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KR20200004313A - 재조합 바이러스의 제조 방법 - Google Patents

재조합 바이러스의 제조 방법 Download PDF

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KR20200004313A
KR20200004313A KR1020197033110A KR20197033110A KR20200004313A KR 20200004313 A KR20200004313 A KR 20200004313A KR 1020197033110 A KR1020197033110 A KR 1020197033110A KR 20197033110 A KR20197033110 A KR 20197033110A KR 20200004313 A KR20200004313 A KR 20200004313A
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브라이언 티. 오론스키
크리스토퍼 라슨
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에피센트알엑스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 A549 숙주 세포를 사용하여 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 바이러스의 제조 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 4월 10일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/483,837의 이익, 및 그를 우선권으로 주장한다.
본 발명의 분야
본 발명의 분야는 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
암을 유발하는 근본적인 분자 메카니즘에 대한 폭넓은 지식에도 불구하고, 대부분의 진행성 암은 현재의 화학요법 및 방사선 프로토콜로 여전히 치유될 수 없는 상태 그대로이다. 종양용해성 바이러스는 다양한 악성 종양에 대한 현재의 표준 치료를 상당히 증강시키는 가능성을 갖는 플랫폼 기술로서 부상하였다 ([Kumar, S. et al. (2008) Current Opinion In Molecular Therapeutics 10(4):371-379]; [Kim, D. (2001) Expert Opinion On Biological Therapy 1(3):525-538]; [Kim D. (2000) Oncogene 19(56):6660-6669]). 이들 바이러스는 감염-복제-용해 연쇄 반응을 통해 악성 세포를 직접적으로 파괴할 뿐만 아니라, 항종양 면역을 간접적으로 유도하는 종양용해제로서의 가능성을 보여주었다. 이들 면역 자극 성질은 바이러스가 복제할 때마다 카피되고 발현되는 치료적 트랜스진의 삽입에 의해 증강되었다.
이전에 개발된 종양용해성 바이러스는 정상 세포에서는 전사적으로 약화되지만, 암 세포에서는 전사적으로 활성인 TAV-255로 지칭되는 종양용해성 혈청형 5 아데노바이러스 (Ad5)를 포함한다 (PCT 공개 번호 WO2010/101921 참조). TAV-255 벡터가 이러한 종양 선택성을 달성하는 메카니즘은, 특이적인 DNA 서열과의 결합을 통해 바이러스가 숙주 세포에 진입된 후에 전사되는 가장 초기의 유전자인 E1a의 아데노바이러스 발현을 조절하는 단백질인, 전사 인자 Pea3 및 E2F에 대한 3개의 전사 인자 (TF) 결합 부위의 표적화된 결실을 통한 것으로 믿어진다.
지금까지의 노력에도 불구하고, 인간 환자에서 암 및 과다증식성 장애를 치료하기 위한 개선된 바이러스, 및 재조합 바이러스를 제조하는 개선된 방법이 요구된다.
본 발명은, 부분적으로, A549 숙주 세포, 예컨대, SF-BMAdR 281 A549 숙주 세포가 다량의 재조합 바이러스, 예컨대, 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 사용될 수 있다는 발견에 기초한다. 놀랍게도, 특정 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 복제 허용 환경에서 바이러스 벡터 제조에 널리 사용되는 HEK293 세포에서보다 무혈청 및 현탁 배양 적응(suspension-adapted) A549 세포에서 더 높은 고밀도로 성장하는 것으로 나타났다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 (a) A549 숙주 세포를 재조합 바이러스로 감염시켜 감염된 A549 숙주 세포를 제조하는 단계; 및 (b) 재조합 바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 현탁 배양하여 재조합 바이러스를 제조하는 단계를 포함하는, 재조합 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, A549 숙주 세포는 SF-BMAdR 281 A549 숙주 세포이다. 특정 실시양태에서, 감염된 A549 숙주 세포는 적어도 3일 동안 배양된다.
본 방법은 단계 (b) 이후에 재조합 바이러스를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 재조합 바이러스를 정제하는 단계는 감염된 A549 숙주 세포를 용해시키는 것, 뉴클레아제 처리, 및 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스를 정제하는 단계는 (i) 감염된 A549 숙주 세포를 용해시켜 세포 용해물을 제조하고; (ii) 세포 용해물을 뉴클레아제로 처리하여 처리된 세포 용해물을 제조하고; (iii) 처리된 세포 용해물로부터 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 재조합 바이러스를 정제하는 것을 포함한다.
본 방법은 재조합 바이러스를 제조하는 유사 방법보다 더욱 큰 수율로 재조합 바이러스를 생성할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (a)에서, HEK293 숙주 세포를 재조합 바이러스로 감염시켜 감염된 HEK293 숙주 세포를 제조하고, 단계 (b)에서, 재조합 바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 감염된 HEK293 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법 (예컨대, 다르게는 동일한 방법)과 비교하여 적어도 5x, 10x, 또는 20x 더 많은 재조합 바이러스를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (b)에서, 재조합 바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 부착 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법 (예컨대, 다르게는 동일한 방법)과 비교하여 적어도 5x, 10x, 또는 20x 더 많은 재조합 바이러스를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (b)에서, 재조합 바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 혈청 함유 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법 (예컨대, 다르게는 동일한 방법)과 비교하여 적어도 5x, 10x, 또는 20x 더 많은 재조합 바이러스를 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 아데노바이러스, 예컨대, 유형 5 아데노바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 재조합 종양용해성 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 재조합 종양용해성 아데노바이러스이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) A549 숙주 세포를 재조합 종양용해성 아데노바이러스로 감염시켜 감염된 A549 숙주 세포를 제조하는 단계; 및 (b) 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 현탁 배양하여 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 단계를 포함하는, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, A549 숙주 세포는 SF-BMAdR 281 A549 숙주 세포이다. 특정 실시양태에서, 감염된 A549 숙주 세포는 적어도 3일 동안 배양된다.
본 방법은 단계 (b) 이후에 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계는 감염된 A549 숙주 세포를 용해시키는 것, 뉴클레아제 처리, 및 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계는 (i) 감염된 A549 숙주 세포를 용해시켜 세포 용해물을 제조하고; (ii) 세포 용해물을 뉴클레아제로 처리하여 처리된 세포 용해물을 제조하고; (iii) 처리된 세포 용해물로부터 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 재조합 바이러스를 정제하는 것을 포함한다.
본 방법은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 유사 방법보다 더욱 큰 수율로 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (a)에서, HEK293 숙주 세포를 재조합 종양용해성 아데노바이러스로 감염시켜 감염된 HEK293 숙주 세포를 제조하고, 단계 (b)에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 감염된 HEK293 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법 (예컨대, 다르게는 동일한 방법)과 비교하여 적어도 5x, 10x, 또는 20x 더 많은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (b)에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 부착 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법 (예컨대, 다르게는 동일한 방법)과 비교하여 적어도 5x, 10x, 또는 20x 더 많은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (b)에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 혈청 함유 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법 (예컨대, 다르게는 동일한 방법)과 비교하여 적어도 5x, 10x, 또는 20x 더 많은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 A549 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및 (b) 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 제조되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 A549 숙주 세포를 현탁 배양하여 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 단계를 포함하는, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, A549 숙주 세포는 SF-BMAdR 281 A549 숙주 세포이다. 특정 실시양태에서, A549 숙주 세포는 적어도 3일 동안 배양된다.
본 방법은 단계 (b) 이후에 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계는 A549 숙주 세포를 용해시키는 것, 뉴클레아제 처리, 및 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계는 (i) A549 숙주 세포를 용해시켜 세포 용해물을 제조하고; (ii) 세포 용해물을 뉴클레아제로 처리하여 처리된 세포 용해물을 제조하고; (iii) 처리된 세포 용해물로부터 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 재조합 바이러스를 정제하는 것을 포함한다.
본 방법은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 유사 방법보다 더욱 큰 수율로 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (a)에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 HEK293 숙주 세포 내로 도입하고, 단계 (b) 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 제조되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 HEK293 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법 (예컨대, 다르게는 동일한 방법)과 비교하여 적어도 5x, 10x, 또는 20x 더 많은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (b) 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 A549 숙주 세포를 부착 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법 (예컨대, 다르게는 동일한 방법)과 비교하여 적어도 5x, 10x, 또는 20x 더 많은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (b) 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 혈청 함유 배지 중에서 A549 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법 (예컨대, 다르게는 동일한 방법)과 비교하여 적어도 5x, 10x, 또는 20x 더 많은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 기능성 Pea3 결합 부위의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 바이러스는 E1a의 개시 부위의 약 -300 내지 약 -250 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실, 예컨대, E1a의 개시 부위의 -305 내지 -255 또는 -304 내지 -255 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)의 195-244에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하고/거나, E1a 프로모터는 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 2)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 기능성 TATA 박스의 결실, 예컨대, 전체 TATA 박스의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 바이러스는 각각 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 472 내지 475, 468 내지 475, 455 내지 552, 및 353 내지 552에 상응하는, 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -27 내지 -24, -31 내지 -24, -44 내지 +54, 또는 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열에 달리 플랭킹되는 두 폴리뉴클레오티드 서열을 연결시킴으로써 생성된, 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 3), AGTGCCCG (서열식별번호: 8), 또는 TATTCCCG (서열식별번호: 9)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 바이러스를 생성한다.
특정 실시양태에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -29 내지 -26, -33 내지 -26, -44 내지 +52, 또는 -148 내지 +52에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 353 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열에 달리 플랭킹되는 두 폴리뉴클레오티드 서열을 연결시킴으로써 생성된, 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 3)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 바이러스를 생성한다.
특정 실시양태에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 기능성 CAAT 박스의 결실, 예컨대, 전체 CAAT 박스의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 바이러스는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 423 내지 431에 상응하는, 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -76 내지 -68에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열에 달리 플랭킹되는 두 폴리뉴클레오티드 서열을 연결시킴으로써 생성된, 서열 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 10)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 바이러스를 생성한다.
특정 실시양태에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 예컨대, E1b-19K 삽입 부위에 삽입될 수 있는 트랜스진을 코딩하며, 여기서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위와 E1b-55K의 시작 부위 사이에 위치하는 것인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위와 E1b-19K의 정지 부위 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 약 100 내지 약 305, 약 100 내지 약 300, 약 100 내지 약 250, 약 100 내지 약 200, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 305, 약 150 내지 약 300, 약 150 내지 약 250, 또는 약 150 내지 약 200개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 약 200개의 뉴클레오티드, 예컨대, 202 또는 203개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 1714-1917 또는 1714-1916에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 1714 및 1917에 상응하는 뉴클레오티드 사이에, 또는 1714 및 1916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 CTGACCTC (서열식별번호: 4)와 TCACCAGG (서열식별번호: 5) 사이에 삽입되고, 예컨대, 바이러스는 5'에서 3' 배향으로 CTGACCTC (서열식별번호: 4), 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 TCACCAGG (서열식별번호: 5)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 외인성 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되지 않는다.
특정 실시양태에서, 트랜스진은 CD80, CD137L, IL-23, IL-23A/p19, p40, IL-27, IL-27A/p28, IL-27B/EBI3, ICAM-1, TGF-β 트랩, TGF-β, CD19, CD20, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, CD154, CD86, BORIS/CTCFL, FGF, IL-24, MAGE, NY-ESO-1, 아세틸콜린, 인터페론-감마, DKK1/Wnt, p53, 티미딘 키나제, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 및 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩한다.
특정 실시양태에서, 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 과다증식성 세포에서 선택적으로 복제될 수 있고/거나, 과다증식성 세포에서 트랜스진을 선택적으로 발현할 수 있다. 과다증식성 세포는 암 세포일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 대상체에서 암을 치료하기 위해 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 유효량의 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 및 다른 측면 및 이점은 하기 도면, 상세한 설명 및 청구범위에 의해 예시된다.
본 발명은 하기 도면을 참조하여 더욱 완벽하게 이해될 수 있다.
도 1은 지정된 바이러스로 처리한 후, 마우스 내의 평균 종양 부피를 도시한 선 그래프이다.
도 2는 지정된 바이러스로 처리된 마우스의 무진행 생존을 도시한 선 그래프이다. 진행은 종양 부피가 200 ㎣를 초과하는 것으로 정의된다.
도 3은 HEK-293 유래 세포주 및 SF-BMAdR 281 (A549 유래) 세포주로부터의 바이러스 제조를 도시한 것이다. 비변형 A549 세포의 경우, 이용가능한 결과는 없었는데, 그 이유는 상기 세포는 무혈청 현탁 배양에 적응할 수 없기 때문이다.
본 발명은, 부분적으로, A549 숙주 세포, 예컨대, SF-BMAdR 281 A549 숙주 세포가 재조합 바이러스, 예컨대, 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 사용될 수 있다는 발견에 기초한다. 놀랍게도, 특정 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 복제 허용 환경에서 바이러스 벡터 제조에 널리 사용되는 HEK293 세포에서보다 무혈청 및 현탁 배양 적응 A549 세포에서 더 높은 고밀도로 성장하는 것으로 나타났다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 (a) A549 숙주 세포를 재조합 바이러스로 감염시켜 감염된 A549 숙주 세포를 제조하는 단계; 및 (b) 재조합 바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 현탁 배양하여 재조합 바이러스를 제조하는 단계를 포함하는, 재조합 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 아데노바이러스, 예컨대, 유형 5 아데노바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 재조합 종양용해성 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 재조합 종양용해성 아데노바이러스이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) A549 숙주 세포를 재조합 종양용해성 아데노바이러스로 감염시켜 감염된 A549 숙주 세포를 제조하는 단계, 및 (b) 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 현탁 배양하여 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 단계를 포함하는, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 A549 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 및 (b) 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 제조되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 A549 숙주 세포를 현탁 배양하여 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 단계를 포함하는, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 핵산은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대, 리포솜-기반 형질감염, 화학-기반 형질감염 (예컨대, 인산칼슘, 양이온성 중합체, DEAE-5 덱스트란, 또는 활성화 덴드리머 이용), 미세주입, 전기천공, 나노입자, 또는 세포 스퀴징을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 핵산은 예를 들어, 플라스미드의 일부일 수 있거나, 또는 예를 들어, 1 초과의 플라스미드의 일부일 수 있다.
상기 방법 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, A549 숙주 세포는 SF-BMAdR 281 A549 숙주 세포이다.
A549 숙주 세포, 예컨대, 감염된 A549 숙주 세포는 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 또는 적어도 7일 동안 배양될 수 있다.
제조 후, 바이러스 입자는 배양물로부터 회수되고, 임의적으로 정제된다. 전형적인 정제 단계는 원심분리, 예컨대, 염화세슘 구배 원심분리, 정화, 효소 처리, 예컨대, 뉴클레아제 또는 프로테아제 처리, 크로마토그래피 단계, 예컨대, 이온 교환 크로마토그래피, (예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피), 또는 여과 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 상기 방법 중 임의의 방법은 단계 (b) 이후에 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계는 A549 숙주 세포, 예컨대, 감염된 A549 숙주 세포를 용해시키는 것, 뉴클레아제 처리, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계는 (i) A549 숙주 세포, 예컨대, 감염된 A549 숙주 세포를 용해시켜 세포 용해물을 제조하고; (ii) 세포 용해물을 뉴클레아제로 처리하여 처리된 세포 용해물을 제조하고; (iii) 처리된 세포 용해물로부터 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 재조합 바이러스를 정제하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법 중 임의의 방법은 재조합 바이러스를 제조하는 유사 방법보다 더욱 큰 수율로 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 방법은 상이한 숙주 세포 유형을 사용하는 것을 제외하면 동일한 방법인 유사한 방법과 비교하여 더욱 큰 수율로 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 바이러스 수율은 예컨대, qPCR, 면역세포화학법, 또는 루시페라제 리포터 검정법을 비롯한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 검정될 수 있다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (a)에서, HEK293 숙주 세포를 재조합 바이러스로 감염시켜 감염된 HEK293 숙주 세포를 제조하고, 단계 (b)에서, 재조합 바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 감염된 HEK293 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법 (예컨대, 다르게는 동일한 방법)과 비교하여 적어도 2x, 적어도 3x, 적어도 4x, 적어도 5x, 적어도 10x, 적어도 15x, 적어도 20x, 적어도 25x, 또는 적어도 30x 더 많은 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (a)에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 HEK293 숙주 세포 내로 도입하고, 단계 (b) 재조합 바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 HEK293 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법 (예컨대, 다르게는 동일한 방법)과 비교하여 적어도 2x, 적어도 3x, 적어도 4x, 적어도 5x, 적어도 10x, 적어도 15x, 적어도 20x, 적어도 25x, 또는 적어도 30x 더 많은 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 현탁 배양 대신 부착 배양을 사용하는 것을 제외하면 동일한 방법인 유사한 방법과 비교하여 더욱 큰 수율로 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (b)에서, 재조합 바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 무혈청 배지 중에서 A549 숙주 세포, 예컨대, 감염된 A549 숙주 세포를 부착 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법 (예컨대, 다르게는 동일한 방법)과 비교하여 적어도 2x, 적어도 3x, 적어도 4x, 적어도 5x, 적어도 10x, 적어도 15x, 적어도 20x, 적어도 25x, 또는 적어도 30x 더 많은 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 무혈청 배지 대신 혈청 함유 배지를 사용하는 것을 제외하면 동일한 방법인 유사한 방법과 비교하여 더욱 큰 수율로 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 방법은 단계 (b)에서, 재조합 바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 (예컨대, 복제 허용 환경에서) 혈청 함유 배지 중에서 A549 숙주 세포, 예컨대, 감염된 A549 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법 (예컨대, 다르게는 동일한 방법)과 비교하여 적어도 2x, 적어도 3x, 적어도 4x, 적어도 5x, 적어도 10x, 적어도 15x, 적어도 20x, 적어도 25x, 또는 적어도 30x 더 많은 재조합 바이러스 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 A549 숙주 세포를 후성적 작용제, 예컨대, DNMT, HDAC, 및/또는 티로신 키나제 억제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 예시적인 후성적 작용제로는 보리노스타트, 로미뎁신, 아자시티딘, 데시타빈, RRx-001 및 CUDC-101을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 A549 숙주 세포를 인터과 페론접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 방법은 A549 숙주 세포를 항산화제, 예컨대, 비타민 C, 비타민 E, 글루타티온, 또는 N-아세틸시스테인과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 다양한 특징 및 측면은 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
I. 바이러스
"바이러스"라는 용어는 단백질-합성 또는 에너지-생성 메카니즘을 갖지 않는 임의의 편성 세포내 기생충을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 바이러스 게놈은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 재조합적으로 변형된 바이러스는 본원에서 "재조합 바이러스"로 지칭된다. 재조합 바이러스는 예컨대, 재조합 DNA 기술에 의해 복제 결함이 있거나, 조건부로 복제되거나 또는 복제에 능숙하도록 변형될 수 있고/거나, 재조합 DNA 기술에 의해 외인성 트랜스진의 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 각각의 모 벡터 성질의 유리한 요소를 활용하는 키메라 바이러스 벡터 (예컨대, 문헌 [Feng et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870] 참조) 또한 본 발명의 실시에 유용할 수 있다. 일반적으로 치료하고자 하는 종으로부터의 바이러스를 이용하는 것이 유리하지만, 일부 경우에는, 유리한 병원성 특징을 갖는 상이한 종으로부터 유래된 벡터를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 종양용해성 바이러스, 예컨대, 종양-선택적 복제 및/또는 바이러스 매개된 용해를 나타내는 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 종양용해성 바이러스를 통해 유전자, 예컨대, 트랜스진은 선택적으로 발현될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 바이러스는 신생물 세포에서의 유전자 발현은 허용하지만, 정상 세포에서의 발현은 약화시킨다. 특정 실시양태에서, 비-과다증식성 세포에서의 유전자의 발현은 과다증식성 세포에서의 발현의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 또는 약 5%이다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 비-과다증식성 세포에서는 검출가능한 유전자 발현을 보이지 않는다. 유전자 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법, 예컨대, 웨스턴 블롯 또는 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 과다증식성 세포는 암 세포, 예컨대, 암종, 육종, 백혈병, 림프종, 전립선암, 폐암, 위장관암, 결장직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 위암, 갑상선암, 중피종, 간암, 신장암, 피부암, 두부경부암, 또는 뇌암 세포일 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 아데노바이러스 또는 아데노-연관 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 아데노바이러스이다. 아데노바이러스는 뉴클레오캡시드 및 이중 가닥 선형 DNA 게놈으로 구성된 중간 크기의 (90-100 nm) 비-외피보유 (네이키드) 정이십면체형 바이러스이다. 아데노바이러스는 숙주의 복제 기구를 이용하여 포유동물 세포의 핵에서 복제된다. "아데노바이러스"라는 용어는 인간, 소, 양, 말, 개, 돼지, 뮤린 및 원숭이 아데노바이러스 아속을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 아데노비리다에(Adenoviridiae) 속의 임의의 바이러스를 지칭한다. 특히, 인간 아데노바이러스로는 A-F 아속 뿐만 아니라, 그의 개별 혈청형을 포함하며, 상기 개별 혈청형 및 A-F 아속으로는 인간 아데노바이러스 유형 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad11a 및 Ad11p), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 및 91을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 인간 아데노바이러스 유형 2 및 5로부터 유래된 재조합 바이러스가 바람직하다. 달리 명시하지 않는다면, 모든 아데노바이러스 유형 5 뉴클레오티드 번호는 본원에서 서열식별번호: 1로 기재된 NCBI 참조 서열 AC_000008.1과 관련된 것이다.
아데노바이러스 복제 주기는 2 단계를 갖는다: 4종의 전사 단위 E1, E2, E3 및 E4가 발현되는 동안의 초기 단계, 및 후기 전사체가 주요 후기 프로모터 (MLP)로부터 주로 발현될 때 바이러스 DNA 합성의 개시 이후에 일어나는 후기 단계. 후기 메시지는 대부분의 바이러스 구조 단백질을 코딩한다. E1, E2 및 E4의 유전자 생성물은 전사 활성화, 세포 형질전환, 바이러스 DNA 복제 뿐만 아니라, 다른 바이러스 기능을 담당하고, 바이러스 성장을 위해 필요하다.
"작동가능하게 연결된"이라는 용어는 기능적으로 관계가 있는 폴리뉴클레오티드 요소의 연결을 지칭한다. 핵산 서열은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 있을 때 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 유전자의 전사에 영향을 미친다면, 이는 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 것이다. 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 연속적이다. 그러나, 일반적으로 인핸서는 프로모터로부터 몇몇 킬로염기만큼 분리되어 있을 때 기능하고, 인트론 서열은 다양한 길이를 가질 수 있기 때문에, 일부 폴리뉴클레오티드 요소는 작동가능하게 연결되지만 직접적으로 플랭킹되지는 않을 수 있고, 심지어 상이한 대립 유전자 또는 염색체와는 트랜스로 기능할 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 조절 서열 또는 프로모터에 대해 1개 이상의 변형을 갖는다. 조절 서열 또는 프로모터에 대한 변형은 조절 서열 또는 프로모터의 야생형 서열에 비해 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환 또는 부가를 포함한다.
특정 실시양태에서, 조절 서열 또는 프로모터의 변형은, 예를 들어, 그의 일부를 결실시킴으로써, 또는 결합 부위 내로 단일 점 돌연변이를 삽입시킴으로써, 전사 인자에 대한 친화도를 감소시키기 위해 전사 인자 결합 부위의 서열에 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가의 변형된 조절 서열은 신생물 세포에서의 발현은 증강시키지만, 정상 세포에서의 발현은 약화시킨다.
특정 실시양태에서, 변형된 조절 서열은 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자 (코딩 영역) 중 적어도 하나는 변형된 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, E1a 유전자는 변형된 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.
E1a 조절 서열은 Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV 및 Pea3 V로 지정된, 전사 인자 Pea3에 대한 5개의 결합 부위를 함유하며, 여기서, Pea3 I은 E1a 시작 부위에 가장 근접한 Pea3 결합 부위이고, Pea3 V는 가장 멀리 있다. E1a 조절 서열은 또한 본원에서 E2F I 및 E2F II로 지정된, 전사 인자 E2F에 대한 결합 부위를 함유하며, 여기서, E2F I은 E1a 시작 부위에 가장 근접한 E2F 결합 부위이고, E2F II는 더욱 멀리 있다. E1a 시작 부위로부터, 결합 부위는 Pea3 I, E2F I, Pea3 II, E2F II, Pea3 III, Pea3 IV 및 Pea3 V로 정렬된다.
특정 실시양태에서, 이들 7개의 결합 부위, 또는 기능성 결합 부위 중 적어도 하나는 결실된다. 본원에서 사용되는 바, "기능성 결합 부위"란, 각각의 결합 파트너, 예컨대, 전사 인자에 결합할 수 있는 결합 부위, 예컨대, 상응하는 야생형 결합 부위 서열의 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 또는 적어도 40%를 갖는 결합 부위를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "비-기능성 결합 부위"란, 예컨대, 상응하는 야생형 결합 부위 서열의 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 0%를 갖는 결합 부위를 지칭한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 기능성 Pea3 결합 부위의 결실, 예컨대, 전체 Pea3 결합 부위의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "기능성 Pea3 결합 부위"란, 그의 각각의 전사 인자 (예컨대, Pea3)에 결합할 수 있는 Pea3 결합 부위, 예컨대, 상응하는 야생형 Pea3 결합 부위 서열의 Pea3 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 또는 적어도 40%를 갖는 Pea3 결합 부위를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "비-기능성 Pea3 결합 부위"란, 예컨대, 상응하는 야생형 Pea3 결합 부위 서열의 Pea3 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 0%를 갖는 Pea3 결합 부위를 지칭한다. Pea3 결합 부위가 Pea3에 결합하는지 여부를 측정하는 검정법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 결합 검정법으로는 전기영동 이동성 변화 검정법, 크로마틴 면역침강 검정법, 및 DNAse 풋프린팅 검정법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 Pea3 결합 부위, 또는 기능성 Pea3 결합 부위가 결실된다. 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, 및/또는 Pea3 V일 수 있다. 특정 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, 및/또는 Pea3 V이다. 특정 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 IV 및/또는 Pea3 V이다. 특정 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II 및/또는 Pea3 III이다. 특정 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II 및 Pea3 III, 둘 모두이다. 특정 실시양태에서, Pea3 I 결합 부위, 또는 기능성 Pea3 I 결합 부위는 유지된다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 E2F 결합 부위, 또는 기능성 E2F 결합 부위는 결실된다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 E2F 결합 부위, 또는 기능성 E2F 결합 부위는 유지된다. 특정 실시양태에서, 유지된 E2F 결합 부위는 E2F I 및/또는 E2F II이다. 특정 실시양태에서, 유지된 E2F 결합 부위는 E2F II이다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 적어도 하나의 E2F 결합 부위, 또는 그의 기능적 부분의 결실을 포함할 수 있고, Pea3 결합 부위의 결실은 포함하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 총 결실은 본질적으로 Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, 및/또는 Pea3 V 중 하나 이상의 것으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 E1a 개시 부위의 -304 내지 -255 상류에 위치하는, 예컨대, Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 195-244에 상응하는 50개 염기쌍 영역의 결실을 가지며, 이는 이후에 TAV-255 결실로 지칭된다. 특정 실시양태에서, TAV-255 결실은 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 2)를 포함하는 E1a 프로모터를 생성한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 기능성 TATA 박스의 결실, 예컨대, 전체 TATA 박스의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "기능성 TATA 박스"란, TATA 박스 결합 단백질 (TBP)에 결합할 수 있는 TATA 박스, 예컨대, 상응하는 야생형 TATA 박스 서열의 TBP 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 또는 적어도 40%를 갖는 TATA 박스를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "비-기능성 TATA 박스"란, 예컨대, 상응하는 야생형 TATA 박스 서열의 TBP 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 0%를 갖는 TATA 박스를 지칭한다. TBP가 TATA 박스에 결합하는지 여부를 측정하는 검정법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 결합 검정법으로는 전기영동 이동성 변화 검정법, 크로마틴 면역침강 검정법, 및 DNAse 풋프린팅 검정법을 포함한다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는, 각각이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 472 내지 475, 468 내지 475, 455 내지 552, 및 353 내지 552에 상응하는 것인 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -27 내지 -24, -31 내지 -24, -44 내지 +54, 또는 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -29 내지 -26, -33 내지 -26, -44 내지 +52, 또는 -148 내지 +52에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 353 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열에 달리 플랭킹되는 두 폴리뉴클레오티드 서열을 연결시킴으로써 생성된, 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 3), AGTGCCCG (서열식별번호: 8), 또는 TATTCCCG (서열식별번호: 9)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 바이러스를 생성한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 3)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 기능성 CAAT 박스의 결실, 예컨대, 전체 CAAT 박스의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "기능성 CAAT 박스"란, C/EBP 또는 NF-Y 단백질에 결합할 수 있는 CAAT 박스, 예컨대, 상응하는 야생형 CAAT 박스 서열의 C/EBP 또는 NF-Y 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 또는 적어도 40%를 갖는 CAAT 박스를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "비-기능성 CAAT 박스"란, 예컨대, 상응하는 야생형 CAAT 박스 서열의 C/EBP 또는 NF-Y 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 0%를 갖는 CAAT 박스를 지칭한다. C/EBP 또는 NF-Y 단백질이 CAAT 박스에 결합하는지 여부를 측정하는 검정법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 결합 검정법으로는 전기영동 이동성 변화 검정법, 크로마틴 면역침강 검정법, 및 DNAse 풋프린팅 검정법을 포함한다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는, Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 423 내지 431에 상응하는 것인 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -76 내지 -68에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열에 달리 플랭킹되는 두 폴리뉴클레오티드 서열을 연결시킴으로써 생성된, TTCCGTGGCG (서열식별번호: 10)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 바이러스를 생성한다.
아데노바이러스 E1b-19k 유전자는 주로 항-아폽토시스 유전자로서 작용하고, 세포성 항-아폽토시스 유전자, BCL-2의 동족체이다. 자손 바이러스 입자의 성숙 이전의 숙주 세포 사멸은 바이러스 복제를 제한하기 때문에, E1b-19k는 미성숙 세포 사멸을 방지하기 위해 El 카세트의 일부로서 발현되어, 감염을 진행시키고 성숙한 비리온을 생성한다. 따라서, 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위를 포함하는 재조합 아데노바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제공하며, 예컨대, 재조합 아데노바이러스는 E1b-19K 삽입 부위 내로 삽입된 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위 (즉, E1b-19k의 시작 코돈을 코딩하는, 예컨대, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1714-1716에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 E1b-55K의 시작 부위 (즉, E1b-55k의 시작 코돈을 코딩하는, 예컨대, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 2019-2021에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위 (즉, E1b-19k의 시작 코돈을 코딩하는, 예컨대, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1714-1716에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 E1b-19K의 정지 부위 (즉, E1b-19k의 정지 코돈을 코딩하는, 예컨대, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 2242-2244에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다.
명세서 및 청구범위 전역에 걸쳐, 두 부위 사이의 삽입, 예를 들어, (i) 제1 유전자 (예컨대, E1b-19k)의 시작 부위와 제2 유전자 (예컨대, E1b-55K)의 시작 부위, (ii) 제1 유전자의 시작 부위와 제2 유전자의 정지 부위, (iii) 제1 유전자의 정지 부위와 제2 유전자의 시작 부위, 또는 (iv) 제1 유전자의 정지 부위와 제2 유전자의 정지 부위 사이의 삽입은, 삽입을 둘러싸는 주어진 시작 부위 또는 정지 부위를 구성하는 뉴클레오티드 모두 또는 그 일부가 최종 바이러스에 존재하거나, 부재할 수 있음을 의미하는 것으로 이해한다. 유사하게, 두 뉴클레오티드 사이의 삽입은, 삽입을 둘러싸는 뉴클레오티드가 최종 바이러스에 존재하거나, 부재할 수 있음을 의미하는 것으로 이해한다.
특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 약 100 내지 약 305, 약 100 내지 약 300, 약 100 내지 약 250, 약 100 내지 약 200, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 305, 약 150 내지 약 300, 약 150 내지 약 250, 또는 약 150 내지 약 200개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 약 200개의 뉴클레오티드, 예컨대, 202 또는 203개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 1714-1917 또는 1714-1916에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 1714 및 1917에 상응하는 뉴클레오티드 사이에, 또는 1714 및 1916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 CTGACCTC (서열식별번호: 4)와 TCACCAGG (서열식별번호: 5) 사이에 삽입되고, 예컨대, 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로 CTGACCTC (서열식별번호: 4), 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 TCACCAGG (서열식별번호: 5)를 포함한다. CTGACCTC (서열식별번호: 4) 및 TCACCAGG (서열식별번호: 5)는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1) 내에서 E1b-19K 삽입 부위에 대한 고유한 경계 서열을 정의한다. 명세서 및 청구범위 전역에 걸쳐, 소정의 부위에 인접한 결실, 예를 들어, 소정의 유전자의 시작 부위에 인접한 결실, 또는 소정의 유전자의 정지 부위에 인접한 결실은, 주어진 시작 부위 또는 정지 부위를 구성하는 뉴클레오티드 모두 또는 그 일부의 결실을 포함할 수 있거나, 또는 결실을 포함하지 않을 수 있음을 의미하는 것으로 이해한다.
특정 실시양태에서, E3 삽입 부위을 포함하는 재조합 아데노바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제공하며, 예컨대, 재조합 아데노바이러스는 E3 삽입 부위 내로 삽입된 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 삽입 부위는 pVIII의 정지 부위 (즉, pVIII의 정지 코돈을 코딩하는, 예컨대, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 27855-27857에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 Fiber의 시작 부위 (즉, Fiber의 시작 코돈을 코딩하는, 예컨대, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 31042-31044에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 약 500 내지 약 3185, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 3185, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 3185, 약 1500 내지 약 3000, 약 1500 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 3185, 약 2000 내지 약 3000, 약 2000 내지 약 2500, 약 2500 내지 약 3185, 약 2500 내지 약 3000, 또는 약 3000 내지 약 3185개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 E3-10.5K의 정지 부위 (즉, E3-10.5K의 정지 코돈을 코딩하는, 예컨대, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 29770-29772에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 E3-14.7K의 정지 부위 (즉, E3-14.7K의 정지 코돈을 코딩하는, 예컨대, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30837-30839에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1551, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1551, 약 1000 내지 약 1500, 또는 약 1500 내지 약 1551개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 1050개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하고, 예컨대, E3 삽입 부위는 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 1063 또는 1064개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 Ad5 dl309 E3 결실에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 29773-30836에 상응하는 결실을 포함하거나, 또는 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 29773 및 30836에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 CAGTATGA (서열식별번호: 11)와 TAATAAAAAA (서열식별번호: 12) 사이에 삽입되고, 예컨대, 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로 CAGTATGA (서열식별번호: 11), 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 TAATAAAAAA (서열식별번호: 12)를 포함한다. CAGTATGA (서열식별번호: 11) 및 TAATAAAAAA (서열식별번호: 12)는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1) 내에서 E3 삽입 부위에 대한 고유한 경계 서열을 정의한다.
특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 E3-gp19K의 정지 부위 (즉, E3-gp19K의 정지 코돈을 코딩하는, 예컨대, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 29215-29217에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 E3-14.7K의 정지 부위 (즉, E3-14.7K의 정지 코돈을 코딩하는, 예컨대, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30837-30839에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1824, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1824, 약 1000 내지 약 1500, 또는 약 1500 내지 약 1824개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 약 1600개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 예컨대, E3 삽입 부위는 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 1622개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 29218-30839에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 29218 및 30839에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 TGCCTTAA (서열식별번호: 13)와 TAAAAAAAAAT (서열식별번호: 14) 사이에 삽입되고, 예컨대, 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로 TGCCTTAA (서열식별번호: 13), 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 TAAAAAAAAAT (서열식별번호: 14)를 포함한다. TGCCTTAA (서열식별번호: 13) 및 TAAAAAAAAAT (서열식별번호: 14)는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1) 내에서 E3 삽입 부위에 대한 고유한 경계 서열을 정의한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 E4 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위 (즉, E4-ORF6/7의 시작 코돈을 코딩하는, 예컨대, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 34075-34077에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 우측 반전 말단 반복부 (ITR; 예컨대, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 35836-35938에 상응함) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위와 E4-ORF1의 시작 부위 (즉, E4-ORF1의 시작 코돈을 코딩하는, 예컨대, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 35524-35526에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위와 E4-ORF1의 시작 부위 사이에 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 2500, 약 1500 내지 약 2000, 또는 약 2000 내지 약 2500개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 250 내지 약 1500, 약 250 내지 약 1250, 약 250 내지 약 1000, 약 250 내지 약 750, 약 250 내지 약 500, 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1250, 약 500 내지 약 1000, 약 500 내지 약 750, from 750 내지 약 1500, 약 750 내지 약 1250, 약 750 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1500, 또는 약 1000 내지 약 1250개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 1450개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하고, 예컨대, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 1449개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 34078-35526에 상응하는 결실을 포함한다.
바이러스 유전자를 코딩하는 핵산을 플라스미드 내로 도입시킬 수 있고, 통상적인 형질감염 또는 형질전환 기술을 통해 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다. 구체적인 제조 및 정제 조건은 바이러스 및 이용되는 제조 시스템에 따라 달라질 것이다. 아데노바이러스의 경우, 바이러스 입자의 생성을 위한 전통적인 방법은, 공동-형질감염에 이어서, 셔틀 플라스미드 (일반적으로 아데노바이러스 게놈의 작은 서브세트를 함유하고, 임의적으로, 잠재적 트랜스진 발현 카세트를 함유) 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 (전체 아데노바이러스 게놈의 대부분을 함유)의 후속적인 생체내 재조합이다. 아데노바이러스의 생성을 위한 대안적인 기술로는 박테리아 인공 염색체 (BAC) 시스템, 상보성 아데노바이러스 서열을 함유하는 2개의 플라스미드를 이용하는 recA÷ 박테리아 균주에서의 생체내 박테리아 재조합, 및 효모 인공 염색체 (YAC) 시스템을 이용하는 것을 포함한다.
II. 치료적 트랜스진
본원에 개시된 방법을 사용하여 제조된 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 치료적 트랜스진을 코딩하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. "트랜스진"이라는 용어는 외인성 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "치료적 트랜스진"이라는 용어는 바이러스 내에서 또는 그에 의해 복제 및/또는 발현될 때, 표적 세포, 체액, 조직, 기관, 생리적 시스템, 또는 대상체에 치료 효과를 부여하는 트랜스진을 지칭한다.
치료적 트랜스진은 치료적 핵산, 예컨대, 안티센스 RNA 또는 리보자임 RNA를 코딩할 수 있다. 치료적 트랜스진은 치료적 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대, 아폽토시스 작용제, 항체, CTL 반응성 펩티드, 시토카인, 세포용해제, 세포독성제, 효소, 면역 반응을 유도하는 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 이종성 항원, 면역자극제 또는 면역 조정 작용제, 인터페론, 용해성 펩티드, 종양단백질, 세포 사멸을 유도하는 프로세스를 촉진시키는 폴리펩티드, 체세포에서의 유전자 결함을 보완하는 폴리펩티드, 종양 억제 단백질, 백신 항원, 또는 그의 임의 조합을 코딩할 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료적 트랜스진은 CD80, CD137L, IL-23, IL-23A/p19, p40, IL-27, IL-27A/p28, IL-27B/EBI3, ICAM-1, TGF-β 트랩, TGF-β, CD19, CD20, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, CD154, CD86, BORIS/CTCFL, FGF, IL-24, MAGE, NY-ESO-1, 아세틸콜린, 인터페론-감마, DKK1/Wnt, p53, 티미딘 키나제, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 및 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄로부터 선택되는 치료적 폴리펩티드를 코딩한다.
III. 제약 조성물
치료적 사용을 위해, 본원에 개시된 방법을 사용하여 제조된 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 바람직하게는 제약상 허용가능한 담체와 조합한다. 본원에서 사용되는 바, "제약상 허용가능한 담체"는 합리적인 이익/위험 비에 비례하여 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증이 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 완충제, 담체 및 부형제를 의미한다. 담체(들)는 제형의 다른 성분과 적합성인 면에서 "허용가능하여야" 하고, 수용자에게 유해하지 않아야 한다. 제약상 허용가능한 담체로는 제약 투여에 적합한 완충제, 용매, 분산 매질, 코팅, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약상 활성 물질을 위한 상기 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
재조합 바이러스를 함유하는 제약 조성물은 투여 단위 형태로 제공될 수 있고, 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제제화되어야 한다. 투여 경로의 예로는 정맥내 (IV), 동맥내, 진피내, 흡입, 경피, 국소, 경점막, 및 직장 투여이다. 바람직한 투여 경로는 IV 주입이다. 유용한 제제는 제약 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)]을 참조한다. 비경구 투여에 적합한 제제 성분으로는 멸균 희석제, 예컨대, 주사용수, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 완충제, 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 장성 조정제, 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함한다.
정맥내 투여의 경우, 적합한 담체로는 생리 식염수, 정균수, 크레모포어(Cremophor) ELTM (바스프(BASF: 미국 뉴저지주 파시페니)) 또는 포스페이트 완충처리된 식염수 (PBS)를 포함한다. 담체는 제조 및 보관 조건 하에 안정적이어야 하고, 미생물로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
제약 제제는 바람직하게는 멸균성이다. 멸균화는 임의의 적합한 방법, 예컨대, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물을 동결건조시키는 경우, 여과 멸균화는 동결건조 및 재구성 이전에 또는 그 이후에 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "유효량"이라는 용어는 유익한 또는 원하는 결과를 달성하는 데 충분한 활성 성분의 양 (예컨대, 재조합 바이러스의 양)을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있고, 특정한 제제 또는 투여 경로로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
특정 실시양태에서, 활성 성분의 치료 유효량은 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예컨대, 1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg 범위이다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스의 치료 유효량은 102 내지 1015 플라크 형성 단위 (pfu), 예컨대, 102 내지 1010, 102 내지 105, 105 내지 1015, 105 내지 1010, 또는 1010 내지 1015 플라크 형성 단위 범위이다. 투여되는 양은 치료하고자 하는 질환 또는 적응증의 유형 및 정도, 환자의 전반적인 건강 상태, 바이러스의 생체내 효력, 제약 제제, 투여 경로와 같은 변수에 따라 좌우될 것이다. 초기 투여량은 원하는 혈관 수준 또는 조직 수준을 신속하게 달성하기 위해 상한을 넘어 증가될 수 있다. 대안적으로, 초기 투여량은 최적 투여량보다 적을 수 있고, 1일 투여량은 치료 과정 동안 점진적으로 증가될 수 있다. 인간 투여량은 예컨대, 0.5 mg/kg에서 20 mg/kg까지 실행하도록 고안된 통상적인 I상 용량 증량 연구에서 최적화될 수 있다. 투여 빈도는 투여 경로, 투여량, 바이러스의 혈청 반감기, 및 치료할 질환과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 예시적인 투약 빈도는 1일 1회, 주 1회, 및 매 2주마다 1회이다. 바람직한 투여 경로는 비경구, 예컨대, 정맥내 주입이다.
IV. 치료적 용도
본원에 개시된 방법을 사용하여 제조된 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 이용하여 다양한 의학적 적응증, 예를 들어, 암을 치료할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "치료하다," "치료하는" 및 "치료"는 대상체에서, 예컨대, 인간에서 질환을 치료하는 것을 의미한다. 이는 (a) 질환을 억제시키는 것, 즉, 그의 발생의 저지시키는 것; 및 (b) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환 상태를 퇴행시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "대상체" 및 "환자"라는 용어는 본원에 기술된 방법 및 조성물에 의해 치료되는 유기체를 지칭한다. 상기 유기체에는 바람직하게는 포유동물 (예컨대, 뮤린, 원숭이, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)을 포함하나, 이에 제한되지는 않고, 더욱 바람직하게는 인간을 포함한다.
암의 예로는 고형 종양, 연조직 종양, 조혈성 종양 및 전이성 병변을 포함한다. 조혈성 종양의 예로는 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수구성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 예컨대, 형질전환된 CLL, 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종, 모발 세포 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 림프종, 호지킨병, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 또는 리히터 증후군 (리히터 형질전환)을 포함한다. 고형 종양의 예로는 예컨대, 육종, 선암종, 및 다양한 기관계의 암종, 예컨대, 두부경부 (예컨대, 인두), 갑상선, 폐 (소세포 또는 비소세포 폐 암종 (NSCLC)), 유방, 림프, 위장 (예컨대, 구강, 식도, 위, 간, 췌장, 소장, 결장 및 직장, 항문관), 생식기 및 비뇨생식관 (예컨대, 신장, 요로상피, 방광, 난소, 자궁, 자궁경부, 자궁내막, 전립선, 고환), CNS (예컨대, 신경 또는 교질 세포, 예컨대, 신경모세포종 또는 신경교종), 또는 피부 (예컨대, 흑색종)에서 이환된 것들을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암은 흑색종, 피부의 편평 상피 세포 암종, 기저 세포 암종, 두부경부암, 유방암, 항문암, 자궁경부암, 비소세포 폐암, 중피종, 소세포 폐암, 신세포 암종, 전립선암, 위식도암, 결장직장암, 고환암, 방광암, 난소암, 간세포 암종, 담관암종, 뇌암, 자궁내막암, 신경내분비암, 및 췌장암으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 암은 비인두암, 기저 세포 암종, 활막암, 간세포암, 신암, 결합 조직의 암, 흑색종, 폐암, 장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 뇌암, 인후암, 구강암, 간암, 골암, 췌장암, 융모막암종, 가스트린종, 신경내분비, 크롬 친화성 세포종, 프로락틴종, T-세포 백혈병/림프종, 신경종, 폰힙펠 린도우병(von Hippel-Lindau disease), 졸린거-엘리슨 증후군(Zollinger-Ellison syndrome), 부신암, 항문암, 담도암, 방광암, 수뇨관암, 뇌암, 희소돌기아교세포종, 신경모세포종, 수막종, 척수 종양, 골암, 골연골종, 연골육종, 유잉 육종, 원발 부위 불명 암, 카르시노이드, 위장관 카르시노이드, 섬유육종, 유방암, 파제트병, 자궁경부암, 결장직장암, 직장암, 식도암, 담낭암, 두부암, 안암, 경부암, 신장암, 빌름스 종양, 간암, 카포시 육종, 전립선암, 폐암, 고환암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 구강암, 피부암, 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 내분비 췌장암, 글루카곤종, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 뇌하수체암, 연조직 육종, 망막모세포종, 소장암, 위암, 흉선 암, 갑상선암, 영양막암, 포상기태, 자궁암, 자궁내막암, 질암, 외음암, 청각 신경종, 균상 식육종, 인슐린종, 카르시노이드 증후군, 소마토스타틴종, 잇몸암, 심장암, 구순암, 수막암, 구강암, 신경암, 구개암, 이하선암, 복막암, 인두암, 흉막암, 침샘암, 설암 및 편도암으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 재조합 바이러스, 예컨대, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 하나 이상의 요법, 예컨대, 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 또는 바이러스요법과 함께 조합되어 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 티로신 키나제 억제제, 예컨대, 에를로티닙과 함께 조합되어 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 재조합 바이러스는 체크포인트 억제제, 예컨대, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 또는 항-PD-L1 항체와 함께 조합되어 투여된다. 예시적인 항-PD-1 항체로는 예를 들어, 니볼루맙 (옵디보(Opdivo)®, 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니(Bristol-Myers Squibb Co.)), 펨브롤리주맙 (케이트루다(Keytruda)®, 머크 샤프 & 돔 코포레이션(Merck Sharp & Dohme Corp.)), PDR001 (노바티스 파마슈티칼즈(Novartis Pharmaceuticals)), 및 피딜리주맙 (CT-011, 큐어 테크(Cure Tech))을 포함한다. 예시적인 항-PD-L1 항체로는 예를 들어, 아테졸리주맙 (테센트리크(Tecentriq)®, 제넨테크(Genentech)), 두발루맙 (아스트라제네카(AstraZeneca)), MEDI4736, 아벨루맙, 및 BMS 936559 (브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "조합하여" 투여된다라는 용어는 대상체에서 장애의 발병 동안에 2종의 (또는 그 초과의) 상이한 치료를 대상체에게 전달하여, 환자에 대한 치료 효과가 한 시점에서 중첩되게 하는 것을 의미하는 것으로 이해한다. 특정 실시양태에서, 제2 치료의 전달을 시작할 때 한 치료의 전달이 여전히 일어나고 있어서, 투여의 면에서 중첩된다. 이는 때때로 본원에서 "동시" 또는 "공동 전달"로 지칭된다. 다른 실시양태에서, 다른 치료의 전달을 시작하기 전에 한 치료의 전달이 종료된다. 이러한 경우의 일부 실시양태에서, 조합된 투여로 인해 치료가 더욱 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료는 더욱 효과적이며, 예컨대, 제1 치료의 부재 하에 제2 치료를 투여한 경우에 확인되는 것에 비해, 더 적은 제2 치료에도 등가의 효과가 확인되거나, 또는 제2 치료가 더 큰 정도로 증상을 감소시키거나, 또는 유사한 상황이 제1 치료에서도 확인된다. 특정 실시양태에서, 장애와 관련된 증상 또는 다른 파라미터의 감소가 다른 치료의 부재 하에 전달된 한 치료에 의해 관찰되는 것보다 더 크도록 전달된다. 2종의 치료의 효과는 부분적으로 상가적이거나, 전체적으로 상가적이거나, 또는 상가적인 것보다 더 크다. 제2 치료가 전달될 때, 전달된 제1 치료의 효과가 여전히 검출가능하도록 전달될 수 있다.
명세서 전역에 걸쳐, 바이러스, 조성물 및 시스템이 특정한 성분을 갖거나, 포괄하거나, 또는 포함하는 것으로 기재되거나, 또는 프로세스 및 방법이 특정한 단계를 갖거나, 포괄하거나, 또는 포함하는 것으로 기재된 경우, 이는 추가적으로, 언급된 성분으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진 본 발명의 조성물, 장치 및 시스템이 있고, 언급된 프로세싱 단계로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진 본 발명에 따른 프로세스 및 방법이 있는 것으로 고려된다.
본 출원에서, 요소 또는 성분이 언급된 요소 또는 성분의 목록에 포함되고/거나, 그로부터 선택되는 것으로 언급되는 경우, 상기 요소 또는 성분이 언급된 요소 또는 성분 중 어느 하나일 수 있거나, 또는 상기 요소 또는 성분이 언급된 요소 또는 성분 중 2종 이상으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있음을 이해하여야 한다.
추가로, 본원에 기술된 바이러스, 조성물, 시스템, 방법 또는 프로세스의 요소 및/또는 특징이, 본원에서 명백하건 암시적이건 간에, 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고 다양한 방식으로 조합될 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 특정 바이러스가 언급되는 경우, 문맥상 달리 이해되지 않는다면, 해당 바이러스는 본 발명의 조성물의 다양한 실시양태에서 및/또는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 다시 말해, 본 출원 내에서, 실시양태는 명확하고 간결한 출원이 작성되고, 도시되도록 하는 방식으로 기술되고 도시되었지만, 실시양태가 본원의 교시 및 발명(들)으로부터 벗어나지 않고 다양하게 조합되거나, 분리될 수 있는 것으로 의도되고 그렇게 이해될 것이다. 예를 들어, 본원에 기술되고, 도시된 모든 특징은 본원에 기술되고, 도시된 본 발명(들)의 모든 측면에 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
문맥 및 용법상 달리 이해되지 않는다면, "~중 적어도 하나"라는 표현은 상기 표현 뒤에 이어지는 언급된 대상을 각각 개별적으로, 및 언급된 대상의 2종 이상의 다양한 조합을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 문맥상 달리 이해되지 않는다면, 3종 이상의 언급된 대상과 관련하여 "및/또는"이라는 표현은 동일한 의미를 갖는 것으로 이해하여야 한다.
달리 구체적으로 언급되지 않거나, 또는 문맥상 달리 이해되지 않는다면, "포함한다(include)," "포함한다(includes)," "포함하는," "갖는다(have)," "갖는다(has)," "갖는," "함유한다(contain)," "함유한다(contains)," 또는 "함유하는" 및 이들의 문법적으로 동등한 용어는 일반적으로 예를 들어, 추가적인 언급되지 않은 요소 또는 단계를 배제하지 않고, 개방형이고 비제한적인 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서의 다양한 곳에서, 바이러스, 조성물, 시스템, 프로세스 및 방법, 또는 이들의 특징이 군으로 또는 범위로 개시된다. 구체적으로, 상기 기재는 이러한 군 및 범위의 구성원들의 각각의 모든 개별 하위 조합을 포함하는 것으로 의도된다. 다른 예로, 1 내지 20 범위의 정수는 구체적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20을 개별적으로 개시하는 것으로 의도된다.
"약"이라는 용어가 정량적인 값 앞에서 사용되는 경우, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본 발명은 또한 구체적인 정량적인 값 자체를 포함한다. 달리 명시되거나, 도출되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바, "약"이라는 용어는 공칭 값으로부터 ±10% 변동을 나타낸다.
단계의 순서 또는 특정한 작동을 수행하는 순서는 본 발명이 그대로 작동가능하다면 중요하지 않음을 이해하여야 한다. 더욱이, 2개 이상의 단계 또는 작동이 동시에 수행될 수 있다.
본원에서 임의의 모든 예, 또는 예시적인 표현, 예컨대, "예컨대" 또는 "비롯한"의 사용은 단지 본 발명을 더욱 잘 예시하기 위해 의도된 것이며, 청구되지 않는다면, 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 본 명세서에서 어떤 표현도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실시에서 필수적임을 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적인 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주 또는 내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 종양용해성 아데노바이러스의 제조
본 실시예는 A549 세포에서의 재조합 종양용해성 아데노바이러스 제조를 기술한다.
(앞서 미국 특허 번호 9,073,980에 기술된 바와 같이) E1a 개시 부위의 -304 내지 -255 상류에 위치하는 뉴클레오티드 영역의 결실을 보유하며, 이를 통해 E1a 발현이 암-선택적으로 이루어지는 아데노바이러스 유형 5 바이러스를 구축하였다. 이하, 생성된 바이러스는 TAV로 지칭된다.
E1b-19k 영역에 대략 200개의 염기쌍의 결실을 보유하도록 TAV를 추가로 변형시켰다. 이하, 생성된 바이러스는 TAV-Δ19k로 지칭된다. 변형된 E1b-19k 영역의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같으며, 융합된 SalI 및 XhoI 부위로부터의 잔류 염기는 밑줄로 표시되어 있다:
Figure pct00001
.
변형된 E1b-19k 영역에 마우스 TGF-β 트랩 (마우스 TGFβ 유형 II 수용체 및 마우스 IgG1의 융합 단백질)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 TAV-Δ19k를 변형시켰다. 이하, 생성된 바이러스는 TAV-mTGFβ-트랩으로 지칭된다. TGF-β 트랩을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
Figure pct00002
.
(캐나다 국립 연구원(National Research Council of Canada)으로부터 구입한) SF-BMAdR 281 A549 세포를 진탕 플라스크 중의 현탁 배양물 중 무혈청 배지 (하이클론(Hyclone) SFM4Transfx-293)에서 배양하였다. 총 부피 100 mL 중 2x106 세포/mL의 밀도로 성장시킨 후, 세포를 원심분리하고, 100 mL의 신선한 SFM4Transfx-293 배지 중에 재현탁시켰다. 50 mL의 재현탁된 배양물을 TAV-Δ19k 아데노바이러스로 감염시키고, 50 mL의 재현탁된 배양물을 TAV-mTGFβ-트랩 아데노바이러스로 감염시켰다. 세포를 3일 동안 진탕 플라스크 중의 현탁 배양물 중에서 유지시켜 바이러스를 복제시킨 후, 냉동-해동 사이클로 배양물을 용해시켜 세포 용해물을 제조하였다.
이어서, 바이러스를 세포 용해물로부터 생체내 투여에 적절한 완충제 (10 mM 트리스, 1 mM MgCl2, 3% 수크로스, pH 8)로 원심분리, 뉴클레아제 처리, 음이온 교환 크로마토그래피, 및 투석에 의해 정제하였다.
이어서, 바이러스를 생체내 효능에 대해 시험하였다. 성체 129S4 마우스에 1x106개의, 폐암 세포주인 ADS-12 세포를 피하 주사하고, 피하 종양을 형성시켰다. 종양이 처리할 정도로 충분한 크기로 크게 성장한 후, 10마리의 마우스를 각각 TAV-Δ19k 아데노바이러스 또는 TAV-mTGFβ-트랩 아데노바이러스를 종양내 주사로 처리하였다. 3회 용량의 1x109 IU의 각 바이러스를 매 4일마다 투여하였다. 각 바이러스로 처리된 마우스에서의 평균 종양 부피는 도 1에 도시되어 있고, 각 바이러스로 처리된 마우스의 무진행 생존은 도 2에 도시되어 있다.
실시예 2: 종양용해성 아데노바이러스의 제조
본 실시예는 HEK-293 유래 세포 대비 A549 유래 세포에서의 재조합 종양용해성 아데노바이러스 제조를 기술한다.
(앞서 미국 특허 번호 9,073,980에 기술된 바와 같이) E1a 개시 부위의 -304 내지 -255 상류에 위치하는 뉴클레오티드 영역의 결실을 보유하며, 이를 통해 E1a 발현이 암-선택적으로 이루어지는 아데노바이러스 유형 5 바이러스를 구축하였다. 이하, 생성된 바이러스는 TAV로 지칭된다.
E1b-19k 영역에 대략 200개의 염기쌍의 결실을 보유하도록 TAV를 추가로 변형시켰다. 이하, 생성된 바이러스는 TAV-Δ19k로 지칭된다. 변형된 E1b-19k 영역의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같으며, 융합된 SalI 및 XhoI 부위로부터의 잔류 염기는 밑줄로 표시되어 있다:
Figure pct00003
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변형된 E1b-19k 영역에 인간 TGF-β 트랩 (인간 TGFβ 유형 II 수용체 및 인간 IgG1의 융합 단백질)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 TAV-Δ19k를 변형시켰다. 이하, 생성된 바이러스는 TAV-hTGFβ-트랩으로 지칭된다.
HEK-293 세포 (293-3F6) 및 A549 세포 (SF-BMAdR), 둘 모두에서 TAV-hTGFβ-트랩 아데노바이러스를 제조하였다. 무혈청 배지 (SFM4Transfx-293) 중에서 5x105 세포/mL로 배양된 HEK-293 세포를 감염 다중도 (MOI) 3으로 TAV-hTGFβ-트랩으로 감염시켰다. 감염 후 4일째, 수율은 42 PFU/세포였다. 별개의 실험에서, 무혈청 배지 (SFM4Transfx-293) 중에서 1x106 세포/mL로 배양된 HEK-293 세포를 MOI 3으로 TAV-hTGFβ-트랩으로 감염시켰다. 감염 후 4일째, 수율은 10 PFU/세포 미만이었다. 무혈청 배지 (SFM4Transfx-293) 중에서 1x106 세포/mL로 배양된 A549 세포를 MOI 3으로 TAV-hTGFβ-트랩으로 감염시켰다. 감염 후 4일째, 수율은 1100 PFU/세포였다. 비변형 A549 세포는 현탁 배양물 중의 동일한 무혈청 배지 (SFM4Transfx-293) 중에서 성장할 수 있도록 적응하지 못했다. 상기 세포주로부터의 바이러스 제조는 도 3에 도시되어 있다.
종합하면, 본 결과는 A549 유래 숙주 세포, 예컨대, SF-BMAdR A549 숙주 세포는 특정 종양용해성 바이러스, 예컨대, TAV-hTGFβ-트랩 아데노바이러스를 더 높은 수율로 제조한다는 것을 나타낸다.
참조로의 포함
본원에서 언급된 각각의 특허 문헌 및 과학 기사의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
등가물
본 발명은 그의 정신 또는 필수 특징으로부터 벗어나지 않고 다른 특정한 형태로 실시될 수 있다. 따라서, 상기 실시양태는 본원에 기술된 본 발명을 제한하기 보다는 오히려 모든 측면에서 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범주는 상기 설명에 의해서가 아니라 첨부된 청구범위에 의해 지정되고, 청구범위의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화가 그에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> EpicentRx, Inc. <120> METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT VIRUS <130> RDX-029WO <150> US 62/483,837 <151> 2017-04-10 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35938 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 1 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360 gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420 cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480 tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540 tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga 600 aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta ctggctgata atcttccacc 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10 <210> 13 <211> 8 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 13 tgccttaa 8 <210> 14 <211> 11 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 14 taaaaaaaaa t 11

Claims (75)

  1. (a) A549 숙주 세포를 재조합 바이러스로 감염시켜 감염된 A549 숙주 세포를 제조하는 단계; 및
    (b) 재조합 바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 무혈청 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 현탁 배양하여 재조합 바이러스를 제조하는 단계
    를 포함하는, 재조합 바이러스를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, A549 숙주 세포가 SF-BMAdR 281 A549 세포인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 감염된 A549 숙주 세포를 적어도 3일 동안 배양하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 이후에 재조합 바이러스를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 재조합 바이러스를 정제하는 단계가 감염된 A549 숙주 세포를 용해시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 재조합 바이러스를 정제하는 단계가 뉴클레아제 처리를 포함하는 것인 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스를 정제하는 단계가 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
  8. 제4항에 있어서, 재조합 바이러스를 정제하는 단계가
    (i) 감염된 A549 숙주 세포를 용해시켜 세포 용해물을 제조하고;
    (ii) 세포 용해물을 뉴클레아제로 처리하여 처리된 세포 용해물을 제조하고;
    (iii) 처리된 세포 용해물로부터 이온 교환 크로마토그래피에 의해 재조합 바이러스를 정제하는 것을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서, HEK293 숙주 세포를 재조합 바이러스로 감염시켜 감염된 HEK293 숙주 세포를 제조하고, 단계 (b)에서, 재조합 바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 무혈청 배지 중에서 감염된 HEK293 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법과 비교하여 적어도 10x 더 많은 재조합 바이러스를 생성하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 재조합 바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 무혈청 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 부착 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법과 비교하여 적어도 10x 더 많은 재조합 바이러스를 생성하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 재조합 바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 혈청 함유 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법과 비교하여 적어도 10x 더 많은 재조합 바이러스를 생성하는 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 아데노바이러스 또는 아데노-연관 바이러스인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 아데노바이러스가 유형 5 아데노바이러스 (Ad5)인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 재조합 종양용해성 바이러스인 방법.
  15. (a) A549 숙주 세포를 재조합 종양용해성 아데노바이러스로 감염시켜 감염된 A549 숙주 세포를 제조하는 단계; 및
    (b) 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 무혈청 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 현탁 배양하여 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 단계
    를 포함하는, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, A549 숙주 세포가 SF-BMAdR 281 A549 세포인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 감염된 A549 숙주 세포를 적어도 3일 동안 배양하는 것인 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 이후에 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계가 감염된 A549 숙주 세포를 용해시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계가 뉴클레아제 처리를 포함하는 것인 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계가 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계가
    (i) 감염된 A549 숙주 세포를 용해시켜 세포 용해물을 제조하고;
    (ii) 세포 용해물을 뉴클레아제로 처리하여 처리된 세포 용해물을 제조하고;
    (iii) 처리된 세포 용해물로부터 이온 교환 크로마토그래피에 의해 재조합 바이러스를 정제하는 것을 포함하는 것인 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서, HEK293 숙주 세포를 재조합 종양용해성 아데노바이러스로 감염시켜 감염된 HEK293 숙주 세포를 제조하고, 단계 (b)에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 무혈청 배지 중에서 감염된 HEK293 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법과 비교하여 적어도 10x 더 많은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성하는 방법.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 무혈청 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 부착 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법과 비교하여 적어도 10x 더 많은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성하는 방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 혈청 함유 배지 중에서 감염된 A549 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법과 비교하여 적어도 10x 더 많은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성하는 방법.
  26. (a) 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 A549 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및
    (b) 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 제조되도록 허용하는 조건하에 무혈청 배지 중에서 A549 숙주 세포를 현탁 배양하여 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 단계
    를 포함하는, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 제조하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, A549 숙주 세포가 SF-BMAdR 281 A549 세포인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, A549 숙주 세포를 적어도 3일 동안 배양하는 것인 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 이후에 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계가 A549 숙주 세포를 용해시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계가 뉴클레아제 처리를 포함하는 것인 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계가 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 정제하는 단계가
    (i) 감염된 A549 숙주 세포를 용해시켜 세포 용해물을 제조하고;
    (ii) 세포 용해물을 뉴클레아제로 처리하여 처리된 세포 용해물을 제조하고;
    (iii) 처리된 세포 용해물로부터 이온 교환 크로마토그래피에 의해 재조합 바이러스를 정제하는 것을 포함하는 것인 방법.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서, 재조합 종양용해성 바이러스를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 HEK293 숙주 내로 도입하고, 단계 (b)에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 제조되도록 허용하는 조건하에 무혈청 배지 중에서 HEK293 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법과 비교하여 적어도 10x 더 많은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성하는 방법.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 무혈청 배지 중에서 A549 숙주 세포를 부착 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법과 비교하여 적어도 10x 더 많은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성하는 방법.
  36. 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 복제되도록 허용하는 조건하에 혈청 함유 배지 중에서 A549 숙주 세포를 현탁 배양하는 것을 포함하는 유사한 방법과 비교하여 적어도 10x 더 많은 재조합 종양용해성 아데노바이러스를 생성하는 방법.
  37. 제14항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 유형 5 아데노바이러스 (Ad5)인 방법.
  38. 제14항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 기능성 Pea3 결합 부위의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 결실이 E1a의 개시 부위의 약 -300 내지 약 -250 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 결실이 E1a의 개시 부위의 -305 내지 -255 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  41. 제38항 또는 제39항에 있어서, 결실이 E1a의 개시 부위의 -304 내지 -255 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)의 195-244에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, E1a 프로모터가 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 2)를 포함하는 것인 방법.
  44. 제14항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 기능성 TATA 박스의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 결실이 전체 TATA 박스의 결실을 포함하는 것인 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 결실이 E1a 프로모터의 -27 내지 -24에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 결실이 E1a 프로모터의 -31 내지 -24에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 결실이 E1a 프로모터의 -44 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 결실이 E1a 프로모터의 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 472 내지 475에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 468 내지 475에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 455 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 353 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  54. 제14항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 3), AGTGCCCG (서열식별번호: 8) 및/또는 TATTCCCG (서열식별번호: 9)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 3)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 것인 방법.
  56. 제14항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 기능성 CAAT 박스의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함하는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 결실이 전체 CAAT 박스의 결실을 포함하는 것인 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 결실이 E1a 프로모터의 -76 내지 -68에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 423 내지 431에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, E1a 프로모터가 서열 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 10)를 포함하는 것인 방법.
  61. 제14항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 E1b-19K 삽입 부위 내로 삽입되고, 여기서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위와 E1b-19K의 정지 부위 사이에 위치하는 것인 방법.
  63. 제65항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 약 200개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 202개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  65. 제62항 또는 제63항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 203개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 1714-1917에 상응하는 결실을 포함하는 것인 방법.
  67. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 1714-1916에 상응하는 결실을 포함하는 것인 방법.
  68. 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 1714 및 1917에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입되는 것인 방법.
  69. 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 1714 및 1916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입되는 것인 방법.
  70. 제62항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 CTGACCTC (서열식별번호: 4)와 TCACCAGG (서열식별번호: 5) 사이에 삽입되는 것인 방법.
  71. 제62항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스가 5'에서 3' 배향으로 CTGACCTC (서열식별번호: 4), 트랜스진, 및 TCACCAGG (서열식별번호: 5)를 포함하는 것인 방법.
  72. 제61항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 외인성 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되지 않은 것인 방법.
  73. 제61항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 CD80, CD137L, IL-23, IL-23A/p19, p40, IL-27, IL-27A/p28, IL-27B/EBI3, ICAM-1, TGF-β 트랩, TGF-β, CD19, CD20, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, CD154, CD86, BORIS/CTCFL, FGF, IL-24, MAGE, NY-ESO-1, 아세틸콜린, 인터페론-감마, DKK1/Wnt, p53, 티미딘 키나제, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 및 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 과다증식성 세포에서 선택적으로 복제하는 것인 방법.
  75. 제61항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 과다증식성 세포에서 트랜스진을 선택적으로 발현하는 것인 방법.
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