された機能性残基（即ち、特定の生物活性に関与する残基）を有する。更に、「変異体」は、親と比較して、通常、付加又は欠失を有するとしても、それは５個を超えず、４、３、２、又は１個であり、多くの場合、そのような付加又は欠失を有さない。更に、任意の付加又は欠失残基は、通常、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６個未満であり、一般には約５、約４、約３、又は約２個未満である。一部の実施形態では、親又は参照ポリペプチドは天然に見出されるものである。当業者に理解されるように、対象とする特定のポリペプチドの複数の変異体は、特に対象とするポリペプチドが感染因子のポリペプチドであるとき、通常、天然に見出され得る。
本明細書で使用するとき、用語「ベクター」は、関連する別の核酸を運搬可能な核酸分子を含む。一部の実施形態では、ベクターは、染色体外複製、並びに／又は、真核及び／若しくは原核細胞など宿主細胞中で連結される核酸の発現が可能である。作動可能に連結される遺伝子の発現の方向付けが可能なベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称する。
本明細書で使用される場合、用語「野生型」は、（変異した、病気になった、変更された等の状態とは対照的に）「正常」状態又は状況において、天然に見出される、構造及び／又は活性を有する実体を含む。当業者は、野生型遺伝子及びポリペプチドは、多くの場合、多くの異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在することを理解するだろう。
（特定の実施形態の詳細な説明）
本発明はとりわけ、ヒト遺伝物質コード化軽鎖可変ドメイン（例えば、ＶＬ領域）を有する、改良された及び／又は遺伝子操作された非ヒト動物を提供する。ある実施形態では、そのような非ヒト動物は、例えば、抗原を独立に結合する（ヒト）ＶＬドメインを生産したり、単離したりするのに有用である。そのような非ヒト動物は、独特な抗原結合特性を示すヒトＶＬドメインの生成と親和性成熟のための新たなｉｎ ｖｉｖｏ系を提供するものと考えられる。したがって、本発明は、非ヒト動物内で独特な抗原結合タンパク質を開発するのに特に有用である。特に、本発明は、齧歯類の免疫グロブリン座をヒト化して、ヒト化の結果として、天然起源の免疫グロブリンにその構造が似ているものの、結合特性において異なる抗原結合タンパク質を発現させること、かつヒト化の結果として、非ヒト動物の細胞の膜表面上にその抗原結合タンパク質を発現させることを含む。そのような抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質により提供される独特な結合表面を生成する際に、天然の免疫グロブリンを逃れ得る異質な抗原を認識する能力を有する。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、同種の可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン）と独立な、抗原に結合する（ヒト）ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを生成することが可能であるが、一部の実施形態では、そのような非ヒト動物は、免疫グロブリンと構造が似ているものの、いかなる重鎖可変配列も有しない結合タンパク質を発現させるＢ細胞集団を発達させ、かつ／又は有する。一部の実施形態では、そのような非ヒト動物により発現させられた抗原結合タンパク質は、抗原結合部分が、（ヒト）ＶＬｘＵＬＣドメインのみからなることに特徴付けられている。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、非ヒト動物及び異なる種（例えば、ヒト）由来の遺伝物質を含む内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、かつ非ヒト動物及び異なる種（例えば、ヒト）由来の遺伝物質を含む内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、配列をコードする重鎖定常領域に作動可能に連結された、再配列されていないヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含むハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座と、単一の、再配列されたヒト又は非ヒトＶＬＪＬ配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質の発現は、非ヒト免疫グロブリン遺伝物質（例えば、非ヒト免疫グロブリンプロモーター及び／又はエンハンサー）の制御下にある。
本発明の様々な態様を以下のセクションに詳述する。これらのセクションの使用は、本発明を制限することを意図するものではない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用できる。
再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含有する高多様性ハイブリッド鎖遺伝子座、及び再配列された軽鎖可変領域配列を含有する低多様性軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物
同種の鎖可変領域とは独立に抗原を結合する能力を有する軽鎖可変領域を生成することは、抗原結合分子内で使われる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を作製するために有用であり得る。
同種の鎖可変領域とは独立に抗原を結合することができるそのような軽鎖可変ドメインを生産するためのアプローチの１つは、軽鎖（ＶＬ）の可変領域又はドメインをコードするヌクレオチド配列に選択的圧力をかけて、より多様な抗原結合レパートリーを有する軽鎖ＣＤＲ３を生成することである。本明細書において開示されるように、上のことを実現可能にするには、高多様性の再配列されていない軽鎖遺伝子セグメントを含有する免疫グロブリンハイブリッド鎖遺伝子座と、遺伝子座が単一の、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有するという意味で低多様性の、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とをそのゲノムに含有する、遺伝子改変非ヒト動物を生成することが必要で、それについては、例えば米国特許出願公開第２０１２００９６５７２号（参照により、本明細書に組み込まれる）を参照のこと。あるいは、一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、遺伝子座が、２つ以上であるが野生型の数よりも少ない数（例えば、２、３、又は４つ）の、再配列されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントしか含有しないという意味で低多様性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある軽鎖配列（又は限られた数のＶＬ遺伝子セグメント）は、これらの動物内の、コモン又はユニバーサル（すなわち、同じ又は非常に類似した）配列に限定され、ハイブリッドの遺伝子座にある再配列されていない軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（すなわち、遺伝子）は、より多様性があり効率的な抗原結合特性を有し、同系の可変領域とは独立に、抗原決定基を結合することが可能な軽鎖ＣＤＲ３を作るように強いられる。更に、本明細書において開示されるように、生殖系可変領域遺伝子セグメントの正確な交換（例えば、相同的組換により媒介される遺伝子標的化）により、部分的にヒトの免疫グロブリン座を有する動物（例えば、マウス、ラット、又はニワトリ）を作製することが可能になる。部分的にヒトの免疫グロブリン座は、正常に、再配列、超変異、及び体細胞変異（例えば、クラス転換）するので、部分的にヒトの免疫グロブリン座は、ヒト可変ドメイン（すなわち、ヒトＶＬドメイン）を含む動物に、結合タンパク質を生成する。これらの動物は、野生型の動物と実質的に類似の体液性免疫系を示し、かつその動物が、（免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に）ヒト可変領域遺伝子セグメントの完全なレバートリーを有していない場合でさえも、正常な細胞集団と正常なリンパ器官構造とを示す。これらの動物（例えば、マウス、ラット、又はニワトリ）に免疫をもたせた結果、幅広い多様性のある、軽鎖可変遺伝子セグメントの使用を示す、強い液性応答が得られる。可変領域をコードするヌクレオチド配列は、同定され、クローニングされ、次に、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系において）任意の好みの配列、例えば、特定の使用に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプと融合されることが可能で、その結果、完全にヒト配列由来の抗体又は抗原結合タンパク質が得られる。
加えて、制約のある（制限された）免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、例えば、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（例えば、ユニバーサル軽鎖又は「ＵＬＣ」、これについては、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１−０１９５４５４Ａ１号、同第２０１２−００２１４０９Ａ１号、同第２０１２−０１９２３００Ａ１号、同第２０１３−００４５４９２Ａ１号、同第２０１３−０１８５８２１Ａ１号、及び同第２０１３−０３０２８３６Ａ１号を参照のこと）を含む、制約のある免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を有する動物（例えば、マウス、ラット、又はニワトリ）、又は制約のある（制限された）免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー（例えば、２以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメントしか含まない、制約のある免疫グロブリン軽鎖可変セグメントレパートリー；例えば、デュアル軽鎖、又は「ＤＬＣ」、これについては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３−０１９８８８０Ａ１号を参照のこと。）を、上述の、再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含有する、高多様性ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座と組み合わせて有する、動物（例えば、マウス、ラット、又はニワトリ）を使用することにより、重鎖可変ドメインの不在下で抗原を結合する、免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ）ドメインが生成され得る。更に、ヒスチジンコドンを、例えば、１つ以上のヒスチジンコドンの付加を介して、又は１つ以上の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を介して、本明細書に記載の、非ヒト動物のゲノム中の、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列に（又は制限されたＶＬ遺伝子セグメントに）導入することにより、改善されたｐＨ依存リサイクル性を抗原結合タンパク質に与えることが可能な軽鎖可変領域アミノ酸配列を生成することが可能である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物は、多様性が制限されるものの、結合タンパク質の収率が上がり、それゆえに、同種の可変ドメインとは独立に抗原を結合するハイブリッドの遺伝子座から、軽鎖可変ドメインの生成に成功する蓋然性が高まる。一部の実施形態では、軽鎖は、それ自身、抗原結合特性を示し得る。一部の実施形態では、非ヒト動物は、その軽鎖にある抗原特異性を示す抗原結合タンパク質を生成するように誘導され得る（例えば、マウス又はラットの免疫グロブリン軽鎖レパートリーを制限し、免疫グロブリンハイブリッド鎖レパートリーを最大化することにより；例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖レパートリーを創り出すことにより、例えば、マウス又はラットの重鎖可変領域遺伝子座を、高多様性の再配列されていないヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む遺伝子座と交換することにより、かつマウス又はラットの軽鎖可変領域遺伝子座を、単一の再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と交換することにより）。一部の実施形態では、そのような動物内で生成される抗原結合タンパク質（例えば、抗体）は、その軽鎖結合を通じて、特定のエピトープ（例えば、エフェクター抗原、細胞毒性分子、Ｆｃ受容体、毒素、活性化又は阻害性受容体、Ｔ細胞毒性マーカー、免疫グロブリン輸送体等）に対して特異性がある。
様々な態様では、配列をコードする重鎖定常領域に作動可能に連結された再配列されていない（ヒト）ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座、及び再配列されたヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（即ち、再配列された軽鎖ＶＪ配列）を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を、その生殖系ゲノム中に含む、非ヒト動物が提供される。一部の実施形態では、再配列されていない（ヒト）ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、そのそれぞれが、少なくとも機能性ＣＨ１ドメインをコードする１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、ヒト又は非ヒト重鎖定常領域配列に作動可能に連結され、かつ再配列された（ヒト）免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト又は非ヒト軽鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされている免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性のものではない。一部の実施形態では、非ヒト動物は改変されて、軽鎖定常ドメインに作動可能に連結された再配列された軽鎖可変ドメインを、２部、３部、４部又はそれ超コードするヌクレオチド配列を含むようになっている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、再配列された（ヒト）免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を複数部コードする。例えば、ヌクレオチド配列は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を、少なくとも１部、２部、３部、４部、５部コードすることが可能である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、再配列された（ヒト）免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０部コードする。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、再配列された（ヒト）免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を、複数部含む。
様々な態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、単一の再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、例えば、非ヒト軽鎖定常領域ヌクレオチド配列（例えば、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列）に作動可能に連結された、再配列されたヒトＶＬＪＬ配列を含む。このようにして、そのゲノム中に、（ｉ）ヒト又は非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含むハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座と、（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供される。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、ラット又はマウスの定常領域、例えば、ラット又はマウスのＣκ定常領域である。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）にある、ヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、複数の遺伝子セグメント（２つ以上のヒトＶＬと、２つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメント）として存在し、かつ抗体の重鎖定常領域の関連において、ヒトＶＬドメインを再配列かつコードすることが可能であり、しかも非ヒト動物は、内因性のＶＨ及び／又はＶＬ遺伝子セグメントを含まない。一部の実施形態では、非ヒト動物は、６、１６、３０、４０、又はそれより多くの再配列されていないヒトＶκ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、５つの再配列されていないヒトＪκ遺伝子セグメント、例えば、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、１２、２８、４０、又はそれより多くの再配列されていないヒトＶλ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、１、２、３、４、又はそれより多くの再配列されていないヒトＪλ遺伝子セグメント、例えば、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７等を、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）に含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、再配列されたヒトＶκＪκヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、再配列されたヒトＶλＪλヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒトＶκＪκヌクレオチド配列又は再配列されたヒトＶλＪλヌクレオチド配列は、内因性の軽鎖遺伝子座、例えば、内因性のκ軽鎖遺伝子座に存在する。一部の実施形態では、マウスは、機能性λ軽鎖遺伝子座を含む。一部の実施形態では、マウスは、非機能性λ軽鎖遺伝子座を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、１つ以上のヒトＶＬ及び１つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座中の）マウス又はラットの重鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列されたヒトＶκＪκヌクレオチド配列は、再配列されたヒトＶκ１−３９Ｊκヌクレオチド配列、例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５配列（例えば、配列番号１に記載のもの）である。一部の実施形態では、再配列されたヒトＶκＪκヌクレオチド配列は、再配列されたヒトＶκ３−２０Ｊκヌクレオチド配列、例えば、Ｖκ３−２０Ｊκ１配列（例えば、配列番号２に記載のもの）である。一部の実施形態では、再配列されたヒトＶλＪλヌクレオチド配列は、再配列されたヒトＶλ２−１４Ｊλ１ヌクレオチド配列である。当業者ならば、他のＪＬ配列の使用も、再配列された軽鎖配列に採用し得るということを認識するであろう。
様々な態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントの制限されたレパートリー、例えば、１つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメントと、非ヒト軽鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結された、１つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントと、を含む。このようにして、そのゲノム中に（ｉ）ヒト又は非ヒト重鎖定常領域核酸配列（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、又はそれらの組合せ、例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３、をコードする非ヒト重鎖定常領域核酸配列）に作動可能に連結された、再配列されていないヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）と、（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、２つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子改変非ヒト動物が提供される。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、ラット又はマウスの定常領域、例えば、ラット又はマウスのＣκ定常領域である。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）にある、ヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、複数の遺伝子セグメント（２つ以上のヒトＶＬと、２つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメント）として存在し、かつ抗体の重鎖定常領域の関連において、ヒトＶＬドメインを再配列かつコードすることが可能であり、しかも非ヒト動物は、内因性のＶＨ及び／又はＶＬ遺伝子セグメントを含まない。一部の実施形態では、非ヒト動物は、６、１６、３０、４０、又はそれより多くの再配列されていないヒトＶκ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、５つの再配列されていないヒトＪκ遺伝子セグメント、例えば、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、１２、２８、４０、又はそれより多くの再配列されていないヒトＶλ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、１、２、３、４、又はそれより多くの再配列されていないヒトＪλ遺伝子セグメント、例えば、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７等を、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、２つの再配列されていないヒトＶκ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、２つの再配列されていないヒトＶλ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に含む。
一部の実施形態では、そのゲノム中に、（ｉ）ヒト又は非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されていないヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）と、（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト軽鎖可変領域核酸配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子改変マウスが、野生型のマウス又は他の免疫グロブリン座の一時変異を含むマウス（即ち、遺伝子改変対照マウス；例えば、マウスの体液性免疫系が、野生型マウスの体液性免疫系のように機能する、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス）に見られるＣＤ１９＋Ｂ細胞数、及び成熟Ｂ細胞数と実質的に同じ数を示す。一部の実施形態では、そのようなマウスはまた、脾臓のＢ細胞中の内因性λ軽鎖の機能の発現停止を示す。一部の実施形態では、マウスは、骨髄及び脾臓における、正常又はほぼ正常なＢ細胞の発達を示す。一部の実施形態では、そのようなマウスは、遺伝子改変対照マウスと比較した場合に、λ軽鎖の、検出可能な発現及び／又は使用の欠如（又は機能の発現停止）を示す。
別の１つの態様では、非ヒト動物が提供され、その非ヒト動物が（ａ）遺伝子改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、その遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（例えば、そこでは、第１のヌクレオチド配列が再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む）を含み、その第１のヌクレオチド配列は、それぞれが機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、例えば、少なくともインタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つと、を含む（その結果、例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座が生じる）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、またその非ヒト動物は、（ｂ）遺伝子改変免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含み、その遺伝子座は、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、（例えば、そこでは、第２のヌクレオチド配列は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であるか、又はそこでは第２のヌクレオチド配列は、制限された数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、例えば、２つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含み）、第２のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。例えば、一部の実施形態では、予め設計されたＶＪ領域（即ち、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、即ちコモン又はユニバーサル軽鎖配列）から、又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント（例えば、２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）からの再配列された軽鎖は、再配列された軽鎖配列をマウス軽鎖遺伝子座κ又はλ中に標的化することにより、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され得る。このように、他の実施形態と同様に、この遺伝子操作された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系ゲノム中に存在し得る。重鎖定常領域遺伝子配列との作動可能な連結に、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変非ヒト動物が、米国特許出願公開第２０１２−００９６５７２Ａ１号に記載されており、同文書は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列が、κ軽鎖定常（即ち、Ｃκ）領域遺伝子配列に、作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列が、マウス又はラットのＣκ領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列が、ヒトのＣκ領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列が、Ｃλ領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列が、マウス又はラットのＣλ領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヒト鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列が、ヒトのＣλ領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。再配列されたヒト軽鎖可変領域（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）と、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントとをマウスに採用した（即ち、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は、有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント）を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）を有するマウスの）実施形態は、本明細書において広範囲にわたって論じられているが、本明細書に記載の、遺伝子改変免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む、他の非ヒト動物もまた提供される。そのような非ヒト動物には、本明細書において開示されるように、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は、有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントからのヒト軽鎖可変ドメイン）を発現するように遺伝子改変され得る任意のものが挙げられるが、例えば、哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、牝牛、雄牛、野牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）等が含まれる。例えば、好適な遺伝子改変されたＥＳ細胞がすぐには入手できないそれらの非ヒト動物の場合には、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために他の方法が採用される。そのような方法としては、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞又は誘導多能性細胞）を改変すること、及び体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を用いて、除核した卵母細胞など好適な細胞に遺伝子改変ゲノムを移植し、好適な条件下で非ヒト動物内で改変細胞（例えば、改変卵母細胞）を成熟させて胚を形成することが挙げられる。非ヒト動物のゲノム（例えば、ブタ、雌牛、齧歯類、ニワトリなどのゲノム）を改変するための方法には、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いてゲノムを改変して、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数、例えば２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）と、を含むようにすることが挙げられる。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、例えば、トビネズミ上科又はネズミ上科の小型哺乳類である。一部の実施形態では、遺伝子改変動物は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターから選択される。一部の実施形態では、齧歯類は、ネズミ上科から選択される。一部の実施形態では、遺伝子改変動物は、カンガルーハムスター科（例えば、マウス様ハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラット及びマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（真正マウス及びラット、スナネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、イワマウス、オジロラット、マダガスカルラット及びマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、及びメクラネズミ科（例えば、デバネズミ、タケネズミ、及びモグラネズミ）から選択される科に属する。１つの具体的な実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、真正マウス又はラット（ネズミ科）、スナネズミ、トゲマウス、及びタテガミネズミから選択される。一部の実施形態では、遺伝子改変マウスはネズミ科に属する。一部の実施形態では、動物は、齧歯類である。ある具体的な実施形態では、齧歯類は、マウス及びラットから選択される。一部の実施形態では、非ヒト動物はマウスである。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択される、Ｃ５７ＢＬ系統のマウスである齧歯類である。別の１つの実施形態では、マウスは１２９系統である。一部の実施形態では、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２からなる群から選択される（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇら（１９９９）による、Ｒｅｖｉｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ １２９ ｍｉｃｅ、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６を参照のこと、また、Ａｕｅｒｂａｃｈら（２０００）による、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １２９／ＳｖＥｖ− ａｎｄ Ｃ５７ＢＬ／６−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓを参照のこと）。一部の実施形態では、遺伝子改変マウスは、上記の１２９系統と、上記のＣ５７ＢＬ系統（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統）との混合体である。別の１つの実施形態では、マウスは、上記の１２９系統の混合体、又は上記のＣ５７ＢＬ／６系統の混合体である。一部の実施形態では、混合体の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の１つの実施形態では、マウスは、１２９／ＳｖＥｖ由来の系統と、Ｃ５７ＢＬ／６由来の系統との混合体である。１つの具体的な実施形態では、マウスは、Ａｕｅｒｂａｃｈら（２０００）の、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：１０２４〜１０３２に記載されているように、１２９／ＳｖＥｖ由来の系統と、Ｃ５７ＢＬ／６由来の系統との混合体である。別の１つの実施形態では、このマウスは、ＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統である。別の１つの実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統）と、上記の別の１つの系統との混合体である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。一部の実施形態では、ラットは、ウィスターラツト、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、ＡＣＩ、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される（ＤＡ）。一部の実施形態では、ラット系統は、ウィスター、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、ＡＣＩ、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）から選択される群から選択される、２つ以上の系統の混合体である。
一部の実施形態では、そのような遺伝子改変されたマウスは、λ遺伝子配列が野生型において用いられる頻度の半分以下の頻度で、λ遺伝子配列を用いる。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、再配列された軽鎖可変ドメインは、ヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子配列又はセグメントに由来する。他の実施形態では、再配列された軽鎖可変ドメインは、非ヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子配列又はセグメントに由来する。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変ドメインは、ヒト生殖系ＶＬセグメント及びヒト生殖系ＪＬセグメントに由来する。一部の実施形態では、ヒトＶＬセグメントは、ヒト集団における観察された変異体に対応する。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列のヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、Ｖκ２−４０、及びそれらの多型変異体からなる群から選択される一部の実施形態では、ヒトＶκセグメントは、Ｖκ１−３９又はその多型変異体である。一部の実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−２０である。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、制約された（制限された）免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー（例えば、２つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む、制約された免疫グロブリン軽鎖可変セグメントレパートリー）のヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、本明細書に記載のヒトＶκ遺伝子セグメントから選択される。一部のある実施形態では、制約された（制限された）免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーのヒトＶκ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメント及びヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む。非ヒト動物の制約された（制限された）免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントの様々な実施形態では、制約された軽鎖可変遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメント及びヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント）は、１、２、３、４、又はそれより多くのヒトＪＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結され、制約された免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントが、１、２、３、４、又はそれより多くの、ヒトＪＬ遺伝子セグメント（即ち、Ｊκ遺伝子セグメント）で組み換えを行い、再配列されたＶκＪκ軽鎖可変遺伝子を形成する。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列のヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶλ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１、Ｖλ５−５２、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１、Ｖλ４−６９、及びそれらの多型変異体からなる群から選択される。一部の実施形態では、ヒトＶλセグメントは、Ｖλ２−１４である。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、制約された（制限された）免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー（例えば、２つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む、制約された免疫グロブリン軽鎖可変セグメントレパートリー）のヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶλ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、本明細書に記載のヒトＶλ遺伝子セグメントから選択される。一部のある実施形態では、制約された（制限された）免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーのヒトＶλ遺伝子セグメントは、ヒトＶλ２−１４遺伝子セグメントを含む。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列のヒトＪＬ遺伝子セグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７、及びそれらの多型変異体からなる群から選択される。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、制約された（制限された）免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーのヒトＪＬ遺伝子セグメントは、ヒトＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、及びそれらの多型変異体を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、制約された（制限された）免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーのヒトＪＬ遺伝子セグメントは、ヒトＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７、及びそれらの多型変異体を含む。
一部の実施形態では、ヒト又は非ヒト動物軽鎖定常領域配列は、Ｃκ及びＣλ領域から選択された配列を含む。
様々な実施形態は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス由来の特徴又は配列情報を用いるか、又は含む。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）及び免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ軽鎖、Ｉｇκ）の生殖系可変領域を、対応するヒト免疫グロブリン可変領域により、内因性の遺伝子座において正確に、大規模に交換することを含む（例えば、米国特許第６，５９６，５４１号及び同第８，５０２，０１８号を参照のこと、なお、両者の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。合計で、約６メガベースのマウス遺伝子座が、約１．５メガベースのヒトゲノム配列で交換される。この正確な交換の結果、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する重鎖及び軽鎖を作る、ハイブリッドの免疫グロブリン座を有するマウスが得られる。マウスＶＨ−Ｄ−ＪＨ及びＶκ−Ｊκセグメントの正確な交換により、フランキングマウス配列は操作されずに、ハイブリッドの免疫グロブリン座に機能的なまま残される。マウスの体液性免疫系は、野生型マウスの体液性免疫系のように機能する。Ｂ細胞の発達は、いかなる重要な点でも妨げられることなく、抗原の刺激を受けてマウスに、ヒト可変領域の豊かな多様性が生成される。しかも、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、免疫付与に対して、本質的に正常な野生型の反応を示し、唯一、重要な点で野生型のマウスと異なるのは、免疫付与に反応して生成される可変領域が、完全にヒトのものであるということである。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスが可能なのは、重鎖及びκ軽鎖用の免疫グロブリン遺伝子セグメントが、ヒト及びマウスにおいて同様に再配列するためである。遺伝子座は同一のものではないが、重鎖可変遺伝子座のヒト化が、すべてのＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む、隣接するマウス配列の約３００万個の塩基対を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座からの同等の配列を基本的にカバーする、隣接するヒトゲノム配列の約１００万個の塩基と交換することによって実現可能な程度には十分類似している。
ある特定の実施形態では、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む（即ち、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む）ヒト化マウスが提供される。そのように改変されたヒト化マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント、（即ち、内因性の重鎖遺伝子座にある、再配列されていないＶＬ及びＪＬ遺伝子）によって交換することと、マウス免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントを、再配列されたヒトＶＬＪＬヌクレオチド配列によって交換すること、又は、マウス免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントを、制約された（制限された）免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー（例えば、２つ以上であるが、野生型の数よりは少ない数の、ヒトＶＬ遺伝子セグメント）によって、交換することを含む。
一部の実施形態では、そのように改変されたマウスは、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを、少なくとも４０個の再配列されていないヒトＶκ遺伝子セグメント及び５個の再配列されていないヒトＪκ遺伝子セグメントによって交換することを含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３からなる群から選択される。一部の実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、及びＶκ１−６を含む。１つの実施形態では、Ｖκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、及びＶκ１−１６を含む。一部の実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、及びＶκ２−３０を含む。一部の実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、及びＶκ２−４０を含む。ある具体的な実施形態では、Ｖκ遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座にＶκ４−１からＶκ２−４０まで広がる、隣接するヒト免疫グロブリンκ遺伝子セグメントを含み、かつＪκ遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座にＪκ１からＪκ５まで広がる、隣接する遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（即ち、再配列されたヒトＶκＪκヌクレオチド配列）は、マウス軽鎖定常領域配列（例えば、Ｃκ配列）に作動可能に連結されている。ヒト軽鎖可変ドメインをコードする免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む（即ち、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む）ヒト化マウスは、本明細書に記載の任意の態様、実施形態、方法等において使用し得る。
一部の実施形態では、そのように改変されたマウスは、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを、少なくとも４０個の再配列されていないヒトＶλ遺伝子セグメントと、１つ以上の再配列されていないヒトＪλ遺伝子セグメントと、によって交換することを含み、一部のある実施形態では、少なくとも４０個の再配列されていないヒトＶλ遺伝子セグメントと、４つの再配列されていないヒトＪλ遺伝子セグメントと、によって交換することを含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、Ｖλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１、Ｖλ５−５２、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１、Ｖλ４−６９、及びそれらの多型変異体からなる群から選択される。一部の実施形態では、再配列されていないヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ３−１、Ｖλ４−３、Ｖλ２−８、Ｖλ３−９、Ｖλ３−１０、Ｖλ２−１１、及びＶλ３−１２を含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、及びＶλ３−２７を含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１、Ｖλ５−５２、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１、及びＶλ４−６９を含む。ある具体的な実施形態では、Ｖλ遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座に、Ｖλ３−１からＶλ３−１２まで広がる隣接するヒト免疫グロブリンλ遺伝子セグメントを含み、かつＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１を含む。ある具体的な実施形態では、Ｖλ遺伝子セグメントは、隣接するヒト免疫グロブリンλ遺伝子セグメントは、Ｖλ３−１２からＪλ１まで広がるヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を含む。ある具体的な実施形態では、Ｖλ遺伝子セグメントは、Ｖλ３−１からＶλ３−１２まで、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座に広がる隣接するヒト免疫グロブリンλ遺伝子セグメントを含み、かつＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７を含む。ある具体的な実施形態では、Ｖλ遺伝子セグメントは、Ｖλ３−１２からＶλ３−２７まで、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座に広がる隣接するヒト免疫グロブリンλ遺伝子セグメントを含み、かつ、Ｊλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１又はＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７を含む。ある具体的な実施形態では、Ｖλ遺伝子セグメントは、隣接するヒト免疫グロブリンλ遺伝子セグメントを、Ｖλ１−４０からＶλ５−５２まで広がる、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座に含み、Ｊλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１又は、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、再配列されたヒトＶλＪλヌクレオチド配列であり、かつマウス軽鎖定常領域配列（例えば、Ｃλ配列）に作動可能に連結されている。ヒト軽鎖可変ドメインをコードする免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む（即ち、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む）ヒト化マウスは、本明細書に記載の任意の態様、実施形態、方法等において使用し得る。
様々な実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒト又はマウス重鎖定常領域遺伝子配列（例えば、それぞれの重鎖定常領域遺伝子は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びそれらの組合せから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする重鎖定常領域遺伝子配列）に作動可能に連結されている。例えば、遺伝子改変非ヒト動物が提供され、その動物は、（ａ）再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含み、ヒト又は非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された第１のヌクレオチド配列を含む（即ち、第１のヌクレオチド配列は、少なくとも４０個のヒトＶκ遺伝子セグメントと５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む）、免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座）と、（ｂ）それぞれが、少なくともインタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子の少なくとも１つを含む機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、ヒト又は非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再配列され、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であるか、又は第２のヌクレオチド配列は、有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含み；例えば、２以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含み）を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む。一部の実施形態では、ヒト重鎖定常領域遺伝子は、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組合せを、更にコードする。一部の実施形態では、マウス重鎖定常領域遺伝子は、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組合せを、更にコードする。一部の実施形態では、ある非ヒト動物定常領域遺伝子配列を、ヒト遺伝子配列によって更に交換すること（例えば、マウスＣＨ１配列を、ヒトＣＨ１配列と交換すること、及びマウスＣＬ配列を、ヒトＣＬ配列と交換すること）は、その結果として、ヒト可変領域と部分的にヒト定常領域とを有する抗体を、例えば、完全なヒト抗体断片、例えば、完全にヒトＦａｂを作るのに好適なものとする、キメラ（そしてハイブリッド）免疫グロブリン座を有する、遺伝子改変非ヒト動物が得られる。一部の実施形態では、再配列されていない、ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、それぞれが、機能性ＣＨ１ドメイン、例えば、少なくともインタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つとを含む配列を含む、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、ラットの重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ラット重鎖定常領域遺伝子は、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組合せを、更にコードする。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）は、ヒトＣκ領域配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）マウス又はラットのＣκ領域配列に作動可能に連結されている。様々な実施形態では、非ヒト動物の遺伝子改変免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を２部、３部、４部、又はそれより多く含む。ある特定の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数の複製を含む。
様々な実施形態では、（ヒト）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４重鎖定常領域遺伝子（例えば、発現ベクター中に、内因性の遺伝子座でクローニングされた）等は、遺伝子のＣＨ３コード化配列中の１つ以上の改変を含み、その改変により、Ａタンパク質に対する、改変されたコーディング配列によってコードされているＣＨ３ドメインの親和性を減少させ又は消滅させる。（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，７１３号参照を参照のこと）。そのような改変には、（ａ）ＩＭＧＴ番号付けシステムにおける、９５Ｒ、並びに（ｂ）９５Ｒ及び９６Ｆ、又はＥＵ番号付けシステムにおける、（ａ’）４３５Ｒ、並びに（ｂ’）４３５Ｒ及び４３６Ｆからなる群から選択される突然変異が挙げられるが、それらに限られない。一部の実施形態では、（ヒト及び）突然変異した重鎖定常領域は、（ヒト及び）突然変異したＩｇＧ１定常領域であり、かつ（ａ）（ＩＭＧＴ番号付けシステムにおける）９５Ｒ又は（ｂ）９５Ｒ及び９６Ｆの突然変異に加えて、ＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける、１６Ｅ、１８Ｍ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍ、及び８２Ｉ、又はＥＵ番号付けシステムにおける、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、及び４２２Ｉからなる群から選択される、１〜５個の一時変異を更に含む。一部の実施形態では、重鎖定常遺伝子は、（ヒト）ＩｇＧ２定常遺伝子であり、かつ（ａ）９５Ｒ又は（ｂ）９５Ｒ及び９６Ｆ（ＩＭＧＴ番号付けシステムで）の突然変異に加えて、ＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける、４４Ｓ、５２Ｎ、８２Ｉ、又は、ＥＵ番号付けシステムにおける、３４８Ｓ、３９２Ｎ、及び４２２Ｉからなる群から選択される、１〜２つの一時変異を更に含む。他の実施形態では、（ヒト）重鎖定常遺伝子は、（ヒト）ＩｇＧ４定常遺伝子であり、かつ（ａ）９５Ｒ又は（ｂ）９５Ｒ及び９６Ｆ（ＩＭＧＴ番号付けシステムで）の突然変異に加えて、ＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける、１５Ｒ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍ、６９Ｋ、７９Ｑ、及び８２Ｉ、又はＥＵ番号付けシステムにおける、３５５Ｒ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４０９Ｋ、４１９Ｑ、及び４２２Ｉからなる群から選択される、１〜７つの一時変異、及び／又は、ＩＭＧＴエキソン番号付けシステムにおける１０５Ｐ、又はＥＵ番号付けシステムにおける４４５Ｐの一時変異を更に含む。
様々な実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＣＨ２又はＣＨ３における改変を含み、その改変により、酸性環境下で（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソーム中で）、重鎖定常領域アミノ酸配列の、ＦｃＲｎに対する親和性が増加する。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードし、そのヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、ＥＵ番号付けにおける位置２５０（Ｋａｂａｔ番号付けにおける２６３）に改変（例えば、Ｅ又はＱ）を含み、ＥＵ番号付けにおける位置２５０（Ｋａｂａｔ番号付けにおける２６３）及びＥＵ番号付けにおける位置４２８（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４５９）に改変（例えば、Ｌ又はＦ）を含み、ＥＵ番号付けにおける位置２５２（Ｋａｂａｔ番号付けにおける２６５）に改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ又はＴ）を含み、ＥＵ番号付けにおける位置２５４（Ｋａｂａｔ番号付けにおける２６７）に改変（例えば、Ｓ又はＴ）を含み、及びＥＵ番号付けにおける位置２５６（Ｋａｂａｔ番号付けにおける２６９）に改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／Ｄ、又はＴ）を含み、あるいは、ＥＵ番号付けにおける位置４２８（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４５９）に改変を含み、及び／又はＥＵ番号付けにおける位置４３３（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４６４）に改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑ又はＫ）を含み、及び／又はＥＵ番号付けにおける位置４３４（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４６５）に改変（例えば、Ｈ／Ｆ又はＹ）を含み、あるいは、ＥＵ番号付けにおける位置２５０（Ｋａｂａｔ番号付けにおける２６３）に改変を含み、及び／又はＥＵ番号付けにおける位置４２８（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４５９）に改変を含み、又はＥＵ番号付けにおける位置３０７（Ｋａｂａｔ番号付けにおける３２６）に改変を含み、又はＥＵ番号付けにおける位置３０８（Ｋａｂａｔ番号付けにおける３２７）に改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）を含み、更にＥＵ番号付けにおける位置４３４（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４６５）に改変を含む。１つの実施形態では、改変は、ＥＵ番号付けにおける４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）と４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変を含み、（４５９、例えば、Ｍ４５９Ｌ、及びＫａｂａｔ番号付けで４６５Ｓ（例えば、Ｎ４６５Ｓ）の改変を含み、ＥＵ番号付けにおける、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変を含み、（４５９Ｌ、２７２Ｉ（例えば、Ｖ２７２Ｉ）、及びＫａｂａｔ番号付けで３２７Ｆ（例えば、Ｖ３２７Ｆ）の改変を含み、ＥＵ番号付けにおける、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）改変を含み、及び４３４（例えば、４３４Ｙ）改変を含み、及びＫａｂａｔ番号付けにおける（４６４Ｋ（例えば、Ｈ４６４Ｋ）改変を含み、４６５（例えば、４６５Ｙ）改変を含み、ＥＵ番号付けにおける、２５２、２５４、及び２５６の位置に（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）改変を含み、Ｋａｂａｔ番号付けで（２６５、２６７、２６９（例えば、２６５Ｙ、２６７Ｔ、及び２６９Ｅ）に、改変を含み、ＥＵ番号付けにおける、２５０Ｑ及び４２８Ｌ改変（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）、（Ｋａｂａｔ番号付けにおける、２６３Ｑ及び４５９Ｌ改変、例えば、Ｔ２６３Ｑ及びＭ４５９Ｌ）を含み、更に、ＥＵ番号付けにおける、３０７及び／又は３０８に改変（例えば、３０７Ｆ又は３０８Ｐ）を含み、（Ｋａｂａｔ番号付けにおける、３２６及び／又は３２７の改変、例えば、３２６Ｆ又は３０８Ｐを含み）、改変は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソーム中で）下で、重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトＣＨ２アミノ酸配列をコードし、少なくとも１つの改変を、アミノ酸残基間、ＥＵ番号付けにおける、位置２５２と２５７との間に（即ち、少なくとも１つの改変を、Ｋａｂａｔ番号付けにおけるアミノ酸位置２６５と２７０との間に）含み、その改変は、酸性環境下で（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソーム中で）、ＦｃＲｎに対するヒトＣＨ２アミノ酸配列の親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトＣＨ２アミノ酸配列をコードし、少なくとも１つの改変を、アミノ酸残基間、位置３０７と３１１との間に（即ち、少なくとも１つの改変を、Ｋａｂａｔ番号付けにおけるアミノ酸位置３２６と３３０との間に）含み、その改変は、酸性環境下で（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソーム中で）、ＦｃＲｎに対するＣＨ２アミノ酸配列の親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトＣＨ３アミノ酸配列をコードし、ヒトＣＨ３アミノ酸配列は、少なくとも１つの改変を、アミノ酸残基間、ＥＵ番号付けにおける、位置４３３と４３６との間に（即ち、少なくとも１つの改変を、Ｋａｂａｔ番号付けにおけるアミノ酸残基間、位置４６４と４６７との間に）含み、その改変は、酸性環境下で（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソーム中で）、ＦｃＲｎに対するＣＨ３アミノ酸配列の親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ番号付けにおけるＭ４２８Ｌ（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４５９）、ＥＵ番号付けにおけるＮ４３４Ｓ（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４６５）、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ番号付けにおけるＭ４２８Ｌ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＭ４５９Ｌ）、ＥＵ番号付けにおけるＶ２５９Ｉ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＶ２７２Ｉ）、ＥＵ番号付けにおけるＶ３０８Ｆ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＶ３２７）、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ番号付けにおけるＮ４３４Ａ突然変異（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＮ４６５Ａ突然変異）を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ番号付けにおけるＭ２５２Ｙ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＭ２６５Ｙ）、ＥＵ番号付けにおけるＳ２５４Ｔ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＳ２６７Ｔ）、ＥＵ番号付けにおけるＴ２５６Ｅ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＴ２６９Ｅ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ番号付けにおけるＴ２５０Ｑ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＴ２６３Ｑ）、ＥＵ番号付けにおけるＭ４２８Ｌ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＭ４５９Ｌ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ番号付けにおけるＨ４３３Ｋ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＨ４６４Ｋ）、ＥＵ番号付けにおけるＮ４３４Ｙ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＮ４６５Ｙ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
様々な実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、目的の抗原で免疫を与えられ、目的の抗原に特異的に結合している抗原結合タンパク質を発現しているＢ細胞が同定され、重鎖定常領域を含むポリペプチド中の軽鎖可変ドメインをコードする、Ｂ細胞の核酸配列が同定され、判定される。軽鎖可変ドメインの核酸配列は、好適な細胞内に発現し、好適な発現ベクターを採用しており、重鎖定常核酸配列は、１、２、３個、又はそれ超の一時変異を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域はヒトのものであり、重鎖配列はヒトのものである。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＣＨ２又はＣＨ３における改変を含み、その改変により、酸性環境下で（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソーム中で）、重鎖定常領域アミノ酸配列の、ＦｃＲｎに対する親和性が増加する。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードし、そのヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、ＥＵ番号付けにおける位置２５０（Ｋａｂａｔ番号付けにおける２６３）に改変（例えば、Ｅ又はＱ）を含み、ＥＵ番号付けにおける位置２５０（Ｋａｂａｔ番号付けにおける２６３）及びＥＵ番号付けにおける位置４２８（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４５９）に改変（例えば、Ｌ又はＦ）を含み、ＥＵ番号付けにおける位置２５２（Ｋａｂａｔ番号付けにおける２６５）に改変（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ又はＴ）を含み、ＥＵ番号付けにおける位置２５４（Ｋａｂａｔ番号付けにおける２６７）に改変（例えば、Ｓ又はＴ）を含み、及びＥＵ番号付けにおける位置２５６（Ｋａｂａｔ番号付けにおける２６９）に改変（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／Ｄ、又はＴ）を含み、あるいは、ＥＵ番号付けにおける位置４２８（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４５９）に改変を含み、及び／又はＥＵ番号付けにおける位置４３３（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４６４）に改変（例えば、Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑ又はＫ）を含み、及び／又はＥＵ番号付けにおける位置４３４（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４６５）に改変（例えば、Ｈ／Ｆ又はＹ）を含み、あるいは、ＥＵ番号付けにおける位置２５０（Ｋａｂａｔ番号付けにおける２６３）に改変を含み、及び／又はＥＵ番号付けにおける位置４２８（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４５９）に改変を含み、又はＥＵ番号付けにおける位置３０７（Ｋａｂａｔ番号付けにおける３２６）に改変を含み、又はＥＵ番号付けにおける位置３０８（Ｋａｂａｔ番号付けにおける３２７）に改変（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）を含み、更にＥＵ番号付けにおける位置４３４（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４６５）に改変を含む。１つの実施形態では、改変は、ＥＵ番号付けにおける４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）と４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変を含み、（４５９、例えば、Ｍ４５９Ｌ、及びＫａｂａｔ番号付けで４６５Ｓ（例えば、Ｎ４６５Ｓ）の改変を含み、ＥＵ番号付けにおける、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変を含み、（４５９Ｌ、２７２Ｉ（例えば、Ｖ２７２Ｉ）、及びＫａｂａｔ番号付けで３２７Ｆ（例えば、Ｖ３２７Ｆ）の改変を含み、ＥＵ番号付けにおける、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）改変を含み、及び４３４（例えば、４３４Ｙ）改変を含み、及びＫａｂａｔ番号付けにおける（４６４Ｋ（例えば、Ｈ４６４Ｋ）改変を含み、４６５（例えば、４６５Ｙ）改変を含み、ＥＵ番号付けにおける、２５２、２５４、及び２５６の位置に（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）改変を含み、Ｋａｂａｔ番号付けで（２６５、２６７、２６９（例えば、２６５Ｙ、２６７Ｔ、及び２６９Ｅ）に、改変を含み、ＥＵ番号付けにおける、２５０Ｑ及び４２８Ｌ改変（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）、（Ｋａｂａｔ番号付けにおける、２６３Ｑ及び４５９Ｌ改変、例えば、Ｔ２６３Ｑ及びＭ４５９Ｌ）を含み、更に、ＥＵ番号付けにおける、３０７及び／又は３０８に改変（例えば、３０７Ｆ又は３０８Ｐ）を含み、（Ｋａｂａｔ番号付けにおける、３２６及び／又は３２７の改変、例えば、３２６Ｆ又は３０８Ｐを含み）、改変は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソーム中で）下で、重鎖定常領域アミノ酸配列のＦｃＲｎへの親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトＣＨ２アミノ酸配列をコードし、少なくとも１つの改変を、アミノ酸残基間、ＥＵ番号付けにおける、位置２５２と２５７との間に（即ち、少なくとも１つの改変を、Ｋａｂａｔ番号付けにおけるアミノ酸位置２６５と２７０との間に）含み、その改変は、酸性環境下で（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソーム中で）、ＦｃＲｎに対するヒトＣＨ２アミノ酸配列の親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトＣＨ２アミノ酸配列をコードし、少なくとも１つの改変を、アミノ酸残基間、位置３０７と３１１との間に（即ち、少なくとも１つの改変を、Ｋａｂａｔ番号付けにおけるアミノ酸位置３２６と３３０との間に）含み、その改変は、酸性環境下で（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソーム中で）、ＦｃＲｎに対するＣＨ２アミノ酸配列の親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトＣＨ３アミノ酸配列をコードし、ヒトＣＨ３アミノ酸配列は、少なくとも１つの改変を、アミノ酸残基間、ＥＵ番号付けにおける、位置４３３と４３６との間に（即ち、少なくとも１つの改変を、Ｋａｂａｔ番号付けにおけるアミノ酸残基間、位置４６４と４６７との間に）含み、その改変は、酸性環境下で（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソーム中で）、ＦｃＲｎに対するＣＨ３アミノ酸配列の親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ番号付けにおけるＭ４２８Ｌ（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４５９）、ＥＵ番号付けにおけるＮ４３４Ｓ（Ｋａｂａｔ番号付けにおける４６５）、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ番号付けにおけるＭ４２８Ｌ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＭ４５９Ｌ）、ＥＵ番号付けにおけるＶ２５９Ｉ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＶ２７２Ｉ）、ＥＵ番号付けにおけるＶ３０８Ｆ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＶ３２７）、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ番号付けにおけるＮ４３４Ａ突然変異（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＮ４６５Ａ突然変異）を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ番号付けにおけるＭ２５２Ｙ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＭ２６５Ｙ）、ＥＵ番号付けにおけるＳ２５４Ｔ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＳ２６７Ｔ）、ＥＵ番号付けにおけるＴ２５６Ｅ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＴ２６９Ｅ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ番号付けにおけるＴ２５０Ｑ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＴ２６３Ｑ）、ＥＵ番号付けにおけるＭ４２８Ｌ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＭ４５９Ｌ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ＥＵ番号付けにおけるＨ４３３Ｋ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＨ４６４Ｋ）、ＥＵ番号付けにおけるＮ４３４Ｙ（Ｋａｂａｔ番号付けにおけるＮ４６５Ｙ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
様々な実施形態では、Ｆｃドメインは改変され（非ヒト動物において；あるいは、単一のポリペプチド内で、本明細書に記載の非ヒト動物の重鎖に由来する軽鎖可変ドメインと、重鎖定常配列（例えば、ヒト配列）とを一緒に発現させる発現系において）、変更されたＦｃ受容体結合を有するようになっており、これがエフェクターの機能に影響を及ぼす。一部の実施形態では、Ｆｃドメインを含む、遺伝子操作された重鎖定常領域（ＣＨ）は、キメラである。したがって、キメラＣＨ領域は、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプに由来するＣＨドメインを組み合わせる。例えば、キメラＣＨ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、又はヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部又は全部と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、又はヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部又は全部を含む。一部の実施形態では、キメラＣＨ領域は、キメラヒンジ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する、「ロワーヒンジ」配列（ＥＵ番号付けによる位置２２８から２３６にあるアミノ酸残基；Ｋａｂａｔ番号付けによる、位置２４１から２４９にあるアミノ酸残基）と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する、「アッパーヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けによる位置２１６から２２７にあるアミノ酸残基；Ｋａｂａｔ番号付けによる、位置２２６から２４０にあるアミノ酸残基）を含み得る。一部の実施形態では、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４のアッパーヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトＩｇＧ２のロワーヒンジに由来するアミノ酸残基とを含む。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ含有タンパク質の（例えば抗体の）所望の薬物力学的特性に影響を及ぼすことなく、正常なＦｃエフェクターの機能の全部若しくは一部を活性化するか、又はそれらを１つも活性化させないように、遺伝子操作され得る。キメラＣＨ領域を含み、かつ変更されたエフェクター機能を有するタンパク質の例については、２０１４年１月３１日出願の、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／１４１７５号を参照のこと（なお、同文献はその全体が、本明細書に組み込まれる）。
様々な態様では、非ヒト動物のゲノムが改変され、（ｉ）欠失する又は非機能性にする（例えば、ヌクレオチド配列（例えば、外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して）免疫グロブリン遺伝子座中で、全部、若しくは実質的に全部の内因性の機能性免疫グロブリンＶＨ、Ｄ、ＪＨ遺伝子セグメントの非機能性再配列、又は反転を介する；（ｉｉ）再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含ませる、遺伝子セグメントは、内因性の遺伝子座に存在する、（即ち、遺伝子セグメントは、野生型の非ヒト動物にある）。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、ゲノムに組み込まれる（例えば、そのゲノム内の内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座とは異なる遺伝子座で、又はその内因性の遺伝子座内で、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内で、なお、内因性の遺伝子座は、ゲノム内の別の場所に配置したり、移動したりする）。一部の実施形態では、例えば、すべての内因性の機能性重鎖Ｖ、Ｄ、又はＪ遺伝子セグメントの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上が欠失されたり、あるいは非機能性にされる。一部の実施形態では、例えば、内因性の機能性重鎖Ｖ、Ｄ、又はＪ遺伝子セグメントの、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が欠失されたり、非機能性にされる。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒト又は非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、内因性の機能性ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ重鎖可変遺伝子セグメントと、内因性の機能性軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントとを、欠失する又は非機能性にする改変を含み；かつ（ｉ）再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、例えば、２つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）、及び（ｉｉ）再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＬ）と、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＬ）と、をコードするヌクレオチド配列を、内因性の免疫グロブリン遺伝子座で含む（例えば、それぞれが、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、例えば、少なくともインタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座）又はゲノム内のどこか他の場所で統合して含む（例えば、ゲノム内の、内因性の免疫グロブリン遺伝子座とは異なる遺伝子座内、又はその内因性の遺伝子座内、例えば、免疫グロブリン可変領域遺伝子座内で、なお、内因性の遺伝子座は、ゲノム内で、別の場所に配置したり、移動したりできる）。一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、内因性のＶＨ、Ｄ、及びＪＨ重鎖可変遺伝子セグメントと、内因性の軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントとを、欠失する又は非機能性にする改変を含み；かつ（ｉ）再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、例えば、２つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）を含み、かつ（ｉｉ）１つ以上の再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）を内因性の場所（例えば、内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座）に含むか、又はゲノム内の他の場所で統合して含む（例えば、ゲノム内の内因性の免疫グロブリン鎖遺伝子座とは異なる遺伝子座、又はその内因性の遺伝子座内、例えば、免疫グロブリン可変領域遺伝子座内、なお、内因性の遺伝子座は、ゲノム内で、別の場所に配置したり、移動したりできる）。一部の実施形態では、例えば、すべての内因性の機能性重鎖Ｖ、Ｄ、又はＪ遺伝子セグメントの約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上が欠失されたり、あるいは非機能性にされる。一部の実施形態では、例えば、内因性の機能性重鎖Ｖ、Ｄ、又はＪ遺伝子セグメントの、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が欠失されたり、非機能性にされる。一部の実施形態では、再配列されていない、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、それぞれが、機能性ＣＨ１ドメイン、例えば、少なくともインタクトなＩｇμ遺伝子と、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つとを含む配列を含む、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、ヒト又は非ヒトの重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、例えば、２つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）が、ヒト又は非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列（ただしκ又はλのいずれか）に作動可能に連結される。
様々な実施形態は、ハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座によってコードされている免疫グロブリンハイブリッド鎖由来の軽鎖可変ドメインを含む。軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、本明細書に記載の、遺伝子改変非ヒト動物を作る際に使用され得、そのような動物により発現され得、かつ／又は、そのような動物により生成される（又は、そのような動物により多様化された配列に由来する）抗体内に存在するアミノ酸をコードし得る。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ヒトＶκドメインである。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、マウスＶκドメインである。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ラットＶκドメインである。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ヒトＶλドメインである。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、マウスＶλドメインである。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ラットＶλドメインである。
様々な実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物によって生成された軽鎖可変ドメインは、１つ以上のマウス又はヒトの免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントによってコードされる。一部の実施形態では、１つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約３メガベースのマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。一部の実施形態では、１つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、少なくとも１３７個のＶκ遺伝子セグメント、少なくとも５個のＪκ遺伝子セグメント、又は、マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座のそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約１．５メガベースのヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。ある具体的な実施形態では、１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の近位反復（免疫グロブリンκ定常領域について）を含む。一部の実施形態では、１つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の、少なくとも４０個のＶκ遺伝子セグメント、少なくとも５個のＪκ遺伝子セグメント、又はそれらの組合せを含む。
ある特定の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）遺伝子セグメントと再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖（ＪＬ）遺伝子セグメントとをコードするヌクレオチド配列を更に含む。一部の実施形態では、再配列されていない軽鎖Ｖ遺伝子セグメントと再配列されていない軽鎖Ｊ遺伝子セグメントとをコードするヌクレオチド配列は、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖ（ＶＬ）遺伝子セグメントと、再配列されていないヒト免疫グロブリンＪ（ＪＬ）遺伝子セグメントとは、内因性の齧歯類遺伝子座で、齧歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に、作動可能に連結され；例えば、それぞれが、機能性ＣＨ１ドメインをコードする、ＩｇＭ又はＩｇＧ重鎖定常領域遺伝子に、作動可能に連結される。
様々な実施形態では、再配列されていないヒト可変領域遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶκ遺伝子セグメント）は、抗体のヒト可変ドメインを再配置し、コードすることが可能である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、内因性のＶＬ遺伝子セグメントを含まない。一部の実施形態では、非ヒト動物によって発現された、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３からなる群から選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、遺伝子改変非ヒト動物は、すべての機能性ヒトＶκ遺伝子を発現する。一部の実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ７−３、Ｖκ２−４、Ｖκ１−５、及びＶκ１−６を含む。一部の実施形態では、Ｖκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−７、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ２−１０、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ２−１４、Ｖκ３−１５、及びＶκ１−１６を含む。一部の実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ１−１７、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ３−２０、Ｖκ６−２１、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ３−２５、Ｖκ２−２６、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、及びＶκ２−３０を含む。一部の実施形態では、ヒトＶκ遺伝子セグメントは、Ｖκ３−３１、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ３−３４、Ｖκ１−３５、Ｖκ２−３６、Ｖκ１−３７、Ｖκ２−３８、Ｖκ１−３９、及びＶκ２−４０を含む。様々な実施形態では、非ヒト動物は、５個のヒトＪκ遺伝子セグメント、例えば、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、及びＪκ５遺伝子セグメントを含む。ある具体的な実施形態では、Ｖκ遺伝子セグメントは、隣接するヒト免疫グロブリンκ遺伝子セグメントを、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に、Ｖκ４−１からＶκ２−４０まで含み、かつＪκ遺伝子セグメントは、隣接する遺伝子セグメントを、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に、Ｊκ１からＪκ５まで含む。一部の実施形態では、非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、２個のヒトＶＬ遺伝子セグメント、Ｖκ１−３９及びＶκ３−２０を含む。一部の実施形態では、１つ以上の（例えば、２、３、４、５個、又はそれより多くの）ヒトＶＬ遺伝子セグメントと、２つ以上のヒトＪＬ遺伝子セグメントとが、内因性の重鎖遺伝子座に存在している。一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、機能性λ軽鎖遺伝子座を含む、マウスである。他の実施形態では、マウスは、非機能性λ軽鎖遺伝子座を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウス又はラット）は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を発現し（即ち、再配列された軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を生成し）、かつ、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３からなる群から選択されるＶκ遺伝子によってコードされている１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上等の軽鎖可変ドメインを発現する。
様々な実施形態では、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、対応するヒト生殖系軽鎖可変遺伝子セグメントによってコードされていない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。一部の実施形態では、本明細書に記載の軽鎖可変ドメインは、中性のｐＨと比べて、酸性のｐＨで、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、又は少なくとも約３０倍の解離半減期（ｔ１／２）の減少を示す。一部の実施形態では、中性のｐＨでの値と比べて酸性のｐＨでのｔ１／２が減少しているのは、約３０倍以上である。一部の実施形態では、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は少なくとも、有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの１つ）は、対応するヒト生殖系ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされている少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンによる置換を含む。一部の実施形態では、置換は、１個、２個、３個、又は４個のコドン分（例えば、３個又は４個のコドン）の置換である。一部の実施形態では、置換は、ＣＤＲ３コドン内である。一部の実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９又はヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントであり、かつヒトＶκ１−３９又はヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントは、対応するヒト生殖系ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされている、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンによる置換を含む。一部の実施形態では、ヒトＶκ１−３９又はヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントは、３個又は４個のヒスチジンコドンによる置換を含む。一部の実施形態では、３個又は４個の置換は、ＣＤＲ３領域内で起こる。一部の実施形態では、置換は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの３個の非ヒスチジンコドンの置換であり、その置換は、ヒスチジンを、位置１０６、１０８、及び１１１で発現するように設計されている。一部の実施形態では、置換は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントの４個の非ヒスチジンコドンの置換であり、その置換は、ヒスチジンを、位置１０５、１０６、１０８、及び１１１で発現するように設計されている（例えば、米国特許出願公開第２０１３−０２４７２３４Ａ１号及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１３８６８０号を参照のこと。なお、両文献は参照により、本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、置換は、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの３個の非ヒスチジンコドンの置換であり、その置換は、ヒスチジンを、位置１０５、１０６、及び１０９で発現するように設計されている。更に別の追加的実施形態では、置換は、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントの４個の非ヒスチジンコドンの置換であり、その置換は、ヒスチジンを、位置１０５、１０６、１０７、及び１０９で発現するように設計されている。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、例えば、２つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）を含み、ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントの少なくとも１つ）は、対応するヒト生殖系ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされている少なくとも１つのヒスチジンコドンを含む。様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、遺伝子改変免疫グロブリン座を含む非ヒト動物は、目的の抗原によって刺激されると、ヒトＶＬ遺伝子セグメント由来のアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を発現するが、その抗原結合タンパク質は、少なくとも１つのヒスチジン残基を、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つ）に導入された少なくとも１つのヒスチジンコドンによってコードされているアミノ酸位置に保持している。一部の実施形態では、動物は、抗原に反応して抗原結合タンパク質の集団を発現し、集団内のそのすべての抗原結合タンパク質は、（ａ）ヒトＶＬ遺伝子セグメントとＪＬ遺伝子セグメントとの再配列に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、及び（ｂ）再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされている（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントの１つによってコードされている）ヒト軽鎖可変ドメインを含む、免疫グロブリン軽鎖を含み、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントの少なくとも１つ）は、対応するヒト生殖系ＶＬ遺伝子セグメントによってコードされていない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。
様々な実施形態が、軽鎖定常領域配列を含む。一部の実施形態では、例えば、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列が、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む場合）は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列が再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である場合、又は第２のヌクレオチド配列が有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント、例えば、２つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む場合）は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。様々な実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）に作動可能に連結される軽鎖定常領域配列は、ヒトκ軽鎖定常領域配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）に作動可能に連結された軽鎖定常領域配列は、マウスκ軽鎖定常領域配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）に作動可能に連結された軽鎖定常領域配列は、ラットκ軽鎖定常領域配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）に作動可能に連結された軽鎖定常領域配列は、ヒトλ軽鎖定常領域配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）に作動可能に連結された軽鎖定常領域配列は、マウスλ軽鎖定常領域配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）に作動可能に連結された軽鎖定常領域配列は、ラットλ軽鎖定常領域配列である。
様々な態様では、再配列された軽鎖可変ドメインをコードする、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物が提供され（例えば、免疫グロブリン遺伝子座が、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列又は制約された（限られた）数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む場合には）、再配列された軽鎖可変ドメインは、軽鎖Ｊセグメント（ＪＬ）配列に作動可能に連結された、軽鎖可変（ＶＬ）配列を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）は、非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウス又はラットの定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）は、ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。
別の１つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物と、そのような動物を作製するための方法が提供されるが、その動物は、機能性ユニバーサル軽鎖（「ＵＬＣ」）免疫グロブリン遺伝子座を含むか（例えば、米国特許出願公開第２０１１−０１９５４５４Ａ１号、同第２０１２−００２１４０９Ａ１号、同第２０１２−０１９２３００Ａ１号、同第２０１３−００４５４９２Ａ１号、同第２０１３−０１８５８２１Ａ１号、及び同第２０１３−０３０２８３６Ａ１号を参照のこと。なお、これらは、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）又は、機能性デュアル軽鎖（「ＤＬＣ」）免疫グロブリン遺伝子座を含む（例えば、米国特許出願公開第２０１３−０１９８８８０Ａ１号を参照のこと。なお、これはその全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、そのような動物は、ヒト又は非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメント（即ち、ＩｇＭ、ＩｇＧ等に作動可能に連結されたヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント）を更に含む。本明細書に記載の実施形態において使われる場合、ＵＬＣ又はＤＬＣは、その多様性が、主として体細胞突然変異のプロセスの結果生じる抗体可変鎖配列を生成するためにも使用され得るが、それにより、その抗原結合能力が、ポストゲノムの事象から利益を得る抗体可変鎖配列を明らかにする。
再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含有する高多様性ハイブリッド鎖遺伝子座、及び再配列された軽鎖可変領域配列を含有する低多様性軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製、使用する方法
本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物を作製、使用する方法を提供する。再配列したヒト軽鎖可変領域核酸配列（又は有限数、例えば２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数、のヒトＶＬ遺伝子セグメント）を、非ヒト動物ゲノム内の免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列と作動可能な連結状態で配置する方法を提供する。様々な実施形態では、定常領域核酸配列は、ヒト又は非ヒトであり、非ヒト動物は、齧歯類である。様々な実施形態では、方法は、非ヒト動物を作製する方法を含み、非ヒト動物は、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座、例えば、ヒト若しくは非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、１つ以上のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント、例えば４０個のヒトＶκ遺伝子セグメント及び５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン遺伝子座を更に含む。様々な態様では、方法は、例えば遺伝子導入技術を用いて、非ヒト動物、例えば齧歯類の生殖系内に上述の配列を配置することを含み、遺伝子導入技術には、例えば、宿主胚、生殖細胞（例えば卵母細胞）を有する改変多能性又は全能性ドナー細胞（例えばＥＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞）を用いることなどを含む。したがって、実施形態には、非ヒトハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座、例えば、非ヒト生殖細胞ゲノム内の免疫グロブリン鎖遺伝子座を含み、この免疫グロブリン鎖遺伝子座は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含み、定常領域遺伝子配列は、非ヒト配列、ヒト配列、又はそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）は、内因性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、内因性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域遺伝子配列である。
様々な態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、（ａ）内因性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、（ｂ）ゲノム内に、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを配置することと、を含む。そのような一態様では、非ヒト動物生殖系内の再配列された軽鎖遺伝子配列から単一の免疫グロブリン軽鎖を発現する（又は有限数、例えば２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数、のヒトＶＬ遺伝子セグメントから免疫グロブリン軽鎖を発現する）非ヒト動物を作製する方法を提供するものであり、方法は、非ヒト動物の遺伝子を改変し、その抗体発現成熟Ｂ細胞集団全体が軽鎖を発現するようにするステップを含み、この軽鎖は、（ｉ）単一のＶＬ遺伝子セグメント、及び（ｉｉ）単一のＪＬ遺伝子セグメント又は（ｉｉｉ）有限数（例えば２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数）のヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来する。いくつかの態様では、方法は、内因性軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を不活性化するか、又は本明細書に記載の単一の再配列された軽鎖遺伝子（若しくは有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）と交換することを含む。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、そのような方法は、（ａ）内因性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、（ｂ）ゲノム内に、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを配置することと、を含む。一部の実施形態では、実質的にすべての内因性機能性ＶＨ、Ｄ及びＪＨ遺伝子セグメントは、非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失されるか、又は（例えば、ヌクレオチド配列（例えば、免疫グロブリン遺伝子座内の外因性ヌクレオチド配列）の挿入を介して、又は内因性ＶＨ、Ｄ、ＪＨセグメントの非機能性再配列又は転化を介して）非機能性にされる。一部の実施形態では、方法は、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを内因性位置（例えば、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座）に挿入することを含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ゲノム内の他の場所に存在する（例えば、内因性免疫グロブリン鎖遺伝子座とは異なるゲノム内の遺伝子座、又はその内因性遺伝子座内、例えば、内因性遺伝子座がゲノム内の異なる位置に位置するか又は移動している免疫グロブリン可変遺伝子座内）。一部の実施形態では、例えば、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上のすべての内因性機能性Ｖ、Ｄ、若しくはＪ遺伝子セグメントは、欠失されるか又は非機能性にされる。一部の実施形態では、例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の内因性機能性重鎖Ｖ、Ｄ、若しくはＪ遺伝子セグメントは、欠失されるか又は非機能性にされる。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、（ａ）内因性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントを欠失するか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、（ｂ）内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内に、再配列されたヒト若しくは非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（即ち、再配列された軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列）、又は有限数（例えば２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数）のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメントを配置することと、を含み、ヌクレオチド配列（又は有限数のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系ゲノム内に存在する。一部の実施形態では、再配列したヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列したヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）は、マウス又はラットのκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列したヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）は、ヒトのκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列したヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列したヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）は、マウス又はラットのλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列したヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）は、ヒトのλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、有限数のヒト又は非ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、１つ以上のヒト又は非ヒトＪＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結している。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、（ａ）（ｉ）内因性機能性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメント、並びに（ｉｉ）内因性機能性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、（ｂ）ゲノム内に、（ｉ）再配列された軽鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（例えば、第１のヌクレオチド配列は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であるか、又は第１のヌクレオチド配列は、有限数、例えば、２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数、のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含有し、第１のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している）、及び（ｉｉ）ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再配列したヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である）を配置することと、を含み、第２のヌクレオチド配列は、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結しており、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含み、例えば、少なくともインタクトなＩｇμ遺伝子、並びにインタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及びインタクトなＩｇα遺伝子のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系ゲノム内に存在する。一部の実施形態では、再配列した軽鎖可変領域をコードする（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含有する）第１のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列した軽鎖可変領域をコードする（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含有する）第１のヌクレオチド配列は、マウス又はラットのκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列した軽鎖可変ドメインをコードする（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含有する）第１のヌクレオチド配列は、ヒトのκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列した軽鎖可変ドメインをコードする（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含有する）第１のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列した軽鎖可変ドメインをコードする（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含有する）第１のヌクレオチド配列は、マウス又はラットのλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列した軽鎖可変ドメインをコードする（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含有する）第１のヌクレオチド配列は、ヒトのλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヒトの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはκ軽鎖可変ドメインである。したがって、一部の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、λ軽鎖可変ドメインである。したがって、一部の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウス又はラットの重鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇα遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇε遺伝子を含む。
非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、（ａ）（ｉ）内因性免疫グロブリン重鎖ＶＨ、Ｄ、及び／又はＪＨ遺伝子セグメント、並びに（ｉｉ）内因性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、（ｂ）（ｉ）再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（若しくは有限数、例えば、２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数、のヒトＶＬ遺伝子セグメント）を軽鎖遺伝子座に配置し（再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（若しくは有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）は、軽鎖Ｊ遺伝子セグメント（ＪＬ）配列に作動可能に連結した軽鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＬ）配列を含む）、（ｉｉ）１つ以上の再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（例えば、４０個のヒトＶκ遺伝子セグメント及び少なくとも１つのヒトＪκ遺伝子セグメント）を重鎖遺伝子座に配置することと、を含み、これにより、遺伝子セグメントが、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含むヒト若しくは非ヒト重鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結するようにし、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇα遺伝子を含む。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、対応するヒト生殖系軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。
いくつかの態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、（ａ）内因性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、（ｂ）非ヒト動物ゲノム内に、再配列されたヒト若しくは非ヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）を、軽鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結した状態で配置することと、を含む。
様々な実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類、例えばマウス、ラット又はハムスターである。一部の実施形態では、この齧歯類はマウスである。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、ラット又はマウス定常領域、例えば、ラット又はマウスＣκ定常領域である。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、（ａ）（ｉ）内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及び／又はＪ遺伝子セグメント、及び（ｉｉ）内因性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、（ｂ）非ヒト動物ゲノム内に、（ｉ）再配列された軽鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（例えば、第１のヌクレオチド配列は、再配列されたヒト若しくは非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であるか、又は第１のヌクレオチド配列は、有限数、例えば、２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数、のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含有し、第１のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している）を配置し、（ｉｉ）ヒト若しくは非ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である）を配置することと、を含み、第２のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇα遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇε遺伝子を含む。
様々な実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類、例えばマウス、ラット又はハムスターである。一部の実施形態では、この齧歯類はマウスである。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、ラット又はマウス定常領域、例えば、ラット又はマウスＣκ定常領域である。一部の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含むマウス又はラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含むヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、（ａ）（ｉ）内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及び／又はＪ遺伝子セグメント、並びに（ｉｉ）内因性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、（ｂ）非ヒト動物ゲノム内に、（ｉ）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列された軽鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の対立遺伝子を配置し（例えば、第１のヌクレオチド配列は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であるか、又は第１のヌクレオチド配列は、有限数、例えば２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数、のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含有する）、（ｉｉ）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む第２の対立遺伝子を配置すること（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である）と、を含む。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座）及び改変免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、（ａ）内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及び／又はＪ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、（ｂ）非ヒト動物の内因性重鎖遺伝子座内に、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを重鎖定常領域と作動可能に連結した状態で配置することであって、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＶκ及びヒトＪκ遺伝子セグメントを含む、配置することと、（ｃ）内因性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及び／又はＪ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、（ｄ）非ヒト動物の内因性軽鎖遺伝子座内に、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数、例えば２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数、のヒトＶＬ遺伝子セグメント）を軽鎖定常領域と作動可能に連結した状態で配置することと、を含み、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）は、再配列されたヒトＶκＪκ配列（又は２、３、若しくは４ヒトＶＬ遺伝子セグメント）を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒトＶκＪκ配列は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列（例えば、配列番号１に示す）である。一部の実施形態では、再配列されたヒトＶκＪκ配列は、ヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列（例えば、配列番号２に示す）である。一部の実施形態では、有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメント及びヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇα遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇε遺伝子を含む。
様々な実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類、例えばマウス、ラット又はハムスターである。一部の実施形態では、この齧歯類はマウスである。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、ラット又はマウス定常領域、例えば、ラット又はマウスＣκ定常領域である。一部の実施形態では、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含むマウス又はラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含むヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインのそれぞれをコードするヌクレオチド配列を含むヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、（ａ）（ｉ）内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及び／又はＪ遺伝子セグメント、並びに（ｉｉ）内因性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、（ｂ）非ヒト動物ゲノム内に、（ｉ）再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数、例えば２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数、のヒトＶＬ遺伝子セグメント）を軽鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結した状態で配置し、（ｉｉ）１つ以上のヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した状態で配置することと、を含み、重鎖定常領域核酸配列は、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇα遺伝子を含む。
様々な実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類、例えばマウス、ラット又はハムスターである。一部の実施形態では、この齧歯類はマウスである。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、ラット又はマウス定常領域、例えば、ラット又はマウスＣκ定常領域である。
別の態様では、再配列された軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を提供する。一部の実施形態では、核酸配列は、ヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメントに由来する。一部の実施形態では、核酸配列は、ヒト生殖系Ｖκセグメント及びヒト生殖系Ｊκセグメントに由来する。一部の実施形態では、ヒトＶκセグメントは、ヒト集団内の観察された変異体に対応する。様々な実施形態では、核酸配列は、Ｖκ１−５、Ｖκ１−６、Ｖκ１−８、Ｖκ１−９、Ｖκ１−１２、Ｖκ１−１３、Ｖκ１−１６、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−２２、Ｖκ１−２７、Ｖκ１−３２、Ｖκ１−３３、Ｖκ１−３５、Ｖκ１−３７、Ｖκ１−３９、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ１Ｄ−２２、Ｖκ１Ｄ−２７、Ｖκ１Ｄ−３２、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３５、Ｖκ１Ｄ−３７、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ１Ｄ−４２、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ１−ＮＬ１、Ｖκ２−４、Ｖκ２−１０、Ｖκ２−１４、Ｖκ２−１８、Ｖκ２−１９、Ｖκ２−２３、Ｖκ２−２４、Ｖκ２−２６、Ｖκ２−２８、Ｖκ２−２９、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−３６、Ｖκ２−３８、Ｖκ２−４０、Ｖκ２Ｄ−１０、Ｖκ２Ｄ−１４、Ｖκ２Ｄ−１８、Ｖκ２Ｄ−１９、Ｖκ２Ｄ−２３、Ｖκ２Ｄ−２４、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ２Ｄ−３６、Ｖκ２Ｄ−３８、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ３−７、Ｖκ３−１１、Ｖκ３−１５、Ｖκ３−２０、Ｖκ３−２５、Ｖκ３−３１、Ｖκ３−３４、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−７、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ３Ｄ−２５、Ｖκ３Ｄ−３１、Ｖκ３Ｄ−３４、Ｖκ３−ＮＬ１、Ｖκ３−ＮＬ２、Ｖκ３−ＮＬ３、Ｖκ３−ＮＬ４、Ｖκ３−ＮＬ５、Ｖκ４−１、Ｖκ５−２、Ｖκ６−２１、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ６Ｄ−４１、及びＶκ７−３、並びにそれらの多形変異体からなる群から選択されるヒトＶκ遺伝子を含む。一部の実施形態では、核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列から選択されるヒト又は非ヒト動物重鎖定常領域遺伝子配列を更に含む。特定の実施形態では、核酸は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３をコードするヌクレオチド配列を含む定常領域遺伝子配列を含む。様々な実施形態では、核酸配列は、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、Ｊκ５、及びそれらの多形変異体からなる群から選択されるヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。
別の態様では、本明細書に記載の再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（例えば、再配列されていないヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含有するヌクレオチド配列）を含む核酸構築物を提供する。一部の実施形態では、核酸構築物は、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列がヒト若しくは非ヒト動物重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結するように設計し、ヒト若しくは非ヒト動物重鎖定常領域遺伝子配列は、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇα遺伝子を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結した、２、３、４つ又はそれ超の再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含有する。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇα遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇε遺伝子を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は標的ベクターである。一部の実施形態では、標的ベクターは、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、又は両方を含み、Ａｄａｍ６ａ／６ｂ遺伝子の欠失に関連する受精問題を防止するようにする（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６４２，８３５号を参照）。一部の実施形態では、Ａｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子は、再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメントの転写単位の５’上流に配置される。一部の実施形態では、標的ベクターは、組み換え部位に隣接する選択カセットを含む。一部の実施形態では、標的ベクターは、１つ以上の部位特異的組み換え部位（例えば、ｌｏｘＰ又はＦＲＴ部位）を含む。
別の態様では、重鎖可変領域アミノ酸配列とは独立に抗原を結合することができる軽鎖可変領域（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ）アミノ酸配列を得る方法を提供し、方法は、（ａ）本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物を、目的の抗原により免疫化することであって（例えば、遺伝子改変動物は、そのゲノムが、重鎖定常領域遺伝子と作動可能に連結している、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント、及び軽鎖定常領域遺伝子と作動可能に連結している、再配列されたヒト若しくは非ヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）を含む）、非ヒト動物は、抗原に対する免疫応答を開始する、免疫化することと、（ｂ）遺伝子改変非ヒト動物の細胞（例えば、Ｂ細胞）からの抗原を特異的に結合する軽鎖可変ドメインの再配列された軽鎖（ＶＪ）核酸配列を得ることと、を含む。様々な実施形態では、そのような方法により生成した軽鎖可変領域を提供する。
いくつかの態様では、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ）ドメインをコードする核酸配列を得る方法は、（ａ）任意選択で、目的の抗原又はその免疫原により非ヒト動物を免疫化することであって、非ヒト動物は、そのゲノム内に、（ｉ）１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結した、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含み、例えばインタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇα遺伝子を含む）、及び（ｉｉ）軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結した、再配列されたヒト若しくは非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）を含む、免疫化することと、（ｂ）非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、（ｃ）免疫化した非ヒト動物から、目的の抗原を結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、（ｄ）細胞から、目的の抗原を結合する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン）をコードする核酸配列を得ることと、を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、マウス又はラット重鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、遺伝子改変遺伝子座によって発現された再配列された軽鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対し自己反応性ではない、即ち、非免疫原性である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム内に１つ以上の（例えば、６、１６、３０又は４０個の）再配列されていないヒトＶＬ遺伝子セグメント及び１つ以上の（例えば、５個の）ヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む。一部の特定の実施形態では、再配列されていないヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、単離ステップ（ｃ）は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又はフローサイトメトリーを介して実行する。一部の実施形態では、目的の抗原を結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。一部の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞を含む。一部の実施形態では、方法は、リンパ球を癌細胞と融合するステップ（ｃ）’を更に含む。一部の実施形態では、この癌細胞は骨髄腫細胞である。
したがって、様々な態様では、重鎖可変ドメインとは独立に抗原を結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ）をコードする核酸配列を得る方法を提供し、方法は、（ａ）任意選択で、目的の抗原又はその免疫原により非ヒト動物を免疫化することであって、非ヒト動物は、そのゲノム内に（ｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト若しくは非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）、及び（ｉｉ）重鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結している、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）を含む、免疫化することと、（ｂ）非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、（ｃ）免疫化した非ヒト動物から、抗原を結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、（ｄ）細胞から、抗原を結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン）をコードする核酸配列を得ることと、を含む。
一部の実施形態では、単離ステップ（ｃ）は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又はフローサイトメトリーを介して実行する。一部の実施形態では、抗原を結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞を含む。一部の実施形態では、方法は、リンパ球を癌細胞と融合するステップ（ｃ）’を更に含む。特定の実施形態では、この癌細胞は骨髄腫細胞である。一部の実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合させる。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトκ配列又はヒトλ配列である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、マウスκ配列又はマウスλ配列である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ラットκ配列又はラットλ配列である。一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含むヒト配列であり、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇα遺伝子を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含むマウス又はラット配列であり、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇα遺伝子を含む。一部の実施形態では、（ｄ）の核酸配列は、動物ゲノム内の再配列されていないＶＬ遺伝子セグメントに由来する１つ以上のヒスチジンコドンの置換又は挿入を含む。
いくつかの態様では、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ）をコードする核酸配列を得る方法を提供し、方法は、（ａ）任意選択で、目的の抗原により本明細書に記載の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を免疫化することであって、非ヒト動物は、そのゲノム内に、軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）、及び１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇα遺伝子を含む、免疫化することと、（ｂ）非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、（ｃ）免疫化した非ヒト動物からリンパ球（例えば、Ｂ細胞）を収集することと、（ｄ）ハイブリドーマ細胞を生成するためにリンパ球と骨髄腫細胞とを融合することと、（ｅ）ハイブリドーマ細胞から、抗原を結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン）をコードする核酸配列を得ることと、を含む。
別の態様では、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ）アミノ酸配列を得る方法を提供し、方法は、（ａ）任意選択で、目的の抗原により本明細書に記載の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を免疫化することであって、非ヒト動物は、そのゲノム内に、（ｉ）再配列された軽鎖可変ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列（即ち、第１のヌクレオチド配列は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であるか、又は第１のヌクレオチド配列は、有限数、例えば２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数、のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含有し、第１のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している）、及び（ｉｉ）ヒト若しくは非ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（即ち、第２のヌクレオチド配列は、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列であり、第２のヌクレオチド配列は、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結しており、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇα遺伝子を含む）を含む、免疫化することと、（ｂ）非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、（ｃ）免疫化した非ヒト動物からリンパ球（例えば、Ｂ細胞）を収集することと、（ｄ）ハイブリドーマ細胞を生成するためにリンパ球と骨髄腫細胞とを融合することと、（ｅ）ハイブリドーマ細胞から、抗原を結合することができる軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸配列を得ることと、を含む。
別の態様では、免疫グロブリンハイブリッド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ）核酸配列を得る方法を提供し、方法は、（ａ）任意選択で、目的の抗原により本明細書に記載の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を免疫化することであって、非ヒト動物は、そのゲノム内に、（ｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列（又は有限数、例えば２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数、のヒトＶＬ遺伝子セグメント）、及び（ｉｉ）１つ以上の（例えば、６、１６、３０、４０若しくはそれ超の）再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）を含む、免疫化することと、（ｂ）非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、（ｃ）重鎖可変領域とは独立に抗原を結合するＶＬ／ＣＨｘＵＬＣアミノ酸配列を発現する免疫化非ヒト動物からリンパ球（例えば、Ｂ細胞）を同定することと、（ｄ）（ｃ）のリンパ球から（ｃ）のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣアミノ酸配列をコードする核酸配列をクローニングすることと、を含む。
追加の態様では、本明細書に記載の方法のいずれかにより入手可能な遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を提供する。様々な実施形態では、本明細書に記載の方法により生成した軽鎖可変領域、及びそのような軽鎖可変領域をコードする核酸配列も提供する。
いくつかの態様では、非ヒト動物の生殖細胞系ゲノム内の免疫グロブリン重鎖（例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座）及び軽鎖遺伝子座を提供し、前記軽鎖遺伝子座は、（１）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）を含み、前記重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座）は、（２）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列していないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、重鎖定常領域遺伝子配列は、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇα遺伝子を含む。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウス又はラット軽鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖可変領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖可変領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、マウス又はラット軽鎖可変領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇα遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇε遺伝子を含む。
様々な実施形態では、有限数のヒト又は非ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、２つのヒト又は非ヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２つのヒト又は非ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、１つ以上、又は５つのヒト又は非ヒトＪＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結している。一部の実施形態では、有限数のヒト又は非ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、２つのＶκ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、２つのＶκ遺伝子セグメントは、１つ以上、又は５つのＪκ遺伝子セグメントに作動可能に連結している。
抗原結合タンパク質
追加の態様は、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物により作製した抗原結合タンパク質（例えば抗体）を含む。同様に、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物に由来するか若しくはこれにより生成した（即ち、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントから発現した）軽鎖可変領域（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ）配列を有する抗原結合タンパク質（例えば、組み換え抗体）も提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９又は１０−１０未満の親和性（ＫＤ）で、目的の抗原を特異的に結合することができる免疫グロブリン軽鎖を含む。一部の実施形態では、方法により生成した免疫グロブリン軽鎖は、重鎖可変領域の不在下、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、又は１０−１０未満の親和性（ＫＤ）で、目的の抗原を特異的に結合することができる。
様々な実施形態では、本明細書に記載のように生成した軽鎖可変ドメインは、標的分子（「Ｔ」）を特異的に結合する。１つの実施形態では、標的分子は、あらゆるタンパク質、ポリペプチド、又は活性若しくは細胞外濃度を減衰、低減若しくは除去することが望ましい他の巨大分子である。多くの例では、軽鎖可変領域が結合する標的分子は、タンパク質又はポリペプチド（即ち、「標的タンパク質」）である。しかし、標的分子（「Ｔ」）が、炭水化物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、リポ多糖、又は軽鎖可変領域が結合する他の非タンパク質ポリマー若しくは分子である実施形態も提供する。様々な実施形態では、Ｔは、細胞表面発現標的タンパク質又は可溶性標的タンパク質とすることができる。抗原結合分子による標的結合は、細胞外又は細胞表面の状況で生じさせることができる。しかし、一部の実施形態では、抗原結合分子は、細胞内部、例えば、小胞体、ゴルジ、エンドソーム、リソソームなどの細胞内成分内で標的分子を結合する。細胞表面発現標的分子の例には、細胞表面発現受容体、膜結合リガンド、イオンチャンネル、及び細胞膜に付着若しくは会合する細胞外部分を有するあらゆる他の単量体若しくは多量体ポリペプチド成分を含む。
別の態様では、重鎖可変ドメインとは独立に抗原を結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む抗原結合タンパク質を作製する方法を提供する。そのような方法は、（ａ）任意選択で、エピトープ若しくはその免疫原性部分を含む抗原により遺伝子改変非ヒト動物を免疫化することであって、非ヒト動物は、そのゲノム内に、（ｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト軽鎖可変領域核酸配列（若しくは有限数、例えば、２つ以上であるが野生型ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数、のヒトＶＬ遺伝子セグメント）、及び（ｉｉ）免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）を含む、免疫化することと、（ｂ）非ヒト動物にエピトープ又はその免疫原性部分への免疫応答を開始させることと、（ｃ）非ヒト動物から、エピトープ若しくはその免疫原性部分を特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、及び／又は（ｄ）（ｃ）の細胞から、エピトープ又はその免疫原性部分を特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を得ることと、（ｅ）ヒト重鎖定常領域核酸配列に融合した発現構築物内、例えば、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含むヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列内で（ｄ）の核酸配列を用いることと、を含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇα遺伝子を含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト軽鎖ＶＬ又はＪＬ遺伝子セグメントの少なくとも１つは、対応するヒト生殖細胞系軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない、１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。一部の実施形態では、再配列されたヒト軽鎖可変領域核酸配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントの少なくとも１つ）は、対応するヒト生殖系軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。一部の実施形態では、エピトープは、細胞表面受容体に由来する。
一部の実施形態では、ヒト軽鎖ＶＬ又はＪＬ遺伝子セグメントの少なくとも１つは、対応するヒト生殖細胞系軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない１つ以上のヒスチジンコドンをコードする。
本明細書全体を通して明らかであるように、一部の実施形態では、提供するタンパク質可変ドメインは、免疫グロブリン型可変ドメインであるか又はそれらを含む（例えば、免疫グロブリン可変ドメインであるか又はそれらを含む）。一部の実施形態では、提供するタンパク質可変ドメインは、重鎖可変ドメインであるか又はそれらを含む。一部の実施形態では、提供するタンパク質可変ドメインは、軽鎖可変ドメインであるか又はそれらを含む。
当業者は、本明細書を読めば、様々な技術のいずれかを利用して、重鎖可変ドメインとは独立に抗原を結合することができる軽鎖を含む抗原結合タンパク質を生成、発生及び／又は構築できることは容易に了解するであろう。本明細書に記載する一部の実施形態では、生成する抗原結合タンパク質は、図１９に示す抗原結合タンパク質を含む。これらの抗原結合タンパク質は、本明細書に記載する非ヒト動物内で生成される可変ドメインを含み、これらの可変ドメインをコードする配列を含む核酸配列は、細胞株内で同時発現させ、抗原結合タンパク質を生成する。
遺伝子改変非ヒト細胞及び胚
様々な態様では、様々なゲノム改変を含む非ヒト動物に由来する多能性細胞、誘導多能性、又は全能性幹細胞を本明細書で提供する。一部の実施形態では、多能性又は全能性細胞は、非ヒト動物に由来する。一部の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類、例えばマウス、ラット又はハムスターである。一部の実施形態では、この齧歯類はマウスである。特定の実施形態において、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。一部の実施形態では、多能性細胞は、そのゲノム内に、（ｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト若しくは非ヒト軽鎖可変領域核酸配列（又は有限数、例えば２つ以上であるが野生型ヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント未満の数、のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、及び（ｉｉ）重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、１つ以上の再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座）を含み、重鎖定常領域核酸配列は、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇα遺伝子を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇα遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇε遺伝子を含む。特定の実施形態では、多能性、誘導多能性、又は全能性幹細胞は、マウス又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。一部の実施形態では、多能性、誘導多能性、又は全能性幹細胞は、ＸＸ核型又はＸＹ核型を有する。
本明細書に記載の遺伝子改変、例えば、前核注入によって細胞に導入される改変、を含有する核を含む細胞も提供する。別の態様では、本明細書に記載の非ヒト動物細胞に由来するハイブリドーマ又はクアドローマを提供する。一部の実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット又はハムスターなどの齧歯類である。
別の態様では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物から単離したリンパ球を提供する。一部の実施形態では、リンパ球は、Ｂ細胞であり、Ｂ細胞は、ヒト若しくは非ヒト動物（例えば、マウス若しくはラット）軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト若しくは非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）を含む免疫グロブリンゲノム遺伝子座を含む。一部の実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト若しくは非ヒト動物（例えば、マウス若しくはラット）重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリンゲノム遺伝子座を更に含み、重鎖定常領域遺伝子配列は、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇα遺伝子を含む。一部の実施形態では、Ｂ細胞は抗体を生成することができ、本明細書に記載の再配列された軽鎖可変ドメインは、重鎖又は軽鎖定常ドメインに作動可能に連結している。
別の態様では、非ヒト動物胚は、そのゲノムが、（ｉ）１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座）であって、各定常領域核酸配列が機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む、例えば、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇε遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇα遺伝子を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座、及び（ｉｉ）軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト若しくは非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒト若しくは非ヒトＶＬ遺伝子セグメント）を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む細胞を含む。一部の実施形態では、定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含むハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結しており、重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇα遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇε遺伝子を含む。
様々な実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、再配列された軽鎖可変ドメイン（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含有するヌクレオチド配列）並びに複数の軽鎖Ｖセグメント（及び複数の軽鎖Ｊセグメント）をコードするヌクレオチド配列に由来する抗体のレパートリー（例えば、ＩｇＧレパートリー）を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変遺伝子座は、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９又は１０−１０未満の親和性（ＫＤ）で目的の抗原を特異的に結合することができる免疫グロブリン軽鎖を含む抗体集団を生成する。一部の実施形態では、遺伝子改変遺伝子座によって発現した免疫グロブリン軽鎖は、重鎖可変領域の不在下、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９又は１０−１０未満の親和性（ＫＤ）で目的の抗原を特異的に結合することができる。
様々な実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変は、非ヒト動物の受精に影響しない（例えば、その全体が参照により組み込まれる米国特許第８，６４２，８３５号を参照）。一部の実施形態では、重鎖遺伝子座、例えば、ハイブリッド鎖遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、又は両方を含み、遺伝子改変は、内因性Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、又は両方の発現及び／又は機能に影響しない。一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物ゲノムは、重鎖遺伝子座又はハイブリッド鎖遺伝子座の外側の位置でゲノム内に組み込まれたＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、又は両方を含む。一部の実施形態では、Ａｄａｍ６ａ及び／又はＡｄａｍ６ｂ遺伝子は、再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントの５’上流に配置される。一部の実施形態では、Ａｄａｍ６ａ及び／又はＡｄａｍ６ｂ遺伝子は、再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントの３’下流に配置される。一部の実施形態では、重鎖遺伝子座は、機能性異所性マウスＡｄａｍ６遺伝子を含む。
軽鎖可変領域又はドメイン（例えば、軽鎖ＣＤＲ３）をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドに選択的圧力を適用する本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物の可能性は、様々な可変軽鎖遺伝子配列に適用することができる。言い換えれば、本明細書で開示する再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、重鎖遺伝子座の１つ以上の遺伝子改変、及び／又は軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の重鎖遺伝子座への挿入と対合させることができる。このことは、例えば、本明細書に記載の（コモン若しくはユニバーサル軽鎖可変ドメインに制限された）非ヒト動物と、１つ以上の重鎖コード遺伝子座内に遺伝子改変を含む非ヒト動物とを接合すること（即ち、単一の改変を有する動物との交雑又は交雑受精）によって達成することができる。再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（若しくは有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）を有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物、及び１つ以上の重鎖遺伝子座改変は、同時若しくは連続的な多数の遺伝子座の標的化遺伝子交換によっても（例えば、胚性幹細胞内での連続的な組み換えにより）生成することができる。具体的に記さない限り、重鎖遺伝子座における改変の種別又は方法のいずれも本明細書に記載の実施形態を制限するものではない。そうではなく、本明細書に記載の実施形態によって促進される選択的圧力は、重鎖抗原結合配列として発現、機能させることができるほぼすべてのポリヌクレオチド配列に適用することができ、これにより、適合抗体可変領域の進化を駆動する。
例えば、本明細書に記載するように、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（又は有限数のヒトＶＬ遺伝子セグメント）を有する免疫グロブリン遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物は、（例えば、交雑又は多数の遺伝子標的化方策を介して）ＷＯ２０１１／０７２２０４、ＷＯ２０１１／１６３３１１、ＷＯ２０１１／１６３３１４、ＷＯ２０１２／０１８７６４、ＷＯ２０１２／１４１７９８、ＷＯ２０１３／０２２７８２、ＷＯ２０１３／０５９２３０、ＷＯ２０１３／０９６１４２、ＷＯ２０１３／１１６６０９、ＷＯ２０１３／１８７９５３に記載の１つ以上の改変を更に含むことができる。これらの刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、軽鎖遺伝子座（例えば、ヒト若しくは非ヒトκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列された軽鎖可変ドメイン遺伝子配列、若しくは２つのＶＬ遺伝子セグメント）内に再配列された軽鎖可変領域核酸配列、又は有限数のＶＬ遺伝子セグメントを含む遺伝子改変マウスは、ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座）を含む遺伝子改変マウスと交差される（例えば、マウス重鎖遺伝子座に挿入される４０個のヒトＶκ遺伝子及びすべてのヒトＪκ遺伝子、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２−００９６５７２Ａ１号を参照）。特定の実施形態では、軽鎖遺伝子座（例えば、ヒト若しくは非ヒトκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、若しくは２つのＶＬ遺伝子セグメント）内に再配列された軽鎖可変領域核酸配列、又は有限数のＶＬ遺伝子セグメントを含む遺伝子改変マウスは、１つ以上のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座（例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座）を含む遺伝子改変マウスに交差される。得られたマウスは、ゲノム軽鎖可変配列に由来する可変重鎖を有するＩｇκ＋Ｂ細胞を生成することができるため、特異的標的に結合するＶκドメインの同定を促進する。
以下の非限定的な実施例は、当業者に、本明細書に記載の非ヒト動物の作製及び使用方法の完全な開示及び記載を提供し、その理解を助けるために記載され、発明者が発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものでもなく、以下の実験が実施されたすべて又は唯一の実験であることを示すことを意図するものでもない。実施例は、当業者に既知である従来の方法（分子クローニング技術など）の詳細な記載を含まない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを保つための努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。他に示さない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はそれに近い。
実施例１．修飾免疫グロブリン遺伝子座を有する非ヒト動物の生成
この実施例は、（ａ）免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列（例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座）に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座；ならびに（ｂ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含有する非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座を操作する例示的な方法を示す。
軽鎖遺伝子セグメントによる免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築物
野生型マウス重鎖及びヒトκ軽鎖遺伝子座は、図１に示されている。ヒト軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメント（例えば、Ｖκ及びＪκ）をマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に挿入するための例示的な標的ベクターの構築物を以下に記載する。図２は、相同的組み換えを用いてマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に挿入するための複数のヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを含有する４つの例示的な標的ベクターを示す。
種々の標的構築物を、マウスゲノム細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーを改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子組み換え技術を用いて作製した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．，Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．，Ｇａｌｅ，Ｎ．Ｗ．，Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ，Ａ．Ｎ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．，Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，Ｗ．Ｔ．，Ａｄａｍｓ，Ｎ．Ｃ．，Ｒｏｊａｓ，Ｊ．，Ｙａｓｅｎｃｈａｋ，Ｊ．，Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｓｋｙ，Ｒ．，Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｅｌｓａｓｓｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｅｓａｕ，Ｌ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊ．Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｓｕ，Ｈ．，Ｘｕｅ，Ｙ．，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｍ．Ｇ．，Ｎｏｇｕｅｒａ，Ｉ．，Ｔｏｒｒｅｓ，Ｒ．，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｌ．Ｅ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ．，ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．（２００３）。Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１，６５２〜６５９を参照）。マウスＢＡＣ ＤＮＡは、再配列されていないヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントのその後の挿入のための内因性ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるために、相同的組み換えによって修飾され得る。あるいは、内因性ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントは、無傷に保持され、不活性化されて、機能的可変領域を形成する内因性遺伝子セグメントの組み換えが阻害されてもよい（例えば、遺伝子セグメントの逆転又は破壊によって）。
遺伝子改変マウス、及びその作製方法（そのゲノムが、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリンハイブリッド鎖遺伝子座を含有する）は、米国特許公開公報第２０１２−００９６５７２Ａ１号に開示され、そのすべては参照により本明細書に組み込まれる。図２に示すように、４個の標的ベクターは、当該技術分野で認識されている標準分子技術を用いて、４０個のヒトＶκ遺伝子セグメント及び５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを、不活性な重鎖遺伝子座（例えば、欠失した内因性ＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメント）及び／又は軽鎖定常領域、例えば、非ヒト軽鎖定常領域、例えば、内因性非ヒト軽鎖遺伝子座において、作動可能に連結された単一の再配列されたヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含む軽鎖遺伝子座を含む非ヒトＥＳ細胞に徐々に挿入するように操作された。表１は、マウス免疫グロブリン重鎖座に挿入するための様々なヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを含有する各標的ベクターに含まれるヒトＤＮＡのサイズを示す。任意の数のヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメントを標的ベクターに含めることができる。図２に示される例示的な標的ベクターは、生殖系列ヒトκ軽鎖遺伝子座の近位コンティグにおいて天然に見出されるヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを含む（図１）。４個の標的ベクターのすべてを連続して挿入した後に得られた内因性重鎖遺伝子座を図２の下部に示す。
Figure 2018508224
同様のアプローチを用いて、マウス重鎖定常領域と関連してヒト軽鎖可変ドメインの他の組合せを構築することができる。さらなる軽鎖可変ドメインは、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントに誘導され得る。様々な数のヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントを含むヒトＤＮＡを含む例示的な標的ベクターを図３に示す。
ヒトλ軽鎖遺伝子座は、１，０００ｋｂを超え、可変（Ｖ）又は結合（Ｊ）セグメントをコードする８０個を超える遺伝子を含む。ヒトλ軽鎖遺伝子座の７０個のＶλ遺伝子セグメントのうち、３０〜３８個は、公開された報告書によれば、機能性遺伝子セグメントであるようである。７０個のＶλ配列は３つのクラスターに配列されており、これらのすべては異なるＶ遺伝子ファミリーグループの異なるメンバー（クラスターＡ、Ｂ及びＣ）を含む。ヒトλ軽鎖遺伝子座内で、観察されたすべてのＶλドメインの半分超が、遺伝子セグメント１−４０、１−４４、２−８、２−１４及び３−２１によってコードされている。７個のＪλ遺伝子セグメントが存在し、そのうちの４個のみが概して機能的なＪλ遺伝子セグメントＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３及びＪλ７と見なされる。いくつかの対立遺伝子では、第５のＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対は、疑遺伝子（Ｃλ６）であると報告されている。本明細書に記載されているように、ハイブリッド重鎖遺伝子座への複数のヒトＪλ遺伝子セグメントの組み込みは、デノボ合成によって構築され得る。このようにして、複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを生殖細胞系列の形態で含有するゲノム断片を複数のヒトＶλ遺伝子セグメントで操作し、重鎖定常領域とからんで正常なＶ−Ｊ組み換えを可能にする。複数のＪλ遺伝子セグメントを含む例示的な標的ベクターを図３に示す（標的ベクター１’）。
軽鎖可変ドメインを重鎖定常領域と結合させることは、非ヒト動物におけるヒトＶＬ領域との独特のＶＬ結合タンパク質を生成するための多様性の潜在的に豊富な供給源を表す。マウスにおけるヒトλ軽鎖遺伝子座（又は、上記のヒトκ遺伝子座）の多様性を利用することにより、独特のハイブリッド重鎖の操作がもたらされ、遺伝子組み換えされた動物の免疫レパートリーへの別次元のタンパク質の結合及び治療薬の生成のための次世代プラットフォームとしてそれらの後続の使用をもたらす。
上記の標的ベクターを用いて、ＶＬ結合タンパク質（即ち、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結されたヒト軽鎖遺伝子セグメント）を発現するキメラマウスを生成するための作製した修飾ＥＳ細胞にマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を電気穿孔する。再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメントの挿入を含有するＥＳ細胞は、定量ＰＣＲアッセイ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって同定される（Ｌｉｅ ａｎｄ Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，１９９８．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：４３〜４８）。特定のプライマーセット及びプローブは、ヒト配列及び関連する選択カセットの挿入、マウス重鎖配列の損失ならびに内因性重鎖遺伝子座に隣接するマウス配列の保持のために設計される。
ヒト軽鎖遺伝子セグメントの挿入によって導入された任意の望ましくない選択カセットを除去するために、重鎖定常領域配列に作動可能に連結されたヒト軽鎖遺伝子セグメント（例えば、Ｖκ及びＪκ）を有するＥＳ細胞は、リコンビナーゼを発現する構築物でトランスフェクトされ得る。選択的に、選択カセットは、リコンビナーゼを発現するマウスへの繁殖によって除去することができる（例えば、米国特許第６，７７４，２７９号）。任意選択で、選択カセットはマウスに保持される。
上記の標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により８細胞期マウス胚に導入する（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号、及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，Ｗ．Ｔ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．，Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．，Ｈｉｃｋｅｙ，Ｊ．Ｆ．，Ｅｓｃａｒａｖａｇｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｓａｕ，Ｌ．，Ｄｏｒｅ，Ａ．Ｔ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｓ．，Ａｄａｍｓ，Ｎ．Ｃ．，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｍ．Ｇ．，Ｇａｌｅ，Ｎ．Ｗ．，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．，ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．（２００７）。Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５，９１〜９９を参照）。マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座でヒト軽鎖遺伝子セグメントを独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）（Ｆ０マウスは完全にドナーＥＳ細胞由来である）は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における独特のヒト軽鎖遺伝子セグメントの存在を検出する対立遺伝子アッセイの修飾を用いた遺伝子型同定（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，上記）によって同定される。子犬は遺伝子型が決定され、遺伝子組み換え免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合型又はホモ接合型の子犬が、ＶＬ含有重鎖の発現を特徴付けるために選択される。
ヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメントが内因性重鎖定常領域に作動可能に連結されるように、内因性遺伝子座への４０個の再配列されていないヒトＶκ及び５個のＪκ遺伝子セグメントの挿入を含有するゲノムが免疫グロブリン重鎖対立遺伝子を含むマウスは、ＭＡＩＤ１７１３と称される（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開公報第２０１２−００９６５７２Ａ１を参照）。これを有するマウス及び統合されたマウスＡｄａｍ６遺伝子は、ＭＡＩＤ１９９４と称される（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開公報第２０１３−０２１２７１９Ａ１を参照）。
再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の構築
単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列（例えば、単一の再配列されたヒトＶＬ／ＪＬヌクレオチド配列）のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座への挿入のための例示的な標的ベクターの構築は、以下に記載される。図４は、相同的組み換えを用いてマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に挿入するための単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列を含有する標的ベクターを示す。
遺伝子改変マウス、及びその作製方法（そのゲノムが、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含有する）は、米国特許公開公報第２０１１−０１９５４５４Ａ１号に開示され、そのすべては参照により本明細書に組み込まれる。図４に示すように、標的ベクターは、不活性なマウスκ軽鎖遺伝子座（例えば、欠失した内因性Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメント）ならびに任意に、当該技術分野分野で認識されている標準分子技術を用いたハイブリッド免疫遺伝子座を含むＥＳ細胞への挿入のための単一の再配列されたヒト軽鎖（つまり、再配列されたヒトＶＬ／ＪＬ）を含有するように操作された。単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列は、任意のヒトＶＬ及びヒトＪＬ配列を含み得る。使用することができる適切な例示的な再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列は、再配列されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５ヌクレオチド配列（ＭＡＩＤ１６３３、図５）、再配列されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１ヌクレオチド配列（ＭＡＩＤ１６３５、図５）から誘導されたものを含む。
あるいは、上記のように、一部の実施形態において、マウスは、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントが、重鎖定常領域に作動可能に連結されるように、前記ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座への挿入を含むように操作されてもよい。そのような実施形態では、挿入されたヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントの最適な発現及び使用を達成するために、当業者は、再配列されたヒトＶλＪλヌクレオチド配列のような再配列された配列を使用し得ることを認識する。そのような再配列されたヒトＶλＪλヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域と関連して再配列されたヒトＶλＪλ配列と対になる重鎖定常領域と関連して再配列されたヒトＶλＪλ配列のより良好な能力を提供するだろう。重鎖定常領域と関連して再配列されたヒトＶκＪκ配列は、軽鎖定常領域と関連して再配列されたＶλＪλ配列と効果的に会合することができないかもしれない（米国特許公開公報第２０１２−００９６５７２Ａ１号参照）。したがって、例示的な再配列されたヒトＶλＪλ配列は、再配列されたヒトＶλ２−１４Ｊλ１ヌクレオチド配列を含む。
上記の標的ベクターは、単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列（即ち、マウス軽鎖定常領域に作動可能に連結された単一のヒトＶＬ／ＪＬヌクレオチド配列）によってコードされる軽鎖を発現するキメラマウスを生成するための修飾ＥＳ細胞を作製するために、任意にハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を含み得るマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を電気穿孔するために使用される。単一の再配列されたヒト軽鎖遺伝子ヌクレオチド配列の挿入を含有するＥＳ細胞は、定量ＰＣＲアッセイ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって同定される（Ｌｉｅ ａｎｄ Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，１９９８．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：４３〜４８）。特定のプライマーセット及びプローブは、単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列及び関連する選択カセットの挿入、マウス軽鎖配列の損失ならびに内因性軽鎖遺伝子座に隣接するマウス配列の保持のために設計される。
単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列の挿入によって導入された任意の望ましくない選択カセットを除去するために、単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列を有するＥＳ細胞は、リコンビナーゼを発現する構築物でトランスフェクトされ得る。選択的に、選択カセットは、リコンビナーゼを発現するマウスへの繁殖によって除去することができる（例えば、米国特許第６，７７４，２７９号）。任意選択で、選択カセットはマウスに保持される。
上記の標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により８細胞期マウス胚に導入する（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号、及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，Ｗ．Ｔ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．，Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．，Ｈｉｃｋｅｙ，Ｊ．Ｆ．，Ｅｓｃａｒａｖａｇｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｓａｕ，Ｌ．，Ｄｏｒｅ，Ａ．Ｔ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｓ．，Ａｄａｍｓ，Ｎ．Ｃ．，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｍ．Ｇ．，Ｇａｌｅ，Ｎ．Ｗ．，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．，ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．（２００７）。Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５，９１〜９９を参照）。マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座で単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）（Ｆ０マウスは完全にドナーＥＳ細胞由来である）は、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における独特の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイの修飾を用いた遺伝子型同定（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，上記）によって同定される。子犬は遺伝子型が決定され、遺伝子組み換え免疫グロブリン軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合型又はホモ接合型の子犬が、単一のヒト軽鎖の発現を特徴付けるために選択される。
実施例２．単一の再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列及び複数のヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを含むマウスの特性決定
軽鎖遺伝子座（ＵＬＣマウス：ＭＡＩＤ１６３３、単一の再配列されたヒトＶκ１−３９／Ｊκ５又はＭＡＩＤ１６３５、単一の再配列されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１）における再配列された軽鎖可変領域核酸配列を含むマウスを上記のように生成した。要約すると、ＵＬＣマウスにおいて、すべての内因性機能的軽鎖可変遺伝子セグメントを欠失させ、内因性軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている単一の再配列された軽鎖可変領域核酸配列（例えば、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５又はヒトＶκ３−２０Ｊκ１をコードする配列）で置き換えた。
重鎖遺伝子座（ＫＯＨマウス：ＭＡＩＤ１７１３：４０個のヒトＶκ遺伝子セグメント及び５個のヒトＪκ遺伝子セグメント；ＭＡＩＤ１９９４：４０個のヒトＶκ遺伝子セグメント及び５個のヒトＪκ遺伝子セグメント、ならびに組み込まれたＡｄａｍ６遺伝子）に再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含有する遺伝子操作された重鎖遺伝子座を含むマウスを上記のように生成した。要約すると、ＫＯＨマウスにおいて、すべての内因性機能的重鎖可変遺伝子セグメントが欠失され、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている、４０個の再配列されていないヒトＶκ遺伝子セグメント及び５個の再配列されていないヒトＪκ遺伝子セグメントで置き換えた。
上記のホモ接合型のＵＬＣマウス（ＭＡＩＤ１６３３又はＭＡＩＤ１６３５）をホモ接合型のＫＯＨマウス（ＭＡＩＤ１７１３又はＭＡＩＤ１９９４）マウスに交配して、ＵＬＣ対立遺伝子及びＫＯＨ対立遺伝子についてヘテロ接合型のマウスを産生した。この交配から生成したＦ１ヘテロ接合型のマウスを互いに交配して、各対立遺伝子（ＭＡＩＤ１７１３ＨＯ １６３３ＨＯ、ＭＡＩＤ１７１３ＨＯ １６３５ＨＯ、ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ、又はＭＡＩＤ１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ；「ＫＯＨ×ＵＬＣ」）についてホモ接合型のマウスを得た。このようなマウスは、免疫グロブリンの構造に類似した構造を有するが、そのような結合タンパク質が重鎖可変ドメインを欠くという点で異なるＶＬ結合タンパク質を発現する。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座における遺伝子改変対立遺伝子の存在は、ＴＡＱＭＡＮ（商標）スクリーニング及び上記の特異的なプローブ及びプライマーを用いた核型分析によって確認された。ホモ接合型のＫＯＨ×ＵＬＣマウスは、本明細書に記載されているような再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶκ及びＪκ）のマウス重鎖遺伝子座への挿入、ここで、すべての内因性可変重鎖ＶＤＪ遺伝子セグメントが欠失している、ならびに、マウスκ（κ）軽鎖遺伝子座への単一の再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（ＭＡＩＤ１６３３：再配列されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５；ＭＡＩＤ１６３５：再配列されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１）の挿入、ここで、すべてのマウスＶκ及びＪκ遺伝子が欠失している（図６）、を含む。一部の実施形態では、ＫＯＨ×ＵＬＣマウスは更に、組み込まれたＡｄａｍ６遺伝子を含む。
あるいは、ＵＬＣ対立遺伝子及びＫＯＨ対立遺伝子の両方を含むマウスを生成するために、ＵＬＣ修飾を有するＥＳ細胞又はＫＯＨ修飾を有するＥＳ細胞を、それぞれＫＯＨ又はＵＬＣ標的ベクターで標的化する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）法により８期マウス胚にＥＳ細胞を導入し、実施例３で上記したようにスクリーニングすることにより、両方の修飾を有するＥＳ細胞からマウスを生成する。Ｆ１ヘテロ接合型のマウスを交配し、ホモ接合型のマウスを得る。
すべてのマウスを収容し、特定の病原体のない条件でＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃで交配した。３つのＫＯＨ（ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ １２４２ＨＯ；参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開公報第２０１３−０２１２７１９Ａ１号を参照）マウス（約１１週齢、オス）及び３つのＫＯＨ×ＵＬＣ（ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ、約１２週齢、メス；ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ、約１１週齢、２匹のオス及び１匹のメス）マウスのうちの２つの群を屠殺し、動物から脾臓及び骨髄を採取した。完全ＲＰＭＩ培地（ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム、Ｈｅｐｅｓ、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸及びゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ培地）でフラッシュすることにより、骨髄を大腿骨から集めた。脾臓及び骨髄調製物からの赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液で溶解し、完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した。
フローサイトメトリー
遺伝子改変対立遺伝子から（例えば、軽鎖遺伝子座における再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列の単一コピーを含有する対立遺伝子ならびに重鎖遺伝子座における再配列されていないヒトＶκ及びＪκ遺伝子セグメントを含有する対立遺伝子から）誘導されたＶＬ結合タンパク質を産生するための本明細書に記載の遺伝子改変ホモ接合型「ＫＯＨ×ＵＬＣ」（ＭＡＩＤ１９９４ＨＯ １６３３ＨＯ及びＭＡＩＤ１９９４ＨＯ １６３５ＨＯ）のマウスの能力を試験するために、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を行った。再配列されていないヒトＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント（１９９４ ＨＯ １２４２ ＨＯ）を含むＫＯＨマウス、ならびにマウス重鎖及び軽鎖遺伝子座上の再配列されていないヒト重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスをそれぞれ（ＶＩ３）対照として使用した。
要約すると、１×１０６個の細胞を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）と共に氷上で１０分間インキュベートした後、以下の抗体カクテルで氷上で３０分間標識化した：ＡＰＣ−Ｈ７コンジュゲート抗マウスＣＤ１９（クローン１Ｄ３、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、パシフィックブルーコンジュゲート抗マウスＣＤ３（クローン１７Ａ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇκ（クローン１８７．１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）又は抗マウスＣＤ４３（クローン１Ｂ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥコンジュゲート抗マウスＩｇλ（クローンＲＭＬ−４２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）又は抗マウスｃ−ｋｉｔ（クローン２Ｂ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲート抗マウスＩｇＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＩｇＭ（クローンＩＩ／４１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。染色後、細胞を洗浄し、２％ホルムアルデヒドで固定した。データ取得をＬＳＲＩＩフローサイトメーターで行い、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）で分析した。ゲーティング：全Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ３−）、Ｉｇκ＋Ｂ細胞（Ｉｇκ＋Ｉｇλ−ＣＤ１９＋ＣＤ３−）、Ｉｇλ＋Ｂ細胞（Ｉｇκ−Ｉｇλ＋ＣＤ１９＋ＣＤ３−）。骨髄コンパートメントについての結果を図７〜１０に示す。脾臓コンパートメントについての結果を図１１〜１５に示す。
成熟Ｂリンパ球のみが脾臓及びリンパ節のリンパ濾胞に侵入し、そのため免疫応答に効率的に関与することができる。成熟した、長命のＢリンパ球は、骨髄で生成された短命の前駆体に由来する。成熟プールへの選択は能動的なプロセスであり、脾臓で行われる。脾臓Ｂ細胞の２つの集団が、成熟Ｂ細胞の前駆体として同定されている。１型（Ｔ１）の移行Ｂ細胞は、骨髄からの最近のイミグラントである。それらは、周期的であり、排他的に脾臓の原始卵胞に見出される２型（Ｔ２）の移行Ｂ細胞に発達する。成熟Ｂ細胞は、Ｔ１又はＴ２Ｂ細胞から生成され得る。Ｌｏｄｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９０（１）：７５〜８９，１９９９。
ＦＡＣＳ分析（図７〜１５）は、ＫＯＨ×ＵＬＣマウスが骨髄区画（図７〜８）においてほぼ正常なＢ細胞集団を産生し得ることを示唆した。興味深いことに、ＫＯＨ×ＵＬＣマウスは、骨髄におけるラムダ（λ）発現の欠如を示す（図１０）。
脾臓区画では、ＫＯＨ×ＵＬＣマウスはほぼ正常なＢ細胞集団を産生した（図１１、１２及び１４）。骨髄区画のように、ＫＯＨ×ＵＬＣマウスは、脾臓におけるラムダ（λ）発現の欠如を示した（図１１及び１２）。また、脾臓区画において、ＫＯＨ×ＵＬＣマウスは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ３）マウスと比較して、ほぼ正常な移行及び成熟Ｂ細胞集団を示した（図１３〜１５）。
まとめると、これらのデータは、実施例１に記載の遺伝子改変を有するものなど、本発明により提供されるＫＯＨ×ＵＬＣマウスが健康であり、近野生型Ｂ細胞発生を示すことを示す。更に、このようなマウスは、構造において天然抗体に似ているが、重鎖可変領域配列を欠く結合タンパク質を発現する。
最後に、図１６に示すように、本明細書に記載の遺伝子改変を含むマウスは、抗原１（細胞表面受容体）で免疫化した場合、抗原特異性力価を生成することができた。
実施例３．ＫＯＨ×ＵＬＣマウス由来のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインの抗原結合特性
この実施例は、同種可変ドメイン、例えば、同種ユニバーサル軽鎖可変ドメインとは独立して抗原に検出可能に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ）をコードする核酸配列を得る例示的な方法を示す。同種可変ドメインから独立して抗原に検出可能に結合する例示的なＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインは、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウス）から得られ、その非ヒト動物のゲノムは、重鎖定常領域配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメント（例えば、ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント）を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座（ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座）ならびに軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された再配列された免疫グロブリン軽鎖可変配列（即ち、ユニバーサルな又は共通の軽鎖可変領域）を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。そのような非ヒト動物は、重鎖定常領域に作動可能に連結された免疫グロブリン軽鎖ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ可変ドメイン及び軽鎖定常領域に作動可能に連結された共通の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含有する結合タンパク質を発現し、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ軽鎖は再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメントから誘導され、共通の軽鎖可変ドメインは単一の再配列された軽鎖可変遺伝子配列によってコードされる。
無関係な、例えば非同種ヒトＶＨドメインと対になったときに抗原結合を保持するＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ、具体的にはＶκＯＨｘＵＬＣ免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの調製を行った。ＫＯＨ×ＵＬＣマウスを細胞表面タンパク質（抗原２）で免疫化した。２つのＫＯＨ×ＵＬＣマウス、ＭＡＩＤ１７１２ １６３５（ＫＯＨ×ＵＬＣ：Ｖκ３−２０Ｊκ１）から抗原陽性Ｂ細胞を選別した。抗原２に基づいて細胞を選別し、１５３６個のＢ細胞を収集した。３８４個のＢ細胞を、選別中に判断した「最良の」マウスから処理した。１７６個のＫＯＨ ＶＬドメイン、例えば、Ｖκ／ＣＨｘＵＬＣドメインをＦａｂプラスミドにクローニングした。ヒトＶκ３−２０生殖系列ＵＬＣ配列をコードする配列と共に、１７６個のＫＯＨ ＶＬドメインの１つをコードする個々の配列をＦａｂプラスミドにクローニングした。ＫＯＨ ＶＬ（ＶκＯＨｘＵＬＣ）ドメインをコードする各配列を、重鎖定常領域配列（即ち、ＣＨ１）と作動可能に連結してクローニングし、ＵＬＣ配列を、軽鎖定常κ遺伝子配列と作動可能に連結させて閉じた。一過性トランスフェクションを行って、Ａｇ＋スクリーニングのためのタンパク質を産生した。抗原２結合のスクリーニングを、ＥＬＩＳＡ及びＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によってアッセイした。図１７に示すように、ＥＬＩＳＡによって決定されるように、中性ｐＨで抗原２に１４個のサンプルが結合した。結合は、１４個のＥＬＩＳＡ結合剤のうちの１３個についてＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって確認された。
続いて、２つのＫＯＨ由来のＶＬ（ＶκＯＨｘＵＬＣ）ドメインを選択し、独立してクローニングし、軽鎖定常領域（即ち、Ｃκ）で再フォーマットした。再フォーマットされたＫＯＨ ＶＬ／Ｃκ鎖のそれぞれは、重鎖ＣＨでフォーマットされた非同種ＶＨドメインと独立に対形成され、典型的な抗体構造体を形成した。注目すべきことに、非同種ＶＨドメインは、単一の再配列された重鎖可変領域配列からすべてのＶＨドメインを生成するように遺伝子組み換えされたマウスにおいて生成され、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開公報第２の０１４０２４５４８号を参照、無関係の酵素（抗原３）で免疫化した。再フォーマットされたＶＬドメインを、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）による抗原２結合について試験した。結果を図１８に示す。
図１８に示すように、抗体Ａ及びＢはそれぞれ、Ｃκ定常ドメインと融合した異なるＫＯＨ ＶＬ（ＶκＯＨｘＵＬＣ）を含む免疫グロブリン軽鎖及び無傷なＣＨドメインと融合したＶＨドメインを含む免疫グロブリン重鎖を含む。対照的に、抗体Ｃは、抗体Ａ及びＢと同じ免疫グロブリン重鎖を含むが、抗体Ｃは、Ｃκドメインと融合したＶＨドメインと同種であるＶＬドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を含む。
結果は、単一の再配列された重鎖可変領域から誘導され、抗原３に対して惹起されたＶＨドメインが、同種軽鎖可変ドメインと対になった場合、抗原３への抗原結合が維持されることを示す（抗体Ｃは予想通り抗原３に結合することを示す、図１８を参照）。驚くべきことではないが、同じＶＨドメインが非同種ＫＯＨ ＶＬドメインと対になった場合、抗原３の結合は検出されなかった（図１８）。
対照的に、（１）Ｃκドメイン上に再フォーマットされ、（２）非同種ＶＨドメインと対になるにもかかわらず、抗原２結合は、ＫＯＨ ＶＬ（ＶκＯＨｘＵＬＣ）ドメイン（即ち、抗体Ａ及びＢ ＶＬドメイン）の両方について維持された。
この結果は、ＫＯＨ×ＵＬＣマウスから単離されたＫＯＨ抗体が、１つのＶＬドメイン（即ちＶκドメイン）のみを介して抗原に結合できることを示唆している。これは、ＫＯＨ ＶＬ（ＶκＯＨｘＵＬＣ）ドメインを軽鎖主骨格（即ち、Ｃκ領域）に再フォーマットし、異なる抗原に対して惹起されたＶＨドメインと対になることによって確認される。このような分子は、親ＫＯＨ抗体（即ち、ＶκＯＨｘＵＬＣドメイン）が惹起された抗原への結合を保持することが示された。
まとめると、この実施例は、ＫＯＨ×ＵＬＣマウスが、ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン（例えば、Ｖκ／ＣＨｘＵＬＣ）を介してのみ、即ち同種可変ドメインとは独立に抗原に結合する「抗体様」分子を選択するための頑強なインビボ系を提供することを示す。そのようなマウスは、同種可変ドメインの非存在下で及び／又は非同種可変ドメインと対になった場合に、抗原に結合するＶＬドメイン（Ｖκ／ＣＨｘＵＬＣ又はＶλ／ＣＨｘＵＬＣ）を選択する機会を提供する。本明細書に記載のマウスによって発現されるＶＬ結合タンパク質は、従来の抗体（例えば、ＨＩＶ及びインフルエンザ）を回避するために進化する標的への新規なパラトープ又は結合表面を提供し得る。
実施例４．ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む多重特異性抗原結合タンパク質の作製
この実施例は、ユニバーサル軽鎖と同種である免疫グロブリンハイブリッド鎖から誘導された軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む多重特異性抗原結合タンパク質を作製する例示的な方法を示す。実施例３に示すように、ＫＯＨ ＶＬドメイン、例えばＶκ／ＣＨｘＵＬＣをコードする第１の核酸配列は、非ヒト動物のゲノムにおいて、重鎖定常領域配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメント（例えば、Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメント）を含有する免疫グロブリンハイブリッド鎖遺伝子座ならびに軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された再配列された免疫グロブリン軽鎖可変配列（即ち、ユニバーサルな又は共通の軽鎖可変領域）を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むように、遺伝子改変非ヒト動物から単離される。ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする第２の核酸はまた、非ヒト動物のゲノムにおいて、重鎖定常領域配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメント（例えば、ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント）を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座ならびに軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された再配列された免疫グロブリン軽鎖可変配列（即ち、ユニバーサルな又は共通の軽鎖可変領域）を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むように、遺伝子改変非ヒト動物から単離され得る。あるいは、第２の抗原と結合し、ユニバーサル軽鎖と同種の重鎖可変ＶＨｘＵＬＣドメインをコードする第２の核酸は、ユニバーサル軽鎖（「ＵＬＣ」）、例えば、本明細書に参考により組み込まれる、２０１１−０１９５４５４Ａ１号、米国特許公開公報第２０１２−００２１４０９Ａ１号、米国特許公開公報第２０１２−０１９２３００Ａ１号、米国特許公開公報第２０１３−００４５４９２Ａ１号、米国特許公開公報第２０１３−０１８５８２１Ａ１号、及び米国特許公開公報第２０１３−０３０２８３６Ａ１号を参照、又は、制限された（限定された）免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー（例えば、２以上であり野生型数未満のヒトＶＬ遺伝子セグメント、例えば、二重軽鎖、又は「ＤＬＣ」、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開公報第ＵＳ−２０１３−０１９８８８０−Ａ１号を含む制限された免疫グロブリン軽鎖可セグメントレパートリー）で遺伝子改変非ヒト動物から単離され得る。
第１の抗原と結合する第１のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする第１の核酸配列を含む核酸によりコードされている第１の結合成分は、第２の抗原と結合する第２の可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン又はＶＨ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする核酸配列を含む第２の核酸によってコードされている第２の結合成分と共に細胞において共発現され得、第１及び第２の成分は多重特異性、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質として発現される。例示的な対形成フォーマットは、Ｆｖフォーマット、ｓｃＦｖフォーマット、Ｆａｂフォーマット、ｓｃＦａｂフォーマット、四量体抗体型フォーマットにおいてそれぞれ対となる第１及び第２の結合成分を含み、第１及び第２の結合成分はそれぞれ、ユニバーサル軽鎖と会合する機能的ＣＨ１ドメインを含む重鎖、又は四量体型抗体フォーマットであり、第１又は第２の結合成分の１つは、機能的ＣＨ１ドメインを含む重鎖であり、軽鎖として第１又は第２の結合成分の他方と会合している。
再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含むＫＯＨ×ＵＬＣマウスを抗原Ａ、多価高分子量タンパク質で免疫化して、抗原Ａに特異的なＶκ／ＣＨｘＵＬＣ可変ドメインを形成した。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２０１１−０１９５４５４Ａ１号、米国特許公開公報第２０１２−００２１４０９Ａ１号、米国特許公開公報第２０１２−０１９２３００Ａ１号、米国特許公開公報第２０１３−００４５４９２Ａ１号、米国特許公開公報第２０１３−０１８５８２１Ａ１号、及び米国特許公開公報第２０１３−０３０２８３６Ａ１号に記載されている、再配列されていないヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを含むＵＬＣマウスを、抗原Ｂに特異的なＶＨｘＵＬＣ可変ドメインを形成するために、単量体低分子量タンパク質である抗原Ｂで免疫化した。
抗原Ａ又は抗原Ｂに結合することができる抗原結合タンパク質を発現するＢ細胞を、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５８２，２９８号に記載されているようにＫＯＨ×ＵＬＣ又はＵＬＣマウスからそれぞれ選別した。この研究で使用したＫＯＨ×ＵＬＣ及びＵＬＣマウスの両方を、ヒトＪκ１遺伝子セグメントで再配列されたヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む再配列された免疫グロブリン軽鎖によってコードされているＵＬＣで遺伝子改変した。
要約すると、赤血球を、溶解してその後採取した脾細胞をペレット化することによって除去した。再懸濁した脾細胞を、最初にヒトＩｇＧ、ＦＩＴＣ−抗−ｍＦｃ、及びビオチンで標識した抗原Ａ又はビオチンで標識した抗原Ｂ（必要に応じて）のカクテルで１時間インキュベートした。染色した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いでヒト及びラットＩｇＧ、ＡＰＣ−抗−ｍＩｇＭ及びＳＡ−ＰＥのカクテルで１時間染色した。染色した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ（Ｓｏｎｙ）でのフローサイトメトリーで分析した。各ＩｇＧ陽性、ＩｇＭ陰性及び抗原陽性Ｂ細胞を選別し、３８４ウェルプレート上の別個のウェルに播種した。これらのＢ細胞からの抗体遺伝子のＲＴ−ＰＣＲは、Ｗａｎｇら（２０００）（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４４：２１７〜２２５）の記載方法に従って実施された。
要約すると、各単一Ｂ細胞についてのｃＤＮＡを、逆転写（ＲＴ）を介して合成した。抗原Ａで免疫化したＫＯＨｘＵＬＣマウスからのＶκＯＨｘＵＬＣ領域ＤＮＡ配列を、ヒトκ鎖可変領域リーダー配列に特異的な５’縮重プライマー及びマウス重鎖定常領域に特異的な３’プライマーを用いてＰＣＲにより増幅してアンプリコンを形成した。次いで、アンプリコンを、ヒトκ可変領域配列のフレームワーク１に特異的な５’縮重プライマーセット及びマウス重鎖定常領域に特異的な入れ子３’プライマーを用いてＰＣＲにより再度増幅した。ＶＫＯＨＸＵＬＣ ＰＣＲ生成物を、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及び再配列されたＶκ３−２０Ｊκ１から誘導されたユニバーサル軽鎖の発現カセットを含有する第１のＳａｐＩ線状抗体ベクターにクローニングした。抗原Ｂで免疫化したＵＬＣマウスからの重鎖可変領域ＤＮＡ配列を、ヒトＩｇＧ重鎖可変領域リーダー配列に特異的な５’縮重プライマー及びマウス重鎖定常領域に特異的な３’プライマーを用いてＰＣＲにより増幅してアンプリコンを形成した。次いで、アンプリコンを、ヒトＩｇＧ重鎖可変領域配列のフレームワーク１に特異的な５’縮重プライマーセット及びマウス重鎖定常領域に特異的な入れ子３’プライマーを用いてＰＣＲにより再度増幅した。ＶＨ／ＣＨｘＵＬＣ ＰＣＲ生成物を、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む第２のＳａｐＩ線状抗体ベクターにクローニングした。
ヒトκ定常遺伝子に作動可能に連結された再配列されたＶκ３−２０Ｊκ１配列から誘導されたユニバーサル軽鎖をコードする再配列された遺伝子及びヒトＩｇＧ１定常領域配列に作動可能に連結されたＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ配列を有する精製組み換えプラスミドと、ヒトＩｇＧ１定常領域配列に作動可能に連結されたＶＨ／ＣＨｘＵＬＣ配列を有する精製プラスミドとを合わせ、ＣＨＯ宿主細胞株にトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞プールは、１２日間の４００μｇ／ｍｌハイグロマイシンによる選択の後、単離された。ＣＨＯ細胞プールを使用して、図１９Ａに示すような抗原結合タンパク質を産生した。
選択された抗体上清又は精製された抗体についての平衡解離定数（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００又は４０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって決定した。２５℃又は３７℃で、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）を使用して、泳動及びサンプル緩衝液の両方としてすべてのデータを得た。標準的なアミンカップリング化学剤を用いて高密度の抗ヒトＦｃ抗体で予め誘導体化されたＣＭ４又はＣＭ５センサーチップ表面上の粗上清サンプル又は精製ｍＡｂから抗体を捕捉した。捕捉ステップの間に、上清又は精製されたｍＡｂを抗ヒトＦｃ表面に１０μＬ／分の流速で合計０．５〜２．０分間注入した。捕捉ステップに続いて、流速３０μＬ／分で１．５〜３．０分間、３．１２５ｎＭ〜１００ｎＭの濃度範囲の泳動緩衝液若しくは抗原Ａ又は３．０分間、０．３７ｎＭ〜９０ｎＭの濃度範囲の抗原Ｂのいずれかの注入を行った。捕捉された抗体からの抗原の解離を３．０〜５．０分間モニターした。捕捉された抗体は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の短時間の注入によって除去された。すべてのセンサーグラムは、検体センサーグラムからの緩衝液注入からセンサーグラムを差し引くことによって二重に参照され、それにより、捕捉表面からの抗体の解離によって生じるアーチファクトを除去した。各抗体の結合データを、質量輸送制限を伴う１：１結合モデルに適合させた。
ユニバーサル軽鎖抗体の結合親和性を図４に示し、これは、ナノモル範囲のＫＤ値を示す。具体的には、Ｖκ／ＣＨｘＵＬＣ結合成分、ＶＨｘＵＬＣ結合成分、及びユニバーサル軽鎖を含むすべての特異性抗体（Ｂ１〜Ｂ３）は、２５℃で６．８〜９．６ｎＭ（図２０）の範囲の親和性及び３７℃で１００〜１４０ｎＭの範囲でかつ約１分未満のｔ１／２の値（データ示さず）で抗原Ａに結合した。二重特異性抗体はまた、２５℃で約５〜１００ｎＭの範囲の親和性（図２０）及び３７℃で１７４〜１７８ｎＭの範囲の親和性で抗原Ｂに結合した（データ示さず）。
抗原Ａに対して惹起され、それぞれクローニングして二重特異性抗体Ｂ１〜Ｂ３を産生する、二価のＶκ／ＣＨｘＵＬＣドメインと対になるユニバーサル軽鎖可変ドメインを含む対照単一特異性抗体（抗体ＣＫＯＨ１〜ＣＫＯＨ３）は、２５℃で２〜８ｎＭの範囲の親和性で抗原Ａに結合したが、抗原Ｂには結合しなかった（図２０）。理論に縛られることを望まないが、二重特異性抗体（Ｂ１〜Ｂ３）と比較して二価抗体（ＣＫＯＨ１〜ＣＫＯＨ３）との抗原Ａ相互作用について観察された２５℃でのｔ１／２値の差異は、抗原Ａの多価性による可能性があり、これは、主にアビディティ駆動相互作用に寄与し得る。解離定数（ｔ１／２）は、３７℃でＣＫＯＨ１〜ＣＫＯＨ３抗体について測定されなかった。
抗原Ｂに対して惹起され、それぞれクローニングして二重特異性抗体Ｂ１〜Ｂ３を産生する、二価のｈＶＨｘＵＬＣドメインと対になるユニバーサル軽鎖可変度綿を含む対照単一特異性抗体（抗体ＣＶＨ）は、２５℃で５．２ｎＭの親和性及び抗原Ｂが二重特異性抗体から解離したｔ１／２値（２３〜３１分）と同様のｔ１／２値（４１．１分）で抗原Ｂと結合した（図２０）。３７℃での抗原ＢへのＣＶＨの結合は試験しなかった。
アイソタイプ対照抗体（ＣＩ）は、抗原Ａ又は抗原Ｂのいずれにも結合しなかった（図２０）。例えば、ＣＨドメインと融合したＶＨドメインをそれぞれ含む２つの重鎖、及びＣＬドメインと融合したＶＬドメインをそれぞれ含む２つの軽鎖を有する典型的な抗体フォーマットの別の対照抗Ｂ抗体（Ｃ）は、１．４ｎＭの親和性で抗原Ｂに結合し、抗原Ａに結合しなかった（図２０）。
まとめると、この実施例は、ＫＯＨ×ＵＬＣ非ヒト動物において生成されたＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインが、第２の異なるエピトープに特異的な別の可変ドメインと多重特異性フォーマット中で抗原を結合し得ることを示す。
均等物
このように、本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様を説明したので、当業者には様々な変更、修正、及び改変が容易に思い付くことが理解されるべきである。そのような変更、修正、及び改変は、この開示の一部であることが意図されており、本発明の精神及び範囲内にあることが意図されている。したがって、上記の説明及び図面は単なる例示であり、本発明は以下の特許請求の範囲によって詳細に説明される。
特定の排除が本明細書に列挙されているかどうかに関わらず、本発明の任意の実施形態又は態様を特許請求の範囲から明らかに排除し得ることも理解されるべきである。
当業者は、本明細書に記載のアッセイ又は他のプロセスで得られた値に起因する偏差又は誤差の典型的な水準を理解するであろう。
本発明の背景を説明し、その実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物、ウェブサイト及び他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (33)

  1. 第１のエピトープに結合する第１のヒト軽鎖可変ドメインを含む第１の結合成分を含む抗原結合タンパク質であって、
    前記第１のヒト軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインが、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＡからなる群から選択されるアイソタイプを有する第１の免疫グロブリンハイブリッド鎖の第１のヒト軽鎖可変ドメインと同一又はそれに由来し、機能性ＣＨ１ドメインを含み、かつ、再配列されたヒトユニバーサルＶＬ／ＪＬ遺伝子配列に由来する第１のユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種であり、
    任意選択で、前記第１のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインが、重鎖定常ドメイン又は軽鎖定常ドメインに融合され、かつ、
    任意選択で、前記第１のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインが、前記再配列されたヒトユニバーサルＶＬ／ＪＬ遺伝子配列に由来する、第１のユニバーサル軽鎖可変ドメインに関連付けられている、抗原結合タンパク質。
  2. 第２のエピトープに結合する第２のヒト可変ドメインを含む第２の結合成分を更に含み、
    前記第２のヒト可変ドメインが、
    （ｉ）前記再配列されたヒトユニバーサルＶＬ／ＪＬ遺伝子配列に由来する、第２のユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種の、第２のハイブリッドの免疫グロブリン鎖の第２のヒト軽鎖可変ドメインと同一又はそれに由来する、第２のヒト軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン、又は
    （ｉｉ）前記再配列されたヒトユニバーサルＶＬ／ＪＬ遺伝子配列に由来する、第２のユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種の、ヒト重鎖可変ＶＨｘＵＬＣドメインの、いずれか一方であり；
    任意選択で、前記第２のヒト（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ又はＶＨｘＵＬＣ）可変ドメインが、重鎖定常ドメイン又は軽鎖定常ドメインのいずれか一方に融合され、かつ、
    任意選択で、前記第２のヒト（ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ又はＶＨｘＵＬＣ）可変ドメインが、前記再配列されたヒトユニバーサルＶＬ／ＪＬ遺伝子配列に由来する、第２のユニバーサル軽鎖可変ドメインに関係づけられている、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  3. 前記第１の結合成分及び前記第２の結合成分が、ｓｃＦｖ様のフォーマットで対になるように、前記第１の可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン及び前記第２の可変ドメインが、ペプチドリンカーによって連結されている、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
  4. 前記第１の可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン又は前記第２の可変ドメインのうちの一方が、機能性ＣＨ１ドメインに融合され、前記第１の可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン又は前記第２の可変ドメインのうちの他方が、軽鎖定常（ＣＬ）ドメインに融合され、かつ、前記第１の結合成分及び前記第２の結合成分が、Ｆａｂ様のフォーマット又はｓｃＦａｂ様のフォーマットで対になるように、前記ＣＨ１ドメイン及び前記ＣＬドメインが、ペプチドリンカー又はジスルフィド結合によってリンクされている、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
  5. 前記第１の結合成分が、
    （ａ）第１の機能性ＣＨ１ドメイン、第１のヒンジ領域、第１のＣＨ２ドメイン、第１のＣＨ３ドメイン、及び任意選択で、第１のＣＨ４ドメインに融合された、前記第１の可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインと、
    （ｂ）第１の軽鎖定常（ＣＬ）ドメインに融合された、前記第１のユニバーサル軽鎖可変ドメインと、を含み、
    Ｆａｂ様構造内で（ａ）と（ｂ）とが対になるように、前記第１の機能性ＣＨ１ドメインが前記第１のＣＬドメインに、ジスルフィド結合又はペプチドリンカーによってリンクされ、
    前記第２の結合成分が、
    （ａ’）第２の機能性ＣＨ１ドメイン、第２のヒンジ領域、第２のＣＨ２ドメイン、第２のＣＨ３ドメイン、及び任意選択で、第２のＣＨ４ドメインに融合された、前記第２の可変ドメインと、
    （ｂ’）第２の軽鎖定常（ＣＬ）ドメインに融合した、前記第２のユニバーサル軽鎖可変ドメインと、を含み、
    Ｆａｂ様構造内で（ａ’）と（ｂ’）とが対になるように、前記第２の機能性ＣＨ１が前記第２の軽鎖定常ドメインに、ジスルフィド結合又はペプチドリンカーによってリンクされ、
    前記抗原結合タンパク質が四量体型結合タンパク質を形成するように、前記第１の結合成分及び前記第２の結合成分が対になり、かつ
    任意選択で、前記第１のＣＨ３ドメインと、前記第２のＣＨ３ドメインとが、Ａタンパク質に対して異なる親和性を有する、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
  6. 前記第１及び第２の結合成分が同一である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  7. 第２のエピトープを結合する前記第２のヒト可変ドメインが、ヒト重鎖可変ＶＨｘＵＬＣドメインである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  8. 第２のエピトープを結合する前記第２のヒト可変ドメインが、第２の可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインであり、前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが同一ではない、請求項２〜５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  9. 前記再配列されたヒトユニバーサルＶＬ／ＪＬ遺伝子配列が、再配列されたヒトユニバーサルＶκ／Ｊκ遺伝子配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  10. 前記再配列されたヒトユニバーサルＶκ／Ｊκ遺伝子配列が、再配列されたヒトユニバーサルＶκ１−３９／Ｊκ遺伝子配列又は再配列されたヒトユニバーサルヒトＶκ３−２０／Ｊκ遺伝子配列である、請求項９に記載の抗原結合タンパク質。
  11. 前記再配列されたヒトＶκ１−３９／Ｊκ遺伝子配列が、再配列されたヒトＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列であるか、又は前記再配列されたヒトＶκ３−２０／Ｊκ遺伝子配列が、再配列されたヒトＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列である、請求項１０に記載の抗原結合タンパク質。
  12. すべての重鎖定常領域及び軽鎖定常領域が、それぞれヒト重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  13. ヒトＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを生成するのに有用な非ヒト動物であって、その生殖系のゲノムに：
    （ｉ）免疫グロブリンハイブリッド鎖をコードするハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座であって、そのそれぞれが少なくとも機能性ＣＨ１ドメインをコードする１つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）を前記ハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座が含み、前記ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントが、前記免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含むハイブリッドの配列を形成するように再配列することが可能である、前記ハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座と；
    （ｉｉ）ヒトユニバーサル軽鎖をコードする軽鎖遺伝子座であって、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒトユニバーサル軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む軽鎖遺伝子座と、を含み、
    前記非ヒト動物が、前記ハイブリッドの遺伝子座に由来するヒト免疫グロブリンハイブリッド鎖と、前記軽鎖遺伝子座に由来する同種のヒトユニバーサル軽鎖とを含む抗原結合タンパク質を生成することが可能であり、前記ヒト免疫グロブリンハイブリッド鎖が、機能性ＣＨ１ドメインを含む、重鎖定常ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、又はＩｇＡ領域に融合されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ｈＶＬ／ＣＨｘＵＬＣ）ドメインを含み、かつ前記ヒトユニバーサル軽鎖が、軽鎖定常ドメインに融合されたヒト免疫グロブリン軽鎖を含む、非ヒト動物。
  14. 前記抗原結合タンパク質を発現するＢ細胞を更に含む、請求項１３に記載の非ヒト動物。
  15. 請求項１３又は１４に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
    （ｉ）免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む軽鎖遺伝子座と、
    （ｉｉ）再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント（ＶＬ及びＪＬ）を含み、インタクトなＩｇμ遺伝子、インタクトなＩｇδ遺伝子、インタクトなＩｇγ遺伝子、インタクトなＩｇα遺伝子、及び／又はインタクトなＩｇε遺伝子を含む免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を形成するように再配列することが可能なハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座とを、前記非ヒト動物の生殖系のゲノムが含むように、前記非ヒト動物の生殖系のゲノムを改変することを含む、方法。
  16. 前記非ヒト動物の生殖系のゲノムを改変することが、
    （ａ）内因性の重鎖遺伝子座にある、すべての内因性の機能性免疫グロブリン重鎖ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを、再配列されていないヒト免疫グロブリンＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントに交換し、前記再配列されていない軽鎖可変遺伝子セグメントを、内因性の重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結させることと、
    （ｂ）内因性の軽鎖遺伝子座にある、すべての内因性の機能性軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列に交換し、前記再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を、内因性の軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結させること、とを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ及びＪＬ）遺伝子セグメントを含み、かつ前記軽鎖遺伝子座が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、前記再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、請求項１３又は１４に記載の動物、又は請求項１５又は１６に記載の方法に従って作製される動物。
  18. 前記非ヒト動物が齧歯類である、請求項１７に記載の動物。
  19. 前記齧歯類がラット又はマウスである、請求項１８に記載の動物。
  20. 免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメイン又は免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする核酸を発現している細胞の単離のための、請求項１３〜１４及び１７〜１９のいずれか一項に記載の非ヒト動物の使用、又は請求項１５又は１６に記載の方法により作製された非ヒト動物の使用。
  21. ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む結合成分をコードする核酸であって、前記核酸が、非ヒト若しくはヒト免疫グロブリン重鎖定常遺伝子、又は非ヒト若しくはヒト免疫グロブリン軽鎖定常遺伝子に、作動可能に連結されている、再配列されたヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含む、核酸。
  22. 前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常遺伝子が、インタクトな齧歯類Ｉｇμ遺伝子、インタクトな齧歯類Ｉｇδ遺伝子、インタクトな齧歯類Ｉｇγ遺伝子、インタクトな齧歯類Ｉｇε遺伝子、インタクトな齧歯類Ｉｇα遺伝子、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の核酸。
  23. 前記ヒト免疫グロブリン重鎖定常遺伝子が、ヒトＩｇμ遺伝子、ヒトＩｇδ遺伝子、ヒトＩｇγ遺伝子、ヒトＩｇε遺伝子、ヒトＩｇα遺伝子、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の核酸。
  24. 前記ヒト免疫グロブリン重鎖定常遺伝子が、ヒトＩｇγ遺伝子である、請求項２３に記載の核酸。
  25. 前記ヒトＩｇγ遺伝子が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４からなる群から選択されるＩｇＧ下位クラスをコードする、請求項２４に記載の核酸。
  26. 前記ヒトＩｇγ遺伝子が、前記ＣＨ３における、コードされている前記ＣＨ３ドメインの、Ａタンパク質に対する結合親和性を、野生型のＣＨ３ドメインと比較して減少させる配列をコードする突然変異を含む、請求項２５に記載の核酸。
  27. 軽鎖定常領域に融合されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインを含む結合成分をコードする核酸であって、前記核酸が、非ヒト若しくはヒト免疫グロブリン軽鎖定常遺伝子に、作動可能に連結されている、再配列されたヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含む、核酸。
  28. 請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞。
  29. 前記細胞がリンパ球である、請求項２８に記載の細胞。
  30. 前記細胞が宿主細胞である、請求項２９に記載の細胞。
  31. 多特異性の抗原結合タンパク質を作製する方法であって、宿主細胞内に、
    （ｉ）機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む、第１の非ヒト又はヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されているヒトＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインをコードする核酸配列を含み、前記ヒトＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインが、同種の可変ドメインとは独立に、第１のエピトープに結合する、第１の核酸と、
    （ｉｉ）機能性ＣＨ１ドメインをコードする配列を含む第２の非ヒト又はヒト重鎖定常領域遺伝子と融合された、ヒトＶＨｘＵＬＣドメイン又は第２のヒトＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインのいずれか一方をコードする核酸配列を含み、前記ＶＨｘＵＬＣドメイン又は前記第２のＶＬ／ＣＨｘＵＬＣドメインが、同種の可変ドメインとは独立に、前記第１の抗原決定基とは同一ではない第２のエピトープと結合する第２の核酸と、
    （ｉｉｉ）非ヒト又はヒト軽鎖定常ドメインに融合されたヒトユニバーサル軽鎖可変ドメインをコードする第３核酸と、を共発現させることを含む方法。
  32. 前記第１の重鎖定常領域遺伝子及び前記第２の重鎖定常領域遺伝子が、ヒト重鎖定常領域遺伝子であり、かつ前記軽鎖定常ドメインがヒト軽鎖定常ドメインである、請求項３１に記載の方法。
  33. 請求項３１又は３２に記載の方法にしたがって作製された抗原結合タンパク質。
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