KR102118631B1

KR102118631B1 - 관절염 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트

Info

Publication number: KR102118631B1
Application number: KR1020190120856A
Authority: KR
Inventors: 김춘성
Original assignee: 조선대학교 산학협력단
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2020-06-03

Abstract

본 발명은 관절염 진단을 위한 진단용 조성물 및 키트에 관한 것으로, 본 발명의 조성물, 키트 및 방법은 환자의 시료로부터 쉽고, 정확하게 관절염 여부를 진단할 수 있으므로 관절염의 조기 진단 및 확정에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

관절염 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트{Composition for diagnosing arthritis and kit comprising the same}

본 발명은 관절염 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

관절염이란 관절에 어떤 원인에 의해서든 염증성 변화가 생긴 것을 총괄해서 지칭하는 병명으로 뼈와 뼈 마디를 연결하여 매끈하게 움직이게 하는 연골이 소실되는 것을 말한다. 관절염은 퇴행성 관절염 또는 골관절염, 류머티즘 관절염, 대퇴골두 무혈성괴사, 외상성 관절염, 결핵 및 화농성 관절염 등 여러 종류로 나뉜다.

연골조직의 파괴는 점진적이고 비가역적으로 일어나 삶의 질을 떨어뜨리는 난치성 질환인 관절염의 직접적인 원인이다. 여가 활동의 증가와 고령 인구의 증가로 인해 관절염의 치료법에 대한 중요성이 부각되고 있으나 아직 그 병리적 원인이나 근본적인 치료방법이 개발되지 않고 있다. 수술적 방법 이외에는 항염증제 등을 통한 통증 완화 등에 그치고 있으며 연골보호제 (히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴) 등이 개발되었으나 이 역시 연골퇴행과 연골생성 촉진 및 재생유도 등에는 그 효과가 확립되지 않았다.

그 중 퇴행성 관절염은 숨길 수 없는 노화의 징표로 우리나라 55세 이상 인구의 80%가 앓고 있으므로, 인체 내 200여개의 크고 작은 뼈 사이에서 이음매 역할을 하며 하루에도 10만여 회나 움직이는 중요한 인체의 일부인 관절연골의 노화를 예방하고 늦출 수 있는 방법은 고령화 시대 초미의 관심사일 수밖에 없다.

따라서, 퇴행성 관절염의 진행을 막거나 늦추기 위해서는 퇴행성 관절염을 조기에 진단할 필요가 있으나, 현재까지는 퇴행성 관절염을 진단하는 방법으로 정형외과의 병원내진 또는 X-ray와 같은 방법 등 만이 알려져 있는 실정이다.

이에 따라 관절염의 병리기전을 이해함으로써, 조기 진단을 위한 진단 마커를 발굴하여 이를 활용한 진단용 조성물, 키트 또는 진단을 위한 정보제공방법의 개발이 필요한 실정이다.

한국등록특허 1067817호

본 발명은 관절염 진단을 위한 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 관절염 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 관절염 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. NRSF(Neuron-Restrictive Silencer Factor) mRNA 또는 그 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 관절염 진단용 조성물.

2. 위 1에 있어서, 상기 물질은 연골세포 내에서 상기 NRSF mRNA 또는 그 단백질에 특이적으로 결합하는 것인, 관절염 진단용 조성물.

3. 위 1에 있어서, 상기 물질은 항체, 압타머, DNA, RNA, 단백질, 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 관절염 진단용 조성물.

4. 위 1에 있어서, 상기 관절염은 퇴행성 관절염인, 관절염 진단용 조성물.

5. 위 1 내지 4 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 관절염 진단용 키트.

6. 개체로부터 분리된 시료 내의 NRSF(Neuron-Restrictive Silencer Factor) mRNA 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 관절염 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법.

7. 위 6에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 관절염 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법.

8. 위 6에 있어서, 상기 시료는 연골세포인, 관절염 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법.

9. 위 6에 있어서, 상기 관절염은 퇴행성 관절염인, 관절염 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법.

10. 개체로부터 분리된 시료 내 NRSF(Neuron-Restrictive Silencer Factor) mRNA 또는 그 단백질의 발현을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 관절염 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.

11. 위 10에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 관절염 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.

12. 위 10에 있어서, 상기 시료는 연골세포인, 관절염 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.

13. 위 10에 있어서, 상기 관절염은 퇴행성 관절염인, 관절염 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.

14. NRSF(Neuron-Restrictive Silencer Factor) mRNA 또는 그 단백질의 발현을 감소시키는 물질을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

15. 위 14에 있어서, 상기 물질은 연골세포 내 NRSR mRNA 또는 그 단백질의 발현을 감소시키는, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

16. 위 14에 있어서 상기 물질은 저분자량 약물, 유전자 약물, 단백질 약물, 추출물, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 항체, RNA, DNA, PNA, 압타머, 화학약품, 효소, 아미노산, 당, 지질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

17. 위 14에 있어서, 상기 관절염은 퇴행성 관절염인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

도 1은 실험동물로부터 분리한 연골세포를 확인한 도이다.
도 2는 연골세포에 IL-1β 농도-의존적 염증 유도를 통한 퇴행성 관절염 유도시 NRSF 발현 증가를 확인한 도이다.
도 3은 연골세포에 IL-1β 시간-의존적 염증 유도를 통한 퇴행성 관절염 유도 시 NRSF 발현 증가를 확인한 도이다.
도 4은 연골세포에 염증 억제 시 NRSF 발현 감소를 확인한 도이다.
도 5는 연골세포 분화에 따른 퇴행성 관절염 유도를 확인한 도이다.
도 6은 연골세포 분화를 통한 퇴행성 관절염 유도 시 분화 바이오마커 및 NRSF 발현 증가를 확인한 도이다.
도 7은 NRSF 발현 억제 시 연골세포 분화 바이오마커의 발현이 감소됨을 확인한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본원에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본원의 목적상, 진단은 관절염 존재 여부를 확인하거나, 나아가 관절염 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.

본원에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics) (예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함할 수 있다.

본 발명은 NRSF(Neuron-Restrictive Silencer Factor) mRNA 또는 그 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 관절염 진단용 조성물을 제공한다.

NRSF는 개체 유래 시료에 존재하는 것으로서, 그 mRNA 또는 단백질 서열은 NCBI genbank 등에 공지된 서열을 활용할 수 있다. 예를 들면, 래트(Rat)의 경우, mRNA는 서열번호 1의 서열, 단백질은 서열번호 2의 서열일 수 있다. 서열은 이에 제한되지 않고, 진단 대상이 되는 개체 종의 서열을 사용할 수 있다. 예를 들어, 대상 개체가 인간인 경우 서열번호 3의 서열로 이루어진 mRNA 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 사용할 수 있다.

상기 개체는 현재 관절염을 보유하고 있거나, 관절염을 보유한 이력이 있는 동물, 관절염 보유가 의심되는 동물, 그 외 기타 관절염 진단을 위한 정보를 제공받고자 하는 동물 등으로서, 상기 동물은 인간을 포함한 포유류일 수 있다.

상기 시료는 개체로부터 분리된 것으로서, 그 예로는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 뇨일 수 있고, 바람직하게는 연골세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 물질은 연골세포 내에서 NRSF(Neuron-Restrictive Silencer Factor) mRNA 또는 그 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 물질은 개체로부터 분리된 시료에서 상기 NRSF mRNA 또는 그 단백질을 검출하는 물질일 수 있다.

상기 물질은 NRSF mRNA 또는 그 단백질을 검출할 수 있다면 제한되지 않으나, 예를 들면, 항체, 압타머, DNA, RNA, 단백질, 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있다.

본원에서, "항체"란 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본원의 목적상, 항체는 상기 마커 단백질인 NRSF에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다.

상기 모노클로날 항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리기술을 이용하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상기 폴리클로날 항체는 상기한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 것을 포함하는, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 폴리클로날 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

또한, 본원의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체 등의 특수항체도 포함될 수 있다.

상기 "펩티드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.

상기 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.

상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질은 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 '프라이머'란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 "프로브"란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.

상기 NRSF를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오티드의 단편에 특이적으로 결합하는　프로브 또는　프라이머는 NRSF를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 상기 프라이머　또는　프로브를 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 디자인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라 상기 NRSF 단백질을 검출하는 물질은 항체일 수 있다. 대상 개체가 래트인 경우 예를 들면 Anti-REST(Millipore Merck, Cat. #07-579)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 그 대상 개체가 인간인 경우에 인간 NRSF 단백질 항체를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 관절염은 퇴행성 관절염 또는 골관절염, 류머티즘 관절염, 대퇴골두 무혈성괴사, 외상성 관절염, 결핵 및 화농성 관절염 중 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 바람직하게는 퇴행성 관절염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물을 개체로부터 분리된 시료에 처리하여 시료 내의 NRSF를 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하여 관절염 발병여부를 진단할 수 있다.

예를 들어, 의심환자의 시료 내의 NRSF mRNA 또는 단백질의 발현량과 대조군(비의심환자)의 발현량을 비교하여 의심환자의 발현량이 더 높게 측정되는 경우 관절염의 발병율이 더 높다고 판단할 수 있다. 또는 두 의심환자의 시료 내 각각의 NRSF mRNA 또는 단백질의 발현량을 비교하여 발현량이 더 높은 환자의 경우, 관절염 발병율이 더 높거나, 병기가 더 많이 진행되었다고 판단할 수 있다.

추가로, 당 분야에 공지된 방법으로 cut off를 도출하여 관절염 발병여부를 판단할 수 있다. 예를 들어, 관절염 환자군과 비환자군의 NRSF mRNA 또는 단백질의 발현량 데이터를 얻어, 환자군과 비환자군을 나누는 cut off를 도출하고, 임의의 개체의 시료에서의 NRSF mRNA 또는 단백질 발현량이 해당 cut off 이상이면 해당 개체에서 관절염이 발병한 것으로 진단할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 조성물을 포함하는 관절염 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는 NRSF의 발현양을 NRSF mRNA 또는 그 단백질의 발현양의 측정을 통해 관절염을 진단할 수 있다.

그 진단방법 및 기준은 전술한 바와 같다.

상기 키트는 NRSF mRNA 또는 그 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함할 뿐만 아니라, 그 키트가 이용하는 NRSF mRNA 또는 그 단백질 발현양을 측정하는 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분　조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.

상기 키트는 NRSF mRNA 또는 단백질의 발현양을 측정하기 위한 키트일 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의　프라이머　쌍 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인　프라이머　쌍을 포함할 수 있다.

상기 키트는 NRSF를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오티드의 단편 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 물질의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차　항체, 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질은 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS) 또는 o-페닐렌디아민(OPD), 테트라메틸 벤지딘(TMB) 등이 사용될 수 있다.

상기 키트는 NRSF mRNA의 발현량을 측정할 수 있는 관절염 진단용 마이크로어레이(microarray)일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상기 지표인자를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있으며, 일 구체예에 따르면 상기 SIRT1, SIRT3 또는 SIRT6 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 그의 단편에 해당하는 서열의 cDNA가　프로브로서 기판에 부착되어 있는 마이크로어레이일 수 있다.

또한, 본원의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 키트는 환자 시료 내 NRSF mRNA 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제뿐만 아니라, 발현 수준 분석에 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

구체적인 일례로, 상기 키트는 ELISA 키트, 샌드위치 ELISA등 다양한 ELISA 방법을 구현하기 위하여, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. 이러한 ELISA 키트는 상기 단백질들에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 NRSF에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이 외에도, 상기 키트는 웨스턴 블롯, 면역침전분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석, 또는 단백질 칩 등을 구현하기 위한 키트일 수 있으며, 각 분석 방법에 적합한 부가적인 구성을 추가로 포함할 수 있다. 이 분석 방법들을 통하여, 항원-항체 복합체 형성량을 비교함으로써 관절염을 진단할 수 있다.

본 발명은 개체로부터 분리된 시료 내 NRSF mRNA 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 관절염 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

상기 시료는 개체로부터 분리된 것으로서, 그 예로는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 시료는 연골세포일 수 있다.

상기 측정은 NRSF mRNA 또는 그 단백질을 검출하는 물질을 상기 시료에 처리하여 수행되는 것일 수 있다.

상기 NRSF mRNA 또는 그 단백질을 검출하는 물질은 앞서 예시한 범위 내의 것일 수 있다.

상기 관절염은 전술한 바와 같다.

상기 NRSF mRNA 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법으로서 NRSF를 코딩하는 유전자의 전사물질인 mRNA의 시료 내 농도 또는 상기 NRSF 단백질의 시료 내 농도를 측정하는 방법을 택할 수 있으나, 이에 제한되지 아니하고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 택하여 수행할 수 있다.

상기 mRNA의 시료 내 농도를 측정하는 방법으로서 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단백질의 시료 내 농도를 측정하는 방법으로서 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 면역탁본검사, 샌드위치 측정법(sandwich assay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색(immunohistochemistry), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS(fluorescence-activated cell sorting), 웨스턴 블롯팅, 유체 세포 측정법(flow cytometry), 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있고, 바람직하게는 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 정보제공방법은 상기 발현 수준을 대조 개체의 발현 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 정보제공방법은 상기 방법에 따라 NRSF mRNA 또는 단백질의 발현량을 관절염 의심환자의 시료 및 대조군(비의심환자)의 시료로부터 각각 측정하고, 상기 측정한 결과들을 서로 비교한 후, 상기 NRSF mRNA 또는 단백질의 발현량이 의심환자의 시료에서 대조군의 시료보다 더 높게 측정되는 경우 관절염의 발병율이 더 높다고 판단할 수 있고, 두 의심환자의 시료 내 각각의 NRSF mRNA 또는 단백질의 발현량을 비교하여 발현량이 더 높은 환자의 경우, 관절염 발병율이 더 높거나, 병기가 더 많이 진행되었다고 판단할 수 있는 정보를 제공할 수 있다.

본 발명은 개체로부터 분리된 시료 내 NRSF(Neuron-Restrictive Silencer Factor) mRNA 또는 그 단백질의 발현을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 관절염 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 방법은 피검물질을 개체에 처리하여 그 mRNA 또는 그 단백질의 발현 수준이 감소한다면 관절염이 개선되는 것이므로, 그러한 피검물질을 관절염 예방 또는 치료제 후보물질로 선별할 수 있다.

또한, 상기 방법은 관절염을 지닌 개체로부터 분리된 시료에 피검물질을 처리하여, 처리 전후 NRSF mRNA 또는 단백질의 발현 정도를 비교할 수도 있고, 여러 개체 중 일부 개체에 피검물질을 처리하여 비교군과 상기 발현 수준을 비교할 수도 있다.

상기 피검물질은 새롭게 합성된 또는 공지된 물질로 관절염의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 것으로 기대되는 물질을 제한 없이 포함할 수 있고, 본 발명의 mRNA 또는 단백질의 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 피검물질은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 NRSF mRNA 또는 그 단백질의 발현 수준을 감소시키는 물질은 siRNA일 수 있다. 대상 개체가 래트인 경우 예를 들면 서열번호 5 및 서열번호 6의 siNRSF를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 그 대상 개체가 인간인 경우에 인간 siNRSF를 사용할 수 있다.

이외, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 시료, 발현 수준의 측정 등에 관련한 사항은 전술한 바와 같다.

본 발명은 NRSF mRNA 또는 그 단백질의 발현을 감소시키는 물질을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출가능한지 또는 검출되지 않는지의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. 치료는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다.

"예방"은 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본원의 조성물은 초기 증상, 또는 나타나기 전에 투여할 경우 관련 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

또한, 상기 NRSF를 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질은 연골세포 내에 존재하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것으로 아니다.

상기 NRSF mRNA 또는 그 단백질의 발현 수준을 감소시키는 물질은 저분자량 약물, 유전자 약물, 단백질 약물, 추출물, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 항체, RNA, DNA, PNA, 압타머, 화학약품, 효소, 아미노산, 당, 지질, 화합물(천연화합물 및/또는 합성화합물) 및 이들을 구성하는 요소로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, NRSF를 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현을 감소시키는 효능을 가진 물질이라면 특별히 제한되지 아니한다.

상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 NRSF mRNA 또는 그 단백질의 발현을 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육 내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 상기 NRSF mRNA 또는 그 단백질의 발현을 감소시키는 물질의 구체적 효능 정도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 인비보 동물모델 및 인비트로에서 효과적인 것으로 측정된 EC50을 기초로 계산될 수 있으며, 예를 들면 체중 1kg당 0.01 ㎍ 내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 재발을 위해 조성물이 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 관절염의 치료와 관련하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 선택적으로, 화학치료제, 항염증제, 항바이러스제 및/또는 면역조절제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예

1. 실험물질-연골세포 분리 및 확보

생후 5일경 SD rat을 CO₂를 이용하여 희생한 후 무릎부위만 채취한 뒤, 피부, 근육과 뼈 등 연골을 제외한 모든 부분을 제거하였다. 1X PBS-containing 2X penicillin-streptomycin(2배수의 항생제가 함유된 인산완충용액)으로 분리한 연골을 불순물이 없어질 때까지 세척한 후 0.03% collagenase type II를 이용하여 37℃에서 45분간 반응하여 연골세포 분리하였다. 이 후, 1X PBS-containing 2X penicillin-streptomycin으로 불순물이 없을 때까지 세척한 후, 다시 한번 0.03% collagenase type II를 이용하여 37℃에서 정치배양 방법으로 overnight 반응시켰다. 반응 종료 시점에 피펫으로 연골 덩어리를 최대한 풀어준 뒤 0.45 ㎛ cell strainer를 통과시켜 연골세포를 찌꺼기로부터 분리하여 연골세포를 얻었다.

2. 실험방법 및 결과

(1) Collagen type Ⅱ 항체를 통한 ICC(Immunocytochemistry) 수행

분리한 세포를 원심 분리기를 이용하여 spin down 시킨 후 깨끗한 성장 배지를 첨가하여 세포 펠렛(cell pellet)을 풀어준 뒤 혈구 계수기(hematocytometer)를 이용하여 세포 수를 세어 5x10⁵ cells/㎖로 4-well chamber slide에 분주하였다. 세포 부착을 위해 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 overnight 배양한 뒤, 배지를 제거하고 1X PBS를 이용하여 두 번 세척하였다. 그 후 차가운 100% 메탄올을 첨가하여 실온에서 5분간 방치, 제거한 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 첨가하여 10분간 고정하고 차가운 PBS로 세포를 세척하였다. 항체의 투과화(permeabilization)를 위해 0.1% Triton X-100이 함유된 PBS에서 10분간 반응시킨 뒤 1X PBS로 5분씩 3번 세척하였다. 비특이적인 반응을 방지하기 위해 1% BSA를 첨가하여 30분간 반응시킨 후 1:100으로 희석된 collagen type Ⅱ (invitrogen) 항체를 첨가하여 4℃에서 overnight 반응시켰다. 반응 종료 시점에 용액을 제거한 후 1X PBS로 5분씩 3번 세척한 후 1:1000으로 희석된 FITC가 붙어있는 2차 항체를 첨가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 1시간 뒤, 용액을 제거한 후 1X PBS로 5분씩 3번 세척한 후, 300nM DAPI 용액을 첨가하여 1분 반응시킨 후 1X PBS로 가볍게 린스하고 박제(mounting)하여 형광현미경 하에서 관찰하였다. Collagen type Ⅱ는 연골세포의 세포 외 기질을 구성하고 있는 대표적인 단백질로, 분리한 세포가 연골세포일 경우 세포 외 기질에서 그 발현이 풍부하게 나타나게 되며, 실험동물에서 분리한 세포를 collagen type Ⅱ 항체를 이용하여 염색한 결과, 연골세포임을 확인할 수 있었다 (도 1).

(2) 염증유도 시 NRSF 발현 분석

연골세포의 염증은 대표적으로 IL-1β를 처리하여 유도할 수 있으며, 염증과 NRSF와의 연관성을 분석하기 위해 IL-1β를 시간과 농도에 따라 달리 처리하여 염증과 NRSF의 발현량을 측정하였다. 염증 유도를 분석하기 위해 염증 바이오 마커 중 NO(nitric oxide)와 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)의 양을 griess 시약과 ELISA kit를 이용하여 각각 분석하였으며, iNOS, Cox-2, 그리고 퇴행성관절염 바이오마커인 MMP-3, MMP-13, ADAMTS-4의 mRNA 발현과 단백질 발현 변화는 각각 RT-PCR과 western blot 기법을 이용하여 분석하였다. 염증이 유도되어 세포 배양액으로 분비된 NO 양을 분석하기 위해 100㎕의 배지와 100㎕의 griess 시약 혼합액[1%(w/v) sulfanilamide: 0.1(w/v) naphthylethylenediamine in 5%(v/v) phosphoric acid=1:1 혼합액]를 혼합한 뒤 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, NaNO₃ standard curve를 통해 수치를 정량화하였다. 배양액에 분비된 PGE₂ 양을 측정하기 위해 PGE₂ ELISA kit(R&D system)를 이용하여 제조사의 매뉴얼대로 분석을 진행하였다.

그 결과, IL-1β를 처리한 시간과 농도에 의존적으로 NO와 PGE₂의 분비가 증가함을 확인하였으며 이를 통해 연골세포에 염증이 유도되었음을 확인하였다.

염증 및 퇴행성관절염 바이오마커의 mRNA 발현 변화 분석을 위해 수확된 세포에 Trizol을 첨가하여 total RNA를 추출하였으며, 1㎍ RNA를 이용하여 cDNA를 합성한 후 각 유전자의 특이적인 프라이머를 제작하였고, 래트의 경우 RAT NRSF_F(서열번호 7) 및 RAT NRSF_R(서열번호 8) 프라이머를 제작하였다. 그 후, nTaq DNA polymerase를 이용하여 중합연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 또 이들 바이오마커의 단백질 발현 변화 분석을 위해 수확된 세포에 PRO-RPEP protein isolation solution(iNtRon)을 첨가하여 전체 단백질을 추출한 후 BCA assay를 이용하여 정량한 후 각 샘플마다 20㎍의 단백질을 취하여 SDS-PAGE 겔에 전기영동하고 PVDF membrane에 transfer하였으며 1% BSA에 1:1000으로 희석된 1차 항체를 4℃에서 overnight 반응시킨 후 1X TBST를 이용하여 membrane을 세척하였다. 이어 1:2500으로 희석된 2차 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후 각 단백질의 발현 변화를 분석하였다. 그 결과, 염증 바이오마커인 iNOS와 Cox-2의 발현이 염증 유도에 따라 점차 증가하였으며, 퇴행성관절염 바이오마커인 MMP-3, MMP-13, ADAMTS-4, collagen type I의 발현이 염증 유도에 따라 증가함과 동시에 연골세포 바이오마커인 collagen type II의 발현이 점차 감소함을 확인하였다. 염증 유도를 통해 연골세포가 퇴행성관절염 연골세포화 될 때 NRSF의 mRNA와 단백질 발현이 점차 증가함을 확인하였으며, 이는 관절연골퇴행에서 NRSF의 관련성을 시사함을 확인할 수 있다(도 2 및 도 3)

(3) 염증억제 시 NRSF 발현 분석

연골세포 염증 억제를 위해 분리한 연골세포에 celecoxib를 처리한 후 1시간 뒤에 IL-1β를 24시간 동안 처리하였다. 이 후, griess 시약과 western blot 기법을 이용하여 염증 억제를 분석하였으며, 그 결과 IL-1β에 의해 증가된 NO, iNOS, Cox-2, MMP-13의 단백질 발현이 유의적으로 감소함을 확인하였으며, 이때 NRSF의 단백질 발현 역시 감소함을 확인하였다.(도 4)

(4) 연골세포 분화를 통한 퇴행성 관절염 유도 확인

연골세포(chondrocytes)가 분화하여 퇴행성관절염 연골세포(fibrochondrocytes)로 유도되는 성질을 이용하여 연골세포의 일정한 세포 수(1x10⁶ cells/㎖)를 규칙적으로 계대 배양하여 분화 유도한 후, 퇴행성관절염 연골세포 특징인 proteoglycan 합성 기능 소실과 감소된 cell viability를 세포 염색 기법을 이용하여 분석하였다. 연골세포 분리 후 부착된 세포를 P0으로 하였으며 이후 1번의 계대배양된 세포를 P1, 2번의 계대배양된 세포를 P2로 하여 P6까지 수행하였다. P0, P3, P6에서 세포 염색을 수행하였으며 giemsa 및 alcian blue 염색 방법을 이용하였다. 배양액 제거 후 1X PBS로 두 번 세척하고 95% ethanol로 5분간 고정한 뒤 각 염색약을 첨가하여 2분 및 5분간 염색하였다. 이 후, DW를 이용하여 세척한 후 디지털 카메라를 이용하여 촬영하였다. Safranin O red 염색 방법으로는 배양액 제거 후 1X PBS로 두 번 세척하고 95% Ethanol로 5분간 고정한 뒤 DW로 두 번 세척한 다음 1% acetic acid에서 45초간 반응시켰다. 이 후 바로 1% safranin O red 염색약을 첨가하여 5분간 반응한 뒤 DW를 이용하여 세척한 후 디지털 카메라를 이용하여 촬영하였다. 염색 결과, 분화가 진행될수록 cell viability가 감소하는 것을 Giemsa 염색을 통해 확인하였으며 proteoglycan의 소실은 alcian blue와 safranin O red 염색을 통해 확인하였다.(도 5)

(5) 연골세포 분화를 통한 퇴행성 관절염 유도 시 NRSF 및 분화 바이오마커 발현 분석

연골세포 분리 후 부착된 세포를 P0으로 하였으며, 1번 계대배양이 된 세포를 P1, 2번 계대배양이 된 세포를 P2로 하여 P6까지 수행하였으며, 계대배양 방법으로는 일정한 세포 수 1x10⁶ cells/㎖를 이틀 간격으로 수행하여 분화를 유도하였다. P6 이후로는 cell viability가 현저히 떨어진 상태로써 P6까지 계대배양으로도 충분히 퇴행성관절염 연골세포 확립이 가능하므로 이후 계대배양은 수행하지 않았다. 각 계대배양 단계에서 세포를 수확하여 분석에 이용되기 전까지 -80℃에 보관하였다. 퇴행성관절염 연골세포는 collagen type II의 발현이 감소하고 collagen type I의 발현이 증가하는 것으로 연골세포의 분화 확인을 위해 collagen type I과 collagen type II의 비율을 SYBR GREEN master mix(bioD)를 이용하여 real-time PCR 분석을 수행하였다. 그 결과 P3부터 점차 collagen type I의 비율이 증가함을 확인하였으며, 이때 NRSF mRNA가 유의미적으로 증가함을 확인하였다. 이를 western blot 기법을 이용하여 확인한 결과 P3부터 collagen type II의 단백질 발현이 감소함을 확인하였으며 염증 관련 바이오마커(iNOS, Cox-2)의 발현이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 또, P0와 P6 배양액에 축적된 NO의 양을 griess 시약으로 분석한 결과 P0에 비해 P6에서 NO의 양이 현저히 증가함을 확인하였으며, 이는 계대배양을 통한 연골세포의 퇴행성관절염 연골세포가 확립되었음을 확인하였다. 이때, NRSF mRNA 발현을 real-time PCR, RE-PCR과 western blot 기법을 이용하여 분석한 결과 퇴행성관절염 연골세포로 분화되는 시점인 P3에서 유의적으로 그 발현이 증가됨을 확인하였다. 이는 퇴행성관절염 연골세포 분화에 NRSF가 깊게 관여하고 있음을 시사한다 (도 6)

(6) NRSF 발현저해에 따른 분화 바이오마커 발현 분석

계대배양을 통해 퇴행성관절염 연골세포로 분화가 유도될 때 NRSF의 발현이 증가함을 확인하였으므로 siRNA system을 이용하여 NRSF의 발현 저해에 따른 분화 제어여부를 확인하였다. NRSF의 발현을 저해하기 위해 연골세포 1x10⁶ cells/㎖을 DMEM/F12 free media에 현탁시킨 후 6-well plate에 분주하고, 서열번호 5 및 서열번호 6의 siNRSF(50nM)와 silenceMag transfection reagent(OZ biosciences)의 혼합액을 세포에 한 방울씩(drop-wise) 떨어뜨린 후 magnetic plate 위에서 20분간 반응시켰다. 그 다음 4시간 정체 배양한 뒤 10% FBS와 1% 항생제(페니실린, 스트렙토마이신)가 함유된 DMEM/F12 배양액으로 교체하여 24시간, 48시간 추가 배양하였다. NRSF의 발현 저해 여부는 western blot 기법으로 확인하였으며, 그 결과 48시간에서 그 발현 저해가 되었으므로 이후 모든 발현 저해 시험은 siNRSF(50nM)를 48시간 반응하여 수행하였다. 수확된 P1, P3, P6 세포에서 퇴행성관절염 바이오마커의 발현변화를 western blot으로 다시 확인한 결과, 연골 퇴행이 확실히 진행되었음을 확인하였다. 이에 따라 P1과 P6에서 siNRSF(50nM)를 48시간 처리하여 관련 바이오마커들의 단백질 발현 변화를 확인한 결과, NRSF 발현이 저해 된 후 분화가 유도될 때, NRSF 발현저해가 되지 않은 P6 control에 비해 NRSF 발현저해가 된 P6 siNRSF에서 collagen type I, iNOS, Cox-2, MMP-13의 발현이 현저히 감소함을 확인하였으며, 이는 연골세포의 퇴행성관절염 연골세포로의 분화에서 NRSF의 중추적인 매개체 역할을 시사한다 (도 7).

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> Composition for diagnosing arthritis and kit comprising the same <130> 19P08049 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3251 <212> RNA <213> Rattus norvegicus <400> 1 atggccaccc aggtgatggg gcagtcttct ggaggaggaa gtctctttaa caacagtggc 60 aacatgggca tggccttacc caacgacatg tatgacttgc acgacctctc gaaagctgaa 120 ctggcggcac ctcagctcat tatgttagcc aacgtggccc tgactgggga agtgaatggc 180 agctgctgtg attacctggt tggtgaagag agacagatgg ccgagttgat gcctgttgga 240 gacaaccact tttcagatag cgaaggagaa ggccttgagg agtcggctga actaaaaggt 300 gaccccagtg ggctggacaa catggaactg agaagtttgg agctaagcgt tgtagagccc 360 cagcccgtat ttgaagcatc agctgcccca gaagtgtaca gctcgaataa agatcccgcc 420 cctgaagcac ccgtggcgga ggacaaatgc aagaatttga aggccaaacc cttccgttgt 480 aagccatgcc agtatgaagc ggagtctgaa gaacagttcg tacatcacat ccgggttcac 540 agtgctaaga agttttttgt ggaagagagt gcagagaagc aagccaaagc cagggaatct 600 ggggcttccc cgtctgagga gggcgagttc tccaagggtc ccatccgctg 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gtattttttg tgatcgttct 3120 tttagaaagg aaaaagacta tagcaaacac ctcaatcgcc atttggttaa tgtgtacttc 3180 cttgaagaag cagctgagga gcaggagtag agtagctgat cctcgaggag aagcgcaatg 3240 cgactttgta a 3251 <210> 4 <211> 1097 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Thr Gln Val Met Gly Gln Ser Ser Gly Gly Gly Gly Leu Phe 1 5 10 15 Thr Ser Ser Gly Asn Ile Gly Met Ala Leu Pro Asn Asp Met Tyr Asp 20 25 30 Leu His Asp Leu Ser Lys Ala Glu Leu Ala Ala Pro Gln Leu Ile Met 35 40 45 Leu Ala Asn Val Ala Leu Thr Gly Glu Val Asn Gly Ser Cys Cys Asp 50 55 60 Tyr Leu Val Gly Glu Glu Arg Gln Met Ala Glu Leu Met Pro Val Gly 65 70 75 80 Asp Asn Asn Phe Ser Asp Ser Glu Glu Gly Glu Gly Leu Glu Glu Ser 85 90 95 Ala Asp Ile Lys Gly Glu Pro His Gly Leu Glu Asn Met Glu Leu Arg 100 105 110 Ser Leu Glu Leu Ser Val Val Glu Pro Gln Pro Val Phe Glu Ala Ser 115 120 125 Gly Ala Pro Asp Ile Tyr Ser Ser Asn Lys Asp Leu Pro Pro Glu Thr 130 135 140 Pro Gly Ala Glu Asp Lys Gly Lys Ser Ser Lys Thr Lys Pro Phe Arg 145 150 155 160 Cys Lys 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Claims

NRSF(Neuron-Restrictive Silencer Factor) mRNA 또는 그 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 관절염 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 물질은 연골세포 내에서 상기 NRSF mRNA 또는 그 단백질에 특이적으로 결합하는 것인, 관절염 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 물질은 항체, 압타머, DNA, RNA, 단백질, 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 관절염 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 관절염은 퇴행성 관절염인, 관절염 진단용 조성물.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 관절염 진단용 키트.
개체로부터 분리된 연골세포 시료 내의 NRSF(Neuron-Restrictive Silencer Factor) mRNA 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 관절염 진단을 위한 정보제공방법.
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청구항 6에 있어서, 상기 관절염은 퇴행성 관절염인, 관절염 진단을 위한 정보제공방법.
개체로부터 분리된 연골세포 시료 내 NRSF(Neuron-Restrictive Silencer Factor) mRNA 또는 그 단백질의 발현을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 관절염 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
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청구항 10에 있어서, 상기 관절염은 퇴행성 관절염인, 관절염 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
NRSF(Neuron-Restrictive Silencer Factor) mRNA 또는 그 단백질의 발현을 감소시키는 물질을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 14에 있어서, 상기 물질은 연골세포 내 NRSR mRNA 또는 그 단백질의 발현을 감소시키는, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 14에 있어서 상기 물질은 저분자량 약물, 유전자 약물, 단백질 약물, 추출물, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 항체, RNA, DNA, PNA, 압타머, 화학약품, 효소, 아미노산, 당, 지질로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 14에 있어서, 상기 관절염은 퇴행성 관절염인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.