CN110741081B - 肿瘤选择性tata盒和caat盒突变体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了例如一种重组病毒，其包含与基因可操作地连接的(i)修饰的基于TATA盒的启动子和/或(ii)修饰的基于CAAT盒的启动子，其中所述修饰的基于TATA盒的启动子和/或修饰的基于CAAT盒的启动子缺少具功能性TATA盒和/或CAAT盒，并允许所述基因在过度增殖性细胞中选择性表达。所述重组病毒可用于治疗细胞增殖性疾病和障碍，包括某些形式的癌症。

Description

肿瘤选择性TATA盒和CAAT盒突变体

与相关申请的交叉引用

本申请要求2017年1月30日提交的美国临时专利申请系列号62/452,075的利益和优先权，所述临时申请在此整体通过参考并入本文。

技术领域

本发明的领域是分子生物学和病毒学，具体来说是偏好性感染过度增殖性和/或非生长停滞细胞的修饰的病毒。

背景技术

尽管对引起癌症的潜在分子机制已有广泛了解，但大多数晚期癌症仍不能使用当前的化疗和放射方案治愈。溶瘤病毒已成为具有显著增强当前用于各种不同恶性肿瘤的标准治疗的潜力的平台技术(Kumar，S.等，(2008)，CURRENT OPINION IN MOLECULARTHERAPEUTICS10(4)：371-379；Kim，D.，(2001)，EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL THERAPY1(3)：525-538；Kim D.(2000)ONCOGENE 19(56)：6660-6669)。已显示，这些病毒有希望作为不仅通过感染-繁殖-裂解的链式反应直接破坏恶性细胞，而且间接地诱导抗肿瘤免疫力的溶瘤剂。这些免疫刺激性质，通过在每次病毒复制时复制并表达的治疗性转基因的插入而被增强。

以前开发的溶瘤病毒包括被称为TAV-255的溶瘤性5血清型腺病毒(Ad5)，其在正常细胞中被转录弱化但在癌细胞中有转录活性(参见PCT公布号WO2010/101921)。据信TAV-255载体实现这种肿瘤选择性的机制是通过用于转录因子Pea3和E2F的三个转录因子(TF)结合位点的靶向缺失，所述转录因子是通过结合到特定DNA序列来调控病毒进入宿主细胞后将会转录的最早基因E1a的腺病毒表达的蛋白质。

尽管到目前为止已作出尝试，但对具体来说表现出肿瘤选择性复制、病毒介导的裂解和/或治疗性转基因表达的用于在人类患者中治疗癌症或过度增殖性障碍的改进的溶瘤病毒，仍存在需求。

发明内容

本发明部分是基于下述发现，即对于某些病毒启动子来说，TATA和/或CAAT盒尽管对于在正常的健康细胞中驱动转录来说是必需的，但对于癌性细胞中的活跃转录来说是可有可无的。

因此，一方面，本发明提供了一种重组病毒，其包含：(i)与基因可操作地连接的修饰的基于TATA盒的启动子，其中所述修饰的基于TATA盒的启动子缺少功能性TATA盒并允许所述基因在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中的选择性表达；和/或(ii)与基因可操作地连接的修饰的基于CAAT盒的启动子，其中所述修饰的基于CAAT盒的启动子缺少功能性CAAT盒并允许所述基因在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中的选择性表达。

另一方面，本发明提供了一种重组病毒，其包含与基因可操作地连接的修饰的基于TATA盒的启动子，其中所述修饰的基于TATA盒的启动子缺少功能性TATA盒并允许所述基因在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中的选择性表达。

另一方面，本发明提供了一种重组病毒，其包含与基因可操作地连接的修饰的基于CAAT盒的启动子，其中所述修饰的基于CAAT盒的启动子缺少功能性CAAT盒并允许所述基因在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中的选择性表达。

在前述重组病毒任一者的某些实施方式中，所述重组病毒选自重组痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯性疱疹病毒1(HSV1)、黏液瘤病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MV)和新城疫病毒(NDV)。在某些实施方式中，所述重组病毒是腺病毒例如5型腺病毒(Ad5)或35型腺病毒(Ad35)，例如5型腺病毒。在某些实施方式中，所述修饰的基于TATA盒的启动子和/或修饰的基于CAAT盒的启动子是早期基因启动子，例如E1a启动子、E1b启动子或E4启动子，例如E1a启动子。

在前述重组病毒任一者的某些实施方式中，包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰包含整个TATA盒的缺失。在某些实施方式中，所述病毒包含对应于所述5型腺病毒E1a启动子的-27至-24、-31至-24、-44至+54或-146至+54位的核苷酸的缺失，所述核苷酸分别对应于SEQ ID NO：2的471至474、467至474、454至551和352至551位核苷酸和SEQ IDNO：8的472至475、468至475、455至552和353至552位核苷酸。

在某些实施方式中，所述病毒包含对应于所述5型腺病毒E1a启动子的-29至-26、-33至-26、-44至+52或-148至+52位的核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述病毒包含对应于SEQ ID NO：2的471至475、467至475、446至551和352至551位核苷酸的核苷酸缺失。

另一方面，本发明提供了一种重组病毒，其中所述病毒是5型腺病毒，并且所述病毒包含对应于所述5型腺病毒E1a启动子的-27至-24、-31至-24、-44至+54或-146至+54位的核苷酸的缺失，所述核苷酸分别对应于SEQ ID NO：2的471至474、467至474、454至551和352至551位核苷酸和SEQ ID NO：8的472至475、468至475、455至552和353至552位核苷酸。

另一方面，本发明提供了一种重组病毒，其中所述病毒是5型腺病毒，并且所述病毒包含对应于所述5型腺病毒E1a启动子的-29至-26、-33至-26、-44至+52或-148至+52位的核苷酸的缺失，或对应于SEQ ID NO：2的471至475、467至475、446至551和352至551位核苷酸的核苷酸缺失。

另一方面，本发明提供了一种重组病毒，其中所述病毒是5型腺病毒，并且所述病毒包含多核苷酸缺失，所述所核苷酸缺失导致包含序列CTAGGACTG(SEQ ID NO：7)、AGTGCCCG(SEQ ID NO：12)或TATTCCCG(SEQ ID NO：13)的重组5型腺病毒，其由联结原本在所述被缺失的多核苷酸序列两侧的两个多核苷酸序列产生。

在前述重组病毒任一者的某些实施方式中，包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰包含整个CAAT盒的缺失。在某些实施方式中，所述病毒包含对应于5型腺病毒E1a启动子的-76至-68位的核苷酸的缺失，所述核苷酸对应于SEQ ID NO：2的422至430位核苷酸和SEQ ID NO：8的423至431位核苷酸。

另一方面，本发明提供了一种重组病毒，其中所述病毒是5型腺病毒，并且所述病毒包含对应于5型腺病毒E1a启动子的-76至-68位的核苷酸的缺失，所述核苷酸对应于SEQID NO：2的422至430位核苷酸和SEQ ID NO：8的423至431位核苷酸。

在前述重组病毒任一者的某些实施方式中，所述病毒包含SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQID NO：23的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

另一方面，本发明提供了一种重组病毒，其中所述病毒是5型腺病毒，并且所述病毒包含多核苷酸缺失，所述多核苷酸缺失导致包含序列TTCCGTGGCG(SEQ ID NO：14)的重组5型腺病毒，其由联结原本在所述被缺失的多核苷酸序列两侧的两个多核苷酸序列产生。

在前述重组病毒任一者的某些实施方式中，所述病毒包含对应于所述Ad35基因组的477至484位的核苷酸的缺失。

在某些实施方式中，任何前述重组病毒还可以包含编码治疗性转基因的核苷酸序列。所述治疗性转基因可以编码治疗性多肽，例如凋亡剂、抗体、CTL应答肽、细胞因子、细胞裂解剂、细胞毒性剂、酶、在肿瘤细胞表面表达以引发免疫应答的异源抗原、免疫刺激或免疫调节剂、干扰素、裂解肽、癌蛋白、催化导致细胞死亡的过程的多肽、补充体细胞中的遗传缺陷的多肽、肿瘤抑制蛋白、疫苗抗原及其任何组合。所述治疗性转基因可以编码治疗性核酸例如反义RNA或核酶。在某些实施方式中，所述治疗性转基因选自乙酰胆碱、抗PD-1抗体重链或轻链、抗PD-L1抗体重链或轻链、BORIS/CTCFL、CD19、CD20、CD80、CD86、CD137L、CD154、DKK1/Wnt、ICAM-1、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-17、IL-23、IL-23A/p19、干扰素-γ、TGF-β、TGF-β阱、FGF、IL-24、IL-27、IL-35、MAGE、NY-ESO-1、p53和胸苷激酶。在某些实施方式中，所述治疗性转基因是TGF-β阱。在某些实施方式中，所述重组病毒包含E1b-19K和E1b-55K起始位点，并且编码所述治疗性转基因的核苷酸序列被插入到所述E1b-19K的起始位点与E1b-55K的起始位点之间。

在某些实施方式中，任何前述重组病毒可以包含至少一个Pea3结合位点或其功能性部分的缺失。

在某些实施方式中，任何前述重组病毒可以选择性地在过度增殖性细胞和/或非生长停滞细胞中复制。在某些实施方式中，任何前述重组病毒可以选择性地在过度增殖性细胞和/或非生长停滞细胞中表达E1a、E1b和/或治疗性转基因。在某些实施方式中，任何前述重组病毒可以选择性地在过度增殖性细胞和/或非生长停滞细胞中具有细胞裂解活性。

所述过度增殖性和/或非生长停滞细胞可以是癌细胞、内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞和/或免疫细胞。所述过度增殖性和/或非生长停滞细胞可以是癌细胞，例如肛门癌、基底细胞癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、上皮癌、胆管癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胃食管癌、胃肠(GI)癌、胃肠道间质瘤、肝细胞癌、妇科癌症、头颈癌、血液癌症、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、神经内分泌癌症、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、儿科癌症、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、皮肤的鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌细胞。

另一方面，本发明提供了一种重组病毒，其包含允许在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中选择性表达所述病毒的任何修饰或缺失的病毒调控序列。

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含前述重组病毒中的任一者或组合和至少一种可药用载体或稀释剂。

另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗过度增殖性疾病的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文描述的重组病毒，以在所述受试者中治疗所述过度增殖性疾病。在某些实施方式中，所述过度增殖性疾病选自癌症、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、银屑病、狼疮、特发性肺纤维化、硬皮病肺动脉高压、哮喘、肾纤维化、COPD、囊性纤维化、DIP、UIP、黄斑变性、再狭窄、视网膜病、过度增殖性成纤维细胞障碍、硬皮病、肾小球肾炎、糖尿病性肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病综合征、移植排斥、肾小球病和硬化症。

在某些实施方式中，所述过度增殖性疾病是癌症。在某些实施方式中，所述癌症选自肛门癌、基底细胞癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、上皮癌、胆管癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胃食管癌、胃肠(GI)癌、胃肠道间质瘤、肝细胞癌、妇科癌症、头颈癌、血液癌症、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、神经内分泌癌症、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、儿科癌症、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、皮肤的鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌和甲状腺癌。

另一方面，本发明提供了一种在受试者中抑制肿瘤生长的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文描述的重组病毒，以抑制所述肿瘤细胞的增殖。

另一方面，本发明提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的方法。所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的本文描述的重组病毒，以抑制所述肿瘤细胞的增殖。

在每种上述方法中，所述重组病毒可以例如与选自手术、放射、化疗、免疫疗法、激素疗法和病毒疗法的一种或多种疗法联合施用。在每种上述方法中，所述重组病毒的有效量可以包含例如10²-10¹⁵噬斑形成单位(pfu)。在每种上述方法中，所述受试者可以是例如人类例如人类儿童或动物。

在每种上述方法中，所述重组病毒的有效量可以例如通过测量所述受试者中对抗原的免疫应答来鉴定。在某些实施方式中，通过在受试者皮肤上的注射部位向受试者注射抗原并测量注射部位的硬结大小来测量对抗原的免疫应答。

另一方面，本发明提供了一种在靶细胞中表达治疗性转基因的方法。所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的本文描述的重组病毒，以表达所述靶转基因。

另一方面，本发明提供了一种工程化改造溶瘤病毒的方法。所述方法包括修饰与基因可操作地连接的基于病毒TATA盒的启动子，使得修饰的基于TATA盒的启动子缺少功能性TATA盒，并允许在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中选择性表达所述基因。

另一方面，本发明提供了一种工程化改造溶瘤病毒的方法。所述方法包括修饰与基因可操作地连接的基于病毒CAAT盒的启动子，使得修饰的基于CAAT盒的启动子缺少功能性CAAT盒，并允许在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中选择性表达所述基因。

另一方面，本发明提供了一种工程化改造溶瘤病毒的方法。所述方法包括修饰与基因可操作地连接的基于病毒TATA盒的启动子，使得修饰的基于TATA盒的启动子缺少功能性TATA盒，并允许在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中选择性表达所述基因，和/或修饰与基因可操作地连接的基于病毒CAAT盒的启动子，使得修饰的基于CAAT盒的启动子缺少功能性CAAT盒，并允许在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中选择性表达所述基因。

另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在某些实施方式中，所述分离的核酸包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列。本发明提供了包含一种或多种上述核酸的宿主细胞。

另一方面，本发明提供了一种生产重组病毒的方法。所述方法包括：(a)将一种或多种上述宿主细胞在使所述宿主细胞生产所述重组病毒的条件下生长；以及(b)纯化所述重组病毒。

本发明的这些和其他方面和优点，通过下面的附图、详细描述和权利要求书来说明。

附图说明

参考下面的附图，可以更完整地理解本发明。

图1A描绘了Ad-Δ350(其包括TATA盒和CAAT盒两者的缺失)的5’末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列。从野生型腺病毒序列缺失200个核苷酸的位点用连字符表示。图1B描绘了Ad-TATA的5’末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列。从野生型腺病毒序列缺失8个核苷酸的位点用连字符表示。图1C描绘了Ad-CAAT的5’末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列。从野生型腺病毒序列缺失9个核苷酸的位点用连字符表示。图1D描绘了Ad-CAAT-TATA的5’末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列。从野生型腺病毒序列缺失9个核苷酸和8个核苷酸的位点用连字符表示。图1E描绘了Ad-CAAT-mTATA的5’末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列。从野生型腺病毒序列缺失9个核苷酸和4个核苷酸的位点用连字符表示。图1F描绘了野生型Ad5的5’末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列。CAAT盒(GGTCAAAGT)和TATA盒(TATTTATA)用框指明。

图2A描绘了Western印迹，示出了在用Ad-Δ350或Ad-TAV-255感染后指定时间内癌性Panc-1细胞中的E1a表达水平。图2B描绘了Western印迹，示出了在用Ad-Δ350或Ad-TAV-255感染后指定时间内非癌性WI-38细胞中的E1a表达水平。L表示分子量标准Ladder，CN表示未感染的对照。

图3A描绘了Western印迹，示出了在用Ad-Δ350或Ad-TAV-255以3或5的感染复数(MOI)感染后72小时癌性Panc-1细胞中的E1a表达水平。图3B描绘了Western印迹，示出了在用Ad-Δ350或Ad-TAV-255以3或5的感染复数(MOI)感染后72小时癌性A549细胞中的E1a表达水平。L表示分子量标准Ladder，CN表示未感染的对照。

图4A描绘了癌性HCT116细胞、Panc-1细胞和A549细胞在用Ad-Δ350以指示的MOI感染后指示的时间点时的结晶紫染色。图4B描绘了非癌性MRC5细胞和WI38细胞在用Ad-Δ350或Ad-TAV-255以指示的MOI感染后10天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。CN表示未感染的对照。

图5描绘了癌性A549、Panc1、HCT116和Hep3b细胞作为未感染的对照和在用Ad-CAAT或Ad-CAAT-mTATA以5MOI感染后三天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。

图6描绘了癌性ADS-12、ASPC1、HT-29和Hep3b细胞作为未感染的对照和用Ad-TATA、Ad-CAAT、Ad-CAAT-TATA、Ad-Δ350和Ad-TAV-Δ19k以5MOI感染后三天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。

图7描绘了癌性ADS-12、ASPC1、HT-29和Hep3b细胞作为未感染的对照和用Ad-TATA、Ad-CAAT、Ad-CAAT-TATA、Ad-Δ350和Ad-TAV-Δ19k以5MOI感染后四天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。

图8描绘了癌性Panc1、A549、MeWo和HCT-116细胞作为未感染的对照和用Ad-TATA、Ad-CAAT、Ad-CAAT-TATA、Ad-Δ350和Ad-TAV-Δ19k以5MOI感染后三天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。

图9描绘了癌性Panc1、A549、MeWo和HCT-116细胞作为未感染的对照和用Ad-TATA、Ad-CAAT、Ad-CAAT-TATA、Ad-Δ350和Ad-TAV-Δ19k以5MOI感染后四天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。

图10描绘了癌性A549、HCT116、Hep3b和Panc1细胞作为未感染的对照和用Ad-TATA、Ad-CAAT、Ad-CAAT-TATA、Ad-Δ350和Ad-TAV-Δ19k以5MOI感染后五天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。

图11描绘了癌性MeWo、HT29、ADS12和ASPC细胞作为未感染的对照和用Ad-TATA、Ad-CAAT、Ad-CAAT-TATA、Ad-Δ350和Ad-TAV-Δ19k以5MOI感染后五天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。

图12描绘了非癌性WI38细胞作为未感染的对照和用Ad-TATA、Ad-CAAT、Ad-CAAT-TATA、Ad-Δ350和Ad-TAV-Δ19k以指示的MOI感染后四天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。

图13描绘了非癌性WI38细胞作为未感染的对照和用Ad-TATA、Ad-CAAT、Ad-CAAT-TATA、Ad-Δ350和Ad-TAV-Δ19k以指示的MOI感染后六天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。

图14描绘了癌性Panc-1细胞、A549细胞和ADS12细胞用Ad-Δ350-Δ19k以指示的MOI感染后五天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。CN表示未感染的对照。

图15描绘了癌性Panc-1细胞、A549细胞和ADS12细胞用Ad-Δ350-GM-CSF以指示的MOI感染后五天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。CN表示未感染的对照。

图16描绘了癌性A549细胞用Ad-Δ350-Δ19k、Ad-Δ350-mGM-CSF和Ad-TAV-Δ19k以5MOI感染后三天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。CN表示未感染的对照。

图17描绘了癌性A549细胞用Ad-Δ350-Δ19k、Ad-Δ350-mGM-CSF和Ad-TAV-Δ19k以5MOI感染后五天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。CN表示未感染的对照。

图18描绘了癌性HCT116细胞用Ad-Δ350-Δ19k、Ad-Δ350-mGM-CSF和Ad-TAV-Δ19k以5MOI感染后三天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。CN表示未感染的对照。

图19描绘了癌性HCT116细胞用Ad-Δ350-Δ19k、Ad-Δ350-mGM-CSF和Ad-TAV-Δ19k以5MOI感染后五天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。CN表示未感染的对照。

图20描绘了癌性Hep3b细胞用Ad-Δ350-Δ19k、Ad-Δ350-mGM-CSF和Ad-TAV-Δ19k以5MOI感染后三天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。CN表示未感染的对照。

图21描绘了癌性MeWo细胞用Ad-Δ350-Δ19k、Ad-Δ350-mGM-CSF和Ad-TAV-Δ19k以5MOI感染后五天的结晶紫染色。结晶紫将活细胞染为蓝色。CN表示未感染的对照。

图22描绘了柱状图，示出了在将A549细胞用Ad-Δ350-Δ19k或Ad-Δ350-mGM-CSF以10MOI感染后通过ELISA测定的mGM-CSF表达。

图23描绘了柱状图，示出了在将ADS12细胞用Ad-Δ350-Δ19k或Ad-Δ350-mGM-CSF以指示的MOI感染后通过ELISA测定的mGM-CSF表达。

图24描绘了带有皮下ADS-12肿瘤，用缓冲液、Ad-Δ350-Δ19k(表示为350-19k)或Ad-TAV-Δ19k(表示为TAV-19k)的三次肿瘤内注射进行治疗的小鼠的肿瘤体积。图中的每条线代表单个小鼠的肿瘤体积。

图25是描绘了从在E1A启动子中包含TATA盒缺失的人类35型腺病毒基因组转染的HEK-293细胞产生的病毒细胞病理效应的图像。发明详述

转录需要RNA聚合酶II(RNA pol II)正确定位在被称为启动子的短DNA序列上。启动子序列通常包含高度保守的被称为TATA盒的富含A/T的序列，其通常在侧翼带有富含G/C的序列，位于转录起始位点上游大约30个碱基对处。缺少可识别的TATA盒的基因通常是管家基因，并且依赖转录因子Sp1来转录，而含有TATA盒的基因通常是对生物响应途径做出响应的高度受调控的基因。TATA盒被RNA polII的召集所需的转录因子IIB(TFIIB)和TATA结合蛋白(TBP)识别。在TATA盒的突变或移除例如腺病毒E1a基因的启动子中的TATA盒的移除后转录受损或失活的实验观察，支持了TATA盒在转录中的核心作用(Wu等，(1987)NATURE326(6112)：512-5)。

许多启动子中存在的另一种序列是CAAT盒。CAAT盒通常位于基因的转录起始位点上游大约60-100碱基处，并具有共有序列GG(T/C)CAATCT。CAAT盒被核心结合因子(也被称为核因子Y或NF-Y)和CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)识别。

本发明部分是基于下述发现，即对于某些病毒启动子例如5型腺病毒(Ad5)E1a启动子来说，TATA和/或CAAT盒尽管在正常的健康细胞中对驱动转录来说是必需的，但对于癌性细胞中的活跃转录来说是可有可无的。因此，一方面，本发明提供了一种重组病毒，其包含：(i)与基因可操作地连接的修饰的基于TATA盒的启动子，其中所述修饰的基于TATA盒的启动子缺少功能性TATA盒，并允许所述基因在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中选择性表达；和/或(ii)与基因可操作地连接的修饰的基于CAAT盒的启动子，其中所述修饰的基于CAAT盒的启动子缺少功能性CAAT盒，并允许所述基因在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中选择性表达。所述基于TATA盒的启动子和基于CAAT盒的启动子可以是相同启动子(例如Ad5 E1a启动子)，或者可以是不同启动子。

另一方面，本发明提供了一种重组病毒，其包含与基因可操作地连接的修饰的基于TATA盒的启动子，其中所述修饰的基于TATA盒的启动子缺少功能性TATA盒，并允许所述基因在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中选择性表达。

另一方面，本发明提供了一种重组病毒，其包含与基因可操作地连接的修饰的基于CAAT盒的启动子，其中所述修饰的基于CAAT盒的启动子缺少功能性CAAT盒，并允许所述基因在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中选择性表达。

另一方面，本发明提供了一种重组病毒，其包含允许所述病毒在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中选择性表达的任何修饰或缺失的病毒调控序列。示例性的病毒调控序列除了TATA和CAAT盒之外还包括TATA盒下游的Ad5 E1a引发序列和Ad5 E1a启动子元件。

当在本文中使用时，“TATA盒”是指能够结合到TATA结合蛋白(TBP)的核苷酸序列。TATA盒通常包含富含A/T的8核苷酸的区段，其含有核心序列TATAAA(SEQ ID NO：1)，其中所述8核苷酸区段在侧翼带有富含G/C的序列，然而，TATA盒可能与所述典型TATA序列具有很少相似之处。

当在本文中使用时，“修饰的TATA盒”是指相对于野生型TATA盒序列具有一个或多个核苷酸的缺失、替换或添加的TATA盒。

当在本文中使用时，“功能性TATA盒”是指能够结合到TBP的TATA盒，例如具有相应的野生型TATA盒序列的至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％或至少40％的TBP结合活性的TATA盒。当在本文中使用时，“无功能的TATA盒”是指例如具有相应的野生型TATA盒序列的低于30％、低于20％、低于10％或0％的TBP结合活性的TATA盒。用于确定TBP是否结合到TATA盒的测定法在本领域中是已知的。示例性的结合测定法包括电泳迁移率变动测定法、染色质免疫沉淀测定法和DNAse足迹测定法。

当在本文中使用时，“基于TATA盒的启动子”是指含有TATA盒的任何基因启动子。

当在本文中使用时，“修饰的基于TATA盒的启动子”是指已通过一个或多个核苷酸的缺失、替换或添加进行修饰的基于TATA盒的启动子。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰包含野生型基于TATA盒的启动子序列的一个或多个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰由野生型基于TATA盒的启动子序列的一个或多个核苷酸的缺失构成。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰包含野生型基于TATA盒的启动子序列的整个TATA盒的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰由野生型基于TATA盒的启动子序列的整个TATA盒的缺失构成。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰包含所述整个基于TATA盒的启动子的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰由所述整个基于TATA盒的启动子的缺失构成。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰不包含分开的有功能的启动子序列的添加或替换。

在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰包含野生型基于TATA盒的启动子序列的1至300、1至200、1至100、1至75、1至50、1至25、1至10、1至8、1至4个核苷酸、4至300、4至200、4至150、4至100、4至75、4至50、4至25、4至10、4至8、8至300、8至200、8至150、8至100、8至75、8至50、8至25、8至10、10至300、10至200、10至150、10至100、10至75、10至50、10至25、25至300、25至200、25至150、25至100、25至75、25至50、50至300、50至200、50至150、50至100、50至75、75至300、75至200、75至150、75至100、100至300、100至200、100至150、150至300、150至200或200至300个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰包含野生型基于TATA盒的启动子序列的约10、约25、约50、约75、约100、约150、约200或约300个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰包含野生型基于TATA盒的启动子序列的约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰包含野生型基于TATA盒的启动子序列的1、2、3、4、5、6、7、8或10个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰包含野生型基于TATA盒的启动子序列的4或8个核苷酸的缺失。

当在本文中使用时，“CAAT盒”是指能够结合到C/EBP或NF-Y蛋白的核苷酸序列。TATA盒通常包含共有序列GG(T/C)CAATCT。

当在本文中使用时，“修饰的CAAT盒”是指相对于野生型CAAT盒序列具有一个或多个核苷酸的缺失、替换或添加的CAAT盒。

当在本文中使用时，“功能性CAAT盒”是指能够结合到C/EBP或NF-Y蛋白的CAAT盒，例如具有相应的野生型CAAT盒序列的至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％或至少40％的C/EBP或NF-Y结合活性的CAAT盒。当在本文中使用时，“无功能的CAAT盒”是指例如具有相应的野生型CAAT盒序列的低于30％、低于20％、低于10％或0％的C/EBP或NF-Y结合活性的CAAT盒。用于确定C/EBP或NF-Y蛋白是否结合到CAAT盒的测定法在本领域中是已知的。示例性的结合测定法包括电泳迁移率变动测定法、染色质免疫沉淀测定法和DNAse足迹测定法。

当在本文中使用时，“基于CAAT盒的启动子”是指含有CAAT盒的任何基因启动子。

当在本文中使用时，“修饰的基于CAAT盒的启动子”是指已通过一个或多个核苷酸的缺失、替换或添加进行修饰的基于CAAT盒的启动子。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰包含野生型基于CAAT盒的启动子序列的一个或多个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰由野生型基于CAAT盒的启动子序列的一个或多个核苷酸的缺失构成。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰包含所述野生型基于CAAT盒的启动子序列的整个CAAT盒的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰由所述野生型基于CAAT盒的启动子序列的整个CAAT盒的缺失构成。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰包含所述整个基于CAAT盒的启动子的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰由所述整个基于CAAT盒的启动子的缺失构成。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰不包含分开的有功能的启动子序列的添加或替换。

在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰包含野生型基于CAAT盒的启动子序列的1至300、1至200、1至100、1至75、1至50、1至25、1至10、1至8、1至4个核苷酸、4至300、4至200、4至150、4至100、4至75、4至50、4至25、4至10、4至8、8至300、8至200、8至150、8至100、8至75、8至50、8至25、8至10、10至300、10至200、10至150、10至100、10至75、10至50、10至25、25至300、25至200、25至150、25至100、25至75、25至50、50至300、50至200、50至150、50至100、50至75、75至300、75至200、75至150、75至100、100至300、100至200、100至150、150至300、150至200或200至300个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰包含野生型基于CAAT盒的启动子序列的约10、约25、约50、约75、约100、约150、约200或约300个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰包含野生型基于CAAT盒的启动子序列的约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰包含野生型基于CAAT盒的启动子序列的1、2、3、4、5、6、7、8或10个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰包含野生型基于CAAT盒的启动子序列的9个核苷酸的缺失。

术语“可操作连接”是指多核苷酸元件以有功能的关系连接。核酸序列当与另一个核酸序列以有功能的关系放置时，被“可操作连接”。例如，如果启动子或增强子影响基因的转录，则它被可操作连接到所述基因。可操作连接的核苷酸序列通常是毗连的。然而，由于增强子通常在与启动子相隔几千碱基时起作用并且内含子序列可能具有可变的长度，因此某些多核苷酸元件可能是可操作连接的但不直接在两侧，并且甚至可能从不同的等位基因或染色体反式起作用。在某些实施方式中，基因(编码区)被可操作连接到修饰的基于TATA盒和/或修饰的基于CAAT盒的启动子。

术语“转基因”是指外源基因或多核苷酸序列。术语“治疗性转基因”是指当在病毒中或被病毒复制和/或表达时，在靶细胞、体液、组织、器官、生理系统或受试者中提供治疗效果的转基因。

在某些实施方式中，所述重组病毒表现出可操作连接到修饰的基于TATA盒和/或修饰的基于CAAT盒的启动子的基因在过度增殖性和/或非生长停滞细胞例如癌细胞相对于非过度增殖性和/或生长停滞细胞中的选择性表达。在某些实施方式中，所述基因在所述非过度增殖性和/或生长停滞细胞中的表达为所述基因在所述过度增殖性细胞和/或非生长停滞细胞中的表达的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。在某些实施方式中，所述病毒在非过度增殖性和/或生长停滞细胞中不表现出所述基因的可检测的表达。在某些实施方式中，所述重组病毒在非过度增殖性和/或生长停滞细胞中对可操作连接到修饰的基于TATA盒和/或基于CAAT盒的启动子的基因的表达，为不含所述修饰的基于TATA盒和/或基于CAAT盒的启动子的相应病毒对所述基因的表达的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。在某些实施方式中，所述重组病毒表现出早期基因例如腺病毒E1a或E1b的选择性表达。基因表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法来确定，例如在本文实施例2中所描述的Western印迹。

在某些实施方式中，可操作连接到修饰的基于TATA盒和/或基于CAAT盒的启动子的基因例如早期基因被所述重组病毒在过度增殖性和/或非生长停滞细胞例如癌细胞中的选择性表达，引起所述病毒在所述过度增殖性和/或非生长停滞细胞中的选择性复制。在某些实施方式中，所述病毒在非过度增殖性和/或生长停滞细胞中的复制为所述病毒在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中的复制的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。在某些实施方式中，所述病毒在非过度增殖性和/或生长停滞细胞中的复制为不含修饰的基于TATA盒和/或基于CAAT盒的启动子的相应病毒的复制的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。病毒复制可以通过本领域中已知的任何适合的方法来确定，例如通过例如本文实施例2中描述的Western印迹测定病毒蛋白质的表达，通过例如本文实施例3中描述的结晶紫染色测定病毒介导的裂解，或通过定量聚合酶链反应(qPCR)。

在某些实施方式中，可操作连接到修饰的基于TATA盒和/或基于CAAT盒的启动子的基因例如早期基因被所述重组病毒在过度增殖性和/或非生长停滞细胞例如癌细胞中的选择性表达，引起所述过度增殖性和/或非生长停滞细胞的选择性的病毒介导的裂解(即细胞裂解活性)。在某些实施方式中，非过度增殖性和/或生长停滞细胞的所述病毒介导的裂解为过度增殖性和/或非生长停滞细胞的病毒介导的裂解的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％，或约5％。在某些实施方式中，所述病毒不表现出非过度增殖性和/或生长停滞细胞的可检测的病毒介导的裂解。在某些实施方式中，非过度增殖性和/或生长停滞细胞的所述病毒介导的裂解为不含修饰的基于TATA盒和/或基于CAAT盒的启动子的相应病毒的病毒介导的裂解的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。病毒介导的裂解可以通过本领域中已知的任何适合的方法来确定，例如本文实施例3中所描述的结晶紫染色。

在某些实施方式中，可操作连接到修饰的基于TATA盒和/或基于CAAT盒的启动子的基因例如早期基因被所述重组病毒在过度增殖性和/或非生长停滞细胞例如癌细胞中的选择性表达，引起治疗性转基因被所述重组病毒的选择性表达。在某些实施方式中，治疗性转基因在非过度增殖性和/或生长停滞细胞中的表达为所述治疗性转基因在过度增殖性和/或非生长停滞细胞中的表达的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％。在某些实施方式中，所述病毒在非过度增殖性和/或生长停滞细胞中不表现出所述治疗性转基因的可检测的表达。在某些实施方式中，治疗性转基因在非过度增殖性和/或生长停滞细胞中的表达为不含修饰的基于TATA盒和/或基于CAAT盒的启动子的相应病毒在所述细胞中的所述治疗性转基因的表达的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、或约5％。治疗性转基因的表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法来确定，例如本文实施例4中所描述的ELISA。

所述过度增殖性和/或非生长停滞细胞可以是癌细胞、内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞和/或免疫细胞。所述过度增殖性和/或非生长停滞细胞可以是癌细胞，例如肛门癌、基底细胞癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、上皮癌、胆管癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胃食管癌、胃肠(GI)癌、胃肠道间质瘤、肝细胞癌、妇科癌症、头颈癌、血液癌症、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、神经内分泌癌症、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、儿科癌症、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、皮肤的鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌细胞。在其他实施方式中，所述过度增殖性细胞源自于过度增殖性障碍。示例性的过度增殖性障碍包括血管增殖性障碍(例如再狭窄、视网膜病和动脉粥样硬化)、纤维化障碍(例如硬化症例如肝硬化(其可能是病毒感染例如肝炎继发的))、肾小球膜障碍(例如人类肾病如肾小球肾炎、糖尿病性肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病综合征、移植排斥和肾小球病)、癌前障碍(例如增生或发育不良)、自体免疫障碍、类风湿性关节炎、银屑病、狼疮、特发性肺纤维化、硬皮病肺动脉高压、哮喘、肾纤维化、COPD、囊性纤维化、DIP、UIP、黄斑变性、过度增殖性成纤维细胞障碍和硬皮病。

序列同一性可以以本领域技术之内的各种不同方式确定，例如使用公开可用的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx所利用的算法的BLAST(局部序列比对检索基本工具)分析(Karlin等，(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87：2264-2268；Altschul，(1993)J.MOL.EVOL.36，290-300；Altschul等，(1997)NUCLEIC ACIDS RES.25：3389-3402，通过参考并入本文)，被定制用于序列相似性检索。对于检索序列数据库中的基本问题的讨论，参见Altschul等，(1994)NATURE GENETICS 6：119-129，其整体通过参考并入本文。本领域技术人员可以为用于测量对齐、包括在待比较的序列的整个长度上获得最大对齐所需的任何算法，确定适合的参数。用于直方图、描述、比对、期望值(即报告对数据库序列的匹配的统计显著性阈值)、截止值、矩阵和筛选程序的搜索参数，采用缺省设置。被blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的缺省评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等，(1992)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 89：10915-10919，其整体通过参考并入本文)。四种blastn参数可以如下调整：Q＝10(间隙生成罚分)；R＝10(间隙扩展罚分)；wink＝1(在沿着查询的每个wink位置处产生词命中数)；和gapw＝16(设置在其中产生带间隙的比对的窗口宽度)。等效的Blastp参数设置可以是Q＝9，R＝2，wink＝1和gapw＝32。检索也可以使用NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)BLAST高级选项参数来进行(例如：-G，间隙开放罚分[Integer]：缺省值＝对于核苷酸来说5/对于蛋白质来说11；-E，间隙扩展罚分[Integer]：缺省值＝对于核苷酸来说2/对于蛋白质来说1；-q，核苷酸错配罚分[Integer]：缺省值＝-3；-r，核苷酸匹配奖励[Integer]：缺省值＝1；-e，期望值[Real]：缺省值＝10；-W，词大小[Integer]：缺省值＝对于核苷酸来说11/对于megablast来说28/对于蛋白质来说3；-y，以字节为单位的blast扩展的衰减(X)：缺省值＝对于blastn来说20/对于其他来说7；-X，带间隙的比对的X衰减值(以字节为单位)：缺省值＝对于所有程序来说15，不适用于blastn；和-Z，带间隙的比对的最终X衰减值(以字节为单位)：对于blastn来说50，对于其他来说25)。也可以将ClustalW用于成对蛋白质比对(缺省参数可以包括例如Blosum62矩阵和间隙开放罚分＝10和间隙扩展罚分＝0.1)。在GCG软件包10.0版中可用的序列之间的Bestfit比较，使用DNA参数GAP＝50(间隙生成罚分)和LEN＝3(间隙扩展罚分)，在蛋白质比较中的等同设置是GAP＝8和LEN＝2。

I.病毒

术语“病毒”在本文中用于指称不具有蛋白质合成或能量产生机制的任何专性细胞内寄生物。病毒的基因组可以是RNA或DNA。在本发明的实践中有用的病毒包括重组修饰的有包膜或无包膜DNA和RNA病毒，优选地选自杆状病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、痘病毒或腺病毒。重组修饰的病毒在本文中被称为“重组病毒”。重组病毒可以通过重组DNA技术修饰成复制缺陷型、条件复制型或复制型，和/或通过重组DNA技术修饰成包含外源转基因的表达。利用每种母体载体性质的有利要素的嵌合病毒载体(参见例如Feng等，(1997)NATURE BIOTECHNOLOGY 15：866-870)也可用于本发明的实践。尽管使用来自于待治疗物种的病毒通常是有利的，但在某些情况下，使用源自于具有有利致病特点的不同物种的载体，可能是有利的。例如，在PCT公布号WO 98/27216中描述了将马疱疹病毒载体用于人类基因疗法。由于所述马病毒对人类不致病，因此所述载体被描述为可用于人类的治疗。同样地，绵羊腺病毒载体可用于人类基因疗法，因为它们据称避免了对人类腺病毒载体的抗体。这些载体描述在PCT公布号WO 97/06826中。

对本发明的实践有用的病毒含有基于TATA盒和/或基于CAAT盒的启动子。在某些实施方式中，所述基于TATA盒和/或基于CAAT盒的启动子是早期基因例如编码在进入宿主细胞之后但在复制之前产生的蛋白质的基因的启动子，所述蛋白质通常启动基因组的复制和晚期基因的表达。

具有早期基因的基于TATA盒和/或基于CAAT盒的启动子的病毒的实例包括人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、1型单纯性疱疹病毒、腺相关病毒、流感病毒、呼肠孤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、辛德毕斯病毒(SIN)和仙台病毒(SV)。

优选地，所述重组病毒是腺病毒。腺病毒是中等大小(90-100nm)、无包膜(裸露的)二十面体病毒，由核衣壳和双链线性DNA基因组构成。腺病毒在哺乳动物细胞的核中使用宿主的复制机制复制。术语“腺病毒”是指腺病毒属包括但不限于人类、牛、绵羊、马、犬、猪、鼠和猴腺病毒亚属的任何病毒。具体来说，人类腺病毒包括A-F亚属及其各个血清型，所述各个血清型和A-F亚属包括但不限于人类1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad11a和Ad11p)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91型腺病毒。优选的是源自于人类2、5和35型腺病毒的重组病毒。除非另有陈述，否则所有5型腺病毒的核苷酸编号是相对于本文中描绘在SEQ ID NO：8中的NCBI参比序列AC_000008.1，并且所有35型腺病毒的核苷酸编号是相对于本文中描绘在SEQ ID NO：24中的NCBI参比序列AC_000019.1。编码5型腺病毒基因组的5’末端的示例性载体质粒(pXC1)的序列在本文中描绘在SEQ ID NO：2中。

腺病毒复制周期具有两个阶段：早期阶段，在此期间四个转录单元E1、E2、E3和E4被表达；和晚期阶段，其在病毒DNA合成开始之后发生，此时晚期转录本主要从主要晚期启动子(MLP)表达。晚期讯息编码病毒的大多数结构蛋白质。E1、E2和E4的基因产物负责转录激活、细胞转化、病毒DNA复制以及其他病毒功能，并且对于病毒生长来说是必需的。

在某些实施方式中，所述修饰的基于TATA盒的启动子是腺病毒E1a、E1b或E4启动子。在某些实施方式中，所述修饰的基于TATA盒的启动子是腺病毒E1a启动子，例如Ad5 E1a启动子。包含在所述修饰的基于TATA盒的启动子中的修饰可以例如包含整个E1a启动子TATA盒的缺失，例如包含对应于Ad5 E1a启动子的-27至-24位核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述病毒包含对应于Ad5 E1a启动子的-27至-24、-31至-24、-44至+54或-146至+54位的核苷酸的缺失，所述核苷酸分别对应于SEQ ID NO：2的471至474、467至474、454至551和352至551位核苷酸和SEQ ID NO：8的472至475、468至475、455至552和353至552位核苷酸。在某些实施方式中，所述病毒包含对应于Ad5 E1a启动子的-29至-26、-33至-26、-44至+52或-148至+52位的核苷酸的缺失。

在某些实施方式中，所述病毒包含对应于Ad5 E1a启动子的约-50至约-10、约-50至约-20、约-50至约-30、约-50至约-40、约-40至约-10、约-40至约-20、约-40至约-30、约-30至约-10、约-30至约-20或约-20至约-10位的核苷酸的缺失。

在某些实施方式中，所述病毒包含产生包含序列CTAGGACTG(SEQ ID NO：7)、AGTGCCCG(SEQ ID NO：12)或TATTCCCG(SEQ ID NO：13)的病毒的多核苷酸缺失，其由联结原本在所述被缺失的多核苷酸序列两侧的两个多核苷酸序列产生。在某些实施方式中，所述病毒包含序列CTAGGACTG(SEQ ID NO：7)、AGTGCCCG(SEQ ID NO：12)或TATTCCCG(SEQ IDNO：13)，或与CTAGGACTG(SEQ ID NO：7)、AGTGCCCG(SEQ ID NO：12)或TATTCCCG(SEQ ID NO：13)具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

在某些实施方式中，所述修饰的基于CAAT盒的启动子是腺病毒E1a、E1b或E4启动子。在某些实施方式中，所述修饰的基于CAAT盒的启动子是腺病毒E1a启动子，例如Ad5 E1a启动子。包含在所述修饰的基于CAAT盒的启动子中的修饰可以例如包含整个E1a启动子CAAT盒的缺失，例如包含对应于5型腺病毒E1a启动子的-76至-68位核苷酸的缺失，所述核苷酸对应于SEQ ID NO：2的422至430位核苷酸和SEQ ID NO：8的423至431位核苷酸。

在某些实施方式中，所述病毒包含对应于Ad5 E1a启动子的约-90至约-50、约-90至约-60、约-90至约-70、约-90至约-80、约-80至约-50、约-80至约-60、约-80至约-70、约-70至约-50、约-70至约-60或约-60至约-50位的核苷酸的缺失。

在某些实施方式中，所述病毒包含产生包含序列TTCCGTGGCG(SEQ ID NO：14)的病毒的多核苷酸缺失，其由联结原本在所述被缺失的多核苷酸序列两侧的两个多核苷酸序列产生。在某些实施方式中，所述病毒包含序列TTCCGTGGCG(SEQ ID NO：14)或与TTCCGTGGCG(SEQ ID NO：14)具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

在某些实施方式中，所述病毒包含对应于Ad5 E1a启动子的约-200至约+50、约-175至约+50、约-150至约+50、约-125至约+50、约-100至约+50、约-75至约+50、约-50至约+50、约-25至约+50、约+1至约+50、约+25至约+50、约-200至约+25、约-175至约+25、约-150至约+25、约-125至约+25、约-100至约+25、约-75至约+25、约-50至约+25、约-25至约+25、约+1至约+25、约-200至约+1、约-175至约+1、约-150至约+1、约-125至约+1、约-100至约+1、约-75至约+1、约-50至约+1、约-25至约+1、约-200至约-25、约-175至约-25、约-150至约-25、约-125至约-25、约-100至约-25、约-75至约-25、约-50至约-25、约-200至约-50、约-175至约-50、约-150至约-50、约-125至约-50、约-100至约-50、约-75至约-50、约-200至约-75、约-175至约-75、约-150至约-75、约-125至约-75、约-100至约-75、约-200至约-100、约-175至约-100、约-150至约-100、约-125至约-100、约-200至约-125、约-175至约-125、约-150至约-125、约-200至约-150、约-175至约-150或约-200至约-175位的核苷酸的缺失。

在某些实施方式中，除了修饰的基于TATA盒和/或基于CAAT盒的启动子之外，所述病毒还具有对调控序列或启动子的一个或多个其他修饰。对调控序列或启动子的其他修饰包括与所述调控序列或启动子的野生型序列相比一个或多个核苷酸的缺失、替换或添加。所述其他修饰可以邻近或远离所述修饰的基于TATA盒和/或基于CAAT盒的启动子。

在某些实施方式中，所述调控序列或启动子的其他修饰包括转录因子结合位点序列的修饰，以例如通过缺失其一部分或通过在所述结合位点中插入单个点突变来降低对所述转录因子的亲和性。在某些实施方式中，所述其他的修饰的调控序列增强在癌细胞中的表达但减弱在正常细胞中的表达。

在某些实施方式中，所述调控序列或启动子的其他修饰包括对E1a调控序列的其他修饰。E1a调控序列含有用于转录因子Pea3的5个结合位点，被称为Pea3 I、Pea3 II、Pea3III、Pea3 IV和Pea3 V，其中Pea3 I是最靠近E1a起始位点的Pea3结合位点，Pea3 V是最远离的。E1a调控序列也含有用于转录因子E2F的结合位点，因此被称为E2F I和E2F II，其中E2F I是最靠近E1a起始位点的E2F结合位点，E2F II更远离一些。从E1a起始位点起，所述结合位点的排列为：Pea3 I，E2F I，Pea3 II，E2F II，Pea3 III，Pea3 IV和Pea3 V。

在某些实施方式中，这七个结合位点中的至少一个或其功能性部分被缺失。“功能性部分”是所述结合位点的在被缺失时将所述结合位点的功能例如对其相应转录因子(Pea3或E2F)的结合亲和性与完整序列相比降低例如至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％或甚至消除所述功能的部分。在某些实施方式中，一个或多个完整的结合位点被缺失。在某些实施方式中，一个或多个结合位点的功能性部分被缺失。“缺失的结合位点”涵盖了完整结合位点的缺失和功能性部分的缺失两者。当两个或更多个结合位点被缺失时，可以使用完整结合位点缺失和功能性部分缺失的任何组合。

在某些实施方式中，至少一个Pea3结合位点或其功能性部分被缺失。所述缺失的Pea3结合位点可以是Pea3 I、Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IV和/或Pea3 V。在某些实施方式中，所述缺失的Pea3结合位点是Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IV和/或Pea3 V。在某些实施方式中，所述缺失的Pea3结合位点是Pea3 IV和/或Pea3 V。在某些实施方式中，所述缺失的Pea3结合位点是Pea3 II和/或Pea3 III。在某些实施方式中，所述缺失的Pea3结合位点是Pea3II和Pea3 III两者。在某些实施方式中，Pea3 I结合位点或其功能性部分被保留。

在某些实施方式中，至少一个E2F结合位点或其功能性部分被缺失。在某些实施方式中，至少一个E2F结合位点或其功能性部分被保留。在某些实施方式中，所述保留的E2F结合位点是E2F I和/或E2F II。在某些实施方式中，所述保留的E2F结合位点是E2F II。在某些实施方式中，全部缺失基本上由Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IV和/或Pea3 V或其功能性部分中的一者或多者构成。在某些实施方式中，所述病毒具有位于E1a起始位点上游-305至-255位的50个碱基对区域的缺失，其在后文中被称为TAV-255缺失。在某些实施方式中，所述病毒具有位于E1a起始位点上游-304至-255位、例如对应于Ad5基因组(SEQ ID NO：8)的195-244位的50个碱基对区域的缺失，其在后文中被称为TAV-255缺失。在某些实施方式中，所述TAV-255缺失产生包含序列GGTGTTTTGG(SEQ ID NO：11)的E1a启动子。

公开的重组病毒可以包含编码治疗性转基因的核苷酸序列。所述治疗性转基因可以编码治疗性核酸例如反义RNA或核酶RNA。所述治疗性转基因可以编码治疗性肽或多肽，例如凋亡剂、抗体、CTL应答肽、细胞因子、细胞裂解剂、细胞毒性剂、酶、在肿瘤细胞表面表达以引发免疫应答的异源抗原、免疫刺激或免疫调节剂、干扰素、裂解肽、癌蛋白、催化导致细胞死亡的过程的多肽、补充体细胞中的遗传缺陷的多肽、肿瘤抑制蛋白、疫苗抗原或其任何组合。

在某些实施方式中，所述治疗性转基因编码治疗性多肽，所述治疗性多肽选自乙酰胆碱、抗PD-1抗体重链或轻链、抗PD-L1抗体重链或轻链、BORIS/CTCFL、CD19、CD20、CD80、CD86、CD137L、CD154、DKK1/Wnt、ICAM-1、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-17、IL-23、IL-23A/p19、干扰素-γ、TGF-β、TGF-β阱、FGF、IL-24、IL-27、IL-35、MAGE、NY-ESO-1、p53和胸苷激酶。在某些实施方式中，所述治疗性转基因是TGF-β阱。适合用于本发明的TGF-β阱蛋白描述在2017年9月27日提交的美国专利申请号15/717,199中。

腺病毒E1b-19k基因主要起到抗凋亡基因的作用，并且是细胞抗凋亡基因BCL-2的同源物。由于在子代病毒粒子成熟之前的宿主细胞死亡将限制病毒复制，因此E1b-19k作为E1盒式元件的一部分表达以防止过早的细胞死亡，由此允许感染继续并产生成熟病毒粒子。因此，在某些实施方式中，提供了包含E1b-19K插入位点的重组病毒，例如所述腺病毒具有插入到E1b-19K插入位点中的编码治疗性转基因的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点(即编码E1b-19k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：8的1714-1716位核苷酸)与E1b-55K的起始位点(即编码E1b-55k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：8的2019-2021位核苷酸)之间。在整个本描述和权利要求书中，两个位点之间的插入，例如(i)第一基因(例如E1b-19k)的起始位点与第二基因(例如E1b-55K)的起始位点、(ii)第一基因的起始位点与第二基因的终止位点、(iii)第一基因的终止位点与第二基因的起始位点或(iv)第一基因的终止位点与第二基因的终止位点之间的插入，被理解为意味着在所述插入周围的构成给定起始位点或终止位点的全部或一部分核苷酸，可能存在或不存在于最终病毒中。同样地，两个核苷酸之间的插入被理解为意味着所述插入周围的核苷酸可能存在或不存在于最终病毒中。

在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点位于E1b-19K的起始位点(即编码E1b-19k的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：8的1714-1716位核苷酸)与E1b-19K的终止位点(即编码E1b-19k的终止密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：8的2242-2244位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约100至约305、约100至约300、约100至约250、约100至约200、约100至约150、约150至约305、约150至约300、约150至约250或约150至约200个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含邻近所述E1b-19K的起始位点的约200个核苷酸例如203个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E1b-19K插入位点包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO：8)的1714-1916位核苷酸的缺失，或者编码所述治疗性转基因的核苷酸序列被插入到对应于Ad5基因组(SEQ ID NO：8)的1714和1916位的核苷酸之间。在某些实施方式中，编码所述治疗性转基因的核苷酸序列被插入到CTGACCTC(SEQ ID NO：9)与TCACCAGG(SEQ ID NO：10)之间，例如所述重组腺病毒以5’至3’方向包含CTGACCTC(SEQ ID NO：9)、编码所述治疗性转基因的核苷酸序列和TCACCAGG(SEQ ID NO：10)。CTGACCTC(SEQ ID NO：9)和TCACCAGG(SEQ ID NO：10)为Ad5基因组(SEQ ID NO：8)内的E1b-19K插入位点定义了独特的边界序列。在整个本描述和权利要求书中，邻近位点的缺失，例如邻近基因的起始位点的缺失或邻近基因的终止位点的缺失，被理解为意味着所述缺失可以包括构成给定起始位点或终止位点的全部或一部分核苷酸的缺失或不包括所述核苷酸的缺失。

在某些实施方式中，在任何前述病毒中，所述重组腺病毒还包含E4缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失位于E4-ORF6/7的起始位点(即编码E4-ORF6/7的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的34075-34077位核苷酸)与右侧末端反向重复序列(ITR；例如对应于SEQ ID NO：23的35836-35938位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E4缺失位于E4-ORF6/7的起始位点与E4-ORF1的起始位点(即编码E4-ORF1的起始密码子的核苷酸序列，例如对应于SEQ ID NO：23的35524-35526位核苷酸)之间。在某些实施方式中，所述E4缺失包含E4-ORF6/7的起始位点与E4-ORF1的起始位点之间的核苷酸序列的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含约500至约2500、约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约1000至约2500、约1000至约2000、约1000至约1500、约1500至约2500、约1500至约2000或约2000至约2500个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含邻近E4-ORF6/7的起始位点的约250至约1500、约250至约1250、约250至约1000、约250至约750、约250至约500、500至约1500、约500至约1250、约500至约1000、约500至约750、750至约1500、约750至约1250、约750至约1000、约1000至约1500或约1000至约1250个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含邻近E4-ORF6/7的起始位点的约1450个核苷酸的缺失，例如所述E4缺失包含邻近E4-ORF6/7的起始位点的约1449个核苷酸的缺失。在某些实施方式中，所述E4缺失包含对应于Ad5基因组(SEQ ID NO：23)的34078-35526位核苷酸的缺失。

II.病毒的生产方法

用于生产本发明的重组病毒的方法在本领域中是已知的。通常，本公开的病毒在适合的宿主细胞系中，使用常规的技术来生产，所述技术包括将转染或感染的宿主细胞在适合条件下培养，以便允许生产感染性病毒粒子。可以将编码病毒基因的核酸并入到质粒中，并通过常规的转染或转化技术引入到宿主细胞中。适合于生产本公开的病毒的示例性宿主细胞包括人类细胞系例如HeLa、Hela-S3、HEK293、911、A549、HER96或PER-C6细胞。具体的生产和纯化条件随着病毒和使用的生产系统而变。对于腺病毒来说，用于病毒粒子的产生的传统方法是穿梭质粒(通常含有少部分腺病毒的基因组并任选地含有可能的转基因表达盒)和腺病毒辅助质粒(含有完整腺病毒基因组的大部分)的共转染和随后的体内重组。

用于产生腺病毒的另一种技术包括使用细菌人工染色体(BAC)系统，利用含有互补腺病毒序列的两个质粒在recA÷细菌菌株中的体内细菌重组，以及酵母人工染色体(YAC)系统。

在生产后，将感染性病毒粒子从培养物回收并任选地纯化。典型的纯化步骤可以包括噬斑纯化、离心例如氯化铯梯度离心、澄清、酶处理例如全能核酸酶(benzonase)或蛋白酶处理、层析步骤例如离子交换层析或过滤步骤。

III.治疗性组合物和治疗方法

为了治疗性使用，优选地将重组病毒与可药用载体合并。当在本文中使用时，“可药用载体”意味着适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。所述载体应该在与配方的其他成分相容并对接受者无害的意义上是“可接受的”。可药用载体包括与药物施用相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和药剂用于药物活性物质的使用在本领域中是已知的。

含有本文公开的重组病毒的药物组合物可以以剂量单位形式存在，并且可以通过任何适合的方法制备。药物组合物应该被配制成与其目标施用途径相容。施用途径的实例是静脉内(IV)、真皮内、吸入、透皮、局部、透黏膜和直肠施用。用于融合蛋白的优选的施用途径是IV输注。有用的配方可以通过制药技术领域中已知的方法来制备。例如参见《Remington制药学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第18版(Mack PublishingCompany，1990)。适合于肠胃外施用的配方组分包括无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂，抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂例如EDTA，缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节渗涨度的药剂例如氯化钠或右旋糖。

对于静脉内施用来说，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所述载体在制造和储存条件下应该是稳定的，并且应该对微生物进行防腐。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其适合的混合物的溶剂或分散介质。

药物配方优选为无菌的。除菌可以通过任何适合的方法例如通过除菌滤膜过滤来实现。当所述组合物被冷冻干燥时，过滤除菌可以在冷冻干燥和重构之前或之后进行。

当在本文中使用时，术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的活性组分的量(例如本发明的重组病毒的量)。有效量可以在一次或多次施用、施用或剂量中施用，并且不打算限于特定配方或施用途径。

在某些实施方式中，活性组分的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg例如1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至10mg/kg的范围内。在某些实施方式中，重组病毒的治疗有效量在10²至10¹⁵噬斑形成单位(pfu)例如10²至10¹⁰、10²至10⁵、10⁵至10¹⁵、10⁵至10¹⁰或10¹⁰至10¹⁵噬斑形成单位的范围内。施用的量取决于多种变量，例如待治疗的疾病或指征的类型和程度、患者的总体健康、抗体的体内效能、药物配方和施用途径。初始剂量可以提高到超过上限，以便快速获得所需的血液水平或组织水平。或者，初始剂量可以低于最适剂量，并且可以在治疗过程中逐渐提高每日剂量。人类剂量可以例如在被设计从0.5mg/kg运行到20mg/kg的常规I期升剂量研究中进行优化。施用频率可以随着多种因素而变，例如施用途径、剂量、病毒的血清半衰期和待治疗的疾病。示例性的施用频率是每天一次、每周一次和每两周一次。优选的施用途径是肠胃外，例如静脉内输注。基于病毒的药物的配制在本领域的普通技术范围之内。在某些实施方式中，重组病毒被冷冻干燥，然后在施用时在缓冲盐水中重构。

本文公开的重组病毒可用于治疗各种不同的医学指征。例如，本文公开的重组病毒可用于治疗各种不同的过度增殖性疾病例如癌症。将过度增殖性细胞例如癌细胞暴露于治疗有效量的所述重组病毒，以便抑制或减少所述癌细胞的增殖。本发明提供了一种在受试者中治疗癌症的方法。所述方法包括向所述受试者单独地或与另一种治疗剂联合施用有效量的本发明的重组病毒，以在所述受试者中治疗所述癌症。在某些实施方式中，向受试者施用有效量的重组病毒，将该受试者中的肿瘤负荷降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

当在本文中使用时，“治疗”意味着受试者中例如人类中疾病的治疗。这包括：(a)抑制所述疾病，即停止其发展；和(b)缓解所述疾病，即引起疾病状态的消退。当在本文中使用时，术语“受试者”和“患者”是指通过本文描述的方法和组合物治疗的生物体。这些生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠科动物、猴科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物等)，更优选地包括人类。

癌症的实例包括实体肿瘤、软组织肿瘤、造血系肿瘤和转移病灶。造血系肿瘤的实例包括白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)例如转化的CLL、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、霍奇金病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤或Richter’s综合征(Richter’s转化)。实体肿瘤的实例包括各种不同器官系统的恶性肿瘤例如肉瘤、腺癌和癌，例如影响头颈部(包括咽)、甲状腺、肺(小细胞或非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺、淋巴系、胃肠道(例如口腔、食道、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖器和生殖泌尿道(例如肾、尿道上皮、膀胱、卵巢、子宫、宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)、CNS(例如神经或神经胶质细胞例如成神经细胞瘤或神经胶质瘤)或皮肤(例如黑素瘤)的恶性肿瘤。

在某些实施方式中，所述癌症选自肛门癌、基底细胞癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、上皮癌、胆管癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胃食管癌、胃肠(GI)癌、胃肠道间质瘤、肝细胞癌、妇科癌症、头颈癌、血液癌症、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、神经内分泌癌症、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、儿科癌症、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、皮肤的鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌和甲状腺癌。

其他示例性过度增殖性疾病包括血管增殖性障碍(例如再狭窄、视网膜病和动脉粥样硬化)、纤维化障碍(例如硬化症例如肝硬化(其可以是病毒感染例如肝炎继发的))、肾小球膜障碍(例如人类肾病如肾小球肾炎、糖尿病性肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病综合征、移植排斥和肾小球病)、癌前障碍(例如增生或发育不良)、自体免疫障碍、类风湿性关节炎、银屑病、狼疮、特发性肺纤维化、硬皮病肺动脉高压、哮喘、肾纤维化、COPD、囊性纤维化、DIP、UIP、黄斑变性、过度增殖性成纤维细胞障碍和硬皮病。

在某些实施方式中，将重组病毒与一种或多种疗法例如手术、放射、化疗、免疫疗法、激素疗法或病毒疗法联合施用到所述受试者。

在某些实施方式中，本发明的重组病毒与酪氨酸激酶抑制剂例如埃罗替尼联合施用。

在某些实施方式中，本发明的重组病毒与检验点抑制剂例如抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体联合施用。示例性的抗PD-1抗体包括例如纳武单抗(Bristol-Myers Squibb Co.)、派姆单抗(Merck Sharp&Dohme Corp.)、PDR001(Novartis Pharmaceuticals)和pidilizumab(CT-011，Cure Tech)。示例性的抗PD-L1抗体包括例如阿特珠单抗(Genentech)、duvalumab(AstraZeneca)、MEDI4736、avelumab和BMS 936559(Bristol Myers Squibb Co.)。

当在本文中使用时，术语“联合”施用被理解为意味着在受试者患有所述障碍的过程中将两种(或更多种)不同治疗递送到所述受试者，使得所述治疗对所述患者的效果在时间点上交叠。在某些实施方式中，在一种治疗的递送仍在进行时开始第二种治疗的递送，使得在施用方面存在交叠。这有时在本文中被称为“同时”或“共同递送”。在其他实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的某些实施方式中，由于组合施用，所述治疗更加有效。例如，所述第二种治疗更加有效，例如使用更少的第二种治疗时观察到等同的效果，或与在不存在所述第一种治疗的情况下施用所述第二种治疗时观察到的相比，所述第二种治疗更大程度地减轻症状，或者对于所述第一种治疗来说观察到类似的情形。在某些实施方式中，递送使得症状或与所述障碍相关的其他参数的减轻，大于在递送一种治疗而不存在另一种治疗的情况下观察到的减轻。所述两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加的。所述递送可以使得在递送第二种治疗时，递送的第一种治疗的效果仍然可检测。

在某些实施方式中，所述重组病毒的有效量通过在所述受试者中测量对抗原的免疫应答来鉴定，和/或治疗所述受试者的方法还包括在所述受试者中测量对抗原的免疫应答。过度增殖性疾病例如癌症可以通过免疫抑制来表征，并且在所述受试者中测量对抗原的免疫应答可以指示所述受试者中免疫抑制的水平。因此，在所述受试者中测量对抗原的免疫应答可以指示所述治疗的效能和/或所述重组病毒的有效量。所述受试者中对所述抗原的免疫应答可以通过本领域中已知的任何方法来测量。在某些实施方式中，对所述抗原的免疫应答通过在所述受试者皮肤上的注射部位处用所述抗原注射所述受试者，并在所述注射部位处测量硬结的大小或炎症的量来测量。在某些实施方式中，对所述抗原的免疫应答通过在暴露于所述抗原后从所述受试者的细胞释放的细胞因子(例如干扰素-γ、IL-4和/或IL-5)来测量。

在整个本描述中，当病毒、组合物或系统被描述为具有、包括或包含特定组分时，或者当过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，设想了另外还存在基本上由所叙述的组分构成或由所叙述的组分构成的本发明的组合物、装置和系统，并且存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本发明的过程和方法。

在本申请中，当要素或组分被称为包含在叙述的要素或组分的名单中和/或选自所述名单时，应该理解所述要素或组分可以是所叙述的要素或组分中的任一者，或者所述要素或组分可以选自两种或更多种所述叙述的要素或组分。

此外，应该理解，本文描述的病毒、组合物、系统、方法或过程的要素和/或特点可以以本文中明示或暗示的各种不同的方式组合，而不背离本发明的精神和范围。例如，当对特定化合物做出指称时，该化合物可用于本发明的组合物的各种不同实施方式中和/或本发明的方法中，除非从上下文理解不是如此。换句话说，在本申请中，实施方式以能够写出或画出清晰简明的申请的方式进行描述和描绘，但是意图是并且应该认识到的是，实施方式可以进行各种不同的组合或分离，而不背离本发明的教授。例如，应该认识到，本文中描述和描绘的所有特点可以适用于本文中描述和描绘的本发明的所有方面。

应该理解，表述“至少一个”包括在所述表述之后的单独的每个所叙述的物体以及两个或更多个所述叙述的物体的各种不同组合，除非从上下文和用法理解不是如此。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的意义，除非从上下文理解不是如此。

术语“包括”、“具有”或“含有”包括其语法等同语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非上下文另有具体陈述或从上下文理解不是如此。

在本说明书中的各个不同地方，病毒、组合物、系统、过程和方法或其特点成组或以范围公开。具体来说，所述描述包括这些组合和范围的成员的每一个单独的子组合。作为另一个实例，1至20范围内的整数打算单个地公开1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。

当在定量值之前使用术语“约”时，本发明还包括所述特定定量值本身，除非另有具体陈述。当在本文中使用时，术语“约”是指从所述标称值变动±10％，除非另有指明或推断。

应该理解，步骤的顺序或用于执行某些行动的顺序并不重要，只要本发明仍然可操作即可。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中任何和所有的实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅是打算更好地说明本发明，并且除非要求，否则不对本发明的范围做出限制。本说明书中的所有语言都不应该被解释为指示任何未提出权利要求的要素对于本发明的实践来说是必不可少的。

实施例

下面的实施例仅仅是说明性的，并且不打算以任何方式限制本发明的范围或内容。

实施例1：质粒和腺病毒构建

本实施例描述了在包括TATA和/或CAAT盒的E1a启动子区中具有缺失的重组5型(Ad5)腺病毒的生产。

带有Ad5基因组的5′部分的腺病毒载体质粒pXC1从Microbix Biosystem(Toronto，Canada)获得。pXC1载体质粒的核苷酸序列在本文中描绘在SEQ ID NO：2中。Ad5基因组的NCBI参考序列AC_000008.1在本文中描绘在SEQ ID NO：8中。图1F描绘了野生型Ad5的5′末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列，说明了CAAT盒和TATA盒的位置。

产生了修饰的pXC1载体质粒，其具有对应于SEQ ID NO：2的352-551位核苷酸(对应于SEQ ID NO：8的353-552位核苷酸)的200个核苷酸的缺失，包括E1a启动子中的CAAT盒和TATA盒。所述突变的载体质粒在后文中被称为pXC1-Δ350，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为Ad-Δ350。pXC1-Δ350的5′末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列被示出在SEQ ID NO：20中。pXC1-Δ350的全长核苷酸序列示出在SEQ ID NO：4中。Ad-Δ350的5′末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列示出在图1A和SEQ IDNO：3中。所述pXC1载体质粒(和任何修饰的pXC1载体质粒)的5′末端处的21个核苷酸不同于野生型腺病毒序列，然而，这些核苷酸在产生重组腺病毒的过程中被转变成所述野生型腺病毒序列。

在指明时，pXC1-Δ350被进一步修饰，以在Elb-19k区的起始位点处带有SalI位点并在所述SalI位点的3′方向200个碱基对处带有XhoI位点，以便于治疗性转基因的插入。所述修饰的E1b-19k区的核苷酸序列提供在SEQ ID NO：5中。得到的载体质粒在后文中被称为pXC1-Δ350-Δ19k，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为Ad-Δ350-Δ19k。

在指明时，将鼠类GM-CSF的基因克隆到pXC1-Δ350-Δ19k中，在SalI与XhoI位点之间的修饰的E1b-19k区中。小鼠GM-CSF的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：6中。得到的载体质粒在后文中被称为pXC1-Δ350-mGM-CSF，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为Ad-Δ350-mGM-CSF。

产生了另一个修饰的pXC1载体质粒，其具有对应于SEQ ID NO：2的467-474位核苷酸(对应于SEQ ID NO：8的468-475位核苷酸)的8个核苷酸的缺失，包括E1a启动子中的TATA盒。所述突变的载体质粒在后文中被称为pXC1-TATA，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为Ad-TATA。pXC1-TATA的5′末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列示出在SEQ ID NO：21中。Ad-TATA的5′末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列示出在图1B和SEQ ID NO：15中。

产生了另一个修饰的pXC1载体质粒，其具有对应于SEQ ID NO：2的422-430位核苷酸(对应于SEQ ID NO：8的423-431位核苷酸)的9个核苷酸的缺失，包括E1a启动子中的CAAT盒。所述突变的载体质粒在后文中被称为pXC1-CAAT，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为Ad-CAAT。pXC1-CAAT的5′末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列示出在SEQ ID NO：22中。Ad-CAAT的5′末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列示出在图1C和SEQ ID NO：16中。

产生了另一个修饰的pXC1载体质粒，其具有对应于SEQ ID NO：2的422-430位核苷酸(对应于SEQ ID NO：8的423-431位核苷酸)的9个核苷酸的缺失，包括E1a启动子中的CAAT盒，以及对应于SEQ ID NO：2的467-474位核苷酸(对应于SEQ ID NO：8的468-475位核苷酸)的8个核苷酸的缺失，包括E1a启动子中的TATA盒。所述突变的载体质粒在后文中被称为pXC1-CAAT-TATA，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为Ad-CAAT-TATA。pXC1-CAAT-TATA的5′末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列示出在SEQ ID NO：23中。Ad-CAAT-TATA的5′末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列示出在图1D和SEQ ID NO：17中。

产生了另一个修饰的pXC1载体质粒，其具有对应于SEQ ID NO：2的422-430位核苷酸(对应于SEQ ID NO：8的423-431位核苷酸)的9个核苷酸的缺失，包括E1a启动子中的CAAT盒，以及对应于SEQ ID NO：2的471-474位核苷酸(对应于SEQ ID NO：8的472-475位核苷酸)的4个核苷酸的缺失，包括E1a启动子中的TATA盒的4个核苷酸的TATA序列(在后文中被称为最小TATA或mTATA缺失)。所述突变的载体质粒在后文中被称为pXC1-CAAT-mTATA，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为Ad-CAAT-mTATA。pXC1-CAAT-mTATA的5′末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列示出在SEQ ID NO：25中。Ad-CAAT-TATA的5′末端直至E1a基因的起始密码子之前的核苷酸序列示出在图1E和SEQ ID NO：26中。

产生了另一个修饰的pXC1载体质粒，其具有对应于SEQ ID NO：2的194-243位核苷酸(对应于SEQ ID NO：8的195-244位核苷酸和E1a起始位点上游的-304至-255位核苷酸)的50个核苷酸的缺失，其使E1a具有癌症选择性表达(正如以前在美国专利号9,073,980中描述的)。所述突变的载体质粒在后文中被称为pXC1-TAV-255，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为Ad-TAV-255。在指明时，pXC1-TAV-255被进一步修饰以在E1b-19k区的起始位点处带有SalI位点并在所述SalI位点的3′方向200个碱基对处带有XhoI位点，以如上所述便于治疗性转基因的插入。得到的载体质粒在后文中被称为pXC1-TAV-Δ19k，并且从其产生的任何得到的病毒粒子在后文中被称为Ad-TAV-Δ19k。

将各个修饰的pXC1质粒与质粒pJM17共转染到HEK-293A细胞中，以允许通过同源重组来挽救重组病毒。收集病毒并经历两轮噬斑纯化，并在必要时测序以测试相应的缺失的存在。

实施例2：在正常和癌性细胞中来自于Ad-Δ350的E1a表达

本实施例描述了在癌性和正常细胞中来自于修饰的腺病毒Ad-Δ350的病毒蛋白表达之间的比较。

将Panc1细胞(人类胰腺癌细胞)和WI-38细胞(非癌性人类肺成纤维细胞)用如实施例1中所述制备的Ad-Δ350或Ad-TAV-255病毒感染。在感染后指示的小时通过Western印迹测定E1a表达。

如图2A和2B中所示，在用Ad-Δ350病毒感染后，WI-38细胞以比Panc1细胞更低的水平并在更晚的时间点表达腺病毒蛋白E1a。

将Panc1细胞和A549细胞(人类肺癌细胞)用Ad-TAV-255或Ad-Δ350以3或5的感染复数(MOI)感染，并在感染后72小时通过Western印迹测定E1a表达。如图3A(Panc1细胞)和图3B(A549细胞)中所示，两种癌细胞系都支持从Ad-Δ350或Ad-TAV-255病毒的高水平E1a表达。

合在一起，这些结果显示Ad5中包括E1a TATA盒的200个核苷酸的区域为非癌性细胞中的E1a表达所需，尽管该区域对于肿瘤细胞中的E1a表达来说是可有可无的。

实施例3：在正常和癌性细胞中来自于Ad-Δ350、Ad-CAAT、Ad-TATA、Ad-CAAT-TATA和Ad-CAAT-mTATA的细胞毒性

本实施例描述了在癌性和正常细胞中从修饰的腺病毒Ad-Δ350、Ad-CAAT、Ad-TATA、Ad-CAAT-TATA和Ad-CAAT-mTATA产生的细胞毒性之间的比较。

将HCT116细胞(人类结肠癌细胞)、Panc1细胞和A549细胞用如实施例1中所述制备的Ad-Δ350感染。细胞以指示的MOI感染或未保持作为感染的对照，并在感染后指示的时间用结晶紫染色，其将活细胞染为蓝色。如图4A中所示，每种癌性细胞系在感染后4至5天显示出大范围的细胞死亡。

将一组癌性细胞系用如实施例1中所述制备的Ad-CAAT、Ad-TATA、Ad-CAAT-TATA或Ad-CAAT-mTATA感染。所述一组细胞系包括A549、Panc1、HCT116、Hep3b、ADS-12m ASPC 1、HT-29和MeWo细胞。将细胞以5的MOI感染，并在感染后3-4用结晶紫染色。作为对照，将所述细胞系在不感染或用以前描述的溶瘤病毒Ad-TAV-Δ19k感染的情况下培养。结果示出在图5-11中。所有人类癌性细胞系在感染后，特别是到感染后5天为止显示出大范围的细胞死亡，而小鼠细胞系ADS-12在用每种病毒感染后显示出可变的细胞死亡。

将非癌性MRC5细胞(人类肺成纤维细胞)和WI38细胞用如实施例1中所述制备的Ad-Δ350或Ad-TAV感染。将细胞以指示的MOI感染并在感染后10天用结晶紫染色。如图4B中所示，与在感染后4-5天被杀死的癌性细胞相反，所述非癌性细胞在晚到感染后10天仍然存活。

将非癌性WI38细胞用如实施例1中所述制备的Ad-CAAT、Ad-TATA、Ad-CAAT-TATA、Ad-Δ350和Ad-TAV-Δ19k以3和5的MOI感染，并在感染后4天(图12)或6天(图13)用结晶紫染色。结果证实对于每种病毒来说在感染后存在极小的细胞毒性。

合在一起，这些结果显示Ad5中包含E1a TATA盒的200个核苷酸的区域为非癌性细胞中Ad5介导的细胞毒性所需，尽管该区域对于肿瘤细胞中Ad5介导的细胞毒性来说是可有可无的。同样地，在E1a启动子中具有单独的TATA盒、单独的CAAT盒或TATA和CAAT盒两者的缺失的Ad5病毒，显示出癌症选择性细胞毒性。

实施例4：在正常和癌性细胞中来自于Ad-Δ350的治疗性转基因表达

进一步调查了带有Δ350缺失的腺病毒用治疗性转基因代替病毒的E1b-19k基因进行武装的潜力。如实施例1中所述产生下述病毒：病毒Ad-Δ350-Δ19k，其带有Δ350缺失并缺失了19k区域并且随后未插入任何转基因；病毒Ad-Δ350-mGM-CSF，其带有Δ350缺失并携带克隆到E1b-19k区域中SalI与XhoI之间的小鼠GM-CSF的基因；以及病毒Ad-TAV-Δ19k，其带有TAV-255缺失和缺失了19k区域并且随后未插入任何转基因。

将癌性Panc1细胞、A549细胞和ADS12细胞(小鼠肺癌)用Ad-Δ350-Δ19k以指示的MOI感染并在感染后5天用结晶紫染色。如图14中所示，所述癌性细胞系以剂量依赖性方式被杀死。

将癌性Panc1细胞、A549细胞和ADS12细胞用Ad-Δ350-mGM-CSF以指示的MOI感染并在感染后5天用结晶紫染色。如图15中所示，带有小鼠GM-CSF基因的病毒保留了溶瘤活性。

将A549、HCT116、Hep3b和MeWo细胞用Ad-Δ350-mGM-CSF、Ad-Δ350-Δ19k和Ad-TAV-Δ19k以5的MOI感染，并在感染后3至5天用结晶紫染色。如图16-21中所示，Ad-Δ350-mGM-CSF维持与Ad-Δ350-Δ19k和Ad-TAV-Δ19k可比的细胞裂解活性。

将A549细胞用Ad-Δ350-Δ19k或Ad-Δ350-mGM-CSF病毒以10MOI感染。将感染后4天的调制培养基用于mGM-CSF的ELISA。如图22中所示，Ad-Δ350-mGM-CSF诱导mGM-CSF的表达。

将ADS12细胞用Ad-Δ350-Δ19k或Ad-Δ350-mGM-CSF以指示的MOI感染，并将感染后4天的调制培养基用于mGM-CSF的ELISA。如图23中所示，Ad-Δ350-mGM-CSF在该小鼠癌细胞系中诱导mGM-CSF的表达。

合在一起，这些结果显示Ad5中包含E1a TATA盒和CAAT盒的200个核苷酸的区域为非癌性细胞中来自于E1b-19k表达位点的治疗性转基因表达所需，尽管该区域对于肿瘤细胞中来自于E1b-19k表达位点的治疗性转基因表达来说是可有可无的。

实施例5：Ad-Δ350的抗癌活性

本实施例描述了如实施例1中所述生产的具有TATA盒和/或CAAT盒缺失的重组腺病毒的抗癌活性。

将小鼠(129S4株)用ADS-12细胞(小鼠肺癌)皮下注射并允许形成肿瘤。在肿瘤达到大约50-100mm³的体积后，将所述小鼠随机分组，用Ad-Δ350-Δ19k、Ad-TAV-Δ19k(作为有效的溶瘤病毒的阳性对照)或缓冲液(作为阳性对照)治疗。小鼠每4天通过所指示的治疗的肿瘤内注射进行施用，共三剂。如图24中所示，用缓冲液治疗的小鼠具有快速的肿瘤生长，而用Ad-Δ350-Δ19k或Ad-TAV-Δ19k治疗的小鼠的肿瘤大小减小，并且在许多病例中没有可检测的剩余肿瘤。

这个结果表明，带有移除了病毒E1a基因的启动子的CAAT盒和TATA盒两者的缺失的Ad-Δ350-Δ19k，是有效的癌症治疗。

实施例6：Ad35中的TATA盒缺失

本实施例描述了在E1a启动子区中具有包括TATA盒的缺失的重组35型(Ad35)腺病毒的生产。

35型腺病毒(Ad35)的E1a启动子在对应于SEQ ID NO：24的477至484位核苷酸的核苷酸处含有TATA盒。产生了具有TATA盒缺失的重组Ad35腺病毒，所述缺失通过将天然序列

TTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCTAGGGTATTTATACCTCAGGGTTTGTGTCAAGAGGCCACTCTT(SEQ ID NO：18；TATA盒被下划线)

转变成下述序列来产生：

TTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCTAGGGCCTCAGGGTTTGTGTCAAGAGGCCACTCTT(SEQ IDNO：19)。

将HEK-293细胞用TATA缺失的Ad35病毒的基因组转染，并且如图25中所示，发生了指示病毒生长的细胞病理效应。这些结果表明，产生了具有TATA盒缺失的重组Ad35腺病毒，其可以适合地用作溶瘤病毒。

通过参考并入

本文中提到的每个专利文献和科学论文的整个公开内容为所有目的通过参考并入本文。

等同性

本发明可以以其他特定形式体现而不背离其精神或本质特征。因此，前述实施方式应该在所有情况下被认为是说明性的而不是限制本文描述的发明。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是上面的描述指明，并且打算将进入权利要求书的意义和等同性范围之内的所有变化涵盖在其中。

Claims (37)

1.一种重组腺病毒，其包含与基因可操作地连接的修饰的基于TATA盒和/或CAAT盒的启动子，其中所述修饰的基于TATA盒和/或CAAT盒的启动子缺少功能性TATA盒和/或CAAT盒并允许所述基因在癌细胞中选择性表达，其中所述修饰的基于TATA盒和/或CAAT盒的启动子是E1a启动子，其中包含在所述修饰的基于TATA盒和/或CAAT盒的启动子中的修饰不包含单独的功能性启动子序列的添加或替换，并且还包含编码治疗性转基因的核苷酸序列，其中所述重组腺病毒选择性地在癌细胞中复制，并且其中所述修饰如下任一所示：

（i）对应于如SEQ ID NO：8所示的Ad5基因组的353至552位核苷酸的200个核苷酸的缺失；

（ii）对应于如SEQ ID NO：8所示的Ad5基因组的468至475位核苷酸的8个核苷酸的缺失；

（iii）对应于如SEQ ID NO：8所示的Ad5基因组的423至431位核苷酸的9个核苷酸的缺失；

（iv）对应于如SEQ ID NO：8所示的Ad5基因组的423至431位核苷酸的9个核苷酸的缺失以及468至475位核苷酸的8个核苷酸的缺失；

（v）对应于如SEQ ID NO：8所示的Ad5基因组的423至431位核苷酸的9个核苷酸的缺失以及472至475位核苷酸的4个核苷酸的缺失；以及

（vi）对应于如SEQ ID NO：24所示的Ad35基因组的477至487位核苷酸的缺失。

2.如权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒选自5型腺病毒和35型腺病毒。

3.如权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述腺病毒是5型腺病毒。

4.如权利要求3所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒选择性地在癌细胞中表达E1a和/或E1b。

5.如权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述修饰包含整个TATA盒的缺失。

6.如权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述修饰包含整个CAAT盒的缺失。

7.如权利要求1-6中任一项所述的重组腺病毒，其中所述治疗性转基因编码治疗性多肽，所述治疗性多肽选自癌蛋白、肿瘤抑制多肽、酶、细胞因子、免疫调节多肽、抗体、裂解肽、疫苗抗原、补充体细胞中的遗传缺陷的多肽和催化导致细胞死亡的过程的多肽。

8.如权利要求1-6中任一项所述的重组腺病毒，其中所述治疗性转基因编码治疗性多肽，所述治疗性多肽选自凋亡剂、抗体、CTL应答肽、细胞因子、细胞裂解剂、细胞毒性剂、酶、在肿瘤细胞表面表达以引发免疫应答的异源抗原、免疫刺激或免疫调节剂、裂解肽、癌蛋白、催化导致细胞死亡的过程的多肽、补充体细胞中的遗传缺陷的多肽、肿瘤抑制蛋白、疫苗抗原及其任何组合。

9.如权利要求1-6中任一项所述的重组腺病毒，其中所述治疗性转基因编码治疗性多肽，所述治疗性多肽是干扰素。

10. 如权利要求1-6中任一项所述的重组腺病毒，其中所述治疗性转基因编码治疗性多肽，所述治疗性多肽选自抗PD-1抗体重链或轻链、抗PD-L1抗体重链或轻链、BORIS/CTCFL、CD19、CD20、CD80、CD86、CD137L、CD154、DKK1/Wnt、ICAM-1、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-17、IL-23、IL-23A/p19、干扰素-γ、TGF-β、TGF-β trap、FGF、IL-24、IL-27、IL-35、MAGE、NY-ESO-1、p53和胸苷激酶。

11. 如权利要求1-6中任一项所述的重组腺病毒，其中所述治疗性转基因编码TGF-βtrap。

12.如权利要求1-6中任一项所述的重组腺病毒，其中所述治疗性转基因编码选自反义RNA和核酶的治疗性核酸。

13.如权利要求1-6中任一项所述的重组腺病毒，其中所述腺病毒包含E1b-19K和E1b-55K起始位点，并且其中编码所述治疗性转基因的核苷酸序列被插入到所述E1b-19K的起始位点与E1b-55K的起始位点之间。

14.如权利要求1-6中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒选择性地在癌细胞中具有细胞裂解活性。

15.如权利要求1-6中任一项所述的重组腺病毒，其中所述重组腺病毒选择性地在癌细胞中表达所述治疗性转基因。

16.如权利要求15所述的重组腺病毒，其中所述癌细胞选自膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、胃肠癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、头颈癌、血液癌症、肾癌、肺癌、间皮瘤、神经内分泌癌症、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌和睾丸癌细胞。

17.如权利要求15所述的重组腺病毒，其中所述癌细胞是甲状腺癌细胞。

18.如权利要求15所述的重组腺病毒，其中所述癌细胞是人类儿童的癌细胞。

19.如权利要求15所述的重组腺病毒，其中所述癌细胞是上皮癌细胞。

20.如权利要求15所述的重组腺病毒，其中所述癌细胞选自胃癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞和胰腺癌细胞。

21.一种药物组合物，其包含权利要求1-20中任一项所述的重组腺病毒和至少一种可药用载体或稀释剂。

22.一种非诊断治疗目的的在靶细胞中表达治疗性转基因的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的权利要求1-20中任一项所述的重组腺病毒，以表达所述治疗性转基因。

23.一种非诊断治疗目的的抑制肿瘤细胞的增殖的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的权利要求1-20中任一项所述的重组腺病毒，以抑制所述肿瘤细胞的增殖。

24.权利要求1-20中任一项所述的重组腺病毒在制备用于在需要的受试者中抑制肿瘤生长的药物中的用途，其中包括向所述受试者施用有效量的所述重组腺病毒，以抑制所述肿瘤的增殖。

25.权利要求1-20中任一项所述的重组腺病毒在制备用于在需要的受试者中治疗癌症的药物中的用途，其中包括向所述受试者施用有效量的所述重组腺病毒，以在所述受试者中治疗所述癌症。

26.如权利要求25所述的用途，其中所述癌症选自头颈癌、乳腺癌、间皮瘤、肾细胞癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、脑癌、神经内分泌癌症和肉瘤。

27.如权利要求25所述的用途，其中所述癌症选自膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、胃肠癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、头颈癌、血液癌症、肾癌、肺癌、间皮瘤、神经内分泌癌症、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌和睾丸癌。

28.如权利要求25所述的用途，其中所述癌症是甲状腺癌。

29.如权利要求25所述的用途，其中所述受试者是人类儿童。

30.如权利要求25所述的用途，其中所述癌症是上皮癌。

31.如权利要求25所述的用途，其中所述重组腺病毒与选自手术、放射、化疗、免疫疗法、激素疗法和病毒疗法的一种或多种疗法联合施用。

32.如权利要求25所述的用途，其中所述重组腺病毒的有效量是10²-10¹⁵噬斑形成单位（pfu）。

33.如权利要求25所述的用途，其中所述受试者是人类。

34.如权利要求25所述的用途，其中进一步还包括在所述受试者中测量对抗原的免疫应答。

35.如权利要求34所述的用途，其中通过在受试者皮肤上的注射部位注射抗原并测量注射部位的硬结大小来测量对抗原的免疫应答。

36.如权利要求25所述的用途，其中所述重组腺病毒的有效量通过在所述受试者中测量对抗原的免疫应答来鉴定。

37.一种工程化改造溶瘤腺病毒的方法，所述方法包括修饰与基因可操作地连接的基于病毒TATA盒和/或CAAT盒的启动子，使得修饰的基于TATA盒和/或CAAT盒的启动子缺少功能性TATA盒和/或CAAT盒并允许所述基因在癌细胞中选择性表达，其中包含在所述修饰的基于TATA盒和/或CAAT盒的启动子中的修饰不包含单独的功能性启动子序列的添加或替换，其中所述修饰如下任一所示：

（i）对应于如SEQ ID NO：8所示的Ad5基因组的353至552位核苷酸的200个核苷酸的缺失；

（ii）对应于如SEQ ID NO：8所示的Ad5基因组的468至475位核苷酸的8个核苷酸的缺失；

（iii）对应于如SEQ ID NO：8所示的Ad5基因组的423至431位核苷酸的9个核苷酸的缺失；

（iv）对应于如SEQ ID NO：8所示的Ad5基因组的423至431位核苷酸的9个核苷酸的缺失以及468至475位核苷酸的8个核苷酸的缺失；

（v）对应于如SEQ ID NO：8所示的Ad5基因组的423至431位核苷酸的9个核苷酸的缺失以及472至475位核苷酸的4个核苷酸的缺失；以及

（vi）对应于如SEQ ID NO：24所示的Ad35基因组的477至487位核苷酸的缺失。