KR20180048215A - 혈중 순환 암세포를 이용한 pd-l1 타겟 면역치료법을 위한 암 환자 선별 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명은 고밀도 마이크로 칩을 이용해서 PD-L1발현 CTC를 분리해내어 이를 면역형광법을 이용해 검출해내는, PD-L1 타겟 면역치료법을 위한 암환자 판별 방법을 제공한다.

Description

혈중 순환 암세포를 이용한 PD-L1 타겟 면역치료법을 위한 암 환자 선별 방법{A METHOD FOR IDENTIFYING A SUBJECT WITH CANCER FOR PD-L1 TARGETED IMMUNE THERAPY WITH CIRCULATING TUMOR CELLS}

본 발명은 암환자의 면역치료법을 위한 암환자 선별방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혈중 순환 암세포를 이용하여 PD-L1을 타겟으로 하는 면역치료법을 위한 암환자 선별 방법에 관한 것이다.

암 면역 치료법(cancer immunotherapy)은 암과 면역 체계의 밀접한 연관성에 대한 자료를 근거로 암 주변 미세환경이나 숙주의 면역 체계를 조절함으로써, 기존의 세포 독성 항암화학치료 및 방사선 치료의 효과를 극대화하려는 연구 분야이다. 암 면역 치료에 대한 시도는 1990년부터 다양하게 시도되어, 면역 자극 싸이토카인(cytokine)을 이용한 면역 치료, 암 백신요법, 양자 T 림프구 요법(adoptive T lymphocyte therapy)등을 중심으로 전임상 및 초기 임상연구가 시행되었으나, 약물의 국소 전달기전이나 전신 독성문제, 주목할 만한 치료 성적 부족 등으로 인해 실질적인 임상적용으로 이어지지 못했다. 하지만, 최근 면역 치료에 대한 관심이 다시 증폭된 계기가 있는데, 표적치료제의 일종인 cetuximab의 치료 작용중 면역기전이 관여한다는 점, 암의 면역회피기전에 대한 연구성과, 그리고 면역 관문(immune checkpoint) 차단을 위해 단클론 항체를 사용한 초기 임상연구에서 악성 흑색종뿐 아니라, 두경부암과 같이 비면역성 고형암인 비소세포성 폐암 등에서도 만족할 만한 임상 성적을 보인 점 등이다.

이 중에서도 면역 관문(immune checkpoint) 차단에 작용하는 항체 치료법으로 계획된 세포소멸 단백질-1(programmed cell death protein 1, PD-1/PD-L1 pathway)가 새롭게 주목받고 있다.

PD-1은 B7-CD28 family에 속하는 상호 억제성 수용체의 일종이며, TCR 활성화 이후 CTLA-4보다 더 다양한 종류의 면역세포(세포독성 T 림프구, 자연살해세포, B 림프구, 단핵구, 수지상세포 등)에서 발현된다. PD-1의 리간드인 PD-L1은 IFN-γ의 자극에 의해 비조혈성 조직(non-hematopoietic tissue)에 전반적으로 발현되는데, PD-1 수용체와 의 결합을 통해 nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells 전사(transcription) 및 IFN-γ 분비를 억제함으로써, 감염 반응 중 자가면역반응이나 면역 공격으로부터 정상 조직을 보호하는 것으로 생각된다. CTLA-4와유사하게 PD-1도 Treg 림프구에서 강하게 발현되는데, Treg림프구가 암 조직 내로 많이 침윤되어 있는 점을 감안할 때, PD-1 기전을 차단하게 되면 암 조직 내 Treg 림프구 억제를 유발하여 암세포 억제 면역 반응을 유도할 수 있게 된다. 또한, 많은 종류의 상피암(epithelial cancer)에서 세포 표면의 PD-L1이 과발현되면서 PD-1 경로가 증진되어, T 림프구의 무감각 상태가 발생하게 되고 항원제시세포들의 종양항원의 인식 및 제시과정이 억제된다. 이러한 PD-L1의 과발현이 비소세포성 폐암환자에서 19~100%까지 관찰된다는 점에서, PD-1/PDL1기전은 임상적으로 응용할 만한 표적이 될 수 있다.

PD-L1에 대한 항체는, B7과 상호작용을 통한 T 림프구억제 신호를 차단하면서, PD-1 수용체와 PD-L2 사이의 반응은 유지한다는 점에서 PD-1 항체와는 작용 기전이 다른 것으로 생각된다. 그 중 BMS-956559는 IgG4 단클론항체로서 여러 가지 고형암에서 객관적인 반응률을 보인 항체이며, 기타 다른 약제 역시 방광암, 소화기암을 대상으로 한 임상연구에서 주목할 만한 성적을 보였다.

현재 유전자 진단을 개인 맞춤형 암 치료에 활용하려는 연구의 대부분은 암 조직을 직접 채취함으로써 이루어지고 있다. 전신마취가 필요하거나 암 조직을 채취하기 어려운 췌장암, 폐암, 위암 등의 환자로부터 유전자 검사를 위한 시료를 얻기 어렵기 때문에, 유전자 분석 기술들이 발달하고 있음에도 불구하고 적절한 항암제 처방이 어려운 실정이다. 특히 전체 폐암환자의 8~18%는 조직검사가 불가능한 상황이다.

이러한 상황에서 암환자를 위한 면역 치료법 개발에 있어서 암 환자에게 부담이 덜 되고 또한 보다 효율적이며 선택적인 치료를 위한 방법들이 필요한 실정이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 암에 대한 면역치료법을 보다 효과적이고 선택적으로 적용하기 위해서 뿐만이 아니라 암환자의 조직 채취에 대한 부담을 경감시키기 위하여 혈중 순환 암세포를 이용한 암 환자 판별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면에 따른 PD-L1을 타겟으로 하는 면역치료법 적용을 위한 암환자 판별 방법은

(a) 암 환자로부터 얻은 액상 생검샘플을 준비하는 단계;

(b) 상기 액상 생검샘플에서 바이오칩을 이용하여 CTC 및 면역세포를 분리하는 단계;

(c) 상기 (b)단계에서 분리된 CTC 및 면역세포에서 PD-L1를 발현하는 CTC를 검출하는 단계;

(d) 상기 (b)단계에서 분리된 CTC 및 면역세포에서 면역세포를 분리하는 단계;

(e) 상기 (c)단계에서 검출된PD-L1을 발현하는 CTC와 상기 (d)단계에서 분리된 면역세포의 상대적인 비율을 계산하는 단계; 및

(f) 상기 상대적인 비율이 기준값을 초과하는지 여부를 판단하는 단계;

를 포함할 수 있다.

상기 (b) 단계는 대기압 1000내지 1020 hPa에서 이루어지는 것을 포함할 수 있다.

상기 바이오칩은 BSA용액으로 코팅된 고밀도 마이크로칩인 것을 포함할 수 있다.

상기 고밀도 마이크로칩은 사이즈 특이성을 가지는 것을 포함할 수 있다.

상기 BSA용액 코팅은 0.05내지0.15% 농도로 코팅되는 것을 포함할 수 있다.

상기 BSA용액 코팅은 5내지 15분동안 코팅되는 것을 포함할 수 있다.

상기 면역세포는 T림프구인 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, PD-L1을 타겟으로 하는 면역치료법 적용을 위한 암환자 판별 방법은 암환자를 판별해내기 위한 알고리즘을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, PD-L1을 타겟으로 하는 면역치료법 적용을 위한 암환자 판별 방법은 마지막 단계로서, 상기 암환자의 면역반응을 강화시키는 약제학적 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 억제성 면역조절 신호를 막는 조성물인 것을 포함할 수 있다.

상기 억제성 면역조절 신호는 PD-1/PD-L1 신호 체계에서 나오는 것임을 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 일측면에 따른 PD-L1 타겟 면역치료법을 받는 암환자의 CTC 상 PD-L1 발현 모니터링 방법은

(a) 특정 시점 전후로 적어도 2개의 액상 생검샘플을 PD-L1 타겟 면역치료를 받는 암환자로부터 준비하는 단계;

(b) 상기 액상 생검샘플에서 바이오칩을 이용하여 얻은 CTC 및 면역세포를 분리하는 단계;

(c) 상기 (b)단계에서 분리된 CTC및 면역세포에서 PD-L1을 발현하는 CTC를 검출하는 단계;

(d) 상기 (c)단계에서 검출된PD-L1을 발현하는 CTC가 상기 액상 생검샘플에서 차지하는 비율을 계산하는 단계; 및

(e) PD-L1 발현을 모니터링하기 위해 상기 특정시점 전후의 액상 생검샘플들간의 상기 (d)단계에서의 비율을 비교하는 단계;

를 포함할 수 있다.

상기 (e) 단계에서, 상기 (d)단계의 비율의 감소는 PD-L1 타겟 면역치료법에 대한 반응이 부정적일 것이라는 예후증상임을 포함할 수 있다.

상기 (e) 단계에서, 상기 (d)단계의 비율의 변화가 없는 것은 PD-L1 타겟 면역치료법에 대한 반응이 긍정적일 것이라는 예후증상임을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 고밀도 마이크로칩을 이용하여 PD-L1을 발현하는 CTC 및 면역세포를 분리해낼 수 있으며, 본 발명의 또다른 실시예에 따르면, 분리된 PD-L1발현 CTC와 면역세포간의 비율을 비교 분석할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 CTC를 분리하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 CTC를 검출하기 위한 면역형광법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 PD-L1(+) H1975 NSCLC 세포를 면역형광염색한 데이터이다.
도 4는 PD-L1(-) A549 NSCLC 세포를 면역형광염색한 데이터이다.
도 5는 PD-L1(+)세포와 PD-L1(-)세포에 대한 각 마커로 면역형광 강도를 측정한 데이터이다.
도 6은 PD-L1(+)세포와 PD-L1(-)세포 및 WBC에 대한 CD45마커로 면역형광 강도를 측정한 데이터이다.
도 7은 PD-L1(+)세포와 PD-L1(-)세포에 대한 pan-CK CTC 마커 및 PD-L1 으로 면역형광 강도를 측정한 데이터이다.
도 8은 PD-L1(+)세포로 알려진 H1975와 PD-L1(-)세포주로 알려진 A549에 대한 pan-CK CTC 마커 및 Vimentin CTC 마커로 면역형광 강도를 측정한 데이터이다.
도 9는 PD-L1(+)세포와 PD-L1(-)세포에 대한 면역형광 강도 데이터의 평균과 표준편차를 나타낸 데이터이다.
도 10은 마이크로칩으로 PC9-GFP세포를 분리한 결과를 나타낸 사진이다.
도 11은 마이크로칩에 의해 분리된 세포를 찍은 사진이다.
도 12는 마이크로칩에 의해 분리된 H3122, PC9 및 SK BR3 세포의 회복률을 측정한 데이터이다.
도 13은 WBC(백혈구)가 마이크로칩에 의해 제거된 정도를 나타내주는 데이터이다.
도 14는 H3122, PC9 및 SK BR3 세포가 마이크로칩에 의해 분리된 후의 세포 순도를 나타내주는 데이터이다.
도 15는 마이크로칩에 의해 분리된 세포들을 별도 배양과정을 통해 배양시킨 결과를 나타내는 데이터이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 일측면에 따른, PD-L1을 타겟으로 하는 면역치료법 적용을 위한 암환자 판별 방법은 a) 암 환자로부터 얻은 액상 생검샘플을 준비하는 단계 b) 상기 액상 생검샘플에서 바이오칩을 이용하여 CTC 및 면역세포를 분리하는 단계 c) 상기 b)단계에서 분리된 CTC 및 면역세포에서 PD-L1를 발현하는 CTC를 검출하는 단계 d) 상기 b)단계에서 분리된 CTC 및 면역세포에서 면역세포를 분리하는 단계 e) 상기 c)단계에서 분리된PD-L1을 발현하는 CTC와 상기 d)단계에서 분리된 면역세포의 상대적인 비율을 계산하는 단계 및 f) 상기 상대적인 비율이 기준값을 초과하는지 여부를 판단하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 PD-L1을 타겟으로 하는 면역치료법은 PD-1항체, PD-L1항체, PD-L2항체, 항PD-1 RNAi, 항PD-L1 RNAi, 항 PD-L2 RNAi, 항PD-I antisense RNA, 항PD-L1 antisense RNA, 항PD-L2 antisense RNA, dominant negative PD-1 단백질, dominant negative PD-L1 단백질, 혹은dominant negative PD-L2 단백질을 포함한다. 또한, 상기 PD-L1을 타겟으로 하는 면역치료법은 2차 agent, 예를 들어 cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) 혹은Band T lymphocyte attenuator(BTLA)의 활성이나 발현을 줄일 수 있는 화합물, 예를 들어CTLA-4 항체, BTLA 항체, CD28항체, ICOS 항체, ICOS-L 항체, B7-1 항체, B7-2 항체, B7-H3 항체, 혹은 B7-H4 항체를 포함하는 치료방법의 일부일수 있다.

상기 액상생검이란, 천자나 절개 등의 침습적인 시술 없이 혈액이나 복수 등 체액에 있는 암의 유전자조각을 채취하는 검사를 의미한다. 즉, 상기 액상 생검은 혈액 등의 체액 검사만으로 신체 부위별 혈액이나 복수내에 존재하는 암세포 유래 DNA를 분석하여 암 발생 및 전이 등에 대한 상세한 관찰이 가능하게 해줄 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 액상 생검을 위한 샘플은 혈액, 활액, 복수, 흉막액, 뇌척수액, 복막액을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 액상 생검 샘플은 혈액일 수 있다.

상기 혈중 순환 암세포(Circulating Tumor Cells;CTC)란, 악성 종양 환자의 말초혈액에서 발견되는 종양세포를 의미한다. 순환종양세포들은 매우 드물고 구할 수 있는 표본의 양이 매우 제한된다. 혈중 순환 암세포의 검출 및 특성해석에서의 기술은 다중역전사정량중합효소연쇄반응 방법들, 영상화 기반 접근법들, 그리고 미세여과법 및 마이크로칩 장치들을 포함하며 이제 국한되지 않는다. 혈중 순환 암세포는 액상 생검검체로 개별화된 치료와 치료 후 경과관찰을 필연적으로 제공할 수 있는 종양생물학적 표지자로 작용할 수 있다. 또한, 혈중 순환 암세포는 종양의 생물학적 특성 및 종양세포의 파종을 이해하기 위한 표적으로 사용될 수 있지만 이에 국한되지 않는다.

상기 면역세포란, 외부에서 침입한 병원균이나 이물질, 바이러스 등에 저항하여 이겨낼 수 있도록 면역력을 조절하거나 균을 직접 제거하는 세포를 말한다. 면역세포에는 미생물이나 암세포를 포식한 다음, 미생물이나 암세포의 항원을 전달하는 대식세포 표면에 제시된 미생물이나 항원을 인식, 이에 대한 항체를 생산하여 공격하는 B림프구, 외부 항원을 가진 세포를 직접 파괴하는 세포독성 T림프구 그리고 이러한 면역반응들을 조절하는 조력-T림프구와 억제 T림프구, 자연살해세포라고 불리는 NK세포, NKT, DC 등이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 면역세포는 B림프구, T림프구 NK세포, 수지상세포 및 대식세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 면역세포는 T 림프구를 일 수 있다.

상기 PD-L1(Programmed Cell death ligand1)이란, PD-1(Programmed cell death protein-1)의 리간드로서 인체의 면역시스템이 특정 세포를 죽이지 못하도록 하는 단백질이다. 상기 PD-L1은 PD-1 수용체와의 결합을 통해 nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells 전사(transcription) 및 IFN-γ 분비를 억제함으로써, 감염 반응 중 자가면역반응이나 면역 공격으로부터 정상 조직을 보호하는 것으로 알려져 있다. 암세포는 APC(antigen presenting cells)에서 발현되는 PD-L1을 세포 표면에 발현하여 면역 반응을 회피한다. 즉, 암세포 표면에 PD-L1이 발현되며, 면역 세포 표면에 발현되는 PD-1 과 결합하게 되면 정상적인 면역세포 기능을 억제하여 면역반응을 회피하게 된다.

상기 기준값은, 정량데이터를 다루고 상기 샘플의 분류를 제공해줄 수 있는 다양한 통계적 기법을 통해 추론될 수 있다. 구체적인 예시로서, algorithm, a recursive feature elimination model, a prediction analysis of microarray model, a logistic regression model, a CART algorithm, a flex tree algorithm, a LART algorithm, a random forest algorithm, a MART algorithm, a machine learning algorithm를 포함할 수 있다.

상기 바이오 칩이란, 반도체와 같은 무기물로 된 고체 기질에 생물에서 유래된 DNA, 단백질, 효소, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포 등의 물질을 고밀도로 집적화하고 조합하여 기존의 반도체칩 형태로 만든 혼성 소자로서 생체분자의 고유한 기능을 이용하며 유전자 발형 양상, 유전자 결합, 단백질 분포 등의 생물학적 정보를 얻거나 생화학적 공정 및 반응 속도 또는 정보 처리 속도를 높이는 도구나 장치를 말한다.

상기 고밀도 마이크로칩이란, 바이오칩의 작용 원리를 기반으로 특정 사이즈의 물질을 분리해낼 수 있는 바이오칩을 말하며 복수의 여과 구멍들이 형성되어 있을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로칩은 금속재질일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로칩에 형성된 여과구멍들은 분리되는 세포의 손상률을 최소화시키기 위해서 정사각형 모양으로 형성될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 정사각형 모양의 여과구멍의 크기는 각 변이 5~25㎛일 수 있다. 바람직하게는 상기 정사각형 모양의 여과구멍의 크기는 각 변이 8~20㎛일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로칩에 형성된 복수의 여과구멍들은 균일한 간격으로 형성될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로칩에 형성된 복수의 여과구멍들의 간격은 6~24㎛일 수 있고, 바람직하게는 4~21㎛일 수 있다.

상기 BSA(Bovine Serum Albumin)용액이란, 소혈청 알부민을 말한다. 분자량은 약 66.4 kDa 정도 되는 단백질로써 대부분의 동물에 많이 존재하는 단백질이다. BSA는 생화학/생물학에서 세포 배양시에 세포의 영양분으로써 첨가해줄 수 있고, 또한 단백질의 정량에서 검정곡선을 얻기 위한 표준물로도 많이 쓰이며 제한효소를 사용할때 적은양의 효소(단백질)를 사용해야 하므로 용액내의 단백질 농도를 보완해주기 위하여 첨가해줄 수도 있다. 그리고 여러 생화학적 실험(Western blot , Immunocytochemistry , ELISA 등) 에서 특정 항체를 검출하고자 하는 단백질이 붙여주기 전에 nonspecific binding 즉 원하지 않는 단백질, 혹은 원치않는 위치에 항체가 달라붙는 비특이적 결합을 막아 주기 위해 사용될 수도 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 원심분리법을 이용하여 말초 혈액을 상기 BSA용액으로 코팅된 고밀도 마이크로칩에 반응시켜서 혈중순환 암세포(Circulating Tumor Cells;CTC)와 면역세포를 제외한 기타 생체고분자를 제거할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로칩을 이용한 분리는 대기압 1000 내지 1020Pa에서 이루어질 수 있고, 바람직하게는 1000 내지 1014 Pa에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 0.05내지 0.15% 농도로 이루어 질 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 0.08 내지 0.012% 농도로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 5내지 15분동안 처리될 수 있다. 볼 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 8내지 12분동안 처리될 수 있다.

도1을 참조해보면, 환자의 혈액에서 먼저 혈구세포를 제거하기 위해서, 채혈된 환자의 혈액에 항체 중합체를 넣어 준 뒤 잘 혼합을 시킨 후 상온에서 반응을 시킨다. 이후 1% FBS가 들어있는 PBS용액을 가하고 Ficoll용액을 반응용액에 올리고 난 뒤 원심분리를 통해 1차적으로 혈구세포를 제거한다. 이렇게 본 발명에서 불필요한 혈구세포를 1차적으로 제거한 뒤, BSA용액으로 특별 코팅된 고밀도 마이크로 칩을 이용해서 적혈구를 여과해서 순도가 높은 혈중 암세포와 면역 세포를 분리해낸다. 분리된 혈중 암세포나 면역세포는 염색을 통해 동정을 한다. 상기 BSA로 코팅된 고밀도 마이크로 칩을 이용하게 되면 본 발명에서 분리하고자 하는 혈중 암세포와 면역세포를 손상을 최소화시킨 상태로 분리시킬 수가 있고 이렇게 높은 순도의 혈중 암세포와 면역세포는 본 발명의 암환자 판별 방법이 효과적으로 작용하도록 그 효율을 상당히 증대시켜 줄 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 마이크로칩에 의해 분리될 수 있는 면역세포는 백혈구일 수 있으며, 도13을 참고해보면 백혈구 제거 비율이 75%이상이 될 수 있음을 알 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 마이크로칩을 통한 백혈구 제거 비율은 80%이상이 될 수 있다.

그리고 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 마이크로칩에 의해 분리된 세포들은 손상이 최소화될 수 있기 때문에 그 회복률이 99%이상이 될 수 있다. 즉, 분리되기 이전의 세포 상태로 회복이 가능하기 때문에 본 발명의 암환자 판별 방법이 효과적으로 이루어질 수 있도록 할 수 있다(도12 참조).

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 마이크로칩에서 분리된 세포들은 별도의 배양과정(단기배양)을 통해 본 발명의 본 발명의 암환자 판별 방법을 위해 필요한 충분한 세포들을 선택적으로 확보할 수 있다. 즉, 상기 별도의 배양과정(단기배양)을 통해 본 발명에 필요하지 않은 세포들은 죽이고 필요한 세포들만 더욱 배양하여 그 순도를 더욱 높일 수 있다. 도 15 를 참조해보면, EpCAM+/CD45- 혈중순환암세포들은 더욱 늘어났고 EpCAM-/CD45+세포들을 줄어들었음 알 수 있다.

상기 별도의 배양(단기배양)은 혈중순환 암세포를 배양하는 일반적인 방법을 포함할 수 있다. 상기 별도 배양은 산소부족 상태(hypoxia condition)에서 표피성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF) 및 섬유아세포 성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF)를 포함하는 무혈청배지에서 배양하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 별도의 배양(단기배양)은 5내지10일동안 이루어질 수 있으면, 바람직하게는 6내지 10일동안 이루어질 수 있다. 보다 더 바람직하게는 7내지10일동안 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 별도의 배양(단기배양)은 35내지 38℃에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는 37.5℃에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 별도의 배양(단기배양)은 플레이트 바닥에 붙어서 성장하는 세포에도 적용이 가능하며 반드시 이에 국한된 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본발명의 암환자 판별방법은 상기 PD-L1을 타겟으로 하는 면역요법이 적용되는 암환자를 판별해내기 위한 알고리즘을 더 포함할 수 있다. 상기 알고리즘이란, 어떤 문제를 해결하기 위해 명확히 정의된(well-defined) 유한 개의 규칙과 절차의 모임을 의미하며 또한 명확히 정의된 한정된 개수의 규제나 명령의 집합이며, 한정된 규칙을 적용함으로써 문제를 해결하는 것을 의미한다. 알고리즘은 부여된 문자가 수학적인지 비수학적인지, 또 사람의 손으로 문제를 해결할 것인지, 컴퓨터로 해결할 것인지에 관계없이 적용될 수 있다. 본 발명의 또다른 일실시예에 따르면, 상기 알고리즘은 PD-L1을 타겟으로 하는 면역요법이 적용되는 암환자를 판별해내기 위해서 측정된 값과 기준치 값을 비교하는 알고리즘을 포함할 수 있다. 해당 분야의 당업자에게 상기 비교가 직접적일수도 있고 간접적일 수도 있다는 점은 자명하다. 더 구체적으로 보면, 상기 알고리즘은 a linear discriminant analysis model, a support vector machine classification algorithm, a recursive feature elimination model, a prediction analysis of microarray model, a logistic regression model, a CART algorithm, a flex tree algorithm, a LART algorithm, a random forest algorithm, a MART algorithm, a machine learning algorithm, a penalized regression method 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 암환자 판별방법은 마지막 단계로서, 상기 암환자의 면역반응을 강화시키는 약제학적 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 억제성 면역조절 신호란, 면역반응을 조절하는 인자에 의해서 면역 반응이 일어나는 것이 억제되도록 하는 신호를 말한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 억제성 면역조절 신호는 PD-L1 과 PD-1이 결합함으로써 일어나는 신호 전달 체계에 작용하여 면역반응을 억제하도록 하는 신호를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 PD-L1 타겟 면역치료법을 받는 암환자의 CTC 상 PD-L1 발현 모니터링 방법은 a) 특정 시점 전후로 적어도 2개의 액상 생검샘플을 PD-L1 타겟 면역치료를 받는 암환자로부터 얻는 단계 b) 상기 액상 생검샘플에서 바이오칩을 이용하여 얻은 CTC 및 면역세포를 분리하는 단계 c) 상기 b) 단계에서 분리된 CTC 및 면역세포에서 PD-L1을 발현하는 CTC를 검출하는 단계 d) 상기 c)단계에서 분리된 PD-L1을 발현하는 CTC 가 상기 액상 생검샘플에서 차지하는 비율을 계산하는 단계 e) PD-L1 발현을 모니터링하기 위해 a)단계의 액상 생검샘플들간의 상기 d)단계에서의 비율을 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 (e) 단계에서, 상기 (d)단계의 비율의 감소는 PD-L1 타겟 면역치료법에 대한 반응이 부정적일 것이라는 예후증상임을 포함할수 있다.

본 발명의 또다른 일실시예에서, 상기 (e) 단계에서, 상기 (d)단계의 비율의 변화가 없는 것은 PD-L1 타겟 면역치료법에 대한 반응이 긍정적일 것이라는 예후증상임을 포함할 수 있다. 여기서 비율이 변하지 않는다라는 것은 상기 비율이 실질적으로 변하지 않는다는 것을 의미하는 것이지 오로지 비율이 똑같다는 것만을 포함하는 것은 아니다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1 : CTC 분리과정

1. 혈액 5㎖에 항체 중합체 250㎕를 넣은 뒤 3초 정도 혼합한 후 상온에서 20분간 반응시킨다.

2. 1% FBS가 든 PBS 5ml을 가한다.

3. Ficoll 용액 15㎖가 담긴 50㎖ tube에 반응용액 10㎖을 조심스럽게 올린다.

4. 용액을 20분간 1200g에서 원심분리 하여 1차적으로 혈구세포를 제거한다.

5. 불필요한 세포의 흡착을 방지하기 위하여 고밀도 마이크로칩(HD Microporous chip, 여과망)을 0.1% BSA 용액으로 10 분간 처리하여 코팅한 다음 PBS로 린스한다.

6. Ficoll 의 상층용액을 여과망위에 올리고 미량 존재하는 적혈구를 중력으로 여과하여 2차적으로 순도가 높은 CTC를 분리한다. 이는 원심분리나 immunobead와 같은 처리를 하지않음으로 CTC가 손상되는 것을 방지해 준다.

7. 분리된 CTC는 염색을 통해 동정한다.

실시예 2 : CTC 단기배양

CTC 배양은 RPMI-1640 배지(phenol red)로 구성되는 tumor sphere 배지를 포함하는 ultralow attachment 플레이트(Corning)에서 이루어 진다. Tumor sphere배지는 추가적으로 EGF(20ng/ml), 기본 FGF(20ng/ml) B27(10ml) 및 1x Antibiotic-antimycotic(Life Technologies)를 포함한다. CTC는 5% CO2 및 4% O2상태의 습한 37℃ 인큐베이터에서 배양된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

1. (a) 암 환자로부터 얻은 액상 생검샘플을 준비하는 단계;
   (b) 상기 액상 생검샘플에서 바이오칩을 이용하여 CTC 및 면역세포를 분리하는 단계;
   (c) 상기 (b)단계에서 분리된 CTC 및 면역세포에서 PD-L1를 발현하는 CTC를 검출하는 단계;
   (d) 상기 (b)단계에서 분리된 CTC 및 면역세포에서 면역세포를 분리하는 단계;
   (e) 상기 (c)단계에서 검출된PD-L1을 발현하는 CTC와 상기 (d)단계에서 분리된 면역세포의 상대적인 비율을 계산하는 단계; 및
   (f) 상기 상대적인 비율이 기준값을 초과하는지 여부를 판단하는 단계;
   를 포함하는 PD-L1을 타겟으로 하는 면역치료법 적용을 위한 암환자 판별 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계는 대기압 1000내지 1020 hPa에서 이루어지는 것을 포함하는 암환자 판별 방법.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 바이오칩은 BSA용액으로 코팅된 고밀도 마이크로칩인 것을 포함하는 암환자 판별 방법.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 고밀도 마이크로칩은 사이즈 특이성을 가지는 것을 포함하는 암환자 판별 방법.
   
5. 제3항에 있어서,
   상기 BSA용액 코팅은 0.05내지0.15% 농도로 코팅되는 것을 포함하는 암환자 판별 방법.
   
6. 제3항에 있어서,
   상기 BSA용액 코팅은 5내지 15분동안 코팅되는 것을 포함하는 암환자 판별 방법.
   
7. 제 1항에 있어서,
   상기 면역세포는 T림프구인 것을 포함하는 암환자 판별 방법.
   
8. 제 1 내지 7항에 있어서,
   PD-L1을 타겟으로 하는 면역요법이 적용되는 암환자를 판별해내기 위한 알고리즘을 더 포함하는 암환자 판별 방법.
   
9. 제 1항에 있어서,
   마지막 단계로서, 상기 암환자의 면역반응을 강화시키는 약제학적 유효량의 조성물을 적용하는 단계를 더 포함하는 암환자 판별 방법.
   
10. 제 9항에 있어서,
    상기 조성물은 억제성 면역조절 신호를 막는 조성물인 것을 포함하는 암환자 판별 방법.
    
11. 제 10항에 있어서,
    상기 억제성 면역조절 신호는 PD-1/PD-L1 신호 체계에서 나오는 것임을 포함하는 암환자 판별 방법.
    
12. (a) 특정 시점 전후로 적어도 2개의 액상 생검샘플을 PD-L1 타겟 면역치료를 받는 암환자로부터 준비하는 단계;
    (b) 상기 액상 생검샘플에서 바이오칩을 이용하여 얻은 CTC 및 면역세포를 분리하는 단계;
    (c) 상기 (b)단계에서 분리된 CTC및 면역세포에서 PD-L1을 발현하는 CTC를 검출하는 단계;
    (d) 상기 (c)단계에서 검출된PD-L1을 발현하는 CTC가 상기 액상 생검샘플에서 차지하는 비율을 계산하는 단계; 및
    (e) PD-L1 발현을 모니터링하기 위해 상기 특정시점 전후의 액상 생검샘플들간의 상기 (d)단계에서의 비율을 비교하는 단계;
    를 포함하는 PD-L1 타겟 면역치료법을 받는 암환자의 CTC 상 PD-L1 발현 모니터링 방법.
    
13. 제 12항에 있어서,
    상기 (e) 단계에서, 상기 (d)단계의 비율의 감소는 PD-L1 타겟 면역치료법에 대한 반응이 부정적일 것이라는 예후증상임을 포함하는 모니터링 방법.
    
14. 제 12항에 있어서,
    상기 (e) 단계에서, 상기 (d)단계의 비율의 변화가 없는 것은 PD-L1 타겟 면역치료법에 대한 반응이 긍정적일 것이라는 예후증상임을 포함하는 모니터링 방법.

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