KR20200062514A

KR20200062514A - 고분자-세포 혼합 스페로이드, 이의 제조방법 및 이를 사용하는 방법

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Publication number: KR20200062514A
Application number: KR1020180147999A
Authority: KR
Inventors: 김호용; 김소영; 김민지; 정영조; 이진호; 변준호; 오세행
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2020-06-04
Also published as: KR102189844B1

Abstract

본 발명은 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포를 이용한 고분자-세포 혼합 스페로이드, 이의 제조방법, 및 이를 조직공학, 재생의학, 진단의학, 약물 스크리닝, 및 동물실험대체재로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나에 사용하는 다양한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 고분자 미세입자-세포 혼합 스페로이드는 기존의 세포 스페로이드와 달리 시간이 지남에 따라 세포의 유실이나 스페로이드 직경의 변화 없이 완성된 형태를 유지하며, 미세입자와 세포의 혼합 비율에 따라서 다양한 형태와 크기의 혼합 스페로이드 형성이 가능하다. 또한 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자가 세포들 간의 빽빽한 결합 사이사이에 느슨한 구조체 역할을 하여 세포들 간의 간격을 이격시켜 일종의 통로를 만들게 되어 세포 스페로이드의 내부 중심부까지 산소 및 영양분을 공급하여 내부에서의 세포 괴사를 방지할 수 있다. 이를 이용하여 종래 기술적 한계가 있던 세포 스페로이드의 문제점을 극복하고 인체와 더욱 유사한 구조의 세포 스페로이드를 제공할 수 있다.

Description

고분자-세포 혼합 스페로이드, 이의 제조방법 및 이를 사용하는 방법{Polymer cell mixed spheroids, method for preparing thereof, and use thereof}

본 발명은 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자를 이용한 고분자-세포 혼합 스페로이드, 이의 제조방법 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

인체를 구성하고 있는 세포를 외부에서 배양하는 방법으로 오랫동안 2차원 세포 배양 방법이 널리 사용되어 왔으며, 2차원 배양법으로 분석된 데이터를 통하여 생체 내 생리학적 거동을 예측하거나 대응하고자 하였다. 그러나 2차원 세포 배양을 통해 생체 내의 3차원 구조 및 표면 특성을 반영하거나 생체 내에서 세포간의 신호전달을 통한 성질 유지를 재현하는 데에는 큰 제한이 있다.

그리하여 실험실에서 인체와 유사한 환경을 모사하기 위하여 세포를 응집한 3차원 스페로이드(spheroid) 형태로 배양할 수 있는 기술이 개발되었다. 세포 스페로이드 배양법은 2차원 배양법에서 얻을 수 없는 생체 유사 환경을 제공하여 생체로 실험하는 것보다 훨씬 간단하며 생체 내의 복잡한 환경의 영향을 단순화하여 보다 측정하기 용이한 데이터를 얻을 수 있는 장점이 있다.

오늘날 세포 스페로이드 기술은 단일 세포나 두 종 이상의 세포를 혼합하여 다양한 생물학적 기전 연구, 약물 스크리닝, 질병 모델링, 조직공학용 치료제, 동물실험 대체재 등으로 이용되고 있다.

이러한 세포 스페로이드는 실리콘 혹은 하이드로겔 기반의 미세 오목 (micro convave well) 혹은 평평한 표면 구조를 이용한 배양 및 hanging drop 배양을 통해 제조할 수 있다. 하지만, 상기 방법들은 혈관을 포함하고 있지 않는 구조이며, 세포들이 매우 조밀하게 밀집되어 있어 세포 스페로이드 내부로 산소 및 자양분의 공급이 제한적이다. 따라서, 세포만을 이용한 스페로이드의 문제점은 세포 스페로이드 내부까지 산소와 영양분의 제한적인 공급으로 인하여 중심 세포의 괴사가 일어나 일정 크기 이상의 스페로이드의 제조가 어렵다는 가장 큰 한계점이 있으며, 이로 인해 스페로이드의 크기의 조절이 어렵고 대량 생산의 한계점이 존재한다는 것이다.

따라서 직경이 200㎛를 초과하는 세포 스페로이드를 제조 및 활용에는 제한점이 있어 스페로이드의 크기를 키울 수 있는 새로운 방법이 필요하다. 그러나, 스페로이드의 크기를 키우기 위해서는 그만큼 내부 중심부까지 산소와 영양분을 제대로 공급할 수 있어 내부 순환이 잘 될 수 있는 구조를 만족해야 하는 등, 여러 가지 까다로운 조건들이 필요하다.

그러나, 이와 같은 문제를 해결하기 위하여 세포 스페로이드 제작 기술에 대한 많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고 아직까지는 상기 문제점을 해결하기는 어려운 상황이다. 따라서 세포 스페로이드의 가장 큰 한계점을 극복할 수 있는 새로운 개념의 세포 스페로이드의 제조방법이 필요한 실정이다.

한국특허출원 제 2016-0140291호에서는 폴리카테콜계 고분자 코팅된 섬유상 입자의 도입을 통해 세포-세포 간의 자가조립 및 세포-섬유상 입자 간의 결합을 유도함으로써 세포 구상체의 크기 제어가 용이하고, 세포 생존율을 높일 수 있는 3차원 세포 구상체의 제조방법을 제시하였다.

그러나, 상기 특허에서는 고분자와 세포 간의 친화력이 없어 세포에 고분자가 잘 점착되지 않는 문제를 해결하기 위하여 폴리카테콜계 고분자를 섬유상 입자에 코팅시켜 사용해야 하는 번거로운 문제가 있다.

한국특허출원 제2016-0140291호 한국특허출원 제2017-0071744호

본 발명은 종래 세포 스페로이드의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 크기 조절이 용이하며, 큰 크기의 스페로이드에서도 그 중심부까지 산소와 영양분을 효과적으로 공급할 수 있는 새로운 구조의 스페로이드를 제조하는 데 그 목적이 있다.

즉, 본 발명은 본 출원인이 개발한 독특한 구조인 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자를 이용하여 세포와의 혼합을 통해 고분자와 세포가 혼합된 구조의 스페로이드를 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 고분자-세포 혼합 스페로이드의 제조방법을 제공하는 데도 있다.

추가적으로, 본 발명은 상기 고분자-세포 혼합 스페로이드를 다양한 용도에 사용하는 방법을 제공하는 데도 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 고분자-세포 혼합 스페로이드는 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포를 이용한 고분자-세포의 혼합 스페로이드인 것을 그 특징으로 한다.

상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자는 분자량 1,000 1,000,000 g/mol이며, 생체적합성과 생분해성을 가지는 것으로, 폴리락틱산 (poly(lactic acid)), 폴리글리콜산 (poly(glycolic acid)), 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(poly(lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤 공중합체(polycaprolactone), 폴리락틱산-카프로락톤 공중합체 (poly(lactic acid-co-ε-caprolactone)), 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체(polyhydroxybutyric acid-co-hydroxyvaleric acid), 폴리다이옥사논 (poly(dioxanone), 및 폴리포스포에스터 (poly(phosphoester))로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2 종 이상의 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 낙엽적층구조 미세입자는 53㎛ 보다 작은 체(sieve)들을 이용하여 분리시켜, 그 평균 입경이 53㎛보다 작은 것들로만 이루어진 것이 바람직하다.

상기 세포는 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 근세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래줄기세포, 골막유래줄기세포, 혈관내피전구세포, 배아줄기세포, 역분화줄기세포 (induced pluripotent stem cell) 중에서 선택되는 단독 또는 2종 이상일 수 있다.

상기 고분자-세포 혼합 스페로이드의 직경은 100~1,000 ㎛의 다양한 크기를 가지는 데 특징이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 고분자-세포 혼합 스페로이드는 2주 후 세포 생존율이 90% 이상을 유지하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 고분자-세포 혼합 스페로이드의 제조방법은 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자를 제조하는 제1단계, 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포를 혼합하여 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합액을 제조하는 제2단계, 및 상기 제2단계의 고분자-세포 혼합액을 세포 스페로이드 배양시스템에 분주하여 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포가 혼합된 스페로이드를 형성하는 제3단계를 포함하여 이루어지는 데 그 특징을 가진다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합액 내의 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자의 비율은 1% 내지 20%의 숫자비로 혼합하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 상기 고분자 미세입자-세포 혼합 스페로이드를 조직공학, 재생의학, 진단의학, 약물 스크리닝, 및 동물실험대체재로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 용도로 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 고분자 미세입자-세포 혼합 스페로이드는 기존의 세포 스페로이드와 달리 시간이 지남에 따라 세포의 유실이나 스페로이드 직경의 변화 없이 완성된 형태를 유지하며, 미세입자와 세포의 혼합 비율에 따라서 다양한 형태와 크기의 혼합 스페로이드 형성이 가능하다.

또한 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자가 세포들 간의 빽빽한 결합 사이사이에 느슨한 구조체 역할을 하여 세포들 간의 간격을 이격시켜 일종의 통로를 만들게 되어 세포 스페로이드의 내부 중심부까지 산소 및 영양분을 공급하여 내부에서의 세포 괴사를 방지할 수 있다. 이를 이용하여 종래 기술적 한계가 있던 세포 스페로이드의 문제점을 극복하고 인체와 더욱 유사한 구조의 세포 스페로이드를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 고분자 미세입자-세포의 혼합 스페로이드는 내부 세포의 생존률을 높일 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 사용되는 스페로이드 배양시스템의 크기에 따라 매우 간단한 방법으로 고분자 미세입자-세포 혼합 스페로이드를 제조할 수 있어 대량 생산이 가능하다.

결과적으로, 본 발명에 따른 고분자 미세입자-세포 혼합 스페로이드는 종래의 세포 스페로이드의 한계점을 뛰어넘어, 세포 스페로이드가 필요한 다양한 바이오 분야에서 새로운 개념의 세포 스페로이드로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 고분자-세포 혼합 스페로이드의 구조의 모식도이고,
도 2는 본 발명의 실시예에서 제조된 아가로스를 이용한 세포 스페로이드 배양시스템의 제작 과정과 이를 이용한 낙엽적층형 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합 스페로이드 제조과정을 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 낙엽적층형 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자의 주사전자현미경 사진이며,
도 4는 비교예 1에 따른 세포 스페로이드, 및 실시예 1~2에서 제조된 미세입자-세포 혼합 스페로이드의 형성 및 시간에 따른 직경 변화를 관찰한 광학현미경 사진이고,
도 5는 비교예 1에 따른 세포 스페로이드, 및 실시예 1~2에서 제조된 미세입자-세포 혼합 스페로이드의 형태 변화를 관찰한 주사전자현미경 사진으로, 각각 위의 것은 스페로이드의 표면 사진이고, 아래 것은 표면 일부를 확대한 사진이고,
도 6은 비교예 1에 따른 세포 스페로이드, 및 실시예 1~2에서 제조된 미세입자-세포 혼합 스페로이드의 직경의 변화를 정량화한 그래프이고,(**P<0.01),
도 7은 비교예 2에 따른 PCL 고분자 미세입자를 세포와 혼합하여 제조된 샘플의 구조를 확인한 SEM 사진이고,
도 8은 비교예 1에 따른 세포 스페로이드, 및 실시예 1~2에서 제조된 미세입자-세포 혼합 스페로이드의 세포 생존률을 정량화한 그래프이며,(**P<0.01)
도 9는 비교예 1에 따른 세포 스페로이드, 및 실시예 1~2에서 제조된 미세입자-세포 혼합 스페로이드의 괴사 여부를 분석한 결과이다.(*, 낙엽적층구조 미세입자; 갈색, Ki67)

이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.

본 발명은 독특한 구조를 가지는 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자를 세포 스페로이드 제조에 응용한 고분자 미세입자-세포 혼합 스페로이드와 이의 제조방법 및 이를 다양한 용도에 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자는 본 출원인의 기 출원 특허인 2017-0071744에 상세히 설명되어 있으며, 상기 특허는 본 발명에 그대로 병합된다.

본 발명에 따른 '낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자'는 고분자 전체(표면 및 내부)에 걸쳐 다수의 낙엽들이 겹겹이 쌓인 것과 같은 구조를 가지며, 상기 겹겹이 쌓인 낙엽들 사이사이에는 무수히 많은 다공들이 존재하며, 상기 다공들은 서로 연결된 구조를 가지는 것을 포함하는 의미이다.

따라서, 상기와 같이 독특한 구조를 가지는 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자를 세포 스페로이드에 이용함으로써, 종래 세포만을 이용한 세포 스페로이드에 비해 다양한 크기를 가지는 스페로이드의 제조가 가능하고, 고분자와 세포 간의 친화성 부족으로 사용하지 못했던 종래 문제점을 해결하여 고분자에 어떠한 표면처리나 표면개질을 사용하지 않고도 세포와 안정적인 스페로이드의 결합이 가능한 것이다.

이러한 본 발명에 따른 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자는 분자량 1,000~1,000,000 g/mol이며, 생체적합성과 생분해성을 가지는 것으로, 폴리락틱산 (poly(lactic acid)), 폴리글리콜산 (poly(glycolic acid)), 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(poly(lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤 공중합체(polycaprolactone), 폴리락틱산-카프로락톤 공중합체 (poly(lactic acid-co-ε-caprolactone)), 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체(polyhydroxybutyric acid-co-hydroxyvaleric acid), 폴리다이옥사논 (poly(dioxanone), 및 폴리포스포에스터 (poly(phosphoester))로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2 종 이상의 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자는 53㎛ 보다 작은 체(sieve)들을 이용하여 분리시켜, 그 평균 입경이 53㎛보다 작은 것들로만 이루어진 것이 바람직하며, 상기 낙엽적층구조 다공성 고분자 미세입자의 평균 입경이 53㎛보다 큰 경우에는 세포 스페로이드가 형성되는 것이 아니라 다공성 고분자 미세입자의 표면에 세포가 단순히 점착되는 문제가 있어 바람직하지 못하다.

또한, 본 발명의 스페로이드에 포함되는 상기 세포는 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 근세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래줄기세포, 골막유래줄기세포, 혈관내피전구세포, 배아줄기세포, 역분화줄기세포 (induced pluripotent stem cell) 중에서 선택되는 단독 또는 2종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 상기 고분자-세포 혼합 스페로이드의 직경은 100~1,000 ㎛의 크기를 가지는데, 이는 종래 세포만으로 이루어진 세포 스페로이드에 비해 다양한 크기를 가지는 혼합 스페로이드의 제조가 가능하다는 것을 의미한다.

이러한 직경 크기는 본 발명에 따른 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자의 독특한 구조로 인한 것으로, 즉, 본 발명에 따른 고분자-세포 혼합 스페로이드의 구조의 모식도를 나타낸 다음 도 1을 참조하면, 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자가 스페로이드를 구성하는 세포와 세포 사이에 들어가 빽빽한 세포 간 간격을 느슨하게 해주는 역할을 수행하기 때문으로 해석될 수 있다.

뿐만 아니라, 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자는 전체적으로 다공성 구조를 가지며, 그 다공들이 서로 연결된 구조를 가지기 때문에 상기 다공들 사이로 산소와 자양분들이 이동할 수 있는 통로를 제공하는 역할까지 수행하는 것이다.

본 발명에 따른 고분자 미세입자-세포 혼합 스페로이드의 제조방법은 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자를 제조하는 제1단계, 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포를 혼합하여 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합액을 제조하는 제2단계, 및 상기 제2단계의 고분자-세포 혼합액을 세포 스페로이드 배양시스템에 분주하여 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포가 혼합된 스페로이드를 형성하는 제3단계를 포함하여 이루어진다.

본 발명에 따른 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자를 제조하는 제1단계는 한국특허 출원번호 2017-0071744에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.

제2단계는 상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포를 혼합하여 고분자-세포 혼합액을 제조하는 것이다. 즉, 세포 현탁액과 고분자 미세입자를 액상에서 혼합하고 이를 배양시스템에 분주하여 고분자-세포 스페로이드를 제조한다. 상기 세포현탁액은 세포가 배양액에 suspension된 상태를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포 현탁액 내 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자의 비율은 세포 현탁액 내 세포수 대비 1% 내지 20%의 숫자비로 혼합하는 것이 바람직하다.

세포 현탁액 내의 세포수는 hemocytometer를 이용하여 카운팅하므로, 낙엽적층형 구조를 가지는 미세입자도 세포배양액에 suspension 시키고 hemocytometer를 이용하여 카운팅한다. 그 다음, 각 용액으로부터 원하는 수만큼의 세포 및 입자를 채취하고 이를 원하는 세포/입자 비율로 혼합하여 사용하며, 상기 숫자%는 이러한 방법으로 계산된 함량을 의미한다.

미세입자와 세포의 혼합 비율이 20%를 초과하면 스페로이드 형성에 참여하지 못하는 잉여의 미세입자가 낭비될 수 있다. 또한 혼합 비율이 1% 미만이면 세포에 혼합되는 미세입자의 양이 적어져 일반적인 세포 스페로이드와 비슷해지므로 그 혼합 효과가 없기 때문이다.

제3단계는 상기 제2단계의 고분자-세포 혼합액을 세포 스페로이드 배양시스템에 분주하여 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포가 혼합된 스페로이드를 형성시키도록 하는 것이다.

이때 사용되는 세포 스페로이드 배양시스템과 배양 조건은 특별히 한정되지 않으며, 공지된 모든 방법에 따라 각 세포의 배양 조건에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있다.

예를 들어, 상기 세포 스페로이드 배양시스템은 아가로스 (agarose), 폴리아크릴아미드 (polyacrylamide), 히알루론산 (hyaluronic acid), 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol), 키토산 (chitosan), 칼슘알지네이트 (calcium alginate), 카르복시메틸셀룰로우스 (CMC, carboxymethyl cellulose), 덱스트란(dextran), 하이드록시프로필메틸셀룰로우스(HPMC, hydroypropyl methyl celluolse), 폴리하이드록시에틸렌메타크릴레이트(polyHEMA, polyhydroethyl methacrylate), 폴리비닐피롤리돈(PVP, poly(N-vinyl pyrrolidone), 폴리아이소프로필아크릴아마이드 (PNIPAAm, poly (N-isopropyl acrylamide)), 폴리비닐알콜(PVA, polyvinyl alcohol), 폴리에틸렌옥사이드 (PEO, poly(ethylene oxide)), 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드(polyethylene oxide-polypropyleneoxide) 공중합체 (PEO-PPO 공중합체; Pluronic series) 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 재료를 이용하여 성형된 것을 사용할 수도 있다.

상기와 같이 성형된 스페로이드 배양시스템을 이용하는 경우, 비교적 간단한 방법으로 일정 크기를 가지는 세포 스페로이드를 대량으로 생산가능한 장점을 가진다.

상기 과정을 거쳐 제조된 고분자-세포 혼합 스페로이드는 일정 기간(2주)이 지나도 그 크기의 변화가 거의 없이 유지될 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 고분자-세포 혼합 스페로이드는 2주 후 세포 생존율이 90% 이상을 유지하는 효과를 가진다.

따라서, 본 발명에 따른 고분자 미세입자-세포 혼합 스페로이드는 조직공학, 재생의학, 진단의학, 약물 스크리닝, 및 동물실험대체재로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 용도로 다양하게 응용할 수 있다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 이하의 실시예에서는 특정 화합물을 이용하여 예시하였으나, 이들의 균등물을 사용한 경우에 있어서도 동등 유사한 정도의 효과를 발휘할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

실시예 1~2 : 낙엽적층형 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합 스페로이드 제조

1) 낙엽적층구조 미세입자의 제조

본 출원인의 기 출원 특허인 2017-0071744에 기재된 방법에 따라 낙엽적층형 구조를 가지는 미세입자를 제조하였다.

생체적합성생분해성을 나타내는 폴리카프로락톤 (polycaprolactone, PCL)을 테트라글리콜에 15중량%로 혼합하고, 90℃에서 폴리카프로락톤을 용해시켜 테트라글리콜과 혼합시켰다. 90℃에서 혼합된 폴리카프로락톤 용액을 4℃에서 80 rpm으로 냉각시켰다. 냉각된 폴리카프로락톤 용액에 증류수를 과량 넣어서 미세입자 형성 유도와 잔여 테트라글리콜을 완전히 세척해 내었다. 세척과정에서 냉각된 폴리카프로락톤 미세입자가 서로 분리되어 다양한 크기의 미세입자가 형성된다.

세척이 끝난 PCL 미세입자는 53 ㎛보다 작은 다양한 체들을 이용하여 분류시키고, 동결건조시켜 평균 입경이 53 ㎛보다 작은 미세입자들로만 이루어진 낙엽적층형 구조를 가지는 PCL 고분자 미세입자를 얻었다.

2) 세포 스페로이드 배양시스템 제조

다음 도 1에 나타낸 바와 같이, 세포 스페로이드 배양시스템 내부에 concave well이 36개씩 4귀퉁이에 형성되어 있으며, 가운데 십자 모양으로 배양액 교환용 홈이 위치한 플라스틱 몰드에 용융 상태의 4 중량%의 아가로스 용액을 부어 세포 스페로이드 배양시스템을 제작하였다.

3) 세포 스페로이드 배양시스템을 이용한 미세입자-세포 스페로이드 제조

상기 1)에서 제조된 낙엽적층형 구조의 미세입자 비율이 세포 혼합용액의 세포수 대비 각각 5, 10% 숫자비로 포함되도록 rat에서 획득한 골수줄기세포와 혼합시켜 1 mL의 고분자 미세입자-세포 혼합액을 제조하였다.(표 1 조성 참조)

상기 2)에서 제작된 세포 스페로이드 배양시스템에 상기 미세입자-세포 혼합액을 분주하고, 미세입자와 세포가 세포 스페로이드 배양시스템 내의 concave well에 균일하게 위치할 수 있도록, well 외부에 잉여로 존재하는 세포와 미세입자는 제거하였다. 그 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양시켰다.(도 2 참조)

비교예 1 : 세포 스페로이드 배양시스템을 이용한 세포 스페로이드 제조

본 발명과 같이 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자가 포함되지 않고, rat에서 획득한 골수줄기세포만으로 이루어진 세포 현탁액을 이용하여 상기 실시예 1~2에서와 동일하게 세포 스페로이드를 제조하였다.

	세포 양 (x10⁶ cells)	미세입자 양 (x10⁶ particle)	세포 현탁액 내 미세입자의 양 (숫자%)
비교예 1	3.0	0	0
비교예 2	2.7	0.3	10
실시예 3	2.85	0.15	5
실시예 3	2.7	0.3	10

비교예 2 : 53 ㎛보다 큰 평균 입경을 가지는 낙엽적층형 구조를 가지는 PCL 다공성 고분자 미세입자를 이용한 제조

상기 실시예의 1)의 낙엽적층형 구조를 가지는 PCL 다공성 고분자 미세입자의 제조시, 53 ㎛보다 큰 다양한 크기의 체(sieve)들(54, 100㎛, 200㎛)을 이용하여 분리시켜, 최종 제조된 미세입자의 평균입경이 53 ㎛보다 큰 것들로만 이루어진 낙엽적층형 구조의 PCL 다공성 고분자 미세입자를 제조하였다.

또한, 상기 제조된 평균입경이 53 ㎛보다 큰 것들로만 이루어진 낙엽적층형 구조의 PCL 다공성 고분자 미세입자 비율이 세포 혼합용액의 세포수 대비 10% 숫자비로 포함되도록 상기 실시예와 동일하게 혼합하고 스페로이드 제조를 시도하였다. (표 1 조성 참조)

실험예 1 : 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자의 구조 확인

상기 실시예의 1)에 따라 PCL 고분자 미세입자의 구조를 주사전자현미경 (SEM)을 통해 관찰하였으며 그 결과를 다음 도 3에 나타내었다.

다음 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 고분자 미세입자는 고분자 전체(표면 및 내부)에 걸쳐 다수의 낙엽들이 적층되어 있는 것과 같은 낙엽적층형 구조를 가지며, 상기 겹겹이 쌓인 낙엽들 사이사이에는 무수히 많은 다공들이 존재하며, 상기 다공들은 서로 연결된 구조를 가지는 것을 확인하였다.

실험예 2: 낙엽적층구조 미세입자-세포 스페로이드의 형성 과정 확인

상기 실시예와 비교예 1의 샘플에서 세포 스페로이드가 형성되는 과정을 광학현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 다음 도 4에 나타내었다.

다음 도 4를 참조하면, 본 발명과 같이 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자-세포로 이루어진 실시예 1~2의 혼합 스페로이드와 비교예 1의 세포 스페로이드는 모두 배양 후 하루가 지나면 미세입자와 세포가 뭉친 형태를 가지는 3차원의 스페로이드가 형성됨을 확인할 수 있다.

이와 같은 결과로부터, 본 발명에 따른 낙엽적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자를 세포와 혼합하더라도 종래 세포만을 이용한 스페로이드에서와 마찬가지로 3차원의 스페로이드를 효과적으로 형성할 수 있음을 확인하였다.

실험예 3: 낙엽적층구조 미세입자-세포 스페로이드의 형태 분석

상기 실시예 1~2와 비교예 1~2에서 제조된 3차원 구조의 각 세포 스페로이드의 형태 변화를 2주간에 걸쳐 주사전자현미경(SEM)으로 확인하였으며, 그 결과를 다음 도 5(실시예 1~2, 비교예 1)와 7(비교예 2)에 나타내었다.

다음 도 5를 참조하면, 상기 실험예 2의 결과에서와 같이 본 발명 실시예 1~2의 방법에 따르면 세포와 고분자 미세입자를 혼합시킨 후 1일이 지나면 미세입자와 세포가 뭉친 형태의 3차원 구조의 고분자-세포의 혼합 스페로이드가 형성됨을 확인하였다.

또한, 실시예 1~2와 같이 고분자 미세입자를 혼합시킨 고분자-세포의 혼합 스페로이드의 경우 시간이 지남에 따라 비교예 1의 세포만을 이용한 스페로이드에 비해 전체 스페로이드의 직경 변화가 거의 없이 유지하고 있음을 확인하였다. 또한 상기 광학현미경 사진을 바탕으로 2주 동안 세포의 스페로이드 직경 변화를 image J를 이용하여 정량화한 결과(도 6)에서도 이를 확인하였다.

이는 도 1의 구조에서와 같이, 본 발명에 따른 낙엽적층구조의 다공성 고분자 미세입자의 독특한 표면구조가 넓은 표면적을 제공하여 세포가 점착하기 쉬워 세포 점착성능이 향상되고, 이러한 구조로 인하여 세포와 낙엽적층형 구조를 가지는 다공성 고분자 미세입자 간의 결합이 단단하게 유지되기 때문인 것으로 볼 수 있다.

이러한 결과로부터, 본 발명과 같이 낙엽 적층형 구조를 가지는 고분자 미세입자를 세포와 혼합하여 하이브리드 구조의 세포 스페로이드를 효과적으로 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 일정 시간이 지나도 그 크기를 일정하게 유지할 수 있음을 확인하였는 바, 이는 종래 크기 조절이 제한적이었던 세포 스페로이드의 문제를 현저하게 해결한 결과로 볼 수 있다.

또한, 상기 고분자 미세입자-세포의 혼합 스페로이드의 확대사진을 참조하면, 본 발명에서 사용한 낙엽적층형 구조의 고분자 미세입자와 세포가 서로 복잡하게 결합하여 뭉친 형태를 가지는 것을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 고분자 미세입자-세포의 혼합 스페로이드에서는 고분자 미세입자의 함량이 세포의 함량보다 상대적으로 적게 포함되므로, 전체 혼합 스페로이드에서 고분자 미세입자가 중간 중간에 박힌 구조를 형성하게 된다. 따라서, 고분자 미세입자들이 스페로이드에서 세포들 간의 빽빽한 결합 사이사이에 느슨한 구조체 역할을 하여 세포들 간의 간격을 이격시켜 일종의 통로를 만들게 된다.

또한, 본 발명에 따른 낙엽 적층형 다공성 고분자 미세입자는 외부 및 내부에 전체적으로 다공성 구조를 가지고 있기 때문에 통로가 된 고분자 미세입자들 사이로 세포 스페로이드의 내부 중심부까지 산소 및 영양분을 공급할 수 있는 효과를 가지므로 스페로이드의 크기가 커지더라도 세포 내부에서의 세포 괴사를 효과적으로 방지할 수 있는 구조를 제공하는 것이다.

그러나, 낙엽적층형 구조를 가지는 PCL 다공성 고분자 미세입자 중, 평균입경이 53 ㎛보다 큰 미세입자-세포로 이루어진 비교예 2에서도 3차원의 스페로이드가 형성되는지를 관찰한 다음 도 7의 결과를 참조하면, 본 발명 실시예에서와 같이 고분자와 세포가 3차원의 스페로이드를 형성하지 못하고 세포들이 입자의 표면에 점착되고 스페로이드를 형성하지 못함을 확인하였다. 이는 비교예에서 사용한 PCL 다공성 고분자 미세입자가 낙엽적층형 구조를 가지더라도, 평균 입경이 53㎛보다 큰 경우에는 세포 스페로이드가 형성되지 못하는 것을 알 수 있다.

이는 미세입자의 크기가 53 ㎛보다 작을 경우, 세포 (크기, 10 ~ 50㎛)와 미세입자의 크기가 유사해 서로 균일하게 섞이고 서로 간의 충분한 점착력으로 스페로이드를 형성할 수 있으나, 미세입자의 크기가 53 ㎛보다 클 경우, 세포와 미세입자가 균일하게 섞이기 보다는 미세입자 사이에 적은 양의 세포가 존재하고 이때 세포와 미세입자 간의 점착력이 미세입자들을 응집시킬 정도의 힘이 되지 못하여 스페로이드를 형성하기 보다는 단순히 미세입자 표면에 점착되는 결과를 낳는다.

실험예 4 : 세포의 생존률 및 괴사 여부 분석

상기 실시예 1~2와 비교예 1에서 제조된 3차원 구조의 각 세포 스페로이드에서 세포의 생존률과 괴사 여부를 분석하였다. 비교예 2에서는 3차원 구조의 스페로이드 형성이 되지 않아, 본 실험에서는 제외시켰다.

낙엽적층구조 미세입자-세포 스페로이드를 이루고 있는 세포를 trypsin처리하여 세포 스페로이드에서 분리시켰다. 그 후 trypan blue 염색을 통하여 세포 생존률을 정량화하였다. (도 8 참조)

또한, 내부 세포의 괴사 여부를 확인하기 위하여 미세입자-세포 스페로이드를 10 ㎛로 절편하여 hematoxylin & eosin (H&E) 염색과 생존한 세포만 염색가능한 Ki67을 이용하여 조직면역염색을 진행하였다.(도 9 참조)

다음 도 8의 세포 생존률 결과를 참조하면, 종래 rat에서 획득한 골수줄기세포만을 이용한 비교예 1에 따른 세포 스페로이드의 경우 2주가 지난 후 세포 생존율이 82%에서 62%까지 현저하게 떨어지는 것으로 나타났다.

그러나, 본 발명에서와 같이 고분자 미세입자-세포의 혼합 스페로이드의 경우 2주가 지나도 세포 생존율이 거의 변화없이 유지되고 있음을 확인하였다. 이는 상기 실험예 3의 결과에서와 같이, 낙엽적층구조 미세입자가 외부의 영양분이나 산소를 내부까지 공급하는 매개체로서의 역할을 수행하여 내부의 세포 괴사를 방지할 수 있음을 뒷받침하는 결과라 볼 수 있다.

또한, 다음 도 9의 세포 괴사 여부를 분석한 결과를 참조하면, rat에서 획득한 골수줄기세포만을 이용한 비교예 1에서는 스페로이드 내부에서 세포의 괴사 및 세포의 증식이 억제됨을 확인할 수 있었으나, 실시예 1~2에서는 스페로이드 내부의 세포가 생존하고 증식이 활발히 진행되고 있는, 즉, 스페로이드 내부의 세포의 괴사를 효과적으로 억제하고 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포를 이용한 고분자-세포 혼합 스페로이드.
제 1 항에 있어서,
낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자는 분자량 1,000~1,000,000 g/mol이며, 생체적합성과 생분해성을 가지는 것으로, 폴리락틱산 (poly(lactic acid)), 폴리글리콜산 (poly(glycolic acid)), 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(poly(lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤 공중합체(polycaprolactone), 폴리락틱산-카프로락톤 공중합체 (poly(lactic acid-co-ε-caprolactone)), 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체(polyhydroxybutyric acid-co-hydroxyvaleric acid), 폴리다이옥사논 (poly(dioxanone), 및 폴리포스포에스터 (poly(phosphoester))로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2 종 이상의 것인 고분자-세포 혼합 스페로이드.
제 1 항에 있어서,
상기 낙엽적층구조 미세입자는 53㎛ 보다 작은 체(sieve)들을 이용하여 분리시켜, 그 평균 입경이 53㎛보다 작은 것들로만 이루어진 것인 고분자-세포 혼합 스페로이드.
제 1항에 있어서,
상기 세포는 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 근세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래줄기세포, 골막유래줄기세포, 혈관내피전구세포, 배아줄기세포, 역분화줄기세포 (induced pluripotent stem cell) 중에서 선택되는 단독 또는 2종 이상인 것인 고분자-세포 혼합 스페로이드.
제 1항에 있어서,
상기 고분자-세포 혼합 스페로이드의 직경은 100~1,000 ㎛의 크기를 가지는 것인 고분자-세포 혼합 스페로이드.
제 1항에 있어서,
상기 고분자-세포 혼합 스페로이드는 2주 후 세포 생존율이 90% 이상을 유지하는 것인 고분자-세포 혼합 스페로이드.
낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자를 제조하는 제1단계,
상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포를 혼합하여 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합액을 제조하는 제2단계, 및
상기 제2단계의 고분자-세포 혼합액을 세포 스페로이드 배양시스템에 분주하여 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자와 세포가 혼합된 스페로이드를 형성하는 제3단계를 포함하는 고분자-세포 혼합 스페로이드의 제조방법.
제 7항에 있어서,
상기 낙엽 적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자-세포 혼합액 내의 낙엽적층형 구조의 다공성 고분자 미세입자의 비율은 1% 내지 20%의 숫자비로 혼합되는 것인 고분자-세포 혼합 스페로이드의 제조방법.
제1항에 따른 고분자-세포 혼합 스페로이드를 조직공학, 재생의학, 진단의학, 약물 스크리닝, 및 동물실험대체재로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 용도에 사용하는 방법.