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KR20190128633A - 종양 선택적 tata-박스 및 caat-박스 돌연변이체 - Google Patents

종양 선택적 tata-박스 및 caat-박스 돌연변이체 Download PDF

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KR20190128633A
KR20190128633A KR1020197025497A KR20197025497A KR20190128633A KR 20190128633 A KR20190128633 A KR 20190128633A KR 1020197025497 A KR1020197025497 A KR 1020197025497A KR 20197025497 A KR20197025497 A KR 20197025497A KR 20190128633 A KR20190128633 A KR 20190128633A
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South Korea
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cancer
virus
recombinant virus
cells
seq
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토니 알. 레이드
브라이언 티. 오론스키
파라 헤드란
크리스토퍼 라슨
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에피센트알엑스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 예를 들어 유전자에 작동가능하게 연결된 (i) 변형된 TATA 박스-기반 프로모터 및/또는 (ii) 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터를 포함하며, 여기서 변형된 TATA 박스-기반 프로모터 및/또는 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 기능적 TATA 박스 및/또는 CAAT 박스를 결여하고 과다증식성 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하는 것인 재조합 바이러스를 제공한다. 상기 재조합 바이러스를 이용하여 특정한 형태의 암을 비롯한 세포 증식성 질환 및 장애를 치료할 수 있다.

Description

종양 선택적 TATA-박스 및 CAAT-박스 돌연변이체
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 1월 30에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/452,075를 우선권으로 주장하며, 그의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명의 분야는 분자 생물학 및 바이러스학, 구체적으로 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포를 우세하게 감염시키는 변형된 바이러스이다.
암을 유발하는 근본적인 분자 메카니즘에 대한 폭넓은 지식에도 불구하고, 대부분의 진행된 암은 현재의 화학요법 및 방사선 프로토콜로 치유할 수 없다. 종양용해성 바이러스는 다양한 악성 종양에 대한 현재의 표준 치료를 상당히 증강시키는 가능성을 갖는 플랫폼 기술로서 부상하였다 (Kumar, S. et al. (2008) Current Opinion In Molecular Therapeutics 10(4):371-379; Kim, D. (2001) Expert Opinion On Biological Therapy 1(3):525-538; Kim D. (2000) ONCOGENE 19(56):6660-6669). 이들 바이러스는 감염-복제-용해 연쇄 반응을 통해 악성 세포를 직접적으로 파괴할 뿐만 아니라, 항종양 면역을 간접적으로 유도하는 종양용해제로서의 가능성을 보여주었다. 이들 면역 조절 성질은 바이러스가 복제할 때마다 카피되고 발현되는 치료적 트랜스진의 삽입에 의해 증강되었다.
이전에 개발된 종양용해성 바이러스는 정상 세포에서는 전사적으로 약화되지만 암 세포에서는 전사적으로 활성인 TAV-255로 지칭되는 종양용해성 혈청형 5 아데노바이러스 (Ad5)를 포함한다 (PCT 공개 번호 WO2010/101921 참조). TAV-255 벡터가 이러한 종양 선택성을 달성하는 메카니즘은, 특이적인 DNA 서열과의 결합을 통해 바이러스가 숙주 세포에 유입된 후에 전사되는 가장 초기의 유전자인 E1a의 아데노바이러스 발현을 조절하는 단백질인, 전사 인자 Pea3 및 E2F에 대한 3개의 전사 인자 (TF) 결합 부위의 표적화된 결실을 통한 것으로 믿어진다.
지금까지의 노력에도 불구하고, 인간 환자에서 암 및 과다증식성 장애를 치료하기 위한, 특히 종양-선택적 복제, 바이러스 매개된 용해 및/또는 치료적 트랜스진 발현을 나타내는 개선된 종양용해성 바이러스가 요구된다.
본 발명은, 부분적으로, 특정한 바이러스 프로모터의 경우에 정상의 건강한 세포에서는 전사를 유도하는데 필요한 TATA 및/또는 CAAT 박스가 암성 세포에서는 능동적인 전사에 불필요하다는 발견에 기초한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 (i) 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 TATA 박스-기반 프로모터로서, 기능적 TATA 박스를 결여하고 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하는 변형된 TATA 박스-기반 프로모터; 및/또는 (ii) 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터로서, 기능적 CAAT 박스를 결여하고 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하는 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 TATA 박스-기반 프로모터로서, 기능적 TATA 박스를 결여하고 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하는 변형된 TATA 박스-기반 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터로서, 기능적 CAAT 박스를 결여하고 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하는 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다.
임의의 상기 재조합 바이러스의 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 재조합 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 단순 포진 바이러스 1 (HSV1), 점액종 바이러스, 레오바이러스, 폴리오바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 홍역 바이러스 (MV), 및 뉴캐슬병 질환 바이러스 (NDV)로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 아데노바이러스, 예를 들어 유형 5 아데노바이러스 (Ad5) 또는 유형 35 아데노바이러스 (Ad35), 예를 들어 유형 5 아데노바이러스이다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터 및/또는 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 초기 유전자 프로모터, 예를 들어 E1a 프로모터, E1b 프로모터 또는 E4 프로모터, 예를 들어 E1a 프로모터이다.
임의의 상기 재조합 바이러스의 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 전체 TATA 박스의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 각각 서열식별번호(SEQ ID NO): 2의 뉴클레오티드 471 내지 474, 467 내지 474, 454 내지 551, 및 352 내지 551에 및 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 472 내지 475, 468 내지 475, 455 내지 552, 및 353 내지 552에 상응하는, 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -27 내지 -24, -31 내지 -24, -44 내지 +54, 또는 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -29 내지 -26, -33 내지 -26, -44 내지 +52, 또는 -148 내지 +52에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 471 내지 475, 467 내지 475, 446 내지 551, 및 352 내지 551에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 바이러스로서, 여기서 바이러스는 유형 5 아데노바이러스이고, 바이러스는 각각 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 471 내지 474, 467 내지 474, 454 내지 551, 및 352 내지 551에 및 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 472 내지 475, 468 내지 475, 455 내지 552, 및 353 내지 552에 상응하는, 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -27 내지 -24, -31 내지 -24, -44 내지 +54, 또는 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 바이러스로서, 여기서 바이러스는 유형 5 아데노바이러스이고, 바이러스는 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -29 내지 -26, -33 내지 -26, -44 내지 +52, 또는 -148 내지 +52에 상응하는 뉴클레오티드의 결실 또는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 471 내지 475, 467 내지 475, 446 내지 551, 및 352 내지 551에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 바이러스로서, 여기서 바이러스는 유형 5 아데노바이러스이고, 바이러스는 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 7), AGTGCCCG (서열식별번호: 12) 또는 TATTCCCG (서열식별번호: 13)을 포함하는 재조합 유형 5 아데노바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실 (다르게는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹할 2개의 폴리뉴클레오티드 서열을 결합시킴으로써 생성됨)을 포함하는 것인 재조합 바이러스를 제공한다.
임의의 상기 재조합 바이러스의 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 전체 CAAT 박스의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 422 내지 430에 및 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 423 내지 431에 상응하는, 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -76 내지 -68에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 바이러스로서, 여기서 바이러스는 유형 5 아데노바이러스이고, 바이러스는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 422 내지 430에 및 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 423 내지 431에 상응하는, 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -76 내지 -68에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스를 제공한다.
임의의 상기 재조합 바이러스의 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 23의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 23과 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 바이러스로서, 여기서 바이러스는 유형 5 아데노바이러스이고, 바이러스는 서열 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 14)를 포함하는 재조합 유형 5 아데노바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실 (다르게는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹할 2개의 폴리뉴클레오티드 서열을 결합시킴으로써 생성됨)을 포함하는 것인 재조합 바이러스를 제공한다.
임의의 상기 재조합 바이러스의 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 Ad35 게놈의 477 내지 484에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 임의의 상기 재조합 바이러스는 치료적 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 치료적 트랜스진은 치료적 폴리펩티드, 예를 들어 아폽토시스제, 항체, CTL 반응성 펩티드, 시토카인, 세포용해제, 세포독성제, 효소, 종양 세포의 표면 상에서 발현되어 면역 반응을 도출하는 이종성 항원, 면역자극 또는 면역조정 작용제, 인터페론, 용해성 펩티드, 종양단백질, 세포 사멸을 유도하는 과정을 촉매하는 폴리펩티드, 체세포에서의 유전자 결함을 보완하는 폴리펩티드, 종양 억제 단백질, 백신 항원, 및 이들의 임의의 조합물을 코딩할 수 있다. 치료적 트랜스진은 치료적 핵산, 예를 들어 안티센스 RNA 또는 리보자임을 코딩할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료적 트랜스진은 아세틸콜린, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄, BORIS/CTCFL, CD19, CD20, CD80, CD86, CD137L, CD154, DKK1/Wnt, ICAM-1, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-17, IL-23, IL-23A/p19, 인터페론-감마, TGF-β, TGF-β 트랩, FGF, IL-24, IL-27, IL-35, MAGE, NY-ESO-1, p53, 및 티미딘 키나제로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 치료적 트랜스진은 TGF-β 트랩이다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 E1b-19K 및 E1b-55K 시작 부위를 포함하고, 치료적 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 E1b-19K의 시작 부위와 E1b-55K의 시작 부위 사이에 삽입된다.
특정 실시양태에서, 임의의 상기 재조합 바이러스는 적어도 하나의 Pea3 결합 부위 또는 그의 기능적 부분의 결실을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 임의의 상기 재조합 바이러스는 과다증식성 세포 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 선택적으로 복제할 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 상기 재조합 바이러스는 과다증식성 세포 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 E1a, E1b, 및/또는 치료적 트랜스진을 선택적으로 발현할 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 상기 재조합 바이러스는 과다증식성 세포 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 세포용해 활성을 선택적으로 가질 수 있다.
과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포는 암 세포, 내피 세포, 표피 세포, 섬유모세포, 및/또는 면역 세포일 수 있다. 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포는 암 세포, 예를 들어 항문암, 기저 세포 암종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 암종, 담관암종, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 위식도암, 위장 (GI) 암, 위장관 간질 종양, 간세포성 암종, 부인과암, 두경부암, 혈액암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 신경내분비암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 소아암, 전립선암, 신세포 암종, 육종, 피부암, 소세포 폐암, 피부의 편평 상피 암종, 위암, 고환암 또는 갑상선암 세포일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 바이러스로서, 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 바이러스의 선택적 발현을 허용하는 임의의 변형된 또는 결실된 바이러스 조절 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 재조합 바이러스 중 어느 하나 또는 이들의 조합물, 및 적어도 1종의 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 과다증식성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 재조합 바이러스의 유효량을 투여하여 대상체에서 과다증식성 질환을 치료하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 과다증식성 질환은 암, 아테롬성동맥경화증, 류마티스 관절염, 건선, 루푸스, 특발성 폐 섬유증, 경피증 폐 고혈압, 천식, 신장 섬유증, COPD, 낭성 섬유증, DIP, UIP, 황반 변성, 재협착, 망막병증, 과다증식성 섬유모세포 장애, 경피증, 사구체 신염, 당뇨병성 신병증, 악성 신경화증, 혈전성 미세혈관병증 증후군, 이식 거부, 사구체병증 및 간경변증으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 과다증식성 질환은 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 항문암, 기저 세포 암종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 암종, 담관암종, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 위식도암, 위장 (GI) 암, 위장관 간질 종양, 간세포성 암종, 부인과암, 두경부암, 혈액암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 신경내분비암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 소아암, 전립선암, 신세포 암종, 육종, 피부암, 소세포 폐암, 피부의 편평 상피 암종, 위암, 고환암 및 갑상선암으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 재조합 바이러스의 유효량을 투여하여 종양 세포의 증식을 억제하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포를 본원에 기재된 재조합 바이러스의 유효량에 노출시켜 종양 세포의 증식을 억제하는 것을 포함한다.
상기 각각의 방법에서, 재조합 바이러스를 예를 들어 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 및 바이러스요법으로부터 선택된 하나 이상의 요법과 조합하여 투여할 수 있다. 상기 각각의 방법에서, 재조합 바이러스의 유효량은 예를 들어 102-1015 플라크 형성 단위 (pfu)를 포함할 수 있다. 상기 각각의 방법에서, 대상체는 예를 들어 인간, 예를 들어 소아 인간, 또는 동물일 수 있다.
상기 각각의 방법에서, 재조합 바이러스의 유효량은 예를 들어 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 측정함으로써 확인될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원에 대한 면역 반응은 대상체의 피부 상의 주사 부위에서 대상체에게 항원을 주사하고, 주사 부위에서 경화의 크기를 측정함으로써 측정된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표적 세포에서 치료적 트랜스진을 발현하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 세포를 본원에 기재된 재조합 바이러스의 유효량에 노출시켜 표적 트랜스진을 발현하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양용해성 바이러스를 조작하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유전자에 작동가능하게 연결된 바이러스 TATA 박스-기반 프로모터를 변형시켜, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터가 기능적 TATA 박스를 결여하고 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하도록 하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양용해성 바이러스를 조작하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유전자에 작동가능하게 연결된 바이러스 CAAT 박스-기반 프로모터를 변형시켜, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터가 기능적 CAAT 박스를 결여하고 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하도록 하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양용해성 바이러스를 조작하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유전자에 작동가능하게 연결된 바이러스 TATA 박스-기반 프로모터를 변형시켜, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터가 기능적 TATA 박스를 결여하고 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하도록 하는 것, 및/또는 유전자에 작동가능하게 연결된 바이러스 CAAT 박스-기반 프로모터를 변형시켜, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터가 기능적 CAAT 박스를 결여하고 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하도록 하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 23의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 23과 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 특정 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명은 상기 핵산 중 하나 이상을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 숙주 세포가 재조합 바이러스를 생산하는 조건 하에 상기 숙주 세포 중 하나 이상을 성장시키고; (b) 재조합 바이러스를 정제하는 것을 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 측면 및 이점은 하기 도면, 상세한 설명 및 청구범위에 의해 예시된다.
본 발명은 하기 도면을 참조하여 더욱 완벽하게 이해될 수 있다.
도 1a는 E1a 유전자의 시작 코돈까지의 Ad-Δ350 (TATA 박스 및 CAAT 박스 둘 다의 결실을 포함함)의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열을 도시한다. 야생형 아데노바이러스 서열로부터 200개 뉴클레오티드 결실의 부위는 하이픈으로 나타내었다. 도 1b는 E1a 유전자의 시작 코돈까지 Ad-TATA의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열을 도시한다. 야생형 아데노바이러스 서열로부터 8개 뉴클레오티드 결실의 부위는 하이픈으로 나타내었다. 도 1c는 E1a 유전자의 시작 코돈까지 Ad-CAAT의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열을 도시한다. 야생형 아데노바이러스 서열로부터 9개 뉴클레오티드 결실의 부위는 하이픈으로 나타내었다. 도 1d는 E1a 유전자의 시작 코돈까지 Ad-CAAT-TATA의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열을 도시한다. 야생형 아데노바이러스 서열로부터 9개 뉴클레오티드 및 8개 뉴클레오티드 결실의 부위는 하이픈으로 나타내었다. 도 1e는 E1a 유전자의 시작 코돈까지 Ad-CAAT-mTATA의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열을 도시한다. 야생형 아데노바이러스 서열로부터 9개 뉴클레오티드 및 4개 뉴클레오티드 결실의 부위는 하이픈으로 나타내었다. 도 1f는 E1a 유전자의 시작 코돈까지 야생형 Ad5의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열을 도시한다. CAAT 박스 (GGTCAAAGT) 및 TATA 박스 (TATTTATA)는 박스로 나타내었다.
도 2a는 Ad-Δ350 또는 Ad-TAV-255로 감염된 후 지정된 시간에서 암성 Panc-1 세포에서 E1a 발현 수준을 제시하는 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 2b는 Ad-Δ350 또는 Ad-TAV-255로 감염된 후 지정된 시간에서 비-암성 WI-38 세포에서 E1a 발현 수준을 제시하는 웨스턴 블롯을 도시한다. L은 래더(ladder)를 나타내고, CN은 비-감염된 대조군을 나타낸다.
도 3a는 3 또는 5의 감염 다중도 (MOI)에서 Ad-Δ350 또는 Ad-TAV-255로 감염된지 72시간 후의 암성 Panc-1 세포에서의 E1a 발현 수준을 제시하는 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 3b는 3 또는 5의 감염 다중도 (MOI)에서 Ad-Δ350 또는 Ad-TAV-255로 감염된지 72시간 후의 암성 A549 세포에서의 E1a 발현 수준을 제시하는 웨스턴 블롯을 도시한다. L은 래더를 나타내고, CN은 비-감염된 대조군을 나타낸다.
도 4a는 지정된 MOI에서 Ad-Δ350으로 감염된 후 지정된 시점에서 암성 HCT116 세포, Panc-1 세포 및 A549 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 도 4b는 지정된 MOI에서 Ad-Δ350 또는 Ad-TAV-255로 감염된지 10일 후의 비-암성 MRC5 세포 및 WI38 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다. CN은 비-감염된 대조군을 나타낸다.
도 5는 비-감염된 대조군으로서 및 5 MOI에서 Ad-CAAT 또는 Ad-CAAT-mTATA로 감염된지 3일 후의 암성 A549, Panc1, HCT116 및 Hep3b 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다.
도 6은 비-감염된 대조군으로서 및 5 MOI에서 Ad-TATA, Ad-CAAT, Ad-CAAT-TATA, Ad-Δ350 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 3일 후의 암성 ADS-12, ASPC1, HT-29 및 Hep3b 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다.
도 7은 비-감염된 대조군으로서 및 5 MOI에서 Ad-TATA, Ad-CAAT, Ad-CAAT-TATA, Ad-Δ350 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 4일 후의 암성 ADS-12, ASPC1, HT-29 및 Hep3b 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다.
도 8은 비-감염된 대조군으로서 및 5 MOI에서 Ad-TATA, Ad-CAAT, Ad-CAAT-TATA, Ad-Δ350 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 3일 후의 암성 Panc1, A549, MeWo 및 HCT-116 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다.
도 9는 비-감염된 대조군으로서 및 5 MOI에서 Ad-TATA, Ad-CAAT, Ad-CAAT-TATA, Ad-Δ350 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 4일 후의 암성 Panc1, A549, MeWo 및 HCT-116 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다.
도 10은 비-감염된 대조군으로서 및 5 MOI에서 Ad-TATA, Ad-CAAT, Ad-CAAT-TATA, Ad-Δ350 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 5일 후의 암성 A549, HCT116, Hep3b 및 Panc1 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다.
도 11은 비-감염된 대조군으로서 및 5 MOI에서 Ad-TATA, Ad-CAAT, Ad-CAAT-TATA, Ad-Δ350 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 5일 후의 암성 MeWo, HT29, ADS12 및 ASPC 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다.
도 12는 비-감염된 대조군으로서 및 지정된 MOI에서 Ad-TATA, Ad-CAAT, Ad-CAAT-TATA, Ad-Δ350 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 4일 후의 비-암성 WI38 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다.
도 13은 비-감염된 대조군으로서 및 지정된 MOI에서 Ad-TATA, Ad-CAAT, Ad-CAAT-TATA, Ad-Δ350 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 6일 후의 비-암성 WI38 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다.
도 14는 지정된 MOI에서 Ad-Δ350-Δ19k로 감염된지 5일 후의 암성 Panc-1 세포, A549 세포 및 ADS12 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다. CN은 비-감염된 대조군을 나타낸다.
도 15는 지정된 MOI에서 Ad-Δ350-GM-CSF로 감염된지 5일 후의 암성 Panc-1 세포, A549 세포 및 ADS12 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다. CN은 비-감염된 대조군을 나타낸다.
도 16은 5 MOI에서 Ad-Δ350-Δ19k, Ad-Δ350-mGM-CSF 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 3일 후의 암성 A549 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다. CN은 비-감염된 대조군을 나타낸다.
도 17은 5 MOI에서 Ad-Δ350-Δ19k, Ad-Δ350-mGM-CSF 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 5일 후의 암성 A549 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다. CN은 비-감염된 대조군을 나타낸다.
도 18은 5 MOI에서 Ad-Δ350-Δ19k, Ad-Δ350-mGM-CSF 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 3일 후의 암성 HCT116 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다. CN은 비-감염된 대조군을 나타낸다.
도 19는 5 MOI에서 Ad-Δ350-Δ19k, Ad-Δ350-mGM-CSF 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 5일 후의 암성 HCT116 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다. CN은 비-감염된 대조군을 나타낸다.
도 20은 5 MOI에서 Ad-Δ350-Δ19k, Ad-Δ350-mGM-CSF 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 3일 후의 암성 Hep3b 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다. CN은 비-감염된 대조군을 나타낸다.
도 21은 5 MOI에서 Ad-Δ350-Δ19k, Ad-Δ350-mGM-CSF 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염된지 5일 후의 암성 MeWo 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 청색으로 염색한다. CN은 비-감염된 대조군을 나타낸다.
도 22는 10 MOI에서 A549 세포를 Ad-Δ350-Δ19k 또는 Ad-Δ350-mGM-CSF로 감염시킨 후 ELISA에 의해 검정되는, mGM-CSF 발현을 제시하는 막대 그래프를 도시한다.
도 23은 지정된 MOI에서 ADS12 세포를 Ad-Δ350-Δ19k 또는 Ad-Δ350-mGM-CSF로 감염시킨 후 ELISA에 의해 검정되는, mGM-CSF 발현을 제시하는 막대 그래프를 도시한다.
도 24는 완충제, Ad-Δ350-Δ19k (350-19k로 표시됨) 또는 Ad-TAV-Δ19k (TAV-19k로 표시됨)의 3회 종양내 주사로 치료된, 피하 ADS-12 종양을 보유한 마우스의 종양 부피를 도시한다. 도면에서 각각의 선은 개별 마우스의 종양 부피를 나타낸다.
도 25는 E1A 프로모터에서 TATA 박스의 결실을 포함하는 인간 아데노바이러스 유형 35 게놈으로 형질감염된 HEK-293 세포로부터 발생한 바이러스 세포변성 효과를 도시하는 영상이다.
전사는 프로모터로 불리는 짧은 DNA 서열 상에서 RNA 폴리머라제 II (RNA pol II)의 정확한 위치 설정을 필요로 한다. 흔히 프로모터 서열은 전사 시작 부위의 대략 30개 염기쌍 상류에 위치하는, 종종 G/C-풍부 서열에 의해 플랭킹된, TATA 박스로 불리는 고도로 보존된 A/T-풍부 서열을 포함한다. 확인가능한 TATA 박스가 결여된 유전자는 전형적으로 하우스키핑 유전자이고, 전사를 위해 전사 인자 Sp1에 의존하는 반면에, TATA 박스를 함유하는 유전자는 전형적으로 생물학적 반응 경로에 반응하는 고도로 조절된 유전자이다. TATA 박스는 전사 인자 IIB (TFIIB) 및 TATA 결합 단백질 (TBP)에 의해 인식되며, 이들은 RNA pol II의 동원을 위해 필요하다. 전사에서 TATA 박스의 중요한 역할은, 아데노바이러스 E1a 유전자의 프로모터에서 TATA 박스의 돌연변이 또는 제거, 예를 들어 TATA 박스의 제거 후에 손상된 또는 불활성화된 전사의 실험 관찰에 의해 뒷받침된다 (Wu et al. (1987) Nature 326(6112):512-5).
여러 프로모터에 존재하는 추가적인 서열은 CAAT 박스이다. CAAT 박스는 전형적으로 유전자의 전사 시작 부위의 대략 60-100개 염기 상류에 위치하고, 컨센서스 서열 GG(T/C)CAATCT를 갖는다. CAAT 박스는 코어 결합 인자 (핵 인자 Y 또는 NF-Y로도 지칭됨) 및 CCAAT/인핸서 결합 단백질 (C/EBP)에 의해 인식된다.
본 발명은, 부분적으로, 특정한 바이러스 프로모터, 예를 들어 유형 5 아데노바이러스 (Ad5) E1a 프로모터의 경우에 정상의 건강한 세포에서는 전사를 유도하는데 필요한 TATA 및/또는 CAAT 박스가 암성 세포에서는 능동적인 전사에 불필요하다는 발견에 기초한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 (i) 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 TATA 박스-기반 프로모터로서, 기능적 TATA 박스를 결여하고 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하는 변형된 TATA 박스-기반 프로모터; 및/또는 (ii) 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터로서, 기능적 CAAT 박스를 결여하고 과다증식성 세포 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하는 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다. TATA 박스-기반 프로모터 및 CAAT 박스-기반 프로모터는 동일한 프로모터일 수 있거나 (예를 들어, Ad5 E1a 프로모터) 또는 상이한 프로모터일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 TATA 박스-기반 프로모터로서, 기능적 TATA 박스를 결여하고 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하는 변형된 TATA 박스-기반 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터로서, 기능적 CAAT 박스를 결여하고 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하는 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 바이러스로서, 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 바이러스의 선택적 발현을 허용하는 임의의 변형된 또는 결실된 바이러스 조절 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다. TATA 및 CAAT 박스 외에도 예시적인 바이러스 조절 서열에는 TATA 박스의 하류에 있는 Ad5 E1a 개시제 서열 및 Ad5 E1a 프로모터 요소가 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "TATA 박스"는 TATA 결합 단백질 (TBP)에 결합할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. TATA 박스는 전형적으로 TATAAA의 코어 서열 (서열식별번호: 1)을 함유하는 A/T-풍부 8-뉴클레오티드 세그먼트를 포함하고, 상기 8-뉴클레오티드 세그먼트는 G/C-풍부 서열에 의해 플랭킹되지만, TATA 박스는 전형적인 TATA 서열과 거의 유사하지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 TATA 박스"는 야생형 TATA 박스 서열에 대해 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 TATA 박스를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "기능적 TATA 박스"는 TBP에 결합할 수 있는 TATA 박스, 예를 들어 상응하는 야생형 TATA 박스 서열의 TBP 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50% 또는 적어도 40%를 갖는 TATA 박스를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비-기능적 TATA 박스"는 예를 들어 상응하는 야생형 TATA 박스 서열의 TBP 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 0%를 갖는 TATA 박스를 지칭한다. TBP가 TATA 박스에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 결합 검정에는 전기영동 이동성 변화 검정, 염색질 면역침강 검정, 및 DNAse 풋프린팅 검정이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "TATA 박스-기반 프로모터"는 TATA 박스를 함유하는 임의의 유전자 프로모터를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 TATA 박스-기반 프로모터"는 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환 또는 부가에 의해 변형된 TATA 박스-기반 프로모터를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 TATA 박스-기반 프로모터 서열의 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 TATA 박스-기반 프로모터 서열의 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 TATA 박스-기반 프로모터 서열의 전체 TATA 박스의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 TATA 박스-기반 프로모터 서열의 전체 TATA 박스의 결실로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 전체 TATA 박스-기반 프로모터의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 전체 TATA 박스-기반 프로모터의 결실로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 별도의 기능적 프로모터 서열의 부가 또는 그로의 치환을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 TATA 박스-기반 프로모터 서열의 1 내지 300, 1 내지 200, 1 내지 100, 1 내지 75, 1 내지 50, 1 내지 25, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 4개 뉴클레오티드, 4 내지 300, 4 내지 200, 4 내지 150, 4 내지 100, 4 내지 75, 4 내지 50, 4 내지 25, 4 내지 10, 4 내지 8, 8 내지 300, 8 내지 200, 8 내지 150, 8 내지 100, 8 내지 75, 8 내지 50, 8 내지 25, 8 내지 10, 10 내지 300, 10 내지 200, 10 내지 150, 10 내지 100, 10 내지 75, 10 내지 50, 10 내지 25, 25 내지 300, 25 내지 200, 25 내지 150, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 300, 50 내지 200, 50 내지 150, 50 내지 100, 50 내지 75, 75 내지 300, 75 내지 200, 75 내지 150, 75 내지 100, 100 내지 300, 100 내지 200, 100 내지 150, 150 내지 300, 150 내지 200, 또는 200 내지 300개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 TATA 박스-기반 프로모터 서열의 약 10, 약 25, 약 50, 약 75, 약 100, 약 150, 약 200 또는 약 300개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 TATA 박스-기반 프로모터 서열의 약 200개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 TATA 박스-기반 프로모터 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 10개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 TATA 박스-기반 프로모터 서열의 4 또는 8개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "CAAT 박스"는 C/EBP 또는 NF-Y 단백질에 결합할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. CAAT 박스는 전형적으로 GG(T/C)CAATCT의 컨센서스 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 CAAT 박스"는 야생형 CAAT 박스 서열에 비해 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 CAAT 박스를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "기능적 CAAT 박스"는 C/EBP 또는 NF-Y 단백질에 결합할 수 있는 CAAT 박스, 예를 들어 상응하는 야생형 CAAT 박스 서열의 C/EBP 또는 NF-Y 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50% 또는 적어도 40%를 갖는 CAAT 박스를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비-기능적 CAAT 박스"는 예를 들어 상응하는 야생형 CAAT 박스 서열의 C/EBP 또는 NF-Y 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 0%를 갖는 CAAT 박스를 지칭한다. C/EBP 또는 NF-Y 단백질이 CAAT 박스에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 결합 검정에는 전기영동 이동성 변화 검정, 염색질 면역침강 검정, 및 DNAse 풋프린팅 검정이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "CAAT 박스-기반 프로모터"는 CAAT 박스를 함유하는 임의의 유전자 프로모터를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변형된 CAAT 박스-기반 프로모터"는 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환 또는 부가에 의해 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터 서열의 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터 서열의 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터 서열의 전체 CAAT 박스의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터 서열의 전체 CAAT 박스의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 전체 CAAT 박스-기반 프로모터의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 전체 CAAT 박스-기반 프로모터의 결실로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 별도의 기능적 프로모터 서열의 부가 또는 그로의 치환을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터 서열의 1 내지 300, 1 내지 200, 1 내지 100, 1 내지 75, 1 내지 50, 1 내지 25, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 4개 뉴클레오티드, 4 내지 300, 4 내지 200, 4 내지 150, 4 내지 100, 4 내지 75, 4 내지 50, 4 내지 25, 4 내지 10, 4 내지 8, 8 내지 300, 8 내지 200, 8 내지 150, 8 내지 100, 8 내지 75, 8 내지 50, 8 내지 25, 8 내지 10, 10 내지 300, 10 내지 200, 10 내지 150, 10 내지 100, 10 내지 75, 10 내지 50, 10 내지 25, 25 내지 300, 25 내지 200, 25 내지 150, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 300, 50 내지 200, 50 내지 150, 50 내지 100, 50 내지 75, 75 내지 300, 75 내지 200, 75 내지 150, 75 내지 100, 100 내지 300, 100 내지 200, 100 내지 150, 150 내지 300, 150 내지 200, 또는 200 내지 300개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터 서열의 약 10, 약 25, 약 50, 약 75, 약 100, 약 150, 약 200 또는 약 300개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터 서열의 약 200개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 10개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터 서열의 9개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 기능적으로 관계가 있는 폴리뉴클레오티드 요소의 연결을 지칭한다. 핵산 서열은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 있을 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 유전자의 전사에 영향을 미치는 경우에 상기 유전자에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 연속적이다. 그러나, 일반적으로 인핸서는 프로모터로부터 몇몇 킬로염기만큼 분리되어 있을 때 기능하고, 인트론 서열은 다양한 길이를 가질 수 있기 때문에, 일부 폴리뉴클레오티드 요소는 작동가능하게 연결되지만 직접적으로 플랭킹되지는 않을 수 있고, 심지어 상이한 대립 유전자 또는 염색체와는 트랜스로 기능할 수 있다. 특정 실시양태에서, 유전자 (코딩 영역)는 변형된 TATA 박스- 및/또는 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
용어 "트랜스진"은, 외인성 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "치료적 트랜스진"은 바이러스 내에서 또는 그에 의해 복제 및/또는 발현될 때, 표적 세포, 체액, 조직, 기관, 생리적 시스템, 또는 대상체에 치료 효과를 부여하는 트랜스진을 지칭한다.
특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 비-과다증식성 및/또는 성장 정지된 세포에 비해 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포, 예를 들어 암 세포에서 변형된 TATA 박스- 및/또는 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 선택적 발현을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 비-과다증식성 및/또는 성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 발현은 과다증식성 세포 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 발현의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10% 또는 약 5%이다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 비-과다증식성 및/또는 성장 정지된 세포에서 상기 유전자의 검출가능한 발현을 나타내지 않는다. 특정 실시양태에서, 비-과다증식성 및/또는 성장 정지된 세포에서 재조합 바이러스에 의해 변형된 TATA 박스- 및/또는 CAAT 박스-기반 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현은 변형된 TATA 박스- 및/또는 CAAT 박스-기반 프로모터가 없는 상응하는 바이러스에 의한 상기 유전자의 발현의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10% 또는 약 5%이다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 초기 유전자, 예를 들어 아데노바이러스 E1a 또는 E1b의 선택적 발현을 나타낸다. 유전자 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법, 예를 들어 본원의 실시예 2에 기재된 바와 같은 웨스턴 블롯에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포, 예를 들어 암 세포에서 재조합 바이러스에 의해 변형된 TATA 박스- 및/또는 CAAT 박스-기반 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자, 예를 들어 초기 유전자의 선택적 발현은 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 바이러스의 선택적 복제를 일으킨다. 특정 실시양태에서, 비-과다증식성 및/또는 성장 정지된 세포에서 상기 바이러스의 복제는 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 상기 바이러스의 복제의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10% 또는 약 5%이다. 특정 실시양태에서, 비-과다증식성 및/또는 성장 정지된 세포에서 상기 바이러스의 복제는 변형된 TATA 박스- 및/또는 CAAT 박스-기반 프로모터가 없는 상응하는 바이러스의 복제의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10% 또는 약 5%이다. 바이러스 복제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해, 예를 들어 바이러스 단백질의 발현을 검정함으로써 (예를 들어 본원의 실시예 2에 기재된 것과 같은 웨스턴 블롯에 의해), 바이러스 매개된 용해를 검정함으로써 (예를 들어 본원의 실시예 3에 기재된 바와 같은 크리스탈 바이올렛 염색에 의해), 또는 정량적인 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포, 예를 들어 암 세포에서 재조합 바이러스에 의해 변형된 TATA 박스- 및/또는 CAAT 박스-기반 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자, 예를 들어 초기 유전자의 선택적 발현은 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포의 선택적 바이러스 매개된 용해 (즉, 세포용해 활성)를 일으킨다. 특정 실시양태에서, 비-과다증식성 및/또는 성장 정지된 세포의 바이러스 매개된 용해는 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포의 바이러스 매개된 용해의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10% 또는 약 5%이다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 비-과다증식성 및/또는 성장 정지된 세포의 검출가능한 바이러스 매개된 용해를 나타내지 않는다. 특정 실시양태에서, 비-과다증식성 및/또는 성장 정지된 세포의 바이러스 매개된 용해는 변형된 TATA 박스- 및/또는 CAAT 박스-기반 프로모터가 없는 상응하는 바이러스에 의한 세포의 바이러스 매개된 용해의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10% 또는 약 5%이다. 바이러스 매개된 용해는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법, 예를 들어 본원의 실시예 3에 기재된 바와 같은 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 측정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포, 예를 들어 암 세포에서 재조합 바이러스에 의해 변형된 TATA 박스- 및/또는 CAAT 박스-기반 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자, 예를 들어 초기 유전자의 선택적 발현은 재조합 바이러스에 의한 치료적 트랜스진의 선택적 발현을 일으킨다. 특정 실시양태에서, 비-과다증식성 및/또는 성장 정지된 세포에서 치료적 트랜스진의 발현은 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 치료적 트랜스진의 발현의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10% 또는 약 5%이다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 비-과다증식성 및/또는 성장 정지된 세포에서 치료적 트랜스진의 검출가능한 발현을 나타내지 않는다. 특정 실시양태에서, 비-과다증식성 및/또는 성장 정지된 세포에서 치료적 트랜스진의 발현은 변형된 TATA 박스- 및/또는 CAAT 박스-기반 프로모터가 없는 상응하는 바이러스에 의한 세포에서 치료적 트랜스진의 발현의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10% 또는 약 5%이다. 치료적 트랜스진 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법, 예를 들어 본원의 실시예 4에 기재된 바와 같은 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포는 암 세포, 내피 세포, 표피 세포, 섬유모세포, 및/또는 면역 세포일 수 있다. 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포는 암 세포, 예를 들어 항문암, 기저 세포 암종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 암종, 담관암종, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 위식도암, 위장 (GI) 암, 위장관 간질 종양, 간세포성 암종, 부인과암, 두경부암, 혈액암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 신경내분비암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 소아암, 전립선암, 신세포 암종, 육종, 피부암, 소세포 폐암, 피부의 편평 상피 암종, 위암, 고환암 또는 갑상선암 세포일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 과다증식성 세포는 과다증식성 장애로부터 유래된다. 예시적인 과다증식성 장애에는 혈관 증식 장애 (예를 들어, 재협착, 망막병증 및 아테롬성동맥경화증), 섬유증 장애 (예를 들어, 간경변증, 예를 들어 간의 경변증 (바이러스 감염 예컨대 간염에 대해 속발성일 수 있음)), 사구체간질 장애 (예를 들어, 인간 신장 질환, 예를 들어 사구체 신염, 당뇨병성 신병증, 악성 신경화증, 혈전성 미세혈관병증 증후군, 이식 거부, 및 사구체병증), 전암성 장애 (예를 들어, 과형성증 또는 이형성증), 자가면역 장애, 류마티스 관절염, 건선, 루푸스, 특발성 폐 섬유증, 경피증 폐 고혈압, 천식, 신장 섬유증, COPD, 낭성 섬유증, DIP, UIP, 황반 변성, 과다증식성 섬유모세포 장애, 및 경피증이 포함된다.
서열 동일성은 관련 기술분야의 기술 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인 (Megalign, DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 결정할 수 있다. 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 이용되는 알고리즘을 사용하는 BLAST (베이직 로칼 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool)) 분석 (Karlin et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Altschul, (1993) J. Mol. Evol. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 참조로 포함됨)은 서열 유사성 검색을 위해 맞추어진다. 서열 데이터베이스를 검색하는데 있어서 기본적인 사안의 논의에 대해서는, 문헌 [Altschul et al., (1994) Nature Genetics 6:119-129 (전문이 본원에 참조로 포함됨)]를 참조한다. 관련 기술분야의 기술자는, 비교할 서열의 전장에 걸쳐서 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 결정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 히스토그램, 작도, 정렬, 기대치 (즉, 데이터베이스 서열에 대한 매칭을 보고하기 위한 통계적 유의성 임계치), 컷오프, 매트릭스 및 필터에 대한 검색 파라미터가 디폴트 설정에 있다. blastp, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 사용되는 디폴트 스코어링 매트릭스(default scoring matrix)는 BLOSUM62 매트릭스이다 (Henikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 전문이 참조로 포함됨). 4종의 blastn 파라미터를 다음과 같이 조정할 수 있다: Q=10 (갭 생성 페널티); R=10 (갭 연장 페널티); wink=1 (질문에 따라 모든 wink.sup.th 위치에서 워드 히트를 생성함); 및 gapw=16 (내부에 갭이 있는 정렬이 생성되는 윈도우 폭을 설정함). 동등한 Blastp 파라미터 설정은 Q=9; R=2; wink=1; 및 gapw=32일 수 있다. 또한, NCBI (국립 생물공학 정보 센터, National Center for Biotechnology Information) BLAST 어드밴스드 옵션(Advanced Option) 파라미터 (예를 들어: -G, 갭 개방을 위한 값 [정수]: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우 5 / 단백질의 경우 11; -E, 갭 연장을 위한 값 [정수]: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우 2 / 단백질의 경우 1; -q, 뉴클레오티드 미스매치에 대한 페널티 [정수]: 디폴트 = -3; -r, 뉴클레오티드 매치에 대한 보상 [정수]: 디폴트 = 1; -e, 기대치 [실수]: 디폴트 = 10; -W, 워드 크기 [정수]: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우 11 / 메가블라스트의 경우 28 / 단백질의 경우 3; -y, 블라스트 연장에 대한 드롭오프 (X) (비트(bit)): 디폴트 = blastn의 경우 20 / 다른 경우 7; -X, 갭이 있는 정렬에 대한 X 드롭오프 값 (비트): 디폴트 = 모든 프로그램의 경우 15, blastn에는 적용되지 않음; 및 -Z, 갭이 있는 정렬에 대한 최종 X 드롭오프 값 (비트): blastn의 경우 50, 다른 경우 25)를 이용하여 검색을 수행할 수 있다. 쌍별 단백질 정렬을 위한 ClustalW를 또한 사용할 수 있다 (디폴트 파라미터에는 예를 들어 Blosum62 매트릭스 및 갭 개방 페널티 = 10 및 갭 연장 페널티 = 0.1이 포함될 수 있음). GCG 팩키지 버젼 10.0으로 입수가능한 서열들 사이의 베스트핏(Bestfit) 비교는 DNA 파라미터 GAP=50 (갭 생성 페널티) 및 LEN=3 (갭 연장 페널티)을 이용하고, 단백질 비교에서의 동등한 설정은 GAP=8 및 LEN=2이다.
I. 바이러스
용어 "바이러스"는 단백질-합성 또는 에너지-생성 메카니즘을 갖지 않는 임의의 편성 세포내 기생충을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 바이러스 게놈은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 바이러스에는 바람직하게는 바쿨로비리다에(baculoviridiae), 파르보비리다에(parvoviridiae), 피코르노비리다에(picornoviridiae), 헤르페스비리다에(herpesviridiae), 폭시이리다에(poxyiridae) 또는 아데노비리다에(adenoviridiae)로부터 선택된, 재조합적으로 변형된 외피보유 또는 비-외피보유 DNA 및 RNA 바이러스가 포함된다. 재조합적으로 변형된 바이러스는 본원에서 "재조합 바이러스"로 지칭된다. 재조합 바이러스는 예를 들어 재조합 DNA 기술에 의해 복제 결함이 있거나, 조건부로 복제되거나 또는 복제에 능숙하도록 변형될 수 있고/거나 재조합 DNA 기술에 의해 외인성 트랜스진의 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 각각의 모 벡터 성질의 유리한 요소를 활용하는 키메라 바이러스 벡터 (예를 들어, 문헌 [Feng et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870] 참조) 또한 본 발명의 실시에 유용할 수 있다. 일반적으로 치료할 종으로부터의 바이러스를 이용하는 것이 유리하지만, 특정한 경우에는, 유리한 병원성 특징을 갖는 상이한 종으로부터 유래된 벡터를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 인간 유전자 요법을 위한 말 헤르페스 바이러스 벡터가 PCT 공개 번호 WO 98/27216에 기재되어 있다. 상기 벡터는 말 바이러스가 인간에 대해 병원성이 아니기 때문에 인간의 치료에 유용한 것으로 기재되어 있다. 유사하게, 양 아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스 벡터에 대한 항체를 피하는 것으로 주장되었기 때문에 인간 유전자 요법에서 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 PCT 공개 번호 WO 97/06826에 기재되어 있다.
본 발명의 실시에 유용한 바이러스는 TATA 박스- 및/또는 CAAT 박스-기반 프로모터를 함유한다. 특정 실시양태에서, TATA 박스- 및/또는 CAAT 박스-기반 프로모터는 초기 단계 유전자, 예를 들어 숙주 세포에 유입된 후에 그러나 복제하기 전에 생산되는, 전형적으로 상기 게놈의 복제 및 후기 유전자의 발현을 개시하는 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 프로모터이다.
초기 유전자 TATA 박스- 및/또는 CAAT 박스-기반 프로모터를 갖는 바이러스의 예에는 인간 면역결핍 바이러스-1 (HIV-1), 단순 포진 바이러스의 바이러스 유형 1, 아데노-연관 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 레오바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 뉴캐슬 바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오바이러스, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 신드비스 바이러스 (SIN), 및 센다이 바이러스 (SV)가 포함된다.
바람직하게는, 재조합 바이러스는 아데노바이러스이다. 아데노바이러스는 뉴클레오캡시드 및 이중 가닥 선형 DNA 게놈으로 구성된 중간 크기의 (90-100 nm) 비-외피보유 (네이키드) 정이십면체형 바이러스이다. 아데노바이러스는 숙주의 복제 기구를 이용하여 포유류 세포의 핵에서 복제한다. 용어 "아데노바이러스"는 인간, 소, 양, 말, 개, 돼지, 뮤린 및 원숭이 아데노바이러스 아속을 비롯하여 이에 제한되지는 않는 아데노비리다에 속의 임의의 바이러스를 지칭한다. 특히, 인간 아데노바이러스는 A-F 아속 뿐만 아니라 그의 개별 혈청형을 포함하며, 상기 개별 혈청형 및 A-F 아속에는 인간 아데노바이러스 유형 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad11a 및 Ad11p), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 및 91이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 인간 아데노바이러스 유형 2, 5 및 35로부터 유래된 재조합 바이러스가 바람직하다. 달리 명시하지 않는다면, 모든 아데노바이러스 유형 5 뉴클레오티드 번호는 본원에서 서열식별번호: 8로 기재된 NCBI 참조 서열 AC_000008.1과 관련된 것이고, 모든 아데노바이러스 유형 35 뉴클레오티드 번호는 본원에서 서열식별번호: 24로 기재된 NCBI 참조 서열 AC_000019.1과 관련된 것이다. 아데노바이러스 유형 5 게놈 (pXC1)의 5' 말단을 코딩하는 예시적인 벡터 플라스미드의 서열은 본원에서 서열식별번호: 2에 기재되어 있다.
아데노바이러스 복제 주기는 2 단계를 갖는다: 4종의 전사 단위 E1, E2, E3 및 E4가 발현되는 동안의 초기 단계, 및 후기 전사체가 주요 후기 프로모터 (MLP)로부터 주로 발현될 때 바이러스 DNA 합성의 개시 이후에 일어나는 후기 단계. 후기 메시지는 대부분의 바이러스 구조 단백질을 코딩한다. E1, E2 및 E4의 유전자 산물은 전사 활성화, 세포 형질전환, 바이러스 DNA 복제, 뿐만 아니라 다른 바이러스 기능을 담당하고, 바이러스 성장을 위해 필요하다.
특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터는 아데노바이러스 E1a, E1b 또는 E4 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터는 아데노바이러스 E1a 프로모터, 예를 들어 Ad5 E1a 프로모터이다. 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 예를 들어 전체 E1a 프로모터 TATA 박스의 결실을 포함할 수 있으며, 예를 들어 Ad5 E1a 프로모터의 뉴클레오티드 -27 내지 -24에 상응하는 결실을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 각각 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 471 내지 474, 467 내지 474, 454 내지 551, 및 352 내지 551에 및 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 472 내지 475, 468 내지 475, 455 내지 552, 및 353 내지 552에 상응하는, Ad5 E1a 프로모터의 -27 내지 -24, -31 내지 -24, -44 내지 +54, 또는 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 Ad5 E1a 프로모터의 -29 내지 -26, -33 내지 -26, -44 내지 +52, 또는 -148 내지 +52에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 Ad5 E1a 프로모터의 약 -50 내지 약 -10, 약 -50 내지 약 -20, 약 -50 내지 약 -30, 약 -50 내지 약 -40, 약 -40 내지 약 -10, 약 -40 내지 약 -20, 약 -40 내지 약 -30, 약 -30 내지 약 -10, 약 -30 내지 약 -20, 또는 약 -20 내지 약 -10에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 7), AGTGCCCG (서열식별번호: 12) 또는 TATTCCCG (서열식별번호: 13)을 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실 (다르게는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹할 2개의 폴리뉴클레오티드 서열을 결합시킴으로써 생성됨)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 7), AGTGCCCG (서열식별번호: 12) 또는 TATTCCCG (서열식별번호: 13), 또는 CTAGGACTG (서열식별번호: 7), AGTGCCCG (서열식별번호: 12) 또는 TATTCCCG (서열식별번호: 13)과 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 아데노바이러스 E1a, E1b 또는 E4 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 아데노바이러스 E1a 프로모터, 예를 들어 Ad5 E1a 프로모터이다. 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 예를 들어 전체 E1a 프로모터 CAAT 박스의 결실을 포함할 수 있으며, 예를 들어 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 422 내지 430에 및 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 423 내지 431에 상응하는, 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 뉴클레오티드 -76 내지 -68에 상응하는 결실을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 Ad5 E1a 프로모터의 약 -90 내지 약 -50, 약 -90 내지 약 -60, 약 -90 내지 약 -70, 약 -90 내지 약 -80, 약 -80 내지 약 -50, 약 -80 내지 약 -60, 약 -80 내지 약 -70, 약 -70 내지 약 -50, 약 -70 내지 약 -60, 또는 약 -60 내지 약 -50에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 서열 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 14)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실 (다르게는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹할 2개의 폴리뉴클레오티드 서열을 결합시킴으로써 생성됨)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 서열 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 14), 또는 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 14)와 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 Ad5 E1a 프로모터의 약 -200 내지 약 +50, 약 -175 내지 약 +50, 약 -150 내지 약 +50, 약 -125 내지 약 +50, 약 -100 내지 약 +50, 약 -75 내지 약 +50, 약 -50 내지 약 +50, 약 -25 내지 약 +50, 약 +1 내지 약 +50, 약 +25 내지 약 +50, 약 -200 내지 약 +25, 약 -175 내지 약 +25, 약 -150 내지 약 +25, 약 -125 내지 약 +25, 약 -100 내지 약 +25, 약 -75 내지 약 +25, 약 -50 내지 약 +25, 약 -25 내지 약 +25, 약 +1 내지 약 +25, 약 -200 내지 약 +1, 약 -175 내지 약 +1, 약 -150 내지 약 +1, 약 -125 내지 약 +1, 약 -100 내지 약 +1, 약 -75 내지 약 +1, 약 -50 내지 약 +1, 약 -25 내지 약 +1, 약 -200 내지 약 -25, 약 -175 내지 약 -25, 약 -150 내지 약 -25, 약 -125 내지 약 -25, 약 -100 내지 약 -25, 약 -75 내지 약 -25, 약 -50 내지 약 -25, 약 -200 내지 약 -50, 약 -175 내지 약 -50, 약 -150 내지 약 -50, 약 -125 내지 약 -50, 약 -100 내지 약 -50, 약 -75 내지 약 -50, 약 -200 내지 약 -75, 약 -175 내지 약 -75, 약 -150 내지 약 -75, 약 -125 내지 약 -75, 약 -100 내지 약 -75, 약 -200 내지 약 -100, 약 -175 내지 약 -100, 약 -150 내지 약 -100, 약 -125 내지 약 -100, 약 -200 내지 약 -125, 약 -175 내지 약 -125, 약 -150 내지 약 -125, 약 -200 내지 약 -150, 약 -175 내지 약 -150, 또는 약 -200 내지 약 -175에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스- 및/또는 CAAT 박스-기반 프로모터 외에도, 상기 바이러스는 조절 서열 또는 프로모터에 대해 1개 이상의 추가적인 변형을 갖는다. 조절 서열 또는 프로모터에 대한 추가적인 변형은 조절 서열 또는 프로모터의 야생형 서열에 비해 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환 또는 부가를 포함한다. 추가적인 변형은 변형된 TATA 박스- 및/또는 CAAT 박스-기반 프로모터에 인접하여 있거나 또는 그로부터 멀리 떨어져 있을 수 있다.
특정 실시양태에서, 조절 서열 또는 프로모터의 추가적인 변형은, 예를 들어 일부를 결실시킴으로써 또는 결합 부위에 단일 점 돌연변이를 삽입시킴으로써, 전사 인자에 대한 친화도를 감소시키기 위해 전사 인자 결합 부위의 서열에 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가적인 변형된 조절 서열은 암 세포에서의 발현을 강화시키지만, 정상 세포에서의 발현은 약화시킨다.
특정 실시양태에서, 조절 서열 또는 프로모터의 추가적인 변형은 E1a 조절 서열에 대한 추가적인 변형을 포함한다. E1a 조절 서열은 Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV 및 Pea3 V로 지정된, 전사 인자 Pea3에 대한 5개의 결합 부위를 함유하며, 여기서 Pea3 I은 E1a 시작 부위에 가장 근접한 Pea3 결합 부위이고, Pea3 V는 가장 멀리 있다. E1a 조절 서열은 또한 본원에서 E2F I 및 E2F II로 지정된, 전사 인자 E2F에 대한 결합 부위를 함유하며, 여기서 E2F I은 E1a 시작 부위에 가장 근접한 E2F 결합 부위이고, E2F II는 더욱 멀리 있다. E1a 시작 부위로부터, 결합 부위는 Pea3 I, E2F I, Pea3 II, E2F II, Pea3 III, Pea3 IV 및 Pea3 V로 정렬된다.
특정 실시양태에서, 이들 7개의 결합 부위 중 적어도 1개 또는 그의 기능적 부분이 결실된다. "기능적 부분"은, 결실될 때 그의 각각의 전사 인자 (Pea3 또는 E2F)에 대한 결합 부위의 기능성, 예를 들어 결합 친화도를 예를 들어 완전한 서열에 비해 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 감소시키거나 심지어 제거하는 결합 부위의 부분이다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 전체 결합 부위가 결실된다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 결합 부위의 기능적 부분이 결실된다. "결실된 결합 부위"는 전체 결합 부위의 결실 및 기능적 부분의 결실 둘 다를 포괄한다. 2개 이상의 결합 부위가 결실되는 경우, 전체 결합 부위 결실 및 기능적 부분 결실의 임의의 조합이 이용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 적어도 1개의 Pea3 결합 부위 또는 그의 기능적 부분이 결실된다. 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV 및/또는 Pea3 V일 수 있다. 특정 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV 및/또는 Pea3 V이다. 특정 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 IV 및/또는 Pea3 V이다. 특정 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II 및/또는 Pea3 III이다. 특정 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II 및 Pea3 III 둘 다이다. 특정 실시양태에서, Pea3 I 결합 부위 또는 그의 기능적 부분은 유지된다.
특정 실시양태에서, 적어도 1개의 E2F 결합 부위 또는 그의 기능적 부분이 결실된다. 특정 실시양태에서, 적어도 1개의 E2F 결합 부위 또는 그의 기능적 부분은 유지된다. 특정 실시양태에서, 유지된 E2F 결합 부위는 E2F I 및/또는 E2F II이다. 특정 실시양태에서, 유지된 E2F 결합 부위는 E2F II이다. 특정 실시양태에서, 총 결실은 본질적으로 Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV 및/또는 Pea3 V 중 1개 이상 또는 그의 기능적 부분으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 E1a 개시 부위의 -305 내지 -255 상류에 위치하는 50개 염기쌍 영역의 결실을 가지며, 이후에 TAV-255 결실로 지칭한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 E1a 개시 부위의 -304 내지 -255 상류에 위치하는, 예를 들어 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8)의 195-244에 상응하는 50개 염기쌍 영역의 결실을 가지며, 이후에 TAV-255 결실로 지칭된다. 특정 실시양태에서, TAV-255 결실은 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 11)을 포함하는 E1a 프로모터를 생성한다.
개시된 재조합 바이러스는 치료적 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 치료적 트랜스진은 치료적 핵산, 예를 들어 안티센스 RNA 또는 리보자임 RNA를 코딩할 수 있다. 치료적 트랜스진은 치료적 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어 아폽토시스제, 항체, CTL 반응성 펩티드, 시토카인, 세포용해제, 세포독성제, 효소, 종양 세포의 표면 상에서 발현되어 면역 반응을 도출하는 이종성 항원, 면역자극 또는 면역조정 작용제, 인터페론, 용해성 펩티드, 종양단백질, 세포 사멸을 유도하는 과정을 촉매하는 폴리펩티드, 체세포에서의 유전자 결함을 보완하는 폴리펩티드, 종양 억제 단백질, 백신 항원, 또는 이들의 임의의 조합물을 코딩할 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료적 트랜스진은 아세틸콜린, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄, BORIS/CTCFL, CD19, CD20, CD80, CD86, CD137L, CD154, DKK1/Wnt, ICAM-1, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-17, IL-23, IL-23A/p19, 인터페론-감마, TGF-β, TGF-β 트랩, FGF, IL-24, IL-27, IL-35, MAGE, NY-ESO-1, p53, 및 티미딘 키나제로부터 선택된 치료적 폴리펩티드를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 치료적 트랜스진은 TGF-β 트랩이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 TGF-β 트랩 단백질은 2017년 9월 27일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/717,199에 기재되어 있다.
아데노바이러스 E1b-19k 유전자는 주로 항-아폽토시스 유전자로서 기능하고, 세포성 항-아폽토시스 유전자, BCL-2의 동족체이다. 자손 바이러스 입자의 돌연변이 이전의 숙주 세포 사멸은 바이러스 복제를 제한하기 때문에, E1b-19k는 조기 세포 사멸을 방지하기 위해 El 카세트의 일부로서 발현되어, 감염을 진행시키고 성숙한 비리온을 생성한다. 따라서, 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위를 포함하는 재조합 바이러스가 제공되며, 예를 들어 아데노바이러스는 E1b-19K 삽입 부위에 삽입된 치료적 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위 (즉, E1b-19k의 시작 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1714-1716에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 E1b-55K의 시작 부위 (즉, E1b-55k의 시작 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 2019-2021에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 명세서 및 청구범위에 걸쳐, 두 부위 사이의 삽입, 예를 들어 (i) 제1 유전자 (예를 들어, E1b-19k)의 시작 부위와 제2 유전자 (예를 들어, E1b-55K)의 시작 부위, (ii) 제1 유전자의 시작 부위와 제2 유전자의 정지 부위, (iii) 제1 유전자의 정지 부위와 제2 유전자의 시작 부위, 또는 (iv) 제1 유전자의 정지 부위와 제2 유전자의 정지 부위 사이의 삽입은, 삽입을 둘러싸는 주어진 시작 부위 또는 정지 부위를 구성하는 뉴클레오티드의 전부 또는 일부가 최종 바이러스에 존재하거나 부재할 수 있음을 의미하는 것으로 이해한다. 유사하게, 두 뉴클레오티드 사이의 삽입은, 삽입을 둘러싸는 뉴클레오티드가 최종 바이러스에 존재하거나 부재할 수 있음을 의미하는 것으로 이해한다.
특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위 (즉, E1b-19k의 시작 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1714-1716에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 E1b-19K의 정지 부위 (즉, E1b-19k의 정지 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 2242-2244에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 약 100 내지 약 305, 약 100 내지 약 300, 약 100 내지 약 250, 약 100 내지 약 200, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 305, 약 150 내지 약 300, 약 150 내지 약 250, 또는 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 약 200개 뉴클레오티드, 예를 들어 203개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8)의 뉴클레오티드 1714-1916에 상응하는 결실을 포함하거나, 또는 치료적 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8)의 1714 및 1916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, 치료적 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 CTGACCTC (서열식별번호: 9)와 TCACCAGG (서열식별번호: 10) 사이에 삽입되며, 예를 들어 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로 CTGACCTC (서열식별번호: 9), 치료적 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 TCACCAGG (서열식별번호: 10)을 포함한다. CTGACCTC (서열식별번호: 9) 및 TCACCAGG (서열식별번호: 10)은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8) 내에서 E1b-19K 삽입 부위에 대한 독특한 경계 서열을 정의한다. 명세서 및 청구범위에 걸쳐, 소정의 부위에 인접한 결실, 예를 들어 소정의 유전자의 시작 부위에 인접한 결실 또는 소정의 유전자의 정지 부위에 인접한 결실은, 주어진 시작 부위 또는 정지 부위를 구성하는 뉴클레오티드의 전부 또는 일부의 결실을 포함할 수 있거나 또는 결실을 포함하지 않을 수 있음을 의미하는 것으로 이해한다.
특정 실시양태에서, 임의의 상기 바이러스에서, 재조합 아데노바이러스는 E4 결실을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위 (즉, E4-ORF6/7의 시작 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 23의 뉴클레오티드 34075-34077에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 우측 반전 말단 반복부 (ITR; 예를 들어 서열식별번호: 23의 뉴클레오티드 35836-35938에 상응함) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위와 E4-ORF1의 시작 부위 (즉, E4-ORF1의 시작 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 23의 뉴클레오티드 35524-35526에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위와 E4-ORF1의 시작 부위 사이에 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 2500, 약 1500 내지 약 2000, 또는 약 2000 내지 약 2500개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 250 내지 약 1500, 약 250 내지 약 1250, 약 250 내지 약 1000, 약 250 내지 약 750, 약 250 내지 약 500, 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1250, 약 500 내지 약 1000, 약 500 내지 약 750, 750 내지 약 1500, 약 750 내지 약 1250, 약 750 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1500, 또는 약 1000 내지 약 1250개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 1450개 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 예를 들어 E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 1449개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 23)의 뉴클레오티드 34078-35526에 상응하는 결실을 포함한다.
II. 바이러스의 생산 방법
본 발명의 재조합 바이러스를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 감염성 바이러스 입자의 생산이 가능하도록 적합한 조건 하에 형질감염된 또는 감염된 숙주 세포를 배양하는 것을 비롯한 통상적인 기술을 이용하여 적합한 숙주 세포주에서 개시된 바이러스를 생산한다. 바이러스 유전자를 코딩하는 핵산을 플라스미드에 도입시킬 수 있고, 통상적인 형질감염 또는 형질전환 기술을 통해 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 개시된 바이러스의 생산을 위한 예시적인 적합한 숙주 세포에는 인간 세포주 예컨대 HeLa, Hela-S3, HEK293, 911, A549, HER96 또는 PER-C6 세포가 포함된다. 구체적인 생산 및 정제 조건은 바이러스 및 이용되는 생산 시스템에 따라 달라질 것이다. 아데노바이러스의 경우, 바이러스 입자의 생성을 위한 전통적인 방법은, 공동-형질감염에 이어서, 셔틀 플라스미드 (일반적으로 아데노바이러스 게놈의 작은 하위 집합을 함유하고, 임의적으로 잠재적인 트랜스진 발현 카세트를 함유함) 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 (전체 아데노바이러스 게놈의 대부분을 함유함)의 후속적인 생체내 재조합이다.
아데노바이러스의 생성을 위한 대안적인 기술에는 박테리아 인공 염색체 (BAC) 시스템 (상보성 아데노바이러스 서열을 함유하는 2개의 플라스미드를 이용하는 recA÷ 박테리아 균주에서 생체내 박테리아 재조합) 및 효모 인공 염색체 (YAC) 시스템을 이용하는 것이 포함된다.
생산 후에, 감염성 바이러스 입자를 배양물로부터 회수하고, 임의적으로 정제한다. 전형적인 정제 단계에는 플라크 정제, 원심분리, 예를 들어 염화세슘 구배 원심분리, 정화, 효소 처리, 예를 들어 벤조나제 또는 프로테아제 처리, 크로마토그래피 단계, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 또는 여과 단계가 포함될 수 있다.
III. 치료적 조성물 및 치료 방법
치료적 사용을 위해, 재조합 바이러스를 바람직하게는 제약상 허용가능한 담체와 조합한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용가능한 담체"는 합리적인 이익/위험 비에 비례하여 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증이 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 완충제, 담체 및 부형제를 의미한다. 담체(들)는 제형의 다른 성분과 적합성인 면에서 "허용가능해야" 하고, 수용자에게 유해하지 않아야 한다. 제약상 허용가능한 담체에는 제약적 투여에 적합한 완충제, 용매, 분산 매질, 코팅, 등장화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 제약상 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 개시된 재조합 바이러스를 함유하는 제약 조성물은 투여 단위 형태로 제시될 수 있고, 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화되어야 한다. 투여 경로의 예는 정맥내 (IV), 피내, 흡입, 경피, 국소, 경점막, 및 직장 투여이다. 융합 단백질을 위한 바람직한 투여 경로는 IV 주입이다. 유용한 제형은 제약 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)]을 참조한다. 비경구 투여에 적합한 제형 성분에는 멸균 희석제 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 경화유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 긴장성 조정제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스가 포함된다.
정맥내 투여의 경우, 적합한 담체에는 생리 식염수, 정균수, 크레모포어(Cremophor) ELTM (바스프(BASF), 뉴저지주 파시페니) 또는 인산염 완충된 식염수 (PBS)가 포함된다. 담체는 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하고, 미생물에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
제약 제형은 바람직하게는 멸균성이다. 멸균화는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물을 동결건조시키는 경우, 여과 멸균화는 동결건조 및 재구성 이전에 또는 이후에 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 유익한 또는 원하는 결과를 달성하는데 충분한 활성 성분의 양 (예를 들어, 본 발명의 재조합 바이러스의 양)을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 용량으로 투여될 수 있고, 특정한 제형 또는 투여 경로에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
특정 실시양태에서, 활성 성분의 치료 유효량은 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예를 들어 1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 범위이다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스의 치료 유효량은 102 내지 1015 플라크 형성 단위 (pfu), 예를 들어 102 내지 1010, 102 내지 105, 105 내지 1015, 105 내지 1010, 또는 1010 내지 1015 플라크 형성 단위의 범위이다. 투여되는 양은 치료할 질환 또는 징후의 유형 및 정도, 환자의 전반적인 건강 상태, 항체의 생체내 능력, 제약 제형, 투여 경로와 같은 변수에 따라 좌우될 것이다. 초기 용량은 원하는 혈관 수준 또는 조직 수준을 신속하게 달성하기 위해 상한을 넘어 증가될 수 있다. 대안적으로, 초기 용량은 최적 용량보다 적을 수 있고, 치료 과정 동안에 1일 용량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 인간 용량은 예를 들어 0.5 mg/kg에서 20 mg/kg까지 작동하도록 고안된 통상적인 I상 용량 증량 연구에서 최적화될 수 있다. 투여 빈도는 투여 경로, 투여량, 바이러스의 혈청 반감기, 및 치료할 질환과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 예시적인 투여 빈도는 1일 1회, 주 1회, 2주마다 1회이다. 바람직한 투여 경로는 비경구, 예를 들어 정맥내 주입이다. 바이러스-기반 약물의 제형은 관련 기술분야의 통상적인 기술 내에 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스를 동결건조시킨 다음, 투여시에 완충된 식염수 중에서 재구성한다.
본원에 개시된 재조합 바이러스를 이용하여 다양한 의학적 징후를 치료할 수 있다. 예를 들어, 재조합 바이러스를 이용하여 다양한 과다증식성 질환, 예를 들어 암을 치료할 수 있다. 과다증식성 세포, 예를 들어 암 세포를 재조합 바이러스의 치료 유효량에 노출시켜, 암 세포의 증식을 억제하거나 감소시킨다. 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 재조합 바이러스의 유효량을 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합하여 대상체에게 투여하여, 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스의 유효량을 대상체에게 투여하면, 해당 대상체에서 종양 로드가 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 감소된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 대상체에서, 예를 들어 인간에서 질환을 치료하는 것을 의미한다. 여기에는 (a) 질환의 억제, 즉, 그의 발생의 저지; 및 (b) 질환의 완화, 즉, 질환 상태의 퇴행 유발이 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 치료되는 유기체를 지칭한다. 이러한 유기체에는 바람직하게는 포유류 (예를 들어, 뮤린, 원숭이, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)가 포함되나 이에 제한되지는 않고, 가장 바람직하게는 인간이 포함된다.
암의 예에는 고형 종양, 연조직 종양, 조혈성 종양 및 전이성 병변이 포함된다. 조혈성 종양의 예에는 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수구성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 예를 들어 형질전환된 CLL, 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종, 모발 세포 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 림프종, 호지킨병, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 또는 리히터 증후군 (리히터 형질전환)이 포함된다. 고형 종양의 예에는 악성 종양, 예를 들어 육종, 선암종, 및 다양한 기관계의 암종, 예컨대 두경부 (예컨대, 인두), 갑상선, 폐 (소세포 또는 비소세포 폐 암종 (NSCLC)), 유방, 림프, 위장 (예를 들어, 구강, 식도, 위, 간, 췌장, 소장, 결장 및 직장, 항문관), 생식기 및 비뇨생식관 (예를 들어, 신장, 요로상피, 방광, 난소, 자궁, 자궁경부, 자궁내막, 전립선, 고환), CNS (예를 들어, 신경 또는 교질 세포, 예를 들어 신경아세포종 또는 신경교종), 또는 피부 (예를 들어, 흑색종)에서 발병하는 것들이 포함된다.
특정 실시양태에서, 암은 항문암, 기저 세포 암종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 암종, 담관암종, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 위식도암, 위장 (GI) 암, 위장관 간질 종양, 간세포성 암종, 부인과암, 두경부암, 혈액암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 신경내분비암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 소아암, 전립선암, 신세포 암종, 육종, 피부암, 소세포 폐암, 피부의 편평 상피 암종, 위암, 고환암 및 갑상선암으로부터 선택된다.
추가적 예시적인 과다증식성 질환에는 혈관 증식 장애 (예를 들어, 재협착, 망막병증, 및 아테롬성동맥경화증), 섬유증 장애 (예를 들어, 간경변증, 예를 들어 간의 경변증 (바이러스 감염 예컨대 간염에 대해 속발성일 수 있음)), 사구체간질 장애 (예를 들어, 인간 신장 질환, 예를 들어 사구체 신염, 당뇨병성 신병증, 악성 신경화증, 혈전성 미세혈관병증 증후군, 이식 거부, 및 사구체병증), 전암성 장애 (예를 들어, 과형성증 또는 이형성증), 자가면역 장애, 류마티스 관절염, 건선, 루푸스, 특발성 폐 섬유증, 경피증 폐 고혈압, 천식, 신장 섬유증, COPD, 낭성 섬유증, DIP, UIP, 황반 변성, 과다증식성 섬유모세포 장애, 및 경피증이 포함된다.
특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 하나 이상의 요법, 예를 들어 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 또는 바이러스요법과 조합되에 대상체에게 투여된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 재조합 바이러스는 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 에를로티닙과 조합되어 투여된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 재조합 바이러스는 체크포인트 억제제, 예를 들어 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 또는 항-PD-L1 항체와 조합되어 투여된다. 예시적인 항-PD-1 항체에는 예를 들어 니볼루맙 (옵디보(Opdivo)®, 브리스톨-마이어스 스큅 캄파니(Bristol-Myers Squibb Co.)), 펨브롤리주맙 (케이트루다(Keytruda)®, 머크 샤프 앤드 돔 코퍼레이션(Merck Sharp & Dohme Corp.)), PDR001 (노바티스 파마슈티칼스(Novartis Pharmaceuticals)), 및 피딜리주맙 (CT-011, 큐어 테크(Cure Tech))이 포함된다. 예시적인 항-PD-L1 항체에는 예를 들어 아테졸리주맙 (테센트리크(Tecentriq)®, 제넨테크(Genentech)), 두발루맙 (아스트라제네카(AstraZeneca)), MEDI4736, 아벨루맙, 및 BMS 936559 (브리스톨 마이어스 스큅 캄파니)가 포함된다.
용어 "조합하여" 투여하는 것은, 본원에서 사용된 바와 같이, 대상체에서 장애의 발병 동안에 2종의 (또는 그 초과의) 상이한 치료를 대상체에게 전달하여, 환자에 대한 치료 효과가 한 시점에서 중첩되게 하는 것을 의미하는 것으로 이해한다. 특정 실시양태에서, 두번째 치료의 전달을 시작할 때 한 치료의 전달이 여전히 일어나고 있어서, 투여의 면에서 중첩된다. 이는 때때로 본원에서 "동시" 또는 "공동 전달"로 지칭된다. 다른 실시양태에서, 다른 치료의 전달을 시작하기 전에 한 치료의 전달이 종료된다. 이러한 경우의 일부 실시양태에서, 조합된 투여로 인해 치료가 더욱 효과적이다. 예를 들어, 두번째 치료는 더욱 효과적이며, 예를 들어 첫번째 치료의 부재 하에 두번째 치료를 투여한 경우에 확인되는 것에 비해, 더 적은 두번째 치료에도 동등한 효과가 확인되거나, 또는 두번째 치료가 더 큰 정도로 증상을 감소시키거나, 또는 유사한 상황이 첫번째 치료에서도 확인된다. 특정 실시양태에서, 장애와 관련된 증상 또는 다른 파라미터의 감소가 다른 치료의 부재 하에 전달된 한 치료에 의해 관찰되는 것보다 더 크도록 전달된다. 두 치료의 효과는 부분적으로 상가적이거나, 전체적으로 상가적이거나 또는 상가적인 것보다 더 크다. 두번째 치료가 전달될 때, 전달된 첫번째 치료의 효과가 여전히 검출가능하도록 전달될 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 바이러스의 유효량은 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 측정함으로써 확인되고/거나, 대상체의 치료 방법은 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 과다증식성 질환, 예를 들어 암은 면역저해를 특징으로 할 수 있으며, 대상체에서 항원에 대한 면역 반응의 측정은 대상체에서 면역저해 수준의 지표일 수 있다. 따라서, 대상체에서 항원에 대한 면역 반응의 측정은 치료의 효능 및/또는 재조합 바이러스의 유효량의 지표일 수 있다. 대상체에서 항원에 대한 면역 반응은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원에 대한 면역 반응은 대상체의 피부 상의 주사 부위에서 대상체에게 항원을 주사하고, 주사 부위에서 염증의 경화 또는 양의 크기를 측정함으로써 측정된다. 특정 실시양태에서, 항원에 대한 면역 반응은 항원에 노출 시 대상체의 세포로부터의 시토카인 (예를 들어, 인터페론 감마, IL-4 및/또는 IL-5)의 방출에 의해 측정된다.
명세서에 걸쳐, 바이러스, 조성물 및 시스템이 특정한 성분을 갖거나, 포괄하는 또는 포함하는 것으로 기재되거나, 또는 공정 및 방법이 특정한 단계를 갖거나, 포괄하는 또는 포함하는 것으로 기재된 경우, 이는 추가적으로, 인용된 성분으로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어지는 본 발명의 조성물, 디바이스 및 시스템이 있고, 인용된 공정 단계로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진 본 발명에 따른 공정 및 방법이 있는 것으로 고려된다.
본 출원에서, 요소 또는 성분이 인용된 요소 또는 성분의 목록에 포함되고/거나 그로부터 선택되는 경우, 상기 요소 또는 성분이 인용된 요소 또는 성분 중 어느 하나일 수 있거나, 또는 상기 요소 또는 성분이 인용된 요소 또는 성분 중 2종 이상으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있음을 이해해야 한다.
추가로, 본원에 기재된 바이러스, 조성물, 시스템, 방법 또는 공정의 요소 및/또는 특징이, 본원에서 명백하건 암시적이건 간에, 본 발명의 개념 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 방식으로 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 특정한 화합물이 언급된 경우, 문맥상 달리 이해되지 않는다면, 해당 화합물은 본 발명의 조성물의 다양한 실시양태에서 및/또는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 달리 말하면, 본 출원 내에서, 실시양태는 명확하고 간결한 출원이 기재되고 도시되도록 하는 방식으로 기재되고 도시되었지만, 실시양태가 본원의 교시 및 발명(들)으로부터 벗어나지 않고 다양하게 조합되거나 분리될 수 있는 것으로 의도되고 그렇게 이해될 것이다. 예를 들어, 본원에 기재되고 도시된 모든 특징은 본원에 기재되고 도시된 본 발명(들)의 모든 측면에 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
문맥 및 용법상 달리 이해되지 않는다면, 표현 "중 적어도 하나"는 상기 표현 뒤에 있는 각각의 인용된 대상 및 인용된 대상의 2종 이상의 다양한 조합을 개별적으로 포함한다는 것을 이해해야 한다. 문맥상 달리 이해되지 않는다면, 3종 이상의 인용된 대상과 관련하여 표현 "및/또는"은 동일한 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다.
달리 구체적으로 명시되지 않거나 문맥상 달리 이해되지 않는다면, 용어 "포함하다", "포함한다", "포함하는", "갖다", "갖는다", "갖는", "함유하다", "함유한다", 또는 "함유하는" 및 이들의 문법적으로 동등한 용어는 일반적으로 예를 들어 추가적인 인용되지 않은 요소 또는 단계를 배제하지 않고 개방형이고 비제한적인 것으로 이해되어야 한다.
본 출원의 다양한 곳에서, 바이러스, 조성물, 시스템, 공정 및 방법, 또는 이들의 특징이 그룹으로 또는 범위로 개시된다. 구체적으로, 상기 기재는 이러한 그룹 및 범위의 구성원들의 각각의 모든 개별 하위 조합을 포함하는 것으로 의도된다. 다른 예로, 1 내지 20 범위의 정수는 구체적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20을 개별적으로 개시하는 것으로 의도된다.
용어 "약"이 정량적인 값 앞에서 사용되는 경우, 또한 달리 구체적으로 명시하지 않는다면, 본 발명은 또한 구체적인 정량적인 값 자체를 포함한다. 달리 나타내거나 유추되지 않는다면, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 공칭 값으로부터 ±10% 변동을 나타낸다.
단계의 순서 또는 특정한 작용을 수행하는 순서는 본 발명이 작동가능하다면 중요하지 않음을 이해해야 한다. 더욱이, 2개 이상의 단계 또는 작동이 동시에 수행될 수 있다.
본원에서 임의의 모든 예, 또는 예시적인 용어, 예를 들어 "예컨대" 또는 "비롯한"의 사용은 단지 본 발명을 더욱 잘 예시하기 위해 의도된 것이며, 청구되지 않는다면 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 용어도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실시에서 필수적임을 나타내는 것으로 파악되어서는 안된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적인 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위 또는 내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 플라스미드 및 아데노바이러스 구축
이 실시예는 TATA 및/또는 CAAT 박스를 포함하는 E1a 프로모터 영역에서 결실을 갖는 재조합 유형 5 (Ad5) 아데노바이러스의 생산을 기재한다.
Ad5 게놈의 5' 부분을 보유하는 아데노바이러스 벡터 플라스미드 pXC1을 마이크로빅스 바이오시스템(Microbix Biosystem, 캐나다 토론토)으로부터 획득하였다. pXC1 벡터 플라스미드의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열식별번호: 2로 기재된다. Ad5 게놈 NCBI 참조 서열 AC_000008.1은 본원에서 서열식별번호: 8로 기재된다. 도 1f는 CAAT 박스 및 TATA 박스의 위치를 나타내는 E1a 유전자의 시작 코돈까지 야생형 Ad5의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열을 기재한다.
E1a 프로모터에서 CAAT 박스 및 TATA 박스를 포함하는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 352-551에 상응하는 200개 뉴클레오티드의 결실 (서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 353-552에 상응함)을 갖는 변형된 pXC1 벡터 플라스미드를 생성하였다. 돌연변이된 벡터 플라스미드는 이후에 pXC1-Δ350으로 지칭하고, 그로부터 생산된 임의의 생성된 바이러스 입자는 이후에 Ad-Δ350으로 지칭한다. E1a 유전자의 시작 코돈까지 pXC1-Δ350의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 20에 제시되어 있다. pXC1-Δ350의 전장 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 4에 제시되어 있다. E1a 유전자의 시작 코돈까지 Ad-Δ350의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열은 도 1a 및 서열식별번호: 3에 제시되어 있다. pXC1 벡터 플라스미드 (및 임의의 변형된 pXC1 벡터 플라스미드)의 5' 말단에서 21개 뉴클레오티드는 야생형 아데노바이러스 서열과 상이하지만, 이들 뉴클레오티드는 재조합 아데노바이러스를 생성하는 과정 동안에 야생형 아데노바이러스 서열로 전환된다.
나타낸 경우, pXC1-Δ350을 E1b-19k 영역의 시작 부위에서 SalI 부위 및 SalI 부위의 XhoI 부위 200개 염기쌍 3'을 보유하도록 추가로 변형시켜, 치료적 트랜스진의 삽입을 용이하게 하였다. 변형된 E1b-19k 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 5에 제시되어 있다. 생성된 벡터 플라스미드는 이후에 pXC1-Δ350-Δ19k로 지칭하고, 그로부터 생산된 임의의 생성된 바이러스 입자는 이후에 Ad-Δ350-Δ19k로 지칭한다.
나타낸 경우, 뮤린 GM-CSF에 대한 유전자를 SalI와 XhoI 부위 사이의 변형된 E1b-19k 영역에 있는 pXC1-Δ350-Δ19k에 클로닝하였다. 마우스 GM-CSF에 대한 아미노산 서열은 서열식별번호: 6에 제시되어 있다. 생성된 벡터 플라스미드는 이후에 pXC1-Δ350-mGM-CSF로 지칭하고, 그로부터 생산된 임의의 생성된 바이러스 입자는 이후에 Ad-Δ350-mGM-CSF로 지칭한다.
E1a 프로모터에 TATA 박스를 포함하는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 467-474에 상응하는 8개 뉴클레오티드의 결실 (서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 468-475에 상응함)을 갖는 추가적인 변형된 pXC1 벡터 플라스미드를 생성하였다. 돌연변이된 벡터 플라스미드는 이후에 pXC1-TATA로 지칭하고, 그로부터 생산된 임의의 생성된 바이러스 입자는 이후에 Ad-TATA로 지칭한다. E1a 유전자의 시작 코돈까지 pXC1-TATA의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 21에 제시되어 있다. E1a 유전자의 시작 코돈까지 Ad-TATA의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열은 도 1b 및 서열식별번호: 15에 제시되어 있다.
E1a 프로모터에 CAAT 박스를 포함하는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 422-430에 상응하는 9개 뉴클레오티드의 결실 (서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 423-431에 상응함)을 갖는 추가적인 변형된 pXC1 벡터 플라스미드를 생성하였다. 돌연변이된 벡터 플라스미드는 이후에 pXC1-CAAT로 지칭하고, 그로부터 생산된 임의의 생성된 바이러스 입자는 이후에 Ad-CAAT로 지칭한다. E1a 유전자의 시작 코돈까지 pXC1-CAAT의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 22에 제시되어 있다. E1a 유전자의 시작 코돈까지 Ad-CAAT의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열은 도 1c 및 서열식별번호: 16에 제시되어 있다.
E1a 프로모터에 CAAT 박스를 포함하는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 422-430에 상응하는 9개 뉴클레오티드의 결실 (서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 423-431에 상응함) 및 E1a 프로모터에 TATA 박스를 포함하는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 467-474에 상응하는 8개 뉴클레오티드의 결실 (서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 468-475에 상응함)을 갖는 추가적인 변형된 pXC1 벡터 플라스미드를 생성하였다. 돌연변이된 벡터 플라스미드는 이후에 pXC1-CAAT-TATA로 지칭하고, 그로부터 생산된 임의의 생성된 바이러스 입자는 이후에 Ad-CAAT-TATA로 지칭한다. E1a 유전자의 시작 코돈까지 pXC1-CAAT-TATA의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 23에 제시되어 있다. E1a 유전자의 시작 코돈까지 Ad-CAAT-TATA의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열은 도 1d 및 서열식별번호: 17에 제시되어 있다.
E1a 프로모터에 CAAT 박스를 포함하는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 422-430에 상응하는 9개 뉴클레오티드의 결실 (서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 423-431에 상응함) 및 E1a 프로모터에 TATA 박스의 4개 뉴클레오티드 TATA 서열 (이후에 최소 TATA 또는 mTATA 결실로 지칭함)을 포함하는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 471-474에 상응하는 4개 뉴클레오티드의 결실 (서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 472-475에 상응함)을 갖는 추가적인 변형된 pXC1 벡터 플라스미드를 생성하였다. 돌연변이된 벡터 플라스미드는 이후에 pXC1-CAAT-mTATA로 지칭하고, 그로부터 생산된 임의의 생성된 바이러스 입자는 이후에 Ad-CAAT-mTATA로 지칭한다. E1a 유전자의 시작 코돈까지 pXC1-CAAT-mTATA의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 25에 제시되어 있다. E1a 유전자의 시작 코돈까지 Ad-CAAT-TATA의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열은 도 1e 및 서열식별번호: 26에 제시되어 있다.
서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 194-243에 상응하는 50개 뉴클레오티드의 결실 (서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 195-244 및 E1a 개시 부위의 뉴클레오티드 -304 내지 -255 상류에 상응함)을 가져서 E1a 발현이 암-선택적이게 만든 추가적인 변형된 pXC1 벡터 플라스미드를 생성하였다 (미국 특허 번호 9,073,980에서 이전에 기재됨). 돌연변이된 벡터 플라스미드는 이후에 pXC1- TAV-255로 지칭하고, 그로부터 생산된 임의의 생성된 바이러스 입자는 이후에 Ad-TAV-255로 지칭한다. 나타낸 경우, 상기 기재된 바와 같이 E1b-19k 영역의 시작 부위에서 SalI 부위 및 SalI 부위의 XhoI 부위 200 염기쌍 3'을 보유하도록 pXC1- TAV-255를 추가로 변형시켜, 치료적 트랜스진의 삽입을 용이하게 하였다. 생성된 벡터 플라스미드는 이후에 pXC1-TAV-Δ19k로 지칭하고, 그로부터 생산된 임의의 생성된 바이러스 입자는 이후에 Ad-TAV-Δ19k로 지칭한다.
다양한 변형된 pXC1 플라스미드를 HEK-293A 세포에서 플라스미드 pJM17과 공동 형질감염시켜, 재조합 바이러스를 구조하기 위해 상동성 재조합을 가능하게 하였다. 바이러스를 수집하고, 두 차례의 플라크 정제 및 서열분석을 수행하여, 필요에 따라 상응하는 결실의 존재를 시험하였다.
실시예 2: 정상 및 암성 세포에서 Ad-Δ350으로부터 E1a 발현
이 실시예는 암성 및 정상 세포에서 변형된 아데노바이러스 Ad-Δ350으로부터 바이러스 단백질 발현의 비교를 기재한다.
Panc1 세포 (인간 췌장암 세포) 및 WI-38 세포 (비-암성 인간 폐 섬유모세포)를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 Ad-Δ350 또는 Ad-TAV-255 바이러스로 감염시켰다. 감염시킨 후에 지정된 시간에서 E1a 발현을 웨스턴 블롯에 의해 검정하였다.
도 2a 및 2b에 도시된 바와 같이, Ad-Δ350 바이러스로 감염된 후에, WI-38 세포는 Panc1 세포에 비해 낮은 수준으로 및 늦은 시점에서 아데노바이러스 단백질 E1a를 발현하였다.
Panc1 세포 및 A549 세포 (인간 폐암 세포)를 3 또는 5의 감염 다중도 (MOI)에서 Ad-TAV-255 또는 Ad-Δ350으로 감염시키고, 감염 72시간 후의 E1a 발현을 웨스턴 블롯에 의해 검정하였다. 도 3a (Panc1 세포) 및 도 3b (A549 세포)에 도시된 바와 같이, 암 세포주 둘 다는 Ad-Δ350 또는 Ad-TAV-255 바이러스로부터 높은 수준의 E1a 발현을 뒷받침한다.
종합하면, 이들 결과는, E1a TATA 박스를 비롯하여 Ad5에서 200개 뉴클레오티드 영역이 비-암성 세포에서는 E1a 발현을 위해 필요하지만, 이들 영역이 종양 세포에서는 E1a 발현을 위해 불필요함을 제시한다.
실시예 3: 정상 및 암성 세포에서 Ad-Δ350, Ad-CAAT, Ad-TATA, Ad-CAAT-TATA 및 Ad-CAAT-mTATA로부터의 세포독성
이 실시예는 암성 및 정상 세포에서 변형된 아데노바이러스 Ad-Δ350, Ad-CAAT, Ad-TATA, Ad-CAAT-TATA 및 Ad-CAAT-mTATA로부터 생성된 세포독성의 비교를 기재한다.
HCT116 세포 (인간 결장암 세포), Panc1 세포 및 A549 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 Ad-Δ350으로 감염시켰다. 세포를 지정된 MOI에서 감염시키거나 또는 비-감염된 대조군으로서 유지하였고, 감염 이후 지정된 시점에서 생존가능한 세포를 청색으로 염색하는 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 각각의 암성 세포주는 감염 이후 4 내지 5일째에 대규모 세포 사멸을 나타내었다.
암성 세포주의 패널을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 Ad-CAAT, Ad-TATA, Ad-CAAT-TATA 또는 Ad-CAAT-mTATA로 감염시켰다. 패널은 A549, Panc1, HCT116, Hep3b, ADS-12m ASPC 1, HT-29 및 MeWo 세포를 포함하였다. 세포를 5의 MOI에서 감염시키고, 감염 이후 3-4일째에 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 대조군으로서, 세포주를 감염시키지 않거나 또는 이전에 기재된 종양용해성 바이러스 Ad-TAV-Δ19k로 감염시켜서 배양하였다. 결과는 도 5-11에 제시되어 있다. 모든 인간 암성 세포주는 감염 후에, 특히 감염 이후 5일째까지 대규모 세포 사멸을 나타낸 반면에, 마우스 세포주 ADS-12는 각각의 바이러스로 감염된 후에 가변적인 세포 사멸을 나타내었다.
비-암성 MRC5 세포 (인간 폐 섬유모세포) 및 WI38 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 Ad-Δ350 또는 Ad-TAV로 감염시켰다. 세포를 지정된 MOI에서 감염시키고, 감염 10일 후에 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 도 4b에 도시된 바와 같이, 감염 이후 4-5일 이내에 사멸한 암성 세포와는 대조적으로, 비-암성 세포는 감염 이후 10일째까지 생존가능하게 유지되었다.
비-암성 WI38 세포를 3 및 5 MOI에서 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 Ad-CAAT, Ad-TATA, Ad-CAAT-TATA, Ad-Δ350 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염시키고, 감염 이후 제4일 (도 12) 또는 제6일 (도 13)에 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 결과는 각각의 바이러스로 감염된 후에 최소의 세포독성이 있었음을 입증한다.
종합하면, 이들 결과는, E1a TATA 박스를 비롯하여 Ad5에서 200개 뉴클레오티드 영역이 비-암성 세포에서는 Ad5-매개된 세포독성을 위해 필요하지만, 이 영역이 종양 세포에서는 Ad5-매개된 세포독성을 위해 불필요함을 나타낸다. 유사하게, TATA 박스 단독, CAAT 박스 단독, 또는 TATA 및 CAAT 박스 둘 다의 E1a 프로모터에서 결실을 갖는 Ad5 바이러스는 암-선택적 세포독성을 나타내었다.
실시예 4: 정상 및 암성 세포에서 Ad-Δ350으로부터 치료적 트랜스진 발현
Δ350 결실을 보유한 아데노바이러스가 바이러스 E1b-19k 유전자 대신에 치료적 트랜스진으로 무장되는 능력에 대해 추가로 연구하였다. 하기 바이러스를 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하였다: Δ350 결실을 보유하고, 임의의 트랜스진의 후속적인 삽입없이 결실된 19k 영역을 갖는 바이러스 Ad-Δ350-Δ19k; Δ350 결실을 보유하고, SalI와 XhoI 사이의 E1b-19k 영역에 클로닝된 마우스 GM-CSF에 대한 유전자를 보유하는 바이러스 Ad-Δ350-mGM-CSF; 및 TAV-255 결실을 보유하고, 임의의 트랜스진의 후속적인 삽입없이 결실된 19k 영역을 갖는 바이러스 Ad-TAV-Δ19k.
암성 Panc1 세포, A549 세포 및 ADS12 세포 (마우스 폐 암종)를 지정된 MOI에서 Ad-Δ350-Δ19k로 감염시키고, 감염 5일 후에 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, 암성 세포주는 용량-의존적 방식으로 사멸하였다.
암성 Panc1 세포, A549 세포 및 ADS12 세포를 지정된 MOI에서 Ad-Δ350-mGM-CSF로 감염시키고, 감염 5일 후에 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 도 15에 제시된 바와 같이, 마우스 GM-CSF에 대한 유전자를 보유하는 바이러스는 종양용해 활성을 나타내었다.
A549, HCT116, Hep3b 및 MeWo 세포를 5의 MOI에서 Ad-Δ350-mGM-CSF, Ad-Δ350-Δ19k 및 Ad-TAV-Δ19k로 감염시키고, 감염 3 내지 5일 후에 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 도 16-21에 제시된 바와 같이, Ad-Δ350-mGM-CSF는 Ad-Δ350-Δ19k 및 Ad-TAV-Δ19k에 필적하는 세포용해 활성을 유지하였다.
A549 세포를 10 MOI에서 Ad-Δ350-Δ19k 또는 Ad-Δ350-mGM-CSF 바이러스로 감염시켰다. 감염 4일 후에 조건화된 배지를 mGM-CSF에 대한 ELISA에서 사용하였다. 도 22에 제시된 바와 같이, Ad-Δ350-mGM-CSF는 mGM-CSF의 발현을 유도하였다.
ADS12 세포를 지정된 MOI에서 Ad-Δ350-Δ19k 또는 Ad-Δ350-mGM-CSF로 감염시키고, 감염 4일 후에 조건화된 배지를 mGM-CSF에 대한 ELISA에서 사용하였다. 도 23에 제시된 바와 같이, Ad-Δ350-mGM-CSF는 이 마우스 암 세포주에서 mGM-CSF의 발현을 유도하였다.
종합하면, 이들 결과는, E1a TATA 및 CAAT 박스를 비롯하여 Ad5에서 200개 뉴클레오티드 영역이 비-암성 세포에서는 E1b-19k 발현 부위로부터 치료적 트랜스진 발현을 위해 필요하지만, 이 영역이 종양 세포에서는 E1b-19k 발현 부위로부터 치료적 트랜스진 발현을 위해 불필요함을 나타낸다.
실시예 5: Ad-Δ350의 항암 활성
이 실시예는 실시예 1에 기재된 바와 같이 생산된 TATA 박스 및/또는 CAAT 박스 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스의 항암 활성을 기재한다.
마우스 (균주 129S4)에게 ADS-12 세포 (마우스 폐암)를 피하 주사하여, 종양을 형성하게 하였다. 종양이 대략 50-100 mm3의 부피에 도달한 후에, 마우스를 Ad-Δ350-Δ19k, Ad-TAV-Δ19k (효과적인 종양용해성 바이러스를 위한 양성 대조군으로서), 또는 완충제 (음성 대조군으로서)로의 치료에 대해 무작위화하였다. 3회 투약으로 4일마다 제공되는 지정된 치료의 종양내 주사를 마우스에게 투약하였다. 도 24에 제시된 바와 같이, 완충제로 치료한 마우스는 신속한 종양 성장을 갖는 반면에, Ad-Δ350-Δ19k 또는 Ad-TAV-Δ19k로 치료한 마우스는 그들의 종양 크기에서 감소를 나타내었고, 여러 경우에 검출가능한 잔류 종양이 없었다.
이 결과는, 바이러스 E1A 유전자에 대한 프로모터의 CAAT 박스 및 TATA 박스 둘 다를 제거하는 결실을 보유한 Ad-Δ350-Δ19k가 효과적인 암 치료임을 시사한다.
실시예 6: Ad35에서 TATA 박스 결실
이 실시예는 TATA 박스를 포함하는 E1a 프로모터 영역에서 결실을 갖는 재조합 유형 35 (Ad35) 아데노바이러스의 생산을 기재한다.
아데노바이러스 유형 35 (Ad35)의 E1a 프로모터는 서열식별번호: 24의 뉴클레오티드 477 내지 484에 상응하는 뉴클레오티드에서 TATA 박스를 함유한다.
TTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCTAGGGTATTTATACCTCAGGGTTTGTGTCAAGAGGCCACTCTT (서열식별번호: 18; TATA 박스는 밑줄침)의 천연 서열을 TTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCTAGGGCCTCAGGGTTTGTGTCAAGAGGCCACTCTT (서열식별번호: 19)로 전환시킴으로써, TATA 박스가 결실된 재조합 Ad35 아데노바이러스를 생성하였다.
HEK-293 세포를 TATA-결실된 Ad35 바이러스에 대한 게놈으로 형질감염시켰고, 도 25에 제시된 바와 같이 이는 바이러스 성장을 나타내는 세포변성 효과를 나타내었다. 이들 결과는, TATA 박스를 결실시켜 생성된 재조합 Ad35 아데노바이러스가가 종양용해성 바이러스로서 적합할 수 있음을 시사한다.
참조로의 포함
본원에서 언급된 각각의 특허 문헌 및 과학 기사의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
등가물
본 발명은 그의 개념 또는 필수 특징으로부터 벗어나지 않고 다른 특정한 형태로 실시될 수 있다. 따라서, 상기 실시양태는 본원에 기재된 본 발명을 제한하기 보다는 오히려 모든 측면에서 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 설명에 의해서가 아니라 첨부된 청구범위에 의해 지정되고, 청구범위의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화가 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> EpicentRx, Inc. <120> TUMOR SELECTIVE TATA-BOX AND CAAT-BOX MUTANTS <130> RDX-025PC <150> US62/452,075 <151> 2017-01-30 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canonical TATA box <400> 1 tataaa 6 <210> 2 <211> 9905 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pXC1 vector plasmid <400> 2 cccttccagc tctctgcccc ttttggattg aagccaatat gataatgagg gggtggagtt 60 tgtgacgtgg cgcggggcgt gggaacgggg cgggtgacgt agtagtgtgg cggaagtgtg 120 atgttgcaag tgtggcggaa cacatgtaag cgacggatgt ggcaaaagtg acgtttttgg 180 tgtgcgccgg tgtacacagg aagtgacaat tttcgcgcgg ttttaggcgg atgttgtagt 240 aaatttgggc gtaaccgagt aagatttggc cattttcgcg ggaaaactga ataagaggaa 300 gtgaaatctg aataattttg tgttactcat agcgcgtaat atttgtctag ggccgcgggg 360 actttgaccg tttacgtgga gactcgccca ggtgtttttc tcaggtgttt tccgcgttcc 420 gggtcaaagt tggcgtttta ttattatagt cagctgacgt gtagtgtatt tatacccggt 480 gagttcctca agaggccact cttgagtgcc agcgagtaga gttttctcct ccgagccgct 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ccaaccctgt atgccatctt ccagcagagt cggggtcaag agcaggaact gaaaataaaa 26340 aaccgatctc tgcgttcgct caccagaagt tgtttgtatc acaagagcga agatcaactt 26400 cagcgcactc tcgaggacgc cgaggctctc ttcaacaagt actgcgcgct gactcttaaa 26460 gagtaggcag cgaccgcgct tattcaaaaa aggcgggaat tacatcatcc tcgacatgag 26520 taaagaaatt cccacgcctt acatgtggag ttatcaaccc caaatgggat tggcagcagg 26580 cgcctcccag gactactcca cccgcatgaa ttggctcagc gccgggcctt ctatgatttc 26640 tcgagttaat gatatacgcg cctaccgaaa ccaaatactt ttggaacagt cagctcttac 26700 caccacgccc cgccaacacc ttaatcccag aaattggccc gccgccctag tgtaccagga 26760 aagtcccgct cccaccactg tattacttcc tcgagacgcc caggccgaag tccaaatgac 26820 taatgcaggt gcgcagttag ctggcggctc caccctatgt cgtcacaggc ctcggcataa 26880 tataaaacgc ctgatgatca gaggccgagg tatccagctc aacgacgagt cggtgagctc 26940 tccgcttggt ctacgaccag acggaatctt tcagattgcc ggctgcggga gatcttcctt 27000 cacccctcgt caggctgttc tgactttgga aagttcgtct tcgcaacccc gctcgggcgg 27060 aatcgggacc gttcaatttg tagaggagtt tactccctct gtctacttca accccttctc 27120 cggatctcct gggcactacc cggacgagtt cataccgaac ttcgacgcga ttagcgagtc 27180 agtggacggc tacgattgat gtctggtgac gcggctgagc tatctcggct gcgacatcta 27240 gaccactgcc gccgctttcg ctgctttgcc cgggaactta ttgagttcat ctacttcgaa 27300 ctccccaagg atcaccctca aggtccggcc cacggagtgc ggattactat cgaaggcaaa 27360 atagactctc gcctgcaacg aattttctcc cagcggcccg tgctgatcga gcgagaccag 27420 ggaaacacca cggtttccat ctactgcatt tgtaatcacc ccggattgca tgaaagcctt 27480 tgctgtctta tgtgtactga gtttaataaa aactgaatta agactctcct acggactgcc 27540 gcttcttcaa cccggatttt acaaccagaa gaacaaaact tttcctgtcg tccaggactc 27600 tgttaacttc acctttccta ctcacaaact agaagctcaa cgactacacc gcttttccag 27660 aagcattttc cctactaata ctactttcaa aaccggaggt gagctccacg gtctccctac 27720 agaaaaccct tgggtggaag cgggccttgt agtactagga attcttgcgg gtgggcttgt 27780 gattattctt tgctacctat acacaccttg cttcactttc ctagtggtgt tgtggtattg 27840 gtttaaaaaa tggggcccat actagtcttg cttgttttac tttcgctttt ggaaccgggt 27900 tctgccaatt acgatccatg tctagacttt gacccagaaa actgcacact tacttttgca 27960 cccgacacaa gccgcatctg tggagttctt attaagtgcg gatgggaatg caggtccgtt 28020 gaaattacac acaataacaa aacctggaac aataccttat ccaccacatg ggagccagga 28080 gttcccgagt ggtacactgt ctctgtccga ggtcctgacg gttccatccg cattagtaac 28140 aacactttca ttttttctga aatgtgcgat ctggccatgt tcatgagcaa acagtattct 28200 ctatggcctc ctagcaagga caacatcgta acgttctcca ttgcttattg cttgtgcgct 28260 tgccttctta ctgctttact gtgcgtatgc atacacctgc ttgtaaccac tcgcatcaaa 28320 aacgccaata acaaagaaaa aatgccttaa cctctttctg tttacagaca tggcttctct 28380 tacatctctc atatttgtca gcattgtcac tgccgctcac ggacaaacag tcgtctctat 28440 cccactagga cataattaca ctctcatagg acccccaatc acttcagagg tcatctggac 28500 caaactggga agcgttgatt actttgatat aatctgtaac aaaacaaaac caataatagt 28560 aacttgcaac atacaaaatc ttacattgat taatgttagc aaagtttaca gcggttacta 28620 ttatggttat gacagataca gtagtcaata tagaaattac ttggttcgtg ttacccagtt 28680 gaaaaccacg aaaatgccaa atatggcaaa gattcgatcc gatgacaatt ctctagaaac 28740 ttttacatct cccaccacac ccgacgaaaa aaacatccca gattcaatga ttgcaattgt 28800 tgcagcggtg gcagtggtga tggcactaat aataatatgc atgcttttat atgcttgtcg 28860 ctacaaaaag tttcatccta aaaaacaaga tctcctacta aggcttaaca tttaatttct 28920 ttttatacag ccatggtttc cactaccaca ttccttatgc ttactagtct cgcaactctg 28980 acttctgctc gctcacacct cactgtaact ataggctcaa actgcacact aaaaggacct 29040 caaggtggtc atgtcttttg gtggagaata tatgacaatg gatggtttac aaaaccatgt 29100 gaccaacctg gtagattttt ctgcaacggc agagacctaa ccattatcaa cgtgacagca 29160 aatgacaaag gcttctatta tggaaccgac tataaaagta gtttagatta taacattatt 29220 gtactgccat ctaccactcc agcaccccgc acaactactt tctctagcag cagtgtcgct 29280 aacaatacaa tttccaatcc aacctttgcc gcgcttttaa aacgcactgt gaataattct 29340 acaacttcac atacaacaat ttccacttca acaatcagca tcatcgctgc agtgacaatt 29400 ggaatatcta ttcttgtttt taccataacc tactacgcct gctgctatag aaaagacaaa 29460 cataaaggtg atccattact tagatttgat atttaatttg ttcttttttt ttatttacag 29520 tatggtgaac accaatcatg gtacctagaa atttcttctt caccatactc atctgtgctt 29580 ttaatgtttg cgctactttc acagcagtag ccacagcaac cccagactgt ataggagcat 29640 ttgcttccta tgcacttttt gcttttgtta cttgcatctg cgtatgtagc atagtctgcc 29700 tggttattaa ttttttccaa cttctagact ggatccttgt gcgaattgcc tacctgcgcc 29760 accatcccga ataccgcaac caaaatatcg cggcacttct tagactcatc taaaaccatg 29820 caggctatac taccaatatt tttgcttcta ttgcttccct acgctgtctc aaccccagct 29880 gcctatagta ctccaccaga acaccttaga aaatgcaaat tccaacaacc gtggtcattt 29940 cttgcttgct atcgagaaaa atcagaaatc cccccaaatt taataatgat tgctggaata 30000 attaatataa tctgttgcac cataatttca tttttgatat accccctatt tgattttggc 30060 tggaatgctc ccaatgcaca tgatcatcca caagacccag aggaacacat tcccccacaa 30120 aacatgcaac atccaatagc gctaatagat tacgaaagtg aaccacaacc cccactactc 30180 cctgctatta gttacttcaa cctaaccggc ggagatgact gaaacactca ccacctccaa 30240 ttccgccgag gatctgctcg atatggacgg ccgcgtctca gaacaacgac ttgcccaact 30300 acgcatccgc cagcagcagg aacgcgtggc caaagagctc agagatgtca tccaaattca 30360 ccaatgcaaa aaaggcatat tctgtttggt aaaacaagcc aagatatcct acgagatcac 30420 cgctactgac catcgcctct cttacgaact tggcccccaa cgacaaaaat ttacctgcat 30480 ggtgggaatc aaccccatag ttatcaccca acaaagtgga gatactaagg gttgcattca 30540 ctgctcctgc gattccatcg agtgcaccta caccctgctg aagaccctat gcggcctaag 30600 agacctgcta ccaatgaatt aaaaaaaaat gattaataaa aaatcactta cttgaaatca 30660 gcaataaggt ctctgttgaa attttctccc agcagcacct cacttccctc ttcccaactc 30720 tggtattcta aaccccgttc agcggcatac tttctccata ctttaaaggg gatgtcaaat 30780 tttagctcct ctcctgtacc cacaatcttc atgtctttct tcccagatga ccaagagagt 30840 ccggctcagt gactccttca accctgtcta cccctatgaa gatgaaagca cctcccaaca 30900 cccctttata aacccagggt ttatttcccc aaatggcttc acacaaagcc cagacggagt 30960 tcttacttta aaatgtttaa ccccactaac aaccacaggc ggatctctac agctaaaagt 31020 gggaggggga cttacagtgg atgacactga tggtacctta caagaaaaca tacgtgctac 31080 agcacccatt actaaaaata atcactctgt agaactatcc attggaaatg gattagaaac 31140 tcaaaacaat aaactatgtg ccaaattggg aaatgggtta aaatttaaca acggtgacat 31200 ttgtataaag gatagtatta acaccttatg gactggaata aaccctccac ctaactgtca 31260 aattgtggaa aacactaata caaatgatgg caaacttact ttagtattag taaaaaatgg 31320 agggcttgtt aatggctacg tgtctctagt tggtgtatca gacactgtga accaaatgtt 31380 cacacaaaag acagcaaaca tccaattaag attatatttt gactcttctg gaaatctatt 31440 aactgaggaa tcagacttaa aaattccact taaaaataaa tcttctacag cgaccagtga 31500 aactgtagcc agcagcaaag cctttatgcc aagtactaca gcttatccct tcaacaccac 31560 tactagggat agtgaaaact acattcatgg aatatgttac tacatgacta gttatgatag 31620 aagtctattt cccttgaaca tttctataat gctaaacagc cgtatgattt cttccaatgt 31680 tgcctatgcc atacaatttg aatggaatct aaatgcaagt gaatctccag aaagcaacat 31740 agctacgctg accacatccc cctttttctt ttcttacatt acagaagacg acaactaaaa 31800 taaagtttaa gtgtttttat ttaaaatcac aaaattcgag tagttatttt gcctccacct 31860 tcccatttga cagaatacac caatctctcc ccacgcacag ctttaaacat ttggatacca 31920 ttagagatag acattgtttt agattccaca ttccaaacag tttcagagcg agccaatctg 31980 gggtcagtga tagataaaaa tccatcgcga tagtctttta aagcgctttc acagtccaac 32040 tgctgcggat gcgactccgg agtttggatc acggtcatct ggaagaagaa cgatgggaat 32100 cataatccga aaacggtatc ggacgattgt gtctcatcaa acccacaagc agccgctgtc 32160 tgcgtcgctc cgtgcgactg ctgtttatgg gatcagggtc cacagtttcc tgaagcatga 32220 ttttaatagc ccttaacatc aactttctgg tgcgatgcgc gcagcaacgc attctgattt 32280 cactcaaatc tttgcagtag gtacaacaca ttattacaat attgtttaat aaaccataat 32340 taaaagcgct ccagccaaaa ctcatatctg atataatcgc ccctgcatga ccatcatacc 32400 aaagtttaat ataaattaaa tgacgttccc tcaaaaacac actacccaca tacatgatct 32460 cttttggcat gtgcatatta acaatctgtc tgtaccatgg acaacgttgg ttaatcatgc 32520 aacccaatat aaccttccgg aaccacactg ccaacaccgc tcccccagcc atgcattgaa 32580 gtgaaccctg ctgattacaa tgacaatgaa gaacccaatt ctctcgaccg tgaatcactt 32640 gagaatgaaa aatatctata gtggcacaac atagacataa atgcatgcat cttctcataa 32700 tttttaactc ctcaggattt agaaacatat cccagggaat aggaagctct tgcagaacag 32760 taaagctggc agaacaagga agaccacgaa cacaacttac actatgcata gtcatagtat 32820 cacaatctgg caacagcggg tggtcttcag tcatagaagc tcgggtttca ttttcctcac 32880 aacgtggtaa ctgggctctg gtgtaagggt gatgtctggc gcatgatgtc gagcgtgcgc 32940 gcaaccttgt cataatggag ttgcttcctg acattctcgt attttgtata gcaaaacgcg 33000 gccctggcag aacacactct tcttcgcctt ctatcctgcc gcttagcgtg ttccgtgtga 33060 tagttcaagt acagccacac tcttaagttg gtcaaaagaa tgctggcttc agttgtaatc 33120 aaaactccat cgcatctaat tgttctgagg aaatcatcca cggtagcata tgcaaatccc 33180 aaccaagcaa tgcaactgga ttgcgtttca agcaggagag gagagggaag agacggaaga 33240 accatgttaa tttttattcc aaacgatctc gcagtacttc aaattgtaga tcgcgcagat 33300 ggcatctctc gcccccactg tgttggtgaa aaagcacagc taaatcaaaa gaaatgcgat 33360 tttcaaggtg ctcaacggtg gcttccaaca aagcctccac gcgcacatcc aagaacaaaa 33420 gaataccaaa agaaggagca ttttctaact cctcaatcat catattacat tcctgcacca 33480 ttcccagata attttcagct ttccagcctt gaattattcg tgtcagttct tgtggtaaat 33540 ccaatccaca cattacaaac aggtcccgga gggcgccctc caccaccatt cttaaacaca 33600 ccctcataat gacaaaatat cttgctcctg tgtcacctgt agcgaattga gaatggcaac 33660 atcaattgac atgcccttgg ctctaagttc ttctttaagt tctagttgta aaaactctct 33720 catattatca ccaaactgct tagccagaag ccccccggga acaagagcag gggacgctac 33780 agtgcagtac aagcgcagac ctccccaatt ggctccagca aaaacaagat tggaataagc 33840 atattgggaa ccaccagtaa tatcatcgaa gttgctggaa atataatcag gcagagtttc 33900 ttgtagaaat tgaataaaag aaaaatttgc caaaaaaaca ttcaaaacct ctgggatgca 33960 aatgcaatag gttaccgcgc tgcgctccaa cattgttagt tttgaattag tctgcaaaaa 34020 taaaaaaaaa acaagcgtca tatcatagta gcctgacgaa caggtggata aatcagtctt 34080 tccatcacaa gacaagccac agggtctcca gctcgaccct cgtaaaacct gtcatcgtga 34140 ttaaacaaca gcaccgaaag ttcctcgcgg tgaccagcat gaataagtct tgatgaagca 34200 tacaatccag acatgttagc atcagttaag gagaaaaaac agccaacata gcctttgggt 34260 ataattatgc ttaatcgtaa gtatagcaaa gccacccctc gcggatacaa agtaaaaggc 34320 acaggagaat aaaaaatata attatttctc tgctgctgtt taggcaacgt cgcccccggt 34380 ccctctaaat acacatacaa agcctcatca gccatggctt accagagaaa gtacagcggg 34440 cacacaaacc acaagctcta aagtcactct ccaacctctc cacaatatat atacacaagc 34500 cctaaactga cgtaatggga ctaaagtgta aaaaatcccg ccaaacccaa cacacacccc 34560 gaaactgcgt caccagggaa aagtacagtt tcacttccgc aatcccaaca agcgtcactt 34620 cctctttctc acggtacgtc acatcccatt aacttacaac gtcattttcc cacggccgcg 34680 ccgccccttt taaccgttaa ccccacagcc aatcaccaca cggcccacac tttttaaaat 34740 cacctcattt acatattggc accattccat ctataaggta tattattgat gatg 34794 <210> 25 <211> 548 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pXC1-CAAT-mTATA 5' end <400> 25 cccttccagc tctctgcccc ttttggattg aagccaatat gataatgagg gggtggagtt 60 tgtgacgtgg cgcggggcgt gggaacgggg cgggtgacgt agtagtgtgg cggaagtgtg 120 atgttgcaag tgtggcggaa cacatgtaag cgacggatgt ggcaaaagtg acgtttttgg 180 tgtgcgccgg tgtacacagg aagtgacaat tttcgcgcgg ttttaggcgg atgttgtagt 240 aaatttgggc gtaaccgagt aagatttggc cattttcgcg ggaaaactga ataagaggaa 300 gtgaaatctg aataattttg tgttactcat agcgcgtaat atttgtctag ggccgcgggg 360 actttgaccg tttacgtgga gactcgccca ggtgtttttc tcaggtgttt tccgcgttcc 420 gtggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat tcccggtgag ttcctcaaga 480 ggccactctt gagtgccagc gagtagagtt ttctcctccg agccgctccg acaccgggac 540 tgaaaatg 548 <210> 26 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ad-CAAT-mTATA 5' end <400> 26 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360 gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420 cgtggcgttt tattattata gtcagctgac gtgtagtgta ttcccggtga gttcctcaag 480 aggccactct tgagtgccag cgagtagagt tttctcctcc gagccgctcc gacaccggga 540 ctgaaaatg 549 <210> 27 <211> 562 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 27 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360 gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420 cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480 tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540 tccgacaccg ggactgaaaa tg 562

Claims (87)

  1. (i) 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 TATA 박스-기반 프로모터로서, 기능적 TATA 박스를 결여하고 과다증식성 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하는 변형된 TATA 박스-기반 프로모터; 및/또는 (ii) 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터로서, 기능적 CAAT 박스를 결여하고 과다증식성 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하는 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스.
  2. 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 TATA 박스-기반 프로모터로서, 기능적 TATA 박스를 결여하고 과다증식성 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하는 변형된 TATA 박스-기반 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스.
  3. 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터로서, 기능적 CAAT 박스를 결여하고 과다증식성 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하는 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터를 포함하는 재조합 바이러스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 재조합 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 단순 포진 바이러스 1 (HSV1), 점액종 바이러스, 레오바이러스, 폴리오바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 홍역 바이러스 (MV), 및 뉴캐슬병 바이러스 (NDV)로부터 선택되는 것인 재조합 바이러스.
  5. 제4항에 있어서, 재조합 바이러스가 재조합 아데노바이러스인 재조합 바이러스.
  6. 제5항에 있어서, 재조합 바이러스가 유형 5 아데노바이러스 및 유형 35 아데노바이러스로부터 선택되는 것인 재조합 바이러스.
  7. 제6항에 있어서, 아데노바이러스가 유형 5 아데노바이러스인 재조합 바이러스.
  8. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터가 초기 유전자 프로모터인 재조합 바이러스.
  9. 제8항에 있어서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터가 E1a 프로모터, E1b 프로모터 또는 E4 프로모터인 재조합 바이러스.
  10. 제9항에 있어서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터가 E1a 프로모터인 재조합 바이러스.
  11. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형이 전체 TATA 박스의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 E1a 프로모터의 -27 내지 -24에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  13. 제12항에 있어서, 바이러스가 E1a 프로모터의 -31 내지 -24에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  14. 제13항에 있어서, 바이러스가 E1a 프로모터의 -44 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  15. 제14항에 있어서, 바이러스가 E1a 프로모터의 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8)의 472 내지 475에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  17. 제16항에 있어서, 바이러스가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8)의 468 내지 475에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  18. 제17항에 있어서, 바이러스가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8)의 455 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  19. 제18항에 있어서, 바이러스가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8)의 353 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 7), AGTGCCCG (서열식별번호: 12) 및/또는 TATTCCCG (서열식별번호: 13)을 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  21. 재조합 바이러스로서, 여기서 바이러스는 E1a 프로모터 영역의 -27 내지 -24에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 유형 5 아데노바이러스인 재조합 바이러스.
  22. 제21항에 있어서, 바이러스가 E1a 프로모터 영역의 -31 내지 -24에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  23. 제22항에 있어서, 바이러스가 E1a 프로모터 영역의 -44 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  24. 제23항에 있어서, 바이러스가 E1a 프로모터 영역의 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  25. 재조합 바이러스로서, 여기서 바이러스는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8)의 472 내지 475에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 유형 5 아데노바이러스인 재조합 바이러스.
  26. 제25항에 있어서, 바이러스가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8)의 468 내지 475에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  27. 제26항에 있어서, 바이러스가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8)의 455 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  28. 제27항에 있어서, 바이러스가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8)의 353 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  29. 재조합 바이러스로서, 여기서 바이러스는 유형 5 아데노바이러스이며, 여기서 바이러스는 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 7), AGTGCCCG (서열식별번호: 12) 또는 TATTCCCG (서열식별번호: 13)을 포함하는 유형 5 아데노바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  30. 재조합 바이러스로서, 여기서 바이러스는 유형 5 아데노바이러스이며, 여기서 바이러스는 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 7)을 포함하는 유형 5 아데노바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  31. 제1항 및 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터가 초기 유전자 프로모터인 재조합 바이러스.
  32. 제31항에 있어서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터가 E1a 프로모터, E1b 프로모터 또는 E4 프로모터인 재조합 바이러스.
  33. 제32항에 있어서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터가 E1a 프로모터인 재조합 바이러스.
  34. 제1항, 제3항 내지 제20항 및 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형이 전체 CAAT 박스의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 E1a 프로모터의 -76 내지 -68에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  36. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8)의 423 내지 431에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 서열 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 14)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  38. 재조합 바이러스로서, 여기서 바이러스는 E1a 프로모터 영역의 -76 내지 -68에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 유형 5 아데노바이러스인 재조합 바이러스.
  39. 재조합 바이러스로서, 여기서 바이러스는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 8)의 423 내지 431에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 유형 5 아데노바이러스인 재조합 바이러스.
  40. 재조합 바이러스로서, 여기서 바이러스는 유형 5 아데노바이러스이며, 여기서 바이러스는 서열 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 14)를 포함하는 유형 5 아데노바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 Ad35 게놈 (서열식별번호: 24)의 477 내지 484에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
  42. 재조합 바이러스로서, 여기서 바이러스는 Ad35 게놈 (서열식별번호: 24)의 477 내지 484에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 유형 35 아데노바이러스인 재조합 바이러스.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터 또는 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형이 별도의 기능적 프로모터 서열의 부가 또는 그로의 치환을 포함하지 않는 것인 재조합 바이러스.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 바이러스.
  45. 제44항에 있어서, 치료적 트랜스진이 종양단백질, 종양 억제 폴리펩티드, 효소, 시토카인, 면역 조정 폴리펩티드, 항체, 용해성 펩티드, 백신 항원, 체세포에서의 유전자 결함을 보완하는 폴리펩티드, 및 세포 사멸을 유도하는 과정을 촉매하는 폴리펩티드로부터 선택된 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 것인 재조합 바이러스.
  46. 제44항에 있어서, 치료적 트랜스진이 아폽토시스제, 항체, CTL 반응성 펩티드, 시토카인, 세포용해제, 세포독성제, 효소, 종양 세포의 표면 상에서 발현되어 면역 반응을 도출하는 이종성 항원, 면역자극 또는 면역조정 작용제, 인터페론, 용해성 펩티드, 종양단백질, 세포 사멸을 유도하는 과정을 촉매하는 폴리펩티드, 체세포에서의 유전자 결함을 보완하는 폴리펩티드, 종양 억제 단백질, 백신 항원, 및 이들의 임의의 조합물로부터 선택된 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 것인 재조합 바이러스.
  47. 제44항에 있어서, 치료적 트랜스진이 아세틸콜린, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄, BORIS/CTCFL, CD19, CD20, CD80, CD86, CD137L, CD154, DKK1/Wnt, ICAM-1, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-17, IL-23, IL-23A/p19, 인터페론-감마, TGF-β, TGF-β 트랩, FGF, IL-24, IL-27, IL-35, MAGE, NY-ESO-1, p53, 및 티미딘 키나제로부터 선택된 치료적 폴리펩티드을 코딩하는 것인 재조합 바이러스.
  48. 제44항에 있어서, 치료적 트랜스진이 TGF-β 트랩을 코딩하는 것인 재조합 바이러스.
  49. 제44항에 있어서, 치료적 트랜스진이 안티센스 RNA 및 리보자임으로부터 선택된 치료적 핵산을 코딩하는 것인 재조합 바이러스.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 E1b-19K 및 E1b-55K 시작 부위를 포함하고, 치료적 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 E1b-19K의 시작 부위와 E1b-55K의 시작 부위 사이에 삽입되는 것인 재조합 바이러스.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 과다증식성 세포에서 선택적으로 복제하는 것인 재조합 바이러스.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 비-성장 정지된 세포에서 선택적으로 복제하는 것인 재조합 바이러스.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 과다증식성 세포에서 세포용해 활성을 선택적으로 갖는 것인 재조합 바이러스.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 비-성장 정지된 세포에서 세포용해 활성을 선택적으로 갖는 것인 재조합 바이러스.
  55. 제5항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 과다증식성 세포에서 E1a 및/또는 E1b를 선택적으로 발현하는 것인 재조합 바이러스.
  56. 제5항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 비-성장 정지된 세포에서 E1a 및/또는 E1b를 선택적으로 발현하는 것인 재조합 바이러스.
  57. 제44항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 과다증식성 세포에서 치료적 트랜스진을 선택적으로 발현하는 것인 재조합 바이러스.
  58. 제44항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스가 비-성장 정지된 세포에서 치료적 트랜스진을 선택적으로 발현하는 것인 재조합 바이러스.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 과다증식성 세포가 암 세포, 내피 세포, 표피 세포, 섬유모세포, 및/또는 면역 세포인 재조합 바이러스.
  60. 제59항에 있어서, 과다증식성 세포가 암 세포인 재조합 바이러스.
  61. 제60항에 있어서, 암 세포가 항문암, 기저 세포 암종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 암종, 담관암종, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 위식도암, 위장 (GI) 암, 위장관 간질 종양, 간세포성 암종, 부인과암, 두경부암, 혈액암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 신경내분비암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 소아암, 전립선암, 신세포 암종, 육종, 피부암, 소세포 폐암, 피부의 편평 상피 암종, 위암, 고환암 및 갑상선암 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 바이러스.
  62. 제60항에 있어서, 암 세포가 폐암 세포, 결장암 세포, 및 췌장암 세포로부터 선택되는 것인 재조합 바이러스.
  63. 재조합 바이러스로서, 과다증식성 세포에서 상기 바이러스의 선택적 발현을 허용하는 변형된 또는 결실된 바이러스 조절 서열을 포함하는 재조합 바이러스.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스 및 적어도 1종의 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
  65. 표적 세포를 제44항 내지 제63항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스의 유효량에 노출시켜 표적 트랜스진을 발현하는 것을 포함하는, 표적 세포에서 치료적 트랜스진을 발현하는 방법.
  66. 종양 세포를 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스의 유효량에 노출시켜 종양 세포의 증식을 억제하는 것을 포함하는, 종양 세포의 증식을 억제하는 방법.
  67. 종양 성장의 억제가 필요한 대상체에게 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스의 유효량을 투여하여 종양의 증식을 억제하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법.
  68. 암의 치료가 필요한 대상체에게 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스의 유효량을 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 암이 흑색종, 피부의 편평 상피 암종, 기저 세포 암종, 두경부암, 유방암, 항문암, 자궁경부암, 비소세포 폐암, 중피종, 소세포 폐암, 신세포 암종, 전립선암, 위식도암, 결장직장암, 고환암, 방광암, 난소암, 간세포성 암종, 담관암종, 뇌암, 자궁내막암, 신경내분비암, 메르켈 세포 암종, 위장관 간질 종양, 육종, 및 췌장암으로부터 선택되는 것인 방법.
  70. 제68항에 있어서, 암이 항문암, 기저 세포 암종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 암종, 담관암종, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 위식도암, 위장 (GI) 암, 위장관 간질 종양, 간세포성 암종, 부인과암, 두경부암, 혈액암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 신경내분비암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 소아암, 전립선암, 신세포 암종, 육종, 피부암, 소세포 폐암, 피부의 편평 상피 암종, 위암, 고환암 및 갑상선암으로부터 선택되는 것인 방법.
  71. 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스를 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 및 바이러스요법으로부터 선택된 하나 이상의 요법과 조합하여 투여하는 것인 방법.
  72. 과다증식성 질환의 치료가 필요한 대상체에게 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스의 유효량을 투여하여 대상체에서 과다증식성 질환을 치료하는 것을 포함하는, 대상체에서 과다증식성 질환을 치료하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 과다증식성 질환이 아테롬성동맥경화증, 류마티스 관절염, 건선, 루푸스, 특발성 폐 섬유증, 경피증 폐 고혈압, 천식, 신장 섬유증, COPD, 낭성 섬유증, DIP, UIP, 황반 변성, 재협착, 망막병증, 과다증식성 섬유모세포 장애, 경피증, 사구체 신염, 당뇨병성 신병증, 악성 신경화증, 혈전성 미세혈관병증 증후군, 이식 거부, 사구체병증 및 간경변증으로부터 선택되는 것인 방법.
  74. 제72항에 있어서, 과다증식성 질환이 아테롬성동맥경화증, 류마티스 관절염, 건선, 루푸스, 특발성 폐 섬유증, 경피증 및 간경변증으로부터 선택되는 것인 방법.
  75. 제65항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스의 유효량이 102-1015 플라크 형성 단위 (pfu)인 방법.
  76. 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  77. 유전자에 작동가능하게 연결된 바이러스 TATA 박스-기반 프로모터를 변형시켜, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터가 기능적 TATA 박스를 결여하고 과다증식성 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하도록 하는 것을 포함하는, 종양용해성 바이러스를 조작하는 방법.
  78. 유전자에 작동가능하게 연결된 바이러스 CAAT 박스-기반 프로모터를 변형시켜, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터가 기능적 CAAT 박스를 결여하고 과다증식성 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하도록 하는 것을 포함하는, 종양용해성 바이러스를 조작하는 방법.
  79. 유전자에 작동가능하게 연결된 바이러스 TATA 박스-기반 프로모터를 변형시켜, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터가 기능적 TATA 박스를 결여하고 과다증식성 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하도록 하는 것, 및/또는 유전자에 작동가능하게 연결된 바이러스 CAAT 박스-기반 프로모터를 변형시켜, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터가 기능적 CAAT 박스를 결여하고 과다증식성 세포에서 상기 유전자의 선택적 발현을 허용하도록 하는 것을 포함하는, 종양용해성 바이러스를 조작하는 방법.
  80. 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22 및 서열식별번호: 23으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  81. 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  82. 제81항에 있어서, 단리된 핵산이 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  84. (a) 재조합 바이러스를 생산하는 조건 하에 제83항의 숙주 세포를 성장시키고;
    (b) 재조합 바이러스를 정제하는 것
    을 포함하는, 재조합 바이러스를 생산하는 방법.
  85. 제65항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 측정하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  86. 제65항 내지 제76항 및 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 바이러스의 유효량이 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 측정함으로써 확인되는 것인 방법.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 항원에 대한 면역 반응이, 대상체의 피부 상의 주사 부위에서 대상체에게 항원을 주사하고, 주사 부위에서 경화의 크기를 측정함으로써 측정되는 것인 방법.
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