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KR20200045910A - 섬유화 질환을 예방 또는 치료하는 조성물 - Google Patents

섬유화 질환을 예방 또는 치료하는 조성물 Download PDF

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KR20200045910A
KR20200045910A KR1020180127002A KR20180127002A KR20200045910A KR 20200045910 A KR20200045910 A KR 20200045910A KR 1020180127002 A KR1020180127002 A KR 1020180127002A KR 20180127002 A KR20180127002 A KR 20180127002A KR 20200045910 A KR20200045910 A KR 20200045910A
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klhl3
gene
protein
expression
inhibitor
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KR1020180127002A
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민정기
박종길
장주홍
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한국생명공학연구원
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Abstract

본 발명은 섬유화 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있는 신규 표적으로서 KLHL3 유전자의 신규 용도에 관한 것이다.

Description

섬유화 질환을 예방 또는 치료하는 조성물{Composition for prevention or treatment of fibrosis disease}
본 발명은 섬유화 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
섬유화(fibrosis)는 다양한 원인에 의해 장기의 일부가 굳는 현상을 의미하며, 신장 섬유화, 간 섬유화, 폐 섬유화가 대표적인 질환이다. 섬유화는 일반적으로 만성적인 염증반응에 이어서 나타난다. 염증으로 발생한 여러 가지 사이토카인이나 면역세포에 의해 아교질섬유를 형성하는 섬유조직이 이주 및 증식하게 되고, 이로 인해 발생하는 몸의 실질세포의 괴사나 손상에 이어서 섬유화가 발생한다. 또한 섬유화는 섬유모세포에 의한 세포의 바탕질 축적으로 진행된다.
섬유화의 대표적인 질환 중 하나인 신장 섬유화는 신장의 경화(scarring)의 초기 단계로 만성 신부전으로 이행되는 대부분의 신장 질환에서 나타나는 공통된 현상이다. 신장에서 신세뇨관 및 간질은 전체 신장 용적의 80%를 차지하는데, 이러한 부위에 섬유화(tubulointerstitial fibrosis)가 발생한 신장 질환 환자는 비교적 예후가 나쁘고 말기 신부전으로 이행되는 경우가 많다. 간질이 차지하는 부분은 10~17%에 이르며, 세뇨관, 혈관, 사구체, 메산지움(mesangium)과 밀접하게 연결되어 있는바 주변 지역의 병적인 문제가 쉽게 영향을 미쳐 간질 부위에서 섬유화가 주로 발생하게 된다.
일반적으로 신장 섬유화의 진행 과정은 섬유아세포의 이동 및 증식으로 인해 유도되며, 이에 따른 콜라겐 (Ⅰ, Ⅲ)(collagen (Ⅰ, Ⅲ)), 피브로넥틴(fibronectin), 여러 프로테오글리칸(proteoglycan)과 같은 간질성 기질 단백(interstitial matrix protein)의 생성과 축적으로 인해 일어난다. 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 축적은 정상적인 상처 치유과정의 일부인데, 신장에 염증이 발생하거나 손상을 받게 되면 신장에 들어오거나 신장에 존재하는 세포에서 분비되는 여러 인자들이 신장 조직에서 세포외기질의 생산을 자극하고, 과다 생성의 결과 세포의 경화를 유발하여 신장의 구조나 기능상의 손상을 초래한다.
간질성 섬유화를 일으키는 원인으로는 일측성 요관 폐쇄(unilateral ureteral obstruction; UUO), 당뇨병성 신장염, 고혈압, 사이클로스포린 신독성(cyclosporine nephropathy), 동맥협착증(artery stenosis) 등이 있는데, 이와 같은 질환에서 국소적으로 안지오텐신 Ⅱ(ANG Ⅱ)가 증가되어 있다. ANG Ⅱ의 증가는 TGF-β와 같은 사이토카인의 생산을 촉진시키는데, TGF-β가 섬유화의 주된 매개 물질로 알려져 있다. TGF-β는 세포외기질 단백질의 생성을 증가시키는 역할을 하고, 기질의 과다 생산을 억제하는 프로테아제인 MMP(matrix metalloproteinase)의 수를 감소시킬 뿐만 아니라, 세포외기질 단백 수용체의 생성을 자극하는 역할을 하여 간질성 섬유화를 지속시킨다.
섬유화의 또 다른 대표적인 질환 중 하나인 간 섬유화(liver fibrosis)는 신장 섬유화와 비슷하게 나타나는데, 반복적인 간 손상에 대하여 지속적인 상처 회복의 과정의 결과로 나타난다. 간 손상 후에 세포자멸사(apoptosis) 또는 세포괴사(necrosis)에 빠진 간세포는 새롭게 재생된 간세포로 대체되는데, 간 손상이 지속적으로 발생하면 간세포의 재생이 느려지고 죽은 간세포를 대신하여 collagen 같은 세포외기질 단백질로 채워져 간 섬유화가 발생한다. 정상적인 간에서는 세포외기질의 과도한 축적 시 MMP에 의해 세포외기질이 분해되어 원래의 상태로 돌아오는데, 간경변증 환자의 경우 MMP를 억제하는 물질인 TIMP (tissue inhibitor of metalloproteinase)의 과발현으로 인해 간 섬유화가 진행될 수 있다.
간성상세포는 간에서 세포외기질의 주된 분비 세포로서 간 섬유화에 핵심적인 역할을 한다. 간성상세포는 간 손상을 받으면 활성화되어 α-SMA (α-smooth muscle actin) 양성인 근섬유모세포처럼 형태가 변한다. 활성화된 간성상세포는 증식하며 제1형 및 제3형 콜라겐, 혈관 수축성 물질 및 다양한 염증성 사이토카인을 분비한다. 간성상세포 뿐만 아니라 작은 문맥 주위에서 유래하는 근섬유모세포, 골수 유래 세포가 간 섬유화의 원인이 되는 것으로 알려져 있다.
간 섬유화의 기전은 알코올 또는 비알코올성 지방간, 간염 바이러스, 담즙산 등이 있고, 이러한 원인들에 의해 간세포에 손상이 발생하면 염증성 물질들이 분비된다. 이에 이어 쿠퍼세포(Kuffer cell)와 염증세포들이 활성화되고, 간성상세포를 활성화시킴으로써 간 섬유화가 일어난다. 간 섬유화를 일으키는 중요한 물질로는 PDGF와 TGF-β가 있는데 PDGF는 간성상세포의 증식을 강력하게 유발하는 물질이고, 따라서 PDGF 신호전달의 차단은 간 섬유화를 억제하는데 효과가 있는 것으로 밝혀져 있다. TGF-β는 간 섬유화 과정의 핵심적인 물질로서 간성상세포를 활성화시키며, 세포외기질의 합성을 유발하고 분해는 억제하여 간 섬유화를 유발한다. 이와 같은 물질 외에도 혈관 수축성 물질들(endothelin-1, norepinephrine, angiotensin Ⅱ) 등이 간 섬유화를 유발하는 방향으로 작용한다고 알려져 있는데, 특히 안지오텐신 Ⅱ는 손상된 간에서 수치가 증가되어 있으며 활성화된 간성상세포에서도 생성되어 간성상세포의 증식, 이동, 염증반응, 콜라겐 합성을 유발하는 물질로 알려져 있다.
간질성 신장 섬유화를 치료할 수 있는 약물로는 RAS (Renin-Angiotensin System)을 억제함으로써 혈압 및 사구체의 압력을 떨어뜨리는 방법을 이용하는 ACE Ⅰ과 AT1R 길항체가 있다. 이 두 가지 RAS 억제제 약제는 각각 문제점을 가지고 있다. ACE Ⅰ의 경우 비특이적인 RAS 억제, bradykinin 증가에 의한 기침이 발생할 수 있고, 다른 조직이나 ACE (angiotensin converting enzyme)가 아닌 다른 방향으로 생성된 ANG Ⅱ는 억제 되지 않는다. 또한 ACEⅠ의 사용 초기에는 ANG Ⅱ가 저하되나 얼마 후에는 원상 복귀되어 다시 ANG Ⅱ의 증가가 일어난다. AT1R의 길항제의 경우는 ACE Ⅰ에 비해 단백뇨를 줄이는 효과가 다소 떨어지며, 사용 후에 ANG Ⅱ, renin이 증가되는데 다시 증가된 ANG Ⅱ가 어떠한 효과를 나타내는지 아직 밝혀지지 않았다. 따라서 이러한 약제들을 통한 RAS의 억제는 어느 정도 신장 질환의 진행을 늦출 수는 있으나 예방할 수는 없으며, ANG Ⅱ를 최대한 억제하여도 임상 질환에서 신장 섬유화를 멈출 수 없다. 따라서 RAS의 억제와 더불어 신부전을 진행시키는 새로운 인자를 찾아서 치료제로 이용하는 것이 중요하다.
간 섬유화를 치료하기 위해 간에서 염증반응을 완화시키는 약제, 항-TGF-β 약제, 섬유화를 일으키는 수용체에 대한 길항제를 이용한 약제들이 현재 이용되고 있으나 아직까지 간 섬유화에 대한 표준적인 치료 방법은 없다. 간 섬유화에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있음에 따라 동물 실험에서 항-섬유화 효과를 보이는 물질이나 약물이 많이 발견되었지만 대부분은 사람에서 효과가 입증되지 않았다. 사람에게서 항-섬유화 효과를 입증하려면 장기간의 치료가 필요하며, 사람이 설치류보다 치료에 덜 예민하다는 점들이 임상연구가 적은 이유로 제시되고 있지만 항-섬유화 제제의 임상시험이 활성화되기 위해서는 간-특이적인 간 섬유화 표지자의 개발이 필요한 실정이다.
KLHL3 (Kelch like family member 3)는 43개의 Kelch like family 중 하나로, N-말단 부분에 BTB 도메인을 가지고 있어 단백질의 유비퀴틴화(protein ubiquitination)에 관여하는 단백질로 알려져 있다. 또한 이 단백질은 C-말단에 Kelch 반복 모티프를 가지는데, 이 모티프 부위에 Cullin3가 결합함으로써 E3 ubiquitin ligase를 형성하는 것으로 보고되어 있다. KLHL3와 관련된 연구는 주로 신장에서 진행되어 있는데, KLHL3는 신장에서 NCC (Na-Cl co-transporter)를 활성화 시키는 WNK1 및 WNK4의 분해를 유도함으로써 신장의 삼투압을 일정하게 조절하는 역할을 한다. 이 KLHL3 유전자를 결핍 시킨 마우스에서 WNK1, WNK4가 과발현되고, 이에 의해 고혈압이 발생된다고 알려져 있으며 RAS가 억제 된다고 보고 되었다. 다만 아직까지 구체적으로 섬유화와 관련해서 KLHL3의 역할은 알려져 있는 것이 없다. 이러한 배경 하에 본 발명자들은 효과적인 치료제가 거의 없는 섬유화를 예방 또는 치료하기 위하여, 새로운 섬유화 조절 인자로서 신장 섬유화나 간 섬유화 등과 같은 섬유화 질환을 치료하는 새로운 표적으로 KLHL3를 제시하려고 한다.
본 발명은 신장 섬유화, 간 섬유화 및 폐 섬유화 등으로 대표될 수 있는 섬유화 질환을 치료하기 위해 사용되었던 방법에 있어서, 낮은 예방 및 치료 효과, 부작용의 발생과 같은 문제점을 해결하기 위해서, 이들 방법을 대체하여 섬유화 질환의 예방과 치료에 이용될 수 있는 신규 표적을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 신규 표적에 작용하여 섬유화 질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 상기와 같은 신규 표적으로부터 섬유화 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 신규 표적에 작용하여 섬유화 질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있는 치료제 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 상기 유전자로부터 발현된 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 형질도입된 세포를 포함하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 피검체 유래 시료에서 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 섬유화 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 KLHL3 발현 세포주에 피검 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 섬유화 질환의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, KLHL3 유전자 결핍 마우스를 대상으로 인위적인 신장 섬유화 또는 간 섬유화를 유도한 경우에도 야생형 마우스에 신장 섬유화 또는 간 섬유화를 유도한 경우와 비교하였을 때, 섬유화 질환을 악화시키거나 질환의 결과로 나타나는 중요 물질들이 현저히 감소하여 있음이 확인되는바, KLHL3 유전자의 발현 또는 KLHL3 단백질의 활성을 억제함으로써 섬유화 질환의 예방 또는 치료에 대한 새로운 해결책을 제공할 수 있는 효과가 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 야생형 마우스(WT) 및 KLHL3 유전자 결핍 마우스(KLHL3 -/-)를 대상으로 일측성 요관 폐쇄(UUO)를 유도한 경우와 그렇지 않은 경우에 대하여, 헤마톡실린/에오신(H&E) 염색 및 마손삼색(MT stain) 염색한 결과를 나타낸 도 및 그래프이다.
도 2a는 야생형 마우스(WT) 및 KLHL3 유전자 결핍 마우스(KLHL3 -/-)를 대상으로 일측성 요관 폐쇄(UUO)를 유도한 경우와 그렇지 않은 경우에 대하여, α-SMA 및 collagen Ⅳ (COL Ⅳ)에 대한 항체를 이용하여 디아미노벤지딘 염색을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 야생형 마우스(WT) 및 KLHL3 유전자 결핍 마우스(KLHL3 KO)를 대상으로 일측성 요관 폐쇄(UUO)를 유도한 경우와 그렇지 않은 경우에 대하여, fibronectin(FN), α-SMA 및 collagen Ⅳ (COL Ⅳ)의 발현량(단백질의 양 및 mRNA의 양)을 분석한 결과를 나타낸 도 및 그래프이다.
도 2c는 야생형 마우스(WT) 및 KLHL3 유전자 결핍 마우스(KLHL3 KO)를 대상으로 일측성 요관 폐쇄(UUO)를 유도한 경우와 그렇지 않은 경우에 대하여, F4/80 항체를 이용하여 디아미노벤지딘 염색을 수행한 결과를 나타낸 도 및 그래프이다.
도 2d는 야생형 마우스(WT) 및 KLHL3 유전자 결핍 마우스(KLHL3 KO)를 대상으로 일측성 요관 폐쇄(UUO)를 유도한 경우와 그렇지 않은 경우에 대하여, MCP-1의 발현량(mRNA 양)을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2e는 야생형 마우스(WT) 및 KLHL3 유전자 결핍 마우스(KLHL3 KO)를 대상으로 일측성 요관 폐쇄(UUO)를 유도한 경우와 그렇지 않은 경우에 대하여, FGF23 및 Klotho의 발현량(단백질의 양 및 mRNA의 양)을 분석한 결과를 나타낸 도 및 그래프이다.
도 2f는 야생형 마우스(WT) 및 KLHL3 유전자 결핍 마우스(KO)를 대상으로 일측성 요관 폐쇄(UUO)를 유도한 경우와 그렇지 않은 경우에 대하여, TGF-β, renin 및 angiotensin I의 발현량(mRNA의 양)을 분석한 결과를 나타낸 도 및 그래프이다.
도 3은 일반 식이(Normal chow diet; ND)를 섭취시킨 마우스 및 메티오닌-콜린 결핍 식이(Methionine-Choline Deficient Diet; MCD)를 섭취시켜 간 손상을 유도한 마우스에 대하여, KLHL3 유전자의 발현량(mRNA의 양)을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 야생형 마우스(KLHL3 +/+) 및 KLHL3 유전자 결핍 마우스(KLHL3 -/-)를 대상으로 일반 식이(Chow)를 섭취시킨 경우와 MCD를 섭취시켜 간 손상을 유도한 경우에 대하여, 간 조직에 Sirius red 염색을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 야생형 마우스(KLHL3 +/+) 및 KLHL3 유전자 결핍 마우스(KLHL3 -/-)를 대상으로 일반 식이(Chow, ND)를 섭취시킨 경우와 MCD를 섭취시켜 간 손상을 유도한 경우에 대하여, Collagen Type I(Col I) 항체를 이용하여 디아미노벤지딘 염색을 수행한 결과 및 collagen type I의 발현량(mRNA 양)을 분석한 결과를 나타낸 도 및 그래프이다.
도 4c는 야생형 마우스(KLHL3 +/+) 및 KLHL3 유전자 결핍 마우스(KLHL3 -/-)를 대상으로 일반 식이(Chow, ND)를 섭취시킨 경우와 MCD를 섭취시켜 간 손상을 유도한 경우에 대하여, α-SMA에 대한 항체를 이용하여 형광 염색을 수행한 결과 및 α-SMA의 발현량(mRNA 양)을 분석한 결과를 나타낸 도 및 그래프이다.
먼저, 본 발명에서 사용된 용어를 정의한다.
본 발명에서 '섬유화 질환'은 다양한 원인에 의해 장기의 일부가 굳는 현상을 의미하며, 신장 섬유화, 간 섬유화, 폐 섬유화 등을 포함한다.
본 발명에서 '신장 섬유화'는 신장 조직에서 발생하는 과다한 염증반응, 상피세포의 섬유세포화 등과 같은 다양한 원인들로 인하여 신장조직 및/또는 혈관이 단단하게 굳어져 신장의 기능을 상실하게 되는 증상을 의미한다.
본 발명에서 '예방'은 질환 또는 장애에 걸릴 위험을 감소시키는 것을 나타내며, 즉 질환에 노출되거나 질환에 걸리기는 쉽지만 아직 질환에 걸리거나 질환의 증후를 나타내지 않는 대상에서 질병의 1종 이상의 임상적 증후가 진행되지 않도록 하는 것을 나타낸다. 상기 '치료'는 질환 또는 장애를 경감시키는 것을 나타내며, 즉 질환 또는 이의 1종 이상의 임상적 증후의 진행을 저지 또는 감소시키는 것을 나타낸다.
본 발명에서 '진단'은 하나 이상의 지표, 이를 테면 질환, 장애, 또는 상태의 징후 또는 증상의 존재에 기초하여 질환, 장애, 또는 상태를 갖는 대상을 확인하기 위한 관찰, 테스트 또는 환경들에 기초한 대상의 상태의 임상적 또는 여타 평가를 나타낸다.
본 발명에서 '시료'는 대상으로부터 분리된 유사한 유동체들, 세포들, 또는 조직들의 수집물을 나타낸다. '시료'라는 용어는 신체의 유동체(예컨대, 소변, 혈청, 혈액 유동체들, 림프, 담낭 유동체, 복수(ascetic) 유동체, 안구 유동체들, 그리고 기관지 세척 및/또는 복막 헹굼에 의하여 수집된 유동체들), 복수들(ascites), 조직 시료들 또는 대상으로부터의 세포를 포함한다. 또한, 눈물 방울들, 혈청, 뇌척수 유동체, 분변들, 객담, 그리고 세포 추출물들을 포함한다.
본 발명에서 '피검 물질'은 세포 내에서 유의하게 일어나는 유전자 발현량의 변화를 간접적 또는 직접적으로 유도할 수 있을 것으로 예상되는 모든 물질을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명의 일 측면은 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 상기 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 KLHL3 (Kelch-like family member 3) 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함한다.
상기 KLHL3 (Kelch-like family member 3) 유전자는 사람에게서 발현되며 Kelch-like family member 3 단백질을 암호화하는 유전자를 의미한다. 상기 KLHL3 유전자로부터 발현된 KLHL3 단백질은 cullin3와 함께 E3 ubiquitin ligase 복합체를 이루어, 상기 단백질의 C-말단 부위에 존재하는 6개의 kelch-like 반복 서열과 N-말단 부위의 BTB 도메인이 상호작용하여 기질을 유비퀴틴화시키는 기능을 갖는 단백질이다. 상기 KLHL3 유전자의 염기서열 및 상기 KLHL3 단백질의 아미노산 서열은 NCBI의 GenBank 등의 공개된 데이터베이스나 문헌에서 얻을 수 있다.
상기 KLHL3 유전자의 발현 억제제는 KLHL3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA (short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA)일 수도 있고, 프로모터에 결합해서 전사를 억제하는 등의 내용 추가 - 이에 한정하지 않고 통상의 기술자에게 알려진 어떠한 발현을 억제하는 제제이든 가능하다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-크릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA또는 성숙된 mRNA에 대해 상보적 염기서열을 가지고 있어 상보적으로 결합(혼성화)하여 DNA로부터 단백질에 이르는 유전정보의 흐름을 방해하는 뉴클레오티드이다.
상기 작은 간섭 RNA는 상기 KLHL3 유전자 서열과 상동인 독립적인 센스 RNA와 이에 상보적인 안티센스 RNA가 이중가닥 RNA 분자를 형성하는 것일 수 있다. 상기 이중가닥 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. 상기 센스 RNA 및/또는 안티센스 RNA 가닥은 이의 당 부분, 염기 부분 또는 인터뉴클레오티드 구조 내에 최소한 1개의 화학적 변형을 포함하는 것이 가능하다. 이러한 변형은 생체 내에서 뉴클레아제에 의해 siRNA의 파괴를 저해하는 것을 가능하게 할 수 있다. 또한, 상기 작은 간섭 RNA는 '분리된 것'이며, 이는 자연 상태에 있지 않은 것을 의미하지만 인간의 개입과 관련된 모든 수단에 의해 얻어질 수 있는 것을 의미하고, 특히 화학적 합성, PCR에 의한 요구되는 뉴클레오티드 서열의 증폭 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 작은 간섭 RNA를 정제함으로써 얻어질 수 있다.
상기 짧은 헤어핀 RNA는 상기 KLHL3 유전자 서열과 상동인 센스 RNA와 이에 상보적인 안티센스 RNA가 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조를 이루는 헤어핀 구조의 단일 RNA 가닥일 수 있다. 상기 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. 또한, 상기 로프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스 RNA 서열과 안티센스 RNA 서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3 내지 10 정도의 염기를 가지고 있으면 족하다.
상기 KLHL3 단백질의 활성 억제제는 KLHL3 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체일 수 있으나, 이에 한정하지 않고 통상의 기술자에게 알려진 어떠한 활성을 억제하는 제제이든 가능하다.
상기 KLHL3 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드 미메틱스(peptide mimetics)는 KLHL3 단백질이 기질과 결합하거나 반응을 촉매하는 도메인 부위를 억제하는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있다.
상기 KLHL3 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머(aptamer)는 상기 단백질을 표적으로 하여 특이적인 결합을 형성할 수 있는 특징을 가지며 안정적인 3차 입체구조를 이루고 있는 단일가닥 핵산 분자를 의미하며, SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기술 등을 이용하여 상기 단백질에 특이성을 가진 앱타머를 합성할 수 있다.
상기 KLHL3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 면역학적으로 상기 단백질의 에피토프(epitope)와 특이적 결합하여 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 의미하며, 단일클론항체, 다클론항체, 전체 길이의 사슬 구조를 가진 항체, 적어도 항원 결합 기능을 갖는 기능적인 단편의 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다.
상기 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제는, 그 자체가 그대로 본 발명의 상기 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 내에 포함될 수도 있고, 상기 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 벡터에 삽입된 형태로 포함될 수도 있다.
상기 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 벡터에 삽입된 형태로 본 발명의 상기 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 내에 포함되는 경우, 상기 벡터는 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이의 전사 또는 해독을 위한 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 조절 서열 중 특히 중요한 조절 서열은 프로모터, 인핸서와 같이 전사 개시를 조절하는 것이다. 또한, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 코작(Kozak), 인핸서, 막 표적화 및 분비를 위한 신호서열, IRES(Internal Ribosome Entry Site) 등으로 이루어진 조절 서열을 포함할 수 있다. 이러한 조절 서열과 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 작동가능하게 연결될 수 있다.
재조합 바이러스의 특정 목적을 위해 도입되는 프로모터에는, 지속적인 유전자 발현을 유도하는 바이러스 유래의 CMV 프로모터, RSV 프로모터, SV 프로모터 등이 있으며, 특정 환경에서만 유전자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터, 호르몬에 의해 작동이 유도되는 ERE를 포함하고 있는 프로모터, 곤충 호르몬인 엑다이손에 의해 작동되는 프로모터, 항생제 테트라사이클린에 의해 유도되는 프로모터 등이 포함된다. 이들 프로모터는 목적 유전 물질의 목적에 적합하게 바이러스 게놈에 삽입하여 사용할 수 있다.
상기 벡터는 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 신장 조직 또는 간 조직에서 특이적으로 발현시키는 프로모터를 추가로 포함할 수 있고, 신장 특이적 또는 간 특이적이고, KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절할 수 있는 프로모터라면 본 발명에 적용 가능하다. 신장 특이적 또는 간 특이적 프로모터와 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 작동 가능하게 연결되며, 신장 특이적 또는 간 특이적 프로모터와 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터를 동물 모델에 도입함으로써, KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 다른 조직보다도 신장 또는 간에서만 특이적으로 발현하게 되며, 유전자 치료의 효율이 높아질 수 있다. 신장 특이적 또는 간 특이적 프로모터는 다른 유전자 또는 임의의 다른 동물 종으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기'작동 가능하게 연결된'이란 프로모터 서열의 다운스트림에 유전자가 연결될 때, 해당 유전자의 발현이 가능한 형태로 연결되는 것을 나타낸다.
상기 벡터는 인간 또는 동물 세포에서 발현 가능한 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 재조합 바이러스성 벡터일 수 있고, 상기 재조합 바이러스는 베큘로 바이러스, 배니시아 바이러스, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 아데노 관련 바이러스일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 측면은 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 형질도입된 세포를 포함하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
벡터는 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 방법으로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 도입 방법으로는 일렉트로포레이션(electroporation) 및 리포펙션(lipofection) 등이 있으나 이에 한정된 것이 아니며, 본 기술 분야에 공지된 방법을 선택할 수 있다.
상기 형질도입은 안정적이거나 일시적일 수 있다. 일시적 형질도입의 한 가지 예는 벡터가 숙주 세포 게놈 내에 통합되지 않는, 특정 세포 내에서의 벡터 발현을 포함한다. 또 다른 한편, 안정적 형질도입은 벡터가 숙주 세포 게놈 내에 통합되는, 특정 세포 내에서의 벡터 발현을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 본 발명에서 '투여'는 약제학적 조성물 또는 약제를 대상의 시스템 내로 또는 대상 내 또는 위의 특정한 영역에 전달하는 방법을 포함한다. 투여는 예를 들면, 장내로, 비경구적으로, 정맥 내로, 근육 내로, 피하로, 피내로, 비강 내로, 경구로, 경피적으로, 자궁내 경막, 뇌혈관내(intracerebroventricular) 또는 점막으로 투여될 수 있다. 또한, 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상과 함께 투여될 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다.
상기 '약학적으로 허용 가능한'의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 '담체'는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.
상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제 등은 단독으로 또는 담체 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회 투여 또는 반복 투여 제형일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 담체, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 산제는 본 발명의 유효 성분과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용가능한 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 상기 유효성분, 약학적으로 허용 가능한 적당한 담체 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용 가능한 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용 가능한 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 유효 성분은 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약학적으로 허용 가능한 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.
상기 투여시 유효성분인 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제, KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 가 형질도입된 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 한 성분의 양은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율, 목적 부위 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 약학적 조성물의 일일 투여량은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg으로, 바람직하게는 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 양을 1일 1회 투여할 수 있다. 아울러, 투여 기간은 1일 내지 2개월일 수 있으나, 질환의 예방 또는 치료 효과가 나타날 때까지 제한 없이 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량을 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물로 사용될 경우, 상기 조성물 내의 상기 유효성분은 30μM 이상, 구체적으로는 35μM 이상, 보다 구체적으로는 40μM 이상의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 유효성분으로서, KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 포함될 경우, 0.05 내지 500 ㎎가 함유되는 것이 바람직하고, 0.1 내지 300 ㎎가 함유되는 것이 더욱 바람직하며, KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 103~1012 IU (10 내지 1010 PFU)가 함유되는 것이 바람직하고, 105 내지 1010 IU를 함유되는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1 ㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 107 내지 1011 바이러스 입자(105 내지 109 IU)/㎏이고, 바람직하게는 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 108 내지 1010 입자(106 내지 108 IU)/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
2. 섬유화 질환의 진단 방법
본 발명의 다른 측면은 섬유화 질환의 진단 방법, 구체적으로는 섬유화 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 섬유화 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은, 1) 피검체 유래 시료에서 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 KLHL3 유전자의 발현량을 측정하는 단계는 상기 KLHL3 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 양을 증폭시킬 수 있는 제제를 이용하여 측정하는 단계일 수 있다.
구체적인 예로, 상기 mRNA 또는 mRNA를 역전사시켜 만든 cDNA의 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브를 이용하여 측정하는 것일 수 있으며, 중합효소 연쇄반응(PCR), RT-PCR(Reverse transcription-PCR), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 노던 블롯(Northern blot), 마이크로 어레이(Microarray), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 염기서열 분석(sequencing) 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 한정하지 않고 통상의 기술자에게 알려진 어떠한 방법을 이용하여 측정하는 것이든 가능하다.
또한, 상기 KLHL3 유전자의 발현량을 측정하는 단계는 상기 KLHL3 유전자로부터 발현된 KLHL3 단백질에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있는 제제를 이용하여 측정하는 단계일 수 있다.
구체적인 예로, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 측정하는 것일 수 있으며, 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining, IHC), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence) 등의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 한정하지 않고 통상의 기술자에게 알려진 어떠한 방법을 이용하여 측정하는 것이든 가능하다.
상기 KLHL3 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩 등의 방법으로 측정할 수 있고, 단백질의 활성 수준을 측정할 수 있는 방법이면 본 발명에 제한 없이 적용할 수 있다.
한편, 본 발명의 상기 섬유화 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은, 상기 측정하는 단계에서 측정된 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준을 정상 개체 유래 시료의 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준과 비교하는 단계; 및 비교하는 단계의 비교 결과 피검체 유래 시료의 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준이 정상 개체 유래 시료에 비해 높은 경우 상기 피검체를 섬유화 질환의 발생 위험이 높은 것으로 판정하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 피검체 유래 시료에서 KLHL3 유전자의 발현량을 정상 개체의 KLHL3 유전자의 발현량과 비교하였을 때, KLHL3 유전자로부터 발현된 mRNA 또는 단백질의 양이 정상 개체의 mRNA 양 또는 단백질의 양보다 더 높게 나타날 경우 장차 섬유화 질환이 발생할 가능성이 높거나 현재 섬유화 질환이 진행되고 있을 가능성이 높은 것으로 판정하는 정보를 피검체에게 제공할 수 있다. 아울러, 피검체 유래 시료 내에 존재하는 KLHL3 단백질의 활성 수준이 정상 개체의 KLHL3 단백질의 활성 수준보다 더 높은 활성을 보이는 것으로 나타날 경우에도 장차 섬유화 질환이 발생할 가능성이 높거나 현재 섬유화 질환이 진행되고 있을 가능성이 높은 것으로 판정하는 정보를 피검체에게 제공할 수 있다.
3. 섬유화 질환의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법
본 발명의 다른 측면은 KLHL3 발현 세포주에 피검 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 섬유화 질환의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
한편, 본 발명의 섬유화 질환의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법은, 상기 피검 물질을 처리하는 단계의 피검 물질이 처리된 세포주에서 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정하는 단계의 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준이 피검 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검 물질을 선별하는 단계;를 더 포함 할 수 있다.
상기 피검 물질은 천연 화합물, 합성 화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
상기 KLHL3 유전자의 발현량을 측정하는 방법 및 KLHL3 단백질의 활성 수준을 측정하는 방법은 상기 KLHL3 유전자의 발현량 측정을 통한 섬유화 질환의 진단 방법에서 설명한 KLHL3 유전자의 발현량을 측정하는 방법 및 KLHL3 단백질의 활성 수준 측정하는 방법과 동일하다.
상기 KLHL3 발현 세포주에 피검 물질을 처리한 결과 피검 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 KLHL3 유전자로부터 발현된 mRNA의 양 또는 단백질의 양이 더 감소한 것으로 나타나거나, KLHL3 단백질의 활성 수준이 더 낮게 나타날 경우, 처리한 피검 물질은 KLHL3 단백질이 섬유화 질환을 진행시키거나 악화시키는 것을 저해하는 섬유화 질환 치료제의 후보물질일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되지 아니한다.
KLHL3 유전자가 결핍된 마우스 모델에서의 신장 간질성 섬유화(interstitial fibrosis) 진행 억제 여부 확인
Wei Ni 등의 PLoS One. 2014; 9(9): e106718.에 개시된 CRISPR/CAS9 유전자 교정 방법을 이용하여 KLHL3 유전자 결핍(KLHL3 knock-out; KLHL3 KO) 마우스를 제조하였다. CRISPR 시스템은 세균의 면역 시스템으로, 바이러스 및 플라스미드의 침입 시에 이들 단편을 DNA로 기억하고 있다가 재감염시 유전자 가위 역할을 하는 뉴클레아제인 Cas9(CRISPR associated protein 9: RNA-guided DNA endonuclease enzyme)으로 잘라 없앤다. 상기 CRISPR 시스템은 유전체에서도 적용가능하며, 특정 염기 서열인 가이드 RNA(gRNA)에 의해서 인식 되는 부위를 잘라서 원하는 부위의 교정이 가능하다. Cas9과 sgRNA(single guide RNA)를 발현하는 pX330 벡터(Bicistronic expression vector) 제조 시, gRNA는 KLHL3 유전자를 표적으로 하여 제작하였다. KLHL3 유전자의 야생형 WT (1, 2), KLHL3 KO (1, 2)의 염기 서열은 하기 [표 1]과 같다. 제조된 pX330 벡터는 마우스 배아 줄기세포(embryonic stem cell)에 미세주입 기법을 통해 도입하여 두 종의 KO 마우스를 생산하였다.
서열번호 유전자 명칭 염기 서열
1 gRNA1 TGAAGAGAAGAAC
2 gRNA2 GGATGAAGAGAAGAA
3 KLHL3 WT1 CTGAGGATGAAGAGAAGAACCGGAGG
4 KLHL3 KO1 CTGAGGATGAAGAGAAGAAAACCGGAGG
5 KLHL3 WT2 GATGAAGAGAAGAACCGGAGGACTGTAACCGT
6 KLHL3 KO2 GATGANTN*****************TAACCGT
서열번호4에서 굵게 표시된 서열은 뉴클레오티드의 삽입을 의미하며 서열번호6에서*은 뉴클레오티드의 결실을 의미한다.
KLHL3 유전자 결핍 마우스의 대조군으로 야생형 C57BL6/N 마우스를 사용 하였으며 이는 한국생명공학연구원 실험동물자원센터(대한민국, 대전)에서 키우거나, 혹은 라온바이오㈜에서 구매하여 사용하였다.
KLHL3 유전자 결핍 마우스 및 야생형 마우스를 대상으로 일측성 요관 폐쇄(unilateral ureteral obstruction, UUO)를 통해 인위적으로 신장 섬유화를 유도하였다. 일측성 요관 폐쇄모델(UUO)은 마우스를 흡입 마취제를 이용한 호흡 마취 후 마우스의 배(abdomen)을 절개 후, 소화기관들 뒤에 위치하는 신장과 연결된 수뇨관(Ureter) 의 근위부(Proximal)와 원위부(Distal)를 봉합사로 묶은 후 그 사이를 가위로 절개하여 만들었으며, 일측성 요관 폐쇄모델(UUO)을 만든 후 7일 후에 마우스를 희생하여 신장섬유화와 관련된 분석을 진행하였다.
상기 신장 섬유화가 유도된 KLHL3 유전자가 결핍된 마우스 및 야생형 마우스의 신장 조직을 헤마톡실린/에오신 염색 및 마손삼색 염색하여 간질성 섬유화(interstitial fibrosis)의 진행 여부를 확인하였다. 그 결과, KLHL3 유전자 결핍 마우스에서는 일측성 요관 폐쇄를 통해 신장 섬유화를 유도하였음에도, 야생형 마우스의 경우에 비해 간질성 섬유화의 진행이 현저히 억제되어 있음을 확인하였다(도 1 참고).
상기와 같은 결과를 통해 KLHL3 유전자가 발현되지 못하는 경우 신세뇨관 및 간질 부위에서 발생하는 간질성 섬유화가 억제되어 있음을 직접적으로 확인할 수 있었고, 따라서 KLHL3 유전자의 발현 억제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제가 간질성 섬유화 질환에 있어 새로운 예방책 또는 치료책이 될 수 있다.
KLHL3 유전자가 결핍된 마우스 모델에서의 신장 섬유화(renal fibrosis) 진행 억제 여부 확인
2-1. 세포외기질 단백질의 감소 확인
먼저, 일측성 요관 폐쇄를 통해 신장 섬유화가 유도된 KLHL3 유전자 결핍 마우스 및 야생형 마우스의 신장 조직에서 α-SMA(α smooth muscle actin)와 콜라겐 Ⅳ 의 축적을 확인하기 위하여 α-SMA에 대한 항체(ab7817, abcam) 및 콜라겐 Ⅳ에 대한 항체(ab6586, abcam)를 이용하여 디아미노벤지딘 염색을 통해 α-SMA 및 콜라겐 Ⅳ의 축적 정도를 확인하였다. 그 결과, KLHL3 유전자 결핍 마우스에서는 일측성 요관 폐쇄를 통해 신장 섬유화를 유도하였음에도, 야생형 마우스에서 신장 섬유화를 유도한 경우에 비해 α-SMA와 콜라겐 Ⅳ의 축적 정도가 현저하게 억제되고 있음을 확인하였다(도 2a 참고).
아울러, 상기 신장 조직에서 FN (fibronectin), α-SMA 및 콜라겐 Ⅳ의 발현량을 단백질의 양은 항-αSMA 마우스 단일클론 항체 (ab7817; abcam), 항-콜라겐Ⅳ 토끼 다클론 항체 (ab6586,;abcam), 항-피브로넥틴 토끼 다클론 항체 (ab2413; abcam)를 사용하여 웨스턴 블랏을 통해 확인하였고, 각 유전자의 mRNA 양 측정을 위해 트리졸trizol) 시약 (Life Technologies)을 이용하여 전체 RNA(total RNA)를 마우스 신장조직으로부터 추출한 후, 역전사 키트 (Promega)를 이용해 cDNA(complementary DNA)를 합성하였고, 합성된 cDNA는 QuantiSpeed SYBR Mix contents(PhileKorea)를 가지고 실시간 qPCR(real-time quantitative PCR)을 통해 분석하였다. KLHL3 유전자 결핍 마우스에서는 일측성 요관 폐쇄를 통해 신장 섬유화를 유도하였음에도, 야생형 마우스에서 신장 섬유화를 유도한 경우에 비해 FN, α-SMA 및 콜라겐 Ⅳ의 단백질 발현량 및 mRNA의 양이 현저하게 감소되어 있음을 확인하였다(도 2b 참고). PCR 분석을 위해 사용된 프라이머는 하기 [표 2]와 같다.
서열번호 서열 명칭 염기서열
7 FN forward primer sequence 5'-CCCGCTAAACTCTTCCACCAT-3'
8 FN reverse primer sequence 5'-TGTGTCAGTGTAGTAGGGGCA-3'
9 α-SMA forward primer sequence 5'-GGCATCCACGAAACCACCTAT-3'
10 α-SMA reverse primer sequence 5'-TTCTGGAGGGGCAATGATCTTG-3'
11 Col14a1 forward primer sequence 5'-GCTCTGGCTGTGGAAAATGTG-3'
12 Col14a1 reverse primer sequence 5'-GTTCTCCAGCATCACCCTTTTG-3'
13 Col1a1 forward primer sequence 5'-CCCGAACCCCAAGGAAAAGAA-3'
14 Col1a1 reverse primer sequence 5'-TAGGCTACGCTGTTCTTGCAG-3'
상기와 같은 결과를 볼 때, KLHL3 유전자와 신장에서 섬유화를 유발하는 상기 FN, α-SMA 및 콜라겐 Ⅳ와 같은 세포외기질 단백질의 발현 및 축적 간에 관계가 있으며, KLHL3 유전자의 발현 억제 또는 KLHL3 단백질의 활성을 억제하는 방법을 통하여 신장 섬유화의 예방, 치료가 가능할 수 있다.
2-2. 염증반응의 감소 확인
신장 섬유화 과정은 염증반응을 동반하기 때문에 일측성 요관 폐쇄를 통해 신장 섬유화가 유도된 KLHL3 유전자 결핍 마우스 모델에서 신장 섬유화의 억제와 함께 염증반응도 감소하였는지 여부를 확인하였다. 염증반응 시 동원되는 대식세포의 동원 수를 확인하기 위하여 대식세포 마커인 F4/80 항체(항-F4/80 토끼 다클론 항체, ab74383; abcam)를 이용하여 디아미노벤지딘 염색을 수행하였고, 대식세포의 동원을 유도하는 대표적인 사이토카인인 MCP-1의 발현량(mRNA 양)을 확인하였다. 전체 RNA(Total RNA)는 마우스 신장조직으로부터 트리졸(trizol) 시약(Life Technologies)을 이용하여 추출하였고, cDNA(complementary DNA)는 역전사 키트 (Promega)를 이용해 합성하였다. 합성된 cDNA는 QuantiSpeed SYBR Mix contents (PhileKorea)를 가지고 실시간 qPCR(real-time quantitative PCR)을 통해 분석하였다. PCR 분석을 위해 사용된 프라이머는 하기 [표 3]과 같다.
서열번호 서열 명칭 염기서열
15 MCP1 forward primer sequence 5'-CACCTGCTGCTACTCATTCAC-3'
16 MCP1 reverse primer sequence 5'-TGTCTGGACCCATTCCTTCTT-3'
그 결과, KLHL3 유전자 결핍 마우스에서는 일측성 요관 폐쇄를 통해 신장 섬유화를 유도하였음에도, 야생형 마우스에서 신장 섬유화를 유도한 경우에 비해, 대식세포의 동원 수도 감소하였고(도 2c 참고) MCP-1의 발현도 함께 감소되어 있음을 확인하였다(도 2d 참고).
상기와 같은 결과를 볼 때, KLHL3 유전자가 발현되지 않을 때는 신장 섬유화 질환 발생 시 수반되는 염증반응이 감소하였는바, KLHL3 유전자의 발현 억제 방법이 신장 섬유화 치료에 이용할 수 있음을 간접적으로 증명한 것으로 볼 수 있다.
2-3. 섬유화와 관련된 각종 인자들의 증감 확인
상기 실시예들과 마찬가지로 일측성 요관 폐쇄를 통해 인위적인 신장 섬유화를 유도한 KLHL3 유전자 결핍 마우스 및 야생형 마우스를 대상으로 섬유화 질환과 관련된 각종 인자들의 발현량을 측정하였다.
먼저, 신장 섬유화 과정에서 신장 섬유화세포를 활성화시키는 성장인자인 FGF23 (fibroblast growth factor 23)과, 반대로 섬유화를 억제하는 역할을 하는 Klotho의 발현량을 확인하였다. KLHL3 유전자 결핍 마우스에서는 일측성 요관 폐쇄를 통해 신장 섬유화를 유도하였음에도 야생형 마우스에서 신장 섬유화를 유도한 경우에 비해 FGF23(항-FGF23 마우스 단일클론 항체, sc-74412, Santa Cruz)의 단백질 및 mRNA 양은 감소하였고, Klotho(항-Klotho 염소 다클론 항체, sc-22220, Santa Cruz)의 단백질 및 mRNA 양은 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 2e 참고). 전체 RNA(Total RNA)는 마우스 신장조직으로부터 트리졸(trizol) 시약(Life Technologies)을 이용하여 추출하였고, cDNA(complementary DNA)는 역전사 키트 (Promega)를 이용해 합성하였다. 합성된 cDNA는 QuantiSpeed SYBR Mix contents (PhileKorea)를 가지고 실시간 qPCR(real-time quantitative PCR)을 통해 분석하였다. PCR 분석을 위해 사용된 프라이머는 하기 [표 4]와 같다.
서열번호 서열 명칭 염기 서열
17 FGF23 forward primer sequence 5'-GTCGCAGAAGCATCACTACCT-3'
18 FGF23 reverse primer sequence 5'-GAGAGCAGGATACAGGCACAG-3'
19 Klotho forward primer sequence 5'-TTCGGTGGTCAGGTCAAGTAC-3'
20 Klotho reverse primer sequence 5'-GGCGGAAAGAGGTGTTGTAGA-3'
아울러, 사구체 경화증(glomerulosclerosis)과 요관사이 섬유화(ubulointerstitial fibrosis)를 일으키는 중요 물질인 TGF-β, 및 신장 섬유화를 유도하는 레닌-안지오텐신(Renin-Angiotensin) 신호전달경로의 리간드인 레닌과 수용체인 제 1형 안지오텐신　II 수용체의 발현량을 확인하였다. 그 결과, KLHL3 유전자 결핍 마우스에서는 일측성 요관 폐쇄를 통해 신장 섬유화를 유도하였음에도 야생형 마우스에서 신장 섬유화를 유도한 경우에 비해 TGF-β, 레닌 및 제 1형 안지오텐신　II 수용체의 mRNA 양이 모두 감소하였음을 확인할 수 있었다(도 2f 참고).
전체 RNA(Total RNA)는 마우스 신장조직으로부터 트리졸(trizol) 시약(Life Technologies)을 이용하여 추출하였고, cDNA(complementary DNA)는 역전사 키트 (Promega)를 이용해 합성하였다. 합성된 cDNA는 QuantiSpeed SYBR Mix contents (PhileKorea)를 가지고 실시간 qPCR(real-time quantitative PCR)을 통해 분석하였다. PCR 분석을 위해 사용된 프라이머는 하기 [표 5]와 같다.
서열번호 서열 명칭 염기 서열
21 TGF-β forward primer sequence 5'-GCCTGAGTGGCTGTCTTTTGA-3'
22 TGF-β reverse primer sequence 5'-GGCTGATCCCGTTGATTTCCA-3'
23 Renin forward primer sequence 5'-ATCCCGCTCAAGAAAATGCCT-3'
24 Renin reverse primer sequence 5'-GATGCCAATCTCGCCGTAGTA-3'
25 Agtr1a forward primer sequence 5'-GGCTTCCTGTTCCCTTTCCTA-3'
26 Agtr1a reverse primer sequence 5'-GTCCACGATGTCGGCAATTTTA-3'
상기와 같은 섬유화 관련 각종 인자들의 발현량 측정 결과들을 볼 때 KLHL3 유전자의 발현을 억제할 경우, 신장 섬유화를 진행시키는 방향으로 작용하는 FGF23, TGF-β, 레닌 및 제 1형 안지오텐신　II 수용체의 발현량은 감소하고 반대로 신장 섬유화를 억제하는 방향으로 작용하는 Klotho의 발현량은 증가하였는바, 상기의 실시예들과 마찬가지로 KLHL3 유전자의 발현 또는 KLHL3 단백질의 활성을 억제하여 신장 섬유화 질환의 예방 및 치료에 이용할 수 있음을 확인하였다.
간 손상을 유도한 마우스에서의 KLHL3 유전자 발현 양상 확인
마우스를 대상으로 메티오닌-콜린 결핍 식이(Methionine-Choline Deficient Diet; MCD)를 섭취시켜 지속적인 간 손상을 유도할 경우 인위적인 간 섬유화가 발생한다. 일반식이 조성은 단백질 14.9%, 탄수화물 64.3%, 지질 10% 이며, 메티오닌-콜린 결핍 식이는 일반식이 조성에서 메티오닌과 콜린이 제외되었다. 일반 식이(Normal chow diet)를 섭취시킨 마우스와 MCD를 섭취시킨 마우스에서 각각 KLHL3 유전자의 발현 양상(mRNA의 양)을 확인한 결과, 인위적인 간 손상을 유발한 마우스에서 일반 식이를 섭취시킨 마우스에 비해 KLHL3 유전자의 발현이 높아지는 것을 확인하였다(도 3 참고).
전체 RNA(Total RNA)는 마우스 신장조직으로부터 트리졸(trizol) 시약(Life Technologies)을 이용하여 추출하였고, cDNA(complementary DNA)는 역전사 키트 (Promega)를 이용해 합성하였다. 합성된 cDNA는 QuantiSpeed SYBR Mix contents (PhileKorea)를 가지고 실시간 qPCR(real-time quantitative PCR)을 통해 분석하였다. PCR 분석을 위해 사용된 프라이머는 하기 [표 6]과 같다.
서열번호 서열 명칭 염기 서열
27 KLHL3 forward primer sequence 5'-GAGACTCGCCTAGACCACA-3'
28 KLHL3 reverse primer sequence 5'-AAGTCATAGCACTCCACGCT-3'
29 GAPDH forward primer sequence 5'-GAGACCCCACTAACATCAAA-3'
30 GAPDH reverse primer sequence 5'-TTGCTGACAATCTTGAGTGA -3'
상기와 같은 결과를 볼 때, 간 손상에 의한 간 섬유화 질환의 발생과 KLHL3 유전자의 발현 간에 관계가 있는바, KLHL3 유전자가 간 섬유화 질환의 예방 및 치료의 표적으로 이용될 수 있는 가능성이 있다.
KLHL3 유전자가 결핍된 마우스 모델에서의 간 섬유화(liver fibrosis) 진행 억제 여부 확인
상기 실시예 4에서 확인한 바와 같이 간 섬유화 발생 시 KLHL3 유전자의 발현이 증가하여 있으므로, MCD 섭취를 통해 인위적인 간 손상을 유발한 KLHL3 유전자 결핍 마우스의 간 조직을 대상으로 간 섬유화의 억제 정도를 확인하였다.
먼저, KLHL3 유전자 결핍 마우스와 야생형 마우스를 MCD 섭취를 통해 인위적인 간 손상을 유발시키고 간 조직에서 Sirius red 염색을 통해 간 섬유화의 정도를 확인한 결과, KLHL3 유전자 결핍 마우스에서는 MCD 섭취를 통해 간 손상을 유도하였음에도 야생형 마우스에서 간 손상을 유도한 경우에 비해, 간 섬유화가 상당히 억제되고 있는 것으로 확인되었다(도 4a 참고).
아울러, KLHL3 유전자 결핍 마우스에서 MCD를 섭취시켜 인위적인 간 손상을 유도하였고, 간 손상이 유도된 상기 마우스의 간 조직에서 제1형 콜라겐 및 α-SMA의 발현량을 확인하였다. 제1형 콜라겐 항체(항-콜라겐 I 토끼 다클론 항체, ab34710, abcam)를 이용한 디아미노벤지딘 염색 결과 및 mRNA의 양을 확인하였고(도 4b 참고), α-SMA 항체 (항-aSMA 마우스 단일클론 항체, c6198, sigma)를 이용한 형광 염색 결과 및 mRNA의 양을 확인한 결과(도 4c 참고), KLHL3 유전자 결핍 마우스에서는 MCD 섭취를 통해 간 손상을 유도하였음에도 야생형 마우스에서 간 손상을 유도한 경우에 비해, 제1형 콜라겐 및 α-SMA의 발현이 모두 감소되어 있음을 확인하였다.
전체 RNA(Total RNA)는 마우스 신장조직으로부터 트리졸(trizol) 시약(Life Technologies)을 이용하여 추출하였고, cDNA(complementary DNA)는 역전사 키트 (Promega)를 이용해 합성하였다. 합성된 cDNA는 QuantiSpeed SYBR Mix contents (PhileKorea)를 가지고 실시간 qPCR(real-time quantitative PCR)을 통해 분석하였다. PCR 분석을 위해 사용된 프라이머는 하기 [표 7]과 같다.
서열번호 서열 명칭 염기 서열
31 Col1a1 forward primer sequence 5'-CCCGAACCCCAAGGAAAAGAA-3'
32 Col1a1 reverse primer sequence 5'-TAGGCTACGCTGTTCTTGCAG-3'
상기와 같은 결과를 볼 때, 신장 섬유화뿐만 아니라 간 섬유화 질환의 진행과도 KLHL3 유전자가 높은 관련성을 가지며, 따라서 KLHL3 유전자의 발현이 일어나지 않는 마우스에서 섬유화와 관련된 단백질의 발현 및 섬유화가 억제되어 있음을 알 수 있는바, KLHL3 유전자의 발현 억제 또는 KLHL3 단백질의 활성을 억제하는 방법을 통하여 간 섬유화의 예방, 치료가 가능할 수 있다.
이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Composition for prevention or treatment of fibrosis disease <130> 2018DPA2792 <160> 32 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA1 <400> 1 tgaagagaag aac 13 <210> 2 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA2 <400> 2 ggatgaagag aagaa 15 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> mRNA <222> (1)..(26) <223> 539nt-564nt of Klhl3 mRNA <400> 3 ctgaggatga agagaagaac cggagg 26 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLHL3 KO1 <400> 4 ctgaggatga agagaagaaa accggagg 28 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> mRNA <222> (1)..(32) <223> 544nt-575nt of Klhl3 mRNA <400> 5 gatgaagaga agaaccggag gactgtaacc gt 32 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLHL3 KO2 <400> 6 gatgantnta accgt 15 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN forward primer sequence <400> 7 cccgctaaac tcttccacca t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN reverse primer sequence <400> 8 tgtgtcagtg tagtaggggc a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-SMA forward primer sequence <400> 9 ggcatccacg aaaccaccta t 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-SMA reverse primer sequence <400> 10 ttctggaggg gcaatgatct tg 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col14a1 forward primer sequence <400> 11 ggcatccacg aaaccaccta t 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col14a1 reverse primer sequence <400> 12 gttctccagc atcacccttt tg 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col1a1 forward primer sequence <400> 13 cccgaacccc aaggaaaaga a 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col1a1 reverse primer sequence <400> 14 taggctacgc tgttcttgca g 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP1 forward primer sequence <400> 15 cacctgctgc tactcattca c 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP1 reverse primer sequence <400> 16 tgtctggacc cattccttct t 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF23 forward primer sequence <400> 17 gtcgcagaag catcactacc t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF23 reverse primer sequence <400> 18 gagagcagga tacaggcaca g 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klotho forward primer sequence <400> 19 ttcggtggtc aggtcaagta c 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klotho reverse primer sequence <400> 20 ggcggaaaga ggtgttgtag a 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta forward primer sequence <400> 21 gcctgagtgg ctgtcttttg a 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta reverse primer sequence <400> 22 ggctgatccc gttgatttcc a 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Renin forward primer sequence <400> 23 atcccgctca agaaaatgcc t 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Renin reverse primer sequence <400> 24 gatgccaatc tcgccgtagt a 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Agtr1a forward primer sequence <400> 25 ggcttcctgt tccctttcct a 21 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Agtr1a reverse primer sequence <400> 26 gtccacgatg tcggcaattt ta 22 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLHL3 forward primer sequence <400> 27 gagactcgcc tagaccaca 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLHL3 reverse primer sequence <400> 28 aagtcatagc actccacgct 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer sequence <400> 29 gagaccccac taacatcaaa 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer sequence <400> 30 ttgctgacaa tcttgagtga 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col1a1 forward primer sequence <400> 31 cccgaacccc aaggaaaaga a 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col1a1 reverse primer sequence <400> 32 taggctacgc tgttcttgca g 21

Claims (19)

  1. KLHL3(Kelch-like family member 3) 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 KLHL3 유전자의 발현 억제제는 KLHL3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 KLHL3 단백질의 활성 억제제는 KLHL3 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 섬유화 질환은 신장 섬유화, 간 섬유화 및 폐 섬유화로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 벡터에 삽입된 형태인, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 벡터는 상기 KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 신장 조직 또는 간 조직에서 특이적으로 발현시키는 프로모터를 추가로 포함하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 청구항 6에 있어서,
    상기 벡터는 상기 벡터는 재조합 바이러스성 벡터인, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 재조합 바이러스는 베큘로 바이러스, 배니시아 바이러스, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. KLHL3 유전자의 발현 억제제 또는 KLHL3 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 형질도입된 세포를 포함하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 피검체 유래 시료에서 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 섬유화 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계에서 측정된 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준을 정상 개체 유래 시료의 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준과 비교하는 단계; 및
    상기 비교하는 단계의 비교 결과 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준이 정상 개체 유래 시료에 비해 높은 경우 상기 피검체를 섬유화 질환의 발생 위험이 높은 것으로 판정하는 단계;를 더 포함하는, 섬유화 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  13. 청구항 11또는 청구항 12에 있어서,
    KLHL3 유전자의 발현량은 중합효소 연쇄반응(PCR), RT-PCR(Reverse transcription-PCR), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 노던 블롯(Northern blot), 마이크로 어레이(Microarray), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 염기서열 분석(sequencing), 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining, IHC), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는, 섬유화 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  14. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    KLHL3 단백질의 활성 수준은 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는, 섬유화 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  15. KLHL3 발현 세포주에 피검 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 섬유화 질환의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 피검 물질을 처리하는 단계의 피검 물질이 처리된 세포주에서 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정하는 단계에서 측정한 KLHL3 유전자의 발현량 또는 KLHL3 단백질의 활성 수준이 피검 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검 물질을 선별하는 단계;를 더 포함하는, 섬유화 질환의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법.
  17. 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서,
    상기 피검 물질은 천연 화합물, 합성 화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 구성된 군으로부터 선택되는, 섬유화 질환의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법.
  18. 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서,
    상기 KLHL3 유전자의 발현량은 중합효소 연쇄반응(PCR), RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 노던 블롯, 마이크로 어레이, RNase 보호 분석법, 염기서열 분석, 웨스턴블랏, 효소-면역화학 검출법(ELISA), 면역조직화학염색법, 면역침강 및 면역형광법 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는, 섬유화 질환의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법.
  19. 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서,
    상기 KLHL3 단백질의 활성 수준은 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는, 섬유화 질환의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115961026A (zh) * 2022-12-13 2023-04-14 重庆市急救医疗中心(重庆市第四人民医院、重庆市急救医学研究所) Fto在筛选用于治疗肾间质纤维化药物中的应用

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