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KR20190012232A - 생체 분자들을 접합시키기 위한 아즈락톤 관능화 기재 - Google Patents

생체 분자들을 접합시키기 위한 아즈락톤 관능화 기재 Download PDF

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KR20190012232A
KR20190012232A KR1020187038177A KR20187038177A KR20190012232A KR 20190012232 A KR20190012232 A KR 20190012232A KR 1020187038177 A KR1020187038177 A KR 1020187038177A KR 20187038177 A KR20187038177 A KR 20187038177A KR 20190012232 A KR20190012232 A KR 20190012232A
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South Korea
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polymer
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palladium
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어텀 마루니악
크리스토퍼 존슨
하비불라 아마드
나데즈다 포미나
샘 카부시
Original Assignee
로베르트 보쉬 게엠베하
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Publication date
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Abstract

2관능성 중합체가, 관심 있는 생체 분자들을 접합시키기 위해 하나의 말단에서 아즈락톤 말단 그룹으로 관능화되고, 상기 중합체를 기재에 부착시키기 위해 또 다른 말단에서 아지드 앵커(anchor) 그룹으로 관능화된다. 상기 2관능성 중합체의 제조방법이 제공된다. 코팅된 기재가 상기 기재의 표면 상에 상기 2관능화 중합체를 포함한다. 상기 코팅된 기재의 제조방법도 제공된다. 마이크로어레이가, 각각의 영역이 상기 코팅된 기재를 포함하는 복수의 개별 영역을 포함한다.

Description

생체 분자들을 접합시키기 위한 아즈락톤 관능화 기재
본 발명의 양태들은, 2관능성 중합체 및 상기 2관능성 중합체의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 2관능성 중합체는 관심 있는 생체 분자들을 접합(conjugation)시키기 위해 하나의 말단에서 아즈락톤 그룹으로 관능화되고, 상기 중합체를 기재에 부착시키기 위해 또 다른 말단에서 아지드 앵커(anchor) 그룹으로 관능화되며, 이러한 관능화는 상기 아지드 그룹이 반응성인 조건 하에서 아즈락톤 관능성이 온전하게 유지되게 한다. 또한, 본 발명의 양태들은 코팅된 기재로서, 당해 기재의 표면 상에 상기 2관능화 중합체를 포함하는 코팅된 기재, 및 상기 코팅된 기재의 제조방법도 제공한다. 또한, 본 발명의 양태들은, 복수의 개별 스팟을 포함하는 마이크로어레이에 관한 것으로, 각각의 스팟은 상기 마이크로어레이의 표면 상에 상기 코팅된 기재를 포함한다.
측정 검정법 또는 플랫폼(measurement assay or platform), 예를 들어 단백질 및 항체 마이크로어레이에서, 표적 분자의 높은 충실도(fidelity)(예를 들어, 감도 및 특이성)를 달성하는 것이 매우 중요하다. 검정에서의 샘플은, 생체 분자, 예를 들어, 핵산, 단백질, 생물학적 세포 및 소형 분자일 수 있으며, 이들은 기타 인간 체액, 예를 들어 혈액, 혈청, 타액 및 소변, 및 소비재(consumable), 예를 들어 우유, 유아식 또는 물을 함께 포함한다. 상기 샘플과 상관없이, 상기 검정법의 기재에 대한 표적 분자의 효율적인 접합은 이러한 검정법에서 보다 높은 충실도를 달성하는 것을 도울 수 있다.
활성화 에스테르(N-하이드록시석신이미드(NHS), 말레이미드, 플루오로페닐), 카바메이트, 카보네이트, 에폭사이드, 및 알데하이드는, 생체 분자를 접합시키기 위해 검정법에서 통상적으로 사용되는 관능 그룹이다. 그러나, 이들 관능 그룹은 낮은 가수분해 안정성으로 인해 곤란을 겪는다. 낮은 가수분해 안정성은, 경쟁하는 가수분해 반응으로 인해 생체 분자의 접합 효율을 최적 이하로 되게 할 수 있으며, 이로 인해 접합되는 생체 분자의 양이 적어지고 접합되는 생체 분자들이 불균일하게 된다.
아즈락톤 그룹은 개환 부가 반응을 통해, 강한 친핵체, 예를 들어 1급 아민, 알콜 및 티올과 반응하는 한편, 중성 pH에서 물에 의한 가수분해에 대한 우수한 내성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Carter, H.E., Chapter 5: "Azlactones," Organic Reactions, John Wiley & Sons, 3: 198-239 (1946) 참조). 아즈락톤 관능화 표면은, 보다 더 높은 안정성 이외에, 주위 조건 하에서 보다 더 오래 보관할 수 있는 반면, 활성화 에스테르, 에폭사이드, 및 알데하이드를 함유하는 표면은 습기 부재 조건(진공 씰링 패키징, 냉동고)에서 보관해야 하고, 주위 온도에 노출시 즉시 사용해야 한다.
"아즈락톤"은 6원 환으로 나타내어질 수 있다:
Figure pct00001
상기 화학식에서,
R1 및 R2는 독립적으로, 수소, 탄소수 1 내지 14의 알킬 그룹, 탄소수 3 내지 14의 사이클로알킬 그룹, 환 원자가 5 내지 12개인 아릴 그룹, 6 내지 26개의 탄소 원자 및 0 내지 3개의 황, 질소, 및 비과산화(nonperoxidic) 산소 헤테로원자를 갖는 아레닐 그룹일 수 있거나, R1 및 R2는 이들이 연결되는 탄소와 함께 4 내지 12개의 환 원자를 포함하는 카보사이클릭 환을 형성할 수 있고;
n은 정수 0 또는 1이다.
n이 0인 경우, 아즈락톤은 5원 환에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure pct00002
상기 화학식에서,
R1 및 R2는 상기 정의된 바와 같다.
이들의 유리하고 독특한 특성으로 인해, 단백질 접합에 사용하기 위한 아즈락톤 관능화 중합체의 제조방법이 공지되어 있다. 미국 특허 제5,321,095호는 단백질-PEG 접합체를 제조하기 위한 목적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 아즈락톤 활성화 폴리알킬렌 옥사이드의 제조방법을 개시한다. 또한, 미국 특허 제4,485,236호 및 제5,013,795호는 라디칼 공정을 통한 아즈락톤 함유 중합체의 제조방법 및 단백질 접합을 위한 아즈락톤 함유 중합체의 용도를 개시한다.
아즈락톤 그룹은 크로마토그래피에서 사용되어 왔다. 문헌[Rasmussen et al., "Crosslinked, hydrophilic, azlactone-functional polymeric beads: A two-step approach," Reactive Polymers, 16(2): 199-212 (1991)]은, 크로마토그래피용 아즈락톤 관능화 중합체 비드를 개시하며, 여기서, 아크릴아미드계 중합체 비드가 라디칼 중합을 통해 제조되고, 아즈락톤 그룹은 아세트산 무수물을 사용하는 펜던트(pendant) 아실아미노산 그룹의 탈수 환화(cyclodehydration)를 통해 도입된다. 문헌[Coleman et al., "Immobilization of Protein A at High Density on Azlactone-functional Polymeric Beads and Their Use in Affinity Chromatography," Journal of Chromatography, 512:345-63 (1990)]은, 친화성 크로마토그래피에서 사용하기 위한, 메틸렌-비스-아크릴아미드와 비닐디메틸 아즈락톤으로부터의 역상 중합에 의해 제조되는 고도로 가교결합된 공중합체 비드를 개시한다.
아즈락톤 그룹은 세포 및 효소 고정 기재에도 사용되어 왔다. 문헌[Buck et al., "Chemical Modification of Reactive Multilayered Films Fabricated from Poly(2-alkenyl azlactone)s: Design of Surfaces That Prevent or Promote Mammalian Cell Adhesion and Bacterial Biofilm Growth," Biomacromolecules, 10(6): 1564-74 (2009)]은, 폴리아민 및 폴리(2-비닐-4,4'-디메틸아즈락톤)(PVDMA)의 적층 형태의 어셈블리(layer-by-layer assembly)를 통해 세포의 부착 및 성장을 방지 또는 촉진시키기 위해 관능화될 수 있는 반응성 중합체 필름을 개시한다. 폴리아민의 아미노 그룹과 PVDMA의 아즈락톤 관능성와의 반응은 필름들의 공유 가교결합을 생성한다. PVDMA의 미반응된 아즈락톤 그룹은 친수성 또는 소수성 모이어티(moiety)를 부착시키기 위해 추가로 사용되어, 세포 접착 또는 표면으로부터의 세포 반발을 촉진시킨다. 문헌[Cullen et al., "Surface-Anchored Poly(2-vinyl-4,4-dimethyl azlactone) Brushes as Templates for Enzyme Immobilization," Langmuir, 24(23): 13701-09 (2008)]은, 원자 이동 라디칼 중합을 통해 유리 표면에 앵커링되는 개시제로부터 PVDMA 브러시를 성장시키는 것을 개시한다.
아즈락톤 그룹은 의료용 이식물에도 사용되어 왔다. 미국 특허 제5,292,514호는, 라디칼 중합을 통한 중합체성 및 올리고머성 비닐디메틸 아즈락톤의 제조 및 포유류 체내 이식물용 코팅제로서의 이들의 용도를 개시한다.
미국 특허 제4,981,933호는 불포화 중합성 아즈락톤 중합체(예를 들어 비닐 아즈락톤) 및 비닐벤질할라이드로부터의, 따라서 이들 2개 모이어티의 각각의 반응 관능성을 갖는 아즈락톤 공중합체의 제조를 개시한다.
미국 특허 제5,344,701호는, 바이오시약(bioreagent)들을 커플링시키기 위해 기존의 지지체 상에 아즈락톤 관능성을 도입하는 몇 가지 방법을 개시한다. 이러한 방법은 비닐-아즈락톤과 후속적으로 반응하는 자유 라디칼을 생성하는 고에너지 방사선, 표면 상에 필름을 형성하기 위한 아즈락톤 단량체들의 화학적 가교결합, 및 지지체의 공극들 내에 관능성 입자들을 생성시키는 분산 중합을 포함한다.
본 발명의 특정한 예시적인 양태들에 대한 요약이 하기에 기재된다. 이들 양태들은 독자에게 이들 특정 양태들에 대한 간략한 요약을 제공하기 위한 것일 뿐이며, 이들 양태는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 본 발명은 이하에 기재되지 않을 수 있는 다양한 양태를 포함할 수 있다.
측정 플랫폼 또는 검정법에서의 아즈락톤 관능화 표면은 우수한 명도 및 균일성을 갖는 스팟을 잠재적으로(potentially) 생성할 수 있다. 아즈락톤 관능화 표면의 물에 의한 가수분해에 대한 보다 더 높은 안정성으로 인해, 스팟팅의 재현성 또한 잠재적으로 향상될 수 있다. 그러나, 측정 플랫폼 또는 검정법에서 아즈락톤 그룹을 사용하기 위해서는, 아즈락톤 관능화 중합체가 아즈락톤 그룹의 관능성이 손상되지 않으면서 상기 표면 또는 기재에 고정되어야 한다. 달리 말하자면, 제2 관능 그룹은, 아즈락톤 관능화 중합체를 상기 표면 또는 기재에 부착시켜야 하지만, 관심 있는 생체 분자에 대한 아즈락톤 그룹의 접합능을 방해해서는 안된다.
따라서, 본 발명의 예시적인 양태들은, 생체 분자들을 접합시키기 위한 아즈락톤 그룹, 및 생체 적합성 표면을 생성하기 위해 아즈락톤 관능화 중합체를 기재 상에 고정시키기 위한 부착 그룹 둘 다로 관능화된 중합체를 제공하며, 여기서, 아즈락톤 관능성은 상기 부착 그룹을 반응성으로 만드는 조건 하에 온전하게 유지된다. 예시적인 양태에 따라, PEG는 생체 분자를 접합시키기 위한 아즈락톤 그룹 및 기재에 부착시키기 위한 아지드 그룹으로 관능화된다. 아지드 그룹 및 아즈락톤 그룹은 화학적으로 직교(orthogonal)하기 때문에, 아즈락톤 관능성이 아지드 그룹을 반응성으로 만드는 조건 하에서 온전하게 유지될 것이다. 본 발명의 예시적인 양태들은, 이러한 생체 적합성 표면의 제조방법 및 이러한 생체 적합성 표면을 측정 플랫폼, 예를 들어 단백질 및 항체 마이크로어레이에 기재로서 도입시키는 방법도 제공한다.
본 발명의 예시적인 양태들은, 표면 또는 기재에 앵커링될 수 있는 아즈락톤 관능화 중합체를 제공하며, 여기서, 생성되는 아즈락톤 관능화 표면 또는 기재는 측정 검정법, 예를 들어 단백질 및 항체 마이크로어레이에서 보다 효율적인 생체 분자의 접합을 위해 사용될 수 있다. 이러한 관능화 표면은 미국 특허 출원 일련번호 제14/792,553호, 제14/792,576호, 제14/792,541호, 제14/792,569호 및 제14/792,530호에 개시된 바와 같은 바이오센서 시스템에서 사용될 수 있으며, 상기 문헌들은 이들의 전문이 인용에 의해 본원에 포함된다.
예시적인 양태에 따라, 2관능성 중합체는 다음을 포함한다: (a) 아지드, 카복실산, 티올, 아민, 하이드록실, 하이드라진, 실릴, 포스포네이트, 알킨, 카테콜, 및 리신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 앵커 그룹; (b) PEG 또는 다당류를 포함하는 하나 이상의 제1 중합체를 포함하는 중합체 블록; (c) 페닐, 비닐, 벤질, 및 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 링커(linker) 그룹; 및 (d) R1 및 R2를 포함하는 아즈락톤 말단 그룹으로서, 여기서, R1 및 R2가 각각 독립적으로, 수소, 알킬, 및 아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 상기 아즈락톤 말단 그룹.
일부 예시적인 양태에서, 상기 하나 이상의 제1 중합체는, 폴리리신, 폴리옥사졸린, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리-N-이소프로필아크릴아미드, 폴리도파민, 폴리알칸, 및 N-치환된 글리신 중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제2 중합체와의 공중합체이다.
예시적인 양태에 따라, 코팅된 기재는 다음을 포함한다: (a) 기재; 및 (b) 상기 기재에 부착된 중합체 층으로서, 여기서, 상기 중합체 층은 하나 이상의 제1 중합체, 상기 하나 이상의 제1 중합체 각각의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 아즈락톤 관능 그룹, 및 상기 하나 이상의 제1 중합체 각각의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹을 포함하며, 상기 하나 이상의 아지드 그룹이 상기 중합체 층을 상기 기재에 부착시키는, 상기 중합체 층.
일부 예시적인 양태에서, 상기 기재는, 유리, 실리카, 플라스틱, 탄소, 금속, 및 금속 산화물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 중합체 층은, 선형 중합체, 멀티암(multiarm) 중합체, 브러시 중합체, 또는 나노 입자이다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 하나 이상의 제1 중합체는 PEG 또는 다당류이다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 하나 이상의 제1 중합체는, 폴리리신, 폴리옥사졸린, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리-N-이소프로필아크릴아미드, 폴리도파민, 폴리알칸, 및 N-치환된 글리신 중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제2 중합체와의 공중합체이다.
예시적인 양태에 따라, 마이크로어레이는 복수의 개별 영역을 포함하며, 각각의 개별 영역은 코팅된 기재를 포함하며, 상기 코팅된 기재는 다음을 포함한다: (a) 기재; 및 (b) 중합체 층으로서, 상기 기재에 부착되어 있으며, 하나 이상의 중합체, 상기 하나 이상의 중합체 각각의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 아즈락톤 관능 그룹, 및 상기 하나 이상의 중합체 각각의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹을 포함하며, 여기서, 상기 하나 이상의 아지드 그룹이 상기 중합체 층을 상기 기재에 부착시키는, 상기 중합체 층.
예시적인 양태에 따라, 2관능성 중합체의 제조방법은 다음을 포함한다: (a) 중합체를 제공하는 단계로서, 상기 중합체가, 상기 중합체의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 카복실산 그룹 또는 활성화 에스테르 그룹, 및 상기 중합체의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹을 함유하는, 상기 중합체를 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 카복실산 그룹 또는 활성화 에스테르 그룹을 아릴 또는 비닐 할라이드 그룹으로 전환시키는 단계; 및 (c) 비닐디알킬 아즈락톤을 상기 아릴 또는 비닐 할라이드 그룹에 부착시키는 단계.
일부 예시적인 양태에서, 상기 중합체는 PEG이다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 비닐디알킬 아즈락톤이 팔라듐 촉매, 하나 이상의 용매, 및 염기를 사용하는 커플링 반응을 통해 부착된다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 팔라듐 촉매는, 팔라듐 (II) 퀴놀린-8-카복실레이트, 팔라듐 (II) 클로라이드, 팔라듐 (II) 브로마이드, 팔라듐 (II) 아세테이트, 팔라듐 (II) 아세토아세테이트, 비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐(0), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0), 팔라듐 (II) 트리플루오로아세테이트, 알릴팔라듐 (II) 클로라이드 이량체, 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 디클로라이드, 디클로로비스(트리사이클로헥실포스핀)팔라듐(II), 및 [1,1'-비스(디-tert-부틸포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 하나 이상의 용매는, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 톨루엔, 테트라하이드로푸란, 디옥산, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 및 알콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 염기는, 탄산칼륨, 탄산나트륨, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 4-(디메틸아미노)피리딘, 칼륨 tert-부톡사이드, 및 나트륨 tert-부톡사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
예시적인 양태에 따라, 2관능성 중합체를 기재에 부착시키는 방법이 제공되며, 상기 2관능성 중합체는 중합체, 상기 중합체의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 아즈락톤 관능 그룹, 및 상기 중합체의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹을 포함하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 알킨 관능 그룹을 포함하는 기재를 제공하는 단계; (b) 상기 2관능성 중합체, 하나 이상의 용매, 촉매, 염기, 및 환원제를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; 및 (c) 상기 기재를 상기 혼합물과 접촉시키는 단계.
일부 예시적인 양태에서, 상기 중합체는 PEG이다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 하나 이상의 용매는 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 톨루엔, 테트라하이드로푸란, 디옥산, 아세토니트릴, 및 물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 촉매는 구리 (II) 염 또는 구리 (I) 염이다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 촉매는 황산구리, 브롬화구리, 및 요오드화구리로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 촉매는 루테늄 촉매이다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 촉매는 펜타메틸사이클로펜타디에닐비스(트리페닐포스핀)루테늄(II) 클로라이드, 펜타메틸사이클로펜타디에닐(사이클로옥타디에닐)루테늄(II) 클로라이드, 및 펜타메틸사이클로펜타디에닐(노르보르나디엔)루테늄(II) 클로라이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 염기는 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 4-(디메틸아미노)피리딘, 피리딘, 퀴놀론, 페난스롤린, 및 이미다졸로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 환원제는 아스코르브산나트륨, 트리스(트리아졸)아민, 및 하이드로퀴논으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
예시적인 양태에 따라, 관심 있는 생체 분자를 단리시키는 방법이 다음을 포함한다: (a) 관능화 기재를 제공하는 단계로서, 상기 관능화 기재가 기재, 하나 이상의 중합체, 상기 하나 이상의 중합체 각각의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 아즈락톤 그룹, 및 상기 하나 이상의 중합체 각각의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹을 포함하고, 상기 하나 이상의 아지드 그룹은 상기 하나 이상의 중합체 각각을 상기 기재에 부착시키는, 상기 관능화 기재의 제공 단계; (b) 상기 관심 있는 생체 분자를 함유하는 수용액을 제공하는 단계; 및 (c) 상기 관능화 기재를 상기 수용액과 일정 시간 기간 동안 접촉시키는 단계로서, 상기 시간 기간 동안 상기 관심 있는 생체 분자가 상기 아즈락톤 그룹에 부착되는, 상기 접촉 단계.
일부 예시적인 양태에서, 상기 수용액이 첨가제를 포함하며, 여기서, 상기 첨가제는, 글리세롤, 올리고에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 계면활성제, 폴리비닐알콜, 당, 유기 용매, 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 수용액의 pH 수준이 약 2 내지 약 10의 범위이다.
일부 예시적인 양태에서, 상기 기재를 상기 수용액과 접촉시키는 단계가, 제트 프린팅, 핀 프린팅, 퀼 프린팅(quill printing), 생물학적 레이저 프린팅, 모세관 기반 유체 역학(capillary-based fluidic), 또는 침지에 의해 달성된다.
본 발명의 상기 및 기타 특징, 양태 및 이점은, 첨부된 도면을 참조하여 다음의 특정 예시적인 양태에 대한 상세한 설명을 판독할 때 보다 더 잘 이해될 것이며, 상기 도면에서 유사한 문자는 도면 전반에 걸쳐 동일한 부분을 나타낸다.
도 1은, 본 발명의 예시적인 양태에 따른 2관능성 중합체를 도시한다.
도 2는, 본 발명의 예시적인 양태에 따른 코팅된 기재를 도시한다.
도 3은, 본 발명의 예시적인 양태에 따른 마이크로어레이를 도시한다.
도 4는, NHS 관능화 기재와 아즈락톤 관능화 기재 상의 그린 형광 단백질(GFP) 스팟의 형광 강도(평균 10개 스팟)를 비교한다.
도 5a는, NHS 관능화 기재 상에서 수득된 GFP 스팟 모폴로지의 대표적인 예를 도시한다. 도 5b는, 아즈락톤 관능화 기재 상에서 수득된 GFP 스팟 모폴로지의 대표적인 예를 도시한다.
도 6은, 아즈락톤 그룹으로 관능화된 PEG 코팅된 슬라이드 및 NHS 그룹으로 관능화된 PEG 코팅된 슬라이드의 표면 상에 접합된 면역 글로불린 G(IgG)의 형광 강도를 비교한다.
도 7은, NHS 관능화 표면의 아즈락톤 관능화 표면으로의 전환을 도시한다.
도 8은, 알데하이드 관능화 표면의 아즈락톤 관능화 표면으로의 전환을 도시한다.
본 발명의 예시적인 양태는, 관심 있는 생체 분자를 접합시키기 위해 하나의 말단에서 아즈락톤 말단 그룹으로 관능화되고, 중합체를 기재에 부착시키기 위해 또 다른 말단에서 아지드 앵커 그룹으로 관능화되는, 2관능성 중합체, 예를 들어 PEG를 제공한다. 중합체의, 아즈락톤 및 아지드와 같이 화학적으로 직교하는 2개의 그룹으로의 관능화는, 상기 중합체를 상기 기재에 부착시키기 위해 상기 아지드 그룹이 반응성인 조건 하에서 생체 분자를 접합시키기 위한 아즈락톤 관능성을 온전하게 유지시킨다. 본 발명의 예시적인 양태는, 기재의 표면 상에 상기 2관능화된 중합체를 도입시키는 코팅된 기재를 제공하며, 여기서, 상기 아지드 그룹은, 상기 아즈락톤 그룹을 자유롭고 생체 분자를 접합시키기 위해 활성인 상태로 유지하면서, 상기 중합체를 상기 기재에 부착시킨다. 본 발명의 예시적인 양태는, 마이크로어레이의 표면 상에 상기 코팅된 기재를 도입시킨 마이크로어레이를 제공하며, 여기서, 상기 마이크로어레이는 복수의 개별 스팟을 포함하며, 각 스팟은 2관능화된 중합체를 포함한다.
도 1은, 아지드, 카복실산, 티올, 아민, 하이드록실, 하이드라진, 실릴, 포스포네이트, 알킨, 카테콜, 및 리신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 앵커 그룹(110); PEG 또는 다당류일 수 있는 하나 이상의 제1 중합체를 포함하는 중합체 블록(106); 페닐, 비닐, 벤질 및 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 링커 그룹(112); 및 R1 및 R2를 포함하는 아즈락톤 말단 그룹(108)(여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소, 알킬 및 아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)을 포함하는 예시적인 양태에 따른 2관능성 중합체를 도시한다. 또 다른 예시적인 양태에서, 하나 이상의 제1 중합체는, 폴리리신, 폴리옥사졸린, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리-N-이소프로필아크릴아미드, 폴리도파민, 폴리알칸, 및 N-치환된 글리신 중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제2 중합체와의 공중합체이다.
도 2는, 예시적인 양태에 따른 코팅된 기재(200)를 도시하며, 상기 코팅된 기재(200)는, 기재(202) 및 기재(202)에 부착된 중합체 층(204)을 포함하며, 여기서, 중합체 층(204)은 하나 이상의 제1 중합체(206), 링커 그룹(212)을 통해 하나 이상의 제1 중합체(206) 각각의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 아즈락톤 관능 그룹(208), 및 상기 하나 이상의 제1 중합체(206) 각각의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹(210)을 포함하며, 여기서, 상기 하나 이상의 아지드 그룹(210)은 중합체 층(204)을 기재(202)에 부착시킨다.
예시적인 양태에서, 기재(202)는 유리, 실리카, 플라스틱, 탄소, 금속 또는 금속 산화물일 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, 중합체 층(204)은 선형 중합체로 이루어질 수 있지만, 다른 예시적인 양태에서 중합체 층(204)은 멀티암 중합체, 브러시 중합체 또는 나노 입자로 이루어질 수도 있다. 일부 예시적인 양태에서, 하나 이상의 제1 중합체(206)는 PEG 또는 다당류일 수 있고, 다른 예시적인 양태에서, 상기 하나 이상의 제1 중합체(206)는, 폴리리신, 폴리옥사졸린, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리-N-이소프로필아크릴아미드, 폴리도파민, 폴리알칸, 또는 N-치환된 글리신 중합체일 수 있는 제2 중합체와의 공중합체일 수 있다.
도 3은, 예시적인 양태에 따른 마이크로어레이(300)를 도시하며, 상기 마이크로어레이(300)는 복수의 개별 영역(314)을 포함하며, 여기서, 각각의 개별 영역(314)은, 기재(302) 및 기재(302)에 부착된 중합체 층(304)을 포함하는 코팅된 기재를 포함하며, 여기서, 중합체 층(304)은 하나 이상의 중합체(306), 링커 그룹(312)을 통해 하나 이상의 중합체(306) 각각의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 아즈락톤 관능 그룹(308), 및 하나 이상의 중합체(306) 각각의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹(310)을 포함하며, 상기 하나 이상의 아지드 그룹(310)은 중합체 층(304)을 기재(302)에 부착시킨다.
본 발명의 예시적인 양태는 중합체, 예를 들어 PEG가 아즈락톤 및 아지드 그룹으로 관능화되는 2관능성 중합체의 제조방법도 제공한다.
본 발명의 예시적인 양태에 따라, 예를 들어 하기 실시예 1 및 2와 관련하여 기재된 바와 같이, 2관능성 중합체의 제조방법은 다음을 포함한다: (a) 중합체를 제공하는 단계로서, 상기 중합체가, 상기 중합체의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 카복실산 그룹 또는 활성화 에스테르 그룹, 및 상기 중합체의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹을 함유하는, 상기 중합체를 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 카복실산 그룹 또는 활성화 에스테르 그룹을 아릴 또는 비닐 할라이드 그룹으로 전환시키는 단계; 및 (c) 비닐디알킬 아즈락톤을 상기 아릴 또는 비닐 할라이드 그룹에 부착시키는 단계. 상기 중합체는 PEG일 수 있다. 상기 비닐디알킬 아즈락톤은 팔라듐 촉매, 하나 이상의 용매, 및 염기를 사용하는 커플링 반응을 통해 아릴 또는 비닐 할라이드 그룹에 부착될 수 있다. 상기 팔라듐 촉매는, 팔라듐 (II) 퀴놀린-8-카복실레이트, 팔라듐 (II) 클로라이드, 팔라듐 (II) 브로마이드, 팔라듐 (II) 아세테이트, 팔라듐 (II) 아세토아세테이트, 비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐(0), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0), 팔라듐 (II) 트리플루오로아세테이트, 알릴팔라듐 (II) 클로라이드 이량체, 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 디클로라이드, 디클로로비스(트리사이클로헥실포스핀)팔라듐(II), 및 [1,1'-비스(디-tert-부틸포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 하나 이상의 용매는, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 톨루엔, 테트라하이드로푸란, 디옥산, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 및 알콜로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 염기는, 탄산칼륨, 탄산나트륨, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 4-(디메틸아미노)피리딘, 칼륨 tert-부톡사이드, 및 나트륨 tert-부톡사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 예시적인 양태는 아즈락톤 관능화 중합체, 예를 들어 PEG로 표면을 관능화시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 예시적인 양태에 따르면, 예를 들어 하기 실시예 3과 관련하여 기재된 바와 같이, 기재에, 중합체, 상기 중합체의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 아즈락톤 관능 그룹, 및 상기 중합체의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹을 포함하는 2관능성 중합체를 포함하는 2관능성 단량체를 부착시키는 "탑 다운(top down)" 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 알킨 관능 그룹을 포함하는 기재를 제공하는 단계; (b) 상기 2관능성 중합체, 하나 이상의 용매, 촉매, 염기, 및 환원제를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; 및 (c) 상기 기재를 상기 혼합물과 접촉시키는 단계.
탑 다운 접근법에서, 아즈락톤 그룹 및 아지도 그룹이 먼저 중합체 쇄의 말단에 도입된 다음, 상기 중합체가 "클릭(click)" 반응을 통해 알킨 그룹을 포함하는 표면에 부착된다. 이러한 탑 다운 접근법은, 각 중합체 쇄가 아즈락톤 관능성을 갖는 것을 보장하도록, 관능화도(degree of functionalization)에 대한 보다 우수한 제어를 가능하게 한다. 기재는 금속, 금속 산화물, 실리카, 유리, 탄소 또는 플라스틱일 수 있다. 이러한 표면 상에 알킨 관능성을 도입하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Achatz et al., "Colloidal silica nanoparticles for use in click chemistry-based conjugations and fluorescent affinity assays," Sensors and Actuators B: Chemistry, 150(1):211-19 (2010)]은, O-(프로파질)-N-(트리에톡시실릴프로필) 카바메이트를 갖는 실리카 나노 입자를 데코레이팅(decorating)하는 방법을 개시한다. 상기 중합체는 PEG 또는 다당류일 수 있다. 상기 하나 이상의 용매는, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 톨루엔, 테트라하이드로푸란, 디옥산, 아세토니트릴, 및 물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 촉매는, 구리 (II) 염 또는 구리 (I) 염(황산구리, 브롬화구리, 및 요오드화구리를 포함함) 또는 루테늄 촉매(펜타메틸사이클로펜타디에닐비스(트리페닐포스핀)루테늄(II) 클로라이드, 펜타메틸사이클로펜타디에닐(사이클로옥타디에닐)루테늄(II) 클로라이드, 및 펜타메틸사이클로펜타디에닐(노르보르나디엔)루테늄(II) 클로라이드를 포함함)일 수 있다. 상기 염기는, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 4-(디메틸아미노)피리딘, 피리딘, 퀴놀론, 페난스롤린, 및 이미다졸로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 환원제는, 아스코르브산나트륨, 트리스(트리아졸)아민, 및 하이드로퀴논으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 기재를 상기 혼합물과 접촉시키는 단계는 실온 또는 승온에서, 예를 들어 약 23 내지 150℃에서 완료될 수 있으며, 상기 기재를 상기 혼합물과 접촉시키는데 허용되는 반응 시간의 양은 PEG 코팅의 최종 밀도와 관련된다.
본 발명의 다른 예시적인 양태에 따르면, 아즈락톤으로 표면을 관능화시키는는 "바텀 업(bottom up)" 방법은, 중합체를 제공하는 단계로서, 상기 중합체가, 상기 중합체의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 카복실산 그룹, 및 상기 중합체의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 부착물 그룹을 함유하는, 상기 중합체를 제공하는 단계; 상기 부착물 그룹을 통해 상기 중합체를 상기 표면에 부착시키는 단계; 및 이후에, 상기 카복실산 그룹을 아즈락톤으로 전환시키는 단계를 포함한다. 상기 중합체는 PEG일 수 있다. 이러한 바텀 업 접근법은, 표면 부착이 더 이상 아즈락톤 화학 물질(chemistry)에 대해 직교할 필요가 없기 때문에, 중합체를 표면에 부착시키기 위한 보다 많은 대체 화학 물질의 사용을 허용한다. 바텀 업 접근법에서, 중합체의 부착 그룹은, 아지드, 포스폰산, 카복실산, 실란, 티올, 아민, 하이드라진, 알킨, 또는 카테콜일 수 있다.
본 발명의 예시적인 양태에 따라, 도 7에 도시한 바와 같이, NHS 관능화 표면(16)은 고체상(solid phase) 합성을 통해 아즈락톤 관능화 표면(18)으로 전환된다. NHS 관능화 표면은 염기(예를 들어, 트리메틸아민(TEA)) 및 용매(예를 들어, 디메틸포름아미드(DMF))의 존재 하에 2-메틸알라닌과 반응하여, 중간체 구조(17)를 생성한다. 중간체 구조(17)는 커플링제(예를 들어, 카보디이미드, 예를 들어 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)) 및 용매(예를 들어, 디클로로메탄(DCM))의 존재 하에 환화 반응하여, 아즈락톤 관능화 표면(18)을 생성한다.
본 발명의 또 다른 예시적인 양태에 따라, 도 8에 도시된 바와 같이, 알데하이드 관능화 표면(19)은 고체상 합성을 통해 아즈락톤 관능화 표면(20)으로 전환된다. 알데하이드 관능화 표면(19)은 촉매(예를 들어, 3-벤질-5-(2-하이드록시에틸)-4-메틸티아졸륨 클로라이드), 염기(예를 들어, TEA), 및 용매(예를 들어, 테트라하이드로푸란(THF))의 존재 하에 비닐디알킬 아즈락톤과 반응하여, 아즈락톤 관능화 표면(20)을 생성한다.
아즈락톤 관능 그룹을 갖는 기재는, 상기 기재에 적합한 보다 넓은 범위의 반응 조건을 포함하여 특정 이점을 제공한다. 아즈락톤 그룹의 가수분해 안정성으로 인해, 기재는 다양한 완충액, pH 수준, 및 기타 환경 조건(온도 및 습도 포함)을 견딜 것이며, 따라서 사용자가 생체 분자 부착 화학 물질을 최적화하고 개선된 신호 강도 및 균일성을 수득하는 것이 더 쉬워진다.
예를 들어, 고형 기재 상의 단백질 어레이를 제조하기 위해 스팟팅 방법을 사용하는 경우, 단백질 용액 한 방울을 상기 기재 상에 분산시키고 건조시킨다. 건조 과정은 신호 강도와 균일성에 영향을 미치며, 건조 과정이 더 느려지면 (반응이 일어나기까지 더 많은 시간이 필요하기 때문에) 접합 효율을 개선하고, 원형 외주 둘레가 중심보다 더 높은 단백질 농도를 함유하는 커피 링 효과(coffee ring effect)를 최소화한다. 그러나, NHS, 활성화 에스테르, 에폭사이드, 및 알데하이드와 같은 그룹의 경우에는, 물에 의한 가수분해가 접합 반응과 경쟁하며, 따라서 보다 양호한 강도 및 균일성을 희생하는 보다 더 빠른 건조가 바람직하다. 수용액에서의 아즈락톤 그룹의 견고성(robustness)은 최적의 신호 강도 및 균일성을 모두 달성하기 위한 보다 느린 건조 공정을 허용한다.
또 다른 예로서, 연속 유동 마이크로 프린팅(continuous-flow microprinting)이 단백질 어레이의 또 다른 제조방법이다. 연속 유동 마이크로 프린팅은, 건조시키지 않고 관능성 기재와 단백질 용액의 보다 더 긴 접촉을 제공하며, 기재가 표면에 가수분해 안정성 관능 그룹을 갖는 경우 연속 유동 마이크로 프린팅의 완전한 잠재력(full potential)을 발휘할 수 있다.
본 발명의 예시적인 양태는 관심 있는 생체 분자를 접합시키기 위한 아즈락톤 관능화 기재의 사용 방법도 제공한다.
본 발명의 예시적인 양태에 따라, 관심 있는 생체 분자의 단리 방법은 다음을 포함한다: (a) 관능화 기재를 제공하는 단계로서, 상기 하나 관능화 기재가, 기재, 하나 이상의 중합체, 상기 하나 이상의 중합체 각각의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 아즈락톤 그룹, 및 상기 하나 이상의 중합체 각각의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹을 포함하고, 여기서, 상기 하나 이상의 아지드 그룹은 상기 하나 이상의 중합체 각각을 상기 기재에 부착시키는, 관능화 기재의 제공 단계; (b) 상기 관심 있는 생체 분자를 함유하는 수용액을 제공하는 단계; 및 (c) 상기 관능화 기재를 상기 수용액과 일정 시간 기간 동안 접촉시키는 단계로서, 상기 시간 기간 동안 상기 관심 있는 생체 분자가 상기 아즈락톤 그룹에 부착되는, 상기 접촉 단계. 상기 수용액은 첨가제(예를 들어, 글리세롤, 올리고에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 계면활성제, 폴리비닐알콜, 당, 유기 용매 및 무기 염)를 포함할 수 있고, 약 2 내지 약 10의 범위의 pH 수준을 가질 수 있다. 관능화 기재를 상기 수용액과 접촉시키는 단계는 제트 프린팅, 핀 프린팅, 퀼 프린팅, 생물학적 레이저 프린팅, 모세관 기반 유체 역학, 또는 침지에 의해 달성될 수 있다. 상기 시간 기간은 수 초 내지 수 시간이 될 수 있다. 또한, 생체 분자는 시험관내 전사 및 번역 기술을 사용하여 기재 상에 현장(in-situ) 발현되고 포획될 수 있다.
상기 설명은 예시적인 것으로 의도하며 제한하려는 것은 아니다. 당업자는 상기 개시로부터 본 발명이 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 다양한 양태가 단독으로 또는 조합되어 구현될 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 따라서, 본 발명의 양태가 본 발명의 특정 실시예와 관련하여 설명되었지만, 본 발명의 양태 및/또는 방법의 진정한 범위는 상기 특정 실시예에 한정되지 않아야 하는데, 도면, 명세서, 및 하기의 실시예 및 청구범위에 대한 연구시 다른 변경이 당업자에게 명백할 것이기 때문이다.
다음은 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 의도 없이 특정 방법을 예시하는 실시예들이다. 실시예들은 일반적인 지식으로부터 이해되는 바와 같이 명세서의 범위 내에서 변경될 수 있다.
실시예
실시예 1 - 카복실산 그룹을 아릴 할라이드 그룹으로 전환시키는, 아지도 -PEG-아즈락톤의 합성
무수 디클로로메탄(DCM) 중 N3-PEG1k-C02H(200mg, 0.20mmol, 1.0당량), 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)(37mg, 0.24mmol, 1.2당량), 및 요오도아닐린(52mg, 0.24mmol, 1.2당량)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 아르곤 하에 교반시켰다. 반응물을 물로 켄칭하고, 유기층을 분리했다. 수성 층을 DCM으로 3회 추출하고, 합쳐진 유기 분획들을 황산마그네슘(MgS04)에서 건조시켰다. 상기 용액을 감압하에 조악한 오일로 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(0 내지 10% 메탄올/DCM)로 정제하여 연질 백색 고체를 수득했다(225mg, 82%).
Figure pct00003
상기 생성된 생성물의 구조를 양성자 핵 자기 공명(NMR) 분광법으로 분석하여 다음 NMR 스펙트럼을 얻었다:
Figure pct00004
박층 크로마토그래피(TLC)에서의 상기 생성물의 체류 인자(Rf)는 다음과 같다: TLC Rf = 0.5(10% MeOH/DCM).
실시예 2 - 비닐디알킬 아즈락톤을 아릴 할라이드 그룹에 부착시키는, 아지도 -PEG-아즈락톤의 합성
예를 들어 문헌[Cui et al., "Pd(quinoline-8-carboxylate)2　as a Low-Priced, Phosphine-Free Catalyst for Heck and Suzuki Reactions," Journal of Organic Chemistry, 72:9342 (2007)]에 개시된 바와 같은 절차에 따라 팔라듐 촉매 "Quin2Pd"를 합성했다.
10mL 화염 건조(flame-dried) 쉬링크 플라스크를 N3-PEG1k-요오도아닐라이드(200mg, 0.152mmol, 1.0당량) 및 Quin-Pd(3.2mg, 0.0072mmol, 0.05당량)로 충전하고, 아르곤으로 퍼징했다.
무수 디메틸포름아미드(DMF)(0.2M, 0.8mL), 트리에틸아민(100μL, 0.076mmol, 5.0당량, 무수이고 CaH2 상에서 새롭게 증류됨), 및 비닐 아즈락톤(58μL, 0.456mmol, 3.0당량)을 첨가하고, 상기 시스템을 씰링했다. 반응 혼합물은 3시간 동안 130℃로 가열하였고, 암갈색으로 변화되었다. 이후, 이를 실온으로 냉각시키고, 감압하에 농축시켰다. 조악한 잔류물을 DCM에 용해시키고, 셀라이트 상에 무수 로딩하여 실리카 컬럼에 적용했다. 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제(0 내지 20% 메탄올/DCM)로 156mg을 수득했다.
Figure pct00005
상기 생성된 생성물의 구조를 양성자 NMR 분광법으로 분석하여 다음 NMR 스펙트럼을 얻었다:
Figure pct00006
박층 크로마토그래피(TLC)에서의 상기 생성물의 체류 인자(Rf)는 다음과 같다: TLC Rf = 0.4(10% MeOH/DCM).
실시예 3 - "클릭" 반응을 통한 알킨 관능화 표면 상으로의 아지도-PEG-아즈락톤의 부착
5mL의 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 5mL의 탈염(DI)수 중 아지드-PEG-아즈락톤 용액(3mg/mL)에 0.52mL의 1.0mM 스톡 클릭 화학 물질 용액(stock click chemistry solution)(1.5mg의 CuS04·5H20, 6mg의 아스코르브산나트륨, 4μL의 트리에틸아민, 3 mL의 DMSO, 및 3mL의 DI수)을 첨가했다. 알킨 그룹 관능화 슬라이드를 실온에서 12시간 동안 온화하게 흔들어 상기 용액에 침지시켰다. 상기 PEG화 슬라이드를 DI수로 세정하고, 회전 건조시켰다.
다르게는, 상기 표면의 아지드 그룹으로의 예비관능화 후, "클릭" 반응을 통한 상기 표면과 알킨-PEG-아즈락톤의 커플링에 의해, PEG-아즈락톤을 표면 상에 도입했다.
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 4 - 아즈락톤 관능 그룹 및 아지드 관능 그룹으로 개질된 다당류들의 합성
아래 예시된 바와 같이, 다당류를 산화시켜 아즈락톤으로의 추가 관능화에 적합한 카복실산 그룹을 생성했다. 다당류 쇄(구조 7) 상의 1차 알콜 중 일부는, 촉매로서의 백금 상의 산소 또는 TEMPO((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥실 또는 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥시다닐)을 염기성 pH의 차아염소산나트륨(NaOCl)과 함께 사용하여 카복실산 그룹으로 전환되어, 구조 8을 생성한다(Cumpstey, I., ISRN Organic Chemistry, Article ID 417672 (2013) 참조). 이어서, 카복실산 그룹을 아릴 또는 비닐 할라이드(브로마이드 또는 요오다이드) 관능성로 전환시켜, 구조 9를 생성하고, 팔라듐 촉매 커플링을 통해 비닐디알킬 아즈락톤을 부착시켜, 목적하는 아즈락톤 관능화 물질을 제조했다(구조 10).
Figure pct00009
다르게는, 이하에 예시된 바와 같이, 과요오드산염을 사용하여, 다당류 쇄(구조 7)의 1,2-디올의 개열을 달성하고, 상기 중합체 쇄 내로 카복실산 관능성을 도입하여, 구조 11을 생성했다. 이어서, 구조 11을 요오도아닐린과 반응시켜, 구조 12를 생성한 뒤, 비닐디알킬 아즈락톤과 반응시켜 목적하는 아즈락톤 관능화 물질을 제조했다(구조 13).
Figure pct00010
아래에 예시된 바와 같이, 다당류 쇄의 1차 알콜의 일부를 (예를 들어, N-브로모석신이미드(NBS) 및 트리페닐포스핀(PPh)을 사용하여) 브로마이드로 또는 (토실 클로라이드(TsCl)와의 반응에 의해) 토실 그룹으로 전환시킴으로써 구조 14를 제공한 뒤, 나트륨 아지드(NaN3)와의 반응에 의해 구조 15를 생성(Cumpstey 참조)함으로써 아지드 관능성을 다당류 쇄(구조 7)에 도입한다. 이 방법은, 앞선 2개의 아즈락톤 관능화 다당류 합성 방법과 조합되어, 아즈락톤 및 아지드 그룹 둘 다를 함유하는 다당류 쇄를 수득할 수 있다. 다당류 쇄 상의 1차 알콜 중 일부만이 아즈락톤으로 개질되기 때문에, 다른 알콜은 아지드로의 전환에 사용할 수 있다.
Figure pct00011
실시예 5 - 핀 프린팅을 통한 아지도 -PEG- 아즈락톤으로 코팅된 기재에 대한 단백질의 부착
인산염 완충 식염수(PBS) 중 0.1%의 폴리비닐 알콜을 함유하는 그린 형광 단백질(GFP) 200mg/mL 용액을, 실온 및 55%의 상대 습도에서 핀 프린팅 방법을 사용하여 기재 상에 스팟팅했다. 스팟들을 데시케이터에서 12시간 동안 건조시킨 뒤, 슬라이드들을 PBS-Tween 및 PBS로 세정하여 비결합된 단백질을 제거했다. 기재에 공유 결합으로 부착된 GFP의 상대적인 양을, 표면 상의 단백질의 형광 강도를 측정하여 결정했다. 아즈락톤 관능화 슬라이드의 형광 강도는 NHS 에스테르 관능화 슬라이드에 비해 2.5배 더 높았다(도 4 참조). 슬라이드들의 모폴로지를 스팟을 통과하는 상기 형광 강도에서 관찰하여 비교했다. 아즈락톤 관능화 표면 상의 단백질 스팟들은 균일했던 반면(도 5b), NHS 관능화 표면 상의 스팟들은 커피 링 모폴로지 특성을 보였다(도 5a 참조).
실시예 6 - 침지를 통한 단백질 접합
표면 상에 동일한 밀도의 관능 그룹을 함유하는 아지드-PEG-아즈락톤으로 관능화된 유리 기재 및 아지드-PEG-NHS로 관능화된 유리 기재를, pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS) 중 면역 글로불린 G(IgG) 용액에 최대 6시간까지 노출시켰다. 상기 용액을 제거하고, PBS-Tween 및 PBS로 슬라이드들을 세정한 뒤, 상기 기재들에 대해 공유 결합으로 부착된 IgG의 상대적인 양을, 표면 상의 단백질의 형광 강도를 측정하여 결정했다. 항온 처리 6시간 후, 아즈락톤 관능화 슬라이드의 형광 강도는 NHS 에스테르 관능화 슬라이드의 형광 강도에 비해 5배 더 높았다(도 6 참조).

Claims (27)

  1. (a) 아지드, 카복실산, 티올, 아민, 하이드록실, 하이드라진, 실릴, 포스포네이트, 알킨, 카테콜, 및 리신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 앵커(anchor) 그룹;
    (b) 폴리에틸렌 글리콜 또는 다당류를 포함하는 하나 이상의 제1 중합체를 포함하는 중합체 블록;
    (c) 페닐, 비닐, 벤질, 및 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 링커(linker) 그룹; 및
    (d) R1 및 R2를 포함하는 아즈락톤 말단 그룹으로서, 여기서, R1 및 R2가 각각 독립적으로, 수소, 알킬, 및 아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 상기 아즈락톤 말단 그룹을 포함하는, 2관능성 중합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 중합체가, 폴리리신, 폴리옥사졸린, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리-N-이소프로필아크릴아미드, 폴리도파민, 폴리알칸, 및 N-치환된 글리신 중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제2 중합체와의 공중합체인, 2관능성 중합체.
  3. (a) 기재; 및
    (b) 중합체 층으로서, 상기 중합체 층은, 하나 이상의 제1 중합체, 상기 하나 이상의 제1 중합체 각각의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 아즈락톤 관능 그룹, 및 상기 하나 이상의 제1 중합체 각각의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹을 포함하며, 여기서, 상기 하나 이상의 아지드 그룹은 상기 중합체 층을 상기 기재에 부착시키는, 상기 중합체 층을 포함하는, 코팅된 기재.
  4. 제3항에 있어서, 상기 기재가, 유리, 실리카, 플라스틱, 탄소, 금속, 및 금속 산화물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 코팅된 기재.
  5. 제3항에 있어서, 상기 중합체 층이, 선형 중합체, 멀티암(multiarm) 중합체, 브러시 중합체, 또는 나노 입자를 포함하는, 코팅된 기재.
  6. 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 또는 다당류를 포함하는, 코팅된 기재.
  7. 제6항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 중합체가, 폴리리신, 폴리옥사졸린, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리-N-이소프로필아크릴아미드, 폴리도파민, 폴리알칸, 및 N-치환된 글리신 중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제2 중합체와의 공중합체인, 코팅된 기재.
  8. 복수의 개별 영역을 포함하는 마이크로어레이(microarray)로서, 각각의 개별 영역이 코팅된 기재를 포함하고, 상기 코팅된 기재가,
    (a) 기재; 및
    (b) 중합체 층으로서, 하나 이상의 중합체, 상기 하나 이상의 중합체 각각의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 아즈락톤 관능 그룹, 및 상기 하나 이상의 중합체 각각의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹을 포함하며, 여기서, 상기 하나 이상의 아지드 그룹이 상기 중합체 층을 상기 기재에 부착시키는, 상기 중합체 층을 포함하는, 마이크로어레이.
  9. 2관능성 중합체의 제조방법으로서, 상기 방법이,
    (a) 중합체를 제공하는 단계로서, 상기 중합체가, 상기 중합체의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 카복실산 그룹 또는 활성화 에스테르 그룹, 및 상기 중합체의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹을 함유하는, 상기 중합체를 제공하는 단계;
    (b) 적어도 하나의 카복실산 그룹 또는 활성화 에스테르 그룹을 아릴 또는 비닐 할라이드 그룹으로 전환시키는 단계; 및
    (c) 비닐디알킬 아즈락톤을 상기 아릴 또는 비닐 할라이드 그룹에 부착시키는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 비닐디알킬 아즈락톤이 팔라듐 촉매, 하나 이상의 용매, 및 염기를 사용하는 커플링 반응을 통해 부착되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 팔라듐 촉매가, 팔라듐 (II) 퀴놀린-8-카복실레이트, 팔라듐 (II) 클로라이드, 팔라듐 (II) 브로마이드, 팔라듐 (II) 아세테이트, 팔라듐 (II) 아세토아세테이트, 비스(디벤질리덴아세톤)팔라듐(0), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0), 팔라듐 (II) 트리플루오로아세테이트, 알릴팔라듐 (II) 클로라이드 이량체, 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 디클로라이드, 디클로로비스(트리사이클로헥실포스핀)팔라듐(II), 및 [1,1'-비스(디-tert-부틸포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 용매가, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 톨루엔, 테트라하이드로푸란, 디옥산, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 및 알콜로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 염기가, 탄산칼륨, 탄산나트륨, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 4-(디메틸아미노)피리딘, 칼륨 tert-부톡사이드, 및 나트륨 tert-부톡사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  15. 2관능성 중합체를 기재에 부착시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) 알킨 관능 그룹을 포함하는 기재를 제공하는 단계;
    (b) 상기 2관능성 중합체, 하나 이상의 용매, 촉매, 염기, 및 환원제를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계; 및
    (c) 상기 기재를 상기 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하며,
    여기서, 상기 2관능성 중합체가, 중합체, 상기 중합체의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 아즈락톤 관능 그룹, 및 상기 중합체의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 하나 이상의 용매가, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 톨루엔, 테트라하이드로푸란, 디옥산, 아세토니트릴, 및 물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 촉매가 구리 (II) 염 또는 구리 (I) 염을 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 촉매가, 황산구리, 브롬화구리, 및 요오드화구리로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  20. 제15항에 있어서, 상기 촉매가 루테늄 촉매를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 촉매가, 펜타메틸사이클로펜타디에닐비스(트리페닐포스핀)루테늄(II) 클로라이드, 펜타메틸사이클로펜타디에닐(사이클로옥타디에닐)루테늄(II) 클로라이드, 및 펜타메틸사이클로펜타디에닐(노르보르나디엔)루테늄(II) 클로라이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 염기가, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 4-(디메틸아미노)피리딘, 피리딘, 퀴놀론, 페난스롤린, 및 이미다졸로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  23. 제15항에 있어서, 상기 환원제가, 아스코르브산나트륨, 트리스(트리아졸)아민, 및 하이드로퀴논으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  24. 관심 있는 생체 분자(biomolecule)를 단리시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) 관능화 기재를 제공하는 단계로서, 상기 관능화 기재가, 기재, 하나 이상의 중합체, 상기 하나 이상의 중합체 각각의 제1 말단에 부착된 하나 이상의 아즈락톤 그룹, 및 상기 하나 이상의 중합체 각각의 제2 말단에 부착된 하나 이상의 아지드 그룹을 포함하고, 여기서, 상기 하나 이상의 아지드 그룹은 상기 하나 이상의 중합체 각각을 상기 기재에 부착시키는, 상기 관능화 기재의 제공 단계;
    (b) 상기 관심 있는 생체 분자를 함유하는 수용액을 제공하는 단계; 및
    (c) 상기 관능화 기재를 상기 수용액과 일정 시간 기간 동안 접촉시키는 단계로서, 상기 시간 기간 동안 상기 관심 있는 생체 분자가 상기 아즈락톤 그룹에 부착되는, 상기 접촉 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 수용액이 첨가제를 추가로 포함하고, 상기 첨가제는 글리세롤, 올리고에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 계면활성제, 폴리비닐알콜, 당, 유기 용매, 및 무기 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 수용액의 pH 수준이 약 2 내지 약 10의 범위인, 방법.
  27. 제24항에 있어서, 상기 관능화 기재를 상기 수용액과 접촉시키는 단계가, 제트 프린팅, 핀 프린팅, 퀼 프린팅(quill printing), 생물학적 레이저 프린팅, 모세관 기반 유체 역학(capillary-based fluidic), 또는 침지에 의해 달성되는, 방법.
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